JP2003513608A

JP2003513608A - イソコリスミ酸シンターゼおよび植物における耐性の誘導のためのその使用

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Publication number: JP2003513608A
Application number: JP2000541311A
Authority: JP
Inventors: フベルトゥスヨセフスマリアリントルスト，; ロベルトフェルポールテ，; マリアカターリーナフェルベルネ，; パウロエル．アシェ．モレノ，; テヘレンレオナルドウスヨハネスペトロネラファン; ヘオルヘヨゼフヴレムス，; アントンフェリックスクルース，; マールテンヘンドリックストイフェル，; ジェロームフベルティナヘンリクスフィクトルクステルズ，; ランベルトゥスヘンリクスシモンズ，; レオショードメルチャーズ，; ヨーンフェルディナンドボル，
Original assignee: シンジェンタモーヘンビー．ブイ．; ライフスユニバーシタイトライデン; カトリーケユニバーシタイトナイメヘン
Priority date: 1998-03-31
Filing date: 1999-03-25
Publication date: 2003-04-15
Also published as: MA24793A1; WO1999050423A2; AR018172A1; EP1066389A2; AU746787B2; CN1295619A; MXPA00009573A; PE20000358A1; AU3602599A; BR9909303A; CO5050251A1; CA2333433A1; PL343635A1; WO1999050423A3

Abstract

(57)【要約】本発明は、植物において病原体耐性を誘導するための方法を記載し、この方法は、イソコリスミ酸シンターゼをコードする遺伝子を保有する発現カセットで植物を形質転換することで特徴付けられている。より詳細には、この方法は、イソコリスミ酸シンターゼをコードする遺伝子を、ｅｎｔＣ、ｏｒｆＡ、ｐｃｈＡおよびＩＣＳ（好ましくは、Ｃａｔｈａｒａｎｔｕｓｒｏｓｅｕｓ由来のＩＣＳ遺伝子）からなる群から選択することで特徴付けられている。本発明の別の実施態様は、上記の方法に従う方法であって、イソコリスミ酸ピルベートリアーゼをコードする遺伝子を保有する発現カセット（好ましくは、イソコリスミ酸シンターゼをコードする遺伝子と同一の発現カセット上）で植物をさらに形質転換することで特徴付けられている。イソコリスミ酸ピルベートリアーゼをコードする遺伝子は、好ましくは、ｏｒｆＤおよびｐｃｈＢからなる群から選択される。本発明のさらなる局面は、Ｃａｔｈａｒａｎｔｕｓｒｏｓｅｕｓから単離されたイソコリスミ酸シンターゼ活性を有するタンパク質である。本発明のなおさらなる局面は、ＣａｔｈａｒａｎｔｕｓｒｏｓｅｕｓにおいてＩＣＳ遺伝子の発現を調節することが天然において見出されている５’調節領域を含むヌクレオチド配列である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の分野）本発明は、サリチル酸生合成経路中の遺伝子に関し、より詳細には、イソコリ
スミ酸を通るサリチル酸経路中の遺伝子に関し、そして植物におけるサリチル酸
を介する耐性の誘導のためのこれらの遺伝子の使用に関する。より詳細には、本
発明は、詳細には新規な植物イソコリスミ酸シンターゼ遺伝子による、サリチル
酸の生成のためのイソコリスミ酸シンターゼ（ＩＣＳ）遺伝子の使用に関し、よ
り詳細にはこのイソコリスミ酸シンターゼに加えてイソコリスミ酸ピルベートリ
アーゼの使用に関する。さらに、本発明はこの新規植物イソコリスミ酸シンター
ゼ遺伝子のプロモーターの、病原体誘導性プロモーターとしての使用に関する。

【０００２】（背景技術）病原体のチャレンジに際して、植物は、局所的かつ全身的の両方で作用する防
御機構を惹起することにより反応し得る。過敏性応答（ＨＲ）において、局所的
応答は特に、迅速な細胞壊死／アポトーシス（病変の形成として観察される）、
ならびに増殖阻害フェノール物質（フィトアレキシン）および感染特異的（ＰＲ
）タンパク質の蓄積からなる。また、細胞壁強化および細胞壁肥厚も観察される
。この結合型の、多因子防御応答は、病原体の増殖および蔓延の制限をもたらす
。

【０００３】全身的に、ＰＲタンパク質（これは強力な抗病原体効果を有する）の誘導が、
この過敏性応答の後に生じるが、これが、ＨＲの後に植物が示す全身性獲得耐性
（ＳｙｓｔｅｍｉｃＡｃｑｕｉｒｅｄＲｅｓｉｓｉｔａｎｃｅ）（ＳＡＲ）
の状態の有望な理由である。このＳＡＲの状態は、数週間持続し得、そして植物
を保護しなければ感受性である病原体から保護し得る。

【０００４】ＨＲおよびＳＡＲの両方の発生に関与するシグナル伝達経路は、ほとんど理解
されていない。初期の研究により、サリチル酸（ＳＡ）が局所的および全身的の
両方の実質的レベルまで蓄積することが示されている。また、植物をＳＡで処理
すると、ＰＲ遺伝子の発現レベルが増加し、そして病原体に対する植物の耐性が
増加する。このことは、ＳＡが、ＳＡＲの確立に重要な役割を果たすことを示唆
する（例えば、Ｒｙａｌｓ、ＰｌａｎｔＣｅｌｌ８、１８０９〜１８１９、
１９９６を参照のこと）。

【０００５】ＳＡの重要な役割に関するさらにより確固たる証拠が、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ
ｓｐｕｔｉｄａ由来のｎａｈＧ遺伝子を保有するトランスジェニック植物を作
製することにより得られた。ｎａｈＧ遺伝子の遺伝子産物は、ＳＡをヒドロキシ
ル化し、ＳＡを不活化する。ｎａｈＧトランスジェニックタバコおよびＡｒａｂ
ｉｄｏｐｓｉｓｔｈａｌｉａｎａ植物は、これらが有効なＨＲを惹起する能力
が弱められている。なぜなら、病原体が最初の感染部位から増殖して蔓延するか
らである（Ｇａｆｆｎｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２６１、７５４〜７５６、１９
９３；Ｄｅｌａｎｅｙら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２６６、１２４７〜１２５０、１９
９４）。ｎａｈＧトランスジェニック植物はまた、ＳＡＲ応答を惹起することに
おいて欠陥がある。

【０００６】しかし、過敏性応答の誘導のための代替的経路が存在することが明らかであり
、そしてトマトにおけるｎａｈＧの過剰発現は、それぞれＡｖｒ９およびＡｖｒ
２を含むＣｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍｆｕｌｖｕｍ種でＣｆ９またはＣｆ２植物
をチャレンジした後に生じる過敏性応答を弱めない（Ｈａｍｍｏｎｄ−Ｋｏｓａ
ｃｋ＆Ｊｏｎｅｓ、ＰｌａｎｔＣｅｌｌ８、１７７３〜１７９１、１９９６
）。

【０００７】植物疾患シグナル伝達におけるＳＡの役割についての概説は、Ｄｕｒｎｅｒら
、Ｔｒｅｎｄｓ. Ｐｌａｎｔ. Ｓｃｉ．２、２６６〜２７４、１９９７；Ｃ
ｈａｓａｎ、ＰｌａｎｔＣｅｌｌ７、１５１９〜１５２１，１９９５；Ｋｌ
ｅｓｓｉｇ＆Ｍａｌａｍｙ、ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６、１４３９〜
１４５８、１９９４に見出され得る。

【０００８】（発明の要旨）本発明は、植物において病原体耐性を誘導するための方法を記載し、この方法
は、イソコリスミ酸シンターゼをコードする遺伝子を保有する発現カセットで植
物を形質転換することで特徴付けられている。より詳細には、この方法は、イソ
コリスミ酸シンターゼをコードする遺伝子を、ｅｎｔＣ、ｏｒｆＡ、ｐｃｈＡお
よびＩＣＳ（好ましくは、Ｃａｔｈａｒａｎｔｕｓｒｏｓｅｕｓ由来のＩＣＳ
遺伝子）からなる群から選択することで特徴付けられている。この方法のために
使用され得る遺伝子が、配列番号１３、配列番号１５または配列番号１７に記載
される。

【０００９】本発明の別の実施態様は、上記の方法に従う方法であって、イソコリスミ酸ピ
ルベートリアーゼをコードする遺伝子を保有する発現カセットを有するベクター
（好ましくは、イソコリスミ酸シンターゼをコードする遺伝を含む発現カセット
と同一のベクター上）で植物をさらに形質転換することで特徴付けられている。
イソコリスミ酸ピルベートリアーゼをコードする遺伝子は、好ましくは、ｏｒｆ
ＤおよびｐｃｈＢからなる群から選択される。

【００１０】本発明の特定の実施態様は、上記の方法であって、イソコリスミ酸シンターゼ
をコードする遺伝子がｅｎｔＣであり、そしてイソコリスミ酸ピルベートリアー
ゼをコードする遺伝子がｏｒｆＤであることで特徴付けられている。

【００１１】本発明のさらなる局面は、Ｃａｔｈａｒａｎｔｕｓｒｏｓｅｕｓから単離さ
れたイソコリスミ酸シンターゼ活性を有するタンパク質である。このタンパク質
は、６７ｋＤの分子量を有する。このタンパク質は、好ましくは、配列番号１９
のアミノ酸配列を含む。

【００１２】また、本発明の一部は、このタンパク質をコードするヌクレオチド配列であり
、これは、好ましくは、配列番号１８のヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配
列である。

【００１３】本発明のさらなる局面は、ＣａｔｈａｒａｎｔｕｓｒｏｓｅｕｓにおいてＩ
ＣＳ遺伝子の発現を調節することが天然において見出されている５’調節領域を
含むヌクレオチド配列である。この調節領域は、病原体誘導性プロモーターとし
て使用され得、これは、抗真菌性特性、抗菌特性または抗ウイルス特性を有する
タンパク質の発現を駆動し得る。このようなタンパク質の例は、キチナーゼ、グ
ルカナーゼ、オスモチン、デフェンシン、マガイニン、セクロピン、リボザイム
である。あるいは、このような病原体誘導性プロモーターは、過敏性応答の誘導
を目的とするストラテジーにおける使用のために、エリシタータンパク質または
耐性遺伝子を発現するために使用され得る（ＷＯ９１／１５５８５を参照のこ
と）。上述の遺伝子を含むか、または上述の遺伝子で形質転換された、ベクター
、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉａ、植物細胞および植物が、本発明のさらなる部分を
形成する。

【００１４】（発明の詳細な説明）植物におけるサリチル酸の生合成は、トランス桂皮酸（ｔｒａｎｓｃｉｎｎａ
ｍｉｃａｃｉｄ）の合成および安息香酸への変換、続く２−ヒドロキシル化を
介して進行すると通常は考えられている。感染植物においては、この合成経路は
わずかに改変され得る。ここではトランス桂皮酸を使用して、それをオルトクマ
ル酸に変換し、次いでこれがサリチル酸に変換される。微生物において、サリチ
ル酸の生合成は、コリスミ酸からイソコリスミ酸へと進行することが公知である
（酵素イソコリスミ酸シンターゼ（ＩＣＳ）によって触媒される）。この変換に
必要とされる遺伝子は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（ＩＣ
Ｓ活性をコードするｐｃｈＡ遺伝子、Ｓｅｒｉｎｏ，Ｌら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇ
ｅｎｅｔ．２４９：、２１７−２２８、１９９５）、およびＥｓｃｈｅｒｉｓｃ
ｈｉａｃｏｌｉ（ＩＣＳ活性をコードするｅｎｔＣ遺伝子、Ｏｚｅｎｂｅｒｇ
ｅｒ，Ｂ．Ａ．ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７１、７７５−７８３、１９８
９）からクローニングされている。

【００１５】本発明者らは今回驚くべきことに、サリチル酸を生成するためのコリスミ酸経
路の使用を、イソコリスミ酸シンターゼをコードする遺伝子を保有する発現カセ
ットを用いて植物を形質転換することによって、この植物に導入し得ることを見
出した。この遺伝子は、本出願において提供される場合、上記に同定されたＰｃ
ｈＡ遺伝子およびｅｎｔＣ遺伝子のような細菌由来であるか、またはＰｓｅｕｄ
ｏｍｏｎａｓｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ由来のｏｒｆＡ遺伝子であるか、または
イソコリスミ酸シンターゼをコードする遺伝子が存在することが見出されている
植物由来（例えば、Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓｒｏｓｅｕｓ由来のＩＣＳ遺伝
子）のいずれかであり得る。未だ同定されていないが、イソコリスミ酸シンター
ゼ活性を有する他の遺伝子もまた、本発明において使用されることが認識される
。そのような遺伝子は、本発明において提示される配列由来の縮重プローブを用
いてそれらを探索することによって、細菌または植物から単離され得る。

【００１６】サリチル酸は、おそらくその相対的毒性が理由で、植物体内で迅速に不活化さ
れる（分解またはグリコシド化のいずれかによる）ことが公知である（そして、
このことはまた、本発明においても観察される）が、本発明者らはなお、イソコ
リスミ酸シンターゼをコードする遺伝子を用いて植物を形質転換した後に、サリ
チル酸濃度が増大することを見出し得た。さらに、本発明者らはまた、ほぼおそ
らくサリチル酸の過剰生成によって引き起こされる感染特異的タンパク質の誘導
を観察した。このことは、内因的に生成されたサリチル酸が、病原体耐性を付与
するようにこの植物を誘導することを導き得ることを示す。

【００１７】本発明において使用され得る遺伝子は、配列番号１３、１５、および１８にお
いて示される。この酵素をコードするヌクレオチド配列は、その得られる遺伝子
産物がなおイソコリスミ酸シンターゼ活性を有するかぎり、自由に変換され得る
ことが理解さなければならない。明らかである変換は、その遺伝子が形質転換さ
れる植物に対して最も類似のコドン使用頻度に適合するようなコドン使用頻度の
変換である。形質転換に使用されるポリヌクレオチドはまた、ｍＲＮＡの不安定
化をコードするモチーフおよび／または思いがけないスプライシング領域を除去
し得るという点で改変され得、その結果、このように改変されたポリヌクレオチ
ドの発現は、実質的に類似の酵素を産生する。

【００１８】本発明の遺伝子は、酵素的に活性なタンパク質をコードする。用語タンパク質
とは、ペプチド結合を通して連結したアミノ酸の配列を意味する。ポリペプチド
またはペプチドもまた、タンパク質とみなされる。本発明のタンパク質のムテイ
ンは、配列表に示されるタンパク質から、１つ以上のアミノ酸を置換、付加、お
よび／または欠失することによって得られるが、なおそれらの酵素活性を保持す
るタンパク質である。そのようなムテインは、インビボでタンパク質操作するこ
とによって（例えば、アミノ酸配列が作用を受けるように、酵素をコードし得る
オープンリーディングフレームを変換することによって）、容易に作製され得る
。アミノ酸配列における変換がその酵素活性を全く消滅しないかぎり、そのよう
なムテインは本発明に包含される。さらに、変異体は、配列表に示されるタンパ
ク質またはこれらのタンパク質をコードするＤＮＡ配列に由来するべきであるが
、生物学的活性を保持することが理解されるべきである。すなわち、変異タンパ
ク質と配列表に示されたタンパク質との間の中間体の全てまたは大部分は、酵素
的活性を有するはずである。大部分とは、中間体の３０％以上、好ましくは４０
％以上、より好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上、より好ましく
は７０％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、より好
ましくは９５％以上、より好ましくは９９％以上を意味する。

【００１９】本発明は、本発明に従う発現カセットを含むキメラＤＮＡ配列を提供する。用
語キメラＤＮＡ配列とは、天然にはどこにも存在しないＤＮＡ配列を含む任意の
ＤＮＡ配列を含むことを意味する。例えば、キメラＤＮＡは、植物ゲノムの天然
ではない位置の酵素をコードするオープンリーディングフレームを含むＤＮＡを
含むことを意味する。この植物ゲノムは通常、その天然の染色体位置にある１コ
ピーのこのオープンリーディングフレームを含むという事実にも関わらずである
。同様に、このオープンリーディングフレームは、それが天然に見出されない植
物ゲノム中か、またはそれが天然に見出されないレプリコンもしくはベクター（
例えば、細菌性プラスミドもしくはウイルスベクター）中に組み込まれ得る。キ
メラＤＮＡは宿主において複製可能なＤＮＡ分子に制限されないが、物理的に本
発明に従うオープンリーディングフレームに連結されているレプリコンへと（例
えば、特定のアダプター配列によって）連結され得るＤＮＡを含むこともまた意
味する。このオープンリーディングフレームは、調節エレメントの、その天然の
上流および下流に連結されていてもよいし、連結されていなくてもよい。

【００２０】オープンリーディングフレームはゲノムライブラリーに由来し得る。この後者
において、オープンリーディングフレームは、本発明に従うタンパク質をコード
するオープンリーディングフレームを構成するエキソンを分離する１つ以上のイ
ントロンを含み得る。オープンリーディングフレームはまた、中断されていない
１つのエキソンにより、または本発明に従うタンパク質をコードするｍＲＮＡに
対するｃＤＮＡによりコードされ得る。本発明に従うオープンリーディングフレ
ームはまた、１つ以上のイントロンが人工的に除去されたかまたは付加されたオ
ープンリーディングフレームを含む。これらの改変体の各々が、本発明に包含さ
れる。

【００２１】宿主細胞中で発現され得るために、本発明に従うキメラＤＮＡは、通常、この
ＤＮＡが宿主の生化学的機構により認識されるのを可能にし、そしてそのオーペ
ンリーディングフレームについてこの宿主中で転写および／または翻訳されるの
を可能にする調節エレメントとともに提供される。本発明に従うキメラＤＮＡは
、通常、転写開始領域（選択した宿主細胞中で発現され得る任意の遺伝子に適切
に由来し得る）、ならびにリボソーム認識および結合のための翻訳開始領域を含
む。真核生物細胞において、発現カセットは、通常、さらに、このオーペンリー
ディングフレームの下流に位置する転写終結領域を含み、これにより転写の終結
が可能になり、そして１次転写物のポリアデニル化が生じる。さらに、コドン使
用頻度は、選択した宿主の受容されたコドン使用頻度に適合され得る。さらに、
しばしば、遺伝子の発現産物の細胞下画分への標的化の原因となるシグナル配列
がコードされ得る。選択された宿主細胞におけるキメラＤＮＡ構築物の発現を支
配する原理は、一般に当業者に理解され、そして、発現可能なキメラＤＮＡ構築
物の構築は、いかなる種類の宿主細胞についても、それが原核生物細胞であって
もまたは真核生物細胞であっても、現在では慣用的である。

【００２２】オープンリーディングフレームが宿主細胞中で維持されるために、オープンリ
ーディングフレームは通常、選択された宿主細胞により認識および複製されるＤ
ＮＡに連結された本発明に従うオープンリーディングフレームを含むレプリコン
の形態で提供される。従って、レプリコンの選択は、選択された宿主の細胞によ
り主として決定される。特定の選択された宿主に適切なレプリコンの選択を支配
するような原理は、十分に当業者の範囲内である。

【００２３】特別な型のレプリコンは、それ自体またはその一部が別の宿主細胞（例えば、
植物細胞）へ転移可能であり、それにより本発明に従うオープンリーディングフ
レームが上記の植物細胞へと同時に転移し得るレプリコンである。このような能
力を有するレプリコンを、本明細書中でベクターと呼ぶ。このようなベクターの
例はＴｉプラスミドベクターであり、これは、適切な宿主（例えば、Ａｇｒｏｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）中に存在する場合、それ自体の一
部（いわゆるＴ領域）を植物細胞へと転移し得る。別の型のＴｉプラスミドベク
ター（ＥＰ０１１６７１８Ｂ１を参照のこと）が、キメラＤＮＡ配列を
植物細胞またはプロトプラストへ転移させるために現在慣用的に使用されており
、この植物細胞またはプロトプラストから、このキメラＤＮＡをそのゲノムに安
定に組み込む新規な植物が生成され得る。特に好ましい形態のＴｉプラスミドベ
クターは、（ＥＰ０１２０５１６Ｂ１およびＵＳ４，９４０，８３８
）で請求されているような、いわゆるバイナリーベクターである。本発明に従う
ＤＮＡを植物宿主に導入するために使用され得る他の適切なベクターは、二本鎖
植物ウイルス（例えば、ＣａＭＶ）および一本鎖ウイルス、ジェミニウイルスな
どから由来し得るようなウイルスベクター（例えば、非組み込み植物ウイルスベ
クター）から選択され得る。このようなベクターの使用は、特に植物宿主を安定
に形質転換することが困難である場合に有利であり得る。これは、木本の種、特
に木およびつる植物に関する場合であり得る。

【００２４】表現「本発明に従うキメラＤＮＡ配列をそのゲノム中に組み込んでいる宿主細
胞」とは、細胞ならびに、このような細胞を含むかまたはこのような細胞から本
質的になる多細胞生物を含むことを意味し、このような細胞は、上記のキメラＤ
ＮＡをそのゲノム中に安定に組み込み、それによりこのキメラＤＮＡを維持し、
そして好ましくは、１コピーのこのようなキメラＤＮＡを子孫細胞へと伝達する
（これが有糸分裂を通じてであろうとまたは減数分裂を通じてであろうと）。本
発明の好ましい実施態様に従って、１つ以上のコピーの上記キメラＤＮＡをその
ゲノム中に組み込み、そして１コピーまたは複数のコピーをその子孫に、好まし
くはメンデルの様式で伝達し得る細胞から本質的になる植物が提供される。植物
細胞のいくつかまたは全てにおける本発明に従うキメラＤＮＡの転写および翻訳
によって、酵素を生成する細胞が病原体感染に対して増強された耐性を示す。植
物細胞におけるＤＮＡの転写を支配する上記の原理は常に理解されるわけではな
いが、実質的に構成的な様式、すなわち、植物の実質的にほとんどの細胞型で深
刻な一時的制限および／または発達上の制限を実質的に伴わずに発現され得るキ
メラＤＮＡの作製は、現在慣用的である。この目的のために慣用的に使用される
転写開始領域は、カリフラワーモザイクウイルスから入手され得るプロモーター
であり、特に３５ＳＲＮＡおよび１９ＳＲＮＡ転写物プロモーターならびに
ＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのいわゆるＴ−ＤＮＡプ
ロモーターであり、特に言及されるべきは、ノパリンシンターゼプロモーター、
オクトピンシンターゼプロモーター（ＥＰ０１２２７９１Ｂ１に開示さ
れる）およびマンノピンシンターゼプロモーターである。さらに、実質的に構成
的であり得る植物プロモーター（例えば、イネアクチン遺伝子プロモーター）ま
たは例えば、器官特異的なプロモーター（例えば、根特異的プロモーターＲｏｌ
Ｄ、またはジャガイモ塊茎特異的パタチンプロモーター）が使用され得る。ある
いは、外部因子（最も適切な時点で適用され得る）による病原体耐性の誘導を可
能にする誘導性プロモーターが使用され得る。従って、誘導性プロモーターは、
望まれない効果（例えば、サリチル酸の相対的毒性に起因して生じ得る）を予防
する。誘導性プロモーターは、所定の遺伝子により誘導物質に対する曝露に応答
して生成される遺伝子生成物の量を増加し得る任意のプロモーターを含む。誘導
物質の非存在下では、このＤＮＡ配列は転写されない。代表的には、誘導性プロ
モーターに特異的に結合して転写を活性化する因子が不活性形態で存在し、これ
が次いで誘導物質により直接的か間接的に活性形態へと転換される。誘導物質は
、化学因子（例えば、タンパク質、代謝産物（糖、アルコールなど）、成長調節
因子、除草剤、またはフェノール化合物）、あるいは生理学的ストレス（熱、塩
、創傷、毒素などにより直接かけられるか、または病原体もしくは疾患因子（例
えば、ウイルス）の作用を介して間接的にかけられる）であり得る。誘導性プロ
モーターを含む植物細胞は、誘導物質を外部から適用することにより（例えば、
噴霧、散水、加熱、または類似の方法により）、誘導物質に曝露され得る。誘導
性プロモーターは、当業者に公知であり、そしておそらく本発明の遺伝子の発現
を駆動するために使用され得るいくつかが存在する。本発明に一致する使用に適
切な誘導性プロモーターとしては、熱ショックプロモーター、哺乳動物ステロイ
ドレセプター系および任意の化学的に誘導性のプロモーターが挙げられるが、こ
れらに限定されない。誘導性プロモーターの例としては、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ
ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒの誘導性の７０ｋＤ熱ショックプロモーター（Ｆｒ
ｅｅｌｉｎｇ，Ｍ．ら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１９、２９７〜３２３）
、およびエタノールにより誘導されるアルコールデヒドロゲナーゼプロモーター
（Ｎａｇａｏ，Ｒ．Ｔ．ら、Ｍｉｆｉｎ，Ｂ．Ｊ．（編）ＯｘｆｏｒｄＳｕｒ
ｖｅｙｓｏｆＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒａｎｄＣｅｌｌＢｉｏ
ｌｏｇｙ、第３巻、３８４〜４３８頁、ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ、
１９８６）が挙げられる。単一の化学物質により誘導可能であるプロモーターは
、特に有用である。最後の分類に関する例は、ＷＯ９０／０８８２６、ＷＯ
９３／２１３３４、ＷＯ９３／０３１２９４およびＷＯ９６／３７６０９に
記載されているプロモーターである。病原体誘導性プロモーターの例としては、
ジャガイモから入手可能なＰＲＰ１プロモーター（ｇｓｔ１プロモーターとも名
付けられる）（ＭａｒｔｉｎＮ．ら、（１９９３）、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎ
ｅｔ．２６３、１７９〜１８６）、Ｆｉｓ１プロモーター（ＷＯ９６／３４９
４９）、Ｂｅｔｖ１プロモーター（Ｓｗｏｂｏｄａ，Ｉ．ら、Ｐｌａｎｔ，
ＣｅｌｌａｎｄＥｎｖ．１８、８６５〜８７４、１９９５）、Ｖｓｔ１プロ
モーター（Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｒ．、Ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ、Ｕｎｉｖ．ｏｆ
Ｈｏｈｅｎｈｅｉｍ、１９９４；Ｓｃｈｕｂｅｒｔ，Ｒ．ら、ＰｌａｎｔＭ
ｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４、４１７〜４２６、１９９７）、セスキテルペンシクラー
ゼプロモーター（Ｙｉｎ，Ｓ．ら、ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．１１５、４３
７〜４５１、１９９７）、およびｇｓｔＡ１プロモーター（Ｍａｕｃｈ，Ｆ．お
よびＤｕｄｌｅｒ，Ｒ．、ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．１０２、１１９３〜１
２０１、１９９３）に言及され得る。もちろん、Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓｒ
ｏｓｅｕｓ由来のＩＣＳ遺伝子の調節領域もまた、本発明の一部を形成しており
、この点において使用され得る。

【００２５】構成性高レベルプロモーターおよび／または誘導性プロモーターがわずかに好
ましいというべきであるが、プロモーターの選択は重要ではない。さらに、特定
のエレメント（いわゆる、エンハンサー）の複製は、そのレジメ下でＤＮＡの発
現レベルをかなり増強し得ることが公知である（例えば、以下を参照のこと：Ｋ
ａｙＲ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２３６、１２９９〜１３０２、１９８７；Ｃａ
ＭＶ３５Ｓプロモーターの−３４３〜−９０の間の配列の複製は、そのプロモ
ーターの活性を増加する）。３５Ｓプロモーターに加えて、一倍または二倍に増
強された高レベルプロモーターの例は、光誘導性リブロースビスリン酸カルボキ
シラーゼ小サブユニット（ｒｂｃＳＳＵ）プロモーターおよびクロロフィルａ／
ｂ結合タンパク質（Ｃａｂ）プロモーターである。物理的に連結された異なるプ
ロモーター領域のエレメントを含む、ハイブリッドプロモーターもまた、本発明
に意図される。その周知の例は、いわゆるＣａＭＶ増強マンノピン（ｍａｎｎｏ
ｐｉｎｅ）シンターゼプロモーター（米国特許第５，１０６，７３９号）であり
、これは、ＣａＭＶエンハンサーに連結されたマンノピンシンターゼプロモータ
ーのエレメントを含む。

【００２６】本発明を例示する実施例において実証されるように、植物細胞においてオルガ
ネラに酵素を標的化することによって、サリチル酸の産生を増強し得る。このこ
とは、本発明の酵素の基質が特定のオルガネラにおいて豊富であるという事実に
よって説明され得る。特に、タバコ由来のシグナルペプチドを用いて葉緑体に標
的化することは、良好な結果を生じる。当然のことながら、他の供給源から得ら
れるシグナルペプチドが使用され得る。

【００２７】転写終結領域の必要性に関して、一般に、そのような領域が植物細胞における
転写の信頼性および効率性を増強すると考えられている。従って、転写終結領域
の使用は、本発明の状況において非常に好ましい。

【００２８】異なる植物種における本発明の適用可能性に関して、本発明の１つの特定の実
施態様は、一例として、トランスジェニックタバコおよびＡｒａｂｉｄｏｐｓｉ
ｓ植物に関して単に例示され、その実際の適用可能性は実際、これらの植物種に
限定されないと述べられるべきである。いくつかの形態の病原体の攻撃を受ける
任意の植物種が、本発明の遺伝子で形質転換され、この酵素が植物細胞のいくつ
かまたはすべてにおいて産生されるのを可能にし得る。

【００２９】本発明の実施態様のいくつかは、例えばいくつかの植物種が、現在のところは
遺伝的形質転換に対して扱えないために、現在のところは実施可能でないかもし
れないが、そのような植物種における本発明の実施は、単に時間の問題であり、
原理の問題ではない。なぜなら、遺伝的形質転換自体に対する受け易さは、本発
明の基本的な実施態様とは関係がないからである。

【００３０】植物種の形質転換は、現在、非常に多くの植物種（双子葉類および単子葉類の
両方を含む）について慣用的である。原則として、適切な先祖細胞が、植物体に
再生され得る限り、任意の形質転換法を使用して、本発明によるキメラＤＮＡを
この細胞に導入し得る。方法は、プロトプラストについてのカルシウム／ポリエ
チレングリコール法（Ｋｒｅｎｓ，Ｆ．Ａ．ら、Ｎａｔｕｒｅ２９６、７２〜
７４、１９８２；ＮｅｇｒｕｔｉｕＩ．ら、ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．
８、３６３〜３７３、１９８７）、プロトプラストのエレクトロポレーション（
ＳｈｉｌｌｉｔｏＲ．Ｄ．ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．３、１０９９〜１１
０２、１９８５）、植物材料へのマイクロインジェクション（Ｃｒｏｓｓｗａｙ
Ａ．ら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０２、１７９〜１８５、１９８６）
、種々の植物材料のＤＮＡ（または、ＲＮＡコートした）粒子ボンバードメント
（ＫｌｅｉｎＴ．Ｍ．ら、Ｎａｔｕｒｅ３２７、７０、１９８７）、（非組
込み）ウイルスでの感染などから適切に選択され得る。本発明による好ましい方
法は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介ＤＮＡ移入を含む。ＥＰＡ１２０５
１６および米国特許第４，９４０，８３８号において開示されるような、いわゆ
るバイナリーベクター技術の使用が特に好ましい。トマト形質転換は、好ましく
は、ＶａｎＲｏｅｋｅｌらによって本質的に記載されるように実施される（Ｐ
ｌａｎｔＣｅｌｌＲｅｐ．１２，６４４〜６４７、１９９３）。ジャガイモ
形質転換は、好ましくはＨｏｅｋｅｍａらによって本質的に記載されるように実
施される（Ｈｏｅｋｅｍａ，Ａ．ら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ７、２７
３〜２７８、１９８９）。一般に、形質転換の後、植物細胞または細胞群が、本
発明によるタンパク質をコードする核酸配列とともに同時移入した植物発現可能
遺伝子によってコードされる１つ以上のマーカーの存在について選択され、その
後に形質転換された材料を植物体に再生する。

【００３１】遺伝的形質転換に関して幾分より扱いにくいと考えられるが、単子葉植物は、
形質転換を受けやすく、そして稔性のトランスジェニック植物が形質転換された
細胞もしくは胚、または他の植物材料から再生され得る。現在のところ、単子葉
植物の形質転換のための好ましい方法は、胚、外植片、または懸濁細胞のマイク
ロプロジェクタイルボンバードメント、および直接的ＤＮＡ取り込みまたはエレ
クトロポレーションである（Ｓｈｉｍａｍｏｔｏら、Ｎａｔｕｒｅ３３８、２
７４〜２７６、１９８９）。トランスジェニックトウモロコシ植物は、ホスフィ
ノスリシン（ｐｈｏｓｐｈｉｎｏｔｈｒｉｃｉｎ）アセチルトランスフェラーゼ
（除草剤ホスフィノスリシンを不活化する酵素）をコードするＳｔｒｅｐｔｏｍ
ｙｃｅｓｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓｂａｒ遺伝子を、マイクロプロジェク
タイルボンバードメントによって、トウモロコシ懸濁培養の胚形成細胞に導入す
ることによって得られている（Ｇｏｒｄｏｎ−Ｋａｍｍ、ＰｌａｎｔＣｅｌｌ
，２，６０３〜６１８、１９９０）。コムギおよびオオムギのような他の単子葉
作物の糊粉プロトプラストへの遺伝物質の導入が報告されている（Ｌｅｅ，Ｐｌ
ａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．１３、２１〜３０、１９８９）。コムギ植物は、胚
形成懸濁培養物の樹立のための、老齢のぎっしりと詰まった小結節状の（ｃｏｍ
ｐａｃｔａｎｄｎｏｄｕｌａｒ）胚形成カルス組織のみを選択することによ
って、胚形成懸濁培養物から再生されている（Ｖａｓｉｌ、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎ
ｏｌ．８、４２９〜４３４、１９９０）。これらの作物のための形質転換系との
組み合わせは、本発明の単子葉植物への適用を可能にする。

【００３２】イネおよびトウモロコシのような商業的に重要な作物を含む単子葉植物はまた
、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株によるＤＮＡ移入を受けやすい（ＷＯ９４／０
０９７７；ＥＰ０１５９４１８Ｂ１；ＧｏｕｌｄＪ．ら、Ｐｌａｎｔ
．Ｐｈｙｓｉｏｌ．９５、４２６〜４３４、１９９１を参照のこと）。

【００３３】ＤＮＡ移入および再生の後、推定上形質転換された植物を、例えばサザン分析
を用いて、本発明によるキメラＤＮＡの存在、コピー数、および／またはゲノム
構成について評価し得る。さらに、またはあるいは、新たに導入されたＤＮＡの
発現レベルを、当業者に周知の技術であるノーザンおよび／またはウェスタン分
析を用いてなし得る。最初の分析（これは、必要に応じてである）の後、本発明
による新たに導入されたキメラＤＮＡの所望のコピー数および発現レベルを示す
形質転換された植物を、病原体に対する耐性レベルについて試験し得る。あるい
は、この選択された植物を、例えば耐性レベルを増強するためかまたは耐性を拡
大するためにさらなる遺伝子を導入するために、別の回の形質転換に供し得る。

【００３４】他の評価は、圃場条件下での病原体耐性の試験、稔性の確認、収量、および他
の特徴を含み得る。そのような試験は、現在、当業者によって慣用的に実施され
る。

【００３５】そのような評価の後、その形質転換された植物を直接的に生長させ得るが、通
常には、新しい品種の育種における親株、または雑種の作出における親株などと
して使用され得る。

【００３６】１つより多くのキメラ遺伝子を構成的に発現し得るトランスジェニック植物を
得るために、以下を含む多くの代替が利用可能である：Ａ．選択マーカー遺伝子に物理的に結合した多くの改変された遺伝子とのＤＮＡ
（例えば、バイナリープラスミド上のＴ−ＤＮＡ）の使用。この方法の利点は、
キメラ遺伝子が物理的に結合されており、従って単一のメンデル遺伝子座として
移動することである。Ｂ．各々がすでに１つ以上のキメラ遺伝子（好ましくは、選択マーカー遺伝子に
結合している）を発現し得るトランスジェニック植物の、別の選択マーカーに結
合された１つ以上のキメラ遺伝子を含むトランスジェニック植物由来の花粉との
交差授粉。その後、この交雑によって得られる種子は、２つの選択マーカーの存
在に基づいて、またはキメラ遺伝子自体の存在に基づいて選択され得る。その後
、選択された種子から得られる植物は、さらなる交雑のために使用され得る。原
理的に、このキメラ遺伝子は単一の遺伝子座上に存在せず、従ってこの遺伝子は
、独立した遺伝子座として分離し得る。Ｃ．各々が１つ以上のキメラ遺伝子および選択マーカーを有する、多くの複数の
キメラＤＮＡ分子（例えば、プラスミド）の使用。同時形質転換の頻度が高い場
合、１つのみのマーカーに基づく選択は十分である。他の場合において、１つよ
り多くのマーカーに基づく選択が好ましい。Ｄ．第１、第２（など）のキメラ遺伝子をすでに含むトランスジェニック植物の
、必要に応じて選択マーカー遺伝子を含む新たなキメラＤＮＡでの連続的形質転
換。方法Ｂにおいてと同様に、このキメラ遺伝子は、原理的には単一の遺伝子座
上には存在せず、従ってこのキメラ遺伝子は、独立した遺伝子座として分離し得
る。Ｅ．上述のストラテジーの組み合わせ。

【００３７】実際のストラテジーは、おそらく容易に決定されるようないくつかの考慮（例
えば、親株の目的（直接的な生長、育種プログラムにおける使用、雑種を産生す
るための使用））に依存し得るが、記載の発明に関して重要ではない。

【００３８】この状況において、イソコリスミ酸経路（ｉｓｏｃｈｏｒｉｓｍａｔｉｃｐ
ａｔｈｗａｙ）の酵素をコードし得るキメラＤＮＡをすでに含んでいる植物は、
例えばサリチル酸の産生を増強し、それによって誘導能力を増強し、それによっ
て耐性レベルを増強するために、本発明によるキメラＤＮＡを導入するための適
切な遺伝的バックグラウンドを形成し得ることが強調されるべきである。現在、
ＤＮＡと組み合わせて適切に使用され得るタンパク質に対応する他の遺伝子のク
ローニング、および同じものを相対的に過剰発現し得るトランスジェニック植物
の獲得、ならびに植物における（ｉｎｐｌａｎｔａ）病原耐性に対するそれら
の効果の評価は、当業者の範囲内である。

【００３９】病原に対する改良された耐性を有する、本発明によるサリチル酸を相対的に過
剰発現する植物またはその部分（植物品種を含む）は、圃場、温室、もしくは屋
内、または他の場所にて栽培され得る。植物またはその食用部分は、動物の飼料
もしくは人の消費のために使用され得るか、または食品、飼料、もしくは農業も
しくは産業の任意の形態での他の目的のために加工され得る。農業は、園芸、樹
芸、花卉栽培などを含むことを意味する。本発明による植物材料から利益を得る
産業は、製薬業、紙およびパルプ製造業、糖製造業、飼料および食品産業、酵素
製造業者などを含むがこれらに限定されない。本発明による植物またはその部分
の利点は、殺菌処理の必要性を低減し、従って材料のコスト、労働力、および環
境汚染を低減するか、またはそのような植物の産物（例えば、果実、種子など）
の保存期間を延長することである。本発明の目的での植物は、光合成し得、そし
ていくつかの形態の病原の攻撃を受ける多細胞生物を意味する。それらは、少な
くとも、被子植物ならびに裸子植物、単子葉植物ならびに双子葉植物を含む。

【００４０】句「酵素を相対的に過剰発現する植物」は、その植物中に天然に存在しないか
、または同一の酵素をコードする内因性遺伝子によって存在する場合、同じ量で
は存在しないか、またはその植物の同じ細胞、細胞区画、組織、もしくは器官中
に存在しないかのいずれかである導入遺伝子コード酵素を発現する細胞を含む植
物を意味する。

【００４１】本発明のさらなる局面は、Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓｒｏｓｅｕｓ由来のＩ
ＣＳ遺伝子の５’非翻訳領域に天然に存在する調節配列である。病原感染の際に
、このＩＣＳ遺伝子は高度に発現され、病原の誘導性を示すことが見出された。
病原誘導性プロモーター（例えば、上記のｐｒｐ１プロモーター）は、バイオテ
クノロジーによる耐性操作において非常に価値がある。

【００４２】本発明によるＩＣＳ調節領域と組み合わせて使用され得るタンパク質の例は、
以下を含むがこれらに限定されない：オオムギから入手可能であるβ−１，３−
グルカナーゼおよびキチナーゼ（ＳｗｅｇｌｅＭ．ら、ＰｌａｎｔＭｏｌ．
Ｂｉｏｌ．１２、４０３〜４１２、１９８９；ＢａｌａｎｃｅＧ．Ｍ．ら、Ｃ
ａｎ．Ｊ．ＰｌａｎｔＳｃｉ．５６，４５９〜４６６、１９７６；Ｈｏｊ
Ｐ．Ｂ．ら、ＦＥＢＳＬｅｔｔ．２３０、６７〜７１、１９８８；ＨｏｊＰ
．Ｂ．ら、ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．１３、３１〜４２、１９８９）、豆
（ＢｏｌｌｅｒＴ．ら、Ｐｌａｎｔａ１５７、２２〜３１、１９８３：Ｂｒ
ｏｇｌｉｅＫ．Ｅ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８
３、６８２０〜６８２４、１９８６；ＶｏｇｅｌｉＵ．ら、Ｐｌａｎｔａ１
７４、３６４〜３７２、１９８８）；ＭａｕｃｈＦ．およびＳｔａｅｈｅｌｉ
ｎＬ．Ａ．、ＰｌａｎｔＣｅｌｌ１、４４７〜４５７、１９８９）；キュ
ウリ（ＭｅｔｒａｕｘＪ．Ｐ．およびＢｏｌｌｅｒＴ．、Ｐｈｙｓｉｏｌ．
Ｍｏｌ．ＰｌａｎｔＰａｔｈｏｌ．２８、１６１〜１６９、１９８６）；西洋
ネギ（ＳｐａｎｕＰ．ら、Ｐｌａｎｔａ１７７、４４７〜４５５、１９８９
）；トウモロコシ（ＮａｓｓｅｒＷ．ら、ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．１
１、５２９〜５３８、１９８８）、オートムギ（ＦｉｎｋＷ．ら、Ｐｌａｎｔ
Ｐｈｙｓｉｏｌ．８８、２７０〜２７５、１９８８）、エンドウ（Ｍａｕｃｈ
Ｆ．ら、ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．７６、６０７〜６１１、１９８４；Ｍ
ａｕｃｈＦ．ら、ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．８７、３２５〜３３３、１９
８８）、ポプラ（Ｐａｒｓｏｎｓ，Ｔ．Ｊ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６、７８９５〜７８９９、１９８９）、ジャガイモ（Ｇａ
ｙｎｏｒＪ．Ｊ．、Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１６、５２１０、１９８
８；ＫｏｍｂｒｉｎｋＥ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ８５，７８２〜７８６、１９８８；ＬａｆｌａｍｍｅＤ．およびＲｏｘｂ
ｙＲ．、ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．１３、２４９〜２５０、１９８９）
、タバコ（例えば、ＬｅｇｒａｎｄＭ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４、６７５０〜６７５４、１９８７；ＳｈｉｎｓｈｉＨ．
ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４、８９〜９３、１９
８７）、トマト（ＪｏｏｓｔｅｎＭ．Ｈ．Ａ．およびＤｅＷｉｔＰ．Ｊ．
Ｇ．Ｍ．、ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．８９、９４５〜９５１、１９８９）、
コムギ（ＭｏｌａｎｏＪ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５４、４９０１〜
４９０７、１９７９）、マゲイニン、レクチン、Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉ
ｎｇｉｅｎｓｉｓから単離されたトキシン、Ｍｉｒａｂｉｌｉｓｊａｌａｐａ
から単離された抗真菌性タンパク質（ＥＰ０５７６４８３）、およびＡｍ
ａｒａｎｔｈｕｓから単離された抗真菌性タンパク質（ＥＰ０５９３５０
１および米国特許第５，５１４，７７９号）、アルブミン型タンパク質（例えば
、チオニン、ナピン、オオムギトリプシンインヒビター、穀物グリアジン、およ
びコムギαアミラーゼ、ＥＰ０６０２０９８）、Ｒａｐｈａｎｕｓ、Ｂｒ
ａｓｓｉｃａ、Ｓｉｎａｐｉｓ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ、Ｄａｈｌｉａ、Ｃｎ
ｉｃｕｓ、Ｌａｔｈｙｒｕｓ、およびＣｌｉｔｏｒｉａから単離されたタンパク
質（ＥＰ０６０３２１６）、シュウ酸オキシダーゼ（ＥＰ０６３６
１８１およびＥＰ０６７３４１６）、サッカライドオキシダーゼ（ＰＣＴ／
ＥＰ９７／０４９２３）、Ａｌｌｉｕｍ種子から単離された抗菌性タンパク質、
ならびにＡｒａｌｉａおよびＩｍｐａｔｉｅｎｓ由来のタンパク質（ＷＯ９５／
２４４８５）など。

【００４３】誘導性プロモーターの別の用途は、遺伝子−遺伝子（ｇｅｎｅ−ｆｏｒ−ｇｅ
ｎｅ）耐性相互作用において役割を果たすタンパク質（例えば、ＷＯ９１／１５
５８５に記載される）を駆動することである。そのようなタンパク質は、例えば
、Ｋａｒｒｅｒ，Ｅ．Ｅ．ら（ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．３６、６８１〜
６９０、１９９８）において開示されるような植物タンパク質、ｎｄｒ１および
ｅｄｓ１、トマト由来のＣｆタンパク質およびＰｔｏタンパク質、Ｃｌａｄｏｓ
ｐｏｒｉｕｍｆｕｌｖｕｍ由来のａｖｒ誘導因子タンパク質、ならびにＰｓｅ
ｕｄｏｍｏｎａｓ由来のａｖｒＰｔｏタンパク質である。

【００４４】本発明によるＩＣＳ調節領域を含む３ｋｂインサートを含むプラスミドｐＭＯ
Ｇ１４３１保有クローンを、ＣｅｎｔｒａａｌＢｕｒｅａｕｖｏｏｒＳｃ
ｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ、Ｂａａｒｎ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓに、１９
９９年３月１９日に番号１０１６７０で寄託した。

【００４５】実施例から、配列番号２５に列挙される約２Ｋｂのプロモーターフラグメント
が、すでに誘導特性を示すことが見出され得る。この２ｋｂのフラグメントは、
ＸｈｏＩ部位およびＮｃｏＩ部位にて配列番号２５の配列のスプライシングを受
け、それによって配列番号２５のヌクレオチド番号１１１８〜３２７５の部分を
形成することによって入手され得る。このフラグメントは、なお誘導性を維持し
ながら、さらに切り詰められ得ることが考えられる。

【００４６】以下の技術水準が、特に、本発明が属する分野の一般的な技術レベルを示すと
して考慮され得る。ＥＰ−Ａ３９２２２５Ａ２；ＥＰ−Ａ４４０３０
４Ａ１；ＥＰ−Ａ４６０７５３Ａ２；ＷＯ９０／０７００１Ａ１；米
国特許第４，９４０，８４０号。

【００４７】（トランスジェニック植物の評価）続いて、形質転換された植物を、所望の特性の存在および／または所望の特性
が発現される程度について評価する。第１の評価は、新しく導入された遺伝子の
発現レベル、発現されるサリチル酸のレベル、感染特異的タンパク質の誘導レベ
ル、形質転換された植物の病原耐性、所望の特性の安定な遺伝性、圃場試験など
を含み得る。

【００４８】所望される場合、第２に、その形質転換された植物は、他の品種（例えば、よ
り商業的価値の高い品種、または他の所望の特徴がすでに導入されている品種）
と交雑され得るか、または雑種種子の作出のために使用され得るか、または別の
回の形質転換などに供され得る。

【００４９】（実験項）ＤＮＡの単離、操作、および増幅のための標準的な方法、ならびに組換えＤＮ
Ａの複製のために適切なベクター、適切な細菌株、選択マーカー、培地などは、
例えばＭａｎｉａｔｉｓら、ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂ
ｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ第２版（１９８９）ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ
ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ；ＤＮＡＣｌｏｎｉｎｇ：
第Ｉ巻および第ＩＩ巻（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ編、１９８５）；およびＦｒｏｍ
ＧｅｎｅｓＴｏＣｌｏｎｅｓ（Ｅ．−Ｌ．Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ編、１９８
７）に記載される。

【００５０】（イソコリスミ酸シンターゼ活性のアッセイ）インキュベーション混合物（総容量２５０μｌ）は、０．１ＭＴｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ、ｐＨ７．５、２ｍＭコリスミ酸、１０ｍＭＭｇＣｌ₂、および酵素抽出
物（粗抽出物１２５μｌ、カラム画分１０〜１００μｌ）を含んだ。このインキ
ュベーションを、コリスミ酸の添加によって開始した。３０℃にて６０分間のイ
ンキュベーションの後、この反応を、６２．５μｌのメタノール−イソブタノー
ル（１：１ｖ／ｖ）の添加によって停止した。Ｐｏｕｌｓｅｎ，Ｃ．ら（Ｐｈ
ｙｔｏｃｈｅｍ．３０、２８７３〜２８７８、１９９１）に従って、このサンプ
ルを遠心分離し、そしてＨＰＬＣによって分析した。

【００５１】（実施例１ＣａｔｈａｒａｎｔｕｓｒｏｓｅｕｓからのＩＣＳの精製）Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓｒｏｓｅｕｓ（Ｌ．）Ｇ．Ｄｏｎ細胞培養物を
、以前に記載されるように（Ｍｏｒｅｎｏ，Ｐ．ら、ＰｌａｎｔＣｅｌｌＲ
ｅｐ．１２、７０２〜７０５、１９９３）、３０ｇ／ｌのスクロースを補充した
ＭＳ培地（ＭｕｒａｓｈｉｇｅおよびＳｋｏｏｇ、１９６２）中で増殖させた。
細胞培養物を、Ｍｏｒｅｎｏら（１９９３）によって記載されるように、Ｐｙｔ
ｈｉｕｍａｐｈａｎｉｓｅｒｍａｔｕｍ（ＣＢＳ，Ｂａａｒｎ，ＴｈｅＮｅ
ｔｈｅｒｌａｎｄｓ）濾液で誘発した。細胞を、誘発の２４時間後の吸引によっ
て収集し、水で１回洗浄し、直後に液体窒素下で凍結し、−８０℃で保存した。
６００グラムの凍結した細胞を、ステンレス鋼バケツを備えたＷａｒｉｎｇＢ
ｌｅｎｄｅｒ中でホモジナイズした。１ｇの新鮮物重量あたり、１ｍｌの抽出緩
衝液（０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１０％グリセロール（ｖ／ｖ
）、１ｍＭＤＴＴ、０．２ｍＭＰＭＳＦ、１０μＭロイペプチン、および１
ｍＭＥＤＴＡ）および５０ｍｇポリビニルピロリドンを添加した。融解後、こ
のホモジネートを、１０，０００ｇで３０分間遠心分離し、細胞細片を除去した
。上清を、粗抽出物と呼ぶ。以下の操作を、４℃にて行った。この粗抽出物を、
２００μｍガラス繊維フィルターを通す濾過によって明澄化した。この濾過液を
濃縮し、そして３０ｋＤカットオフ膜を備えた接線流限外濾過ユニット（Ｐｒｏ
ｖａｒｉｏ，ＰＡＬ−Ｆｉｌｔｒｏｎ，Ｂｒｅｄａ、ＴｈｅＮｅｔｈｅｒｌａ
ｎｄｓ）を用いて脱塩した。この脱塩した抽出物に、固体の硫酸アンモニウムを
、３０％飽和まで添加した。２０分間の攪拌の後、沈殿したタンパク質を、１０
，０００ｇで３０分間の遠心分離によって除去した。さらに硫酸アンモニウムを
、６０％飽和まで上清に加えた。沈殿したタンパク質を、１０，０００ｇで３０
分間の遠心分離によって回収した。ペレットを、５０ｍｌの緩衝液Ａ（２０ｍＭ
トリエタノールアミン−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、
１ｍＭＤＴＴ、および０．２ｍＭＰＭＳＦ）中に溶解し、そして固体ＫＣｌ
を２Ｍの最終濃度まで添加した。硫酸アンモニウム沈降によって、実質的なＩＣ
Ｓ活性の損失なしに、良好かつ再生可能な分画を得た。１３，０００ｇでの１５
分間の遠心分離後、上清を、緩衝液Ｂ（Ａ緩衝液＋２ＭＫＣｌ）中で平衡化さ
れたＰｈｅｎｙｌＳｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ−４Ｂカラム（７２ｍｌ、２．６
×１３．５ｃｍ）に適用した。３００ｍｌの緩衝液Ｂでのカラムの洗浄後に、Ｉ
ＣＳ活性を、緩衝液ＢからＡの７００ｍｌ直線勾配、続いて１５０ｍｌ緩衝液Ａ
で、１ｍｌ／分の流速で溶出した。１０ｍｌの画分を回収した。ＩＣＳ活性を含
む画分をプールし、そして限外濾過ユニットを使用して濃縮した。濃縮物を、緩
衝液Ａ中で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５カラム（ＰＤ−１０カラム、
Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ）でのゲル濾過によって脱塩し、そして２
０ｍｌＢｌｕｅＡカラムに適用した。適用後、流れを０．５時間停止し、結合
させた。このカラムを、４０ｍｌ緩衝液Ａで洗浄し、そしてＩＣＳを、緩衝液Ａ
から５０％緩衝液Ｂへの１６０ｍｌ勾配で溶出した。ブルーＡカラムでの色素ア
フィニティークロマトグラフィーは、必須の精製工程であることがわかり、これ
は、比活性において１５倍の増加を生じた。ＩＣＳ活性を含む画分をプールし、
濃縮し、緩衝液Ｃ（２０ｍＭトリエタノールアミン−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、５％
（ｖ／ｖ）グリセロールおよび１ｍＭＤＴＴ）で平衡化したＰＤ−１０カラム
で脱塩した。脱塩したサンプルを、緩衝液Ｃ中で平衡化したＭｏｎｏＱＨＲ
５／５カラムに適用した。このカラムを、１６ｍｌの緩衝液Ｃで洗浄し、そして
ＩＣＳを、緩衝液ＣからＤ（緩衝液Ｃ＋０．５ＭＫＣｌ）への８０ｍｌ直線勾
配で溶出した。流れは、０．５ｍｌ／分であり、そして０．５ｍｌの画分を回収
した。このカラムで、ＩＣＳ活性は、２つのピーク（ＩＣＳＩおよびＩＣＳ
ＩＩ）に分かれた。比活性は、ＩＣＳＩおよびＩＩについて、粗抽出物に対し
てそれぞれ、５３２倍および７５４倍に増加した。ＩＣＳＩおよびＩＩは、い
くつかの独立した精製において見出される数である１〜２の活性比を有した。い
ずれかのＩＣＳの再注入は、クロマトグラムにおいて注入されたＩＣＳのみの出
現を生じた。ＭｏｎｏＱ画分のネイティブのＰＡＧＥは、ＩＣＳＩはなおいく
らかの不純物を含むが、ＩＣＳＩＩは純粋な形態で得られることを示した。Ｉ
ＣＳＩＩのＳＤＳ−ＰＡＧＥは、このタンパク質が約６７ｋＤであることを示
した。

【００５２】（生化学的特徴）両方のイソ型は、７．０〜９．０の間の広いｐＨ至適での同一のｐＨ依存性、
およびｐＨ６．５および１０での最大活性の５０％を示した。Ｍｇ²⁺の存在は、
産物形成について必須であった。１０ｍＭの濃度でのＭｇ²⁺以外の二価イオンＭ
ｇ²⁺との別のインキュベーションは、いずれのイソ型の酵素活性も維持しなかっ
た。両方のイソ型のＩＣＳ活性は、アッセイ混合物におけるチロシン、フェニル
アラニン、またはトリプトファンの存在によって阻害されなかった。

【００５３】両方のイソ型は、コリスミ酸についてミカエリス−メンテン速度論を示した。
コリスミ酸についてのＫｍ値は、ＩＣＳＩおよびＩＩについてそれぞれ５５８
±５μＭおよび３１９±４１μＭであった。代表的な飽和曲線は、両方のイソ型
の酵素活性について、Ｍｇ²⁺濃度の関数として得られた。Ｍｇ²⁺についての飽和
曲線は、ミカエリス−メンテン速度論に従い、１．２７±０．３６ｍＭ（ＩＣＳ
Ｉ）および１．６３±０．１２ｍＭ（ＩＣＳＩＩ）のＫｍ値を有した。

【００５４】（実施例２）（ＣａｔｈａｒａｔｈｕｓｒｏｓｅｕｓからのＩＣＳ遺伝子のクローニン
グ）ＩＣＳＩＩを含むタンパク質バンドを、ネイティブＰＡＧＥゲルから単離し
、そしてトリプシンを用いて消化し、これは約５０ペプチドを生じた。５つのペ
プチドを単離し、そして配列決定した。これらのペプチドの内の１つが、細菌イ
ソコリスミ酸シンターゼ配列に高いホモロジーを示した。従って、縮重プライマ
ーを、このペプチドに対して開発した。このプライマーおよびｐＢｌｕｅｓｃｒ
ｉｐｔのＴ７プライマーを使用するＣ．ｒｏｓｅｕｓの誘発された細胞培養のｃ
ＤＮＡライブラリーに対するＰＣＲは、５２０ｂｐのフラグメントを生じた。こ
のフラグメントを、クローニングおよび配列決定した。この増幅されたＤＮＡの
４４０ｂｐフラグメントを、誘発されたＣ．ｒｏｓｅｕｓ細胞培養物のｃＤＮＡ
ライブラリーをスクリーニングするために使用した。４５０，０００プラークの
スクリーニングにより、５２の独立したポジティブプラークを同定された。これ
らの内の１２を単離し、同じ４４０ｂｐプローブを使用して２回目のスクリーニ
ングに供した。これにより、７の独立したポジティブプラークが同定された。こ
れらをインビボで切断し、そして部分的に配列決定した。最も長いクローンは、
２．１ｋｂのインサートを有し、そしてＡＴＧ開始コドンを含んだ。この最初の
ＡＴＧ周辺の領域（ＴＣＣＡＡＴＧＧＣ）は、植物のコンセンサス翻訳開始配列
（Ｌｕｔｃｋｅら、ＥＭＢＯＪ．、６、４３−４８、１９８７）と密接に類似
していた。２０８１ｂｐの完全長ｃＤＮＡは、５８１アミノ酸のタンパク質をコ
ードする１７４３ヌクレオチドのオープンリーディングフレームを含んだ。計算
された分子量は６４ｋＤであり、等電点は７．８８であった。このタンパク質は
、細菌由来のイソコリスミ酸シンターゼにおよそ３０％同一（４０％相同）であ
り、Ｃ−末端領域において最も相同であった。

【００５５】（異種プロモーターの制御下にあるＩＣＳを含むプラスミドの構築）ＩＣＳｃＤＮＡを、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＳＫ（Ｓｔｒａｔａｇ
ｅｎｅ，ＣＡＵＳＡ）のＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩ部位の間にクローニングし
た。全体のｃＤＮＡを含む２ｋｂｐのＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩフラグメントを、ベ
クターｐＩＣ−２０Ｈに連結し、ＢｇｌＩＩおよびＳａｌＩを用いて消化した。
ＨｉｎｄＩＩＩによるさらなる部分消化は、２ｋｂｐフラグメントを遊離させ、
そしてこれを、ＨｉｎｄＩＩＩを用いて消化したベクターｐＭＯＧ８４３にクロ
ーニングした。これは、ＩＣＳコード配列を、３５ＳＣａＭＶプロモーターか
ら下流に、そしてジャガイモＰＩ−ＩＩターミネーター配列の前に配置している
。このプラスミドを、ｐＭＯＧ８４３−ＩＣＳと称する。

【００５６】（ＩＣＳ発現カセットを含むバイナリーベクターの構築）最初に、３５ＳＣａＭＶプロモーター−ＧＵＳ−ｎｏｓターミネーターカセ
ットを、バイナリーベクターｐＭＯＧ２２に導入した。このことを、発現カセッ
トを含む２．６ｋｂｐフラグメントを遊離させる、ＸｂａＩおよびＥｃｏＲＩを
用いるｐＭＯＧ２２の消化、ならびにＸｂａＩおよびＥｃｏＲＩを用いて消化し
たｐＭＯＧ２２へのこのフラグメントの連結によって行った。生じるベクターは
、ｐＭＯ２２−ＧＵＳである。続いて、ＩＣＳ発現カセットを、ｐＭＯＧ２２−
ＧＵＳにクローニングした。このことは、ＸｂａＩを用いるｐＭＯＧ８４３−Ｉ
ＣＳの部分消化、およびＸｂａＩを用いて消化したｐＭＯＧ２２−ＧＵＳへの３
．２ｋｂｐフラグメントの連結によって行った。生じるプラスミドは、ｐＭＯＧ
２２−ＧＵＳ−ＩＣＳである。

【００５７】バイナリーベクターｐＭＯＧ２２−ＧＵＳ−ＩＣＳを、三親接合を使用して、
ＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓＬＢＡ４４０４株に移
した。タバコの形質転換を、ハイグロマイシンを選択マーカーとして使用して、
本質的に記載されたように（Ｈｏｒｓｃｈら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２２７、１２２
９−１２３１、１９８５）行った。

【００５８】（実施例３）（ｅｎｔＣ／ｏｒｆＤ構築物）ｅｎｔＣコード配列（Ｏｚｅｎｂｅｒｇｅｒら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１
７１、７７５−７８３、１９８９）を、Ｅ．ｃｏｌｉゲノムＤＮＡに対するＰＣ
Ｒ戦略を用いて単離した。この目的のために、プライマー１（配列番号１）およ
びプライマー２（配列番号２）を使用した。これらは、ｅｎｔＣの全体のコード
領域を増幅し、そして両方の末端に余分なＢａｍＨＩ部位を付加する。このフラ
グメントをベクターｐＭＯＧ８４３（このベクターでは、ＢａｍＨＩ部位がアダ
プター配列を介してＨｉｎｄＩＩＩ部位中へ導入された）にクローニングした。
生じるｐＭＯＧ８３４Ｂ−ｅｎｔＣは、３５ＳＣａＭＶプロモーターに結合し
、そしてジャガイモＰＩ−ＩＩ３’非翻訳配列が続くｅｎｔＣコードを含む。
次いで、３５Ｓ−ｅｎｔＣ−ＰＩカセットを、ＸｂａＩ消化およびｐＩＣ２０Ｈ
のＸｂａＩ部位へのクローニングによってｐＩＣ２０Ｈに移した。ｐＩＣ２０Ｈ
のＸｂａＩ部分消化を使用した。従って、このカセットは、ＥｃｏＲＶ部位に隣
接するＸｂａＩ部位にある。生じるベクターを、ｐＩＣ２０Ｈ−ｅｎｔＣと称す
る。葉緑体移行ペプチド（ｓｓと呼ぶ）（ＭａｚｕｒおよびＣｈｕｉ、Ｎｕｃｌ
．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１３、２３７３−２３８６、１９８５）を、プライマー
３（配列番号３）およびプライマー４（配列番号４）を使用してタバコゲノムＤ
ＮＡから単離した。プライマー３は、ｅｎｔＣ遺伝子の前に移行ペプチドを導入
するために使用されたＫｐｎＩ部位を含む。ベクターｐＩＣ２０Ｈ−ｅｎｔＣを
、ＮｃｏＩを用いて消化し、続いて付着部位を平滑化し、次いでＫｐｎＩを用い
て消化した。ＰＣＲ産物をＫｐｎＩを用いて消化し、そしてこのベクターにクロ
ーニングした。生じるベクターｐＩＣ２０Ｈ−ｅｎｔＣ＋ｓｓは、ｅｎｔＣコー
ド配列とともに移行ペプチドをインフレームで含み、ｅｎｔＣのコード配列の最
初の３６ヌクレオチドを欠く。コードされた短縮されたｅｎｔＣは、なお完全に
活性であった。

【００５９】Ｐｓｅｄｏｍｏｎａｓｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ由来のｏｒｆＤ配列を、プラ
イマー５（配列番号５）およびプライマー７（配列番号７）を使用して増幅した
。ｏｒｆＤコード配列と移行ペプチドコード配列との融合物を作製するために、
プライマー６（配列番号６）およびプライマー７を使用した。Ｒｕｂｉｓｃｏ葉
緑体標的化シグナルを、プライマー３およびプライマー８（配列番号８）を使用
して、タバコゲノムＤＮＡから増幅した。プライマーセット６／７および３／８
により得られた増幅フラグメントそれぞれを、ＮｄｅＩを用いて消化し、連結し
、そしてプライマーセット３および７を使用して再増幅した。生じるＰＣＲフラ
グメントは、移行ペプチドに対してインフレームに融合されたｏｒｆＤ配列を有
する。これを、ｏｒｆＤ＋ｓｓと称する。ｏｒｆＤおよびｏｒｆＤ＋ｓｓの両方
のＰＣＲ産物を、ＫｐｎＩおよびＢａｍＨＩを用いて消化し、そしてＫｐｎＩお
よびＢａｍＨＩを用いて消化したｐＭＯＧ８４３Ｂに連結した。生じた発現カセ
ットを、ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩ部位を使用して、バイナリーベクターｐＭＯ
Ｇ８００の中に移した。このことは、ｐＭＯＧ８００−ｏｒｆＤおよびｐＭＯＧ
８００−ｏｒｆＤ＋ｓｓと称する２つのバイナリーベクターを生じた。最後にｅ
ｎｃＣ配列を付加した。ベクターｐＩＣ２０Ｈ−ｅｎｔＣ＋ｓｓを、ＸｂａＩお
よびＳｃａＩを用いて消化し、そしてｅｎｔＣ＋ｓｓ発現カセットを含むＸｂａ
Ｉフラグメントを、ＸｂａＩ消化したｐＭＯＧ８００、ｐＭＯＧ８００−ｏｒｆ
Ｄ、およびｐＭＯＧ８００−ｏｒｆＤ＋ｓｓに連結して、以下の構築物を作製し
た：ｐＭＯＧ８００−ｅｎｔＣ＋ｓｓｐＭＯＧ８００−ｅｎｔＣ＋ｓｓ＋ｏｒｆＤｐＭＯＧ８００−ｅｎｔＣ＋ｓｓ＋ｏｒｆＤ＋ｓｓ。

【００６０】５つすべてのバイナリーベクターを、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅ
ｆａｃｉｅｎｓＬＢＡ４４０４株にエレクトロトランスフォーメーションによ
って形質転換した。タバコ（ＳａｍｓｕｎＮＮ）における形質転換を、カナマ
イシン選択を使用して記載のように行った。

【００６１】（実施例４）（形質転換体、酵素活性の分析）トランスジェニックＳａｍｓｕｎＮＮタバコ植物を、１６時間光レジメ下で
、２３〜２５℃で成長させた。これらの一次形質転換体の葉サンプルを収集し、
そしてさらなる使用まで−８０℃に保った。イソコリスミ酸シンターゼ、および
イソコリスミ酸ピルベートリアーゼの酵素活性の決定のための、ｅｎｔＣ＋ｏｒ
ｆＤ構築物およびｅｎｔＣ＋ｏｒｆＤ＋ｓｓ構築物を有する植物由来の抽出物。
タンパク質抽出物を、２．５ｇの葉材料および２．５ｍｌの抽出緩衝液を用いて
、本質的に記載されるように作製した（Ｍｏｒｅｎｏら、ＰｌａｎｔＣｅｌｌ
Ｒｅｐ．１４、１８８−１９１、１９９４）。すじとり（ｄｅｓｌａｔｉｎｇ
）を、１ｍＭＤＴＴを補充した１００ｍＭＴｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ＝７．５）
を含む緩衝液を用いて行った。イソコリスミ酸シンターゼ活性を、記載されるよ
うに測定した（Ｐｏｕｌｓｅｎら、Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍ．３０、２８７３−２８
７６、１９９１）。蛍光検出器およびインテグレーターを、ＨＰＬＣに連結し、
ＳＡの定量を可能にした（以下を参照のこと）。放射波長検出器を４０７ｎｍに
設定した。励起波長は３０５ｎｍである。両方の抽出物のＢａ−コリスミ酸との
インキュベーションは、イソコリスミ酸およびＳＡの形成をもたらし、このこと
はこれらの酵素が、移行ペプチドの存在に関わらず、活性型で産生されることを
示す。

【００６２】（形質転換体、サリチル酸蓄積の分析）これらの各々の構築物で作製された３つの一次形質転換体を、結合型および遊
離のＳＡの両方の蓄積について分析した。ポジティブおよびネガティブコントロ
ールとして、ＴＭＶ感染させた（感染２日後）ＳａｍｓｕｎＮＮタバコ植物お
よび未処置のＳａｍｓｕｎＮＮタバコ植物をそれぞれ含んだ。Ｍｅｕｗｌｙお
よびＭｅｔｒａｕｘ（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１４、５００−５０５、１
９９３）によって記載されたプロトコールの改変バージョンを使用した。約０．
５ｇの葉組織を、液体窒素中ですりつぶし、そして１ｍｌの９０％メタノールを
使用して、５分間ソニケーターバス中でインキュベートすることによって抽出し
た。次いで、この混合物を卓上遠心機中で１３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離
した。上清を除去し、そしてペレットを上記に要約したような手順を用いて、０
．５ｍｌの１００％メタノールを使用して再抽出した。次いで、上清画分を合わ
せて、溶媒を除去した。残渣を水中の５％ＴＣＡ２５０μｌに再懸濁し、遠心し
、そして上清を収集して、８００μｌの酢酸エチル：シクロヘキサン（１：１、
ｖ：ｖ）で２回抽出した。その後有機相から溶媒を除去した。次いで、残渣を１
０％メタノールを含む０．１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝５．０）４００
μｌに溶解した。ＨＰＬＣカラムに注入する前に、サンプルを手短に遠心分離し
、そして上清を新しいチューブに移した。ＳＡ−グルコシドの量を決定するため
に、酢酸エチル：シクロヘキサン抽出からの水相を、等量の８ＭＨＣｌの添加
により酸性化した。次いで、この混合物を８０℃で１時間インキュベートした。
この酸加水分解の後、ＳＡを、上記のようにＨＰＬＣ分析のために加工した酢酸
エチル：シクロヘキサンを使用して抽出した。

【００６３】サンプル２０μｌをカラムに注入した。逆相Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒ６０
ＲＰ−ＳｅｌｅｃｔＢ（５μｍ）１２５ｍｍ×４ｍｍカラムを使用した（Ｍ
ｅｒｃｋ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）。最初の試験の実行において
、Ｓｈｉｍａｄｚｕ蛍光ＨＰＬＣモニターＲＦ−５３０およびＣｈｒｏｍｐａｃ
ｋＫ−００１インテグレーターを使用して、ＳＡレベルを定量した。２回めの
試験の実行において、Ｓｈｉｍａｄｚｕ蛍光ＨＰＬＣモニターＲＦ−１０Ａｘ１
およびＣｈｒｏｍｐａｃｋＫ−００１インテグレーターを使用した。ＨＰＬＣ
溶離液は、０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ＝５．０）、１０％メタノールである。
使用した流速は、０．９ｍｌ／分であった。

【００６４】結果を表１に列挙する。結合型のサリチル酸（ＳＡ）の実質的な蓄積が、ｅｎ
ｔｃ_ss＋ｏｒｆｄおよびｅｎｔｃ_ss＋ｏｒｆｄ_ssを含む植物中で観察される。後
者の構築物を含む植物において、遊離のＳＡさえ、低いレベルであったが検出さ
れた。結合型のＳＡのいくぶんかの増加が、ｅｎｔｃ_ssのみで形質転換された植
物において見られた。ｏｒｆｄ単独で形質転換した場合、遊離のＳＡは観察され
なかった。

【００６５】表１：一次形質転換体の葉材料１ｇにおけるＳＡの蓄積、遊離のＳＡおよび酸
加水分解後。

【００６６】

【表１】（実施例５）（タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）を用いるトランスジェニックタバコ植物
の感染アッセイ）細菌のｅｎｔＣおよび／またはｏｒｆＤ構築物で形質転換したトランスジェニ
ックタバコ植物（実施例３および４に記載）を、植物病原体ウイルスの伝播を阻
害する能力について試験した。構築物あたり３つの植物体、系統ごとに８の植物
体、および植物体あたり３枚の葉に、１μｇ／ｍｌＴＭＶを含む懸濁物を接種
した。コントロールとして、タバコトランスジェニックＰ１２植物をこのアッセ
イに含めた。接種は、カーボランダム粉末およびウイルス懸濁物を植物にこすり
つけることによって行った。接種後、葉を水ですすいでカーボランダム粉末を再
度除去した。傷害のサイズ（葉あたり８の傷害）を、接種後２、４、および７日
後に測定した。データを、一方向ＡＮＯＶＡ試験（α＝０．０５、ＳＰＳＳ）を
使用して分析および加工した。植物体における傷害のサイズを、タバコＰ１２コ
ントロール植物において決定された傷害のサイズのパーセンテージとして表現し
た。

【００６７】表２：タバコＰ１２コントロール植物において測定された傷害の直径と比較し
た、トランスジェニックタバコにおいて測定された傷害の直径の表示。

【００６８】

【表２】（粉末状のかび（Ｏｉｄｉｕｍｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ）を用いるトラン
スジェニックタバコ植物の感染アッセイ）測定されたＳＡレベルに基づいて、タバコの一次形質転換体を、真菌感染に対
する増加された耐性の分析のために選択した。以下の系統を選択した：ｅｎｔｃ
＋ｏｒｆｄ_ss４、ｅｎｔｃ＋ｏｒｆｄ_ss１６およびｅｎｔｃ＋ｏｒｆｄ_ss２０。
これらの系統の次に、非トランスジェニックコントロール系統（ｗｔ／Ｎｔ／ｓ
ｓｎｎ−１およびｗｔ／Ｎｔ／ｓｓｎｎ−２）もまた、アッセイに含めた。６週
齢の植物を、１系統あたり７〜８植物体使用した。一次形質転換体ｅｎｔｃ＋ｏ
ｒｆｄｓｓ１６由来の植物は、非トランスジェニックコントロール植物および他
のトランスジェニック系統と比較してサイズが小さかった。これらの植物体に、
トマト真菌病原体Ｏｉｄｉｕｍｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎを、３．５×１０４
ｓｐ／ｍｌの胞子懸濁物（総容量４００ｍｌ）を噴霧することによって接種し
た。これらの植物体を、温度２０℃、相対湿度（ＲＨ）８０％、そして１６時間
の明条件／８時間の暗条件のレジメで試験した。疾患の重篤度を、粉末状のかび
によって覆われた葉の面積のパーセンテージを測定することによって決定した。
疾患の重篤度を、接種後１３日目、１８日目、および２４日目で点数化した。

【００６９】表３．接種後１３日目、１８日目、および２４日目（ｄａｉ）で測定したｅｎ
ｔｃ＋ｏｒｆｄ_ssを有するトランスジェニックタバコ系統の感染した葉の面積の
パーセンテージで示された疾患の重篤度。

【００７０】

【表３】注記：−＝植物体は試験中に枯死した。

【００７１】＊＝植物体は葉に壊死性の斑点を有する。

【００７２】トランスジェニック系統のＴ１後代を、目的の遺伝子の存在について選択しな
かった。ゆえに試験した集団は、分離したＴ−ＤＮＡ遺伝子座を有し得、従って
また、耐性の分離が観察され得る（ｅｎｔｃ＋ｅｎｔｃ_ss４系統におけるように
）。

【００７３】（実施例６）（ＰＲ遺伝子発現の誘導）ＲＮＡを、０．５グラムの葉材料から単離した。このＲＮＡを、液体窒素中で
葉材料をすりつぶすこと、および０．５ｍｌの緩衝液（０．３５Ｍグリシン、
０．０４８ＭＮａＯＨ、０．３４ＭＮａＣｌ、０．０４ＭＥＤＴＡ、およ
び４％ＳＤＳを含む）を用いる抽出によって抽出した。この調製物を、続いて
水で飽和したフェノール／クロロホルム（１：１、ｖ／ｖ）溶液、水で飽和した
フェノール溶液、および水で飽和したフェノール／クロロホルム溶液で抽出した
。水相に、半分の容量の８ＭＬｉＣｌを添加し、そしてサンプルを一晩４℃で
保存した。遠心分離後、ペレットを７０％エタノールで洗浄し、そして水に溶解
した。各サンプルのＲＮＡ１０μｇを、１時間５０℃にてグリオキシル化（ｇ
ｌｙｏｘｙｌａｔｅ）し、そして１５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝６
．５）中の１５ｍＭリン酸ナトリウム１．５％アガロースゲル上で、７Ｖ／
ｃｍで電気泳動した。陰極および陽極緩衝液を、規則的に混合した。このゲルを
Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋ナイロン転写メンブレンにブロットし、架橋させ、そして８
０℃で２時間ベーキングした（図２を参照のこと）。４５０ｂｐのＰｓｔＩフラ
グメントを、ＰＲ１ａプローブとして使用した。このプローブを、３２Ｐ−ｄＣ
ＴＰを使用してランダムプライム標識によって標識した。このブロットを一晩ハ
イブリダイズさせ、続いて２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを用いて６５℃にて洗浄
した。増感スクリーンを用いて、−８０℃で３日間露光した。手順は、Ｆｅｉｎ
ｂｅｒｇおよびＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ１３７、２
６６−２６７、１９８４；Ｃｏｒｎｅｌｉｓｓｅｎ，Ｂ．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉ
ｄｓＲｅｓ．１７、６７９９−６８１１、１９８７；Ｐａｙｎｅら、Ｐｌａｎ
ｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．１１、８９−９４、１９８８；Ｐｆｉｔｚｎｅｒら、Ｍ
ｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２１１、２９０−２９５、１９８８によって記載さ
れたものである。

【００７４】表４．インビトロならびに形質転換タバコＳａｍｓｕｎＮＮ植物およびコン
トロールのタバコＳａｍｓｕｎＮＮ植物における定性的なＳＡの合成およびＰ
Ｒ−１ａの発現。

【００７５】

【表４】結果を表４に示す。ＴＭＶ誘導植物およびｅｎｔＣ＋ｓｓ＋ｏｒｆＤ＋ｓｓを含
む形質転換植物において、ＰＲ−１ａ転写物の蓄積は明白である。

【００７６】（実施例７）（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａｃａｃｔｏｒｕｍを用いるＣａｔｈａｒａｔ
ｈｕｓｒｏｓｅｕｓにおける感染アッセイ）約５０ｃｍの高さのＣ．ｒｏｓｅｕｓ植物に、Ｐ．ｃａｃｔｏｒｕｍ菌糸の懸
濁物の小滴（１５−２０μｌ）を、葉に作製した０．５ｃｍの小さい切り込みに
滴下することによって接種して、真菌が浸透することを可能にした。真菌感染を
、１８℃および比較的高い湿度（±９０％）で、進行させることを可能にした。
感染部位を含む葉ディスク（直径＝１３ｍｍ）を、接種４８時間後および接種６
日後に収穫した。コントロール葉ディスクを、非感染葉組織および接種した葉
の非感染領域から、接種４８時間後に収穫した。

【００７７】（感染した葉組織からのＲＮＡ抽出およびｃＤＮＡ合成）ポリＡ＋ＲＮＡを、ＱｕｉｃｋｐｒｅｐＭｉｃｒｏｍＲＮＡ精製キット（
ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａＢｉｏｔｅｃｈ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓ
ｗｅｄｅｎ）を使用して、１００ｍｇの葉組織から収穫した。ｍＲＮＡの相対量
を、ＵＶイルミネーター上で、１０μｌのサンプルを４μｌの１μｇ／ｍｌエ
チジウムブロマイドとともにスポットすることによる核酸の可視化を用いて決定
した。２００単位のＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩＲＴＲＮＡｓｅＨ−逆転
写酵素（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）および１μｌオリゴ（ｄＴ）１２−１８プライ
マー（５００μｇ／ｍｌ、ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を製造業者によって記載される
ように使用して、等量のポリＡ＋ＲＮＡ（±１００ｎｇ）を用いてｃＤＮＡを合
成した。

【００７８】（ＰＣＲ模倣物の構築および競合的ＲＴ−ＰＣＲによるサンプルの分析）ｃＲＴ−ＰＣＲ実験においてコンペティターとして働くＰＣＲ模倣物の構築の
ために、以下のプライマーを開発した：ＦＲ−ｐＵＣ−２５７（配列番号９）５
’ＡＴＡＧＡＡＡＣＧＡＧＧＡＣＡＣＴＴＣＣＡＣＧＴＴＡＡ
ＧＧＧＡＴＴＴＴＧＧ３’、ＦＲ−ｐＵＣ−２５８（配列番号１０）
５’ＡＴＡＡＧＣＡＣＧＧＡＴＴＡＡＴＧＧＧＣＣＧＧＡＧＣ
ＴＧＡＡＴＧＡＡＧＣＣ３’、ＦＲ−ＩＣＳ−２５５（配列番号１１
）５’ＡＴＡＧＡＡＡＣＧＡＧＧＡＣＡＣＴＴＣＣ３’およびＦ
Ｒ−ＩＣＳ−２５６（配列番号１２）５’ＡＴＡＡＧＣＡＣＧＧＡＴＴ
ＡＡＴＧＧＧＣ３’。プライマーＦＲ−ｐＵＣ−２５７およびＦＲ−ｐＵ
Ｃ−２５８を使用して、ＰＣＲによってプラスミドｐＵＣ１８（Ｙａｎｉｓｃｈ
−Ｐｅｒｒｏｎ，Ｃ．ら、Ｇｅｎｅ３３、１０３−１１９、１９８５）から５
２７ｂｐフラグメントを増幅した。プライマーＦＲ−ＩＣＳ−２５５およびＦＲ
−ＩＣＳ−２５６を使用して、ＰＣＲによってこのＰＣＲ産物からの１μｌが増
幅されて、大量のＰＣＲ模倣物を産生した。プライマーＦＲ−ＩＣＳ−２５５お
よびＦＲ−ＩＣＳ−２５６は、ＩＣＳＤＮＡから４４３ｂｐのバンドを増幅し
、それゆえこのバンドは、１．５％アガロースゲル上で分離された場合に５２７
ｂｐの模倣物のバンドから容易に区別し得る。ＰＣＲ模倣物の希釈を、１０ｎｇ
／μｌ〜０．１ａｇ／μｌの範囲で、０．２μｇ／μｌグリコーゲンをキャリ
アとして含むＨ２Ｏ中で行った。

【００７９】ｃＤＮＡサンプルを、競合的ＰＣＲにおいて分析した。従って、０．５ｍｌチ
ューブ中で、２μｌのｃＤＮＡサンプルを１μｌの希釈した模倣物（量：０．１
ｐｇ、１０ｆｇ、１ｆｇ、および０．１ｆｇ）、または模倣物なしと合わせた。
ｃＤＮＡおよび模倣物の増幅を、１０μＭのプライマーＦＲ−ＩＣＳ−２５５お
よびＦＲ−ＩＣＳ−２５６、０．５μｌの２０ｍＭｄＮＴＰ、１×ＰＣＲ緩衝
液、ＭｇＣｌ２および２．５単位の組換えＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｇｉｂ
ｃｏＢＲＬ）を使用して行い、９５℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で
２分間の３５サイクルを進行させた。

【００８０】表５．Ｐ．ｃａｃｔｏｒｕｍによるＣ．ｒｏｓｅｕｓ葉の感染後の、コントロ
ールに対するＩＣＳメッセンジャーの誘導レベル。

【００８１】

【表５】注記：^a：コントロールと比較した、誘導の倍数。

【００８２】 ^b：非感染葉領域は、真菌によって感染されていない接種された葉の領域
である。

【００８３】（実施例８）（ｉＰＣＲによるＣａｔｈａｒａｎｔｈｕｓｒｏｓｅｕｓ由来のイソコリス
ミ酸シンターゼプロモーターの単離）ＰＣＲプライマーを、ＩＣＳｃＤＮＡ（配列番号１８）の配列に基づいて開
発した。ｉＰＣＲのためのプライマーＦＲ−ＩＣＳ−２５９５’ＴＧＧＴＧ
ＡＴＣＣＡＡＧＡＧＣＴＣＣＧＧ３’（配列番号２０）およびＦＲ−
ＩＣＳ−２６０５’ＣＣＴＧＧＴＴＧＡＡＡＧＧＴＣＴＧＴＧ３
’（配列番号２１）、ならびにネスト化ＰＣＲのためのＦＲ−ＩＣＳ−２６１
５’ＧＣＡＡＣＡＣＡＡＴＧＣＣＣＴＧＴＧ３’（配列番号２２）。
Ｃ．ｒｏｓｅｕｓゲノムＤＮＡを、ＣＴＡＢＤＮＡ抽出手順を使用して単離し
た。ゲノムＤＮＡを、５つの異なる酵素、ＤｄｅＩ、ＫｐｎＩ、ＭｓｃＩ、Ｎｃ
ｏＩ、およびＮｌａＩＶを用いる制限酵素消化に供した。制限酵素消化後、この
ＤＮＡをフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールを用いて抽出し、そ
してエタノールを用いて沈澱させた。ＤＮＡペレットを、５０μｌの水に溶解し
、そしてさらなる（ｆｕｒｅｒ）ｉＰＣＲのために２５μｌを使用した。この目
的のために、５単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を含む１×
リガーゼ緩衝液（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）中で、消化したＤＮＡ混合物の容量を３
００μｌに増加させた。この混合物を、１６℃で１６時間インキュベートした。
連結後、このＤＮＡを再度フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールで
抽出し、そしてエタノールで沈澱させ、そして５０μｌの水に溶解した。この混
合物２μｌを、１５０ｎｇのプライマーＦＲ−ＩＣＳ−２５９およびＦＲ−ＩＣ
Ｓ−２６９、１×ＫｌｅｎｔａｑＰＣＲ緩衝液、１０μＭｄＮＴＰならびに
１．０μｌ５０×ＡｄｖａｎｔａｇｅｃＤＮＡポリメラーゼ混合物（Ｃｌ
ｏｎｔｅｃｈ，ＰａｌｏＡｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いるＰＣＲ反応におけ
る鋳型として使用した。完全な反応混合物を、９４℃で１分間および３０サイク
ル（９４℃で３０秒間、５５℃で１分間、６８℃で３分間）に供した。次いで、
１μｌの反応物を、ネスト化ＰＣＲのために使用した。従って、同様の手順に従
ったが、プライマーＦＲ−ＩＣＳ−２６０を、プライマーＦＲ−ＩＣＳ−２６１
に置き換えた。ｉＰＣＲの結果を表６に列挙する。

【００８４】表６．５つの異なる酵素を用いたｉＰＣＲ後に得られたバンド

【００８５】

【表６】ＫｐｎＩ、ＮｃｏＩ、およびＮｌａＩＶ消化物から得られたＰＣＲバンドを、
Ｔ／ＡクローニングベクターｐＧＥＭ−Ｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローニングし
た。挿入物のＤＮＡ配列を決定した。

【００８６】（実施例９）（直接的ＰＣＲによるＩＣＳプロモーターの単離）新しいＰＣＲプライマーを、クローニングされたＰＣＲフラグメントのＤＮＡ
配列に基づいて開発した。これらのプライマーは、プロモーターのはるかに上流
の部分およびＩＣＳのオープンリーディングフレームのＡＴＧ翻訳開始コドンに
位置した。プライマーＦＲ−ＩＣＳ−２９５５’ＧＣＡＡＧＣＴＴＣＡ
ＴＧＴＡＣＣＴＴＡＴＣＴＴＧＧＣＣ３’（配列番号２３）は、プロ
モーターの上流の末端に位置し、そしてＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を導入する。そ
してプライマーＦＲ−ＩＣＳ−２９６５’−ＴＡＧＡＴＧＣＣＡＴＧＧ
ＧＡＴＧＧＧＡＧ３’（配列番号２４）は、ＩＣＳのＯＲＦの開始コドン
に位置し、ＡＴＧ翻訳開始部分と重複するＮｃｏＩ制限部位を導入する。これら
のプライマー（１５０ｎｇ）を、１×ＫｌｅｎｔａｑＰＣＲ緩衝液、１０μＭ
ｄＮＴＰおよび２．０μｌ５０×ＡｄｖａｎｔａｇｅｃＤＮＡポリメラー
ゼ混合物（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，ＰａｌｏＡｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）中でのＣ．
ｒｏｓｅｕｓゲノムＤＮＡに対するＰＣＲ反応において使用した。完全な反応混
合物（１００μｌ）を、９４℃で１分間および３０サイクル（９４℃で３０秒間
、５５℃で１分間、６８℃で４分間）に供した。正しいサイズ（３．０ｋｂ）の
バンドを、アガロースゲルから単離し、精製し、そして制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ
およびＮｃｏＩを用いて、ｐＵＣ１８に基づく高コピークローニングベクター（
Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ，Ｃ．，Ｖｉｅｉｒａ，Ｊ．，およびＭｅｓｓｉ
ｎｇ，Ｊ．（１９８５）Ｇｅｎｅ３３，１０３−１１９）にクローニングし、
プラスミドｐＭＯＧ１４３１を形成した。完全プロモーターフラグメントのＤ
ＮＡ配列（配列番号２５）を、自動化ＤＮＡ配列決定を用いて決定した。このプ
ロモーターを、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＮｃｏＩを使用して切断し、そしてＧＵＳ
イントロン（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎら、（１９８７）ＥＭＢＯＪ６：３９０１
−３９０７）、続いてジャガイモプロテイナーゼインヒビターＩＩ遺伝子の３’
非翻訳領域（Ｔｈｏｒｎｂｕｒｇら、１９８７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ
．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４、７４４−７４８）（これは、ポリアデニル化に必要な
配列を含む（Ａｎら、１９８９、ＰｌａｎｔＣｅｌｌ１、１１５−１２２）
）を含む、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｃｏＩ消化したクローニングベクターに連結した
。次いで、この発現ユニットを、制限酵素ＸｈｏＩを使用して、バイナリーベク
ターｐＭＯＧ８００（１９９３年８月１２日に、ＣｅｎｔｒａａｌＢｕｒｅａ
ｕｖｏｏｒＳｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ、Ｂａａｒｎ、ＴｈｅＮｅ
ｔｈｅｒｌａｎｄｓへＣＢＳ４１４．９３の名のもとで寄託した）に移した。
ＸｈｏＩを使用して、実際３．０ｋｂプロモーターの２．０ｋｂをバイナリーベ
クターに移した。発現ユニット全体を正しい方向で有するクローン（例えば、右
端の反復配列の次にＴ−ＤＮＡ上のプロモーターを有する）を選択した。生じた
プラスミドを、ｐＭＯＧ１４３３と名付けた。

【００８７】（実施例１０）（ＩＣＳプロモーター−ＧＵＳバイナリーベクターのジャガイモへの形質転換
）ｐＭＯＧ１４３３を、本質的にＨｏｅｋｅｍａら（Ｈｏｅｋｅｍａ，Ａ．ら、
Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ７．２７３−２７８、１９８９）によって記載
されたように、ジャガイモに形質転換した。手短に言えば、ジャガイモ（Ｓｏｌ
ａｎｕｍｔｕｂｅｒｏｓｕｍｃｖ．Ｋａｒｄａｌ）を、Ａｇｒｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍＥＨＡ１０５ｐＭＯＧ１４３３株で形質転換した。基本培養培地
は、必要な場合、８ｇ／ｌＤａｉｃｈｉｎ寒天で固形化した、最終ｐＨ５．８
（ＫＯＨを用いて調整した）を有する、ＭＳ塩類（ＭｕｒａｓｈｉｇｅおよびＳ
ｋｏｏｇ（１９６２）Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｐｌａｎｔ．１４、４７３）、Ｒ３ビタ
ミン（Ｏｏｍｓら、（１９８７）Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．７３、７
４４）、３０ｇ／ｌスクロース、０．５ｇ／ｌＭＥＳからなるＭＳ３０Ｒ３
培地である。Ｓｏｌａｎｕｍｔｕｂｅｒｏｓｕｍｃｖ．Ｋａｒｄａｌの塊茎
の皮をはぎ、９６％エタノール中で５秒間それらの塊茎を焼くことによって表面
を滅菌した。炎を滅菌水中で消し、そして約２ｍｍ厚の薄片に切断した。導管組
織から穴を有するディスクを切断し、そして２０分間、バイナリーベクターを含
むＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍＥＨＡ１０５１ｍｌあたり１−５×１０⁸
細菌を含むＭＳ３０Ｒ３培地中でインキュベートした。塊茎ディスクをＭＳ３０
Ｒ３培地を用いて洗浄し、そして固形化した培養後培地（ＰＭ）に移した。ＰＭ
は、３．５ｍｇ／ｌのゼアチンリボシドおよび０．０３ｍｇ／ｌのインドール酢
酸（ＩＡＡ）を補充したＭ３０Ｒ３培地からなった。２日後、ディスクを２００
ｍｇ／ｌのセフォタキシムおよび１００ｍｇ／ｌのバンコマイシンを含む新鮮な
ＰＭ培地に移した。３日後、塊茎ディスクを、２５０ｍｇ／ｌのカルベニシリン
および１００ｍｇ／ｌのカナマイシンを含むＰＭ培地からなる苗条誘導培地（Ｓ
ＩＭ）に移した。４〜８週間後、ディスクから現れた苗条を切断し、そして根付
け培地（１００ｍｇ／ｌのセフォタキシム、５０ｍｇ／ｌのバンコマイシン、お
よび５０ｍｌ／ｌのカナマイシンを含むＭＳ３０Ｒ３−培地）上に置いた。苗条
を、無菌的に分裂組織切断によって増殖させた。

【００８８】（実施例１１）（トランスジェニックジャガイモ植物におけるプロモーター機能の試験）ｐＭＯＧ１４３３ＩＣＳプロモーター−ＧＵＳ構築物を有するトランスジェ
ニックジャガイモ植物を、試験管内でインビトロで成長させ、そしてＧＵＳ遺伝
子の発現についてアッセイした。この目的のために、葉、茎、および根のサンプ
ルを取り、そして染色した（表７の結果）。ＧＵＳ発現レベルを、０が検出可能
な発現がなく、そして５は、本発明者らが、トランスジェニック植物の葉（ほと
んどないタバコ３５Ｓ−ＧＵＳ−トランスジェニック（９６３０６系統）の葉）
で観察した最も高いＧＵＳレベルである、０〜５までの尺度で視覚的に決定した
。この植物体の葉のサンプルを、内部参照のためにすべての実験において含めた
。

【００８９】表７：インビトロの小植物体の葉、茎、および根においてＩＣＳプロモーター
によって駆動されるＧＵＳ遺伝子の発現。

【００９０】

【表７】同じ齢のインビトロの小植物体を、ジャガイモ疫病を引き起こす真菌Ｐｈｙｔ
ｏｐｈｔｈｏｒａｉｎｆｅｓｔａｎｓで感染させた。高濃度の真菌胞子を含む
水の小滴を、葉の表面に塗布した。感染を、９６時間室温で放置し続けた。疾患
の症状を示す葉を、これらの小植物体から取り出し、そして組織化学的ＧＵＳ分
析（Ｇｏｄｄｉｊｎら、ＴｈｅＰｌａｎｔＪｏｕｒｎａｌ（１９９３）４（
５）：８６３−８７３）によってＧＵＳ遺伝子の発現について染色した。結果を
表８に列挙する。発現を、真菌感染から生じる傷害において、一次領域において
（ちょうど感染の部位周辺の領域）、そして葉の非感染部分（バックグラウンド
）においてモニターした。

【００９１】表８．Ｐ．ｉｎｆｅｓｔａｎｓによって感染したジャガイモインビトロ植物体
の葉におけるＩＣＳプロモーターによって駆動されるＧＵＳ遺伝子の発現。

【００９２】

【表８】注記：＊＝感染していない植物／疾患の症状が見られないプロモーターの能力をまた、Ｐ．ｉｎｆｅｓｔａｎｓによる感染の前後で、完
全に生育したジャガイモ植物の葉において試験した。接種の前に、葉を取り外し
、そしてＧＵＳの発現について染色した。次いで、これらの植物に５×１０⁵胞
子／ｍｌの胞子懸濁物を噴霧し、そして４日間（９６時間）感染を発達させた
。再度、葉を取り外し、そしてＧＵＳの発現について染色した。ＧＵＳ発現レベ
ルを、傷害、一次領域、および葉の非感染部分（バックグラウンド）において点
数化した。結果を表９に列挙する。

【００９３】表９．Ｐ．ｉｎｆｅｓｔａｎｓによる感染の前後のトランスジェニックジャガ
イモ植物の葉におけるＩＣＳプロモーターによって駆動されるＧＵＳ遺伝子の発
現。

【００９４】

【表９】

【００９５】

【表１０】

【００９６】

【表１１】

【００９７】

【表１２】

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、ベクターｐＭＯＧ２２ＧＵＳＩＣＳの模式図である。

【図２】図２は、示される構築物を有するトランスジェニック植物（構築物１つ当たり
３つのトランスジェニック系統）およびコントロール植物から単離されたＲＮＡ
の、ＰＲ−１ａについてのプローブでハイブリダイズされたノーザンブロットで
ある。

【図３】図３は、Ｃａｔｈａｒａｎｔｕｓｒｏｓｅｕｓのイソコリスミ酸シンターゼ
遺伝子の調節配列の制限部位に関する概略地図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者リントルスト，フベルトゥスヨセフスマリアオランダ国エヌエル−2331 ハーエスライデン，アンクファンデルムールストラート 70 (72)発明者フェルポールテ，ロベルトオランダ国エヌエル−2352 アーカーライデルドルプ，スパンヤールスラーン７ (72)発明者フェルベルネ，マリアカターリーナオランダ国エヌエル−2334 エーテーライデン，ブールーフェラーン 132 (72)発明者モレノ，パウロエル．アシェ．ブラジル国，サンパウロ，セーエーペー−05590−120 サンパウロ，カーサ２，ルアコロネルカミソン 220 (72)発明者ファンテヘレンレオナルドウスヨハネスペトロネラオランダ国エヌエル−3511 イックスヨットユトレヒト，コルテロゼンダール９ (72)発明者ヴレムス，ヘオルヘヨゼフオランダ国エヌエル−6584 アーハーモレンフーク，ミデルウェグ 12 アー (72)発明者クルース，アントンフェリックスオランダ国エヌエル−6533 エヌハーナイメヘン，アインシュタインストラート 93 (72)発明者ストイフェル，マールテンヘンドリックオランダ国エヌエル−2343 ベーエルウーフストヘースト，フルークーフェラーン 71 (72)発明者クステルズ，ジェロームフベルティナヘンリクスフィクトルオランダ国エヌエル−2406 フレーカーアルフェンアーンデンライン，ファザンストラート 32 (72)発明者シモンズ，ランベルトゥスヘンリクスオランダ国エヌエル−1187 ヴェーエルアムステルフニーン，アンネデフリースラーン 20 (72)発明者メルチャーズ，レオショードオランダ国エヌエル−2331 ベーゼッドライデン，ヴィルヘルミナブラデルクルーンウェグ 45 (72)発明者ボル，ヨーンフェルディナンドオランダ国エヌエル−2341 カーアーウーフストヘースト，ランゲフォール 34 Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD05 CA06 CA17 CA19 CB02 CD03 CD07 CD10 4B024 AA08 BA07 CA04 DA01 DA05 EA04 FA02 GA11 HA01 4B050 CC03 DD13 LL10 4B065 AA11X AA88X AA88Y AB01 BA01 CA27 CA53 【要約の続き】ａｒａｎｔｕｓｒｏｓｅｕｓにおいてＩＣＳ遺伝子の発現を調節することが天然において見出されている５’ 調節領域を含むヌクレオチド配列である。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】植物において病原体耐性を誘導するための方法であって、イ
ソコリスミ酸シンターゼをコードする遺伝子を保有する発現カセットで植物を形
質転換することで特徴付けられる、方法。
【請求項２】請求項１に記載の方法であって、イソコリスミ酸シンターゼ
をコードする前記遺伝子を、ｅｎｔＣ、ｏｒｆＡ、ｐｃｈＡおよびＩＣＳからな
る群より選択することで特徴付けられる、方法。
【請求項３】請求項２に記載の方法であって、イソコリスミ酸シンターゼ
をコードする前記遺伝子がＣａｔｈａｒａｎｔｕｓｒｏｓｅｕｓ由来のＩＣＳ
遺伝子であることで特徴付けられる、方法。
【請求項４】請求項２または請求項３に記載の方法であって、イソコリス
ミ酸シンターゼをコードする前記遺伝子が配列番号１４、配列番号１６または配
列番号１９のタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むことで特徴付けら
れる、方法。
【請求項５】請求項５に記載の方法であって、イソコリスミ酸シンターゼ
をコードする前記遺伝子が配列番号１３、配列番号１５または配列番号１８のオ
ープンリーディングフレームのヌクレオチド配列を含むことで特徴付けられる、
方法。
【請求項６】請求項１〜５のいずれかに記載の方法であって、イソコリス
ミ酸ピルベートリアーゼをコードする遺伝子を保有する発現カセットで植物をさ
らに形質転換することで特徴付けられる、方法。
【請求項７】請求項６に記載の方法であって、イソコリスミ酸シンターゼ
をコードする前記遺伝子、およびイソコリスミ酸ピルベートリアーゼをコードす
る前記遺伝子の両方が同一のベクター上に存在することで特徴付けられる、方法
。
【請求項８】請求項６または請求項７に記載の方法であって、イソコリス
ミ酸ピルベートリアーゼをコードする前記遺伝子をｏｒｆＤおよびｐｃｈＢから
なる群より選択することで特徴付けられる、方法。
【請求項９】請求項８に記載の方法であって、イソコリスミ酸シンターゼ
をコードする前記遺伝子がｅｎｔＣであり、そしてイソコリスミ酸ピルベートリ
アーゼをコードする前記遺伝子がｏｒｆＤであることで特徴付けられる、方法。
【請求項１０】イソコリスミ酸シンターゼ活性を有するタンパク質であっ
て、該タンパク質はＣａｔｈａｒａｎｔｕｓｒｏｓｅｕｓから単離される（そ
して約６７ｋＤの分子量を有する）、タンパク質。
【請求項１１】請求項１０に記載のタンパク質であって、該タンパク質が
配列番号１９のアミノ酸配列を含むということで特徴付けられる、タンパク質。
【請求項１２】請求項１０または請求項１１に記載のタンパク質をコード
する、ヌクレオチド配列。
【請求項１３】配列番号１８のヌクレオチド配列を含むことで特徴付けら
れる、ヌクレオチド配列。
【請求項１４】請求項１２または請求項１３に記載のヌクレオチド配列で
あって、該ヌクレオチド配列が、Ｃａｔｈａｒａｎｔｕｓｒｏｓｅｕｓにおい
てＩＣＳ遺伝子の発現を調節することが天然において見出されている５’調節領
域もまた含むということで特徴付けられる、ヌクレオチド配列。
【請求項１５】ＣａｔｈａｒａｎｔｕｓｒｏｓｅｕｓにおいてＩＣＳ遺
伝子の発現を調節することが天然において見出されている５’調節領域を含む、
ヌクレオチド配列。
【請求項１６】病原体誘導性プロモーターであって、該プロモーターが、
ＣａｔｈａｒａｎｔｕｓｒｏｓｅｕｓにおいてＩＣＳ遺伝子の発現を調節する
ことが天然において見出されている５’調節領域を含むということで特徴付けら
れる、病原体誘導性プロモーター。
【請求項１７】請求項１６に記載の病原体誘導性プロモーターであって、
該プロモーターが、配列番号２５において示されるヌクレオチド１１１８からヌ
クレオチド３２７５までのヌクレオチド配列を含むことで特徴付けられる、病原
体誘導性プロモーター。
【請求項１８】請求項１７に記載の病原体誘導性プロモーターであって、
該プロモーターが、配列番号２５において記載されるヌクレオチド１からヌクレ
オチド３２７５までのヌクレオチド配列を含むことで特徴付けられる、病原体誘
導性プロモーター。
【請求項１９】請求項１６に記載の病原体誘導性プロモーターであって、
該プロモーターが、図３に示される制限部位ＨｉｎｄＩＩＩとＮｃｏＩとの間に
位置するプラスミドｐＭＯＧ１４３１（第１０１６７０号という名でオランダ国
バールン、セントラールビューローフォールスヒメルクルトゥレスに寄託さ
れている）由来のヌクレオチド配列を含むことで特徴付けられる、病原体誘導性
プロモーター。
【請求項２０】異種タンパク質の発現を駆動するための、請求項１６〜１
９のいずれかに記載の病原体誘導性プロモーターの使用。
【請求項２１】請求項２０に記載の使用であって、前記異種タンパク質が
、キチナーゼ、グルカナーゼ、オスモチン、マガイニン、レクチン、サッカリド
オキシダーゼ、オキザレートオキシダーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇ
ｉｅｎｓｉｓ由来の毒素、Ｍｉｒａｂｉｌｉｓｊａｌａｐａから単離された抗
真菌性タンパク質、Ａｍａｒａｎｔｈｕｓから単離された抗真菌性タンパク質、
Ｒａｐｈａｎｕｓから単離された抗真菌性タンパク質、Ｂｒａｓｓｉｃａから単
離された抗真菌性タンパク質、Ｓｉｎａｐｉｓから単離された抗真菌性タンパク
質、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓから単離された抗真菌性タンパク質、Ｄａｈｌｉａ
から単離された抗真菌性タンパク質、Ｃｎｉｃｕｓから単離された抗真菌性タン
パク質、Ｌａｔｈｙｒｕｓから単離された抗真菌性タンパク質、Ｃｌｉｔｏｒｉ
ａから単離された抗真菌性タンパク質、Ａｌｌｉｕｍの種から単離された抗真菌
性タンパク質、Ａｒａｌｉａから単離された抗真菌性タンパク質およびＩｍｐａ
ｔｉｅｎｓから単離された抗真菌性タンパク質、ならびにアルブミン型タンパク
質（例えば、チオニン）、ナピン、オオムギトリプシンインヒビター、穀物グリ
アジンならびにコムギαアミラーゼからなる群より選択される抗病原性タンパク
質であることで特徴付けられる、使用。
【請求項２２】請求項２０に記載の使用であって、前記異種タンパク質が
、過敏応答を誘導し得るタンパク質であって、好ましくは、トマト由来のＣｆタ
ンパク質、Ｂｓ３タンパク質およびＰｔｏタンパク質、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ
ｔｈａｌｉａｎａ由来のＲｐｍ１およびＲｐｓ２、タバコ由来のＮタンパク質
、Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍｆｕｌｖｕｍ由来のａｖｒタンパク質、Ｅｒｗｉ
ｎｉａ由来のハルピンならびにＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓまたはＸａｎｔｈｏｍｏ
ｎａｓ由来のエリシタータンパク質（ａｖｒＢｓ３、ａｖｒＲｐｍ１、ａｖｒＲ
ｐｔ２）からなる群より選択されるタンパク質であることで特徴付けられる、使
用。
【請求項２３】請求項１１〜１５のうちの１項に記載のヌクレオチド配列
を含む、べクター。
【請求項２４】請求項２３に記載のベクターを含む、Ａｇｒｏｂａｃｔｅ
ｒｉｕｍ株。
【請求項２５】病原体に耐性である植物細胞であって、該植物細胞がイソ
コリスミ酸シンターゼをコードする遺伝子で形質転換されていることで特徴付け
られる、植物細胞。
【請求項２６】請求項２５に記載の植物細胞であって、イソコリスミ酸シ
ンターゼをコードする前記遺伝子がｅｎｔＣ、ｏｒｆＡ、ｐｃｈＡおよびＩＣＳ
からなる群より選択されることで特徴付けられる、植物細胞。
【請求項２７】請求項２６に記載の植物細胞であって、イソコリスミ酸シ
ンターゼをコードする前記遺伝子がＣａｔｈａｒａｔｕｓｒｏｓｅｕｓ由来の
ＩＣＳ遺伝子であることで特徴付けられる、植物細胞。
【請求項２８】請求項２５〜２７のいずれかに記載の植物細胞であって、
該植物細胞がさらにイソコリスミ酸ピルベートリアーゼをコードする遺伝子を含
むことで特徴付けられる、植物細胞。
【請求項２９】請求項２８に記載の植物細胞であって、イソコリスミ酸ピ
ルベートリアーゼをコードする前記遺伝子がｏｒｆＤおよびｐｃｈＢからなる群
より選択されることで特徴付けられる、植物細胞。
【請求項３０】請求項２８に記載の植物細胞であって、イソコリスミ酸シ
ンターゼをコードする前記遺伝子がｅｎｔＣであり、そしてイソコリスミ酸ピル
ベートリアーゼをコードする前記遺伝子がｏｒｆＤであることで特徴付けられる
、植物細胞。
【請求項３１】請求項２５〜３０のいずれかに記載の植物細胞を含む、植
物。