MXPA00009573A - Isocorismato sintasa y su uso para la induccion de resistencia en las plantas. - Google Patents

Abstract

Esta invencion describe un metodo para inducir resistencia a patogenos en plantas caracterizado porque las plantas son transformadas con un cassette de expresion que contiene un gen que codifica para la isocorismato cintaza. Mas especificamente, este metodo se caracteriza porque el gen que codifica se selecciona del grupo que consiste en entC, orfA, pchA e ICS, siendo este ultimo preferido del gen ICS de Catharantus roseus. Otra realizacion de la invencion es un metodo de acuerdo con el metodo descrito arriba caracterizado porque las plantas son ademas transformadas con un cassette de expresion que contiene un gen que codifica para una isocorismato piruvato liasa, preferiblemente en el mismo cassette de expresion que el gen codifica para la isocorismato cintaza. El gen que codifica para la isocorismato piruvato liasa es preferiblemente seleccionado del grupo que consiste en orfB y pshB. Otro aspecto de la invencion es una proteina con actividad isocorismato cintaza aislada de Catharantus roseus. Otro aspecto de la invencion es la secuencia de nucleotidos que comprende la region reguladora 5' de la que se sabe que naturalmente regula la expresion del gen los en Catharantus roseus.

Description

ISOCORISMATO SINTASA Y SU USO PARA LA INDUCCIÓN DE RESISTENCIA EN LAS PLANTAS Campo de la Invención Esta invención se relaciona con genes en la vía biosintética del ácido salicílico, más específicamente en la vía del ácido salicílico a través de ácido i socor i smico , y su uso para la inducción de resistencia mediante el ácido salicílico en plantas. Más específicamente, la invención se relaciona se relaciona con el uso de los genes de la isocorismato sintasa (ICS) para la producción de ácido salicílico, específicamente por un nuevo gen vegetal de isocorismato sintasa, más específicamente con el uso de un isocorismato piruvato liasa combinada con la isocorismato sintasa. Además, la invención se relaciona con el uso del promotor del nuevo gen vegetal de isocorismato sintasa como un promotor inducible por patógeno .

Antecedentes de la Invención Ref. 1233^1 Ante el ataque de un patógeno, las plantas pueden reaccionar activando un mecanismo de defensa que actúa a escala local y sistémica. En la respuesta hiper s ens ible (HR) la respuesta local consiste en, entre otras, necr os i s /apopt os i s acelerada de las células, apreciable por la formación de lesiones, y la acumulación de sustancias fenólicas inhibidores de crecimiento (fitoalexinas) y proteínas relacionadas con la patogénesis (PR) . También se observa el refuerzo y el engrosamiento de la pared celular. Esta respuesta de defensa muí t i fact or ial combinada conduce a la restricción del crecimiento y la dispersión del patógeno.

S i s temí cament e , la inducción de proteínas PR, que tienen fuertes efectos ant i -pat ógeno , ocurre después de esta respuesta hipe r sens ibl e , lo cual es la razón más probable para el estado de Resistencia Sistémica Adquirida (SAR) que exhiben las plantas después de la HR . Este estado de SAR puede durar por varias semanas y protege a las plantas de patógenos a los cuales, de lo contrario, resultaría susceptible.

Las vías de señalización involucradas en el desarrollo tanto de la HR como de la SAR se conocen muy pobremente. Estudios tempranos han mostrado que el ácido salicílico (SA) se acumula en cantidades sustanciales tanto local como sistemicamente. También el tratamiento de plantas con SA aumenta el nivel de expresión de genes PR, y aumenta la resistencia de plantas a patógenos, sugiriendo que el que el SA juega un papel crucial en el establecimiento de la SAR (ver por ejemplo, Ryais, Plant Cell 8_, 1809-1819, 1996) .

Se obtuvo aun más evidencia sobre el papel crucial del SA creando plantas transgénicas con el gen nahG de Pseudomonas putida. El producto del gen nahG hidroxila el SA y lo vuelve inactivo. Las plan as de tabaco y Arabidopsis thaliana transgénicas para nahG tienen su capacidad de generar una HR comprometida, observándose que el patógeno crece y se disemina desde su sitio de infección inicial (Gaffney et al, Science 261 , 754-756, 1993; Delaney et al, Science 266, 2147-2150, 1994) . Las plantas transgénicas para nah también producen una SAR defectuosa.

Esta claro, sin embargo, que hay vías alternativas para la inducción de la HR presentes, y la sobre expresión de nahG en tomate no compromete al HR que ocurre después del ataque de plantas Cf9 o Cf2 con razas de Cladosporium fulvum que contienen Avr9 y Avr2, respectivamente (Hammond Kosack & Jones, Plant cell 8_, 1773-1791, 1996) .

Puede verse una revisión del papel del SA en la marca de las enfermedades vegetales en Durner et al, Trends. Plant. Sci. 2, 266-174, 1997; Chasan, Plant cell 7_, 1519-1521, 1995; Klessing & Malamy, Plant Mol. Biol. 26, 1439-1458, 1994.

Breve Descripción de la Invención Esta invención describe un método para inducir resistencia a patógenos en plantas, caracterizado porque en estas plantas se lleva a cabo una transformación con un cassette de expresión que contienen un gen que codifica para una isocorismato sintasa. Más específicamente, este método se caracteriza porque la secuencia que codifica para la isocarismato sintasa se selecciona del grupo que consiste en entC, orfA, pchA e ICS, siendo para este ultimo gen preferible el de Catharantus roseus. Los genes que pueden ser usados para este método se ilustran en SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 17.

Otra realización de la invención es un método de acuerdo con el método descrito arriba, caracterizado porque las plantas son adicionalmente transformadas con un vector que porta un cassette de expresión que contiene un gen que codifica para una isocorismato piruvato liasa, preferiblemente en el mismo vector que el cassette de expresión que comprende el gen que codifica para la isocorismato sintasa. El gen que codifica para la isocorismato piruvato liasa se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en orfD y pchB.

Una realización especifica de la invención es un método como se describe arriba caracterizado porque el gen que codifica isocorismato sintasa es entC y el gen que codifica para la isocorismato piruvato liasa es orfD.

Otro aspecto de la invención es una proteína con actividad isocorismato sintasa que es aislada de Catharantus roseus. Esta proteína tiene un peso molecular de 67 kD. Esta proteína comprende preferiblemente la secuencia de amino ácidos SEQ ID NO: 19. También es parte de la invención una secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína, la cual es preferiblemente una secuencia de nucleótidos con la secuencia de SEQ ID NO: 18.

Otro aspecto de la invención es la secuencia de nucleótidos que comprende la región reguladora 5' de la cual se sabe que regula la expresión del gen ICS en Catharantus roseus. Esta región reguladora puede ser usada como promotor inducible por patógeno que puede inducir la expresión de una proteína que es antifungica, antibacteriana, o antiviral. Ejemplos de tales proteínas son las quitinasas, las glucanasas, las osmotinas, las defensinas, las magaininas, las cecropinas, las ribozimas. Alternativamente tal promotor inducible por patógeno puede ser usado para expresar proteínas deletéreas o genes de resistencia para su uso en una estrategia apuntada a la inducción de una HR (ver WO 91/15585) . Vectores, Agrobacte ia, células vegetales y plantas que comprenden o están transformadas con los genes arriba mencionados forman además parte de la invención .

Descripción de las figuras Figura 1 Representación esquemática del vector pMOG22 GUS ICS.

Figura 2: Northern blot de ARN aislado de plantas transgénicas con las construcciones indicadas (3 líneas transgénicas por construcción) y plantas control hibridizadas con una sonda para PR-la.

Fi gu r a 3 Mapa esquemático con sitios de restricción de la secuencia reguladora del gen isocorismato sintasa de Catharantus roseus.

Descripción Detallada de la Invención Se supone que la biosíntesis de ácido salicílico en plantas se condice mediante la síntesis puede ser ligeramente alterada usando ácido t rans cinámico y su conversión a acido benzoico seguida por 2 - hidroxi 1 ación . En las plantas infectadas, la vía de síntesis puede ser ligeramente alterada usando ácido t r anscí námi co para convertirlo en acido ortocumápco que es luego convertido en ácido salicílico. En microorganismos, la biosíntesis de ácido salicílico se desarrolla desde corismato a isocorismato (catalizada por la enzima isocorismato sintasa, ICS) . Se han clonado los genes requeridos para esta conversión de Pseudomonas aerugmosa (el gen pchA que codifica para actividad ICS, Serino, L: et al, Mol. Gen. Genet. 249, 217-228, 1995) y de Eschepchia coli (el gen entC que codifica para actividad ICS, Ozemberg, B. A. Et al, J. Bacteriol. 171, 775-783, 189) .

Se ha descubierto ahora que, sorprendentemente, el uso de la vía del corismato para producir ácido salicílico puede ser introducido en plantas mediante la transformación de las mismas con un cassette de expresión que contiene un gen que codifica para la isocorismato sintasa. Este gen puede ser derivado de bacterias como los genes pchA y entC identificados arriba, o el gen orfA de Pseudomonas fluorescens, o de plantas en las que se halla encontrado el gen que codifica para la isocorismato sintasa, tal como el gen ICS de Catharantus roseus, como se indica en esta solicitud. También se están investigando otros genes, aun no identificados, para ser empleados en esta invención. Tales genes pueden ser aislados d4e bacterias o de plantas sondeándolas con una sonda degenerada derivada de las secuencias presentes en esta invención.

Aunque se conoce (y también se observa en esta invención) que el ácido salicílico, probablemente debido a su relativa toxicidad, es rápidamente inactivado en plantas (tanto por degradación como por glucos idaci ón ) , todavía se ha podido hallar una concentración aumentada de ácido salicílico después de la transformación de las plantas con genes que codifican para la isocorismato sintasa.

Además, también se ha observado una inducción de proteínas PR, más probablemente causada por la sob eproducción de ácido salicílico, mostrando que el ácido salicílico generado endógenamente puede conducir a la inducción de las plantas a impartir resistencia a patógenos.

Los genes que pueden ser usados en esta invención se ilustran en SEQ ID NO: 13, 15 y 18. Debe comprenderse que las secuencias de nucleótidos que codifican para las enzimas pueden ser alteradas libremente siempre y cuando el producto del gen resultante conserve actividad enzimática de isocorismato sintasa. Los cambios más aparentes son cambios al empleo de codones para adaptarlos a la secuencia de la planta susceptible de ser transformada. También, el polinucleótido usado para la transformación puede ser modificado en motivos que contribuyan a la estabilidad del ARNm y pueden retirarse sitios de corte fortuitos para que la expresión de los polinucleótidos así modificados brinde una enzima substancialmente similar.

Los genes de la invención codifican para proteínas enzimáticamente activas. La palabra proteína sig ifica una secuencia de amino ácidos conectados a través de uniones péptídicas. Los polipéptidos o péptidos también se consideran proteínas. Muteínas de la proteína de la invención son proteínas que se obtienen de las proteínas ilustradas en el listado de secuencia reemplazando, agregando y/o eliminando uno o más amino ácidos, conservando igualmente su actividad enzimática. Tales muteínas pueden ser creadas por ingeniería genética in vivo, por ejemplo, cambiando el marco de lectura abierto capaz de codificar para la enzima de tal manera que se afecta la secuencia de amino ácidos. Mientras los cambios en la secuencia de amino ácidos no destruyan la actividad enzimática de la proteína tales muteínas serán aceptadas en la presente invención. Además, debe entenderse las mutaciones deberían ser derivables de las proteínas o de las secuencias de ADN que codifican para estos productos ilustradas en el listado de secuencias mientras retuvieran actividad biológica, es decir, todos o una buena parte de los intermediarios entre la proteína mutada y la ilustrada en el listado de secuencias deberían tener actividad enzimática. Una buena parte representaría 30% o más de los intermediarios, preferiblemente 40% o más, más preferiblemente 50% o más, más preferiblemente 60% o más, más preferiblemente 70% o más, más preferiblemente 80% o más, más preferiblemente 90% o más, más preferiblemente 95% o más, más preferiblemente 99% o más.

La presente invención provee una secuencia quimérica de ADN que comprende un cassette de expresión de acuerdo con la invención. El término secuencia quimérica de ADN debe interpretarse como cualquier secuencia de ADN que comprende secuencias que no se encuentran normalmente en la naturaleza. Entonces, ADN quimérico debe abarcar secuencias de ADN que comprendan el marco abierto de lectura para la enzima en un sitio no natural del genoma de la planta sin olvidar el hecho de que el genoma de dicha planta contiene normalmente una copia de dicho marco abierto de lectura en un sitio cromosómico normal. De manera semejante, dicho marco abierto de lectura puede ser incorporado en el genoma de la planta en sitios donde no pueda hallárselo naturalmente, o en un vector de replicación donde tampoco se lo halle en la naturaleza, tal como en un plásmido bacteriano o en un vector viral. El ADN quimérico no debería limitarse a las moléculas de ADN que puedan replicarse en un hospedador, sino que debería también abarcar ADN capaz de ser ligado al marco abierto de lectura de un replicón de acuerdo con esta invención, por ejemplo mediante secuencias adaptadoras especificas. El marco abierto de lectura puede o no estar unido a sus elementos de regulación en la dirección 5' y 3' .

El marco abierto de lectura puede ser derivado de una biblioteca de genes. En este caso puede contener uno o más intrones separando a los exones que constituyen el marco abierto de lectura que codifica para la proteína de acuerdo con la invención. El marco abierto de lectura puede estar codificado también por un único exón o por un ADN del ARNm que codifica para la proteína de acuerdo con la invención. Marcos abiertos de lectura de acuerdo con la invención también pueden ser aquellos en que se han agregado o retirado artificialmente intrones. Cada una de estas variantes es abarcada por esta invención.

Para poder ser expresadas en una célula hospedadora, las secuencias de ADN quimérico de acuerdo con la presente invención serán usualmente acompañadas ce elementos regulatorios que les permitan ser reconocidas por la maquinaria bioquímica del hospedador y permitan la correcta t r n s cr ipc i ón / t raducci ón del marco abierto de lectura en el hospedador. Estas secuencias comprenderán comúnmente una secuencia de iniciación de la transcripción que será adecuadamente derivada de cualquier gen capaz de ser expresado en la célula hospedadora elegida, así como una región de iniciación de la traducción para reconocimiento y adhesión de los ribosomas. En células e cariotas, un cassette de expresión comprende usualmente una región de terminación de la transcripción localizada río abajo del marco abierto de lectura, permitiendo que la transcripció termine y ocurra la poliadenilación del transcrip o primario. Además, puede adaptarse el uso de codones al del hospedador elegido. Además comúnmente puede codificarse una secuencia señal que sea responsable de la orientación del producto de expresión del gen hacia compartimentos subcelula es. Los principios que gobiernan la expresión de una construcción de ADN quimérico en una célula nospedadora determinada son comunmente comprendidos por aquellos entrenados en la técnica y la creación de construcciones expresables de ADN quimérico es ahora rutina para cualquier célula hospedadora, sea esta procariota o eucariota.

Para que el marco abierto de lectura pueda ser mantenido en una célula hospedadora debe ser usualmente colocado en forma de replicón que comprenda dicho marco abierto de la lectura de acuerdo con la invención unido a ADN que sea reconocido y replicado en la célula hospedadora elegida. De acuerdo con esto, la selección del replicón es determinada en gran parte por la célula hospedador elegida. Tales principios que rigen la elección de replicones adecuados para un determinado tipo de célula hospedadora son bien conocidos por cualquier persona entrenada en la técnica.

Un tipo especial de replicón es aquél capaz de transferirse, en su totalidad o en parte, a otra célula hospedadora, tal como una célula vegetal, c o t r a n s f i r i e ndo así el marco abierto de lectura de acuerdo con la invención a una dicha célula vegetal. Los replicones con esa capacidad se denominan aquí vectores. Un ejemplo de tales vectores es el plásmido vector Ti que, cuando esta presente en un hospedador adecuado, tal como Agrobacterium tumefaciens, es capaz de transferir parte de si mismo, la denominada región T, a una célula vegetal. Comúnmente se utilizan en la actualidad numerosos tipos de plásmidos vectores Ti (ver EP 0 116 718 Bl) para transferir secuencias de ADN quimérico de células vegetales, o protoplastos, a partir de las cuales pueden generarse nuevas plantas con dichas secuencias de ADN quimérico incorporadas establemente en su genoma. Una forma particularmente preferida de vectores plásmidos Ti es la de los llamados vectores binarios como se describe en (EP 0 120 516 Bl y US 4940838) . Otros vectores adecuados que pueden ser empleados para introducir ADN de acuerdo con la invención en una planta hospedadora pueden seleccionarse entre los vectores virales, por ejemplo, vectores virales no int egr a t i vos , tales como los que pueden ser derivados de virus vegetales con doble cadena (por ejemplo, CaMV), virus con simple cadena, virus gemini y semejantes. El uso de tales vectores puede ser ventajoso, particularmente cuando es difícil transformar la planta hospedadora de manera estable. Este puede ser el caso de las especies leñosas, especialmente arboles y iñas.

La expresión "células hospedadoras que incorporan una secuencia de ADN quimérico de acuerdo con la invención a su genoma" debe comprender a todas las células y organismos multicelulares que las comprenden o que están constituidos por ellas que incorporan de manera estable dicho ADN quimérico en su genoma, manteniendo asi el ADN quimérico y transmitiendo preferiblemente una copia del mismo a células de su progenie, sea por mitosis o por meiosis. De acuerdo con una realización preferible de la invención se proveen plantas que esencialmente consisten en células que incorporan una o más copias de dicho ADN quimérico en su genoma y que son capaces de transmitir una o varias copias a su progenie, preferiblemente de manera mendeliana. Gracias a la transcripción y traducción del ADN quimérico de acuerdo con la invención en alguna o todas las células de la planta hospedadora, aquellas células que produzcan la enzima mostraran mayor resistencia a infecciones por patógenos. Aunque, como se indicó arriba, los principios que gobiernan la transcripción de ADN en las células vegetales no son siempre conocidos, la creación de ADN quimérico capaz de ser expresado en una manera substancialmente continua, esto es, en substancialmente la mayoría de los tipos celulares de la planta y substancialmente sin restricciones serias a escala temporal y/o de desarrollo, es ahora un proceso rutinario. Las regiones de iniciación de la transcripción normalmente usadas con este propósito son promotores que pueden obtenerse del virus mosaico de la coliflor, notablemente los promotores de los transcriptos de ARN 35S y del ARN 19S y los llamados promotores ADN - T de Agrobacterium Tumefaciens, siendo particularmente mencionables el promotor de la nopalina sintasa, el promotor de la octopina sintasa (como se describe en EP 0 122 791 Bl) y el promotor de la manopina sintasa. Además pueden usarse promotores vegetales, como el promotor del gen de la octina del arroz o, por ejemplo, promotores específicos para órganos, tal como el promotor especifico para raíz RolD o el promotor promotor especifico para tubérculos de la patatina de ia papa. Alternativamente pueden usarse promotores inducibles que permitan la inducción de resistencia a patógenos por medio de un factor externo, que puede ser aplicado en un momento adecuado. Se previenen así efectos no deseados, tal como los que pueden ocurrir debido a la relativa toxicidad del ácido salicílico. Los promotores inducibles incluyen cualquier promotor capaz de aumentar el tamaño de los productos de un gen dado en respuesta a un inductor. En ausencia del inductor, la secuencia de ADN no se transcribe. Típicamente, ei factor que se une específicamente con un promotor inducible para activar la transcripción esta presente en una forma inactiva que es luego convertida directa o indirectamente en una forma activa por el inductor. Dicho inductor puede ser un agente químico tal como una proteína, un metabolito (azúcar, alcohol, etcétera) , un regulador de crecimiento, un herbicida un compuesto fenólico o un indicador de estrés fisiológico impuesto directamente por calor, sal, heridas, elementos tóxicos, etcétera, o directamente a través de la acción de un patógeno o de un agente de enfermedad como un virus. Una célula egetal que contiene un promotor inducible puede ser expuesta a un conductor aplicando externamente el inductor a la célula por medió de rociado, regado, calentado o métodos semejantes. Aquellos entrenados en la técnica conocen promotores inducibles y existen varios que pueden ser usados para inducir la expresión de los genes de la invención. Promotores adecuados para su uso de acuerdo con la presente invención incluyen, pero no se limitan a: el promotor inducible por golpe térmico, el sistema receptor de esteroides de los mamíferos y cualquier promotor inducible químicamente. Ejemplos de promotores inducibles incluyen el promotor inducible por golpe térmico de 70kD de Drosophila melanogaster (Freeling, M. Et al, Ann. Rev. Genet. _1_9, 297-323) y el promotor de la alcohol deshidrogenasa que es inducido por etanol (agao, R. T. Et al, en Milflin, B. J, (ed.) Oxford Surveys of Plant Molecular and Cell Biology, Vol. 3, pp. 384-438, Oxford, Univ. Press, 1986) . Un promotor que es inducido por un simple agente químico es particularmente útil. Ejemplos de esta ultima categoría son los promotores descritos en WO 90/08826, WO 93/21334, WO 93/031294 y WO 96/3769. Como ejemplos de promotores inducibles oor patógenos están el promotor PRP1 (también llamado promotor gastl) que pueae conseguirse de la papa (Martini, N. Et al (1993) , Mol. Gen. Genet. 263, 179-186), el promotor Fisl (WO 96/34949), el promotor Bet v 1 (S oboba, I. Et al, Plant Cell and Env. 1_8_, 865-874, 1995), el promotor Vatl (Fischer, R, Disertación, Univ. Fr Hohenheim, 1994; Schubert, R. et al., Plant Mol. Biol. 3 A_, 417-426, 1997) , el promotor de la s e s qui terpeno ciclasa (Yin, S. et al., Plant Physiol. 115 , 437-451, 1997) y el promotor gstA (Mauch, F. Y Dudler, R, Plant Physiol. 102 , 1193-1201, 1993) entre los que pueden mencionarse. Por supuesto, también la región reguladora del gen de Catharantus roseus, que forma parte de esta invención, puede ser usada a este respecto.

La elección del promotor no es esencial, aunque debe mencionarse que se prefieren promotores inducibles. Se conoce además que la duplicación de determinados elementos, llamados mejoradores, pueden mejorar considerablemente el nivel de expresión del ADN subordinado (ver: Kay, R et al, Science 236, 1299-1302, 1987: la duplicación de la secuencia entre -343 y -90 del promotor CaMV 35S aumenta la actividad del mismo) . Además del promotor 35S, mejorado simple o doblemente, otros ejemplos de promotores del alto nivel son el promotor de la subunidad pequeña de la ribulosa bisfosfato carboxilasa inducible por la luz (rbcSSU) y el promotor de la proteína que une clorofila a/b (Cab) . También están contemplados por la presente invención lo promotores híbridos que comprenden elementos de diferentes regiones promotoras unidos físicamente. Un ejemplo bien conocido de los mismos es el llamado promotor de la manopina sintasa mejorado por CaMV (patente de los EEUU 5106739) que comprende elementos del promotor de la manopina sintasa unidos al mejorador del CaMV.

Como se demuestra en los ejemplos que ilustran esta invención, la orientación de las enzimas a organelas en la planta puede mejorar la producción de ácido salicílico. Esto puede ser explicado por el hecho de que el substrato para las enzimas de la invención es abundante en organelas especiales. Brinda resultados especialmente buenos la dirección de las enzimas hacia los cloroplastos usando un péptido señal derivado del tabaco. Por supuesto pueden usarse péptidos señales de otras fuentes .

Considerando la necesidad de una región de ter inación de la transcripción, generalmente se cree que la región mejora tanto la confianza como la eficiencia de la transcripción en células vegetales. El uso de la misma es entonces marcadamente preferible en el contexto de la presente invención.

Considerando la aplicabilidad de la invención en diferentes especies de plantas, debe mencionarse que una realización particular de la invención puede ilustrarse con plantas transgénicas de tabaco y Arabidopsis thaliana, por ejemplo, no limitándose la aplicabilidad real a estas especies de plantas. Cualquier especie de planta que esta sujeta de alguna forma a algún tipo de ataque por parte de patógenos puede ser transformada con genes de acuerdo con la invención, permitiendo que las enzimas sean producidas en varias o todas las células de la planta.

Aunque algunas realizaciones de la invención puede r"o ser practica D les en el presente, por ejemplo, porque algunas especies de plantas son todavía resistentes a la transformación genética, la practica de la invención en tales especies de plantas es meramente una cuestión de tiempo y no de principio, porque la resistencia a la transformación genética como tal no es de relevancia ante la realización subyacente de la invención.

La transformación de especies de plantas es ahora rutina para un número ahora impresionante de especies de plantas, incluyendo mono y dicotiledóneas. En principio puede usarse cualquier método de transformación para introducir ADN quimérico de acuerdo con la invención en una célula ancestral adecuada, siempre y cuando las células sean capaces de regenerar una planta completa. Los métodos pueden ser elegidos entre el método de ca 1 ci o /pol i e 111 engl i col para protoplastos (Krens, F. A. Et al, Nature 296, 72-74, 1982; Negrutiu, I. Et al, Plant Mol. Biol. 8_, 363-373, 1987), electroporación de protoplastos (Shillito, R. D. Et al, Bio/Technol. 3, 1099-1102, 1985) , microinyección en material vegetal (Crossaway, A. Et al, Mol. Gen. Genet. 202 , 179- 185, 1986) , bombardeo de partículas cubiertas con ADN o ARN sobre material vegetal variado (Klein, T. M. Et al, Nature 327 , 70, 1987) , infección con virus (no integrativos) y semejantes. Un método preferible de acuerdo con la invención comprende la transfere cia de ADN mediada por Agrobacterium. Se prefiere especialmente el empleo de la llamada tecnología de vectores binarios como se describe en EP A 120 516 y la patente de los EEUU 4, 940,838.

La transformación del tomate es preferiblemente hecha como se describe en Van Rokel et al (Plant Cell Rep. 1_2, 644-647, 1993) .

La transformación de la papa es preferiblemente hecha como se describe en Hoekma et al (Hoekma, A. Et al, Bio/technology 1_, 273-278, 1989) . Generalmente, después de la transformación se seleccionan células o grupos de células vegetales en base a la presencia de uno o más marcadores que son codificados por los genes expresables de la planta cot ran s fer i dos con la secuencia de ácido nucleico que codifica para la proteína de acuerdo con ia invención. Luego, el material transformado de regenerado en una planta completa.

Aunque consideradas más resistentes a la transfo ación genética, las plantas monocotiledóneas son susceptibles a ser transformadas, pudiendo regenerarse plantas transgénicas fértiles a partir de células, embriones u otro material vegetal transformado. Actualmente los métodos preferidos para la transformación de monoco iledóneas son el bombardeo con mi c r i op r oyec t i 1 e s de embriones, explantos o suspenciones de células, y la toma directa de ADN o electroporación (Shimamoto et al, Nature 338 , 274-276, 1989) . Se han obtenido plantas de maíz transgénico introduciendo el gen barra de Streptomyces hy roscopicus, que codifica para la fosfinotricina acetiltransferasa (una enzima que inactiva el herbicida fosfinotricina ) en células embriogénicas de una suspención de un cultivo de maíz por bombardeo con microproyectiles (Gordon-Kamm, Plant Cell, 2_, 603-618, 1990) . La introducción de material genético en protoplastos de aleurona u otros cultivos de monocotiledóneas tales como trigo y cebada también ha sido reportada (Lee, Plant Mol. Biol. 1_3, 21-30, 1989) . Se han regenerado plantas de trigo a partir de cultivos de suscenciones embnogemcas seleccionando solamente los tendos de callos embr i o j en i co s mas viejos compactos y nodulares para el establecimiento de cultivos de suspencion embpogenica (Vasil, Bio/Technol. 8_, 429-434, 1990) . La combinación con sistemas de transformación para estos cultivos permite la aplicación de la presente invención en monocotiledoneas .

Las plantas monoco t i 1 edonea s , incluyendo comercialmente importantes como arroz o maíz son también susceptibles a la transferencia de ADN por cepas de Agrobacterium (ver WO 94/00977; EP 0 159 418 Bl; Gould, J. Et al, Plant Physiol. 95, 426-434, 1991) .

Terminada la tra sferencia de ADN y la regeneración puede evaluarse a las plantas supuestamente transformadas usando, por ejemplo, análisis de Southern, en busca de la presencia del ADN quimérico de acuerdo con la invención, numero de copias y/u organización genomica. Ademas, o alternativamente, pueden medirse los niveles de e?pres_on del n u e */o ADN introducido usando análisis de Northern o Western, técnicas bien conocidas para personas entrenadas en ia técnica. Después del análisis m-cial, que es opcional, las plantas t r an s f ormaaa s con el numero de copias y el nivel de expresión deseado del nuevo ADN quimérico introducido pueden ser evaluadas respecto de sus niveles de resistencia contra patógenos. Alternativamente, las plantas seleccionadas pueden ser sometidas a otra sesión de transformación, por ejemplo, para introducir otros genes de manera de mejorar los niveles de resistencia o aumentar la misma.

Otras evaluaciones pueden incluir la evaluación de resistencia patogénica a campo abierto, verificando fertilidad, rendimiento t otras ca acterísticas. Tal evaluación es ahora llevada a cabo rutinariamente por personas con conocimientos comunes en la técnica.

Después de tales evaluaciones, las plantas transformadas pueden ser cultivadas directamente, pero comunmente pueden ser usadas como lineas parentales en la creación de nuevas variedades o en la creación de híbridos y semejantes.

Para obtener plantas transgénicas capaces de expresar constitutivamente más de un gen quimérico existen varias alte nativas, incluyendo las siguientes : A. Eí uso de ADN, por ejemplo, ADN - T en un plásmido binario, con un número de genes modificados físicamente unidos al gen del marcador selectivo. La ventaja de este método es que los genes quiméricos están físicamente unidos y así migran como un único locus mendeliano.

B. La polinización cruzada de plantas transgénicas capaces de expresar uno o más genes quiméricos, preferiblemente unidas a un gen marcador selectivo, con polen de una planta transgénica que contiene uno o más genes quiméricos unidos a otro ma cador selectivo. Luego, la semilla obtenida mediante este cruzamiento puede ser seleccionada en base a la presencia de ambos marcadores, o en base a la presencia de los genes quiméricos en si. Las plantas obte idas de ias semillas seleccionadas pueden ser usadas para cr zamiento adicionales en principio, los genes quiméricos no están en un mismo locus y pueden segregar entonces como loci independientes .

C_. El uso de un_ número o una pluralidad de moléculas de ADN quimérico, por ejemplo, plásmidos, cada uno con uno o más genes quiméricos y un marcador selectivo. Si la frecuencia de cotransformación es alta, entonces, la selección sobre la base de un solo marcador es suficiente. En otros casos se prefiere la selección en base a más de un marcador. _D. La transformación consecutiva de plantas transgénicas que ya contienen un primer, un segundo, etcétera, gen quimérico con el nuevo ADN qui érico, que comprenden opcionalmente un gen marcador selectivo. Como en el método B, los genes quiméricos no están en principio en un mismo locus, pudiendo segregar como loci independientes.

La combina ción de las estrategias mencionadas arriba.

La estrategia real puede depender de diversas consideraciones como puede determinarse fácilmente de acuerdo con el propósito de las líneas parentales (cultivo directo, uso en un programa de crianza, empleo para producir híbridos) pero no es critica respecto de la invención descripta.

En este contexto debe enfatizarse que las plantas que ya contienen el ADN quimérico capaz de codificar para una enzima de la vía del ácido isocorismico pueden formar un marco genético adecuado para introducir ADN quimérico de acuerdo con la invención, por ejemplo para mejorar la producción de SA, mejorando entonces la capacidad de introducción, mejorando así los niveles de resistencia. El clonado de otros genes correspondientes a proteínas que pueden ser adecuadamente en combinación con ADN y la obtención de plantas transgénicas capaces de sobre expresar relativamente el mismo, así como la evaluación de su efecto en la resistencia -a patógenos in planta, esta ahora dentro del conocimiento de cualquiera entrenado en la técnica .

Pueden cultivarse en el campo, el invernadero en el hogar u otros lugares plantas o partes de las mismas con relativa sobre expresión de ácido salicílico de acuerdo con la invención, incluyendo variedades de plantas con resistencia mejorada contra patógenos. Pueden usarse para consumo humano o de animales las plantas o las partes comestibles de las mismas, pudiendo también ser procesadas como comida, alimento y otros propósitos en cualquier forma de agricultura o industria. Agricultura supone además horticultura, arbori cul tur a , floricultura y semejantes. Las industrias que se beneficiaran del material vegetal de acuerdo con la invención incluyen pero no se limitan a 'la industria farmacéutica, la industria de manufactura de pulpa y papel, la industria azucarera, la industria de alimentos y comidas, 1 industria de manufactura de enzimas y seme jantes .

Las ventajas de las plantas o partes de las mismas de acuerdo con la invención son la menor necesidad de biocidas, disminuyendo el costo del material, trabajo y contaminación ambiental, prolongando además la vida de almacenamiento de los productos (por ejemplo, frutas, semillas y semejantes) de tales plantas. Plantas para el propósito de esta invención debe abarcar cualquier organismo multicelular capaz de hacer fotosíntesis y sujeto a alguna forma de ataque patogénico. Deben al menos incluirse las angiospermas así como las gimnospermas, las plantas mono y dicotiledóneas .

La frase "plantas que con relativa sobre expresión de una enzima" debe entenderse como plantas que contienen células que expresan una enzima codificada por un transgen que esta o no presente en dicha planta, o si está presente en virtud de un gen endógeno que codifica para una enzima idéntica, no en la misma cantidad o no en la misma célula, compartimento celular, tejido u órgano de la planta.

Otro aspecto de la invención es la secuencia reguladora presente naturalmente en la región naturalmente no transcrita 5' del gen ICS de Catarantus roseus. Se ha hallado que ante la infección de un patógeno, el gen ICS se expresa en gran medida, indicando induct íbi 1 idad por patógeno. Los promotores inducibles por patógeno (tal como el promotor prpl descrito arriba) tienen gran valor en el desarrollo biotecnológico de resistencia Un ejemplo de proteínas que pueden ser usadas en combinación con la región reguladora ICS de acuerdo con la invención incluyen, pero no se limitan a: ß- 1 , 3 -gl ucana sa s y quitinasas disponibles de cebada (Swegle, M. Et al, Plant. Mol. Biol. 1_2, 403-421, 1989); Balance, G. M. Et al, Can J. Plant Sci. 56, 459-466, 1976; Hoj P. B. -et al., FEBS Lett. , 230, 67-71, 1988; Hoj P. B. et al., Plant Mol. Biol 13, 31-42, 1989), poroto (Bolier T. Et al., Planta 157, 22-31, 1983; Broglie K. E. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 6820-6824, 1986; Vógeli U. Et al., Planta 174, 364-372, 1988); Maunch F. & Staehelin L.A., Plant Cell 1, 447-457, 1989); pepino (Metraux J.P. & Boller T., Physiol. Mol. Plant Pathol. 28, 161-169, 1986); puerro (spanu P. Et al., planta 177, 447-455, 1989); maize (Nasser W. Et al., Plant Mol. Biol. 11, 529-538, 1988), avena (Fink W. Et al., Plant Physiol. 88, 270-275, 1988) ; arveja (Mauch F. et al., Plant Physiol. 76, 607-611, 1984; Mauch F. et ai, Plant Physiol 87, 325-333, 1988); poplar (Parsons, T.J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 7895-7899, 1989); papa (Gaynor J.J., Nucí. Acids Res. 16, 5210, 1988; Kombrink E. et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 85, 782-786, 1988; la fñamme D. And Roxby R., Plant Mol. Bioi. 13, 249-250, 1989); tabaco (por ejemplo, La grand M. Et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 6750-6754, 1987; Shinshi H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 89-93, 1987); tomate (Jooste M.H. A. & De Wit P.J.G.M., Plant Physiol. 89, 945-951, 1989); trigo (Molano J. et al., J Biol Chem 254, 4901-4907, 1979); magaininas, lectinas, toxinas aisladas de Bacillus thuringiensis, Proteínas antifúngidas aisladas de Mirabilis jalapa (EP 0 576 483) y Amaranthus (EP 0 593 501 and US 5, 514, 779), proteínas albuminoides (tales como tionina, napina, inhibidor de la tripcina de la cebada, gliadina del cereal y alfa amilasa del trigo, EP 0 602 098) , proteínas aisladas de Raphanus, Brassica, Sinapis, Arabidopsis, Dahlia, Cnicus, Lathyrus y Clitoria (EP 0 603216) , oxalato oxidasa (EP o 636 181 y EP 0 673 416), sacárido oxidasa (PCT/EP 97/04923), proteínas antimicrobianas aisladas de semillas de Allium y proteínas de Aralia e Impatiens (WO 95/24485), y semejantes.

Otro uso del promotor inducible es la inducción de proteínas que juegan un papel en ia interacción entre genes para la resistencia (por ejemplo, como se describe en WO 91/15585) . Tales proteínas son, por ejemplo, proteínas vegetales como se describe en Karrer, E. E. et al (plant Mol. Biol. 3_6, 681-690, 1998), ndrl y edsl, proteínas Cf y Pto del tomate, la proteína deletérea avr de Cladosporium Fulvum y la proteína avrPto de Pseudomonas.

Un clon con el plásmido pMOG1431 con un inserto que contiene la región reguladora ICS de acuerdo con la invención fue depositado bajo el número 101670 en el Central Bureau voor Schimmelcul tures en Baam, Holanda el 19 de Marzo de 1999.

Por los ejemplos puede apreciarse que un fragmento de aproximadamente 2kb del promotor como se lo indica en SEQ ID NO: 25 ya muestra las propiedades inducibles. Este fragmento de 2kb puede ser obtenido cortando la secuencia de SEQ ID NO: 25 en los sitios Xhol y Ncol, formando la parte de nucleótidos número 1118 a 3275 de SEQ ID NO; 25. Se advierte que este fragmento puede ser truncado adicionalmente y aun mantener la inductibiíidad .

Puede tomarse en consideración las siguientes muestras de la técnica especialmente para ilustrar el nivel general de entrenamiento en la técnica que requiere esta invención. EP-A 392 225 A2 ; EP-A 440 304 Al; EP-A 460 753 A2 ; WO 90/07001 Al; patente de los EU 4940840.

Evaluación De Las Plantas Transgénicas Las plantas subsecuentemente transformadas son evaluadas en busca de la presencia de las propiedades y/o para verificar cuanto se expresan las mismas. Una primera evaluación puede incluir el nivel de expresión de los genes introducidos, el nivel se SA expresado, el nivel de inducción de proteínas PR, la resistencia al patógeno de las plantas transformadas, la heredabi 1 idad estable de las propiedades deseadas ensayos de campo semej antes Seguidamente, si se desea, las plantas t ansformadas pueden cruzarse con otras variedades, por ejemplo, variedades de mayor valor comercial o variedades en las cuales ya se hayan introducido las características deseadas, o usadas en la creación de semillas híbridas, o someterlas a otra sesión de transformación, y semejantes.

Parte Experimental Los métodos comunes para el aislamiento, la manipulación y la amplificación de ADN, así como los vectores adecuados para la replicación de ADN recombinante, las cepas adecuadas de bacterias, los marcadores de selección, los medios y semejantes están descritos en Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press; DNA Cloning: Volúmenes I y II (Ediciones D. N. Glover, 1985); y en : From Genes to Clones (Ediciones E. -L. WinnacKer, 1987) .

Ensayo de Actividad de Isocorismato Sintasa La mezcla de incubación (volumen total de 250 µl) contenía Tris HCl 0,1 M pH 7,5, corismato 2 mM , MgCl2 10 mM y extracto de enzima (extractos crudos, 125 µl, 10 a 100 µl de fracciones de columna) . Se comenzó la incubación agregando corismato. Después de incubar por 60 minutos a 30°C se detuvo la reacción agregando 62,5 µ1 de met anol -i sobt anol (l a l v/v) . Las muestras fueron centrifugadas y analizadas por HPLC de acuerdo con Poulsen, C. et al Phytochem. 30, 2873+2878, 1991) .

EJEMPLO 1 Purificación de ICS de Catharantus Roseus Se obtuvieron cultivos de células de Catharantus roseus (L) G. Donde en medio MS (uranshigue y Skodg, 1962), agregándoles 30 g/1 de sucrosa como se describe previamente (Moreno, P. et al., Plant Cell Rep. 12_, ,702-705, 1993) . Los cultivos fueron tratados con filtrado de Pythium aphaniderma tum (CBS, Baam, Holanda) como se describe en Moreno et al. (1993) . Las células fueron cosechadas por succión 24 horas después del tratamiento, lavadas una vez con agua, inmediatamente congeladas en nitrógeno líquido y guardadas a -80°C. se homogeneizaron 600g de células congeladas en un Waring Blender equipado con una cubeta de acero inoxidable. Se agregaron 1 ml de solución amortiguadora de extracción (Tris-HCl 0,1 M pH 7.5, glicerol 10% (v/v), DTT 1 mM , PMSF 0.2 mM leupeptina 10 mM EDTA 1 mM ) y 50 g de pol i vini lpir rol idona por gramo de peso fresco. Después de descongelar, el homogenato fue centrifugado a 10,000 G por 30 minutos para retirar los desechos celulares. El sobrenadante se deno inara extracto crudo. Las siguientes operaciones fueron llevadas a cabo a 4°C. el extracto crudo fue retirado por filtración a través de un tamiz de fibra de vidrio de 200µm. el filtrado fue concentrado y desalado usando una u idad de ultrafiltración de flujo tangencial (Povario, Pal- Filtron, Breda Holanda) equipada con una membrana recortable de 30 kD. Se agrego sulfato de amonio al extracto desalado hasta 30% de saturación. Después de revolver por 20 minutos se retiró la proteína precipitada mediante centrifugación a 10,000 G por 30 minutos. Se agregó sulfato de amonio adicional al sobrenadante hasta 60% de saturación, ía proteína precipitada fue colectada por centrifugación a 10,000 G por 30 minutos. El precipitado fue disuelto en 50 ml de solución amortiguadora A ( t riet anol amina -HC I 20mM pH 7.5, glicerol 101 (v/v) , DTT 1 mM y PMSF 0.2 mM) agregándose KCl sólido hasta una concentración final de 2 M. la precipitación con sulfato de amonio tuvo un buen rendimiento y un fraccionamiento repetible sin perdida sustancial de actividad ICS. Después de centrifugar a 13,000 G por 15 minutos, el sobrenadante fue colocado sobre una columna de fenil sefarosa CL-4B (72 ml, 2.6 x 13.5 cm) equilibrada en solución amortiguadora B (solución amortiguadora A + KCl 2 M) . Después de lavar la columna con 300 ml de solución amortiguadora B, se eluyó la actividad ICS con un gradiente lineal de 700 ml de solución amortiguadora B a solución amortiguadora A, seguidos por 150 ml de solución amortiguadora A con un flujo de 1 ml/min. Se colectaron fracciones de 10 ml . Se agruparon las fracciones con actividad ICS, concentrándoselas con una unidad de ultrafiltración. El concentrado fue desalado mediante filtración en gel sobre columnas Sephadex G-25 (columnas PD-10, Pharmacia, Upsala) equilibradas en solución amortiguadora A y aplicado sobre una columna de 20 ml Blue A. Después de la aplicación el flujo fue detenido por media hora para permitir la unión. La columna fue lavada con 40 ml de soiución amortiguadora A, eluyéndose la ICS con un gradiente de 160 ml de solución amortiguadora A a 50% de solución amortiguadora B. la cromatografía de afinidad por tinturas en una columna Blue A resultó un paso crucial de purificación, obteniéndose un aumento de 15 veces en la actividad especifica. Las fracciones con actividad ICS fueron agrupadas, concentradas y desaladas en columnas PD-1 equilibradas con solución amortiguadora C ( trietilamina-HCI 20 mM pH 8.0, glicerol 5% (v/v) y DTT 1 mM ) . La muestra desalada fue colocada en una columna mono Q HR 5/5 equilibrada en solución amortiguadora C. la columna fue lavada con 16 ml de solución amortiguadora C y la ICS fue eluida con un gradiente de 80 ml de solución amortiguadora C a solución amortiguadora D (solución amortiguadora C + KCl 0.5 M) . el flujo fue de 0.5 ml/min y se colectaron fracciones de 0.5 ml . En esta columna, la actividad ICS fue separada en dos picos (ICS I y II) . Las actividades especificas fueron aumentadas 532 y 754 veces con relación al extracto crudo para ICS I y II, respectivamente. La relación de actividad entre ICS I y II fue de 1 a 2, un número hallado en diversas purificaciones independientes. La reinyección de ICS a cualquiera de ambas resultó en la ocurrencia de solamente la ICS inyectada en el c roma tógr ama . PAGE nativa de fracciones de Mono Q mostraron que ICS todavía contenía impurezas, mientras que ICS II había sido obtenida de forma pura. SDS-PAGE de ICS II reveló que esta proteína es de aproximadamente 67 kD.

Carac erización Bioquímica Ambas isoformas mostraron una dependencia idéntica del pH con un amplio pH óptimo entre 7.0 y 9.0, y 50% de la actividad máxima a pH 6.5 y 10. La presencia de Mg"' fue esencial para la formación del producto. Incubaciones separadas con iones divalentes distintos de Mg2+ a una concentración de lOmM no sostuvieron la actividad enzimática de cualquiera de las isotermas. La actividad ICS de ambas isoformas no fue inhibida por la presencia de tirosina, fenilelamna o triptofano en la mezcla de ensayo.

Ambas isoformas mostraron cinética de Mi c h a e 1 i s -Me n t en para el corismato. Los valores de Km para el corismato fueron 558 5 µM y 319 l µM para ICS I y II, respectivamente. Se obtuvieron típicas curvas de saturación para la actividad de la enzima en ambas isoformas en función de la concentración de MG~+. Las curvas de saturación para g~t mostraron cinética de Mi chae 1 i s -Ment en con valores de 1.27+0.36 mM (ICS I) y 1.63+0.12 mM ( ICS II ) .

EJEMPLO 2 Clonación del Gen De ICS de Catharantus Roseus La banda de proteína que contenía ICS II fue aislada de un gel de PEGE nativa y digerida con tripsina, lo que resultó en la obtención de unos 50 péptidos. Se aislaron y secuenciaron cinco péptidos. Uno de ellos mostró alta homología con secuencias bacterianas de ICS. Entonces, se decidió elaborar un cebador degenerado para este péptido. Una PCR sobre una biblioteca de ADNc de cultivos celulares tratados de C. roseus usando este cebador y el cebador T7 resultó en la obtención de un fragmento de 520 pb . Este fragmento fue clonado y secuenciado. Un fragmento de 440 pb del ADN amplificado fue usado para sondear una biblioteca de ADNc de los cultivos tratados de C. roseus. La revisión de 450,000 placas positivas independientes. Doce de ellas fueron aisladas y sometidas a un segundo sondeo con la misma sonda de 400 pb. Esto resultó en la identificación de 7placas positivas independientes. Estas fueron recortadas in vivo y secuenciadas parcialmente. El clon más largo tenía insertos de 2.1 kb y contenía el codón de iniciación ATG. La región alrededor del primer ATG (TCCAATGGC) se parece en gran medida a la secuencia de iniciación consenso en plantas (Lútcke et ai, EMBO J. 6, 43-48, 1987) . El ADNc con una longitud completa de 2081 pb contenía un marco abierto de lectura de 1743 nucleótidos que codificaban para una proteína de 581 amino ácidos. La masa molecular calculada fue de 64 kD y el punto isoeléctrico, 1.88. la proteína es superficialmente 30% idéntica (40%homóloga) con las ICS bacterias con más homología en la región C te rmina 1.

Construcción De Un Plásmido Que Contiene ICS Bajo El Control De Un Promotor Heterólogo El ADNc de ICS fue clonado entre los sitios EcoRI y Xhol en pBluescppt II SK (Stratagene, CA EEUU) . Se ligó un fragmento de 2 kb BamHI-Xhol que contenía el ADNc completo al vector plC-20H digerido con Bglll y Salí. Otra digestión parcial con HindIII liberó el fragmento de 2kb, siendo este clonado en el vector pMOG843 digerido con HindIII. Esto coloca las secuencias codificantes ICS río abajo del promotor CaMV 35S, precediendo las secuencias de terminación PI-II de la papa. El plásmido es llamado pMOG843-ICS.

Construcción De Un Vector Binario Que Contiene El Cassette De Expresión ICS Primero se introdujo un cassette promotor 35S-GUS- t ermi na t or nos en un vector binario pMOG22. Esto fue hecho mediante la digestión de pMOGlOl con Xbal y EcoRI, lo que libera el fragmento de 2.6 kb que con iene el cassette de expresión, y el ligado de este fragmento con pMOG22 digerido con Xbal y EcoRl. El vector resultante es pMOG22-GUS. Subsiguientemente, el cassette de expresión ICS fue clonado en pMOG22-GUS. Esto fue logrado mediante la digestión parcial de pMOG843-ICS con Xbaly el ligado del fragmento de 3.2 kb en pMOG22-GUS digerido con Xbal. El plásmido resultante es pMOG22-GUS-ICS .

El vector binario pMOG22 -GUS - I CS fue movilizado en la cepa de Agrobacterium tumefaciens LBA4404 usando cruza iento triparental. Se llevó a cabo la transformación de tabaco esencialmente como se ha descrito (Horsch et al., 227, 1229-1231, 1985) usando higromicina como marcador selectivo .

EJEMPLO 3 Cons rucciones entC/orfD La secuencia codificante entC (Ozemberg et al., Bacteriol. 171, 775-783, 1989) fue aislada usando una estrategia de PCR en una biblioteca de ADN genómico de Escherichia coli. Con este proposito se usaron los cebadores 1 (SEQ ID NO: 1) y 2 (SEQ ID NO: 2) . Estos amplificaron la región codificante entera de entC y se agregaron un sitio BamHl extra en ambos extremos. Este fragmento fue clonado en el vector pMOG843 en el cual se introdujo un sitio de BamHl merced a una secuencia adaptadora en el sitio de HindIII. El resultante pMOG 834 B-entC contiene las secuencias que codifican para entC ligadas al promotor 35S CaMV ^ seguidas de una secuencia 3' no traducida PI-II de la papa. El cassette 35S-entC-PI fue luego movilizado en plC20H mediante digestión con Xbal y clonado en el sitio Xbal de plC20H. se uso digerido parcial de plC20H. entonces, el cassette esta en el sitio Xbal flanqueado por el stio EcoRV. El vector resultante es denominado plC20H-entC .

Se aislo un peptido de transito para cloroplasto (llamado ss, Mazur y Chuí, Nucí. Acid Res. 13, 2373-2386, 1985) de ADN genomico de tabaco usando los cebadores 3 (SEQ ID NO: 3) y 4 (SEQ ID NO: 4) . El cebador 3 contiene un sitio kpnl que fue usado para introducir el peptido de transito enfrente del gen entC. El vector plC20H- entC fue dirigido con el Ncol, seguido de la eliminación de los sitios adhesivos, y luego digerido con Kpni. El producto PCR fue digerido con Kpní y clonado en este vector. El vector resultante plC20H-entC+ss contiene el peptido de transito en marco con las secuencias codificantes entC, careciendo de los primeros 36 nucleótidos de la secuencia entC. Dicho entC truncado es aun completamente activo.

La secuencia orfD de Pseudomonas fluorescens fue amplificada usando los cebadores 5 (SEQ ID NO: 5) y 7 (SEQ ID NO: 7) de manera de crear una fusión de las secuencias codificantes orfD con las del péptido de transito. Se emplearon los cebadores 6 (SEQ ID NO: 6) y 7. Se amplificó la señal de dirección a cloroplasto de la Rubisco de ADN genómico de tomate usando los cebadores 3 y 8 ( SEQ ID NO : 8 ) .

Los fragmentos amplificados obtenidos con los juegos cebadores 6/7 y 3/8, respectivamente, fueron digeridos con Ndel, ligados y vueltos a amplificar usando los juegos de cebadores 3 y 7. El fragmento resultante de PCR tiene las secuencias orfD fusionadas en marco respecto del peptido de transito. Este se denomina orfD+ss. Tanto los productos de orfD+ss fueron digeridos con Kpnl y BamHl y ligados a pMOG843B digerido con Kpnl y BamHl. Los cassettes de expresión resultantes fueron movilizados en vectores binarios pMOG800 usando los sitios EcoRI y Xbal. Esto resultó en dos vectores binarios denominados pMOGdOO-orfD y pMOG 800 - or f D- s s .

Finalmente se agregaron las secuencias entC. El vector plC20H- entC+ss fue digerido con Xbal y Seal, y el fragmento de Xbal que contiene el cassette de expresión fue ligado a pMOG800, pMOG800-orfD y pMOG 800 -o r f D- s s digeridos con Xbal para crear las siguientes construcciones: pMOG800-entC + ss pMOG800-entC+ss+orfD pMOG800-entC+ss+orf D+ss Los cinco vectores binarios fueron transformados en la cepa de Agrobacterium tumefaciens LBA 4404 por medio de electrotrans formación. La transformación en tabaco (Samsun NN) fue llevada a cabo como se ha descrito usando selección por kanamicina.

EJEMPLO 4 Análisis De Transformantes , Ac ividades Enzimáticas Se cultivaron plantas transgénicas de tabaco Samsun NN bajo regímenes de luz de 16 h a 23-25°C. se tomaron muestras de hojas de estas transformantes primarias y se las mantuvo a -80°C hasta uso posterior.

Para la determinación de las actividades enzimáticas se emplearon los extractos de isocorismato sintasa e isocorismato piruvato liasa de plantas con las construcciones entC+orf D y entC+or f D+s s . Los extractos de proteínas fueron hechos esencialmente como se ha descrito (Moreno et al., Plant Cell Rep. 14, 188-191, 1994) usando 2.5g de material de hojas y 2.5 de solución amortiguadora de extracción. El desalado fue llevado a cabo usando una solución amortiguadora con Tris-Cl lOOmM (pH=7.5) suplido con DTT 1 mM .

Se midió la actividad de isocorismato sintasa como se ha descrito (Poulsen et al., Phytochem. 30, 2873-2876, 1991) . Se unieron un detecto fluorescencia y un integrador al HPLC para permitir la cuantificación de SA (ver más abajo) . El detector de emisión fue fijado a 407 nmde longitud de onda, la longitud de onda de excitación es 305 nm .

La incubación de ambos extractos con Ba-corismato a la formación de isocorismato y SA, indicando que las enzimas son producidas en una forma activa, sin importar la presencia del péptido de transito.

Análisis De Transformantes , Acumulación De Ácido Salicílico Tres transformantes primarias hechas con cada una de las construcciones fueron analizadas en busca de la acumulación de SA libre y unido. Se emplearon como controles positivos y negativos, respectivamente, plantas de tabaco Samsun NN infectadas con TMV (2 días después de la infección) y plantas sin tratar. Se usó una versión modificada del protocolo descrito por Mewly y Metraux (Anal. Biochem. 214, 500-505, 1993) . Se molieron apro imadamente 0.5g de tej-ido de hojas en nitrógeno líquido, ex rayéndoselos con 1 ml de metanol 90% por medio de incubación en un baño en sonificador por 5 minutos. Luego, la mezcla fue centrifugada por 5 minutos en una centrifuga de tabla a 13,000 rpm. El sobrenadante fue retirado y el precipitado reextraido con 0.5 ml de metanol 100% usando el procedimiento señalado arriba. Las fracciones de sobrenadante fueron combinadas y secadas. El residuo fue suspendido en 250 µl de TCA en agua, agitado y colectado el sobrenadante, extrayéndoselo dos veces con 800 µl de etilacetato: ciciohexano (1 a 1 v/v) , después de lo cual se secó la fase orgánica. El residuo fue luego disuelto en 400 µl de solución amortiguadora de Na -ace t a t oO .1 M (pH=5.0) con metanol 10%. Antes de la inyección a una columna de HPLC, la muestra fue centrifugada brevemente y el sobrenadante fue transferido a un nuevo tubo. Para determinar la cantidad de SA-glucósido se acidifico la fase acuosa agregando igual volumen de HCl 8 M. Luego, la mezcla fue incubada a 80°Cpor 1 hora. Luego esta hidrólisis acida, se extrajo el SA usando etilacetato: ciciohexano procesado por HPLC, como se describe arriba .

Se inyectaron muestras de 20 µl en la columna. Se uso una columna de fase reversa Lichrosper 60 RP Select B (5 µm) de 125 mm x 4 mm -(Merck, Darmstadt, Alemania) . En la primera pueva se usaron un monitor de fluorescencia de HPLC Shimedzu RF-530 y un integrador Chrompack K-001 para cuantificar los niveles de SA. En una segunda prueba se usaron un monitor de fluorescencia de HPLC Shimadzu RF-lOAxl y un integrador Chrompack K-001. El eluyente de HPLC es amortiguador de acetato 0. ÍM (pH=5.0), metanol al 10%. La relación de flujo empleada fue de 0.9 ml/minuto.

Los resultados se indican en la Tabla 1. Se observa acumulación sustancial de SA unido en plantas con entcss + orfd y entcss+ orfdS5. En las plantas con la ultima construcción se detecto aun más SA libre, especialmente a bajos niveles. Se vio algún aumento en el SA unido en plantas transformadas solamente con entcss. No se observo SA libre cuando se transformo solamente con orfd.

TABLA 1 : Acumulación de SA en un gramo de material de noja de ransformantes primarias, SA libre después de la hidrólisis .

Plantas que µg de SA µg de SA µg de SA µg de SA fueron libre por g libre por g unido por g libre por g analizadas de material de material de material de material de hoja RF- de hoja RF- de hoja RF- de hoja RF- 10x1 530 lOAxl 530 Ente- 15 0.09 Ente - 5 0.14 Ente. 14 Orfd 18 0.87 Orfd 4 0.20 Orfd 9 Orfd. 10 Orfd., 22 Orfd._ 1 1.01 Entc^+orfd4 + 0.01 Entc.+orfdll 0.80 0.84 Ente. +orfdl3 0.08 0.043 Entc.,-+orfd4 0.25 0.41 0.18 Ente +orfdl6 0.93 +0.01 6.49 7.36 Entc ,+orfd20 0.37 4.39 6.10 Infectado con - 0.75 6.22 TMV 2 Tabaco 0.41 Control 1 Tabaco control 2 P12 nt 0.97 Nt EJEMPLO 5 Ensayo De Infección De Plantas De Tabaco Transgénico Con Virus De Mosaico Del Tabaco (TMV) Se ensayo la capacidad de inhibir la dispersión de un virus- patogénico para plantas en planta de tabaco transformadas con las construcciones bacterianas entC y/u orfD (descritas en los ejemplos 3 y 4) . Se inocularon 3 plantas por construcción, 8 plantas por línea y 4 por planta con una suspención con 1 µg/ml de TMV.

Se incluyeron como control plantas transgénicas de tabaco P12. La inoculación fue llevada a cabo frotando las plantas con polvo de carborundum y la suspención de virus. Después de la inyección las hojas fueron lavadas con agua para eliminar el polvo. El tamaño de la lesión (8 lesiones por hoja) fue medido 2, 4 y 7 días después de ia i oculación .

Los datos fueron analizados y procesados usando una prueba de ANOVA de un factor (a=0.05, SPSS) . El tamaño de la lesión en las plantas esta expresado como porcentaje del tamaño de la lesión en las plantas de tabaco control P12.

TABLA 2: Representación del diámetro de la lesión medido en plantas de tabaco transgénico en comparación con el diámetro medido en las plantas control P12.

Línea de T = 2 T= 4 T = 7 planta P12 100 100 100 E n t c + o r f ds s 4 57.3 44.6 45.7 Entc+orfdsslß 53.3 36.4 37.7 Entc+orfdss20 56.7 40.8 51.8 Entc+orf d4 94.3 94.3 90.1 Entc+orfdll 84.0 85.7 89.4 Entc+orf dl3 90.7 87.6 88.5 Entc5 97.6 101.4 92.7 Entc8 .21.8 91.7 85.6 En t c 13 110.1 96.2 93.3 Orf d5 107.9 99.5 93.4 Or f dl8 105.2 99.9 95.5 Orf di 135.3 93.9 86.7 or f dS? 16 D . D 96.6 96.7 or f dss22 95.9 78.8 orf dss10 96 96.8 86.5 Ensayo De Infección De Plantas De Tabaco Trnasgénico Con Moho Polvoriento (Oidium Lycopersicon) Sobre la base de los niveles de SA medidos se seleccionaron transformantes primarias de tabaco para el análisis de la resistencia aumentada a la infección fúngica. Se seleccionaron las siguientes líneas: en t c + or f dss 4 , en t c + or f d s 16 y en t c + or f dss20. Se incluyeron también líneas control no transgénicas (wt/Nt/ssnn-1 y -2) en el ensayo. Se tomaron plantas de 6, 7 y 8 semanas. Las plantas originadas en la transformante primaria entc+orfdss16 fueron más pequeñas que las plantas control no transgérnicas y que las otras líneas transgénicas. Las plantas fueron inoculadas con el hongo patógeno del tabaco Oidium lycopersicon ' rociando una suspención de esporas de 3.5x104 esporas/ml (volumen total de 400 ml) . Las planta las plantas fueron analizadas a 20°C, a una humedad relativa de 80% y bajo un régimen de 16 horas de luz y 8 de oscuridad.

La severidad de la enfermedad fue determinada midiendo el porcentaje de área cubierta por moho polvoriento y fue medida a los 13, 18 y 24 días de la inoculación.

TABLA 3: Sev ridad de la enfermedad representada como porcentaje de área de hoja infectada de líneas de tabaco transgénico con entc+orfdss medidas a 13, 18 y 24 días después de la inoculación (ddi) .

Línea de planta Severidad Severidad de la Severidad de de la enfermedad (°) la enfermedad enfermedad (°) 18 ddi ( % ) 24 ddi 13 ddi Entc+orfd.,4 0* 0~* 0* 5 40 60 0* 0* 0* 10 20 <5 0 0 5 10 40 5 20 20 0 0 <5 entc+orfd«-16 5 30 50 5 30 50 10 ' 50 40 5 35 50 10 50 40 20 40 5 40 40 5 40 40 entc+orfd^-20 <5 20 60 <5 40 60 <5 40 60 <5 5 50 50 5 <5 50 10 40 50 wt/Nt/ssnn-1 5 30 40 15 50 40 5 20 30 5 20 50 5 40 30 5 30 50 5 40 50 10 25 40 wt/Nt/ssnn-2 10 40 60 10 40 70 10 25 60 5 60 50 10 50 40 <5 5 50 40 10 40 70 Nota -= las plantas murieron durante la prueba *= las plantas tienen manchas necróticas en las hojas La progenie TI de las líneas transgénicas no fue seleccionada por la presencia de genes de interés. Así q e la población evaluada puede tener locí de ADN-T segregantes y por y donde también puede observarse segregación de resistencia (como en la línea en t c + or fdss4 ) .

EJEMPLO 6 Inducción De Expresión De Genes PR Se aisló ARN de 0.5 g de material de hojas. El ARN fue extraído moliendo el material de hojas en nitrógeno líquido y extrayéndolo con 0.5 ml de una solución amortiguadora con glicina 0.35 M, NaOH 0.48 M, NaCl 0.34 M, EDTA 0.04 M, y SDS 4%. La preparación fue extraída subsiguientemente con soluciones saturadas de agua de fenol / cloro formo (l a 1 v/v) , fenol y fenol / clorof ormo . A la fase acuosa se agregó la mitad de un volumen de LiCl 8 M, guardándose la muestra una noche a 4°C. después de centrifugar, el precipitado fue lavado con etanol 70% y disuelto en agua.

Se glicosilaron 10 µg de cada muestra por 1 hora a 50°C y se corrieron en un gel de Na-fosfato 15 mM, agarosa 1.5% en solución amortiguadora de Na-fosfato (pH=6.5) a 7 V/cm. se mezclaron regularmente las soluciones amortiguadoras de ánodo y cátodo .

El gel fue transferido a una membrana Hybond-N+ de transferencia de nylon, entrecruzando y calentando por 2 horas a 80°C (ver figura) .

Se usó un fragmento de 450 pb de Pstl como sonda. Se realizó una marcación de unión al azar usando 32P-dCTP. La impronta fue hibridizada una noche y subsiguientemente lavada con 2 x SSC, SDS 0.1% a 65°C. se la expuso por 3 días a -80°C usando una pantalla intensificadora. Los procedimientos son como los descritos en Feinberg y Voglestein, Anal. Biochem. 137, 266-267, 1984; Cornelissen, B. et al., Nucí. Acid Res. 17, 6799- 6811, 1987; Payne et al., Plant Mol. Biol. 11, 89- 94, 1988; Pfitzner et al., Mol. Gen. Genet. 211, 290-295, 1988.

TABLA 4: Síntesis cualitativa de SA y expresión de PR-la in vitro y en las plantas de control de tabaco Samsun NN .

Los resultados se muestran en la Tabla 4. En plantas inducidas con TMV y en plantas transformadas con entC+s s +or f D+s s se observa acumulación de transcripto de PR-1A.

EJEMPLO 7 Ensayos De Infección En Catharantus Roseus Con Phytophthora Cactorum.

Se inocularon plantas de C. roseus de alrededor de 50 cm de altura por medio de la colocación de una pequeña gota (15-20µl) de una suspención de hifas de P. Cactorum en un pequeño corte de 0.5 cm realizado en la hoja para permitir la penetración del hongo.

Se dejó proceder la infección del hongo a 18°C a una humedad relativa alta (+_90%) . Se colectaron discos de las hojas (13 mm de diámetro) que contenían el sitio de la infección 48 horas después de la inoculación y 6 días después de la inoculación. Se colectaron discos de hojas de tejido de hoja no infectado 48 horas después de la inoculación en el área no infectada de las hojas inoculadas .

Extracción De ARN De Tejido De Hoja Infectado Y Síntesis De Adnc Se colectó poli-A+ ARN de 100 mg de tejido de hoja usando el Quikprep Micro mRNA Purification Kit (Amersham Pharmacia Biotech, Upsala, Suecia) .

Se determinó la cantidad relativa de ARNm usando visualización de ácidos nucleicos manchando 10 µl de las muestras con 4 µl de bromuro de etidio 1 µg/ml en un iluminador UV.

Se usaron cantidades iguales de poli-A+ ARN (+_100 ng) para sintetizar ADNc' usando 200 unidades de Superscrip II RT ARNasa H- transcriptasa reversa (Gibco BRL) y 1 µl de cebadores oligo(dT) 12 a 18 (500 µg/ml, Gibco, BRL) como lo describe el fabricante.

Construcción De MIMIC PCR Y Análisis De Muestras Por RT-PCR Comparativa Para la construcción del MIMIC PCR que sirvió como competidor en los experimentos de cRT-PCR se desarrollaron los siguientes cebadores: FR-pUC-257 (SEQ ID NO: 9) 5' ATA GAA ACG ACÁ CTT CCA CGT TAA GGG ATT TTG G 3', FR-pUC-258 (SEQ ID NO: 10) 5' ATA AGC ACG GAT TAA TGG GCC GGA GCT GAA TGA AGC AGC C 3', FR-ICS-255 (SEQ ID-255 (SEQ ID NO: 11) 5' ATA GAA ACG AGG ACÁ CTT CC 3' Y FR-ICS-256 (SEQ ID NO: 12) 5' ATA AGC ACG GAT TAA TGG GC 3' . Los cebadores FR-pUC-257 y FR-pUC-258 fueron usados para amplificar un fragmento de 527 pb del plásmido pUC18 ( Yani s ch- Per ron , C. et al., Gene 33, 103-119, 1985) por PCR. A partir de este producto de PCR se amplificó 1 µl usando los cebadores FR-ICS-255 y FR-ICS-256 mediante PCR usando gran cantidad de MIMIC PCR.

Los cebadores FR-ICS-255 y FR-ICS-256 amplificaran una banda de 443 pares de bases del ADNc de ICS de manera que pueda ser distinguida fácilmente de la banda MI MIC de 527 pb cuando sea separada en un gel de agarosa 1.5%.

Las soluciones de MIMIC PCR fueron hechas en un rango de 10 ng/ml a 0.1 µg/ml en agua con 0.2 µg/ml de glucógeno como transportador.

Las muestras de ADNc fueron analizadas en una PCR competitiva. Entonces, se combinaron 2 µl de cada muestra en un tubo de 0.5 ml con 1 µl de MIMIC diluido (cantidades 0.1 pg, 10 fg, 1 fg y O.lfg) o sin MIMIC. La amplificación del ADN y del MIMIC fue realizada usando 10 µM de los cebadores FR-ICS-255 y FR-ICS-256, 0.5 -µl de dNTP 20mM, solución amortiguadora PCR lx, MgCl2 y 2.5 unidades de ADN polimerasa Taq (Gibco BRL), dejándola proceder por 35 ciclos, 1' 95°C, 1' 55°C, 2 ' 72°C .

TABLA 5: Niveles de inducción del mensajero de ICS después de la infección de hojas de C roseus con P Catorum respecto del control.

Número de multiplicación Mué s t r a de inducción Cont rol 48 horas después de la inoculación >100 6 días después de la inoculación 10 Área sin infectar de la hoja Notas a= número de multiplicación de inducción respecto del control b= área infectada de la hoja es el área de la hoja inoculada no infectada por el hongo.

EJEMPLO 8 Aislamiento Del Promotor De La Isocorismato Sintasa De Catharantus Roseus Por Iper Se desarrollaron cebadores de PCR sobre la base de la secuencia de ADNc de ICS (SEQ ID NO: 18) . Se seleccionaron los cebadores FR-ICS-259 5' TGG TGA TCC AAG AGC TCC GG 3', (SEQ ID NO: 20) FR- ICS-260 5' CCT CGT TGA AAG GTC TGT G 3', (SEQ ID NO: 21) para la iPCR y el cebador FR-ICS-261 5' GCA ACÁ CAA TGC CCT GTG 3', (SEQ ID NO: 22) para la PCR nativa.

Se aisló ADN genómico de C. roseus usando un procedimiento de extracción de ADN CTAB. El ADN genómico fue sometido a digestión con cinco diferentes enzimas, Ddel, Kpnl, Mscl, Ncol y NlalV. Después de la digestión con enzimas de restricción del ADN fue extraído con fenol / clor oformo/a 1 cohol isoamílico y precipitado con etanol. El precipitado de ADN fue disuelto en 50 µl de agua, usándose 25µl para otra iPCR. Para este propósito, el volumen de la mezcla de ADN digerido fue aumentado a 300 µl en solución amortiguadora de ligasa (Gibco BRL) con 5 unidades de ADN ligasa T4 (Gilcob BRL) . Esta mezcla fue incubada a 16°C por 16 horas. Después del ligado, el ADN fue extraído nuevamente con fenol / clorof ormo /alcohol isoamílico, precipitado con etanol y disuelto en 50 µl de agua.

Se emplearon 2 µl de esta mezcla como molde en una reacción de PCR con 150 ng de cebadores FR-ICS-259 y FR-ICS-260, solución amortiguadora Klentaq PCR lx, dNTP 10 mM y 1.0 µl de mezcla de ADNc polimerasa Advantage (Clontech, palo alto, CA EEUU) . La mezcla completa de reacción fue sometida a 94°C por 1 minuto y 30 ciclos de 30" a 94°C, 1' a 55°C, 3' a 68°C. luego, 1 µl de la reacción fue empleado para PCR nativa. Entonces se siguió un procedimiento semejante pero se reemplazó el cebador FR-ICS-160 por el FR-ICS-261. Los resultados de la iPCR se indican en la Tabla 6.

TABLA 6: Bandas obtenidas después de la iPCR con cinco enzimas diferentes Enzima de restricción Tamaño de la banda Ddel 100 Kpnl 900 Mscl Ncol 3000 NlalV 900 Las bandas resultantes de PCR para las digestiones con Kpnl, Ncol y NlalV fueron clonadas en el vector de clonación T/A pGEM-T (Promega) . Se determinaron las secuencias de ADN de los insertos .

EJEMPLO 9 Aislamiento Del Promotor ICS Por PCR Directa Se desarrollaron nuevos cebadores de PCR sobre la base de la secuencia de ADN de los fragmentos clonados. Estos cebadores fueron localizados río arriba del promotor y en el codón de iniciación de la traducción ATG de marco de lectura abierto de la ICS. El cebador FR-ICS-295 5' GCA AGC TTC ATG TAC CTT ATC TTG GCC 3', (SEQ ID NO: 23) esta localizado en río arriba del promotor e introduce un sitio de restricción para Hindill y el cebador FR-ICS-296 5' TAG ATG CCA TGG GAT GGG AG 3', (SEQ ID NO: 24) esta en el codón de inicio de la ICS ORF introduciendo un sitio de restricción Ncol superpuesto con el codón inicial ATG.

Estos cebadores (150 ng) fueron usados en una reacción en una reacción de PCR sobre ADN genómico de C. roseus en solución amortiguadora de PCR Klentaq lx dNTP 10 µM y 2.0 µl de mezcla de ADNc polimerasa Advantage (Clontech, Palo Alto, CA, EEUU) . La mezcla completa de reacción (100 µl ) fue sometida a 1' a 94°C y 30 ciclos de 30" a 94°C, 1' a 55°C, 4' a 68°C. se aisló una banda del tamaño correcto (3.0 Kb) de un gel de agarosa, se la purificó y clonó usando las enzimas de restricción HindIII y. Ncol en un vector de gran número de copias basado en pUC18 ( Yani sch- Per r on , C, Viera, J y messing, J. (1985) Gene 33, 103-119) formando el plásmido pMOG1431. La secuencia de ADN del fragmento promotor completo fue determinada usando un secuenciador automático (SEQ ID NO: 25) . El promotor fue cortado usando HindIII y Ncol, ligado a un vector de clonado cortando con HindIII y Ncol que contiene el intrón GUS (Jefferson et al. (1987), EMBO J, 6, 3901-3907) seguido de la región no traducida 3' del gen del gen del inhibidor II de proteínas en la papa (Thornbug et al, 1987, Proc Natl. Acad. Sci. EEUU, 84, 744-748) que contiene la secuencia necesaria para la poliadenilación (An et al., 1989, Plant Cell 1, 115-122) , La unidad de expresión fue luego transferida al vector binario pMOG800 (depositado en el Central Bureau voor S chimmel cul t ur e s en Baam, Holanda, bajo CBS 414,93, el 12 de Agosto de 1993) usando la enzima de restricción Xhol. Usando el fragmento retirado, se transfirió el promotor de 3.0 kb al vector binario. Se selecciono un clon la unidad correcta en la orientación adecuada, por ejemplo, el promotor en el ADN-T próximo a la secuencia repetitiva del borde adecuado. El plásmido resultante fue designado pMOG1433.

EJEMPLO 10 Transformación Del Vector Binario Promotor ICS-GUS En Papa El pMOG1433 fue transformado en papa esencialmente como se describe en Hoekma et al. (Hoekma, A. Et al, Bi o/ technol ogy 7, 273-278, 1989) : Brevemente se transformaron papas (Solanum tuberosum cv. Kardal) con la cepa de Agrobacterium EHA 105 pMOG1433. El medio de cultivo básico consistió en sales MS (Murashigue y Skoog (1962) Physiol. Plant. 14, 473), vitaminas R3 (Ooms et al (1987) Theor. Appl. Genet. 73, 744), 30 g/1 de sucrosa, 0.5 g/1 de MES con pH final de 5.8 (ajustado con KOH) solidificado cuando necesario con 8 g/1 de agar Daichin. Se pelaron tubérculos de Solanum tuberosum cv. Kardal, e s 11 r i 1 i z ando s e su superficie mediante quemadura en etanol 96% por 5 segundos. Las llamas fueron extinguidas en agua estéril, cortándose luego trozos de aproximadamente 2mm de espesor. Se cortaron discos que contenían un trozo del tejido vascular y se les incubo por 20 minutos en medio MSS30R3 con 1 a 5 x 108 bacterias/ml de Agrobacterium EHA 105 que contenían el vector binario. Los discos de tubérculo fueron lavados con medio MSS30R3 y transferidos a medio de post-cultivo solidificado (PM) . El PM consistió en medio MSS30R3 suplido con 3.5 mg/ml de zeatina ribosido y 0.03 mg/ml de ácido indol oacé ti co (IAA) . Después de dos días , los discos fueron transferidos a medio PM fresco con 200 mg/l de cefotaxina y 100 mg/l de vancomicina. Tres días después, los discos de tubérculo fueron transferidos a medio de inducción de brotes (SIM) que consistió en medio PM con 250 mg/l de carbenicilina y 100 mg/l de kanamicina. 4 a 8 semanas después, los brotes que emergieron de los discos fueron separados y colocados para desarrollo de raíces (medio MSS30R3 con 100 mg/l de cefotaxima, 50 mg/l de vancomicina y 50 mg/l de kanamicina) . Los brotes fueron propagados axialmente mediante cortes en los meristemas.

EJEMPLO 11 Evaluación De La Función Del Promotor En Plantas De Papa Transgénica Se cultivaron plantas de papa transgénica que contenían la construcción promotor pMOG1443 ICS-GUS en tubos in vitro y se las analizo por su expresión del gen GUS. Para este propósito, se tomaron y tiñeron muestras de hojas, tallos y raíces (resultados en tabla 7) . Los niveles de expresión de GUS fueron determinados visualmente en una escala de 0 a 5, donde 0 es expresión no detectable y 5 es el nivel más alto de GUS observado en las hojas de la planta transgénica, de una línea transgénica rara de tabaco 35S-GUS (línea 96306) . Se incluyeron muestras de las hojas de esta planta en todos los experimentos como referencia interna.

TABLA 7: Expresión del gen GUS conducida por el promotor ICS en hojas, tallos y raíces de plántulas pequeñas in vitro.

Núme ro de Hoja Tallo R a í z planta 1433-1 0 0 0 1433-2 0 0 0 1433-3 0 0 0 1433-4 0 0 0 1433-5 0 0 0 1433-6 0 0 0 1433-7 0 0 0 1433-8 1 1 1 1433-9 0 0 0 1433-10 0 0 o 1433-11 0 0 o 1433-12 0 0 o 1433-13 0 0 o 1433-14 0 0 o 1433-15 1 0 o 1433-16 0 0 1 1433-17 0 0 o 1433-18 0 0 o 1433-19 0 0 o 1433-20 0 0 o 1433-21 0 0 o 1433-22 0 0 o 1433-23 0 O o 1433-24 O O o 1433-25 O O o Plántulas in vitro de la misma edad fueron infectadas con el hongo causante del pulgón tardío de la papa, Phytophthora infestans. Se aplicaron pequeñas gotas de agua que contenía una elevada concentración, de esporas sobre la superficie de la hoja. Se dejo proceder la infección a temperatura ambiente por 96 horas. Se retiraron las hojas que mostraron síntomas de la enfermedad de las plántulas y se las tiño en busca de la expresión del gen GUS por medio de análisis histoquímico GUS (Godjin et al., The plant Journal (1993)4(5), 863-873. Los resultados se indican en la tabla 8. Se monitoreo la expresión en la lesión resultante de la infección del hongo, en la zona primaria (el área alrededor del sitio de la infección) y en la parte no infectada de la hoja (fondo) .

TABLA 8 : Expresión del gen GUS conducida por el promotor ICS en hojas de plántulas in vitro infectadas por P. Infestans.

Número de Ante s Lesión Zona Fondo planta de la prima na i n f ecci ón 1433-1 0 0 1 0 1433-2 0 0 1 0 1433-3 0 0 0 0 1433-4 0 0 0 0 1433-5 0 0 1 0 1433-6 0 0 1 0 1433-7 0 0 0 0 1433-8 1 0 1 0 1433-9 0 0 0 0 1433-10 0 0* 0* 0* 1433-11 0 0 0 0 1433-12 0 0 1 0 1433-13 0 0 0 0 1433-14 0 0 0 0 1433-15 1 0 1 0 1433-16 0 0 2 0 1433-17 0 0 1 0 1433-18 0 0 1 0 1433-19 0 0 1 0 1433-20 0 0 1 0 1433-21 O O 1 o 1433-22 O O 1 o 1433-23 O o 1 o 1433-24 1 o- O' o* 1433-25 1 o 1 o Nota: *= plantas no inf ect ada s /no se aprecian síntomas de la enfermedad Se evaluó también el desempeño del promotor en las hojas de papas crecidas antes y después de la infección con P. Ifestans. Antes de la inoculación, las hojas fueron retiradas y teñidas en busca de expresión de GUS. Las plantas fueron luego rociadas con una suspención de esporas a 5xl05 esporas/ml, dejándose desarrollar la infección por 4 días (96 horas) . Nuevamente las hojas fueron retiradas y teñidas en busca de expresión de GUS. Los niveles de expresión de GUS fueron medidos en la lesión, en la zona primaria y en la parte no infectada de la hoja (fondo) . Los resultados se indican en la tabla 9.

TABLA 9: Expresión del gen GUS conducida por el promotor ICS en hojas de plantas transgénicas de papa antes y después de la infección con P. Infestans .

Número de Ant e s Lesión Zona Fondo planta de la primar i a infección 1433-1 1 4 3 1 1433-2 1 0 2 0 1433-3 1 4 2 1 1433-4 1 0 0 o 1433-5 1 2 2 o 1433-6 1 0 2 1 1433-7 1 0 2 o 1433-8 3 0 2 2 1433-10 1 4 3 1 1433-11 0 0 0 1 1433-12 1 4 4 1 1433-13 1 0 0 o 1433-14 1 0 0 o 1433-15 1 0 2 1 1433-16 1 4 4 1 1433-17 1 0 4 1 1433-18 1 4 4 o 1433-19 2 0 4 1 1433-20 1 2 3 1 1433-21 1 4 4 0 1433-22 1 2 2 1 1433-23 1 0 4 1 1433-24 3 2 3 1 1433-25 3 0 4 11 Listado de Secuencia <110 ogen International nv <120> Genes de la vía del ácido salicílico y su empleo para la introducción de resistencia en plantas. <130> 46049 PCT <140> <141> <150> US 60/080,625 <151> 1998-04-03 <150> US 60/080,203 < 151 > 1998-03-31 <16ü> 25 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 30 < 212 > DN <213> Secuencia Artificial <220> :223> Descripción de la secuencia artificial cebador <400> 1 gtcgaggatc catggatacg tcactggctg 30 10 <210> 2 • <211> 31 <212> ADN <213> Secuencia Artificial 15 <220> <223> Descripción de la secuencia artificial cebador • 20 <400> gaatggaatg cggatcctcg ctccttaatg c 31 <210> 3 <211> 33 25 <212> ADN Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial <400> gcgggtacca caatggcttc ctcagttctt tcc 33 <210> 4 <211> 18 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial cebador <400> 4 cattgcactc ttccgccg <210> <2il> 30 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> < 223 > Descnpción de la secuencia artificial cebador <400> gcgggt a tgctgccgct aaaaccgcca 30 <210> <211> 27 <212> ADN <2 I 3> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: cebador <400> 6 gcgcatatgc tgccgctaaa accgcca 27 <210> 7 <211> 33 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial :eí <400> cgcggatcct catgacttgg cctgcgccga gta 33 <210> <211> 13 <212> .DN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descnpción de la secuencia artificial cepador <400> 8 cgccatatgg cattgcactc :cgccgtt gct 33 <210. <211> <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial cebador < 400 > c- a a a a a acacttcc acgttaaggg attttgg <210> 10 <211> 37 <212> DN <213> Secuencia Artificial <220> <223> escripción de la secuencia artificial cebador ataagcacgg attaatgggc cggagctgaa tgaagcc 37 <210 > 11 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial cebador < 4 O O > atagaai ggacacttc 20 < 210 > <211> <212> DN <213> Secue cia Artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial cebador <400> 12 ataagcacgg attaatgggc 20 < 210 > i 3 <211> 165 <212> ADN <213> Esscchenchia coli <220> <221> Función: proteína entC "isocorismato sintetasa" <400> 13 gagtctcaca aatcagcttc ctgttattaa taaggttaag ggcgtaatga caaattcgac 60 aaagcgcaca atccgtcccc tcgcctttgg gagagggtta gggtgagggg aacagccagc 120 actggtgcga acattaaccc tcaccccagc cctcaccctg gaaggagagg gggcagaacg 180 gcgcaggaca tcacattgcg cttatgcgaa tccatcaata atgcttctca ttttcattgt 2 0 aaccacaacc agatgcaacc ccgagttgca gattgcgtta cctcaagagt tgacatagtg 300 cgcgtttgct tttaggttag cgaccgaaaa tataaatgat aatcattatt aaagccttta 360 tcattttgtg gaggatgat atg gat acg tca ctg gct gag gaa gta cag cag 412 Met Asp Thr Ser Leu Ala Glu Glu Val Gln Gln 1 5 10 acc atg gca acá ctt gcg ccc aat cgc ttt ttc ttt atg tcg ccg tac 460 Thr Met Ala Thr Leu Ala Pro Asn Arg Phe Phe Met Ser Pro Tyr 15 20 25 cgc agt ttt acg acg tca gga tgt ttc gcc cgc ttc gat gaa ccg gct 508 Arg Ser Phe Thr Thr Ser Gly Cys Phe Ala Arg Phe Asp Glu Pro Ala 10 35 40 gtg aac ggg gat tcg ccc gac agt ccc ttc cag caa aaa etc gcc gcg 556 Val Asn Gly Asp Ser Pro Asp Ser Pro Phe Gln Gln Lys Leu Ala Ala 45 50 55 cgt ttt gcc gat gcc aaa gcg cag ggc ate aaa aat ccg gtg atg gtc 604 Leu Phe Ala Asp Ala Lys Ala Gln Gly lie Lys Asn Pro Val Met Val 60 65 70 75 ggg gcg att ccc ttc gat cca cgt cag cct tcg tcg ctg tat att cct 652 Gly Ala lie Pro Phe Asp Pro Arg Gln Pro Ser Ser Leu Tyr lie Pro 80 85 90 gaa tcc tgg cag tcg ttc tcc cgt cag gaa aaa caa gct tcc gca cgc 700 Glu Ser Trp Gln Ser Phe Ser Arg Gln Glu Lys Gln Ala Ser Ala Arg 95 100 105 cgt ttc acc cgc age cag tcg ctg aat gtg gtg gaa cgc cag gca att 748 Arg Phe Thr Arg Ser Gln Ser Leu Asn Val Val Glu Arg Gln Ala He 110 115 120 ccg gag caa acc acg ttt gaa cag atg gtt gcc cgc gcc gcc gca ctt 796 Pro Glu Gln Thr Thr Phe Glu Gln Met Val Ala Arg Ala Ala Ala Leu 125 130 135 acc gcc acg ccg cag gtc gac aaa gtg gtg ttg tca cgg ttg att gat 844 Thr Ala Thr Pro Gln Val Asp Lys Val Val Leu Ser Arg Leu He Asp 140 145 150 155 ate acc act gac gcc gcc att gat agt ggc gta ttg ctg gaa cgg ttg 892 He Thr Thr Asp Ala Ala He Asp Ser Gly Val Leu Leu Glu Arg Leu 160 165 170 att gcg caa aac ccg gtt agt tac aac ttc cat gtt ccg ctg gct gat 940 He Ala Gln Asn Pro Val Ser Tyr Asn Phe His Val Pro Leu Ala Asp 175 180 185 ggt ggc gtc ctg ctg ggg gcc age ccg gaa ctg ctg cta cgt aaa gac 988 Glt Gly Val Leu Leu Gly Ala Ser Pro Glu Leu Leu Leu Arg Lys Asp 190 195 200 ggc gag cgt ttt age tcc att ccg tta gcc ggt tcc gcg cgt cgt cag 1036 Gly Glu Arg Phe Ser Ser He Pro Leu Ala Gly Ser Ala Arg Arg Gln 205 210 215 ccg gat gaa gtg etc gat cgc gaa gca ggt aat cgt ctg ctg gcg tca 1084 Pro Asp Glu Val Leu Asp Arg Glu Ala Gly Asn Arg Leu Leu Ala Ser 220 225 230 235 gaa aaa gat cgc cat gaa cat gaa ctg gtg act cag gcg atg aaa gag 1132 Glu Lys Asp Arg His Glu His Glu Leu Val Thr Gln Ala Met Lys Glu 240 245 250 gta ctg cgt gaa cgc agt agt gag tta c a gtt cct tet tet cca cag 1180 Val Leu Arg Glu Arg Ser Ser Glu Leu His Val Pro Ser Ser Pro Gln 255 260 265 ctg ate acc acg ccg acg ctg tgg cat etc gca act ccc ttt gaa ggt 1228 Leu He Thr Thr Pro Thr Leu Trp His Leu Ala Thr Pro Phe Glu Gly 270 275 280 aaa gcg aat tcg caa gaa aac gca ctg act ctg gcc tgt ctg ctg cat 1276 Lys Ala Asn Ser Gln Glu Asn Ala Leu Thr Leu Ala Cys Leu Leu His 285 290 295 ccg acc ccc gcg ctg age ggt ttc ccg cat cag gcc gcg acc cag gtt 1324 Pro Thr Pro Ala Leu Ser Gly Phe Pro His Gln Ala Ala Thr Gln Val 300 305 310 315 att gct gaa ctg gaa ccg ttc gac cgc gaa ctg ttt ggc ggc att gtg 1372 He Ala Glu Leu Glu Pro Phe Asp Arg Glu Leu Phe Gly Gly He Val 320 325 330 ggt tgg tgt gac age gaa ggt aac ggc gaa tgg gtg gtg acc ate cgc 1420 Gly Trp Cys Asp Ser Glu Gly Asn Gly Glu Trp Val Val Thr He Arg 335 340 345 tgc gcg aag ctg cgg gaa aat cag gtg cgt cgt ttt gcc gga gcg ggg 1468 Cys Ala Lys Leu Arg Glu Asn Gln Val Arg Leu Phe Ala Gly Ala Gly 350 355 360 att gtg cct gcg tcg tca ccg ttg ggt gag tgg cgc gaa acá ggc gtc 1516 He Val Pro Ala Ser Ser Pro Leu Gly Glu Trp Arg Glu Thr Gly Val 365 370 375 aaa ctt tet acc atg ttg aac gtt ttt gga ttg cat taa ggagcgagga 1565 Lys Leu Ser Thr Met Leu Asn Val Phe Gly Leu His 380 385 390 tgageattec attcacccgc tggccgaaga gtttgcccgt cgctatcgga aaaaggatac 1625 tgcagatttc gctgaccgac attctgacgc aact 1659 <210> 14 <211> 272 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 14 Gln Ala He Pro Glu Gln Thr Thr Phe Glu Gln Met Val Ala Arg Ala 1 5 10 15 Ala Ala Leu Thr Ala Thr Pro Gln Val Asp Lys Val Val Leu Ser Arg 20 25 30 Leu He Asp He Thr Thr Asp Ala Ala He Asp Ser Gly Val Leu Leu 35 40 45 Glu Arg Leu He Ala Gln Asn Pro Val Ser Tyr Asn Phe His Val Pro 50 55 60 Leu Ala Asp Gly Gly Val Leu Leu Gly Ala Ser Pro Glu Leu Leu Leu 65 70 75 80 Arg Lys Asp Gly Glu Arg Phe Ser Ser He Pro Leu Ala Gly Ser Ala 85 90 95 Arg Arg Gln Pro Asp Glu Val Leu Asp Arg Glu Ala Gly Asn Arg Leu 100 105 110 Leu Ala Ser Glu Lys Asp Arg His Glu His Glu Leu Val Thr Gln Ala 115 120 125 Met Lys Glu Val Leu Arg Glu Arg Ser Ser Glu Leu His Val Pro Ser 130 135 140 Ser Pro Gln Leu He Thr Thr Pro Thr Leu Trp His Leu Ala Thr Pro 145 150 155 160 Phe Glu Gly Lys Ala Asn Ser Gln Glu Asn Ala Leu Thr Leu Ala Cys 165 170 175 Leu Leu HÍS Pro Thr Pro Ala Leu Ser Gly Phe Pro His Gln Ala Ala 180 185 190 Thr Gln Val He Ala Glu Leu Glu Pro Phe Asp Arg Glu Leu Phe Gly 195 200 205 Gly He Val Gly Trp Cys Asp Ser Glu Gly Asn Gly Glu Trp Val Val 210 215 220 Thr He Arg Cys Ala Lys Leu Arg Glu Asn Gln Val Arg Leu Phe Ala 225 230 235 240 Gly Ala Gly He Val Pro Ala Ser Ser Pro Leu Gly Glu Trp Arg Glu 245 250 255 Thr Gly Val Lys Leu Ser Thr Met Leu Asn Val Phe Gly Leu His 260 265 270 <210> 15 <211> 5057 <212> ADN <213> Pseudomonas fluorescens <220> <221> CDS <222> ( 207 ) ... ( 1382 ) <223> Función: proteina orfA "i socori sma t o sintetasa' <220> <221> CDS <222> (4516)... (4851) <223> Función: proteina orfD "isocorismato piruvato liasa' <400> 15 gaattcggca tacagatgag ctgaaacttt ccctaaaaac gcatgagcag tccgcccgat 60 ccaaca ggcg gcttgcattg aagttaactc tctcatggct cactcatgtg attgacaaat 120 cg taatgatt agcatcacat attagaaacg ataatgatte tatttcaagt ttctttttat 180 ccctaggcca cggaggcttc ccccaa atg aga acg ggc acc cta aga acg acc 233 Met Arg Thr Gly Thr Leu Arg Thr Thr 1 5 gag atg gaa gag gtg caa etc gca gag gta caa cgt agt ttt tcg ttc 281 Glu Met Glu Glu Val Gln Leu Ala Glu Val Gln Arg Ser Phe Ser Phe 10 15 20 25 acá tcc ggc gat cgc gag tta gcg gtc acc ggg atg ctg cag aga att 329 Thr Ser Gly Asp Arg Glu Leu Ala Val Thr Gly Met Leu Gln Arg He 30 35 40 gaa acá cct gcc att gcc ggc gat gac gcc aat age ctg ttc cag cag 377 Glu Thr Pro Ala He Gly Gly Asp Asp Ala Asn Ser Leu Phe Gln Gln 45 50 55 acá att gcg caa gcg ctt gat cgg gcg cgc gaa gct ggc cag age acc 425 Thr He Ala Gln Ala Leu Asp Arg Ala Arg Glu Ala Gly Gln Ser Asn 60 65 70 cca ate ate gtt ggc gcc ate cct ttc gac cct gct gaa cct tcc tgc 473 Pro He He Val Gly Ala He Pro Phe Asp Pro Ala Glu Pro Ser Cys 75 80 85 etc tac att ccc gaa cae gcg caa tgg cgg acc cga gac ate cae gcg 521 Leu Tyr He Pro Glu His Ala Gln Trp Arg Thr Arg Asp He His Ala 90 95 100 105 aaa acg ggt atg tcg acg ctg cct gag ttg ate gaa cag aaa aac att 569 Lys Thr Gly Met Ser Thr Leu Pro Glu Leu He Glu Gln Lys Asn He 110 115 120 ccg gac gaa cag gcc ttc aaa cgg gcg gtg gaa cae gcc gtc gtc aac 617 Pro Asp Glu Gln Ala Phe Lys Arg Ala Val Glu His Ala Val Val Asn 125 130 135 ttc cgc cae age gac gta cgc aag gct gtg etc tcg gtt caa cgc gag 665 Phe Arg His Ser Asp Val Arg Lys Ala Val Leu Ser Val Gln Arg Glu 140 145 150 ctg ata ttt gca aac gat gtg gat gtg agt gcc ctg cag cae aac ctg 713 Leu He Phe Ala Asn Asp Val Asp Val Ser Ala Leu Gln His Asn Leu 155 160 165 aaa gcc cag aac ccg age ggc tac cae ttc cgt gtg cca atg cct gat 761 Lys Ala Gln Asn Pro Ser Gly Tyr His Phe Arg Val Pro Met Pro Asp 170 175 180 - 185 ggc acc acg ctg ate ggt gtc agt ccc gaa ctt ctg gtc cgc asg gaa 809 Gly Thr Thr Leu He Gly Val Ser Pro Glu Leu Leu Val Arg Lys Glu 190 195 200 ggc ctg age tet ctg tcc aac ccg ctg gca ggg tca gcc aag cgc atg 857 Gly Leu Ser Ser Leu Ser Asn Pro Leu Ala Gly Ser Ala Lys Arg Met 205 210 215 gcc gat cca gaa gcc gac cgg cgc aat gca gac tgg ttg ctg acá tcg 905 Ala Asp Pro Glu Ala Asp Arg Arg Asn Ala Asp Trp Leu Leu Thr Ser 220 225 230 gaa aaa gat cae tac gaa cae ggg ttc gtg acc cag gac ate gtc age 953 Glu Lys Asp His Tyr Glu His Gly Phe Val Thr Gln Asp He Val Ser 235 240 245 c a a ctg ggg aaa ctg tgc acg cag ctg aat gtg ccg caa cgc ccc tcc 1001 Gln Leu Gly Lys Leu Cys Thr Gln Leu Asn Val Pro Gln Arg Pro Ser 250 255 260 265 etc ate age acg ccc gcg etc tgg cae etc tcg acc cgc ate gaa ggt 1049 Leu He Ser Thr Pro Ala Leu Trp His Leu Ser Thr Arg He Glu Gly 270 275 280 acg ctg gca gac ccg gct gta tcg gcc ttg cag ctt gcc tgc cgc ttg 1097 Thr Leu Ala Asp Pro Ala Val Ser Ala Leu Gln Leu Ala Cys Arg Leu 285 290 295 cae ccc acá ccg gct gtg tgc ggc ttc ccc acc gag cgc gcc cgg cgc 1145 His Pro Thr Pro Ala Val Cys Gly Phe Pro Thr Glu Arg Ala Arg Arg 300 305 310 ctg att cgc ttc gtc gaa ccc ttc gag cgc ggc ctg ttc acc ggc atg 1193 Leu He Arg Phe Val Glu Pro Phe Glu Arg Gly Leu Phe Thr Gly Met 315 320 325 gtg ggt tgg tgc gat gcc cag ggc aat ggc gaa tgg gtc gta acg att 1241 Val Gly Trp Cys Asp Ala Gln Gly Asn Gly Glu Trp Val Val Thr He 330 335 340 345 cgt tgc ggc acg gtc agg cga aac aag gtc cgc ctg ttc gcc ggc gca 1289 Arg Cys Gly Thr Val Arg Arg Asn Lys Val Arg Leu Phe Ala Gly Ala 350 355 360 ggc ate gtt gaa gcc tca age ccc gac tcc gaa tgg gca gaa gtc cag 1337 Gly He Val Glu Ala Ser Ser Pro Asp Ser Glu Trp Ala Glu Val Gln 365 370 375 acc aaa ctt ggc acc ate gtg cgc gcc tgc gga ttg gcc cae taa 1382 Thr Lys Leu Gly Thr He Val Arg Ala Cys Gly Leu Ala His 380 385 390 ctcgaatttt ttcacacgtg aatactatga ctattgaatt taaccactgg cctctggaaa 1442 gcgcacagcg ttatcgggac aaaggetatt ggetegacaa accgctcacc cacctccttc 1502 iggaacgcag ccagtcgcaa cccgacgccc cegegattat ttgcggcgat cgccacttca 1562 gctatgccga gttggaccaa ttgtcttcca acctggcctc gcgactggcc gccagcgggc 1622 ttggcaacgg tgacactgca ctggtgcagt tgeccaatat cgcggagttt tacattgtcc 1682 tttttgccct getcaagtca ggaategeac ccctcaacgc gctctacagc catcgcaaac 1742 ttgaaetcaa gagttaegee aaacaaatcg cgccaacgtt gttgattgcc tcccgcgaac 1802 atgaagtctt ccgtgacgac agctatatcg ccgacttcaa ggaggtgggt tcaagtccag 1862 acatcatctt gctgttgggc gagcaacgtc acgaaaacaa cctcgccgac tggatcaata 1922 cgccgagcga gagcaacgtg aacgtctccc cctcggggcc cggcgaggtc gcattgttcc 1982 aactgtcagg cggcagcacg ggcaccccca aactcatccc ccgcactcac aacgactatt 2042 actacaacgc cagggcaagc gcgcaagtat gegaaettac gccacgcacg egetttetat 2102 gcgcgctacc tgccgcccat aacttcttgc tcagctcccc cggcgccctc ggtgttctac 2162 atgetggcgg ctgcatcatc atggcgccca gcccggagcc cttgacctgt ttttcgatca 2222 tccagcgcca agaagtcaat actgtggcct tggtgccaag tgcagtcgcc ttgtggctgc 2282 aggcagcgcc ggagcataaa gaacaactgc aatcgcttga gttcctccag gtcggtggcg 2342 cctgttttgc cgactcgctg gcacgccagg tgcccggcgt gctcggttgt aagctgcaac 2402 aggtattcgg gatggccgaa ggcctgatca actacacccg gctaaatgac tccgacgaac 2462 agatttttac tacccagggc cgtccgacga gccccgacga tgaaatcaaa atcgttgacg 2522 aacaaggcct ccccgtcccg gacggagaac ctggcatgct cgccacacgt ggcccttaca 2582 ctttttgcgg gtactaccaa agccccgaac aaaatgccca ggcgttcgat aacgaggggt 2642 actactactc cggcgacctc gtccaactca tgcccagcgg cgatttgcgc gtggtcggca 2702 gggtcaagga ccagatcaac cgtggcggtg aaaaagtcgc ctcggaggaa atcgaaaacc 2762 tcatcgtcct ccatcctgat gtgactcacg cgggcttggt ggccatgccc gatgacaggc 2822 tgggagaaaa aagctgcgcg ttcgtcgtct cacgcaaccc gagcctgaag ccgcccgcgc 2882 tcagacgtca cctgatggaa ctcggcatcg cegaatacaa actgcccgac cgcatccggt 2942 taatcgaaac catgccgctg acccccgtgg gcaagattga caagaagcat ctgcgtcagc 3002 ttctggcagc ggaaaccaca cgcgcctggt tgcagactcg cgtgcggcaa ctcgtcgagg 3062 actgtgaaga cctggacccc gaggaaaacc tgattttcta tggcctcgac tccttgcaag 3122 tgatgagact cgctgccgaa ctcaaggagc gtggcattgc cgtcagcttc gaagaactgg 3182 cggattcgcc cacgctcagc agctggtggt cattggtaga cgcgaggcag atagccgcct 3242 gaccgggcgg cgtcacccag tcgttttaaa aggagttaga catgacttta tcccctgccg 3302 accaaagcaa gcttgaaggc ttctggcagc actgcgtgac acatcagtat ttcaacattg 3362 ggtatcccga atcagccgat tttgattact cccagctgca ccgtttcttg cagttttcaa 3422 ttaacaactt gctggggact acagcaacta cctgttgaac tcgttcgact tcgttcgact 3482 ttgaaaaaga cgtcatgacg tatttcgccg agctgttcaa cattgccctt gaagacagtt 3542 ggggttacgt caccaatggc gggacggaag gcaatatgtt tggctgctac ctgggacgcg 3602 aactgtttcc ggacggcacc ctgtactact cgaaagacac ccactactcc gtggcaaaga 3662 tcgtcaaatt attgcggatc aaatgccgtg cggtcgaatc gctgcccaat ggcgaaatcg 3722 actacgacga cctgatggca aaaataaccg ccgaccagga gcgtcacccc atcatcttcg 3782 ccaacatcgg caccacgatg cgtggagccc tggataatat cgtgaccatc cagcaacgcc 3842 tgcaacaggc aggcattgcc cgccacgact actacctgca cgctgatgcg gccttgagcg 3902 ggatgatcct gcccttcgtc gatcacccac aacccttctc gtttgccgac ggcatcgact 3962 cgatctgcgt ctccggccac aagatgatcg gctcgcccat tccttgcgga attgtcgtgg 4022 ccaaacgcaa caacgtcgcg cgcatttcag tggaagtgga ctatatccgc gcccatgaca 4082 agaccatcag cggctcgcgc aacggccaca cacccctgat gatgtgggcg gcactgcgca 4142 gctactcatg ggctgaatgg cgccatcgaa tcaaacacag cctggacacg gcacactacg 4202 ccgtcgaccg cttccaggcc tcgggcattg atgcctggcg caacgaaaac tccatcaccg 4262 tcgtgttccc ttgcccatca gaaagaattg cgacgaaata ctgcctggcc acctccggta 4322 attcggcaca cctgatcacc acacctcatc atcacgactg cagcatgatc gacgccttga 4382 tcgacgaagt ggttgccgaa gctcaactga atacccttcg atccaagcga gcattcactg 4442 aacaaacggt cgtcgagcga ttgcccgcgg cgtcattcaa cttgcgtacc cattattgaa 4502 agagaccagc etc atg ctg ccg cta aaa ccg ccg caa gcc tgc gag acc 4551 Met leu Pro Leu Lys Pro Pro Gln Ala Cys Glu Asn 395 400 etc aat gac att cga gcg ggc ate gac ttt ttt gac cgc cag ate ctt 4599 Leu Asn Asp He Arg Ala Gly He Asp Phe Phe Asp Arg Gln He Leu 405 410 415 420 gac tcg cta caa aaa cgc ctg cgt tac gta aag gct gcg gcg cag ttc 4647 Asp Ser Leu Gln Lys Arg Leu Arg Tyr Val Lys Ala Ala Ala Gln Phe 425 430 435 aaa gcc aac gag cag gac att cca gca cct gaa cgc gtc gcg gcc atg 4695 Lys Ala Asn Glu Gln Asp He Pro Ala Pro Glu Arg Val Ala Ala Met 440 445 450 cct gag gag cgg cga cta tgg gcg gta gaa gcc gaa ctt gat gtc gct 4743 Leu Glu Glu Arg Arg Leu Trp Ala Val Glu Ala Glu Leu Asp Val Ala 455 460 465 ttc gtc gag aag etc tac gag cag att att cae tgg aat att caa cag 4791 Phe Val Glu Lys Leu Tyr Glu Gln He Tie His Trp Asn He Gln Gln 470 475 480 caa ate ctg cat tgg cgg gcc acc cga caa cca acg tac tcg gcg cag 4839 Gln He Leu His Trp Arg Ala Thr Arg Gln Pro Thr Tyr Ser Ala Gln 485 490 495 500 gcc aag tca tga cgatggcggg tggatgcctg acgacttgag gtctgcgatt 4891 Ala Lys Ser cacgcgggct gtccttgttc gagtggtgtg tgttcacaac tatcaccgta gaccaagggc 4951 ggccttttct tcattttttt gtaatcagat cagcctgtta gctgttaatt aagtgecatt 5011 caaatctgtc cccttttttt ttcgccataa tgctgatatc gaatte 5057 <210> 16 <211> 332 <212> Pseudomonas fluorescens <400> 16 Gln Ala Leu Asp Arg Ala Arg Glu Ala Gly Gln Ser Asn Pro He He 1 5 10 15 Val Gly Ala He Pro Phe Asp Pro Ala Glu Pro Ser Cys Leu Tyr He 20 25 30 Pro Glu His Ala Gln Trp Arg Thr Arg Asp He His Ala Lys Thr Gly 35 40 45 Met Ser Thr Leu Pro Glu Leu He Glu Gln Lys Asn He Pro Asp Glu 50 55 60 Gln Ala Phe Lys Arg Ala Val Glu His Ala Val Val Asn Phe Arg His 65 70 75 80 Ser Asp Val Arg Lys Ala Val Leu Ser Val Gln Arg Glu Leu He Phe 85 90 95 Ala Asn Asp Val Asp Val Ser Ala Leu Gln His Asn Leu Lys Ala Gln 100 105 110 Asn Pro Ser Gly Tyr His Phe Arg Val Pro Met Pro Asp Gly thr Thr 115 120 125 Leu He Gly Val Ser Pro Glu Leu Leu Val Arg Lys Glu Gly Leu Ser 130 135 140 Ser Leu Ser Asn Pro Leu Ala Gly Ser Ala Lys Arg Met Ala Asp Pro 145 150 155 160 Glu Ala Asp Arg Arg Asn Ala Asp Trp Leu Leu Thr Ser Glu Lys Asp 165 170 175 His Tyr Glu His Gly Phe Val Thr Gln Asp He Val Ser Gln Leu Gly 180 185 190 Lys Leu Cys Thr Gln Leu Asn Val Pro Gln Arg Pro Ser Leu He Ser 195 200 205 Thr Pro Ala Leu Trp His Leu Ser Thr Arg He Glu Gly Thr Leu Ala 210 215 220 Asp Pro Ala Val Ser Ala Leu Gln Leu Ala Cys Arg Leu His Pro Thr 225 230 235 240 Pro Ala Val Cys Gly Phe Pro Thr Glu Arg Ala Arg Arg Leu He Arg 245 250 255 Phe Val Glu Pro Phe Glu Arg Gly Leu Phe Thr Gly Met Val Gly Trp 260 265 270 Cys Asp Ala Gln Gly Asn Gly Glu Trp Val Val Thr He Arg Cys Gly 275 280 285 Thr Val arg Arg Asn Lys Val Arg Leu Phe Ala Gly Ala Gly He Val 290 295 300 Glu Ala Ser Ser Pro Asp Ser Glu Trp Ala Glu Val Gln Thr Lys Leu 305 310 315 320 Gly Thr He Val Arg Ala Cys Gly Leu Ala His 325 330 <210> 17 <211> 52 <212> PRT <213> Pseudomonas fluorescens <400> 17 Leu Glu Glu Arg Arg Leu Trp Ala Val Glu Ala Glu Leu Asp Val Ala 1 5 10 15 Phe Val Glu Lys Leu Tyr Glu Gln He He His Trp Asn He Gln Gln 20 25 30 Gln He Leu His Trp Arg Ala Thr Arg Gln Pro Thr Tyr Ser Ala Gln 35 40 45 Ala Lys Ser 50 <210> 18 <211> 2078 <212> ADN <213> Catharantus Roseus <220> <221> CDS <222> (31) (1773) <223> Función: "isocorimato sintetasa" ICS <400> 18 ttctctctcc ctctctctct ctcccatcca atg gca tet ate acá ggg cat tgt 54 Met Ala Ser He Thr Gly His Cys 1 5 gtt gct cat ttc acá gac cct tca acc agg aaa tet tet ttt ttc tet 102 Val Ala His Phe Thr Asp Leu Ser Thr arg Lys Ser ?ei Phe Phe Ser 10 15 20 aat tet aat aat aac tet tcc ctt ttt aga aga aag tet acá aat ata 150 Asn Ser Asn Asn Asn Ser Ser Leu Phe Arg Arg Lys Ser Thr Asn lie 25 30 35 40 gtc acc aga aaa aaa tat ata ttt tgt tet acá tca ttg tcc atg aat 198 Val Thr Arg Lys Lys Tyr He Phe Cys Ser Thr Ser Leu Ser Met Asn 45 50 55 ggt tgc aat ggt gat cca aga gct ccg gtt gga act ata gaa acg agg 246 Gly Cys Asn Gly Asp Pro Arg Ala Pro Val Gly Thr He Glu Thr Arg 60 65 70 acá ctt ccg gcg gtt tcg acg ccg gca ttg gcc atg gaa cgt ctt age 294 Thr Leu Pro Ala Val Ser Thr Pro Ala Leu Ala Met Glu Arg Leu Ser 75 80 85 tcc gcc gtg gct acc ttg aaa tca act cta cct tet gct caa tca ggg 342 Ser Ala Val Ala Asn Leu Lys Ser Thr Leu Pro Ser Ala Gln Ser Gly 90 95 100 ate ate cgt ctt gag gta cca att gaa gaa cat ata gaa gca cta qac 390 lie He Arg Leu Glu Val Pro lie Glu Glu His He Glu Ala Leu Asp 105 110 115 120 tgg ctt cat tcg caa gac caa aaa aac ctt ctt ccc cgt tgc tat ttc 438 Trp Leu His Ser Gln Asp Gln Lys Asn Leu Leu pro Arg Cys Tyr Phe 125 130 135 tet ggt aga agt caa caa gtt acc ttc gat ttc acá tet aac gac ctt 486 Ser Gly Arg Ser Gln Val Thr Phe Ser Asp Phe Thr Ser Asn Asp Leu 140 145 150 acá aat aga aat ggg agt gcc gcc aat gga cat ctt caa cga att tet 53' Thr Asn Arg Asn Gly Ser Ala Ala ñsn Gly His Leu Gln ñrg He Ser 155 160 165 act tca tet gat gat aag aat ctg gtc agt gtt gct ggt gtc ggt tet 582 Thr Ser Ser Asp Asp Lys Asn Leu Val Ser Val Ala Gly Val Glv Ser 170 175 180 gca gtc etc ttc cgg age cca aat c c a ttc tet ttt gat gat tgg etc ¡ 30 Ala Val Leu Phe Arg Ser Pro Asn Pro Phe Ser Phe asp Asp Trp Leu 185 190 195 200 tca att aag agg ttt ttg tcc aag aac tgc c c a tta ate cgt gct tat 678 Ser He Lys Arg Phe Leu Ser Lys Asn Cys Pro Leu lie Arg Ala Tyr 205 210 215 gga gca att cgc ttt gat gca agg cct cat ata gca cca gag tgg aag 726 Gly Ala He Arg Phe Asp Ala Arg Pro His He Ala Pro Glu Trp L s 220 225 230 gct ttt ggc tca ttt tac ttc atg gtt cct cag gtt gag ttt gat gag 774 Ala Phe Gly Ser Phe Tyr Phe Met Val Pro Gln Val Glu Phe Asp Glu 235 240 . 245 cta cat gga agt tcc atg att gct gca acá gtt gca tgg gat aat gct 822 Leu His Gly Ser Ser Met He Ala Ala Thr Val Ala Trp Asp Asn Ala 250 255 260 etc tet ttg acá tat caa caa gca ata gtt cga ctt caa acá acá atg 870 Leu Ser Leu Thr Tyr Gln Gln Ala He Val Arg Leu Gln Thr Thr Met 265 270 275 280 gag cag gtt tcc tet acc gtc tcc aaa cta aga caa gat gtc tet cat 918 Glu Gln Val Ser Ser Thr Val Ser Lys Leu Arg Gln Asp Val Ser His 285 290 295 act tet ttg gtg age aag gct aat att cct gat aga acá tcc tgg gat 966 Thr Ser Leu Val Ser Lys Ala Asn He Pro Asp Arg Thr Ser Trp Asp 300 305 310 ctt act ctt aac cga gtt ttg gaa gaa ata ggc aac aaa tat tcg cca 1014 Leu Thr Leu Asn Arg Val Leu Glu Glu He Gly Asn Lys Tyr Ser Pro 315 320 325 ttg acá aag gtt gta ctt gca cgt cgt agt caa gtt ate acá a c á tca 1062 Leu Thr Lys Val Val Leu Ala Arg Arg Ser Gln Val He Thr Thr Ser 330 335 340 gat att gat cct ttg gct tgg ctg agt agt ttc aag gct gat ggg aaa 1110 Asp He Asp Pro Leu Ala Trp Leu Ser Ser Phe Lys Ala Asp Gly Lys 345 350 355 360 gat gct tac caa ttt tgc ctt cag cct cat gaa gca cca gca ttc att 1158 Asp Ala Tyr Gln Phe Cys Leu Gln Pro His Glu Ala Pro Ala Phe He 365 370 375 gga aac act cca gag caa cta ttt ggc cgg gac cag cta acc gtt ttt 1206 Gly Asn Thr Pro Glu Gln Leu Phe Gly Arg Asp Gln Leu Thr Val Phe 380 385 390 agt gag gct ttg gct gca a c c c g a g c c agg ggt gaa tca gat tcg tta 1254 Ser Glu Ala Leu Ala Ala Thr Arg Ala Arg Gly Glu Ser Asp Ser Leu 395 400 405 gat ctt cag atg gca cat gat etc ttt tcc agt ccc aag gat a a c c a e 1302 Asp Leu Gln Met Ala His Asp Leu Phe Ser Ser Pro Lys Asp Asn His 410 415 420 gag ttt gcc ata gta cga gag aac ate aga cag aaa cta gat gcc att 1350 Glu Phe Ala He Val Arg Glu Asn He Arg Gln Lys Leu Asp Ala He 425 430 435 440 tgt act agt gta gaa act gaa cca atg aag tca gta aga aag ctt aag 1398 Cys Thr Ser Val Glu Thr Glu Pro Met Lys Ser Val Arg Lys Leu Lys 445 450 455 aga att caa cat ctt tat gct cga ttt gca ggc aga tta cgc tet gaa 1446 Arg He Glr. His Leu Tyr la Arg Phe Ala Gly Arg Leu Arg Ser Glu 460 465 470 gat gat gag ttc aag att ttg tet tcc ctt cat cct act cca gct gtt 1494 Asp Aso Glu Pge Lys He Ley Ser Ser Leu His Pro Thr Pro Ala Val 475 480 485 tgt ggg ttt cct atg gaa gat gca cgg aaa ttt att gcg gaa aat gaa 1542 Cys Gly Phe Pro Met Glu Asp Ala Arg Lys Phe He Ala Glu Asn Glu 490 495 500 atg ttt gac cga gga tta tac gct ggc cct gtt ggt ttc ttt gga gga 1590 Met Phe Asp ñrg Gly Leu Tyr Ala Gly Pro Val Gly Phe Phe Gly Gly 505 510 515 520 gct cag agt gat ttt tet gtt gga ata aga tet gcc ttg att gga aag 1638 Ala Gln Ser Asp Phe Ser Val Gly He Arg Ser Ala Leu He Gly Lys 525 530 535 gat gcc ggt gca tta ata tat gcg ggg ctt ggg gtt gta gaa gga agt 1686 Asp Ala Gly Ala Leu He Tyr Ala Gly Leu Gly Val Val Glu Gly Ser 540 545 550 gat cca gct cta gaa tgg cag gaa cta gag etc aag gca tcg cag ttt 1734 Asp Pro Ala Leu Glu Trp Gln Glu Leu Glu Leu Lys Ala Ser Gln Phe 555 560 565 atg aag ttg atg aaa tta gag gca cct gct ttg aag tga aattaggac 1783 Met Lys Leu Met Lys Leu Glu ña Pro Ala Leu Lys 570 575 580 tgaaaaatca ataaaaagat tgcgatagaa atttcagata attcgttagc cagaagarct 1843 tgttgagccg ttattaaatg tgtcctctac agtttaactg ataaccagat gaagaaaacc 1903 tatatetagt atatatatat ctaccatata taaatatatt gtacattttt gttttttetc 1963 ccacaaattt tatttgtatc tttttgaaca ttgtgecage tggtttattg tattccatta 2023 tcttaattca ttattcaata agatgtgtca attcattcaa aaaaaaaaaa aaaaa )078 <210> 19 <211> 581 <212> PRT <213> C Caattharantus roseus <400> 19 Met Ala Ser He Thr Gly His Cys Val Ala His Phe Thr Asp Leu Ser 1 5 10 15 Thr Arg Lys Ser Ser Phe Phe Ser Asn Ser Asn Asn Asn Ser Ser Leu 20 25 30 Phe Arg Arg Lys Ser Thr Asn He Val Thr Arg Lys Lys Tyr He Phe 35 40 45 Cys Ser Thr Ser Leu Ser Met Asn Gly Cys Asn Gly Asp Pro Arg Ala 50 55 .60 Pro Val Gly Thr He Glu Thr ñrg Thr Leu Pro ñla Val Ser Thr Pro 65 70 75 80 ñla Leu ñla Met Glu ñrg Leu Ser Ser ñla Val ñla ñsn Leu Lys Ser 85 90 95 Thr Leu Pro Ser ñla Gln Ser Gly He He arg Leu Glu Val Pro He 100 105 110 Glu Glu His He Glu ñla Leu ñsp Trp Leu His Ser Gln ñsp Gln Lys 115 120 125 ñsn Leu Leu Pro ñrg Cys Tyr Phe Ser Gly ñrg Ser Gln Val Thr Phe 130 135 140 Ser Asp Phe Thr Ser Asn Asp Leu Thr Asn Arg Asn Gly Ser Ala Ala 145 150 155 160 Asn Gly His Leu Gln Arg lie Ser Thr Ser Ser Asp Asp Lys Asn Leu 165 170 175 Val Ser Val Ala Gly Val Gly Ser Ala Val Leu Phe Arg Ser Pro Asn 180 185 190 Pro Phe Ser Phe Asp Asp Trp Leu Ser He Lys Arg Phe Leu Ser Lys 195 200 205 Asn Cys Pro Leu He Arg Ala Tyr Gly Ala He Arg Phe Asp Ala Arg 210 215 220 Pro His He Ala Pro Glu Trp Lys Ala Phe Gly Ser Phe Tyr Phe Met 225 230 235 240 Val Pro Gln Val Glu Phe Asp Glu Leu His Gly ser Ser Met He Ala 245 250 255 ñla Thr Val ñla Trp ñsp ñsn ñla Leu Ser Leu Thr Tyr Gln Gln ñla 260 265 270 He Val ñrg Leu Gln Thr Thr Met Glu Gln Val Ser Ser Thr Val Ser 275 280 285 Lys Leu ñrg Gln Asp Val Ser His Thr Ser Leu Val Ser Lys Ala Asn 290 295 300 He Pro Asp Arg Thr Ser Trp Asp Leu Thr Leu Asn Arg Val Leu Glu 305 310 315 320 Glu He Gly Asn Lys Tyr Ser Pro Leu Thr Lys Val Val Leu Ala ñrg 325 330 335 ñrg Ser Gln Val He Thr Thr Ser ñsp He ñsp Pro Leu ñla Trp Leu 340 345 350 Ser Ser Phe Lys Ala Asp Gly Lys Asp Ala Tyr Gln Phe Cys Leu Gln 355 360 365 Pro His Glu Ala Pro Ala Phe He Gly Asn Thr Pro Glu Gln Leu Phe 370 375 380 Gly Arg Asp Gln Leu Thr Val Phe Ser Glu Ala Leu Ala Ala Thr Arg 385 390 395 400 Ala ñrg Gly Glu Ser Asp Ser Leu Asp Leu Gln Met Ala His Asp Leu 405 410 415 Phe Ser Ser Pro Lys Asp Asn His Glu Phe ñla He Val ñrg Glu ñns 420 425 430 He ñrg Gln Lys Leu ñsp ñla He Cys Thr Ser Val Glu Thr Glu Pro 435 440 445 Met Lys Ser Val Arg Lys Leu Lys Arg lie Gln His Leu Tyr Ala Arg 450 455 460 Phe Ala Gly Arg Leu Arg Ser Glu Asp Asp Glu Phe Lys He Leu Ser 465 470 475 ' 480 Ser Leu His Pro Thr Pro Ala Val Cys Gly Phe Pro Met Glu Asp Ala 485 490 495 Arg Lys Phe He Ala Glu Ans Glu Met Phe Asp Arg Gly Leu Tyr Ala 500 505 510 Gly Pro Val Gly Phe Phe Gly Gly Ala Gln Ser Asp Phe Ser Val Gly 515 520 , 525 He Arg Ser Ala Leu He Gly Lys Asp Ala Gly Ala Leu He Tyr Ala 530 535 540 Gly Leu Gly Val Val Glu Gly Ser Asp Pro Ala Leu Glu Trp Gln Glu 545 550 555 560 Leu Glu Leu Lys Ala Ser Gln Phe Met Lys Leu Met Lys Leu Glu Ala 565 570 575 Pro Ala Leu Lys 580 <210> 20 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial: Primera <400> 20 tggtgatcca agagctccgg <210> 21 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial cebador <400> 21 cctggttgaa aggtctgtg 19 <210> 22 <211> <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial cebador <400> 22 gcaacacaat gccctgtg <210> 23 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial cebador <400> 23 gcaagcttca tgtaccttat cttggcc 27 <210> 24 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial cebador <400> 24 tagatgccat gggatgggag 20 <210> 25 <211> 3279 <212> ADN <213> Catharantus roseus <220> <221 > promotor <222> (1) .. (3275 <220> <221> promotor <222> 111 3275 <400> 25 aagcttcatg t acct t at ct tggccttact gataattaaa ctaaaatatt caatttattt 60 atcacatgac catatttttc ct gttecata t ta tggtgaa ttaaaaatat attaactgaa 120 aattattcag atcatacact aataaat ggt tag tatgtg atttatttgt taatttaaat 180 taacttttaa aattaattaa ttaaaaattt a t aaat taa gtatatttga taaettatte 240 agtcttatat ttaataatga 111 tt acaaa teaettaatt atttaatata cataattata 300 aattttaagt gaaattattt t actaaact t atgtcaaatt aaaatacttt t t t gcat ata 360 attactactt tegattataa atataaaggg ttttagcact atatatatta agggtcttga 420 aaataaaata attttttaac at agt atet t ttttatcctt tataagtgag aaaagaaaga 480 gatagtagaa gaaaaataaa tgaataaaaa ttatgggtaa atatgaaaag agttcaataa 540 atgctcattg tgagttgcaa aacgcttttt agt ttt tace atcgttgatg tctaaaattc 600 cttatacttt tgactggaga t agt a tcact tattaattaa tttagtattt aatttcagat 660 taagggtcag aettaagate aaaattcata aatctaaaca attcaaattt gct act t tag 720 tttcaatttt atcaaataga gctataattt aaataagttc atattetcat atataattta 780 ttcaacactc aattaaaaca atetagtaag taatettttt taatgattat gatgtectag 840 ggtgacaaat atatattaaa acgttacagt tet tat t cag cgacatagaa gt cgatt aac 900 aactaaaaca tegacaatat acctaggcca ttcaatgggt tggtttaaca tatattecag 960 aac t gat taa tt tggacaat t aaat aatca aaatattata taaaatttaa taaaatttaa 1020 aattttatat gaaattatta aatctaaact aatttaggaa aatttacggt gcacaaaatt 1080 actgcagca t gcgattgaaa tacaacataa aatcactctc gagataaaag gagetattea 1140 tagtggtgat t t ct aggagg attgaatgaa tgcattgaca gtt cga tccg atategaatt 1200 caaaactttt tacttgataa aattggtgga ggtacttaat agaggagtgc tttactatta 1260 gactatacgt tcgttgctct acaaagcact attttgattg gtatttttag taaagtgtaa 1320 ttcttttaga agttcataaa aaaattaaaa ttttgattaa aaaataagtt gaactcaaaa 1380 gaatattgag t aaa tat tga aaaaacaaca aaccaaggaa agt tet cgt t tcttttcata 1440 tet tcaagag tget tegatg ttcaaaette aaacacagac catecatatt tagaattata 1500 tttaaatcat ctaatgataa attttttttc cttttttggg aa acct aaa a tata ttt ttc 15c" gaagatcaaa taaaatagta gggact acat caaaactaat ttgtctaatc tgttccaaaa 1620 ttacatcaeg cttacattag ataagttatt ggtcacatgt tcaatcaaat ttatatatac 1680 tataaacaaa aaagtt t tat tattcttgct t acataaaga actattetag attgttggaa 1740 cttttaaagt tataaaaaat acttttaaat aagttgtttt gcaaaaaaa t aatataaaca 1800 atttcatttt taatcccaca aataaatagt tttaaaaaac acctttaaaa taaattttca 1860 ataaattttc tttaaagtta aaactaattt attttagagt caacaaataa attaagaaat 1920 aaacattttt tttgaataaa aatttgtttt aagacaacag gaaataaatt acactaatga 1980 gtaggaaata ggactcctgc aactcacggt aa taa taaac acaagtctaa tagttttaac 2040 tggatataar acaataaaca aatgtatcgt aactctcttt tageaettet aaccctaact 2100 caacactatc agtaattagt atagaacaaa ct cagt 11 ga acaactcgac cgtaaaaatc 2160 gaccatetaa aagaatctga acgaattaga ttttttgaag atagtttagg acagagatga 2220 acagttgaag aggggttcaa atttgctcaa ggttgaaaga gaccttctca aaagagaaga 2280 accaaactcc gatttaaaga aatcgaagag aaactatgee aatagatttt agaectagta 2340 aaaaaaaact ctaaagagaa aactaaaaat gatttgtaaa caaaataaga cttggagaaa 2400 t aaa aga aat agaagataga ttttcagatc aagataaaca ctctagtgta aatcaaggat 2460 ccat ttt ggt cgaaaggacg gacagagaaa gaggagaggt ggtttggcac aag t aag gga 2520 ggaagaagag aagaaggata aaattcaacg aacatttaat tcatacat aa tgaatattat 2580 ttatcaaaag aaaaataata gtaagaacaa aga tga t gga ataagtgaga aagtaataat 2640 ttattaataa aaatatcttt tattatgtca gatatttcat ttatatcaca tcctctctct 2700 aat aat aatg aaacaaaaga atatcatgaa aatattaaga aaaagaaaaa aaatcatgaa 2760 atactettte cagaagttga t gca t agat t agat gga te actattttat tcatatgaac 2820 ttgaattaat aa aag taaac tttgacaaaa aaattatcaa agtttttgac tataetttec 2880 attcacacgc tcattttctc cctttcttgc ctccttgttt gttgggtcaa aattgtaatc 2940 gcactacaca aaatggcctt aaggtaccat teatttecaa gaa cca agea ategtggaat 3000 tetatattag taccactttg attataaaat ttccacgcat ttccacgcat ttcataaaag 3060 tcctctggaa aat aaat aaa tatatataac t cct cct cct cctattttca ctattattat 3120 aaataaacct te aaat aat a tattatatat aagaaaattc ctcttagtct gtgtacatgt 3180 a taa a taaac ct agagact t ccccttcarg tttgcatcgc ttacaaagtt caccaatcag 3240 tctcattctc tctctctctc tctctctccc ateccatgg 3279 Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la practica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes.

Claims (31)

Reivindicaciones

1. Un método para inducir resistencia a patógenos en plantas, caracterizado porque las plantas se transforman con un cásete de expresión que contiene un gen que codifica para una isocorismato sintasa.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el gen que codifica para la isocorismato sintasa se selecciona de un grupo que consiste de en t C, orfA , pchA e ICS .

3. El método de conformidad con la reivindicación 2 , caracterizado porque el gen que codifica para la isocorismato sintasa es el gen ICS de Ca tha ran t us roseus .

4. El método de conformidad con las reivindicaciones 2 ó 3, caracterizado porque el gen que codifica para la isocorismato sintasa comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína de la SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16 ó SEQ ID NO: 19.

5. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque el gen que codifica para la isocorismato sintasa comprende la secuencia de nucleótidos del marco abierto de lectura de SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15 ó SEQ ID NO: 18.

6. El método de conformidad con las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque las plantas son adicionalmente transformadas con un cásete de expresión que contiene un gen que codifica para la isocorismato piruvato liasa.

7. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el gen que codifica para la isocorismato sintasa y el gen que codifica para la isocorismato piruvato liasa están presentes ambos en el mismo vector.

8. El método de conformidad con las reivindicaciones 6 ó , caracterizado porque el gen que codifica para la isocorismato piruvato liasa se selecciona del grupo que consiste en orfD y pchB .

9. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el gen que codifica para la isocorismato sintasa es en t C y que el gen que codifica para la isocorismato piruvato liasa es orfD . •

10. Una proteína que tiene actividad isocorismato sintasa, caracterizada por que es se aislada de Ca tha ran t us roseus (y tiene un peso 10 molecular de aproximadamente 67 kD) .

11. La proteína de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 19. 15

12. Una secuencia de nucleótidos, caracterizada porque codifica para la proteína de conformidad con las reivindicaciones 10 u 11. 20

13. Una secuencia de nucleótidos, caracterizada porque comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 18.

14. La secuencia de nucleótidos de 25 conformidad con las reivindicaciones 12 ó 13 caracterizada porque también comprende la región reguladora 5' que se encuentra naturalmente para regular la expresión del gen ICS en Ca th a ra n t u s roseus .

15. Una secuencia de nucleótidos, caracterizada porque comprende la región reguladora 5' que se encuentra naturalmente para regular la expresión del gen ICS en Ca tha ra n t us roseus .

16. Un promotor que puede inducirse por un patógeno, caracterizado porque comprende la región reguladora 5' que se encuentra naturalmente para regular la expresión del gen ICS en Ca tha ra n t us roseus .

17. El promotor que puede inducirse por un patógeno de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque comprende una secuencia de nucleótidos del nucleótido 1118 al nucleótido 3275 como se indica en la SEQ ID NO: 25.

18. El promotor que puede inducirse por un patógeno de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque comprende una secuencia de nucleótidos del nucleótido 1 al nucleótido 3275 como se indica en la SEQ ID NO: 25.

19. El promotor que puede inducirse por un patógeno de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque comprende una secuencia de nucleótidos del plásmido pMOG1431 (depositado bajo el número 101670 en el Centraal Boreau voor Schimmelcultures en Baarn, Holanda) localizada entre los sitios de restricción de HindII y Ncol como se muestra en la figura 3.

20. El uso de un promotor que puede inducirse por un patógeno de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19, que maneja la expresión de una proteína heteróloga.

21. Un uso de conformidad con la reivindicación 20, en donde la proteína heteróloga es una proteína antipatogénica seleccionada del grupo que consiste en quitinasas, gluconsas, osmotinas, magaininas, lectinas, sacárido oxidasas, toxinas de Ba ci l l us th ur in gl es i s , proteínas antifungicidas aisladas de Mi rabi l i s jalapa, Amaranthus , Raphanus , Brassica , Sinapis, Arabidopsis , Dahlia, Cnicus , Lathyrus , Clitoria, semillas de Allium, Aralia e Impatiens y proteínas albuminoides tales como la tionina, la napina, el inhibidor de la tripsina de la cebada, la gliadina de cereal y la alfa amilasa del trigo.

22. El uso de conformidad con la reivindicación 20, en donde la proteína heteróloga es una proteína capaz de inducir una respuesta hipersensible , preferiblemente seleccionada del grupo que consiste en las proteínas CF, Bs3 y PtO del tomate, Rpml y Rps2 de Arabidopsis thaliana , la proteína N del tabaco, las proteínas avr de Cladosporium fulvum, las harpinas de Erwinia y las proteínas derivadora (avrBsr3, avrRpml, avrRpt2) de Pseudomonas o Xanthomonas .

23. Un vector, caracterizado porque comprende una secuencia de nucleótidos de conformidad con las reivindicaciones 11 a 15.

24. Una cepa de Agrobecterium, caracterizada porque contiene un vector de conformidad con la reivindicación 23.

25. Células de plantas resistentes a patógenos, caracterizadas porque se transforman con un gen que codifica para la isocorismato s int asa .

26. Las células de plantas de conformidad con la reivindicación 25, caracterizadas porque el gen que codifica para la isocorismato sintasa se selecciona del grupo que consiste en en t C , orfA , pchA e ICS .

27. Las células de plantas de conformidad con la reivindicación 26, caracterizadas porque el gen que codifica para la isocorismato sintasa es el gen ICS de Ca tha ran t u s ros e u s .

28. Las células de plantas de conformidad con las reivindicaciones 25 a 27, caracterizadas porque comprenden adicionalmente un gen que codifica para la isocorismato piruvato liasa.

29. Las células de plantas de conformidad con la reivindicación 28, caracterizadas porque el gen de la isocorismato piruvato liasa se selecciona del grupo que consiste en orfD y pchB .

30. Las células de plantas de conformidad con la reivindicación 28, caracterizadas porque el gen que codifica para la isocorismato sintasa es en t C y el gen que codifica para la isocorismato piruvato liasa es orfD .

31. Plantas, caracterizadas porque comprenden células de plantas de conformidad con las reivindicaciones 25 a 30. Resumen de la Invención Esta invención describe un método para inducir resistencia a patógenos en plantas caracterizado porque las plantas son transformadas con un cassette de expresión que contiene un gen que codifica para la isocorismato sintasa. Más específicamente, este método se caracteriza porque el gen que codifica se selecciona del grupo que consiste en entC, orfA, pchA e ICS, siendo este ultimo preferido del gen ICS de Catharantus roseus. Otra realización de la invención es un método de acuerdo con el método descrito arriba caracterizado porque las plantas son además transformadas con un cassette de expresión que contiene un gen que codifica para una isocorismato piruvato liasa, preferiblemente en el mismo cassette de expresión que el gen codifica para la isocorismato sintasa. El gen que codifica para la isocorismato piruvato liasa es preferiblemente seleccionado del grupo que consiste en orfB y pchB . Otro aspecto de la invención es una proteína con actividad isocorismato sintasa aislada de Catharantus roseus. Otro aspecto de la invención es la secuencia de nucleótidos que comprende la región reguladora 5' de la que se sabe que naturalmente regula la expresión del gen ICS en Catharantus roseus.