ES2290956T3 - Mejoras en o relacionadas con una composicion de almidon de una planta. - Google Patents

Abstract

SE DESCUBRE UNA SECUENCIA NUCLEOTIDICA QUE CODIFICA UNA PORCION EFECTIVA DE UN ENZIMA RAMIFICADOR DE ALMIDON DE CLASE A (SBE) OBTENIBLE A PARTIR DE PLANTAS DE PATATA, O UN EQUIVALENTE FUNCIONAL DEL MISMO, JUNTO CON, ENTRE OTROS, UN POLIPEPTIDO CORRESPONDIENTE, UN METODO PARA ALTERAR LAS CARACTERISTICAS DE UNA PLANTA, UNA PLANTA CON CARACTERISTICAS ALTERADAS; Y ALMIDON, EN PARTICULAR ALMIDON OBTENIDO DE UNA PLANTA DE PATATA, CON NUEVAS PROPIEDADES.

Description

Mejoras en o relacionadas con una composición de almidón de una planta.

Campo de la invención

Esta invención se relaciona con nuevas secuencias de nucleótidos, con los polipéptidos codificados por ellas, con vectores y células huésped y organismos huésped que contienen una o más de las secuencias nuevas, y con un método para alterar una o más de las características de un organismo. La invención también se relaciona con un almidón que tiene propiedades nuevas y con los usos del mismo.

Antecedentes de la invención

El almidón es la forma principal de reserva de carbono en las plantas, constituyendo 50% o más del peso seco de muchos órganos de almacenamiento - por ejemplo tubérculos, semillas de cereales. El almidón se utiliza en numerosos alimentos y aplicaciones industriales. En muchos casos, sin embargo, es necesario modificar los almidones nativos, a través de medios químicos o físicos, con el propósito de producir propiedades distintas para satisfacer aplicaciones particulares. Sería altamente deseable poder producir almidones con las propiedades referidas directamente en la planta, eliminando así la necesidad de modificaciones adicionales. Para lograr esto a través de ingeniería genética se requiere el conocimiento de la ruta metabólica de la biosíntesis de almidón. Esto incluye la caracterización de genes y de los productos génicos codificados que catalizan la síntesis del almidón. El conocimiento acerca de la regulación de la biosíntesis del almidón permite la posibilidad de rutas biosintéticas de "reprogramación" para crear almidones con nuevas propiedades que podrían tener nuevas aplicaciones comerciales.

Las propiedades comerciales útiles del almidón se derivan de la habilidad de la forma granular nativa para hincharse y absorber agua por un tratamiento adecuado. Usualmente se requiere calor para provocar que los gránulos se hinchen en un proceso conocido como gelatinización, que ha sido definido como (W A Atwell y colaboradores, Cereal Foods World 33, 306-311, 1988): "... el colapso (ruptura) del ordenamiento molecular dentro del gránulo de almidón que se manifiesta en cambios irreversibles en propiedades tales como el hinchamiento granular, la fundición del cristal nativo, la pérdida de birrefringencia, y la solubilización del almidón. El punto inicial de la gelatinización y el rango sobre el cuál ocurre están gobernados por la concentración del almidón, el método de observación, el tipo de gránulo, y la heterogeneidad dentro de la población de gránulos bajo observación". Se encuentran disponibles un gran número de técnicas para la determinación de la gelatinización como la inducida por calor, siendo un método conveniente y preciso el de la calorimetría diferencial de barrido, que detecta el rango de temperatura y la entalpía asociados con el colapso del ordenamiento molecular dentro del gránulo. Para obtener resultados precisos y significativos, usualmente se determina la temperatura de inicio y/o la de pico de la endoterma observada por medio de calorimetría diferencial de barrido.

La consecuencia del colapso del ordenamiento molecular dentro de los gránulos de almidón es que los gránulos son capaces de recoger agua en un proceso conocido como adhesión, que ha sido definido como (W A Atwell y colaboradores, Cereal Foods World 33, 306-311, 1988): "... el fenómeno después de la gelatinización en la disolución de almidón. Involucra hinchamiento granular, exudación de componentes moleculares del gránulo, y eventualmente, la ruptura total de los gránulos". El mejor método para evaluar las propiedades de adhesión se considera que es la viscoamilografía (Atwell y colaboradores, 1998, citado anteriormente) en la cual se hace seguimiento a la viscosidad de una suspensión agitada de almidón bajo un régimen definido de tiempo/temperatura. Un perfil típico de viscoamilografa para almidón de patata muestra una elevación inicial de la viscosidad, que se considera que es debida al hinchamiento del gránulo. Además de la forma total de la respuesta de viscosidad en un viscoamilógrafo, una medida cuantitativa conveniente es la temperatura del desarrollo inicial de viscosidad (inicio). La Figura 1 muestra un perfil típico de viscosidad de esta clase para almidón de patata, durante y después de la cocción, e incluye las etapas A-D que corresponden al comienzo de la viscosidad (A), a la viscosidad máxima (B), a la dispersión completa (C) y a la reasociación de moléculas (o retrogradación, D). En la figura, la línea punteada representa la viscosidad (en el número de unidades can agitación) de una suspensión de almidón al 10% p/p y la línea continúa muestra la temperatura en grados centígrados. En un cierto punto, definido por el pico de viscosidad, el hinchamiento del gránulo es tan grande que las estructuras altamente expandidas resultantes son sensibles a una fragmentación mecánicamente inducida bajo las condiciones de agitación utilizadas. Con un calentamiento mayor y sostenido a 95°C, se observa una reducción adicional en la viscosidad debido a una mayor fragmentación de los gránulos hinchados. Este perfil general ha sido siempre previamente encontrado para almidón nativo de patata.

Después del calentamiento de almidones en agua a 95°C y de mantenerlos a esa temperatura (típicamente durante 15 minutos), el enfriamiento posterior a 50°C resulta en un incremento en la viscosidad debido al proceso de retrogradación o de retroceso. La retrogradación (o retroceso) se define como (Atwell y colaboradores, 1998, citado anteriormente) "... un proceso que se presenta cuando las moléculas que contienen almidón gelatinizado comienzan a reasociarse en una estructura ordenada...". A 50°C, es principalmente el componente amilosa el que se reasocia, como lo indica el incremento en la viscosidad con el viscoamilógrafo para el almidón a partir de maíz normal (21,6% de amilosa) comparado con el almidón del maíz ceroso (1,1% de amilosa) como se observa en la Figura 2. La Figura 2 es una viscoamilografía de suspensiones de almidón al 10% p/p a partir de maíz ceroso (línea continua), maíz convencional (puntos y rayas), una variedad con alto contenido de amilosa (hylon 5, línea punteada) y una variedad con un contenido muy alto de amilosa (hylon 7, cruces). Se observa también el perfil de temperatura por medio de una línea continua, como la Figura 1. El grado de incremento en la viscosidad en el viscoamilógrafo enfriando y manteniendo 50°C depende de la cantidad de amilosa que sea capaz de reasociarse debido a su exudación a partir de los gránulos de almidón durante los procesos de gelatinización y adhesión. Una característica de los almidones ricos en amilosa a partir de plantas de maíz es que se exuda muy poca amilosa a partir de los gránulos por gelatinización y adhesión hasta 95°C, probablemente debido al hinchamiento restringido de los gránulos. Esto es ilustrado la Figura 2 que muestra bajas viscosidades para un almidón (Hylon 5) con amilosa alta (44,9%) a partir de maíz durante la gelatinización y adhesión a 95°C y un bajo incremento en la viscosidad al enfriar y mantener a 50°C. Éste efecto es más extremo para un mayor contenido de amilosa (58%, como en Hylon 7), que muestra viscosidades aún menores en el ensayo con el viscoamilógrafo (Figura 2). Para los almidones comercialmente disponibles con alto contenido de amilosa (actualmente disponibles a partir de plantas de maíz, tal como aquellas descritas más arriba), usualmente es necesario un procesamiento por encima de 100°C con el propósito de generar los beneficios de contenidos altos de amilosa con respecto a velocidades y concentraciones mayores de reasociación, pero el uso de temperatura tan altas es energéticamente desfavorable y costoso. Por lo tanto, existe una necesidad insatisfecha por almidones con alto contenido de amilosa que puedan ser procesados por debajo de 100°C y que muestra aún niveles mejorados de reasociación, como lo indican por ejemplo las mediciones por medio de un viscoamilógrafo.

Las propiedades del almidón de patata son útiles en una variedad eje aplicaciones tanto alimenticias como no alimenticias (papel, textiles, adhesivos, etc.). Sin embargo, para muchas aplicaciones, las propiedades no son óptimas y se emprenden diferentes modificaciones químicas y físicas conocidas en el arte con el propósito de mejorar las propiedades útiles. Dos tipos de manipulación apropiadas que serían útiles son: la alteración controlada de las temperaturas de gelatinización y de adhesión; y almidones que sufran menos fragmentación granular durante la adhesión que los almidones convencionales.

Actualmente las únicas formas de manipular las temperaturas de gelatinización y de adhesión del almidón de patata son por medio de la inclusión de aditivos tales como azúcares, polihidroxi compuestos de sales (Evans & Haisman. Starke 34, 224-231, 1982) o por medio de pretratamientos fisicos o químicos extensivos (por ejemplo Stute, Starke 44, 205-214, 1992) La reducción de la fragmentación de los gránulos durante la adhesión se puede lograr ya sea por medio de pretratamientos físicos extensivos (Stute, Starke 44, 205-214, 1992) o por medio de entrelazamiento químico. Tales procesos son inconvenientes e ineficientes. Por lo tanto es deseable obtener plantas que produzca almidón que intrínsecamente posean tales propiedades ventajosas.

El almidón consiste de dos polisacáridos principales, amilosa y amilopectina. La amilosa es un polímero generalmente lineal que contienen unidades de glucosa enlazadas \alpha-1,4, mientras que la amilopectina es un polímero altamente ramificado que consiste de una columna vertebral de glucano enlazado \alpha-1,4 con ramificaciones de glucano enlazadas \alpha-1,6. En la mayoría de las plantas las reservas almacenadas de amilopectina constituyen aproximadamente el 75% del contenido de almidón. La amilopectina se sintetiza por medio de la acción concertada de la sintasa de almidón soluble y de la enzima de ramificación del almidón [glucano \alpha-1,4: 6-glicosiltransferasa de glucano \alpha-1,6, EC 2.4.1.18]. La enzima de ramificación del almidón (SBE) hidroliza los enlaces \alpha-1,4 y vuelve a unir al glucano escindido, a través de un enlace \alpha-1,6, a una cadena aceptora para producir una estructura ramificada. Las propiedades físicas del almidón se afectan fuertemente por la abundancia relativa de amilosa y amilopectina, y SBE es por lo tanto una enzima crucial en la determinación tanto de la cantidad como de la calidad de los almidones producidos en sistemas de plantas.

En la mayoría de las plantas estudiadas hasta la fecha, por ejemplo maíz (Boyer & Preiss, 1978 Biochem. Biophys. Res. Comm. 80, 169-175), arroz (Smyth, 1988, Plant Sci. 57, 1-8) y guisantes (Smith. Planta 175, 270-279), se han identificado dos formas de SBE, cada una codificada por un gen separado. Una revisión reciente por Burton y colaboradores, (1995 The Plant Journal 7, 3-15) ha demostrado que las dos formas de SBE constituyen clases distintas de la enzima de manera que, en general, enzimas de la misma clase de plantas diferentes pueden exhibir una mayor similitud que enzimas de clases diferentes de la misma planta. En su revisión, Burton y colaboradores llamaron a las dos respectivas familias de enzimas clase "A" y clase "B", y el lector es remitido a las mismas (y a las referencias citadas aquí) para una discusión detallada de las distinciones entre las dos clases. Una distinción general observada parecería ser la presencia, en las moléculas de SBE de clase A, de un dominio N-terminal flexible, quien no se encuentra en moléculas de clase B. Las distinciones observadas por Burton y colaboradores son tenidas en cuenta aquí para definir las moléculas de SBE clase A y clase B, cuyos términos se deben interpretar de conformidad.

Sin embargo en patatas, únicamente una isoforma de la molécula de SBE (que pertenece la clase B) ha sido reportada hasta el momento y solamente un gen clonado (Blennow & Johansson, 1991 Phytochem. 30, 437-444, y Koßmann y colaboradores, 1991 Mol. Gen. Genet. 230, 39-44). Además, los intentos publicados para modificar las propiedades del almidón en plantas de patata (evitando la expresión de la única SBE conocida) generalmente no han sido exitosos (por ejemplo, Muller-Rober & Koßmann 1994 Plant Cell and Environment 17, 601-613).

Resumen de la invención

En un primer aspecto la invención provee una secuencia aislada de nucleótidos que codifican a un polipéptido que contiene la secuencia de aminoácidos de los residuos 49-882 de la secuencia mostrada en la Figura 5, o el complemento de la misma.

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La secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 5 (Seq ID No. 15) incluye una secuencia líder que dirige al polipéptido, cuando es sintetizado en células de patata, al amiloplasto. Aquellos capacitados el arte reconocerán que la secuencia líder es removida para producir una enzima madura y que la secuencia líder no es por lo tanto esencial para la actividad de la enzima. Por lo tanto, una "porción efectiva" del polipéptido es una que posee suficiente actividad de la SB E para complementar la mutación de la enzima de ramificación en células KV 832 de E. coli (es que describen más adelante) y que es activa cuando se expresa en E. coli en el ensayo de estimulación de la fosforilación. Un ejemplo de un polipéptido incompleto que constituye sin embargo una "porción efectiva" es la enzima madura que carece de la secuencia líder. Por analogía con la secuencia de la SBE clase A del guisante, la secuencia clase A de la patata mostrada en la Figura 5, probablemente posee una secuencia líder de aproximadamente 48 residuos de aminoácidos, de tal manera que se piensa que la secuencia de aminoácidos N-terminal comienza alrededor del residuo (E) de ácido glutámico en la posición 49 (EKSSYN...etc.). Aquellos capacitados en el arte apreciarán que una porción efectiva de la enzima puede excluir bien otras partes de la secuencia mostradas en la figura sin un efecto nocivo sustancial. Por ejemplo, la región rica en ácido glutámico C-terminal podría ser reducida en longitud, o posiblemente suprimida completamente, sin suprimir los la actividad de la SBE clase A. Una comparación con otras secuencias conocidas de la SBE, especialmente otras secuencias de la SBE clase A (ver por ejemplo, Burton y colaboradores, 1995 citado anteriormente), debe indicar aquellas porciones que están altamente conservadas (y por lo tanto probablemente sea esencial para la actividad) y aquellas porciones que están menos bien conservadas (y por lo tanto probablemente toleran más cambios en la secuencia sin una pérdida sustancial de actividad de la enzima).

Convenientemente, la secuencia de nucleótidos comprenderá sustancialmente a los nucleótidos 289 a 2790 de la secuencia de ADN (Seq ID No. 14) mostrada en la Figura 5 (cuyos nucleótidos codifican a la enzima madura) o a un equivalente funcional de la misma, y puede incluir también nucleótidos adicionales en el extremo 5' o en el extremo 3'. Por ejemplo, por facilidad de expresión, la secuencia también comprenderá deseablemente un codón de inicio ATG en el marco, y puede codificar también una secuencia líder. Por lo tanto, en una modalidad, la secuencia comprende además a los nucleótidos 145 a 288 de la secuencia mostrada en la Figura 5. Otras modalidades son los nucleótidos 228 a 2855 de la secuencia marcada como "psbe2con.seq" en la Figura 8, y los nucleótidos 57 a 2564 de la secuencia mostrada en la Figura 12 (preferiblemente contiene un codón de inicio ATG en el marco, tal como la secuencia de nucleótidos 24 a 56 en la misma Figura), o equivalentes funcionales de la secuencias anteriormente mencionadas.

El término "equivalente funcional" como se lo aplica aquí a las secuencias de nucleótidos se propone abarcar a aquellas secuencias que difieren en su composición de nucleótidos de aquella mostrada en la Figura 5 pero que, en virtud de la degeneración del código genético, codifica polipéptidos que tienen secuencias idénticas o sustancialmente idénticas de aminoácidos. Se pretende que el término se aplique también a secuencias que son suficientemente homólogas a la secuencia de la invención que ellas puedan hibridar hasta el complemento de la misma bajo condiciones rigurosas de hibridación - tales equivalentes poseerán preferiblemente al menos 85%, más preferiblemente al menos 90%, y lo más preferiblemente al menos 95% de homología de secuencia con la secuencia de la invención como la ejemplificada por los nucleótidos 289 a 2790 de la secuencia de ADN mostrada en la Figura 5. Será claro para aquellos capacitados en el arte que la secuencia de nucleótidos de la invención puede encontrar también aplicación útil cuando se presenta como una secuencia "antisentido". Por lo tanto, las secuencias funcionalmente equivalentes incluirán también a aquellas secuencias que pueden hibridar, bajo condiciones rigurosas de hibridación, hasta la secuencia de la invención (en vez de hasta el complemento de la misma). Tales equivalentes "antisentido" preferiblemente poseerán al menos 85%, más preferiblemente al menos 90%, y lo más preferiblemente 95% de homología de secuencia con el complemento de la secuencia de invención como la ejemplificada por los nucleótidos 289 a 2790 de la secuencia de ADN mostrada en la Figura 5. Se muestran equivalentes funcionales particulares, por ejemplo, en las Figuras 8 y 10 (si uno hace caso omiso de las diferentes mutaciones del marco de lectura observadas aquí).

La invención también provee vectores, particularmente vectores de expresión, que contienen la secuencia de nucleótidos de la invención. El vector típicamente comprenderá un promotor y una o más señales reguladoras del tipo conocido por aquellos capacitados en el arte. La invención también incluye una provisión de células transformadas (cuyo término abarca transducción y transfección) con un vector que contiene la secuencia de nucleótidos de la invención.

La invención provee además un polipéptido de la SBE clase A, que puede obtenerse a partir de plantas de patata y codificado por la secuencia de ácido nucleico del primer aspecto de la invención. En particular, la invención provee al polipéptido en una forma sustancialmente pura, especialmente en una forma libre de otros componentes derivados de la planta (especialmente derivados de la planta de patata), que puede lograrse fácilmente por medio de la expresión de la secuencia relevante de nucleótidos en un huésped adecuado que no es una planta (tal como cualquiera de las cepas de levadura rutinariamente utilizadas para propósitos de expresión, por ejemplo, Pichia spp, o Saccharomyces spp). Típicamente, la enzima comprenderá sustancialmente la secuencia de residuos aminoácidos 49 a 882 mostrada en la Figura 5 (haciendo caso omiso de la secuencia MNKRIDL, que no hace parte de la enzima), o un equivalente funcional de la misma. El polipéptido de la invención se puede usar en un método para modificar almidón in vitro, que comprende el tratamiento del almidón bajo condiciones adecuadas (por ejemplo, temperatura y pH apropiados, etc.) con una cantidad efectiva del polipéptido de acuerdo con la invención.

El término "equivalente funcional", como se lo aplica aquí a las secuencias de aminoácidos, se propone abarcar las secuencias de aminoácidos sustancialmente similares a aquellas mostradas en la Figura 5, ya que el polipéptido posee suficiente actividad para complementar la mutación de la enzima de ramificación en células KV 832 de E. coli (descritas más adelante) y que es activo en E. coli en los ensayos de estimulación de la fosforilación. Típicamente, tales secuencias de aminoácidos funcionalmente equivalentes poseerán preferiblemente al menos 85%, más preferiblemente al menos 90%, y lo más preferiblemente al menos 95% de identidad de la secuencia con la secuencia de aminoácidos de la enzima madura (esto es, menos secuencia líder) mostrada en la Figura 5. Aquellos capacitados en el arte apreciarán que se pueden hacer sustituciones conservadoras generalmente en toda la molécula sin afectar sustancialmente la actividad de la enzima. Además, se pueden tolerar algunas sustituciones no conservadoras, especialmente en las regiones menos altamente conservadas de la molécula. Tales sustituciones pueden hacerse, por ejemplo, para modificar ligeramente la actividad de la enzima. El polipéptido puede, si se desea, incluir una secuencia líder, tal como aquella ejemplificada por los residuos 1 a 48 de la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 5, aunque se conocen y se pueden incluir otras secuencias líder y péptidos señal y similares.

Una porción de la secuencia de nucleótidos de la invención ha sido introducida en una planta y se encontró que afecta las características de la planta. En particular, se encontró que la introducción de la secuencia de la invención, operativamente enlazada en la orientación antisentido a un promotor adecuado, reduce la cantidad de moléculas de almidón ramificadas en la planta.. Adicionalmente, se ha demostrado recientemente en otros sistemas experimentales que puede ocurrir también una "supresión sentido" (esto es, la expresión de una secuencia introducida operativamente enlazada en la orientación sentido puede interferir, por medio de algún mecanismo desconocido, con la expresión del gen nativo), como lo describen Matzke & Matzke (1995 Plant Physiol. 107, 679-685). Cualquiera de los métodos mencionados por Matzke & Matzke podría, en teoría, ser utilizado para afectar la expresión en un huésped de un gen homólogo que codifica para la SBE.

Se cree que los métodos antisentido son principalmente operables por medio de la producción de ARNm antisentido que hibrida al ARNm sentido, previniendo su traducción en un polipéptido funcional, posiblemente provocando que el ARN híbrido se degrade (por ejemplo, Sheehy y colaboradores, 1988 PNAS 85, 8805-8809: Van der Krol y colaboradores, Mol. Gen. Genet. 220, 204-212). La supresión sentido también requiere de homología entre la secuencia introducida y el gen objetivo, pero el mecanismo exacto no es claro. Es claro sin embargo que, en relación tanto con la supresión sentido como antisentido, ni una secuencia de nucleótidos completa, ni una secuencia "nativa" son esenciales. Preferiblemente, la "porción efectiva" utilizada en el método comprenderá al menos un tercio de la secuencia de longitud completa, pero por simple ensayo y error se pueden encontrar otros argumentos (más pequeños o más grandes) que son funcionales en la alteración de las características de la planta.

Por lo tanto, en un aspecto adicional la invención provee un método de alterar las características de una planta, que comprende introducir dentro de la planta una porción de la secuencia de la invención operativamente enlazada a un promotor adecuado activo en la planta, para afectar la expresión de un gen presente en la planta. Convenientemente, la secuencia se enlazará en la orientación antisentido al promotor. Preferiblemente, la planta es una planta de patata. Convenientemente, las características alteradas se relacionan con el contenido de almidón y/o con la composición del almidón de la planta (esto es, la cantidad y/o el tipo de almidón presente en la planta). Preferiblemente, el método de alterar las características de la planta comprenderá también la introducción que una o más secuencias adicionales, además de una porción de la secuencia de la invención. La secuencia introducida de la invención y una o más secuencias adicionales (que pueden ser secuencias sentido o antisentido) pueden ser operativamente enlazadas a un promotor único (que garantizaría que ambas secuencias se transcribieran esencialmente al mismo tiempo), o pueden ser operativamente enlazadas a promotores separados (lo que puede ser necesario para una expresión óptima). Donde se emplean promotores separados, ellos pueden ser idénticos entre sí o diferentes. Los promotores adecuados son conocidos por aquellos capacitados en el arte e incluyen tanto tipos constitutivos como inducibles. Los ejemplos incluyen al promotor 35S del CaMV (por ejemplo una repetición sencilla o en tándem) y al promotor de la patatina. Convenientemente, el promotor será específico del tejido. Deseablemente, el promotor causará la expresión de la secuencia operativamente enlazada en niveles sustanciales únicamente en el tejido de la planta donde ocurre principalmente la síntesis del almidón y/o el almacenamiento del almidón. Así, por ejemplo, donde se introduzca la secuencia en una planta de patata, el promotor operativamente enlazado puede ser específico del tubérculo, tal como el promotor de la patatina.

Deseablemente, la secuencia adicional contendrá una porción de la secuencia que codifica a la molécula de la SBE clase B de la patata. Deseablemente, por ejemplo, el método comprenderá también la introducción de una porción de una secuencia que codifica a una SBE clase B, operativamente enlazada en la orientación antisentido a un promotor adecuado activo en la planta. Convenientemente, la secuencia adicional comprenderá una porción efectiva de la secuencia descrita por Blennow & Johansson (1991 Phytochem. 30, 437-444) o aquella divulgada en WO 92/11375. Más preferiblemente, la secuencia adicional comprenderá al menos una porción de la secuencia divulgada en la Solicitud Internacional de Patente No. WO 95/26407. Los presentes inventores han encontrado ahora que el uso de secuencias antisentido tanto contra la SBE clase A como clase B en combinación, resulta en la producción de un almidón que tiene propiedades muy grandemente alteradas (ver más abajo). Aquellos capacitados en el arte apreciarán la posibilidad de que, si la planta ya contiene una secuencia sentido o antisentido que inhibe eficientemente la actividad de la SBE clase B, la introducción de una secuencia sentido o antisentido para inhibir la actividad de la SBE clase A (produciendo por lo tanto una planta con inhibición tanto de actividad clase A como clase B) puede alterar grandemente las propiedades del almidón en la planta, sin necesidad de la. introducción de una o más secuencias adicionales. Por lo tanto, se introduce convenientemente la secuencia la invención en plantas que ya tienen niveles bajos de actividad de la SBE clase A y/o clase B, de tal manera que la inhibición resultante de la introducción de la secuencia de la invención probablemente tenga un efecto más pronunciado.

La secuencia de la invención, y una o más secuencias adicionales si se desea, se puede introducir en la planta por cualquiera entre una variedad de técnicas conocidas (por ejemplo, una transformación mediada por Agrobacterium, o por medio de métodos "biolísticos"). Las secuencias son probablemente más efectivas en la inhibición de la actividad de la SBE en plantas de patata, pero teóricamente podrían ser introducidas en cualquier planta. Los ejemplos deseables incluyen guisantes, tomate, maíz, trigo, arroz, cebada, patata dulce y plantas de casabe. Preferiblemente, la planta contendrá un gen natural que codifica a una molécula de la SBE que exhibe una homología razonable con la secuencia introducida de ácido nucleico de la invención.

En otro aspecto, la invención provee una célula de una planta, o una planta o la progenie de la misma, que contienen una construcción que tiene la secuencia del primer aspecto de la invención. La progenie de la planta alterada se puede obtener, por ejemplo, por medio de propagación vegetativa, o por cruzamiento de la planta alterada y guardando la semilla así obtenida. La invención también provee partes de la planta alterada, tal como los órganos de almacenamiento. Convenientemente, por ejemplo, la invención provee tubérculos que contienen almidón alterado, siendo obtenidos dichos tubérculos a partir de una planta alterada o de la progenie de la misma. Los tubérculos de la patata obtenidos a partir de plantas alteradas (o la progenie de las mismas) serán materiales particularmente útiles en ciertas aplicaciones industriales y para la preparación y/o el procesamiento de productos alimenticios y pueden ser utilizados, por ejemplo, para preparar gofres y patatas fritas bajos en grasa (siendo generalmente utilizada la amilosa como un recubrimiento para prevenir la incorporación de grasa), y para preparar puré de patatas (especialmente puré de patata "instantáneo") con características particulares.

La invención también provee almidón como el definido en cualquiera de las reivindicaciones 1-16 en las reivindicaciones anexas. El uso de secuencias de nucleótidos de acuerdo con la invención les ha permitido a los inventores presentes producir almidones de patata que tienen una amplia variedad de propiedades nuevas.

En particular la invención provee lo siguiente: una planta (especialmente una planta de patata) que contienen almidón el cual, cuando se extrae de la planta por medio de molienda en húmedo a temperatura ambiente, tiene una temperatura elevada del desarrollo Inicial de viscosidad (convenientemente elevada en 10-25°C) de acuerdo a lo juzgado por la viscoamilografía llevada a cabo de acuerdo al protocolo definido en la reivindicación 7 de las reivindicaciones anexas comparado con el almidón extraído de una planta inalterada, o bien genéticamente idéntica; una planta (especialmente una planta de patata) que contienen almidón el cual, cuando es extraído de la planta por medio de molienda en húmedo a temperatura ambiente, tiene una menor viscosidad de pico (convenientemente menor en 240-700 SNUs) de acuerdo a lo juzgado por la viscoamilografía llevada a cabo de acuerdo al protocolo definido en la reivindicación 7 de las reivindicaciones anexas comparado con el almidón extraído de una planta inalterada, o bien genéticamente idéntica; una planta (especialmente una planta de patata) que contienen almidón el cual, cuando es extraído de la planta por medio de molienda en húmedo a temperatura ambiente, tiene una mayor viscosidad de adhesión (convenientemente incrementada en 37-260 SNUs) de acuerdo a lo juzgado por la viscoamilografía llevada a cabo de acuerdo al protocolo definido en la reivindicación 7 de las reivindicaciones anexas comparado con el almidón extraído de una planta inalterada, o bien genéticamente idéntica; una planta (especialmente una planta de patata) que contienen almidón el cual, cuando es extraído de la planta por medio de molienda en húmedo a temperatura ambiente, tiene una mayor viscosidad de retroceso (convenientemente incrementada en 224-313 SNUs) de acuerdo a lo juzgado por la viscoamilografía llevada a cabo de acuerdo al protocolo definido en la reivindicación 7 de las reivindicaciones anexas comparado con el almidón extraído de una planta inalterada, o bien genéticamente idéntica; una planta (especialmente una planta de patata) que contienen almidón el cual, cuando es extraído de la planta por medio de molienda en húmedo a temperatura ambiente, tiene una menor viscosidad de retroceso de acuerdo a lo juzgado por la viscoamilografía llevada a cabo de acuerdo al protocolo definido en la reivindicación 7 de las reivindicaciones anexas comparado con el almidón extraído de una planta inalterada, o bien genéticamente idéntica; y una planta (especialmente una planta de patata) que contienen almidón el cual, cuando es extraído de la planta por medio de molienda en húmedo a temperatura ambiente, tiene un contenido elevado de amilosa de acuerdo a lo juzgado por el ensayo iodométrico de acuerdo con el método de Morrison & Laignelet 1983, (citado anteriormente) comparado con el almidón extraído de una planta inalterada, o bien genéticamente idéntica. La invención también provee almidón que tiene propiedades tales como las mencionadas anteriormente.

En particular la invención provee un almidón el cual, una vez extraído de una planta de patata por medio de molienda en húmedo a temperatura ambiente, tiene una o más de las siguientes propiedades, de acuerdo a lo juzgado por el análisis con el viscoamilógrafo llevado a cabo de acuerdo con las condiciones definidas más abajo: temperatura de inicio de desarrollo eh la viscosidad en el rango entre 70-95°C (preferiblemente 75-95°C); viscosidad pico en el rango entre 500-12 unidades numéricas de agitación; viscosidad de adhesión en el rango entre 214-413 unidades numéricas de agitación; viscosidad de retroceso en el rango entre 450-618 ó 14-192 unidades numéricas de agitación; o no muestra un incremento significativo en la viscosidad durante la viscoamilografía. Las viscosidades pico, de adhesión y de retroceso se definen más abajo. La temperatura de inicio de desarrollo de la viscosidad es la temperatura a la cual existe un repentino incremento marcado en la viscosidad a partir de niveles de línea base durante la viscoamilografía, y es un término conocido por aquellos capacitados en el arte.

En otras modalidades particulares, la inversión provee almidón que ya extraído de una planta de patata por medio de molienda en húmedo a temperatura ambiente, tiene una viscosidad pico en el rango entre 200-500 SNUs y una viscosidad de retroceso en el rango entre dos entre 275-618 SNUs de acuerdo a lo juzgado por la viscoamilografía según el protocolo definido más abajo; y almidón que una vez extraído de una planta de patata por medio de molienda en húmedo a temperatura ambiente tiene una viscosidad que no disminuye entre el inicio de la fase de calentamiento (etapa 2) y el inicio de la fase final de sostenimiento (etapa 5) y tiene una viscosidad de retroceso de 303 SNUs o menor de acuerdo a lo juzgado por la viscoamilografía según el protocolo definido más abajo.

Para los propósitos de la presente invención, se entiende que las condiciones de la viscoamilografía corresponden al análisis de una suspensión acuosa al 10% (p/p) de almidón a presión atmosférica, utilizando un Newport Scientific Rapid Visco Analyzer (etapa 2), manteniendo a 95°C durante 15 minutos (etapa 3), enfriando desde 95 hasta 50°C a una velocidad de 1,5°C por minuto (etapa 4), y luego mantener a 50°C durante 15 minutos (etapa 5). La velocidad pico se puede defmir para los propósitos presentes como la viscosidad máxima lograda durante la fase de calentamiento (etapa 2) o la fase de sostenimiento (etapa 3) de la viscoamilografía. La viscosidad de adhesión se puede definir como la viscosidad lograda por las suspensiones de almidón al final de la fase de sostenimiento (etapa 3) de la viscoamilografía. La viscosidad de retroceso se puede definir como la viscosidad de la suspensión de almidón al final de la etapa 5 de la viscoamilografía.

Aún en otro aspecto la invención provee almidón de una planta de patata que tiene un contenido aparente de amilosa (% p/p) de al menos 35%, de acuerdo a lo citado por el análisis iodométrico según el método descrito por Morrison & Laignelet (1983, J. Cereal Science 1, 9-20). Preferiblemente, el almidón tendrá un contenido de amilosa al menos del 40%, m 3s preferiblemente al menos del 50%, y lo más preferiblemente al menos del 66%. El almidón obtenido directamente a partir de una planta de patata y que tiene tales propiedades no ha sido producido hasta ahora. En realidad, como resultado de la presente invención, es posible generar ahora un almidón de patata in vivo que tiene algunas propiedades análogas a las de los almidones de amilosa muy alta (por ejemplo Hylon 7) que se puede obtener del maíz.

Los almidones con altos contenidos de amilosa (al menos 35%) encuentran aplicación comercial, entre otras razones, ya que el componente de amilosa del almidón se reasocia más fuerte y rápidamente que el componente de amilopectina durante los procesos de retrogradación. Esto puede resultar, por ejemplo, en pastas con viscosidades altas, en geles de mayor cohesión, o en películas de mayor resistencia para almidones con alto contenido de amilosa (al menos 35%) en comparación con contenidos normales de amilosa (menores al 35%). Alternativamente, se pueden obtener los almidones con contenidos muy altos de amilosa, de tal manera que la estructura del gránulo se preserve sustancialmente durante el calentamiento, resultando en suspensiones de almidón que no demuestran un incremento sustancial en la viscosidad durante la cocción (esto es, no existe un incremento significativo en la viscosidad durante las condiciones de la viscoamilografía definidas anteriormente). Tales almidones típicamente exhiben un incremento de la viscosidad menor al 10% (preferiblemente menor al 5%) durante la viscoamilografía bajo las condiciones definidas anteriormente.

En el comercio, estas valiosas propiedades se obtienen actualmente a partir de almidones de alto contenido de amilosa derivados de planta de maíz. Sería de valor comercial tener una fuente alternativa de almidones con alto contenido de amilosa a partir de la patata ya quia otras características tales como el tamaño de gránulo, propiedades organolépticas y cualidades texturales pueden diferenciar los desempeños de almidones con alto contenido de amilosa de las plantas de maíz y de patata.

Por lo tanto, este almidón con alto contenido de amilosa obtenido a partir del método de la presente invención puede encontrar aplicación en muchos campos tecnológicos diferentes, que pueden ser categorizados en forma amplia en dos grupos: productos alimenticios y procesamiento; y aplicaciones "industriales". Bajo el encabezado de productos alimenticios, los nuevos almidones de la presente invención pueden encontrar aplicación como, por ejemplo, películas, barreras, recubrimientos o agentes de gelificación. En general, los almidones con alto contenido de amilosa absorben menos grasa durante el fritado que los almidones con bajo contenido de amilosa, de tal manera que los almidones con alto contenido de amilosa de la invención pueden ser utilizados convenientemente en la preparación de productos fritos bajos en grasa (por ejemplo, patatas fritas y similares). Los nuevos almidones se pueden emplear también convenientemente en la preparación de golosinas y en almidones granulados y "resistentes" a la retrogradación. Un almidón "resistentes" es un almidón que es resistente a la digestión por \alpha-amilasa. Por lo tanto, un almidón resistente no es digerido por las \alpha-amilasas presentes en el intestino delgado humano, sino que pasa al colon donde exhibe propiedades similares a las de la fibra dietética soluble e insoluble. El almidón resistente es por lo tanto muy benéfico en los productos alimenticios debido a su bajo contenido calórico y a su alto contenido de fibra dietética. El almidón resistente se forma por medio de la retrogradación (semejante a recristalización) de la amilosa de los geles de almidón. Tale retrogradación se inhibe por medio de la amilopectina. Por lo tanto, los almidones con alto contenido de amilosa de la presente invención son excelentes materiales de partida para la preparación de almidón resistente. Los métodos adecuados para la preparación de almidón resistente son conocidos por aquellos capacitados en el arte e incluyen, por ejemplo, aquellos descritos en las patentes estadounidenses Nos. 5.05 1.271 y 5.281.276. Convenientemente, los almidones resistentes proveídos por la presente invención contienen al menos un 5% de fibra dietética total, de acuerdo a lo juzgado por el método de Prosky y colaboradores, (1985 J. Assoc. Off. Anal. Chem. 68, 677), mencionado en la patente estadounidense No. 5.281.276.

Bajo el título de aplicaciones "industriales", se pueden emplear provechosamente los nuevos almidones de la invención, por ejemplo, en adhesivos para corrugados, en productos biodegradables tales como los empaques tipo loose fill y formas de espuma, y en la producción de fibras de vidrio y textiles.

Aquellos capacitados en el arte apreciarán que los nuevos almidones de la invención, si se desea, pueden ser sometidos in vitro a una modificación enzimática, física y/o química convencional, tal como el entrelazamiento, la introducción de grupos hidrófobos (por ejemplo ácido octenil succínico, ácido dodecil succínico), o derivatización (por ejemplo por medio de esterificación o de eterificación).

La invención provee almidones con alto contenido de amilosa (35% o más) que pueden generar viscosidades de pasta superiores a aquellas obtenidas a partir de almidones con alto contenido de amilosa de plantas de maíz después de procesamiento a temperaturas por debajo de 100°C. Esto provee la ventaja de tratamientos de gelatinización y adhesión del almidón en forma más económica por medio del uso de temperaturas de procesamiento más bajas que las actualmente requeridas para almidones con alto contenido de amilosa a partir de plantas de maíz.

Se describirá ahora adicionalmente la invención por medio de un ejemplo ilustrativo y con referencia a los dibujos, de los cuales:

La Figura 1 muestra una viscoamilografía típica para una suspensión al 10% p/p de almidón de patata;

La Figura 2 muestra viscoamilografías para suspensiones al 10% de almidón de diferentes variedades de maíz;

La Figura 3 es una representación esquemática de una estrategia de clonación utilizada por los presentes inventores;

La Figura 4a muestra el alineamiento de aminoácidos de la porción C-terminal de isoformas de la enzima para ramificación del almidón a partir de diferentes fuentes: los residuos de aminoácido que hacen juego con la secuencia de consenso están sombreados;

La Figura 4b muestra el alineamiento de las secuencias de ADN de diferentes isoformas de la enzima para ramificación del almidón que codifican a una secuencia conservada de aminoácidos;

La Figura 5 muestra la secuencia de ADN (Seq ID No. 14) y la secuencia predicha de aminoácidos (Seq ID No. 15) de un clon de ADNc de la SBE clase A de patata de longitud completa obtenido por PCR;

La Figura 6 muestra una comparación de la parte más altamente conservada de las secuencias de aminoácidos de las moléculas de SBE clase A (la secuencia más alta) y clase B (la secuencia inferior) de patata;

La Figura 7 muestra una comparación de la secuencia de aminoácidos de las moléculas de SBE clase A de patata (la secuencia más alta) y clase A de guisante (la secuencia inferior) de longitud completa;

La Figura 8 muestra un alineamiento de ADN de diferentes clones de la SBE clase A de patata de longitud completa obtenido por los inventores;

La Figura 9 muestra la secuencia de ADN de un clon de la SBE clase A de patata determinada por medio de secuenciación directa de productos PCR, junto con la secuencia predicha de aminoácidos;

La Figura 10 es una alineación múltiple de ADN de diferentes clones A de la SBE de patata de longitud completa obtenida por los inventores;

La Figura 11 es una ilustración esquemática del plásmido pSJ64;

La Figura 12 muestra la secuencia de ADN y la secuencia predicha de aminc ácidos del clon de la SBE clase A de patata de longitud completa como está presente en el plásmido pSJ90; y

La Figura 13 muestra las viscoamilografías para suspensiones al 10% p/p de almidón de diferentes plantas transgénicas de patata elaboradas por medio del aspecto relevante el método la invención.

Ejemplos Ejemplo 1 Clonación de la SBE clase A de Patata

La estrategia para la donación de la segunda forma de la enzima para ramificación del almidón a partir de la patata es mostrada en la Figura 3. Las flechas pequeñas representan a los iniciadores utilizados por los inventores en los protocolos para la PCR y RACE. El tamaño aproximado de los fragmentos aislados se indica por medio de los numerales al lado derecho de la Figura. A manera de explicación, una comparación de las secuencias de aminoácidos de diferentes enzimas clonadas para ramificación del almidón (SBE) de la planta de maíz (clase A), de guisante (clase A), de maíz (clase B), de arroz (clase B) y de patata (clase B), así como la enzima para ramificación de glicógeno humano, permitió a los inventores identificar una región en el tercio del carboxilo terminal de la proteína que está casi completamente conservada (GYLNFMGNEFGHPEWIDFPR) (Figura 4a). Una alineación múltiple de las secuencias de ADN (humano, clase A de guisante, clase B de patata, clase B de maíz, clase A de maíz y clase B de arroz, respectivamente) correspondiente a esta región es mostrada en la Figura 4b y fue utilizada para diseñar un oligo que potencialmente hibridaría a todas las enzimas conocidas para ramificación del almidón de la planta: AATTT(C/T)ATGGGIAA(C/T)GA(A/G)TT(C/T)GG (Seq ID No. 20).

PCR de Biblioteca

El aislamiento inicial de un clon parcial de ADNc de la SBE clase A de patata se hizo a partir de una biblioteca amplificada de ADNc de tubérculo de patata en el vector \lambdaZap (Stratagene). Se utilizó como molde medio \muL de una biblioteca de ADNc de patata (título 2,3 x 10^{9} pfu/mL) en una reacción de 50 \muL que contenía 100 pmol de un iniciador POTSBE degenerado 16 veces y 25 pmol de un iniciador T7 (presente en el vector \lambdaZap 3' a las secuencias de ADNc - ver Figura 3), dNTPs 100 \muM. 2,5 U Taq polimerasa y el amortiguador suministrado con la Taq polimerasa (Stratagene). Todos los componentes excepto la enzima fueron añadidos a un tubo de microcentrífuga de 0,5 mL, cubierto con aceite mineral e incubado a 94°C durante 7 minutos y luego mantenido a 55ºC, al mismo tiempo que se añadía la Taq polimerasa y se mezclaba por pipeteo. Se llevó a cabo entonces la PCR incubando durante 1 min a 94°C, 1 min a 58°C y 3 min a 72°C, durante 35 ciclos. Se extrajeron los productos de la PCR con fenol/cloroformo, se precipitó con etanol y se resuspendió en TE pH 8,0 antes de la clonación dentro director de clonación T/A pT7BlueR (Invitrogen).

Se amplificaron varios fragmentos entre 600 y 1300 pb. Estos fueron aislados a partir de un gel de agarosa y clonados dentro del vector de clonación T/A pT7BlueR. El mapeo de restricción de 24 clones seleccionados en forma aleatoria mostró que ellos pertenecían a varios grupos diferentes (con base en el tamaño y la presencia/ausencia de sitios de restricción). Inicialmente se escogieron cuatro clones para secuenciación. De estos cuatro, se encontró que dos correspondían a la secuencia conocida de la SBE clase B de patata, sin embargo los otros dos, aunque homólogos, diferían significativamente y eran más similares a la secuencia de la SBE clase A de guisante, sugiriendo que ellos pertenecían a la familia clase A de enzimas de ramificación (Burton y colaboradores, 1995, The Plant Journal, citado anteriormente). Los dos últimos clones (\sim 800 pb) túeron secuenciados completamente. Ambos contenían en el extremo 5' la secuencia correspondiente al oligonucleótido degenerado utilizado en la PCR y tenía un marco de lectura abierta predicho de 192 aminoácidos. La secuencia deducida de aminoácidos era altamente homologa con aquella de la SBE clase A de guisante.

El fragmento de ADNc derivado de la PCR de \sim 800 pb (correspondiente a los nucleótidos 2281 a 3076 de la secuencia psbe2con.seq mostrada en la Figura 8) fue utilizado como sonda para seleccionar la biblioteca de ADNc de tubérculo de patata. De ciento ochenta mil placas, se obtuvieron siete positivas en la selección primaria. El análisis por PCR mostró que cinco de estos clones eran más pequeños que el clon original de ADNc de 800 pb, de modo que esto no fueron analizados más. Los otros dos clones (designados como 3.2.1 y 3.1.1) eran aproximadamente de 1200 y 1500 pb en longitud, respectivamente. Estos fueron secuenciados a partir de sus extremos 5' y la secuencia combinada de consenso alineada con la secuencia de los clones generados por la PCR. El clon de ADNc 3.2.1 fue cortado del vector fago y se preparó un ADN de plásmido y se secuenció completamente el inserto. Varios de los intentos para obtener clones mayores a partir de la biblioteca fueron infructuosos, por lo tanto se obtuvieron clones que contenían el extremo 5' del gen de longitud completa utilizando RACE (amplificación rápida de extremos de ADNc).

Amplificación Rápida de extremos de ADNc (RACE) y condiciones PCR

RACE fue realizado esencialmente de acuerdo con Frohman (1992 Amplifications 11-15). Se calentaron dos \mug de ARN total de tubérculos de patata madura a 65°C durante 5 min y se los enfrió rápidamente sobre hielo. Se trascribió luego en forma inversa al ARN en un volumen de reacción de 20 \muL durante 1 hora a 37°C utilizando transcriptasa inversa M-MLV de BRL y amortiguador con DTT 1 mM. dNTPs 1 mM, 1 U/\muL de RNAsin (Promega) y 500 pmol de hexámeros aleatorios (Pharmacia) como iniciador. Se removió el exceso de iniciadores sobre una columna Centricon 100 y se recuperó el ADNc y se lo precipitó con isopropanol, al ADNc se le colocó una cola de poli A en un volumen de 20 \mul utilizando 10 unidades de transferasa terminal (BRL), 200 \muM de dATP durante 10 min a 37°C, seguido por 5 min a 65°C. Se dividió luego la reacción hasta 0,5 ml con TE pH 8 y se la almacenó a 4°C como la reserva de ADNc, se aislaron los clones de ADNc por medio de amplificación por PCR utilizando los iniciadores R_{0}R_{1}dT_{17}, R_{0} y POTSBE24. La PCR se realizó en 50 \muL utilizando una técnica de arranque en caliente: se calentaron 10 \muL de la reserva de ADNc a 94°C en agua durante 5 min con 25 pmol de POTSBE24, 25 pmol de R_{0} y 2,5 pmol de R_{0}R_{1}dT_{17} y se enfrió hasta 75°C. Se añadieron cinco \muL de amortiguador 10 x PCR (Stratagene), dNTPs 200 \muM y 1,25 unidades de Taq polimerasa, se calentó la mezcla a 45°C durante 2 min y a 72°C durante 40 min seguido por 35 ciclos de 94°C durante 45 segundos, 50°C durante 25 segundos, 72°C durante 1,5 min y una incubación final a 72°C durante 10 min. Se separaron los productos PCR por medio de electroforesis sobre geles de agarosa al 1% con bajo punto de fusión y la mancha cubriendo los fragmentos en el rango de 600-800 pb fue cortada y utilizada en una segunda amplificación por PCR con 25 pmol de R_{1} e iniciadores POTSBE25 en un volumen de reacción de 50 \muL (28 ciclos de 94°C durante 1 min, 50°C durante 1 min, 72°C durante 2 min). Se purificaron los productos por medio de extracción con cloroformo y se los clonó dentro del pT7 Blue. Se utilizó PCR para seleccionar las colonias y se secuenciaron los clones más largos.

La primera vuelta de RACE únicamente extendió la longitud de la secuencia de la SBE aproximadamente en 100 bases, por lo cual se construyó una nueva biblioteca de ADNc con cola A utilizando el oligo POTSBE24 específico de la SBE clase A (10 pmol) en un intento por recobrar productos RACE más largos. La primera y segunda vueltas de las reacciones PCR fueron realizadas utilizando nuevos iniciadores de la SBE clase A (POTSBE 28 y 29 respectivamente) derivados de los nuevos datos de la secuencia. Las condiciones fueron las mismas de antes excepto porque la etapa de alargamiento en la primera PCR fue de 3 min y la segunda PCR consistió de 28 ciclos a 94°C durante 45 segundos, 55°C durante 25 segundos y 72°C durante 1 min 45 segundos.

Se aislaron los clones en el rango de tamaño entre 400 pb y 1.4 kb y se los secuenció. La secuencia combinada de los productos RACE más largos y los clones de ADNc predijeron un gen de longitud completa de aproximadamente 3150 nucleótidos, excluida la cola poli(A) (psbe2con.seq en la Fig. 8).

Ya que la secuencia de la mitad 5' del gen fue compilada a partir de la secuencia de varios productos RACE generados utilizando Taq polimerasa, fue posible que la secuencia compilada no representara a aquella de una especie única de ARNm y/o tenía cambios en la secuencia de nucleótidos. Las 1600 bases 5' del gen fueron por lo tanto aisladas nuevamente por medio de la PCR utilizando Ultma, una ADN polimerasa termoestable que, debido a que posee actividad de exonucleasa 3'-5', tiene una menor rata de error comparada con la Taq polimerasa. Varios productos PCR fueron donados y se mapeo la restricción y se encontró que diferían en el número de sitios Hind III, Ssp I, y EcoR I. Estas diferencias no representan productos de la PCR ya que ellas fueron observadas en clones que fueron obtenidos a partir de reacciones PCR independientes (datos no mostrados) e indican que existen varias formas del gen que codifica para la SBE clase A transcritas en tubérculos de patata.

Con el propósito de garantizar que la secuencia del clon de ADNc de longitud completa se derivara de una especie única de ARNm fue necesario por lo tanto someter a PCR al gen completo en una pieza, se preparó el ADNc de acuerdo con el protocolo para RACE excepto porque se utilizó el adaptador oligo R_{0}R_{1}dT_{17} (5 pmol) como iniciador y después de la síntesis se diluyó la reacción hasta 200 \muL con TE pH 8 y se la almacenó a 4°C. Se utilizaron dos \muL del ADNc en una reacción PCR de 50 \muL utilizando 25 pmoles de los iniciadores específicos de la SBE clase A, P13ER1 y PBERT (ver más abajo), y treinta ciclos de 94° durante 1 min, 60°C durante 1 min y 72°C durante 3 min. Si se utilizó Taq polimerasa, se donaron los productos PCR dentro de pT7Blue mientras que si se utilizó Ultma polimerasa, se purificaron los productos PCR por medio de extracción con cloroformo, precipitación con etanol y sometidos a la acción de la quinasa en un volumen de 20 \muL (y luego se los clonó dentro de pBSSK IIP que había sido cortado con EcoRV y desfosforilado). Se aislaron al menos cuatro clases de ADNc, que nuevamente diferían en la presencia o ausencia de sitios Hind III, Ssp I y EcoRI. Tres de estos clones fueron secuenciados completamente, aunque un clon no pudo ser aislado en cantidad suficiente para la secuenciación.

La secuencia de uno de los clones (número 19) se muestra la Figura 5. El primer codón de metionina (iniciación) inicia un marco corto de lectura abierta (ORF) de 7 aminoácidos que está por fuera del marco con el siguiente ORF predicho de 882 aminoácidos que tiene una masa molecular (Mr) aproximadamente de 100 Kd. Los nucleótidos 6-2996 corresponden a la secuencia de la SBE - el resto de la secuencia mostrada se deriva del vector. La Figura 6 muestra una comparación de la parte más altamente conservada de la secuencia de aminoácidos de la SBE clase A de patata (residuos 180-871, fila superior) y de la SBE clase B de patata (fila inferior, residuos 98-792); la fila del medio indica el grado de similitud, siendo los residuos idénticos simbolizados con letra común, los cambios conservadores por dos puntos y los cambios neutros por un único punto. Los guiones indican vacíos introducidos para optimizar la alineación. La proteína de la SBE clase A tiene 44% de identidad sobre la longitud completa con la SBE clase B de patata, y 56% de identidad con esta en el dominio central conservado (Figura 6), de acuerdo a lo juzgado por el programa "Mesalign" (DNASTAR). Sin embargo, la Figura 7 muestra una comparación entre la SBE clase A de patata (fila superior, residuos 1-873) y la SBE clase A de guisante (fila inferior, residuos 1-861), a partir de la cual se puede observar que el gen clonado de la patata es más homólogo a la enzima clase A de guisante, donde la identidad está casi por encima del 70% de la longitud completa, y ésta se incrementa hasta el 83% sobre la región central conservada (comenzando en IPPP aproximadamente en la posición 170). Es claro a partir de éste análisis que este gen clonado que codifica para la SBE de patata pertenece a la familia clase A de los genes que codifican para la SBE.

Un cultivo de E. coli, que contiene al plásmido pSJ78 (que dirige la expresión de un gen de longitud completa que codifica para la SBE clase A de patata), ha sido depositado (el 3 de enero de 1996) bajo los términos del Tratado de Budapest en The National Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited (23 St Machar Drive, Aberdeen, AB2 1RY, Reino Unido), bajo el número de acceso NCIMB 40781. En plásmido pSJ78 es equivalente al clon 19 descrito anteriormente. Representa un ADNc de longitud completa de poli A de la SBE de extremo romo ligado dentro del vector pBSSKIIP.

Polimorfismo de los genes que codifican para la SBE clase A

El análisis de la secuencia de otros dos genes que codifican para la SBE clase A de longitud completa mostró que ellos contenían mutaciones del marco de lectura y que por 1D tanto son incapaces de codificar proteínas de longitud completa y realmente son incapaces de complementar la deficiencia de la enzima de ramificación en el mutante KV832 (que se describe más abajo). En la Figura 8 se muestra una alineación de las secuencias de ADN de longitud completa: "10con.seq" (Seq ID No. 12), "19con.seq" (Seq ID No. 14) y "11con.seq" (Seq ID No. 13) representan la secuencia de los clones 10, 19 y 11 de longitud completa obtenidos por medio de PCR utilizando los iniciadores PBER1 y PBERT (ver más abajo), mientras que "psbe2con.seq" (Seq ID No. 18) representa la secuencia de consenso de los clones RACE y del clon 3.2.1 de ADNc. Aquellos nucleótidos que difieren de la secuencia total de consenso (no mostrada) están sombreados. Los guiones indican vacíos introducidos para optimizar la alineación. Aparte de las mutaciones del marco de lectura estos clones son altamente homólogos. Debe observarse que la secuencia 5' de psbe2con es más larga debido a que este es el producto RACE más largo y también contiene varios cambios comparado con los otros clones. El codón de metionina secuencia arriba está aún presente en este clon pero el ORF secuencia arriba se acorta a sólo 3 aminoácidos y además existe una supresión en la base 10 en la secuencia líder 5' no traducida.

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La otra área significativa de variación está en la región carboxilo terminal de la región de codificación de la proteína. Un examen más cercano de esta área revela una estructura de repetición trinucleótida GAA que varía en longitud entre los cuatro clones. Estas son características típicas de una región microsatélite de repetición. El clon más divergente es el #11 que tiene únicamente un triplete GAA mientras que el clon 19 tiene once repeticiones perfectas y los otros dos clones tienen cinco y siete repeticiones GAA. Todas estas supresiones mantienen al ORF pero cambia el número de residuos de ácido glutámico en el carboxilo terminal de la proteína.

La mayoría de las otras diferencias entre los clones son cambios sencillos de base. Es muy posible que algunos de estos sean errores de la PCR. Para dirimir esta cuestión se llevó a cabo una secuenciación directa de fragmentos de la PCR amplificados a partir de la primera cadena de ADNc. La Figura 9 demuestra la secuencia de ADN, y la secuencia predicha de aminoácidos, obtenida por dicha secuenciación directa. Ciertos sitios de restricción están también marcados. Los nucleótidos que podrían ser asignados en forma no ambigua se indican utilizando notación IUPAC estándar y, donde esta incertidumbre afecta la secuencia predicha de aminoácidos, se utiliza un signo de interrogación. La secuencia en el extremo 5' y en el extremo 3' del gen no podía ser determinada debido a la heterogeneidad observada en los diferentes genes clonados en estas regiones (ver párrafo anterior). Sin embargo esto puede ser tomado como evidencia directa de que estas diferencias son reales y no son productos de la PCR o de clonación.

No existe ninguna evidencia el absoluto para las mutaciones del marco de lectura en la secuencia derivada de la PCR y parecería que estas mutaciones son producto de los procesos de clonación, que resultan de la presión de selección negativa en E. coli. Esto está soportado por el hecho de que probó ser extremadamente difícil clonar los productos intactos de la PCR de longitud completa ya que se observaron muchas supresiones grandes y los clones de longitud completa obtenidos fueron todos clonados en una orientación (lejos del promotor LacZ), sugiriendo quizás que la expresión del gen es tóxica para las células. Las dificultades de este estilo pueden haber sido las responsables, al menos en parte, para las fallas previas de otros investigadores para obtener la presente invención.

Se observa una comparación de todas las secuencias de longitud completa en la Figura 10. Además de los clones 10, 11 y 19 se observan las secuencias de un producto BGl II - Xho I donado directamente dentro del vector de expresión QE32 ("86CON.SEQ", Seq ID No.16) y la secuencia de consenso de los productos PCR secuenciados directamente ("persbe2con.seq". Seq ID No. 17). Aquellos nucleótidos que difieren de la secuencia de consenso (no mostrada) están sombreados. Los guiones indican vacíos introducidos para optimizar la alineación. Existen 11 diferencias de nucleótidos predichas que están presentes en la población de ARNm, lo cual se indica por medio de asteriscos por encima y por debajo de la secuencia. Las otras diferencias son probablemente productos PCR o posibles errores de secuenciación.

Complementación de un mutante de E. coli deficiente en enzima de ramificación

Para determinar si el gen que codifican para la SBE aislada codifica a una proteína activa, esto es, una que tenga actividad como enzima de ramificación, se llevó a tubo una prueba de complementación en la cepa KV832 de E. coli. Esta cepa es incapaz de elaborar glicógeno bacterial ya que el gen que codifica para la enzima de ramificación del glicógeno ha sido suprimida (Keil y colaboradores, 1987 Mol. Gen. Genet. 207, 294-301). Cuando se cultivan células de tipo natural en presencia de glucosa, ellas sintetizan glicógeno (un polímero de glucosa altamente ramificado) que se colorea de color marrón con yodo, mientras que las células KV832 elaboran únicamente un polímero de glucosa de cadena lineal que se colorea de color verde azulado con yodo. Para determinar si el gen clonado que codifica para la SBE podría restablecer la habilidad de las células KV832 para elaborar un polímero ramificado, se construyó y utilizó el clon pSJ90 (Seq ID No. 19) de la siguiente forma. La construcción es un fragmento sustancialmente de longitud completa, derivado de la PCR (elaborada utilizando a los iniciadores PBE 2B y PBE 2X, que se detalla más abajo), que fue cortado con Bgl II y Xho I y clonado dentro de los sitios BamH I/Sal I del vector de expresión pQE32. (Qiagen) etiquetado con His. Este clon, pSJ86, fue secuenciado y se encontró que tiene una mutación en el marco de lectura de dos bases en la mitad 5' del gen. Este marco de lectura fue removido por digestión con Nsi I y con SnaB I y reemplazado con el fragmento correspondiente de un clon PCR generado con Taq para producir el plásmido pSJ90 (secuencia mostrada en la Figura 12; los primeros 10 aminoácidos se derivan del vector de expresión). El polipéptido codificado por pSJ90 sería predicho por corresponder a los aminoácidos 46-882 de la secuencia completa de codificación de la SBE. La construcción pSJ90 fue transformada dentro del las células KV832 deficientes en la enzima de ramificación y se cultivaron los transformantes sobre medio PYG sólido (KH_{2}PO_{4} al 0,85%, K_{2}HPO_{4} al 1,1%, extracto de levadura al 0,6%) que contenía glucosa al 1,0%. Para analizar la complementación, se raspó un bucle de células y se lo resuspendió en 150 \mul de agua, a la cual se le añadieron 15 \mul de solución de Lugol (2 g de KI y 1 g de I_{2} por 300 ml de agua). Se encontró que las células KV832 transformadas con el fragmento de la SBE de patata se colorearon ahora de un color amarillo-marrón con yodo mientras que las células de control que contenían únicamente al vector pQE32 continuaron coloreándose de color verde azulado.

Expresión de la SBE clase A de patata en E. coli

Se recogieron colonias sencillas de KV832, que contenían uno de les plásmidos pQE32, pAGCR1 o pSJ90, en 50 ml de medio 2xYT que contenía carbencilina, kanamicina y estreptomicina e según corresponda (100, 50 y 25 mg/L, respectivamente) en un frasco de 250 ml y se las cultivó durante 5 horas, con agitación, a 37°C. Se añadió luego IPTG hasta una concentración final de 1 mM para inducir expresión y se incubaron adicionalmente los frascos durante la noche a 25°C. Se cosecharon las células por medio de centrifugación y se las resuspendió en amortiguador de fosfato de sodio 50 mM (pH 8,0), que contenía NaCl 300 mM, 1 mg/ml de lisozima y PMSF 1 mM y se dejó sobre hielo durante 1 hora. Se sonicaron luego los lisados celulares (3 pulsos de 10 segundos con una potencia de 40% utilizando una microsonda) y se aclaró por medio de centrifugación a 12.000 g durante 10 minutos a 4°C. Se concentraron los lisados aclarados aproximadamente 10 veces en una unidad de filtración Centricon^{TM} 30. Se analizaron duplicados de las muestras de 10 \mul del extracto resultante por la actividad de la SBE por el método de estimulación de la fcsforilación, como se describe en la Solicitud Internacional de Patente No. PCT/GB95/00634. En resumen, la mezcla de reacción del ensayo estándar (0,2 ml) fue de amortiguador de ácido 2-(N-morfolino) etanosulfónico (MES) 200 mM pH 6,5, que contenía 100nCi de glucosa-1-fosfato con ^{14}C 50 mM, 0,05 mg de fosforilasa A de conejo, y lisado de E. coli. Se incubó la mezcla de reacción durante 60 minutos a 30°C y se terminó la reacción y se precipitó el polímero glucano por medio de ,a adición de 1 ml de metanol al 75% (v/v), hidróxido de potasio al 1% (p/v) y luego 0,1 ml de glicógeno (10 mg/ml). Los resultados se presentan a continuación:

1

La actividad de la SBE clase A de patata está 7-8 veces por encima desniveles base. Se concluyó por lo tanto que el gen que codifica para la SBE clase A de patata fue capaz de complementar la mutación de la BE en el ensayo de estimulación de la fosforilación y que el gen clonado en realidad codifica para una proteína con actividad de enzima de ramificación.

Oligonucleótidos

Se utilizaron los siguientes oligonucleótidos sintéticos (Seq ID Nos. 1-11 respectivamente):

3

Ejemplo 2 Producción de Plantas Transgénicas Construcción de vectores de transformación de plantas con genes que codifican para la enzima antisentido de ramificación del almidón

Un fragmento de Sac I - Xho I de 1200 pb, que codifica aproximadamente la mitad de -COOH de la SBE clase A de patata (aislado del clon rescatado 3.2.1 de \lambdaZap) fue clonado dentro de los sitios Sac I - Sal I del vector pSJ29 de transformación de una planta para crear al plásmido pSJ64, que se ilustra esquemáticamente en la Figura 11. En la figura, la línea negra representa la secuencia de ADN. La línea discontinua representa la columna vertebral del plásmido bacteriano (que contiene el origen de replicación y el marcador de selección bacteriana), que no se muestra completamente. Los triángulos rellenos sobre la línea denotan los bordes del T-ADN (RB = borde derecho, LB = borde izquierdo). Los sitios de restricción relevante se observan por encima y por debajo de la línea, con las distancias aproximadas (en kilobases) entre los sitios (marcadas por medio de un asterisco) dadas por los números debajo de la línea. Las flechas más delgadas indican señales de poliadenilación (pAnos = nopalina sintasa, pAg7 = gen 7 de Agrobacterium), las flechas con espesor intermedio denotan regiones que codifican proteína (SBE II = SBE clase A de patata. HYG = gen de resistencia a la higromicina) y las flechas más gruesas representan regiones promotoras (P-2x35 =
promotor doble 35S de CaMV, Pnos = promotor de nopalina sintasa). Por lo tanto, pSJ64 contenía al fragmento del gen que codifica para la SBE clase A en una orientación antisentido entre el promotor 2X 35S de CaMV y la señal de poliadenilación de la nopalina sintasa.

Para información, pSJ29 es un derivado del vector binario pGPTV-HYG (Becker y colaboradores, 1992 Plant Molecular Biology 20, 1195-1197) modificado de la siguiente manera: un fragmento aproximadamente de 750 pb (Sac I, T4 ADN polimerasa roma - Sal I) de pJIT60 (Guerineau y colaboradores, 1992 Plant Mol. Biol. 18, 815-818) que contenía al promotor duplicado 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) (cepa Cabb-JI, equivalente a las nucleótidos 7040 a 7376 duplicados secuencia arriba de 7040 a 7433, Frank y colaboradores, 1980 Cell 21, 285-294) fue donado dentro de los sitios Hind III (polimerasa Klenow reparada) - Sal I de pGPTV-HYG para crear pSJ29.

Transformación de la planta

La transformación se llevó a cabo sobre dos tipos de explantes de plantas de patata; o bien minitubérculos no transformados de tipo natural (con el propósito de suministrar transformantes sencillos que contienen a la construcción antisentido clase A sola) o minitubérculos de tres líneas celulares del tejido (que dieron origen a las plantas #12, #15, #17 y #18 indicadas era Tabla 1) que ya habían sido exitosamente transformadas con la construcción antisentido clase B (SBE I) que contenía al promotor 35S en tándem (para obtener plantas doblemente transformadas, que contienen secuencias antisentido tanto para las enzimas clase A cómo clase B).

Los detalles del método de transformación del Agrobacterium, y del desarrollo de las plantas transformadas, se encuentran en la Solicitud Internacional de Patente No. WC) 95/26407, excepto porque el medio utilizado contenía 3% de sacarosa (no 1%) hasta la transferencia final y porque la incubación inicial con Agrobacterium (cepa 3850) se llevó a cabo la oscuridad Los transformantes que contenían la secuencia antisentido clase A se seleccionaron por medio del desarrollo en medio que contenía 15 mg/L de higromicina (la construcción antisentido clase A se comprende al gen HYG, esto es, higromicina fosfotransferasa).

La transformación fue confirmada en todos los casos por medio de la producción de un fragmento de ADN del gen antisentido después de PCR en presencia de iniciadores apropiados y de un extracto crudo de ADN genómico de cada vástago regenerado.

Caracterización del almidón de plantas de patata

El almidón de las plantas fue extraído de la siguiente manera: se homogenizaron tubérculos de patata en agua durante 2 minutos de un mezclador Waring operando a alta velocidad. Se lavó y filtró el homogenizado (inicialmente a través de un filtro de 2 mm, luego a través de un filtró de 1 mm) utilizando aproximadamente 4 litros de agua cada 100 gramos de tubérculos (6 extracciones). Se extrajeron finalmente los gránulos lavados de almidón con acetona y se los secó al aire.

El almidón extraído de plantas de patata transformadas individualmente (clase A/SBE II y clase B/SBE I antisentido), o a partir de plantas de control no transformadas, fue parcialmente caracterizado. Los resultados se observan en la Tabla 1. La tabla muestra la cantidad de actividad de la SBE (unidades/gramo de tejido) en tubérculos de cada planta transformada. La temperatura endotérmica pico (°C) de almidón extraído de varias plantas se determinó por medio de DSC, y la temperatura de inicio (°C) de la adhesión fue determinada por referencia a una viscoamilografía ("RVA"), como se describe en WO 95/26407. El perfil de la viscoamilografía fue la siguiente: etapa 1 50°C durante 2 minutos; etapa 2 - incremento en la temperatura desde 50°C hasta 95°C a una velocidad de 1,5°C por minuto; etapa 3 - mantener a 95°C durante 15 minutos; etapa 4 - enfriar desde 95°C hasta 50°C a una velocidad de 1,5°C por minuto; y finalmente, etapa 5 - mantener a 50°C durante 15 minutos. La Tabla 1 muestra las viscosidades de pico, de adhesión y de retroceso en unidades numéricas de agitación (SNUs), que es una medida de la cantidad de torque requerido para agitar las suspensiones. La viscosidad de pico se puede definir para los propósitos presentes como la viscosidad máxima alcanzada durante la fase de calentamiento (etapa 2) o la fase de mantenimiento (etapa 3) de la viscoamilografía. La viscosidad de retroceso se puede definir corro la viscosidad de la suspensión de almidón al final de la etapa 5 de la viscoamilografía.

Se llevó a cabo también una determinación del contenido aparente de amilosa (% p/p), utilizando el método del ensayo iodométrico de Morrison & Laignelet (1983 J. Cereal Sci. 1, 9-20). Los resultados (porcentaje aparente de amilosa) se muestran en la Tabla 1. Las plantas de control transformadas y no transformadas dieron lugar a almidones con contenidos aparentes de amilosa en el rango de 29 \pm 3%.

Generalmente se obtuvieron valores similares para el contenido de amilosa del almidón extraído de la mayoría de las plantas individualmente transformadas que contenían la secuencia antisentido clase A (SBE II). Sin embargo, algunas plantas (#152, 249) dieron lugar a un almidón que tenía un contenido aparente de amilosa del 37-38%, notablemente superior a aquel del valor de control. El almidón extraído de estas plantas tenía temperaturas de inicio de adhesión marcadamente elevadas, y el almidón de la planta 152 también exhibió una temperatura endoténnica de pico elevada (el almidón de la planta 249 no fue analizado por medio de DSC).

4

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\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
\cr}

5

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Debe observarse que, aún si otros transformantes sencillos no proveyeran almidón con una proporción alterada de amilosa/amilopectina, el almidón de tales plantas puede tener aún diferentes propiedades con relación al almidón de plantas convencionales (por ejemplo, diferente peso molecular promedio o diferentes patrones de ramificación de la amilopectina), que pueden ser útiles.

Las plantas transformantes dobles, que contienen secuencias antisentido tanto para enzimas clase A cómo clase B, tenían actividad de la SBE muy reducida (unidades/gm) comparadas con las plantas no transformadas o con los transformantes sencillos clase A antisentido al paréntesis (como se observa en la Tabla 1). Además, ciertas de las plantas transformantes dobles que contenían almidón tienen propiedades alteradas muy significativas. Por ejemplo, el almidón extraído de las plantas # 201, 202, 208, 208a, 236 y 236a tenían proporciones de amilosa/amilopectina drásticamente alteradas, hasta el grado de que la amilosa era de constituyente principal del almidón de estas plantas. Las temperaturas de inicio de la adhesión del almidón a partir de esas plantas tuvieron también el incremento más grande (aproximadamente a 25-30°C). El almidón de plantas tales como la #150, 161, 212, 220 y 230a representaron un rango de intermedios, en los que tal almidón mostró un incremento más modesto tanto en el contenido de amilosa como en la temperatura de inicio de la adición. Los resultados tenderían a sugerir que existe una correlación general entre el % en contenido de amilosa y la temperatura de inicio de la adhesión, que está de acuerdo con el comportamiento conocido de los almidones de otras fuentes, notablemente del maíz.

El marcado incremento en el contenido de amilosa obtenido por medio de la inhibición de la SBE clase A sola, comparado con la inhibición de la SBE clase B sola (ver PCT/GB95/00634) puede sugerir que sería conveniente transformar plantas primero con una construcción para suprimir la expresión de la SBE clase A (probablemente, en la práctica, una construcción antisentido), seleccionar aquellas plantas que dan lugar a un almidón con las propiedades más alteradas, y luego transformar nuevamente con una construcción para suprimir la expresión de la SBE clase A (nuevamente, en la práctica, probablemente una construcción antisentido), para maximizar el grado de modificación del almidón.

Además de las temperaturas de inicio de la adhesión, otras características del perfil de la viscoamilografía, por ejemplo, para almidones de las plantas # 149, 150, 152, 161, 201, 236 y 236a mostraron diferencias significativas con los almidones de las plantas de control, como se ilustra en la Figura 13. Con relación a la Figura 13, se observan varias trazas de viscoamilografía. La leyenda es la siguiente: casilla sombreada - control de almidón de patata normal (29,8% de contenido de amilosa); círculo sombreado - almidón de la planta 149 (35,6% de amilosa); triángulo sombreado, apuntando hacia arriba – planta 152 (37,5%); triángulo sombreado, apuntando hacia abajo - planta 161 (40,9%); diamante sombreado - planta 150 (53,1%); casilla no sombreada - planta 236a (56,7%); círculo no sombreado - planta (60,4%); triángulo no sombreado, apuntando hacia arriba – planta 201 (66,4%); triángulo no sombreado, apuntando hacia abajo – almidón Hylon V, del maíz (44,9% de amilosa). La línea delgada denota el perfil de calentamiento.

Con un contenido creciente de amilosa, las viscosidades pico durante el procesamiento a 95°C disminuyen, y la gota en la viscosidad del pico hasta el final del período de sostenimiento a 95°C generalmente también disminuye (en realidad, para algunas de las muestras le almidón existe un incremento en la viscosidad durante este período). Ambos resultados son indicativos de una fragmentación de gránulo reducida, y por lo tanto de una mayor estabilidad del gránulo durante la adhesión. Esta propiedad no había estado antes disponible en el almidón de patata sin una extensa modificación física o química previa. Para aplicaciones donde es deseable una viscosidad máxima después del procesamiento a 95°C (esto es, correspondiente a la viscosidad después de 47 minutos en la prueba del viscoamilógrafo), se seleccionaría el almidón de la planta # 152 va que los almidones con contenidos de amilosa más bajos (Controles, #149) y más altos (#161, #150) tienen viscosidades más bajas después de este régimen de gelatinización y adhesión (Figura 13 y Tabla 1). Se cree que la viscosidad en esta etapa se determina por medio de una combinación del grado de hinchamiento del granulo y la resistencia de los gránulos hinchados a la fragmentación mecánica. Para cualquier comportamiento de viscosidad deseado, alguien entrenado en el arte seleccionaría un almidón de patata entre un rango que contenga diferentes contenidos amilosa producidos de acuerdo con la invención llevado a cabo análisis estándar de viscosidad adecuados.

Por el enfriamiento de las pastas desde 95°C hasta 50°C, los almidones de patata de la mayoría de las plantas transformadas de acuerdo con invención mostraron un incremento en la viscosidad con el viscoamilógrafo como se esperaba por la reasociación parcial de la amilosa. Todos los almidones de las plantas #149, 152 y 161 mostraron viscosidades a 50 significativamente superiores a aquellas para los almidones de las plantas de control (Figura 13 y Tabla 1). Esto contrasta con el efecto de contenidos elevados de amilosa en almidones de plantas de maíz (Figura 2) que muestran viscosidades muy bajas en los ensayos con el viscoamilógrafo. De particular interés es el hecho de que, para contenidos similares de amilosa, el almidón de la planta de patata 150 (53% de amilosa) muestra una viscosidad marcadamente superior comparado con el almidón Hylon 5 (44,9% de amilosa) como se ilustra la Figura 13. Esto demuestra que se pueden obtener propiedades útiles que requieren elevados niveles de amilosa (35% o superior) por medio del procesamiento de almidones de plantas de patata por debajo de 100°C, mientras que se requiere un procesamiento con mayor intensidad de energía con el propósito de generar propiedades útiles similares a partir de almidones con mayor contenido de amilosa derivados de plantas de maíz.

La viscosidad final en la prueba con el viscoamilógrafo (viscosidad de retroceso después de 92 minutos) es mayor para el almidón de la planta # 161 (40,9% de amilosa) entre aquéllos analizados (Figura 13 y Tabla 1). La disminución de las viscosidades finales se obtiene para los almidones de la planta # 152 (37,5% amilosa), # 149 (35,6% de amilosa) y # 150 (53,1% de amilosa). La viscosidad de retroceso se presenta cuando las moléculas de amilosa, exudadas a partir del gránulo de almidón durante la adhesión, comienzan a reasociarse por fuera del gránulo y forman una sustancia viscosa tipo gel. Se cree que los valores de viscosidad de retroceso de los almidones de plantas de patata transgénicas representan un balance entre el contenido inherente de amilosa de los almidones y la habilidad de la fracción de amilosa para ser exudada del granulo durante la adhesión y por lo tanto estar disponible para el proceso de reasociación lo cual resulta en un incremento en la viscosidad. Para los almidones con bajo contenido de amilosa, el incremento en el contenido de amilosa tiende a hacer más disponible a la amilosa para la reasociación, incrementando así la viscosidad de retroceso. Sin embargo, por encima de un valor de umbral, se piensa que un mayor contenido de amilosa inhibe el hinchamiento del gránulo, evitando así la exudación de amilosa del gránulo de almidón y reduciendo la cantidad de amilosa disponible para la reasociación. Esto está soportado por resultados RVA obtenidos para los almidones de patata de muy alto contenido amilosa observados en los perfiles del viscoamilógrafo en la Figura 13. Para cualquier comportamiento de viscosidad deseada después del retroceso o la retrogradación a partir de cualquier temperatura deseada durante cualquier período de tiempo deseado, alguien capacitado en el arte seleccionaría un almidón de patata entre un rango que contiene diferentes contenidos amilosa producidos de acuerdo con la invención llevando a cabo análisis estándar de viscosidad.

Experimentos adicionales con almidón de las plantas # 201 y 208 mostraron que éstas tenían un contenido aparente de amilosa por encima del 62% (ver Tabla 1). Los estudios de viscoamilografía mostraron que el almidón de estas plantas tenía propiedades radicalmente alteradas y se comportó en forma similar a almidón hylon 5 de las plantas de maíz (Figura 13). Bajo las condiciones empleadas con el viscoamilógrafo, este almidón exhibió una hinchazón del gránulo extremadamente limitada (casi que indetectable). Por lo tanto, por ejemplo, a diferencia del almidón de las plantas de control, el almidón de las plantas 201, 208 y 208a no mostró un pico de viscosidad de adhesión claramente definido durante la fase de calentamiento. El análisis microscópico confirmó que la estructura de los gránulos de almidón experimentó únicamente un hinchamiento menor durante el proceso experimental de calentamiento. Esta propiedad puede ser particularmente útil en ciertas aplicaciones, que será clara para aquellos capacitados en el arte.

Se ha encontrado hasta ahora que algunas plantas cultivadas nuevamente incrementan aún más el contenido aparente de amilosa del almidón extraído de ellas. Tales incrementos pueden ser debidos a:

i)

que el cultivo y desarrollo de la primera generación de plantas transformadas puede haber sido afectado en alguna medida por las hormonas exógenas de crecimiento presentes en el sistema de cultivo del tejido, cuyas hormonas exógenas no estaban presentes durante el cultivo de la segunda generación de plantas; y

ii)

que las generaciones siguientes fueron cultivadas bajo condiciones de campo, que pueden permitir el logro de una madurez mayor que las cultivadas bajo condiciones de laboratorio, siendo generalmente sostenido que el contenido amilosa del almidón de patata se incrementa con la madurez del tubérculo de la patata. Por lo tanto, debería ser posible obtener plantas de patata que den lugar a tubérculos con almidón que tenga un contenido de amilosa por encima del nivel del 66% logrado hasta ahora, simplemente analizando un gran número de plantas transformadas y/o cultivando nuevamente las plantas transgénicas mediante una o más generaciones bajo condiciones de campo.

La Tabla 1 muestra que otra característica del almidón que es afectada por la presencia de secuencias antisentido de la SBE es el contenido de fósforo. El almidón de las plantas de control no transformadas tenían un contenido de fósforo aproximadamente de 60-70 mg/100 gramos de peso seco (como se determinó de acuerdo a los Métodos Oficiales de Análisis de la AOAC, 15^{ava} edición, Método 948.09 "Fósforo en Harina"). Se encontró que la introducción en la planta de una secuencia B antisentido de la SBE causa un incremento modesto (aproximadamente dos veces) en el contenido de fósforo, que está de acuerdo con los hallazgos previos reportados en encuentros científicos. En forma similar, una secuencia A antisentido de la SBE sola, únicamente causa un pequeño aumento en el contenido de fósforo con relación a los controles no transformados. Sin embargo, el uso de una secuencia antisentido tanto A como B de la SBE en combinación resulta en un incremento hasta de cuatro veces en el contenido de fósforo, lo cual es mucho mayor que cualquier contenido de fósforo en la planta previamente demostrado para el almidón de patata.

Esto es útil porque, para ciertas aplicaciones, el almidón debe ser fosforilado in vitro por medio de una modificación química. La habilidad para obtener un almidón de patata que, en la medida en que es extraído por la planta, ya tenga un alto contenido de fósforo que reducirá la cantidad de fosforilación requerida in vitro, adecuada para modificar al almidón. Por lo tanto, en otro aspecto la invención provee un almidón de patata que, en la medida en que es extraído de la planta, tenga un contenido de fósforo por encima de 200 mg/100 gramos de peso seco de almidón. Típicamente, el almidón tendrá un contenido de fósforo en el rango entre 200-240 mg/100 gramos de peso seco de almidón.

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Referencias citadas en la descripción

Este listado de referencias citado por el solicitante es únicamente para conveniencia del lector. No forma parte del documento europeo de la patente. Aunque se ha tenido gran cuidado en la recopilación, no se pueden excluir los errores o las omisiones y la OEP rechaza toda responsabilidad en este sentido.

Documentos de patente citados en la descripción

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\bullet US 5281276 A [0032] [0032]

\bullet WO 9526407 A [0021] [0060] [0063]

\bullet GB 9500634 W [0054] [0068]

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\bulletMORRISON; LAIGNELET. J. Cereal Sci, 1983, vol. 1, 9-20 [0064]

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i)

SOLICITANTE:

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(A)

NOMBRE: National Starch and Chemical Investment Holding Corporation

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: 501 Silverside Road. Suite 27

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(C)

CIUDAD: Wilmington

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(D)

ESTADO: Delaware

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: Estados Unidos de América

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(F)

CÓDIGO POSTAL (ZIP): 19809

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(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Mejoras en o Relacionadas con una Composición de Almidón de una Planta

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 20

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(iv)

FORMA QUE PUEDE LEERSE EN EL COMPUTADOR:

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(A)

TIPO DE MEDIO: Disco flexible

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(B)

COMPUTADOR: IBM PC compatible

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(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

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(D)

SOFTWARE: Patentin Release #1.0, Versión #1.30 (EPO)

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 57 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

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(C)

ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAGGATCCGT CGACATCGAT AATACGACTC ACTATAGGGA TTTTTTTTTT TTTTTTT

\hfill

57

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 17 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AAGGATCCGT CGACATC

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 17 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GACATCGATA ATACGAC

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CATCCAACCA CCATCTCGCA

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTGAGAGAAG ATACCTAAGT

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATGTTCAGTC CATCTAAAGT

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGAACAACAA TTCCTAGCTC

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGGCCTTGA ACTCAGCAAT

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGTCCCAGCA TTCGACATAA

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 26 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTTGGATCCT TGAACTCAGC AATTTG

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 29 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TAACTCGAGC AACGCGATCA CAAGTTCGT

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 3003 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12:

6

7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2975 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 13:

\vskip1.000000\baselineskip

8

9

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 3033 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

UBICACIÓN: 145..2790

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 14:

\vskip1.000000\baselineskip

10

11

12

13

14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 882 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 15:

\vskip1.000000\baselineskip

15

16

17

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2576 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 16:

\vskip1.000000\baselineskip

19

20

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2529 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 17:

\vskip1.000000\baselineskip

22

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 3231 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 18:

\vskip1.000000\baselineskip

24

25

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2578 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 19:

\vskip1.000000\baselineskip

27

28

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 20:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

ENTRELAZAMIENTO: sencillo

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 20:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AATTTYATGG GNAAYGARTT YGG

\hfill

23

Claims (56)

1. Almidón extraído de una planta de patata y que tiene un contenido de amilosa de al menos 35% de acuerdo a lo juzgado por el método de análisis iodométrico de Morrison & Laignelet (1983 J. Cereal Science 1, 9-20).

2. Almidón de acuerdo a la reivindicación 1, que tiene un contenido de amilosa de al menos 37%, de acuerdo a lo juzgado por el método definido en la reivindicación 1.

3. Almidón de acuerdo a la reivindicación 1, que tiene un contenido de amilosa de al menos 40%, de acuerdo a lo juzgado por el método definido en la reivindicación 1.

4. Almidón de acuerdo a la reivindicación 1, que tiene un contenido de amilosa de al menos 50%, de acuerdo a lo juzgado por el método definido en la reivindicación 1.

5. Almidón de acuerdo a la reivindicación 1, que tiene un contenido de amilosa de al menos 66%, de acuerdo a lo juzgado por el método definido en la reivindicación 1.

6. Almidón de acuerdo a cualquiera de la reivindicaciones 1-5, que tiene un contenido de amilosa de 35-66%, de acuerdo a lo juzgado por el método definido en la reivindicación 1.

7. Almidón de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones precedentes que una vez extraído de una planta de patata por medio de una molienda en húmedo a temperatura ambiente tiene una temperatura de inicio de desarrollo de la viscosidad en el rango de 70-95°C, de acuerdo a lo juzgado por una viscoamilografía de una suspensión acuosa al 10% p/p de la misma, llevada a cabo a presión atmosférica utilizando el Newport Scientific Rapid Visco Analyser 3C con un perfil de calentamiento mantenido a 50°C durante 2 minutos, calentando desde 50 hasta 95°C con una velocidad de 1,5°C por minuto, manteniendo a 95°C durante 15 minutos, enfriando desde 95 hasta 50°C a una velocidad de 1,5°C por minuto, y luego manteniendo a 50°C durante 15 minutos.

8. Almidón de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1-6 que una vez extraído de una planta de patata por medio de una molienda en húmedo a temperatura ambiente tiene una viscosidad pico en el rango de 500-12 unidades del número de agitación (SNUs), de acuerdo a lo juzgado por la viscoamilografía llevada a cabo de acuerdo al protocolo definido en la reivindicación 7.

9. Almidón de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1-6 que una vez extraído de una planta de patata por medio de una molienda en húmedo a temperatura ambiente tiene una viscosidad de adhesión en el rango de 214-434 SNUs, de acuerdo a lo juzgado por la viscoamilografía llevada a cabo de acuerdo al protocolo definido en la reivindicación 7.

10. Almidón de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1-6 que una vez extraído de una planta de patata por medio de una molienda en húmedo a temperatura ambiente tiene una viscosidad de retroceso en el rango de 450-618 SNUs, de acuerdo a lo juzgado por la viscoamilografía llevada a cabo de acuerdo al protocolo definido en la reivindicación 7.

11. Almidón de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1-6 que una vez extraído de una planta de patata por medio de una molienda en húmedo a temperatura ambiente tiene una viscosidad de retroceso en el rango de 14-192 SNUs, de acuerdo a lo juzgado por la viscoamilografía llevada a cabo de acuerdo al protocolo definido en la reivindicación 7.

12. Almidón de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1-6 que una vez extraído de una planta de patata por medio de una molienda en húmedo a temperatura ambiente tiene una viscosidad pico en el rango de 200-500 SNUs y una viscosidad de retroceso en el rango de 275-618 SNUs de acuerdo a lo juzgado por la viscoamilografía llevada a cabo de acuerdo al protocolo definido en la reivindicación 7.

13. Almidón de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1-6 que una vez extraído de una planta de patata por medio de una molienda en húmedo a temperaturE. ambiente tiene una viscosidad que no disminuye entre el inicio de la fase de calentamiento (etapa 2) y el inicio de la fase final de mantenimiento (etapa 5) y tiene una viscosidad de retroceso de 303 SNUs o menor de acuerdo a lo juzgado por la viscoamilografía de acuerdo al protocolo definido en la reivindicación 7.

14. Almidón de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1-6 que una vez extraído de una planta de patata por medio de una molienda en húmedo a temperatura ambiente no muestra un incremento significativo en viscosidad de acuerdo a lo juzgado por la viscoamilografía llevada a cabo de acuerdo al protocolo definido en la reivindicación 7.

15. Almidón de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1-6 que una vez extraído de una planta de patata por medio de una molienda en húmedo a temperatura ambiente, está de acuerdo con la reivindicación 7 y de acuerdo con cualquiera que las reivindicaciones 8 a 14.

16. Almidón de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones precedentes el cual, una vez extraído de una planta de patata, tiene un contenido de fósforo por encima de 200 mg/100 gramos de peso seco de almidón.

17. El uso de almidón de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-1,5 en la preparación o el procesamiento de productos alimenticios.

18. El uso de almidón de acuerdo a la reivindicación 17, en donde el almidón se utiliza para proveer una película, barrera, recubrimiento o como un agente de gelificación.

19. El uso de almidón de acuerdo con la reivindicación 17, para preparar composiciones de almidón resistentes.

20. El uso de almidón de acuerdo con cualquiera de la reivindicaciones 1-16 en la preparación o el procesamiento de aditivos para corrugados, productos biodegradables. empaques, fibras de vidrio y textiles.

21. Una molécula aislada de ácido nucleico que codifica a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de los residuos 49 a 882 de la secuencia mostrada en la Figura 5, o el complemento de la misma.

22. Una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 21, que comprende sustancialmente la secuencia de nucleótidos 289 a 2790 de la secuencia mostrada en la Figura 5, o el complemento de la misma.

23. Una molécula de ácido nucleico de acuerdo a la reivindicación 22, que comprende además la secuencia de nucleótidos 145 a 288 de la secuencia mostrada en la Figura 5, o el complemento de la misma.

24. Una molécula de ácido nucleico de acuerdo a la reivindicación 21, que comprende la secuencia de nucleótidos 228 a 2855 de la secuencia marcada como psbe2con.seq en la Figura 8, o el complemento de la misma.

25. Una molécula de ácido nucleico de acuerdo a la reivindicación 21, que comprende la secuencia de nucleótidos 57 a 2564 de la secuencia marcada como psbe2con.seq en la Figura 12, o el complemento de la misma.

26. Una molécula de ácido clínico de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 21 a 25, que comprende un codón de inicio ATG en el marco, y que opcionalmente incluye una región 5' y/o 3' no traducida.

27. Una molécula de ácido nucleico de acuerdo a la reivindicación 21, que comprende la secuencia de nucleótidos 45 a 3200 de la secuencia marcada como psbe2con.seq en la Figura 8, o el complemento de la misma.

28. Una construcción de ácido nucleico que comprende una molécula de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 21 a 27.

29. Un vector que comprende una construcción de ácido nucleico de acuerdo a la reivindicaciones 28.

30. Una célula huésped aislada que comprende un vector de acuerdo con la reivindicación 29.

31. Un polipéptido de la SBE clase A obtenible a partir de plantas de patata y codificado por una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 21 a 29.

32. Un polipéptido de acuerdo a la reivindicación 31, que comprende además la secuencia de aminoácidos 1 a 48 de la secuencia mostrada en la Figura 5.

33. Un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 31 o la 32 en aislamiento sustancial de otros constituyentes derivados de la planta.

34. Un método para alterar las características de una planta, que comprende la introducción dentro de la planta de una molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 21 a 29, operativamente enlazada a un promotor activo adecuado en la planta, para afectar la expresión de un gen presente en la planta, cuya gen codifica a una enzima de ramificación del almidón Clase A.

35. Un método de acuerdo a la reivindicación 34, en donde la secuencia de nucleótidos está operativamente enlazada en la orientación antisentido a un promotor activo adecuado en la planta.

36. Un método de acuerdo a la reivindicación 34, en donde la secuencia introducida comprende uno o más de lo siguiente operativamente enlazado en la orientación sentido a un promotor activo en la planta, para causar una supresión sentido de una enzima naturalmente expresada en la planta: una región 5' no traducida, una región 3' no traducida, o una región de codificación de la enzima de ramificación del almidón SBE clase A de la patata.

37. Un método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 34, 35 ó 36, que comprende además la introducción dentro de la planta de una o más secuencias adicionales.

\newpage

38. Un método de acuerdo a la reivindicación 37, en donde una o más de las secuencias adicionales está operativamente enlazadas en la orientación antisentido a un promotor activo adecuado en la planta.

39. Un método de acuerdo a la reivindicación 37 ó 38, en donde la secuencia adicional comprende una porción de una secuencia de nucleótidos para la SBE clase B.

40. Un método de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 34 a 39, efectivo en la alteración de la composición de almidón de una planta.

41. Una planta o célula de una planta, o la progenie de dicha planta, o una parte de dicha planta, que comprende un vector de acuerdo con la reivindicación 29.

42. Una planta de acuerdo a la reivindicación 41, seleccionada entre una de las siguientes: patata, guisante, tomate, maíz, trigo, arroz, cebada, patata dulce, y casabe.

43. Un tubérculo u otro órgano de almacenamiento de una planta de acuerdo a la reivindicación 41 ó 42.

44. El uso de un tubérculo o de otro órgano de almacenamiento de acuerdo con la reivindicación 43, en la preparación y/o el procesamiento de un producto alimenticio.

45. Una planta de acuerdo a la reivindicación 41 ó 42, que contiene almidón el cual, una vez extraído de la planta por medio de molienda en húmedo a temperaturz ambiente, tiene una elevada temperatura de inicio del desarrollo de viscosidad de acuerdo a lo juzgado por medio de la viscoamilografía llevada a cabo de acuerdo con el protocolo definido en la reivindicación 7, comparado con el almidón extraído de una planta inalterada, o bien genéticamente idéntica.

46. Una planta de acuerdo a la reivindicación 45, en donde la temperatura de inicio de desarrollo de la viscosidad se eleva en una cantidad en el rango de 10 a 25°C.

47. Una planta de acuerdo a la reivindicación 41 ó 42, que contiene almidón el cual, una vez extraído de la planta por medio de molienda en húmedo a temperatura ambiente, tiene una menor viscosidad de pico de acuerdo a lo juzgado por medio de la viscoamilografía llevada a cabo de acuerdo con el protocolo definido en la reivindicación 7, comparada con la del almidón extraído de una planta inalterada, o bien genéticamente idéntica

48. Una planta de acuerdo a la reivindicación 47, en donde la viscosidad pico disminuye en una cantidad en el rango de 240 a 700 SNUs.

49. Una planta de acuerdo a la reivindicación 41 ó 42, que contiene almidón el cual, una vez extraído de la planta por medio de molienda en húmedo a temperatura ambiente, tiene una mayor viscosidad de adhesión de acuerdo a lo juzgado por medio de la viscoamilografía llevada a cabo de acuerdo con el protocolo definido en la reivindicación 7, comparada con la del almidón extraído de una planta inalterada, o bien genéticamente idéntica.

50. Una planta de acuerdo a la reivindicación 49, en donde la viscos: dad de adhesión se incrementa en una cantidad en el rango de 37 a 260 SNUs.

51. Una planta de acuerdo a la reivindicación 41 ó 42, que contiene almidón el cual, una vez extraído de la planta por medio de molienda en húmedo a temperatura ambiente, tiene una mayor viscosidad de retroceso de acuerdo a lo juzgado por medio de la viscoamilografía llevada a cabo de acuerdo con el protocolo definido en la reivindicación 7, comparada con la del almidón extraído de una planta inalterada, o bien genéticamente idéntica.

52. Una planta de acuerdo a la reivindicación 51, en donde la viscosidad de retroceso se incrementa en una cantidad en el rango de 224 a 313 SNUs.

53. Una planta de acuerdo a la reivindicación 41 ó 42, que contiene almidón el cual, una vez extraído de la planta por medio de molienda en húmedo a temperatura ambiente, tiene una menor viscosidad de retroceso de acuerdo a lo juzgado por medio de la viscoamilografía llevada a cabo de acuerdo con el protocolo definido en la reivindicación 7, comparada con la del almidón extraído de una planta inalterada, o bien genéticamente idéntica.

54. Una planta de acuerdo a la reivindicación 41 ó 42, que contiene almidón el cual, una vez extraído de la planta por medio de molienda en húmedo a temperatura ambiente, tiene un elevado contenido aparente de amilosa de acuerdo a lo juzgado por medio del ensayo iodométrico de acuerdo con el método de Morrison & Laignelet, comparado con el almidón extraído de una planta inalterada, o bien genéticamente idéntica.

55. Una planta de acuerdo a la reivindicación 41 ó 42, que contiene almidón el cual, una vez extraído de la planta, tiene un contenido de fósforo por encima de 200 mg/100 gramos de peso seco de almidón.

56. Un método de modificación del almidón in vitro, que comprende el tratamiento del almidón bajo condiciones adecuadas con una cantidad efectiva de un polipéptido de acuerdo con cualquiera de la reivindicaciones 31 a 33.