CN104293805A - 一种重组脂氧合酶及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种重组脂氧合酶PhLOX及其制备方法，该PhLOX同时具有脂氧合酶、氢过氧化物裂解酶、丙二烯氧化物合成酶活性。制备过程中，从坛紫菜中提取总RNA，根据脂氧合酶基因序列设计引物，通过RACE技术扩增出全长cDNA序列，重组到表达载体pET-28a，转化大肠杆菌E.coli BL21，筛选出阳性克隆，通过诱导表达产生表达量为2mg/L菌液的多功能脂氧合酶。与现有技术中的脂氧合酶相比，该重组脂氧合酶具有多种酶功能，没有严格的底物专一性，可形成多种结构的下游产物。

Description

一种重组脂氧合酶及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种重组脂氧合酶及其制备方法。

背景技术

脂氧合酶（LOX）是含有非血红素离子的双加氧酶，广泛存在于需氧生物中，包括植物、动物和低等水生生物中，可催化含（Z,Z）-1,4戊二烯结构单元的不饱和脂肪酸的加氧反应，产生不饱和脂肪酸的过氧化物，参与植物的萌发、生长、发育、衰老、植物抗病和抗伤害等多种生理功能，以及动物中涉及炎症反应。

LOX的产物——氢过氧化脂肪酸在其他酶的作用下最终生成茉莉酸、白三烯以及短链芳香性化合物，其中的短链芳香性化合物广泛应用于食品、日化以及医药工业等，如氢过氧化物裂解酶（HPL）催化产生的多种天然短链香料物质会散发出青草香、草药香、花香、菌菇香、肉香、木香等多种自然的香味，广泛添加于食品、日用化妆品、医药辅料等，由于天然的香料不具有毒物质，因此比化学合成的香料更受欢迎，当然价格也更高。

现有技术中脂氧合酶均为单功能酶，只催化脂肪酸的氢过氧化反应，而要形成短链香料，必须要有HPL对其产物继续分解产生，而两种酶体系的反应条件复杂，较难控制，不适合大规模生产，且一般酶法合成短链类香料所用的反应酶均为从植物中提取的粗酶液，如中国专利CN1563310A、CN101225406A，该种粗酶液中酶种类多、酶活不稳定，导致产物不稳定，不适合生产化。

发明内容

本发明所要解决的第一个技术问题是提供含有所述的PhLOX的cDNA序列的表达载体和利用该表达载体转化的重组微生物。

本发明所要解决的第二个技术问题是提供所述的重组微生物制备PhLOX的过程。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：

一种脂氧合酶PhLOX的cDNA序列，它的核苷酸序列如SEQID NO.1所述，为获得重组脂氧合酶PhLOX的cDNA序列，提取一种红藻门坛紫菜叶状体的总RNA，设计特异性引物克隆该坛紫菜脂氧合酶核心片段，然后以该脂氧合酶核心片段为模板，设计用于3’端和5’端延伸的特异性引物，进行RACE扩增得到完整的开放阅读框，获得扩增产物，将扩增序列与GeneBank数据库系列进行相似性搜索，发现其非血红素铁活性区域的氨基酸序列与其它动植物的保守性高，可以确定该序列是脂氧合酶类基因全长cDNA，碱基序列总长为3288bp，包含一个完整的编码框。

所述的PhLOX核苷酸序列和推断的氨基酸序列表明PhLOX cDNA与现有的脂氧合酶相比，是新的一种LOX，PhLOX的氨基酸序列如SEQID NO.2所述，具有898个氨基酸序列，蛋白大小约为98.7KDa。通过多重序列比对分析发现，其在非血红素铁活性区域的氨基酸序列与其他动植物的保守性高。

在表达载体中插入这样克隆的新的PhLOX cDNA序列，并且导入宿主细胞如大肠杆菌中表达重组PhLOX，作为优选，表达载体为LOX-28a，宿主细胞为E.coli BL21。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明从较低等的真核生物-红藻门坛紫菜中提取脂氧合酶基因，与高等真核生物中的脂氧合酶基因相比，该脂氧合酶基因进化度低，未出现功能分化，使得该基因编码的脂氧合酶可以一酶执行多酶功能，且没有严格的底物专一性，可以形成多种结构的下游产物；利用基因克隆的方法制得的重组脂氧合酶，酶纯度高，酶活稳定，适合工业化生产。

附图说明

图1为RACE产物的SDS-PAGE反应结果示意图；

图2为目的蛋白PhLOX催化游离不饱和脂肪酸的LC示意图；

图3为目的蛋白PhLOX催化游离不饱和脂肪酸的利用率示意图；

图4为PhLOX催化亚麻酸反应过程示意图。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

本发明选取坛紫菜叶状体的DNA和总cDNA为模板，克隆脂氧合酶全基因，并选取大肠杆菌E.coli BL21为表达系统，实现了对PhLOX的表达，并通过多不饱和脂肪酸的酶解分析，确定其多功能的特征。

实施例1：PhLOX全长cDNA序列的克隆

以CTAB法(十六烷基三甲基溴化铵法)提取坛紫菜叶状体的基因组DNA，步骤如下：

1)65℃水浴预热2%CTAB抽提液后，分装15mL抽提液到50mL离心管中，加入0.1%的巯基乙醇，混匀待用；

2）取500mg叶状体，于无菌研钵中液氮快速研磨至粉末，后立即转入CTAB抽提液中；

3）震荡均匀后65℃水浴加热60min，期间每10min反复颠倒离心管数次；

4）放入离心机离心，离心条件为：4℃，8000rpm，10min，离心结束后吸上清；

5）在上述上清液中加入等体积酚/氯仿/异戊醇混合液（比例为：25/24/1），颠倒数次，于4℃，10000rpm离心10min；

6）吸上清至新离心管中，重复5）抽提一次；

7）吸上清，加2/3体积异丙醇，轻颠倒混匀，-20℃放置3h沉淀DNA；

8）4℃，10000rpm，离心10min，弃上清；

9）2mL75%酒精漂洗沉淀2次，然后于4℃，10000rpm，离心10min，弃上清；

10）在超净工作台上倒置离心管，至沉淀周围水分晾干，用500μL无菌水溶解DNA，-20℃保存待用。

采用Takara RNAiso Plus kit（Takara，日本），以trizol法提取坛紫菜叶状体的总RNA。采用Takara primescript RT reagent kit（Takara，日本），对提取的坛紫菜叶状体总RNA进行反转录得到坛紫菜叶状体总cDNA。

在NCBI中搜索藻类脂氧合酶LOXs序列信息，采用Primer primer5软件设计可行性引物，进行坛紫菜脂氧合酶核心片段的克隆，其中特异性引物序列为LOX-S1-5'CTCACCCGCAAGGGAGATGG3'LOX-A1-5'TGGTAGGCCGCCGAGAAGAC3'，扩增353bp片段。分别以坛紫菜叶状体的基因组DNA和总cDNA为模板进行PCR扩增，PCR程序见表1。

表1PhLOX核心片段克隆的PCR程序

以脂氧合酶核心片段为模板，分别设计用于3’端和5’端延伸的特异性引物，进行RACE(rapid-amplification of cDNA ends，cDNA末端快速扩增技术)扩增PhLOX的全长序列，RACE程序见表2。

3’RACE特异性引物：lox-os：5’GCCCTCCCGTCCACCCACGTT3’

                    lox-is：5’TGCCCCACTTCGCCGACACC3’；

5’RACE特异性引物：lox-oa：5’CGAGCCCAGAAAGTCCCACCCTT3’

                     lox-ia：5’GCCGCCGAGAAGACGTCCATCC3’。

表2PhLOX全长扩增的PCR程序

得到RACE产物序列后，采用MEGA5软件进行比对拼接，总长为3288bp，包含一个完整的编码框。于该ORF两端设计一对特异性引物对PhLOX进行验证。

LORF-S：5'GGTCGTCCCATACCACATCG3'

LORF-A：5'TGAAGGAAGCAGCTCGGATC3'。

产物2974bp，扩增程序如表3。

表3PhLOX完整ORF验证的PCR程序

实施例2：PhLOX原核表达的重组体系构建

在PhLOX的ORF(开放阅读框)两端设计一对带NdeΙ/HindΙΙΙ酶切位点的特异性引物：正向引物：5'GGAATTCCATATGATGGGGAATGCG3'

反向引物：5'CCCAAGCTTCTAGATGTCGATGGACAG3'。

以叶状体总cDNA为模板，扩增PhLOX完整ORF。克隆的目的片段首先连接到pMD-18T（Takara，日本）上形成LOX-18T的重组克隆载体，通过转化E.coli DH5α进行测序，以检测目的片段的编码正确性。选择pET-28a（Takara，日本）为表达载体，在每40μL体系中，取LOX-18T和pET-28a空载体各自用2U的NdeΙ/HindΙΙΙ（BioLabs，英国）进行双酶切，37℃孵育2h以上。取5μL酶切产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，待质粒酶切完全后进行割胶回收和定量。在每20μL体系中，将回收的目的片段和表达载体按照135ng/50ng的比例进行连接，采用1U的T4连接酶（Fermentas，美国）在4℃下连接过夜，以构建重组质粒LOX-28a。取所有连接液，与100μL感受态E.coliBL21（Takara，日本）快速混匀，冰中预冷30min，后42℃水浴热激90s，热激后立即插在冰中，以构建重组体系LOX-28a-BL21。构建的重组体系LOX-28a-BL21冰浴5min后加入800μL、4℃预冷的LB液体培养基，于37℃下200r/min摇菌2h。接着取100μL上述菌液均匀涂布在含50μg/mL卡那霉素（Kana⁺）的LB固体平板上，平板倒扣放置在37℃下避光培养12h～16h后，用10μL无菌移液枪头将肉眼可见的乳白色菌落挑取并溶解于20μL、含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中。取1μL该菌液作为模板，用上述带NdeΙ/HindΙΙΙ酶切位点的特异性引物进行PCR检测，检测程序同表3。取5μL该PCR产物通过1.5%琼脂糖凝胶电泳检测其对应菌落的真阳性，后将剩余19μL菌液转移至5mL的LB+Kana⁺（50μg/mL）液体培养基中扩大培养，于37℃下200r/min摇菌12h。取1mL菌液送测序以确定重组载体的编码正确性。得到的真阳性克隆LOX-28a-BL21保存于含20%甘油的LB+Kana⁺（50μg/mL）液体培养基中，-70℃下储存保菌。通过含50μg/mL卡那霉素（Kana⁺）的LB固体平板进行阳性克隆筛选，并送测序以确定重组载体的编码正确性。最后将得到的真阳性克隆LOX-28a-BL21保存于含20%甘油的LB+Kana⁺（50μg/mL）液体培养基中，-70℃下储存保菌。

实施例3：PhLOX蛋白的诱导和纯化

将实施例2中获得的克隆菌株活化、扩培，以0.1mM IPTG诱导表达。诱导条件为20℃，100rpm，14～20h。诱导完成后，以5000rpm，4℃，15min离心收集菌体。去上清培养液，再用10mL细胞裂解液buffer A-ΙΙ（50mM Tris-HCl，pH8.0，200mM NaCl，10%（v/v）glycerol，0.1%tween20）充分重悬菌体。以6500rpm，20s-破碎/2min-冰浴的程序进行菌体破碎匀浆（Bertin technologies Precellys24Dual，法国），循环4次。12000rpm，4℃，10min离心匀浆液，并收集上清。

采用6×His-Tagged Protein Purification Kit（CWBIO，中国）对上清液进行目的蛋白的纯化，并以含10mM、50mM、150mM、500mM咪唑的洗脱液进行梯度洗脱和收集目的蛋白。纯化完成后，将16μL的原上清液、沉淀悬浮液、流穿液和各梯度洗脱液进行SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）检测，检测结果如图1所示，其中泳道M为Mark标准蛋白，泳道1为空载对照，泳道2为重组表达得到的PhLOX纯化前，泳道3为PhLOX纯化后，由图1可得目的蛋白在获得的重组蛋白中占85%以上，得率约为1.7mg蛋白/L培养液。确定目标洗脱峰后，将对应的梯度洗脱液通过10000（MW）截留分子量的MilliPower超滤管去咪唑，4000rpm，4℃，离心40min，再用10～15mL Bffuer A-ΙΙ冲洗超滤膜以回收目的蛋白。

实施例4：PhLOX的催化活性

分别在2mL目的蛋白纯化终溶液中加入100μM的游离不饱和脂肪酸底物，游离不饱和脂肪酸底物包括油酸、亚油酸（LA）、亚麻酸（ALA）、花生四烯酸（ARA）、二十碳五烯酸（EPA），混匀后在20℃下孵育，并在反应进行15min时，对产物进行HPLC/MS和GC-MS检测分析。实验结果显示PhLOX既能催化C18类，又能催化C20类脂肪酸的反应，如图2所示，反应15min后EPA、ALA、ARA、LA均急剧减少，如图3所示，PhLOX优先利用C20类，反应15min时，EPA基本消耗完全，约占底物消耗总量的55%，而ARA部分被催化，占总消耗的29%。如图4所示，PhLOX催化亚麻酸既能产生氢过氧化产物，说明它有脂氧合酶功能；也能产生酮醇类化合物，说明它具有丙二烯氧化物合成酶功能；同时还能检测到短链挥发性烯醛类化合物（包括2-己烯醛、3-己烯醛、2-庚烯醛、2-壬烯醛、3-壬烯醛、1-辛烯-3-醇、1-辛烯-3-酮、2-辛烯-1-醇、3,5-辛烯-2-酮和2,6-2-烯-壬醛），说明它有氢过氧化物裂解酶活性，最终说明该酶具有多功能特征。

Claims (7)

1.一种重组脂氧合酶PhLOX的cDNA，它的核苷酸序列如SEQID NO.1所述。

2.一种重组脂氧合酶PhLOX，它的氨基酸序列如SEQID NO.2所述。

3.包括权利要求1的cDNA序列的表达载体。

4.包括权利要求1的cDNA序列的表达载体LOX-28a。

5.制备如权利要求1所述的重组脂氧合酶PhLOX的方法，包括用权利要求3所述的表达载体转化宿主细胞，培养转化体，获得PhLOX。

6.根据权利要求5所述的方法，其中宿主细胞是大肠杆菌。

7.根据权利要求6所述的方法，其中宿主细胞是E.coli BL21。