JP4964588B2 - 植物の形質転換および選択 - Google Patents
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Description
本発明は、木の細胞に外来性遺伝子を形質転換させ、かつそこから安定に形質転換された木を再生するための遺伝子型非依存的方法に関する。特に、本発明は、木の移植片からトランスジェニック植物を形質転換および再生するためのアグロバクテリウム媒介遺伝子形質移入方法を教示する。本明細書に記載される形質転換プロセスは、細胞分裂を刺激する前培養培地、およびシュート発生を加速するシュート生成培地を利用する。この形質転換プロセスから生成される植物が提供される。特に、本発明は、形質転換効率、ならびに選抜されかつ扱いにくいクローンからのシュート再生を増加させるための方法を提供する。本発明はまた、植物、特に森林樹を選択および再生するための培地、方法、およびプラスミドに関する。
植物の遺伝子操作は、商業的に重要な植物種の改善のための大きな潜在能力を提供してきた。近年、木の遺伝子操作が勢いを増し、パルプ産業および材木産業において特定の適用を見い出している。モミジバフウ(Sullivan and Lagrinini 1993)、ヨーロッパカラマツ(Huang et al. 1991)、ユリノキ(Wilde et al. 1992)、および多くのポプラ種(Minocha et al. 1986, Fillatti et al. 1988, De Block 1990,Brasileiro et al. 1992, Tsai et al. 1994)などの種のための、いくつかの確立された木の形質転換系が存在している。ポプラ属の種は木の遺伝子操作のためのモデル系として働く(Kim et al. 1997)。昆虫耐性および除草剤耐性などの種々の形質が、これらの種に操作されてきた(Klopfenstein et al. 1993, De Block 1990)。従って、木の種を遺伝子操作するための潜在能力は、商業的に重要な木の種(ユーカリ(ユーカリ属)を含む)にとって大きい。
本発明において、木の移植片の少なくとも1つの細胞を外来性DNAで形質転換するための方法が意図され、この方法は、(i)アグロバクテリウムのインデューサーを含む培地上で木の移植片を前培養する段階;(ii)この外来性DNAを有する形質転換ベクターを含むアグロバクテリウム株にこの移植片を曝露する段階;(iii)形質転換された移植片を選択し、ここで、この外来性DNAがこの形質転換された移植片の少なくとも1つの細胞に移される段階;および(iv)この形質転換された移植片を再生して完全な植物を産生する段階を含む。好ましくは、アグロバクテリウムのインデューサーはアセトシリンゴンであり、このアセトシリンゴンの濃度は約10から約400mg/lまでである。また好ましくは、アセトシリンゴンの濃度は約5から約200mg/lまでであり、培地はさらにオーキシンおよび/またはサイトカイニンを含む。
遺伝子型非依存的な木の形質転換のための本発明の方法は、選抜した遺伝子型の形質転換から得られた低い形質転換効率を克服する。その最も広い局面において、本発明の方法は、木の移植片からの形質転換およびシュート再生の効率を増加させることに関する。形質転換効率の増加は、細胞分裂を刺激する培地上で移植片を前培養することによって達成される。形質転換された移植片のシュート再生頻度は、シュート再生を促進する培地上で移植片を培養することによって改善される。
実施例1-植物材料
全優良クローンを、マゼンタボックス(Magenta box)中でシュートクランプとして維持し、4〜6週間毎にサブクローニングした。シュートクランプを、必要に応じて分け、保存培養として維持した。他に注記されない限り、全ての培養を、遮光した、寒色の蛍光下で、30〜40μE/m2/sの光強度で、16時間の光時間で増殖させた。成長室の温度は21℃である。選択したユーカリプツス・ドゥニークローンを別として、葉移植片を、全ての選択したクローンについて使用した。
2つの構築物:pWVZ20およびpWVR133を形質転換実験のために使用した。バイナリプラスミドpWVZ20は、植物プロモーターによって駆動される除草剤耐性遺伝子、およびT-DNAボーダー間の構成的プロモーターによって駆動されるβ-グルクロニダーゼ(GUS)遺伝子を含む。バイナリプラスミドpWVR133は、同じ除草剤耐性遺伝子構築物を含むが、GUS遺伝子はイントロンをふくみ、かつアクチンプロモーターによって駆動される。pWVR133のGUS発現は植物細胞においてのみ起こり、細菌細胞においては起こらない。アグロバクテリウム株GV2260(Deblaere et al.1985)を、形質転換研究のために使用した。当業者は、構成的植物プロモーターに作動可能に連結された除草剤耐性遺伝子を有する任意のバイナリ構築物を使用することが可能である。
pWVZ20またはpWVR133のいずれかを含むアグロバクテリウムをYEP培地(10g/l酵母抽出物、10g/lペプトン、および50mg/l NaCl、pH 7.0〜7.2)上で3日間成長させた。プレートから単一コロニーを選択し、100mg/l カナマイシンおよび50mg/l リファンピシンを有する20〜50mlの液体YEP培地中で成長させた。培養を、28℃および150rpmにて、振盪インキュベーター中で一晩インキュベートした。約0.6〜1.1のODを有する一晩培養物を、3000gで20分間、卓上遠心分離機で遠心分離し、アグロバクテリウム誘導培地またはAIM(5g/lグルコース、250μMアセトシリンゴン、2mMリン酸緩衝液、および0.05M MES、pH 5.8を有するWPM塩)で再懸濁し、これは約0.6〜1.1のODを有する。培養を感染前に28℃で25分間インキュベートした。細菌濃度を感染の前後で決定した。
Euc維持培地上で維持したユーカリ保存培養を、移植片の供給源として使用した。葉、葉柄、節間組織、花組織、または胚形成組織を形質転換のために使用可能であるが、葉が豊富であるために葉移植片を選択した。健康かつ新規に開いた葉を形質転換のために選択した。損傷を有する細胞の数を増加させるために、はさみまたはピンセットによって葉の先端部分を除去した。移植片を、背軸面を下にして前培養培地(表2)上に配置した。前培養培地は、植物移植片がアグロバクテリウム形質転換の前にその上で培養される栄養培地である。具体的には、本発明の前培養培地は、形質転換効率および植物再生を増加させる。本前培養培地は、アセトシリンゴンなどの、アグロバクテリウムのインデューサーを含むが、他のアグロバクテリウムインデューサーが使用されてもよい。木本培地(Woody Plant Medium)(WPM)塩(Loyd and McCown, 1980)が本発明の前培養培地において使用された;しかし、MS培地(Murashige and Skoog 1962)またはLepoivre培地などの他の塩培地が使用されてもよい。任意に、この前培養培地は、オーキシンおよびサイトカイニンを含む植物成長調節剤を含んでもよい。
誘導されたアグロバクテリウム培養を実施例3に記載されるように調製し、この培養物をピペットによって各移植片に滴り落とした。全ての切断された端が細菌溶液で覆われるように、十分なアグロバクテリウム培養物を滴り落とした。または、移植片は、真空浸透、floral dip法、およびアグロバクテリウム媒介形質転換の他の方法によって形質転換され得る。形質転換後、アグロバクテリウム培養物で覆われた移植片を、4日間の同時培養のために暗所に配置した。または、この移植片は、光条件下でアグロバクテリウムと同時培養され得る。さらに、この移植片は、2〜10日間の間、好ましくは4日間、明所条件下または暗所条件下でアグロバクテリウムとともに同時培養され得る。同時培養後、移植片は、400mg/lチメンチンを有するEuc再生培地(表3)に移した。移植片を洗浄する必要はない。移植片を、選択培地への移植前に4日間の間、この培地上で培養した。本実施例において、選択培地は、チメンチンおよび除草剤選択剤の両方を補充したEuc再生培地である。
選択で生存するシュートクランプを、除草剤およびチメンチンを含むEuc再生培地上で維持し、これらを、シュートが増殖しかつ最初に延長するまで、3週間毎に移す。pWVR133を用いる形質転換実験のためには、再生したシュートからの葉および茎の組織を、シュートが発生するとすぐに、GUS発現について染色する。pWVZ20を用いる形質転換実験のためには、再生したシュートからの葉および茎の組織は、シュートがさらに発生し、かつ残渣のアグロバクテリウムを含まないときに、GUS発現について染色する。
GUS染色を、アグロバクテリウム感染の頻度をモニターするため、および逸出またはキメラではない選択されたシュートを保証するために実行した。pWVR133を用いる形質転換実験のために、再生されたシュートからの葉および茎の組織を、シュート発生の際すぐにGUS発現について染色した。pWVZ20を用いる形質転換実験のためには、再生したシュートからの葉および茎の組織は、シュートがさらに発生し、かつ残渣のアグロバクテリウムを含まないときに、GUS発現について染色する。GUS活性を決定するために、移植片を、100mM リン酸緩衝液(pH 7.0)、0.05%ジメチルスルホキシド、0.05% Triton X-100、10mM EDTA、0.5mMフェロシアン化カリウム、および1.5mg/ml 5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-グルクロニド(X-gluc)を含む物質中でインキュベートした。この移植片を10分間真空に供し、その後37℃で一晩インキュベーションを行った。一晩インキュベーションの後、GUS焦点を計数した。
RNAを、野生型および形質転換したユーカリプツス・グランディス、グランディス ウロフィラ、およびユーカリプツス・カマデュレンシス(E. camadulensis)植物の葉組織およびシュート組織から、製造業者の指示書に従ってRNAqueous(商標)-96キットを用いて単離した。手短に述べると、0.1から1.5mgの組織を300μl 溶解/結合緩衝液中に懸濁し、プラスチックの乳棒を用いて微細粉末に粉砕した。試料を最大速度で3分間遠心分離し、上清を新鮮なプレートに移した。300μlの(1×v/v)64%エタノールを上清に加え、試料を手短にボルテックスした。次いで試料を1850gで2分間遠心分離した。遠心分離後、任意に、DNase処理工程を実行した。各試料に、5μlのDNase+35μl DNase緩衝液を、フィルターパッドの中心に加え、試料を室温で20分間インキュベートした。20分間のインキュベーションの後、600mlの洗浄緩衝液Aを各試料に加え、この試料を最大速度で2分間遠心分離した。遠心分離後、上清を廃棄し、600μlの洗浄緩衝液Bを各試料のフィルターパッドに加えた。最大速度で2分間の遠心分離後、上清を廃棄し、600μlの洗浄緩衝液C/Dを各フィルターパッドに加えた。この試料を最大速度で2分間遠心分離し、上清を廃棄した。洗浄検証液C/Dを用いる第2のすすぎの後、50μlのRNA溶出液を加え、試料を最大速度で2〜3分間遠心分離した。RNA溶出工程を反復し、溶出したRNA試料をさらなる使用まで-80℃に保存した。
ALS除草剤耐性遺伝子の存在および発現を決定するために、RT-PCRを実行した。全RNAを、実施例8において記載されるように、ユーカリプツス・グランディス、ユーカリプツス・グランディス x ウロフィラ、およびユーカリプツス・カマデュレンシス植物の形質転換された試料および野生型試料から単離した。RNAの単離および定量の後、RT-PCRを、Ready to Go RT-PCRキット(Pharmacia)を製造業者の指示書に従って実行した。一般的には、5μlの全RNA(約20ng RNA)を、1μl Oligo dTn、1μl 3μM ALSフォワードプライマー、1μl 3μM ALSリバースプライマー、および42μl 水を含む、45μl RT-PCR反応混液に加えた。
サイクル1:95℃5分間
55℃1分間
72℃1分間
サイクル2〜30:95℃1分間
55℃1分間
72℃1分間
サイクル31:95℃1分間
55℃1分間
72℃10分間
本実施例は、扱いにくい市販のユーカリプツス・ドゥニークローンDUN00001または他の扱いにくいクローンからのシュート再生のための成長調節剤のレベルを最適化するための方法を教示する。節間移植片を実施例1に記載されるように調製し、実施例5に記載されるようにアグロバクテリウムを接種する。同時培養後、形質転換されたシュートクランプを、シュート再生培地に移す。本実施例の前の研究において、ゼアチンおよびNAAの組み合わせのみがシュート再生を生じ、そしてサイトカイニンBA、2ip、およびオーキシン2,4-D、IAA、IBAからの他の組み合わせが偶発的なシュートを生じなかった。シュート再生培地におけるオーキシンおよびサイトカイニンの濃度を最適化するために、いくつかのホルモンの組み合わせを、伸長したシュートの産生の関数として評価した。TDZおよびNAAなどの多くの組み合わせがシュート原基を産生するが伸長したシュートを産生しなかった。初期のスクリーニングの間、ゼアチンレベルは10、1、および0.1mg/lであり、NAAレベルは0.01、0.1、および1mg/lであった。ゼアチンは、1mg/lまたは0.1mg/lよりも10mg/lにおいて良好な結果を有した。以下のデータは、ゼアチンおよびNAAのレベルを最適化するための試みを要約する。
本実施例は、シュートの塊の成長を促進することによってシュート再生プロセスを加速するためのアミノ酸およびビタミンの混合(表2の処方を参照されたい)の使用を教示する。ユーカリプツス・グランディスクローンFC3の葉移植片を実施例1に記載されるように調製し、そしてアグロバクテリウム接種を実施例4に従って調製する。葉移植片を実施例5に記載されるように接種し、3日間同時培養した。同時培養後、葉移植片を収集し、マゼンタボックスあたり10片で、アミノ酸混合ありまたはなしで培地上に配置した。4週間後、初期相の器官形成を、偶発的なシュートの形成を形成する移植片の頻度として評価し、そしておよびシュート原基、小さなシュート、およびカルスを有するクランプのサイズを測定した(表6を参照されたい)。
本実施例は、アグロバクテリウム感染速度を増加させるための方法を教示する。特に、本実施例は、細胞増殖を刺激し、標的細胞の数を増加し、かつ感染を促進する方法を教示する。選抜されたユーカリプツス・グランディス x ウロフィラ クローンIPB Iからの移植片を実施例1に記載されるように調製し、pWVR133を含むアグロバクテリウム株GV2260を実施例3に記載されるように調製した。収集した移植片を、ユーカリ再生培地上または種々のオーキシンリッチ成長調節剤を有する培地上のいずれかで、暗所で4日間インキュベートした。アグロバクテリウム培養を移植片に滴り落とし、そして暗所で3日間、同じ培地上で移植片とともに同時培養した。次いで、移植片をアグロバクテリウムの水たまりから取り出し、400mg/lチメンチンを補充したEuc再生培地に4日間移した。再生培地への移動後、移植片をGUS発現について染色した。表7〜8において示されるように、種々のオーキシン型成長調節剤は、感染後7日間のGUS発現に対してポジティブな効果を有した。
この実施例は、前培養培地中にアセトシリンゴン(AS)を単独で含めることが感染速度を有意に改善することを示す。この実験において、ユーカリプツス・グランディスクローンFC3およびFC5からの葉移植片を4種の培地:Euc再生培地、250μMもしくは750μMのアセトシリンゴンを有するEuc再生培地、または0.25mg/l 2,4-Dおよび5mg/l ゼアチンの成長調節剤の組み合わせを有するEuc再生培地を用いて4日間前培養した。次いで、移植片を、アグロバクテリウムで感染させ、同じ培地上で3日間同時培養し、その後400mg/l チメンチンを有するEuc再生培地に移した。GUS染色を、同時培養後4日間実行した。データを表9〜10に要約する。
本実施例は、前培養相におけるASおよびオーキシンの組み合わせは感染をさらに高く増加させ得ることを示す。以下の実施例において、ユーカリプツス・グランディスクローンFC1〜5およびユーカリプツス・グランディス x ウロフィラ クローンIPB 1からの移植片を、250μM ASのあるなしで、感染前にオーキシンリッチ前培養上で培養した。移植片を、対照としてEuc再生培地を用いて前培養した。前培養後、実施例5に記載されるように、移植片にアグロバクテリウムを接種した。
本実施例は、同時培養相ASおよびオーキシンの組み合わせが感染速度をさらに増加させることを示す。市販のユーカリプツス・ドゥニークローンDUN0003からの葉移植片を、750μM AS単独、または250μM ASおよび上昇濃度のオーキシン(2mg/l IAA 対0.1mg/l IAA)の組み合わせのいずれかを含む再生培地上で前培養した。移植片を、GUS遺伝子(構成的プロモーターによって駆動される)およびNPTII遺伝子(異なる構成的プロモーターによって駆動される)を含む、pWVR31を含むアグロバクテリウム株GV2260で感染させた。本実施例において、移植片にアグロバクテリウムを直接的に接種するか、または同時培養の4日後にGUS発現についてアッセイする。
本実施例は、前培養および同時培養相におけるASおよびオーキシンの組み合わせが、感染速度をさらに増加させ得ることを示す。市販のユーカリプツス・ドゥニークローンDUN00003からの葉移植片を、250μM ASおよび上昇濃度のオーキシン(2mg/l IAA 対0.1mg/l NAA)の組み合わせを有する再生培地上のいずれかで前培養した。移植物を、4日間前培養し、GUS遺伝子(構成的プロモーターによって駆動される)およびNPTII遺伝子(異なる構成的プロモーターによって駆動される)を含む、pARB1001を含むアグロバクテリウム株GV2260で感染させる。4日間の前培養および3日間の同時培養後に、50個の移植片を一過性GUS発現についてアッセイした。200個の移植片を、30mg/lジェネティシンおよび400mg/l チメンチンを補充した再生培地上で選択した。再生培地上での3ヶ月の選択において、選択で生存する、カルスを有する移植片をGUS選択について染色した。
本実施例は、前培養および同時培養相におけるASおよびオーキシンの2つの組み合わせを比較する。市販のユーカリプツス・ドゥニークローンDUN00001からの葉移植片を、250μM ASおよび上昇濃度のオーキシン(2mg/l のIAAもしくは0.25mgの2,4-Dのいずれか)の組み合わせを有する再生培地上、または0.1mg/l NAAを有する再生培地上のいずれかで前培養した。移植片を4日間前培養し、次いで実施例16において記載されるように、pARB1001を含むアグロバクテリウム株GV2260で感染させた。4日間の前培養および3日間の同時培養後に、50個の移植片を一過性GUS発現についてアッセイした。
本実施例は、2つのアグロバクテリウム株、GV2260およびEHA105を用いる葉移植片または節間移植片の感染を比較する。前培養培地および同時培養培地は、250μM ASおよび2mg/l IAAとしての(通常の再生培地における0.1mg/l NAAに対して)上昇濃度のオーキシンを有する再生培地である。葉抽出物および5mm節間を市販のユーカリプツス・ドゥニークローンDUN00003の保存培養から収集し、実施例4に記載されるように、前培養培地上で培養した。移植片を4日間前培養し、次いでpARB1001を含むアグロバクテリウム株GV2260または株EHA105のいずれかで感染させた。4日間の前培養および3日間の同時培養後に、50個の移植片を一過性GUS発現についてアッセイした。
本実施例は、本発明の形質転換方法を使用する、3つの初期開花ユーカリプツス・オシデンタリスクローンEO66、EO129、およびEO208の感染および形質転換を詳述する。葉移植片を収集し、4日間前培養し、次いで移植片を、p35SGUSINT(35S::GUSINT、NOS::NPTII)を有するアグロバクテリウム株GV2260で感染させた。EO66については、アグロバクテリウム株は、p35SGUSINT(35S::GUSINT、NOS::NPTII)を有するアグロバクテリウム株GV2260であった。EO129およびEO208については、アグロバクテリウム株は同じGV2260であったが、その構築物はpWVK192(イントロンを有するGUS遺伝子を駆動するマツ4CoAリガーゼのプロモーター-4CL::GUSINT、構成的::NPTII)であった。移植片を再生培地上で培養し、これは、NH4H2PO4を0.25g/lの代わりに0.5g/lに変更したという改変を伴った。この培地は750μM ASを含み、オーキシン濃度を上昇しなかった。一過性のGUS発現データを、前培養および同時培養段階の後で収集した。EO66について、GUS発現データを、前培養および同時培養段階の後で収集した。EO129およびEO208については収集した一過性GUS発現データは存在しなかった。クローンEO66、EO129、およびEO208からのそれぞれ144、400、および200移植片を、30mg/lジェネティシンを有する通常の再生培地として選択培地に移植した。6ヶ月後、再生されたシュートをGUS発現について染色し、その結果を表16に示す。
本実施例は優良クローンの形質転換を提供する。優良クローンからの移植片を実施例4に記載されるように調製し、オーキシンおよびアグロバクテリウムインデューサーを含む培地上で前培養する。この移植片を実施例5に記載されるように、アグロバクテリウムで形質転換し、同時培養した。同時培養および形質転換体の選択後、形質転換された移植片を実施例6に詳述されるようにシュート再生培地に移した。GUS発現の完了の際に、これらのシュートを収集し、根形成培地に移した。根形成を、5g/l MeadWestvaco Nuchar活性炭を補充したBTM-1培地上で行い、根形成は通常2〜4週間後に起こる。一旦根系が発生すると、形質転換体を土壌に移した。
本実施例は、トランスジェニック株の試料における除草剤耐性遺伝子の存在および発現を示す。実施例8に記載されるように、RNAを各推定のトランスジェニック株の葉および茎組織から単離した。特に、RNAを、形質転換したグランディスユーカリ株、ユーカリプツス・グランディス x ウロフィラ株、およびユーカリプツス・カマデュレンシス株から単離した。さらに、RNAを、野生型のユーカリプツス・グランディス株、ユーカリプツス・グランディス x ウロフィラ株、およびユーカリプツス・カマデュレンシスの植物から単離した。各株について、5μl RNA試料を、除草剤耐性遺伝子の存在および発現を評価するためのRT-PCRのために使用した。RT-PCRを、Ready-to-Go RT-PCRキット(Pharmacia)を、製造業者の指示書に従って用いて実行した。手短に述べると、各5μl RNA調製物を、オリゴ(dT)nおよび除草剤耐性遺伝子プライマーを含む別々のRT-PCR反応に加えた。RT-PCR後、増幅産物を、エチジウムブロマイド染色したアガロースゲル上で可視化した。
本実施例は、アミノグリコシド抗生物質ネオマイシン、カナマイシン、またはジェネティシン(G418)に対する耐性を付与する異なる選択マーカー、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ(NPTII)遺伝子に対する、現在の形質転換方法論の適合性を実証する。市販のユーカリプツス・グランディス x ウロフィラクローンIPB1の葉移植片を、GUS遺伝子(構成的プロモーターによって駆動される)およびNPTII遺伝子(異なる構成的プロモーターによって駆動される)を含むpWVC33を有するアグロバクテリウム株GV2260で感染させた。形質転換の前に、この移植片を、オーキシン増加(標準再生培地において0.1mg/l NAAの代わりに2mg/lのIAA)およびアセトシリンゴン(250μM)を有する培地上で4日間前培養した。実施例6に記載されるように、移植片をアセトシリンゴンで感染させ、同じ培地上で3日間同時培養し、次いで4日間、400mg/l チメンチンを補充した再生培地に移した。次いで、移植片を、除草剤選択剤の代わりにジェネティシンを含む選択培地に移した。
本実施例は、ユーカリ移植片が、P35SGUSINT(35S::GUSINT、NOS::NPTII)を有するアグロバクテリウム株GV2260で形質転換され得ることを実証する。実施例16において開示される方法と同様に、ユーカリプツス・カマデュレンシスクローンC9を、p35SGUSINTを有するGV2260で形質転換した。再生後、移植片をジェネティシン(30、40、50、または60mg/lジェネティシン)を含む選択培地に移した。30および50mg/lのレベルのジェネティシンについては、さらなるセットの移植片を1日間前培養した。選択培地上での8週間の後、初期発生段階にあるジェネティシン耐性シュート培養の試料を収集し、GUS発現についてx-glucで染色した。GUS発現データを以下の表に要約する。
本実施例は、市販のユーカリプツス・グランディスクローンが、別の構築物pWVR8(シロイヌナズナActinII::GUSINT、構成的::NPTII)を有するアグロバクテリウム株GV2260を用いて形質転換され得ることを実証する。実施例4に記載されるように、ユーカリプツス・グランディスクローンIP1からの葉移植片を、オーキシンおよびアグロバクテリウムインデューサーを含む前培養培地上で前培養した。この移植片をアグロバクテリウムで形質転換し、オーキシン増加(標準再生培地において0.1mg/l NAAの代わりに2mg/lのIAA)およびアセトシリンゴン(250μM)を有する前培養培地上で3日間同時培養した。次いで、この移植片を400mg/lチメンチンを補充したEuc再生培地に4日間移した。ついでこの移植片を、ジェネティシン(30または40mg/lジェネティシン)を含む選択培地に移した。選択培地上で8日間の後、初期発生段階にあるジェネティシン耐性シュート培養の試料を収集し、GUS発現についてx-glucで染色した。GUS発現データを表20に要約する。
上記の実施例からのデータに基づいて、優良ユーカリクローンは、開示された方法によって外来性DNAで形質転換され得る。例えば、優良ユーカリクローンは、セルロースシンターゼなどのセルロース合成に関与する酵素をコードする遺伝子で形質転換され得る。セルロースシンターゼはUDP-グルコースに結合し、新生グルカン鎖の非還元末端に糖を転移させる。本発明の方法を使用して、UDP-グルコース結合ドメインがトランスジェニック植物において過剰発現され得る
本実施例は、モデル植物における選択のために十分なレベルでスルホニルウレア系除草剤を含む培地中での、ALSをコードする選択マーカーを使用する、遺伝子形質転換したマツの選択を記載する。以下の実施例において記載されるものを含む、いくつかの実験においては、植物組織中でals遺伝子を発現するベクターが、植物組織中でnptII遺伝子を発現するベクターを有する細胞に同時衝撃され、次いでその同時衝撃された細胞が2つの群に分けられて、スルホニルウレア系除草剤またはジェネティシンのいずれかを含む選択培地に配置され、その結果、形質転換体がジェネティシン上で選択される頻度が、除草剤上での選択の頻度と比較され得る。
aCoke(1996)による。
bGupta and Durzan (1985)による。
cBecwar et al. (1990)による。
dフィルター滅菌した水性保存として、まだ暖かい(約60℃)間にオートクレーブした培地に加える。
a基礎培地の組成については表19を参照されたい。
b以下の実施例のいくつかにおいては、カゼイン加水分解物の代わりに定義されたアミノ酸混合物に置換されている。
cGELRITE(登録商標)(Merck,Inc.によって製造されたジェランガム)。
d2,4-ジクロロフェノキシ酢酸(2,4-D)またはナフタレン酢酸。
eN6-ベンジルアミノプリン(BAP)またはN6-ベンジルアデニン(BA)。
f全てのゲル化培地について、約10、15、または20mlの培地を各100×15mmの滅菌ペトリ皿に注ぎ、培地を使用するまで冷蔵するかまたは室温で保存した。全ての液体培養培地について、ゲル化剤を加えず、かつ培地を、使用前に冷蔵または冷凍下において500mlバッチで保存する。
2つの各々が異なる3つの異なるファミリーからである(2つの遺伝的に多様なテーダマツファミリーおよび1つのテーダマツ×ヤニマツの雑種)、6つの胚形成株を評価した。遺伝的に異なる組織培養株の各々からの均一な懸濁培養物を、実施例26に記載されるように樹立した。これらの6つの株の各々の懸濁細胞からの3つの同一の複製を、実施例26に記載されるように、DCR2培地の10個の処方、すなわち、カゼイン加水分解物のあるなし、および0、10、20、40、および80nMの除草剤Oustを含む各々に配置した。プレートをシールし、実施例26の実験開始前段階、維持段階、および選択段階のために使用されるのと同じ条件下でインキュベートした。3週間毎に培養物を、ポリエステル支持体上で組織の滅菌条件下で秤量後、以前に提供したのと同じ処方の新鮮な培地に移した。全体で12週間後の6種の細胞株の各々についてのこれらの培地上での増殖を図9に示す。
a基礎培地の組成については表19を参照されたい。
bGELRITE(登録商標)(Merck,Inc.によって製造されたジェランガム)
cポリエチレングリコール(分子量4000)
dアブシジン酸
本実施例において、4つの選抜したファミリーからの5つのテーダマツ株を、als選択マーカーを含むプラスミドを用いて形質転換し、そして選択を、カゼイン加水分解物を除外するように改変したスルホニルウレア含有培地上で行った。5つのマツ細胞株は、5つの株の1つがジョージア州のInternational Paper seed 果樹園において交雑された優良テーダマツであった以外は、実施例26に記載されるように惹起された。株を凍結保存し、実施例26に記載される誘導体に均一な懸濁物として培養した。
構成的プロモーターによって駆動される、レポーター遺伝子およびnptII選択マーカーならびに代替的な選択マーカーalsまたはasa2を含む、DNAベクターを設計した。ベクター中の遺伝子の相対的な位置は、バイナリベクターにおいて、選択マーカーnptIIが、形質転換の間にほとんどの場合失われるボーダーの近くにあり、および代替的な選択マーカーが、nptII遺伝子とuidAレポーター遺伝子との間にあるように設計された。これは、細胞が最初にまたは並行してnptIIを使用して選択され得、かつnptII遺伝子の存在が、首尾よいジェネティシン選択によって明らかになるように、これらの2つの遺伝子間の連結された代替的な選択マーカーが存在する高い可能性の証拠である、選択実験を可能にするために実行された。この構成は、代替的なマーカー選択条件が樹立されるまで、形質転換の成功の迅速な非分子的尺度を使用して、選択系の試験および開発を容易にした。ベクターは、便利な制限部位が、nptII遺伝子およびuidA遺伝子の引き続く除去、ならびに関心対象の他の遺伝子の挿入を可能にするように設計した。形質転換の間に最も頻繁に失われるボーダーの近くに位置する代替的な選択マーカーは、関心対象の遺伝子が代替的な選択マーカーと同時移入されることを可能にする。
テーダマツ細胞株を、実施例28と同じ方法を使用する形質転換のために調製し、そしてこれもまた実施例28に記載されるように、pWVC23(図5)で形質転換されたアグロバクテリウム・ツメフェイシェンスとともに同時培養した。アグロバクテリウムの根絶後、各細胞株を、15mg/Lジェネティシンまたは50もしくは100nMのいずれかのAllyのいずれかを含む選択培地に等しく分けた。推定の形質転換した亜系統を十分なサイズまで生育させ、Ally含有培地上で生育した9個の亜系統をジェネティシン含有培地に移し、PCRの前に迅速に形質転換状態をチェックした。これらの株の100%がジェネティシン含有培地上で生育可能であった。次いで、5個のこれらの株を、実施例28に記載される6個のプライマー対を使用するPCRを用いてチェックした。これらの株の100%がPCRによってポジティブな形質転換体と確認された。しかし、これらの株は、実施例28に記載される株と同じ非再生表現型を示した。
カゼイン加水分解物は、カゼインミルクタンパク質の加水分解によって得られる主として遊離のアミノ酸を含むが、ある程度の遊離のアンモニアおよび少量のジペプチド、トリペプチド、およびより複雑なペプチドもまた含む複雑な混合物である、以下の表23は、2つの異なる年度のSigma(登録商標)において引用された分析手順によって決定されるような、カゼイン加水分解物の遊離のアミノ酸組成および遊離のアンモニア組成を示す。
2個のテーダマツ細胞株を、実施例28の方法を使用する形質転換のために調製し、実施例28に記載されるように、pWVC33(図7)で形質転換したアグロバクテリウム・ツメフェイシェンスとともに同時培養した。アグロバクテリウムの根絶後、各細胞株を、6枚のプレートに等しく分け、各々5つの異なる選択培地が、カゼイン加水分解物および15mg/Lのジェネティシン、またはアミノ酸混合物AA4および30もしくは50mg/Lの5-メチルトリプトファン(5MT)または30もしくは50mg/Lのα-メチルトリプトファン(AMT)のいずれかを含んだ。これらの結果を図12に示す。推定の形質転換された亜系統は、30mg/Lのメチル化トリプトファン選択性アナログが取り込まれた場合に、ジェネティシン含有プレートおよび両方の選択処理で増殖した。
この実験において、実施例30と同様に、選抜したファミリーからのBrazilianテーダマツ株を含む、6個の遺伝的に多様なテーダマツ株および雑種マツ株を、実施例28と同様に形質転換のために調製し、かつ同時培養し、pWVC24(図4)またはpWVC33(図7)で形質転換したアグロバクテリウム株間の各々の細胞を分けた。
Claims (14)
- 分枝鎖アミノ酸およびカゼイン加水分解物を含まず、スルホニルウレア系除草剤またはイミダゾリノン系除草剤およびアミノ酸成分としてカゼイン加水分解物の誘導体を含む、形質転換された移植片のシュート再生培地であって、カゼイン加水分解物の誘導体が、グリシン、スレオニン、セリン、トリプトファン、チロシン、メチオニン、フェニルアラニン、アルギニン、およびリシンからなる、シュート再生培地。
- 以下の段階を含む、トランスジェニック植物を産生するための方法:
(i)アセトシリンゴンを含む培地上で移植片を前培養する段階;
(ii)植物細胞に遺伝子を移すことが可能であるベクターを宿すアグロバクテリウム株に移植片を曝露する段階;
(iii)形質転換した移植片を、請求項1記載の再生培地上で選択する段階;ならびに
(iv)移植片からトランスジェニック植物を再生する段階。 - トリプトファンおよびカゼイン加水分解物を含まず、トリプトファンアナログおよびアミノ酸成分としてカゼイン加水分解物の誘導体を含む、形質転換された移植片のシュート再生培地であって、カゼイン加水分解物の誘導体が、グリシン、スレオニン、セリン、チロシン、メチオニン、バリン、フェニルアラニン、アルギニン、リシン、ロイシン、およびイソロイシンからなる、シュート再生培地。
- 以下の段階を含む、形質転換された木の移植片を選択するための方法:
(i)除草剤耐性型の植物アセト乳酸シンターゼ(ALS)をコードする遺伝子、およびリグニン生合成もしくはセルロース合成に関与する遺伝子を含むベクターで木の移植片細胞を形質転換する段階;
(ii)形質転換された木の移植片細胞を培養する段階;および
(iii)請求項1記載の再生培地上で形質転換された移植片を選択する段階。 - 以下の段階を含む、形質転換された木の移植片を選択するための方法:
(i)フィードバック非感受性型のアントラニル酸シンターゼ(AS)をコードする遺伝子、およびリグニン生合成もしくはセルロース合成に関与する遺伝子を含むベクターで植物細胞を形質転換する段階;
(ii)形質転換された植物細胞を培養する段階;および
(iii)請求項3記載の再生培地上で形質転換された移植片を選択する段階。 - 1.99 mg/g グリシン、8.52 mg/g スレオニン、9.04 mg/g セリン、12.2 mg/g トリプトファン、12.7 mg/g チロシン、13.2 mg/g メチオニン、25.7 mg/g フェニルアラニン、25.8 mg/g アルギニン、および50.8 mg/g リシンからなるカゼイン加水分解物の誘導体 0.5g/Lを含む、請求項1記載の形質転換された移植片の再生培地。
- 1.99 mg/g グリシン、8.52 mg/g スレオニン、9.04 mg/g セリン、12.7 mg/g チロシン、13.2 mg/g メチオニン、18.3 mg/g バリン、25.7 mg/g フェニルアラニン、25.8 mg/g アルギニン、50.8 mg/g リシン、54 mg/g ロイシン、および72.4 mg/g イソロイシンからなるカゼイン加水分解物の誘導体 0.5g/Lを含む、請求項3記載の形質転換された移植片の再生培地。
- 以下の段階を含む、トランスジェニック植物を産生するための方法:
(i)アセトシリンゴンを含む培地上で移植片を前培養する段階;
(ii)植物細胞に遺伝子を移すことが可能であるベクターを宿すアグロバクテリウム株に移植片を曝露する段階;
(iii)形質転換した移植片を、請求項3記載の再生培地上で選択する段階;ならびに
(iv)移植片からトランスジェニック植物を再生する段階。 - トランスジェニック植物が以下からなる群から選択される、請求項8記載の方法;
トランスジェニックユーカリプツス・オシデンタリス植物、トランスジェニックユーカリプツス・ドゥニー植物、トランスジェニックユーカリプツス・グランディス植物、およびトランスジェニックユーカリプツス・グランディス×ユーカリプツス・ウロフィラ雑種植物。 - トランスジェニック植物が以下からなる群から選択される、請求項2記載の方法;
トランスジェニックユーカリプツス・オシデンタリス植物、トランスジェニックユーカリプツス・ドゥニー植物、トランスジェニックユーカリプツス・グランディス植物、およびトランスジェニックユーカリプツス・グランディス×ユーカリプツス・ウロフィラ雑種植物。 - トランスジェニック植物から木材パルプを得る段階をさらに含む、請求項2または8記載の方法。
- トランスジェニック植物から材木を得る段階をさらに含む、請求項2または8記載の方法。
- トランスジェニック植物から紙を得る段階をさらに含む、請求項2または8記載の方法。
- トランスジェニック植物からオイルを得る段階をさらに含む、請求項2または8記載の方法。
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