KR20160125506A - 키메라 유전자 조절 요소에 의해 부여된 뿌리 특이적 발현 - Google Patents

키메라 유전자 조절 요소에 의해 부여된 뿌리 특이적 발현 Download PDF

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KR20160125506A
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멀로 패트리시아 앤 오언스
로니 2세 햄튼
코리 라슨
에런 우슬리
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다우 아그로사이언시즈 엘엘씨
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Abstract

키메라 유전자 조절 요소를 사용하여 식물 세포 및/또는 식물 조직에서 트랜스진을 발현시키기 위한 구축물 및 방법이 제공된다. 구체적으로, 구축물은 제아 메이스 퍼옥시다제 5로부터 수득된 상류-프로모터 폴리뉴클레오티드 서열에 이어서 제아 메이스 알콜 데히드로게나제 (I) 인트론 6 및 메이즈 줄무늬 바이러스 5'-UTR을 포함하는 키메라 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자 발현 카세트를 포함한다. 생성된 프로모터 서열은 키메라 유전자 조절 요소를 포함한다. 키메라 유전자 프로모터 조절 요소를 사용하여 트랜스진을 발현하는 식물을 성장시키는 방법이 추가로 개시된다.

Description

키메라 유전자 조절 요소에 의해 부여된 뿌리 특이적 발현 {ROOT SPECIFIC EXPRESSION CONFERRED BY CHIMERIC GENE REGULATORY ELEMENTS}
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2014년 2월 28일에 출원된 미국 가출원 일련 번호 61/946,066에 대한 35 USC § 119 (e) 하의 우선권을 주장하며, 상기 가출원은 본원에 참조로 명백히 포함된다.
전자적으로 제출된 서열 목록에 대한 참조
서열 목록의 공식 사본은 2015년 2월 26일에 작성되고 크기가 49.7 킬로바이트인 파일명 "68242_ST25.txt"로 수록된 ASCII 포맷 서열로서 EFS-웹을 통해 전자적으로 제출된 것이며, 본 명세서와 함께 출원된다. ASCII 포맷 문서에 함유된 서열 목록은 본 명세서의 일부이며, 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 일반적으로 식물 분자생물학 분야, 및 보다 구체적으로, 식물에서의 트랜스진 발현의 분야에 관한 것이다.
많은 식물 종은 농경학상 바람직한 형질 또는 특징을 도입하기 위해 트랜스진으로 형질전환될 수 있다. 식물 종은 특정한 바람직한 형질을 갖도록 개발되고/거나 변형된다. 일반적으로, 바람직한 형질은, 예를 들어 영양 품질 개선, 수확량 증가, 해충 또는 질병 저항성 부여, 가뭄 및 스트레스 내성 증가, 원예 품질 (예를 들어, 착색 및 성장) 개선, 제초제 저항성 부여, 식물로부터의 산업상 유용한 화합물 및/또는 물질의 생산 가능, 및/또는 제약의 생산 가능을 포함한다.
단일 게놈 유전자좌에 스택킹된 다중 트랜스진을 포함하는 트랜스제닉 식물 종은 식물 형질전환 기술을 통해 생산된다. 식물 형질전환 기술은 식물 세포 내로의 트랜스진의 도입, 식물 게놈 내 안정하게 통합된 트랜스진 카피를 함유하는 생식력 있는 트랜스제닉 식물의 회수, 및 식물 게놈의 전사 및 번역을 통한 후속 트랜스진 발현으로 바람직한 형질 및 표현형을 보유하는 트랜스제닉 식물의 생성을 가져온다. 그러나, 형질 스택으로서 조작된 다중 트랜스진을 고도로 발현하는 트랜스제닉 식물 종이 생산되도록 하는 메카니즘이 바람직하다.
마찬가지로, 식물의 특정한 조직 또는 기관 내에서 트랜스진이 발현되도록 하는 메카니즘이 바람직하다. 예를 들어, 토양-매개 병원체에 의한 감염에 대한 식물의 증가된 저항성은 병원체-저항성 단백질이 식물의 뿌리 내에서 강하게 발현되도록 식물 게놈을 병원체-저항성 유전자로 형질전환시킴으로써 달성될 수 있다. 대안적으로, 특정한 성장 또는 발달 단계에 있는, 예컨대, 예를 들어 세포 분열 또는 신장 중인 식물 조직에서 트랜스진을 발현시키는 것이 바람직할 수 있다.
키메라 프로모터 조절 요소 (예를 들어, 상류 프로모터, 인트론 및 5'-UTR을 포함하는 프로모터 서열)가 본원에 개시된다. 키메라 프로모터 조절 요소를 이용하는 구축물 및 방법이 추가로 기재된다.
식물 세포 및/또는 식물 조직에서 트랜스진을 발현시키기 위한 구축물 및 방법이 본원에 개시된다. 한 실시양태에서, 구축물은 제아 메이스(Zea mays) 퍼옥시다제 5로부터 수득된 상류-프로모터 폴리뉴클레오티드 서열에 이어서 제아 메이스 알콜 데히드로게나제 (I) 인트론 6 및 메이즈 줄무늬 바이러스(Maize Streak Virus) 5'-UTR을 포함하는 키메라 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자 발현 카세트를 포함한다. 생성된 키메라 프로모터 서열은 신규 키메라 유전자 조절 요소를 포함한다.
한 실시양태에서, 유전자 발현 카세트는 트랜스진 또는 이종 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 키메라 유전자 프로모터 조절 요소를 포함한다. 한 실시양태에서, 유전자 발현 카세트는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 트랜스진을 포함한다.
키메라 유전자 프로모터 조절 요소 (예를 들어, 상류-프로모터, 인트론 및 5'-UTR)를 사용하여 트랜스진을 발현하는 식물을 성장시키는 방법이 본원에 개시된다. 키메라 유전자 프로모터 조절 요소를 사용하여 트랜스진을 발현하는 식물 조직 및 세포를 배양하는 방법이 또한 본원에 개시된다. 한 실시양태에서, 본원에 개시된 바와 같은 방법은 식물 뿌리에서의 조직-특이적 유전자 발현을 포함한다. 키메라 유전자 프로모터 조절 요소를 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 단리하는 방법이 또한 본원에 개시된다.
한 실시양태에서, 본 개시내용은 트랜스진에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 유전자 발현 카세트에 관한 것이며, 여기서 프로모터는 엄격한 조건 하에서 서열식별번호(SEQ ID NO): 1의 상보체에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 포함하는 폴리뉴클레오티드 프로브에 혼성화되는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 실시양태의 후속 측면에서, 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호: 1에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는다. 다른 측면에서, 작동가능하게 연결된 트랜스진은 폴리펩티드 또는 소형 RNA를 코딩한다. 추가 측면에서, 트랜스진은 살곤충제 저항성 트랜스진, 제초제 내성 트랜스진, 질소 사용 효율 트랜스진, 물 사용 효율 트랜스진, 영양 품질 트랜스진, DNA 결합 트랜스진 및 선택 마커 트랜스진으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 한 측면에서, 실시양태는 3'-비번역 영역을 포함하는 유전자 발현 카세트에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 본 개시내용은 유전자 발현 카세트를 포함하는 재조합 벡터에 관한 것이다. 실시양태의 한 측면에서, 벡터는 플라스미드, 코스미드, 박테리아 인공 염색체, 바이러스 및 박테리오파지로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 실시양태에서, 본 개시내용은 유전자 발현 카세트를 포함하는 트랜스제닉 세포에 관한 것이다. 또 다른 실시양태에서, 트랜스제닉 세포는 트랜스제닉 식물 세포이다. 추가 실시양태에서, 본 개시내용은 트랜스제닉 식물 세포를 포함하는 트랜스제닉 식물에 관한 것이다. 실시양태의 한 측면에서, 트랜스제닉 식물은 단자엽 또는 쌍자엽 식물이다. 다른 측면에서, 단자엽 식물은 메이즈 식물, 벼 식물 및 밀 식물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 추가 실시양태에서, 본 개시내용은 트랜스제닉 식물로부터의 트랜스제닉 종자에 관한 것이다. 또 다른 실시양태에서, 프로모터는 조직-선호 프로모터이다. 후속 실시양태에서, 조직-선호 프로모터는 뿌리 조직-선호 프로모터이다.
한 실시양태에서, 본 개시내용은 엄격한 조건 하에서 서열식별번호: 1의 상보체에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 포함하는 폴리뉴클레오티드 프로브에 혼성화되는 합성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 트랜스제닉 세포에 관한 것이다. 실시양태의 한 측면에서, 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호: 1에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는다. 실시양태의 추가 측면에서, 트랜스제닉 세포는 트랜스제닉 식물 세포이다. 또 다른 측면에서, 트랜스제닉 식물 세포는 식물 형질전환 방법에 의해 생산된다. 다른 측면에서, 식물 형질전환 방법은 아그로박테리움(Agrobacterium)-매개 형질전환 방법, 바이오리스틱 형질전환 방법, 탄화규소 형질전환 방법, 원형질체 형질전환 방법 및 리포솜 형질전환 방법으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 추가 실시양태에서, 본 개시내용은 트랜스제닉 식물 세포를 포함하는 트랜스제닉 식물에 관한 것이다. 실시양태의 한 측면에서, 트랜스제닉 식물은 단자엽 또는 쌍자엽 식물이다. 다른 측면에서, 단자엽 식물은 메이즈 식물, 벼 식물 및 밀 식물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 추가 실시양태에서, 본 개시내용은 트랜스제닉 식물로부터의 트랜스제닉 종자에 관한 것이다. 추가의 실시양태에서, 프로모터는 조직-선호 프로모터이다. 추가 실시양태에서, 조직-선호 프로모터는 뿌리 조직-선호 프로모터이다.
한 실시양태에서, 본 개시내용은 엄격한 조건 하에서 서열식별번호: 1의 상보체에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 포함하는 폴리뉴클레오티드 프로브에 혼성화되는 키메라 폴리뉴클레오티드 서열에 관한 것이다. 실시양태의 또 다른 측면에서, 폴리뉴클레오티드는 서열식별번호: 1에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는다. 추가 측면에서, 키메라 폴리뉴클레오티드 서열은 트랜스진에 작동가능하게 연결된다. 또 다른 측면에서, 작동가능하게 연결된 트랜스진은 폴리펩티드 또는 소형 RNA를 코딩한다. 한 측면에서, 키메라 폴리뉴클레오티드 서열은 트랜스진에 작동가능하게 연결된다. 추가 측면에서, 트랜스진은 살곤충제 저항성 트랜스진, 제초제 내성 트랜스진, 질소 사용 효율 트랜스진, 물 사용 효율 트랜스진, 영양 품질 트랜스진, DNA 결합 트랜스진 및 선택 마커 트랜스진으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 추가의 실시양태에서, 본 개시내용은 유전자 발현 카세트를 포함하는 재조합 벡터에 관한 것이다. 추가 측면은 벡터가 플라스미드, 코스미드, 박테리아 인공 염색체, 바이러스 및 박테리오파지로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 개시내용은 유전자 발현 카세트를 포함하는 트랜스제닉 세포에 관한 것이다. 다른 측면에서, 트랜스제닉 세포는 트랜스제닉 식물 세포이다. 한 실시양태에서, 본 개시내용은 트랜스제닉 식물 세포를 포함하는 트랜스제닉 식물에 관한 것이다. 추가의 측면은 트랜스제닉 식물이 단자엽 식물인 것을 포함한다. 추가 측면은 단자엽 식물이 메이즈 식물, 밀 식물 및 벼 식물로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 개시내용은 트랜스제닉 식물로부터의 트랜스제닉 종자에 관한 것이다. 실시양태의 추가 측면에서, 키메라 폴리뉴클레오티드 서열은 트랜스진의 뿌리-선호 발현을 촉진한다.
한 실시양태에서, 본 개시내용은
3'-비번역 영역에 작동가능하게 연결된 이종 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 서열식별번호: 1에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자 발현 카세트에 의해 식물 세포를 형질전환시키는 단계;
유전자 발현 카세트를 포함하는 형질전환된 식물 세포를 단리하는 단계;
형질전환된 식물 세포를 트랜스제닉 식물로 재생시키는 단계; 및
서열식별번호: 1을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자 발현 카세트를 포함하는 트랜스제닉 식물을 수득하는 단계
를 포함하는, 트랜스제닉 식물에서 이종 코딩 서열을 발현시키는 방법에 관한 것이다.
실시양태의 한 측면에서, 이종 코딩 서열은 살곤충제 저항성 코딩 서열, 제초제 내성 코딩 서열, 질소 사용 효율 코딩 서열, 물 사용 효율 코딩 서열, 영양 품질 코딩 서열, DNA 결합 코딩 서열 및 선택 마커 코딩 서열로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 측면에서, 식물 세포를 형질전환시키는 것은 식물 형질전환 방법이다. 후속 측면에서, 식물 형질전환 방법은 아그로박테리움-매개 형질전환 방법, 바이오리스틱 형질전환 방법, 탄화규소 형질전환 방법, 원형질체 형질전환 방법 및 리포솜 형질전환 방법으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 측면에서, 트랜스제닉 식물은 단자엽 또는 쌍자엽 트랜스제닉 식물이다. 추가 측면은 단자엽 트랜스제닉 식물이 메이즈 식물, 밀 식물 및 벼 식물로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 개시내용은 트랜스제닉 식물로부터의 트랜스제닉 종자에 관한 것이다. 추가의 측면에서, 이종 코딩 서열은 트랜스제닉 식물 조직에서 발현된다. 후속 측면에서, 트랜스제닉 식물 조직은 트랜스제닉 식물 뿌리 조직이다.
한 실시양태에서, 본 개시내용은
서열식별번호: 1에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 확인하는 단계;
서열식별번호: 1에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열에 결합하는 복수의 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열을 생산하는 단계;
복수의 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열로부터 선택된 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열을 갖는 DNA 샘플로부터 서열식별번호: 1에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 증폭시키는 단계; 및
서열식별번호: 1에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 단리하는 단계
를 포함하는, 서열식별번호: 1에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 단리하는 방법에 관한 것이다.
실시양태의 또 다른 측면에서, 서열식별번호: 1에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드 서열은 트랜스진에 작동가능하게 연결된다. 실시양태의 후속 측면에서, 작동가능하게 연결된 트랜스진은 폴리펩티드 또는 소형 RNA를 코딩한다.
하기 넘버링된 실시양태가 고려되고, 이는 비-제한적이다:
1. 트랜스진에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 유전자 발현 카세트이며, 여기서 프로모터는 엄격한 조건 하에서 서열식별번호: 1의 상보체에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 포함하는 폴리뉴클레오티드 프로브에 혼성화되는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인 유전자 발현 카세트.
2. 제1항목에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 서열식별번호: 1에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 것인 유전자 발현 카세트.
3. 제1항목에 있어서, 작동가능하게 연결된 트랜스진이 폴리펩티드 또는 소형 RNA를 코딩하는 것인 유전자 발현 카세트.
4. 제1항목에 있어서, 트랜스진이 살곤충제 저항성 트랜스진, 제초제 내성 트랜스진, 질소 사용 효율 트랜스진, 물 사용 효율 트랜스진, 영양 품질 트랜스진, DNA 결합 트랜스진 및 선택 마커 트랜스진으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 유전자 발현 카세트.
5. 제1항목에 있어서, 3'-비번역 영역을 추가로 포함하는 유전자 발현 카세트.
6. 제1항목의 유전자 발현 카세트를 포함하는 재조합 벡터.
7. 제6항목에 있어서, 플라스미드, 코스미드, 박테리아 인공 염색체, 바이러스 및 박테리오파지로 이루어진 군으로부터 선택되는 재조합 벡터.
8. 제1항목의 유전자 발현 카세트를 포함하는 트랜스제닉 세포.
9. 제8항목에 있어서, 트랜스제닉 식물 세포인 트랜스제닉 세포.
10. 제9항목의 트랜스제닉 식물 세포를 포함하는 트랜스제닉 식물.
11. 제10항목에 있어서, 단자엽 또는 쌍자엽 식물인 트랜스제닉 식물.
12. 제11항목에 있어서, 단자엽 식물이 메이즈 식물, 벼 식물 및 밀 식물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 트랜스제닉 식물.
13. 제10항목의 트랜스제닉 식물로부터의 트랜스제닉 종자.
14. 제1항목에 있어서, 프로모터가 조직-선호 프로모터인 유전자 발현 카세트.
15. 제1항목에 있어서, 조직-선호 프로모터가 뿌리 조직-선호 프로모터인 유전자 발현 카세트.
16. 엄격한 조건 하에서 서열식별번호: 1의 상보체에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 포함하는 폴리뉴클레오티드 프로브에 혼성화되는 합성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 트랜스제닉 세포.
17. 제16항목에 있어서, 합성 폴리뉴클레오티드가 서열식별번호: 1에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 것인 트랜스제닉 세포.
18. 제16항목에 있어서, 트랜스제닉 식물 세포인 트랜스제닉 세포.
19. 제18항목에 있어서, 트랜스제닉 식물 세포가 식물 형질전환 방법에 의해 생산되는 것인 트랜스제닉 세포.
20. 제19항목에 있어서, 식물 형질전환 방법이 아그로박테리움-매개 형질전환 방법, 바이오리스틱 형질전환 방법, 탄화규소 형질전환 방법, 원형질체 형질전환 방법 및 리포솜 형질전환 방법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 트랜스제닉 세포.
21. 제18항목의 트랜스제닉 식물 세포를 포함하는 트랜스제닉 식물.
22. 제21항목에 있어서, 단자엽 또는 쌍자엽 식물인 트랜스제닉 식물.
23. 제22항목에 있어서, 단자엽 식물이 메이즈 식물, 벼 식물 및 밀 식물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 트랜스제닉 식물.
24. 제21항목의 트랜스제닉 식물로부터의 트랜스제닉 종자.
25. 제16항목에 있어서, 프로모터가 조직-선호 프로모터인 트랜스제닉 세포.
26. 제16항목에 있어서, 조직-선호 프로모터가 뿌리 조직-선호 프로모터인 트랜스제닉 세포.
27. 엄격한 조건 하에서 서열식별번호: 1의 상보체에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 포함하는 폴리뉴클레오티드 프로브에 혼성화되는 키메라 폴리뉴클레오티드 서열.
28. 제27항목에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 서열식별번호: 1에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 것인 키메라 폴리뉴클레오티드 서열.
29. 제27항목에 있어서, 트랜스진에 작동가능하게 연결된 키메라 폴리뉴클레오티드 서열.
30. 제29항목에 있어서, 작동가능하게 연결된 트랜스진이 폴리펩티드 또는 소형 RNA를 코딩하는 것인 작동가능하게 연결된 트랜스진.
31. 제27항목의 트랜스진에 작동가능하게 연결된 키메라 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자 발현 카세트.
32. 제31항목에 있어서, 트랜스진이 살곤충제 저항성 트랜스진, 제초제 내성 트랜스진, 질소 사용 효율 트랜스진, 물 사용 효율 트랜스진, 영양 품질 트랜스진, DNA 결합 트랜스진 및 선택 마커 트랜스진으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 유전자 발현 카세트.
33. 제31항목의 유전자 발현 카세트를 포함하는 재조합 벡터.
34. 제33항목에 있어서, 플라스미드, 코스미드, 박테리아 인공 염색체, 바이러스 및 박테리오파지로 이루어진 군으로부터 선택되는 재조합 벡터.
35. 제31항목의 유전자 발현 카세트를 포함하는 트랜스제닉 세포.
36. 제35항목에 있어서, 트랜스제닉 식물 세포인 트랜스제닉 세포.
37. 제36항목의 트랜스제닉 식물 세포를 포함하는 트랜스제닉 식물.
38. 제37항목에 있어서, 단자엽 식물인 트랜스제닉 식물.
39. 제38항목에 있어서, 단자엽 식물이 메이즈 식물, 밀 식물 및 벼 식물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 트랜스제닉 식물.
40. 제37항목의 트랜스제닉 식물로부터의 트랜스제닉 종자.
41. 제27항목에 있어서, 트랜스진의 뿌리-선호 발현을 촉진하는 키메라 폴리뉴클레오티드 서열.
42. a) 3'-비번역 영역에 작동가능하게 연결된 이종 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 서열식별번호: 1에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자 발현 카세트에 의해 식물 세포를 형질전환시키는 단계;
b) 유전자 발현 카세트를 포함하는 형질전환된 식물 세포를 단리하는 단계;
c) 형질전환된 식물 세포를 트랜스제닉 식물로 재생시키는 단계; 및
d) 서열식별번호: 1을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자 발현 카세트를 포함하는 트랜스제닉 식물을 수득하는 단계
를 포함하는, 트랜스제닉 식물에서 이종 코딩 서열을 발현시키는 방법.
43. 제42항목에 있어서, 이종 코딩 서열이 살곤충제 저항성 코딩 서열, 제초제 내성 코딩 서열, 질소 사용 효율 코딩 서열, 물 사용 효율 코딩 서열, 영양 품질 코딩 서열, DNA 결합 코딩 서열 및 선택 마커 코딩 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
44. 제42항목에 있어서, 식물 세포를 형질전환시키는 것이 식물 형질전환 방법인 방법.
45. 제44항목에 있어서, 식물 형질전환 방법이 아그로박테리움-매개 형질전환 방법, 바이오리스틱 형질전환 방법, 탄화규소 형질전환 방법, 원형질체 형질전환 방법 및 리포솜 형질전환 방법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
46. 제42항목에 있어서, 트랜스제닉 식물이 단자엽 또는 쌍자엽 트랜스제닉 식물인 방법.
47. 제46항목에 있어서, 단자엽 트랜스제닉 식물이 메이즈 식물, 밀 식물 및 벼 식물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
48. 제42항목의 트랜스제닉 식물로부터의 트랜스제닉 종자.
49. 제42항목에 있어서, 이종 코딩 서열이 트랜스제닉 식물 조직에서 발현되는 것인 방법.
50. 제42항목에 있어서, 트랜스제닉 식물 조직이 트랜스제닉 식물 뿌리 조직인 방법.
51. a) 서열식별번호: 1에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 확인하는 단계;
b) 서열식별번호: 1에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열에 결합하는 복수의 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열을 생산하는 단계;
c) 복수의 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열로부터 선택된 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열을 갖는 DNA 샘플로부터 서열식별번호: 1에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 증폭시키는 단계; 및
d) 서열식별번호: 1에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 단리하는 단계
를 포함하는, 서열식별번호: 1에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 단리하는 방법.
52. 제51항목에 있어서, 서열식별번호: 1에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드 서열이 트랜스진에 작동가능하게 연결되는 것인 방법.
53. 제52항목에 있어서, 작동가능하게 연결된 트랜스진이 폴리펩티드 또는 소형 RNA를 코딩하는 것인 방법.
정의
본원에 사용된 단수 형태는 문맥에서 달리 분명하게 및 명백하게 기재되지 않는 한 복수 지시대상을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "역교배"는 육종가가 잡종 자손을 다시 부모 중 하나와, 예를 들어 제1 세대 잡종 F1을 F1 잡종의 부모 유전자형 중 하나와 교배시키는 과정을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "인트론"은 전사되지만 번역되지는 않는 유전자 (또는 발현된 관심 뉴클레오티드 서열)에 포함된 임의의 핵산 서열을 지칭한다. 인트론은 DNA의 발현된 서열 내의 비번역 핵산 서열, 뿐만 아니라 그로부터 전사된 RNA 분자 중 상응하는 서열을 포함한다.
본원에 기재된 구축물은 또한 번역 및/또는 mRNA 안정성을 증진시키는 서열, 예컨대 인트론을 함유할 수 있다. 하나의 이러한 인트론의 예는 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)의 히스톤 변이체의 유전자 II의 제1 인트론 또는 임의의 다른 통상적으로 공지된 인트론 서열이다. 인트론은 번역 및/또는 mRNA 안정성을 증진시키기 위해 프로모터 서열과 조합되어 사용될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "5' 비번역 영역" 또는 "5'-UTR"은 프리-mRNA 또는 성숙 mRNA의 5' 말단의 비번역 절편을 지칭한다. 예를 들어, 성숙 mRNA 상에서 5'-UTR은 전형적으로 그의 5' 말단에 7-메틸구아노신 캡을 보유하고, 많은 과정, 예컨대 스플라이싱, 폴리아데닐화, 세포질을 향한 mRNA 유출, 번역 기구에 의한 mRNA의 5' 말단 확인 및 분해에 대한 mRNA 보호에 관여한다.
본원에 사용된 용어 "3' 비번역 영역" 또는 "3'-UTR"은 프리-mRNA 또는 성숙 mRNA의 3' 말단의 비번역 절편을 지칭한다. 예를 들어, 성숙 mRNA 상에서 이 영역은 폴리-(A) 꼬리를 보유하고, mRNA 안정성, 번역 개시 및 mRNA 유출에서 많은 역할을 갖는 것으로 공지되어 있다.
본원에 사용된 용어 "폴리아데닐화 신호"는 폴리-(A) 폴리머라제의 존재 하에 있을 때 전사체의 종결이, 예를 들어 폴리-(A) 신호의 하류 10 내지 30개 염기에 위치하는 폴리아데닐화 부위 상에서 폴리아데닐화되도록 하는 mRNA 전사체에 존재하는 핵산 서열을 지칭한다. 많은 폴리아데닐화 신호는 관련 기술분야에 공지되어 있고, 본 발명에 유용하다. 예시적인 서열은 문헌 [Loke J., et al., (2005) Plant Physiology 138(3); 1457-1468]에 기재된 바와 같은 AAUAAA 및 그의 변이체를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "단리된"은 생물학적 성분 (핵산 또는 단백질 포함)이 그 성분을 자연적으로 발생시키는 유기체의 세포 내의 다른 생물학적 성분 (즉, 다른 염색체 및 염색체외 DNA)으로부터 분리된 것을 지칭한다.
핵산 분자와 관련하여 본원에 사용된 용어 "정제된"은 절대적 순도 (예컨대 균질 제제)를 요구하지 않으며; 그 대신에, 서열이 그의 천연 세포 환경에서보다 상대적으로 더 순수하다는 지표를 나타낸다 (천연 수준과 비교하여 이 수준은, 예를 들어 농도 또는 유전자 발현 수준의 관점에서 적어도 2-5배 더 커야 함). DNA 분자는 총 DNA 또는 총 RNA로부터 직접 수득된다. 추가로, cDNA 클론은 자연 발생된 것이 아니라 오히려 바람직하게는 부분적으로 정제된 자연 발생 물질 (메신저 RNA)의 조작을 통해 수득된다. mRNA로부터의 cDNA 라이브러리의 구축은 합성 물질 (cDNA)의 생성을 수반한다. 개별 cDNA 클론은 cDNA 라이브러리를 운반하는 세포의 클론 선택에 의해 합성 라이브러리로부터 정제될 수 있다. 따라서, mRNA로부터의 cDNA 라이브러리의 구축 및 별개의 cDNA 클론의 정제를 포함하는 과정은 천연 메시지의 대략 106배 정제를 가져온다. 마찬가지로, 프로모터 DNA 서열은 플라스미드 내로 클로닝될 수 있다. 이러한 클론은 자연 발생된 것이 아니라 오히려 바람직하게는 부분적으로 정제된 자연 발생 물질, 예컨대 게놈 DNA 라이브러리의 조작을 통해 수득된다. 따라서, 적어도 한 자릿수, 바람직하게는 두 또는 세 자릿수, 보다 바람직하게는 네 또는 다섯 자릿수의 정제가 이들 기술에서 선호된다.
유사하게, 정제는 성분 DNA 서열에서 화학적 또는 기능적 변화가 발생했다는 지표를 나타낸다. "정제된" 핵산 분자 및 단백질은 표준 정제 방법에 의해 정제된 핵산 분자 및 단백질을 포함한다. 용어 "정제된"은 또한 숙주 세포 (예를 들어, 식물 세포)에서 재조합 DNA 방법에 의해 제조된 핵산 및 단백질, 뿐만 아니라 화학적으로 합성된 핵산 분자, 단백질 및 펩티드를 포함한다.
용어 "재조합"은 유전자 재조합이 발생한 세포 또는 유기체를 의미한다. 이는 또한 인간 개입에 의해 인공적으로 또는 합성적으로 (즉, 비-자연적으로) 변경된 분자 (예를 들어, 벡터, 플라스미드, 핵산, 폴리펩티드 또는 소형 RNA)를 포함한다. 변경은 그의 자연 환경 또는 상태 내의 분자, 또는 그러한 자연 환경 또는 상태로부터 제거된 분자 상에서 수행될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "발현"은 폴리뉴클레오티드가 mRNA (소형 RNA 분자 포함)로 전사되는 과정 및/또는 전사된 mRNA (또한 "전사체"로 지칭됨)가 후속적으로 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질로 번역되는 과정을 지칭한다. 유전자 발현은 외부 신호, 예를 들어 유전자 발현을 증가 또는 감소시키는 작용제에 대한 세포, 조직 또는 유기체의 노출에 의해 영향을 받을 수 있다. 유전자의 발현은 또한 DNA에서 RNA를 거쳐 단백질로의 경로 중 어디에서나 조절될 수 있다. 유전자 발현의 조절은, 예를 들어 전사, 번역, RNA 수송 및 프로세싱, 중간 분자, 예컨대 mRNA의 분해에 작용하는 제어를 통해, 또는 특정 단백질 분자가 제조된 후에 그의 활성화, 불활성화, 구획화 또는 분해를 통해, 또는 그의 조합에 의해 발생한다. 유전자 발현은 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법, 예를 들어 비제한적으로 노던(Northern) 블롯, RT-PCR, 웨스턴(Western) 블롯, 또는 시험관내, 계내 또는 생체내 단백질 활성 검정(들)에 의해 RNA 수준 또는 단백질 수준에서 측정될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "상동성-기반 유전자 침묵" 또는 "HBGS"는 전사 유전자 침묵 및 전사 후 유전자 침묵 둘 다를 포함하는 일반 용어이다. 비연결 침묵 유전자좌에 의한 표적 유전자좌의 침묵은 각각 프로모터 또는 전사된 서열에 상응하는 이중-가닥 RNA (dsRNA)의 생산에 의한 전사 억제 (전사 유전자 침묵; TGS) 또는 mRNA 분해 (전사 후 유전자 침묵; PTGS)로부터 유발될 수 있다. 각각의 과정에서 별개의 세포 성분의 관여는 dsRNA-유도된 TGS 및 PTGS가 고전적인 통상의 메카니즘의 다양화로부터 유발되었을 가능성을 시사한다. 그러나, TGS 및 PTGS의 엄격한 비교는 일반적으로 별개의 침묵 유전자좌의 분석에 의존하기 때문에 달성하기가 어려웠다. 단일 트랜스진 유전자좌는 상이한 표적 유전자의 프로모터 및 전사된 서열에 상응하는 dsRNA의 생산에 의해 TGS 및 PTGS 둘 다를 촉발하는 것으로 설명될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "핵산 분자", "핵산" 또는 "폴리뉴클레오티드" (3개 용어는 모두 서로 동의어임)는 RNA, cDNA, 게놈 DNA 및 합성 형태, 및 그의 혼합된 중합체의 센스 및 안티-센스 가닥 둘 다를 포함할 수 있는, 뉴클레오티드의 중합체 형태를 지칭한다. "뉴클레오티드"는 리보뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드 또는 어느 하나의 유형의 뉴클레오티드의 변형된 형태를 지칭할 수 있다. 핵산 분자는 통상적으로 달리 명시되지 않는 한, 적어도 10개 염기의 길이이다. 용어는 결정되지 않은 길이의 RNA 또는 DNA 분자를 지칭할 수 있다. 용어는 DNA의 단일- 및 이중-가닥 형태를 포함한다. 핵산 분자는 자연 발생 및/또는 비-자연 발생 뉴클레오티드 연결에 의해 함께 연결된 자연-발생 및 변형된 뉴클레오티드 중 어느 하나 또는 둘 다를 포함할 수 있다.
핵산 분자는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 인지되는 바와 같이, 화학적 또는 생화학적으로 변형될 수 있거나, 또는 비-자연적 또는 유도체화된 뉴클레오티드 염기를 함유할 수 있다. 이러한 변형은, 예를 들어 표지, 메틸화, 자연 발생 뉴클레오티드 중 1개 이상의 유사체에 의한 치환, 뉴클레오티드간 변형 (예를 들어, 비하전된 연결: 예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포르아미데이트, 카르바메이트 등; 하전된 연결: 예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등; 펜던트 모이어티: 예를 들어, 펩티드; 삽입제: 예를 들어, 아크리딘, 프소랄렌 등; 킬레이트화제; 알킬화제; 및 변형된 연결: 예를 들어, 알파 아노머 핵산 등)을 포함한다. 용어 "핵산 분자"는 또한 단일 가닥, 이중 가닥, 부분 듀플렉스형, 트리플렉스형, 헤어핀형, 원형 및 패드록형 입체구조를 포함한 임의의 위상 입체형태를 포함한다.
전사는 DNA 가닥을 따라 5'에서 3'로의 방식으로 진행된다. 이는 RNA가 성장하는 쇄의 3' 말단에 리보뉴클레오티드-5'-트리포스페이트를 순차적 부가함으로써 (피로포스페이트의 제거를 요건으로 함) 제조된다는 것을 의미한다. 선형 또는 원형 핵산 분자에서, 별개의 요소들 (예를 들어, 특정한 뉴클레오티드 서열)은 이들이 추가의 요소로부터 5' 방향으로 동일한 핵산에 결합하거나 결합할 것이라면 그 추가의 요소에 비해 "상류"인 것으로 지칭될 수 있다. 유사하게, 별개의 요소들은 이들이 추가의 요소로부터 3' 방향으로 동일한 핵산에 결합하거나 결합할 것이라면 그 추가의 요소에 비해 "하류"인 것으로 지칭될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "염기 위치"는 지정된 핵산 내에 주어진 염기 또는 뉴클레오티드 잔기의 위치를 지칭한다. 지정된 핵산은 참조 핵산과의 정렬에 의해 규정될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "혼성화"는 올리고뉴클레오티드 및 그의 유사체가 왓슨-크릭(Watson-Crick), 후그스틴(Hoogsteen) 또는 역 후그스틴 수소 결합을 포함하는, 상보적 염기 사이의 수소 결합에 의해 혼성화되는 과정을 지칭한다. 일반적으로, 핵산 분자는 피리미딘 (시토신 (C), 우라실 (U) 및 티민 (T)) 또는 퓨린 (아데닌 (A) 및 구아닌 (G))인 질소함유 염기로 이루어진다. 이들 질소함유 염기는 피리미딘과 퓨린 사이에 수소 결합을 형성하고, 퓨린에 대한 피리미딘의 결합은 "염기 쌍형성"으로 지칭된다. 보다 구체적으로, A는 T 또는 U에 수소 결합할 것이고, G는 C에 결합할 것이다. "상보적"은 2개의 별개의 핵산 서열 또는 동일한 핵산 서열의 2개의 별개의 영역 사이에 발생하는 염기 쌍형성을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "특이적으로 혼성화가능한" 및 "특이적으로 상보적인"은 올리고뉴클레오티드와 DNA 또는 RNA 표적 사이에 안정하고 특이적인 결합이 발생하도록 하기에 충분한 정도의 상보성을 지칭한다. 올리고뉴클레오티드는 특이적으로 혼성화되기 위해 표적 서열에 대해 100% 상보적일 필요는 없다. 올리고뉴클레오티드의 표적 DNA 또는 RNA 분자에 대한 결합이 표적 DNA 또는 RNA의 정상적인 기능을 방해하고, 특이적 결합이 요구되는 조건 하에서, 예를 들어 생체내 검정 또는 시스템의 경우에 생리학적 조건 하에서 올리고뉴클레오티드의 비-표적 서열에 대한 비-특이적 결합을 피하는데 충분한 정도의 상보성이 존재하는 경우에, 올리고뉴클레오티드는 특이적으로 혼성화가능하다. 이러한 결합은 특이적 혼성화로 지칭된다. 특정한 정도의 엄격도를 생성하는 혼성화 조건은 선택된 혼성화 방법의 성질 및 혼성화 핵산 서열의 조성 및 길이에 따라 달라질 것이다. 일반적으로, 혼성화 온도 및 혼성화 완충제의 이온 강도 (특히, Na+ 및/또는 Mg2+ 농도)가 혼성화의 엄격도에 기여할 것이만, 세척 시간도 또한 엄격도에 영향을 미친다. 특정한 정도의 엄격도를 달성하는데 요구되는 혼성화 조건에 관한 계산은 문헌 [Sambrook et al. (ed.), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989]에 논의되어 있다.
본원에 사용된 용어 "엄격한 조건"은 혼성화 분자와 DNA 표적 사이에 50% 미만의 미스매치가 존재할 경우에만 혼성화가 발생할 조건을 포괄한다. "엄격한 조건"은 추가의 특정한 수준의 엄격도를 포함한다. 따라서, 본원에 사용된 "중간 엄격도" 조건은 50% 초과의 서열 미스매치를 갖는 분자가 혼성화되지 않을 조건이고; "고 엄격도" 조건은 20% 초과의 미스매치를 갖는 서열이 혼성화되지 않을 조건이고; "매우 고도의 엄격도" 조건은 10% 초과의 미스매치를 갖는 서열이 혼성화되지 않을 조건이다.
특정한 실시양태에서, 엄격한 조건은 65℃에서의 혼성화에 이어서 40분 동안 65℃에서 0.1x SSC/0.1% SDS로의 세척을 포함할 수 있다. 하기는 대표적인 비제한적 혼성화 조건이다:
Figure pct00001
매우 고도의 엄격도: 16시간 동안 65℃에서 5x SSC 완충제 중에서 혼성화; 각각 15분 동안 실온에서 2x SSC 완충제 중에서 2회 세척; 및 각각 20분 동안 65℃에서 0.5x SSC 완충제 중에서 2회 세척.
Figure pct00002
고 엄격도: 16-20시간 동안 65-70℃에서 5-6 x SSC 완충제 중에서 혼성화; 각각 5-20분 동안 실온에서 2x SSC 완충제 중에서 2회 세척; 및 각각 30분 동안 55-70℃에서 1x SSC 완충제 중에서 2회 세척.
Figure pct00003
중간 엄격도: 16-20시간 동안 실온 내지 55℃에서 6x SSC 완충제 중에서 혼성화; 각각 20-30분 동안 실온 내지 55℃에서 2-3x SSC 완충제 중에서 적어도 2회 세척.
한 실시양태에서, 특이적으로 혼성화가능한 핵산 분자는 매우 고도의 엄격도 혼성화 조건 하에서 결합된 상태로 유지될 수 있다. 한 실시양태에서, 특이적으로 혼성화가능한 핵산 분자는 고 엄격도 혼성화 조건 하에서 결합된 상태로 유지될 수 있다. 한 실시양태에서, 특이적으로 혼성화가능한 핵산 분자는 중간 엄격도 혼성화 조건 하에서 결합된 상태로 유지될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "올리고뉴클레오티드"는 짧은 핵산 중합체를 지칭한다. 올리고뉴클레오티드는 보다 긴 핵산 절편의 절단에 의해 또는 개별 뉴클레오티드 전구체의 중합에 의해 형성될 수 있다. 자동화 합성기는 수백개까지의 염기쌍 길이의 올리고뉴클레오티드를 합성할 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 상보적 뉴클레오티드 서열에 결합할 수 있기 때문에, DNA 또는 RNA를 검출하기 위한 프로브로서 사용될 수 있다. DNA (올리고데옥시리보뉴클레오티드)로 구성된 올리고뉴클레오티드는 소형 DNA 서열의 증폭을 위한 기술인 폴리머라제 연쇄 반응에 사용될 수 있다. 폴리머라제 연쇄 반응에서, DNA 폴리머라제가 올리고뉴클레오티드를 연장시키고 상보적 가닥을 복제하도록 하는 올리고뉴클레오티드는 전형적으로 "프라이머"로 지칭된다.
본원에 사용된 용어 "폴리머라제 연쇄 반응" 또는 "PCR"은 미국 특허 번호 4,683,195에 기재된 바와 같이 미량의 핵산, RNA 및/또는 DNA를 증폭시키는 절차 또는 기술을 지칭한다. 일반적으로, 올리고뉴클레오티드 프라이머가 설계될 수 있도록, 관심 영역 말단 또는 그 너머로부터의 서열 정보가 이용가능할 필요가 있으며; 이들 프라이머는 증폭시키려는 주형의 대향하는 가닥에 대한 서열과 동일하거나 유사할 것이다. 2개의 프라이머의 5' 말단 뉴클레오티드는 증폭되는 물질의 말단과 일치할 수 있다. PCR은 특정 RNA 서열, 총 게놈 DNA로부터의 특정 DNA 서열, 및 총 세포 RNA로부터 전사되는 cDNA, 박테리오파지 또는 플라스미드 서열 등을 증폭시키는데 사용될 수 있다. 일반적으로 문헌 [Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 51:263 (1987); Erlich, ed., PCR Technology, (Stockton Press, NY, 1989)]을 참조한다.
본원에 사용된 용어 "프라이머"는 조건이 프라이머 연장 산물의 합성에 적합한 경우에 상보적 가닥을 따라 합성의 개시점으로서 작용할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 지칭한다. 합성 조건은 4종의 상이한 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트 및 적어도 1종의 중합-유도제, 예컨대 역전사효소 또는 DNA 폴리머라제의 존재를 포함한다. 이들은 보조인자이거나 또는 다양한 적합한 온도에서 pH 등과 같은 조건에 영향을 미치는 구성성분을 포함할 수 있는 적합한 완충제 중에 존재한다. 프라이머는 바람직하게는 증폭 효율이 최적화되도록 하는 단일 가닥 서열이지만, 이중 가닥 서열이 이용될 수도 있다.
본원에 사용된 용어 "프로브"는 표적 서열에 혼성화되는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 택맨(TaqMan)® 또는 택맨®-스타일 검정 절차에서, 프로브는 2개의 프라이머의 어닐링 부위 사이에 위치하는 표적 부분에 혼성화된다. 프로브는 약 8개의 뉴클레오티드, 약 10개의 뉴클레오티드, 약 15개의 뉴클레오티드, 약 20개의 뉴클레오티드, 약 30개의 뉴클레오티드, 약 40개의 뉴클레오티드 또는 약 50개의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로브는 약 8개의 뉴클레오티드 내지 약 15개의 뉴클레오티드를 포함한다.
서던(Southern) 블롯 검정 절차에서, 프로브는 막에 부착되는 DNA 단편에 혼성화된다. 프로브는 약 10개의 뉴클레오티드, 약 100개의 뉴클레오티드, 약 250개의 뉴클레오티드, 약 500개의 뉴클레오티드, 약 1,000개의 뉴클레오티드, 약 2,500개의 뉴클레오티드 또는 약 5,000개의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로브는 약 500개의 뉴클레오티드 내지 약 2,500개의 뉴클레오티드를 포함한다.
프로브는 검출가능한 표지, 예를 들어 방사성 표지, 비오티닐화 표지, 형광단 (텍사스-레드(Texas-Red)®, 플루오레스세인 이소티오시아네이트 등)을 추가로 포함할 수 있다. 검출가능한 표지는, 예를 들어 프로브의 5' 말단 또는 프로브의 3' 말단에 위치하는 프로브 올리고뉴클레오티드에 직접 공유 부착될 수 있다. 형광단을 포함하는 프로브는 또한 켄처, 예를 들어 블랙 홀 켄처(Black Hole Quencher)™, 아이오와 블랙(Iowa Black)™ 등을 추가로 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "서열 동일성" 또는 "동일성"은 상호교환가능하게 사용될 수 있고, 특정된 비교 윈도우에 걸쳐 최대 상응도로 정렬된 경우에 동일한 2개의 서열 내의 핵산 잔기를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "서열 동일성의 백분율"은 비교 윈도우에 걸쳐 최적으로 정렬된 2개의 서열 (예를 들어, 핵산 서열 또는 아미노산 서열)을 비교함으로써 결정된 값을 지칭하며, 여기서 비교 윈도우 내 서열 부분은 2개의 서열의 최적의 정렬을 위해 참조 서열 (부가 또는 결실을 포함하지 않음)과 비교하여 부가 또는 결실 (즉, 갭)을 포함할 수 있다. 백분율은 둘 다의 서열에서 동일한 핵산 또는 아미노산 잔기가 발생하는 위치의 개수를 결정하여 매칭된 위치의 개수를 산출하고, 매칭된 위치의 개수를 비교 윈도우 내 위치의 총 개수로 나누고, 그 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 산출함으로써 계산된다. 비교를 위해 서열을 정렬하는 방법은 널리 공지되어 있다. 다양한 프로그램 및 정렬 알고리즘이, 예를 들어 다음 문헌에 기재되어 있다: [Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443; Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444; Higgins and Sharp (1988) Gene 73:237-44; Higgins and Sharp (1989) CABIOS 5:151-3; Corpet et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-90; Huang et al. (1992) Comp. Appl. Biosci. 8:155-65; Pearson et al. (1994) Methods Mol. Biol. 24:307-31; Tatiana et al. (1999) FEMS Microbiol. Lett. 174:247-50].
국립 생물 정보 센터 (NCBI) 베이직 로컬 얼라인먼트 서치 툴(Basic Local Alignment Search Tool) (BLAST™; 문헌 [Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10])은 여러 서열 분석 프로그램과 함께 사용하기 위한 경우에 국립 생물 정보 센터 (메릴랜드주 베데스다)를 포함한 여러 공급원으로부터 및 인터넷 상에서 이용가능하다. 이 프로그램을 사용하여 서열 동일성을 결정하는 방법의 설명은 인터넷 상에서 BLAST™에 대한 "도움" 섹션 하에 이용가능하다. 핵산 서열의 비교를 위해, BLAST™ (Blastn) 프로그램의 "Blast 2 서열" 기능이 디폴트 파라미터를 사용하여 이용될 수 있다. 참조 서열에 대해 보다 더 큰 유사성을 갖는 핵산 서열은 이 방법에 의해 평가하였을 때 증가하는 백분율 동일성을 나타낼 것이다.
본원에 사용된 용어 "작동가능하게 연결된"은 또 다른 핵산과 기능적 관계로 배치된 핵산을 지칭한다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결된 핵산이 인접함을 의미할 수 있다. 연결은 편리한 제한 부위에서의 라이게이션에 의해 달성될 수 있다. 이러한 부위가 존재하지 않는 경우에는, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커를 핵산에 라이게이션 또는 어닐링시키고, 이를 사용하여 인접 폴리뉴클레오티드 단편을 연결시킨다. 그러나, 요소는 작동가능하게 연결되기 위해 인접할 필요는 없다.
본원에 사용된 용어 "프로모터"는 일반적으로 유전자의 상류에 (즉, 유전자의 5' 영역을 향해) 위치하며 유전자의 전사를 개시하고 유도하는데 필요한 DNA의 영역을 지칭한다. 프로모터는, 그가 제어하는 유전자의 적절한 활성화 또는 억제를 허용할 수 있다. 프로모터는 전사 인자에 의해 인식되는 특정 서열을 함유할 수 있다. 이들 인자는 프로모터 DNA 서열에 결합할 수 있고, 이는 유전자의 코딩 영역으로부터 RNA를 합성하는 효소인 RNA 폴리머라제의 동원을 유발한다. 프로모터는 일반적으로 상류 프로모터, 5'-UTR, 인트론 및 리더 서열을 포함한, 유전자의 상류에 위치하는 모든 유전자 조절 요소를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "상류-프로모터"는 전사의 개시를 지시하기에 충분한 인접 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 본원에 사용된 상류-프로모터는 TATA 박스, 개시인자 서열, TFIIB 인식 요소 및 다른 프로모터 모티프를 포함하는 여러 서열 모티프를 갖는 전사의 개시 부위를 포괄한다 (Jennifer, E.F. et al., (2002) Genes & Dev., 16: 2583-2592). 상류 프로모터는 TFIIA, B, D, E, F 및 H와 같은 기본적 또는 일반적 전사 인자를 사용하는 다중-서브유닛 효소인 RNA 폴리머라제 II에 대한 작용 부위를 제공한다. 이들 인자는 DNA 주형으로부터 RNA의 합성을 촉매하는 전사 개시전 복합체로 조립된다.
상류-프로모터의 활성화는 다양한 단백질이 결합하고 후속적으로 전사 개시 복합체와 상호작용하여 유전자 발현을 활성화시키는 조절 DNA 서열 요소의 추가의 서열에 의해 수행된다. 이들 유전자 조절 요소 서열은 특정 DNA-결합 인자와 상호작용한다. 이들 서열 모티프는 때때로 시스-요소로 지칭될 수 있다. 조직-특이적 또는 발달-특이적 전사 인자가 결합하는 이러한 시스-요소는 개별적으로 또는 조합되어 프로모터의 시공적 발현 패턴을 전사 수준에서 결정할 수 있다. 이들 시스-요소는 작동가능하게 연결된 유전자에 대해 발휘하는 제어의 유형에 있어서 광범위하게 다르다. 일부 요소는 환경 반응 (예를 들어, 온도, 수분 및 상처형성)에 반응하여 작동가능하게 연결된 유전자의 전사를 증가시키도록 작용한다. 다른 시스-요소는 발달 신호 (예를 들어, 발아, 종자 성숙 및 개화) 또는 공간 정보 (예를 들어, 조직 특이성)에 반응할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Langridge et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:3219-23]을 참조한다. 이들 시스-요소는 전사 개시점으로부터 다양한 거리에 위치하고, 일부 시스-요소 (근위 요소로 불림)는 최소 코어 프로모터 영역에 인접하는 반면에 다른 요소는 프로모터의 상류 또는 하류의 수개의 킬로염기에 위치할 수 있다 (인핸서).
"DNA 결합 트랜스진"은 DNA 결합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 코딩 서열이다. DNA 결합 단백질은 후속적으로 또 다른 분자에 결합할 수 있다. 결합 단백질은, 예를 들어 DNA 분자 (DNA-결합 단백질), RNA 분자 (RNA-결합 단백질) 및/또는 단백질 분자 (단백질-결합 단백질)에 결합할 수 있다. 단백질-결합 단백질의 경우, 이는 자신에게 결합 (동종이량체, 동종삼량체 등을 형성)할 수 있고/있거나, 상이한 단백질 또는 단백질들 중 1종 이상의 분자에 결합할 수 있다. 결합 단백질은 결합 활성의 유형이 한가지를 초과할 수 있다. 예를 들어, 아연 핑거 단백질은 DNA-결합, RNA-결합 및 단백질-결합 활성을 갖는다.
DNA 결합 단백질의 예는 다음을 포함한다; 미리 결정된 뉴클레오티드 서열에 결합하도록 "조작될 수 있는" 메가뉴클레아제, 아연 핑거, CRISPR 및 TALE 결합 도메인. 전형적으로, 조작된 DNA 결합 단백질 (예를 들어, 아연 핑거, CRISPR 또는 TALE)은 비-자연 발생 단백질이다. DNA-결합 단백질을 조작하는 방법의 비제한적 예는 설계 및 선택이다. 설계된 DNA 결합 단백질은 주로 합리적 기준에 의해 설계/조성이 이루어지는, 자연에서 발생하지 않는 단백질이다. 설계에 대한 합리적인 기준은 기존의 ZFP, CRISPR 및/또는 TALE 설계 및 결합 데이터의 정보가 저장된 데이터베이스 내의 정보 처리를 위한 치환 규칙 및 컴퓨터 알고리즘의 적용을 포함한다. 예를 들어, 미국 특허 6,140,081; 6,453,242; 및 6,534,261을 참조하고; 또한, WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 02/016536 및 WO 03/016496 및 미국 공개 번호 20110301073, 20110239315 및 20119145940을 참조한다.
"아연 핑거 DNA 결합 단백질" (또는 결합 도메인)은 1개 이상의 아연 핑거를 통해 서열-특이적 방식으로 DNA에 결합하는 단백질 또는 보다 큰 단백질 내의 도메인이며, 상기 아연 핑거는 아연 이온의 배위를 통해 구조가 안정화되는 결합 도메인 내의 아미노산 서열의 영역이다. 용어 아연 핑거 DNA 결합 단백질은 종종 아연 핑거 단백질 또는 ZFP로 약칭된다. 아연 핑거 결합 도메인은 미리 결정된 뉴클레오티드 서열에 결합하도록 "조작"될 수 있다. 아연 핑거 단백질을 조작하는 방법의 비제한적 예는 설계 및 선택이다. 설계된 아연 핑거 단백질은 주로 합리적 기준에 의해 설계/조성이 이루어지는, 자연에서 발생하지 않는 단백질이다. 설계에 대한 합리적인 기준은 기존의 ZFP 설계 및 결합 데이터의 정보가 저장된 데이터베이스 내의 정보 처리를 위한 치환 규칙 및 컴퓨터 알고리즘의 적용을 포함한다. 예를 들어, 미국 특허 번호 6,140,081; 6,453,242; 6,534,261 및 6,794,136을 참조하고; 또한, WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 02/016536 및 WO 03/016496을 참조한다.
다른 예에서, 1종 이상의 뉴클레아제의 DNA-결합 도메인은 자연 발생 또는 조작된 (비-자연 발생) TAL 이펙터 DNA 결합 도메인을 포함한다. 예를 들어, 미국 특허 공개 번호 20110301073 (그 전문이 본원에 참조로 포함됨)을 참조한다. 크산토모나스(Xanthomonas) 속의 식물 병원성 박테리아는 중요한 작물 식물에서 많은 질병을 야기하는 것으로 공지되어 있다. 크산토모나스의 병원성은 보다 많은 상이한 이펙터 단백질을 식물 세포 내로 주입하는 보존된 유형 III 분비 (T3S) 시스템에 좌우된다. 이들 주입된 단백질 중에는 식물 전사 활성화제를 모방하고 식물 트랜스크립톰을 조작하는 전사 활성화제-유사 (TALEN) 이펙터가 있다 (문헌 [Kay et al. (2007) Science 318:648-651] 참조). 이들 단백질은 DNA 결합 도메인 및 전사 활성화 도메인을 함유한다. 대부분의 잘 특징화된 TAL-이펙터 중 1종은 크산토모나스 캄페스트그리스 병원체변종 베시카토리아(Xanthomonas campestgris pv. Vesicatoria)로부터의 AvrBs3이다 (문헌 [Bonas et al. (1989) Mol Gen Genet 218: 127-136] 및 WO2010079430 참조). TAL-이펙터는 탠덤 반복부의 집중된 도메인을 함유하고, 각각의 반복부는 이들 단백질의 DNA 결합 특이성에 핵심적인 대략 34개의 아미노산을 함유한다. 추가로, 이들은 핵 국재화 서열 및 산성 전사 활성화 도메인을 함유한다 (검토를 위해, 문헌 [Schornack S, et al. (2006) J Plant Physiol 163(3): 256-272] 참조). 추가로, 식물병원성 박테리아 랄스토니아 솔라나세아룸(Ralstonia solanacearum)에서, 알. 솔라나세아룸 생물변이형 균주 GMI1000 및 생물변이형 4 균주 RS1000에서 크산토모나스의 AvrBs3 패밀리에 상동인 brg11 및 hpx17로 지정된 2개의 유전자가 발견되었다 (문헌 [Heuer et al. (2007) Appl and Enviro Micro 73(13): 4379-4384] 참조). 이들 유전자는 서로 뉴클레오티드 서열이 98.9% 동일하지만, hpx17의 반복 도메인 내의 1,575 bp의 결실에 있어서 상이하다. 그러나, 둘 다의 유전자 산물은 크산토모나스의 AvrBs3 패밀리 단백질과 40% 미만의 서열 동일성을 갖는다. 예를 들어, 미국 특허 공개 번호 20110301073 (그 전문이 참조로 포함됨)을 참조한다.
이들 TAL 이펙터의 특이성은 탠덤 반복부에서 발견되는 서열에 좌우된다. 반복된 서열은 대략 102 bp를 포함하고, 반복부는 전형적으로 서로에 대해 91-100% 상동이다 (상기 동일 문헌 [Bonas et al.]). 반복부의 다형성은 통상적으로 위치 12 및 13에 위치하고, 위치 12 및 13의 초가변 이잔기의 정체와 TAL-이펙터의 표적 서열 내의 인접 뉴클레오티드의 정체 사이에 1:1 대응이 존재하는 것으로 보인다 (문헌 [Moscou and Bogdanove, (2009) Science 326:1501 및 Boch et al. (2009) Science 326:1509-1512] 참조). 실험에 의해, 이들 TAL-이펙터의 DNA 인식을 위한 천연 코드는 위치 12 및 13의 HD 서열이 시토신 (C)에 결합하고, NG가 T에 결합하고, NI가 A, C, G 또는 T에 결합하고, NN이 A 또는 G에 결합하고, ING가 T에 결합하도록 결정되었다. 이들 DNA 결합 반복부는, 새로운 서열과 상호작용하고 식물 세포 내에서 비-내인성 리포터 유전자의 발현을 활성화시킬 수 있는 인공 전사 인자를 제조하기 위해 새로운 조합 및 반복부의 수를 갖는 단백질로 조립되었다 (상기 동일 문헌 [Boch et al.]). 조작된 TAL 단백질은 효모 리포터 검정 (플라스미드 기반 표적)에서 활성을 나타내는 TAL 이펙터 도메인 뉴클레아제 융합체 (TALEN)를 생성시키기 위해 FokI 절단 절반 도메인에 연결되었다.
CRISPR (클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문식 반복부)/Cas (CRISPR 연관) 뉴클레아제 시스템은 게놈 조작에 사용될 수 있는 박테리아 시스템을 기초로 최근에 조작된 뉴클레아제 시스템이다. 이는 많은 박테리아 및 고세균의 적응 면역 반응의 일부를 기초로 한다. 바이러스 또는 플라스미드가 박테리아를 침습하는 경우에, 침습자 DNA의 절편은 '면역' 반응에 의해 CRISPR RNA (crRNA)로 전환된다. 이어서, 이 crRNA는 부분 상보성의 영역을 통해 회합하고, tracrRNA로 불리는 또 다른 유형의 RNA가 "프로토스페이서"로 불리는 표적 DNA 내 crRNA에 상동인 영역으로 Cas9 뉴클레아제를 가이드한다. Cas9는 DNA를 절단하여, crRNA 전사체 내에 함유된 20개 뉴클레오티드 가이드 서열에 의해 특정된 부위의 DSB에 평활 말단을 생성시킨다. Cas9는 부위 특이적 DNA 인식 및 절단을 위해 crRNA 및 tracrRNA 둘 다를 요구한다. 이 시스템은 본 발명에 이르러 crRNA 및 tracrRNA가 1개의 분자 ("단일 가이드 RNA")로 합해질 수 있도록 조작되었고, 단일 가이드 RNA의 crRNA 등가 부분은 Cas9 뉴클레아제가 임의의 목적하는 서열을 표적화하는 것을 가이드하도록 조작될 수 있다 (문헌 [Jinek et al. (2012) Science 337, p. 816-821, Jinek et al., (2013), eLife 2:e00471, 및 David Segal, (2013) eLife 2:e00563] 참조). 따라서, CRISPR/Cas 시스템은 게놈 내 목적하는 표적에 이중-가닥 파괴 (DSB)를 생성하도록 조작될 수 있고, DSB의 복구는 오류 유발 복구의 증가를 야기하는 복구 억제제의 사용에 의해 영향을 받을 수 있다.
다른 예에서, DNA 결합 트랜스진은 조작된 (비-자연 발생) 메가뉴클레아제 (또한 귀소 엔도뉴클레아제로 기재됨)를 포함하는 부위 특이적 뉴클레아제이다. 귀소 엔도뉴클레아제 또는 메가뉴클레아제, 예컨대 I-SceI, I-CeuI, PI-PspI, PI-Sce, I-SceIV, I-CsmI, I-PanI, I-SceII, I-PpoI, I-SceIII, I-CreI, I-TevI, I-TevII 및 I-TevIII의 인식 서열이 공지되어 있다. 또한, 미국 특허 번호 5,420,032; 미국 특허 번호 6,833,252; 문헌 [Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-30 3388; Dujon et al. (1989) Gene 82:115-118; Perler et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22, 11127; Jasin (1996) Trends Genet. 12:224-228; Gimble et al. (1996) J. Mol. Biol. 263:163-180; Argast et al. (1998) J. Mol. Biol. 280:345-353 및 the New England Biolabs catalogue]을 참조한다. 추가로, 귀소 엔도뉴클레아제 및 메가뉴클레아제의 DNA-결합 특이성은 비-자연 표적 부위에 결합하도록 조작될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Chevalier et al. (2002) Molec. Cell 10:895-905; Epinat et al. (2003) Nucleic Acids Res. 5 31:2952-2962; Ashworth et al. (2006) Nature 441:656-659; Paques et al. (2007) Current Gene Therapy 7:49-66]; 미국 특허 공개 번호 20070117128을 참조한다. 귀소 엔도뉴클레아제 및 메가뉴클레아제의 DNA-결합 도메인은 전체적으로 뉴클레아제의 맥락에서 (즉, 뉴클레아제가 동족 절단 도메인을 포함하도록) 변경될 수 있거나, 또는 이종 절단 도메인에 융합될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "형질전환"은 핵산 분자를 상기 세포 내로 도입할 수 있는 모든 기술을 포괄한다. 예는 다음을 포함하나 이에 제한되지는 않는다: 바이러스 벡터를 사용하는 형질감염; 플라스미드 벡터를 사용하는 형질전환; 전기천공; 리포펙션; 미세주사 (Mueller et al. (1978) Cell 15:579-85); 아그로박테리움-매개 전달; 직접 DNA 흡수; 휘스커스(WHISKERS)™-매개 형질전환; 및 미세발사체 충격. 이들 기술은 식물 세포의 안정한 형질전환 및 일시적 형질전환 둘 다를 위해 사용될 수 있다. "안정한 형질전환"은 핵산 단편을 숙주 유기체의 게놈 내로 도입하여, 유전자적으로 안정한 유전을 유발하는 것을 지칭한다. 일단 안정하게 형질전환되면, 핵산 단편은 숙주 유기체 및 임의의 후속 세대의 게놈 내에 안정하게 통합된다. 형질전환된 핵산 단편을 함유하는 숙주 유기체는 "트랜스제닉" 유기체로 지칭된다. "일시적 형질전환"은 핵산 단편을 숙주 유기체의 핵 또는 DNA-함유 소기관 내로 도입하여, 유전자적으로 안정한 유전 없이 유전자 발현을 유발하는 것을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "형질도입"은 바이러스가 핵산을 세포 내로 전달하는 과정을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "트랜스진"은 외인성 핵산 서열을 지칭한다. 한 예에서, 트랜스진은 유전자 서열 (예를 들어, 제초제-저항성 유전자), 산업상 또는 제약상 유용한 화합물을 코딩하는 유전자, 또는 바람직한 농업 형질을 코딩하는 유전자이다. 또 다른 예에서, 트랜스진은 소형 RNA, 예컨대 안티센스 핵산 서열이며, 여기서 소형 RNA 서열의 발현은 표적 핵산 서열의 발현을 억제한다. 트랜스진은 트랜스진에 작동가능하게 연결된 조절 서열 (예를 들어, 프로모터, 인트론 또는 3'-UTR)을 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 관심 핵산은 트랜스진이다. 그러나, 다른 실시양태에서, 관심 핵산은 내인성 핵산 (내인성 핵산의 추가의 게놈 카피가 요구되는 경우), 또는 숙주 유기체 내의 표적 핵산의 서열에 관해 안티센스 배향으로 존재하는 핵산이다.
본원에 사용된 용어 "소형 RNA"는 여러 부류의 비-코딩 리보핵산 (ncRNA)을 지칭한다. 용어 소형 RNA는 박테리아 세포, 동물, 식물 및 진균에서 생산되는 단쇄의 ncRNA를 기재한다. 이들 단쇄의 ncRNA는 자연적으로 세포 내에서 생산될 수 있거나, 또는 단쇄의 ncRNA를 발현하는 외인성 서열의 도입에 의해 생산될 수 있다. 소형 RNA 서열은 단백질을 직접 코딩하지 않으며, 소형 RNA 서열은 단지 전사될 뿐 번역되지는 않는다는 점에서 다른 RNA와 기능에 있어서 상이하다. 소형 RNA 서열은 유전자 발현 및 변형을 포함한 다른 세포 기능에 관여한다. 소형 RNA 분자는 통상적으로 약 20 내지 30개의 뉴클레오티드로 구성된다. 소형 RNA 서열은 보다 긴 전구체로부터 유래될 수 있다. 전구체는 자기-상보적 영역에서 서로 다시 폴딩되는 구조를 형성하고; 이어서 동물에서는 다이서(Dicer) 뉴클레아제 및 식물에서는 DCL1 뉴클레아제에 의해 프로세싱된다.
마이크로RNA (miRNA), 짧은 간섭 RNA (siRNA), 안티센스 RNA, 짧은 헤어핀 RNA (shRNA) 및 소형 핵소체 RNA (snoRNA)를 포함한 많은 유형의 소형 RNA가 자연적으로 존재하거나 또는 인공적으로 생산된다. 특정 유형의 소형 RNA, 예컨대 마이크로RNA 및 siRNA는 유전자 침묵 및 RNA 간섭 (RNAi)에서 중요하다. 유전자 침묵은 정상적으로는 발현될 유전자가 세포내 요소에 의해, 이 경우에서는 소형 RNA에 의해 "턴 오프"되는 유전자적 조절 과정이다. 이 유전자 정보에 의해 정상적으로 형성될 단백질은 간섭으로 인해 형성되지 않고, 유전자 내 코딩된 정보는 발현되지 못하게 차단된다.
본원에 사용된 용어 "소형 RNA"는 "타이니 RNA" (Storz, (2002) Science 296:1260-3; Illangasekare et al., (1999) RNA 5:1482-1489); 원핵 "소형 RNA" (sRNA) (Wassarman et al., (1999) Trends Microbiol. 7:37-45); 진핵 "비코딩 RNA (ncRNA)"; "마이크로-RNA (miRNA)"; "소형 비-mRNA (snmRNA)"; "기능적 RNA (fRNA)"; "전달 RNA (tRNA)"; "촉매 RNA" [예를 들어, 자기-아실화 리보자임을 포함한 리보자임 (Illangaskare et al., (1999) RNA 5:1482-1489)]; "소형 핵소체 RNA (snoRNA)"; "tmRNA" (별칭 "10S RNA", 문헌 [Muto et al., (1998) Trends Biochem Sci. 23:25-29; 및 Gillet et al., (2001) Mol Microbiol. 42:879-885]); RNAi 분자, 예를 들어 비제한적으로 "소형 간섭 RNA (siRNA)", "엔도리보뉴클레아제-제조된 siRNA (e-siRNA)", "짧은 헤어핀 RNA (shRNA)" 및 "소형의 일시적 조절된 RNA (stRNA)"; "다이스드 siRNA (d-siRNA)" 및 적어도 1개의 우라실 염기를 포함하는 압타머, 올리고뉴클레오티드 및 다른 합성 핵산으로서 문헌에 기재된 RNA 분자를 포괄한다.
본원에 사용된 용어 "벡터"는 세포 내로 도입되어 형질전환된 세포를 생산하는 핵산 분자를 지칭한다. 벡터는 그가 숙주 세포 내에서 복제될 수 있도록 허용하는 핵산 서열, 예컨대 복제 기점을 포함할 수 있다. 예는 외인성 DNA를 세포 내로 운반하는 플라스미드, 코스미드, 박테리오파지, 박테리아 인공 염색체 (BAC) 또는 바이러스를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 벡터는 또한 1개 이상의 유전자, 안티센스 분자 및/또는 선택 마커 유전자, 및 관련 기술분야에 공지된 다른 유전 요소를 포함할 수 있다. 벡터는 세포를 형질도입, 형질전환 또는 감염시켜, 그 세포가 벡터에 의해 코딩된 핵산 분자 및/또는 단백질을 발현하도록 할 수 있다. 벡터는 핵산 분자의 세포 내로의 진입을 달성하는 것을 보조하는 물질 (예를 들어, 리포솜)을 임의로 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "카세트", "발현 카세트" 및 "유전자 발현 카세트"는 특정 제한 부위에서 또는 상동 재조합에 의해 핵산 또는 폴리뉴클레오티드 내로 삽입될 수 있는 DNA의 절편을 지칭한다. DNA의 절편은 관심 소형 RNA 또는 폴리펩티드를 코딩하는 관심 유전자를 함유하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 카세트 및 제한 부위는 전사 및 번역을 위한 적절한 리딩 프레임으로의 카세트의 삽입을 보장하도록 설계된다. 한 실시양태에서, 발현 카세트는 관심 소형 RNA 또는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 폴리뉴클레오티드에 추가로 특정한 숙주 세포의 형질전환을 용이하게 하는 요소를 가질 수 있다. 한 실시양태에서, 유전자 발현 카세트는 또한 숙주 세포 내에서 관심 폴리펩티드를 코딩하는 소형 RNA 또는 폴리뉴클레오티드의 발현을 증진시키는 요소를 포함할 수 있다. 이들 요소는 다음을 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다: 프로모터, 최소 프로모터, 인핸서, 반응 요소, 인트론, 5' 비번역, 3' 비번역 영역 서열, 종결인자 서열, 폴리아데닐화 서열 등.
본원에 사용된 용어 "이종 코딩 서열"은 숙주 유기체에 정상적으로 존재하지 않고 적절한 조건 하에 숙주 세포에서 발현될 수 있는 펩티드 또는 단백질 또는 그의 등가 아미노산 서열, 예를 들어 효소를 코딩하거나 또는 이를 궁극적으로 코딩하는 임의의 폴리뉴클레오티드를 나타내는 것으로 사용된다. 이에 따라, "이종 코딩 서열"은 숙주 세포가 그 세포에 정상적으로 존재하지 않는 코딩 서열의 추가의 카피를 발현하도록 숙주 세포에 정상적으로 존재하지 않는 코딩 서열의 1개 또는 추가의 카피를 포함할 수 있다. 이종 코딩 서열은 RNA 또는 그의 임의의 유형, 예를 들어 mRNA, DNA 또는 그의 임의의 유형, 예를 들어 cDNA, 또는 RNA/DNA의 혼성체일 수 있다. 코딩 서열의 예는 코딩 서열, 인트론, 프로모터 영역, 5'-UTR, 3'-UTR 및 인핸서 영역과 같은 특색을 포함하는 전장 전사 단위를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
"이종 코딩 서열"은 또한, 펩티드 또는 효소의 코딩 부분, 즉 펩티드 또는 효소의 cDNA 또는 mRNA 서열, 뿐만 아니라 전장 전사 단위의 코딩 부분, 즉 인트론 및 엑손을 포함하는 유전자, 뿐만 아니라 "코돈 최적화" 서열, 말단절단된 서열, 또는 효소를 코딩하거나 그의 등가 아미노산 서열을 코딩하는 다른 형태의 변경된 서열 (단, 상기 등가 아미노산 서열은 기능적 단백질을 생산해야 함)을 포함한다. 이러한 등가 아미노산 서열은 1개 이상의 아미노산의 결실을 가질 수 있으며, 이때 결실은 N-말단, C-말단 또는 내부에 존재한다. 말단절단된 형태는 그들이 본원에 나타낸 촉매 능력을 갖는 한 고려된다.
본원에 사용된 용어 "대조군"은 비교 목적을 위해 분석 절차에 사용되는 샘플을 지칭한다. 대조군은 "양성" 또는 "음성"일 수 있다. 예를 들어, 분석 절차의 목적이 세포 또는 조직에서 차등 발현된 전사체 또는 폴리펩티드를 검출하는 것인 경우에, 이는 일반적으로 양성 대조군, 예컨대 목적하는 발현을 나타내는 공지된 식물로부터의 샘플, 및 음성 대조군, 예컨대 목적하는 발현이 결여된 공지된 식물로부터의 샘플을 포함하는 것이 바람직하다.
본원에 사용된 용어 "식물"은 식물 세포 및 식물 조직, 예컨대 잎, 줄기, 뿌리, 꽃, 화분 및 종자를 포함하나 이에 제한되지는 않는 식물 및 식물의 일부를 포함한다. 본 발명에 사용될 수 있는 식물의 부류는 일반적으로 광범위하게는 속씨식물, 겉씨식물, 양치식물 및 다세포 조류를 포함한 돌연변이유발에 적용될 수 있는 고등 및 하등 식물 부류이다. 따라서, "식물"은 쌍자엽 및 단자엽 식물을 포함한다. 쌍자엽 식물의 예는 담배, 아라비돕시스(Arabidopsis), 대두, 토마토, 파파야, 카놀라, 해바라기, 목화, 알팔파, 감자, 포도덩굴, 비둘기콩, 완두, 브라시카(Brassica), 병아리콩, 사탕무, 평지씨, 수박, 멜론, 페퍼, 땅콩, 호박, 무, 시금치, 스쿼시, 브로콜리, 양배추, 당근, 콜리플라워, 셀러리, 배추, 오이, 가지 및 상추를 포함한다. 단자엽 식물의 예는 옥수수, 벼, 밀, 사탕수수, 보리, 호밀, 소르굼, 난초, 대나무, 바나나, 부들, 백합, 귀리, 양파, 기장 및 트리티케일을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "식물 물질"은 잎, 줄기, 뿌리, 꽃 또는 꽃의 일부, 과일, 화분, 난세포, 접합자, 종자, 삽목, 세포 또는 조직 배양물, 또는 식물의 임의의 다른 일부 또는 산물을 지칭한다. 한 실시양태에서, 식물 물질은 자엽 및 잎을 포함한다. 한 실시양태에서, 식물 물질은 뿌리 조직 및 지하에 위치하는 다른 식물 조직을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "선택 마커 유전자"는 식물 형질전환에서, 예를 들어 식물 세포를 선택적 작용제로부터 보호하거나 저항성/내성을 선택적 작용제에 제공하는데 임의로 사용되는 유전자를 지칭한다. 추가로, "선택 마커 유전자"는 리포터 유전자를 포괄하도록 의도된다. 기능적 선택 마커를 제공받은 세포 또는 식물만이 선택적 작용제를 갖는 조건 하에서 분열 또는 성장할 수 있다. 선택적 작용제의 예는, 예를 들어 스펙티노마이신, 네오마이신, 카나마이신, 파로모마이신, 겐타미신 및 히그로마이신을 포함한 항생제를 포함할 수 있다. 이들 선택 마커는 항생제 카나마이신에 대한 저항성을 부여하는 효소를 발현하는 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 (npt II), 및 관련 항생제 네오마이신, 파로모마이신, 겐타미신 및 G418에 대한 유전자, 또는 히그로마이신에 대한 저항성을 부여하는 효소를 발현하는 히그로마이신 포스포트랜스퍼라제 (hpt)에 대한 유전자를 포함한다. 다른 선택 마커 유전자는 bar 또는 pat (글루포시네이트 암모늄 또는 포스피노트리신에 대한 저항성), 아세토락테이트 신타제 (ALS, 분지쇄 아미노산의 합성의 제1 단계를 방지하는 억제제, 예컨대 술포닐우레아 (SU), 이미다졸리논 (IMI), 트리아졸로피리미딘 (TP), 피리미디닐 옥시벤조에이트 (POB) 및 술포닐아미노 카르보닐 트리아졸리논에 대한 저항성), 글리포세이트, 2,4-D를 포함한 제초제 저항성, 및 금속 저항성 또는 감수성을 코딩하는 유전자를 포함할 수 있다. 선택 마커 유전자로서 사용될 수 있는 "리포터 유전자"의 예는 발현된 리포터 유전자 단백질, 예컨대 β-글루쿠로니다제 (GUS), 루시페라제, 녹색 형광 단백질 (GFP), 황색 형광 단백질 (YFP), DsRed, β-갈락토시다제, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 (CAT), 알칼리성 포스파타제 등을 코딩하는 단백질의 시각적 관찰을 포함한다. 어구 "마커-양성"은 선택 마커 유전자를 포함하도록 형질전환된 식물을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "검출가능한 마커"는 검출할 수 있는 표지, 예컨대, 예를 들어 방사성동위원소, 형광 화합물, 생물발광 화합물, 화학발광 화합물, 금속 킬레이트화제 또는 효소를 지칭한다. 검출가능한 마커의 예는 하기를 포함하나 이에 제한되지는 않는다: 형광 표지 (예를 들어, FITC, 로다민, 란타나이드 인광체), 효소적 표지 (예를 들어, 양고추냉이 퍼옥시다제, β-갈락토시다제, 루시페라제, 알칼리성 포스파타제), 화학발광, 비오티닐 기, 2차 리포터에 의해 인식되는 미리 결정된 폴리펩티드 에피토프 (예를 들어, 류신 지퍼 쌍 서열, 2차 항체에 대한 결합 부위, 금속 결합 도메인, 에피토프 태그). 한 실시양태에서, 검출가능한 마커는 잠재적 입체 장애를 감소시키기 위해 다양한 길이의 스페이서 아암에 의해 부착될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "검출하는"은 가장 넓은 의미에서 특정 분자의 정성적 및 정량적 측정 둘 다, 예를 들어 특정 폴리펩티드의 측정을 포함하는 것으로 사용된다.
달리 구체적으로 설명되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 과학 용어는 본 개시내용이 속하는 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 분자 생물학에서 통상의 용어의 정의는, 예를 들어 다음 문헌에서 찾을 수 있다: [Lewin, Genes V, Oxford University Press, 1994; Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Science Ltd., 1994; 및 Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc., 1995].
조절 요소
기본적 연구 또는 생명공학적 적용을 위해 사용된 식물 프로모터는 일반적으로 단방향성으로서, 그의 3' 말단 (하류)에 융합된 트랜스진의 발현을 지시한다. 트랜스진을 대사 조작 및 형질 스택킹을 위해 식물 내에서 강하게 발현시키는 것이 종종 필요하다. 추가로, 다중 신규 프로모터가 전형적으로 다중 유전자의 발현을 유도하기 위해 트랜스제닉 작물에서 요구된다. 3' 말단 (하류)에 융합된 트랜스진의 발현을 지시할 수 있는 키메라 프로모터가 본원에 개시된다.
트랜스제닉 산물 개발은 점점 더 복잡해지고 있으며, 트랜스진을 강하게 발현시키는 것 및 다중 트랜스진을 단일 유전자좌 내로 스택킹하는 것이 요구된다. 전통적으로, 각각의 트랜스진은 발현을 위해 고유한 프로모터가 요구되며, 여기서 다중 프로모터가 한 유전자 스택 내에서 상이한 트랜스진을 발현시키는데 요구된다. 유전자 스택의 크기가 증가함에 따라, 이는 빈번하게 동일한 프로모터의 반복 사용으로 이어져, 단일 다유전자 형질의 발현과 유사한 수준의 상이한 트랜스진의 발현 패턴이 수득된다. 동일한 프로모터에 의해 유도되는 다중 유전자 구축물은 유전자 침묵을 야기하여 덜 효과적으로 트랜스제닉 산물을 생성하는 것으로 관련 기술분야에 공지되어 있다. 프로모터 반복으로 인한 과량의 전사 인자 (TF)-결합 부위는 내인성 TF의 고갈을 야기하여 전사 불활성화로 이어질 수 있다. 트랜스진의 침묵은 가능하게는 트랜스진을 발현하도록 생산된 트랜스제닉 식물의 성능에 바람직하지 못한 영향을 줄 수 있을 것이다. 트랜스진 내의 반복적인 서열은 유전자좌내 유전자 상동 재조합을 일으켜 폴리뉴클레오티드 재배열을 유발할 수 있다.
조직 특이적 (즉, 조직-선호) 또는 기관 특이적 프로모터는 특정 조직에서, 예컨대 식물의 커넬, 뿌리, 잎 또는 융단에서 유전자 발현을 유도한다. 조직 및 발달 단계 특이적 프로모터는 유전자의 발현을 유도하며, 이 유전자는 특정한 조직 또는 식물 발달 동안 특정한 시점에서 발현된다. 조직 특이적 프로모터는 트랜스제닉 식물 산업에서 특정 적용을 위해 요구되며, 이는 다른 것에서는 그렇지 않지만, 다양한 기관, 조직 및/또는 시점에서 차등적으로 이종 유전자의 발현을 나타내는 것인 조직 및/또는 발달 단계에 선택적인 방식으로 이종 유전자가 특이적으로 발현될 수 있도록 허용하므로 바람직하다. 예를 들어, 토양-매개 병원체에 의한 감염에 대한 식물의 증가된 저항성은 병원체-저항성 단백질이 식물의 뿌리 내에서 강하게 발현되도록 식물 게놈을 병원체-저항성 유전자로 형질전환시킴으로써 달성될 수 있다. 대안적으로, 특정한 성장 또는 발달 단계에 있는, 예컨대, 예를 들어 세포 분열 또는 신장 중인 식물 조직에서 트랜스진을 발현시키는 것이 바람직할 수 있다. 또 다른 적용은, 예를 들어 발달 중인 물관부에서 농경학적 형질을 코딩하는 트랜스진의 발현을 국한시키도록 하는 조직 특이적 프로모터 사용의 바람직성이다. 조직 특이적 프로모터 확인에 있어서 남아있는 하나의 특정한 문제는, 잠재적으로 가장 중요한 유전자 및 그의 상응하는 프로모터를 확인하고 이들을 세포의 특이적 발달 특성과 어떻게 관련시키느냐이다. 또 다른 문제는 클로닝된 DNA 단편이 원하는 특이적 발현 패턴으로 전사를 유도하도록 모든 관련된 시스-작용 전사 제어 요소를 클로닝하는 것이다. 특정한 문제는 다른 식물 조직에서는 발현되지 않는, 식물에 특이적인 세포 유형, 발달 단계 및/또는 기능과 관련된 조직-특이적 프로모터를 확인하는 것이다.
트랜스진 발현은 또한 프로모터 서열의 하류에 위치하는 인트론 및 5'-UTR 영역에 의해 조절될 수 있다. 인트론 및 5'-UTR에 작동가능하게 연결된 상류-프로모터를 포함하는 키메라 프로모터가 트랜스진 발현을 조절할 수 있다. 상류-프로모터가 전사를 유도하는데 필요한 반면, 인트론 및 5'-UTR의 존재는 발현 수준을 증가시켜 번역 및 단백질 합성을 위한 mRNA 전사체를 생성할 수 있다. 인트론 및 5'-UTR을 상류-프로모터 폴리뉴클레오티드 서열에 부가하는 것은 트랜스진의 안정한 발현을 보조할 수 있다.
제아 메이스 퍼옥시다제 5로부터의 상류-프로모터에 이어서 제아 메이스 알콜 데히드로게나제 (I), 인트론 6 및 메이즈 줄무늬 바이러스 5'-UTR (예를 들어, 리더)을 포함하는 키메라 프로모터 유전자 조절 요소를 사용하여 식물에서 트랜스진을 발현시키는 방법 및 구축물이 제공된다. 한 실시양태에서, 키메라 프로모터는 다음의 프로모터일 수 있다:
Figure pct00004
Figure pct00005
한 실시양태에서, 유전자 발현 카세트는 프로모터를 포함한다. 한 실시양태에서, 프로모터는 본 개시내용의 키메라 프로모터일 수 있다. 한 실시양태에서, 유전자 발현 카세트는 프로모터를 포함하며, 여기서 프로모터는 서열식별번호: 1에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.8% 또는 100% 동일하다. 한 실시양태에서, 유전자 발현 카세트는 트랜스진에 작동가능하게 연결된 키메라 프로모터를 포함한다. 한 실시양태에서, 키메라 프로모터를 포함하는 유전자 발현 카세트는 2개 이상의 트랜스진의 발현을 유도할 수 있다. 한 예시적 실시양태에서, 유전자 발현 카세트는 트랜스진에 작동가능하게 연결된 키메라 프로모터를 포함하며, 여기서 트랜스진은 살곤충제 저항성 트랜스진, 제초제 내성 트랜스진, 질소 사용 효율 트랜스진, 물 사용 효율 트랜스진, 영양 품질 트랜스진, DNA 결합 트랜스진, 선택 마커 트랜스진 또는 그의 조합일 수 있다.
선택 마커
형질전환된 식물 ("형질전환체")을 확인 및 선택하기 위해 리포터 유전자로서 또한 기재된 다양한 선택 마커가 선택된 발현 벡터 내로 혼입될 수 있다. 예를 들어 DNA 서열분석 및 PCR (폴리머라제 연쇄 반응), 서던 블롯팅, RNA 블롯팅, 벡터로부터 발현된 단백질, 예를 들어 포스피노트리신 저항성을 매개하는 침전된 단백질의 검출을 위한 면역학적 방법, 또는 β-글루쿠로니다제 (GUS), 루시페라제, 녹색 형광 단백질 (GFP), 황색 형광 단백질 (YFP), DsRed, β-갈락토시다제, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 (CAT), 알칼리성 포스파타제 등을 코딩하는 리포터 유전자와 같은 다른 단백질의 시각적 관찰을 포함한, 형질전환된 식물에서 선택 마커의 발현을 확인하기 위한 많은 방법이 이용가능하다 (문헌 [Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Press, N.Y., 2001] 참조, 상기 문헌의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨).
선택 마커 유전자는 형질전환된 세포 또는 조직의 선택에 이용된다. 선택 마커 유전자는 항생제 저항성을 코딩하는 유전자, 예컨대 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 II (NEO) 및 히그로마이신 포스포트랜스퍼라제 (HPT)를 코딩하는 유전자, 뿐만 아니라 제초 화합물에 대한 저항성을 부여하는 유전자를 포함한다. 제초제 저항성 유전자는 일반적으로 제초제에 대해 감수성을 띠지 않는 변형된 표적 단백질, 또는 작용할 수 있기 전에 식물에서 제초제를 분해하거나 해독시키는 효소를 코딩한다. 예를 들어, 글리포세이트에 대한 저항성은 돌연변이체 표적 효소인 5-엔올피루빌쉬키메이트-3-포스페이트 신타제 (EPSPS)를 코딩하는 유전자를 사용함으로써 수득되었다. EPSPS에 대한 유전자 및 돌연변이체는 널리 공지되어 있고, 하기에 추가로 기재된다. 글루포시네이트 암모늄, 브로목시닐 및 2,4-디클로로페녹시아세테이트 (2,4-D)에 대한 저항성은 각각의 제초제를 해독시키는, pat 또는 DSM-2를 코딩하는 박테리아 유전자, 니트릴라제, aad-1 또는 aad-12 유전자를 사용하여 수득되었다.
한 실시양태에서, 이미다졸리논 또는 술포닐우레아를 포함한 제초제는 성장점 또는 분열조직을 억제할 수 있고, 이들 제초제에 대한 아세토히드록시산 신타제 (AHAS) 및 아세토락테이트 신타제 (ALS)의 저항성/내성을 위한 유전자는 널리 공지되어 있다. 글리포세이트 저항성 유전자는 각각 돌연변이체 5-에놀피루빌쉬키메이트-3-포스페이트 신타제 (EPSP) 및 dgt-28 유전자 (재조합 핵산의 도입 및/또는 천연 EPSP 유전자에 대한 다양한 형태의 생체내 돌연변이유발을 통함), aroA 유전자 및 글리포세이트 아세틸 트랜스퍼라제 (GAT) 유전자를 포함한다. 다른 포스포노 화합물에 대한 저항성 유전자는 스트렙토미세스 히그로스코피쿠스(Streptomyces hygroscopicus) 및 스트렙토미세스 비리도크로모게네스(Streptomyces viridichromogenes)를 포함한 스트렙토미세스 종으로부터의 bar 유전자, 및 피리딘옥시 또는 페녹시 프로프리온산 및 시클로헥손 (ACCase 억제제-코딩 유전자)을 포함한다. 시클로헥산디온 및/또는 아릴옥시페녹시프로판산 (할록시포프(Haloxyfop), 디클로포프(Diclofop), 페녹시프로프(Fenoxyprop), 플루아지포프(Fluazifop), 퀴잘로포프(Quizalofop) 포함)에 대한 저항성을 부여하는 예시적인 유전자는 아세틸 조효소 A 카르복실라제 (ACCase)--Acc1-S1, Acc1-S2 및 Acc1-S3의 유전자를 포함한다. 한 실시양태에서, 트리아진 (psbA 및 1s+ 유전자) 또는 벤조니트릴 (니트릴라제 유전자)을 포함한 제초제는 광합성을 억제할 수 있다.
한 실시양태에서, 선택 마커 유전자는 다음을 코딩하는 유전자를 포함하나 이에 제한되지는 않는다: 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 II; 시안아미드 히드라타제; 아스파르테이트 키나제; 디히드로디피콜리네이트 신타제; 트립토판 데카르복실라제; 디히드로디피콜리네이트 신타제 및 탈감작된 아스파르테이트 키나제; bar 유전자; 트립토판 데카르복실라제; 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 (NEO); 히그로마이신 포스포트랜스퍼라제 (HPT 또는 HYG); 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR); 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제; 2,2-디클로로프로피온산 데할로게나제; 아세토히드록시산 신타제; 5-엔올피루빌-쉬키메이트-포스페이트 신타제 (aroA); 할로아릴니트릴라제; 아세틸-조효소 A 카르복실라제; 디히드로프테로에이트 신타제 (sul I); 및 32 kD 광화학계 II 폴리펩티드 (psbA).
한 실시양태는 또한 다음에 대한 저항성을 코딩하는 유전자를 포함한다: 클로람페니콜; 메토트렉세이트; 히그로마이신; 스펙티노마이신; 브로목시닐; 글리포세이트; 및 포스피노트리신.
선택 마커 유전자의 상기 목록은 제한적인 것으로 의도되지 않는다. 임의의 리포터 또는 선택 마커 유전자가 본 발명에 포괄된다.
식물에서의 최적의 발현을 위해 선택 마커 유전자가 합성된다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 유전자의 코딩 서열은 식물에서의 발현을 증진시키기 위해 코돈 최적화에 의해 변형될 수 있다. 선택 마커 유전자는 특정한 식물 종에서의 발현을 위해 최적화될 수 있거나, 또는 대안적으로, 쌍자엽 또는 단자엽 식물에서의 최적의 발현을 위해 변형될 수 있다. 식물 선호 코돈은 특정한 관심 식물 종에서 최다량으로 발현되는 단백질에서의 최고 빈도의 코돈으로부터 결정될 수 있다. 한 실시양태에서, 선택 마커 유전자는 식물에서 보다 높은 수준으로 발현되어 보다 높은 형질전환 효율을 유발하도록 설계된다. 유전자의 식물 최적화 방법은 널리 공지되어 있다. 합성 폴리뉴클레오티드 서열의 최적화 및 제조에 관한 안내는, 예를 들어 WO2013016546, WO2011146524, WO1997013402, 미국 특허 번호 6166302 및 미국 특허 번호 5,380,831 (본원에 참조로 포함됨)에서 찾을 수 있다.
트랜스진
개시된 방법 및 조성물은 식물 게놈 내의 폴리뉴클레오티드 유전자 서열을 발현시키는데 사용될 수 있다. 따라서, 제초제 내성, 곤충 저항성, 영양소, 항생제 또는 치료 분자를 코딩하는 유전자의 발현은 식물 프로모터에 의해 유도될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 개시내용의 키메라 조절 요소는 글리포세이트 또는 또 다른 제초제에 대한 저항성 또는 내성을 제공하고/거나, 선택 곤충 또는 질병에 대한 저항성 및/또는 영양 증진 및/또는 개선된 농경학적 특징 및/또는 사료, 식품, 산업, 제약 또는 다른 용도에 유용한 단백질 또는 다른 산물을 제공하는 유전자 코딩 폴리뉴클레오티드 서열과 조합되거나 또는 작동가능하게 연결될 수 있다. 트랜스진은 식물 게놈 내에 2개 이상의 관심 핵산 서열과 "스택킹"될 수 있다. 스택킹은, 예를 들어 2개 이상의 사건을 사용하는 통상적인 식물 육종, 관심 서열을 함유하는 구축물을 사용한 식물의 형질전환, 트랜스제닉 식물의 재-형질전환, 또는 상동 재조합을 통한 표적화된 통합에 의한 새로운 형질의 부가를 통해 달성될 수 있다.
이러한 관심 폴리뉴클레오티드 서열은 하기 제공된 예들을 포함하나 이에 제한되지는 않는다:
1. 해충 또는 질병에 대한 저항성을 부여하는 유전자 또는 코딩 서열 (예를 들어, iRNA)
(A) 식물 질병 저항성 유전자. 식물 방어는 종종 식물에서의 질병 저항성 유전자 (R)의 산물과 병원체에서의 상응하는 비병독성 (Avr) 유전자의 산물 사이의 특이적 상호작용에 의해 활성화된다. 식물 품종을 클로닝된 저항성 유전자로 형질전환시켜, 특정 병원체 균주에 대해 저항성이 있는 식물을 조작할 수 있다. 이러한 유전자의 예는 클라도스포리움 풀붐(Cladosporium fulvum)에 대한 저항성의 경우 토마토 Cf-9 유전자 (Jones et al., 1994 Science 266:789), 슈도모나스 시린가에(Pseudomonas syringae) 병원체변종 토마토에 대한 저항성의 경우 단백질 키나제를 코딩하는 토마토 Pto 유전자 (Martin et al., 1993 Science 262:1432), 및 슈도모나스 시린가에에 대한 저항성의 경우 아라비돕시스 RSSP2 유전자 (Mindrinos et al., 1994 Cell 78:1089)를 포함한다.
(B) 바실루스 투린기엔시스(Bacillus thuringiensis) 단백질, 그의 유도체, 또는 그를 모델로 한 합성 폴리펩티드, 예컨대 Bt δ-내독소 유전자의 뉴클레오티드 서열 (Geiser et al., 1986 Gene 48:109), 및 영양 살곤충 (VIP) 유전자 (예를 들어, 문헌 [Estruch et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. 93:5389-94] 참조). 더욱이, δ-내독소 유전자를 코딩하는 DNA 분자는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection) (메릴랜드주 록빌)으로부터 ATCC 수탁번호 40098, 67136, 31995 및 31998 하에 구입될 수 있다.
(C) 렉틴, 예컨대 여러 클리비아 미니아타(Clivia miniata) 만노스-결합 렉틴 유전자의 뉴클레오티드 서열 (Van Damme et al., 1994 Plant Molec. Biol. 24:825).
(D) 곤충 해충에 대한 살유충제로서 유용한 비타민 결합 단백질, 예컨대 아비딘 및 아비딘 상동체. 미국 특허 번호 5,659,026 참조.
(E) 효소 억제제, 예를 들어 프로테아제 억제제 또는 아밀라제 억제제. 이러한 유전자의 예는 벼 시스테인 프로테이나제 억제제 (Abe et al., 1987 J. Biol. Chem. 262:16793), 담배 프로테이나제 억제제 I (Huub et al., 1993 Plant Molec. Biol. 21:985), 및 α-아밀라제 억제제 (Sumitani et al., 1993 Biosci. Biotech. Biochem. 57:1243)를 포함한다.
(F) 곤충-특이적 호르몬 또는 페로몬, 예컨대 엑디스테로이드 및 유충 호르몬, 그의 변이체, 그를 기초로 한 모방체, 또는 그의 길항제 또는 효능제, 예컨대 유충 호르몬의 불활성인자인 클로닝된 유충 호르몬 에스테라제의 바큘로바이러스 발현 (Hammock et al., 1990 Nature 344:458).
(G) 발현 시에 침범한 해충의 생리학을 교란시키는 곤충-특이적 펩티드 또는 뉴로펩티드 (J. Biol. Chem. 269:9). 이러한 유전자의 예는 곤충 이뇨 호르몬 수용체 (Regan, 1994), 디플로프테라 푼크타타(Diploptera punctata)에서 확인된 알로스타틴 (Pratt, 1989), 및 곤충-특이적, 마비성 신경독소 (미국 특허 번호 5,266,361)를 포함한다.
(H) 뱀, 말벌 등에 의해 자연에서 생산된 곤충-특이적 독, 예컨대 전갈 곤충독성 펩티드 (Pang, 1992 Gene 116:165).
(I) 모노테르펜, 세스퀴테르펜, 스테로이드, 히드록삼산, 페닐프로파노이드 유도체 또는 살곤충 활성을 갖는 또 다른 비-단백질 분자의 과축적을 담당하는 효소.
(J) 생물학적 활성 분자의 변형 (번역후 변형 포함)에 관여하는 효소; 예를 들어, 천연이든지 합성이든지 간에, 당분해 효소, 단백질분해 효소, 지질분해 효소, 뉴클레아제, 시클라제, 트랜스아미나제, 에스테라제, 히드롤라제, 포스파타제, 키나제, 포스포릴라제, 폴리머라제, 엘라스타제, 키티나제 및 글루카나제. 이러한 유전자의 예는 칼라스 유전자 (PCT 공개 출원 WO93/02197), 키티나제-코딩 서열 (이는, 예를 들어 ATCC로부터 수탁번호 3999637 및 67152 하에 수득될 수 있음), 담배 구충 키티나제 (Kramer et al., 1993 Insect Molec. Biol. 23:691), 및 파슬리 ubi4-2 폴리유비퀴틴 유전자 (Kawalleck et al., 1993 Plant Molec. Biol. 21:673)를 포함한다.
(K) 신호 전달을 자극하는 분자. 이러한 분자의 예는 녹두 칼모듈린 cDNA 클론에 대한 뉴클레오티드 서열 (Botella et al., 1994 Plant Molec. Biol. 24:757) 및 메이즈 칼모듈린 cDNA 클론의 뉴클레오티드 서열 (Griess et al., 1994 Plant Physiol. 104:1467)을 포함한다.
(L) 소수성 모멘트 펩티드. 미국 특허 번호 5,659,026 및 5,607,914 참조; 후자는 질병 저항성을 부여하는 합성 항미생물 펩티드를 교시하고 있다.
(M) 트랜스제닉 담배 식물이 슈도모나스 솔라나세아룸(Pseudomonas solanacearum)에 대해 저항성이 있게 만드는 막 퍼미아제, 채널 형성제 또는 채널 차단제, 예컨대 세크로핀-β 용해 펩티드 유사체 (Jaynes et al., 1993 Plant Sci. 89:43).
(N) 바이러스-침습성 단백질 또는 그로부터 유래된 복합 독소. 예를 들어, 형질전환된 식물 세포에서의 바이러스 코트 단백질의 축적은, 코트 단백질 유전자가 유래되는 바이러스뿐만 아니라 관련 바이러스에 의해 일어나는 바이러스 감염 및/또는 질병 발생에 대한 저항성을 부여한다. 코트 단백질-매개 저항성은 알팔파 모자이크 바이러스, 오이 모자이크 바이러스, 담배 줄무늬 바이러스, 감자 바이러스 X, 감자 바이러스 Y, 담배 식각 바이러스, 담배 얼룩무늬 바이러스 및 담배 모자이크 바이러스 대하여 형질전환된 식물에 부여되었다. 예를 들어, 문헌 [Beachy et al. (1990) Ann. Rev. Phytopathol. 28:451]을 참조한다.
(O) 곤충-특이적 항체 또는 그로부터 유래된 면역독소. 따라서, 곤충 장에서의 결정적 대사 기능을 표적화하는 항체는 침범된 효소를 불활성화시켜 곤충을 사멸시킬 것이다. 예를 들어, 문헌 [Taylor et al. (1994) Abstract #497, Seventh Int'l. Symposium on Molecular Plant-Microbe Interactions]은 단일-쇄 항체 단편의 생산을 통한 트랜스제닉 담배에서의 효소적 불활성화를 제시한다.
(P) 바이러스-특이적 항체. 예를 들어, 재조합 항체 유전자를 발현하는 트랜스제닉 식물이 바이러스 공격으로부터 보호된다는 것을 제시하는 문헌 [Tavladoraki et al. (1993) Nature 266:469]을 참조한다.
(Q) 병원체 또는 기생충에 의해 자연에서 생산된 발달-정지 단백질. 따라서, 진균 엔도 α-1,4-D 폴리갈락투로나제는 식물 세포벽 호모-α-1,4-D-갈락투로나제를 가용화시킴으로써 진균 콜로니화 및 식물 영양소 방출을 용이하게 한다 (Lamb et al., 1992 Bio/Technology 10:1436). 콩 엔도폴리갈락투로나제-억제 단백질을 코딩하는 유전자의 클로닝 및 특징화는 문헌 [Toubart et al. (1992 Plant J. 2:367)]에 기재되어 있다.
(R) 식물에 의해 자연에서 생산된 발달-정지 단백질, 예컨대 진균성 질병에 대한 증가된 저항성을 제공하는 보리 리보솜-불활성화 유전자 (Longemann et al., 1992 Bio/Technology 10:3305).
(S) RNA 분자가 사용되어 표적 유전자의 발현을 억제하는 RNA 간섭. 한 예에서 RNA 분자는 부분 또는 완전 이중 가닥이고, 이는 침묵 반응을 촉발하여 dsRNA를 소형 간섭 RNA로 절단하고, 이어서 이는 상동 mRNA를 파괴하는 표적화 복합체 내로 혼입된다. 예를 들어, 미국 특허 6,506,559 (Fire et al.); 6,573,099 (Graham et al.)를 참조한다.
2. 제초제에 대한 저항성을 부여하는 유전자
(A) 성장점 또는 분열조직을 억제하는 제초제, 예컨대 이미다졸리논, 술폰아닐리드 또는 술포닐우레아 제초제에 대한 저항성 또는 내성을 코딩하는 유전자. 이 범주 내의 예시적인 유전자는 아세토히드록시산 신타제 (AHAS) 효소로서 공지되기도 한 (Miki et al., 1990 Theor. Appl. Genet. 80:449) 돌연변이체 아세토락테이트 신타제 (ALS)를 코딩한다 (Lee et al., 1988 EMBOJ. 7:1241).
(B) 돌연변이체 EPSP 신타제 및 aroA 유전자에 의해 부여되거나, 또는 유전자, 예컨대 DGT-28, 2mEPSPS, GAT (글리포세이트 아세틸트랜스퍼라제) 또는 GOX (글리포세이트 옥시다제) 및 다른 포스포노 화합물, 예컨대 글루포시네이트 (pat, bar 및 dsm-2 유전자), 및 아릴옥시페녹시프로피온산 및 시클로헥산디온 (ACCase 억제제 코딩 유전자)에 의한 대사 불활성화를 통해 부여된 글리포세이트에 대한 저항성 또는 내성을 코딩하는 1개 이상의 추가의 유전자. 예를 들어, 글리포세이트 저항성을 부여할 수 있는 EPSP 형태의 뉴클레오티드 서열을 개시하고 있는 미국 특허 번호 4,940,835를 참조한다. 돌연변이체 aroA 유전자를 코딩하는 DNA 분자는 ATCC 수탁번호 39256 하에 수득될 수 있고, 돌연변이체 유전자의 뉴클레오티드 서열은 미국 특허 번호 4,769,061에 개시되어 있다. 유럽 특허 출원 번호 0 333 033 및 미국 특허 번호 4,975,374에는 L-포스피노트리신과 같은 제초제에 대한 저항성을 부여하는 글루타민 신테타제 유전자의 뉴클레오티드 서열이 개시되어 있다. 포스피노트리신아세틸-트랜스퍼라제 유전자의 뉴클레오티드 서열은 유럽 출원 번호 0 242 246에 제공되어 있다. 문헌 [De Greef et al. (1989) Bio/Technology 7:61]에는 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 활성을 코딩하는 키메라 bar 유전자를 발현하는 트랜스제닉 식물의 생산이 기재되어 있다. 아릴옥시페녹시프로피온산 및 시클로헥산디온, 예컨대 세톡시딤 및 할록시포프에 대한 저항성을 부여하는 예시적인 유전자는 문헌 [Marshall et al. (1992) Theor. Genet. 83:435]에 기재된 Accl-S1, Accl-S2 및 Accl-S3 유전자이다.
(C) 광합성을 억제하는 제초제, 예컨대 트리아진에 대한 저항성 또는 내성을 코딩하는 유전자 (psbA 및 gs+ 유전자) 및 벤조니트릴에 대한 저항성 또는 내성을 코딩하는 유전자 (니트릴라제 유전자). 문헌 [Przibilla et al. (1991) Plant Cell 3:169]에는 클라미도모나스(Chlamydomonas)를 형질전환시키기 위한 돌연변이체 psbA 유전자를 코딩하는 플라스미드의 용도가 기재되어 있다. 니트릴라제 유전자에 대한 뉴클레오티드 서열은 미국 특허 번호 4,810,648에 개시되어 있고, 이들 유전자를 함유하는 DNA 분자는 ATCC 수탁번호 53435, 67441 및 67442 하에 이용가능하다. 글루타티온 S-트랜스퍼라제를 코딩하는 DNA의 클로닝 및 발현이 문헌 [Hayes et al. (1992) Biochem. J. 285:173]에 기재되어 있다.
(D) 파라-히드록시페닐피루베이트 (HPP)를 호모겐티세이트로 전환시키는 반응을 촉매하는 효소인 히드록시페닐피루베이트 디옥시게나제 (HPPD)에 결합하는 제초제에 대한 저항성 또는 내성을 코딩하는 유전자. 이는 제초제, 예컨대 이속사졸 (EP418175, EP470856, EP487352, EP527036, EP560482, EP682659, 미국 특허 번호 5,424,276), 특히 메이즈에 대한 선택적 제초제인 이속사플루톨, 디케토니트릴 (EP496630, EP496631), 특히 2-시아노-3-시클로프로필-1-(2-SO2CH3-4-CF3 페닐)프로판-1,3-디온 및 2-시아노-3-시클로프로필-1-(2-SO2CH3-4-2,3Cl2페닐)프로판-1,3-디온, 트리케톤 (EP625505, EP625508, 미국 특허 번호 5,506,195), 특히 술코트리온 및 피라졸리네이트를 포함한다. 예를 들어 미국 특허 번호 6,268,549 및 6,245,968 및 미국 특허 출원 공개 번호 20030066102에 기재된 유전자를 포함한, 식물에서 과잉의 HPPD를 생산하는 유전자가 상기 제초제에 대한 내성 또는 저항성을 제공할 수 있다.
(E) 페녹시 옥신 제초제, 예컨대 2,4-디클로로페녹시아세트산 (2,4-D)에 대한 저항성 또는 내성을 코딩하며, 또한 아릴옥시페녹시프로피오네이트 (AOPP) 제초제에 대한 저항성 또는 내성을 부여할 수 있는 유전자. 이러한 유전자의 예는 미국 특허 번호 7,838,733에 기재된 α-케토글루타레이트-의존성 디옥시게나제 효소 (aad-1) 유전자를 포함한다.
(F) 페녹시 옥신 제초제, 예컨대 2,4-디클로로페녹시아세트산 (2,4-D)에 대한 저항성 또는 내성을 코딩하며, 또한 피리딜옥시 옥신 제초제, 예컨대 플루록시피르 또는 트리클로피르에 대한 저항성 또는 내성을 부여할 수 있는 유전자. 이러한 유전자의 예는 WO 2007/053482 A2에 기재된 α-케토글루타레이트-의존성 디옥시게나제 효소 유전자 (aad-12)를 포함한다.
(G) 디캄바에 대한 저항성 또는 내성을 코딩하는 유전자 (예를 들어, 미국 특허 공개 번호 20030135879 참조).
(H) 프로토포르피리노겐 옥시다제 (PPO)를 억제하는 제초제에 대한 저항성 또는 내성을 제공하는 유전자 (미국 특허 번호 5,767,373 참조).
(I) 광화학계 II 반응 중심 (PS II)의 코어 단백질에 결합하는 트리아진 제초제 (예컨대 아트라진) 및 우레아 유도체 (예컨대 디우론) 제초제에 대한 저항성 또는 내성을 제공하는 유전자 (문헌 [Brussian et al., (1989) EMBO J. 1989, 8(4): 1237-1245] 참조).
3. 가치-부가된 형질을 부여하거나 이에 기여하는 유전자
(A) 예를 들어, 메이즈 또는 브라시카를 안티센스 유전자 또는 스테아로일-ACP 데새투라제로 형질전환시켜 식물의 스테아르산 함량을 증가시킴으로써 변형된 지방산 대사 (Knultzon et al., 1992 Proc. Nat. Acad. Sci. USA 89:2624).
(B) 감소된 피테이트 함량
(1) 피타제-코딩 유전자, 예컨대 아스페르길루스 니거(Aspergillus niger) 피타제 유전자의 도입 (Van Hartingsveldt et al., 1993 Gene 127:87)은 피테이트의 파괴를 증진시켜 보다 많은 유리 포스페이트를 형질전환된 식물에 첨가한다.
(2) 피테이트 함량을 감소시키는 유전자가 도입될 수 있다. 메이즈에서, 이는, 예를 들어 낮은 수준의 피트산을 특징으로 하는 메이즈 돌연변이체를 담당하는 단일 대립유전자와 연관된 DNA를 클로닝한 다음 재도입함으로써 달성될 수 있다 (Raboy et al., 1990 Maydica 35:383).
(C) 예를 들어 전분의 분지화 패턴을 변경시키는 효소를 코딩하는 유전자로 식물을 형질전환시킴으로써 이루어진 변형된 탄수화물 조성. 이러한 효소의 예는 스트렙토코쿠스 무쿠스(Streptococcus mucus) 프룩토실트랜스퍼라제 유전자 (Shiroza et al., 1988 J. Bacteriol. 170:810), 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 레반수크라제 유전자 (Steinmetz et al., 1985 Mol. Gen. Genel. 200:220), 바실루스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis) α-아밀라제 (Pen et al., 1992 Bio/Technology 10:292), 토마토 인버타제 유전자 (Elliot et al., 1993), 보리 아밀라제 유전자 (Sogaard et al., 1993 J. Biol. Chem. 268:22480) 및 메이즈 내배유 전분 분지화 효소 II (Fisher et al., 1993 Plant Physiol. 102:10450)를 포함한다.
형질전환
식물의 형질전환에 적합한 방법은 DNA를 세포 내로 도입할 수 있는 임의의 방법, 예를 들어 비제한적으로 다음을 포함한다: 전기천공 (예를 들어, 미국 특허 5,384,253 참조); 미세-발사체 충격 (예를 들어, 미국 특허 5,015,580; 5,550,318; 5,538,880; 6,160,208; 6,399,861; 및 6,403,865 참조); 아그로박테리움-매개 형질전환 (예를 들어, 미국 특허 5,635,055; 5,824,877; 5,591,616; 5,981,840; 및 6,384,301 참조); 및 원형질체 형질전환 (예를 들어, 미국 특허 5,508,184 참조). 이들 방법은 식물을 안정하게 형질전환시키거나 일시적으로 형질전환시키는데 사용될 수 있다.
탄화규소 섬유를 사용한 교반과 같은 기술 (예를 들어, 미국 특허 5,302,523 및 5,464,765 참조)을 사용하여 DNA 구축물을 식물 세포의 게놈 DNA 내로 직접 도입할 수 있거나, 또는 바이오리스틱 방법, 예컨대 DNA 입자 충격 (예를 들어, 문헌 [Klein et al., (1987) Nature 327:70-73] 참조)을 사용하여 상기 DNA 구축물을 식물 조직 내로 직접 도입할 수 있다. 대안적으로, 나노입자 형질전환을 통해 DNA 구축물을 식물 세포 내로 도입할 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 공개 번호 2009/0104700 참조, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함됨).
추가로, 유전자 전달은 비-아그로박테리움 박테리아 또는 바이러스, 예컨대 리조비움(Rhizobium) 종 NGR234, 시노리조비움 멜리로티(Sinorhizoboium meliloti), 메소리조비움 로티(Mesorhizobium loti), 감자 바이러스 X, 콜리플라워 모자이크 바이러스 및 카사바 베인 모자이크 바이러스 및/또는 담배 모자이크 바이러스를 사용하여 달성될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Chung et al. (2006) Trends Plant Sci. 11(1):1-4]을 참조한다.
형질전환 기술의 적용을 통해, 사실상 임의의 식물 종의 세포를 안정하게 형질전환시킬 수 있고, 이들 세포는 널리 공지된 기술에 의해 트랜스제닉 식물로 발달될 수 있다. 예를 들어, 목화 형질전환과 관련하여 특히 유용할 수 있는 기술은 미국 특허 5,846,797; 5,159,135; 5,004,863; 및 6,624,344에 기재되어 있고; 브라시카 식물을 형질전환시키기 위한 기술은 특히, 예를 들어 미국 특허 5,750,871에 기재되어 있고; 대두를 형질전환시키기 위한 기술은, 예를 들어 미국 특허 6,384,301에 기재되어 있고; 메이즈를 형질전환시키기 위한 기술은, 예를 들어 미국 특허 7,060,876 및 5,591,616 및 국제 PCT 공개 WO 95/06722에 기재되어 있다.
외인성 핵산의 수용자 세포로의 전달을 실시한 후에, 형질전환된 세포는 일반적으로 추가의 배양 및 식물 재생을 위해 확인된다. 형질전환체를 확인하는 능력을 개선하기 위해, 형질전환체를 생성하는데 사용된 형질전환 벡터와 함께 선택 마커 유전자를 사용하는 것이 요구될 있다. 한 예시적 실시양태에서, 세포를 선택적 작용제 또는 작용제들에 노출시킴으로써 형질전환된 세포 집단을 검정할 수 있거나, 또는 세포를 목적하는 마커 유전자 형질에 대해 스크리닝할 수 있다.
선택적 작용제에 노출되어 생존한 세포, 또는 스크리닝 검정에서 양성으로 점수화된 세포는 식물 재생을 지지하는 배지 중에서 배양될 수 있다. 한 실시양태에서, 임의의 적합한 식물 조직 배양 배지는 추가의 물질, 예컨대 성장 조절제를 포함시킴으로써 변형될 수 있다. 충분한 조직이 식물 재생 노력을 시작하는데 이용가능할 때까지, 또는 수동 선택을 수회 반복한 후 조직의 형태가 재생에 적합할 때까지 (예를 들어, 적어도 2주), 조직을 성장 조절제가 함유된 기본 배지 상에 유지한 다음, 싹 형성에 도움이 되는 배지로 옮길 수 있다. 충분한 싹 형성이 발생할 때까지 배양물을 주기적으로 옮긴다. 싹이 형성되면, 이를 뿌리 형성에 도움이 되는 배지로 옮긴다. 일단 충분한 뿌리가 형성되면, 식물을 추가의 성장 및 성숙을 위해 토양으로 옮길 수 있다.
재생 식물에 제공된 구축물을 포함하는 목적하는 핵산의 존재를 확인하기 위해, 다양한 검정이 수행될 수 있다. 이러한 검정은 다음을 포함할 수 있다: 분자 생물학적 검정, 예컨대 서던 및 노던 블롯팅 및 PCR; 생화학적 검정, 예컨대, 예를 들어 면역학적 수단 (ELISA, 웨스턴 블롯 및/또는 LC-MS MS 분광광도측정법)에 의한 또는 효소적 기능에 의한 단백질 산물의 존재 검출; 식물 부분 검정, 예컨대 잎 또는 뿌리 검정; 및/또는 재생된 전체 식물의 표현형 분석.
트랜스제닉 사건은, 예를 들어, 예컨대 관심 핵산 분자에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하는 PCR 증폭에 의해 스크리닝될 수 있다. PCR 유전자형 결정은 게놈 내로 통합된 관심 핵산 분자를 함유하는 것으로 예측되는 단리된 숙주 식물 캘러스 조직으로부터 유래된 게놈 DNA의 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR) 증폭, 이어서 PCR 증폭 산물의 표준 클로닝 및 서열 분석을 포함하나 이에 제한되지는 않는 것으로 이해된다. PCR 유전자형 결정 방법은 문헌에 잘 설명되었고 (예를 들어, 문헌 [Rios et al. (2002) Plant J. 32:243-53] 참조), 세포 배양물을 포함한 임의의 식물 종 또는 조직 유형으로부터 유래된 게놈 DNA에 적용될 수 있다. 표적 서열 및 도입된 서열 둘 다에 결합하는 올리고뉴클레오티드 프라이머의 조합은 PCR 증폭 반응에서 순차적으로 사용되거나 또는 멀티플렉스화될 수 있다. 표적 부위, 도입된 핵산 서열 및/또는 그 둘의 조합에 어닐링하도록 설계된 올리고뉴클레오티드 프라이머가 생산될 수 있다. 따라서, PCR 유전자형 결정 전략은, 예를 들어 비제한적으로 다음을 포함할 수 있다: 식물 게놈 중 특이적 서열의 증폭; 식물 게놈 중 다중 특이적 서열의 증폭; 식물 게놈 중 비-특이적 서열의 증폭; 및 상기 중 임의의 조합. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 게놈에 대해 조사하기 위해 프라이머 및 증폭 반응의 추가의 조합을 고안할 수 있다. 예를 들어, 정방향 및 역방향 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 도입된 핵산 서열의 경계 바깥쪽 표적에 특이적인 핵산 서열(들)에 어닐링하도록 설계될 수 있다.
정방향 및 역방향 올리고뉴클레오티드 프라이머는, 예를 들어 도입된 핵산 분자에 포함된 관심 뉴클레오티드 서열 내의 코딩 영역 또는 핵산 분자의 다른 부분에 상응하는 서열에서 도입된 핵산 분자에 특이적으로 어닐링하도록 설계될 수 있다. 프라이머는 본원에 기재된 프라이머와 함께 사용될 수 있다. 올리고뉴클레오티드 프라이머는 목적하는 서열에 따라 합성될 수 있고, (예를 들어, 인티그레이티드 디엔에이 테크놀로지스, 인크.(Integrated DNA Technologies, Inc.), 아이오와주 코랄빌로부터) 상업적으로 입수가능하다. 증폭 후에 클로닝 및 서열분석, 또는 증폭 산물의 직접적 서열 분석이 이어질 수 있다. 한 실시양태에서, 유전자 표적에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머가 PCR 증폭에 사용된다.
트랜스진 발현 방법
한 실시양태에서, 식물에서 적어도 1개의 트랜스진을 발현시키는 방법은 적어도 1개의 트랜스진에 작동가능하게 연결된 키메라 프로모터를 포함하는 식물을 성장시키는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 식물 조직 또는 식물 세포에서 적어도 1개의 트랜스진을 발현시키는 방법은 적어도 1개의 트랜스진에 작동가능하게 연결된 키메라 프로모터를 포함하는 식물을 배양하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 식물에서 적어도 1개의 트랜스진을 발현시키는 방법은 적어도 1개의 트랜스진에 작동가능하게 연결된 키메라 프로모터를 포함하는 식물 조직 또는 식물 세포를 성장시키는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 식물 조직 또는 식물 세포에서 적어도 1개의 트랜스진을 발현시키는 방법은 적어도 1개의 트랜스진에 작동가능하게 연결된 키메라 프로모터를 포함하는 식물 조직 또는 식물 세포를 배양하는 것을 포함한다.
한 실시양태에서, 식물에서 적어도 1개의 트랜스진을 발현시키는 방법은 적어도 1개의 트랜스진에 작동가능하게 연결된 키메라 프로모터를 포함하는 유전자 발현 카세트를 포함하는 식물을 성장시키는 것을 포함한다.
한 실시양태에서, 식물 조직 또는 식물 세포에서 적어도 1개의 트랜스진을 발현시키는 방법은 적어도 1개의 트랜스진에 작동가능하게 연결된 키메라 프로모터를 포함하는 유전자 발현 카세트를 포함하는 식물 조직 또는 식물 세포를 배양하는 것을 포함한다.
한 실시양태에서, 식물, 식물 조직 또는 식물 세포는 트랜스진에 작동가능하게 연결된 키메라 프로모터를 포함하는 유전자 발현 카세트를 포함한다. 여기서, 키메라 프로모터는 상류-프로모터, 인트론 및 5'-UTR로 구성된다. 한 실시양태에서, 식물, 식물 조직 또는 식물 세포는 상류-프로모터, 인트론 및 5'-UTR을 포함하는 유전자 발현 카세트를 포함한다. 한 실시양태에서, 상류-프로모터, 인트론 및 5'-UTR은 서열식별번호: 1의 폴리뉴클레오티드이다. 한 실시양태에서, 식물, 식물 조직 또는 식물 세포는 상류-프로모터, 인트론 및 5'-UTR을 포함하는 유전자 발현 카세트를 포함하며, 여기서 상류-프로모터, 인트론 및 5'-UTR은 서열식별번호: 1에 대해 적어도 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.8% 또는 100% 동일하다. 한 예시적 실시양태에서, 식물, 식물 조직 또는 식물 세포는 트랜스진에 작동가능하게 연결된 상류-프로모터, 인트론 및 5'-UTR을 포함하는 유전자 발현 카세트를 포함하며, 여기서 트랜스진은 살곤충제 저항성 트랜스진, 제초제 내성 트랜스진, 질소 사용 효율 트랜스진, 물 사용 효율 트랜스진, 영양 품질 트랜스진, DNA 결합 트랜스진, 선택 마커 트랜스진 또는 그의 조합일 수 있다.
한 실시양태에서, 식물, 식물 조직 또는 식물 세포는 트랜스진에 작동가능하게 연결된 키메라 프로모터를 포함하는 유전자 발현 카세트를 포함한다. 여기서, 키메라 프로모터는 상류-프로모터, 인트론 및 5'-UTR로 구성된다. 상류-프로모터, 인트론 및 5'-UTR은 유전자 발현 카세트가 2개 이상의 트랜스진을 포함하는 경우에 유전자 발현 카세트 내의 상이한 트랜스진에 작동가능하게 연결될 수 있다. 한 예시적 실시양태에서, 유전자 발현 카세트는 트랜스진에 작동가능하게 연결된 상류-프로모터, 인트론 및 5'-UTR을 포함하며, 여기서 트랜스진은 살곤충제 저항성 트랜스진, 제초제 내성 트랜스진, 질소 사용 효율 트랜스진, 물 사용 효율 트랜스진, 영양 품질 트랜스진, DNA 결합 트랜스진, 선택 마커 트랜스진 또는 그의 조합일 수 있다.
한 실시양태에서, 본원에 기재된 방법을 사용하는 트랜스진 발현은 바람직하게는 식물의 뿌리 조직 내에서 발현된다. 한 실시양태에서, 트랜스진 발현은 식물의 뿌리 조직에서 발현된 1개 초과의 트랜스진을 포함한다. 한 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 트랜스제닉 식물을 성장시키는 방법은 뿌리-선호 트랜스진 발현을 포함한다. 한 실시양태에서, 식물 조직 또는 식물 세포에서 트랜스진을 발현시키는 방법은 뿌리-선호 조직 및 뿌리-선호 세포를 포함한다. 한 실시양태에서, 뿌리-선호 발현은 메이즈 뿌리-선호 발현을 포함한다.
한 실시양태에서, 식물, 식물 조직 또는 식물 세포는 본원에 개시된 바와 같은 키메라 유전자 프로모터 조절 요소를 포함하는 벡터를 포함한다. 한 실시양태에서, 식물, 식물 조직 또는 식물 세포는 트랜스진에 작동가능하게 연결된, 본원에 개시된 바와 같은 키메라 유전자 프로모터 조절 요소를 포함하는 벡터를 포함한다. 한 실시양태에서, 식물, 식물 조직 또는 식물 세포는 본원에 개시된 바와 같은 유전자 발현 카세트를 포함하는 벡터를 포함한다. 한 실시양태에서, 벡터는 플라스미드, 코스미드, 박테리아 인공 염색체 (BAC), 박테리오파지 또는 바이러스 단편일 수 있다.
한 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에 따른 식물, 식물 조직 또는 식물 세포는 단자엽일 수 있다. 단자엽 식물, 식물 조직 또는 식물 세포는 옥수수, 벼, 밀, 사탕수수, 보리, 호밀, 소르굼, 난초, 대나무, 바나나, 부들, 백합, 귀리, 양파, 기장 및 트리티케일일 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
한 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에 따른 식물, 식물 조직 또는 식물 세포는 쌍자엽일 수 있다. 쌍자엽 식물, 식물 조직 또는 식물 세포는 평지씨, 카놀라, 인도 겨자, 에티오피아 겨자, 대두, 해바라기 및 목화일 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
유전자 변형 식물의 생산과 관련하여, 식물의 유전자 조작 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물에 대한 생물학적 및 물리학적 형질전환 프로토콜을 포함한 수많은 식물 형질전환 방법이 개발되었다 (예를 들어, 문헌 [Goto-Fumiyuki et al., Nature Biotech 17:282-286 (1999); Miki et al., Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick, B. R. and Thompson, J. E. Eds., CRC Press, Inc., Boca Raton, pp. 67-88 (1993)]). 추가로, 식물 세포 또는 조직 형질전환 및 식물의 재생을 위한 벡터 및 시험관내 배양 방법은, 예를 들어 문헌 [Gruber et al., Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick, B. R. and Thompson, J. E. Eds., CRC Press, Inc., Boca Raton, pp. 89-119 (1993)]에서 이용가능하다.
관련 기술분야의 통상의 기술자는 외인성 서열이 트랜스제닉 식물에 안정하게 혼입되고, 작동가능한지 여부에 대해 확인된 후에, 유성 교배에 의해 다른 식물 내로 도입될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 교배될 종에 따라, 임의의 다수의 표준 육종 기술이 사용될 수 있다.
조작된 식물 물질을 형질전환 DNA 상에 존재하는 마커 유전자에 의해 코딩된 형질에 대해 선택 또는 스크리닝함으로써, 형질전환된 식물 세포, 캘러스, 조직 또는 식물을 확인 및 단리할 수 있다. 예를 들어, 선택은 형질전환 유전자 구축물이 저항성을 부여하는 항생제 또는 제초제를 억제량으로 함유하는 배지 상에서 조작된 식물 물질을 성장시킴으로써 수행될 수 있다. 추가로, 형질전환된 세포는 또한 재조합 핵산 구축물 상에 존재할 수 있는 임의의 시각적 마커 유전자 (예를 들어, yfp, gfp, β-글루쿠로니다제, 루시페라제, B 또는 C1 유전자)의 활성에 대해 스크리닝함으로써 확인될 수 있다. 이러한 선택 및 스크리닝 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다.
물리적 및 생화학적 방법을 또한 사용하여, 삽입된 유전자 구축물을 함유하는 식물 또는 식물 세포 형질전환체를 확인할 수 있다. 이들 방법은 다음을 포함하나 이에 제한되지는 않는다: 1) 재조합 DNA 삽입물의 구조를 검출 및 결정하기 위한 서던 분석 또는 PCR 증폭; 2) 유전자 구축물의 RNA 전사체를 검출 및 검사하기 위한 노던 블롯, S1 RNase 보호, 프라이머-연장 또는 역전사효소-PCR 증폭; 3) 효소 또는 리보자임 활성을 검출하기 위한 효소적 검정 (여기서 상기 유전자 산물은 유전자 구축물에 의해 코딩됨); 4) 차세대 서열분석 (NGS) 분석; 5) 단백질 겔 전기영동, 웨스턴 블롯 기술, 면역침전 또는 효소-연결 면역흡착 검정 (ELISA) (여기서 유전자 구축물 산물은 단백질임). 추가의 기술, 예컨대 계내 혼성화, 효소 염색 및 면역염색을 또한 사용하여, 특정 식물 기관 및 조직에서의 재조합 구축물의 존재 또는 발현을 검출할 수 있다. 모든 이들 검정을 수행하는 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다.
본원에 개시된 방법을 사용하는 유전자 조작의 효과는, 예를 들어 관심 조직으로부터 단리된 RNA (예를 들어, mRNA)의 노던 블롯에 의해 관찰할 수 있다. 전형적으로, mRNA가 존재하거나 mRNA 양이 증가한 경우에, 상응하는 트랜스진이 발현되고 있는 것으로 가정할 수 있다. 유전자 및/또는 코딩된 폴리펩티드 활성을 측정하는 다른 방법이 사용될 수 있다. 사용된 기질 및 반응 산물 또는 부산물의 증가 또는 감소를 검출하는 방법에 따라, 상이한 유형의 효소적 검정이 사용될 수 있다. 추가로, 발현된 폴리펩티드의 수준은 면역화학적으로, 즉 ELISA, RIA, EIA 및 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지된 다른 항체 기반 검정, 예컨대 전기영동 검출 검정 (염색 또는 웨스턴 블롯팅과 병행)에 의해 측정될 수 있다. 비제한적 일례로서, ELISA 검정을 사용하여 AAD-1 (아릴옥시알카노에이트 디옥시게나제; WO 2005/107437 참조) 및 PAT (포스피노트리신-N-아세틸-트랜스퍼라제) 단백질을 검출하는 것이 미국 특허 공개 번호 20090093366 (이는 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다. 트랜스진은 식물의 일부 세포 유형 또는 조직에서, 또는 일부 발달 단계에서 선택적으로 발현될 수 있거나, 또는 트랜스진은 실질적으로 모든 식물 조직에서 실질적으로 그의 전 생활 주기에 따라 발현될 수 있다. 그러나, 임의의 조합 발현 방식이 또한 적용가능하다.
본 개시내용은 또한 상기 기재된 트랜스제닉 식물의 종자를 포괄하며, 여기서 종자는 트랜스진 또는 유전자 발현 카세트를 포함한다. 본 개시내용은 추가로 상기 기재된 트랜스제닉 식물의 자손, 클론, 세포주 또는 세포를 포괄하며, 여기서 상기 자손, 클론, 세포주 또는 세포는 트랜스진 또는 유전자 구축물을 포함한다.
본 발명은 구체적 방법 및 실시양태를 참조로 하여 기재되었지만, 본 발명으로부터 벗어남 없이 다양한 변형 및 변화가 이루어질 수 있다는 것을 인지할 것이다.
실시예
실시예 1: 신규 키메라 유전자 프로모터 조절 요소
키메라 프로모터 서열은 제아 메이스 퍼옥시다제 5로부터 수득된 상류-프로모터 폴리뉴클레오티드 서열에 이어서 제아 메이스 알콜 데히드로게나제 (I) 인트론 6 및 메이즈 줄무늬 바이러스 5'-UTR로 구성된다. 1,642 bp 제아 메이스 퍼옥시다제 5 상류 프로모터 서열 (서열식별번호: 2)은 밑줄표시로 제시된다. 117 bp 메이즈 줄무늬 바이러스 5'-UTR (또한 리더 서열로 지칭됨) 서열 (서열식별번호: 3)은 소문자로 제시된다. 341 bp 제아 메이스 알콜 데히드로게나제 (I) 인트론 6 서열 (서열식별번호: 4)은 이탤릭체이다.
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실시예 2: 구축물 설계
달리 나타내지 않는 한, 본 실시예 및 후속 실시예에 기재된 분자 생물학적 및 생화학적 조작은, 예를 들어 문헌 [Ausubel et al. (1995) 및 Sambrook et al. (1989)] 및 이들의 개정판에 개시된 바와 같은 표준 방법론에 의해 수행하였다. 실험에 사용된 구축물 (표 1)은 하기에서 보다 상세하게 기재된다.
2개의 유전자 발현 카세트를 함유하는 구축물 pDAS5144 (예를 들어 pDAB3620)를 구축하였다. 제1 유전자 발현 카세트 (서열식별번호: 5)는 제아 메이스 퍼옥시다제 5 상류-프로모터 (국제 특허 출원 번호 1998/056921)에 이어서 제아 메이스 알콜 데히드로게나제 (I) 인트론 6 (Dennis et al., (1984) Nucleic Acids Res. 12:3983-4000) 및 메이즈 줄무늬 바이러스 5'-UTR (Mullineaux et al., (1984) EMBO J. 3:3063-3068), 이것이 작동가능하게 연결된 tcdA 트랜스진 (미국 특허 출원 번호 2009/0221501) 및 이에 플랭킹되어 있는 제아 메이스 퍼옥시다제 5 3'-UTR (국제 특허 출원 번호 1998/056921)을 함유하였다. 제2 유전자 발현 카세트는 선택 마커 유전자를 함유하였고, 오리자 사티바(Oryza sativa) 액틴 프로모터 (미국 특허 번호 6,429,357), 이것이 작동가능하게 연결된 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 (Wohlleben et al., (1988) Gene 70: 25-37) 트랜스진 및 종결되는 제아 메이스 리파제 3'-UTR (미국 특허 번호 7,179,902)로 구성되었다. 이 구축물을 슈퍼바이너리(Superbinary) pSB1 이원 벡터 (재팬 토바코(Japan Tobacco), 일본 도쿄) 내로 고정화시켰다. pDAS5144를 완성하는데 사용된 구축물은 제한 효소 소화 및 DNA 서열분석을 통해 분자적으로 확인하였다.
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2개의 유전자 발현 카세트를 함유하는 구축물 pDAS5128 (예를 들어 pDAB3619)을 구축하였다. 제1 유전자 발현 카세트 (서열식별번호: 6)는 제아 메이스 유비퀴틴 1 프로모터 (Christensen et al., (1992) Plant Molecular Biology 18; 675-689)에 이어서 제아 메이스 알콜 데히드로게나제 (I) 인트론 6 (Dennis et al., (1984) Nucleic Acids Res. 12:3983-4000) 및 메이즈 줄무늬 바이러스 5'-UTR (Mullineaux et al., (1984) EMBO J. 3:3063-3068), 이것이 작동가능하게 연결된 tcdA 트랜스진 (미국 특허 출원 번호 2009/0221501) 및 이에 플랭킹되어 있는 제아 메이스 퍼옥시다제 5 3'-UTR (국제 특허 출원 번호 1998/056921)을 함유하였다. 제2 유전자 발현 카세트는 선택 마커 유전자를 함유하였고, 오리자 사티바 액틴 프로모터 (미국 특허 번호 6,429,357), 이것이 작동가능하게 연결된 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 (Wohlleben et al., (1988) Gene 70: 25-37) 트랜스진 및 종결되는 제아 메이스 리파제 3'-UTR (미국 특허 번호 7,179,902)로 구성되었다. 이 구축물을 슈퍼바이너리 pSB1 이원 벡터 (재팬 토바코, 일본 도쿄) 내로 고정화시켰다. pDAS5128을 완성하는데 사용된 구축물은 제한 효소 소화 및 DNA 서열분석을 통해 분자적으로 확인하였다. 신규 제아 메이스 유비퀴틴 1 프로모터에 이어서 제아 메이스 알콜 데히드로게나제 (I) 인트론 6 및 메이즈 줄무늬 바이러스 5'-UTR은 서열식별번호: 7로서 본원에 개시된다.
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2개의 유전자 발현 카세트를 함유하는 구축물 pDAS5143 (예를 들어 pDAB3924)을 구축하였다. 제1 유전자 발현 카세트 (서열식별번호: 8)는 사탕수수 간균형 바이러스 상류-프로모터 (미국 특허 번호 6,489,462)에 이어서 제아 메이스 알콜 데히드로게나제 (I) 인트론 6 (Dennis et al., (1984) Nucleic Acids Res. 12:3983-4000) 및 메이즈 줄무늬 바이러스 5'-UTR (Mullineaux et al., (1984) EMBO J. 3:3063-3068), 이것이 작동가능하게 연결된 tcdA 트랜스진 (미국 특허 출원 번호 2009/0221501) 및 이에 플랭킹되어 있는 제아 메이스 퍼옥시다제 5 3'-UTR (국제 특허 출원 번호 1998/056921)을 함유하였다. 제2 유전자 발현 카세트는 선택 마커 유전자를 함유하였고, 오리자 사티바 액틴 프로모터 (미국 특허 번호 6,429,357), 이것이 작동가능하게 연결된 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 (Wohlleben et al., (1988) Gene 70: 25-37) 트랜스진 및 종결되는 제아 메이스 리파제 3'-UTR (미국 특허 번호 7,179,902)로 구성되었다. 이 구축물을 슈퍼바이너리 pSB1 이원 벡터 (재팬 토바코, 일본 도쿄) 내로 고정화시켰다. pDAS5143을 완성하는데 사용된 구축물은 제한 효소 소화 및 DNA 서열분석을 통해 분자적으로 확인하였다. 신규 사탕수수 간균형 바이러스 프로모터에 이어서 제아 메이스 알콜 데히드로게나제 (I) 인트론 6 및 메이즈 줄무늬 바이러스 5'-UTR은 서열식별번호: 9로서 본원에 개시된다.
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2개의 유전자 발현 카세트 (둘 다에 RB7 매트릭스 부착 영역 (MAR; 국제 특허 출원 번호 WO9727207)이 플랭킹되어 있음)를 함유하는, 대조군 구축물인 구축물 pDAB1405를 구축하였다. 제1 유전자 발현 카세트는 제아 메이스 유비퀴틴 1 프로모터, 이것이 작동가능하게 연결된 녹색 형광 단백질 트랜스진 (미국 특허 번호 6,172,188) 및 이에 플랭킹되어 있는 제아 메이스 퍼옥시다제 5 3'-UTR을 함유하였다. 제2 유전자 발현 카세트는 선택 마커 유전자를 함유하였고, 오리자 사티바 액틴 프로모터 (미국 특허 번호 6,429,357), 이것이 작동가능하게 연결된 포스피노트리신 아세틸 트랜스퍼라제 (Wohlleben et al., (1988) Gene 70: 25-37) 트랜스진 및 종결되는 제아 메이스 리파제 3'-UTR (미국 특허 번호 7,179,902)로 구성되었다. 이 구축물을 슈퍼바이너리 pSB1 이원 벡터 (재팬 토바코, 일본 도쿄) 내로 고정화시켰다. pDAB1405를 완성하는데 사용된 구축물은 제한 효소 소화 및 DNA 서열분석을 통해 분자적으로 확인하였다.
<표 1> 구축물은 각각의 구축물에 사용된 조절 요소 및 선택 마커의 간단한 설명과 함께 pDAS 번호로 지정되어 있다.
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실시예 3: 식물 형질전환 및 분자적 확인
식물 물질. 제아 메이스 재배품종 Hi-II를 모든 형질전환 실험에 사용하였다. 식물을 온실에서 성장시키고, 이삭을 수분 약 9-11일 후에 미성숙 접합 배아가 1-2 mm 사이의 길이였을 때 수거하였다. 이삭을 껍질제거하고, 헹구고, 사용 전에 최대 1일 동안 4℃에서 저장하였다.
아그로박테리움 배양 개시. 상기 기재된 구축물을 보유하는 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 균주 LBA4404를 글리세롤 스톡으로 -80℃에서 유지하였다. 형질전환 실험의 개시 전에, 박테리아를 글리세롤 스톡으로부터 250 mg/L 스트렙토마이신, 100 mg/L 스펙티노마이신 및 10 mg/L 테트라시클린을 함유하는 YEP 플레이트 상으로 스트리킹하였다. 플레이트를 28℃에서 24시간 동안 인큐베이션한 다음, 각각의 플레이트 상에 세포 론이 발생할 때까지 19℃로 2일 동안 옮겼다.
미성숙 배아의 공동배양. 아그로박테리움의 1 내지 2개의 루프를 각각의 YEP 플레이트로부터 취하고, 100 μM 아세토시린곤으로 보충된 45 ml의 N6-inf 배지 (N6 염 및 비타민, 1.5 mg/L 2,4-D, 700 mg/L L-프롤린, 6.84% 수크로스, 3.6% 글루코스, 5.2로 조정된 pH) 중에 현탁시키고, 균일한 현탁액이 수득될 때까지 볼텍싱하였다. 박테리아를 네펠로(Nephelo)™ 플라스크로 옮기고, 배양 밀도를 청색 필터를 사용하여 대략 200 클렛(Klett) 단위로 조정하였다. 플라스크를 실온에서 2-4시간 동안 회전식 진탕기 상에서 75 rpm으로 진탕하고 그 동안 미성숙 배아를 단리하였다. 메이즈 이삭을 70% 에탄올 중에서 5분 동안 헹구고, 이어서 여러 방울의 리퀴녹스(Liquinox)®를 함유하는 20% 표백제 용액 중에 20-30분 침지시켜 멸균하였다. 이삭을 멸균 탈이온수 중에서 삼중으로 헹구고, 사용시까지 멸균 종이 수건 및 호일로 랩핑하였다. 공동배양 및 선택 프로토콜은 문헌 [Frame et al. (Plant Physiol. 129: 12-22, 2005)]에 약술된 것을 근접하게 따랐다. 미성숙 접합 배아를 메이즈 커넬로부터 절제하고, 100 μM 아세토시린곤이 함유된 2 ml의 N6-inf 배지를 함유하는 에펜도르프 튜브에 넣었다. 다중 이삭으로부터의 배아를 튜브에 모으거나 개별적으로 유지시켰다. 배아를 감염 배지 중에서 1-2회 세척하고, 용액을 대략 1ml의 박테리아 현탁액으로 대체하였다. 튜브를 수회 서서히 뒤집고, 실온에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 배아를 100 x 15 mm 플레이트 내 N6-AS (KW) 배지 (N6 염 및 비타민, 1.5 mg/L 2,4-D, 700 mg/L L-프롤린, 0.85 mg/L 질산은, 300 mg/L L-시스테인, 3% 수크로스, 3 g/L 겔라이트(Gelrite)™, 100 μM 아세토시린곤 및 5.8로 조정된 pH)로 옮겼다. 과량의 액체를 플레이트로부터 제거한 후에, 현미경을 사용하여 배아를 배반이 위로 향하게 배향시켰다.
플레이트를 3M® 테이프 또는 파라필름(Parafilm)®으로 밀봉하고, 암흑에서 20℃에서 3 내지 4일 동안 인큐베이션하였다. TcdA 구축물에 대해 구축물당 50-120개의 배아를 처리하고, 양성 대조군 구축물 (pDAB1405)에 대해 대략 30-50개의 배아를 처리하였다. 형질전환 효율을 모니터링하기 위해 추정 양성 대조군 단리물을 2주 후에 GFP 발현에 대해 평가하였다. 남아있는 아그로박테리움 현탁액을 테이블탑 원심분리기에서 5000 rpm으로 회전 침강시키고, 펠릿을 100 μl의 액체 중에 재현탁시키고, 이어서 YEP +strep/spec/tet 플레이트 상에 스트리킹하고, 28℃에서 3일 동안 인큐베이션한 다음, 재검증에 사용하였다. 메이즈 공여자 물질의 조직 배양 반응을 평가하기 위한 양성 대조군으로서, 이삭당 대략 5개의 배아를 15Ag 배지 (N6 염 및 비타민, 100 mg/L 효소적 카세인 가수분해물, 1 mg/L 2,4D, 2% 수크로스, 2.5 g/L 겔라이트™, pH 5.8, 10 mg/L 질산은 및 25 mM L-프롤린으로 보충됨) 상에 플레이팅하고, 암흑에서 28℃에서 2주 동안 인큐베이션하였다. 대조군 배아를 2 및 4주에 배아발생 반응에 대해 점수화한 다음, 폐기하였다.
단리, 선택 및 재생. 공동배양 3-4일 후에, 생존 배아를 KW-휴지 배지 (N6 염 및 비타민, 1.5 mg/L 2,4-D, 700 mg/L L-프롤린, 500 mg/L MES, 0.85 mg/L 질산은, 100 mg/L 반코마이신, 100 mg/L 세포탁심, 3% 수크로스, 8 g/L TC 한천 및 5.8로 조정된 pH)로 옮겼다. 10개의 배아를 각각 60 x 20 mm 플레이트 상에 놓고, 3M® 테이프 또는 파라필름®으로 밀봉하였다. 플레이트를 배양 암실에서 28℃에서 7일 동안 인큐베이션하였다. 모든 구축물이 선택 마커로서 PAT 유전자를 함유하였기 때문에, 비알라포스-기반 제제 허비에이스(Herbiace)®를 선택적 작용제로서 사용하였다. 배아를 N6 (1.5H) KW 배지 (N6 염 및 비타민, 1.5 mg/L 2,4-D, 700 mg/L L-프롤린, 500 mg/L MES, 0.85 mg/L 질산은, 100 mg/L 반코마이신, 100 mg/리터 세포탁심, 1.5 mg/L 허비에이스®, 3% 수크로스, 8 g/L TC 한천 및 5.8로 조정된 pH)로 옮겼다. 대략 2주 후에, 배아를 이중 수준의 허비에이스®가 함유된 배지로 옮기고, 후속적으로 N6 (3.0H) KW 배지 (N6 염 및 비타민, 1.5 mg/L 2,4-D, 700 mg/L L-프롤린, 500 mg/L MES, 0.85 mg/L 질산은, 100 mg/L 반코마이신, 100 mg/L 세포탁심, 3.0 mg/L 허비에이스®, 3% 수크로스, 8 g/L TC 한천 및 5.8로 조정된 pH)로 옮겼다. 처음 N6 (3.0H) KW 배지로 옮긴 후에, 임의의 급속 성장 배아발생 조직을 N6 (3.0H) KW 배지의 개별 플레이트로 계대배양하여 추정 트랜스제닉 단리물의 부피를 증가시켰다. 배아발생 캘러스 물질의 충분한 양이 수득되었을 때, 접합성 및 발현 검정을 위해 샘플을 취하였다. 카피수 및 발현 기준을 충족시키는 사건을 28(1H) 재생 배지 (MS 염 및 비타민, 5 mg/L BAP, 25 μg/L 2,4-D, 3% 수크로스, 1 mg/L 허비에이스®, 2.5 g/L 겔라이트™ 및 5.7로 조정된 pH)로 옮기고, 16:8시간 광주기로 저 광 (13 μEm-2s-1)에서 7일 동안, 이어서 고 광 (40 μEm-2s-1)에서 7일 동안 배양하였다. 출아한 싹을 100 x 25 mm 플레이트 내 36(1H) 배지 (MS 염 및 비타민, 3% 수크로스, 1 mg/L 허비에이스®, 2.5 g/L 겔라이트™, pH 5.7)로 옮겼다. 싹이 약 3-5 mm의 길이에 도달하였을 때, 25 x 150 mm 유리 튜브 내 SHGA 발근 배지 (SH 염 및 비타민, 1 g/L 미오-이노시톨, 1% 수크로스, 2.5 g/L 겔라이트™, pH 5.8)로 옮겼다. 소식물체는 적절한 뿌리 발달이 관찰된 후에 온실로 옮겼다.
온실 내 T0 식물의 이송 및 정착. 트랜스제닉 식물에 고유한 식별자를 할당하고, 온실로 옮겼다. 식물을 튜브로부터 작은 화분 (3.5" SVD)으로 이식하고, 온실 환경 (~28℃ 낮 온도/~26℃ 밤 온도/16:8 보충 조명)에 식물을 순응시키는 것을 돕기 위해 1주 동안 휴미돔(Humidome)™으로 덮었다. 이어서, 식물을 작은 화분으로부터 곤충-생물검정을 위한 뿌리 트레이너 (스펜서-르메르 인더스트리즈(Spencer-Lemaire Industries), 캐나다 앨버타주 에드몬톤; 스타일 티누스 350-4)로 이식하였다. 사건당 3개의 식물을 뿌리 트레이너에 넣고 그 동안 온실 스탭은 사건당 남아있는 3개의 식물을 수동 수분 및 T1 종자 생산을 위해 5-갤런 화분으로 옮겼다. 뿌리 트레이너에 이식한지 대략 4일 후에, 식물을 생물검정을 위해 침입시켰다.
T1 종자의 생산. 생물검정을 통과한 식물 및 생물검정되지 않은, 사건당 상응하는 3개의 식물을 5 갤런 화분으로 이식하였다. 매주 관찰하여 임의의 비정상적 표현형을 추적하였다. 이삭이 출아하였을 때, 싹 백을 수염 출아 전에 싹에 걸쳐 놓아 자리를 벗어난 화분에 의한 교차-오염이 없도록 보장하였다. 덮기 전에 임의의 싹이 수염을 생산한 경우에, 기록하고 그 싹을 제거하였다. 제2 싹을 수분에 사용하기 위해 덮었다. 비정상적 싹을 생산하거나 싹을 생산하지 않은 식물을 데이터베이스에 기록하였다. T0 식물로부터의 웅수를 떨어지기 전에 제거하여 온실에서 트랜스제닉 화분 유동을 배제시켰다. 수분 동안에 화분을 받아들이기 위한 고른 브러시를 제공하기 위해 수염을 다시 절단하였다. 근교 제아 메이스 재배품종 5XH751로부터의 화분을 모든 수분에 사용하였다.
수분이 완료된 후에, 식물을 온실에 넣고, 성장 및 발달하도록 하였다. 이삭을 수분 21일 후에 다시 박리하여 건조를 증진시키고, 이어서 수분 42일 후에 완전히 수거하였다 (이삭을 식물로부터 제거함). 이삭을 1주 동안 건조기에 넣고, 이어서 종자를 처리하였다 (껍질제거, 계수, 미리-인쇄된 봉투에 포장 및 데이터베이스에 종자 수 등록).
실시예 4: 트랜스제닉 식물/사건의 단백질 발현
캘러스 식물 물질에서 웨스턴 블롯에 의한 단백질 발현. 메이즈 캘러스 샘플을 웨스턴 블롯에 의해 TcdA의 존재에 대해 분석하였다. 분석을 위한 준비로, 200 mg의 캘러스 샘플을 96 웰 클러스터 튜브 박스 (코닝(Corning), 뉴욕주 코닝) 내로 수집하고, -80℃에서 저장하였다. 분석 시에, 4개의 스틸 비드 (3.5mm, 바이오스펙 프로덕츠(BioSpec Products), 오클라호마주 바틀즈빌) + 200 μl의 추출 완충제 (1X 포스페이트 완충 염수 (PBS) + 0.1% 트리톤-X-100)를 첨가하여 샘플을 추출하였다. 샘플을 클레코 비드 밀(Kleco bead mill)™ (가르시아 머신(Garcia Machine), 캘리포니아주 비살리아) 내의 비드를 사용하여 최대 설정으로 3분 동안 비팅하였다. 처리 후에, 샘플을 플레이트 원심분리기 (퀴아젠(Qiagen))에서 3000 rcf로 5분 동안 원심분리하였다. 생성된 상청액을 피펫팅에 의해 새로운 튜브로 옮겼다. 추출물을 적절한 양의 샘플 완충제 (40 mM 디티오트레이톨이 함유된 누페이지 LDS(NuPage LDS)™ 4X 샘플 완충제 (인비트로젠(Invitrogen), 캘리포니아주 칼스배드))와 혼합하여 웨스턴 샘플을 준비하였다. 정제된 단백질 양성 대조군 (PA1, 0.4mg/ml)을 상기와 같은 샘플 완충제 중에 6.25 ng/μl의 농도로 준비하였다. 40 마이크로리터의 각각의 준비된 샘플 및 표준물을 PCR 튜브 (써모 사이언티픽(Thermo Scientific))에 넣고, 써모사이클러 (어플라이드 바이오시스템즈(Applied BioSystems), 캘리포니아주 포스터 시티) 내 90℃에서 5분 동안 가열하였다. 샘플을 트리스-아세테이트-SDS 구동 완충제 (인비트로젠)가 함유된 3-8% 트리스-아세테이트 겔 (인비트로젠 EA0375) 상에서 분해시켰다.
추가로, 내부 겔 챔버는 구동 완충제에 첨가된 항산화제 (인비트로젠)를 가졌다. 샘플을 겔 사양에 따라 로딩하였으며, 캘러스 샘플의 경우 25 μL의 샘플을 로딩하고, 정제된 단백질 대조군 (25 ng)의 경우 4 μl를 로딩하고, 분자량 마커 (시블루 마커(SeeBlue Marker)™, 인비트로젠, 캘리포니아주 칼스배드) 15 μl를 로딩하였다. 겔을 일정한 150 V에서 75분 동안 구동하였다. 한편, 전달 패드 및 0.2 μm 니트로셀룰로스 막 (인비트로젠)을 전달 완충제 (1X 누페이지 트랜스퍼 버퍼(1X NuPage Transfer Buffer)™ (인비트로젠) + 10-20% 메탄올) 중에 침지시켜 준비하였다.
겔 상에서 단백질을 분해시킨 후에, 블롯 모듈 (인비트로젠) 및 옮겨질 겔을 제조업체의 지침에 따라 조립하였다. 이어서, 겔을 일정한 45 V에서 적어도 1.5시간 (블롯 모듈당 2개 겔에 대해 2시간) 동안 옮겼다. 초기 캘러스 웨스턴 블롯을 바이오-라드 크리테리온(Bio-Rad Criterion)™ 시스템 (4-20% 트리스-HCl 겔 [바이오-라드, 캘리포니아주 허큘레스] 및 1X 트리스/글리신/SDS 구동 완충제)을 사용하여 구동하였다. 그러나, 불량한 겔 품질로 인해, 상기 설명된 인비트로젠 시스템으로 교체하도록 결정하였다. 옮긴 후에, 막을 웨스턴 브리즈(Western Breeze) 차단 완충제 (인비트로젠) 중에서 실온에서 30분 동안 차단하였다. 차단 용액을 제거하고, 1차 항체 (MAB 항-TcdA 148G4.1 및 MAB 항-TcdA 148D11.1)를 차단 완충제 중에 1.0 μg/ml의 농도로 첨가하였다. 막을 실온에서 적어도 1시간 동안 인큐베이션하였다. 막을 웨스턴 브리즈™ 세척 용액 (인비트로젠)으로 각각 5분 동안 3회 세척하였다. 2차 항체 (항-마우스 HRP [시그마(Sigma), 미주리주 세인트 루이스])를 차단 용액 중에 1:3000 희석률로 준비하였다. 막을 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한 후에 상기와 같이 세척하였다. 잉여량의 세척 완충제를 막의 가장자리에서 종이 수건으로 서서히 블롯팅하여 막으로부터 제거하였다. 막을 5분 동안 화학발광 기질 (써모 사이언티픽)에 노출시켰다. 잉여량의 기질을 상기와 같이 제거하고, 막을 플라스틱 랩으로 랩핑하였다. 암실에서, X선 필름 (써모 사이언티픽, 매사추세츠주 월섬)을 막에 노출시켜 밴드를 가시화하였다. 필름을 5분 동안 현상하고, 2시간 필름 노출하였다.
T0 식물 물질에서 ELISA에 의한 단백질 발현. 메이즈 잎 물질을 모노-모노 ELISA를 사용하여 TcdA의 존재에 대해 분석하였다. 온실에서 성장시킨 식물로부터의 잎은, 식물이 뿌리벌레 알로 침입된 지 1주 후에, 처음으로 완전히 확장된 잎의 끝으로부터 2 cm 잎 조각을 절단하여 샘플링하였다. 샘플을 96 웰 클러스터 튜브 박스 (코닝) 내로 수집하고, -80℃에서 동결시켰다. 샘플은 3개의 스틸 비드 (3.5mm, 바이오스펙 프로덕츠, 오클라호마주 바틀즈빌), 1개의 스틸 비드 (4.5 mm 데이지(Daisy)) 및 100 μl의 PBEX 추출 완충제 (19 mM NaH2PO4, 31 mM Na2HPO4, 10 mM 0.5M EDTA 및 0.1% 트리톤(Triton)®-X 100)를 첨가하여 추출을 위해 준비하였다. 샘플을 클레코 비드밀™ (가르시아 머신)을 사용하여 최대 설정으로 3분 동안 분쇄하였다. 추가 300 μl의 PBEX 추출 완충제를 샘플에 첨가하고, 샘플을 추가 1분 동안 처리하였다. 처리 후에, 샘플을 플레이트 원심분리기 (퀴아젠)에서 3000 rcf로 5분 동안 원심분리하였다. 생성된 상청액을 새로운 튜브로 옮겼다. ELISA 플레이트는 하기와 같이 비콘 어낼리티칼 시스템즈(Beacon Analytical Systems) (메인주 포틀랜드)에 의해 제조되었다: 맥시소르브 플레이트(Maxisorb plates)™ (써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific))를 1X PBS 중 1.0 μg/ml의 농도의 항-TcdA 모노클로날 항체 (MAB 항-TcdA 148G4.1)로 코팅하였다. 4℃에서 밤새 인큐베이션한 후에, 플레이트를 PBST (PBS + 0.5% 트윈(Tween)®-20) 중 1% 냉수 어류 젤라틴 (시그마)으로 차단하였다. 플레이트를 건조시키고, 저장을 위해 개별적으로 랩핑하였다. 분석 시에, 플레이트를 실온으로 가온하고, 샘플 로딩 전에 플레이트 세척기 (톰텍(TomTec))에서 세척당 350 μl의 PBST를 사용하여 4회 세척하였다. 정제된 단백질 참조 항원 (PA1, 0.4 mg/ml)을 PBEX 완충제 중에 150 ng/ml로 희석하고, 이를 사용하여 150 ng/ml에서 2.34 ng/ml로의 연속 희석물의 표준 곡선을 생성하였다. 샘플을 PBEX 완충제 중에 1:8의 희석률로 시작해서 희석하고, 추가로 3회 연속 희석하였다. 다음에, 100 μl의 모든 표준물 및 샘플 희석물을 ELISA 플레이트 상에 이중으로 로딩하였다. 샘플을 ELISA 플레이트 상에서 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후에, 플레이트를 상기와 같이 세척하였다. 모노클로날 항체에 접합된 양고추냉이 퍼옥시다제 (MAB 항-TcdA 148D11.1 -- HRP) (펜실베니아주 덴버 소재의 코반스(Covance)에 의해 제조됨)를 PBS 중에 1 μg/ml로 희석하고, 플레이트에 웰당 100 μl로 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후에 플레이트를 세척하였다. 플레이트의 스택을 180° 회전시키고, 세척 단계를 반복하였다. 다음에, 1-스텝 울트라 TMB 기질(1-Step Ultra TMB substrate)™ (써모 사이언티픽)을 플레이트에 웰당 100 μl로 첨가하였다. 표준 곡선의 최하 희석률을 갖는 웰이 청색을 보여주기 시작하였을 때, 50 μl의 정지 용액 (0.4 N H2SO4)을 첨가하여 반응을 정지시켰다. 플레이트를 플레이트 판독기 (몰레큘라 디바이시스(Molecular Devices))에서 소프트맥스(SoftMax)® 프로 v5 (몰레큘라 디바이시스)를 사용하여 450 nm의 파장 (650 nm 참조의 차감)에서 판독하였다. 시험 샘플의 TcdA 농도를 2차 표준 곡선의 선형 회귀에 의해 계산하였다.
잎 추출물 중 총 가용성 단백질을 브래드포드(Bradford) 검정에 의해 결정하였다. 메이즈 잎 샘플을 96 웰 폴리프로필렌 플레이트 (코닝)에서 밀리-큐(Milli-Q)® 물을 사용하여 희석하였다. 단백질 표준물 (미리-희석된 단백질 검정 표준물: BSA [써모 사이언티픽])을 0.5 mg/ml의 농도로 시작해서 희석하고, 플레이트를 0.0625 mg/ml로 연속 하향 희석하여 하단 웰이 물 블랭크로서 남겨졌다. 샘플을 맥시소르브® 플레이트 (써모 피셔 사이언티픽)로 옮기고, 준비된 단백질 염료 (바이로라드)를 웰에 첨가하였다. 플레이트를 플레이트 판독기 (몰레큘라 디바이시스)에서 소프트맥스® 프로 v5 (몰레큘라 디바이시스)를 사용하여 595 nm의 파장에서 판독하였다. 총 가용성 단백질 농도를 2차 표준 곡선의 선형 회귀에 의해 계산하였다. 통계적 분석을 JMP 소프트웨어 (버전 7.0.2, 에스에이에스 인더스트리즈, 인크.(SAS Industries, Inc.), 노스캐롤라이나주 캐리)를 사용하여 수행하였다. log+1 변환을 사용하여 단백질 발현 (TcdA의 백만분율) 값을 변환하였다.
여기서 ELISA는 항체당 단지 1개의 에피토프만을 인식할 수 있는 2개의 모노클로날 항체를 사용하므로 검정의 말단절단된 TcdA 인식 능력은 감소된다. 이 특이성 때문에, ELISA에 의해 결정된 발현 수준은 전장 TcdA를 나타낸다는 신뢰성이 있다. 잎 샘플 추출물의 최하 희석률이 1:8이기 때문에, 이로 인해 검출 하한치는 16 ng/ml 및 정량 하한치 (최하 희석 인자 x 배경의 2배의 O.D.를 갖는 최하 표준)는 36 ng/ml가 된다. 따라서 36 ng/ml과 0 사이의 임의의 결과는 정확한 것으로 간주되어서는 안된다.
T1 식물 물질에서 ELISA에 의한 단백질 발현. 비-파괴성 스크리닝 방법으로서, 메이즈 식물을 정성적 효소 연결 면역흡착 검정 (ELISA)에 의해 선택 마커 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제 (PAT)의 존재에 대해 분석하였다. 온실에서 성장시킨 식물로부터의 잎은, 처음으로 완전히 확장된 잎의 끝으로부터 2 cm 잎 조각을 절단하여 샘플링하였다. 샘플을 96 웰 클러스터 튜브 박스 (코닝) 내로 수집하고, -80℃에서 동결시켰다. 샘플은 2개의 스틸 비드 (4.5 mm, 데이지, 아칸소주 로저스) 및 0.5% 트윈®-20 (PBST) 추출 완충제가 함유된 100 μl의 포스페이트 완충 염수를 첨가하여 추출을 위해 준비하였다. 샘플을 클레코 비드밀™ (가르시아 머신)을 사용하여 최대 설정으로 3분 동안 분쇄하였다. 추가 300 μl의 PBST 추출 완충제를 샘플에 첨가하고, 샘플을 추가 1분 동안 처리하였다. 비드 비팅 후에, 샘플을 플레이트 원심분리기 (퀴아젠)에서 3,000 rcf로 5분 동안 원심분리하였다. 생성된 상청액을 새로운 튜브로 옮겼다. PAT 키트 AP014 (엔바이롤로직스(EnviroLogix), 메인주 포틀랜드)로부터의 ELISA 플레이트를 사용을 위한 준비로 실온으로 가온하였다. 정제된 단백질 참조 항원 (PAT 표준물 TSN 104799, 63 μg/ml)을 PBST 완충제 중에 10 ng/ml로 희석하고, 이를 사용하여 하기 희석물의 표준 곡선을 생성하였다: 5 ng/ml, 0.625 ng/ml 및 0.156 ng/ml. 사용을 위한 플레이트를 준비하기 위해, 50 μl의 효소 접합체 (엔바이롤로직스, 메인주 포틀랜드)를 각 웰에 첨가하고, 이어서 50 μl의 PBST를 첨가하였다. 다음에, 50 μl의 표준물 및 샘플을 ELISA 플레이트 상에 그의 각 웰에 로딩하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후에, 플레이트를 플레이트 세척기 (톰텍)에서 세척당 350 μl의 PBST를 사용하여 4회 세척하였다. 엔바이롤로직스 TMB 기질™을 플레이트에 웰당 100 μl로 첨가하고, 15분 동안 인큐베이션하였다. 100 μl의 정지 용액을 첨가하여 반응을 정지시켰다. 플레이트를 플레이트 판독기 (몰레큘라 디바이시스)에서 소프트맥스® 프로 v5 (몰레큘라 디바이시스)를 사용하여 O.D. 450의 파장에서 판독하였으며, 차감된 OD는 0.7 nm보다 더 컸다.
곤충 생물검정을 위해 선택된 식물을 모노/모노 ELISA에 의해 TcdA의 존재에 대해 분석하였다. 잎 샘플을 다음 두 시점에 수집하였다: 뿌리벌레 알에 의한 침입 1주 후 및 생물검정의 말기 (침입 21일 후). 잎은 처음으로 완전히 확장된 잎의 끝으로부터 2 cm 잎 조각을 절단하여 샘플링하였다. 샘플을 96 웰 클러스터 튜브 박스 (코닝) 내로 수집하고, -80℃에서 동결시켰다. 샘플은 2개의 스틸 비드 (4.5mm, 데이지) 및 100 μl의 PBEX 추출 완충제 (19 mM NaH2PO4, 31mM Na2HPO4, 10 mM 0.5M EDTA 및 0.1% 트리톤®-X 100)를 첨가하여 추출을 위해 준비하였다. 샘플을 클레코 비드밀™ (가르시아 머신)을 사용하여 최대 설정으로 3분 동안 분쇄하였다. 추가 300 μl의 PBEX 추출 완충제를 샘플에 첨가하고, 샘플을 추가 1분 동안 처리하였다. 비드 비팅 후에, 샘플을 플레이트 원심분리기 (퀴아젠)에서 3000 rcf로 5분 동안 원심분리하였다. 각각의 식물에 대한 뿌리 샘플을 생물검정의 말기에 수집하였다. 뿌리 샘플 (식물당 200 mg)은 4개의 스틸 비드 (4.5mm, 데이지) 및 400 μl의 PBEX 추출 완충제를 2 ml 튜브에 첨가하여 추출을 위해 준비하였다. 샘플을 클레코 비드밀™ (가르시아 머신)을 사용하여 최대 설정으로 3분 동안 분쇄하였다. 비드 비팅 후에, 샘플을 플레이트 원심분리기 (퀴아젠)에서 3000 rcf로 5분 동안 원심분리하였다. 생성된 상청액을 새로운 튜브로 옮겼다. ELISA 플레이트는 하기와 같이 비콘 어낼리티칼 시스템즈 (메인주 포틀랜드)에 의해 제조되었다: 맥시소르브 플레이트 (써모 피셔 사이언티픽)를 1X PBS 중 1.0 μg/ml의 농도의 항-TcdA 모노클로날 항체 (MAB 항-TcdA 148G4.1)로 코팅하였다. 4℃에서 밤새 인큐베이션한 후에, 플레이트를 PBST (PBS + 0.5% 트윈®-20) 중 1% 냉수 어류 젤라틴 (시그마)으로 차단하였다. 플레이트를 건조시키고, 저장을 위해 개별적으로 랩핑하였다. 분석 시에, 플레이트를 실온으로 가온하고, 샘플 로딩 전에 플레이트 세척기 (톰텍)에서 세척당 350μl의 PBST를 사용하여 4회 세척하였다.
정제된 단백질 참조 항원 (PA1, 0.4 mg/ml)을 PBEX 완충제 중에 150 ng/ml로 희석하고, 이를 사용하여 150 ng/ml에서 2.344 ng/ml로의 연속 희석물의 표준 곡선을 생성하였다. 샘플을 PBEX 완충제 중에 1:8의 희석률로 시작해서 희석하고, 추가로 3회 연속 희석하였다 (1:8, 1:16, 1:32, 1:64). 다음에, 100 μl의 표준물 및 샘플 희석물을 ELISA 플레이트 상에 이중으로 로딩하였다. 샘플을 ELISA 플레이트 상에서 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후에, 플레이트를 상기와 같이 세척하였다. 모노클로날 항체에 접합된 양고추냉이 퍼옥시다제 (MAB 항-TcdA 148D11 - HRP)를 PBS 중에 1 μg/ml로 희석하고, 플레이트에 웰당 100 μl로 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후에 플레이트를 스텝 울트라 TMB™ 기질 (써모 사이언티픽)로 세척하였다. 이 세척 용액을 플레이트에 웰당 100 μl로 첨가하였다. 표준 곡선의 최하 희석률을 갖는 웰이 청색을 보여주기 시작하였을 때, 50 μl의 정지 용액 (0.4 N H2SO4)을 첨가하여 반응을 정지시켰다. 플레이트를 플레이트 판독기 (몰레큘라 디바이시스)에서 소프트맥스® 프로 v5 (몰레큘라 디바이시스)를 사용하여 O.D. 450 nm의 파장 (650 nm 참조의 차감)에서 판독하였다. 시험 샘플의 TcdA 농도를 2차 회귀 분석에 의해 계산하였다.
생물검정 후에, 잎 및 뿌리 샘플의 하위세트를 웨스턴 블롯에 의해 TcdA의 존재에 대해 분석하였다. 추출물을 적절한 양의 샘플 완충제 (40 mM 디티오트레이톨이 함유된 누페이지 LDS™ 4X 샘플 완충제 [인비트로젠])와 혼합하여 웨스턴 샘플을 준비하였다. 정제된 단백질 양성 대조군 (PA1, 0.4mg/ml)을 상기와 같은 샘플 완충제 중에 6.25 ng/μl의 농도로 준비하였다. 다음에, 40 μl의 각각의 준비된 샘플 및 표준물을 PCR 튜브 (써모 사이언티픽)에 넣고, 써모사이클러 (어플라이드 바이오시스템즈) 내 90℃에서 5분 동안 가열하였다. 샘플을 트리스-아세테이트-SDS 구동 완충제 (인비트로젠)가 함유된 3-8% 트리스-아세테이트 겔 (인비트로젠) 상에서 분해시켰다. 추가로, 내부 겔 챔버는 구동 완충제에 첨가된 항산화제 (인비트로젠)를 가졌다. 샘플을 겔 사양에 따라 로딩하였으며, 각각의 잎 및 뿌리 샘플의 경우 25 μl의 샘플을 로딩하고, 정제된 단백질 대조군 (25 ng)의 경우 4 μl를 로딩하고, 분자량 마커 (시블루 마커™, 인비트로젠) 15 μl를 로딩하였다. 겔을 일정한 150 V에서 75분 동안 구동하였다. 겔이 구동되는 동안, 전달 패드 및 0.2 μm 니트로셀룰로스 막 (인비트로젠)을 전달 완충제 (1X 누페이지® 트랜스퍼 버퍼 (인비트로젠) + 10-20% 메탄올) 중에 침지시켜 준비하였다. 겔 상에서 단백질을 분해시킨 후에, 블롯 모듈 (인비트로젠) 및 옮겨질 겔을 제조업체의 지침에 따라 조립하였다. 이어서, 겔을 일정한 45 V에서 적어도 1.5시간 (블롯 모듈당 2개 겔에 대해 2시간) 동안 옮겼다. 옮긴 후에, 막을 웨스턴 브리즈® 차단 완충제 (인비트로젠) 중에서 실온에서 30분 동안 차단하였다. 차단 용액을 제거하고, 1차 항체 (MAB 항-TcdA 148G4.1 및 MAB 항-TcdA 148D11.1)를 차단 완충제 중에 1.0 μg/ml의 농도로 첨가하였다. 막을 실온에서 적어도 1시간 동안 인큐베이션하였다. 막을 웨스턴 브리즈® 세척 용액 (인비트로젠)으로 각각 5분 동안 3회 세척하였다. 2차 항체 (항-마우스 HRP (시그마))를 차단 용액 중에 1:3000 희석률로 준비하였다. 막을 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한 후에 상기와 같이 세척하였다. 잉여량의 세척 완충제를 막의 가장자리에서 종이 수건으로 서서히 블롯팅하여 막으로부터 제거하였다. 막을 5분 동안 화학발광 기질 (써모 사이언티픽)에 노출시켰다. 잉여량의 기질을 상기와 같이 제거하고, 막을 플라스틱 랩으로 랩핑하였다. 암실에서, X선 필름 (써모 사이언티픽)을 막에 노출시켜 밴드를 가시화하였다. 필름을 5분 동안 현상하고, 2시간 필름 노출하였다.
잎 및 뿌리 추출물 중 총 가용성 단백질을 브래드포드 검정에 의해 결정하였다. 메이즈 잎 및 뿌리 샘플을 96 웰 폴리프로필렌 플레이트 (코닝)에서 밀리-큐® 물을 사용하여 희석하였다. 단백질 표준물 (미리-희석된 단백질 검정 표준물: BSA™ (써모 사이언티픽))을 0.5 mg/ml의 농도로 시작해서 희석하고, 플레이트를 0.0625 mg/ml로 연속 하향 희석하여 하단 웰이 물 블랭크로서 남겨졌다. 샘플을 맥시소르브 플레이트™ (써모 피셔 사이언티픽)로 옮기고, 준비된 단백질 염료 (바이로라드)를 웰에 첨가하였다. 플레이트를 플레이트 판독기 (몰레큘라 디바이시스)에서 소프트맥스® 프로 v5 (몰레큘라 디바이시스)를 사용하여 O.D. 595 nm의 파장에서 판독하였다. 총 가용성 단백질 농도를 2차 회귀 분석에 의해 계산하였다.
통계적 분석을 JMP® 소프트웨어 (버전 7.0.2, 에스에이에스 인더스트리즈, 인크., 노스캐롤라이나주 캐리)를 사용하여 수행하였다. log 변환을 사용하여 단백질 발현 (TcdA의 백만분율) 값을 변환하였다.
실시예 5: T0 트랜스제닉 식물 발현 스크리닝
T0 식물에서의 단백질 발현 분석. 웨스턴 블롯 및 ELISA 데이터는 트랜스제닉 pDAS5144 사건이 뿌리 조직에서 TcdA 단백질을 특이적으로 발현시켰다는 것을 제시하였다. pDAS5144 사건에 대한 캘러스 및 T0 잎 샘플 둘 다에서의 TcdA의 발현은 표 2에 제시된 바와 같이 놀랍게도 낮았다. 다양한 구축물에 대한 TcdA의 메이즈 잎 발현 프로파일이 백만분율 (PPM)로 보고되어 있다. pDAS5144 구축물에서의 TcdA의 발현은 다른 구축물보다 유의하게 더 적었다. pDAS5144 구축물에서의 TcdA의 평균 발현은 14 PPM이었다. 이 구축물로부터의 잎 물질에 대한 발현 범위는 0-200 PPM이었다. 잎 조직에서의 보다 낮은 발현 수준은 프로모터 조직 특이성의 결과이다.
<표 2> T0 메이즈 잎 및 캘러스에서 구축물에 의한 TcdA 단백질의 발현
Figure pct00030
*동일한 문자가 이어지지 않은 수준은 유의한 차이가 있다.
T1 식물에서의 단백질 발현 분석. 표 3은 곤충 생물검정 동안 침입 1주 후 T1 메이즈 잎으로부터 단리된 TcdA 단백질에 대한 정량적 ELISA 분석의 결과를 열거한다. 다양한 사건에 대한 T1 메이즈 잎을 수거하고, 발현된 TcdA 단백질의 효능을 시험하기 위해 곤충 생물검정에 제출하였다. 평균 TcdA 발현 (PPM)을 구축물별로 범위 및 상위 사분위수 결과와 함께 기록하였다. 추가로, 메이즈 잎에서의 평균 TcdA 발현에 대한 터키-크레이머(Tukey-Kramer) 평균 분리 분석 결과가 사건의 각 세트에 대해 보고되어 있다. 구축물 pDAS5144를 함유하는 식물의 TcdA 단백질 발현은 잎 조직에서 무시할만하였다. 메이즈 잎에서의 TcdA의 무시할만한 발현에도 불구하고, 생물검정 결과는 pDAS5144 사건이 곤충 침입 (예를 들어, 뿌리벌레 침입)에 대한 내성을 제공하였다는 것을 나타냈다. 생물검정 데이터 및 단백질 발현 데이터의 조합 (잎으로부터의 것)을 분석한 것은 잎에서의 단백질 발현과 뿌리벌레에 의한 뿌리 손상 수준 사이에 어떠한 상관관계도 없음을 제시하였다. 뿌리에서의 TcdA의 발현과 조합된 잎 조직에서의 보다 낮은 TcdA 발현 수준은 신규 키메라 유전자 프로모터 조절 요소가 뿌리-조직 특이적 방식으로 tcda 트랜스진을 발현한다는 것을 시사한다.
<표 3> 곤충 생물검정 동안 수집된 샘플에 대한, 메이즈 잎에서의 구축물에 의한 평균 TcdA 단백질 발현 수준 (ppm).
Figure pct00031
*동일한 문자가 이어지지 않은 수준은 유의한 차이가 있다.
곤충 생물검정 후 단백질 발현 분석. ELISA 및 웨스턴 블롯을 사용하여, 곤충 생물검정 실험의 완료 후 잎 및 뿌리 물질의 하위세트를 분석하였다. 표 4 및 5는 각각 잎 및 뿌리 물질에서의 평균 TcdA 단백질 발현을 열거한다. 구축물 사이에 T1 메이즈 잎에서의 TcdA 단백질의 발현 수준의 유의차가 존재하였지만, 구축물 사이의 차이는 잎과 비교하여 곤충 생물검정 후 분석된 뿌리에서 덜 구별되었다. pDAS5144 사건은 TcdA 단백질 발현의 최대 범위를 생성하여, 검정된 트랜스제닉 사건에서 TcdA 단백질의 발현을 유발하였다. 비교컨대, 회수된 총 단백질 중에서, TcdA 단백질은 잎 조직에서 검출가능하지 않았다. 이들 결과는 TcdA가 신규 키메라 유전자 프로모터 조절 요소에 의해 유도되는 구축물 pDAS5144로부터의 트랜스진 발현은 뿌리 특이적임을 추가로 시사한다.
<표 4> 곤충 생물검정의 완료 후, 메이즈 잎에서의 구축물에 의한 TcdA 단백질의 발현 (PPM).
Figure pct00032
*동일한 문자가 이어지지 않은 수준은 유의한 차이가 있다.
<표 5> 곤충 생물검정의 완료 후, 메이즈 뿌리에서의 구축물에 의한 TcdA 단백질의 발현 (PPM).
Figure pct00033
*동일한 문자가 이어지지 않은 수준은 유의한 차이가 있다.
발달의 V6 및 VT 단계에서의 단백질 발현. 옥수수 식물 발달의 V6 및 VT 단계에서 신규 키메라 유전자 프로모터 조절 요소에 의한 TcdA의 발현 수준을 평가하기 위해 추가의 연구를 수행하였다. 각각의 구축물 5116, 5117 및 5144로부터 트랜스진 TcdA를 발현하는 메이즈 식물을 성장시켰다. 단백질을 T1 잎 조직에 대해 단리하고, 정량화하고, 이들 결과를 전체 식물로부터 단리된 총 단백질과 비교하였다. 표 6에 제시된 바와 같은 이들 결과는 구축물 pDAS5144의 신규 키메라 유전자 프로모터 조절 요소로부터의 tcda 트랜스진 발현이 뿌리 특이적임을 추가로 확인시켜 준다. TcdA 단백질은 전체 식물로부터 단리된 총 단백질 중에서 검출되었지만, 잎에서는 TcdA 단백질이 검출되지 않았다. 추가적으로, 구축물 pDAS5144의 신규 키메라 유전자 프로모터 조절 요소는 메이즈 성장 및 발달의 V6 및 VT 단계 둘 다에서 tcda 트랜스진을 발현하였다.
<표 6> 식물 성장 및 발달의 V6 및 VT 단계에서 수거된 T1 메이즈 잎으로부터의 총 TcdA 단백질.
Figure pct00034
이와 같이 신규 키메라 유전자 프로모터 조절 요소는 작동가능하게 연결되어 유전자 발현 카세트로서 트랜스진을 발현하는데 사용되었으며, 생성된 발현 프로파일이 특징화되었다. 유전자 발현 구축물에 사용하기 위한 제아 메이스 퍼옥시다제 5로부터 수득된 상류-프로모터 폴리뉴클레오티드 서열에 이어서 제아 메이스 알콜 데히드로게나제 (I) 인트론 6 및 메이즈 줄무늬 바이러스 5'-UTR을 포함하는 키메라 프로모터가 처음으로 개시된다. 신규 키메라 유전자 프로모터 조절 요소를 발현하는 구축물은 뿌리 조직 특이적 방식으로 트랜스진을 발현하는 것으로 제시되었다. 제아 메이스 퍼옥시다제 5로부터 수득된 상류-프로모터 폴리뉴클레오티드 서열에 이어서 제아 메이스 알콜 데히드로게나제 인트론 1을 포함하는 키메라 프로모터가 잎 및 뿌리 조직 둘 다에서 트랜스진을 발현한다는 것을 고려하면 조직 특이성 결과는 놀라운 것이다. 미국 특허 번호 6,384,207의 표 22를 참조한다.
SEQUENCE LISTING <110> Dow AgroSciences LLC Owens Merlo, Patricia Ann Hampton Jr., Ronnie Larsen, Cory Woosley, Aaron <120> Root Specific Expression Conferred by Chimeric Gene Regulatory Elements <130> 14764-233719 <140> Unknown <141> 2015-02-26 <150> 61/946,066 <151> 2014-02-28 <160> 9 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 2179 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The chimeric promoter sequences are made up of an upstream-promoter polynucleotide sequence that was obtained from Zea mays Peroxidase 5 followed by the Zea mays alcohol dehydrogenase (I) intron 6 and Maize Streak Virus 5' -UTR <400> 1 accactgttg taacttgtaa gccactagct cacgttctcc atgagctctt ctctctgctg 60 tttcttcctc tgctaactgc gttatgatat gacgtcgtat aaataatctc acaatacttc 120 cttattttca gcatggcctc ttttatgttt atttaacagt agcaaccaac gccgctcgat 180 gtttccttca agaaacggcc actcactatg tggtgtgcag aagaacaaat gtaagcagct 240 cctacaggta ccagtagtca tgtcagtgtg gaagctttcc aaccaacgcc tccttcgagg 300 aacctggtcg tgctgacatg aatgtaggcc 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agatgtttgg tgctgccact ggagccgctc 4380 ctgcccatga tgccctgtca ctcatcatgt tgacgaggtt tgcagactgg gtcaacgccc 4440 ttggtgagaa agcctcgtct gtcctggcag cctttgaagc caactccctg actgcggaac 4500 agcttgcgga tgccatgaac cttgatgcca acttgctcct gcaagcttcg atccaagccc 4560 agaaccatca gcatttgcca cctgtcacgc ctgaaaatgc gttctcatgc tggacctcca 4620 tcaacaccat actccagtgg gtgaacgtgg cgcaacagct caatgtggca cctcaaggag 4680 tgtcagcgct ggttgggctt gactacatcc agtccatgaa ggagacaccg acctacgcgc 4740 agtgggagaa tgcagctggc gtcttgacag ctggtctgaa ctcacagcaa gccaacacgc 4800 tgcatgcgtt cttggatgag agccgctctg ctgccctcag cacgtactat atccggcaag 4860 ttgccaaggc agcggctgcc atcaagtctc gggatgacct ctaccagtac ttgctcattg 4920 acaatcaggt ttctgctgcc atcaaaacga cccggattgc tgaggccata gccagcatcc 4980 agctctacgt caacagagcg cttgagaacg ttgaagagaa tgccaactct ggagtgattt 5040 ctcgccagtt tttcatagac tgggacaagt acaacaagcg ctactccacc tgggctgggg 5100 tctctcagct tgtctactat cctgagaact acatagatcc gacgatgcgg attggccaga 5160 ccaagatgat ggatgccctc cttcagtcgg tgtcccagag ccagctcaat gctgacactg 5220 tggaggatgc cttcatgagc tacctcacct ccttcgagca agttgccaac ctcaaggtca 5280 tctctgctta ccacgacaac atcaacaatg accaagggct cacctacttc attggcctgt 5340 ctgaaactga tgcgggtgag tattactggc gctcagtgga ccacagcaag ttcaacgatg 5400 gcaagtttgc tgcaaatgcc tggtctgagt ggcacaagat tgactgcccc atcaacccgt 5460 acaagtccac catcagacct gtcatctaca agagccgctt gtacttgctc tggcttgagc 5520 agaaggaaat cacgaagcag actggcaact ccaaagatgg ctaccagact gagacggact 5580 accgctatga gttgaaactt gctcacatcc gctatgatgg tacatggaac actccgataa 5640 cgtttgatgt gaacaagaag atttcggagc tgaaactgga gaagaacaga gcgcctgggc 5700 tctactgtgc tggctaccaa ggggaagata cgctgttggt gatgttctac aaccagcaag 5760 acacccttga ctcgtacaag aacgcttcca tgcaaggcct ctacatcttt gctgacatgg 5820 cttccaaaga catgactccg gagcagagca atgtctaccg ggacaactcc taccagcaat 5880 ttgacaccaa caatgttcgg agggtcaata accgctatgc ggaagattat gagatcccaa 5940 gctcagtgtc tagccgcaag gactatggct ggggagacta ctatctcagc atggtgtaca 6000 atggtgacat acccacgatc aactacaagg ctgcctcctc agacctgaag atatacatca 6060 gccccaagct ccgcatcatt cacaatggct atgagggcca gaagaggaac cagtgcaact 6120 tgatgaacaa gtatggcaaa cttggggaca agttcattgt ctacacctcg cttggtgtga 6180 acccgaacaa ttcctcgaac aagctcatgt tctacccggt ctaccagtac agcggcaaca 6240 cctctggctt gaaccaaggg aggctcctgt tccacagaga caccacgtac ccgagcaagg 6300 tggaggcgtg gattcctggt gccaaaaggt cactcaccaa ccagaatgca gccattggtg 6360 atgactatgc cacagacagc ctgaacaagc ctgatgacct gaagcagtac atcttcatga 6420 ctgactccaa gggcacagcc actgatgtgt ctggtccggt ggagatcaac actgcaatca 6480 gcccagccaa ggtccaaatc attgtcaaag ctggtggcaa ggaacagacc ttcacagctg 6540 acaaagatgt gagcatccag ccaagcccct cctttgatga gatgaactac cagttcaacg 6600 ctcttgaaat tgatggctcg ggactcaact tcatcaacaa ttcggcttca attgatgtga 6660 cgttcactgc ctttgcggag gatgggagga aattgggcta tgagagcttc tcaataccag 6720 tcaccttgaa ggtttccact gacaatgcac tcacgcttca tcacaacgag aatggagcgc 6780 agtacatgca atggcagagc taccgcacaa ggttgaacac cctctttgca aggcaacttg 6840 tggccagagc cacgactggc attgacacca tactcagcat ggaaacgcag aacatccaag 6900 agccacagtt gggcaagggt ttctatgcca cctttgtgat cccaccctac aacctgtcaa 6960 cgcatggtga tgagcgctgg ttcaagctgt acatcaagca cgtggttgac aacaattccc 7020 acatcatata ctcgggtcag ctcactgaca cgaacatcaa catcaccctg ttcatcccac 7080 ttgatgacgt tcccctgaac caagactacc atgccaaggt ctacatgacc ttcaagaaat 7140 caccgtcaga tggcacctgg tggggaccgc acttcgttcg ggatgacaaa ggcattgtca 7200 caatcaaccc caagtccata ctcacccact ttgagtctgt gaatgttctg aataacatct 7260 cctcagagcc gatggacttc tcgggtgcca actccctgta cttctgggag ttgttctatt 7320 acacgccgat gcttgtggcg cagaggttgc tccatgaaca gaactttgat gaggccaacc 7380 gctggctcaa gtatgtctgg agcccctcgg gttacattgt gcatggccag atccagaact 7440 accaatggaa tgttcgccca ttgcttgagg acacctcctg gaactctgac ccccttgact 7500 cggtggaccc tgatgcggtg gctcagcatg accccatgca ctacaaggtc tcaaccttca 7560 tgaggaccct ggaccttctg attgccagag gagaccatgc ttaccgccaa ttggaacggg 7620 acacactgaa tgaggcaaag atgtggtaca tgcaagctct gcacctcttg ggagacaagc 7680 cgtacctccc gctcagcacc acatggtcag acccaaggtt ggacagagca gctgacatca 7740 caactcagaa tgctcatgac tctgccattg tggctctgag gcagaacatc ccaacacctg 7800 cgccactgtc gctgagatct gcgaacaccc tgacagacct gttcctcccc cagatcaatg 7860 aggtcatgat gaactactgg caaaccttgg cgcagcgggt ctacaacctc cgccacaacc 7920 tctccattga tgggcagccg ctgtacctcc caatctatgc cacaccagct gacccaaagg 7980 cgcttctcag cgcagctgtg gccacgagcc aagggggagg caagctccct gagagcttca 8040 tgtcgctctg gaggtttccc cacatgttgg agaatgccag aggcatggtg agccaactga 8100 ctcagtttgg ctcgacgctc cagaacatca ttgagaggca agatgcagag gctctgaatg 8160 cgttgctcca gaatcaagca gctgagttga tcctgacgaa cctgtcaatc caagacaaga 8220 ccattgagga acttgatgcg gaaaagacag tccttgaaaa gagcaaggct ggagcccaaa 8280 gccggttcga ctcatatggc aagctgtatg atgagaacat caatgctggg gagaatcaag 8340 ccatgaccct gagggcttca gcagcgggtc tgaccacggc agtgcaagcg tctcgcttgg 8400 ctggggctgc ggctgacctc gttcccaaca tctttgggtt tgctggtggc ggatcaaggt 8460 ggggagccat tgcagaagca acgggctatg tgatggagtt ctctgccaat gtcatgaaca 8520 ctgaggcaga caaaatcagc caatcggaga cctacagacg gagacggcaa gaatgggaga 8580 tacaaaggaa caatgcagag gcagaactga agcaaataga tgcccaactg aagtccttgg 8640 ctgtcagaag ggaggctgcg gtcctccaaa agacctccct caagacccag caagagcaaa 8700 cccagtccca gttggcgttc ctccagagga agttctcgaa ccaagcgctg tacaactggc 8760 tgaggggaag gttggcagcc atctacttcc agttctatga ccttgctgtg gccagatgcc 8820 tcatggcgga acaagcctac cgctgggaac tgaatgatga ctctgccaga ttcatcaaac 8880 cgggtgcatg gcaaggcaca tatgctggac tccttgctgg ggagacactc atgctctcat 8940 tggcccagat ggaggatgct cacctcaaac gggacaagag ggctctggaa gtggagcgga 9000 cagtcagcct tgcggaggtc tatgcgggac tgcccaaaga caatggacca ttttcgttgg 9060 cgcaagagat agacaagttg gtcagccaag ggtctggatc agcgggttct ggaaacaaca 9120 atctggcgtt cggtgctggc actgacacca agacgtccct ccaagcctca gtctcctttg 9180 ctgacctgaa gataagggag gactacccag cgtcccttgg gaagatcaga cgcatcaagc 9240 agatttcagt gaccctgcca gctcttctgg gtccatacca agatgttcaa gcgatcctct 9300 cctatgggga caaggctggt ttggcgaatg gctgtgaggc ccttgctgtg tcacatggca 9360 tgaatgactc tgggcagttc cagcttgatt tcaacgatgg caagttcctg ccattcgagg 9420 gcatagccat tgatcaaggc accctgaccc tctccttccc caatgcttcg atgccagaga 9480 agggaaaaca agccaccatg ctcaagaccc tgaatgatat catactccac atccgctaca 9540 ccatcaagtg agtagttagc ttaatcacct agagctcgtt taaactgagg gcactgaagt 9600 cgcttgatgt gctgaattgt ttgtgatgtt ggtggcgtat tttgtttaaa taagtaagca 9660 tggctgtgat tttatcatat gatcgatctt tggggtttta tttaacacat tgtaaaatgt 9720 gtatctatta ataactcaat gtataagatg tgttcattct tcggttgcca tagatctgct 9780 tatttgacct gtgatgtttt gactccaaaa accaaaatca caactcaata aactcatgga 9840 atatgtccac ctgtttcttg aagagttcat ctaccattcc agttggcatt tatcagtgtt 9900 gcagcggcgc tgtgctttgt aacataacaa ttgttacggc atatatccaa 9950 <210> 9 <211> 1997 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> The novel Sugar Cane Bacilliform Virus promoter followed by the Zea mays alcohol dehydrogenase (I) intron 6 and Maize Streak Virus 5' -UTR <400> 9 atcggaagtt gaagacaaag aaggtcttaa atcctggcta gcaacactga actatgccag 60 aaaccacatc aaagatatcg gcaagcttct tggcccatta tatccaaaga cctcagagaa 120 aggtgagcga aggctcaatt cagaagattg gaagctgatc aataggatca agacaatggt 180 gagaacgctt ccaaatctca ctattccacc agaagatgca tacattatca ttgaaacaga 240 tgcatgtgca actggatggg gagcagtatg caagtggaag aaaaacaagg cagacccaag 300 aaatacagag caaatctgta ggtatgccag tggaaaattt gataagccaa aaggaacctg 360 tgatgcagaa atctatgggg ttatgaatgg cttagaaaag atgagattgt tctacttgga 420 caaaagagag atcacagtca gaactgacag tagtgcaatc gaaaggttct acaacaagag 480 tgctgaacac aagccttctg agatcagatg gatcaggttc atggactaca tcactggtgc 540 aggaccagag atagtcattg aacacataaa agggaagagc aatggtttag ctgacatctt 600 gtccaggctc aaagccaaat tagctcagaa tgaaccaacg gaagagatga tcctgcttac 660 acaagccata agggaagtaa ttccttatcc agatcatcca tacactgagc aactcagaga 720 atggggaaac aaaattctgg atccattccc cacattcaag aaggacatgt tcgaaagaac 780 agagcaagct tttatgctaa cagaggaacc agttctactc tgtgcatgca ggaagcctgc 840 aattcagtta gtgtccagaa catctgccaa cccaggaagg aaattcttca agtgcgcaat 900 gaacaaatgc cattgctggt actgggcaga tctcattgaa gaacacattc aagacagaat 960 tgatgaattt ctcaagaatc ttgaagttct gaagaccggt ggcgtgcaaa caatggagga 1020 ggaacttatg aaggaagtca ccaagctgaa gatagaagag caggagttcg aggaatacca 1080 ggccacacca agggctatgt cgccagtagc cgcagaagat gtgctagatc tccaagacgt 1140 aagcaatgac gattgaggag gcattgacgt cagggatgac cgcagcggag agtactgggc 1200 ccattcagtg gatgctccac tgagttgtat tattgtgtgc ttttcggaca agtgtgctgt 1260 ccactttctt ttggcacctg tgccacttta ttccttgtct gccacgatgc ctttgcttag 1320 cttgtaagca aggatcgcag tgcgtgtgtg acaccacccc ccttccgacg ctctgcctat 1380 ataaggcacc gtctgtaagc tcttacgatc atcggtagtt caccaaggta cccggggtcg 1440 acctcgaggg ggggcccggt accctgaagg ctcgacaagg cagtccacgg aggagctgat 1500 atttggtgga caagctgtgg ataggagcaa ccctatccct aatataccag caccaccaag 1560 tcagggcaat ccccagatca ccccagcaga ttcgaagaag gtacagtaca cacacatgta 1620 tatatgtatg atgtatccct tcgatcgaag gcatgccttg gtataatcac tgagtagtca 1680 ttttattact ttgttttgac aagtcagtag ttcatccatt tgtcccattt tttcagcttg 1740 gaagtttggt tgcactggca cttggtctaa taactgagta gtcattttat tacgttgttt 1800 cgacaagtca gtagctcatc catctgtccc attttttcag ctaggaagtt tggttgcact 1860 ggccttggac taataactga ttagtcattt tattacattg tttcgacaag tcagtagctc 1920 atccatctgt cccatttttc agctaggaag ttcggatctg gggccatttg ttccaggcac 1980 gggataagca ttcagcc 1997

Claims (20)

  1. 엄격한 조건 하에서 서열식별번호: 1의 상보체에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 포함하는 폴리뉴클레오티드 프로브에 혼성화되는 키메라 폴리뉴클레오티드 서열.
  2. 제1항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 서열식별번호: 1에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 것인 키메라 폴리뉴클레오티드 서열.
  3. 제1항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 서열식별번호: 1을 포함하는 것인 키메라 폴리뉴클레오티드 서열.
  4. 제1항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 서열식별번호: 1로 이루어진 것인 키메라 폴리뉴클레오티드 서열.
  5. 제1항에 있어서, 트랜스진에 작동가능하게 연결된 키메라 폴리뉴클레오티드 서열.
  6. 제5항에 있어서, 트랜스진이 tcdA인 키메라 폴리뉴클레오티드 서열.
  7. 제1항에 있어서, 작동가능하게 연결된 트랜스진이 폴리펩티드 또는 소형 RNA를 코딩하는 것인 키메라 폴리뉴클레오티드 서열.
  8. 제1항에 있어서, 트랜스진의 뿌리-선호 발현을 촉진하는 키메라 폴리뉴클레오티드 서열.
  9. 제8항에 있어서, 뿌리-선호 발현이 메이즈 뿌리-선호 발현을 포함하는 것인 키메라 폴리뉴클레오티드 서열.
  10. 엄격한 조건 하에서 서열식별번호: 1의 상보체에 대해 적어도 90%의 서열 동일성을 포함하는 폴리뉴클레오티드 프로브에 혼성화되는 합성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 트랜스제닉 세포.
  11. 제10항에 있어서, 합성 폴리뉴클레오티드가 서열식별번호: 1에 대해 적어도 90% 서열 동일성을 갖는 것인 트랜스제닉 세포.
  12. 제10항에 있어서, 합성 폴리뉴클레오티드가 서열식별번호: 1을 포함하는 것인 트랜스제닉 세포.
  13. 제10항에 있어서, 식물 형질전환 방법에 의해 생산되는 트랜스제닉 세포.
  14. 제13항에 있어서, 식물 형질전환 방법이 아그로박테리움(Agrobacterium)-매개 형질전환 방법, 바이오리스틱 형질전환 방법, 탄화규소 형질전환 방법, 원형질체 형질전환 방법 및 리포솜 형질전환 방법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 트랜스제닉 세포.
  15. 제10항에 있어서, 합성 폴리뉴클레오티드가 조직-선호 프로모터인 트랜스제닉 세포.
  16. 제15항에 있어서, 조직-선호 프로모터가 뿌리 조직-선호 프로모터인 트랜스제닉 세포.
  17. 제10항의 트랜스제닉 세포를 포함하는 트랜스제닉 식물.
  18. 제17항에 있어서, 단자엽 또는 쌍자엽 식물인 트랜스제닉 식물.
  19. 제18항에 있어서, 단자엽 식물이 메이즈 식물, 벼 식물 및 밀 식물로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 트랜스제닉 식물.
  20. 제17항의 트랜스제닉 식물로부터의 트랜스제닉 종자.
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