BR102015004282B1

BR102015004282B1 - Sequência polinucleotídica quimérica promotora de expressão específica de raiz

Info

Publication number: BR102015004282B1
Application number: BR102015004282-5A
Authority: BR
Inventors: Patricia Ann Owens Merlo; Ronnie Hampton Jr.; Cory Larsen; Aaron T. Woosley
Original assignee: Corteva Agriscience Llc
Priority date: 2014-02-28
Filing date: 2015-02-26
Publication date: 2023-11-14
Also published as: US9909133B2; RU2016138290A; UY36013A; CA2939112A1; CL2016002145A1; JP2017506516A; EP3110955A4; KR20160125506A; BR102015004282A2; WO2015130931A1; EP3110955A1; AU2015222996B2; IL247236A0; CN106062202B; AR099601A1; CA2939112C; CN106062202A; BR102015004282A8; US20150247155A1; AP2016009469A0

Abstract

EXPRESSÃO ESPECÍFICA DE RAÍZ CONFERIDA POR ELEMENTOS REGULADORES DO GENE QUIMÉRICO. A presente invenção refere-se a construtos e métodos para a expressão de um transgene em células vegetais e/ou tecidos vegetais usando elementos reguladores genéticos quiméricos.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção refere-se geralmente ao campo da biologia molecular vegetal, e mais especificamente, ao campo da expressão transgênica em plantas.

ANTECEDENTES

[002] Muitas espécies vegetais são capazes de ser transformadas com transgenes para introduzir traços ou características agronomicamente desejáveis. As espécies vegetais são desenvolvidas e/ou modificadas para terem traços particulares desejáveis. Geralmente, os traços desejáveis incluem, por exemplo, melhora na qualidade do valor nutricional, aumento da produção, conferindo resistência à praga ou doenças, aumentando a tolerância à estiagem e ao estresse, aumentando as qualidades hortícolas (por exemplo, pigmentação e crescimento), transmitindo resistência herbicida, permitindo a produção de compostos industrialmente úteis e/ou materiais da planta, e/ou permitindo a produção de medicamentos.

[003] As espécies transgênicas vegetais que compreendem múltiplos transgenes empilhados em um único locus genômico são produzidas através de tecnologias de transformação da planta. As tecnologias de transformação da planta resultam na introdução de um transgene na célula vegetal, recuperação de uma planta transgênica fértil que contenha a cópia estavelmente integrada do transgene no genoma da planta, e subsequente expressão transgene através da transcrição e translação do genoma da planta que resulta em plantas transgênicas que possuem os traços e fenótipos desejáveis. No entanto, os mecanismos que permitem a produção das espécies transgênicas da planta para expressar altamente múltiplos transgenes projetados como uma pilha de traços são desejáveis.

[004] Do mesmo modo, são desejáveis os mecanismos que permitem a expressão de um transgene dentro de tecidos ou órgãos em particular de uma planta. Por exemplo, o aumento da resistência de uma planta à infecção por patógenos do solo pode ser realizado pela transformação do genoma da planta com um gene de resistência ao patógeno tal que a proteína de resistência ao patógeno é expressa fortemente nas raízes da planta. Alternativamente, pode ser desejável expressar um transgene nos tecidos vegetais que estejam em uma fase de crescimento ou desenvolvimento em particular tal como, por exemplo, divisão ou alongamento da célula.

[005] Neste documento são descritos os elementos reguladores do promotor quimérico (por exemplo, sequências promotoras caracterizadas pelo fato de incluírem promotores a montante, íntrons e 5’ -UTRs). Além disso, são descritos construtos e métodos que utilizam os elementos reguladores do promotor quimérico.

SUMÁRIO

[006] Neste documento são apresentados construtos e métodos para a expressão de um transgene em células vegetais e/ou tecidos vegetais. Em uma modalidade, um construto inclui um cassete de expressão gênica caracterizado pelo fato de abranger uma sequência polinucleotídica quimérica que compreende um promotor a montante de sequência polinucleotídica que foi obtido de Peroxidase 5 de milho (Zea mays) e seguido pelo íntron 6 do álcool-desidrogenase do milho (Zea mays) e o Vírus da Listra do Milho 5’ -UTR. A sequência promotora quimérica resultante é caracterizada pelo fato de incluir um novo elemento regulador de gene quimérico.

[007] Em uma modalidade, um cassete de expressão gênica inclui um elemento regulador promotor de gene quimérico ligado operativamente a um transgene ou a uma sequência de codificação heteróloga. Em uma modalidade, um cassete de expressão gênica inclui pelos menos um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez ou mais transgenes.

[008] Métodos de cultivo vegetais que expressam um transgene que usa um elemento regulador promotor de gene quimérico (por exemplo, promotor a montante, íntron, e 5’ -UTR) são expostos aqui. Métodos de cultura de tecidos e células vegetais que expressam um transgene que usa o elemento regulador promotor de gene quimérico também são descritos aqui. Em uma modalidade, os métodos com são descritos aqui incluem expressão gênica específica de tecidos radiculares vegetais. Métodos de isolamento uma sequência polinucleotídica que inclui o elemento regulador promotor de gene quimérico são também descritos aqui.

[009] Em uma modalidade, a invenção aqui apresentada se refere a um cassete de expressão gênica caracterizado pelo fato de incluir um promotor ligado operativamente a um transgene, onde o promotor abrange um polinucleotídeo que hibridiza sob condições rigorosas a uma sonda polinucleotídica que abrange uma identidade de sequência de pelo menos 90% a um complemento de SEQ ID NO:1. Em um subsequente aspecto da modalidade, o polinucleotídeo tem pelo menos 90% da identidade da sequência para SEQ ID NO:1. Em outros aspectos, o transgene ligado operativamente codifica um polipeptídeo ou um pequeno RNA. Em outros aspectos ainda, o transgene é selecionado do grupo que consiste em um transgene que proporciona resistência ao inseticida, um transgene que proporciona tolerância ao herbicida, um transgene que proporciona eficiência do uso do nitrogênio, um transgene que proporciona eficiência no uso da água, um transgene que proporciona qualidade nutricional, um transgene que proporciona ligação do DNA, e um transgene que proporciona marcador selecionável. Em um aspecto, a modalidade se refere a um cassete de expressão gênica caracterizado pelo fato de abranger uma região 3' não traduzida. Em uma modalidade, a invenção aqui apresentada se refere a um vetor recombinante que se caracteriza pelo fato de incluir um cassete de expressão gênica. Em um aspecto da modalidade, o vetor é selecionado do grupo que consiste em um plasmídeo, um cosmídeo, cromossomo artificial de bactéria, um vírus e um bacteriófago. Em outra modalidade, a invenção aqui apresentada se refere a uma célula transgênica que se caracteriza pelo fato de incluir um cassete de expressão gênica. Em outra modalidade, a célula transgênica é uma célula vegetal transgênica. Em outra modalidade, a invenção aqui apresentada se refere a uma planta transgênica que se caracteriza pelo fato de incluir uma célula vegetal transgênica. Em um aspecto da modalidade, a planta transgênica é uma planta monocotiledônea ou a dicotiledônea. Em outros aspectos, a planta monocotiledônea é selecionada de um grupo que consiste em uma planta de milho, uma planta de arroz, e uma planta de trigo. Em outra modalidade, a invenção aqui apresentada se refere a uma semente transgênica da planta transgênica. Em outra modalidade, o promotor é um promotor tecido- específico. Em uma subsequente modalidade, o promotor tecido- específico é um promotor específico de tecido radicular.

[0010] Em uma modalidade, a invenção aqui apresentada se refere a uma célula transgênica caracterizada pelo fato de incluir um polinucleotídeo sintético que hibridiza sob condições rigorosas a uma sonda polinucleotídica que abrange uma identidade de sequência de pelo menos 90% a um complemento de SEQ ID NO:1. Em um aspecto da modalidade, o polinucleotídeo tem pelo menos 90% da identidade da sequência para SEQ ID NO:1. Em outro aspecto da modalidade, a célula transgênica é uma célula vegetal transgênica. Em outro aspecto, a célula vegetal transgênica é produzida por um método de transformação da planta. Em outros aspectos, o método de transformação da planta é selecionado do grupo que consiste em um método de transformação mediada por Agrobacterium, um método de transformação biolística, um método de transformação de carboneto de silício, um método de transformação de protoplasto, um método de transformação de lipossoma. Em outra modalidade, a invenção aqui apresentada se refere a uma planta transgênica que se caracteriza pelo fato de incluir uma célula vegetal transgênica. Em um aspecto da modalidade, a planta transgênica é uma planta monocotiledônea ou a dicotiledônea. Em outros aspectos, a planta monocotiledônea é selecionada de um grupo que consiste em uma planta de milho, uma planta de arroz e uma planta de trigo. Em outrasmodalidades, a invenção aqui apresentada se refere a uma semente transgênica da planta transgênica. Em uma modalidade adicional, o promotor é um promotor tecido-específico. Em outras modalidades, o promotor tecido- específico é um promotor específico de tecido radicular.

[0011] Em uma modalidade, a invenção aqui apresentada se refere a uma sequência polinucleotídica quiméricos que hibridiza sob condições rigorosas a uma sonda polinucleotídica que abrange uma identidade de sequência de pelo menos 90% a um complemento de SEQ ID NO:1. Em um aspecto da modalidade, o polinucleotídeo tem pelo menos 90% da identidade da sequência para SEQ ID NO:1. Em um aspecto adicional, a sequência do polinucleotídeo quimérico está ligada operativamente a um transgene. Em outro aspecto, transgene ligado operativamente codifica um polipeptídeo ou um pequeno RNA. Em um aspecto, a sequência polinucleotídica quimérica está ligada operativamente ao transgene. Em aspectos adicionais, o transgene é selecionado do grupo que consiste em um transgene que proporciona resistência a inseticida, um transgene que proporciona tolerância ao herbicida, um transgene que proporciona eficiência do uso do nitrogênio, um transgene que proporciona eficiência no uso da água, um transgene que proporciona qualidade nutricional, um transgene que proporciona ligação do DNA, e um transgene que proporciona marcador selecionável. Em uma modalidade adicional, a invenção aqui apresentada se refere a um vetor recombinante que se caracteriza pelo fato de incluir um cassete de expressão gênica. Em aspectos adicionais da modalidade, o vetor é selecionado do grupo que consiste em um plasmídeo, um cosmídeo, cromossomo artificial de bactéria, um vírus e um bacteriófago. Em uma modalidade, a invenção aqui apresentada se refere a uma célula transgênica que se caracteriza pelo fato de incluir um cassete de expressão gênica. Em outros aspectos, a célula transgênica é uma célula vegetal transgênica. Em uma modalidade, a invenção aqui apresentada se refere a uma planta transgênica que se caracteriza pelo fato de incluir uma célula vegetal transgênica. Um aspecto adicional inclui, onde a planta transgênica é uma planta monocotiledônea. Em aspectos adicionais, onde a planta monocotiledônea é selecionada de um grupo que consiste em uma planta de milho, uma planta de trigo e uma planta de arroz. Em uma modalidade, a invenção aqui apresentada se refere a uma semente transgênica da planta transgênica. Em outro aspecto da modalidade, a sequência polinucleotídica quimérica promove a expressão radicular preferencial de um transgene.

[0012] Em uma modalidade, a invenção aqui apresentada se refere a um método para a expressão de uma sequência de codificação heteróloga em uma planta transgênica, o método é caracterizado pelo fato de abranger:

[0013] a transformação de uma célula vegetal com um cassete de expressão gênica que inclui uma sequência polinucleotídica que abrange uma identidade de sequência de pelo menos 90% para a SEQ ID NO:1 ligado operativamente à sequência de codificação heteróloga, a qual está ligada operativamente à região 3' não traduzida;

[0014] o isolamento da célula vegetal transformada que consiste no cassete de expressão gênica;

[0015] a regeneração da célula vegetal transformada em uma planta transgênica; e,

[0016] a obtenção da planta transgênica, onde a planta transgênica inclui o cassete de expressão gênica caracterizado pelo fato de abranger a sequência polinucleotídica que abrange SEQ ID NO:1.

[0017] Em um aspecto da modalidade, a sequência de codificação heteróloga é selecionada do grupo que consiste em uma sequência codificadora que proporciona resistência ao inseticida, uma sequência codificadora que proporciona tolerância ao herbicida, uma sequência codificadora que proporciona eficiência do uso do nitrogênio, uma sequência codificadora que proporciona eficiência no uso da água, uma sequência codificadora que proporciona qualidade nutricional, uma sequência codificadora que proporciona ligação do DNA, e uma sequência codificadora que proporciona marcador selecionável. Em outros aspectos, a transformação de uma célula vegetal é um método de transformação vegetal. Em aspectos subsequentes, o método de transformação vegetal é selecionado do grupo que consiste em um método de transformação mediada por Agrobacterium, um método de transformação biolística, um método de transformação de carboneto de silício, um método de transformação de protoplasto, um método de transformação de lipossoma. Em outros aspectos, a planta transgênica é uma planta transgênica monocotiledônea ou dicotiledônea. Aspectos adicionais incluem onde a planta monocotiledônea é selecionada de um grupo que consiste em uma planta de milho, uma planta de trigo e uma planta de arroz. Em uma modalidade, a invenção aqui apresentada se refere a uma semente transgênica da planta transgênica. Em aspectos adicionais, a sequência de codificação heteróloga é expressa em um tecido vegetal transgênico. Em aspectos subsequentes, o tecido vegetal transgênico é um tecido radicular vegetal.

[0018] Em uma modalidade, a invenção aqui apresentada se refere a um método para o isolamento de uma sequência polinucleotídica inclui uma identidade de sequência de pelos menos 90% para SEQ ID NO:1, o método se caracteriza pelo fato de abranger:

[0019] a identificação de sequência polinucleotídica que inclui uma identidade de sequência de pelo menos 90% para a SEQ ID NO:1;

[0020] produzir uma pluralidade de sequências oligonucleotídicas iniciadoras, onde as sequências oligonucleotídicas iniciadoras se vinculam às sequências de polinucleotídeos que incluem uma identidade de sequência de pelo menos 90% para a SEQ ID NO:1;

[0021] amplificação de sequências de polinucleotídeos que inclui uma identidade de sequência de pelo menos 90% para a SEQ ID NO:1 de uma amostra de DNA com sequências oligonucleotídicas iniciadoras da pluralidade de sequências oligonucleotídicas iniciadoras; e,

[0022] o isolamento da sequência polinucleotídica que inclui uma identidade de sequência de pelo menos 90% para a SEQ ID NO:1;

[0023] Em outro aspecto da modalidade, a sequência de polinucleotídeos isolada inclui uma identidade de sequência de pelo menos 90% para a SEQ ID NO:1 está ligado operativamente a um transgene. Em um aspecto subsequente da modalidade, o transgene ligado operativamente codifica um polipeptídeo ou um pequeno RNA.

DESCRIÇÃO DETALHADA Definições

[0024] Como aqui são usados, os artigos, "uma", "um", "o" e "a" incluem referências plurais a menos que o contexto clara e inequivocamente determine o contrário.

[0025] Como aqui é usado, o termo "retrocruzamento" se refere a um processo no qual um criador cruza progênie híbrida de novo com um dos pais, por exemplo, uma primeira geração híbrida F1 com um dos genótipos parentais do híbrido F1.

[0026] Como é usado aqui, o termo "íntron" se refere a qualquer sequência de ácido nucleico que incluiu em um gene (ou expressou a sequência nucleotídica de interesse) que é transcrita, mas não traduzida. Os íntrons incluem sequência de ácido nucleico não traduzida dentro de uma sequência de DNA expressa, assim como também a correspondente sequência em moléculas RNA transcritas delas decorrentes.

[0027] Um construto descrito aqui pode também conter sequências que melhoram a tradução e/ou estabilidade de mRNA tal como íntrons. Um exemplo de um íntron é o primeiro íntron de gene II da variante de histona de Arabidopsis thaliana ou qualquer outro comumente conhecido da sequência de íntrons. Os íntrons podem ser usados em combinação com uma sequência promotora para melhorar a tradução e/ou estabilidade de mRNA.

[0028] Como são usados aqui, os termos "região 5’ não traduzida" ou "5’-UTR" se referem a um segmento não traduzido no terminal 5’ do pré-mRNAs ou mRNAs maduros. Por exemplo, sobre mRNAs maduros, um 5’-UTR geralmente alberga sobre seu terminal 5’ um "cap" 7-metil-guanosina e está envolvido em muitos processos tais como divisão, poliadenilação, exportação de mRNA para o citoplasma, identificação do terminal 5’ do mRNA pela maquinaria translacional, e proteção dos mRNAs contra a degradação.

[0029] Como são usados aqui, os termos "região 3’ não traduzida" ou "3’-UTR" se referem a um segmento não traduzido no terminal 3’ do pré-mRNAs ou mRNAs maduros. Por exemplo, sobre mRNAs maduros esta região aloja a cauda poli-(A) e é conhecido por ter muitas funções na estabilidade, iniciação de tradução do mRNA, e exportação do mRNA.

[0030] Como é usado aqui, o termo "sinal de poliadenilação" se refere à sequência de ácido nucleico presente nas transcrições do mRNA que permite a cessação das transcrições, quando na presença da polimerase poli-(A), para ser poliadenilado sobre o sítio de poliadenilação, por exemplo, localizado a 10 a 30 bases a jusante do sinal poli-(A). Muitos sinais de poliadenilação são conhecidos na técnica e são úteis para a presente invenção. Uma sequência exemplar inclui AAUAAA e variantes das mesmas, como é descrito em Loke J., et al., (2005) Plant Physiology 138(3); 1457-1468.

[0031] Como é usado aqui, o termo "isolado" se refere a um componente biológico (que inclui um ácido nucleico ou proteína) que tenha sido separado de outros componentes biológicos na célula do organismo no qual o componente naturalmente ocorre (ou seja, outro DNA cromossômico e extracromossômico).

[0032] Como é usado aqui, o termo "purificado" em referência a moléculas de ácido nucleico não requer pureza absoluta (tal como uma preparação homogênea); em vez disso, representa uma indicação de que a sequência é relativamente mais pura que no seu ambiente celular nativo (comparado com o nível natural este nível deve ser pelo menos 2-5 vezes maior, por exemplo, em termos de concentração ou níveis de expressão do gene). As moléculas de DNA obtidas diretamente do DNA total ou do RNA total. Além disso, os clones cDNA não estão ocorrendo naturalmente, sendo preferivelmente obtidos através da manipulação de uma substância parcialmente purificada, que ocorre naturalmente (RNA mensageiro). A construção de uma biblioteca de cDNA do mRNA envolve a criação de uma substância sintética (cDNA). Os clones cDNA individuais podem ser purificados da biblioteca sintética da seleção clonal das células portadoras da biblioteca cDNA. Assim, o processo que inclui a construção de uma biblioteca cDNA do mRNA e purificação dos distintos clones cDNA produz uma purificação aproximadamente 106 vezes da mensagem nativa. Do mesmo modo, uma sequência promotora de DNA poderia ser clonada em um plasmídeo. Tal clone não está ocorrendo naturalmente, mas sendo preferivelmente obtido através da manipulação de uma substância parcialmente purificada, que ocorre naturalmente, tal como uma biblioteca genômica de DNA. Assim, a purificação de pelo menos uma ordem de magnitude, preferivelmente duas ou três ordens, e mais preferivelmente quatro ou cinco ordens de magnitude é favorecida nestas técnicas.

[0033] Similarmente, a purificação representa uma indicação de que aconteceu uma mudança química ou funcional na sequência de DNA do componente. As moléculas e proteínas de ácido nucleico que foram "purificadas" incluem moléculas e proteínas de ácido nucleico purificadas por métodos padrão de purificação. O termo "purificado" também abrange ácidos nucleicos e proteínas preparados por métodos recombinantes de DNA em uma célula anfitriã (por exemplo, células vegetais), assim como também moléculas, proteínas e peptídeos de ácido nucleico sintetizados quimicamente.

[0034] O termo "recombinante" significa uma célula ou organism no qual aconteceu uma recombinação genética. E também inclui uma molécula (por exemplo, um vetor, plasmídeo, ácido nucleico, polipeptídeo, ou um pequeno RNA) que foi alterado artificial ou sinteticamente (ou seja, não naturalmente) por intervenção humana. A alteração pode ser realizada sobre uma molécula dentro, ou removido de, seu ambiente ou estado natural.

[0035] Como é usado aqui, o termo "expressão" se refere ao processe pelo qual um polinucleotídeo é transcrito no mRNA (incluindo as moléculas de pequeno RNA) e/ou o processo pelo qual o mRNA transcrito (também é referido como "transcrito") é subsequentemente traduzido em peptídeos, polipeptídeos ou proteínas. A expressão gênica pode ser influenciada pelos sinais externos, por exemplo, exposição de uma célula, tecido ou organismo para um agente que aumenta ou diminui a expressão gênica. A expressão de um gene pode ser também regulada em qualquer lugar no caminho do DNA para o RNA para proteína. Regulação de expressão gênica ocorre, por exemplo, através de ação de controle sobre transcrição, tradução, transporte e processamento de RNA, degradação de moléculas intermediárias tais como mRNA, ou através de ativação, desativação, compartimentalização, ou degradação de moléculas de proteína específicas após terem sido feitas, ou por combinações das mesmas. A expressão gênica pode ser medida no nível de RNA ou no nível de proteína por qualquer método conhecido no estado da técnica, incluindo, sem limitação, Northern blot, RT-PCR, Western blot, ou in vitro, in situ, ou ensaio(s) de atividade da proteína in vivo.

[0036] Como foi usado aqui, os termos "silenciamento gênico dependente de homologia" ou HBGS, conforme sua sigla em inglês,são termos gênicos que inclui tanto o silenciamento gênico transcricional e silenciamento gênico pós-transcricional. Silenciamento de um locus objetivo por um locus silencioso desvinculado pode resultar da inibição da transcrição (silenciamento gênico transcricional; TGS) ou degradação mRNA (silenciamento gênico pós-transcricional; PTGS), próprio da produção de RNA de cadeia dupla (dsRNA) correspondente a promotor ou sequências transcritas, respectivamente. O envolvimento de diferentes componentes celulares em cada processo sugere que dsRNA induzido TGS e PTGS provavelmente resulte da diversificação de um antigo mecanismo comum. No entanto, uma comparação rigorosa do TGS e PTGS tem sido difícil de atingir porque geralmente depende da análise de diferentes locis silenciosos. Um único locus transgênico pode ser descrito pelo disparador tanto de TGS como de PTGS, próprio da produção do dsRNA correspondente ao promotor e sequências transcritas de diferentes genes alvo.

[0037] Como é usado aqui, os termos "molécula de ácido nucleico", "ácido nucleico", ou "polinucleotídeo" (todos os três termos são sinônimos uns dos outros) se referem a uma forma polimérica de nucleotídeos, o que pode incluir filamento de senso e antissenso de RNA, cDNA, DNA genômico, formas sintéticas e polímeros mistos dos mesmos. "Um nucleotídeo" pode se referir a um ribonucleotídeo, desoxirribonucleotídeo ou uma forma modificada de ambos os tipos de nucleotídeo. Uma molécula de ácido nucleico geralmente é de pelos menos 10 bases de comprimento, a menos que seja especificado o contrário. Os termos podem se referir a uma molécula de RNA ou DNA de comprimento indeterminado. Os termos incluem formas de filamento único e duplo de DNA. Uma molécula de ácido nucleico pode incluir qualquer um dos nucleotídeos modificados e que ocorrem naturalmente interligados por ligações nucleotídicas que ocorrem naturalmente ou que não ocorrem naturalmente.

[0038] As moléculas de ácido nucleico podem ser modificadas química ou bioquimicamente, ou podem conter bases nucleotídicas não naturais ou derivadas, como serão prontamente apreciadas por aqueles que conhecem a técnica. Tais modificações incluem, por exemplo, etiquetas, metilação, substituição de um ou mais de nucleotídeos que ocorrem naturalmente com umas modificações análogas internucleotídeas (por exemplo, ligações sem carga: por exemplo, metilfosfonatos, fosfotriesterases, fosforamidatos, carbamatos, etc.; ligações com carga: por exemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.; grupos pendentes: por exemplo, peptídeos; intercaladores: por exemplo, acridina, psoraleno, etc.; queladores; alquiladores; e ligações modificadas: por exemplo, ácidos nucleicos alfa anoméricos, etc.). O termo "molécula de ácido nucleico" também inclui qualquer conformação topológica, incluindo conformações de filamento único, filamento duplo, parcialmente duplicado, triplicado, tipo grampo, circular e trancado.

[0039] A transcrição procede de uma maneira de 5’ a 3’ alinhado com o filamento de DNA. Isto significa que RNA é feito pela adição sequencial de ribonucleotídeo -5’- trifosfatados para o terminal 3’ da cadeia de crescimento (com um requisito de eliminação do pirofosfato). Tanto a molécula de ácido nucleico linear quanto circular, elementos discretos (por exemplo, sequências de nucleotídeos particulares) pode ser referido como sendo "a montante" relativo a um elemento adicional se estiverem ligados ou poderiam estar ligados ao mesmo ácido nucleico na direção 5’ daquele elemento. Similarmente, os elementos discretos podem ser "a jusante" relativo a um elemento adicional se estiverem ou poderiam estar ligados ao mesmo ácido nucleico na direção 3’ daquele elemento.

[0040] Como é usado aqui, o termo "posição de base" se refere à localização de uma determinada base ou resíduo nucleotídico dentro de um ácido nucleico designado. Um ácido nucleico designado pode ser definido pelo alinhamento com um ácido nucleico de referência.

[0041] Como é usado aqui, o termo "hibridização" se refere a um processo onde oligonucleotídeos e seus análogos hibridizam pela ligação de hidrogênio, a qual inclui ligação de hidrogênio Watson- Crick, Hoogsteen ou Hoogsteen invertido, entre as bases complementares. Geralmente, as moléculas de ácido nucleico consistem em bases de nitrogênio que sejam pirimidinas (citosina (C), uracila (U), e timina (T)) ou purinas (adenina (A) e guanina (G)). Estas bases de nitrogênio ligam entre uma pirimidina e uma purina, e ligação de uma pirimidina a uma purina é referido como "emparelhamento de base." Mais especificamente, A será ligação de hidrogênio a T ou U, e G vai ligar a C. "Complementar" se refere ao emparelhamento de base que ocorre entre duas sequências de ácido nucleico ou duas regiões diferentes da mesma sequência de ácido nucleico.

[0042] Como é usado aqui, os termos "especificamente hibridizável" e "especificamente complementar" se referem a um grau de complementaridade suficiente tal que ocorra ligação específica e estável entre um oligonucleotídeo e o DNA ou RNA alvos. Os oligonucleotídeos não necessitam ser 100% complementares à sequência alvo para hibridizar especificamente. Um oligonucleotídeo é especificamente hibridizável quando a ligação do oligonucleotídeo à molécula de DNA ou RNA alvo interfere com a função normal do DNA ou RNA alvo, e existe grau de complementaridade suficiente para evitar ligação não específica de um oligonucleotídeo a sequências não alvo sob condições onde uma ligação específica é desejada, por exemplo, sob condições fisiológicas no caso de ensaios ou sistemas in vivo. Tal ligação é referida como hibridização específica. As condições de hibridização que resultam em graus de rigorosidade em particular vão variar dependendo da natureza do método de hibridização escolhido e a composição e extensão das sequências de ácido nucleico. Geralmente, a temperatura de hibridização e a força iônica (especialmente a concentração de Na+ e/ou Mg2+ ) de um tampão de hibridização vai contribuir para a rigorosidade da hibridização, embora as vezes de lavagem também influencia a rigorosidade. Os cálculos relativos às condições de hibridização requeridas para atingir os graus de rigorosidade particular são discutidos em Sambrook et al. (ed.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova York, 1989.

[0043] Como é usado aqui, o termo "condições rigorosas" abrange as condições sob as quais a hibridização vai ocorrer apenas se existir menos de 50% de incompatibilidade entre a molécula de hibridização e o DNA alvo. "Condições rigorosas" incluem níveis adicionais de rigorosidade em particular. Assim, como é usado aqui, condições de "rigorosidade moderada" são aquelas nas quais as moléculas com mais de 50% de incompatibilidade da sequência não vai hibridizar; as condições de "alta rigorosidade" são aquelas sob as quais as sequências com mais de 20% de incompatibilidade não vão hibridizar; e condições de "rigorosidade muito alta" são aquelas sob as quais as sequências com mais de 10% de incompatibilidade não vão hibridizar.

[0044] Em modalidades particulares, as condições de rigorosidade podem incluir a hibridização em 65°C, seguida pelas lavagens em 65°C com 0,1x SSC/0,1% SDS para 40 minutos. As seguintes são condições de hibridização representativas, não limitantes:

[0045] Rigorosidade Muito Alta: hibridização em 5x SSC de tampão em 65°C por 16 horas; lavar duas vezes em 2x SSC de tampão em temperatura ambiente por 15 minutos cada; e lavar duas vezes em 0,5x SSC de tampão em 65°C por 20 minutos cada.

[0046] Rigorosidade Alta: Hibridização em 5x SSC tampão em - 70°C por 16 horas; lavar duas vezes em 2x SSC tampão em temperatura ambiente por 5-20 minutos cada; e lavar duas vezes em 0,5x SSC de tampão em -70°C por 30 minutos cada.

[0047] Rigorosidade Moderada: Hibridização em 6x SSC de tampão a temperatura ambiente a 55°C por 16-20 horas; lavar pelo menos duas vezes em 2-3x SSC de tampão em temperatura ambiente a 55°C por 20-30 minutos cada.

[0048] Em uma modalidade, as moléculas de ácido nucleico especificamente hibridizáveis podem permanecer ligadas sob condições de hibridização de muita alta rigorosidade. Em uma modalidade, as moléculas de ácido nucleico especificamente hibridizáveis podem permanecer ligadas sob condições de hibridização de alta rigorosidade. Em uma modalidade, as moléculas de ácido nucleico especificamente hibridizáveis podem permanecer ligadas sob condições de hibridização de rigorosidade moderada.

[0049] Como é usado aqui, o termo "oligonucleotídeo" se refere a um polímero curto de ácido nucleico. Os oligonucleotídeos podem ser formados por clivagem de segmentos mais extensos de ácido nucleico, ou por polimerização individual de precursores de nucleotídeo. Os sintetizadores automáticos permitem a síntese de oligonucleotídeos até várias centenas de pares de base em comprimento. Porque os oligonucleotídeos podem se ligar a uma sequência de nucleotídeos complementar, podem ser usados como sondas para detectar DNA ou RNA. Os oligonucleotídeos compostos de DNA (oligodesoxirribonucleotídeos) podem ser usados em reação em cadeia de polimerase, uma técnica para a amplificação de pequenas sequências de DNA. Na reação em cadeia de polimerase, um oligonucleotídeo geralmente é referido como um "iniciador" que permite uma polimerase de DNA prolongue o oligonucleotídeo e replique o filamento complementar.

[0050] Como é usado aqui, os termos "Reação em Cadeia de Polimerase" ou "PCR" se refere a um procedimento ou técnica na qual pequenas quantidades de ácido nucleico, RNA e/ou DNA, são amplificadas como é descrito na Pat. U.S. No. 4.683.195. Geralmente, a informação da sequência dos terminais da região de interesse ou além precisa estar disponível, tal como os iniciadores de oligonucleotídeos podem ser designados; estes iniciadores serão idênticos ou similares em sequência para filamentos opostos do modelo a ser amplificado. Os terminais 5’ dos nucleotídeos dos dois iniciadores podem coincidir com os terminais do material amplificado. A PCR pode ser usada para amplificar sequências específicas de RNA, as sequências específicas de DNA do total genômico do DNA, e cDNA transcrito do total celular do RNA, sequências de bacteriófago ou plasmídeo, etc. Veja geralmente Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 51:263 (1987); Erlich, ed., Tecnologia PCR,(Stockton Press, NY, 1989).

[0051] Como é usado aqui, o termo "iniciador" se refere a um oligonucleotídeo capaz de atuar como um ponto de início da síntese juntamente com um filamento complementar quando as condições são adequadas para a síntese de um produto de extensão iniciadora. As condições de sintetização incluem a presença de quatro diferentes trifosfatos de desoxirribonucleótidos e pelo menos um agente de indução de polimerização tal como transcriptase reversa ou polimerase de DNA. Estes estão presentes em um tampão adequado, que pode incluir constituintes que sejam cofatores ou que afetem as condições tais como pH e afins em várias temperaturas adequadas. Um iniciador é preferivelmente uma sequência de filamento único, tal que a eficiência de amplificação seja otimizada, mas podem ser utilizadas sequências de filamento duplo.

[0052] Como é usado aqui, o termo "sonda" se refere a uma sequência de oligonucleotídeo ou polinucleotídeo que hibridiza a uma sequência alvo. No procedimento do ensaio estilo TaqMan® ou TaqMan®, a sonda hibridiza a uma porção do alvo situada entre o sítio de arrefecimento dos dois iniciadores. Como a sonda inclui aproximadamente oito nucleotídeos, aproximadamente dez nucleotídeos, aproximadamente quinze nucleotídeos,aproximadamente vinte nucleotídeos, aproximadamente trinta nucleotídeos, aproximadamente quarenta nucleotídeos, ou aproximadamente cinquenta nucleotídeos. Em algumas modalidades, uma sonda inclui de aproximadamente oito nucleotídeos até aproximadamente quinze nucleotídeos.

[0053] No procedimento do ensaio Southern blot, a sonda hibridiza a fragmentos de DNA que é anexado a uma membrana. A sonda inclui aproximadamente dez nucleotídeos, aproximadamente 100 nucleotídeos, aproximadamente 250 nucleotídeos, aproximadamente 500 nucleotídeos, aproximadamente 1.000 nucleotídeos, aproximadamente 2.500 nucleotídeos, ou aproximadamente 5.000 nucleotídeos. Em algumas modalidades, uma sonda inclui de aproximadamente 500 nucleotídeos até aproximadamente 2.500 nucleotídeos.

[0054] Uma sonda pode, além disso, incluir uma etiqueta detectável, por exemplo, uma etiqueta radioativa, uma etiqueta biotinilada, um fluoróforo (Texas-Red®, isotiocianato de fluoresceína, etc.,). A etiqueta detectável pode ser covalentemente anexado diretamente à sonda oligonucleotídeo, por exemplo, localizado na terminal 5’ da sonda ou na terminal 3’ da sonda. Uma sonda incluindo um fluoróforo, além disso, pode também incluir um supressor, por exemplo, Black Hole Quencher™, Iowa Black™, etc.

[0055] Como é usado aqui, os termos "identidade de sequência" ou "identidade" podem ser usada de forma intercambiável e se refere a resíduos de ácido nucleico em duas sequências que são as mesmas quando alinhadas para a máxima correspondência sobre uma janela de comparação especificada.

[0056] Como é usado aqui, o termo "porcentagem de identidade de sequência" se refere a um valor determinado ao comparar duas sequências otimamente alinhadas (por exemplo, as sequências de ácido nucleico ou sequências de aminoácidos) sobre uma janela de comparação, onde a porção de uma sequência na janela de comparação pode abranger adições ou deleções (ou seja, lacunas) na medida em que és comparada a uma sequência de referência (que não abrange adições ou deleções) para o alinhamento ótimo das duas sequências. Uma porcentagem é calculada pela determinação do número de posições nas quais um ácido nucleico idêntico ou resíduo de aminoácido ocorre em ambas as sequências para produzir o número de posições compatíveis, dividindo o número de posições compatíveis pelo número total de posições na janela de comparação e multiplicando o resultado por 100 para produzir a porcentagem de identidade da sequência. Os métodos para alinhar sequências para comparação são bem conhecidos. Vários programas e algoritmos de alinhamento são descritos em, por exemplo: Smith e Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; Needleman e Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443; Pearson e Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444; Higgins e Sharp (1988) Gene 73:237-44; Higgins e Sharp (1989) CABIOS 5:151-3; Corpet et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-90; Huang et al. (1992) Comp. Appl. Biosci. 8:155-65; Pearson et al. (1994) Methods Mol. Biol. 24:307-31; Tatiana et al. (1999) FEMS Microbiol. Lett. 174:247-50.

[0057] The National Center for Biotechnology Information (NCBI) Basic Local Alignment Search Tool (BLAST™; Altschul et al. (1990) Methods Mol. Biol. 215:403-10) está disponível de várias fontes, incluindo o National Center for Biotechnology Information (Bethesda, MD), e na internet, para uso em conexão com vários programas de análise de sequência. Uma descrição de como determinar a identidade da sequência usando este programa está disponível na internet na seção "ajuda" para BLAST™. Para comparações de sequências de ácido nucleico, o função das "sequências Blast 2" do programa BLAST™ (Blastn) pode ser empregado usando os parâmetros padrão. As sequências de ácido nucleico com até mesmo maior similaridade com as sequências de referência vão mostrar aumento porcentual de identidade quando avaliadas por este método.

[0058] Como é usado aqui, o termo "ligado operativamente" se refere a um ácido nucleico localizado em uma relação funcional com outro ácido nucleico. Geralmente, "ligado operativamente" pode significar que os ácidos nucleicos ligados são contíguos. A ligação pode ser realizada pela ligação em sítios de restrição convenientes. Se tais sítios não existirem, os adaptadores ou ligantes de oligonucleotídeo sintético estão ligados ou arrefecidos ao ácido nucleico e usado para vincular o fragmento de polinucleotídeo contíguo. No entanto, os elementos não precisam ser contíguos para estar ligado operativamente.

[0059] Como é usado aqui, o termo "promotor" se refere a uma região de DNA que geralmente está localizado a montante (em direção à região 5’ de um gene) de um gene e é necessário iniciar e impulsar a transcrição do gene. Um promotor pode permitir a ativação ou repressão adequada de um gene que ele controla. Um promotor pode conter sequências específicas que são reconhecidas pelos fatores de transcrição. Estes fatores podem se ligar a um promotor de sequência de DNA, o que resulta no recrutamento de polimerase de RNA, uma enzima que sintetiza RNA da região de codificação do gene. O promotor geralmente se refere a todos os elementos reguladores do gene localizados a montante do gene, incluindo, promotores a montante, 5’-UTR, íntrons e sequências líderes.

[0060] Como é usado aqui, o termo "promotor a montante" se refere a uma sequência de polinucleotídeo contígua que é suficiente para direcionar a iniciação da transcrição. Como é usado aqui, um promotor a montante abrange o sítio de iniciação de transcrição com vários motivos de sequência, que inclui TATA Box, sequência iniciadora, TFIIB elementos de reconhecimento e outros motivos de promotor (Jennifer, E.F. et al, (2002) Genes & Dev., 16: 2583-2592). O promotor a montante proporciona o sítio de ação da polimerase de RNA II que é uma enzima multi subunidade com os fatores de transcrição basal ou geral como, TFIIA, B, D, E, F e H. Estes fatores se agrupam um complexo de pré-iniciação da transcrição que catalisa a síntese de RNA do modelo de DNA.

[0061] A ativação do promotor a montante é feita pela sequência adicional de elementos reguladores da sequência de DNA a quais várias proteínas se ligam e subsequentemente interagem com o complexo de iniciação da transcrição para ativar a expressão gênica. Estes sequências de elementos reguladores genéticos interagem com fatores específicos da ligação do DNA. Estes motivos de sequência podem algumas vezes ser referidos como cis-elementos. Tais cis- elementos, aos quais os fatores de transcrição específicos do tecido ou específicos do desenvolvimento se ligam, individualmente ou em combinação, pode determinar o padrão da expressão espaciotemporal de um promotor no nível transcricional. Estes cis-elementos variam amplamente no tipo de controle que exercem sobre genes ligados operativamente. Alguns elementos atuam para aumentar a transcrição dos genes ligados operativamente em resposta das respostas ambientais (por exemplo, temperatura, mistura e ferimento). Outros cis-elementos podem responder a sinais de desenvolvimento (por exemplo, germinação, amadurecimento de semente e florescimento) ou a informação espacial (por exemplo, especificidade do tecido). Veja, por exemplo, Langridge et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 86:3219-23. Estes cis-elementos estão localizados em uma variação de distância do ponto de partida da transcrição, alguns cis-elementos (chamados elementos proximais) estão adjacentes a um centro mínimo da região promotora enquanto outros elementos podem ser posicionados de vários quilobases a montante e a jusante do promotor (otimizadores).

[0062] Um "Transgene de Ligação de DNA" é uma sequência codificadora que proporciona polinucleotídeo que codifica uma proteína de ligação DNA. A proteína de ligação de DNA é subsequentemente capaz de se ligarem a outra molécula. Uma proteína de ligação pode se ligar a, por exemplo, uma molécula de DNA (uma proteína de ligação de DNA), uma molécula de RNA (uma proteína de ligação RNA) e/ou uma molécula de proteína (uma proteína de ligação de proteína). No caso de uma proteína de ligação de proteína, pode se ligar a si mesma (para formar homodímeros, homotrímeros, etc.) e/ou pode se ligar a uma ou mais moléculas de uma proteína diferente ou proteínas. Uma proteína de ligação pode ter mais de um tipo de atividade de ligação. Por exemplo, proteínas dedo de zinco tem uma atividade de ligação de DNA, ligação de RNA e ligação de proteína.

[0063] Os exemplos de proteínas de ligação de DNA incluem; domínios de ligação meganucleases, dedos de zinco, CRISPRs e TALE que podem ser "projetadas" para ligar a uma sequência de nucleotídeo predeterminada. Geralmente, as proteínas de ligação de DNA projetadas (por exemplo, dedo de zincos, CRISPRs, ou TALEs) são proteínas que estão ocorrendo de forma não natural. Os exemplos não limitantes de métodos de projeto de proteínas de ligação de DNA são design e seleção. Uma proteína de ligação de DNA projetada é uma proteína que não ocorre na natureza cujo design/composição resultam principalmente de critérios racionais. Os critérios racionais para o design incluem aplicação de regras de substituição e algoritmos computorizado para processamento de informação em um banco de dados que armazena informação de designs de ZFP, CRISPR, e/ou TALE existentes e dados de ligação. Veja, por exemplo, Patentes U.S. 6.140.081; 6.453.242; e 6.534.261; veja também WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 02/016536 e WO 03/016496 e Publicação U.S. Nos. 20110301073, 20110239315 e 20119145940.

[0064] Uma "proteína de ligação de dedo de zinco de DNA" (ou domínio de ligação) é uma proteína, ou um domínio dentro de uma proteína maior, que liga o DNA em uma maneira específica da sequência através de um ou mais dedos de zinco, os quais são regiões de sequência de aminoácidos dentro do domínio da ligação cuja estrutura é estabilizada através da coordenação de um íon de zinco. O termo proteína de ligação de dedo de zinco de DNA é muitas vezes abreviado como proteína de dedo de zinco ou ZFP. Os domínios de ligação de dedo de zinco podem ser "projetados" para ligar a uma sequência nucleotídica predeterminada. Os exemplos não limitantes de métodos de projeto de proteínas de ligação de dedo de zinco são design e seleção. Uma proteína de dedo de zinco projetada é uma proteína não ocorre na natureza cujo design/composição resultam principalmente de critérios racionais. Os critérios racionais para o design incluem aplicação de regras de substituição e algoritmos computorizado para processamento de informação em um banco de dados que armazena informação de designs de ZFP existentes e dados de ligação. Veja, por exemplo, Pat. U.S. Nos. 6.140.081; 6.453.242; 6.534.261 e 6.794.136 ; veja também WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 02/016536 e WO 03/016496.

[0065] Em outros exemplos, o domínio de ligação de DNA de um ou mais dos nucleases inclui um domínio de ligação TAL efetor DNA que ocorrem naturalmente ou projetados (não ocorrem naturalmente). Veja, por exemplo, Publicação de Patente U.S. No. 20110301073, incorporado por referência em sua integridade aqui. A bactéria patogênica vegetal dos genus Xanthomonas é conhecida por causar muitas doenças em importantes plantas cultivadas. A patogenicidade do Xanthomonas depende de um tipo conservado de sistema de secreção III (T3S) que injetam mais que proteínas de efetor diferente em uma célula vegetal. Entre as proteínas injetadas são transcrição de efetores como ativador (TALEN) que imitam ativadores transcricional vegetais e manipula um transcriptoma vegetal (veja Kay et al (2007) Science 318:648-651). Estas proteínas contêm um domínio de ligação de DNA e um domínio de ativação transcricional. Um dos mais bem caracterizados efetores TAL é AvrBs3 de Xanthomonas campestgris pv. Vesicatoria (veja Bonas et al (1989) Mol Gen Genet 218: 127-136 e WO2010079430). Os efetores TAL contêm um domínio centralizado de tandem repetem, cada repetida contém aproximadamente 34 aminoácidos, que são fundamentais para especificidades de ligações de DNA destas proteínas. Além disso, eles contêm uma localização de sequência nuclear e um domínio de ativação transcricional acídica (para uma revisão veja Schornack S, et al (2006) J Plant Physiol 163(3): 256-272). Além disso, na bactéria fitopatogênica Ralstonia solanacearum dois genes, designados brg11 e hpx17 foram encontrados que são homólogos à família AvrBs3 de Xanthomonas no R. solanacearum estirpe biovar GMI1000 e na estirpe biovar 4 RS1000 (Veja Heuer et al (2007) Appl and Enviro Micro 73(13): 4379-4384). Estes genes são 98,9% idênticos em sequência de nucleotídeo uns a outros mas difere por uma deleção de 1,575 bp no domínio repetido de hpx17. No entanto, amos os produtos genéticos têm menos de 40% de identidade de sequência com as proteínas da família AvrBs3 de Xanthomonas. Veja, por exemplo, Publicação de Patente U.S. No. 20110301073, incorporada por referência em sua integridade aqui.

[0066] A especificidade destes efetores TAL depende das sequências encontradas nas repetições tandem. A sequência repetida abrange aproximadamente 102 bp e as repetições são geralmente 91100% homólogas uns aos outros (Bonas et al, ibid). Os polimorfismos das repetições geralmente estão localizados nas posições 12 e 13 e ali aparecem para serem uma correspondência um-a-um entre a identidade dos resíduos hipervariáveis nas posições 12 e 13 com a identidade de nucleotídeos contíguos na sequência alvo do efetor TAL (veja Moscou e Bogdanove, (2009) Science 326:1501 e Boch et al (2009) Science 326:1509-1512). Experimentalmente, o código natural para reconhecimento de DNA destes efetores TAL foi determinado tal que uma sequência HD nas posições 12 e 13 leva a uma ligação a citosina (C), NG liga a T, NI para A, C, G ou T, NN liga a A ou G, e ING liga a T. Estas repetições de ligações de DNA foram montadas em proteínas com novas combinações e números de repetições, para fazer fatores de transcrição artificial que são capazes de interagir com novas sequências e ativa a expressão de um gene repórter não endógeno nas células vegetais (Boch et al, ibid). As proteínas TAL projetadas têm sido ligadas a um meio domínio de clivagem FokI para produzir uma atividade de exibição de fusão de nuclease de efetor TAL (TALEN) em um ensaio de repórter de levedura (alvo baseado em plasmídeo).

[0067] O sistema de nuclease CRISPR (sigla em inglês de Agrupados de Curtas Repetições Palindrômicas Regularmente Interespaçadas)/Cas (CRISPR Associado) é um sistema de nuclease recentemente projetado baseado em um sistema bacteriano que pode ser usado para projeto de genoma. Está baseado em parte nas respostas imune adaptativas de muitas bactérias e Archea. Quando um vírus ou plasmídeos invade uma bactéria, segmentos do DNA invasor são convertidos em CRISPR RNAs (crRNA) pela resposta ‘imune’. Este crRNA então se associa, através de uma região de complementaridade parcial, com outro tipo de RNA chamado tracrRNA para guiar a nuclease Cas9 para uma região homóloga ao crRNA no DNA alvo chamado um "proto-espaçador". O Cas9 cliva o DNA para gerar terminais sem corte no DSB em sítios especificados por uma sequência guia de 20 nucleotídeos contida dentro do crRNA transcrito.Cas9 requer que o crRNA e o tracrRNA para o sítio específico de reconhecimento e clivagem do DNA. Este sistema agora tem sido projetado tal que o crRNA e tracrRNA pode ser combinado em uma molécula (a "guia única RNA"), e a porção equivalente de crRNA da guia única RNA pode ser projetada para guiar a nuclease Cas9 para nuclease para direcionar-se a qualquer sequência desejada (veja Jinek et al (2012) Science 337, p. 816-821, Jinek et al, (2013), eLife 2:e00471, e David Segal, (2013) eLife 2:e00563). Assim, o sistema CRISPR/Cas pode ser projetado para criar uma ruptura de filamento duplo (DSB) em um alvo desejado em um genoma, e conserta do DSB pode ser influenciada pelo uso dos inibidores de reparação para causar um aumento na reparação propensa a erro.

[0068] Em outros exemplos, o transgene de ligação de DNA é um sítio nuclease específico que abrange um Meganuclease projetado (que não ocorre naturalmente) (também descrito como um fornecimento de endonuclease). As sequências de reconhecimento de fornecimento de endonucleases ou meganucleases tais como I-SceI, I- CeuI, PI-PspI, PI-Sce, I-SceIV, I-CsmI, I-PanI, I-SceII, I-PpoI, I-SceIII, I-CreI, I-TevI, I-TevII e I-TevIII são conhecidos. Veja também Patente U.S. No. 5.420.032; Patente U.S. No. 6.833.252; Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-30 3388; Dujon et al. (1989) Gene 82:115118; Perler et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22, 11127; Jasin (1996) Trends Genet. 12:224-228; Gimble et al. (1996) Methods Mol. Biol. 263:163-180; Argast et al. (1998) J. Mol. Biol. 280:345-353 e o catálogo do New England Biolabs. Além disso, a especificidade da ligação de DNA do fornecimento de endonucleases e meganucleases pode ser projetada para ligar sítios alvo não naturais. Veja, por exemplo, Chevalier et al. (2002) Molec. Cell 10:895-905; Epinat et al. (2003) Nucleic Acids Res. 5 31:2952-2962; Ashworth et al. (2006) Nature 441:656-659; Paques et al. (2007) Current Gene Therapy 7:49-66; Publicação de Patente U.S. No. 20070117128. Os domínios da ligação de DNA do fornecimento de endonucleases e meganucleases podem ser alterados no contexto da nuclease como um todo (ou seja, tal que a nuclease inclui o domínio de clivagem do cognato) ou pode ser fusionado a um domínio de clivagem heterólogo.

[0069] Como é usado aqui, o termo "transformação" abrange todas as técnicas que uma molécula de ácido nucleico pode ser introduzida nesta célula. Os exemplos incluem, mas não se limitam a: transfecção com vetores virais; transformação vetores plasmídeos; eletroporação; lipofecção; microinjeção (Mueller et al. (1978) Cell 15:579-85);transferência mediada por Agrobacterium; captação direta de DNA; transformação mediada por WHISKERS™; e bombardeamento de microprojéteis. Estas técnicas podem ser usadas tanto para a transformação estável como para a transformação transitória de uma célula vegetal. "Transformação estável" se refere à introdução de um fragmento de ácido nucleico em um genoma de um organismo anfitrião que resulta em uma herança geneticamente estável. Uma vez estavelmente transformado, o fragmento de ácido nucleico é estavelmente integrada no genoma do organismo anfitrião e qualquer geração subsequente. Os organismos anfitriões que contém os fragmentos de ácido nucleico transformado são referidos como organismos "transgênicos". "Transformação transitória" se refere à introdução de um fragmento de ácido nucleico em um núcleo, ou organela que contém DNA, de um organismo anfitrião que resulta em uma expressão gênica sem herança geneticamente estável.

[0070] Como aqui é usado, o termo "transdução" se refere ao processo onde um vírus transfere ácido nucleico em uma célula.

[0071] Como é usado aqui, o termo "transgene" se refere a uma sequência de ácido nucleico exógena. Em um exemplo, um transgene é uma sequência genética (por exemplo, um gene de resistência a herbicida), um gene que codifica um composto útil industrial ou farmacologicamente, ou um gene que codifica um traço agronômico desejável. Em ainda outro exemplo, um transgene é um pequeno RNA, tal como uma sequência de ácido nucleico de antissenso, onde a expressão da sequência do pequeno RNA inibe a expressão de uma sequência de ácido nucleico alvo. Um transgene pode conter sequências reguladoras ligadas operativamente com o transgene (por exemplo, um promotor, íntron, ou 3’ -UTR). Em algumas modalidades, um ácido nucleico de interesse é um transgene. No entanto, em outras modalidades, um ácido nucleico de interesse é um ácido nucleico endógeno, onde as cópias genômicas adicionais do ácido nucleico endógenos são desejados, ou um ácido nucleico que está na orientação de antissenso com relação à sequência de ácido nucleico alvo em um organismo anfitrião.

[0072] Como é usado aqui, o termo "pequeno RNA" se refere a várias classes de ácido ribonucleico não codificador (ncRNA). O termo pequeno RNA descreve as cadeias curtas de ncRNA produzidas nas células bacterianas, animais, vegetais e fungos. Estas cadeias curtas de ncRNA podem ser produzidas naturalmente dentro da célula ou podem ser produzidas pela introdução de uma sequência exógena que expressa a cadeia curta ou ncRNA. As sequências de pequeno RNA não codificam diretamente para uma proteína, e difere na função de outro RNA naquelas sequências de pequeno RNA são apenas transcritos e não traduzidos. As sequências de pequeno RNA estão envolvidas em outras funções celulares, incluindo expressão e modificação genética. As moléculas de pequeno RNA geralmente estão compostas de aproximadamente 20 a 30 nucleotídeos. As sequências de pequeno RNA podem ser derivadas de precursores mais extensos. As estruturas das formas precursoras que se dobram uns sobre outros em regiões autocomplementares; então elas são processadas pela nuclease Dicer em animais ou DCL1 em plantas.

[0073] Muitos tipos de pequeno RNA existem tanto naturalmente quanto produzidos artificialmente, incluindo microRNAs (miRNAs), interferência curta RNAs (siRNAs), antissenso RNA, grampo curto RNA (shRNA), e pequeno nucleolar RNAs (snoRNAs). Determinados tipos de pequeno RNA, tal como microRNA e siRNA, são importantes em silenciamento genético e interferência de RNA (RNAi). O silenciamento genético é um processo de regulagem genética no qual um gene que normalmente deveria ser expresso é "desligado" por um elemento intracelular, neste caso, o pequeno RNA. A proteína que deveria normalmente ser formada por esta informação genética não é formada devido à interferência, e a informação codificada no gene é bloqueado da expressão.

[0074] Como é usado aqui, o termo "pequeno RNA" abrange moléculas de RNA descrito na literatura como "minúsculo RNA" (Storz, (2002) Science 296:1260-3; Illangasekare et al., (1999) RNA 5:14821489); procarióticas "pequeno RNA" (sRNA) (Wassarman et al., (1999) Trends Microbiol. 7:37-45); eucariótico "RNA não-codificador (ncRNA)"; "micro-RNA (miRNA)"; "pequeno não-mRNA (snmRNA)"; "funcional RNA (fRNA)"; "transferência RNA (tRNA)"; "catalítico RNA" [por exemplo, ribozimas, incluindo ribozimas auto- acilação (Illangaskare et al., (1999) RNA 5:1482-1489); "pequeno nucleolar RNAs (snoRNAs)"; "tmRNA" (a.k.a. "10S RNA", Muto et al., (1998) Trends Biochem Sci. 23:25-29; e Gillet et al., (2001) Mol Microbiol. 42:879-885); as moléculas RNAi incluindo sem limitação "pequena interferência RNA (siRNA)", "endoribonuclease preparada siRNA (esiRNA)", "grampo curto RNA (shRNA)", e "pequeno temporariamente reguladas RNA (stRNA)"; "diced siRNA (d-siRNA)", e aptâmeros, oligonucleotídeos e outros ácidos nucleicos sintéticos que abrange pelo menos um base uracila.

[0075] Como é usado aqui, o termo "vetor" se refere a uma molécula de ácido nucleico como introduzida em uma célula, deste modo produzindo uma célula transformada. Um vetor pode incluir sequências de ácido nucleico que permitem replicá-lo na célula anfitriã, tal como uma origem de replicação. Os exemplos incluem, mas não se limitam a, um plasmídeo, cosmídeo, bacteriófago, cromossoma bacteriano artificial (BAC), ou vírus que transporta DNA exógeno em uma célula. Um vetor também pode incluir um ou mais genes, moléculas antissenso, e/ou marcadores genéticos selecionáveis e outros elementos genéticos conhecidos na técnica. Um vetor pode transduzir, transformar ou infectar uma célula, deste modo causando que a célula expresse as moléculas de ácido nucleico e/ou proteínas codificados pelo vetor. Um vetor pode opcionalmente incluir materiais para ajudar a atingir a entrada da molécula de ácido nucleico na célula (por exemplo, a lipossoma).

[0076] Como são usados aqui, os termos "cassete", "cassete de expressão", e "cassete de expressão gênica" se refere a um segmento de DNA que pode ser inserido em um ácido nucleico ou polinucleotídeo em sítios de restrição específicos ou pela recombinação homóloga. Um segmento de DNA abrange um polinucleotídeo que contém um gene de interesse que codifica um pequeno RNA ou um polipeptídeo de interesse, e o cassete e sítios de restrição são projetados para garantir a inserção do cassete no esquema de leitura adequado para transcrição e tradução. Em uma modalidade, um cassete de expressão pode incluir um polinucleotídeo que codifica um pequeno RNA ou um polipeptídeo de interesse e ter elementos, além disso, para o polinucleotídeo que facilita a transformação de uma célula anfitriã em particular. Em uma modalidade, um cassete de expressão gênica pode também incluir elementos que permite uma melhor expressão de um pequeno RNA ou um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de interesse em uma célula anfitriã. Estes elementos podem incluir, mas não se limitam a: um promotor, um promotor mínimo, um melhorador, um elemento de resposta, um íntron, um 5’ não traduzido, uma sequência de região 3’ não traduzida, uma sequência exterminadora, uma sequência poliadenilação, e similares.

[0077] Como é usado aqui, o termo "sequência de codificação heteróloga" é usado para indicar qualquer polinucleotídeo que codifica para, ou finalmente codifica para, um peptídeo ou proteína ou suas sequências de aminoácidos equivalentes, por exemplo, uma enzima, que não está normalmente presente no organismo anfitrião e pode ser expresso na célula anfitriã sob condições adequadas. Como tal, "as sequências de codificação heterólogas" podem incluir uma ou cópias adicionais de sequências de codificação que normalmente não estão presentes na célula anfitriã, tal que a célula está expressando cópias adicionais de uma sequência de codificação que normalmente não estão presentes nas células. As sequências de codificação heteróloga pode ser RNA ou um tipo do mesmo, por exemplo, mRNA, DNA ou qualquer tipo do mesmo, por exemplo, cDNA, ou um híbrido de RNA/DNA. Os exemplos de sequências de codificação incluem, mas não se limitam a, unidades de transcrição de extensão total que inclui tais características como a sequência de codificação, íntrons, regiões promotoras, 5’-UTR, 3‘-UTRs e regiões melhoradores.

[0078] "Sequências de codificação heterólogas" também inclui a porção codificadora do peptídeo ou enzima, ou seja, a sequência cDNA ou mRNA, do peptídeo ou enzima, assim como também a porção codificadora da unidade transcricional de extensão total, ou seja, o gene que abrange íntrons e éxons, assim como também sequências "códon otimizadas", sequências truncadas ou outras formas de sequências alteradas que o código para a enzima ou código para sua sequência de aminoácidos equivalente, proporcionada que a sequência de aminoácidos equivalente produz uma proteína funcional. Tais sequências de aminoácidos equivalentes podem ter uma deleção de um ou mais aminoácidos, com a deleção sendo N-terminal, C- terminal ou interna. As formas truncadas são previstas enquanto tenham a capacidade catalítica indicada aqui.

[0079] Como é usado aqui, o termo "controle" se refere a uma amostra usada em um procedimento analítico para fins de comparação. Um controle pode ser "positivo" ou "negativo". Por exemplo, onde o propósito de um procedimento analítico é para detectar um transcrito expresso diferencialmente ou polipeptídeo em células ou tecido, geralmente é preferível para incluir um controle positivo, tais como uma amostra de uma planta conhecida que exibe a expressão desejada, e um controle negativo, tal como uma amostra de uma planta conhecida que carece da expressão desejada.

[0080] Como é usado aqui, o termo "planta" incluiu plantas e partes de plantas incluindo, mas não se limitando a células vegetais e tecidos vegetais tais como folhas, troncos, raízes, flores, pólen e sementes. Uma classe de planta que pode ser usada na presente invenção é geralmente tão ampla quanto a classe de plantas mais alta ou mais baixa receptiva à mutagênese incluindo angiospermas, gimnospermas, samambaias e algas multicelulares. Assim, "planta" inclui plantas dicotiledôneas e monocotiledôneas. Os exemplos de plantas dicotiledôneas incluem tabaco, Arabidopsis, soja, tomate, papaia, canola, girassol, algodão, alfafa, batata, parreira, ervilha-de- pombo, ervilha, Brassica, grão de bico, beterraba, colza, melancia, melão, pimenta, amendoim, abóbora, rabanete, espinafre, abóbora, brócolis, couve, cenoura, couve-flor, aipo, couve chinesa, pepino, berinjela e alface. Os exemplos de plantas monocotiledôneas incluem milho, arroz, trigo, cana-de-açúcar, cevada, centeio, sorgo, orquídeas,bambu, banana, amentilho, lírios, aveia, cebola, painço e triticale.

[0081] Como é usado aqui, o termo "material vegetal" se refere a folhas, troncos, raízes, flores ou partes de flores, frutas, pólen, células somática, zigotos, sementes, aparas, cultivos de células ou tecidos, ou qualquer outra parte ou produto de uma planta. Em uma modalidade, o material vegetal inclui cotilédone e folha. Em uma modalidade, o material vegetal inclui tecidos radiculares e outros tecidos vegetais localizados sob o solo.

[0082] Como é usado aqui, o termo "marcador genético selecionável" se refere a um gene que é opcionalmente usado na transformação da planta para, por exemplo, proteger as células vegetais de um agente seletivo ou proporcionar resistência/tolerância a um agente seletivo. Além disso, "marcador genético selecionável" se destina a abranger o gene repórter. Apenas aquelas células ou plantas que recebem um marcador funcional selecionável são capazes de se dividir ou de crescer sob as condições que têm um agente seletivo. Os exemplos dos agentes seletivos podem incluir, por exemplo, antibióticos, incluindo espectinomicina, neomicina, canamicina, paromomicina, gentamicina e higromicina. Estes marcadores selecionáveis incluem neomicina-fosfotransferase (npt II), que expressa uma enzima que conferem resistência para o antibiótico canamicina, e genes relativos aos antibióticos neomicina, paromomicina, gentamicina e G418, ou o gene por higromicina fosfotransferase (hpt), que expressa uma enzima que confere resistência à higromicina. Outros marcadores genéticos selecionáveis podem incluir genes que codificam a resistência do herbicida incluindo bar ou pat (resistência contra glufosinato de amônio ou fosfinotricina), acetolactato sintase (ALS, resistência contra inibidores tais como sulfonilureias (SUs), imidazolinonas (IMIs), triazolopirimidinas (TPs), pirimidinil oxibenzoatos (POBs), e sulfonil-amino-carbonil-triazolinona que previne o primeiro passo na síntese dos aminoácidos de cadeia ramificada), glifosato, 2,4-D, e resistência ou sensibilidade ao metal. Os exemplos de "genes repórter" que podem ser usados com marcador genético selecionável inclui a observação visual das proteínas do gene repórter expressas tais como codificação de proteínas β-glucuronidase (GUS), luciferase, proteína verde fluorescente (GFP), proteína amarela fluorescente (YFP), DsRed, β- galactosidase, cloranfenicol acetiltransferase (CAT), fosfatase alcalina e similares. A frase "marcador-positivo" se refere a plantas que tenham sido transformadas para incluir um marcador genético selecionável.

[0083] Como é usado aqui, o termo "marcador detectável" se refere a uma etiqueta capaz de detecção, tais como, por exemplo, um radioisótopo, composto fluorescente, composto bioluminescente, um composto quimioluminescente, quelador metálico, ou enzima. Os exemplos de marcadores detectáveis incluem, mas não se limitam ao seguinte: etiquetas fluorescentes (por exemplo, FITC, rodamina, fósforos de lantanídeos), etiquetas enzimáticas (por exemplo, peroxidase de rábano silvestre, β-galactosidase, luciferase, fosfatase alcalina), quimioluminescente, grupos biotinil, epitopos polipeptídeos predeterminados reconhecidos por um repórter secundário (por exemplo, par de sequências de zíper de leucina, sítios de ligação para anticorpos secundários, domínios de ligação metálica, identificadores de epitopo). Em uma modalidade, um marcador detectável pode ser anexado pelos braços espaçadores de vários comprimentos para reduzir potenciais obstáculos estéricos.

[0084] Como é usado aqui, o termo "detecção" é usado no sentido mais amplo para incluir medidas qualitativas e quantitativas de uma molécula específica, por exemplo, medidas de um polipeptídeo específico.

[0085] A menos que seja especificado indicado o contrário, todos os termos técnicos e científicos usados aqui tem o mesmo significado como é comumente entendido por aqueles de conhecimento ordinário ao estado da técnica a que pertence esta descoberta. As definições de termos comuns em biologia molecular podem ser encontradas em, por exemplo: Lewin, Genes V, Oxford University Press, 1994; Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Science Ltd., 1994; e Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc., 1995.

Elementos Reguladores

[0086] Os promotores vegetais usados para a pesquisa básica ou aplicações biotecnológicas geralmente são unidirecionais, direcionando a expressão do transgene que foi fusionado em seu terminal 3’ (a jusante). Muitas vezes é necessário expressar fortemente os transgenes dentro de plantas para engenharia metabólica e empilhamento de traços. Além disso, múltiplos promotores novos são geralmente requeridos em cultivos transgênicos para acionar a expressão de múltiplos genes. Aqui é divulgado um promotor quimérico que pode dirigir a expressão de um transgene que tenha sido usado em seu terminal 3’ (a jusante).

[0087] O desenvolvimento de produtos transgênicos está se tornando cada vez mais complexo, o que requer transgenes que se expressa fortemente e empilhando múltiplos transgenes em um único locus. Tradicionalmente, cada transgene requer um único promotor para expressão onde múltiplos promotores são requeridos para expressar diferentes transgenes dentro de uma pilha de genes. Com um cada vez maior tamanho das pilhas de gene, esta frequentemente leva a repetir o uso do mesmo promotor para obter níveis similares de padrões de expressão de transgenes diferentes para expressão de um traço poligênico único. Os construtos multigenéticos impulsionados pelo mesmo promotor são conhecidos por causar o silenciamento do gene que resulta em menos eficácia dos produtos transgênicos no campo. Excesso de fator de transcrição (TF)-sítios de ligação devido à repetição do promotor pode causar depleção dos TFs endógenos que levam a inativação transcricional. O silenciamento de transgenes provavelmente vai afetar de forma indesejável o desempenho de uma planta transgênica produzida ao expressar transgenes. As sequências repetitivas dentro de um transgene pode levar a recombinação genética homóloga intra locus que resulta em rearranjos de polinucleotídeos.

[0088] Os promotores específicos de tecido (ou seja, tecido preferencial) ou específicos de órgão impulsionam a expressão gênica em um determinado tecido tal como no grão, na raiz, na folha ou tapetum da planta. Os promotores de tecido e de etapa de desenvolvimento específicos derivem a expressão de genes, que são expressos em tecidos em particular ou em períodos de tempo em particular durante o desenvolvimento da planta. Os promotores específicos de tecido são requeridos para determinadas aplicações na indústria das plantas transgênicas e são desejáveis já que permitem a expressão específica de genes heterólogos em um tecido e/ou etapa de desenvolvimento de maneira seletiva, indicando a expressão do gene heterólogo diferencialmente em vários órgãos, tecidos e/ou prazos, mas não em outros. Por exemplo, o aumento da resistência de uma planta à infecção por patógenos do solo pode ser realizado pela transformação do genoma da planta com um gene de resistência ao patógeno tal que a proteína de resistência ao patógeno é expressa fortemente dentro das raízes da planta. Alternativamente, pode ser desejável expressar um transgene nos tecidos vegetais que seja um crescimento ou fase desenvolvimento em particular tal como, por exemplo, divisão ou alongamento da célula. Outra aplicação é o desejo de usar promotores específicos de tecido, p.ex. os que devem confinar a expressão de transgenes que codificam um traço agronômico no desenvolvimento de xilema. Um problema em particular que persiste na identificação de promotores específicos de tecido é como identificar os genes potencialmente mais importante e seus correspondentes promotores, e para relacioná-los a propriedades de desenvolvimento específicas da célula. Outro problema é clonar todos os elementos de controle da cis-atuação transcricional relevantes assim que os fragmentos de DNA clonados impulsionam a transcrição no padrão de expressão específico desejado. Um problema em particular é identificar os promotores específicos de tecido, relacionados a tipos específicos de célula, etapas de desenvolvimento e/ou funções na planta que não expressou em outros tecidos vegetais.

[0089] A expressão transgênica pode também ser regulada por um íntron e a região 5’ -UTR localizada a jusante da sequência promotora. Um promotor quimérico que abrange um promotor a montante do ligado operativamente a um íntron, e 5’ -UTR pode regular a expressão transgênica. Enquanto um promotor a montante é necessário para impulsionar a transcrição, a presença de um íntron e 5’ -UTR pode aumentar os níveis de expressão que resultam no mRNA transcrito para tradução e síntese da proteína. A adição de um íntron e 5’ -UTR a uma promotor a montante de sequência de polinucleotídeos pode ajudar a estabilizar a expressão de um transgene.

[0090] São fornecidos métodos e construtos usando um element regulador de promotor de gene quimérico caracterizado pelo fato de abranger um promotor a montante de Peroxidase 5 de milho (Zea mays) seguido de álcool-desidrogenase do milho (Zea mays) (I), íntron 6 e Vírus do Listrado do Milho 5’ -UTR (por exemplo, líder) para expressar transgenes em plantas. Em uma modalidade, um promotor quimérico pode ser um promotor de:ACCACTGTTGTAACTTGTAAGCCACTAGCTCACGTTCTCCATGAGCTCT TCTCTCTGCTGTTTCTTCCTCTGCTAACTGCGTTATGATATGACGTCGT ATAAATAATCTCACAATACTTCCTTATTTTCAGCATGGCCTCTTTTATGTT TATTTAACAGTAGCAACCAACGCCGCTCGATGTTTCCTTCAAGAAACGG CCACTCACTATGTGGTGTGCAGAAGAACAAATGTAAGCAGCTCCTACAG GTACCAGTAGTCATGTCAGTGTGGAAGCTTTCCAACCAACGCCTCCTTC VGAGGAACCTGGTCGTGCTGACATGAATGTAGGCCATGCAAGCACAAG CACCTAACGCGAATCATCACGACGCGCCGTGTACTGGGCGTTGGTACA TCACACCCCGCGTTTGACCTGATCGGAAGCATGCGTGTGTGTTGGCTG CAGGACCGGCTATAGGTTTCCTGCATTGGACAGCAGAAGCCAGTCATG TTAGGCACTCACGCGCTCCTGCCGTTTGATGAATCATCCGGTCTTTCGT ATTGATCACTAGTTCACTACGCTGATATAGCAAATTTTAAGATGTGAAAC CACGAGACGAGCGATAAATCTTAGACGTTACCTATCCATATGAAGCTTG TGCGAAAAAAAGGCGTGCCGCTGTAGCATCATTCGTATACACTTTTGTC CCCAAAGACAGGGATACGAATCCATGCTCGACAGAACCCTCCCTTCCC TGCAGATAACGACACTTAAGTATAACAAAAGTAGTTGGATTATTTCAGAA GCAAAATCTCACTTTTCGCTGGCCTTTTTGTACTTTGGTTACTTGAGTTC AGACAGTGTATGCTATATTGTCATGTGCTGCGTAAGGTTTAAATATGGTT CGACAAATATATCAGTATATCACTACTTTGTTATGGGTGGGGCCTAGCA CAAACTTGATACAGCTAGGATAAAGTTAGAACGATGACTGATCTACTGTA AAGCGACACCTGTCCTGTTATGGTAGTTTAAGTCCATTCCTGGACGACT CCAGATCCAGGATATGATGCTGTTACATAATGCGATTGTTCACAATAAA ATTGCATGATGTTCTTCTACTCTTTAGGCAGTTTTGTTCAACAGGCAAG TTGCATAATGCATGTGCATATATGAGCAGCATAATCATCAATTAATCA TAGGTTCGTCATTTTAGTTTCACTCCTTCACATTATTCCAGCCCTTGAA GAAAAATGTAGCAGTGCTTGCTGTTTAATAAGTGGCAGAGCTGTTTTC ACTCCACCTACGCTTGTCTAGGACCAAAATTTTAATCTGTCACTTTGAG CTAAAACTGAAGCACCAAACCGCTACAAAAGAACGTAGGAGCTGAATT GTAACTTGATGGGATTACTATAGCAGTTGCTACAGTTCTAGCTAGCTA CCTTATTCTATACGCATCACCCTAACAACCCGGCTGACTGCTGCATCTG ACCCCACCGTCCCCTGCTCCAAACCAACTCTCCTTTCCTTGCATGCAC TACACCCACTTCCTGCAGCTATATATACCACCATATGCCCATCTTATG AAACCATCCACAAGAGGAGAAGAAACAATCAACCAGCAACACTCTTCTC TTATAACATAGTACAGCGAAGGTAACTCACGGTACCCTGAAGGCTCGA CAAGGCAGTCCACGGAGGAGCTGATATTTGGTGGACAAGCTGTGGAT AGGAGCAACCCTATCCCTAATATACCAGCACCACCAAGTCAGGGCAA TCCCCAGATCACCCCAGCAGATTCGAAGAAGGTACAGTACACACACA TGTATATATGTATGATGTATCCCTTCGATCGAAGGCATGCCTTGGTATA ATCACTGAGTAGTCATTTTATTACTTTGTTTTGACAAGTCAGTAGTTCA TCCATTTGTCCCATTTTTTCAGCTTGGAAGTTTGGTTGCACTGGCCTT GGTCTAATAACTGAGTAGTCATTTTATTACGTTGTTTCGACAAGTCAG TAGCTCATCCATCTGTCCCATTTTTTCAGCTAGGAAGTTTGGTTGCAC TGGCCTTGGACTAATAACTGATTAGTCATTTTATTACATTGTTTCGACA AGTCAGTAGCTCATCCATCTGTCCCATTTTTCAGCTAGGAAGTTCGGAT CTGGGGCCATTTGTTCCAGGCACGGGATAAGCATTCAG (SEQ ID NO:1)

[0091] Em uma modalidade, um cassete de expressão gênica abrange um promotor. Em uma modalidade, um promotor pode ser um promotor quimérico do assunto da divulgação: Em uma modalidade, um cassete de expressão gênica caracterizado pelo fato de abranger um promotor, onde o promotor é pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.8%, ou 100% idêntico a SEQ ID NO:1. Em uma modalidade, um cassete de expressão gênica inclui um promotor quimérico que está ligado operativamente a um transgene. Em uma modalidade, um cassete de expressão gênica que abrange o promotor quimérico pode impulsionar a expressão de dois ou mais transgenes. Em uma modalidade ilustrativa, um cassete de expressão gênica abrange um promotor quimérico que está ligado operativamente a um transgene, onde o transgene pode ser um transgene que proporciona resistência a inseticida, um transgene que proporciona tolerância a herbicida, um transgene que proporciona eficiência de uso do nitrogênio, um transgene que proporciona eficiência do uso da água, um transgene que proporciona qualidade nutricional, um transgene que proporciona ligação de DNA, um transgene que proporciona marcador selecionável, ou combinações do mesmo.

Marcadores Selecionáveis

[0092] Vários marcadores selecionáveis também descritos como genes repórter podem ser incorporados em um vetor da expressão escolhida para permitir a identificação e seleção das plantas transformadas ("transformantes"). Muitos métodos estão disponíveis para confirmar a expressão de marcadores selecionáveis em plantas transformadas, incluindo, por exemplo, sequência de DNA e PCR (reação de cadeia de polimerase), Southern blotting, RNA blotting, métodos imunológicos para a detecção de uma proteína expressa do vetor, por exemplo, a proteína precipitada que media a resistência à fosfinotricina, ou observação visual de outras proteínas tais como genes repórter que codificam β-glucuronidase (GUS), luciferase, proteína verde fluorescente (GFP), proteína amarela fluorescente (YFP), DsRed, β-galactosidase, cloranfenicol acetiltransferase (CAT), fosfatase alcalina, e similares (Veja Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Press, N.Y., 2001, o conteúdo está incorporado aqui por referência em sua totalidade).

[0093] Os marcadores genéticos selecionáveis são utilizados por seleção de células ou tecidos transformados. Os marcadores genéticos selecionáveis incluem genes que codificam resistência a antibiótico, tais como aqueles que codificam neomicina fosfotransferase II (NEO) e higromicina fosfotransferase (HPT) assim como também genes que conferem resistência a compostos herbicidas. Os genes de resistência ao herbicida geralmente codifica para uma proteína alvo modificada, insensível ao herbicida ou para uma enzima que degrada ou desintoxica o herbicida na planta antes que possa agir. Por exemplo, a resistência a glifosato foi obtida por usar genes que codificam para enzimas alvo mutante, 5- enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintase (EPSPS). Genes e mutantes para EPSPS são bem conhecidas e, além disso, descritos abaixo. A resistência ao glufosinato amônio, bromoxinil, e 2,4- diclorofenoxiacetato (2,4-D) foi obtida ao usar os genes bacterianas que codificam pat ou DSM-2, uma nitrilase, um gene aad-1 ou um aad- 12 , que desintoxica os respectivos herbicidas.

[0094] Em uma modalidade, os herbicidas podem inibir o ponto de crescimento ou meristema, incluindo imidazolinona ou sulfoniluréia, e genes por resistência/tolerância de aceto-hidroxiácido-sintase (AHAS) e acetolactato sintase (ALS) para estes herbicidas são bem conhecidos. Os genes de resistência ao glifosato incluem mutante 5- enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintase (EPSPs) e dgt-28 genes (através da introdução de ácido nucleico recombinante e/ou várias formas de mutagênese in vivo de genes EPSPs nativos), genes aroA e genes glifosato acetil transferase (GAT) , respectivamente). Os genes de resistência a outros compostos fósfonos incluem genes de barra de espécies Streptomyces, incluindo Streptomyces hygroscopicus e Streptomyces viridichromogenes e piridinoxina ou ácidos fenóxi propiônicos e ciclo-hexonas (ACCase inibidor- que codifica genes). Os genes exemplares que conferem resistência aos ciclo-hexanodionas e/ou ácido ariloxifenoxipropanoico (incluindo Haloxyfop, Diclofop, Fenoxyprop, Fluazifop, Quizalofop) inclui genes de acetil coenzima A carboxilase (ACCase)--Acc1-S1, Acc1-S2 e Acc1-S3. Em uma modalidade, os herbicidas podem inibir a fotossíntese, incluindo triazina (psbA and 1s+ genes) ou benzonitrila (gene nitrilase).

[0095] Em uma modalidade, os genes marcadores selecionáveis incluem, mas não se limitam a genes que codificam: neomicina fosfotransferase II; cianamida hidratase; aspartato quinase; di-hidrodi- picolinato sintase; triptofano decarboxilase; di-hidrodipicolinato sintase e dessensibilizado aspartato quinase; bar gene; triptofano decarboxilase; neomicina fosfotransferase (NEO); higromicina fosfotransferase (HPT ou HYG); di-hidrofolato redutase (DHFR); fosfinotricina acetitransferase; 2,2-ácido dicloro-propiônico desalogenase; aceto-hidroxiácido sintase; 5-enolpiruvil-shikimate- fosfato sintase (aroA); haloarilnitrilase; acetil-coenzima A carboxilase; di-hidropteroato sintetase (sul I); e 32 kD fotossistema II polipeptídeo (psbA).

[0096] Uma modalidade também inclui genes que codificam resistência ao: cloranfenicol; metotrexato; higromicina; espectinomicina; bromoxinil; glifosato; e fosfinotricina.

[0097] A lista acima dos marcadores genéticos selecionáveis não se destina a ser limitante. Qualquer gene repórter ou marcador selecionável estão abrangidos pela presente invenção.

[0098] Os marcadores genéticos selecionáveis estão sintetizados para a ótima expressão em uma planta. Por exemplo, em uma modalidade, uma sequência codificadora que proporciona um gene tem sido modificado pela otimização do códon para melhorar a expressão em plantas. Um marcador genético selecionável pode ser otimizado por expressão em espécies vegetais em particular ou alternativamente pode ser modificado para expressão ótima em plantas dicotiledôneas ou monocotiledôneas. Os códons preferenciais da planta podem ser determinados dos códons de maior frequência nas proteínas expressas no maior valor nas espécies vegetais em particular de interesse. Em uma modalidade, um marcador genético selecionável está projetado para ser expresso em plantas em um nível alto que resulta em eficiência de transformação mais elevada. Os métodos para otimização de genes vegetais são bem conhecidos. A orientação relativa à otimização e manufatura de sequências de polinucleotídeos sintéticos pode ser encontrado em, por exemplo, WO2013016546, WO2011146524, WO1997013402, Patente U.S. No. 6166302, e Patente U.S. No. 5.380.831, aqui incorporada por referência.

Transgenes

[0099] Os métodos e composições descobertos podem ser usados para expressar sequências genéticas de polinucleotídeos dentro do genoma da planta. Em conformidade, a expressão de genes que codificam a tolerância ao herbicida, resistência ao inseto, nutrientes, moléculas antibióticas ou terapêuticas pode ser impulsionada por um promotor vegetal.

[00100] Em uma modalidade, o elemento regulador quimérico da invenção aqui apresentada está combinado ou ligado operativamente com gene que codifica sequências de polinucleotídeo que proporciona resistência ou tolerância ao glifosato ou outra herbicida, e/ou proporciona resistência para selecionar insetos ou doenças e/ou melhoras nutricionais, e/ou características agronômicas melhoradas, e/ou proteínas ou outros produtos úteis em alimentação, alimentos, industrial, farmacêutico ou outros usos. Os transgenes podem ser "empilhados" com duas ou mais sequências de ácido nucleico de interesse dentro de um genoma vegetal. O empilhamento pode ser realizado, por exemplo, via cultivo de plantas convencional usando dois ou mais eventos, transformação de uma planta com um construto que contém as sequências de interesse, retransformação de uma planta transgênica, ou adição de novos traços através da integração visada via recombinação homóloga.

[00101] Tais sequências de polinucleotídeos de interesse incluem, mas não se limitam a, aqueles exemplos fornecidos abaixo:

[00102] Genes ou Sequência de Codificação (p.ex. iRNA) Que Confere Resistência a Pragas ou Doenças

[00103] Genes Vegetais de Resistência à Doença. As defesas da planta são, muitas vezes, ativadas por interação específica entre o produto de um gene de resistência à doença (R) na planta e no produto de uma correspondente avirulência (Avr) gene no patógeno. Uma variedade de planta pode ser transformada com gene de resistência clonado para elaborar plantas que sejam resistentes a estirpes específicas de patógenos. O exemplos de tais genes incluem, o gene Cf-9 do tomate por resistência a Cladosporium fulvum (Jones et al., 1994 Science 266:789), gene Pto de tomate, que codifica uma proteína quinase, por resistência a Pseudomonas syringae pv. tomate (Martin et al., 1993 Science 262:1432), e gene Arabidopsis RSSP2 para a resistência a Pseudomonas syringae (Mindrinos et al., 1994 Cell 78:1089).

[00104] Uma proteína Bacillus thuringiensis, um derivado da mesma ou um polipeptídeo sintético modelado nele, tais como, uma sequência de nucleotídeo de um gene Bt δ-endotoxina (Geiser et al., 1986 Gene 48:109), e um gene vegetativo inseticida (VIP) (veja, por exemplo, Estruch et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. 93:5389-94). Além do mais, as moléculas de DNA que codificam genes de δ-endotoxina podem ser compradas da American Type Culture Collection (Rockville, Md.), sob o número de acesso ATCC 40098, 67136, 31995 e 31998.

[00105] Uma lectina, tal como, sequências nucleotídicas de vários genes de lecitina de ligação Clivia miniata mannose (Van Damme et al., 1994 Plant Molec. Biol. 24:825).

[00106] Uma vitamina que liga a proteína, tal como avidina e homólogas da avidina que sejam úteis com larvicidas contra pragas de insetos. Veja. Pat. U.S. No. 5.659.026.

[00107] Um inibidor de enzima, por exemplo, um inibidor protease ou um inibidor amilase. Exemplos de tais genes incluem um inibidor da proteinase da cisteína do arroz (Abe et al., 1987 J. Biol. Chem. 262:16793), um inibidor da proteinase do tabaco I (Huub et al., 1993 Plant Molec. Biol. 21:985), e um inibidor α-amilase (Sumitani et al., 1993 Biosci. Biotech. Biochem. 57:1243).

[00108] Um feromona ou hormônio de um específico inseto tal como um ecdisteroide e hormônio juvenil um variante do mesmo, um mimético baseado nele, ou um antagonista ou agonista do mesmo, tais como expressão do baculovirus da esterase do hormônio juvenil clonado, um desativador de hormônio juvenil (Hammock et al., 1990 Nature 344:458).

[00109] Um peptídeo específico inseto ou neuropeptídeo que, sobre expressão, interrompe a fisiologia da praga afetada (J. Biol. Chem. 269:9). Os exemplos de tais genes incluem um receptor de hormônio diurético de inseto (Regan, 1994), um alostatina identificada em Diploptera punctata (Pratt, 1989), e específicos de insetos, neurotoxinas paralíticas (Pat. U.S. No. 5.266.361 ).

[00110] Um veneno específico de inseto produzido na natureza por uma cobra, uma vespa, etc., tal como um peptídeo inseto tóxico de escorpião (Pang, 1992 Gene 116:165).

[00111] Uma enzima responsável por uma hiperacumulação de monoterpene, um sesquiterpene, um esteroide, ácido hidroxâmico, uma derivado fenilpropanoide ou outra molécula não proteína com atividade inseticida.

[00112] Uma enzima envolvida na modificação, incluindo a modificação pós-translacional, de uma molécula biologicamente ativa; por exemplo, enzima glicolítica, uma enzima proteolítica, uma enzima lipolítica, uma nuclease, uma ciclase, uma transaminase, uma esterase, uma hidrolase, uma fosfatase, uma quinase, uma fosforilase, uma polimerase, uma elastase, uma chitinase e um glucanase, seja natural ou sintético. Os exemplos de tais genes incluem, um gene callas (Pedido Publicado PCT WO93/02197), sequências de codificação de chitinase (que pode ser obtida, por exemplo, de ATCC sob o números de acesso 3999637 e 67152), tabaco ancylostoma chitinase (Kramer et al., 1993 Insect Molec. Biol. 23:691), e gene ubi4- 2 poliubiquitina de salsinha (Kawalleck et al., 1993 Plant Molec. Biol. 21:673).

[00113] Uma molécula que estimula a transdução de sinal. Os exemplos de tais moléculas incluem sequências de nucleotídeos para clones de calmodulina cDNA do feijão mung (Botella et al., 1994 Plant Molec. Biol. 24:757) e uma sequência de nucleotídeo de um clone de calmodulina cDNA do milho (Griess et al., 1994 Plant Physiol. 104:1467).

[00114] Um peptídeo momento hidrofóbico. Veja. Patentes U.S. Nos. 5.659.026 e 5.607.914 ; o último ensina os peptídeos sintéticos antimicrobianos que confere resistência à doença.

[00115] Uma membrana permease, um antigo canal ou um bloqueador de canal, tal como um peptídeo cecropina-β lítico análogo (Jaynes et al., 1993 Plant Sci. 89:43) o qual produz plantas de tabaco transgênicas resistentes a Pseudomonas solanacearum.

[00116] Uma proteína invasiva viral ou uma toxina complexa derivada da mesma. Por exemplo, a acumulação das proteínas de revestimento viral em células vegetais transformadas confere resistência à infecção viral e/ou desenvolvimento de doença efetuada pelos vírus dos quais o gene de revestimento da proteína é derivado, assim como também pelos vírus relacionados. A resistência da proteína mediada por revestimento tem sido conferida em plantas transformadas contra o vírus do mosaico da alfafa, vírus do mosaico do pepino, vírus da listrado do tabaco, vírus X da batata, vírus Y da batata, vírus de gravar tabaco, vírus do guizo do tabaco e vírus do mosaico do tabaco. Veja, por exemplo, Beachy et al. (1990) Ann. Rev. Phytopathol. 28:451.

[00117] Um anticorpo específico de inseto ou uma imunotoxina derivada do mesmo. Assim, um anticorpo orientado a uma função metabólica crítica no inseto que poderia desativar uma enzima afetada, matando o inseto. Veja, por exemplo, Taylor et al. (1994) Abstract #497, Seventh Int'l. O Symposium on Molecular Plant-Microbe Interactions mostra desativação enzimática no tabaco transgênico via produção de fragmentos de anticorpos de cadeia simples.

[00118] Um anticorpo específico de vírus. Veja, por exemplo, Tavladoraki et al. (1993) Nature 266:469, que mostra que as plantas transgênicas que expressam genes de anticorpos recombinantes estão protegidas do ataque de vírus.

[00119] Uma proteína bloqueadora de desenvolvimento produzida na natureza por um patógeno ou um parasita. Assim, a endo α-1,4-D poligalacturonases fúngica facilita a colonização fúngica e libera nutrientes da planta pela solubilização da parede da célula vegetal homo-α-1,4-D-galacturonase (Lamb et al., 1992) Bio/Technology 10:1436. A clonagem e caracterização de um gene que codifica uma proteína que inibe a endopoligalacturonase do feijão é descrita por Toubart et al. (1992 Plant J. 2:367).

[00120] Uma proteína bloqueadora do desenvolvimento produzida na natureza por uma planta, tal como o gene que desativa o ribossomo da cevada que proporciona um aumento da resistência à doença fúngica (Longemann et al., 1992). Bio/Technology 10:3305.

[00121] interferência de RNA, na qual uma molécula de RNA é usada para inibir a expressão de um gene alvo. Uma molécula de RNA de um exemplo é parcialmente ou totalmente de duplo filamento, o que ativa uma resposta silenciadora, resultando na clivagem de dsRNA em pequenos RNAs que interferem, os quais então são incorporados em um complexo alvo que destrói mRNAs homólogos. Veja, por exemplo, Fire et al., Patente U.S. 6.506.559 ; Graham et al.6.573.099.

[00122] Genes Que Conferem Resistência a um Herbicida

[00123] Genes que codificam resistência ou tolerância a um herbicida que inibe o ponto de crescimento ou meristema, tal como um herbicida imidazalinona, sulfonanilida ou sulfonilureia. Os genes exemplares nesta categoria codificam para mutante acetolactato sintase (ALS) (Lee et al., 1988 EMBOJ. 7:1241) também conhecida como acetohidroxiácido sintase (AHAS) enzima (Miki et al., 1990 Theor. Appl. Genet. 80:449).

[00124] Um ou mais genes adicionais que codificam resistência ou tolerância ao glifosato conferida por genes sintase EPSP mutante e aroA , ou através de desativação metabólica por genes tais como DGT-28, 2mEPSPS, GAT (glifosato acetiltransferase) ou GOX (glifosato oxidase) e outros compostos fósfonos tais como glufosinato (genes pat, bar, e dsm-2 ), e ácidos ariloxifenoxipropiônicos e ciclo- hexanodionas (genes que codificam inibidor ACCase). Veja, por exemplo, Pat. U.S. No. 4.940.835, as quais apresentam a sequência de nucleotídeo de uma forma de EPSP que pode conferir resistência ao glifosato. Uma molécula de DNA que codifica um gene aroA mutante pode ser obtida de acordo com o Número de Acesso de ATCC 39256, e a sequência de nucleotídeo de um gene mutante é apresentada na Pat. U.S. No. 4.769.061. O pedido de patente europeia No. 0 333 033 e Pat. U.S. No. 4.975.374. apresentam sequências de nucleotídeos de genes de sintetase de glutamina que conferem resistência a herbicidas tais como L-fosfinotricina. A sequência de nucleotídeo de um gene de transferase de fosfinotricinacetil é fornecida no pedido europeu No. 0 242 246. De Greef et al. (1989) Bio/Technology 7:61 descreve a produção de plantas transgênica que expressa genes barra quiméricos que codificam para a atividade de transferase de fosfinotricina acetil. Os exemplares de genes que conferem resistência aos ácidos ariloxifenoxipropiônicos e ciclo- hexanodionas, tais como setoxidim e haloxifop, são os genes Accl-S1, Accl-S2 e Accl-S3 descritos por Marshall et al. (1992) Theor. Appl. Genet. 83:435.

[00125] Genes que codificam resistência ou tolerância a um herbicida que inibe a fotossínteses, tal como uma triazina (genes psbA e gs+ ) e uma benzonitrila (gene nitrilase ). Przibilla et al. (1991) Célula Vegetal 3:169 descreve o uso de plasmídeos que codificam genes psbA mutantes para transformar Clamidomonas. As sequências de nucleotídeos para genes nitrilase são apresentadas na Pat. U.S. No. 4.810.648, e moléculas de DNA que contêm estes genes estão disponíveis sob os números de acesso ATCC 53435, 67441 e 67442. A clonagem e expressão de código de DNA para uma glutationa S- transferase são descritas por Hayes et al. (1992) Biochem. J. 285:173.

[00126] Genes que codificam resistência ou tolerância a herbicida que liga a Hidroxifenilpiruvato Dioxigenasa (HPPD), enzimas que catalisam a reação na qual para-hidroxifenilpiruvato (HPP) é transformado em homogentisate. Isto inclui herbicidas tais como isoxazóis (EP418175, EP470856, EP487352, EP527036, EP560482, EP682659, Pat. U.S. No. 5.424.276 ), em particular isoxaflutol, que é um herbicida seletivo para milho, diketonitrilas (EP496630, EP496631), em particular 2-ciano-3-ciclopropil-1-(2-SO2CH3-4-CF3 fenil)propano- 1,3-diona e 2-ciano-3-ciclopropil-1-(2-SO2CH3-4-2,3Cl2fenil)propano- 1,3-diona, tricetonas (EP625505, EP625508, Pat. U.S. No. 5.506.195), em particular sulcotriona, e pirazolinatos. Um gene que produz um excesso de HPPD em plantas pode fornecer tolerância ou resistência a tais herbicidas, incluindo, por exemplo, genes descritos nas Patentes U.S. Nos. 6.268.549 e 6.245. 968 e no Pedido de Patente U.S. , Publicação No. 20030066102.

[00127] Genes que codificam resistência ou tolerância aos herbicidas fenóxi auxina, tais como ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4- D) e os quais podem também conferir resistência ou tolerância aos herbicidas ariloxifenoxipropionato (AOPP). Os exemplos destes genes incluem o gene α-ketoglutarate-dependente dioxigenase enzima (aad- 1), descrito na Patente U.S. No. 7.838.733.

[00128] Genes que codificam resistência ou tolerância aos herbicidas fenóxi auxina, tais como ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4- D) e os quais podem também conferir resistência ou tolerância aos herbicidas piridiloxi auxina, tal como fluroxipir ou triclopir. Os exemplos destes genes incluem o gene α-cetoglutarato-dependente de dioxigenase enzima (aad-12) , descrito na WO 2007/053482 A2.

[00129] Genes que codificam resistência ou tolerância a dicamba (veja, por exemplo, Publicação de Patente U.S. No. 20030135879).

[00130] Os genes que proporcionam resistência ou tolerância aos herbicidas que inibem protoporfirinogênio oxidase (PPO) (veja Pat. U.S. No. 5.767.373).

[00131] Genes que proporcionam resistência ou tolerância aos herbicidas triazina (tais como atrazina) e herbicidas derivados de ureia (tais como diuron) que se ligam aos principais centros de reações de proteínas do fotossistema II (PS II) (Veja Brussian et al., (1989) EMBO J. 1989, 8(4): 1237-1245.

[00132] Genes Que Conferem ou Contribuem a um Traço de Valor Agregado

[00133] Metabolismo de ácido graxo modificado, por exemplo, pela transformação do milho ou Brassica com um gene antissenso ou estearoil-ACP desaturase para aumentar o conteúdo de ácido esteárico da planta (Knultzon et al., 1992) Proc. Nat. Acad. Sci. EUA 89:2624.

[00134] Menor conteúdo de fitato

[00135] Introdução de um gene que codifica uma fitase, tal como o gene Aspergillus niger fitase (Van Hartingsveldt et al., 1993 Gene 127:87), melhora a repartição de fitato, acrescentando mais fosfato livre para a planta transformada.

[00136] Poderia ser introduzido um gene que reduz o conteúdo de fitato. Em milho, isto, por exemplo, poderia ser atingido pela clonagem e então reintroduzindo DNA associado com o único alelo que é responsável por mutantes de milho caracterizados pelos baixos níveis de ácido fítico (Raboy et al., 1990 Maydica 35:383).

[00137] A composição modificada de hidrato de carbono efetuada, por exemplo, pela transformação de plantas com um gene que codifica para uma enzima que altera o padrão de ramificação do amido. Os exemplos destas enzimas incluem, gene Streptococcus mucus fructosiltransferase (Shiroza et al., 1988) J. Bacteriol. 170:810, gene Bacillus subtilis levansucrase (Steinmetz et al., 1985 Mol. Gen. Genel. 200:220), Bacillus licheniformis α-amilase (Pen et al., 1992 Bio/Technology 10:292), genes da invertase do tomate (Elliot et al., 1993), gene da amilase da cebada (Sogaard et al., 1993 J. Biol. Chem. 268:22480), e endosperma de milho enzima de ramificação do milho II (Fisher et al., 1993 Plant Physiol. 102:10450).

Transformação

[00138] Os métodos adequados para a transformação de plantas incluem qualquer método que o DNA pode ser introduzido em uma célula, por exemplo, e sem limitação: eletroporação (veja, por exemplo, Patente U.S. 5.384.253); bombardeamento de microprojéteis (veja, por exemplo, Patentes U.S. 5.015.580; 5.550.318; 5.538.880; 6.160.208; 6.399.861; e 6.403.865); transformação mediada por Agrobacterium (veja, por exemplo, Patentes U.S. 5.635.055; 5.824.877; 5.591.616; 5.981.840; e 6.384.301); e transformação protoplasto (veja, por exemplo, Patente U.S. 5.508.184 ). Estes métodos podem ser usados para transformar de forma estável ou transitória uma planta.

[00139] Um construto de DNA pode ser introduzido diretamente no DNA genômico da célula vegetal usando técnicas tais como agitação como fibras de carboneto de silício (Veja, por exemplo, Patentes U.S. 5.302.523 e 5.464.765), ou os construtos de DNA podem ser introduzidos diretamente ao tecido vegetal usando métodos biolíticos, tais como bombardeamento de partículas de DNA (veja, por exemplo, Klein et al., (1987) Nature 327:70-73). Alternativamente, o construto de DNA pode ser introduzido em uma célula vegetal via transformação de nanopartícula (veja, por exemplo, Publicação de Patente U.S. No. 2009/0104700, incorporado aqui por referência em sua integridade).

[00140] Além disso, a transferência de gene pode ser atingida usando bactéria ou vírus não Agrobacterium tais como Rhizobium sp. NGR234, Sinorhizoboium meliloti, Mesorhizobium loti, vírus X da batata, vírus de mosaico da couve-flor e vírus do mosaico do veio da mandioca e/ou vírus do mosaico do tabaco, veja, por exemplo, Chung et al. (2006) Trends Plant Sci. 11(1):1-4.

[00141] Através da aplicação das técnicas de transformação, as células de virtualmente qualquer espécie de plantas podem ser transformadas estavelmente, e estas células podem ser desenvolvidas em plantas transgênicas por técnicas bem conhecidas. Por exemplo, as técnicas que podem ser particularmente úteis no contexto da transformação do algodão estão descritos nas Patentes U.S. 5.846.797; 5.159.135; 5.004.863; e 6.624.344; técnicas para a transformação de plantas Brassica em particular são descritos, por exemplo, na Patente U.S. 5.750.871; técnicas para a transformação de soja estão descritas, por exemplo, na Patente U.S. 6.384.301; e técnicas para a transformação do milho estão descritas, por exemplo, nas Patentes U.S. 7.060.876 e 5.591.616, e Publicação Internacional PCT WO 95/06722.

[00142] Após efetuar a entrega de um ácido nucleico exógeno para a célula receptora, uma célula transformada está geralmente identificada por cultivo adicional e regeneração da planta. Com o objetivo de melhorar a capacidade de identificar transformantes, pode- se desejar empregar um marcador genético selecionável com o vetor de transformação usado para gerar o transformante. Em uma modalidade ilustrativa, uma população de célula transformada pode ser doseada pela exposição de células a um agente ou agentes seletivos, ou as células podem ser examinado para o traço de marcador genético desejado.

[00143] As células que sobrevivem a exposição a um agente seletivo, ou células que tiveram qualificação positiva em um teste de rastreio, pode ser cultivado em um meio que suporta a regeneração de plantas. Em uma modalidade, qualquer meio de cultivo de tecido vegetal adequado pode ser modificado ao incluir substâncias adicionais, tais como reguladores de crescimento. O tecido pode ser mantido em um meio básico com reguladores de crescimento até que tecido suficiente esteja disponível para começar os esforços de regeneração da planta, ou seguindo rodadas repetidas de seleção manual, até que a morfologia do tecido seja adequada para a regeneração (por exemplo, pelo menos 2 semanas), então é transferido para meio conducente para a formação de brotos. Os cultivos são transferidos periodicamente até que tenha ocorrido suficiente formação de brotos. Uma vez que os brotos estejam formados, são transferidos a um meio conducente para a formação de raiz. Uma vez suficientes raízes sejam formadas, as plantas podem ser transferidas para o solo para crescimento e amadurecimento adicional.

[00144] Para confirmar a presença de um ácido nucleico desejado que abranja construtos proporcionados na regeneração de plantas, uma variedade de ensaios pode ser realizada. Tais ensaios podem incluir: ensaios biológicos moleculares, tais como Southern e Northern blotting e PCR; ensaios bioquímicos, tais como detecção da presença de um produto da proteína, por exemplo, por meios imunológicos (ELISA, western blots, e/ou LC-MS MS espectrofotometria) ou por função enzimática; ensaios de parte da planta, tais como ensaios de folha ou raiz; e/ou análise do fenótipo de toda a planta regenerada.

[00145] Os eventos transgênicos podem ser selecionados, por exemplo, pela amplificação de PCR usando, por exemplo, iniciadores de oligonucleotídeos específicos para moléculas de ácido nucleico de interesse. Entende-se que a determinação de genótipo PCR inclui, mas não se limita a, reação de cadeia de polimerase (PCR) amplificação do DNA genômico derivado do tecido de calo isolado da planta anfitriã previsto para conter uma molécula de ácido nucleico de interesse integrada no genoma, seguido por clonagem padrão e análise de sequência dos produtos de amplificação da PCR. Os métodos de determinação de genótipos PCR têm sido bem descritos (veja, por exemplo, Rios et al. (2002) Plant J. 32:243-53), e pode ser aplicados ao DNA genômico derivado de qualquer espécie de planta ou tipo de tecido, incluindo cultivos de células. As combinações de iniciadores de oligonucleotídeos que se ligam tanto à sequência alvo como à sequência introduzida pode ser usada sequencialmente ou multiplexado nas reações de amplificação de PCR.Os iniciadores oligonucleotídeos projetados para temperar o sítio alvo, as sequências de ácidos nucleico introduzidos, e/ou combinações dos dois podem ser produzidos. Assim, as estratégias de determinação de genótipo PCR podem incluir, por exemplo, e sem limitação: amplificação de sequências específicas no genoma da planta; amplificação de múltiplas sequências específicas no genoma da planta; amplificação de sequências não específicas no genoma da planta; e combinações de qualquer um dos supracitados. Os conhecedores da técnica podem elaborar combinações adicionais de iniciadores e reações de amplificação para interrogar o genoma. Por exemplo, um conjunto de iniciadores de oligonucleotídeos diretos e reversos pode ser projetado para temperar a(s) sequência(s) de ácido nucleico específico para os alvos externos aos limites da sequência de ácido nucleico introduzido.

[00146] Os iniciadores de oligonucleotídeos diretos e reversos podem ser projetados para temperar especificamente a uma molécula de ácido nucleico introduzida, por exemplo, em uma sequência correspondente a uma região de codificação dentro de uma sequência de nucleotídeo de interesse incluída aqui, ou outras partes da molécula de ácido nucleico. Os iniciadores podem ser usados em conjunção com os iniciadores descritos aqui. Os iniciadores de oligonucleotídeos podem ser sintetizados de acordo com a sequência desejada e estão comercialmente disponíveis (por exemplo, de Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IA). A amplificação pode ser seguida pela clonagem e sequencialmente ou por análise direta de sequências dos produtos da amplificação. Em uma modalidade, os iniciadores de oligonucleotídeos específicos para o gene alvo são empregados nas amplificações PCR.

Método de Expressão de um Transgene

[00147] Em uma modalidade, um método de expressão de pelo menos um transgene em uma planta abrange o crescimento uma planta que inclui um promotor quimérico ligado operativamente a pelo menos um transgene. Em uma modalidade, um método de expressão de pelo menos um transgene em um tecido vegetal ou célula vegetal abrange o cultivo de uma planta que inclui um promotor quimérico ligado operativamente a pelo menos um transgene. Em uma modalidade, um método de expressão de pelo menos um transgene em uma planta abrange o crescimento um tecido vegetal ou célula vegetal que inclui um promotor quimérico ligado operativamente a pelo menos um transgene. Em uma modalidade, um método de expressão de pelo menos um transgene em um tecido vegetal ou célula vegetal abrange o cultivo de um tecido vegetal ou uma célula vegetal que inclui um promotor quimérico ligado operativamente a pelo menos um transgene.

[00148] Em uma modalidade, um método de expressão de pelo menos um transgene em uma planta abrange o crescimento de uma planta que inclui um cassete de expressão gênica que inclui um promotor quimérico ligado operativamente a pelo menos um transgene.

[00149] Em uma modalidade, um método de expressão de pelo menos um transgene em um tecido vegetal ou célula vegetal abrange o cultivo de um tecido vegetal ou uma célula vegetal que inclui um cassete de expressão gênica que abrange um promotor quimérico ligado operativamente a pelo menos um transgene.

[00150] Em uma modalidade, uma planta, um tecido vegetal ou célula vegetal abrange um cassete de expressão gênica que abrange um promotor quimérico ligado operativamente a pelo menos um transgene. Onde, o promotor quimérico abrange um promotor a montante, íntron e 5’ -UTR. Em uma modalidade, uma planta, um tecido vegetal ou célula vegetal abrange um cassete de expressão gênica que abrange um promotor a montante, íntron e 5’ -UTR. Em uma modalidade, o promotor a montante, íntron e 5’ -UTR é um polinucleotídeo de SEQ ID NO:1. Em uma modalidade, uma planta, um tecido vegetal ou célula vegetal abrange um cassete de expressão gênica que abrange um promotor a montante, íntron e 5’ -UTR, onde o promotor a montante, o íntron, e 5’-UTR é pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.8%, ou 100% idêntico a SEQ ID NO:1. Em uma modalidade ilustrativa, uma planta, um tecido vegetal ou célula vegetal abrange um cassete de expressão gênica que abrange um promotor a montante, íntron e 5’ -UTR, que está ligado operativamente a um transgene, onde o transgene pode ser um transgene que proporciona resistência a inseticida, um transgene que proporciona tolerância a herbicida, um transgene que proporciona eficiência de uso do nitrogênio, um transgene que proporciona eficiência do uso da água, um transgene que proporciona qualidade nutricional, um transgene que proporciona ligação de DNA, um transgene que proporciona marcador selecionável, ou combinações do mesmo.

[00151] Em uma modalidade, uma planta, um tecido vegetal ou célula vegetal abrange um cassete de expressão gênica que abrange um promotor quimérico ligado operativamente a pelo menos um transgene. Onde, o promotor quimérico abrange um promotor a montante, íntron e 5’ -UTR. O promotor a montante, íntron, e 5’ -UTR pode estar ligado operativamente a diferentes transgenes dentro de um cassete de expressão gênica quando um cassete de expressão gênica inclui dois ou mais transgenes. Em uma modalidade ilustrativa, um cassete de expressão gênica abrange um promotora montante, íntron e 5’-UTR que está ligado operativamente a um transgene, onde o transgene pode ser um transgene que proporciona resistência a inseticida, um transgene que proporciona tolerância a herbicida, um transgene que proporciona eficiência de uso do nitrogênio, um transgene que proporciona eficiência do uso da água, um transgene que proporciona qualidade nutricional, um transgene que proporciona ligação de DNA, um transgene que proporciona marcador selecionável, ou combinações do mesmo.

[00152] Em uma modalidade, a expressão do transgene usando métodos descritos aqui é preferivelmente expressa dentro de tecidos radiculares vegetais. Em uma modalidade, a expressão do transgene usando mais de um transgene expresso dentro de tecidos radiculares vegetais. Em uma modalidade, um método de crescimento de planta transgênica como é descrito aqui inclui expressão transgênica preferencial de raiz. Em uma modalidade, um método de expressão um transgene em um tecido vegetal ou célula vegetal inclui tecidos radiculares preferidos e células de raiz preferidos. Em uma modalidade, a expressão de radicular preferencial inclui a expressão radicular preferencial do milho.

[00153] Em uma modalidade, uma planta, um tecido vegetal ou célula vegetal abrange um vetor que inclui um elemento regulador promotor do gene quimérico como é descrito aqui. Em uma modalidade, uma planta, um tecido vegetal ou célula vegetal abrange um vetor que abrange um elemento regulador de promotor de gene quimérico ligado operativamente a um transgene como é descrito aqui. Em uma modalidade, uma planta, um tecido vegetal ou célula vegetal abrange um vetor que inclui um cassete de expressão gênica como é descrito aqui. Em uma modalidade, um vetor pode ser um plasmídeo, um cosmídeo, cromossomo artificial de bactéria (BAC), um bacteriófago, ou um fragmento de vírus.

[00154] Em uma modalidade, uma planta, um tecido vegetal ou célula vegetal de acordo com os métodos apresentados aqui pode ser monocotiledôneo. A planta, o tecido vegetal ou a célula vegetal monocotiledônea pode ser, mas não se limita a milho, arroz, trigo, cana-de-açúcar, cevada, centeio, sorgo, orquídeas, bambu, banana, amentilho, lírios, aveia, cebola, painço e triticale.

[00155] Em uma modalidade, uma planta, um tecido vegetal ou célula vegetal de acordo com os métodos apresentados aqui pode ser dicotiledônea. As plantas, o tecido vegetal e a célula vegetal dicotiledônea podem ser, mas não se limita a colza, canola, mostarda da Índia, mostarda da Etiópia, soja, girassol e algodão.

[00156] Com relação a produção de plantas geneticamente modificadas, os métodos para a engenharia genética de plantas são bem conhecidos da técnica. Por exemplo, inúmeros métodos de transformação vegetal foram desenvolvidos, incluindo protocolos de transformação biológica e física para plantas dicotiledôneas assim como também de plantas monocotiledôneas (Por exemplo,Goto- Fumiyuki et al., Nature Biotech 17:282-286 (1999); Miki et al., Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick, B. R. e Thompson, J. E. Eds., CRC Press, Inc., Boca Raton, pp. 67-88 (1993)). Além disso, os vetores e métodos de cultivo in vitro para transformação e regeneração de célula ou tecido vegetal de plantas estão disponíveis, por exemplo, em Gruber et al., Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick, B. R. e Thompson, J. E. Eds., CRC Press, Inc., Boca Raton, pp. 89-119 (1993).

[00157] Os conhecedores da técnica reconhecerão que após a sequência exógena estar incorporada estavelmente em plantas transgênicas e confirmado para ser operável, pode ser introduzido em outras plantas por cruzamento sexual. Qualquer um de número de técnicas de reprodução padrão pode ser usado, dependendo das espécies a serem cruzadas.

[00158] Uma célula, calo, tecido ou planta transformada pode ser identificado e isolado pelo selecionamento ou triagem os materiais da planta projetada para traços codificados pelos marcadores genéticos presentes na DNA transformado. Por exemplo, a seleção pode ser realizada pelo crescimento do material vegetal projetado sobre meio que contém uma quantia inibitória do antibiótico ou herbicida para o qual o construto do gene transformado confere resistência. Além disso, as células transformadas também podem ser identificadas pela triagem para as atividades de quaisquer marcadores genéticos visíveis (Por exemplo,os genes yfp, gfp, β-glucuronidase, luciferase, B ou C1 ) que podem estar presentes nos construtos de ácido nucleico recombinantes. Tais metodologias de seleção e triagem são bem conhecidas para os conhecedores da técnica.

[00159] Métodos físicos e bioquímicos podem também ser usados para identificar planta ou célula vegetal transformante que contenha construtos genéticos inseridos. Estes métodos incluem, mas não se limitam a: 1) Análise Southern ou amplificação de PCR para detecção e determinação da estrutura do DNA recombinante inserido; 2) Northern blot, S1 RNase proteção, extensão iniciadora ou transcriptase reversa-amplificação de PCR para detectar e examinar RNA transcritos dos construtos genético; 3) ensaios enzimáticos para detectar atividade de enzima ou ribozima, onde tais produtos genéticos são codificados pelo construto genético; 4) análise de sequenciamento da próxima geração (NGS); 5) eletroforese gel da proteína, técnicas western blot, imunoprecipitação, ou prova de imunoadsorção enzimática (ELISA), onde o produtos do construto genético são proteínas. As técnicas adicionais, tal como hibridação in situ, coloração enzimática e imunocoloração, também podem ser usadas para detectar a presença ou expressão do construto recombinante em órgãos e tecidos vegetais específicos. Os métodos para fazer todos estes ensaios são bem conhecidos para os conhecedores da técnica.

[00160] Os efeitos da manipulação genética que usam os métodos expostos aqui podem ser observados pelos, por exemplo, Northern blots do RNA (Por exemplo,mRNA) isolado dos tecidos de interesse. Geralmente, se o mRNA está presente ou o total do mRNA aumentou, pode ser assumido que o correspondente transgene está sendo expresso. Outros métodos de medida de atividade genética e/ou polipeptídeo codificado pode ser usado. Os diferentes tipos de ensaios enzimáticos podem ser usados, dependendo do substrato usado e o método de detecção do aumento ou diminuição de um produto de reação ou pelo-produto. Além disso, os níveis de polipeptídeos expressos podem ser medidos imunoquimicamente, ou seja, ELISA, RIA, EIA e outros ensaios baseados em anticorpos bem conhecidos daqueles experimentados na técnica, tais como ensaios de detecção eletroforética (seja com coloração ou western blotting). Como um exemplo não limitante, a detecção do AAD-1 (ariloxialcanoato dioxigenase; veja WO 2005/107437) e PAT (fosfinotricina-N-acetil- transferase) proteínas usando um ensaio ELISA é descrito na Publicação de Patente No. 20090093366 dos E.U.A. que é, neste documento, incorporado por referência em sua integridade. O transgene pode ser expresso seletivamente em alguns tipos de células ou tecidos vegetais ou em alguma etapa de desenvolvimento, ou o transgene pode ser expresso em todas os tecidos vegetais substancialmente, substancialmente ao longo de todo o seu ciclo de vida. No entanto, qualquer modo de expressão combinatório também é aplicável.

[00161] A presente invenção também abrange sementes de plantas transgênicas descritas acima onde a semente inclui o cassete de expressão transgênica ou genética. A presente invenção, além disso, abrange a progênie, clones, linhas celulares ou células de plantas transgênicas descritos acima onde diz progênie, clone, linhas celular ou célula abrange o construto transgênico ou genético.

[00162] Enquanto a invenção foi descrita com referência a métodos e modalidades específicos, serão apreciadas que várias modificações e mudanças podem ser feitas sem afastar-se da invenção.

EXEMPLOS Exemplo 1: Elementos reguladores do promotor genético quimérico novo

[00163] As sequências do promotor quimérico são feitos de uma sequências de polinucleotídeos promotor a montantes que foi obtido de Peroxidase 5 de milho (Zea mays) seguido pelo íntron 6 do gene da álcool-desidrogenase do milho (Zea mays) e Vírus do Listrado do Milho 5’ -UTR. A sequência promotora a montante do 1,642 bp peroxidase 5 de milho (Zea mays) (SEQ ID NO:2), é mostrada com sublinhado. O Vírus do Listrado do Milho 117 bp 5’ -UTR (também é referido como uma sequência líder) sequência (SEQ ID NO:3) é mostrada em letras minúsculas. A sequência 341 bp íntron 6 do gene da álcool-desidrogenase do milho (Zea mays) (SEQ ID NO:4) está em itálicas. ACCACTGTTGTAACTTGTAAGCCACTAGCTCACGTTCTCCATGAGC TCTTCTCTCTGCTGTTTCTTCCTCTGCTAACTGCGTTATGATATGA CGTCGTATAAATAATCTCACAATACTTCCTTATTTTCAGCATGGCC TCTTTTATGTTTATTTAACAGTAGCAACCAACGCCGCTCGATGTTT CCTTCAAGAAACGGCCACTCACTATGTGGTGTGCAGAAGAACAA ATGTAAGCAGCTCCTACAGGTACCAGTAGTCATGTCAGTGTGGA AGCTTTCCAACCAACGCCTCCTTCGAGGAACCTGGTCGTGCTGA CATGAATGTAGGCCATGCAAGCACAAGCACCTAACGCGAATCAT CACGACGCGCCGTGTACTGGGCGTTGGTACATCACACCCCGCG TTTGACCTGATCGGAAGCATGCGTGTGTGTTGGCTGCAGGACCG GCTATAGGTTTCCTGCATTGGACAGCAGAAGCCAGTCATGTTAG GÇAÇTÇAÇGÇGÇTÇÇTGÇÇGTTTGATGAATÇATÇÇGGTÇTTTÇG TATTGATCACTAGTTCACTACGCTGATATAGCAAATTTTAAGATG TGAAAÇÇAÇGAGAÇGAGÇGATAAATÇTTAGAÇGTTAÇÇTATÇÇA TATGAAGÇTTGTGÇGAAAAAAAGGÇGTGÇÇGÇTGTAGÇATÇATT ÇGTATAÇAÇTTTTGTÇÇÇÇAAAGAÇAGGGATAÇGAATÇÇATGÇTÇ GAÇAGAAÇÇÇTÇÇÇTTÇÇÇTGÇAGATAAÇGAÇAÇTTAAGTATAA ÇAAAAGTAGTTGGATTATTTÇAGAAGÇAAAATÇTÇAÇTTTTÇGÇT GGÇÇTTTTTGTAÇTTTGGTTAÇTTGAGTTÇAGAÇAGTGTATGÇTA TATTGTÇATGTGÇTGÇGTAAGGTTTAAATATGGTTÇGAÇAAATATA TÇAGTATATÇAÇTAÇTTTGTTATGGGTGGGGÇÇTAGÇAÇAAAÇTT GATAÇAGÇTAGGATAAAGTTAGAAÇGATGAÇTGATÇTAÇTGTAAA GÇGAÇAÇÇTGTÇÇTGTTATGGTAGTTTAAGTÇÇATTÇÇTGGAÇGA ÇTÇÇAGATÇÇAGGATATGATGÇTGTTAÇATAATGÇGATTGTTÇAÇ AATAAAATTGCATGATGTTCTTCTACTCTTTAGGCAGTTTTGTTCA ACAGGCAAGTTGCATAATGCATGTGCATATATGAGCAGCATAATC ATCAATTAATCATAGGTTCGTCATTTTAGTTTCACTCCTTCACATT ATTCCAGCCCTTGAAGAAAAATGTAGCAGTGCTTGCTGTTTAATA AGTGGCAGAGCTGTTTTCACTCCACCTACGCTTGTCTAGGACCA AAATTTTAATCTGTCACTTTGAGCTAAAACTGAAGCACCAAACCGC TACAAAAGAACGTAGGAGCTGAATTGTAACTTGATGGGATTACTA TAGCAGTTGCTACAGTTCTAGCTAGCTACCTTATTCTATACGCAT ÇAÇÇÇTAAÇAAÇÇÇGGÇTGAÇTGÇTGÇATÇTGAÇÇÇÇAÇÇGTÇÇ ÇÇTGÇTÇÇAAAÇÇAAÇTÇTÇÇTTTÇÇTTGÇATGÇAÇTAÇAÇÇÇAÇ TTÇÇTGÇAGÇTATATATAÇÇAÇÇATATGÇÇÇATÇTTATGAAAÇÇAT ÇÇAÇAAGAGGAGAAGAAAÇAATÇAAÇÇAGÇAAÇAÇTÇTTÇTÇTTA TAAÇATAGTAÇAGÇGAAGGTAAÇTÇAÇGGTAÇÇctgaaggctcgacaagg cagtccacggaggagctgatatttggtggacaagctgtggataggagcaaccctatccctaatat accagcaccaccaagtcagggcaatccccagatcaÇÇÇÇAGÇAGATTÇGAAGA AGGTACAGTACACACACATGTATATATGTATGATGTATCCCTTCG ATCGAAGGCATGCCTTGGTATAATCACTGAGTAGTCATTTTATTA CTTTGTTTTGACAAGTCAGTAGTTCATCCATTTGTCCCATTTTTTC AGCTTGGAAGTTTGGTTGCACTGGCCTTGGTCTAATAACTGAGTA GTCATTTTATTACGTTGTTTCGACAAGTCAGTAGCTCATCCATCTG TCCCATTTTTTCAGCTAGGAAGTTTGGTTGCACTGGCCTTGGACT AATAACTGATTAGTCATTTTATTACATTGTTTCGACAAGTCAGTAG CTCATCCATCTGTCCCATTTTTCAGÇTAGGAAGTTÇGGATÇTGGG GÇÇATTTGTTÇÇAGGÇAÇGGGATAAGÇATTÇAG (SEQ ID NO:1)

Exemplo 2: Design do construto

[00164] A menos que seja indicado o contrário, as manipulações moleculares biológicas e bioquímicas descritas neste e no exemplo subsequente foram realizados pelas metodologias padrão como é descrito em, por exemplo, Ausubel et al. (1995), e Sambrook et al. (1989), e atualizações dos mesmos. Os construtos usados nos experimentos (TABELA 1) são descritos mais detalhadamente abaixo.

[00165] Construto pDAS5144 (e.g. pDAB3620) foi construído contendo dois cassetes de expressão gênica. O primeiro cassete de expressão gênica (SEQ ID NO:5) contido no promotor a montante de Peroxidase 5 de milho (Zea mays) (Pedido de Patente Internacional No. 1998/056921) seguido pelo Íntron 6 do gene da álcool- desidrogenase do milho (Zea mays) (Dennis et al., (1984) Nucleic Acids Res. 12:3983-4000) e Vírus Listrado do Milho 5’ -UTR (Mullineaux et al., (1984) EMBO J. 3:3063-3068) ligado operativamente ao transgene tcdA (Pedido de Patente No. 2009/0221501 dos E.U.A.) e flanqueado pelo Peroxidase 5 de milho (Zea mays) 3’ -UTR (Pedido de Patente Internacional No. 1998/056921). O segundo cassete de expressão gênica continha um marcador genético selecionável e foi feito do promotor Oryza sativa Actin (Patente No. 6.429.357 dos E.U.A.) ligado operativamente a fosfinotricina acetil transferase (Wohlleben et al., (1988) Gene 70: 2537) transgene e terminado pelo Zea mays Lipase 3’ -UTR (Patente No. 7.179.902 dos E.U.A). Este construto foi mobilizado no vetor binário Superbinário pSB1(Tabaco do Japão, Tóquio, JP). Os construtos usados para completar pDAS5144 onde foi confirmado molecularmente via digestão da enzima de restrição e sequenciamento de DNA. TACAAAAAAGCAGGCTCCGCAAGCTTGCATGCCTGCAGATCCCC GGGGATCTCCGCGGGGGCCCACCACTGTTGTAACTTGTAAGCCA CTAGCTCACGTTCTCCATGAGCTCTTCTCTCTGCTGTTTCTTCCTC TGCTAACTGCGTTATGATATGACGTCGTATAAATAATCTCACAATA CTTCCTTATTTTCAGCATGGCCTCTTTTATGTTTATTTAACAGTAGC AACCAACGCCGCTCGATGTTTCCTTCAAGAAACGGCCACTCACTA TGTGGTGTGCAGAAGAACAAATGTAAGCAGCTCCTACAGGTACCA GTAGTCATGTCAGTGTGGAAGCTTTCCAACCAACGCCTCCTTCGA GGAACCTGGTCGTGCTGACATGAATGTAGGCCATGCAAGCACA AGCACCTAACGCGAATCATCACGACGCGCCGTGTACTGGGCGT TGGTACATCACACCCCGCGTTTGACCTGATCGGAAGCATGCGTG TGTGTTGGCTGCAGGACCGGCTATAGGTTTCCTGCATTGGACAG CAGAAGCCAGTCATGTTAGGCACTCACGCGCTCCTGCCGTTTG ATGAATCATCCGGTCTTTCGTATTGATCACTAGTTCACTACGCT GATATAGCAAATTTTAAGATGTGAAACCACGAGACGAGCGATAAA TCTTAGACGTTACCTATCCATATGAAGCTTGTGCGAAAAAAAGG CGTGCCGCTGTAGCATCATTCGTATACACTTTTGTCCCCAAAGA CAGGGATACGAATCCATGCTCGACAGAACCCTCCCTTCCCTGCA GATAACGACACTTAAGTATAACAAAAGTAGTTGGATTATTTCAGA AGCAAAATCTCACTTTTCGCTGGCCTTTTTGTACTTTGGTTACT TGAGTTCAGACAGTGTATGCTATATTGTCATGTGCTGCGTAAGG TTTAAATATGGTTCGACAAATATATCAGTATATCACTACTTTGTTA TGGGTGGGGCCTAGCACAAACTTGATACAGCTAGGATAAAGTTA GAACGATGACTGATCTACTGTAAAGCGACACCTGTCCTGTTATG GTAGTTTAAGTCCATTCCTGGACGACTCCAGATCCAGGATATGAT GCTGTTACATAATGCGATTGTTCACAATAAAATTGCATGATGTT CTTCTACTCTTTAGGCAGTTTTGTTCAACAGGCAAGTTGCATAA TGCATGTGCATATATGAGCAGCATAATCATCAATTAATCATAGGTT CGTCATTTTAGTTTCACTCCTTCACATTATTCCAGCCCTTG AAGAAAAATGTAGCAGTGCTTGCTGTTTAATAAGTGGCAGAGC TGTTTTCACTCCACCTACGCTTGTCTAGGACCAAAATTTTAATC TGTCACTTTGAGCTAAAACTGAAGCACCAAACCGCTACAAAA GAACGTAGGAGCTGAATTGTAACTTGATGGGATTACTATAGCAG TTGCTACAGTTCTAGCTAGCTACCTTATTCTATACGCATCACCC TAACAACCCGGCTGACTGCTGCATCTGACCCCACCGTCCCCTG CTCCAAACCAACTCTCCTTTCCTTGCATGCACTACACCCACTTCC TGCAGCTATATATACCACCATATGCCCATCTTATGAAACCATCCA CAAGAGGAGAAGAAACAATCAACCAGCAACACTCTTCTCTTATAA CATAGTACAGCGAAGGTAACTCACGGTACCCTGAAGGCTCGACA AGGCAGTCCACGGAGGAGCTGATATTTGGTGGACAAGCTGTGG ATAGGAGCAACCCTATCCCTAATATACCAGCACCACCAAGTCAG GGCAATCCCCAGATCACCCCAGCAGATTCGAAGAAGGTACAGTA CACACACATGTATATATGTATGATGTATCCCTTCGATCGAAGGCA TGCCTTGGTATAATCACTGAGTAGTCATTTTATTACTTTGTTTTGA CAAGTCAGTAGTTCATCCATTTGTCCCATTTTTTCAGCTTGGAAG TTTGGTTGCACTGGCACTTGGTCTAATAACTGAGTAGTCATTTTA TTACGTTGTTTCGACAAGTCAGTAGCTCATCCATCTGTCCCATTT TTTCAGCTAGGAAGTTTGGTTGCACTGGCCTTGGACTAATAACT GATTAGTCATTTTATTACATTGTTTCGACAAGTCAGTAGCTCAT CCATCTGTCCCATTTTTCAGCTAGGAAGTTCGGATCTGGGGCC ATTTGTTCCAGGCACGGGATAAGCATTCAGCCATGGCTAATGAG TCAGTCAAGGAGATCCCGGATGTTCTCAAATCCCAGTGTGGTTT CAACTGCCTCACGGACATCTCCCACAGCTCATTCAATGAGTTCC GCCAGCAAGTCTCTGAGCACCTCTCATGGTCGGAGACGCATGA CCTCTACCACGATGCTCAGCAAGCCCAGAAAGACAACCGGCTG TATGAGGCACGGATCCTCAAGAGGGCCAACCCGCAGCTCCAGA ATGCGGTCCACCTCGCCATCCTTGCTCCAAATGCGGAATTGATTG GCTACAATAACCAATTCTCGGGAAGGGCCTCACAGTATGTTGCG CCTGGCACAGTTTCGTCCATGTTCAGCCCAGCAGCGTACCTCA CAGAGCTGTACAGAGAGGCGAGGAACCTTCATGCGTCTGACTCC GTGTACTATCTGGACACACGCAGACCGGACCTGAAGTCAATGGC CCTCAGCCAGCAAAACATGGACATTGAACTGTCCACCCTTTCCT TGAGCAATGAGCTTCTGTTGGAATCCATCAAGACTGAGAGCAAG CTGGAAAACTACACAAAGGTGATGGAGATGCTGTCCACCTTCA GACCATCTGGAGCGACTCCATACCACGATGCCTATGAGAATG TGAGGGAGGTCATTCAGCTTCAAGACCCTGGCCTTGAGCAGCT CAATGCCAGCCCAGCCATTGCGGGACTGATGCACCAAGCCTC CCTGCTTGGGATCAATGCCTCCATCAGCCCTGAGCTGTTCAACA TCTTGACTGAAGAGATCACTGAGGGCAATGCGGAGGAACTGTA CAAGAAAAACTTCGGCAACATTGAGCCTGCCAGCCTTGCAATG CCGGAATACCTGAAACGCTATTACAACTTGTCGGATGAGGAAC TTTCGCAGTTCATTGGCAAAGCCTCAAACTTTGGGCAGCAAGAG TACAGCAACAATCAGCTCATCACACCTGTTGTGAACTCATCTGA TGGCACTGTGAAGGTTTACCGCATCACAAGGGAGTACACCACAA ATGCCTACCAGATGGATGTTGAACTGTTCCCGTTTGGAGGTGAA AACTACCGGCTTGACTACAAGTTCAAGAACTTCTACAATGCATCC TACCTGTCGATCAAGCTGAACGACAAACGGGAGCTTGTGAGGA CGGAAGGTGCTCCCCAAGTGAACATTGAATACTCTGCCAACAT CACACTCAACACAGCGGACATCAGCCAGCCGTTTGAAATTGGC TTGACCAGAGTGCTTCCCTCGGGCTCCTGGGCCTATGCGGCAG CCAAGTTTACGGTTGAGGAGTACAACCAGTACAGCTTCCTCC TGAAGCTCAACAAGGCAATCCGGCTGAGCAGAGCCACTGAG CTGTCACCCACCATCCTGGAGGGCATTGTGAGGTCTGTCAAC CTTCAGCTTGACATCAACACTGATGTGCTTGGCAAGGTGTTCC TGACCAAGTATTACATGCAGCGCTATGCCATCCATGCGGAGA CGGCACTGATCCTCTGCAATGCACCCATATCGCAGCGCTCGTA TGACAACCAGCCCAGCCAGTTCGACAGACTCTTCAACACTCCC CTTCTGAACGGCCAGTACTTCAGCACTGGAGATGAAGAGATTGA CCTGAACTCTGGCTCGACGGGTGACTGGAGGAAAACCATCTTG AAGAGGGCCTTCAACATTGATGACGTTTCCCTCTTCCGCCTTTT GAAGATCACAGATCACGACAACAAGGATGGCAAGATCAAGAAV CAATCTCAAGAACCTTTCCAACCTCTACATTGGCAAACTGCTTG CAGACATCCACCAGCTGACCATTGATGAGTTGGACCTGTTGC TGATTGCAGTTGGTGAGGGCAAGACCAACCTCTCTGCAATCTCA GACAAACAGTTGGCAACCCTCATCCGCAAGCTGAACACGATCA CAAGCTGGCTTCACACGCAGAAGTGGTCTGTTTTCCAACTGTT CATCATGACCAGCACGTCCTACAACAAGACCCTGACTCCGGAGA TCAAGAACCTTTTGGATACAGTCTATCATGGTCTCCAAGGCTT TGACAAGGACAAGGCGGACCTGCTTCATGTCATGGCACCCTACA TTGCAGCCACACTCCAGCTCTCCTCTGAAAATGTTGCCCACTCA GTGCTGTTGTGGGCTGACAAGCTCCAGCCTGGGGATGGAGCC ATGACTGCTGAGAAGTTCTGGGACTGGCTCAACACGAAGTACA CACCTGGCTCCTCTGAGGCAGTTGAGACTCAAGAACACATTGTG CAGTACTGCCAAGCGCTTGCACAGTTGGAGATGGTTTACCACT CAACTGGCATCAACGAGAATGCCTTCCGCCTCTTTGTCACAAAGC CTGAGATGTTTGGTGCTGCCACTGGAGCCGCTCCTGCCCATG ATGCCCTGTCACTCATCATGTTGACGAGGTTTGCAGACTGGGT CAACGCCCTTGGTGAGAAAGCCTCGTCTGTCCTGGCAGCCTT TGAAGCCAACTCCCTGACTGCGGAACAGCTTGCGGATGCCA TGAACCTTGATGCCAACTTGCTCCTGCAAGCTTCGATCCAAG CCCAGAACCATCAGCATTTGCCACCTGTCACGCCTGAAAATGCG TTCTCATGCTGGACCTCCATCAACACCATACTCCAGTGGGTGAA CGTGGCGCAACAGCTCAATGTGGCACCTCAAGGAGTGTCAGCG CTGGTTGGGCTTGACTACATCCAGTCCATGAAGGAGACACCGAC CTACGCGCAGTGGGAGAATGCAGCTGGCGTCTTGACAGCTGG TCTGAACTCACAGCAAGCCAACACGCTGCATGCGTTCTTGGATG AGAGCCGCTCTGCTGCCCTCAGCACGTACTATATCCGGCAAGTT GCCAAGGCAGCGGCTGCCATCAAGTCTCGGGATGACCTCTACC AGTACTTGCTCATTGACAATCAGGTTTCTGCTGCCATCAAAACGA CCCGGATTGCTGAGGCCATAGCCAGCATCCAGCTCTACGTCAA CAGAGCGCTTGAGAACGTTGAAGAGAATGCCAACTCTGGAGTG ATTTCTCGCCAGTTTTTCATAGACTGGGACAAGTACAACAAGCGC TACTCCACCTGGGCTGGGGTCTCTCAGCTTGTCTACTATCCTG AGAACTACATAGATCCGACGATGCGGATTGGCCAGACCAAGAT GATGGATGCCCTCCTTCAGTCGGTGTCCCAGAGCCAGCTCAATG CTGACACTGTGGAGGATGCCTTCATGAGCTACCTCACCTCCTTCG AGCAAGTTGCCAACCTCAAGGTCATCTCTGCTTACCACGACAAC ATCAACAATGACCAAGGGCTCACCTACTTCATTGGCCTGTCTGA AACTGATGCGGGTGAGTATTACTGGCGCTCAGTGGACCACAG CAAGTTCAACGATGGCAAGTTTGCTGCAAATGCCTGGTCTGAG TGGCACAAGATTGACTGCCCCATCAACCCGTACAAGTCCACCAT CAGACCTGTCATCTACAAGAGCCGCTTGTACTTGCTCTGGCTT GAGCAGAAGGAAATCACGAAGCAGACTGGCAACTCCAAAGAT GGCTACCAGACTGAGACGGACTACCGCTATGAGTTGAAACTTG CTCACATCCGCTATGATGGTACATGGAACACTCCGATAACGT TTGATGTGAACAAGAAGATTTCGGAGCTGAAACTGGAGAAGAA CAGAGCGCCTGGGCTCTACTGTGCTGGCTACCAAGGGGAAGA TACGCTGTTGGTGATGTTCTACAACCAGCAAGACACCCTTGAC TCGTACAAGAACGCTTCCATGCAAGGCCTCTACATCTTTGCTGA CATGGCTTCCAAAGACATGACTCCGGAGCAGAGCAATGTCTAC CGGGACAACTCCTACCAGCAATTTGACACCAACAATGTTCGGA GGGTCAATAACCGCTATGCGGAAGATTATGAGATCCCAAGCTCA GTGTCTAGCCGCAAGGACTATGGCTGGGGAGACTACTATCTCAG CATGGTGTACAATGGTGACATACCCACGATCAACTACAAGGCTG CCTCCTCAGACCTGAAGATATACATCAGCCCCAAGCTCCGCAT CATTCACAATGGCTATGAGGGCCAGAAGAGGAACCAGTGCAAC TTGATGAACAAGTATGGCAAACTTGGGGACAAGTTCATTGTCTA CACCTCGCTTGGTGTGAACCCGAACAATTCCTCGAACAAGCTCA TGTTCTACCCGGTCTACCAGTACAGCGGCAACACCTCTGGCT TGAACCAAGGGAGGCTCCTGTTCCACAGAGACACCACGTACC CGAGCAAGGTGGAGGCGTGGATTCCTGGTGCCAAAAGGTCACT CACCAACCAGAATGCAGCCATTGGTGATGACTATGCCACAGACA GCCTGAACAAGCCTGATGACCTGAAGCAGTACATCTTCATGAC TGACTCCAAGGGCACAGCCACTGATGTGTCTGGTCCGGTGGA GATCAACACTGCAATCAGCCCAGCCAAGGTCCAAATCATTGTCA AAGCTGGTGGCAAGGAACAGACCTTCACAGCTGACAAAGATGT GAGCATCCAGCCAAGCCCCTCCTTTGATGAGATGAACTACCAG TTCAACGCTCTTGAAATTGATGGCTCGGGACTCAACTTCATCAA CAATTCGGCTTCAATTGATGTGACGTTCACTGCCTTTGCGGAG GATGGGAGGAAATTGGGCTATGAGAGCTTCTCAATACCAGTCAC CTTGAAGGTTTCCACTGACAATGCACTCACGCTTCATCACAAC GAGAATGGAGCGCAGTACATGCAATGGCAGAGCTACCGCACA AGGTTGAACACCCTCTTTGCAAGGCAACTTGTGGCCAGAGCCA CGACTGGCATTGACACCATACTCAGCATGGAAACGCAGAACAT CCAAGAGCCACAGTTGGGCAAGGGTTTCTATGCCACCTTTGTG ATCCCACCCTACAACCTGTCAACGCATGGTGATGAGCGCTGGTT CAAGCTGTACATCAAGCACGTGGTTGACAACAATTCCCACATCA TATACTCGGGTCAGCTCACTGACACGAACATCAACATCACCCTG TTCATCCCACTTGATGACGTTCCCCTGAACCAAGACTACCATG CCAAGGTCTACATGACCTTCAAGAAATCACCGTCAGATGGCAC CTGGTGGGGACCGCACTTCGTTCGGGATGACAAAGGCATTGT CACAATCAACCCCAAGTCCATACTCACCCACTTTGAGTCTGTGAA TGTTCTGAATAACATCTCCTCAGAGCCGATGGACTTCTCGGGTG CCAACTCCCTGTACTTCTGGGAGTTGTTCTATTACACGCCGATG CTTGTGGCGCAGAGGTTGCTCCATGAACAGAACTTTGATGAGG CCAACCGCTGGCTCAAGTATGTCTGGAGCCCCTCGGGTTACA TTGTGCATGGCCAGATCCAGAACTACCAATGGAATGTTCGCCCA TTGCTTGAGGACACCTCCTGGAACTCTGACCCCCTTGACTCGG TGGACCCTGATGCGGTGGCTCAGCATGACCCCATGCACTACAAG GTCTCAACCTTCATGAGGACCCTGGACCTTCTGATTGCCAGAG GAGACCATGCTTACCGCCAATTGGAACGGGACACACTGAATG AGGCAAAGATGTGGTACATGCAAGCTCTGCACCTCTTGGGAGA CAAGCCGTACCTCCCGCTCAGCACCACATGGTCAGACCCAAGG TTGGACAGAGCAGCTGACATCACAACTCAGAATGCTCATGAC TCTGCCATTGTGGCTCTGAGGCAGAACATCCCAACACCTGCG CCACTGTCGCTGAGATCTGCGAACACCCTGACAGACCTGTT CCTCCCCCAGATCAATGAGGTCATGATGAACTACTGGCAAAC CTTGGCGCAGCGGGTCTACAACCTCCGCCACAACCTCTCCA TTGATGGGCAGCCGCTGTACCTCCCAATCTATGCCACACCAG CTGACCCAAAGGCGCTTCTCAGCGCAGCTGTGGCCACGAG CCAAGGGGGAGGCAAGCTCCCTGAGAGCTTCATGTCGCTCTG GAGGTTTCCCCACATGTTGGAGAATGCCAGAGGCATGGTGAG CCAACTGACTCAGTTTGGCTCGACGCTCCAGAACATCATTGA GAGGCAAGATGCAGAGGCTCTGAATGCGTTGCTCCAGAATCA AGCAGCTGAGTTGATCCTGACGAACCTGTCAATCCAAGACAAGA CCATTGAGGAACTTGATGCGGAAAAGACAGTCCTTGAAAAGAG CAAGGCTGGAGCCCAAAGCCGGTTCGACTCATATGGCAAGCTG TATGATGAGAACATCAATGCTGGGGAGAATCAAGCCATGACCC TGAGGGCTTCAGCAGCGGGTCTGACCACGGCAGTGCAAGCG TCTCGCTTGGCTGGGGCTGCGGCTGACCTCGTTCCCAACATC TTTGGGTTTGCTGGTGGCGGATCAAGGTGGGGAGCCATTGCA GAAGCAACGGGCTATGTGATGGAGTTCTCTGCCAATGTCATGAA CACTGAGGCAGACAAAATCAGCCAATCGGAGACCTACAGACG GAGACGGCAAGAATGGGAGATACAAAGGAACAATGCAGAGGCA GAACTGAAGCAAATAGATGCCCAACTGAAGTCCTTGGCTGTCA GAAGGGAGGCTGCGGTCCTCCAAAAGACCTCCCTCAAGACCCA GCAAGAGCAAACCCAGTCCCAGTTGGCGTTCCTCCAGAGGAAG TTCTCGAACCAAGCGCTGTACAACTGGCTGAGGGGAAGGTTGG CAGCCATCTACTTCCAGTTCTATGACCTTGCTGTGGCCAGATG CCTCATGGCGGAACAAGCCTACCGCTGGGAACTGAATGATGAC TCTGCCAGATTCATCAAACCGGGTGCATGGCAAGGCACATATG CTGGACTCCTTGCTGGGGAGACACTCATGCTCTCATTGGCCCA GATGGAGGATGCTCACCTCAAACGGGACAAGAGGGCTCTGGA AGTGGAGCGGACAGTCAGCCTTGCGGAGGTCTATGCGGGACTG CCCAAAGACAATGGACCATTTTCGTTGGCGCAAGAGATAGACA AGTTGGTCAGCCAAGGGTCTGGATCAGCGGGTTCTGGAAACAA CAATCTGGCGTTCGGTGCTGGCACTGACACCAAGACGTCCC TCCAAGCCTCAGTCTCCTTTGCTGACCTGAAGATAAGGGAGGAC TACCCAGCGTCCCTTGGGAAGATCAGACGCATCAAGCAGATTT CAGTGACCCTGCCAGCTCTTCTGGGTCCATACCAAGATGTTCA AGCGATCCTCTCCTATGGGGACAAGGCTGGTTTGGCGAATGG CTGTGAGGCCCTTGCTGTGTCACATGGCATGAATGACTCTGGG CAGTTCCAGCTTGATTTCAACGATGGCAAGTTCCTGCCATT CGAGGGCATAGCCATTGATCAAGGCACCCTGACCCTCTCCTT CCCCAATGCTTCGATGCCAGAGAAGGGAAAACAAGCCACCATG CTCAAGACCCTGAATGATATCATACTCCACATCCGCTACACCAT CAAGTGAGTAGTTAGCTTAATCACCTAGAGCTCGTTTAAAC TGAGGGCACTGAAGTCGCTTGATGTGCTGAATTGTTTGTGATG TTGGTGGCGTATTTTGTTTAAATAAGTAAGCATGGCTGTGATTT TATCATATGATCGATCTTTGGGGTTTTATTTAACACATTGTAAAA TGTGTATCTATTAATAACTCAATGTATAAGATGTGTTCATTCTT CGGTTGCCATAGATCTGCTTATTTGACCTGTGATGTTTTGAC TCCAAAAACCAAAATCACAACTCAATAAACTCATGGAATATG TCCACCTGTTTCTTGAAGAGTTCATCTACCATTCCAGTTGGCATT TATCAGTGTTGCAGCGGCGCTGTGCTTTGTAACATAACAATTGT TACGGCATATATCCAACGGCCGGCCTAGGCCACGGTGGCCAGA TCCACTAGAGGCGCGCCTCTAGTTCTAGAGCGGCCGCTTAATT CACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGG CGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCA GCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCA ACAGTTGCAAATGGCGCGCCGACCCAGCTTTC (SEQ ID NO:5)

[00166] Construto pDAS5128 (Por exemplo, pDAB3619) foi construído contendo dois cassetes de expressão gênica. O primeiro cassete de expressão gênica (SEQ ID NO:6) continha o promotor Zea mays Ubiquitina 1 (Christensen et al., (1992) Plant Molecular Biology 18; 675-689) seguido por íntron 6 do gene da álcool-desidrogenase do milho (Zea mays) (Dennis et al., (1984) Nucleic Acids Res. 12:39834000) e Vírus Listrado do Milho 5’ -UTR (Mullineaux et al., (1984) EMBO J. 3:3063-3068) ligado operativamente ao transgene tcdA (Pedido de Patente No. 2009/0221501 dos E.U.A.) e flanqueado pelo Peroxidase 5 de milho (Zea mays) 3’ -UTR (Pedido de Patente Internacional No. 1998/056921). O segundo cassete de expressão gênica continha um marcador genético selecionável e foi feito do promotor Oryza sativa Actin (Patente No. 6.429.357 dos E.U.A.) ligado operativamente a fosfinotricina acetil transferase (Wohlleben et al., (1988) Gene 70: 25-37) transgene e terminado pelo Zea mays Lipase 3’ -UTR (Patente No. 7.179.902 dos E.U.A). Este construto foi mobilizado no vetor binário Superbinário pSB1(Tabaco do Japão, Tóquio, JP). Os construtos usados para completar pDAS5128 onde foi confirmado molecularmente via digestão da enzima de restrição e sequenciamento de DNA. O novo promotor Zea mays Ubiquitina 1 seguido por Íntron 6 do gene da álcool-desidrogenase do milho (Zea mays) e Vírus Listrado do Milho 5’ -UTR é apresentado aqui como SEQ ID NO:7. GTGCAGCGTGACCCGGTCGTGCCCCTCTCTAGAGATAATGAG CATTGCATGTCTAAGTTATAAAAAATTACCACATATTTTTTTTGT CACACTTGTTTGAAGTGCAGTTTATCTATCTTTATACATATATT TAAACTTTACTCTACGAATAATATAATCTATAGTACTACAATAATA TCAGTGTTTTAGAGAATCATATAAATGAACAGTTAGACATGGTC TAAAGGACAATTGAGTATTTTGACAACAGGACTCTACAGTTTTA TCTTTTTAGTGTGCATGTGTTCTCCTTTTTTTTTGCAAATAGCTT CACCTATATAATACTTCATCCATTTTATTAGTACATCCATTTAGGG TTTAGGGTTAATGGTTTTTATAGACTAATTTTTTTAGTACATCTA TTTTATTCTATTTTAGCCTCTAAATTAAGAAAACTAAAACTCTATTT TAGTTTTTTTATTTAATAGTTTAGATATAAAATAGAATAAAATAAAG TGACTAAAAATTAAACAAATACCCTTTAAGAAATTAAAAAAAC TAAGGAAACATTTTTCTTGTTTCGAGTAGATAATGCCAGCCTGT TAAACGCCGTCGACGAGTCTAACGGACACCAACCAGCGAACCA GCAGCGTCGCGTCGGGCCAAGCGAAGCAGACGGCACGGCATCT CTGTCGCTGCCTCTGGACCCCTCTCGAGAGTTCCGCTCCA CCGTTGGACTTGCTCCGCTGTCGGCATCCAGAAATTGCGTGGCG GAG CGGCAGACGTGAGCCGGCACGGCAGGCGGCCTCCTCCTCCTCTC ACGGCACCGGCAGCTACGGGGGATTCCTTTCCCACCGCTCC TTCGCTTTCCCTTCCTCGCCCGCCGTAATAAATAGACACCCCC TCCACACCCTCTTTCCCCAACCTCGTGTTGTTCGGAGCGCACACA CACACAACCAGATCTCCCCCAAATCCACCCGTCGGCACCTCCGC TTCAAGGGTACCCTGAAGGCTCGACAAGGCAGTCCACGGAGGAG CTGATATTTGGTGGACAAGCTGTGGATAGGAGCAACCCTATCCC TAATATACCAGCACCACCAAGTCAGGGCAATCCCCAGATCACCC CAGCAGATTCGAAGAAGGTACAGTACACACACATGTATATATGTA TGATGTATCCCTTCGATCGAAGGCATGCCTTGGTATAATCACTGA GTAGTCATTTTATTACTTTGTTTTGACAAGTCAGTAGTTCATCCAT TTGTCCCATTTTTTCAGCTTGGAAGTTTGGTTGCACTGGCACTTG GTCTAATAACTGAGTAGTCATTTTATTACGTTGTTTCGACAAGTCA GTAGCTCATCCATCTGTCCCATTTTTTCAGCTAGGAAGTTTGGTT GCACTGGCCTTGGACTAATAACTGATTAGTCATTTTATTACATTGTT TCGACAAGTCAGTAGCTCATCCATCTGTCCCATTTTTCAGCTAG GAAGTTCGGATCTGGGGCCATTTGTTCCAGGCACGGGATAAG CATTCAGCCATGGCTAATGAGTCAGTCAAGGAGATCCCGGATG TTCTCAAATCCCAGTGTGGTTTCAACTGCCTCACGGACATCTC CCACAGCTCATTCAATGAGTTCCGCCAGCAAGTCTCTGAGCAC CTCTCATGGTCGGAGACGCATGACCTCTACCACGATGCTCAG CAAGCCCAGAAAGACAACCGGCTGTATGAGGCACGGATCCTCA AGAGGGCCAACCCGCAGCTCCAGAATGCGGTCCACCTCGCC ATCCTTGCTCCAAATGCGGAATTGATTGGCTACAATAACCAATT CTCGGGAAGGGCCTCACAGTATGTTGCGCCTGGCACAGTTTCG TCCATGTTCAGCCCAGCAGCGTACCTCACAGAGCTGTACAGA GAGGCGAGGAACCTTCATGCGTCTGACTCCGTGTACTATCTGGA CACACGCAGACCGGACCTGAAGTCAATGGCCCTCAGCCAGC AAAACATGGACATTGAACTGTCCACCCTTTCCTTGAGCAATGAG CTTCTGTTGGAATCCATCAAGACTGAGAGCAAGCTGGAAAACTA CACAAAGGTGATGGAGATGCTGTCCACCTTCAGACCATCTGGAG CGACTCCATACCACGATGCCTATGAGAATGTGAGGGAGGTCATT CAGCTTCAAGACCCTGGCCTTGAGCAGCTCAATGCCAGCCCAG CCATTGCGGGACTGATGCACCAAGCCTCCCTGCTTGGGATCAA TGCCTCCATCAGCCCTGAGCTGTTCAACATCTTGACTGAAGAGA TCACTGAGGGCAATGCGGAGGAACTGTACAAGAAAAACTTCGG CAACATTGAGCCTGCCAGCCTTGCAATGCCGGAATACCTGAAA CGCTATTACAACTTGTCGGATGAGGAACTTTCGCAGTTCATTGG CAAAGCCTCAAACTTTGGGCAGCAAGAGTACAGCAACAATCAG CTCATCACACCTGTTGTGAACTCATCTGATGGCACTGTGAAGGTT TACCGCATCACAAGGGAGTACACCACAAATGCCTACCAGATGGA TGTTGAACTGTTCCCGTTTGGAGGTGAAAACTACCGGCTTGAC TACAAGTTCAAGAACTTCTACAATGCATCCTACCTGTCGATCAAG CTGAACGACAAACGGGAGCTTGTGAGGACGGAAGGTGCTCCC CAAGTGAACATTGAATACTCTGCCAACATCACACTCAACACAGC GGACATCAGCCAGCCGTTTGAAATTGGCTTGACCAGAGTGCTT CCCTCGGGCTCCTGGGCCTATGCGGCAGCCAAGTTTACGGTT GAGGAGTACAACCAGTACAGCTTCCTCCTGAAGCTCAACAAGG CAATCCGGCTGAGCAGAGCCACTGAGCTGTCACCCACCATCC TGGAGGGCATTGTGAGGTCTGTCAACCTTCAGCTTGACATCAA CACTGATGTGCTTGGCAAGGTGTTCCTGACCAAGTATTACATG CAGCGCTATGCCATCCATGCGGAGACGGCACTGATCCTCTGCAA TGCACCCATATCGCAGCGCTCGTATGACAACCAGCCCAGCCAG TTCGACAGACTCTTCAACACTCCCCTTCTGAACGGCCAGTACTT CAGCACTGGAGATGAAGAGATTGACCTGAACTCTGGCTCGACG GGTGACTGGAGGAAAACCATCTTGAAGAGGGCCTTCAACATTG ATGACGTTTCCCTCTTCCGCCTTTTGAAGATCACAGATCACGAC AACAAGGATGGCAAGATCAAGAACAATCTCAAGAACCTTTCCA ACCTCTACATTGGCAAACTGCTTGCAGACATCCACCAGCTGAC CATTGATGAGTTGGACCTGTTGCTGATTGCAGTTGGTGAGGGCA AGACCAACCTCTCTGCAATCTCAGACAAACAGTTGGCAACCCT CATCCGCAAGCTGAACACGATCACAAGCTGGCTTCACACGCA GAAGTGGTCTGTTTTCCAACTGTTCATCATGACCAGCACGTCCTA CAACAAGACCCTGACTCCGGAGATCAAGAACCTTTTGGATACAG TCTATCATGGTCTCCAAGGCTTTGACAAGGACAAGGCGGACCTG CTTCATGTCATGGCACCCTACATTGCAGCCACACTCCAGCTCTCC TCTGAAAATGTTGCCCACTCAGTGCTGTTGTGGGCTGACAAGCT CCAGCCTGGGGATGGAGCCATGACTGCTGAGAAGTTCTGGGACT GGCTCAACACGAAGTACACACCTGGCTCCTCTGAGGCAGTTGA GACTCAAGAACACATTGTGCAGTACTGCCAAGCGCTTGCACAG TTGGAGATGGTTTACCACTCAACTGGCATCAACGAGAATGCCTT CCGCCTCTTTGTCACAAAGCCTGAGATGTTTGGTGCTGCCACTG GAGCCGCTCCTGCCCATGATGCCCTGTCACTCATCATGTTGA CGAGGTTTGCAGACTGGGTCAACGCCCTTGGTGAGAAAGCC TCGTCTGTCCTGGCAGCCTTTGAAGCCAACTCCCTGACTGCGGA ACAGCTTGCGGATGCCATGAACCTTGATGCCAACTTGCTCCTG CAAGCTTCGATCCAAGCCCAGAACCATCAGCATTTGCCACCTGT CACGCCTGAAAATGCGTTCTCATGCTGGACCTCCATCAACACCA TACTCCAGTGGGTGAACGTGGCGCAACAGCTCAATGTGGCACC TCAAGGAGTGTCAGCGCTGGTTGGGCTTGACTACATCCAGTCC ATGAAGGAGACACCGACCTACGCGCAGTGGGAGAATGCAGC TGGCGTCTTGACAGCTGGTCTGAACTCACAGCAAGCCAACACG CTGCATGCGTTCTTGGATGAGAGCCGCTCTGCTGCCCTCAG CACGTACTATATCCGGCAAGTTGCCAAGGCAGCGGCTGCCAT CAAGTCTCGGGATGACCTCTACCAGTACTTGCTCATTGACAAT CAGGTTTCTGCTGCCATCAAAACGACCCGGATTGCTGAGGCCA TAGCCAGCATCCAGCTCTACGTCAACAGAGCGCTTGAGAACG TTGAAGAGAATGCCAACTCTGGAGTGATTTCTCGCCAGTTTTTCA TAGACTGGGACAAGTACAACAAGCGCTACTCCACCTGGG CTGGGGTCTCTCAGCTTGTCTACTATCCTGAGAACTACATAGA TCCGACGATGCGGATTGGCCAGACCAAGATGATGGATG CCCTCCTTCAGTCGGTGTCCCAGAGCCAGCTCAATGCTGACAC TGTGGAGGATGCCTTCATGAGCTACCTCACCTCCTTCGAGCAAG TTGCCAACCTCAAGGTCATCTCTGCTTACCACGACAACATCAACA ATGACCAAGGGCTCACCTACTTCATTGGCCTGTCTGAAAC TGATGCGGGTGAGTATTACTGGCGCTCAGTGGACCACAGCAAG TTCAACGATGGCAAGTTTGCTGCAAATGCCTGGTCTGAGTGGCA CAAGATTGACTGCCCCATCAACCCGTACAAGTCCACCATCAGAC CTGTCATCTACAAGAGCCGCTTGTACTTGCTCTGGCTTGAGCA GAAGGAAATCACGAAGCAGACTGGCAACTCCAAAGATGGCTAC CAGACTGAGACGGACTACCGCTATGAGTTGAAACTTGCTCACA TCCGCTATGATGGTACATGGAACACTCCGATAACGTTTGATG TGAACAAGAAGATTTCGGAGCTGAAACTGGAGAAGAACAGAGCG CCTGGGCTCTACTGTGCTGGCTACCAAGGGGAAGATACGCTG TTGGTGATGTTCTACAACCAGCAAGACACCCTTGACTCGTACAAG AACGCTTCCATGCAAGGCCTCTACATCTTTGCTGACATGGC TTCCAAAGACATGACTCCGGAGCAGAGCAATGTCTACCGGGA CAACTCCTACCAGCAATTTGACACCAACAATGTTCGGAGGGTCA ATAACCGCTATGCGGAAGATTATGAGATCCCAAGCTCAGTGTC TAGCCGCAAGGACTATGGCTGGGGAGACTACTATCTCAGCATGG TGTACAATGGTGACATACCCACGATCAACTACAAGGCTGCCT CCTCAGACCTGAAGATATACATCAGCCCCAAGCTCCGCATCATT CACAATGGCTATGAGGGCCAGAAGAGGAACCAGTGCAACTTG ATGAACAAGTATGGCAAACTTGGGGACAAGTTCATTGTCTACAC CTCGCTTGGTGTGAACCCGAACAATTCCTCGAACAAGCTCATG TTCTACCCGGTCTACCAGTACAGCGGCAACACCTCTGGCTTG AACCAAGGGAGGCTCCTGTTCCACAGAGACACCACGTACCC GAGCAAGGTGGAGGCGTGGATTCCTGGTGCCAAAAGGTCACTCA CCAACCAGAATGCAGCCATTGGTGATGACTATGCCACAGACAG CCTGAACAAGCCTGATGACCTGAAGCAGTACATCTTCATGAC TGACTCCAAGGGCACAGCCACTGATGTGTCTGGTCCGGTGGA GATCAACACTGCAATCAGCCCAGCCAAGGTCCAAATCATTGTCA AAGCTGGTGGCAAGGAACAGACCTTCACAGCTGACAAAGATG TGAGCATCCAGCCAAGCCCCTCCTTTGATGAGATGAACTACCAG TTCAACGCTCTTGAAATTGATGGCTCGGGACTCAACTTCATCAA CAATTCGGCTTCAATTGATGTGACGTTCACTGCCTTTGCGGAG GATGGGAGGAAATTGGGCTATGAGAGCTTCTCAATACCAGTCAC CTTGAAGGTTTCCACTGACAATGCACTCACGCTTCATCACAAC GAGAATGGAGCGCAGTACATGCAATGGCAGAGCTACCGCACAA GGTTGAACACCCTCTTTGCAAGGCAACTTGTGGCCAGAGCCA CGACTGGCATTGACACCATACTCAGCATGGAAACGCAGAACA TCCAAGAGCCACAGTTGGGCAAGGGTTTCTATGCCACCTTTGT GATCCCACCCTACAACCTGTCAACGCATGGTGATGAGCGCTGG TTCAAGCTGTACATCAAGCACGTGGTTGACAACAATTCCCACATC ATATACTCGGGTCAGCTCACTGACACGAACATCAACATCACCCT GTTCATCCCACTTGATGACGTTCCCCTGAACCAAGACTACCATG CCAAGGTCTACATGACCTTCAAGAAATCACCGTCAGATGGCAC CTGGTGGGGACCGCACTTCGTTCGGGATGACAAAGGCATTGT CACAATCAACCCCAAGTCCATACTCACCCACTTTGAGTCTGTGAA TGTTCTGAATAACATCTCCTCAGAGCCGATGGACTTCTCGGGTG CCAACTCCCTGTACTTCTGGGAGTTGTTCTATTACACGCCGATG CTTGTGGCGCAGAGGTTGCTCCATGAACAGAACTTTGATGAGG CCAACCGCTGGCTCAAGTATGTCTGGAGCCCCTCGGGTTACA TTGTGCATGGCCAGATCCAGAACTACCAATGGAATGTTCG CCCATTGCTTGAGGACACCTCCTGGAACTCTGACCCCCTTGAC TCGGTGGACCCTGATGCGGTGGCTCAGCATGACCCCATGCAC TACAAGGTCTCAACCTTCATGAGGACCCTGGACCTTCTGATTG CCAGAGGAGACCATGCTTACCGCCAATTGGAACGGGACACAC TGAATGAGGCAAAGATGTGGTACATGCAAGCTCTGCAC CTCTTGGGAGACAAGCCGTACCTCCCGCTCAGCACCACATGGT CAGACCCAAGGTTGGACAGAGCAGCTGACATCACAACTCAGAA TGCTCATGACTCTGCCATTGTGGCTCTGAGGCAGAACATCCCAA CACCTGCGCCACTGTCGCTGAGATCTGCGAACACCCTGACAGA CCTGTTCCTCCCCCAGATCAATGAGGTCATGATGAACTACTGG CAAACCTTGGCGCAGCGGGTCTACAACCTCCGCCACAACCTC TCCATTGATGGGCAGCCGCTGTACCTCCCAATCTATGCCACAC CAGCTGACCCAAAGGCGCTTCTCAGCGCAGCTGTGGCCACGAG CCAAGGGGGAGGCAAGCTCCCTGAGAGCTTCATGTCGCTCTG GAGGTTTCCCCACATGTTGGAGAATGCCAGAGGCATGGTGAG CCAACTGACTCAGTTTGGCTCGACGCTCCAGAACATCATTGA GAGGCAAGATGCAGAGGCTCTGAATGCGTTGCTCCAGAATCA AGCAGCTGAGTTGATCCTGACGAACCTGTCAATCCAAGACAAGA CCATTGAGGAACTTGATGCGGAAAAGACAGTCCTTGAAAAGAG CAAGGCTGGAGCCCAAAGCCGGTTCGACTCATATGGCAAGCTG TATGATGAGAACATCAATGCTGGGGAGAATCAAGCCATGACCCT GAGGGCTTCAGCAGCGGGTCTGACCACGGCAGTGCAAGCG TCTCGCTTGGCTGGGGCTGCGGCTGACCTCGTTCCCAACA TCTTTGGGTTTGCTGGTGGCGGATCAAGGTGGGGAGCCATTG CAGAAGCAACGGGCTATGTGATGGAGTTCTCTGCCAATGTCA TGAACACTGAGGCAGACAAAATCAGCCAATCGGAGACCTACAGA CGGAGACGGCAAGAATGGGAGATACAAAGGAACAATGCAGAGG CAGAACTGAAGCAAATAGATGCCCAACTGAAGTCCTTGGCTGT CAGAAGGGAGGCTGCGGTCCTCCAAAAGACCTCCCTCAAGAC CCAGCAAGAGCAAACCCAGTCCCAGTTGGCGTTCCTCCAGAG GAAGTTCTCGAACCAAGCGCTGTACAACTGGCTGAGGGGAAGG TTGGCAGCCATCTACTTCCAGTTCTATGACCTTGCTGTGGCCA GATGCCTCATGGCGGAACAAGCCTACCGCTGGGAACTGAA TGATGACTCTGCCAGATTCATCAAACCGGGTGCATGGCAAGGCA CATATGCTGGACTCCTTGCTGGGGAGACACTCATGCTCTCATT GGCCCAGATGGAGGATGCTCACCTCAAACGGGACAAGAGGG CTCTGGAAGTGGAGCGGACAGTCAGCCTTGCGGAGGTCTATG CGGGACTGCCCAAAGACAATGGACCATTTTCGTTGGCGCAAGA GATAGACAAGTTGGTCAGCCAAGGGTCTGGATCAGCGGGTT CTGGAAACAACAATCTGGCGTTCGGTGCTGGCACTGACACCAA GACGTCCCTCCAAGCCTCAGTCTCCTTTGCTGACCTGAAGA TAAGGGAGGACTACCCAGCGTCCCTTGGGAAGATCAGACGCAT CAAGCAGATTTCAGTGACCCTGCCAGCTCTTCTGGGTCCATAC CAAGATGTTCAAGCGATCCTCTCCTATGGGGACAAGGCTGG TTTGGCGAATGGCTGTGAGGCCCTTGCTGTGTCACATGGCATGA ATGACTCTGGGCAGTTCCAGCTTGATTTCAACGATGGCAAGTT CCTGCCATTCGAGGGCATAGCCATTGATCAAGGCACCCTGAC CCTCTCCTTCCCCAATGCTTCGATGCCAGAGAAGGGAAAACAAG CCACCATGCTCAAGACCCTGAATGATATCATACTCCACATCCGC TACACCATCAAGTGAGTAGTTAGCTTAATCACCTAGAGCTCGTT TAAACTGAGGGCACTGAAGTCGCTTGATGTGCTGAATTGTTTG TGATGTTGGTGGCGTATTTTGTTTAAATAAGTAAGCATGGCTG TGATTTTATCATATGATCGATCTTTGGGGTTTTATTTAACACATTG TAAAATGTGTATCTATTAATAACTCAATGTATAAGATGTGTTCATT CTTCGGTTGCCATAGATCTGCTTATTTGACCTGTGATGTTTTGAC TCCAAAAACCAAAATCACAACTCAATAAACTCATGGAATATG TCCACCTGTTTCTTGAAGAGTTCATCTACCATTCCAGTTGGCATT TATCAGTGTTGCAGCGGCGCTGTGCTTTGTAACATAACAATTGT TACGGCATATATCCAA (SEQ ID NO:6) GTGCAGCGTGACCCGGTCGTGCCCCTCTCTAGAGATAATGAG CATTGCATGTCTAAGTTATAAAAAATTACCACATATTTTTTTTGT CACACTTGTTTGAAGTGCAGTTTATCTATCTTTATACATATATT TAAACTTTACTCTACGAATAATATAATCTATAGTACTACAATAATA TCAGTGTTTTAGAGAATCATATAAATGAACAGTTAGACATGGTC TAAAGGACAATTGAGTATTTTGACAACAGGACTCTACAGTTTTA TCTTTTTAGTGTGCATGTGTTCTCCTTTTTTTTTGCAAATAGCTT CACCTATATAATACTTCATCCATTTTATTAGTACATCCATTTAGGG TTTAGGGTTAATGGTTTTTATAGACTAATTTTTTTAGTACATCTA TTTTATTCTATTTTAGCCTCTAAATTAAGAAAACTAAAACTCTATTT TAGTTTTTTTATTTAATAGTTTAGATATAAAATAGAATAAAATAAAG TGACTAAAAATTAAACAAATACCCTTTAAGAAATTAAAAAAAC TAAGGAAACATTTTTCTTGTTTCGAGTAGATAATGCCAGCCTGT TAAACGCCGTCGACGAGTCTAACGGACACCAACCAGCGAACCA GCAGCGTCGCGTCGGGCCAAGCGAAGCAGACGGCACGGCA TCTCTGTCGCTGCCTCTGGACCCCTCTCGAGAGTTCCGCTCCA CCGTTGGACTTGCTCCGCTGTCGGCATCCAGAAATTGCGTGG CGGAGCGGCAGACGTGAGCCGGCACGGCAGGCGGCCTCC TCCTCCTCTCACGGCACCGGCAGCTACGGGGGATTCCTTTC CCACCGCTCCTTCGCTTTCCCTTCCTCGCCCGCCGTAATAAATA GACACCCCCTCCACACCCTCTTTCCCCAACCTCGTGTTGTTCG GAGCGCACACACACACAACCAGATCTCCCCCAAATCCACCCG TCGGCACCTCCGCTTCAAGGGTACCCTGAAGGCTCGACAAGG CAGTCCACGGAGGAGCTGATATTTGGTGGACAAGCTGTGGATA GGAGCAACCCTATCCCTAATATACCAGCACCACCAAGTCAGGG CAATCCCCAGATCACCCCAGCAGATTCGAAGAAGGTACAGTACA CACACATGTATATATGTATGATGTATCCCTTCGATCGAAGGCATG CCTTGGTATAATCACTGAGTAGTCATTTTATTACTTTGTTTTGACA AGTCAGTAGTTCATCCATTTGTCCCATTTTTTCAGCTTGGAAG TTTGGTTGCACTGGCACTTGGTCTAATAACTGAGTAGTCATTTTA TTACGTTGTTTCGACAAGTCAGTAGCTCATCCATCTGTCCCATT TTTTCAGCTAGGAAGTTTGGTTGCACTGGCCTTGGACTAATAAC TGATTAGTCATTTTATTACATTGTTTCGACAAGTCAGTAGCTCAT CCATCTGTCCCATTTTTCAGCTAGGAAGTTCGGATCTGGGGCCA TTTGTTCCAGGCACGGGATAAGCATTCAGCC (SEQ ID NO:7)

[00167] O construto pDAS5143 (Por exemplo, pDAB3624) foi construído contendo dois cassetes de expressão gênica. O primeiro cassete de expressão do gene (SEQ ID NO:8) continha o promotor a montante dp Vírus Baciliforme da Cana-de Açúcar (Patente No. 6.489.462 dos E.U.A) seguido pelo Íntron 6 do gene da álcool- desidrogenase do milho (Zea mays) (Dennis et al., (1984) Nucleic Acids Res. 12:3983-4000) e Vírus Listrado do Milho 5’ -UTR (Mullineaux et al., (1984) EMBO J. 3:3063-3068) ligado operativamente ao transgene tcdA (Pedido de Patente No. 2009/0221501 dos E.U.A.) e flanqueado pelo Peroxidase 5 de milho (Zea mays) 3’ -UTR (Pedido de Patente Internacional No. 1998/056921). O segundo cassete de expressão gênica continha um marcador genético selecionável e foi feito do promotor Oryza sativa Actin (Patente No. 6.429.357 dos E.U.A.) ligado operativamente a fosfinotricina acetil transferase (Wohlleben et al., (1988) Gene 70: 2537) transgene e terminado pelo Zea mays Lipase 3’ -UTR (Patente No. 7.179.902 dos E.U.A). Este construto foi mobilizado no vetor binário Superbinário pSB1(Tabaco do Japão, Tóquio, JP). Os construtos usados para completar pDAS5143 onde foi confirmado molecularmente via digestão da enzima de restrição e sequenciamento de DNA. O novo promotor do Vírus Baciliforme da Cana-de-Açúcar seguido pelo Íntron 6 do gene da álcool-desidrogenase do milho (Zea mays) e Vírus Listrado do Milho 5’ -UTR é descrito aqui como SEQ ID NO:9. ATCGGAAGTTGAAGACAAAGAAGGTCTTAAATCCTGGCTAGCAA CACTGAACTATGCCAGAAACCACATCAAAGATATCGGCAAGCTT CTTGGCCCATTATATCCAAAGACCTCAGAGAAAGGTGAGCGAAG GCTCAATTCAGAAGATTGGAAGCTGATCAATAGGATCAAGACAA TGGTGAGAACGCTTCCAAATCTCACTATTCCACCAGAAGATGCA TACATTATCATTGAAACAGATGCATGTGCAACTGGATGGGGAG CAGTATGCAAGTGGAAGAAAAACAAGGCAGACCCAAGAAATACA GAGCAAATCTGTAGGTATGCCAGTGGAAAATTTGATAAGCCAA AAGGAACCTGTGATGCAGAAATCTATGGGGTTATGAATGGCTTA GAAAAGATGAGATTGTTCTACTTGGACAAAAGAGAGATCACAGT CAGAACTGACAGTAGTGCAATCGAAAGGTTCTACAACAAGAGTG CTGAACACAAGCCTTCTGAGATCAGATGGATCAGGTTCATGGAC TACATCACTGGTGCAGGACCAGAGATAGTCATTGAACACATAAA AGGGAAGAGCAATGGTTTAGCTGACATCTTGTCCAGGCTCAAAG CCAAATTAGCTCAGAATGAACCAACGGAAGAGATGATCCTGCT TACACAAGCCATAAGGGAAGTAATTCCTTATCCAGATCATCCATA CACTGAGCAACTCAGAGAATGGGGAAACAAAATTCTGGATCCAT TCCCCACATTCAAGAAGGACATGTTCGAAAGAACAGAGCAAG CTTTTATGCTAACAGAGGAACCAGTTCTACTCTGTGCATGCAGGA AGCCTGCAATTCAGTTAGTGTCCAGAACATCTGCCAACCCAGGA AGGAAATTCTTCAAGTGCGCAATGAACAAATGCCATTGCTGGTAC TGGGCAGATCTCATTGAAGAACACATTCAAGACAGAATTGATGAA TTTCTCAAGAATCTTGAAGTTCTGAAGACCGGTGGCGTGCAAA CAATGGAGGAGGAACTTATGAAGGAAGTCACCAAGCTGAAGATA GAAGAGCAGGAGTTCGAGGAATACCAGGCCACACCAAGGGCTA TGTCGCCAGTAGCCGCAGAAGATGTGCTAGATCTCCAAGACG TAAGCAATGACGATTGAGGAGGCATTGACGTCAGGGATGACCG CAGCGGAGAGTACTGGGCCCATTCAGTGGATGCTCCACTGAG TTGTATTATTGTGTGCTTTTCGGACAAGTGTGCTGTCCACTTT CTTTTGGCACCTGTGCCACTTTATTCCTTGTCTGCCACGATG CCTTTGCTTAGCTTGTAAGCAAGGATCGCAGTGCGTGTGTGACA CCACCCCCCTTCCGACGCTCTGCCTATATAAGGCACCGTCTG TAAGCTCTTACGATCATCGGTAGTTCACCAAGGTACCCGGGG TCGACCTCGAGGGGGGGCCCGGTACCCTGAAGGCTCGACAA GGCAGTCCACGGAGGAGCTGATATTTGGTGGACAAGCTGTGGA TAGGAGCAACCCTATCCCTAATATACCAGCACCACCAAGTCA GGGCAATCCCCAGATCACCCCAGCAGATTCGAAGAAGGTACAG TACACACACATGTATATATGTATGATGTATCCCTTCGATCGAAGG CATGCCTTGGTATAATCACTGAGTAGTCATTTTATTACTTTG TTTTGACAAGTCAGTAGTTCATCCATTTGTCCCATTTTTTCAG CTTGGAAGTTTGGTTGCACTGGCACTTGGTCTAATAACTGAGTAG TCATTTTATTACGTTGTTTCGACAAGTCAGTAGCTCATCCATCTG TCCCATTTTTTCAGCTAGGAAGTTTGGTTGCACTGGCCTTGGAC TAATAACTGATTAGTCATTTTATTACATTGTTTCGACAAGTCAG TAGCTCATCCATCTGTCCCATTTTTCAGCTAGGAAGTTCGGA TCTGGGGCCATTTGTTCCAGGCACGGGATAAGCATTCAGCCAT GGCTAATGAGTCAGTCAAGGAGATCCCGGATGTTCTCAAATC CCAGTGTGGTTTCAACTGCCTCACGGACATCTCCCACAGCTC ATTCAATGAGTTCCGCCAGCAAGTCTCTGAGCACCTCTCATGG TCGGAGACGCATGACCTCTACCACGATGCTCAGCAAGCCCA GAAAGACAACCGGCTGTATGAGGCACGGATCCTCAAGAGGG CCAACCCGCAGCTCCAGAATGCGGTCCACCTCGCCATCCTTG CTCCAAATGCGGAATTGATTGGCTACAATAACCAATTCTCGGGA AGGGCCTCACAGTATGTTGCGCCTGGCACAGTTTCGTCCATGTT CAGCCCAGCAGCGTACCTCACAGAGCTGTACAGAGAGGCGAG GAACCTTCATGCGTCTGACTCCGTGTACTATCTGGACACACGCA GACCGGACCTGAAGTCAATGGCCCTCAGCCAGCAAAACATGGA CATTGAACTGTCCACCCTTTCCTTGAGCAATGAGCTTCTGTTGGA ATCCATCAAGACTGAGAGCAAGCTGGAAAACTACACAAAGGTG ATGGAGATGCTGTCCACCTTCAGACCATCTGGAGCGACTCCATA CCACGATGCCTATGAGAATGTGAGGGAGGTCATTCAGCTTCAA GACCCTGGCCTTGAGCAGCTCAATGCCAGCCCAGCCATTGCGG GACTGATGCACCAAGCCTCCCTGCTTGGGATCAATGCCTCCAT CAGCCCTGAGCTGTTCAACATCTTGACTGAAGAGATCAC TGAGGGCAATGCGGAGGAACTGTACAAGAAAAACTTCGGCAACA TTGAGCCTGCCAGCCTTGCAATGCCGGAATACCTGAAACGCTAT TACAACTTGTCGGATGAGGAACTTTCGCAGTTCATTGGCAAAG CCTCAAACTTTGGGCAGCAAGAGTACAGCAACAATCAGCTCAT CACACCTGTTGTGAACTCATCTGATGGCACTGTGAAGGTTTAC CGCATCACAAGGGAGTACACCACAAATGCCTACCAGATGGATG TTGAACTGTTCCCGTTTGGAGGTGAAAACTACCGGCTTGACTA CAAGTTCAAGAACTTCTACAATGCATCCTACCTGTCGATCAAG CTGAACGACAAACGGGAGCTTGTGAGGACGGAAGGTG CTCCCCAAGTGAACATTGAATACTCTGCCAACATCACACTCAACA CAGCGGACATCAGCCAGCCGTTTGAAATTGGCTTGACCAGAGTG CTTCCCTCGGGCTCCTGGGCCTATGCGGCAGCCAAGTTTACGG TTGAGGAGTACAACCAGTACAGCTTCCTCCTGAAGCTCAACAA GGCAATCCGGCTGAGCAGAGCCACTGAGCTGTCACCCACCATCC TGGAGGGCATTGTGAGGTCTGTCAACCTTCAGCTTGACATCAACA CTGATGTGCTTGGCAAGGTGTTCCTGACCAAGTATTACATGCAG CGCTATGCCATCCATGCGGAGACGGCACTGATCCTCTGCAATGCA CCCATATCGCAGCGCTCGTATGACAACCAGCCCAGCCAGTTCGAC AGACTCTTCAACACTCCCCTTCTGAACGGCCAGTACTTCAGCACT GGAGATGAAGAGATTGACCTGAACTCTGGCTCGACGGGTGACTG GAGGAAAACCATCTTGAAGAGGGCCTTCAACATTGATGACGTTTC CCTCTTCCGCCTTTTGAAGATCACAGATCACGACAACAAGGATGG CAAGATCAAGAACAATCTCAAGAACCTTTCCAACCTCTACATTGGC AAACTGCTTGCAGACATCCACCAGCTGACCATTGATGAGTTGGAC CTGTTGCTGATTGCAGTTGGTGAGGGCAAGACCAACCTCTCTGCA ATCTCAGACAAACAGTTGGCAACCCTCATCCGCAAGCTGAACACG ATCACAAGCTGGCTTCACACGCAGAAGTGGTCTGTTTTCCAACTG TTCATCATGACCAGCACGTCCTACAACAAGACCCTGACTCCGGAG ATCAAGAACCTTTTGGATACAGTCTATCATGGTCTCCAAGGCTTTG ACAAGGACAAGGCGGACCTGCTTCATGTCATGGCACCCTACATTG CAGCCACACTCCAGCTCTCCTCTGAAAATGTTGCCCACTCAGTGC TGTTGTGGGCTGACAAGCTCCAGCCTGGGGATGGAGCCATGACT GCTGAGAAGTTCTGGGACTGGCTCAACACGAAGTACACACCTGG CTCCTCTGAGGCAGTTGAGACTCAAGAACACATTGTGCAGTACTG CCAAGCGCTTGCACAGTTGGAGATGGTTTACCACTCAACTGGCAT CAACGAGAATGCCTTCCGCCTCTTTGTCACAAAGCCTGAGATGTT TGGTGCTGCCACTGGAGCCGCTCCTGCCCATGATGCCCTGTCAC TCATCATGTTGACGAGGTTTGCAGACTGGGTCAACGCCCTTGGTG AGAAAGCCTCGTCTGTCCTGGCAGCCTTTGAAGCCAACTCCCTGA CTGCGGAACAGCTTGCGGATGCCATGAACCTTGATGCCAACTTGC TCCTGCAAGCTTCGATCCAAGCCCAGAACCATCAGCATTTGCCAC CTGTCACGCCTGAAAATGCGTTCTCATGCTGGACCTCCATCAACA CCATACTCCAGTGGGTGAACGTGGCGCAACAGCTCAATGTGGCA CCTCAAGGAGTGTCAGCGCTGGTTGGGCTTGACTACATCCAGTCC ATGAAGGAGACACCGACCTACGCGCAGTGGGAGAATGCAGCTGG CGTCTTGACAGCTGGTCTGAACTCACAGCAAGCCAACACGCTGCA TGCGTTCTTGGAT GAGAGCCGCTCTGCTGCCCTCAGCACGTACTATATCCGGCAAG TTGCCAAGGCAGCGGCTGCCATCAAGTCTCGGGATGACCTC TACCAGTACTTGCTCATTGACAATCAGGTTTCTGCTGCCATCA AAACGACCCGGATTGCTGAGGCCATAGCCAGCATCCAGCTC TACGTCAACAGAGCGCTTGAGAACGTTGAAGAGAATGCCAAC TCTGGAGTGATTTCTCGCCAGTTTTTCATAGACTGGGACAAGTA CAACAAGCGCTACTCCACCTGGGCTGGGGTCTCTCAGCTTGTC TACTATCCTGAGAACTACATAGATCCGACGATGCGGATTGGCCA GACCAAGATGATGGATGCCCTCCTTCAGTCGGTGTCCCAGAG CCAGCTCAATGCTGACACTGTGGAGGATGCCTTCATGAGCTAC CTCACCTCCTTCGAGCAAGTTGCCAACCTCAAGGTCATCTCTG CTTACCACGACAACATCAACAATGACCAAGGGCTCACCTACTT CATTGGCCTGTCTGAAACTGATGCGGGTGAGTATTACTGGCGCT CAGTGGACCACAGCAAGTTCAACGATGGCAAGTTTGCTGCAAA TGCCTGGTCTGAGTGGCACAAGATTGACTGCCCCATCAACCCG TACAAGTCCACCATCAGACCTGTCATCTACAAGAGCCGCTTG TACTTGCTCTGGCTTGAGCAGAAGGAAATCACGAAGCAGACTGG CAACTCCAAAGATGGCTACCAGACTGAGACGGACTACCGCTA TGAGTTGAAACTTGCTCACATCCGCTATGATGGTACATGGAACAC TCCGATAACGTTTGATGTGAACAAGAAGATTTCGGAGCTGAAAC TGGAGAAGAACAGAGCGCCTGGGCTCTACTGTGCTGGCTACCA AGGGGAAGATACGCTGTTGGTGATGTTCTACAACCAGCAAGAC ACCCTTGACTCGTACAAGAACGCTTCCATGCAAGGCCTCTACA TCTTTGCTGACATGGCTTCCAAAGACATGACTCCGGAGCAGAG CAATGTCTACCGGGACAACTCCTACCAGCAATTTGACACCAACA ATGTTCGGAGGGTCAATAACCGCTATGCGGAAGATTATGAGA TCCCAAGCTCAGTGTCTAGCCGCAAGGACTATGGCTGGGGAGA CTACTATCTCAGCATGGTGTACAATGGTGACATACCCACGATCA ACTACAAGGCTGCCTCCTCAGACCTGAAGATATACATCAGCC CCAAGCTCCGCATCATTCACAATGGCTATGAGGGCCAGAAGAG GAACCAGTGCAACTTGATGAACAAGTATGGCAAACTTGGGGACA AGTTCATTGTCTACACCTCGCTTGGTGTGAACCCGAACAATTC CTCGAACAAGCTCATGTTCTACCCGGTCTACCAGTACAGCGGCAA CACCTCTGGCTTGAACCAAGGGAGGCTCCTGTTCCACAGA GACACCACGTACCCGAGCAAGGTGGAGGCGTGGATTCCTGGTG CCAAAAGGTCACTCACCAACCAGAATGCAGCCATTGGTGATGAC TATGCCACAGACAGCCTGAACAAGCCTGATGACCTGAAGCAGTA CATCTTCATGACTGACTCCAAGGGCACAGCCACTGATGTGTCTG GTCCGGTGGAGATCAACACTGCAATCAGCCCAGCCAAGGTCC AAATCATTGTCAAAGCTGGTGGCAAGGAACAGACCTTCACAG CTGACAAAGATGTGAGCATCCAGCCAAGCCCCTCCTTTGATGA GATGAACTACCAGTTCAACGCTCTTGAAATTGATGGCTCGGGAC TCAACTTCATCAACAATTCGGCTTCAATTGATGTGACGTTCACTG CCTTTGCGGAGGATGGGAGGAAATTGGGCTATGAGAGCTTCTCA ATACCAGTCACCTTGAAGGTTTCCACTGACAATGCACTCACGCTT CATCACAACGAGAATGGAGCGCAGTACATGCAATGGCAGAGC TACCGCACAAGGTTGAACACCCTCTTTGCAAGGCAACTTGTGG CCAGAGCCACGACTGGCATTGACACCATACTCAGCATGGAAACG CAGAACATCCAAGAGCCACAGTTGGGCAAGGGTTTCTATGCCAC CTTTGTGATCCCACCCTACAACCTGTCAACGCATGGTGATGAG CGCTGGTTCAAGCTGTACATCAAGCACGTGGTTGACAACAATT CCCACATCATATACTCGGGTCAGCTCACTGACACGAACATCAA CATCACCCTGTTCATCCCACTTGATGACGTTCCCCTGAACCAA GACTACCATGCCAAGGTCTACATGACCTTCAAGAAATCACCGT CAGATGGCACCTGGTGGGGACCGCACTTCGTTCGGGATGACA AAGGCATTGTCACAATCAACCCCAAGTCCATACTCACCCACTT TGAGTCTGTGAATGTTCTGAATAACATCTCCTCAGAGCCGATGG ACTTCTCGGGTGCCAACTCCCTGTACTTCTGGGAGTTGTTCTAT TACACGCCGATGCTTGTGGCGCAGAGGTTGCTCCATGAACAGA ACTTTGATGAGGCCAACCGCTGGCTCAAGTATGTCTGGAGCC CCTCGGGTTACATTGTGCATGGCCAGATCCAGAACTACCAATG GAATGTTCGCCCATTGCTTGAGGACACCTCCTGGAACTCTGAC CCCCTTGACTCGGTGGACCCTGATGCGGTGGCTCAGCATGAC CCCATGCACTACAAGGTCTCAACCTTCATGAGGACCCTGGAC CTTCTGATTGCCAGAGGAGACCATGCTTACCGCCAATTGGA 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TGAAGGCTCGACAAGGCAGTCCACGGAGGAGCTGATATTTGG TGGACAAGCTGTGGATAGGAGCAACCCTATCCCTAATATACCAG CACCACCAAGTCAGGGCAATCCCCAGATCACCCCAGCAGATT CGAAGAAGGTACAGTACACACACATGTATATATGTATGATGTA TCCCTTCGATCGAAGGCATGCCTTGGTATAATCACTGAGTAGT CATTTTATTACTTTGTTTTGACAAGTCAGTAGTTCATCCATTTG TCCCATTTTTTCAGCTTGGAAGTTTGGTTGCACTGGCACTTGGTC TAATAACTGAGTAGTCATTTTATTACGTTGTTTCGACAAGTCAG TAGCTCATCCATCTGTCCCATTTTTTCAGCTAGGAAGTTTGGTTG CACTGGCCTTGGACTAATAACTGATTAGTCATTTTATTACATTG TTTCGACAAGTCAGTAGCTCATCCATCTGTCCCATTTTTCAGC TAGGAAGTTCGGATCTGGGGCCATTTGTTCCAGGCACGGGA TAAGCATTCAGCC (SEQ ID NO:9)

[00168] Construto pDAB1405, um construto de controle, foi construído contendo dois cassetes de expressão gênica, ambos os quais estavam flanqueados pelas RB7 Matrix Attachment Regions (MAR; Pedido de Patente Internacional No. WO9727207). O primeiro cassete de expressão gênica continha o promotor Zea mays Ubiquitina 1 ligado operativamente ao transgene da proteína verde fluorescente (Patente No. 6.172.188 dos E.U.A) e flanqueado pela Peroxidase 5 de milho (Zea mays) 3’ -UTR. O segundo cassete de expressão gênica continha um marcador genético selecionável e foi feito do promotor Oryza sativa Actin (Patente No. 6.429.357 dos E.U.A.) ligado operativamente a fosfinotricina acetil transferase (Wohlleben et al., (1988) Gene 70: 25-37) transgene e terminado pelo Zea mays Lipase 3’ -UTR (Patente No. 7.179.902 dos E.U.A). Este construto foi mobilizado no vetor binário Superbinário pSB1(Tabaco do Japão, Tóquio, JP). Os construtos usados para completar pDAB1405 onde foi confirmado molecularmente via digestão da enzima de restrição e sequenciamento de DNA.TABELA 1: Os construtos são designados pelo número pDAS com uma breve descrição de elementos reguladores e marcador selecionável usado em cada construto.

Exemplo 3: Transformação da planta e confirmação molecular

[00169] Material da Planta. Zea mays c.v. Hi-II foi usado para todos os experimentos de transformação. As plantas foram cultivadas em estufa e espigas onde foi colhido aproximadamente 9-11 dias após a polinização, quando os embriões zigomáticos imaturos estavam entre 1-2 mm de comprimento. As espigas foram descascadas, enxaguadas e armazenadas em 4°C por 1 dia antes do uso.

[00170] Início do Cultivo de Agrobacterium. A estirpe Agrobacterium tumefaciens LBA4404 que abriga os construtos descritos acima foram mantido como glicerol armazenado a -80°C. Antes da iniciação dos experimentos de transformação, a bactéria foi estriado dos estoques de glicerol em placas YEP que continham 250 mg/L estreptomicina, 100 mg/L espectinomicina e 10 mg/L tetraciclina. As placas foram incubadas em 28°C por 24 horas então transferido a 19°C por 2 dias até que seja desenvolvida uma relva de células em cada placa.

[00171] Co-cultivo de Embriões Imaturos. Um de dois loops de Agrobacterium foram tomados de cada placa YEP e suspenso em 45 ml de N6-inf médio(N6 sais e vitaminas, 1.5 mg/L 2,4-D, 700 mg/L L- Proline, 6.84% sacarose, 3.6% glucose, pH ajustado a 5,2) suplementado com 100 μM acetosiringona, e misturado em vortex até que uma suspensão uniforme foi obtida. A bactéria foi transferida a frascos Nephelo™ e a densidade do cultivo foi ajustada a aproximadamente 200 Klett unidades usando filtro azul. Os frascos foram agitados em 75 rpm em um agitador rotativo por 2-4 horas a temperatura ambiente enquanto que os embriões eram isolados. As espigas de milho foram esterilizadas ao enxaguar em 70% etanol por 5 minutos seguido por 20-30 minutos de imersão em uma solução de água sanitária a 20% que contém várias gotas de Liquinox®. As espigas foram enxaguadas três vezes em água deionizada estéril e envoltas em toalhas e lâminas de papel estéreis até serem usadas. O protocolo de co-cultivo e seleção seguido estritamente que destacou Frame et al. (Plant Physiol. 129: 12-22, 2005). Os embriões zigóticos imaturos foram suprimidos dos grão de milhos e colocado em tubos Eppendorf que continham 2 ml de N6-inf médio com 100 μM acetosiringona. Os embriões das múltiplas espigas agrupadas em tubos ou mantidos separados. Os embriões foram lavados em meio de infecção 1-2 vezes e a solução foi substituído com aproximadamente 1ml de suspensão bacteriano. O tubo foi gentilmente invertido algumas vezes e incubado a temperatura ambiente por 5 minutos. Os embriões foram transferidos a meio N6-AS (KW) (N6 Sais e vitaminas, 1,5 mg/L 2,4-D, 700 mg/L L-prolina, 0.85 mg/L nitrato de prata, 300 mg/L L- cisteína, 3% sacarose, 3 g/L Gelrite™, 100 μM acetosiringona e pH ajustado a 5,8) em placas de 100 x 15 mm. Após o excesso de líquido foi removido da placa, os embriões foram orientadas com o scutellar para cima usando um microscópio.

[00172] As placas foram seladas com cinta 3M® ou Parafilm®, e incubadas por 3 a 4 dias a 20°C no escuro. Para construtos TcdA, 50120 embriões foram tratados por construto, e aproximadamente 30-50 embriões foram tratados para o controle positivo do construto (pDAB1405). Para monitorar a eficiência da transformação putativa controle positivo os isolados foram avaliados por expressão de GFP após 2 semanas. A suspensão restante Agrobacterium foi girada para baixo em 5000 rpm em um centrífuga de mesa, e o grânulo foi suspenso novamente em 100 μl de líquido, e então estriado sobre uma placa YEP +strep/spec/tet, e deixado incubar por 3 dias a 28°C, então usado para revalidação. Como um controle positivo para avaliar o cultivo do tecido resposta do material do milho doador, aproximadamente 5 embriões por espiga foram semeados em placas em meio 15Ag (N6 sais e vitaminas, 100 mg/L hidrolisado caseína enzimática, 1 mg/L 2,4D, 2% sacarose, 2,5 g/L Gelrite™, pH 5,8, suplementado com 10 mg/L de nitrato de prata e 25 mM L-prolina) e incubado a 28°C no escuro por 2 semanas. Os embriões de controle foram qualificados por resposta embriogênica em 2 e 4 semanas e estão descartados.

[00173] Isolamento, Seleção e Regeneração. Após 3-4 dias de co-cultivo, os embriões sobreviventes foram transferidos a meio KW- Resting (N6 sais e vitaminas, 1,5 mg/L 2,4-D, 700 mg/L L-prolina, 500 mg/L MES, 0.85 mg/L nitrato de prata, 100 mg/L vancomicina, 100 mg/L cefotaxima, 3 % sacarose, 8 g/L TC ágar e pH ajustado a 5,8). Dez embriões foram semeados em placas sobre cada placa de 60 x 20 mm e selado com cinta 3M® ou Parafilm®. As placas foram incubadas em um a sala de cultivo escura a 28°C por 7 dias. Porque todos os construtos contidos o gene PAT como o marcador selecionável, a formulação baseada em bialafos Herbiace® foi usado como o agente seletivo. Os embriões sobreviventes foram transferidos para N6 (1.5H) meio KW (N6 sais e vitaminas, 1,5 mg/L 2,4-D, 700 mg/L L-prolina, 500 mg/L MES, 0.85 mg/L nitrato de prata, 100 mg/L vancomicina, 100 mg/L cefotaxima, 3% sacarose, 8 g/L TC ágar e pH ajustado a 5,8). Após aproximadamente duas semanas os embriões foram transferidos para meio com um nível duplo de Herbiace®, e subsequentemente foram transferidos para N6 (3.0H) meio KW (N6 sais e vitaminas, 1,5 mg/L 2,4-D, 700 mg/L L-prolina, 500 mg/L MES, 0,85 mg/L nitrato de prata, 100 mg/L vancomicina, 100 mg/L cefotaxima, 3% sacarose, 8 g/L TC ágar e pH ajustado a 5,8). Após a primeira transferência para meio N6 (3,0H) KW, qualquer crescimento rápido de tecido embriogênico foi subcultivado para uma placa separada de (3,0H) meio KW para a suposta maioria dos isolados transgênicos. Quando quantidades suficientes de material de calo embriogênico foram obtidas, as amostras foram tomadas por ensaios de zigosidade e expressão. Os eventos que reúnem número de cópias e critérios de expressão foram transferidos para 28(1H) meio de regeneração (MS sais e vitaminas, 5 mg/L BAP, 25 μg/L 2,4-D, 3% sacarose, 1 mg/L Herbiace®, 2.5 g/L Gelrite™ e pH ajustado a 5,7) e cultivado por sete dias em luz baixa (13 μEm-2s-1) com fotoperíodo de 16:8 horas, permitido por sete dias em luz alta (40 μEm-2s-1). Os brotos emergentes foram transferidos para 36(1H) meio (MS sais e vitaminas, 3% sacarose, 1 mg/L Herbiace®, 2.5 g/L Gelrite™, pH 5.7) em 100 x 25 mm placas. Quando os brotos atingiram aproximadamente 3-5 mm de comprimento, foram transferidos para SHGA meio apropriado para estimular o enraizamento (SH sais e vitaminas, 1 g/L myo-inositol, 1% sacarose, 2.5 g/L Gelrite™, pH 5.8) em 25 x 150 mm de tubos de vidro. As plântulas foram transferidas para a estufa depois que o adequado desenvolvimento das raízes foi observado.

[00174] Transferência e Estabelecimento de T0 Plantas na Estufa. Foram designados identificadores exclusivos e transferidos para a estufa às plantas transgênicas. As plantas foram transplantada de tubos a pequenos potes (3,5" SVD) e cobertas com um Humidome™ por uma semana para ajudar a aclimatar as plantas para o ambiente da estufa (~28°C temp dia /~26°C temp noite/16:8 iluminação suplementar). As plantas foram então transplantadas dos pequenos potes para formadores de raízes para ensaio biológico de inseto (Spencer-Lemaire Industries, Edmonton, Alberta Canada; estilo Tinus 350-4). Três plantas por evento foram colocadas em formadores de raízes enquanto as três plantas restantes por evento foram transferidos para potes de 5 galões pelo pessoal da estufa para polinização manual e T1 produção de semente. Aproximadamente quatro dias após o transplante dos formadores de raízes, as plantas foram infestadas para ensaio biológico.

[00175] Produção de Semente T1. As plantas que passaram o ensaio biológico e as correspondentes três plantas por evento que não foram biotestadas foram transplantadas a potes de 5 galões. As observações foram feitas semanalmente para rastrear quaisquer fenótipos anormais. Na medida em que as espigas emergiram, as bolsas de brotos foram colocadas sobre o broto antes da emergência da seda para assegurar nenhuma contaminação cruzada ao desgarrar o pólen. Se algum dos brotos produziu seda antes da cobertura, foram feitas observações e o broto foi removido. O segundo broto foi coberto para usar para a polinização. As plantas que produziram brotos anormais ou nenhum broto foram registradas na base de dados. As borlas das plantas T0 foram removidas antes do derramamento para eliminar o fluxo de pólen transgênico na estufa. As sedas foram reduzidas para proporcionar uma escova uniforme para aceitar o pólen durante as polinizações. Pólen de Zea mays c.v. endogâmico 5XH751 foi usado para todas as polinizações.

[00176] Após a polinização tere sido concluída, as plantas foram colocadas na estufa e deixadas para crescer e desenvolver. As espigas foram descascadas em 21 dias após polinização para melhorar a secagem seguida pela colheita completa (espiga removida da planta) em 42 dias após a polinização. As espigas foram colocadas em um secador por 1 semana seguida pelo processamento da semente (descasque, contagem, embalagem em envelopes pré- impressos e entrar a contagem da semente no banco de dados).

Exemplo 4: Expressão de proteína de plantas/eventos transgênicos

[00177] Expressão de Proteína por Western Blot em Material de Calo Vegetal. Amostras de calo de milho foram analisadas pela presença de TcdA por western blots. Na preparação para análise, 200 mg de amostra de calo foi colhida em 96 tubos de ensaio em caixas de grupos (Corning, Corning, NY) e armazenado a -80°C. No momento da análise, as amostras foram extraídas pela adição de 4 esferas de aço (3,5mm, Bio Spec Products , Bartlesville, OK) mais 200 μl de tampão de extração (1X Tampão fosfato-salino (PBS) + 0.1% Tríton-X -100). As amostras foram batidas usando esferas em moinho de esferas Kleco™ (Garcia Machine, Visalia, CA) por 3 minutos na configuração máxima. Após o processamento, as amostras foram centrifugadas em 3000 rcf por 5 minuto em uma centrífuga de placa (Qiagen). O sobrenadante resultante foi transferido por pipetagem para novos tubos. As amostras western foram preparadas por um extrato da mistura com uma quantidade apropriada de tampão da amostra (NuPage LDS™ 4X Tampão da amostra (Invitrogen, Carlsbad, CA) com 40 mM ditiotreitol). Um controle positivo de proteína purificada (PA1, 0,4mg/ml) foi preparado em tampão de amostra como acima para uma concentração de 6,25 ng/μl. Quarenta microlitros de cada amostra e padrão preparado foi colocado em tubos PCR (Thermo Scientific) e aquecido por ciclagem térmica (Applied BioSystems, Foster City, CA) por 5 minutos em 90°C. As amostras foram resolvidas em 3-8% Tris- Acetato gels (Invitrogen EA0375) com Tris-Acetato-SDS tampão de corrida (Invitrogen).

[00178] Além disso, a câmara interna de gel tinha antioxidante (Invitrogen) adicionado ao tampão de corrida. As amostras foram carregadas de acordo com as especificações do gel com 25 μL de amostra carregada de amostras de calo, 4 μl carregada de controle de proteína purificada (25 ng) e 15 μl de um marcador de peso molecular (Veja Blue Marker™, Invitrogen, Carlsbad, CA). Os géis foram corridos em uma constância de 150 V por 75 minutos. Entretanto, blocos de transferência e 0,2 μm membranas de nitrocelulose (Invitrogen) foram preparados por imersão em tampão de transferência (1X NuPage Tampão de Transferência™ (Invitrogen) + 10-20% metanol).

[00179] Após resolver as proteínas sobre o gel, o módulo blot (Invitrogen) e géis para ser transferidos foram ensamblados de acordo com as instruções do fabricante. Os géis foram então transferidas em uma constância de 45 V por pelo menos 1,5 horas (2 horas por 2 géis por módulo blot). Os calos precoce dos Western blots foram corridos usando o sistema Bio-Rad Criterion™ (4-20% Tris-HCl géis [Bio-Rad, Hercules, CA] e 1X Tris/Glicina/SDS do tampão de corrida). No entanto, devido ao gel inferior para qualidade do gel a decisão foi tomada para trocar para o sistema Invitrogen especificado acima. Após a transferência, as membranas foram bloqueadas por 30 minutos a temperatura ambiente em tampão Western Breeze Blocking (Invitrogen). A solução bloqueadora foi removida e os anticorpos primários (MAB anti-TcdA 148G4.1 e MAB anti-TcdA 148D11.1) foi adicionado em uma concentração de 1,0 μg/ml no tampão bloqueador. As membranas foram incubadas por pelo menos 1 hora a temperatura ambiente. As membranas foram lavadas 3 vezes por 5 minutos cada um com solução de lavagem Western Breeze™ (Invitrogen). O segundo anticorpo (Anti-Mouse HRP [Sigma, St. Louis, MO]) foi preparado na solução bloqueadora em diluição a 1:3000. As membranas foram incubadas por 1 hora a temperatura ambiente antes da lavagem como foi citado acima. O tampão de lavagem de excesso foi removido das membranas secando delicadamente a margem da membrana para papel de toalha. As membranas foram expostas a substrato quimioluminescente (Thermo Scientific) por 5 minutos. Os excessos de substrato foram removidos como foi mencionado acima e as membranas foram envoltas em envoltório plástico. Em um quarto escuro, filme de raio X (Thermo Scientific, Waltham, MA) foi exposto à membranas para visualizar faixas. Os filmes foram desenvolvidos por 5 minutos e 2 horas de exposições de filme.

[00180] Expressão de Proteína por ELISA em T0 Material Vegetal. O material da folha do milho foi analisado para a presença de TcdA usando um mono-mono ELISA. As folhas das plantas que cresceram em estufas foram amostradas pelo corte de pedação de 2 cm de folha da ponta da primeira folha totalmente expandida, uma semana após as plantas serem infestada com ovos de crisomelídeo. As amostras foram colhidas em 96 tubos de ensaio agrupados em caixas (Corning) e congelados e -80°C. As amostras foram preparadas para extração pela adição de 3 esferas de aço (3,5mm, Bio Spec Products, Bartlesville, OK),1 esfera de aço (4,5 mm Daisy) e 100 μl de tampão de extração PBEX (19 mM NaH2PO4, 31 mM Na2HPO4, 10 mM 0,5M EDTA , e 0,1% Triton®-X 100). As amostras foram pulverizadas usando o Kleco Beadmill™ (Garcia Machine) por 3 minutos na configuração máxima. Um adicional de 300 μl de tampão de extração PBEX foi adicionado às amostras e as amostras foram processadas por um adicional de 1 minuto. Após o processamento, as amostras foram centrifugadas em 3000 rcf por 5 minuto em uma centrífuga de placa (Qiagen). O sobrenadante resultante foi transferido para novos tubos. As placas ELISA foram preparadas pelo Beacon Analytical Systems (Portland, ME) como segue: Placas Maxisorb™ (Thermo Fisher Scientific) foram revestidas com um anticorpo anti- TcdA monoclonal (MAB anti-TcdA 148G4.1) em uma concentração de 1.0 μg/ml em 1X PBS. Após a incubação durante uma noite a 4°C, as placas foram bloqueadas com 1% de gelatina de peixe em água fria (Sigma) em PBST (PBS + 0.5% Tween®-20). As placas foram secadas e individualmente envoltas para armazenamento. No momento da análise, as placas foram aquecidas a temperatura ambiente e lavadas 4 vezes em um lavador de placas (TomTec) usando 350 μl of PBST por lavagem antes das amostras de carga. Um antígeno de referência da proteína purificada (PA1, 0,4 mg/ml) foi diluída em tampão PBEX para150 ng/ml e usado para gerar uma curva padrão de diluições seriais de 150 ng/ml para 2,34 ng/ml. As amostras foram diluídas em tampão PBEX para uma diluição padrão de 1:8 e diluída em série 3 vezes adicionais. A seguir, 100 μl de todos os padrões e das diluições da amostra foram carregados em duplicado na placa ELISA. As amostras foram incubadas em placas ELISA a temperatura ambiente por 1 hora. Após a incubação, as placas foram lavadas como foi citado acima. Uma peroxidase de rábano silvestre conjugada como anticorpo monoclonal (MAB anti-TcdA 148D11.1 -- HRP) (preparado por Covance, Denver, PA) foi diluído a 1 μg/ml em PBS e adicionado a placas em 100 μl por tubo. As placas foram incubadas a temperatura ambiente por 1 hora. Após a incubação, as placas foram lavadas. A pilha de placas foi rotada em 180° e o passo da lavagem foi repetido. A seguir, o substrato 1-Step Ultra TMB™ (Thermo Scientific) foi adicionado às placas em 100 μl por tubo. Na medida em que os tubos com menor diluição da curva padrão começaram a mostrar a cor azul, a reação foi interrompida pela adição de 50 μl de solução de interrupção (0,4 N H2SO4). As placas foram lidas em um leitor de placas (Molecular Devices) usando SoftMax® Pro v5 (Molecular Devices) em uma comprimento de onda de 450 nm menos uma referência de 650 nm. A concentração de TcdA das amostras de teste foi calculada pela regressão linear de uma curva padrão quadrática.

[00181] O total de proteína solúvel nos extratos de folhas foi determinado pelo ensaio Bradford. As amostras de folha de milhos foram diluídas usando água Milli-Q® em 96 tubos em placa de polipropileno (Corning). Um padrão de proteína (Padrões de Ensaio de Proteína Pre-diluída: BSA [Thermo Scientific]) foi diluído para uma concentração inicial de 0,5 mg/ml e diluída em série abaixo da placa a 0,0625 mg/ml deixando o fundo dos tubos com um branco água. As amostras foram transferida à placa Maxisorb® (Thermo Fisher Scientific) e a proteína seca preparada (BioRad) foi adicionada aos tubos. As placas foram lidas em um leitor de placas (Molecular Devices) usando SoftMax® Pro v5 (Molecular Devices) em um comprimento de onda de 595 nm. A concentração total de proteína solúvel foi calculada pela regressão linear de uma curva padrão quadrática. A análise estatística foi realizada usando software JMP (versão 7.0.2, SAS Industries, Inc., Cary, NC). Os valores de expressão de proteína (partes por milhão de TcdA) foram transformados usando um log+1 transformação.

[00182] O ELISA aqui usou dois anticorpos monoclonais que poderiam apenas reconhecer um epítopo por anticorpo reduzindo assim a capacidade do ensaio de reconhecer TcdA truncado. Por causa desta especificidade, existe a confiança que os níveis de expressão determinado pelo ELISA representam o comprimento total do TcdA. Desde que a diluição menor da extração da amostra da folha é 1:8, estes resultam em um limite de detecção mais baixo de 16 ng/ml e um limite de quantificação mais baixo (fator de diluição mais baixo x padrão mais baixo que tem uma O.D. de 2 vezes de fundo) de 36 ng/ml. Assim qualquer resultado entre 36 ng/ml e zero não deve ser considerado preciso.

[00183] Expressão de Proteína por ELISA em T1 Material Vegetal. Como um método de triagem não destrutivo, as plantas de milho foram analisadas para a presença do marcador selecionável de Fosfinotricina Acetiltransferase (PAT) por uma enzima qualitativa ligada ao ensaio de imunoadsorção (ELISA). As folha das plantas que cresceram em estufas foram amostradas pelo corte de pedaços de 2 cm de folha da ponta da primeira folha totalmente expandida. As amostras foram colhidas em 96 tubos de ensaio agrupados em caixas (Corning) e congelados a -80°C. As amostras foram preparadas por extração pela adição de duas esferas de aço (4,5 mm, Daisy, Rogers AR) e 100 μl de tampão fosfato-salino com 0,5% Tween®- 20 (PBST) de tampão de extração. As amostras foram pulverizadas usando o Kleco Beadmill™ (Garcia Machine) por três minutos na configuração máxima. Um adicional de 300 μl de tampão de extração PBST foi adicionado às amostras e as amostras foram processadas por um adicional de 1 minuto. Após serem batidas com esferas, as amostras foram centrifugadas em 3.000 rcf por 5 minutos em uma centrífuga de placa (Qiagen). O sobrenadante resultante foi transferido para novos tubos. As placas ELISA do kit PAT AP014 (EnviroLogix, Portland, ME) foram aquecidas a temperatura ambiente em preparação para uso. Um antígeno da proteína de referência purificado (PAT Standard, TSN 104799, 63 μg/ml) foi diluído em tampão PBST a 10 ng/ml e usado para gerar uma curva padrão das seguintes diluições: 5 ng/ml, 0,625 ng/ml, e 0,156 ng/ml. Para preparar as placas para o uso, 50 μl de enzima conjugada (EnviroLogix, Portland, ME) foi adicionado a cada tubo seguido de 50 μl de PBST. A seguir, 50 μl de padrões e amostras foram carregadas na placa ELISA em seus respectivos tubos e deixadas incubar a temperatura ambiente por uma hora. Após a incubação, as placas foram lavadas quatro vezes em um lavador de placas (TomTec) usando 350 μl de PBST por lavagem. EnviroLogix TMB substrate™ foi acrescentado às placas em 100 μl por tubo e deixado incubar por 15 minutos. A reação foi interrompida pela adição de 100 μl de solução de interrupção. As placas foram lidas em um leitor de placas (Molecular Devices) usando SoftMax® Pro v5 (Molecular Devices) em um comprimento de onda O.D. 450, o substrato OD foi maior de 0,7 nm.

[00184] As plantas selecionadas para ensaio biológico de inseto foram analisadas para a presença da TcdA por um Mono/Mono ELISA. As amostras de folha foram colhido em dois pontos de tempo: uma semana pós infestação com ovos de crisomelídeo e no final do ensaio biológico (21 dias pós infestação). As folha foram amostradas pelo corte de pedaços de 2 cm de folha da ponta da primeira folha totalmente expandida. As amostras foram colhidas em 96 tubos de ensaio agrupados em caixas (Corning) e congelados e -80°C. As amostras foram preparadas para extração pela adição de 3 esferas de aço (4.5mm, Daisy) e 100 μl de PBEX tampão de extração (19 mM NaH2PO4, 31mM Na2HPO4, 10 mM 0.5M EDTA , e 0,1% Triton®-X 100). As amostras foram pulverizadas usando o Kleco Beadmill™ (Garcia Machine) por três minutos na configuração máxima. Um adicional de 300 μl de tampão de extração PBEX foi adicionado às amostras e as amostras foram processadas por um adicional de 1 minuto. Após serem batidas com esferas, as amostras foram centrifugadas em 3000 rcf por 5 minutos em uma centrífuga de placa (Qiagen). As amostras de raiz por cada planta foram colhidas no final do ensaio biológico. As amostras da raiz (200 mg por planta) foi preparado por extração pela adição de quatro esferas de aço (4,5mm, Daisy) e 400 μl de PBEX tampão extração a um tubo de 2 ml. As amostras foram pulverizadas usando o Kleco Beadmill™ (Garcia Machine) por 3 minutos na configuração máxima. Após serem batidas com esferas, as amostras foram centrifugadas em 3000 rcf por 5 minutos em uma centrífuga de placa (Qiagen). O sobrenadante resultante foi transferido para novos tubos. As placas ELISA foram preparadas pelo Beacon Analytical Systems (Portland, ME) como segue: Placas Maxisorb™ (Thermo Fisher Scientific) foram revestidas com um anticorpo anti-TcdA monoclonal (MAB anti-TcdA 148G4.1) em uma concentração de 1.0 μg/ml em 1X PBS. Após a incubação durante uma noite a 4°C, as placas foram bloqueadas com 1% de gelatina de peixe em água fria (Sigma) em PBST (PBS + 0.5% Tween®-20). As placas foram secas e individualmente envoltas para armazenamento. No momento da análise, as placas foram aquecidas a temperatura ambiente e lavadas 4 vezes em um lavador de placas (TomTec) usando 350 μl de PBST por lavagem antes das amostras de carga.

[00185] Um antígeno de referência da proteína purificada (PA1, 0,4 mg/ml) foi diluída em tampão PBEX para 150 ng/ml e usado para gerar uma curva padrão de diluições seriais de 150 ng/ml para 2,344 ng/ml.As amostras foram diluídas em tampão PBEX para uma diluição padrão de 1:8 e diluída em série 3 vezes adicionais (1:8, 1:16, 1:32, 1:64). A seguir, 100 μl de todos os padrões e das diluições da amostra foram carregados em duplicado na placa ELISA. As amostras foram incubadas em placas ELISA a temperatura ambiente por uma hora. Após a incubação, as placas foram lavadas como foi citado acima. Uma peroxidase de rábano silvestre conjugada como anticorpo monoclonal (MAB anti-TcdA 148D11.1 -- HRP) foi diluído a 1 μg/ml em PBS e adicionado a placas em 100 μl por tubo. As placas foram incubadas a temperatura ambiente por 1 hora. Após a incubação, as placas foram lavadas com substrato Step Ultra TMB™ (Thermo Scientific). Esta solução de lavagem foi acrescentada às placas em 100 μl por tubo. Na medida em que os tubos com menor diluição da curva padrão começaram a mostrar a cor azul, a reação foi interrompida pela adição de 50 μl de solução de interrupção (0,4 N H4SO4). As placas foram lidas em um leitor de placas (Molecular Devices) usando SoftMax® Pro v5 (Molecular Devices) em um comprimento de onda O.D. 450 nm, com uma subtração de referência de 650 nm. A concentração de TcdA das amostras de teste foi calculada pela análise de regressão quadrática.

[00186] Após o ensaio biológico, um subconjunto de amostra de folha e raiz foi analisado na presença de TcdA por Western blots. As amostras western foram preparadas por um extrato da mistura com uma quantidade apropriada de tampão da amostra (NuPage LDS™ 4X Tampão da amostra (Invitrogen, Carlsbad, CA) com 40 mM Ditiotreitol). Um controle positivo de proteína purificada (PA1, 0,4mg/ml) foi preparado em tampão de amostra como acima para uma concentração de 6,25 ng/μl. A seguir, 40 μl de cada amostra e padrão preparado foi colocado em tubos PCR (Thermo Scientific) e aquecido por ciclagem térmica (Applied BioSystems, Foster City, CA) por 5 minutos em 90°C. As amostras foram resolvidas em 3-8% Tris- Acetato géis (Invitrogen EA0375) com Tris-Acetato-SDS tampão de corrida (Invitrogen). Além disso, a câmara interna de gel tinha antioxidante (Invitrogen) adicionado ao tampão de corrida. As amostras foram carregadas de acordo com as especificações do gel com 25 μL de amostra carregada de amostras de folhas e raízes, 4 μl carregada de controle de proteína purificada (25 ng) e 15 μl de um marcador de peso molecular (Veja Blue Marker™, Invitrogen). Os géis foram corridos em uma constância de 150 V por 75 minutos. Enquanto os géis corriam, blocos de transferência e 0,2 μm membranas de nitrocelulose (Invitrogen) foram preparados por imersão em tampão de transferência (1X NuPage Tampão de Transferência™ (Invitrogen) + 10-20% metanol). Após resolver as proteínas sobre o gel, o módulo blot (Invitrogen) e géis para ser transferidos foram ensamblados de acordo com as instruções do fabricante. Os géis foram então transferidas em uma constância de 45 V por pelo menos 1,5 horas (2 horas por 2 géis por módulo blot). Após a transferência, as membranas foram bloqueadas por 30 minutos a temperatura ambiente em tampão Western Breeze Blocking (Invitrogen). A solução bloqueadora foi removida e os anticorpos primários (MAB anti-TcdA 148G4.1 e MAB anti-TcdA 148D11.1) foi adicionado em uma concentração de 1,0 μg/ml no tampão bloqueador. As membranas foram incubadas por pelo menos 1 hora a temperatura ambiente. As membranas foram lavadas 3 vezes por 5 minutos cada uma com solução de lavagem Western Breeze™ (Invitrogen). O segundo anticorpo (Anti-Mouse HRP (Sigma)) foi preparado na solução bloqueadora em diluição a 1:3000. As membranas foram incubadas por 1 hora a temperatura ambiente antes da lavagem como foi citado acima. O tampão de lavagem de excesso foi removido das membranas secando delicadamente a margem da membrana para papel de toalha. As membranas foram expostas a substrato quimioluminescente (Thermo Scientific) por 5 minutos. Os excessos de substrato foram removidos como foi mencionado acima e as membranas foram envoltas em envoltório plástico. Em um quarto escuro, filme de raios X (Thermo Scientific, Waltham, MA) foi exposto à membranas para visualizar faixas. Os filmes foram desenvolvidos por 5 minutos e 2 horas de exposições de filme.

[00187] O total de proteína solúvel nos extratos de folhas e raízes foi determinado pelo ensaio Bradford. As amostras de folhas e raízes de milho foram diluídas usando água Milli-Q® em 96 tubos em placa de polipropileno (Corning). Um padrão de proteína (Padrões de Ensaio de Proteína Pre-diluída: BSA™ (Thermo Scientific)) foi diluído para uma concentração inicial de 0,5 mg/ml e diluída em série abaixo da placa a 0,0625 mg/ml deixando o fundo dos tubos com um branco água. As amostras foram transferida à placa MaxiSorb™ (Thermo Fisher Scientific) e a proteína seca preparada (BioRad) foi adicionada aos tubos. As placas foram lidas em um leitor de placas (Molecular Devices) usando SoftMax® Pro v5 (Molecular Devices) em um comprimento de onda O.D. 595 nm. A concentração total de proteína solúvel foi calculada pela análise de regressão quadrática.

[00188] A análise estatística foi realizada usando software JMP® (versão 7.0.2, SAS Industries, Inc., Cary, NC). Os valores de expressão de proteína (partes por milhão de TcdA) foram transformados usando um log transformação.

Exemplo 5: Triagem da expressão de planta transgênica To

[00189] Análise de Expressão de Proteína em Plantas T0. Os dados do Western blot e ELISA mostraram que os eventos transgênicos pDAS5144 especificamente expressaram a proteína TcdA nos tecidos radiculares. A expressão de TcdA tanto em amostra de calo como de folhas T0 para eventos pDAS5144 foi surpreendentemente baixa como mostra a TABELA 2. O perfil da expressão de TcdA da folha de milho para os vários construtos é reportado em partes por milhão (PPM). A expressão de TcdA nos construtos pDAS5144 foi significativamente menor que nos outros construtos. A média de expressão de TcdA nos construtos pDAS5144 foi de 14 PPM. A escala de expressão para material de folha deste construto foi de 0-200 PPM. O nível mais baixo de expressão no tecido da folha é um resultado da especificidade do tecido promotor.TABELA 2: Expressão de proteína TcdA em folhas e calo de milho T0 pelo construto.

Análise de Expressão de Proteína em Plantas T1.

[00190] A TABELA 3 relaciona os resultados da análise quantitativa ELISA para a proteína TcdA isolada de folhas de milho T1 uma semana após infestação durante um ensaio biológico de inseto. As folhas de milho T1 para os vários eventos foram colhidas e submetidas para o ensaio biológico de inseto para testar a eficácia da proteína TcdA expressa. A média de expressão TcdA (PPM) foi registrado pelo construto, com variação e resultados do quartil superior. Além disso, a análise dos meios de separação Tukey-Kramer resultam para a média de expressão TcdA em folhas de milho é reportado para cada conjunto de eventos. A expressão de proteína TcdA das plantas que contém construto pDAS5144 foi desprezível nos tecidos das folhas. Apesar da expressão desprezível de TcdA em folhas de milho, os resultados do ensaio biológico indicou que os eventos pDAS5144 proporcionou tolerância a inseto (Por exemplo,infestação de crisomelídeo). Analisando a combinação dos dados do ensaio biológico e os dados de expressão da proteína (das folhas) mostradas em correlação entre a expressão da proteína nos níveis de danos nas folhas e raízes pelo crisomelídeo. O nível mais baixo de expressão de TcdA no tecido da folha combinado com a expressão do TcdA nas raízes sugere que o novo elemento regulador de promotor genético quimérico expressa o transgene tcda de uma maneira específica no tecido radicular. TABELA 3: Média dos níveis de expressão de proteína TcdA (ppm) em folhas de milho, pelo construto, por amostras colhidas durante o ensaio biológico de inseto.

[00191] Análise da Expressão de Proteína após Ensaio biológico de Inseto.

[00192] Os ELISA e Western blots foram usados para analisar um subconjunto de material de folha e de raiz após a conclusão de experimentos de ensaio biológico de inseto. As TABELAS 4 e 5 relacionam a média de expressão de proteína TcdA em material de folha e raiz, respectivamente. Embora existam diferenças significativas nos níveis de expressão de proteína TcdA em folhas de milho T1 entre construtos, as diferenças entre construtos foram menos distinguidos nas raízes analisadas de acordo com os ensaio biológico inseto quando comparado a folhas. Os eventos pDAS5144 produzidos a maior variação de expressão de proteína TcdA, resultando na expressão de proteína TcdA nos eventos transgênicos que foram testados. Comparativamente, do total de proteína recuperada, nenhuma proteína TcdA foi detectável nos tecidos das folhas. Estes resultados, além disso, sugere que a expressão transgene do construto pDAS5144, nos quais TcdA é impulsionado pelos novos elementos reguladores de promotor genético quimérico, é específico para raízes.TABELA 4: A expressão da proteína TcdA (PPM) em folhas de milho, pelo construto, após a conclusão do ensaio biológico de inseto.TABELA 5: A expressão da proteína TcdA (PPM) em folhas de milho, pelo construto, após a conclusão do ensaio biológico de inseto.

[00193] A Expressão da Proteína nas Etapas de Desenvolvimento V6 e VT. Estudos adicionais foram realizados para avaliar os níveis de expressão TcdA pelos novos elementos reguladores do promotor genérico quimérico nas etapas V6 e VT do desenvolvimento da planta de milho. Plantas de milho foram cultivadas expressando o transgene TcdA de cada um dos construtos 5116, 5117, e 5144. A proteína foi isolada para o tecido da folha T1 e quantificada, estes resultados foram comparados ao total de proteína isolada da planta total. Estes resultados como são mostrados na TABELA 6, além disso, confirma que a expressão do transgene tcda dos novos elementos reguladores de promotor genético quimérico do construto pDAS5144 é específico de raiz. A proteína TcdA foi detectada do total de proteína isolado de todas as plantas, mas não há proteína TcdA detectada nas folhas. Além disso, os novos elementos reguladores do promotor genético quimérico do construto pDAS5144 expressou o transgene tcda nas etapas V6 e VT do crescimento e desenvolvimento do milho.TABELA 6: O total de proteína TcdA de folhas de milho T1 colhidas nas etapas V6 e VT do crescimento e desenvolvimento da planta.

[00194] Tal como os novos elementos reguladores do promotor genético quimérico fora ligados operativamente e usado para expressar um transgene como um cassete de expressão gênica, e o perfil da expressão resultante foi caracterizado. Está descrito pela primeira vez um promotor quimérico caracterizado pelo fato de abranger uma sequência de polinucleotídeos promotor a montante que foi obtido de Peroxidase 5 de milho (Zea mays) seguido pela Íntron 6 do gene da álcool-desidrogenase do milho (Zea mays) e Vírus do Listrado do Milho 5’ -UTR para uso nos construtos da expressão gênica. Os construtos que expressam os novos elementos reguladores do promotor genético quimérico foram mostrados para expressar um transgene em um tecido radicular de maneira específica. Os resultados de especificidade do tecido foram surpreendentes, devido a que um promotor quimérico que abrange uma sequência de polinucleotídeo promotor a montante que foi obtida da Peroxidase 5 de milho (Zea mays) seguida pela íntron 1 de álcool dehidrogenase do milho (Zea mays), expressou um transgene tanto em tecido de folha como radicular. veja Tabela 22 da Pat. No. 6.384.207 dos EUA.

Claims

1. Sequência polinucleotídica quimérica caracterizada pelo fato de que consiste na SEQ ID NO: 1, em que o polinucleotídeo quimérico promove a expressão específica de raiz de um transgene.

2. Sequência polinucleotídica quimérica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que está operacionalmente ligada a um transgene.

3. Sequência polinucleotídica quimérica, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o transgene é tcdA.

4. Sequência polinucleotídica quimérica, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que o transgene operacionalmente ligado codifica um polipeptídeo ou RNA pequeno.