CN106062202A - 通过嵌合基因调节元件赋予的根特异性表达 - Google Patents

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Abstract

提供了利用嵌合基因调节元件在植物细胞和/或植物组织中表达转基因的构建体和方法。具体地，构建体包括包含嵌合多核苷酸序列的基因表达盒，所述嵌合多核苷酸序列包含从玉米过氧化物酶5获得的上游启动子多核苷酸序列，并且其后为玉米醇脱氢酶(I)内含子6和玉米线条病毒5’‑UTR。所得的嵌合启动子序列包含新的嵌合基因调节元件。还公开了培育使用嵌合基因启动子调节元件表达转基因的植物的方法。

Description

通过嵌合基因调节元件赋予的根特异性表达
相关申请的交叉引用
本申请要求获得2014年2月28日提交的美国临时申请系列号61/946,066在美国法典第35编第119条第(e)项下的权益，将该申请明确地通过提述并入本文。
对以电子方式提交的序列表的引用
该序列表的正式副本作为ASCII格式的序列表经由EFS-Web以电子方式提交，其文件名为“68242_ST25.txt”，建立日期为2015年2月26日，大小为49.7千字节，并且与本说明书同时提交。包括在该ASCII格式文件中的序列表是说明书的一部分并通过提述完整并入本文。
发明领域
本发明一般而言涉及植物分子生物学领域，更具体地说涉及转基因在植物中的表达领域。
背景
许多植物物种能够以转基因进行转化，以导入农艺学上期望的性状或特征。植物物种经开发和/或修饰为具有特定的期望性状。通常，期望性状例如包括，提高营养价值质量，增加产量，赋予抗虫性或抗病性，增加干旱和胁迫耐受性，提高园艺质量(例如，着色和生长)，赋予除草剂抗性，赋予从植物生产在工业上有用的化合物和/或材料的能力，和/或赋予生产药物的能力。
通过植物转化技术来生产包含堆叠在单个基因组基因座中的多个转基因的转基因植物物种。植物转化技术导致转基因导入植物细胞中、在植物基因组中含有转基因的稳定整合拷贝的能育转基因植物的回收、以及通过植物基因组的转录和翻译的后续转基因表达，从而生成具有期望性状和表型的转基因植物。不过，理想的机制是能够产生转基因植物物种来高表达设计构建成为性状堆叠的多个转基因。
同样，理想的机制是能够在植物的特定组织或器官内表达转基因。例如，可以借助土传(soil-borne)病原体，用病原体抗性基因转化植物基因组，使得病原体抗性蛋白在植物根内强表达，从而增加植物对感染的抵抗力。或者，可以在处于特定的生长或发育阶段(例如细胞分裂或伸长)的植物组织中表达转基因。
本文中描述了嵌合启动子调节元件(例如，包含上游启动子、内含子、和5’-UTR的启动子序列)。进一步描述了利用嵌合启动子调节元件的构建体和方法。
概述
本文公开了用于在植物细胞和/或植物组织中表达转基因的构建体和方法。在一个实施方案中，构建体包括基因表达盒，所述基因表达盒包含嵌合多核苷酸序列，所述嵌合多核苷酸序列包含从玉米过氧化物酶5获得的上游启动子多核苷酸序列，其后为玉米醇脱氢酶(I)内含子6和玉米线条病毒5’-UTR。所得的嵌合启动子序列构成一种新的嵌合基因调节元件。
在一个实施方案中，基因表达盒包含与转基因或异源编码序列可操作连接的嵌合基因启动子调节元件。在一个实施方案中，基因表达盒包含至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、或更多个转基因。
本文中公开了培育利用嵌合基因启动子调节元件(例如，上游启动子、内含子、和5’-UTR)表达转基因的植物的方法。本文中还公开了培养利用嵌合基因启动子调节元件表达转基因的植物组织和细胞的方法。在一个实施方案中，本文中公开的方法包括在植物根中的组织特异性基因表达。本文中还公开了分离包含嵌合基因启动子调节元件的多核苷酸序列的方法。
在一个实施方案中，本主题公开涉及包含与转基因可操作连接的启动子的基因表达盒，其中该启动子包含在严格条件下与多核苷酸探针杂交的多核苷酸，所述多核苷酸探针包含SEQ ID NO:1的互补物的至少90％的序列同一性。在该实施方案的后续方面，该多核苷酸与SEQ ID NO:1具有至少90％序列同一性。在其他方面，可操作连接的转基因编码多肽或小RNA。在又另外的方面，该转基因选自下组：杀虫剂抗性转基因、除草剂耐受性转基因、氮利用效率转基因、水分利用效率转基因、营养品质转基因、DNA结合转基因、和选择标志物转基因。在一个方面，实施方案涉及包含3'-非翻译区的基因表达盒。在一个实施方案中，本主题公开涉及包含基因表达盒的重组载体。在该实施方案的一个方面，该载体选自下组：质粒、粘粒、细菌人工染色体、病毒、和噬菌体。在其他实施方案中，本主题公开涉及包含基因表达盒的转基因细胞。在另一个实施方案中，该转基因细胞是转基因植物细胞。在另外一个实施方案中，本主题公开涉及包含转基因植物细胞的转基因植物。在该实施方案的一个方面，该转基因植物是单子叶或双子叶植物。在其他方面，该单子叶植物选自下组：玉米植物、水稻植物、和小麦植物。在另外一个实施方案中，本公开涉及来自转基因植物的转基因种子。在另一个实施方案中，该启动子是组织优选启动子。在后续的实施方案中，该组织优选启动子是根组织优选启动子。
在一个实施方案中，本主题公开涉及包含在严格条件下与多核苷酸探针杂交的合成多核苷酸的转基因细胞，所述多核苷酸探针包含与SEQ ID NO:1的互补物的至少90％的序列同一性。在该实施方案的一个方面，该多核苷酸与SEQ ID NO:1具有至少90％序列同一性。在该实施方案的另外一个方面，该转基因细胞是转基因植物细胞。在另一方面，该转基因植物细胞是通过植物转化方法产生的。在其他方面，植物转化方法选自下组：土壤杆菌介导的转化法、生物射弹转化法、碳化硅转化法、原生质体转化法、和脂质体转化法。在另外一个实施方案中，本主题公开涉及包含转基因植物细胞的转基因植物。在该实施方案的一个方面，该转基因植物是单子叶或双子叶植物。在其他方面，该单子叶植物选自下组：玉米植物、水稻植物、和小麦植物。在另外的实施方案中，本主题公开涉及来自所述转基因植物的转基因种子。在另外一个实施方案中，该启动子是组织优选启动子。在另外的实施方案中，该组织优选启动子是根组织优选启动子。
在一个实施方案中，本主题公开涉及包含在严格条件下与多核苷酸探针杂交的嵌合多核苷酸序列，所述多核苷酸探针包含与SEQ ID NO:1的互补物的至少90％的序列同一性。在该实施方案的另一个方面，该多核苷酸与SEQ ID NO:1具有至少90％序列同一性。在一个另外的方面，该嵌合多核苷酸序列与转基因可操作连接。在另一个方面，该可操作连接的转基因编码多肽或小RNA。在一个方面，该嵌合多核苷酸序列与该转基因可操作连接。在另外的方面，该转基因选自下组：杀虫剂抗性转基因、除草剂耐受性转基因、氮利用效率转基因、水分利用效率转基因、营养品质转基因、DNA结合转基因、和选择标志物转基因。在另外一个实施方案中，本主题公开涉及包含所述基因表达盒的重组载体。另外的方面包括，其中该载体选自下组：质粒、粘粒、细菌人工染色体、病毒、和噬菌体。在一个实施方案中，本主题公开涉及包含所述基因表达盒的转基因细胞。在其他方面，该转基因细胞是转基因植物细胞。在一个实施方案中，本主题公开涉及包含所述转基因植物细胞的转基因植物。一个另外的方面包括，其中转基因植物是单子叶植物。另外的方面包括，其中单子叶植物选自下组：玉米植物、小麦植物、和水稻植物。在一个实施方案中，本主题公开涉及来自转基因植物的转基因种子。在实施方案的一个另外的方面，该嵌合多核苷酸序列促进转基因的根优选表达。
在一个实施方案中，本主题公开涉及一种在转基因植物中表达异源编码序列的方法，该方法包括：
用基因表达盒转化植物细胞，所述基因表达盒包含：包含与SEQ ID NO:1的至少90％的序列同一性的多核苷酸序列，与异源编码序列可操作连接，所所述异源编码序列与3'-非翻译区可操作连接；
分离包含该基因表达盒的转化的植物细胞；
使该转化的植物细胞再生为转基因植物；和，
获得该转基因植物，其中该转基因植物包含所述包含含有SEQ ID NO:1的多核苷酸序列的基因表达盒。
在该实施方案的一个方面，该异源编码序列选自下组：杀虫剂抗性编码序列、除草剂耐受性编码序列、氮利用效率编码序列、水分利用效率编码序列、营养品质编码序列、DNA结合编码序列、和选择标志物编码序列。在其他方面，植物细胞的转化利用植物转化方法。在后续的方面，植物转化方法选自下组：土壤杆菌介导的转化法、生物射弹转化法、碳化硅转化法、原生质体转化法、和脂质体转化法。在其他方面，该转基因植物是单子叶或双子叶转基因植物。另外的方面包括，其中单子叶转基因植物选自下组：玉米植物、小麦植物、和水稻植物。在一个实施方案中，本主题公开涉及来自转基因植物的转基因种子。在另外的方面，该异源编码序列表达在转基因植物组织中。在后续的方面，该转基因植物组织是转基因植物根组织。
在一个实施方案中，本主题公开涉及分离包含与SEQ ID NO:1的至少90％序列同一性的多核苷酸序列的方法，该方法包括：
鉴定包含与SEQ ID NO:1的至少90％序列同一性的多核苷酸序列；
产生多个寡核苷酸引物序列，其中所述寡核苷酸引物序列结合所述包含与SEQ IDNO:1的至少90％序列同一性的多核苷酸序列；
用选自多个寡核苷酸引物序列的寡核苷酸引物序列从DNA样品扩增包含与SEQ IDNO:1的至少90％序列同一性的多核苷酸序列，和，
分离包含与SEQ ID NO:1的至少90％序列同一性的多核苷酸序列。
在该实施方案的另一个方面，，包含与SEQ ID NO:1的至少90％序列同一性的分离的多核苷酸序列与转基因可操作连接。在实施方案的后续方面，可操作连接的转基因编码多肽或小RNA。
构想了下列编号的实施方案，它们不构成限制：
1.一种基因表达盒，其包含与转基因可操作连接的启动子，其中该启动子包含在严格条件下与多核苷酸探针杂交的多核苷酸，所述多核苷酸探针包含与SEQ ID NO:1的互补物的至少90％的序列同一性。
2.条款1的基因表达盒，其中该多核苷酸与SEQ ID NO:1具有至少90％序列同一性。
3.条款1的基因表达盒，其中可操作连接的转基因编码多肽或小RNA。
4.条款1的基因表达盒，其中该转基因选自下组：杀虫剂抗性转基因、除草剂耐受性转基因、氮利用效率转基因、水分利用效率转基因、营养品质转基因、DNA结合转基因、和选择标志物转基因。
5.条款1的基因表达盒，进一步包含3'非翻译区。
6.一种包含条款1的基因表达盒的重组载体。
7.条款6的重组载体，其中该载体选自下组：质粒、粘粒、细菌人工染色体、病毒、和噬菌体。
8.一种包含条款1的基因表达盒的转基因细胞。
9.条款8的转基因细胞，其中该转基因细胞是转基因植物细胞。
10.一种包含条款9的转基因植物细胞的转基因植物。
11.条款10的转基因植物，其中该转基因植物是单子叶或双子叶植物。
12.条款11的转基因植物，其中该单子叶植物选自下组：玉米植物、水稻植物、和小麦植物。
13.一种来自条款10的转基因植物的转基因种子。
14.条款1的基因表达盒，其中该启动子是组织优选启动子。
15.条款1的基因表达盒，其中该组织优选启动子是根组织优选启动子。
16.一种转基因细胞，其包含合成多核苷酸，该合成多核苷酸在严格条件下与多核苷酸探针杂交，所述多核苷酸探针包含与SEQ ID NO:1的互补物的至少90％的序列同一性。
17.条款16的转基因细胞，其中该合成多核苷酸与SEQ ID NO:1具有至少90％序列同一性。
18.条款16的转基因细胞，其中该转基因细胞是转基因植物细胞。
19.条款18的转基因细胞，其中该转基因植物细胞是通过植物转化方法产生的。
20.条款19的转基因细胞，其中该植物转化方法选自下组：土壤杆菌介导的转化法、生物射弹转化法、碳化硅转化法、原生质体转化法、和脂质体转化法。
21.一种包含条款18的转基因植物细胞的转基因植物。
22.条款21的转基因植物，其中该转基因植物是单子叶或双子叶植物。
23.条款22的转基因植物，其中该单子叶植物选自下组：玉米植物、水稻植物、和小麦植物。
24.一种来自条款21的转基因植物的转基因种子。
25.条款16的转基因细胞，其中该启动子是组织优选启动子。
26.条款16的基因表达盒，其中该组织优选启动子是根组织优选启动子。
27.一种嵌合多核苷酸序列，其在严格条件下与多核苷酸探针杂交，所述多核苷酸探针包含与SEQ ID NO:1的互补物的至少90％的序列同一性。
28.条款27的嵌合多核苷酸序列，其中该多核苷酸与SEQ ID NO:1具有至少90％序列同一性。
29.条款27的嵌合多核苷酸序列，其中该嵌合多核苷酸序列与转基因可操作连接。
30.条款29的可操作连接的转基因，其中可操作连接的转基因编码多肽或小RNA。
31.一种基因表达盒，其包含与转基因可操作连接的条款27的嵌合多核苷酸序列。
32.条款31的基因表达盒，其中该转基因选自下组：杀虫剂抗性转基因、除草剂耐受性转基因、氮利用效率转基因、水分利用效率转基因、营养品质转基因、DNA结合转基因、和选择标志物转基因。
33.一种包含条款31的基因表达盒的重组载体。
34.条款33的重组载体，该载体选自下组：质粒、粘粒、细菌人工染色体、病毒、和噬菌体。
35.一种包含条款31的基因表达盒的转基因细胞。
36.条款35的转基因细胞，其中该转基因细胞是转基因植物细胞。
37.一种包含条款36的转基因植物细胞的转基因植物。
38.条款37的转基因植物，其中该转基因植物是单子叶植物。
39.条款38的转基因植物，其中该单子叶植物选自下组：玉米植物、小麦植物、和水稻植物。
40.一种来自条款37的转基因植物的转基因种子。
41.条款27的嵌合多核苷酸序列，其中该嵌合多核苷酸序列促进转基因的根优选表达。
42.一种在转基因植物中表达异源编码序列的方法，该方法包括：
a)用基因表达盒转化植物细胞，其中该基因表达盒包含多核苷酸序列，所述多核苷酸序列包含与异源编码序列可操作连接的SEQ ID NO:1的至少90％的序列同一性，所述异源编码序列与3'-非翻译区可操作连接；
b)分离包含该基因表达盒的转化的植物细胞；
c)使该转化的植物细胞再生为转基因植物；和，
d)获得转基因植物，其中该转基因植物包含所述含有SEQ ID NO:1的多核苷酸序列的基因表达盒。
43.条款42的方法，该异源编码序列选自下组：杀虫剂抗性编码序列、除草剂耐受性编码序列、氮利用效率编码序列、水分利用效率编码序列、营养品质编码序列、DNA结合编码序列、和选择标志物编码序列。
44.条款42的方法，其中植物细胞的转化是植物转化方法。
45.条款44的方法，其中该植物转化方法选自下组：土壤杆菌介导的转化法、生物射弹转化法、碳化硅转化法、原生质体转化法、和脂质体转化法。
46.条款42的方法，其中该转基因植物是单子叶或双子叶转基因植物。
47.条款46的方法，其中该单子叶转基因植物选自下组：玉米植物、小麦植物、和水稻植物。
48.一种来自条款42的转基因植物的转基因种子。
49.条款42的方法，其中该异源编码序列在转基因植物组织中表达。
50.条款42的方法，其中该转基因植物组织是转基因植物根组织。
51.一种分离包含与SEQ ID NO:1的至少90％序列同一性的多核苷酸序列的方法，该方法包括：
a)鉴定包含与SEQ ID NO:1的至少90％序列同一性的多核苷酸序列；
b)产生多个寡核苷酸引物序列，其中所述寡核苷酸引物序列与所述包含与SEQ IDNO:1的至少90％序列同一性的多核苷酸序列结合；
c)用选自该多个寡核苷酸引物序列的寡核苷酸引物序列从DNA样品扩增包含与SEQ ID NO:1的至少90％序列同一性的多核苷酸序列，和，
d)分离包含与SEQ ID NO:1的至少90％序列同一性的多核苷酸序列。
52.条款51的方法，其中包含与SEQ ID NO:1的至少90％序列同一性的分离的多核苷酸序列与转基因可操作连接。
53.条款52的方法，其中可操作连接的转基因编码多肽或小RNA。
发明详述
定义
如本文中使用的，冠词“一个(a)”、“一种(an)”和“该(the)”包括复数引用，除非上下文另外清楚且无歧义地另有规定。
如本文中使用的，术语“回交”是指育种者使杂交后代与亲本之一杂交，例如，第一代杂种F1与F1杂种的亲本基因型之一杂交的过程。
如本文中使用的，术语“内含子”是指包含在经过转录但未经翻译的基因(或表达的感兴趣核苷酸序列)中的任何核酸序列。内含子包括表达的DNA序列之内的非翻译核酸序列、以及从所述DNA序列转录的RNA分子中的相应序列。
本文中描述的构建体还可以含有增强翻译和/或mRNA的稳定性的序列，如内含子。这样的内含子的实例是拟南芥组蛋白变体的基因II的第一内含子或任何其他公知的内含子序列。内含子可与启动子序列联合用于增强翻译和/或mRNA的稳定性。
如本文中使用的，术语“5’非翻译区”或“5’-UTR”是指前mRNA或成熟mRNA的5’端中的非翻译区段。例如，在成熟mRNA上，5’-UTR一般在其5’端上包含7-甲基鸟苷帽并涉及许多过程，如剪接、多腺苷酸化、mRNA朝向细胞质输出、翻译机构对mRNA 5’端的识别、以及保护mRNA免于降解。
如本文中使用的，术语“3’非翻译区”或“3’-UTR”是指前mRNA或成熟mRNA的3’端中的非翻译区段。例如，在成熟的mRNA上，这个区域包含多聚(A)尾并且已知其在mRNA稳定性、翻译起始、和mRNA输出中具有多种作用。
如本文中使用的，术语“多腺苷酸化信号”是指存在于mRNA转录物中的核酸序列，当存在多聚(A)聚合酶时，所述核酸序列允许终止转录物在例如位于多聚(A)信号的下游的10到30个碱基的多腺苷酸化位点上的多腺苷酸化。许多多腺苷酸化信号在本领域是已知的并可用于本发明。示例序列AAUAAA及其变体，正如描述于Loke J.等人，(2005)PlantPhysiology 138(3)；1457-1468。
如本文中使用的，术语“分离的”是指这样的生物学组分(包括核酸或蛋白质)，其已经从该组分所天然存在的生物细胞中的其他生物学组分(即，其他染色体和染色体外的DNA)分离。
如本文中使用的，关于核酸分子的术语“纯化的”并不要求绝对的纯度(比如同质的制备物)；相反，其代表该序列比其天然细胞环境相对更纯的含义(与天然水平相比，这个水平例如，就浓度或基因表达水平而言应当至少高2-5倍)。DNA分子直接地获自总DNA或获自总RNA。另外，cDNA克隆并非天然存在，而是优选地经由部分纯化的、天然存在的物质(信使RNA)的操作获得。从mRNA构建cDNA文库涉及合成物质(cDNA)的创建。通过进行携带该cDNA文库的克隆选择，可从该合成文库纯化单独的cDNA克隆。因此，包括从mRNA构建cDNA文库和纯化独特的cDNA克隆的过程导致天然信息的大约106倍纯化。同样，可将启动子DNA序列克隆到质粒中。这样的克隆并非天然存在，而是优选地经由部分纯化的、天然存在的物质(比如基因组DNA文库)的操作获得。因此，至少一个数量级、优选两个或三个数量级、更优选四个或五个数量级的纯化在这些技术中受到青睐。
类似地，“纯化”代表已经在组分DNA序列中发生化学或功能变化的含义。已经“纯化的”核酸分子和蛋白质包括通过标准纯化方法纯化的核酸分子和蛋白质。术语“纯化的”还包括通过重组DNA方法在宿主细胞(例如，植物细胞)中制备的核酸分子和蛋白质，以及化学合成的核酸分子、蛋白质、和肽。
术语“重组”意指其中已经发生遗传重组的细胞或生物。还包括已经通过人为干预以人工或合成方式(即，非天然)改变的分子(例如，载体、质粒、核酸、多肽、或小RNA)。改变可以在天然环境或状态中的分子上进行，或者是从其天然环境或状态移除。
如本文中使用的，术语“表达”是指藉此将多核苷酸转录为mRNA(包括小RNA分子)的过程和/或藉此随后将转录的mRNA(也称为“转录物”)翻译成肽、多肽、或蛋白质的过程。基因表达可能受到外部信号的影响，例如细胞、组织、或生物暴露于增加或降低基因表达的物质。基因表达也可以在从DNA到RNA再到蛋白质的途径中的任何位置受到调节。例如，通过控制对转录、翻译、RNA运输和加工、中间分子比如mRNA的降解的作用，或通过在特异性蛋白分子已经产生之后的活化、失活、区室化、或降解，或它们的组合，由此发生基因表达的调节。通过本领域已知的任何方法，包括但不限于，Northern印迹、RT-PCR、Western印迹，或体外、原位或体内蛋白活性测定，可以在RNA水平或蛋白质水平测量基因表达。
如本文中使用的，术语“基于同源性的基因沉默”或“HBGS”为通用术语，其包括转录基因沉默和转录后基因沉默两者。通过未连接的沉默基因座使靶基因座沉默可由于转录抑制(转录基因沉默；TGS)或mRNA降解(转录后基因沉默；PTGS)所致，原因在于产生分别对应于启动子或转录序列的双链RNA(dsRNA)。在每个过程中涉及不同的细胞组分表明，dsRNA诱导的TGS和PTGS很可能是由于古老的普遍机制的多样化所致。然而，由于通常依赖于分析不同的沉默基因座，已经难于实现TGS和PTGS的严格比较。由于产生对应于不同靶基因的启动子和转录序列的dsRNA，可描述单个转基因基因座来触发TGS和PTGS两者。
如本文中使用的，术语“核酸分子”、“核酸”、或“多核苷酸”(所有这三个术语彼此同义)是指核苷酸的聚合形式，其可包括RNA、cDNA、基因组DNA、和合成形式的正义和反义链、及其混合聚合物。“核苷酸”可以是指核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、或这两种类型核苷酸的任一者的修饰形式。除非另外指明，核酸分子通常在长度上具有至少10个碱基。所述术语可以指具有不确定长度的RNA或DNA分子。所述术语包括DNA的单链和双链形式。核酸分子可以包括天然存在的核苷酸和/或修饰的核苷酸，通过天然存在和/或非天然存在的核苷酸连接而连接在一起。
正如本领域技术人员易于理解的，核酸分子可被化学修饰或生物化学修饰，或者可以含有非天然或衍生的核甘碱基。这些修饰包括，例如，标记物、甲基化、用类似物取代一个或多个天然存在的核苷酸、核苷酸间修饰(例如，如不带电连接(uncharged linkage)的修饰：例如甲基膦酸盐、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等；带电连接(chargedlinkage)的修饰：例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等；悬垂部分的修饰：例如肽类；嵌入剂修饰：例如吖啶、补骨脂素等；螯合剂修饰；烷化剂(alkylator)修饰；和修饰的连接：例如α异头核酸等)。术语“核酸分子”还包括任何拓扑结构，包括单链的、双链的、部分双链体的、三链体的、发夹形的(hairpinned)、圆形的、挂锁形的结构。
转录以5’到3’的方式沿着DNA链行进。这意味着通过向生长链的3’端连续添加5'-核糖核苷三磷酸而产生RNA(消除焦磷酸盐是必不可少的)。在线性或环形核酸分子中，如果离散元件以从另一个元件的5’方向结合到或将要结合到同一核酸上，则所述离散元件(例如，特定的核苷酸序列)可被称为相对于所述另一个元件的“上游”。类似地，如果离散元件以从另一个元件的3’方向结合到或将要结合到同一核酸上，则所述离散元件可为相对于所述另一个元件的“下游”。
如本文中使用的，术语“碱基位置”是指在指定核酸之内的给定碱基或核苷酸残基的位置。通过与参考核酸的比对可定义指定核酸。
如本文中使用的，术语“杂交”是指其中寡核苷酸及其类似物通过互补碱基之间的氢键杂交的过程，所述氢键包括Watson-Crick、Hoogsteen或反Hoogsteen氢键。通常，核酸分子由含氮碱基组成，所述碱基为嘧啶(胞嘧啶(C)、尿嘧啶(U)和胸腺嘧啶(T))或嘌呤(腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G))。这些含氮碱基在嘧啶和嘌呤之间形成氢键，并且嘧啶与嘌呤的键合被称为“碱基配对”。更具体地，A会与T或U键合，而G会与C键合。“互补”指在两条不同的核酸序列或同一核酸序列的两个不同区域之间发生的碱基配对。
如本文中使用的，术语“可特异性杂交”和“特异性互补”是指足够的互补程度，使得在寡核苷酸与DNA或RNA靶标之间发生稳定的和特异性的结合。寡核苷酸不必100％与特异性杂交的靶序列互补。当寡核苷酸与靶DNA或RNA分子的结合干扰了DNA或RNA的正常功能时，所述寡核苷酸是特异性可杂交的，并且存在足够的互补程度，以避免在期望特异性结合的条件下(例如在体内测定或系统情形的生理条件下)的寡核苷酸与非靶序列的非特异性结合。这样的结合被称为特异性杂交。导致特定严格程度的杂交条件会根据选择的杂交方法的性质和杂交的核酸序列的组成和长度而变化。通常，杂交温度和杂交缓冲液的离子强度(尤其是Na+和/或Mg2+浓度)有助于杂交的严格性，尽管洗涤时间也影响严格性。关于得到特定严格程度所需要的杂交条件的计算论述于Sambrook等人(编辑),Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版,1-3卷,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,New York,1989。
如本文中使用的，“严格条件”涵盖的条件为，在这样的条件下，只有当杂交分子与DNA靶之间的错配小于50％时才发生杂交。“严格条件”包括另外的特殊严格性水平。因此，如本文中使用的，“中等严格性”条件为具有50％以上序列错配的分子不会杂交的条件；“高严格性”条件为具有20％以上错配的分子不会杂交的条件；并且“极高严格性”条件为具有10％以上错配的序列不会杂交的条件。
在特定的实施方案中，严格条件可包括：在65℃杂交，然后在65℃用0.1x SSC/0.1％SDS洗涤40分钟。以下是代表性的非限制性杂交条件：
·极高严格性：在5x SSC缓冲液中在65℃杂交16小时；在2x SSC缓冲液中在室温下洗涤两次，每次15分钟；并且在0.5x SSC缓冲液中在65℃洗涤两次，每次20分钟。
·高严格性：在5-6x SSC缓冲液中在65-70℃杂交16-20小时；在2x SSC缓冲液中在室温下洗涤两次，每次5-20分钟；并且在1x SSC缓冲液中在55-70℃洗涤两次，每次30分钟。
·中等严格性：在6x SSC缓冲液中在室温到55℃杂交16-20小时；在2-3x SSC缓冲液中在室温到55℃洗涤至少两次，每次20-30分钟。
在一个实施方案中，特异性可杂交的核酸分子可在极高严格性杂交条件下保持结合。在一个实施方案中，特异性可杂交的核酸分子可在高严格性杂交条件下保持结合。在一个实施方案中，特异性可杂交的核酸分子可在中等严格性杂交条件下保持结合。
如本文中使用的，术语“寡核苷酸”是指短的核酸聚合物。可通过切割较长核酸区段、或通过使单独的核苷酸前体聚合而形成寡核苷酸。自动合成仪能够合成在长度上高达几百个碱基对的寡核苷酸。由于寡核苷酸可与互补的核苷酸序列结合，它们可用作检测DNA或RNA的探针。由DNA组成的寡核苷酸(寡脱氧核糖核苷酸)可用于聚合酶链反应中，聚合酶链反应为用于扩增小DNA序列的技术。在聚合酶链反应中，寡核苷酸一般被称为“引物”，其允许DNA聚合酶延伸寡核苷酸并复制互补链。
如本文中使用的，术语“聚合酶链反应”或“PCR”是指其中微量核酸、RNA和/或DNA被扩增的程序或技术，正如美国专利No.4,683,195中所描述。通常，需要可用的来自感兴趣区域的末端的序列信息或其他信息，使得可以设计寡核苷酸引物；这些引物与有待扩增的模板的相对链在序列上相同或相似。两个引物的5’端核苷酸可与扩增材料的末端一致。PCR可用来扩增特异性RNA序列、来自总的基因组DNA的特异性DNA序列、和从总的细胞RNA、噬菌体或质粒序列等转录的cDNA。总体上参见Mullis等,Cold Spring HarborSymp.Quant.Biol.,51:263(1987)；Erlich编辑,PCR Technology,(Stockton Press,NY,1989)。
如本文中使用的，术语“引物”是指当条件适合于合成引物延伸产物时能够用作沿着互补链的合成起始点的寡核苷酸。合成条件包括四种不同的脱氧核糖核苷三磷酸和诸如逆转录酶或DNA聚合酶的至少一种聚合诱导剂的存在。这些物质存在于适合的缓冲液中，所述缓冲液可包括作为辅因子或在不同的适当温度下影响诸如pH等条件的组分。引物优选地是单链序列，使得扩增效率得以最佳化，不过可以利用双链序列。
如本文中使用的，术语“探针”是指与靶序列杂交的寡核苷酸或多核苷酸序列。在或型测定程序中，探针与位于两个引物的退火位点之间的靶部分杂交。探针包含约八个核苷酸、约十个核苷酸、约十五个核苷酸、约二十个核苷酸、约三十个核苷酸、约四十个核苷酸、或约五十个核苷酸。在一些实施方案中，探针包含从约八个核苷酸到约十五个核苷酸。
在Southern印迹测定程序中，探针与附着到膜上的DNA片段杂交。探针包含约十个核苷酸、约100个核苷酸、约250个核苷酸、约500个核苷酸、约1,000个核苷酸、约2,500个核苷酸、或约5,000个核苷酸。在一些实施方案中，探针包含从约500个核苷酸到约2,500个核苷酸。
探针可进一步包含可检测标记，例如，放射性标记、生物素化标记、荧光团(异硫氰酸荧光素，等)。可检测标记可直接地共价附接到探针寡核苷酸上，例如位于探针的5’端或探针的3’端。包含荧光团的探针还可进一步包含淬灭剂，例如，BlackHole QuencherTM、Iowa BlackTM，等。
如本文中使用的，术语“序列同一性”或“同一性”可以互换地使用，指在指定比较窗口上比对最大对应性时在两个序列中相同的核酸残基。
如本文中使用的，术语“序列同一性百分比”是指通过在比较窗口上比较两个最优比对序列(例如核酸序列或氨基酸序列)确定的值，其中在该比较窗口中的序列部分可以包含相比于参考序列(不包含添加或缺失)的添加或缺失(即，空位)，用于这两个序列的最优比对。通过确定相同核酸或氨基酸残基出现在两个序列中的位置的数目而产生匹配位置的数目，用匹配位置的数目除以比较窗口中的位置的总数，将结果乘以100而产生序列同一性的百分比，从而计算出该百分比。用于比较的序列比对方法是熟知的。各种程序和比对算法例如描述于Smith和Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2:482；Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443；Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:2444；Higgins和Sharp(1988)Gene 73:237-44；Higgins和Sharp(1989)CABIOS 5:151-3；Corpet等(1988)Nucleic Acids Res.16:10881-90；Huang等(1992)Comp.Appl.Biosci.8:155-65；Pearson等(1994)Methods Mol.Biol.24:307-31；Tatiana等(1999)FEMSMicrobiol.Lett.174:247-50。
美国国家生物技术信息中心(NCBI)基本局部比对搜索工具(BLASTTM；Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215:403-10)可从几个来源获得，包括美国国家生物技术信息中心(Bethesda,MD)、以及在因特网上，其与几种序列分析程序结合使用。怎样使用该程序确定序列同一性的描述可在因特网的BLASTTM的“帮助”部分获得。为了比较核酸序列，可以采用利用默认参数的BLASTTM(Blastn)程序的“Blast 2序列”函数。在用这种方法评估时，与参考序列具有较大相似性的核酸序列将显示出同一性百分比的增加。
如本文中使用的，术语“可操作连接”是指核酸被置于与另一种核酸的功能关系中。通常，“可操作连接”可意指连接的核酸是连续的。可通过连接在合适的限制性位点处完成连接。如果这样的位点不存在，则合成的寡核苷酸接头或连接子被连接或退火到核酸上，并且用于连接邻接的多核苷酸片段。然而，可操作连接的元件不必是连续的。
如本文中使用的，术语“启动子”是指通常位于基因上游(朝向基因的5’区)并且对于启动和驱动基因转录是需要的DNA区域。启动子可容许它所控制的基因的正确激活或阻抑。启动子可含有被转录因子识别的特异性序列。这些因子可与启动子DNA序列结合，导致RNA聚合酶的募集，所述RNA聚合酶从基因的编码区合成RNA。启动子通常是指位于基因上游的所有基因调节元件，包括上游启动子、5’-UTR、内含子、和前导序列。
如本文中使用的，术语“上游启动子”是指足以指导转录起始的连续多核苷酸序列。如本文中使用的，上游启动子涵盖具有若干序列基序的转录起始位点，所述序列基序包括TATA盒、起始序列、TFIIB识别元件和其他启动子基序(Jennifer,E.F.等人，(2002)Genes&Dev.,16:2583-2592)。该上游启动子对RNA聚合酶II提供作用位点，所述RNA聚合酶II为具有像TFIIA、B、D、E、F和H的基础或通用转录因子的多亚基酶。这些因子组装成转录前起始复合物，所述转录前起始复合物催化从DNA模板到RNA的合成。
上游启动子的激活是通过另外的调节DNA序列元件的序列完成的，其中各种蛋白质结合到调节DNA序列元件上并且随后与转录起始复合物相互作用而激活基因表达。这些基因调节元件序列与特异性DNA结合因子相互作用。这些序列基序有时可称为顺式元件。组织特异性或发育特异性转录因子与之结合的这样的顺式元件可单独地或联合地在转录水平决定启动子的时空表达模式。这些顺式元件在它们在可操作连接的基因上发挥作用的控制类型方面变化很大。一些元件响应于环境反应(例如，温度、湿度、和伤害)起作用而增加可操作连接的基因的转录。其他的顺式元件可响应于发育线索(例如，萌发、种子成熟、和开花)或响应于空间信息(例如，组织特异性)。参见，例如，Langridge等人，(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:3219-23。这些顺式元件位于转录起始位点的不同距离，一些顺式元件(称作近端元件)邻近最小核心启动子区，而其他元件可定位在启动子(增强子)的上游或下游几千个碱基处。
“DNA结合转基因”是编码DNA结合蛋白的多核苷酸编码序列。随后，DNA结合蛋白能够结合到另一种分子上。结合蛋白可结合到，如，DNA分子(DNA结合蛋白)、RNA分子(RNA结合蛋白)和/或蛋白质分子(蛋白质结合蛋白)上。在蛋白质结合蛋白的情况下，它可与自身结合(形成同二聚体、同三聚体，等)和/或结合到一个或多个不同的蛋白质分子上。结合蛋白可具有超过一种类型的结合活性。如，锌指蛋白具有DNA结合、RNA结合和蛋白质结合的活性。
DNA结合蛋白的实例包括：大范围核酸酶、锌指、CRISPR和TALE结合结构域，其可被“工程化”为与预定的核苷酸序列结合。工程化的DNA结合蛋白(例如，锌指、CRISPR、或TALE)一般是非天然存在的蛋白质。用于工程化DNA结合蛋白的方法的非限制性实例是设计和选择。设计的DNA结合蛋白是非自然界产生的蛋白质，其设计/组成主要来自合理标准(rational criteria)。用于设计的合理标准包括应用替换原则和计算机化算法对存储已有ZFP、CRISPR、和/或TALE设计和结合数据的信息的数据库进行信息处理。参见，例如，美国专利6,140,081；6,453,242；和6,534,261；还参见WO 98/53058；WO 98/53059；WO 98/53060；WO 02/016536和WO 03/016496和美国公开文本Nos.20110301073、20110239315和20119145940。
“锌指DNA结合蛋白”(或结合结构域)是这样一种蛋白质，或更大的蛋白质内的域，其通过一个或多个锌指以序列特异性的方式结合DNA，所述锌指是结合结构域内的氨基酸序列区域，其结构通过与锌离子的配位而稳定。术语锌指DNA结合蛋白通常简称为锌指蛋白或ZFP。锌指结合结构域可被“工程化”为结合预定的核苷酸序列。用于工程化锌指蛋白的方法的非限制性实例是设计和选择。设计的锌指蛋白是非自然界产生的蛋白质，其设计/组成主要来自合理标准(rational criteria)。用于设计的合理的标准包括应用替换原则和计算机化算法对存储已有ZFP设计和结合数据的信息的数据库进行信息处理。参见，例如，美国专利Nos.6,140,081；6,453,242；6,534,261和6,794,136；还参见WO 98/53058；WO 98/53059；WO 98/53060；WO 02/016536和WO 03/016496。
在其他实例中，一种或多种核酸酶的DNA结合结构域包含天然存在的或工程化的(非天然存在的)TAL效应子DNA结合结构域。参见，例如，美国专利公开文本No.20110301073，通过提述将其完整并入本文。已知黄单胞菌属的植物病原菌在重要作物中引起许多疾病。黄单胞菌属的致病性依赖于保守的III型分泌(T3S)系统，其将25种以上不同的效应子蛋白注入植物细胞中。在这些注入的蛋白质中为转录激活子样(TALEN)效应子，其模拟植物转录激活子并操纵植物转录组(参见Kay等人，(2007)Science 318:648-651)。这些蛋白质含有DNA结合结构域和转录活化域。最充分表征的TAL效应子之一是来自野油菜黄单胞菌疱病致病变种的AvrBs3(参见Bonas等人，(1989)Mol Gen Genet 218:127-136和WO2010079430。TAL效应子含有串联重复序列的集中域，每个重复序列大致含34个氨基酸，所述氨基酸对于这些蛋白质的DNA结合特异性是关键的。另外，它们含有核定位序列和酸性转录活化域(对于评论参见Schornack S等人，(2006)J Plant Physiol 163(3):256-272)。另外，在植物病原细菌青枯劳尔氏菌中，已经发现命名为brg11和hpx17的两种基因与青枯劳尔氏菌生物型菌株GMI1000和生物型4菌株RS1000中的黄单胞菌属AvrBs3家族同源(参见Heuer等人，(2007)Appl and Enviro Micro 73(13):4379-4384)。这些基因在核苷酸序列上彼此具有98.9％的同一性，但是因在hpx17的重复域中的1,575bp的缺失而不同。然而，两种基因产物都具有与黄单胞菌属AvrBs3家族蛋白小于40％的序列同一性。参见，例如，美国专利公开文本No.20110301073，通过提述将其完整并入。
这些TAL效应子的特异性取决于在串联重复序列中发现的序列。重复序列大致包含102个bp，并且重复序列彼此之间一般具有91-100％的同源性(Bonas等人，同前)。重复序列的多态性常常位于位置12和13处，并且在位置12和13处的高变双残基的同一性与在TAL效应子的靶序列中的连续核苷酸的同一性之间，似乎存在着在一对一的对应关系(参见Moscou和Bogdanove，(2009)Science 326:1501和Boch等人，(2009)Science 326:1509-1512)。在实验上，已经确定了这些TAL效应子的DNA识别的天然密码，使得在位置12和13处的HD序列导致与胞嘧啶(C)结合，NG与T结合，NI与A、C、G或T结合，NN与A或G结合，并且ING与T结合。这些DNA结合重复序列已组装成具有新的重复序列组合和数目的蛋白质，从而产生能够与新的序列相互作用并激活植物细胞中的非内源报告基因表达的人工转录因子(Boch等人，同前)。工程化的TAL蛋白已经与FokI切割半结构域连接以产生在酵母报告基因测定(基于质粒的靶标)中表现出活性的TAL效应子结构域核酸酶融合(TALEN)。
CRISPR(成簇的规律间隔的短回文重复序列)/Cas(CRISPR相关的)核酸酶系统是基于可用于基因组工程化的细菌系统的最近工程化的核酸酶系统。其基于许多细菌和古细菌的适应性免疫应答的一部分。当病毒或质粒侵入细菌时，侵入菌的DNA片段通过‘免疫'应答转化为CRISPR RNA(crRNA)。然后，这种crRNA通过部分互补区域与另一类称为tracrRNA的RNA结合以将Cas9核酸酶引导至与称为“原型间隔序列”的靶DNA中的crRNA同源的区域。Cas9在由crRNA转录物中所含的20-核苷酸引导序列指定的位点处切割DNA以在DSB处产生平末端。Cas9需要crRNA和tracrRNA两者进行位点特异性DNA识别和切割。这种系统现已被工程化，使得crRNA和tracrRNA可结合成一个分子(“单个引导RNA”)，单个引导RNA的crRNA等效部分可经工程化以引导Cas9核酸酶靶向任何期望序列(参见Jinek等人，(2012)Science 337,816-821页，Jinek等人，(2013),eLife 2:e00471,和David Segal,(2013)eLife 2:e00563)。因此，CRISPR/Cas系统可经工程化以在基因组中的期望靶标处产生双链断裂(DSB)，并且可通过使用修复抑制剂影响DSB的修复而引起易错修复增加。
在其他实例中，DNA结合转基因为包含工程化的(非天然存在的)大范围核酸酶(也描述为归巢核酸内切酶)的位点特异性核酸酶。已知归巢核酸内切酶或大范围核酸酶(如I-SceI、I-CeuI、PI-PspI、PI-Sce、I-SceIV、I-CsmI、I-PanI、I-SceII、I-PpoI、I-SceIII、I-CreI、I-TevI、I-TevII和I-TevIII)的识别序列。还参见美国专利No.5,420,032；美国专利No.6,833,252；Belfort等人，(1997)Nucleic Acids Res.25:3379–30 3388；Dujon等人，(1989)Gene 82:115–118；Perler等人，(1994)Nucleic Acids Res.22,11127；Jasin(1996)Trends Genet.12:224–228；Gimble等人，(1996)J.Mol.Biol.263:163–180；Argast等人，(1998)J.Mol.Biol.280:345–353和New England Biolabs catalogue。此外，归巢核酸内切酶和大范围核酸酶的DNA结合特异性可工程化为结合非天然靶位点。参见，例如，Chevalier等人，(2002)Molec.Cell 10:895-905；Epinat等人，(2003)Nucleic Acids Res.5 31:2952-2962；Ashworth等人，(2006)Nature 441:656-659；Paques等人，(2007)Current GeneTherapy 7:49-66；美国专利公开No.20070117128。归巢核酸内切酶和大范围核酸酶的DNA结合结构域总的来说可在核酸酶的背景下予以改变(即，使得核酸酶包括同源切割结构域)或可融合至异源切割结构域。
如本文中使用的，术语“转化”涵盖可将核酸分子导入这种细胞中的所有技术。实例包括但不限于：用病毒载体转染；用质粒载体转化；电穿孔；脂质体转染；显微注射(Mueller等人，(1978)Cell 15:579-85)；土壤杆菌介导的转移；直接DNA摄取；WHISKERSTM介导的转化；和微粒轰击。这些技术可用于植物细胞的稳定转化和瞬时转化两者。术语“稳定转化”指将核酸片段导入宿主生物的基因组中，从而导致在遗传上稳定的遗传。一旦稳定转化，该核酸片段稳定整合到宿主生物和任何后续世代的基因组中。含有该转化的核酸片段的宿主生物被称为“转基因”生物。术语“瞬时转化”指将核酸片段导入宿主生物的细胞核、或含有DNA的细胞器中，从而导致不具备在遗传上稳定的遗传的基因表达。
如本文中使用的，术语“转导”是指病毒将核酸转移到细胞中的过程。
如本文中使用的，术语“转基因”是外源核酸序列。在一个实例中，转基因是基因序列(例如，除草剂抗性基因)、编码工业或药学上有用的化合物的基因、或编码期望的农业性状的基因。在又另一个实例中，转基因为小RNA，例如反义核酸序列，其中小RNA序列的表达抑制靶核酸序列的表达。转基因可含有与该转基因可操作连接的调节序列(例如，启动子、内含子、或3’-UTR)。在一些实施方案中，感兴趣的核酸为转基因。然而，在其他实施方案中，感兴趣的核酸为内源核酸，其中所述内源核酸的额外基因组拷贝是期望的，或者为相对于宿主生物中的靶核酸序列处于反义取向的核酸。
如本文中使用的，术语“小RNA”是指几类非编码核醣核酸(ncRNA)。术语小RNA描述了在细菌细胞、动物、植物、和真菌中产生的短链ncRNA。这些短链ncRNA可在细胞中天然产生或可以通过导入表达短链ncRNA的外源序列而产生。小RNA序列不直接编码蛋白质，并且与其他RNA在功能上不同之处在于，小RNA序列仅仅被转录而不被翻译。小RNA序列涉及其他细胞功能，包括基因表达和修饰。小RNA分子常常由约20个到30个核苷酸构成。小RNA序列可衍生自较长的前体。所述前体形成在自身互补区中彼此折回的结构；然后它们被动物体内的核酸酶Dicer或植物中的DCL1加工。
许多类型的小RNA天然存在或人工产生，包括microRNA(miRNA)、短干扰RNA(siRNA)、反义RNA、短发夹RNA(shRNA)、和小核仁RNA(snoRNA)。某些类型的小RNA，如microRNA和siRNA在基因沉默和RNA干扰(RNAi)中是重要的。基因沉默是其中通常表达的基因被细胞内元件(在这种情况下为小RNA)“关闭”的遗传调节过程。通常经由此遗传信息形成的蛋白质由于干扰而未形成，并且在该基因中编码的信息被阻断表达。
如本文中使用的，术语“小RNA”涵盖RNA分子，其在文献中被描述为“极小RNA”(Storz,(2002)Science 296:1260-3；Illangasekare等人，(1999)RNA 5:1482-1489)；原核“小RNA”(sRNA)(Wassarman等人，(1999)Trends Microbiol.7:37-45)；真核“非编码RNA(ncRNA)”；“微RNA(miRNA)”；“小非mRNA(snmRNA)”；“功能RNA(fRNA)”；转运RNA(tRNA)”；“催化RNA”[例如，核酶，包括自身酰化核酶(Illangaskare等人，(1999)RNA 5:1482-1489)；“小核仁RNA(snoRNA)”；“tmRNA”(又名“10S RNA”,Muto等人，(1998)Trends Biochem Sci.23:25-29；和Gillet等人，(2001)Mol Microbiol.42:879-885)；RNAi分子，包括但不限于“小干扰RNA(siRNA)”、“核酸内切酶制备的siRNA(e-siRNA)”、“短发夹RNA(shRNA)”、和“时序调节小RNA(stRNA)”；“dicer酶切的siRNA(d-siRNA)”、以及包含至少一个尿嘧啶碱基的适体、寡核苷酸和其他合成核酸。
如本文中使用的，术语“载体”是指当被导入细胞中时，由此产生转化细胞的核酸分子。载体可以包含允许其在宿主细胞中复制的核酸序列，诸如复制起点。实例包括但不限于质粒、粘粒、噬菌体、细菌人工染色体(BAC)、或携带外源DNA进入细胞的病毒。载体还可包括一个或多个基因、反义分子、和/或选择标志物基因和本领域已知的其他遗传元件。载体可以转导、转化或感染细胞，由此引起细胞表达核酸分子和/或由该载体编码的蛋白质。任选地，载体可包括辅助核酸分子实现进入细胞中的物质(例如，脂质体)。
如本文中使用的，术语“盒”、“表达盒”和“基因表达盒”是指可在特异的限制性位点或通过同源重组插入核酸或多核苷酸中的DNA区段。DNA区段包括含编码小RNA或感兴趣多肽的感兴趣基因的多核苷酸，所述盒和限制性位点被设计为确保所述盒插入用于转录和翻译的正确阅读框中。在一个实施方案中，表达盒可包含编码小RNA或感兴趣多肽的多核苷酸，并且具有除了所述多核苷酸之外的便于特定宿主细胞转化的元件。在一个实施方案中，基因表达盒还可包括允许小RNA或编码感兴趣多肽的多核苷酸在宿主细胞中增强表达的元件。这些元件可包括但不限于：启动子、最小启动子、增强子、反应元件、内含子、5’非翻译区序列、3’非翻译区序列、终止子序列、多聚腺苷酸化序列等。
如本文中使用的，术语“异源编码序列”用于指示通常在宿主生物中不存在并在适当条件下可在宿主细胞中表达的编码或最终编码肽或蛋白质或其等效氨基酸序列(例如酶)的任何多核苷酸。正因为如此，“异源编码序列”可包括通常在宿主细胞中不存在的编码序列的一个或多个另外的拷贝，使得该细胞表达通常在细胞中不存在的编码序列的另外的拷贝。异源编码序列可以是RNA或其任何类型(例如，mRNA)、DNA或其任何类型(例如,cDNA)、或RNA/DNA杂交体。编码序列的实例包括但不限于，包括诸如编码序列、内含子、启动子区、5’-UTR、3’-UTR、和增强子区之类的特征的全长转录单单位。
“异源编码序列”还包括肽或酶的编码部分，即，肽或酶的cDNA或mRNA序列，以及全长转录单位的编码部分，即，包含内含子和外显子的基因，以及编码酶或编码其等效氨基酸序列的“密码子优化的”序列、截短序列或其他形式的改变序列，前提是等效氨基酸序列产生功能蛋白。这样的等效氨基酸序列可具有一个或多个氨基酸缺失，其中该缺失在N端、C端或内部。设想了截短形式，只要它们具有本文中指示的催化能力即可。
如本文中使用的，术语“对照”是指在用于比较目的的分析程序中使用的样品。对照可为“阳性”或“阴性”。例如，在分析程序的目的为检测细胞或组织中的差异表达的转录物或多肽的情况下，通常优选包括阳性对照，例如来自展现出期望表达的已知植物的样品，以及阴性对照，例如来自缺乏期望表达的已知植物的样品。
如本文中使用的，术语“植物”包括植物和植物部分，包括但不限于，植物细胞和植物组织，如叶、茎、根、花、花粉、和种子。可用于本发明中的植物类别通常宽泛地为适合于诱变的高等和低等植物类别，包括被子植物、裸子植物、蕨类和多细胞藻类。因此，“植物”包括双子叶和单子叶植物。双子叶植物的实例包括烟草、拟南芥、大豆、番茄、木瓜、芥花(canola)、向日葵、棉花、苜蓿、马铃薯、葡萄、木豆、豌豆、芸苔属植物、鹰嘴豆、糖用甜菜、油菜、西瓜、甜瓜、胡椒、花生、南瓜(pumpkin)、萝卜、菠菜、倭瓜(squash)、绿花椰菜、卷心菜、胡萝卜、花椰菜、芹菜、大白菜、黄瓜、茄子、和莴苣。单子叶植物的实例包括玉米、水稻、小麦、甘蔗、大麦、黑麦、高粱、兰花、竹子、香蕉、香蒲、百合、燕麦、洋葱、小米、和黑小麦。
如本文中使用的，术语“植物材料”是指叶、茎、根、花或花的部分、果实、花粉、卵细胞、接合子、种子、插条、细胞或组织培养物、或一种植物的任何其他部分或产物。在一个实施方案中，植物材料包括子叶和叶。在一个实施方案中，植物材料包括根组织和位于地下的其他植物组织。
如本文中使用的，术语“选择标志物基因”是指任选地在植物转化中使用的基因，以便例如保护植物细胞免受选择剂的影响或提供针对选择剂的抗性/耐受性。另外，“选择标志物基因”意味着涵盖报告基因。只有那些接收功能性选择标志物的细胞或植物才能在具有选择剂的条件下分裂或生长。选择剂的实例可以包括，例如包括大观霉素、新霉素、卡那霉素、巴龙霉素、庆大霉素、和潮霉素之类的抗生素。这些选择标志物包括表达赋予抗生素卡那霉素抗性的酶的针对新霉素磷酸转移酶的基因(npt II)，和针对有关抗生素新霉素、巴龙霉素、庆大霉素和G418的基因，或表达赋予潮霉素抗性的酶的针对潮霉素磷酸转移酶的基因(hpt)。其他选择标志物基因可以包括编码除草剂抗性的基因，包括bar或pat(针对草胺磷或膦丝菌素的抗性)、乙酰乳酸合酶(ALS，针对抑制剂诸如磺酰脲类(SU)、咪唑啉酮类(IMI)、三唑并嘧啶类(TP)、嘧啶氧基苯甲酸类(POB)、和阻止支链氨基酸合成第一步的磺酰基氨基羰基三唑啉酮类的抗性)、草甘膦、2,4-D、和金属抗性或敏感性。可用作选择标志物基因的“报告基因”的实例包括表达的报告基因蛋白的视觉观察，所述报告基因蛋白例如编码的蛋白质：β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)、萤光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、DsRed、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、碱性磷酸酶等。短语“标志物阳性”是指已经被转化而包含选择标志物基因的植物。
如本文中使用的，术语“可检测标志物”是指能够检测的标记，例如放射性同位素、荧光化合物、生物发光化合物、化学发光化合物、金属螫合剂、或酶。可检测标志物的实例包括但不限于下列各项：荧光标记(例如，FITC、罗丹明、镧系磷光体)、酶标记(例如，辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶)、化学发光标记、生物素基；由次级报道分子识别的预定多肽表位(例如，亮氨酸拉链对序列、第二抗体的结合位点、金属结合结构域、表位标签)。在一个实施方案中，可检测标志物可通过不同长度的间隔臂附接，以降低潜在的空间位阻。
如本文中使用的，术语“检测”在最广义上用来包括特异性分子的定性和定量测量两者，例如特异性多肽的测量。
除非另外特别地解释，本文中使用的全部技术术语和科学术语具有与属于本公开的领域之内的普通技术人员通常所理解的相同的含义。可以在以下出版物中找到分子生物学中常见术语的定义：例如，Lewin,Genes V,Oxford University Press,1994；Kendrew等人(编)，The Encyclopedia of Molecular Biology,Blackwell Science Ltd.,1994；和Meyers(编)，Molecular Biology and Biotechnology:A Comprehensive DeskReference,VCH Publishers,Inc.,1995。
调节元件
用于基础研究或生物技术应用的植物启动子通常是单向的，仅指导融合在其3’端(下游)的转基因的表达。代谢工程和性状叠加常常有必要在植物内强表达转基因。另外，在转基因作物中一般需要多个新颖的启动子来驱动多个基因的表达。在本文中公开了嵌合启动子，它可指导已融合在其3’端(下游)的转基因的表达。
转基因产品的开发变得日益复杂，这需要强表达转基因以及将多个转基因叠加在单基因座中。传统上，每个转基因需要用于表达的独特启动子，其中需要多个启动子来表达一个基因叠加中的不同转基因。随着基因叠加的大小增加，这往往导致为了获得用于表达单个多基因性状的不同转基因的表达模式的相似水平而重复使用相同的启动子。已知由相同启动子驱动的多基因构建体引起基因沉默，从而在该领域产生不十分有效的转基因产品。由于启动子重复导致的转录因子(TF)结合位点的过量可引起内源TFs的消耗，从而导致转录失活。转基因的沉默将很可能不良地影响产生的转基因植物表达转基因的性能。转基因内的重复序列可引起导致多核苷酸重排的基因座内(intra-locus)同源重组。
组织特异性(即，组织优选的)或器官特异性启动子驱动某些组织中(如植物的籽粒、根、叶或绒毡层中)的基因表达。组织和发育阶段特异性启动子驱动在植物发育过程中在特定时期或特定组织中表达的基因的表达。组织特异性启动子在转基因植物行业中对于某些应用是需要的和期望的，因为它们允许异源基因以组织和/或发育阶段选择性方式特异性表达，表明异源基因在各个器官、组织和/或时间有差别地表达，而非其他。例如，可以借助于土传病原体通过用病原体抗性基因转化植物基因组使得病原体抗性蛋白在植物根内强表达而实现植物对感染的抵抗力增加。或者，可能希望在处于特定的生长或发育阶段(例如像细胞分裂或伸长)的植物组织中表达转基因。另一种应用是使用组织特异性启动子的需要，例如，使得将编码农艺性状的转基因的表达局限在发育的木质部中。在组织特异性启动子的鉴定中保留的一个特殊问题是怎样鉴定可能最重要的基因及其相应启动子，以及怎样使这些与细胞的具体发育特性相关。另一个问题是克隆全部有关的顺式作用转录控制元件，使得克隆的DNA片段以想要的具体表达模式驱动转录。一个特殊的问题是鉴定与具体细胞类型、发育阶段和/或不表达于其他植物组织中的植物中的功能有关的组织特异性启动子。
还可通过位于启动子序列下游的内含子和5’-UTR区来调节转基因表达。包含与内含子、和5’–UTR可操作连接的上游启动子的嵌合启动子可调节转基因表达。上游启动子对于驱动转录是必要的，而内含子和5’-UTR的存在能增加表达水平，从而产生用于翻译和蛋白质合成的mRNA转录物。向上游启动子多核苷酸序列添加内含子和5’–UTR可辅助转基因的稳定表达。
提供了使用嵌合启动子基因调节元件来在植物中表达转基因的方法和构建体，所述嵌合启动子基因调节元件包含：来自玉米过氧化物酶5的上游启动子，随后为玉米醇脱氢酶(I)、内含子6和玉米线条病毒5’–UTR(例如，前导序列)。在一个实施方案中，嵌合启动子可以是：
ACCACTGTTGTAACTTGTAAGCCACTAGCTCACGTTCTCCATGAGCTCTTCTCTCTGCTGTTTCTTCCTCTGCTAACTGCGTTATGATATGACGTCGTATAAATAATCTCACAATACTTCCTTATTTTCAGCATGGCCTCTTTTATGTTTATTTAACAGTAGCAACCAACGCCGCTCGATGTTTCCTTCAAGAAACGGCCACTCACTATGTGGTGTGCAGAAGAACAAATGTAAGCAGCTCCTACAGGTACCAGTAGTCATGTCAGTGTGGAAGCTTTCCAACCAACGCCTCCTTCGAGGAACCTGGTCGTGCTGACATGAATGTAGGCCATGCAAGCACAAGCACCTAACGCGAATCATCACGACGCGCCGTGTACTGGGCGTTGGTACATCACACCCCGCGTTTGACCTGATCGGAAGCATGCGTGTGTGTTGGCTGCAGGACCGGCTATAGGTTTCCTGCATTGGACAGCAGAAGCCAGTCATGTTAGGCACTCACGCGCTCCTGCCGTTTGATGAATCATCCGGTCTTTCGTATTGATCACTAGTTCACTACGCTGATATAGCAAATTTTAAGATGTGAAACCACGAGACGAGCGATAAATCTTAGACGTTACCTATCCATATGAAGCTTGTGCGAAAAAAAGGCGTGCCGCTGTAGCATCATTCGTATACACTTTTGTCCCCAAAGACAGGGATACGAATCCATGCTCGACAGAACCCTCCCTTCCCTGCAGATAACGACACTTAAGTATAACAAAAGTAGTTGGATTATTTCAGAAGCAAAATCTCACTTTTCGCTGGCCTTTTTGTACTTTGGTTACTTGAGTTCAGACAGTGTATGCTATATTGTCATGTGCTGCGTAAGGTTTAAATATGGTTCGACAAATATATCAGTATATCACTACTTTGTTATGGGTGGGGCCTAGCACAAACTTGATACAGCTAGGATAAAGTTAGAACGATGACTGATCTACTGTAAAGCGACACCTGTCCTGTTATGGTAGTTTAAGTCCATTCCTGGACGACTCCAGATCCAGGATATGATGCTGTTACATAATGCGATTGTTCACAATAAAATTGCATGATGTTCTTCTACTCTTTAGGCAGTTTTGTTCAACAGGCAAGTTGCATAATGCATGTGCATATATGAGCAGCATAATCATCAATTAATCATAGGTTCGTCATTTTAGTTTCACTCCTTCACATTATTCCAGCCCTTGAAGAAAAATGTAGCAGTGCTTGCTGTTTAATAAGTGGCAGAGCTGTTTTCACTCCACCTACGCTTGTCTAGGACCAAAATTTTAATCTGTCACTTTGAGCTAAAACTGAAGCACCAAACCGCTACAAAAGAACGTAGGAGCTGAATTGTAACTTGATGGGATTACTATAGCAGTTGCTACAGTTCTAGCTAGCTACCTTATTCTATACGCATCACCCTAACAACCCGGCTGACTGCTGCATCTGACCCCACCGTCCCCTGCTCCAAACCAACTCTCCTTTCCTTGCATGCACTACACCCACTTCCTGCAGCTATATATACCACCATATGCCCATCTTATGAAACCATCCACAAGAGGAGAAGAAACAATCAACCAGCAACACTCTTCTCTTATAACATAGTACAGCGAAGGTAACTCACGGTACCCTGAAGGCTCGACAAGGCAGTCCACGGAGGAGCTGATATTTGGTGGACAAGCTGTGGATAGGAGCAACCCTATCCCTAATATACCAGCACCACCAAGTCAGGGCAATCCCCAGATCACCCCAGCAGATTCGAAGAAGGTACAGTACACACACATGTATATATGTATGATGTATCCCTTCGATCGAAGGCATGCCTTGGTATAATCACTGAGTAGTCATTTTATTACTTTGTTTTGACAAGTCAGTAGTTCATCCATTTGTCCCATTTTTTCAGCTTGGAAGTTTGGTTGCACTGGCCTTGGTCTAATAACTGAGTAGTCATTTTATTACGTTGTTTCGACAAGTCAGTAGCTCATCCATCTGTCCCATTTTTTCAGCTAGGAAGTTTGGTTGCACTGGCCTTGGACTAATAACTGATTAGTCATTTTATTACATTGTTTCGACAAGTCAGTAGCTCATCCATCTGTCCCATTTTTCAGCTAGGAAGTTCGGATCTGGGGCCATTTGTTCCAGGCACGGGATAAGCATTCAG(SEQ ID NO:1)
的启动子。
在一个实施方案中，基因表达盒包含启动子。在一个实施方案中，启动子可以是本主题公开的嵌合启动子。在一个实施方案中，基因表达盒包含启动子，其中该启动子与SEQID NO:1至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.8％、或100％相同。在一个实施方案中，基因表达盒包含与转基因可操作连接的嵌合启动子。在一个实施方案中，包含该嵌合启动子的基因表达盒可驱动两个或更多个转基因的表达。在一个示例性实施方案中，基因表达盒包含与转基因可操作连接的嵌合启动子，其中所述转基因可以是杀虫剂抗性转基因、除草剂耐受性转基因、氮利用效率转基因、水分利用效率转基因、营养品质转基因、DNA结合转基因、选择标志物转基因、或它们的组合。
选择标志物
各种选择标志物，亦可表述为报告基因，可以纳入选定的表达载体中，以便为鉴定和选择转化的植物(转化体)创造条件。有许多方法可以用于确认选择标志物在转化植物中表达，例如包括DNA测序和PCR(聚合酶链反应)、Southern印迹法、RNA印迹法、用于检测从载体中表达出来的蛋白质的免疫学方法，所述蛋白质例如介导膦丝菌素抗性的沉淀蛋白质，或其他蛋白质的视觉观察，所述其他蛋白质如报告基因编码的β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)、萤光素酶、绿色荧光蛋白(GFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、DsRed、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、碱性磷酸酶，等(参见Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Third Edition,Cold Spring Harbor Press,N.Y.,2001，其全部内容通过提述并入本文)。
利用选择标志物基因来选择转化的细胞或组织。选择标志物基因包括编码抗生素抗性的基因，例如编码新霉素磷酸转移酶II(NEO)和潮霉素磷酸转移酶(HPT)的那些基因，以及赋予对除草化合物的抗性的基因。除草剂抗性基因通常编码对该除草剂不敏感的修饰的靶蛋白或编码在植物中在该除草剂能够起作用之前降解或将该除草剂脱毒的酶。例如，通过使用编码突变体靶酶5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)的基因，已获得对草甘膦的抗性。针对EPSPS的基因和突变体是熟知的，并且在下文进一步描述。已经通过使用编码使对应的除草剂脱毒的pat或DSM-2、腈水解酶、aad-1或aad-12基因的细菌基因获得了对草铵膦、溴苯腈、以及2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)的抗性。
在一个实施方案中，除草剂可以抑制生长点或分生组织，所述除草剂包括包括咪唑啉酮或磺酰脲，并且针对这些除草剂的乙酰羟酸合酶(AHAS)和乙酰乳酸合酶(ALS)的抗性/耐受性的基因是熟知的。草甘膦抗性基因分别包括突变体5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSP)和dgt-28基因(经由导入重组核酸和/或天然EPSP基因的各种形式的体内诱变)、aroA基因和草甘膦乙酰转移酶(GAT)基因)。其他膦酰基化合物的抗性基因包括来自链霉菌属物种(包括吸水链霉菌和绿色产色链霉菌)的bar基因、以及吡啶氧基或苯氧基丙酸和环己酮(ACC酶抑制剂编码基因)。赋予对环己二酮和/或芳氧基苯氧基丙酸(包括氟吡甲禾灵、禾草灵、精恶唑禾草灵、吡氟禾草灵、喹禾灵)抗性的示例性基因包括乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)基因，--Acc1-S1、Acc1-S2和Acc1-S3。在一个实施方案中，除草剂可以抑制光合作用，包括三嗪(psbA和1s+基因)或苄腈(腈水解酶基因)。
在一个实施方案中，选择标志物基因包括但不限于，编码下列物质的基因：新霉素磷酸转移酶II；氰酰胺水合酶；天冬氨酸激酶；二氢吡啶二羧酸合成酶；色氨酸脱羧酶；二氢吡啶二羧酸合成酶和脱敏型天冬氨酸激酶；bar基因；色氨酸脱羧酶；新霉素磷酸转移酶(NEO)；潮霉素磷酸转移酶(HPT或HYG)；二氢叶酸还原酶(DHFR)；膦丝菌素乙酰转移酶；2,2-二氯丙酸脱卤酶；乙酰羟酸合酶；5-烯醇丙酮酰-莽草酸-磷酸合酶(aroA)；卤代芳基腈水解酶；乙酰辅酶A羧化酶；二氢蝶酸合酶(sul I)；和32kD光合体系II多肽(psbA)。
一个实施方案还包括编码对下列物质的抗性的基因：氯霉素；甲氨蝶呤；潮霉素；大观霉素；溴苯腈；草甘膦；和膦丝菌素。
以上列出的选择标志物基因并非意味着限制。本发明涵盖任何报告基因或选择标志物基因。
设计选择标志物基因以便在植物中优化表达。例如，在一个实施方案中，基因的编码序列已通过密码子优化进行修饰，以增强在植物中的表达。选择标志物基因可以被优化用于在特定的植物物种中表达或可替代地被修饰以用于在双子叶或单子叶植物中优化表达。根据以最大量表达在感兴趣的特定植物物种中的蛋白质中最高频率的密码子，可以确定植物优选的密码子。在一个实施方案中，选择标志物基因被设计为以较高水平在植物中表达，从而导致较高的转化效率。用于基因的植物优化的方法是熟知的。关于合成的多核苷酸序列的优化和制造的指南可例如在WO2013016546、WO2011146524、WO1997013402、美国专利No.6166302、美国专利No.5,380,831中找到，将其通过提述并入本文。
转基因
公开的方法和组合物可用于在植物基因组中表达多核苷酸基因序列。因此，可通过植物启动子驱动编码除草剂耐受性、抗虫性、养分、抗生素或其他治疗分子的基因的表达。
在一个实施方案中，本主题公开的嵌合调节元件与编码多核苷酸序列的基因结合或可操作连接，所述多核苷酸序列提供对草甘膦或另一种除草剂的抗性或耐受性的，和/或提供选择昆虫或疾病的抗性和/或营养增强、和/或改进的农艺性状、和/或在饲料、食品、工业、制药或其他用途中有用的蛋白质或其他产品。转基因可与植物基因组内的两个或更多个感兴趣的核酸序列“堆叠”。堆叠可例如通过使用两个或更多个事件的常规植物育种、用含有感兴趣的序列的构建体转化植物、转基因植物的再转化、或者经由同源重组通过靶向整合添加新的性状来实现。
这样的感兴趣的多核苷酸序列包括但不限于以下提供的那些实例：
1.赋予害虫或疾病抗性的基因或编码序列(例如iRNA)
(A)植物疾病抗性基因。植物防御经常通过植物中疾病抗性基因(R)的产物与病原体中相应的无毒性(Avr)基因的产物的特异相互作用而被激活。可以用克隆的抗性基因转化植物品种，从而工程构建对特定病原体株有抗性的植物。这些基因的实例包括：提供黄枝孢霉(Cladosporium fulvum)抗性的番茄Cf-9基因(Jones等人，1994 Science 266:789)，提供丁香假单胞杆菌番茄致病变种抗性的番茄Pto基因，其编码蛋白激酶(Martin等人，1993 Science 262:1432)，和提供丁香假单胞菌抗性的拟南芥RSSP2基因(Mindrinos等人，1994 Cell 78:1089)。
(B)苏云金芽孢杆菌蛋白、其衍生物或以其为模本的合成多肽，例如Btδ-内毒素基因的核苷酸序列(Geiser等人，1986 Gene 48:109)和营养杀虫(VIP)基因(参见，例如，Estruch等人，(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.93:5389-94)。而且，编码δ-内毒素基因的DNA分子可以从美国典型培养物保藏中心(Rockville,Md.)购得，ATCC登录号为40098、67136、31995和31998。
(C)凝集素，例如几种君子兰(Clivia miniata)甘露糖结合凝集素基因的核苷酸序列(Van Damme等人，1994 Plant Molec.Biol.24:825)。
(D)维生素结合蛋白，例如用作对抗昆虫害虫的杀幼虫剂的亲和素和亲和素同源物。参见美国专利No.5,659,026。
(E)酶抑制剂，例如，蛋白酶抑制剂或淀粉酶抑制剂。这些基因的实例包括水稻半胱氨酸蛋白质酶抑制剂(Abe等人，1987 J.Biol.Chem.262:16793)、烟草蛋白酶抑制剂I(Huub等人，1993 Plant Molec.Biol.21:985)、和α-淀粉酶抑制剂(Sumitani等人，1993Biosci.Biotech.Biochem.57:1243)。
(F)昆虫特异性激素或信息素，如蜕皮激素和保幼激素或其变体，在其基础上的模拟物或其拮抗剂或激动剂，如克隆的保幼激素酯酶的杆状病毒表达、保幼激素失活剂(Hammock等人，1990 Nature 344:458)。
(G)昆虫特异性肽或神经肽，其在表达后破坏受影响害虫的生理机能(J.Biol.Chem.269:9)。这些基因的实例包括昆虫利尿激素受体(Regan,1994)，在太平洋折翅蠊(Diploptera punctata)中鉴定的咽侧体抑制素(allostatin)(Pratt,1989)，和昆虫特异性麻痹神经毒素(美国专利No.5,266,361)。
(H)在自然界中由蛇、黄蜂等等产生的昆虫特异性毒液，例如蝎昆虫毒性肽(scorpion insectotoxic peptide)(Pang,1992 Gene 116:165)。
(I)负责超积累单萜、倍半萜、类固醇、异羟肟酸、类苯丙烷衍生物、或另一种具有杀昆虫活性的非蛋白质分子的酶。
(J)涉及生物学活性分子的修饰(包括翻译后修饰)的酶，例如，糖酵解酶、蛋白水解酶、脂肪分解酶、核酸酶、环化酶、转氨酶、酯酶、水解酶、磷酸酶、激酶、磷酸化酶、聚合酶、弹性蛋白酶、几丁质酶和葡聚糖酶(不管是天然的还是合成的)。这些基因的实例包括马蹄莲(callas)基因(PCT公开的申请WO 93/02197)、几丁质酶编码序列(其可以从例如ATCC以登录号3999637和67152获得)、烟草钩虫几丁质酶(Kramer等人，1993 InsectMolec.Biol.23:691)、和欧芹ubi4-2多聚泛素基因(Kawalleck等人，1993 PlantMolec.Biol.21:673)。
(K)刺激信号转导的分子。这些分子的实例包括绿豆钙调蛋白cDNA克隆的核苷酸序列(Botella等人，1994 Plant Molec.Biol.24:757)和玉米钙调蛋白cDNA克隆的核苷酸序列(Griess等人，1994 Plant Physiol.104:1467)。
(L)疏水矩肽。参见美国专利Nos.5,659,026和5,607,914，后者教导了赋予疾病抗性的合成抗微生物肽。
(M)膜通透酶，为通道离子载体(channel former)或通道阻滞剂，例如杀菌肽-β裂解肽类似物(Jaynes等人，1993 Plant Sci.89:43)，其赋予转基因烟草植物针对青枯假单胞菌(Pseudomonas solanacearum)的抗性。
(N)病毒侵入性蛋白或从其衍生的复合毒素。例如，在经转化的植物细胞中，病毒衣壳蛋白的积累可赋予针对该衣壳蛋白所来源的病毒以及相关病毒所致的病毒感染和/或疾病发展的抗性。已经给转化植物赋予了衣壳蛋白介导的针对苜蓿花叶病毒、黄瓜花叶病毒、烟草条纹病毒、马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒、烟草蚀纹病毒、烟草脆裂病毒和烟草花叶病毒的抗性。参见，例如，Beachy等人(1990)Ann.Rev.Phytopathol.28:451。
(O)昆虫特异性抗体或从其衍生的免疫毒素。因而，在昆虫肠中靶向关键代谢功能的抗体将会使受影响的酶失活，从而杀死昆虫。例如，Taylor等人(1994)，在第七届国际分子植物-微生物相互作用研讨会(Seventh Int'l.Symposium on Molecular PlantMicrobe Interactions)上的第497号摘要显示了转基因烟草中通过产生单链抗体片段的酶失活。
(P)病毒特异性抗体。参见，例如，Tavladoraki等人，(1993)Nature 266:469，其显示了表达重组抗体基因的转基因植物被保护免于病毒攻击。
(Q)在自然界中由病原体或寄生虫产生的发育阻滞蛋白。因而，真菌内切α-1,4-D多聚半乳糖醛酸酶通过溶解植物细胞壁同-α-1,4-D-半乳糖醛酸酶而促进真菌定植和植物营养素释放(Lamb等人，1992)Bio/Technology 10:1436。编码抑制豆多聚半乳糖醛酸内切酶的蛋白质的基因的克隆和表征描述于Toubart等人(1992Plant J.2:367)。
(R)在自然界中由植物产生的发育阻滞蛋白，例如提供增加的针对真菌病的抗性的大麦核糖体失活基因(Longemann等人，1992).Bio/Technology 10:3305。
(S)RNA干扰，其中用RNA分子抑制靶基因的表达。一个实施例中的RNA分子是部分或完全双链的，其触发沉默响应，导致dsRNA被切割成小的干扰RNA，它们随后被纳入到靶向复合体中，靶向复合体破坏同源的mRNA。参见，例如，Fire等人，美国专利6,506,559；Graham等人，6,573,099。
2.赋予除草剂抗性的基因
(A)编码针对抑制生长点或分生组织的除草剂例如咪唑啉酮(imidazalinone)、磺酰苯胺或磺酰脲除草剂的抗性或耐受性的基因。这类基因的实例编码突变体乙酰乳酸合酶(ALS)(Lee等人，1988 EMBOJ.7:1241)，其也被称作乙酰羟酸合酶(AHAS)酶(Miki等人，1990Theor.Appl.Genet.80:449)。
(B)一种或多种另外的编码针对草甘膦抗性或耐受性的基因，所述抗性或耐受性是由突变体EPSP合酶和aroA基因赋予的，或者是通过基因如DGT-28、2mEPSPS、GAT(草甘膦乙酰转移酶)或GOX(草甘膦氧化酶)和其他膦酰基化合物，如草铵膦(pat、bar、和dsm-2基因)，和芳氧基苯氧基丙酸和环己二酮(ACC酶抑制剂编码基因)所致的代谢失活而获得的。参见，例如，美国专利No.4,940,835，其公开了可赋予草甘膦抗性的EPSP形式的核苷酸序列。编码突变体aroA基因的DNA分子能够以ATCC登录号39256获得，并且所述突变体基因的核苷酸序列在美国专利No.4,769,061中公开。欧洲专利申请No.0 333 033和美国专利No.4,975,374公开了可赋予除草剂如L-膦丝菌素抗性的谷氨酰胺合成酶基因的核苷酸序列。在欧洲申请No.0 242 246中提供了膦丝菌素乙酰转移酶基因的核苷酸序列。De Greef等人(1989)Bio/Technology 7:61中描述了表达编码膦丝菌素乙酰转移酶活性的嵌合bar基因的转基因植物的产生。赋予针对芳氧基苯氧基丙酸和环己二酮如稀禾定和甲禾灵(haloxyfop)的抗性的示例性基因是Accl-S1、Accl-S2和Accl-S3基因，如Marshall等人在(1992)Theor.Appl.Genet.83:435中所述。
(C)编码针对抑制光合作用的除草剂如三嗪(psbA基因和gs+基因)和苄腈(腈水解酶基因)的抗性或耐受性的基因。Przibilla等人在(1991)Plant Cell 3:169描述了编码转化衣藻属(Chlamydomonas)的突变体psbA基因的质粒的用途。在美国专利No.4,810,648中公开了腈水解酶基因的核苷酸序列，含有这些基因的DNA分子可以通过ATCC登录号53435、67441和67442获得。Hayes等人(1992)在Biochem.J.285:173中描述了编码谷胱甘肽S-转移酶的DNA的克隆和表达。
(D)编码针对可结合羟基苯丙酮酸双加氧酶(HPPD)的除草剂的抗性或耐受性的基因，HPPD是催化对-羟基苯丙酮酸(HPP)转化形成尿黑酸的反应的酶。这包括例如异噁唑(EP418175、EP470856、EP487352、EP527036、EP560482、EP682659、美国专利No.5,424,276)，特别是异噁唑草酮，其为玉米的选择性除草剂，二酮腈(diketonitrile)(EP496630、EP496631)，特别是2-氰基-3-环丙基-1-(2-SO2CH3-4-CF3苯基)丙烷-1,3-二酮和2-氰基-3-环丙基-1-(2-SO2CH3-4-2,3Cl2苯基)丙烷-1,3-二酮，三酮类(EP625505、EP625508、美国专利No.5,506,195)，特别是磺草酮、和吡唑特(pyrazolinate)等除草剂。在植物中产生过量HPPD的基因能够提供针对这些除草剂的耐受性或抗性，包括例如美国专利Nos.6,268,549和6,245,968和美国专利申请公开文本No.20030066102中描述的基因。
(E)编码针对苯氧基生长素除草剂，如2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)的抗性或耐受性的基因，其也可以赋予针对芳氧基苯氧基丙酸类(AOPP)除草剂的抗性或耐受性。这些基因的实例包括α-酮戊二酸依赖性双加氧酶(aad-1)基因，如美国专利No.7,838,733所述。
(F)编码针对苯氧基生长素除草剂例如2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)的抗性或耐受性并且也可以赋予针对吡啶氧基生长素除草剂例如氟草烟或绿草定的抗性和耐受性的基因。这些基因的实例包括α-酮戊二酸依赖性双加氧酶(aad-12)基因，如WO 2007/053482 A2中所述。
(G)编码针对麦草畏的抗性或耐受性的基因(参见，例如美国专利公开文本No.20030135879)。
(H)编码针对抑制原卟啉原氧化酶(PPO)的除草剂的抗性或耐受性的基因(参见美国专利No.5,767,373)。
(I)提供针对可结合光系统II反应中心(PS II)核心蛋白的三嗪除草剂(例如阿特拉津)和尿素衍生物(如敌草隆)除草剂的抗性或耐受性的基因(参见Brussian等人，(1989)EMBO J.1989,8(4):1237-1245)。
3.赋予或贡献增值性状的基因
(A)修饰的脂肪酸代谢，例如通过用反义基因或硬脂酰-ACP去饱和酶转化玉米或芸苔属植物从而增加植物的硬脂酸含量(Knultzon等人，1992)Proc.Nat.Acad.Sci.USA89:2624。
(B)降低的植酸含量
(1)导入植酸酶编码基因，例如黑曲霉植酸酶基因(Van Hartingsveldt等人，1993Gene 127:87)，增强了植酸盐的分解，从而向转化的植物添加更多的游离磷酸盐。
(2)可导入降低植酸含量的基因。在玉米中，这可以通过，例如，克隆然后重新导入与单个等位基因相关的DNA来实现，所述单个等位基因是导致以低植酸水平为特征的玉米突变体的原因(Raboy等人，1990 Maydica 35:383)。
(C)改良的碳水化合物组成，例如通过用编码改变淀粉的分支模式的酶的基因转化植物而实现。这些酶的实例包括，粘液链球菌(Streptococcus mucus)果糖基转移酶基因(Shiroza等人，1988)J.Bacteriol.170:810，枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(Steinmetz等人，1985 Mol.Gen.Genel.200:220)，地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(Pen等人，1992 Bio/Technology 10:292)，番茄转化酶基因(Elliot等人，1993),大麦淀粉酶基因(Sogaard等人，1993 J Biol.Chem.268:22480)，和玉米胚乳淀粉分支酶II(Fisher等人，1993 PlantPhysiol.102:10450)。
转化
用于植物转化的适合方法包括可将DNA导入细胞中的任何方法，例如但不限于：电穿孔(参见，例如，美国专利5,384,253)；微粒轰击(参见，例如，美国专利5,015,580；5,550,318；5,538,880；6,160,208；6,399,861；和6,403,865)；土壤杆菌介导的转化(参见，例如，美国专利5,635,055；5,824,877；5,591,616；5,981,840；和6,384,301)；和原生质体转化(参见，例如，美国专利5,508,184)。这些方法可用于稳定转化或瞬时转化植物。
使用诸如利用碳化硅纤维搅动的技术(参见，例如，美国专利5,302,523和5,464,765)可以将DNA构建体直接导入到植物细胞的基因组DNA中，或者可以使用生物射弹法如DNA粒子轰击将DNA构建体直接导入到植物组织中(参见，例如，Klein等人(1987)Nature327:70-73)。或者，可通过纳米颗粒转化将DNA构建体导入植物细胞中(参见，例如，美国专利公开文本No.2009/0104700，通过提述完整并入本文)。
另外，可以使用非土壤杆菌细菌或病毒，例如根瘤菌菌种NGR234，苜蓿中华根瘤菌、百脉根根瘤菌、马铃薯病毒X、花椰菜花叶病毒和木薯叶脉花叶病毒和/或烟草花叶病毒实现基因转移，参见，例如Chung等人，(2006)Trends Plant Sci.11(1):1-4。
通过应用转化技术，事实上任何植物物种的细胞可被稳定转化，并且可通过熟知的技术将这些细胞开发为转基因植物。例如，在棉花转化背景下可以特别有用的技术描述于美国专利5,846,797；5,159,135；5,004,863；和6,624,344中；用于转化芸苔属植物的技术例如描述于美国专利5,750,871中；用于转化大豆的技术例如描述于美国专利6,384,301中；并且用于转化玉米的技术例如描述于美国专利7,060,876和5,591,616、以及国际PCT公开文本WO 95/06722中。
在完成外源核酸到受体细胞的递送之后，通常鉴定出转化的细胞用于进一步培养和植物再生。为了提高鉴定转化体的能力，人们可能期望采用选择标志物基因，其中转化载体用来再生转化体。在说明性实施方案中，可通过使细胞暴露于一种或多种选择剂来测定转化的细胞群，或者可筛选所述细胞的期望标志物基因性状。
暴露于选择剂后存活的细胞、或者在筛选测定中已被评分为阳性的细胞，可以在支持植物再生的介质中进行培养。在一个实施方案中，可通过包含其他物质，如生长调节剂来改良任何适合的植物组织培养基。可将组织维持在具有生长调节剂的基本培养基上，直到可得到足够的组织开始植物再生的努力时为止，或者在重复轮的手动选择之后，直到组织形态适合于再生时为止(例如，至少2周)，然后转移到有助于茎芽形成的介质中。定期转移培养物，直到已经出现充分的茎芽形成时为止。一旦茎芽形成，将它们转移到有助于根形成的介质中。一旦形成足够的根，可将植物转移到土壤中，以便进一步生长和成熟。
为了证实提供在再生植物中的包含期望核酸的构建体的存在，可进行多种测定。这样的测定可包括：分子生物学测定，如Southern和Northern印迹以及PCR；生物化学测定，如检测蛋白质产物的存在，例如通过免疫学手段(ELISA、western印迹、和/或LC-MS MS分光光度法)或借助于酶功能；植物部分测定，如叶或根测定；和/或再生的全植物的表型分析。
可通过，例如，使用对感兴趣核酸分子特异的寡核苷酸引物进行PCR扩增来筛选转基因事件。PCR基因分型应当理解为包括但不限于，来源于分离的宿主植物愈伤组织的基因组DNA的聚合酶链反应(PCR)扩增，所述愈伤组织预期含有整合到基因组中的感兴趣核酸分子，然后进行标准克隆和PCR扩增产物的序列分析。PCR基因分型方法已被很好地描述(参见，例如，Rios等(2002)Plant J.32:243-53)，并可应用于来源于任何植物物种或组织类型(包括细胞培养物)的基因组DNA。可按顺序使用与靶序列和导入序列两者都结合的寡核苷酸引物的组合，或将所述组合在PCR扩增反应中多重化。可产生被设计为退火到靶位点、导入的核酸序列、和/或这两者的组合上的寡核苷酸引物。因此，PCR基因分型策略可包括，例如但不限于：在植物基因组中的特异性序列的扩增；在植物基因组中的多个特异性序列的扩增；在植物基因组中的非特异性序列的扩增；以及任何前述项的组合。本领域技术人员可设计探询基因组的引物和扩增反应的另外组合。例如，可以设计退火到核酸序列(一个或多个)上的一组正向和反向寡核苷酸引物，所述核酸序列对于导入的核酸序列的边界外部的靶标而言是特异性的。
正向和反向寡核苷酸引物可被设计为特异性地退火到导入的核酸分子上，例如，在相应于包含在其中的感兴趣核苷酸序列之内的编码区、或所述核酸分子的其他部分的序列处。引物的使用可以结合本文中描述的引物。寡核苷酸引物可根据期望的序列来合成并且可商购(例如，来自Integrated DNA Technologies,Inc.,Coralville,IA)。扩增之后可以进行扩增产物的克隆和测序、或直接序列分析。在一个实施方案中，对基因靶特异的寡核苷酸引物用于PCR扩增中。
表达转基因的方法
在一个实施方案中，在植物中表达至少一个转基因的方法包括培育包含与至少一个转基因可操作连接的嵌合启动子的植物。在一个实施方案中，在植物组织或植物细胞中表达至少一个转基因的方法包括培养包含与至少一个转基因可操作连接的嵌合启动子的植物。在一个实施方案中，在植物中表达至少一个转基因的方法包括培育包含与至少一个转基因可操作连接的嵌合启动子的植物组织或植物细胞。在一个实施方案中，在植物组织或植物细胞中表达至少一个转基因的方法包括培养包含与至少一个转基因可操作连接的嵌合启动子的植物组织或植物细胞。
在一个实施方案中，在植物中表达至少一个转基因的方法包括培育包含含有与至少一个转基因可操作连接的嵌合启动子的基因表达盒的植物。
在一个实施方案中，在植物组织或植物细胞中表达至少一个转基因的方法包括培养包含含有与至少一个转基因可操作连接的嵌合启动子的基因表达盒的植物组织或植物细胞。
在一个实施方案中，植物、植物组织、或植物细胞包含含有与转基因可操作连接的嵌合启动子的基因表达盒。其中，该嵌合启动子由上游启动子、内含子和5’-UTR组成。在一个实施方案中，植物、植物组织、或植物细胞包含含有上游启动子、内含子和5’-UTR的基因表达盒。在一个实施方案中，上游启动子、内含子和5’-UTR为SEQ ID NO:1的多核苷酸。在一个实施方案中，植物、植物组织、或植物细胞包含含有上游启动子、内含子和5’-UTR的基因表达盒，其中所述上游启动子、内含子和5’-UTR与SEQ ID NO:1至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.8％、或100％相同。在示例性实施方案中，植物、植物组织、或植物细胞包含含有与转基因可操作连接的上游启动子、内含子和5’-UTR的基因表达盒，其中所述转基因可以是杀虫剂抗性转基因、除草剂耐受性转基因、氮利用效率转基因、水分利用效率转基因、营养品质转基因、DNA结合转基因、选择标志物转基因、或它们的组合。
在一个实施方案中，植物、植物组织、或植物细胞包含含有与转基因可操作连接的嵌合启动子的基因表达盒。其中，该嵌合启动子由上游启动子、内含子和5’-UTR组成。当基因表达盒包含两个或更多个转基因时，所述上游启动子、内含子和5’-UTR可与基因表达盒之内的不同转基因可操作连接。在示例性实施方案中，基因表达盒包含与转基因可操作连接的上游启动子、内含子和5’-UTR，其中所述转基因可以是杀虫剂抗性转基因、除草剂耐受性转基因、氮利用效率转基因、水分利用效率转基因、营养品质转基因、DNA结合转基因、选择标志物转基因、或它们的组合。
在一个实施方案中，使用本文中描述的方法的转基因表达优选地在植物的根组织内表达。在一个实施方案中,转基因表达包括多于一个在植物根组织中表达的转基因。在一个实施方案中，如本文中描述的培育转基因植物的方法包括根优选转基因表达。在一个实施方案中，在植物组织或植物细胞中表达转基因的方法包括根优选组织和根优选细胞。在一个实施方案中，根优选表达包括玉米根优选表达。
在一个实施方案中，植物、植物组织、或植物细胞包含含有如本文中公开的嵌合基因启动子调节元件的载体。在一个实施方案中，植物、植物组织、或植物细胞包含含有与转基因可操作连接的如本文中公开的嵌合基因启动子调节元件的载体。在一个实施方案中，植物、植物组织、或植物细胞包含含有如本文中公开的基因表达盒的载体。在一个实施方案中，载体可以是质粒、粘粒、细菌人工染色体(BAC)、噬菌体、或病毒片段。
在一个实施方案中，根据本文中公开的方法的植物、植物组织、或植物细胞可以是单子叶植物。所述单子叶植物、植物组织、或植物细胞可以是，但不限于玉米、水稻、甘蔗、大麦、黑麦、高粱、兰花、竹子、香蕉、香蒲、百合、燕麦、洋葱、小米、和黑小麦。
在一个实施方案中，根据本文中公开的方法的植物、植物组织、或植物细胞可以是双子叶植物。所述双子叶植物、植物组织、或植物细胞可以是，但不限于，油菜、芥花、芥菜、埃塞俄比亚芥、大豆、向日葵、和棉花。
关于基因修饰植物的生产、用于植物的基因工程的方法在本领域中是熟知的。例如，已经开发了用于植物转化的多种方法，包括双子叶植物以及单子叶植物的生物和物理转化方案(例如，Goto-Fumiyuki等人，Nature Biotech 17:282-286(1999)；Miki等人，Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology，Glick，B.R.和Thompson，J.E.编辑，CRC Press，Inc.，Boca Raton，pp.67-88(1993))。另外，用于植物细胞或组织转化和植物再生的载体和体外培养方法是可获得的，例如，见于Gruber等人，Methods inPlant Molecular Biology and Biotechnology，Glick，B.R.和Thompson，J.E.编辑，CRCPress，Inc.，Boca Raton，pp.89-119(1993)。
本领域技术人员将认识到，在外源序列稳定纳入转基因植物中并经证实为可操作之后,可通过有性杂交将其导入其他植物中。可以使用许多标准育种技术中的任何一种，这取决于被杂交的物种。
可以通过对工程化的植物材料进行选择或筛选，利用转化DNA上存在的标志物基因所编码的性状来鉴定和分离转化的植物细胞、愈伤组织、组织、或植物。例如，可以通过在含有抑制量的抗生素或除草剂(转化基因构建体提供对该抗生素或除草剂的抗性)的培养基上培育工程化的植物材料来实施选择。此外，还可以通过筛选重组核酸构建体上可能存在的任何可见的标志物基因(例如yfp、gfp、β葡糖苷酸酶、荧光素酶、B或C1基因)的活性，来鉴定转化的细胞。这样的选择和筛选方法对于本领域技术人员是熟知的。
还可以使用物理和生物化学方法来鉴定含有插入的基因构建体的植物或植物细胞转化体。这些方法包括但不限于：1)用于检测和确定重组DNA插入物的结构的Southern分析或PCR扩增；2)用于检测和检查基因构建体的RNA转录物的Northern印迹、S1 RNA酶保护、引物延伸或逆转录PCR扩增；3)用于检测酶或核酶活性的酶学分析，其中这类基因产物由基因构建体编码；4)新一代测序(NGS)分析；5)蛋白凝胶电泳、Western印迹技术、免疫沉淀、或酶联免疫吸附测定(ELISA)，其中基因构建体产物是蛋白质。也可以使用另外的技术，例如原位杂交、酶染色、以及免疫染色，来检测重组构建体在特异性植物器官和组织中的存在或表达。用于完成所有这些测定法的方法都是本领域技术人员熟知的。
使用本文公开的方法进行基因操作的效果可以通过例如对从感兴趣组织分离的RNA(例如，mRNA)的Northern印迹观察到。通常，如果mRNA存在或mRNA量增加，可以假定对应的转基因在进行表达。可以使用测量基因和/或编码的多肽活性的其他方法。根据所使用的底物和检测反应产物或副产物的增加或减少的方法，可以使用不同类型的酶学测定。另外，表达的多肽的水平可以通过免疫化学检测，即ELISA、RIA、EIA和其他本领域技术人员所熟知的基于抗体的测定法，例如电泳检测测定法(可以使用染色或免疫印迹(westernblotting))。作为一个非限制性实例，使用ELISA测定法对AAD-1(芳氧基链烷酸酯双加氧酶；参见WO 2005/107437)和PAT(膦丝菌素乙酰转移酶)蛋白的检测描述于美国专利公开文本No.20090093366，通过提述将其完整并入本文。可以在植物的一些细胞类型和组织中或在一些发育阶段选择性地表达转基因，或者所述转基因可基本上沿其整个生命周期表达于基本上所有植物组织中。然而，任何组合表达模式也是可应用的。
本发明公开还涵盖上文描述的转基因植物的种子，其中该种子包含转基因或基因表达盒。本发明公开进一步涵盖上文描述的转基因植物的后代、克隆、细胞系或细胞，其中所述后代、克隆、细胞系或细胞包含转基因或基因构建体。
虽然已经参考特定的方法和实施方案描述了本发明，应当理解的是，可以做出各种不偏离本发明的修改和变化。
实施例
实施例1：新颖的嵌合基因启动子调节元件
该嵌合启动子序列由从玉米过氧化物酶5获得的上游启动子多核苷酸序列以及其后的玉米醇脱氢酶(I)内含子6和玉米线条病毒5’-UTR构成。所述的1,642bp的玉米过氧化物酶5上游启动子序列(SEQ ID NO:2)以下划线显示。117bp的玉米线条病毒5’-UTR(也称为前导序列)序列(SEQ ID NO:3)以小写字体显示。341bp的玉米醇脱氢酶(I)内含子6序列(SEQ ID NO:4)用斜体字显示。
ACCACTGTTGTAACTTGTAAGCCACTAGCTCACGTTCTCCATGAGCTCTTCTCTCTGCTGTTTCTTCCTCTGCTAAC TGCGTTATGATATGACGTCGTATAAATAATCTCACAATACTTCCTTATTTTCAGCATGGCCTCTTTTATGTTTATTT AACAGTAGCAACCAACGCCGCTCGATGTTTCCTTCAAGAAACGGCCACTCACTATGTGGTGTGCAGAAGAACAAATG TAAGCAGCTCCTACAGGTACCAGTAGTCATGTCAGTGTGGAAGCTTTCCAACCAACGCCTCCTTCGAGGAACCTGGT CGTGCTGACATGAATGTAGGCCATGCAAGCACAAGCACCTAACGCGAATCATCACGACGCGCCGTGTACTGGGCGTT GGTACATCACACCCCGCGTTTGACCTGATCGGAAGCATGCGTGTGTGTTGGCTGCAGGACCGGCTATAGGTTTCCTG CATTGGACAGCAGAAGCCAGTCATGTTAGGCACTCACGCGCTCCTGCCGTTTGATGAATCATCCGGTCTTTCGTATT GATCACTAGTTCACTACGCTGATATAGCAAATTTTAAGATGTGAAACCACGAGACGAGCGATAAATCTTAGACGTTA CCTATCCATATGAAGCTTGTGCGAAAAAAAGGCGTGCCGCTGTAGCATCATTCGTATACACTTTTGTCCCCAAAGAC AGGGATACGAATCCATGCTCGACAGAACCCTCCCTTCCCTGCAGATAACGACACTTAAGTATAACAAAAGTAGTTGG ATTATTTCAGAAGCAAAATCTCACTTTTCGCTGGCCTTTTTGTACTTTGGTTACTTGAGTTCAGACAGTGTATGCTA TATTGTCATGTGCTGCGTAAGGTTTAAATATGGTTCGACAAATATATCAGTATATCACTACTTTGTTATGGGTGGGG CCTAGCACAAACTTGATACAGCTAGGATAAAGTTAGAACGATGACTGATCTACTGTAAAGCGACACCTGTCCTGTTA TGGTAGTTTAAGTCCATTCCTGGACGACTCCAGATCCAGGATATGATGCTGTTACATAATGCGATTGTTCACAATAA AATTGCATGATGTTCTTCTACTCTTTAGGCAGTTTTGTTCAACAGGCAAGTTGCATAATGCATGTGCATATATGAGC AGCATAATCATCAATTAATCATAGGTTCGTCATTTTAGTTTCACTCCTTCACATTATTCCAGCCCTTGAAGAAAAAT GTAGCAGTGCTTGCTGTTTAATAAGTGGCAGAGCTGTTTTCACTCCACCTACGCTTGTCTAGGACCAAAATTTTAAT CTGTCACTTTGAGCTAAAACTGAAGCACCAAACCGCTACAAAAGAACGTAGGAGCTGAATTGTAACTTGATGGGATT ACTATAGCAGTTGCTACAGTTCTAGCTAGCTACCTTATTCTATACGCATCACCCTAACAACCCGGCTGACTGCTGCA TCTGACCCCACCGTCCCCTGCTCCAAACCAACTCTCCTTTCCTTGCATGCACTACACCCACTTCCTGCAGCTATATA TACCACCATATGCCCATCTTATGAAACCATCCACAAGAGGAGAAGAAACAATCAACCAGCAACACTCTTCTCTTATA ACATAGTACAGCGAAGGTAACTCACGGTACCctgaaggctcgacaaggcagtccacggaggagctgatatttggtggacaagctgtggataggagcaaccctatccctaatataccagcaccaccaagtcagggcaatccccagatcaCCCCAGCAGATTCGAAGAAG CTAGGAAGTTCGGATCTGGGGCCATTTGTTCCAGGCACGGGATAAGCATTCAG(SEQ ID NO:1)
实施例2：构建体设计
除非另外指明，通过标准方法进行这个和后续实施例中描述的分子生物学和生物化学操作，所述方法公开于，例如，Ausubel等人，(1995)、和Sambrook等人(1989)及其更新。在实验中使用的构建体(表1)更详细地描述于下文。
建立含有两个基因表达盒的构建体pDAS5144(例如，pDAB3620)。第一个基因表达盒(SEQ ID NO:5)含有玉米过氧化物酶5上游启动子(国际专利申请No.1998/056921)，其后为玉米醇脱氢酶(I)内含子6(Dennis等人，(1984)Nucleic Acids Res.12:3983-4000)和玉米线条病毒5’-UTR(Mullineaux等人，(1984)EMBO J.3:3063-3068)，与tcdA转基因(美国专利申请No.2009/0221501)可操作连接，并且侧翼为玉米过氧化物酶5 3’-UTR(国际专利申请No.1998/056921)。第二个基因表达盒含有选择标志物基因，且其构成为：水稻肌动蛋白启动子(美国专利No.6,429,357)与膦丝菌素乙酰转移酶(Wohlleben等人，(1988)Gene 70:25-37)转基因可操作连接，并且以玉米脂肪酶3’-UTR(美国专利No.7,179,902)终止。将这个构建体移动到超二元pSB1二元载体(Japan Tobacco,Tokyo,JP)中。通过限制酶消化和DNA测序分子验证了用于完成pDAS5144的构建体。
TACAAAAAAGCAGGCTCCGCAAGCTTGCATGCCTGCAGATCCCCGGGGATCTCCGCGGGGGCCCACCACTGTTGTAACTTGTAAGCCACTAGCTCACGTTCTCCATGAGCTCTTCTCTCTGCTGTTTCTTCCTCTGCTAACTGCGTTATGATATGACGTCGTATAAATAATCTCACAATACTTCCTTATTTTCAGCATGGCCTCTTTTATGTTTATTTAACAGTAGCAACCAACGCCGCTCGATGTTTCCTTCAAGAAACGGCCACTCACTATGTGGTGTGCAGAAGAACAAATGTAAGCAGCTCCTACAGGTACCAGTAGTCATGTCAGTGTGGAAGCTTTCCAACCAACGCCTCCTTCGAGGAACCTGGTCGTGCTGACATGAATGTAGGCCATGCAAGCACAAGCACCTAACGCGAATCATCACGACGCGCCGTGTACTGGGCGTTGGTACATCACACCCCGCGTTTGACCTGATCGGAAGCATGCGTGTGTGTTGGCTGCAGGACCGGCTATAGGTTTCCTGCATTGGACAGCAGAAGCCAGTCATGTTAGGCACTCACGCGCTCCTGCCGTTTGATGAATCATCCGGTCTTTCGTATTGATCACTAGTTCACTACGCTGATATAGCAAATTTTAAGATGTGAAACCACGAGACGAGCGATAAATCTTAGACGTTACCTATCCATATGAAGCTTGTGCGAAAAAAAGGCGTGCCGCTGTAGCATCATTCGTATACACTTTTGTCCCCAAAGACAGGGATACGAATCCATGCTCGACAGAACCCTCCCTTCCCTGCAGATAACGACACTTAAGTATAACAAAAGTAGTTGGATTATTTCAGAAGCAAAATCTCACTTTTCGCTGGCCTTTTTGTACTTTGGTTACTTGAGTTCAGACAGTGTATGCTATATTGTCATGTGCTGCGTAAGGTTTAAATATGGTTCGACAAATATATCAGTATATCACTACTTTGTTATGGGTGGGGCCTAGCACAAACTTGATACAGCTAGGATAAAGTTAGAACGATGACTGATCTACTGTAAAGCGACACCTGTCCTGTTATGGTAGTTTAAGTCCATTCCTGGACGACTCCAGATCCAGGATATGATGCTGTTACATAATGCGATTGTTCACAATAAAATTGCATGATGTTCTTCTACTCTTTAGGCAGTTTTGTTCAACAGGCAAGTTGCATAATGCATGTGCATATATGAGCAGCATAATCATCAATTAATCATAGGTTCGTCATTTTAGTTTCACTCCTTCACATTATTCCAGCCCTTGAAGAAAAATGTAGCAGTGCTTGCTGTTTAATAAGTGGCAGAGCTGTTTTCACTCCACCTACGCTTGTCTAGGACCAAAATTTTAATCTGTCACTTTGAGCTAAAACTGAAGCACCAAACCGCTACAAAAGAACGTAGGAGCTGAATTGTAACTTGATGGGATTACTATAGCAGTTGCTACAGTTCTAGCTAGCTACCTTATTCTATACGCATCACCCTAACAACCCGGCTGACTGCTGCATCTGACCCCACCGTCCCCTGCTCCAAACCAACTCTCCTTTCCTTGCATGCACTACACCCACTTCCTGCAGCTATATATACCACCATATGCCCATCTTATGAAACCATCCACAAGAGGAGAAGAAACAATCAACCAGCAACACTCTTCTCTTATAACATAGTACAGCGAAGGTAACTCACGGTACCCTGAAGGCTCGACAAGGCAGTCCACGGAGGAGCTGATATTTGGTGGACAAGCTGTGGATAGGAGCAACCCTATCCCTAATATACCAGCACCACCAAGTCAGGGCAATCCCCAGATCACCCCAGCAGATTCGAAGAAGGTACAGTACACACACATGTATATATGTATGATGTATCCCTTCGATCGAAGGCATGCCTTGGTATAATCACTGAGTAGTCATTTTATTACTTTGTTTTGACAAGTCAGTAGTTCATCCATTTGTCCCATTTTTTCAGCTTGGAAGTTTGGTTGCACTGGCACTTGGTCTAATAACTGAGTAGTCATTTTATTACGTTGTTTCGACAAGTCAGTAGCTCATCCATCTGTCCCATTTTTTCAGCTAGGAAGTTTGGTTGCACTGGCCTTGGACTAATAACTGATTAGTCATTTTATTACATTGTTTCGACAAGTCAGTAGCTCATCCATCTGTCCCATTTTTCAGCTAGGAAGTTCGGATCTGGGGCCATTTGTTCCAGGCACGGGATAAGCATTCAGCCATGGCTAATGAGTCAGTCAAGGAGATCCCGGATGTTCTCAAATCCCAGTGTGGTTTCAACTGCCTCACGGACATCTCCCACAGCTCATTCAATGAGTTCCGCCAGCAAGTCTCTGAGCACCTCTCATGGTCGGAGACGCATGACCTCTACCACGATGCTCAGCAAGCCCAGAAAGACAACCGGCTGTATGAGGCACGGATCCTCAAGAGGGCCAACCCGCAGCTCCAGAATGCGGTCCACCTCGCCATCCTTGCTCCAAATGCGGAATTGATTGGCTACAATAACCAATTCTCGGGAAGGGCCTCACAGTATGTTGCGCCTGGCACAGTTTCGTCCATGTTCAGCCCAGCAGCGTACCTCACAGAGCTGTACAGAGAGGCGAGGAACCTTCATGCGTCTGACTCCGTGTACTATCTGGACACACGCAGACCGGACCTGAAGTCAATGGCCCTCAGCCAGCAAAACATGGACATTGAACTGTCCACCCTTTCCTTGAGCAATGAGCTTCTGTTGGAATCCATCAAGACTGAGAGCAAGCTGGAAAACTACACAAAGGTGATGGAGATGCTGTCCACCTTCAGACCATCTGGAGCGACTCCATACCACGATGCCTATGAGAATGTGAGGGAGGTCATTCAGCTTCAAGACCCTGGCCTTGAGCAGCTCAATGCCAGCCCAGCCATTGCGGGACTGATGCACCAAGCCTCCCTGCTTGGGATCAATGCCTCCATCAGCCCTGAGCTGTTCAACATCTTGACTGAAGAGATCACTGAGGGCAATGCGGAGGAACTGTACAAGAAAAACTTCGGCAACATTGAGCCTGCCAGCCTTGCAATGCCGGAATACCTGAAACGCTATTACAACTTGTCGGATGAGGAACTTTCGCAGTTCATTGGCAAAGCCTCAAACTTTGGGCAGCAAGAGTACAGCAACAATCAGCTCATCACACCTGTTGTGAACTCATCTGATGGCACTGTGAAGGTTTACCGCATCACAAGGGAGTACACCACAAATGCCTACCAGATGGATGTTGAACTGTTCCCGTTTGGAGGTGAAAACTACCGGCTTGACTACAAGTTCAAGAACTTCTACAATGCATCCTACCTGTCGATCAAGCTGAACGACAAACGGGAGCTTGTGAGGACGGAAGGTGCTCCCCAAGTGAACATTGAATACTCTGCCAACATCACACTCAACACAGCGGACATCAGCCAGCCGTTTGAAATTGGCTTGACCAGAGTGCTTCCCTCGGGCTCCTGGGCCTATGCGGCAGCCAAGTTTACGGTTGAGGAGTACAACCAGTACAGCTTCCTCCTGAAGCTCAACAAGGCAATCCGGCTGAGCAGAGCCACTGAGCTGTCACCCACCATCCTGGAGGGCATTGTGAGGTCTGTCAACCTTCAGCTTGACATCAACACTGATGTGCTTGGCAAGGTGTTCCTGACCAAGTATTACATGCAGCGCTATGCCATCCATGCGGAGACGGCACTGATCCTCTGCAATGCACCCATATCGCAGCGCTCGTATGACAACCAGCCCAGCCAGTTCGACAGACTCTTCAACACTCCCCTTCTGAACGGCCAGTACTTCAGCACTGGAGATGAAGAGATTGACCTGAACTCTGGCTCGACGGGTGACTGGAGGAAAACCATCTTGAAGAGGGCCTTCAACATTGATGACGTTTCCCTCTTCCGCCTTTTGAAGATCACAGATCACGACAACAAGGATGGCAAGATCAAGAACAATCTCAAGAACCTTTCCAACCTCTACATTGGCAAACTGCTTGCAGACATCCACCAGCTGACCATTGATGAGTTGGACCTGTTGCTGATTGCAGTTGGTGAGGGCAAGACCAACCTCTCTGCAATCTCAGACAAACAGTTGGCAACCCTCATCCGCAAGCTGAACACGATCACAAGCTGGCTTCACACGCAGAAGTGGTCTGTTTTCCAACTGTTCATCATGACCAGCACGTCCTACAACAAGACCCTGACTCCGGAGATCAAGAACCTTTTGGATACAGTCTATCATGGTCTCCAAGGCTTTGACAAGGACAAGGCGGACCTGCTTCATGTCATGGCACCCTACATTGCAGCCACACTCCAGCTCTCCTCTGAAAATGTTGCCCACTCAGTGCTGTTGTGGGCTGACAAGCTCCAGCCTGGGGATGGAGCCATGACTGCTGAGAAGTTCTGGGACTGGCTCAACACGAAGTACACACCTGGCTCCTCTGAGGCAGTTGAGACTCAAGAACACATTGTGCAGTACTGCCAAGCGCTTGCACAGTTGGAGATGGTTTACCACTCAACTGGCATCAACGAGAATGCCTTCCGCCTCTTTGTCACAAAGCCTGAGATGTTTGGTGCTGCCACTGGAGCCGCTCCTGCCCATGATGCCCTGTCACTCATCATGTTGACGAGGTTTGCAGACTGGGTCAACGCCCTTGGTGAGAAAGCCTCGTCTGTCCTGGCAGCCTTTGAAGCCAACTCCCTGACTGCGGAACAGCTTGCGGATGCCATGAACCTTGATGCCAACTTGCTCCTGCAAGCTTCGATCCAAGCCCAGAACCATCAGCATTTGCCACCTGTCACGCCTGAAAATGCGTTCTCATGCTGGACCTCCATCAACACCATACTCCAGTGGGTGAACGTGGCGCAACAGCTCAATGTGGCACCTCAAGGAGTGTCAGCGCTGGTTGGGCTTGACTACATCCAGTCCATGAAGGAGACACCGACCTACGCGCAGTGGGAGAAT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ID NO:5)
建立含有两个基因表达盒的构建体pDAS5128(例如，pDAB3619)。第一个基因表达盒(SEQ ID NO:6)含有：玉米泛素1启动子(Christensen等人，(1992)Plant MolecularBiology 18；675-689)，之后是玉米醇脱氢酶(I)内含子6(Dennis等人，(1984)NucleicAcids Res.12:3983-4000)和玉米线条病毒5’-UTR(Mullineaux等人，(1984)EMBO J.3:3063-3068)，其与tcdA转基因(美国专利申请No.2009/0221501)可操作连接，并且被玉米过氧化物酶5 3’-UTR(国际专利申请No.1998/056921)所侧翼。第二个基因表达盒含有选择标志物基因，其构成为：水稻肌动蛋白启动子(美国专利No.6,429,357)可操作地连接于膦丝菌素乙酰转移酶(Wohlleben等人，(1988)Gene 70:25-37)转基因，并且以玉米脂肪酶3’-UTR终止(美国专利No.7,179,902)。将这个构建体移动到超二元pSB1二元载体(JapanTobacco,Tokyo,JP)中。通过限制酶消化和DNA测序分子验证了用于完成pDAS5128的构建体。新的玉米泛素1启动子后随玉米醇脱氢酶(I)内含子6和玉米线条病毒5’-UTR的序列在本文中作为SEQ ID NO:7公开。
GTGCAGCGTGACCCGGTCGTGCCCCTCTCTAGAGATAATGAGCATTGCATGTCTAAGTTATAAAAAATTACCACATATTTTTTTTGTCACACTTGTTTGAAGTGCAGTTTATCTATCTTTATACATATATTTAAACTTTACTCTACGAATAATATAATCTATAGTACTACAATAATATCAGTGTTTTAGAGAATCATATAAATGAACAGTTAGACATGGTCTAAAGGACAATTGAGTATTTTGACAACAGGACTCTACAGTTTTATCTTTTTAGTGTGCATGTGTTCTCCTTTTTTTTTGCAAATAGCTTCACCTATATAATACTTCATCCATTTTATTAGTACATCCATTTAGGGTTTAGGGTTAATGGTTTTTATAGACTAATTTTTTTAGTACATCTATTTTATTCTATTTTAGCCTCTAAATTAAGAAAACTAAAACTCTATTTTAGTTTTTTTATTTAATAGTTTAGATATAAAATAGAATAAAATAAAGTGACTAAAAATTAAACAAATACCCTTTAAGAAATTAAAAAAACTAAGGAAACATTTTTCTTGTTTCGAGTAGATAATGCCAGCCTGTTAAACGCCGTCGACGAGTCTAACGGACACCAACCAGCGAACCAGCAGCGTCGCGTCGGGCCAAGCGAAGCAGACGGCACGGCATCTCTGTCGCTGCCTCTGGACCCCTCTCGAGAGTTCCGCTCCACCGTTGGACTTGCTCCGCTGTCGGCATCCAGAAATTGCGTGGCGGAGCGGCAGACGTGAGCCGGCACGGCAGGCGGCCTCCTCCTCCTCTCACGGCACCGGCAGCTACGGGGGATTCCTTTCCCACCGCTCCTTCGCTTTCCCTTCCTCGCCCGCCGTAATAAATAGACACCCCCTCCACACCCTCTTTCCCCAACCTCGTGTTGTTCGGAGCGCACACACACACAACCAGATCTCCCCCAAATCCACCCGTCGGCACCTCCGCTTCAAGGGTACCCTGAAGGCTCGACAAGGCAGTCCACGGAGGAGCTGATATTTGGTGGACAAGCTGTGGATAGGAGCAACCCTATCCCTAATATACCAGCACCACCAAGTCAGGGCAATCCCCAGATCACCCCAGCAGATTCGAAGAAGGTACAGTACACACACATGTATATATGTATGATGTATCCCTTCGATCGAAGGCATGCCTTGGTATAATCACTGAGTAGTCATTTTATTACTTTGTTTTGACAAGTCAGTAGTTCATCCATTTGTCCCATTTTTTCAGCTTGGAAGTTTGGTTGCACTGGCACTTGGTCTAATAACTGAGTAGTCATTTTATTACGTTGTTTCGACAAGTCAGTAGCTCATCCATCTGTCCCATTTTTTCAGCTAGGAAGTTTGGTTGCACTGGCCTTGGACTAATAACTGATTAGTCATTTTATTACATTGTTTCGACAAGTCAGTAGCTCATCCATCTGTCCCATTTTTCAGCTAGGAAGTTCGGATCTGGGGCCATTTGTTCCAGGCACGGGATAAGCATTCAGCCATGGCTAATGAGTCAGTCAAGGAGATCCCGGATGTTCTCAAATCCCAGTGTGGTTTCAACTGCCTCACGGACATCTCCCACAGCTCATTCAATGAGTTCCGCCAGCAAGTCTCTGAGCACCTCTCATGGTCGGAGACGCATGACCTCTACCACGATGCTCAGCAAGCCCAGAAAGACAACCGGCTGTATGAGGCACGGATCCTCAAGAGGGCCAACCCGCAGCTCCAGAATGCGGTCCACCTCGCCATCCTTGCTCCAAATGCGGAATTGATTGGCTACAATAACCAATTCTCGGGAAGGGCCTCACAGTATGTTGCGCCTGGCACAGTTTCGTCCATGTTCAGCCCAGCAGCGTACCTCACAGAGCTGTACAGAGAGGCGAGGAACCTTCATGCGTCTGACTCCGTGTACTATCTGGACACACGCAGACCGGACCTGAAGTCAATGGCCCTCAGCCAGCAAAACATGGACATTGAACTGTCCACCCTTTCCTTGAGCAATGAGCTTCTGTTGGAATCCATCAAGACTGAGAGCAAGCTGGAAAACTACACAAAGGTGATGGAGATGCTGTCCACCTTCAGACCATCTGGAGCGACTCCATACCACGATGCCTATGAGAATGTGAGGGAGGTCATTCAGCTTCAAGACCCTGGCCTTGAGCAGCTCAATGCCAGCCCAGCCATTGCGGGACTGATGCACCAAGCCTCCCTGCTTGGGATCAATGCCTCCATCAGCCCTGAGCTGTTCAACATCTTGACTGAAGAGATCACTGAGGGCAATGCGGAGGAACTGTACAAGAAAAACTTCGGCAACATTGAGCCTGCCAGCCTTGCAATGCCGGAATACCTGAAACGCTATTACAACTTGTCGGATGAGGAACTTTCGCAGTTCATTGGCAAAGCCTCAAACTTTGGGCAGCAAGAGTACAGCAACAATCAGCTCATCACACCTGTTGTGAACTCATCTGATGGCACTGTGAAGGTTTACCGCATCACAAGGGAGTACACCACAAATGCCTACCAGATGGATGTTGAACTGTTCCCGTTTGGAGGTGAAAACTACCGGCTTGACTACAAGTTCAAGAACTTCTACAATGCATCCTACCTGTCGATCAAGCTGAACGACAAACGGGAGCTTGTGAGGACGGAAGGTGCTCCCCAAGTGAACATTGAATACTCTGCCAACATCACACTCAACACAGCGGACATCAGCCAGCCGTTTGAAATTGGCTTGACCAGAGTGCTTCCCTCGGGCTCCTGGGCCTATGCGGCAGCCAAGTTTACGGTTGAGGAGTACAACCAGTACAGCTTCCTCCTGAAGCTCAACAAGGCAATCCGGCTGAGCAGAGCCACTGAGCTGTCACCCACCATCCTGGAGGGCATTGTGAGGTCTGTCAACCTTCAGCTTGACATCAACACTGATGTGCTTGGCAAGGTGTTCCTGACCAAGTATTACATGCAGCGCTATGCCATCCATGCGGAGACGGCACTGATCCTCTGCAATGCACCCATATCGCAGCGCTCGTATGACAACCAGCCCAGCCAGTTCGACAGACTCTTCAACACTCCCCTTCTGAACGGCCAGTACTTCAGCACTGGAGATGAAGAGATTGACCTGAACTCTGGCTCGACGGGTGACTGGAGGAAAACCATCTTGAAGAGGGCCTTCAACATTGATGACGTTTCCCTCTTCCGCCTTTTGAAGATCACAGATCACGACAACAAGGATGGCAAGATCAAGAACAATCTCAAGAACCTTTCCAACCTCTACATTGGCAAACTGCTTGCAGACATCCACCAGCTGACCATTGATGAGTTGGACCTGTTGCTGATTGCAGTTGGTGAGGGCAAGACCAACCTCTCTGCAATCTCAGACAAACAGTTGGCAACCCTCATCCGCAAGCTGAACACGATCACAAGCTGGCTTCACACGCAGAAGTGGTCTGTTTTCCAACTGTTCATCATGACCAGCACGTCCTACAACAAGACCCTGACTCCGGAGATCAAGAACCTTTTGGATACAGTCTATCATGGTCTCCAAGGCTTTGACAAGGACAAGGCGGACCTGCTTCATGTCATGGCACCCTACATTGCAGCCACACTCCAGCTCTCCTCTGAAAATGTTGCCCACTCAGTGCTGTTGTGGGCTGACAAGCTCCAGCCTGGGGATGGAGCCATGACTGCTGAGAAGTTCTGGGACTGGCTCAACACGAAGTACACACCTGGCTCCTCTGAGGCAGTTGAGACTCAAGAACACATTGTGCAGTACTGCCAAGCGCTTGCACAGTTGGAGATGGTTTACCACTCAACTGGCATCAACGAGAATGCCTTCCGCCTCTTTGTCACAAAGCCTGAGATGTTTGGTGCTGCCACTGGAGCCGCTCCTGCCCATGATGCCCTGTCACTCATCATGTTGACGAGGTTTGCAGACTGGGTCAACGCCCTTGGTGAGAAAGCCTCGTCTGTCCTGGCAGCCTTTGAAGCCAACTCCCTGACTGCGGAACAGCTTGCGGATGCCATGAACCTTGATGCCAACTTGCTCCTGCAAGCTTCGATCCAAGCCCAGAACCATCAGCATTTGCCACCTGTCACGCCTGAAAATGCGTTCTCATGCTGGACCTCCATCAACACCATACTCCAGTGGGTGAACGTGGCGCAACAGCTCAATGTGGCACCTCAAGGAGTGTCAGCGCTGGTTGGGCTTGACTACATCCAGTCCATGAAGGAGACACCGACCTACGCGCAGTGGGAGAATGCAGCTGGCGTCTTGACAGCTGGTCTGAACTCACAGCAAGCCAACACGCTGCATGCGTTCTTGGATGAGAGCCGCTCTGCTGCCCTCAGCACGTACTATATCCGGCAAGTTGCCAAGGCAGCGGCTGCCATCAAGTCTCGGGATGACCTCTACCAGTACTTGCTCATTGACAATCAGGTTTCTGCTGCCATCAAAACGACCCGGATTGCTGAGGCCATAGCCAGCATCCAGCTCTACGTCAACAGAGCGCTTGAGAACGTTGAAGAGAATGCCAACTCTGGAGTGATTTCTCGCCAGTTTTTCATAGACTGGGACAAGTACAACAAGCGCTACTCCACCTGGGCTGGGGTCTCTCAGCTTGTCTACTATCCTGAGAACTACATAGATCCGACGATGCGGATTGGCCAGACCAAGATGATGGATGCCCTCCTTCAGTCGGTGTCCCAGAGCCAGCTCAATGCTGACACTGTGGAGGATGCCTTCATGAGCTACCTCACCTCCTTCGAGCAAGTTGCCAACCTCAAGGTCATCTCTGCTTACCACGACAACATCAACAATGACCAAGGGCTCACCTACTTCATTGGCCTGTCTGAAACTGATGCGGGTGAGTATTACTGGCGCTCAGTGGACCACAGCAAGTTCAACGATGGCAAGTTTGCTGCAAATGCCTGGTCTGAGTGGCACAAGATTGACTGCCCCATCAACCCGTACAAGTCCACCATCAGACC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ID NO:6)
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建立含有两个基因表达盒的构建体pDAS5143(例如，pDAB3924)。第一个基因表达盒(SEQ ID NO:8)含有甘蔗杆状病毒上游启动子(国际专利申请No.6,489,462/056921)，后随玉米醇脱氢酶(I)内含子6(Dennis等人，(1984)Nucleic Acids Res.12:3983-4000)和玉米线条病毒5’-UTR(Mullineaux等人，(1984)EMBO J.3:3063-3068)，与tcdA转基因(美国专利申请No.2009/0221501)可操作连接并且被玉米过氧化物酶5 3’-UTR(国际专利申请No.1998/056921)所侧翼。第二基因表达盒含有选择标志物基因，且其构成为：水稻肌动蛋白启动子(美国专利No.6,429,357)，与膦丝菌素乙酰转移酶(Wohlleben等人，(1988)Gene70:25-37)转基因可操作连接，并且以玉米脂肪酶3’-UTR(美国专利No.7,179,902)终止。将这个构建体移动到超二元pSB1二元载体(Japan Tobacco,Tokyo,JP)中。通过限制酶消化和DNA测序分子验证了用于完成pDAS5143的构建体。新的甘蔗杆状病毒启动子后随玉米醇脱氢酶(I)内含子6和玉米线条病毒5’-UTR的序列在本文中作为SEQ ID NO:9公开。
ATCGGAAGTTGAAGACAAAGAAGGTCTTAAATCCTGGCTAGCAACACTGAACTATGCCAGAAACCACATCAAAGATATCGGCAAGCTTCTTGGCCCATTATATCCAAAGACCTCAGAGAAAGGTGAGCGAAGGCTCAATTCAGAAGATTGGAAGCTGATCAATAGGATCAAGACAATGGTGAGAACGCTTCCAAATCTCACTATTCCACCAGAAGATGCATACATTATCATTGAAACAGATGCATGTGCAACTGGATGGGGAGCAGTATGCAAGTGGAAGAAAAACAAGGCAGACCCAAGAAATACAGAGCAAATCTGTAGGTATGCCAGTGGAAAATTTGATAAGCCAAAAGGAACCTGTGATGCAGAAATCTATGGGGTTATGAATGGCTTAGAAAAGATGAGATTGTTCTACTTGGACAAAAGAGAGATCACAGTCAGAACTGACAGTAGTGCAATCGAAAGGTTCTACAACAAGAGTGCTGAACACAAGCCTTCTGAGATCAGATGGATCAGGTTCATGGACTACATCACTGGTGCAGGACCAGAGATAGTCATTGAACACATAAAAGGGAAGAGCAATGGTTTAGCTGACATCTTGTCCAGGCTCAAAGCCAAATTAGCTCAGAATGAACCAACGGAAGAGATGATCCTGCTTACACAAGCCATAAGGGAAGTAATTCCTTATCCAGATCATCCATACACTGAGCAACTCAGAGAATGGGGAAACAAAATTCTGGATCCATTCCCCACATTCAAGAAGGACATGTTCGAAAGAACAGAGCAAGCTTTTATGCTAACAGAGGAACCAGTTCTACTCTGTGCATGCAGGAAGCCTGCAATTCAGTTAGTGTCCAGAACATCTGCCAACCCAGGAAGGAAATTCTTCAAGTGCGCAATGAACAAATGCCATTGCTGGTACTGGGCAGATCTCATTGAAGAACACATTCAAGACAGAATTGATGAATTTCTCAAGAATCTTGAAGTTCTGAAGACCGGTGGCGTGCAAACAATGGAGGAGGAACTTATGAAGGAAGTCACCAAGCTGAAGATAGAAGAGCAGGAGTTCGAGGAATACCAGGCCACACCAAGGGCTATGTCGCCAGTAGCCGCAGAAGATGTGCTAGATCTCCAAGACGTAAGCAATGACGATTGAGGAGGCATTGACGTCAGGGATGACCGCAGCGGAGAGTACTGGGCCCATTCAGTGGATGCTCCACTGAGTTGTATTATTGTGTGCTTTTCGGACAAGTGTGCTGTCCACTTTCTTTTGGCACCTGTGCCACTTTATTCCTTGTCTGCCACGATGCCTTTGCTTAGCTTGTAAGCAAGGATCGCAGTGCGTGTGTGACACCACCCCCCTTCCGACGCTCTGCCTATATAAGGCACCGTCTGTAAGCTCTTACGATCATCGGTAGTTCACCAAGGTACCCGGGGTCGACCTCGAGGGGGGGCCCGGTACCCTGAAGGCTCGACAAGGCAGTCCACGGAGGAGCTGATATTTGGTGGACAAGCTGTGGATAGGAGCAACCCTATCCCTAATATACCAGCACCACCAAGTCAGGGCAATCCCCAGATCACCCCAGCAGATTCGAAGAAGGTACAGTACACACACATGTATATATGTATGATGTATCCCTTCGATCGAAGGCATGCCTTGGTATAATCACTGAGTAGTCATTTTATTACTTTGTTTTGACAAGTCAGTAGTTCATCCATTTGTCCCATTTTTTCAGCTTGGAAGTTTGGTTGCACTGGCACTTGGTCTAATAACTGAGTAGTCATTTTATTACGTTGTTTCGACAAGTCAGTAGCTCATCCATCTGTCCCATTTTTTCAGCTAGGAAGTTTGGTTGCACTGGCCTTGGACTAATAACTGATTAGTCATTTTATTACATTGTTTCGACAAGTCAGTAGCTCATCCATCTGTCCCATTTTTCAGCTAGGAAGTTCGGATCTGGGGCCATTTGTTCCAGGCACGGGATAAGCATTCAGCCATGGCTAATGAGTCAGTCAAGGAGATCCCGGATGTTCTCAAATCCCAGTGTGGTTTCAACTGCCTCACGGACATCTCCCACAGCTCATTCAATGAGTTCCGCCAGCAAGTCTCTGAGCACCTCTCATGGTCGGAGACGCATGACCTCTACCACGATGCTCAGCAAGCCCAGAAAGACAACCGGCTGTATGAGGCACGGATCCTCAAGAGGGCCAACCCGCAGCTCCAGAATGCGGTCCACCTCGCCATCCTTGCTCCAAATGCGGAATTGATTGGCTACAATAACCAATTCTCGGGAAGGGCCTCACAGTATGTTGCGCCTGGCACAGTTTCGTCCATGTTCAGCCCAGCAGCGTACCTCACAGAGCTGTACAGAGAGGCGAGGAACCTTCATGCGTCTGACTCCGTGTACTATCTGGACACACGCAGACCGGACCTGAAGTCAATGGCCCTCAGCCAGCAAAACATGGACATTGAACTGTCCACCCTTTCCTTGAGCAATGAGCTTCTGTTGGAATCCATCAAGACTGAGAGCAAGCTGGAAAACTACACAAAGGTGATGGAGATGCTGTCCACCTTCAGACCATCTGGAGCGACTCCATACCACGATGCCTATGAGAATGTGAGGGAGGTCATTCAGCTTCAAGACCCTGGCCTTGAGCAGCTCAATGCCAGCCCAGCCATTGCGGGACTGATGCACCAAGCCTCCCTGCTTGGGATCAATGCCTCCATCAGCCCTGAGCTGTTCAACATCTTGACTGAAGAGATCACTGAGGGCAATGCGGAGGAACTGTACAAGAAAAACTTCGGCAACATTGAGCCTGCCAGCCTTGCAATGCCGGAATACCTGAAACGCTATTACAACTTGTCGGATGAGGAACTTTCGCAGTTCATTGGCAAAGCCTCAAACTTTGGGCAGCAAGAGTACAGCAACAATCAGCTCATCACACCTGTTGTGAACTCATCTGATGGCACTGTGAAGGTTTACCGCATCACAAGGGAGTACACCACAAATGCCTACCAGATGGATGTTGAACTGTTCCCGTTTGGAGGTGAAAACTACCGGCTTGACTACAAGTTCAAGAACTTCTACAATGCATCCTACCTGTCGATCAAGCTGAACGACAAACGGGAGCTTGTGAGGACGGAAGGTGCTCCCCAAGTGAACATTGAATACTCTGCCAACATCACACTCAACACAGCGGACATCAGCCAGCCGTTTGAAATTGGCTTGACCAGAGTGCTTCCCTCGGGCTCCTGGGCCTATGCGGCAGCCAAGTTTACGGTTGAGGAGTACAACCAGTACAGCTTCCTCCTGAAGCTCAACAAGGCAATCCGGCTGAGCAGAGCCACTGAGCTGTCACCCACCATCCTGGAGGGCATTGTGAGGTCTGTCAACCTTCAGCTTGACATCAACACTGATGTGCTTGGCAAGGTGTTCCTGACCAAGTATTACATGCAGCGCTATGCCATCCATGCGGAGACGGCACTGATCCTCTGCAATGCACCCATATCGCAGCGCTCGTATGACAACCAGCCCAGCCAGTTCGACAGACTCTTCAACACTCCCCTTCTGAACGGCCAGTACTTCAGCACTGGAGATGAAGAGATTGACCTGAACTCTGGCTCGACGGGTGACTGGAGGAAAACCATCTTGAAGAGGGCCTTCAACATTGATGACGTTTCCCTCTTCCGCCTTTTGAAGATCACAGATCACGACAACAAGGATGGCAAGATCAAGAACAATCTCAAGAACCTTTCCAACCTCTACATTGGCAAACTGCTTGCAGACATCCACCAGCTGACCATTGATGAGTTGGACCTGTTGCTGATTGCAGTTGGTGAGGGCAAGACCAACCTCTCTGCAATCTCAGACAAACAGTTGGCAACCCTCATCCGCAAGCTGAACACGATCACAAGCTGGCTTCACACGCAGAAGTGGTCTGTTTTCCAACTGTTCATCATGACCAGCACGTCCTACAACAAGACCCTGACTCCGGAGATCAAGAACCTTTTGGATACAGTCTATCATGGTCTCCAAGGCTTTGACAAGGACAAGGCGGACCTGCTTCATGTCATGGCACCCTACATTGCAGCCACACTCCAGCTCTCCTCTGAAAATGTTGCCCACTCAGTGCTGTTGTGGGCTGACAAGCTCCAGCCTGGGGATGGAGCCATGACTGCTGAGAAGTTCTGGGACTGGCTCAACACGAAGTACACACCTGGCTCCTCTGAGGCAGTTGAGACTCAAGAACACATTGTGCAGTACTGCCAAGCGCTTGCACAGTTGGAGATGGTTTACCACTCAACTGGCATCAACGAGAATGCCTTCCGCCTCTTTGTCACAAAGCCTGAGATGTTTGGTGCTGCCACTGGAGCCGCTCCTGCCCATGATGCCCTGTCACTCATCATGTTGACGAGGTTTGCAGACTGGGTCAACGCCCTTGGTGAGAAAGCCTCGTCTGTCCTGGCAGCCTTTGAAGCCAACTCCCTGACTGCGGAACAGCTTGCGGATGCCATGAACCTTGATGCCAACTTGCTCCTGCAAGCTTCGATCCAAGCCCAGAACCATCAGCATTTGCCACCTGTCACGCCTGAAAATGCGTTCTCATGCTGGACCTCCATCAACACCATACTCCAGTGGGTGAACGTGGCGCAACAGCTCAATGTGGCACCTCAAGGAGTGTCAGCGCTGGTTGGGCTTGACTACATCCAGTCCATGAAGGAGACACCGACCTACGCGCAGTGGGAGAATGCAGCTGGCGTCTTGACAGCTGGTCTGAACTCACAGCAAGCCAACACGCTGCATGCGTTCTTGGATGAGAGCCGCTCTGCTGCCCTCAGCACGTACTATATCCGGCAAGTTGCCAAGGCAGCGGCTGCCATCAAGTCTCGGGATGACCTCTACCAGTACTTGCTCATTGACAATCAGGTTTCTGCTGCCATCAAAACGACCCGGATTGCTGAGGCCATAGCCAGCATCCAGCTCTACGTCAACAGAGCG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ID NO:8)
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建立了含有两个基因表达盒的构建体pDAB1405(一种对照构建体)，所述两个基因表达盒均被RB7基质附着区(MAR；国际专利申请No.WO9727207)所侧翼。第一个基因表达盒含有玉米泛素1启动子，与绿色荧光蛋白转基因(美国专利No.6,172,188)可操作连接，并且被玉米过氧化物酶5 3’-UTR所侧翼。第二基因表达盒含有选择标志物基因，其构成为：水稻肌动蛋白启动子(美国专利No.6,429,357)，与膦丝菌素乙酰转移酶(Wohlleben等人，(1988)Gene 70:25-37)转基因可操作连接，并且以玉米脂肪酶3’-UTR终止(美国专利No.7,179,902)。将这个构建体移动到超二元pSB1二元载体(Japan Tobacco,Tokyo,JP)中。用于完成pDAB1405的构建体已通过限制酶消化和DNA测序进行了分子确认。
表1：构建体用pDAS号命名，并简要说明了每个构建体中使用的调节元件和选择标志物
实施例3：植物转化和分子确认
植物材料.玉米栽培种Hi-II用于所有转化实验。在温室中培育植物，在授粉之后约9-11天收获雌穗，此时未成熟合子胚的长度为1-2mm。将雌穗脱壳、冲洗、并在4℃保存，一直到使用之前1天。
土壤杆菌培养启动。将包含上述构建体的根癌土壤杆菌菌株LBA4404以甘油储液的形式维持在-80℃。在启动转化实验之前，将细菌从甘油储液划线接种到含有250mg/L链霉素、100mg/L大观霉素和10mg/L四环素的YEP平板上。将平板在28℃温育24小时，然后转移到19℃维持2天，直到在每个平板上产生菌苔时为止。
未成熟胚的共培养。从每个YEP平板上取1到2环土壤杆菌并悬浮在补充有100μM乙酰丁香酮的45ml的N6-inf培养基(N6盐和维生素、1.5mg/L 2,4-D、700mg/L L-脯氨酸、6.84％蔗糖、3.6％葡萄糖，pH调节至5.2)中，并进行涡旋直到获得均匀的悬浮液时为止。将细菌转移到NepheloTM瓶中，并利用蓝色滤光片将培养物密度调整为大约200Klett单位。在室温下在旋转摇床上以75rpm振摇瓶2-4小时，在这期间分离未成熟胚。将玉米雌穗在70％乙醇中冲洗5分钟，随后在含有几滴的20％漂白剂溶液中浸渍20-30分钟，用以消毒。在无菌去离子水中冲洗雌穗三次，包装在无菌纸巾和箔中直到使用时为止。共培养和选择方案严密遵循Frame等人所述(Plant Physiol.129:12-22,2005)。从玉米粒切下未成熟合子胚并置于含100μM乙酰丁香酮的2ml的N6-inf培养基的Eppendorf管中。来自多个雌穗的胚汇集在管中，或保持分开。在感染培养基中洗涤胚1-2次，用大约1ml的细菌悬液替换该溶液。将管轻轻颠倒数次，在室温温育5分钟。将胚转移至在100 x 15mm平板中的N6-AS(KW)培养基(N6盐和维生素、1.5mg/L 2,4-D、700mg/L L-脯氨酸、0.85mg/L硝酸银、300mg/LL-半胱氨酸、3％蔗糖、3g/L GelriteTM、100μM乙酰丁香酮，pH调节至5.8)。去除平板中的过量液体之后，在显微镜下使胚定向为盾片侧向上。
用胶带或密封平板，在20℃下黑暗中温育3到4天。对于TcdA构建体，每种构建体处理50-120个胚，对于阳性对照构建体(pDAB1405)，处理大约30-50个胚。为了监测转化效率，在2周之后评价推定的阳性对照分离株的GFP表达。在桌上离心机中以5000rpm将剩余的土壤杆菌悬液旋转沉降，将沉淀重悬在100μl的液体中，然后划线接种在YEP+strep/spec/tet平板上，在28℃温育3天，然后用于重新验证。作为评估玉米供体材料的组织培养反应的阳性对照，将大约每个雌穗5个胚在15Ag培养基(N6盐和维生素、100mg/L酪蛋白酶促水解产物、1mg/L 2,4D、2％蔗糖、2.5g/L GelriteTM，pH 5.8，加10mg/L硝酸银和25mM L-脯氨酸)上铺板，并在黑暗中在28℃温育2周。对照胚在第2周和第4周对胚性响应评分，然后弃去。
分离、选择、和再生。在3-4天的共培养之后，将存活胚转移到KW-静息培养基(N6盐和维生素、1.5mg/L 2,4-D、700mg/L L-脯氨酸、500mg/L MES、0.85mg/L硝酸银、100mg/L万古霉素、100mg/L头孢噻肟、3％蔗糖、8g/L TC琼脂，pH调节到5.8)。在每个60 x 20mm平板上放置十个胚，并用胶带或密封。平板在28℃在暗培养室中温育7天。由于所有构建体均含有PAT基因作为选择标志物，使用基于双丙氨磷的制剂作为选择剂。将胚转移到N6(1.5H)KW培养基(N6盐和维生素、1.5mg/L 2,4-D、700mg/L L-脯氨酸、500mg/L MES、0.85mg/L硝酸银、100mg/L万古霉素、100mg/升头孢噻肟、1.5mg/L3％蔗糖、8g/L TC琼脂，pH调节到5.8)。在大约两周之后，将胚转移到水平加倍的培养基，随后转移到N6(3.0H)KW培养基(N6盐和维生素、1.5mg/L 2,4-D、700mg/L L-脯氨酸、500mg/L MES、0.85mg/L硝酸银、100mg/L万古霉素、100mg/L头孢噻肟、3.0mg/L3％蔗糖、8g/L TC琼脂，pH调节到5.8)。在第一次转移到N6(3.0H)KW培养基之后，将任何快速生长的胚性组织在单独的N6(3.0H)KW培养基平板上进行传代培养，以壮大推定的转基因分离株。当已获得足够量的胚性愈伤组织材料时，取样用于接合性和表达测定。将满足拷贝数及表达标准的事件转移到28(1H)再生培养基(MS盐和维生素、5mg/L BAP、25μg/L 2,4-D、3％蔗糖、1mg/L2.5g/L GelriteTM，pH调节到5.7)并在低光照(13μEm-2s-1)下以16:8小时光周期培养七天，随后在高光照(40μEm-2s-1)下培养七天。将新出现的芽转移到100 x 25mm平板中的36(1H)培养基(MS盐和维生素、3％蔗糖、1mg/L2.5g/L GelriteTM,pH 5.7)。当芽的长度达到约3-5mm时，将它们转移到25 x 150mm玻璃管中的SHGA生根培养基(SH盐和维生素、1g/L肌醇、1％蔗糖、2.5g/LGelriteTM，pH 5.8)。在观察到充分的根发育之后将小植株转移到温室。
T0植物的转移和温室中定植。给各转基因植物分配唯一标识符并转移到温室。将植物从管中移栽到小盆(3.5"SVD)，并用HumidomeTM覆盖一周，以帮助植物适应温室环境(约28℃昼温/约26℃夜温/16:8补充光照)。然后将植物从小盆移栽到整根器(root trainer)中，以进行昆虫生物测定(Spencer-Lemaire Industries,Edmonton,Alberta Canada；style Tinus 350-4)。将每个事件三株植物放置在整根器中，同时由温室员工将每个事件其余的三株植物转移到5加仑盆中，以便人工授粉和T1种子生产。大约在移栽移栽到整根器之后四天，侵染植物以进行生物测定。
T1种子的生产。将通过了生物测定的植物以及相应的未经生物测定的每个事件三株植物移栽到5加仑盆中。每周进行观察，以追踪任何异常表型。当出现雌穗时，在萌发出玉米须之前将芽袋套在芽上以确保没有飘来花粉的交叉污染。如果在套袋之前有任何芽产生须，则记录并去除该芽。第二个芽套袋用于授粉。将产生异常芽或不产生芽的植物记录在数据库中。在脱落花粉之前从T0植物去除雄穗，以消除温室中的转基因花粉流。修剪雌穗丝以提供均匀的刷，以便在授粉过程中接受花粉。来自近交玉米栽培种5XH751的花粉用于所有授粉。
在完成授粉之后，将植物置于温室中使其生长和发育。在授粉之后21天将雌穗剥开，以促使其脱水(dry down)，随后在授粉之后42天完成收获(从植物移除雌穗)。将雌穗放置在干燥器中1周，随后进行种子加工(去壳、计数、包装在预先印刷的信封中、和种子计数输入数据库中)。
实施例4：转基因植物/事件的蛋白质表达
愈伤组织植物材料中的蛋白质表达的Western印迹分析。通过Western印迹分析玉米愈伤组织样品中TcdA的存在。在分析制备中，将200mg的愈伤组织样品采集到96孔排管盒(Corning,Corning,NY)中，在-80℃储存。在分析时，通过加入4个钢珠(3.5mm,Bio SpecProducts,Bartlesville,OK)和200μl的提取缓冲液(1X磷酸盐缓冲盐水(PBS)+0.1％Triton-X-100)提取样品。使用钢珠在Kleco珠磨TM(Garcia Machine,Visalia,CA)中在最大设置下击打样品3分钟。加工后，将样品在平板离心机(Qiagen)中在3000rcf离心5分钟。将所得的上清液移液到新的管中。将提取物与适量的样品缓冲液(NuPage LDSTM 4X样品缓冲液(Invitrogen,Carlsbad,CA)，含40mM二硫苏糖醇)混合，制备Western样品。在如上的样品缓冲液中制备纯化蛋白质阳性对照(PA1,0.4mg/ml)，浓度为6.25ng/μl。将四十微升的每一制备样品和标准品置于PCR管(Thermo Scientific)中，在热循环仪(Applied BioSystems,Foster City,CA)中在90℃加热5分钟。在3-8％Tris-Acetate凝胶(Invitrogen EA0375)上利用Tris-Acetate-SDS运行缓冲液(Invitrogen)解析样品。
另外，内凝胶室的运行缓冲液中添加有抗氧化剂(Invitrogen)。根据凝胶规格上样，愈伤组织样品以25μL的样品上样，纯化蛋白质对照以4μl上样(25ng)，分子量标志物(SeeBlue MarkerTM,Invitrogen,Carlsbad,CA)为15μl。在恒定的150V下跑胶75分钟。同时，将转移垫和0.2μm硝酸纤维素膜(Invitrogen)在转移缓冲液(1X NuPage转膜缓冲液TM(Invitrogen)+10-20％甲醇)中浸泡备用。
在凝胶上解析蛋白质之后，根据制造商的说明将印迹组件(Invitrogen)和要转移的凝胶装配好。然后在恒定的45V下将凝胶转膜至少1.5小时(对于每印迹组件的2块凝胶为2小时)。早先的愈伤组织Western印迹的跑胶是使用Bio-Rad CriterionTM系统(4-20％Tris-HCl凝胶[Bio-Rad,Hercules,CA]和1X Tris/甘氨酸/SDS运行缓冲液)进行的。然而，由于胶对胶质量(gel to gel quality)不良，做出了换用上述Invitrogen系统的决定。转膜后，在Western Breeze封闭缓冲液(Invitrogen)中在室温下将膜封闭30分钟。去除封闭缓冲液，加入浓度为1.0μg/ml的溶于封闭缓冲液中的一抗(MAB抗TcdA 148G4.1和MAB抗TcdA 148D11.1)。将膜在室温下温育至少1小时。用Western BreezeTM洗涤溶液(Invitrogen)将膜洗涤3次，每次5分钟。以1:3000稀释度在封闭溶液中制备二抗(抗鼠HRP[Sigma,St.Louis,MO])。将膜在室温下温育1小时，然后如上所述洗涤。通过用纸巾吸干膜的边缘来去除膜中过量的洗涤缓冲液。使膜暴露于化学发光底物(Thermo Scientific)持续5分钟。如上所述去除过量的底物，并将膜包装在塑料包装中。在暗室中，使X射线胶片(Thermo Scientific,Waltham,MA)对膜曝光以使条带可视化。使胶片显影5分钟，并且使胶片曝光2小时。
在T0植物材料中的蛋白质表达的ELISA分析。使用单克隆-单克隆(mono-mono)ELISA分析玉米叶材料TcdA的存在。在用根虫卵侵染植物一周之后，对来自温室培育植物的叶取样，方式是从第一片完全展开的叶的尖端切下2cm的叶片。样品采集到96孔排管盒(Corning)中并在-80℃冷冻。通过加入3个钢珠(3.5mm,Bio Spec Products,Bartlesville,OK)、1个钢珠(4.5mm Daisy)和100μl的PBEX提取缓冲液(19mM NaH2PO4、31mM Na2HPO4,10mM 0.5M EDTA、和0.1％100)制备用于提取的样品。使用KlecoBeadmillTM(Garcia Machine)在最大设置下将样品粉碎3分钟。向样品加入另外300μl PBEX提取缓冲液，并将样品另外加工1分钟。加工后，将样品在平板离心机(Qiagen)中在3000rcf离心5分钟。将所得的上清液转移到新的管中。用Beacon Analytical Systems(Portland,ME)如下制备ELISA板：用1X PBS中的浓度为1.0μg/ml的抗TcdA单克隆抗体(MAB抗TcdA148G4.1)包被Maxisorb platesTM(Thermo Fisher Scientific)。在4℃温育过夜之后，用PBST(PBS+0.5％)中的1％冷水鱼明胶(Sigma)封闭平板。将平板干燥，个别包装以便储存。在分析时，将平板加温至室温，并在上样之前在洗板机(TomTec)中洗涤4次，每次洗涤使用350μl的PBST。在PBEX缓冲液中将纯化的蛋白质参考抗原(PA1,0.4mg/ml)稀释到150ng/ml，用于生成从150ng/ml到2.34ng/ml的连续稀释的标准曲线。将样品稀释在PBEX缓冲液中达到1:8的起始稀释度，并另外连续稀释3次。接着，所有标准品和样品稀释物以100μl以一式两份上样到ELISA板上。在室温下在ELISA板上温育样品1小时。温育后，如上所述洗涤平板。将辣根过氧化物酶偶联的单克隆抗体(MAB抗TcdA 148D11.1--HRP)(由Covance制备，Denver,PA)在PBS中稀释到1μg/ml，并以每孔100μl加到板上。然后在室温下将平板温育1小时。温育后，洗涤平板。将叠置的平板旋转180°，并重复洗涤步骤。接着，以每孔100μl向平板添加1-Step Ultra TMB substrateTM(Thermo Scientific)。当具有标准曲线最低稀释度的孔开始显示蓝色时，通过加入50μl的终止溶液(0.4N H2SO4)使反应停止。在酶标仪(Molecular Devices)中使用Pro v5(Molecular Devices)在450nm读板，减去650nm的参考波长。通过二次方标准曲线的线性回归计算测试样品的TcdA浓度。
通过Bradford测定法确定叶提取物中的总可溶蛋白。将玉米叶样品在96孔聚丙烯板(Corning)中使用水稀释。将蛋白标准品(预稀释的蛋白质测定标准品:BSA[Thermo Scientific])稀释到0.5mg/ml起始浓度，并在板上连续稀释到0.0625mg/ml，留下最底下的孔作为水空白。将样品转移到板(Thermo Fisher Scientific)上，向孔中加入制备好的蛋白质染料(BioRad)。在使用Pro v5(Molecular Devices)的酶标仪(Molecular Devices)中在595nm的波长下读板。通过二次方标准曲线的线性回归计算总可溶蛋白浓度。使用JMP软件(版本7.0.2,SAS Industries,Inc.,Cary,NC)进行统计分析。使用log+1变换进行蛋白质表达(TcdA的每百万分数)值的变换。
这里的ELISA使用两种单克隆抗体，这种抗体仅识别的一个表位，由此降低了该测定法识别截短TcdA的能力。由于这种特异性，可以确信通过该ELISA确定的表达水平能代表全长TcdA。由于叶样品提取物的最低稀释度为1:8，这导致检测下限为16ng/ml，而定量下限36ng/ml(最低稀释因子x具有2倍于背景的O.D.的最低标准)。因此任何在36ng/ml和零之间的结果都不应视为是准确的。
在T1植物材料中的蛋白质表达的ELISA分析。作为无损伤的筛选方法，通过定性酶联免疫吸附测定法(ELISA)分析玉米植物的选择标志物膦丝菌素乙酰转移酶(PAT)的存在。通过从第一片完全展开的叶的尖端切下2cm的叶片，对来自温室培育植物的叶取样。样品采集到96孔排管盒(Corning)中并在-80℃冷冻。通过加入两个钢珠(4.5mm,Daisy,RogersAR)和含0.5％ (PBST)提取缓冲液的100μl的磷酸盐缓冲盐水制备用于提取的样品。使用Kleco BeadmillTM(Garcia Machine)在最大设置下将样品粉碎三分钟。向样品加入另外300μl PBST提取缓冲液，并将样品另外处理一分钟。在珠子击打之后，将样品在平板离心机(Qiagen)中3,000rcf离心五分钟。将所得上清液转移到新的管中。将来自PAT试剂盒AP014(EnviroLogix,Portland,ME)的ELISA板加温到室温以备使用。将纯化的蛋白质参考抗原(PAT Standard,TSN 104799,63μg/ml)在PBST缓冲液中稀释到10ng/ml，用来生成具有下列稀释度的标准曲线：5ng/ml、0.625ng/ml、和0.156ng/ml。为了准备供使用的平板，将50μl的酶偶联物(EnviroLogix,Portland,ME)添加到每个孔中，随后加入50μl的PBST。接着，将50μl的标准品和样品上样到ELISA板上它们的对应孔中，并在室温下温育一小时。温育后，在洗板机(TomTec)中将平板洗涤四次，每次洗涤使用350μl的PBST。以每孔100μl将EnviroLogix TMB substrateTM添加到板上，并温育15分钟。通过加入100μl的终止溶液使反应停止。在使用Pro v5(Molecular Devices)的酶标仪(Molecular Devices)中在O.D.450的波长下读板，减去的OD大于0.7nm。
通过Mono/Mono ELISA，分析选用于昆虫生物测定的植物的TcdA的存在。在两个时间点采集叶样品：在用根虫卵侵染之后一周以及在生物测定法结束时(在侵染之后21天)。通过从第一片完全展开的叶的尖端切下2cm的叶片对叶子进行取样。样品采集到96孔排管盒(Corning)中并在-80℃冷冻。通过加入两个钢珠(4.5mm,Daisy)和100μl的PBEX提取缓冲液(19mM NaH2PO4、31mM Na2HPO4、10mM 0.5M EDTA、和0.1％100)制备用于提取的样品。使用Kleco BeadmillTM(Garcia Machine)在最大设置下将样品粉碎三分钟。向样品加入另外300μl PBEX提取缓冲液，并将样品另外处理1分钟。在珠子击打之后，将样品在平板离心机(Qiagen)中在3000rcf离心五分钟。在生物测定法结束时为每个植物采集根样品。通过向2ml管中加入四个钢珠(4.5mm,Daisy)和400μl的PBEX提取缓冲液制备用于提取的根样品(每个植物200mg)。使用Kleco BeadmillTM(Garcia Machine)在最大设置下将样品粉碎3分钟。在珠子击打之后，将样品在平板离心机(Qiagen)中在3000rcf离心五分钟。将所得上清液转移到新的管中。用Beacon Analytical Systems(Portland,ME)如下制备ELISA板：用1X PBS中的浓度为1.0μg/ml的抗TcdA单克隆抗体(MAB抗TcdA 148G4.1)包被MaxiSorb板(Thermo Fisher Scientific)。在4℃温育过夜之后，用PBST(PBS+0.5％)中的1％冷水鱼明胶(Sigma)封闭平板。将平板干燥，个别包装以便储存。在分析时，将平板加温至室温，并在上样之前在洗板机(TomTec)中洗涤四次，每次洗涤使用350μl的PBST。
在PBEX缓冲液中将纯化的蛋白质参考抗原(PA1,0.4mg/ml)稀释到150ng/ml，用于生成具有150ng/ml到2.344ng/ml连续稀释度的标准曲线。将样品稀释在PBEX缓冲液中达到1:8的起始稀释度，并另外连续稀释3次(1:8、1:16、1:32、1:64)。接着，将100μl的标准品和样品稀释物以一式两份上样到ELISA板上。在室温下在ELISA板上温育样品一小时。温育后，如上所述洗涤平板。将辣根过氧化物酶偶联的单克隆抗体(MAB抗TcdA 148D11-HRP)在PBS中稀释到1μg/ml，并以每孔100μl加到板上。然后在室温下将平板温育1小时。温育后，用Step Ultra TMBTM substrate(Thermo Scientific)洗涤平板。以每孔100μl将此洗涤溶液添加到平板上。当具有标准曲线最低稀释度的孔开始显示蓝色时，通过加入50μl的终止溶液(0.4N H2SO4)使反应停止。在使用Pro v5(Molecular Devices)的酶标仪(Molecular Devices)中在O.D.450nm的波长下读板，其中减去650nm的参考值。通过二次方回归分析计算测试样品的TcdA浓度。
在生物测定法之后，通过Western印迹分析一部分叶和根样品的TcdA的存在。通过将提取物与适量的样品缓冲液((NuPage LDSTM 4X样品缓冲液[Invitrogen)，具有40mM二硫苏糖醇)混合，制备Western样品。在如上的样品缓冲液中制备纯化蛋白质阳性对照(PA1,0.4mg/ml)，浓度为6.25ng/μl。然后，将40μl的每一制备样品和标准品置于PCR管(ThermoScientific)中，在热循环仪(Applied BioSystems,Foster City,CA)中在90℃加热5分钟。在3-8％Tris-Acetate凝胶(Invitrogen)上利用Tris-Acetate-SDS运行缓冲液(Invitrogen)解析样品。另外，内凝胶室的运行缓冲液中添加有抗氧化剂(Invitrogen)。根据凝胶规格上样，其中每个叶和根样品上样25μl的样品，纯化蛋白质对照上样4μl(25ng)，分子量标志物(SeeBlue MarkerTM,Invitrogen)上样15μl。在恒定的150V下跑胶75分钟。在跑胶的同时，将转移垫和0.2μm硝酸纤维素膜(Invitrogen)在转移缓冲液(1X转膜缓冲液(Invitrogen)+10-20％甲醇)中浸泡备用。在凝胶上解析蛋白质之后，根据制造商的说明组装印迹组件(Invitrogen)和凝胶。然后在恒定的45V下将凝胶转膜至少1.5小时(对于每个印迹组件的2条凝胶为2小时)。转移后，在Western封闭缓冲液(Invitrogen)中在室温下将膜封闭30分钟。去除封闭缓冲液，加入封闭缓冲液中1.0μg/ml的浓度的一抗(MAB抗TcdA 148G4.1和MAB抗TcdA 148D11.1)。将膜在室温下温育至少1小时。用Western洗涤溶液(Invitrogen)将膜洗涤3次，每次5分钟。以1:3000稀释度在封闭溶液中制备二抗(抗鼠HRP(Sigma))。如上所述，在洗涤之前将膜在室温下温育1小时。通过用纸巾轻轻吸干膜的边缘来去除膜上过量的洗涤缓冲液。使膜暴露于化学发光底物(Thermo Scientific)5分钟。如上所述去除过量的底物，并将膜包装在塑料包装中。在暗室中，使X射线胶片(Thermo Scientific)对膜曝光，以使条带可视化。使胶片显影5分钟，并且使胶片曝光2小时。
通过Bradford测定法确定叶和根提取物中的总可溶蛋白。在96孔聚丙烯板(Corning)中使用水稀释玉米叶和根样品。将蛋白标准品(Pre-diluted ProteinAssay Standards:BSATM(Thermo Scientific))稀释到0.5mg/ml起始浓度，并在板上连续稀释到0.0625mg/ml，留下最下面的孔作为水空白。将样品转移到MaxiSorb plateTM(ThermoFisher Scientific)上，并将制备好的蛋白质染料(BioRad)添加到孔中。在使用Pro v5(Molecular Devices)的酶标仪(Molecular Devices)中在O.D.595nm的波长下读板。通过二次方回归分析计算总可溶蛋白浓度。
使用软件(版本7.0.2,SAS Industries,Inc.,Cary,NC)进行统计分析。使用对数转换进行蛋白质表达(TcdA的每百万分数)值的转换。
实施例5：T0转基因植物表达筛选
T0植物中的蛋白质表达分析。Western印迹和ELISA数据显示，转基因pDAS5144事件在根组织中特异性地表达TcdA蛋白。如表2中所示，pDAS5144事件在愈伤组织和T0叶样品中的TcdA表达都惊人地低。不同的构建体的TcdA的玉米叶表达概貌以每百万分数(PPM)为单位报告。pDAS5144构建体中的TcdA表达显著少于其他构建体。pDAS5144构建体中的TcdA平均表达为14PPM。来自这个构建体的叶材料的表达范围为0-200PPM。在叶组织中的较低表达水平是启动子组织特异性的结果。
表2：通过构建体在T0玉米叶和愈伤组织中表达TcdA蛋白。
*不是由相同字母连接的水平是显著不同的。
T1植物中的蛋白质表达分析。表3列出了在昆虫生物测定过程中在侵染一周之后从T1玉米叶分离的TcdA蛋白的定量ELISA分析的结果。收获不同事件的T1玉米叶并交付昆虫生物测定，以检测表达的TcdA蛋白的效力。记录各构建体的平均TcdA表达(PPM)，包括范围和最高四分位数结果。另外，报告了每组事件的针对玉米叶中平均TcdA表达的Tukey-Kramer平均值分离分析结果。含有构建体pDAS5144的植物在叶组织中的TcdA蛋白表达可忽略不计。尽管在玉米叶中的TcdA表达可忽略不计，但是生物测定结果表明pDAS5144事件提供了针对昆虫侵染(例如，根虫侵染)的耐受性。生物测定数据和蛋白质表达数据(来自叶)的组合分析未显示叶中的蛋白质表达与根虫所致的根损害水平之间的关联。在叶组织中的较低TcdA表达水平连同根中的TcdA表达表明，该新型嵌合基因启动子调节元件以根组织特异性方式表达tcda转基因。
表3：对于在昆虫生物测定过程中采集的样品的各构建体在玉米叶中的平均TcdA蛋白表达水平(ppm)。
*不是由相同字母连接的水平是显著不同的。
在昆虫生物测定之后的蛋白质表达分析。在完成昆虫生物测定实验之后，使用ELISA和Western印迹来分析一部分叶和根材料。表4和5分别列出了在叶和根材料中的平均TcdA蛋白表达。虽然各构建体之间的T1玉米叶中的TcdA蛋白表达水平有显著差异，各构建体之间在昆虫生物测定之后分析的根中的的差异相比于叶中较不显著。pDAS5144事件产生了最大范围的TcdA蛋白表达，导致TcdA蛋白在被测定的转基因事件中表达。相比而言，根据回收的总蛋白，在叶组织中没有可检出的TcdA蛋白。这些结果进一步提示，来自构建体pDAS5144——其中TcdA由新型嵌合基因启动子调节元件驱动——的转基因表达是根特异性的。
表4：在完成昆虫生物测定之后通过构建体在玉米叶中的TcdA蛋白表达(PPM)。
*不是由相同字母连接的水平是显著不同的。
表5：在完成昆虫生物测定之后通过构建体在玉米根中的TcdA蛋白表达(PPM)。
*不是由相同字母连接的水平是显著不同的。
在V6和VT发育期的蛋白质表达。进行进一步的研究来评估新型嵌合基因启动子调节元件在玉米植物的V6和VT发育期的TcdA表达水平。培育了分别从构建体5116、5117、和5144表达转基因TcdA的玉米植物。分离T1叶组织的蛋白质并定量，将这些结果与从全植物分离的总蛋白进行比较。这些结果如表6中所示，它们进一步证实，来自构建体pDAS5144的新型嵌合基因启动子调节元件的tcda转基因表达是根特异性的。从分离自全植物的总蛋白检测到TcdA蛋白，但在叶中未检测到TcdA蛋白。另外，构建体pDAS5144的新型嵌合基因启动子调节元件在玉米生长和发育的V6和VT期都表达tcda转基因。
表6：来自在植物生长和发育的V6和VT期收获的T1玉米叶的总TcdA蛋白。
如此，将新型嵌合基因启动子调节元件作为基因表达盒与转基因可操作连接，并且用于表达该转基因，并且对所得表达模式进行了表征。第一次公开了这样的嵌合启动子，所述嵌合启动子包含从玉米过氧化物酶5获得的上游启动子多核苷酸序列以及其后的玉米醇脱氢酶(I)内含子6和玉米线条病毒5’-UTR，以供在基因表达构建体中使用。证明了表达新型嵌合基因启动子调节元件的构建体以根组织特异性的方式表达转基因。这些根特异性结果是出人预料的，因为一种嵌合启动子，其包含从玉米过氧化物酶5获得的上游启动子多核苷酸序列以及其后的玉米醇脱氢酶内含子1，在叶和根组织中都表达了转基因。参见美国专利No.6,384,207的表22。

Claims (20)

1.一种嵌合多核苷酸序列，其在严格条件下与这样的多核苷酸探针杂交：所述多核苷酸探针包含与SEQ ID NO:1的互补物的至少90％的序列同一性。
2.权利要求1的嵌合多核苷酸序列，其中该多核苷酸与SEQ ID NO:1具有至少90％序列同一性。
3.权利要求1的嵌合多核苷酸序列，其中该多核苷酸包含SEQ ID NO:1。
4.权利要求1的嵌合多核苷酸序列，其中该多核苷酸由SEQ ID NO:1组成。
5.权利要求1的嵌合多核苷酸序列，其中该嵌合多核苷酸序列与转基因可操作连接。
6.权利要求5的嵌合多核苷酸序列，其中该转基因是tcdA。
7.权利要求1的嵌合多核苷酸序列，其中可操作连接的转基因编码多肽或小RNA。
8.权利要求1的嵌合多核苷酸序列，其中该嵌合多核苷酸序列促进转基因的根优选表达。
9.权利要求8的嵌合多核苷酸序列，其中该根优选表达包括玉米根优选表达。
10.一种包含合成多核苷酸的转基因细胞，所述合成多核苷酸在严格条件下与这样的多核苷酸探针杂交：该多核苷酸探针包含与SEQ ID NO:1的互补物的至少90％的序列同一性。
11.权利要求10的转基因细胞，其中该合成多核苷酸与SEQ ID NO:1具有至少90％序列同一性。
12.权利要求10的转基因细胞，其中该合成多核苷酸包含SEQ ID NO:1。
13.权利要求10的转基因细胞，其中该转基因细胞是通过植物转化方法产生的。
14.权利要求13的转基因细胞，其中该植物转化方法选自下组：土壤杆菌介导的转化法、生物射弹转化法、碳化硅转化法、原生质体转化法、和脂质体转化法。
15.权利要求10的转基因细胞，其中该合成多核苷酸是组织优选启动子。
16.权利要求15的基因表达盒，其中该组织优选启动子是根组织优选启动子。
17.一种包含权利要求10的转基因细胞的转基因植物。
18.权利要求17的转基因植物，其中该转基因植物是单子叶或双子叶植物。
19.权利要求18的转基因植物，其中该单子叶植物选自下组：玉米植物、水稻植物、和小麦植物。
20.一种来自权利要求17的转基因植物的转基因种子。
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