CN103102405A

CN103102405A - 星虫重组铁结合蛋白及制备方法

Info

Publication number: CN103102405A
Application number: CN2013100184674A
Authority: CN
Inventors: 苏秀榕; 周君; 李晔; 张春丹; 李成华; 刘艳; 张云云
Original assignee: Ningbo University
Current assignee: Ningbo University
Priority date: 2013-01-18
Filing date: 2013-01-18
Publication date: 2013-05-15

Abstract

本发明公开了星虫重组铁结合蛋白及制备方法，该星虫重组铁结合蛋白的氨基酸序列如序列表SEQIDNO.1所示；该星虫重组铁结合蛋白是从星虫体壁中，通过RNA提取，再合成为cDNA，对cDNA的载体扩大培育得到阳性克隆质粒，阳性克隆质粒扩增、酶切后，与载体连接培育得到重组质粒，重组质粒培育后破碎和蛋白纯化得到星虫重组铁结合蛋白；该方法得到的星虫重组铁结合蛋白产量远远高于目前从动物肾脏提取的铁结合蛋白，用Ni-NTA得到的铁结合蛋白纯度较高，铁结合蛋白结合铁能力较好，还具有富集重金属和有机磷的作用。

Description

星虫重组铁结合蛋白及制备方法

技术领域

本发明涉及铁结合蛋白，具体涉及星虫重组铁结合蛋白及星虫的体外重组铁结合蛋白的制备方法。

背景技术

铁结合蛋白（铁蛋白）是一种具有储存数千铁离子及数百磷分子能力的蛋白质，其分子结构被认为是由高度对称性亚基所组合的蛋白质，外壳可以包裹着由铁磷化合物组成的铁核。铁核结构起着供给和存储铁的“仓库作用”，铁蛋白的蛋白壳上含有两种横跨蛋白壳的隧道，即三相(X.Y.Z)物质交换隧道和电子隧道，前者的作用供无机磷铁及其他小分子进出，后者的功能起着接收及传递电子的作用。脊椎动物的铁蛋白由两种不同类型的亚基组成，即H和L亚基，L型亚基与H型亚基相互作用使氧化型铁矿化为一个铁核。。目前大部份是脊椎动物的重组铁蛋白，如申请号为CN为200510048963.X的发明专利申请就公开了利用基因工程技术，通过人乳铁蛋白基因的克隆、重组杆状病毒的构建、家蚕体内表达和人乳铁蛋白纯化得到重组人乳铁蛋白。也有无脊椎动物的重组铁蛋白，如公开号为CN102051363的发明专利申请，则公开了文蛤铁蛋白基因、编码蛋白、体外重组产物等，通过文蛤RNA提取和纯化、cDNA构建及铁蛋白基因的筛选、RACE获得铁蛋白基因序列，再利用铁蛋白基因进行PCR扩增、克隆至表达载体、转化至大肠杆菌、LB培养剂培养、菌体用鸡蛋清溶菌酶处理、超声破碎、从包涵体体中纯化得到目的蛋白。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种星虫重组铁结合蛋白及星虫的体外重组铁结合蛋白的制备方法，该重组星虫铁结合蛋白具有存储铁功能外，还具有富集重金属和有机磷的功能。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：星虫重组铁结合蛋白，该星虫重组铁结合蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。

星虫的体外重组铁结合蛋白的制备方法，其步骤如下：

a、 RNA提取：取星虫体壁80-100mg速冻于液氮中，研磨成粉，用RNAiso plus

提取试剂盒提取得到星虫RNA，具体提取方法依照提取试剂盒说明书进行操作；

b、cDNA合成：将星虫RNA用cDNA试剂盒合成cDNA，具体合成方法依该cDNA试剂盒说明操作，得到cDNA文库质粒，然后用下述引物对合成的cDNA进行PCR扩增，上游引物：5’-TTGTTCTGTC AGGAAGTGGC-3’，下游引物：5’-CTAACAGGAC TGGTTGACG-3’； PCR扩增体系：cDNA文库质粒：1.0μL，10×PCR 缓冲液：2.5μL，MgCl₂（25mM）：2.0μL，dNTP（10mM）：2.0μL，上游引物（10μM）：1.0μL，下游引物（10μM）：1.0μL，DNA聚合酶（5U/μL）：0.2μL，超纯水：15.3μL，总体积：25.0μL。扩增条件：94℃ 5 min、94℃ 30 s、58℃ 3 s0、72℃ 1min ，共35个循环，最后72℃延伸10 min；扩增反应后，用回收试剂盒回收电泳后的PCR产物，然后PCR产物与载体pMD18-T连接，转化至大肠杆菌E.Coli DH5α后，在含有氨苄浓度为80-100mg/L的LB平板培养基中培养8-12h，挑取阳性克隆菌落，得到阳性克隆质粒；阳性克隆质粒测序后用BLAST软件进行比对，确定质粒含有星虫铁结合蛋白基因；

c、重组质粒：对上述阳性克隆质粒进行PCR扩增，扩增体系：上述阳性克隆质粒1.0μL，10×PCR 缓冲液2.5μL，浓度25mM 的MgCl₂1.5μL，浓度10mM的 dNTP2.5μL，浓度10μM的正向引物1.0μL，浓度10μM的反向引物1.0μL，浓度5U/μL的 DNA聚合酶0.2μL，超纯水15.3μL；扩增条件：94℃ 4 min、94℃ 1min、58℃ 1min、72℃ 1min ，共35个循环，最后72℃延伸10 min；其中正向引物序列为5’-ACGCAAGCTT TTAAGAAGAG TTCCTT-3’，反向引物序列为5’-CGGGATCCAT GTCACTCTGT CGT-3’，扩增产物经QIAquick Gel Extraction纯化试剂盒纯化后，再用BamHⅠ和Hind Ⅲ内切酶酶切，酶切产物与载体pET-28a(+)连接，获得重组质粒，重组质粒转化至E.Coli BL21(DE3)中，再接种到卡那霉素浓度为50μg/mL的 LB培养液中，37℃、120r/min振荡培养至菌液A600值为0.6~0.8时，加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）使其终浓度为1mmol/L，37℃诱导表达3-6h，收集菌液经12000r/min离心5min，弃上清液，得到细菌沉淀物，4℃保存；

d、蛋白纯化：细菌沉淀物用1×磷酸缓冲液漂洗，再在4℃、12000 r/min离心5min，得漂洗后细菌沉淀物，每克漂洗后细菌沉淀物中加入5ml的1×磷酸缓冲液，混匀后4℃下，用450W超声波，超声破碎10min， 12000 r/min离心5min得到包涵体沉淀；每克包涵体沉淀加入200μL缓冲液B，0.5μLβ-巯基乙醇和4μL浓度为20mM的咪唑，轻微混匀后，在室温放置1h， 12000 r/min离心10min保留上清液，在每毫升上清液中加入镍珠10μL，轻微混匀30min，12000 r/min离心10s，去上清得到镍珠-铁合结蛋白沉淀，10毫克镍珠-铁合结蛋白沉淀中加入250μL缓冲液C和5μL浓度为20mM的咪唑，轻微混匀后，12000 r/min离心10s，去上清，在2-5毫克沉淀中加入25μL缓冲液E和5μL浓度为160mM的咪唑，轻微混匀后，12000 r/min离心10s，取上清，得到含重组铁结合蛋白的洗脱液，浓缩洗脱液得到如序列表SEQ ID NO.1所示的星虫重组铁结合蛋白；所述缓冲液B的pH为8.0，所述缓冲液B含有浓度为100mM的 NaH₂PO₄，浓度为10mM的三羟甲基氨基甲烷，浓度为 6M的盐酸胍；所述缓冲液C的pH为6.3，所述缓冲液C含有浓度为100mM 的NaH₂PO₄，浓度为10mM的三羟甲基氨基甲烷，浓度为8M的尿素；所述缓冲液E的pH为4.5，所述缓冲液E含有浓度为100mM的 NaH₂PO₄，浓度为10mM的三羟甲基氨基甲烷，浓度为8M 的尿素。

与现有技术相比，本发明的优点在于星虫重组铁结合蛋白及制备方法，该星虫重组铁结合蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示；该星虫重组铁结合蛋白是从星虫体壁中，通过RNA提取，再合成为cDNA，对cDNA的载体扩大培育得到阳性克隆质粒，阳性克隆质粒扩增、酶切后，与载体连接培育得到重组质粒，重组质粒培育后破碎和蛋白纯化得到星虫重组铁结合蛋白；该方法得到的星虫重组铁结合蛋白产量远远高于目前从动物肾脏提取的铁结合蛋白，用Ni-NTA得到的铁结合蛋白纯度较高，铁结合蛋白结合铁能力较好，还具有富集重金属和有机磷的作用。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。

实施例

RNA提取：取星虫体壁80-100mg速冻于液氮中，研磨成粉，用RNAiso plus提取

试剂盒（购于Takara公司）提取得到星虫RNA，具体提取方法依照提取试剂盒说明书进行操作：体壁研磨成粉后，加入RNAiso裂解液，样品与裂解液的重量体积比为1：15-20，匀浆，室温下静置5分钟，4℃，12000 rpm, 离心5min，取第一上清液，加入氯仿，上清液与氯仿的体积比为4-5：1，待溶液充分乳化后，室温下静置5min，4℃，12000 rpm/min离心15min，得第二上清液，加入异丙醇，第二上清液与异丙醇的体积比为1：1，室温下静置10min，4℃，12000 rpm/min离心10min，弃上清，沉淀用75%乙醇振荡洗涤，4℃，12000 rpm/min离心10min，干燥沉淀就得星虫RNA；

cDNA合成：将星虫RNA用cDNA试剂盒（购于Takara公司）合成cDNA，具体合成方法依该cDNA试剂盒说明操作，得到cDNA文库质粒，然后用下述引物对合成的cDNA进行PCR扩增，上游引物：5’-TTGTTCTGTC AGGAAGTGGC-3’，下游引物：5’-CTAACAGGAC TGGTTGACG-3’； PCR扩增体系：cDNA文库质粒：1.0μL，10×PCR 缓冲液2.5μL，25mM的 MgCl₂2.0μL，10mM的 dNTP2.0μL，10μM的上游引物1.0μL，10μM的下游引物1.0μL，5U/μL的 DNA聚合酶0.2μL，超纯水15.3μL，总体积25.0μL；扩增条件：94℃ 5 min、94℃ 30 s、58℃ 3 s0、72℃ 1min ，共35个循环，最后72℃延伸10 min；扩增反应后，用回收试剂盒（市售）回收PCR产物，然后PCR产物与载体pMD18-T连接，转化至大肠杆菌E.Coli DH5α后，在含有氨苄浓度为80-100mg/L的LB平板培养基中培养8-12h，挑取阳性克隆菌落，得到阳性克隆质粒；阳性克隆质粒测序后用BLAST软件进行比对，确定质粒含有星虫铁结合蛋白基因；

重组质粒：对上述阳性克隆质粒进行PCR扩增，扩增体系：上述阳性克隆质粒1.0μL，10×PCR 缓冲液2.5μL，25mM的 MgCl₂1.5μL，10mM的 dNTP2.5μL，10μM的正向引物1.0μL，10μM的反向引物1.0μL， 5U/μL的 DNA聚合酶0.2μL，超纯水15.3μL，总体积25.0μL；扩增条件：94℃ 4 min、94℃ 1min、58℃ 1min、72℃ 1min ，共35个循环，最后72℃延伸10 min；正向引物序列为5’-GCGGGATCCA TGTCTCTGTC AAGACCA-3’，反向引物序列为5’-GCGAAGCTTG TTTAGCTGTC GCCATCG-3’，扩增产物经QIAquick Gel Extraction纯化试剂盒（购于QIAquick公司）纯化后，再用BamHⅠ和Hind Ⅲ内切酶酶切，酶切产物（dz ferritin）与载体pET-28a(+)连接，获得重组质粒（pET-28 a（+）/dz ferritin），重组质粒转化至E.Coli BL21(DE3)中，再接种到卡那霉素浓度为50μg/mL的 LB培养液中，37℃、120r/min振荡培养至菌液A600值为0.6~0.8时，加入IPTG使其终浓度为1mmol/L，37℃诱导表达3-6h（4小时为好），收集菌液经12000r/min离心5min，弃上清液，得到细菌沉淀物，4℃保存；正反向引物是根据已克隆到的铁合结蛋白cDNA序列设计，重组质粒阳性筛选和测序用常规方法进行；

蛋白纯化：细菌沉淀物用1×磷酸缓冲液（PBS）漂洗，再在4℃、12000 r/min离心5min，每克漂洗后的细菌沉淀物中加入5ml的1×PBS，混匀后4℃下，用450W超声波，超声破碎10min， 12000 r/min离心5min得到包涵体沉淀；每克包涵体沉淀加入200μL缓冲液B，0.5μLβ-巯基乙醇和4μL浓度为20mM的咪唑，轻微混匀后，在室温放置1h， 12000 r/min离心10min保留上清液，在每毫升上清液中加入镍珠（Ni-NTA）10μL，轻微混匀30min，12000 r/min离心10s，去上清得到Ni-NTA-铁合结蛋白沉淀，10毫克Ni-NTA-铁合结蛋白沉淀中加入250μL缓冲液C和5μL浓度为20mM的咪唑，轻微混匀后，12000 r/min离心10s，去上清，在2-5毫克沉淀中加入25μL缓冲液E和5μL浓度为160mM的咪唑，轻微混匀后，12000 r/min离心10s，取上清，得到含重组铁结合蛋白的洗脱液，浓缩洗脱液得到如序列表SEQ ID NO.1所示的星虫重组铁结合蛋白；其中缓冲液B的pH为8.0，缓冲液B含有浓度为100mM的 NaH₂PO₄，浓度为10mM的三羟甲基氨基甲烷（Tris），浓度为 6M的盐酸胍；缓冲液C的pH为6.3，缓冲液C含有浓度为100mM 的NaH₂PO₄，浓度为10mM的Tris，浓度为8M的尿素；缓冲液E的pH为4.5，缓冲液E含有浓度为100mM的 NaH₂PO₄，浓度为10mM的Tris，浓度为8M 的尿素。

上述引物由上海生工合成，BamHⅠ和Hind Ⅲ，载体pMD18-T，载体pET-28a(+)， E.Coli BL21(DE3)，E.Coli DH5α等载体、酶，购于宝生物工程（大连）有限公司，地址：辽宁省大连市经济技术开发区东北二街19号，联系电话：0411-87641681, 87641683。10×PCR 缓冲液，dNTP ，DNA聚合酶，LB平板培养基，LB培养液，PBS，镍珠等市售。

试验例

蛋白结合铁能力：以BSA作为空白对照，将星虫铁结合蛋白和牛血清白蛋白配成浓度为1μg/mL，2μg/mL，4μg/mL，6μg/mL系列溶液，各取1mL的溶液，分别加入20μL的 2mM FeCl₂溶液，22℃反应10min，再加入40μL 的5mM ferrozine，再反应15min后用分光光度计在波长为562nm处测其吸光值；其中空白对照的吸光值为1.3，1μg/mL的星虫铁结合蛋白的吸光值为1.3，2μg/mL的星虫铁结合蛋白的吸光值为1.1，4μg/mL的星虫铁结合蛋白的吸光值为0. 5，6μg/mL的星虫铁结合蛋白的吸光值为0.3，从中可以看出星虫铁结合蛋白具有结合铁能力。

对重金属的富集：1mL 浓度为2μg/mL牛血清白蛋白为空白样观察，再在三份1mL 浓度为2μg/mL星虫铁结合蛋白中分别加入20μL的 2mM FeCl₂、20μL的 2mM CuCl₂与20μL的 2mM CdCl₂，22℃培养1h后观察，观察用的是美国Veeco 公司的原子力显微镜，使用轻敲(Tapping) 模式观察；观察用探针型号为NSC11(三角形悬臂, MikroMash 公司),弹性常数为50 N/m, 共振频率为330 kHz，扫描速率为1~1.5 Hz，观察结果显示Ferritin空白样，绝大部分蛋白都是分散较好的单个蛋白分子，直径100~300nm，加入Fe²⁺ 、Cu²⁺、 Cd²⁺的Ferritin空间结构发生变化，单个蛋白分子之间相互作用并连接成网状，加入Fe²⁺后的蛋白直径约为300~700nm，加入Cu²⁺后的蛋白直径为400~1000 nm，加入Cd²⁺后的蛋白对镉核进行团聚装富集包裹，蛋白的直径约为400~1100nm。说明星虫铁结合蛋白可以富集金属离子。同样方法也可以看到星虫铁结合蛋白对有机磷有富集作用。

<110> 宁波大学

<120> 星虫重组铁结合蛋白及制备方法

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 169

<212> PRT

<213> 星虫重组铁结合蛋白

<400> 1

Met Ser Leu Ser Arg Pro Arg Gln Asn Tyr His Ala Glu Ser Glu

5 10 15

Ser Gly Val Asn Lys Gln Ile Asn Leu Glu Leu Tyr Ala Ser Tyr

20 25 30

Val Tyr Gln Ser Met Ala Trp Tyr Phe Asp Arg Asp Asp Val Ala

35 40 45

Leu Lys Gly Phe His Lys Phe Phe Lys Lys Ala Ser Glu Glu Glu

50 55 60

Arg Glu His Ala Glu Lys Leu Met Lys Phe Gln Asn Gln Arg Gly

65 70 75

Gly Arg Ile Val Leu Ser Asp Ile Lys Arg Pro Asp His Asp Glu

80 85 90

Trp Gly Thr Gly Leu Glu laA Met Glu Val Ala Leu Asn Leu Glu

95 100 105

Lys Asn Val Asn Gln Ser Leu Leu Asp Leu His Lys Val Ala Glu

110 115 120

Lys Asn Gly Asp Asp Gln Met Gln Asp Trp Ile Glu Ser His Phe

125 130 135

Leu Thr Glu Gln Val Glu Ala Ile Lys Glu Leu Ser Asp His Ile

140 145 150

Thr Asn Leu Lys Arg Val Gly Pro Gly Leu Gly Glu Tyr Met Phe

155 160 165

Asp Lys Glu Thr Leu Asp Gly Asp Ser

170 174

<210> 2

<211> 20

<212> cDNA

<213> 人工序列

<400> 2

TTGTTCTGTC AGGAAGTGGC 20

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

CTAACAGGAC TGGTTGACG 19

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

GCGGGATCCA TGTCTCTGTC AAGACCA 27

<210> 5

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

GCGAAGCTTG TTTAGCTGTC GCCATCG 27

Claims

1.星虫重组铁结合蛋白，其特征在于该星虫重组铁结合蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述的星虫重组铁结合蛋白的制备方法，其特征在于步骤如下：

a、 RNA提取：取星虫体壁80-100mg速冻于液氮中，研磨成粉，用RNAiso plus提取试剂盒提取得到星虫RNA，具体提取方法依照提取试剂盒说明书进行操作；

b、cDNA合成：将星虫RNA用cDNA试剂盒合成cDNA，具体合成方法依cDNA试剂盒说明书操作，得到cDNA文库质粒，然后用下述引物对合成的cDNA进行PCR扩增，上游引物的核苷酸序列为TTGTTCTGTC AGGAAGTGGC，下游引物的核苷酸序列为CTAACAGGAC TGGTTGACG； PCR扩增体系：cDNA文库质粒1.0μL，10×PCR 缓冲液2.5μL，浓度25mM的 MgCl₂2.0μL，浓度10mM的 dNTP2.0μL，浓度10μM的上游引物1.0μL，浓度10μM的下游引物1.0μL，浓度5U/μL的 DNA聚合酶0.2μL，超纯水：15.3μL；扩增条件：94℃ 5 min、94℃ 30 s、58℃ 3 s0、72℃ 1min ，共35个循环，最后72℃延伸10 min；扩增反应后，用回收试剂盒回收PCR产物，然后PCR产物与载体pMD18-T连接，转化至大肠杆菌E.Coli DH5α后，在含有氨苄浓度为80-100mg/L的LB平板培养基中培养8-12h，挑取阳性克隆菌落，得到阳性克隆质粒；

c、重组质粒：对上述阳性克隆质粒进行PCR扩增，扩增体系：上述阳性克隆质粒1.0μL，10×PCR 缓冲液2.5μL，浓度25mM 的MgCl₂1.5μL，浓度10mM的 dNTP2.5μL，浓度10μM的正向引物1.0μL，浓度10μM的反向引物1.0μL，浓度5U/μL的 DNA聚合酶0.2μL，超纯水15.3μL；扩增条件：94℃ 4 min、94℃ 1min、58℃ 1min、72℃ 1min ，共35个循环，最后72℃延伸10 min；其中正向引物的核苷酸序列为GCGGGATCCA TGTCTCTGTC AAGACCA，反向引物序列为GCGAAGCTTG TTTAGCTGTC G CCATCG，扩增产物经QIAquick Gel Extraction纯化试剂盒纯化后，再用BamHⅠ和Hind Ⅲ内切酶酶切，酶切产物与载体pET-28a(+)连接，获得重组质粒，重组质粒转化至E.Coli BL21(DE3)中，再接种到卡那霉素浓度为50μg/mL的 LB培养液中，37℃、120r/min振荡培养至菌液A600值为0.6~0.8时，加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷使其终浓度为1mmol/L，37℃诱导表达3-6h，收集菌液经12000r/min离心5min，弃上清液，得到细菌沉淀物，4℃保存；

d、蛋白纯化：细菌沉淀物用1×磷酸缓冲液漂洗，再在4℃、12000 r/min离心5min，得漂洗后细菌沉淀物，每克漂洗后的细菌沉淀物中加入5ml的1×磷酸缓冲液，混匀后4℃下，用450W超声波，超声破碎10min， 12000 r/min离心5min得到包涵体沉淀；每克包涵体沉淀加入200μL 缓冲液B，0.5μLβ-巯基乙醇和4μL浓度为20mM的咪唑，轻微混匀后，在室温放置1h， 12000 r/min离心10min保留上清液，在每毫升上清液中加入镍珠10μL，轻微混匀30min，12000 r/min离心10s，去上清得到镍珠-铁合结蛋白沉淀，10毫克镍珠-铁合结蛋白沉淀中加入250μL缓冲液C和5μL浓度为20mM的咪唑，轻微混匀后，12000 r/min离心10s，去上清，在2-5毫克沉淀中加入25μL 缓冲液E和5μL浓度为160mM的咪唑，轻微混匀后，12000 r/min离心10s，取上清，得到含重组铁结合蛋白的洗脱液，浓缩洗脱液得到如序列表SEQ ID NO.1所示的星虫重组铁结合蛋白；所述缓冲液B的pH为8.0，所述缓冲液B含有浓度为100mM的 NaH₂PO₄，浓度为10mM的三羟甲基氨基甲烷，浓度为 6M的盐酸胍；所述缓冲液C的pH为6.3，所述缓冲液C含有浓度为100mM 的NaH₂PO₄，浓度为10mM的三羟甲基氨基甲烷，浓度为8M的尿素；所述缓冲液E的pH为4.5，所述缓冲液E含有浓度为100mM的 NaH₂PO₄，浓度为10mM的三羟甲基氨基甲烷，浓度为8M 的尿素。