KR20010043458A

KR20010043458A - 전분 합성에 관여하는 밀 유래 효소를 암호화하는 핵산 분자

Info

Publication number: KR20010043458A
Application number: KR1020007012505A
Authority: KR
Inventors: 뢰르츠호르스트; 뤼틱케스테파니; 아벨게르노트; 겐셸울리치
Original assignee: 바이세르트, 리펠; 아벤티스 크롭사이언스 게엠베하
Priority date: 1998-05-08
Filing date: 1999-05-07
Publication date: 2001-05-25
Also published as: NO20005613L; DE59912434D1; US20030093834A1; NO20005613D0; PL345096A1; WO1999058690A2; BR9910311A; CN1299416A; ATE302280T1; SK16782000A3; CA2331311A1; US6951969B1; DE19820608A1; WO1999058690A3; HUP0102629A2; JP2003517270A; US6897358B2; ZA200006249B; EP1088082A2; AU4258999A

Abstract

본 발명은 식물에서의 전분 합성에 관여하는 효소를 암호화는 핵산 분자에 관한 것이다. 이들 효소는 밀로부터 유래되는 이소아밀라아제이다. 본 발명은 또한 본 발명의 이소아밀라아제의 증가 또는 감소된 활성을 나타내는, 상기 핵산 분자를 함유하는 벡터 및 숙주 세포, 특히 형질전환 식물 세포 및 이로부터 재생될 수 있는 식물에 관한 것이다.

Description

전분 합성에 관여하는 밀 유래 효소를 암호화하는 핵산 분자{NUCLEIC ACID MOLECULES WHICH CODE FOR ENZYMES DERIVED FROM WHEAT AND WHICH ARE INVOLVED IN THE SYNTHESIS OF STARCH}

＜110＞ Aventis CropScience GmbH

＜120＞ Nucleic acid molecules which code for enzymes derived from wheat

and which are involved in the synthesis of starch

＜130＞ 02

＜150＞ DE 198 20 608.9

＜151＞ 1998-05-08

＜160＞ 16

＜170＞ KOPATIN 1.5

＜210＞ 1

＜211＞ 2997

＜212＞ DNA

＜213＞ Triticum aestivum L. cv. Florida

＜220＞

＜221＞ CDS

＜222＞ (3)..(296)

＜220＞

＜221＞ CDS

＜222＞ (397)..(1617)

＜220＞

＜221＞ CDS

＜222＞ (2145)..(2921)

＜220＞

＜221＞ CDS

＜222＞ (2925)..(2945)

＜220＞

＜221＞ CDS

＜222＞ (2949)..(2960)

＜400＞ 1

gg tcg ggg ccg gcg ccg cgc ctg cga cgg tgg cga ccc aat gcg 44

Ser Gly Pro Ala Pro Arg Leu Arg Arg Trp Arg Pro Asn Ala

1 5 10

acg gcg ggg aag ggg gtc ggc gag gtg tgc gcc gcg gtt gtc gag gcg 92

Thr Ala Gly Lys Gly Val Gly Glu Val Cys Ala Ala Val Val Glu Ala

15 20 25 30

gcg acg aag gta gag gac gag ggg gag gag gac gag ccg gtg gcg gag 140

Ala Thr Lys Val Glu Asp Glu Gly Glu Glu Asp Glu Pro Val Ala Glu

35 40 45

gac agg tac gcg ctc ggc ggc gcg tgc agg gtg ctc gcc gga atg ccc 188

Asp Arg Tyr Ala Leu Gly Gly Ala Cys Arg Val Leu Ala Gly Met Pro

50 55 60

gcg ccg ctg ggc gcc acc gcg ctc gcc ggc ggg gtc aat ttc gcc gtc 236

Ala Pro Leu Gly Ala Thr Ala Leu Ala Gly Gly Val Asn Phe Ala Val

65 70 75

tat tcc ggc gga gcc acc gcc gcg gcg ctc tgc ctc ttc acg cca gaa 284

Tyr Ser Gly Gly Ala Thr Ala Ala Ala Leu Cys Leu Phe Thr Pro Glu

80 85 90

gat ctc aag gcg gtgg ggttgcctcc cgagtagagt tcatcagctt tgcgtgcgcc 340

Asp Leu Lys Ala

95

gcgcgcccct tttttgggcc tgcaatttaa gttttgtact ggggcaaatg ctgcag 396

gat agg gtg acc gag gag gtt ccc ctt gac ccc ctg atg aat cgg acc 444

Asp Arg Val Thr Glu Glu Val Pro Leu Asp Pro Leu Met Asn Arg Thr

1 5 10 15

ggg aac gtg tgg cat gtc ttc atc gaa ggc gag ctg cac aac atg ctt 492

Gly Asn Val Trp His Val Phe Ile Glu Gly Glu Leu His Asn Met Leu

20 25 30

tac ggg tac agg ttc gac ggc acc ttt gct cct cac tgc ggg cac tac 540

Tyr Gly Tyr Arg Phe Asp Gly Thr Phe Ala Pro His Cys Gly His Tyr

35 40 45

ctt gat gtt tcc aat gtc gtg gtg gat cct tat gct aag gca gtg ata 588

Leu Asp Val Ser Asn Val Val Val Asp Pro Tyr Ala Lys Ala Val Ile

50 55 60

agc cga ggg gag tat ggt gtt cca gcg cgt ggt aac aat tgc tgg cct 636

Ser Arg Gly Glu Tyr Gly Val Pro Ala Arg Gly Asn Asn Cys Trp Pro

65 70 75 80

cag atg gct ggc atg atc cct ctt cca tat agc acg ttt gat tgg gaa 684

Gln Met Ala Gly Met Ile Pro Leu Pro Tyr Ser Thr Phe Asp Trp Glu

85 90 95

ggc gac cta cct cta aga tat cct caa aag gac ctg gta ata tat gag 732

Gly Asp Leu Pro Leu Arg Tyr Pro Gln Lys Asp Leu Val Ile Tyr Glu

100 105 110

atg cac ttg cgt gga ttc acg aag cat gat tca agc aat gta gaa cat 780

Met His Leu Arg Gly Phe Thr Lys His Asp Ser Ser Asn Val Glu His

115 120 125

ccg ggt act ttc att gga gct gtg tcg aag ctt gac tat ttg aag gag 828

Pro Gly Thr Phe Ile Gly Ala Val Ser Lys Leu Asp Tyr Leu Lys Glu

130 135 140

ctt gga gtt aat tgt att gaa tta atg ccc tgc cat gag ttc aac gag 876

Leu Gly Val Asn Cys Ile Glu Leu Met Pro Cys His Glu Phe Asn Glu

145 150 155 160

ctg gag tac tca acc tct tct tcc aag atg aac ttt tgg gga tat tct 924

Leu Glu Tyr Ser Thr Ser Ser Ser Lys Met Asn Phe Trp Gly Tyr Ser

165 170 175

acc ata aac ttc ttt tca cca atg aca aga tac aca tca ggc ggg ata 972

Thr Ile Asn Phe Phe Ser Pro Met Thr Arg Tyr Thr Ser Gly Gly Ile

180 185 190

aaa aac tgt ggg cgt gat gcc ata aat gag ttc aaa act ttt gta aga 1020

Lys Asn Cys Gly Arg Asp Ala Ile Asn Glu Phe Lys Thr Phe Val Arg

195 200 205

gag gct cac aaa cgg gga att gag gtg atc ctg gat gtt gtc ttc aac 1068

Glu Ala His Lys Arg Gly Ile Glu Val Ile Leu Asp Val Val Phe Asn

210 215 220

cat aca gct gag ggt aat gag aat ggt cca ata tta tca ttt aag ggg 1116

His Thr Ala Glu Gly Asn Glu Asn Gly Pro Ile Leu Ser Phe Lys Gly

225 230 235 240

gtc gat aat act aca tac tat atg ctt gca ccc aag gga gag ttt tat 1164

Val Asp Asn Thr Thr Tyr Tyr Met Leu Ala Pro Lys Gly Glu Phe Tyr

245 250 255

aac tat tct ggc tgt ggg aat acc ttc aac tgt aat cat cct gtg gtt 1212

Asn Tyr Ser Gly Cys Gly Asn Thr Phe Asn Cys Asn His Pro Val Val

260 265 270

cgt caa ttc att gta gat tgt tta aga tac tgg gtg acg gaa atg cat 1260

Arg Gln Phe Ile Val Asp Cys Leu Arg Tyr Trp Val Thr Glu Met His

275 280 285

gtt gat ggt ttt cgt ttt gat ctt gca tcc ata atg acc aga ggt tcc 1308

Val Asp Gly Phe Arg Phe Asp Leu Ala Ser Ile Met Thr Arg Gly Ser

290 295 300

agt ctg tgg gat cca gtt aac gtg tat gga gct cca ata gaa ggt gac 1356

Ser Leu Trp Asp Pro Val Asn Val Tyr Gly Ala Pro Ile Glu Gly Asp

305 310 315 320

atg atc aca aca ggg aca cct ctt gtt act cca cca ctt att gac atg 1404

Met Ile Thr Thr Gly Thr Pro Leu Val Thr Pro Pro Leu Ile Asp Met

325 330 335

atc agc aat gac cca att ctt gga ggc gtc aag ctc att gct gaa gca 1452

Ile Ser Asn Asp Pro Ile Leu Gly Gly Val Lys Leu Ile Ala Glu Ala

340 345 350

tgg gat gca gga ggc ctc tat caa gta ggt caa ttc cct cac tgg aat 1500

Trp Asp Ala Gly Gly Leu Tyr Gln Val Gly Gln Phe Pro His Trp Asn

355 360 365

gtt tgg tct gag tgg aat ggg aag tac cgg gac att gtg cgt caa ttc 1548

Val Trp Ser Glu Trp Asn Gly Lys Tyr Arg Asp Ile Val Arg Gln Phe

370 375 380

att aaa ggc act gat gga ttt gct ggt ggt ttt gcc gaa tgt ctt tgt 1596

Ile Lys Gly Thr Asp Gly Phe Ala Gly Gly Phe Ala Glu Cys Leu Cys

385 390 395 400

gga agt cca cac cta tac cag gta agttgtggca atacttgtaa atgagttgag 1650

Gly Ser Pro His Leu Tyr Gln

405

tgaatgtcac ctggattttt tatatatacc acatgatgat acacatctaa atatataaca 1710

atcatagtgt atgcatatgc atttggctaa gaagtattag tgtatacact agtgctatat 1770

ataggtttta acacccaact tgccaatgaa ggaacatagg gctttctagt tatcttattt 1830

atttgtccgg tgaataatcc actgaaaaat tccagccatg tcatttttta gggggggaga 1890

agaaactata ttgatttgcc cccctaaaag aagccatctc agaattcata ggtaagttgc 1950

ttttctgtaa agaaaggaaa acgacttcat actttctatc ggtgctaact tagctcgatg 2010

tatatttgta agatgaatgc caaatttaat ttgtcggata atttgatctg ttattcacaa 2070

atttctattt ggtttctcta gaaatcaaac cagtaacttg ttattggcac tgcaacttct 2130

tattgattaa tcag gca gga gga agg aaa cct tgg cac agt atc aac 2177

Ala Gly Gly Arg Lys Pro Trp His Ser Ile Asn

1 5 10

ttt gta tgt gca cat gat gga ttt aca ctg gct gat ttg gta aca tat 2225

Phe Val Cys Ala His Asp Gly Phe Thr Leu Ala Asp Leu Val Thr Tyr

15 20 25

aat aag aag tac aat tta cca aat ggg gag aac aac aga gat gga gaa 2273

Asn Lys Lys Tyr Asn Leu Pro Asn Gly Glu Asn Asn Arg Asp Gly Glu

30 35 40

aat cac aat ctt agc tgg aat tgt ggg gag gaa gga gaa ttc gca aga 2321

Asn His Asn Leu Ser Trp Asn Cys Gly Glu Glu Gly Glu Phe Ala Arg

45 50 55

ttg tct gtc aaa aga ttg agg aag agg cag atg cgc aat ttc ttt gtt 2369

Leu Ser Val Lys Arg Leu Arg Lys Arg Gln Met Arg Asn Phe Phe Val

60 65 70 75

tgt ctc atg gtt tct caa gga gtt cca atg ttc tac atg ggt gat gaa 2417

Cys Leu Met Val Ser Gln Gly Val Pro Met Phe Tyr Met Gly Asp Glu

80 85 90

tat ggc cac aca aaa ggg ggc aac aac aat aca tac tgc cat gat tct 2465

Tyr Gly His Thr Lys Gly Gly Asn Asn Asn Thr Tyr Cys His Asp Ser

95 100 105

tat gtc aat tat ttt cgc tgg gat aaa aaa gaa caa tac tct gag ttg 2513

Tyr Val Asn Tyr Phe Arg Trp Asp Lys Lys Glu Gln Tyr Ser Glu Leu

110 115 120

cac cga ttc tgc tgc ctc atg acc aaa ttc cgc aag gag tgc gag ggt 2561

His Arg Phe Cys Cys Leu Met Thr Lys Phe Arg Lys Glu Cys Glu Gly

125 130 135

ctt ggc ctt gag gac ttt cca acg gcc aaa cgg ctg cag tgg cat ggt 2609

Leu Gly Leu Glu Asp Phe Pro Thr Ala Lys Arg Leu Gln Trp His Gly

140 145 150 155

cat cag cct ggg aag cct gat tgg tct gag aat agc cga ttc gtt gcc 2657

His Gln Pro Gly Lys Pro Asp Trp Ser Glu Asn Ser Arg Phe Val Ala

160 165 170

ttt tcc atg aaa gat gaa aga cag ggc gag atc tat gtg gcc ttc aac 2705

Phe Ser Met Lys Asp Glu Arg Gln Gly Glu Ile Tyr Val Ala Phe Asn

175 180 185

acc agc cac tta ccg gcc gtt gtt gag ctc cca gag cgc gca ggg cgc 2753

Thr Ser His Leu Pro Ala Val Val Glu Leu Pro Glu Arg Ala Gly Arg

190 195 200

cgg tgg gaa ccg gtg gtg gac aca ggc aag cca gca cca tac gac ttc 2801

Arg Trp Glu Pro Val Val Asp Thr Gly Lys Pro Ala Pro Tyr Asp Phe

205 210 215

ctc acc gac gac tta cct gat cgc gct ctc acc ata cac cag ttc tcg 2849

Leu Thr Asp Asp Leu Pro Asp Arg Ala Leu Thr Ile His Gln Phe Ser

220 225 230 235

cat ttc ctc tac tcc aac ctc tac ccc atg ctc agc tac tca tcg gtc 2897

His Phe Leu Tyr Ser Asn Leu Tyr Pro Met Leu Ser Tyr Ser Ser Val

240 245 250

atc cta gta ttg cgc cct gat gtt tga gag acc aat ata tac 2939

Ile Leu Val Leu Arg Pro Asp Val Glu Thr Asn Ile Tyr

255 1 5

agt aaa taa tat gtc tat atg taaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2980

Ser Lys Tyr Val Tyr Met

1

aaaaaaaaaa aaaaaaa 2997

＜210＞ 2

＜211＞ 98

＜212＞ PRT

＜213＞ Triticum aestivum L. cv. Florida

＜400＞ 2

Ser Gly Pro Ala Pro Arg Leu Arg Arg Trp Arg Pro Asn Ala Thr Ala

1 5 10 15

Gly Lys Gly Val Gly Glu Val Cys Ala Ala Val Val Glu Ala Ala Thr

20 25 30

Lys Val Glu Asp Glu Gly Glu Glu Asp Glu Pro Val Ala Glu Asp Arg

35 40 45

Tyr Ala Leu Gly Gly Ala Cys Arg Val Leu Ala Gly Met Pro Ala Pro

50 55 60

Leu Gly Ala Thr Ala Leu Ala Gly Gly Val Asn Phe Ala Val Tyr Ser

65 70 75 80

Gly Gly Ala Thr Ala Ala Ala Leu Cys Leu Phe Thr Pro Glu Asp Leu

85 90 95

Lys Ala

＜210＞ 3

＜211＞ 407

＜212＞ PRT

＜213＞ Triticum aestivum L. cv. Florida

＜400＞ 3

Asp Arg Val Thr Glu Glu Val Pro Leu Asp Pro Leu Met Asn Arg Thr

1 5 10 15

Gly Asn Val Trp His Val Phe Ile Glu Gly Glu Leu His Asn Met Leu

20 25 30

Tyr Gly Tyr Arg Phe Asp Gly Thr Phe Ala Pro His Cys Gly His Tyr

35 40 45

Leu Asp Val Ser Asn Val Val Val Asp Pro Tyr Ala Lys Ala Val Ile

50 55 60

Ser Arg Gly Glu Tyr Gly Val Pro Ala Arg Gly Asn Asn Cys Trp Pro

65 70 75 80

Gln Met Ala Gly Met Ile Pro Leu Pro Tyr Ser Thr Phe Asp Trp Glu

85 90 95

Gly Asp Leu Pro Leu Arg Tyr Pro Gln Lys Asp Leu Val Ile Tyr Glu

100 105 110

Met His Leu Arg Gly Phe Thr Lys His Asp Ser Ser Asn Val Glu His

115 120 125

Pro Gly Thr Phe Ile Gly Ala Val Ser Lys Leu Asp Tyr Leu Lys Glu

130 135 140

Leu Gly Val Asn Cys Ile Glu Leu Met Pro Cys His Glu Phe Asn Glu

145 150 155 160

Leu Glu Tyr Ser Thr Ser Ser Ser Lys Met Asn Phe Trp Gly Tyr Ser

165 170 175

Thr Ile Asn Phe Phe Ser Pro Met Thr Arg Tyr Thr Ser Gly Gly Ile

180 185 190

Lys Asn Cys Gly Arg Asp Ala Ile Asn Glu Phe Lys Thr Phe Val Arg

195 200 205

Glu Ala His Lys Arg Gly Ile Glu Val Ile Leu Asp Val Val Phe Asn

210 215 220

His Thr Ala Glu Gly Asn Glu Asn Gly Pro Ile Leu Ser Phe Lys Gly

225 230 235 240

Val Asp Asn Thr Thr Tyr Tyr Met Leu Ala Pro Lys Gly Glu Phe Tyr

245 250 255

Asn Tyr Ser Gly Cys Gly Asn Thr Phe Asn Cys Asn His Pro Val Val

260 265 270

Arg Gln Phe Ile Val Asp Cys Leu Arg Tyr Trp Val Thr Glu Met His

275 280 285

Val Asp Gly Phe Arg Phe Asp Leu Ala Ser Ile Met Thr Arg Gly Ser

290 295 300

Ser Leu Trp Asp Pro Val Asn Val Tyr Gly Ala Pro Ile Glu Gly Asp

305 310 315 320

Met Ile Thr Thr Gly Thr Pro Leu Val Thr Pro Pro Leu Ile Asp Met

325 330 335

Ile Ser Asn Asp Pro Ile Leu Gly Gly Val Lys Leu Ile Ala Glu Ala

340 345 350

Trp Asp Ala Gly Gly Leu Tyr Gln Val Gly Gln Phe Pro His Trp Asn

355 360 365

Val Trp Ser Glu Trp Asn Gly Lys Tyr Arg Asp Ile Val Arg Gln Phe

370 375 380

Ile Lys Gly Thr Asp Gly Phe Ala Gly Gly Phe Ala Glu Cys Leu Cys

385 390 395 400

Gly Ser Pro His Leu Tyr Gln

405

＜210＞ 4

＜211＞ 259

＜212＞ PRT

＜213＞ Triticum aestivum L. cv. Florida

＜400＞ 4

Ala Gly Gly Arg Lys Pro Trp His Ser Ile Asn Phe Val Cys Ala His

1 5 10 15

Asp Gly Phe Thr Leu Ala Asp Leu Val Thr Tyr Asn Lys Lys Tyr Asn

20 25 30

Leu Pro Asn Gly Glu Asn Asn Arg Asp Gly Glu Asn His Asn Leu Ser

35 40 45

Trp Asn Cys Gly Glu Glu Gly Glu Phe Ala Arg Leu Ser Val Lys Arg

50 55 60

Leu Arg Lys Arg Gln Met Arg Asn Phe Phe Val Cys Leu Met Val Ser

65 70 75 80

Gln Gly Val Pro Met Phe Tyr Met Gly Asp Glu Tyr Gly His Thr Lys

85 90 95

Gly Gly Asn Asn Asn Thr Tyr Cys His Asp Ser Tyr Val Asn Tyr Phe

100 105 110

Arg Trp Asp Lys Lys Glu Gln Tyr Ser Glu Leu His Arg Phe Cys Cys

115 120 125

Leu Met Thr Lys Phe Arg Lys Glu Cys Glu Gly Leu Gly Leu Glu Asp

130 135 140

Phe Pro Thr Ala Lys Arg Leu Gln Trp His Gly His Gln Pro Gly Lys

145 150 155 160

Pro Asp Trp Ser Glu Asn Ser Arg Phe Val Ala Phe Ser Met Lys Asp

165 170 175

Glu Arg Gln Gly Glu Ile Tyr Val Ala Phe Asn Thr Ser His Leu Pro

180 185 190

Ala Val Val Glu Leu Pro Glu Arg Ala Gly Arg Arg Trp Glu Pro Val

195 200 205

Val Asp Thr Gly Lys Pro Ala Pro Tyr Asp Phe Leu Thr Asp Asp Leu

210 215 220

Pro Asp Arg Ala Leu Thr Ile His Gln Phe Ser His Phe Leu Tyr Ser

225 230 235 240

Asn Leu Tyr Pro Met Leu Ser Tyr Ser Ser Val Ile Leu Val Leu Arg

245 250 255

Pro Asp Val

＜210＞ 5

＜211＞ 7

＜212＞ PRT

＜213＞ Triticum aestivum L. cv. Florida

＜400＞ 5

Glu Thr Asn Ile Tyr Ser Lys

1 5

＜210＞ 6

＜211＞ 4

＜212＞ PRT

＜213＞ Triticum aestivum L. cv. Florida

＜400＞ 6

Tyr Val Tyr Met

1

＜210＞ 7

＜211＞ 2997

＜212＞ DNA

＜213＞ Triticum aestivum L. cv. Florida

＜400＞ 7

ggtcggggcc ggcgccgcgc ctgcgacggt ggcgacccaa tgcgacggcg gggaaggggg 60

tcggcgaggt gtgcgccgcg gttgtcgagg cggcgacgaa ggtagaggac gagggggagg 120

aggacgagcc ggtggcggag gacaggtacg cgctcggcgg cgcgtgcagg gtgctcgccg 180

gaatgcccgc gccgctgggc gccaccgcgc tcgccggcgg ggtcaatttc gccgtctatt 240

ccggcggagc caccgccgcg gcgctctgcc tcttcacgcc agaagatctc aaggcggtgg 300

ggttgcctcc cgagtagagt tcatcagctt tgcgtgcgcc gcgcgcccct tttttgggcc 360

tgcaatttaa gttttgtact ggggcaaatg ctgcaggata gggtgaccga ggaggttccc 420

cttgaccccc tgatgaatcg gaccgggaac gtgtggcatg tcttcatcga aggcgagctg 480

cacaacatgc tttacgggta caggttcgac ggcacctttg ctcctcactg cgggcactac 540

cttgatgttt ccaatgtcgt ggtggatcct tatgctaagg cagtgataag ccgaggggag 600

tatggtgttc cagcgcgtgg taacaattgc tggcctcaga tggctggcat gatccctctt 660

ccatatagca cgtttgattg ggaaggcgac ctacctctaa gatatcctca aaaggacctg 720

gtaatatatg agatgcactt gcgtggattc acgaagcatg attcaagcaa tgtagaacat 780

ccgggtactt tcattggagc tgtgtcgaag cttgactatt tgaaggagct tggagttaat 840

tgtattgaat taatgccctg ccatgagttc aacgagctgg agtactcaac ctcttcttcc 900

aagatgaact tttggggata ttctaccata aacttctttt caccaatgac aagatacaca 960

tcaggcggga taaaaaactg tgggcgtgat gccataaatg agttcaaaac ttttgtaaga 1020

gaggctcaca aacggggaat tgaggtgatc ctggatgttg tcttcaacca tacagctgag 1080

ggtaatgaga atggtccaat attatcattt aagggggtcg ataatactac atactatatg 1140

cttgcaccca agggagagtt ttataactat tctggctgtg ggaatacctt caactgtaat 1200

catcctgtgg ttcgtcaatt cattgtagat tgtttaagat actgggtgac ggaaatgcat 1260

gttgatggtt ttcgttttga tcttgcatcc ataatgacca gaggttccag tctgtgggat 1320

ccagttaacg tgtatggagc tccaatagaa ggtgacatga tcacaacagg gacacctctt 1380

gttactccac cacttattga catgatcagc aatgacccaa ttcttggagg cgtcaagctc 1440

attgctgaag catgggatgc aggaggcctc tatcaagtag gtcaattccc tcactggaat 1500

gtttggtctg agtggaatgg gaagtaccgg gacattgtgc gtcaattcat taaaggcact 1560

gatggatttg ctggtggttt tgccgaatgt ctttgtggaa gtccacacct ataccaggta 1620

agttgtggca atacttgtaa atgagttgag tgaatgtcac ctggattttt tatatatacc 1680

acatgatgat acacatctaa atatataaca atcatagtgt atgcatatgc atttggctaa 1740

gaagtattag tgtatacact agtgctatat ataggtttta acacccaact tgccaatgaa 1800

ggaacatagg gctttctagt tatcttattt atttgtccgg tgaataatcc actgaaaaat 1860

tccagccatg tcatttttta gggggggaga agaaactata ttgatttgcc cccctaaaag 1920

aagccatctc agaattcata ggtaagttgc ttttctgtaa agaaaggaaa acgacttcat 1980

actttctatc ggtgctaact tagctcgatg tatatttgta agatgaatgc caaatttaat 2040

ttgtcggata atttgatctg ttattcacaa atttctattt ggtttctcta gaaatcaaac 2100

cagtaacttg ttattggcac tgcaacttct tattgattaa tcaggcagga ggaaggaaac 2160

cttggcacag tatcaacttt gtatgtgcac atgatggatt tacactggct gatttggtaa 2220

catataataa gaagtacaat ttaccaaatg gggagaacaa cagagatgga gaaaatcaca 2280

atcttagctg gaattgtggg gaggaaggag aattcgcaag attgtctgtc aaaagattga 2340

ggaagaggca gatgcgcaat ttctttgttt gtctcatggt ttctcaagga gttccaatgt 2400

tctacatggg tgatgaatat ggccacacaa aagggggcaa caacaataca tactgccatg 2460

attcttatgt caattatttt cgctgggata aaaaagaaca atactctgag ttgcaccgat 2520

tctgctgcct catgaccaaa ttccgcaagg agtgcgaggg tcttggcctt gaggactttc 2580

caacggccaa acggctgcag tggcatggtc atcagcctgg gaagcctgat tggtctgaga 2640

atagccgatt cgttgccttt tccatgaaag atgaaagaca gggcgagatc tatgtggcct 2700

tcaacaccag ccacttaccg gccgttgttg agctcccaga gcgcgcaggg cgccggtggg 2760

aaccggtggt ggacacaggc aagccagcac catacgactt cctcaccgac gacttacctg 2820

atcgcgctct caccatacac cagttctcgc atttcctcta ctccaacctc taccccatgc 2880

tcagctactc atcggtcatc ctagtattgc gccctgatgt ttgagagacc aatatataca 2940

gtaaataata tgtctatatg taaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaa 2997

＜210＞ 8

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＜212＞ PRT

＜213＞ Triticum aestivum L. cv. Florida

＜400＞ 8

Ser Gly Pro Ala Pro Arg Leu Arg Arg Trp Arg Pro Asn Ala Thr Ala

1 5 10 15

Gly Lys Gly Val Gly Glu Val Cys Ala Ala Val Val Glu Ala Ala Thr

20 25 30

Lys Val Glu Asp Glu Gly Glu Glu Asp Glu Pro Val Ala Glu Asp Arg

35 40 45

Tyr Ala Leu Gly Gly Ala Cys Arg Val Leu Ala Gly Met Pro Ala Pro

50 55 60

Leu Gly Ala Thr Ala Leu Ala Gly Gly Val Asn Phe Ala Val Tyr Ser

65 70 75 80

Gly Gly Ala Thr Ala Ala Ala Leu Cys Leu Phe Thr Pro Glu Asp Leu

85 90 95

Lys Ala Asp Arg Val Thr Glu Glu Val Pro Leu Asp Pro Leu Met Asn

100 105 110

Arg Thr Gly Asn Val Trp His Val Phe Ile Glu Gly Glu Leu His Asn

115 120 125

Met Leu Tyr Gly Tyr Arg Phe Asp Gly Thr Phe Ala Pro His Cys Gly

130 135 140

His Tyr Leu Asp Val Ser Asn Val Val Val Asp Pro Tyr Ala Lys Ala

145 150 155 160

Val Ile Ser Arg Gly Glu Tyr Gly Val Pro Ala Arg Gly Asn Asn Cys

165 170 175

Trp Pro Gln Met Ala Gly Met Ile Pro Leu Pro Tyr Ser Thr Phe Asp

180 185 190

Trp Glu Gly Asp Leu Pro Leu Arg Tyr Pro Gln Lys Asp Leu Val Ile

195 200 205

Tyr Glu Met His Leu Arg Gly Phe Thr Lys His Asp Ser Ser Asn Val

210 215 220

Glu His Pro Gly Thr Phe Ile Gly Ala Val Ser Lys Leu Asp Tyr Leu

225 230 235 240

Lys Glu Leu Gly Val Asn Cys Ile Glu Leu Met Pro Cys His Glu Phe

245 250 255

Asn Glu Leu Glu Tyr Ser Thr Ser Ser Ser Lys Met Asn Phe Trp Gly

260 265 270

Tyr Ser Thr Ile Asn Phe Phe Ser Pro Met Thr Arg Tyr Thr Ser Gly

275 280 285

Gly Ile Lys Asn Cys Gly Arg Asp Ala Ile Asn Glu Phe Lys Thr Phe

290 295 300

Val Arg Glu Ala His Lys Arg Gly Ile Glu Val Ile Leu Asp Val Val

305 310 315 320

Phe Asn His Thr Ala Glu Gly Asn Glu Asn Gly Pro Ile Leu Ser Phe

325 330 335

Lys Gly Val Asp Asn Thr Thr Tyr Tyr Met Leu Ala Pro Lys Gly Glu

340 345 350

Phe Tyr Asn Tyr Ser Gly Cys Gly Asn Thr Phe Asn Cys Asn His Pro

355 360 365

Val Val Arg Gln Phe Ile Val Asp Cys Leu Arg Tyr Trp Val Thr Glu

370 375 380

Met His Val Asp Gly Phe Arg Phe Asp Leu Ala Ser Ile Met Thr Arg

385 390 395 400

Gly Ser Ser Leu Trp Asp Pro Val Asn Val Tyr Gly Ala Pro Ile Glu

405 410 415

Gly Asp Met Ile Thr Thr Gly Thr Pro Leu Val Thr Pro Pro Leu Ile

420 425 430

Asp Met Ile Ser Asn Asp Pro Ile Leu Gly Gly Val Lys Leu Ile Ala

435 440 445

Glu Ala Trp Asp Ala Gly Gly Leu Tyr Gln Val Gly Gln Phe Pro His

450 455 460

Trp Asn Val Trp Ser Glu Trp Asn Gly Lys Tyr Arg Asp Ile Val Arg

465 470 475 480

Gln Phe Ile Lys Gly Thr Asp Gly Phe Ala Gly Gly Phe Ala Glu Cys

485 490 495

Leu Cys Gly Ser Pro His Leu Tyr Gln Ala Gly Gly Arg Lys Pro Trp

500 505 510

His Ser Ile Asn Phe Val Cys Ala His Asp Gly Phe Thr Leu Ala Asp

515 520 525

Leu Val Thr Tyr Asn Lys Lys Tyr Asn Leu Pro Asn Gly Glu Asn Asn

530 535 540

Arg Asp Gly Glu Asn His Asn Leu Ser Trp Asn Cys Gly Glu Glu Gly

545 550 555 560

Glu Phe Ala Arg Leu Ser Val Lys Arg Leu Arg Lys Arg Gln Met Arg

565 570 575

Asn Phe Phe Val Cys Leu Met Val Ser Gln Gly Val Pro Met Phe Tyr

580 585 590

Met Gly Asp Glu Tyr Gly His Thr Lys Gly Gly Asn Asn Asn Thr Tyr

595 600 605

Cys His Asp Ser Tyr Val Asn Tyr Phe Arg Trp Asp Lys Lys Glu Gln

610 615 620

Tyr Ser Glu Leu His Arg Phe Cys Cys Leu Met Thr Lys Phe Arg Lys

625 630 635 640

Glu Cys Glu Gly Leu Gly Leu Glu Asp Phe Pro Thr Ala Lys Arg Leu

645 650 655

Gln Trp His Gly His Gln Pro Gly Lys Pro Asp Trp Ser Glu Asn Ser

660 665 670

Arg Phe Val Ala Phe Ser Met Lys Asp Glu Arg Gln Gly Glu Ile Tyr

675 680 685

Val Ala Phe Asn Thr Ser His Leu Pro Ala Val Val Glu Leu Pro Glu

690 695 700

Arg Ala Gly Arg Arg Trp Glu Pro Val Val Asp Thr Gly Lys Pro Ala

705 710 715 720

Pro Tyr Asp Phe Leu Thr Asp Asp Leu Pro Asp Arg Ala Leu Thr Ile

725 730 735

His Gln Phe Ser His Phe Leu Tyr Ser Asn Leu Tyr Pro Met Leu Ser

740 745 750

Tyr Ser Ser Val Ile Leu Val Leu Arg Pro Asp Val

755 760

＜210＞ 9

＜211＞ 24

＜212＞ DNA

＜213＞ Artificial Sequence

＜220＞

＜223＞ primer

＜400＞ 9

aaaggcccaa tattatcctt tagg 24

＜210＞ 10

＜211＞ 31

＜212＞ DNA

＜213＞ Artificial Sequence

＜220＞

＜223＞ primer

＜400＞ 10

gccatttcaa ccgttctgaa gtcgggaagt c 31

＜210＞ 11

＜211＞ 2437

＜212＞ DNA

＜213＞ Triticum aestivum L.cv.Florida

＜220＞

＜221＞ CDS

＜222＞ (16)..(2301)

＜400＞ 11

gaattcggca cgagg ccg gcg ccg cgc ctg cga cgg tgg cgg ccc aat 48

Pro Ala Pro Arg Leu Arg Arg Trp Arg Pro Asn

1 5 10

gcg acg gcg ggg aag ggg gtc ggc gag gtc tgc gcc gcg gtt gtc gag 96

Ala Thr Ala Gly Lys Gly Val Gly Glu Val Cys Ala Ala Val Val Glu

15 20 25

gtg gcg acg aag gcc gag gat gag ggg gag gag gac gag ccg gtg gcg 144

Val Ala Thr Lys Ala Glu Asp Glu Gly Glu Glu Asp Glu Pro Val Ala

30 35 40

gag gac agg tac gcg ctc ggc ggc gcg tgc agg gtg ctc gcc gga atg 192

Glu Asp Arg Tyr Ala Leu Gly Gly Ala Cys Arg Val Leu Ala Gly Met

45 50 55

ccc acg ccg ctg ggc gcc acc gcg ctc gcc ggc ggg gtc aat ttc gcc 240

Pro Thr Pro Leu Gly Ala Thr Ala Leu Ala Gly Gly Val Asn Phe Ala

60 65 70 75

gtc tac tcc ggc gga gcc aca gcc gcg gcg ctc tgc ctc ttc acg cca 288

Val Tyr Ser Gly Gly Ala Thr Ala Ala Ala Leu Cys Leu Phe Thr Pro

80 85 90

gaa gat ctc aag gcg gat agg gtg acg gag gag gtt ccc ctt gac ccc 336

Glu Asp Leu Lys Ala Asp Arg Val Thr Glu Glu Val Pro Leu Asp Pro

95 100 105

ctg atg aat cgg act ggg aac gta tgg cat gtc ttc atc gaa ggc gag 384

Leu Met Asn Arg Thr Gly Asn Val Trp His Val Phe Ile Glu Gly Glu

110 115 120

ctg cag gac atg ctt tac ggg tac agg ttc gac ggc acc ttt gct cct 432

Leu Gln Asp Met Leu Tyr Gly Tyr Arg Phe Asp Gly Thr Phe Ala Pro

125 130 135

cac tgc ggg cac tac ctt gat gtt tcc aat gtc gtg gtg gat cct tat 480

His Cys Gly His Tyr Leu Asp Val Ser Asn Val Val Val Asp Pro Tyr

140 145 150 155

gct aag gca gtg ata agc cga ggg gag tat ggt gtt ccg gcg cgt ggt 528

Ala Lys Ala Val Ile Ser Arg Gly Glu Tyr Gly Val Pro Ala Arg Gly

160 165 170

aac aat tgc tgg cct cag atg gct ggc atg atc cct ctt cca tat agc 576

Asn Asn Cys Trp Pro Gln Met Ala Gly Met Ile Pro Leu Pro Tyr Ser

175 180 185

acg ttt gat tgg gaa ggc gac cta cct cta aga tat cct caa aag gac 624

Thr Phe Asp Trp Glu Gly Asp Leu Pro Leu Arg Tyr Pro Gln Lys Asp

190 195 200

ctg gta ata tat gag atg cac ttg cgt gga ttc acg aag cat gat tca 672

Leu Val Ile Tyr Glu Met His Leu Arg Gly Phe Thr Lys His Asp Ser

205 210 215

agc aat gta gaa cat ccc ggt act ttc att ggg gct gtg tcg aag ctt 720

Ser Asn Val Glu His Pro Gly Thr Phe Ile Gly Ala Val Ser Lys Leu

220 225 230 235

gac tat ttg aag gag ctt gga gtt aat tgt att gag tta atg ccc tgc 768

Asp Tyr Leu Lys Glu Leu Gly Val Asn Cys Ile Glu Leu Met Pro Cys

240 245 250

cat gag ttc aac gag ctg gag tac tca acc tct tct tcc aag atg aac 816

His Glu Phe Asn Glu Leu Glu Tyr Ser Thr Ser Ser Ser Lys Met Asn

255 260 265

ttt tgg gga tat tct acc ata aac ttc ttt tca cca atg acg aga tac 864

Phe Trp Gly Tyr Ser Thr Ile Asn Phe Phe Ser Pro Met Thr Arg Tyr

270 275 280

aca tca ggc ggg ata aaa aac tgt ggg cgt gat gcc ata aat gag ttc 912

Thr Ser Gly Gly Ile Lys Asn Cys Gly Arg Asp Ala Ile Asn Glu Phe

285 290 295

aaa act ttt gta aga gag gct cac aaa cgg gga att gag gtg atc ctg 960

Lys Thr Phe Val Arg Glu Ala His Lys Arg Gly Ile Glu Val Ile Leu

300 305 310 315

gat gtt gtc ttc aac cat aca gct gag ggt aat gag aat ggt cca ata 1008

Asp Val Val Phe Asn His Thr Ala Glu Gly Asn Glu Asn Gly Pro Ile

320 325 330

tta tca ttt agg ggg gtc gat aat act aca tac tat atg ctt gca ccc 1056

Leu Ser Phe Arg Gly Val Asp Asn Thr Thr Tyr Tyr Met Leu Ala Pro

335 340 345

aag gga gag ttt tat aac tat tct ggc tgt ggg aat acc ttc aac tgt 1104

Lys Gly Glu Phe Tyr Asn Tyr Ser Gly Cys Gly Asn Thr Phe Asn Cys

350 355 360

aat cat cct gtg gtt cgt caa ttc att gta gat tgt tta aga tac tgg 1152

Asn His Pro Val Val Arg Gln Phe Ile Val Asp Cys Leu Arg Tyr Trp

365 370 375

gtg acg gaa atg cat gtt gat ggt ttt cgt ttt gat ctt gca tcc ata 1200

Val Thr Glu Met His Val Asp Gly Phe Arg Phe Asp Leu Ala Ser Ile

380 385 390 395

atg acc aga ggt tcc agt ctg tgg gat cca gtt aac gtg tat gga gct 1248

Met Thr Arg Gly Ser Ser Leu Trp Asp Pro Val Asn Val Tyr Gly Ala

400 405 410

cca ata gaa ggt gac atg atc aca aca ggg aca cct ctt gtt act cca 1296

Pro Ile Glu Gly Asp Met Ile Thr Thr Gly Thr Pro Leu Val Thr Pro

415 420 425

cca ctt att gac atg atc agc aat gac cca att ctt gga ggc gtc aag 1344

Pro Leu Ile Asp Met Ile Ser Asn Asp Pro Ile Leu Gly Gly Val Lys

430 435 440

ctc gtt gct gaa gca tgg gat gca gga ggc ctc tat caa gta ggt caa 1392

Leu Val Ala Glu Ala Trp Asp Ala Gly Gly Leu Tyr Gln Val Gly Gln

445 450 455

ttc cct cac tgg aat gtt tgg tct gag tgg aat ggg aag tac cgg gac 1440

Phe Pro His Trp Asn Val Trp Ser Glu Trp Asn Gly Lys Tyr Arg Asp

460 465 470 475

att gtg cgt caa ttc att aaa ggc act gat gga ttt gct ggt ggt ttt 1488

Ile Val Arg Gln Phe Ile Lys Gly Thr Asp Gly Phe Ala Gly Gly Phe

480 485 490

gcc gaa tgt ctt tgt gga agt cca cac cta tac cag gca gga gga agg 1536

Ala Glu Cys Leu Cys Gly Ser Pro His Leu Tyr Gln Ala Gly Gly Arg

495 500 505

aaa cct tgg cac agt atc aac ttt gta tgt gca cac gat gga ttt aca 1584

Lys Pro Trp His Ser Ile Asn Phe Val Cys Ala His Asp Gly Phe Thr

510 515 520

ctg gct gat ttg gta aca tat aat aac aag tac aat tta cca aat ggg 1632

Leu Ala Asp Leu Val Thr Tyr Asn Asn Lys Tyr Asn Leu Pro Asn Gly

525 530 535

gag aac aac aga gat gga gaa aat cac aat ctt agc tgg aat tgt ggg 1680

Glu Asn Asn Arg Asp Gly Glu Asn His Asn Leu Ser Trp Asn Cys Gly

540 545 550 555

gag gaa gga gaa ttc gca aga ttg tct gtc aaa aga ttg agg aag agg 1728

Glu Glu Gly Glu Phe Ala Arg Leu Ser Val Lys Arg Leu Arg Lys Arg

560 565 570

cag atg cgc aat ttc ttt gtt tgt ctc atg gtt tct caa gga gtt cca 1776

Gln Met Arg Asn Phe Phe Val Cys Leu Met Val Ser Gln Gly Val Pro

575 580 585

atg ttc tac atg ggt gat gaa tat ggc cac aca aaa ggg ggc aac aac 1824

Met Phe Tyr Met Gly Asp Glu Tyr Gly His Thr Lys Gly Gly Asn Asn

590 595 600

aat aca tac tgc cat gat tct tat gtc aat tat ttt cgc tgg gat aaa 1872

Asn Thr Tyr Cys His Asp Ser Tyr Val Asn Tyr Phe Arg Trp Asp Lys

605 610 615

aaa gaa caa tac tct gac ttg cac cga ttc tgt tgc ctc atg acc aaa 1920

Lys Glu Gln Tyr Ser Asp Leu His Arg Phe Cys Cys Leu Met Thr Lys

620 625 630 635

ttc cgc aag gag tgc gag ggt ctt ggc ctt gag gat ttt cca acg gcc 1968

Phe Arg Lys Glu Cys Glu Gly Leu Gly Leu Glu Asp Phe Pro Thr Ala

640 645 650

gaa cgg ctg cag tgg cat ggt cat cag cct ggg aag cct gat tgg tct 2016

Glu Arg Leu Gln Trp His Gly His Gln Pro Gly Lys Pro Asp Trp Ser

655 660 665

gag aat agc cga ttc gtt gcc ttt tcc atg aaa gat gaa aga cag ggc 2064

Glu Asn Ser Arg Phe Val Ala Phe Ser Met Lys Asp Glu Arg Gln Gly

670 675 680

gag atc tat gtg gcc ttc aac acc agc cac tta ccg gcc gtt gtt gag 2112

Glu Ile Tyr Val Ala Phe Asn Thr Ser His Leu Pro Ala Val Val Glu

685 690 695

ctc ccg gag cgc aca ggg cgc cgg tgg gaa ccg gtg gtg gac aca ggc 2160

Leu Pro Glu Arg Thr Gly Arg Arg Trp Glu Pro Val Val Asp Thr Gly

700 705 710 715

aag cca gca cca tac gac ttc ctc act gac gac tta cct gat cgc gct 2208

Lys Pro Ala Pro Tyr Asp Phe Leu Thr Asp Asp Leu Pro Asp Arg Ala

720 725 730

ctc acc ata cac cag ttc tct cat ttc ctc aac tcc aac ctc tac ccc 2256

Leu Thr Ile His Gln Phe Ser His Phe Leu Asn Ser Asn Leu Tyr Pro

735 740 745

atg ctc agc tac tca tcg gtc atc cta gta ttg cgc cct gat gtt 2301

Met Leu Ser Tyr Ser Ser Val Ile Leu Val Leu Arg Pro Asp Val

750 755 760

tgagaggcg gatatacagt aaataatatg tatatatgta gtcctttggc gtattatcag 2360

tgtgcacaat tgctctattg ccaatgatct attcgatcca cagatacatg tgcaaaaaaa 2420

aaaaaaaaaa actcgag 2437

＜210＞ 12

＜211＞ 762

＜212＞ PRT

＜213＞ Triticum aestivum L.cv.Florida

＜400＞ 12

Pro Ala Pro Arg Leu Arg Arg Trp Arg Pro Asn Ala Thr Ala Gly Lys

1 5 10 15

Gly Val Gly Glu Val Cys Ala Ala Val Val Glu Val Ala Thr Lys Ala

20 25 30

Glu Asp Glu Gly Glu Glu Asp Glu Pro Val Ala Glu Asp Arg Tyr Ala

35 40 45

Leu Gly Gly Ala Cys Arg Val Leu Ala Gly Met Pro Thr Pro Leu Gly

50 55 60

Ala Thr Ala Leu Ala Gly Gly Val Asn Phe Ala Val Tyr Ser Gly Gly

65 70 75 80

Ala Thr Ala Ala Ala Leu Cys Leu Phe Thr Pro Glu Asp Leu Lys Ala

85 90 95

Asp Arg Val Thr Glu Glu Val Pro Leu Asp Pro Leu Met Asn Arg Thr

100 105 110

Gly Asn Val Trp His Val Phe Ile Glu Gly Glu Leu Gln Asp Met Leu

115 120 125

Tyr Gly Tyr Arg Phe Asp Gly Thr Phe Ala Pro His Cys Gly His Tyr

130 135 140

Leu Asp Val Ser Asn Val Val Val Asp Pro Tyr Ala Lys Ala Val Ile

145 150 155 160

Ser Arg Gly Glu Tyr Gly Val Pro Ala Arg Gly Asn Asn Cys Trp Pro

165 170 175

Gln Met Ala Gly Met Ile Pro Leu Pro Tyr Ser Thr Phe Asp Trp Glu

180 185 190

Gly Asp Leu Pro Leu Arg Tyr Pro Gln Lys Asp Leu Val Ile Tyr Glu

195 200 205

Met His Leu Arg Gly Phe Thr Lys His Asp Ser Ser Asn Val Glu His

210 215 220

Pro Gly Thr Phe Ile Gly Ala Val Ser Lys Leu Asp Tyr Leu Lys Glu

225 230 235 240

Leu Gly Val Asn Cys Ile Glu Leu Met Pro Cys His Glu Phe Asn Glu

245 250 255

Leu Glu Tyr Ser Thr Ser Ser Ser Lys Met Asn Phe Trp Gly Tyr Ser

260 265 270

Thr Ile Asn Phe Phe Ser Pro Met Thr Arg Tyr Thr Ser Gly Gly Ile

275 280 285

Lys Asn Cys Gly Arg Asp Ala Ile Asn Glu Phe Lys Thr Phe Val Arg

290 295 300

Glu Ala His Lys Arg Gly Ile Glu Val Ile Leu Asp Val Val Phe Asn

305 310 315 320

His Thr Ala Glu Gly Asn Glu Asn Gly Pro Ile Leu Ser Phe Arg Gly

325 330 335

Val Asp Asn Thr Thr Tyr Tyr Met Leu Ala Pro Lys Gly Glu Phe Tyr

340 345 350

Asn Tyr Ser Gly Cys Gly Asn Thr Phe Asn Cys Asn His Pro Val Val

355 360 365

Arg Gln Phe Ile Val Asp Cys Leu Arg Tyr Trp Val Thr Glu Met His

370 375 380

Val Asp Gly Phe Arg Phe Asp Leu Ala Ser Ile Met Thr Arg Gly Ser

385 390 395 400

Ser Leu Trp Asp Pro Val Asn Val Tyr Gly Ala Pro Ile Glu Gly Asp

405 410 415

Met Ile Thr Thr Gly Thr Pro Leu Val Thr Pro Pro Leu Ile Asp Met

420 425 430

Ile Ser Asn Asp Pro Ile Leu Gly Gly Val Lys Leu Val Ala Glu Ala

435 440 445

Trp Asp Ala Gly Gly Leu Tyr Gln Val Gly Gln Phe Pro His Trp Asn

450 455 460

Val Trp Ser Glu Trp Asn Gly Lys Tyr Arg Asp Ile Val Arg Gln Phe

465 470 475 480

Ile Lys Gly Thr Asp Gly Phe Ala Gly Gly Phe Ala Glu Cys Leu Cys

485 490 495

Gly Ser Pro His Leu Tyr Gln Ala Gly Gly Arg Lys Pro Trp His Ser

500 505 510

Ile Asn Phe Val Cys Ala His Asp Gly Phe Thr Leu Ala Asp Leu Val

515 520 525

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530 535 540

Gly Glu Asn His Asn Leu Ser Trp Asn Cys Gly Glu Glu Gly Glu Phe

545 550 555 560

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565 570 575

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580 585 590

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595 600 605

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610 615 620

Asp Leu His Arg Phe Cys Cys Leu Met Thr Lys Phe Arg Lys Glu Cys

625 630 635 640

Glu Gly Leu Gly Leu Glu Asp Phe Pro Thr Ala Glu Arg Leu Gln Trp

645 650 655

His Gly His Gln Pro Gly Lys Pro Asp Trp Ser Glu Asn Ser Arg Phe

660 665 670

Val Ala Phe Ser Met Lys Asp Glu Arg Gln Gly Glu Ile Tyr Val Ala

675 680 685

Phe Asn Thr Ser His Leu Pro Ala Val Val Glu Leu Pro Glu Arg Thr

690 695 700

Gly Arg Arg Trp Glu Pro Val Val Asp Thr Gly Lys Pro Ala Pro Tyr

705 710 715 720

Asp Phe Leu Thr Asp Asp Leu Pro Asp Arg Ala Leu Thr Ile His Gln

725 730 735

Phe Ser His Phe Leu Asn Ser Asn Leu Tyr Pro Met Leu Ser Tyr Ser

740 745 750

Ser Val Ile Leu Val Leu Arg Pro Asp Val

755 760

＜210＞ 13

＜211＞ 20

＜212＞ DNA

＜213＞ Artificial Sequence

＜220＞

＜223＞ primer

＜400＞ 13

gctttacggg tacaggttcg 20

＜210＞ 14

＜211＞ 18

＜212＞ DNA

＜213＞ Artificial Sequence

＜220＞

＜223＞ primer

＜400＞ 14

aattccccgt ttgtgagc 18

＜210＞ 15

＜211＞ 51

＜212＞ DNA

＜213＞ Artificial Sequence

＜220＞

＜223＞ primer

＜400＞ 15

gcggtacctc tagaaggaga tatacatatg gcggaggaca ggtacgcgct c 51

＜210＞ 16

＜211＞ 33

＜212＞ DNA

＜213＞ Artificial Sequence

＜220＞

＜223＞ primer

＜400＞ 16

gctcgagtcg actcaaacat cagggcgcaa tac 33

최근에 재생성 원료로서의 식물 구성성분에 기인한 중요성의 증가로 생명공학의 연구 목적 중 하나는 이들 식물 원료를 가공산업의 수요에 적합하게 하는 것에 두고 있다. 또한 재생성 원료를 가능한 한 많은 분야에 사용될 수 있도록 하기 위해서는 아주 다양한 물질이 생성되어야 한다.

유지 및 단백질을 제외하고 다당류는 식물 유래의 중요한 재생성 원료를 구성한다. 셀룰로오스를 제외하고 전분-이것은 고등식물에서 가장 중요한 저장 물질 중의 하나이다-은 다당류 중에서 중심적인 위치를 차지한다. 이와 관련하여 밀은 유럽공동체에서 총 전분생산율의 약 20%를 제공하기 때문에 가장 중요한 작물 중의 하나이다.

다당류 전분은 화학적으로 균일한 단위인 글루코스 분자의 중합체이다. 그러나 그것은 중합도, 글루코스 사슬의 분지발생율 및 그것의 사슬길이에 있어서 서로 다른 상이한 분자유형들의 매우 복잡한 혼합물이고, 게다가 그것은 유도체화, 예컨대 인산화될 수 있다. 따라서 전분은 균일한 원료를 구성하지 못한다. 특히, α-1,4-글리코시드로 연결된 글루코스 분자의 본질적으로 비분지된 중합체인 아밀로오스 전분은 다양한 분지를 갖는 글루코스 사슬의 복잡한 혼합물을 구성하는 아밀로펙틴 전분과 구별된다. 분지는 α-1,6-글리코시드 연결이 추가로 발생함으로써 발생된다. 밀에 있어서 아밀로오스 전분은 합성되는 전분의 약 11 내지 37%를 구성한다.

적합한 전분을 가장 광범위한 가능 범위의 공업적 수요를 위해 가장 광범위한 가능 방법으로 사용될 수 있게 하기 위해서는, 여러 가지 목적에 특히 잘 맞는 변형 전분을 합성할 수 있는 식물을 제공하는 것이 바람직하다. 그러한 식물을 제공하는 한가지 가능한 수단은 식물육종법을 사용하는 것이다. 그러나 밀은 특성상 배수체(사배체 및 육배체)이므로, 식물육종에 의해 영향력을 발휘하는 것은 매우 어려운 것으로 판명되고 있다. "찰"(아밀로스 없는) 밀은 자연발생 돌연변이체를 교차시킴으로써 불과 최근에야 생성되었다(Nakamura et al., Mol. Gen. Genet. 248(1995), 253-259).

식물육종법에 대한 대안은 전분 생성 식물을 재조합법에 의해 특이적으로 변형시키는 것이다. 그러나 전분 합성 및/또는 전분 변형에 관여하는 효소의 동정 및 특성화 그리고 이들 효소를 암호화하는 핵산 분자의 분리가 전제조건이 된다.

전분의 합성을 가져오는 생화학적 경로는 본질적으로 공지되어 있다. 식물 세포에서의 전분 합성은 색소체에서 일어난다. 광합성에 활성인 조직에서는 이들 색소체가 엽록체이고 광합성에 불활성인 전분 저장 조직에서는 이들 색소체가 백색체이다.

재조합법의 도움으로 식물에서 합성되는 전분의 분지도를 특이적으로 더 변경하는 것은 전분대사, 특히 전분 분자내로의 분지의 도입 또는 분해에 관여하는 효소를 암호화하는 DNA 서열의 동정을 여전히 요구한다.

전분 분자에 분지를 도입하는 소위 Q 효소 이외에 식물에서는 분지를 분해할 수 있는 효소가 생긴다. 이들 효소는 탈분지효소라고 불리고 그것의 기질특이성에 따라 다음의 3가지 군으로 나누어진다.

(a) 풀룰란 이외에 아밀로펙틴을 기질로서 이용하기도 하는 풀룰라나아제는 미생물, 예컨대 클레브시엘라(Klebsiella) 및 식물에서 발견된다. 식물에서는 이들 효소를 R 효소라고 부르기도 한다.

(b) 풀룰란을 이용하지 않지만 사실상 글리코겐 및 아밀로펙틴을 기질로서 이용하는 이소아밀라아제도 또한 미생물 및 식물에서 발견된다. 예컨대 이소아밀라아제는 옥수수(Manners ＆ Carbohydr. Res. 9 (1969), 107) 및 감자(Ishizaki et al., Agric. Biol. Chem. 47 (1983), 771-779)에 있어서 기재되었다.

(c) 아밀로-1,6-글루코시다아제는 포유동물 및 효모에 있어서 기재되어 있고 그렌즈덱스트린을 기질로서 이용한다.

사탕무에 있어서는 리(Li) 등(Plant Physiol. 98 (1992), 1277-1284)이 5가지의 엔도아밀라아제와 2가지의 엑소아밀라아제 이외에 플룰라나아제형의 탈분지효소를 한가지 발견할 수 있었을 뿐이다. 크기가 약 100kD이고 pH 최적치가 5.5인 이 효소는 엽록체에 국소화되어 있다. 시금치에 있어서도 역시 풀룰란을 기질로서 이용하는 탈분지효소가 기재되었다. 기질인 아밀로펙틴과의 반응에 대한 시금치 탈분지효소와 사탕무 탈분지효소 양자의 활성은 기질인 풀룰란과 비교하여 5배 더 낮다(Ludwig et al., Plant Physiol. 74 (1984), 856-861; Li et al., Plant Physiol. 98 (1992), 1277-1284).

농경학적으로 중요한 전분 저장 작물인 감자에 있어서는 탈분지효소의 활성이 홉슨(Hobson) 등(J. Chem. Soc., (1951), 1451)에 의해 연구되었다. Q 효소와 달리 이 효소는 사슬연장활성을 갖고 있지 않고 단지 α-1,6-글리코시드 결합을 가수분해함이 성공적으로 판명되었다. 그러나 이 효소를 아주 상세히 특성화하는 것은 아직까지 불가능하였다. 감자의 경우에는 탈분지효소의 정제방법 및 정제 단백질의 부분 펩티드 서열이 이미 제안되었다(WO 95/04826). 한편 시금치의 경우에는 탈분지효소의 정제 및 적합한 cDNA의 분리가 기재되었다(Renz et al., Plant Physiol. 108 (1995), 1342).

옥수수에 있어서는 지금까지는 한가지의 탈분지효소가 존재하는 것만이 문헌에 기재되었다 그것의 기질특이성 때문에 이 효소는 이소아밀라아제의 군에 속하는 것으로서 분류된다(예컨대 문헌[Hannah et al., Scientia Horticulturae 55 (1993), 177-197 또는 Garwood (1994) in Starch Chemistry and Technology, Whistler, R.L., BeMiller, J.N., Puschall, E.F.(eds.), Academic Press San Diego, New York, Boston, 25-86] 참조). 대응하는 돌연변이체는 "슈거리(sugary)"라고 불린다. 이 슈거리 유전자좌의 유전자는 최근에 클로닝되었다(문헌[James et al., Plant Cell 7 (1995), 417-429] 참조). 옥수수에 있어서 슈거리 유전자좌를 제외하고 탈분지효소 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 다른 유전자좌는 아직까지 공지되어 있지 않다. 또한 옥수수에서 다른 탈분지효소형이 생긴다는 지적은 현재까지는 전혀 없었다. 더 이상 어떤 탈분지효소 활성도 갖지 않는 옥수수 식물이 생성될 수 있다 해도 예컨대 아밀로펙틴 전분의 분지도를 확대하기 위해서는 옥수수에서 생기는 모든 탈분지효소형을 동정하고 대응 유전자 또는 cDNA 서열을 분리하는 것이 필요하다.

어떤 전분 저장 식물, 바람직하게는 곡물, 특히 밀을 변형 전분을 합성하도록 변경하는 추가의 가능한 수단을 제공하기 위해서는, 분지효소의 추가의 이소형을 암호화하는 DNA 서열을 각각의 경우에 동정하는 것이 필요하다.

본 발명은 식물의 전분 합성에 관여하는 밀 효소를 암호화하는 핵산 분자에 관한 것이다. 이 효소는 이소아밀라아제이다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 핵산 분자를 포함하는 벡터, 숙주 세포, 식물 세포 및 식물에 관한 것이다.

또한 본 발명에 따른 핵산 분자의 도입으로 인하여, 변경된 특성을 갖는 전분을 합성하는 트랜스제닉 식물의 생성방법이 기재되어 있다.

따라서 본 발명의 목적은 전분 합성에 관여하는 효소를 암호화하는 핵산 분자로서, 유전적으로 변형된 식물을 생성될 수 있게 하여 화학적 및/또는 물리적 특성이 변경된 식물 전분을 생성하는 것을 가능하게 하는 핵산 분자를 제공하는 것이다.

이 목적은 특허청구범위에 명시된 용도형태를 제공함으로써 달성된다.

따라서 본 발명은 밀 이소아밀라아제의 기능을 갖는 단백질, 바람직하게는 서열번호: 8 또는 12로 기재된 아미노산 서열에 의해 필수적으로 정의되는 단백질을 암호화하는 핵산 분자에 관한 것이다. 특히 본 발명은 서열번호: 1, 7 또는 11로 기재된 뉴클레오티드 서열 또는 그것의 일부를 포함하는 핵산 분자, 바람직하게는 서열번호: 1, 7 또는 11에 기재된 코딩영역 및 대응하는 리보뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자에 관한 것이다. 매우 특히 바람직한 것은 전사 및 적당하다면 상기 핵산 분자의 번역를 보장하는 조절요소를 더 포함하는 핵산 분자이다. 본 발명의 요지는 또한 본 발명에 따른 핵산 분자 중의 하나와 하이브리드화되는 핵산 분자이다.

본 발명의 요지는 또한 서열이 유전암호의 축퇴로 인하여 상기 분자의 뉴클레오티드 서열로부터 벗어난 밀 이소아밀라아제를 암호화하는 핵산 분자이다.

본 발명은 또한 상술한 서열 중 하나의 전부 또는 일부와 상보적인 서열을 갖는 핵산 분자에 관한 것이다.

본 발명의 명세서에서 사용되는 용어 "하이브리드화"는 종래의 하이브리드화 조건하, 바람직하게는 예컨대 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY]에 기재되어 있는 바와 같은 엄중한 조건하의 하이브리드화를 나타낸다.

"하이브리드화"는 다음 조건하에 특히 바람직하게 일어난다.

하이브리드화 완충액: 2×SSC; 10×덴하드트(Denhardt)용액(피콜(Fikoll) 400+PEG+BSA; 비 1:1:1); 0.1% SDS; 5mM EDTA; 50mM Na₂HPO₄; 250㎍/ml의 청어 정자 DNA; 50㎍/ml의 tRMA; 또는 0.2M 인산나트륨 완충액 pH 7.2; 1mM EDTA; 7% SDS

하이브리드화 온도 T=65 내지 70℃

세척 완충액: 0.2×SSC; 0.1% SDS

세척 온도: T=40 내지 75℃.

본 발명에 따른 핵산 분자와 하이브리드화되는 핵산 분자는 원칙적으로 그러한 단백질을 발현하는 모든 밀 유래의 이소아밀라아제를 암호화할 수 있다.

본 발명에 따른 핵산 분자와 하이브리드화되는 핵산 분자는 예컨대 밀 또는 밀 식물 조직의 게놈 라이브러리 또는 cDNA 라이브러리로부터 분리될 수 있다. 대안으로 이들은 재조합법에 의해 생성되거나 또는 화학적으로 합성될 수 있다.

이러한 핵산 분자의 동정 및 분리는 본 발명에 따른 분자 또는 이들 분자의 일부 또는 이들 분자의 역보체를 사용하여, 예컨대 표준 방법에 의한 하이브리드화에 의해 행해질 수 있다(예컨대 문헌[Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor, NY] 참조).

사용될 수 있는 하이브리드화 프로브는 예컨대 서열번호: 1, 7 또는 11로 기재된 뉴클레오티드 서열 또는 이들 서열의 일부를 반드시 또는 필수적으로 갖는 핵산 분자이다. 하이브리드화 프로브로서 사용되는 단편은 또한 관행 합성기술의 도움으로 제조된 합성단편일 수도 있는데 이것의 서열은 본 발명에 따른 핵산 분자의 것과 본질적으로 일치한다.

본 발명에 따른 핵산 분자와 하이브리드화되는 분자는 또한 본 발명에 따른 밀 이소아밀라아제를 암호화하는 상기 핵산 분자의 단편, 유도체 및 대립유전자 변이체를 포함한다. 단편은 기재한 단백질 중 하나를 암호화할 정도로 충분한 길이의 핵산 분자의 일부를 의미하는 것으로 이해해야 한다. 본 명세서에서 유도체라는 용어는 이들 분자의 서열이 하나 이상의 위치에서 상기 핵산 분자의 서열과 상이하고 이들 서열과 높은 상동도를 가짐을 의미한다. 상동이란 적어도 40%, 특히 적어도 60%의 서열동일성, 바람직하게는 80%보다 높고 특히 바람직하게는 90%보다 높은 서열동일성을 의미한다. 상기 핵산 분자에 대한 일탈이 결실, 치환, 삽입 또는 재조합에 의해 발생할 수도 있었다.

상동이란 또한 당해 핵산 분자 또는 이들에 의해 암호화되는 단백질 사이에 기능적 및/또는 구조적 상응성이 존재함을 의미한다. 상기 분자와 상동이고 이들 분자의 유도체를 구성하는 핵산 분자는 보통 동일한 생물학적 기능을 발휘하는 변형물을 구성하는 이들 분자의 변이물이다. 이들은 자연발생 변이물, 예컨대 다른 유기체로부터의 서열이거나, 또는 자연발생되었거나 또는 지정돌연변이유발에 의해 도입되었을 수 있는 돌연변이물일 수 있다. 또한 변이물은 합성으로 생성된 서열일 수도 있다. 대립유전자 변이체는 자연발생 변이체 및 합성으로 생성된 변이체 양자 모두이거나 또는 재조합 DNA 기술에 의해 제조된 변이체일 수 있다.

본 발명에 따른 핵산 분자의 여러 가지 변이체에 의해 암호화되는 이소아밀라아제는 일정한 특성을 공유한다. 이들 특성으로는 예컨대 효소활성, 분자량, 면역학적 반응성, 입체형태 등, 또는 그밖의 물리적 성질, 예컨대 겔전기이동에서의 이동 작용, 크로마토그래피 작용, 침강계수, 용해도, 분광특성, 전하특성, 안정성; pH 최적치, 온도 최적치 등을 들 수 있다.

본 발명에 따른 핵산 분자에 의해 암호화되는 단백질은 밀 이소아밀라아제이다. 이들 단백질은 이미 공지되어 있는 다른 식물종으로부터의 이소아밀라아제와 일정한 상동범위를 나타낸다.

본 발명에 따른 핵산 분자는 DNA 분자, 특히 cDNA 또는 게놈 분자일 수 있다. 또한 본 발명에 따른 핵산 분자는 예컨대 본 발명에 따른 핵산 분자의 전사로부터 생성될 수 있는 RNA 분자일 수 있다. 본 발명에 따른 핵산 분자는 예컨대 천연 공급원으로부터 얻어졌을 수도 있고 재조합기술에 의해 생성되거나 또는 합성되었을 수도 있다.

본 발명의 요지는 또한 본 발명에 따른 핵산 분자와 특이적으로 하이브리드화되는 올리고뉴클레오티드이다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 적어도 10, 특히 적어도 15, 특히 바람직하게는 적어도 50 뉴클레오티드의 길이를 갖는다. 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드는 본 발명에 따른 핵산 분자와 특이적으로 하이브리드화된다. 즉 다른 단백질, 특히 다른 이소아밀라아제를 암호화하는 핵산 서열과는 하이브리드화되지 않거나 또는 단지 낮은 정도로만 하이브리드화된다. 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드는 예컨대 PCR 반응을 위한 프라이머로서 또는 관련 유전자의 분리를 위한 하이브리드화 프로브로서 사용될 수 있다. 동등하게 이들은 안티센스 구조체의 구성성분 또는 적합한 리보자임을 암호화하는 DNA 분자의 구성성분일 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터, 특히 플라스미드, 코스미드, 파게미드, 바이러스, 박테리오파지 및 유전공학에 통상적으로 사용되는 다른 벡터에 관한 것이다. 이러한 벡터는 원핵생물 또는 진핵생물 세포, 바람직하게는 식물 세포의 형질전환에 적합하다.

본 벡터는 특히 바람직하게는 본 발명에 따른 핵산 분자를, 적당하다면 측면 조절영역과 함께 식물 세포의 게놈에 삽입할 수 있게 한다. 예로는 아그로박테리 매개 유전자전달에 사용될 수 있는 이원성 벡터가 있다. 바람직하게는 본 발명에 따른 핵산 분자를 센스 또는 안티센스 배향으로 삽입하는 것은 번역성 또는 적당하다면 비번역성의 RNA가 형질전환 원핵생물 또는 진핵생물 세포에서 확실히 합성되게 한다.

"벡터"라는 용어는 일반적으로 숙주 세포, 예컨대 DNA 또는 RNA 바이러스; 바이러스 단편; 조절요소의 부재 또는 존재하에 핵산을 세포에 전달하기에 적합할 수 있는 플라스미드 구조체; 또는 유리섬유 또는 예컨대 입자탄총법에 사용될 수 있는 그밖의 금속입자와 같은 지지물질에 단일가닥 또는 이중가닥 핵산 분자를 지정 전달할 수 있게 하는, 숙련자에게 공지된 적합한 보조물을 나타내나, 그것은 또한 화학적 또는 물리적 방법에 의해 세포에 직접 도입될 수 있는 핵산 분자를 포함할 수도 있다.

바람직한 구체예에서는 벡터내의 핵산 분자가 원핵생물 또는 진핵생물 세포에서의 번역성 RNA의 전사 및 합성을 보장하거나 또는 - 원한다면 - 비번역성 RNA의 합성을 보장하는 조절요소에 연결된다.

원핵생물 세포, 예컨대 대장균에서의 본 발명에 따른 핵산 분자의 발현은 이들 분자에 의해 암호화되는 효소의 효소활성를 보다 상세하게 특성화하기 위해 중요하다. 특히, 식물 세포에서 전분 합성에 관여하는 다른 효소의 부재하에 당해 효소에 의해 합성된 생성물을 특성화하는 것이 가능하다. 이것에 의해 당해 단백질이 식물 세포에서 전분 합성 동안 발휘하는 기능에 관하여 추론할 수 있게 된다.

더욱이 본 발명에 따른 핵산 분자에는 분자생물학의 관행 기술(예컨대 문헌[Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY] 참조)에 의해 여러 가지 유형의 돌연변이가 도입되어, 생물학적 성질이 변경될 수 있는 단백질이 합성될 수 있다. 한편 여기서는 코딩 DNA 서열의 5' 또는 3' 말단으로부터의 성공적인 결실로 핵산 분자를 생성하는 결실 돌연변이체의 생성이 가능하고 이것은 대응적으로 끝이 잘린 단백질의 합성으로 이어진다. 뉴클레오티드 서열의 5' 말단에서의 이러한 결실로 예컨대 아미노산 서열을 동정할 수 있게 되는데 이것은 효소가 색소체(전이 펩티드)로 전좌하기 때문이다. 이로써 당해 서열의 제거로 인하여 더 이상 색소체에 국소화되지 않고 시토졸에 국소화되거나, 또는 다른 신호서열의 첨가로 인하여 다른 대립물에 국소화되는 효소의 지정 생성이 가능하게 된다.

한편, 변경된 아미노산 서열이 예컨대 효소활성 또는 효소조절에 영향을 미치는 위치에서 점돌연변이를 도입하는 것도 또한 가능하다. 이런 식으로 예컨대 변경된 K_m값을 갖거나 또는 세포에 통상 존재하는 알로스테릭 조절 또는 공유결합 변형을 더 이상 받지 않는 돌연변이체를 생성하는 것이 가능하다.

더욱이 본 발명에 따른 단백질의 변경된 기질 특이성 또는 생성물 특이성을 갖는 돌연변이체를 생성하는 것이 가능하다. 더욱이 본 발명에 따른 단백질의 변경된 활성-온도 프로파일을 갖는 돌연변이체를 생성하는 것이 가능하다.

원핵생물 세포의 재조합변형을 수행하기 위해 본 발명에 따른 핵산 분자 또는 이들 분자의 일부는 DNA 서열을 재조합함으로써 돌연변이유발을 일어날 수 있게 하거나 또는 서열을 변경되게 할 수 있는 플라스미드에 도입될 수 있다. 표준 방법의 도움으로 염기교환을 수행하거나 또는 천연 또는 합성 서열을 첨가할 수 있다(참고: Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, USA). DNA 단편들을 서로 연결하기 위해 어댑터 또는 링커를 이 단편에 부착할 수도 있다. 더욱이 적합한 제한절단부위를 제공하거나 또는 여분의 DNA 또는 제한절단부위를 제거하는 조작을 이용할 수도 있다. 삽입, 결실 또는 치환이 적합한 경우에는 시험관내 돌연변이유발, 프라이머 수복, 제한 또는 라이게이션이 이용될 수 있다. 일반적으로 사용되는 분석방법은 서열분석, 제한분석 또는 다른 생화학 및 분자생화학의 방법이다.

추가의 구체예에 있어서 본 발명은 본 발명에 따른 상기 핵산 분자 또는 본 발명에 따른 벡터에 의해 형질전환된 숙주 세포, 특히 원핵생물 또는 진핵생물 세포에 관한 것이며, 또한 이와 같이 형질전환된 세포로부터 유래되고 본 발명에 따른 핵산 분자 또는 벡터를 포함하는 세포에 관한 것이다. 이들은 바람직하게는 진핵생물 또는 원핵생물 세포, 특히 식물 세포이다.

본 발명의 요지는 또한 본 발명에 따른 핵산 분자에 의해 암호화되고 재조합기술로 제조될 수 있는, 이소아밀라아제 활성을 갖는 단백질 및 그것의 제조방법이고, 이 방법에서는 본 발명에 따른 숙주 세포를 숙련자에게 공지되어 있고 본 발명에 따른 단백질의 합성을 가능하게 하는 적합한 조건하에 배양하고 계속해서 그것을 숙주 세포 및/또는 배양 배지로부터 분리한다.

본 발명에 따른 핵산 분자를 제공하면 식물의 전분대사를 재조합법의 도움으로 지정 방법으로 조정하고 그것을 변경시켜 결과의 합성이 물리화학적 성질, 예컨대 아밀로오스/아밀로펙티 비, 분지도, 평균 사슬길이, 인산염 함량, 젤라틴화 작용, 겔 또는 막 형성 특성, 전분과립 크기 및/또는 전분과립 형상이 공지 전분과 비교하여 변경된 변형 전분의 합성이 되도록 하는 것이 가능하게 된다.

따라서, 당해 이소아밀라아제의 활성을 증가시키기 위해 또는 천연적으로 이 효소를 발현하지 않는 세포에 그것들을 도입하기 위해 식물 세포에서 본 발명에 따른 핵산 분자를 발현시키는 것이 가능하다. 또한 본 발명에 따른 핵산 분자를 발현시키면 식물 세포에서 본 발명에 따른 이소아밀라아제의 천연 활성 레벨을 저하시키는 것이 가능하게 된다. 더욱이 더 이상 세포의 고유 조절대사를 받지 않거나 또는 온도-활성 프로파일 또는 기질 또는 생성물 특이성이 변경된 본 발명에 따른 이소아밀라아제를 얻기 위해 본 발명에 따른 핵산 분자를 숙련자에게 공지된 방법에 의해 변형시키는 것이 가능하다.

식물에서 본 발명에 따른 핵산 분자를 발현시키는 경우에는 합성된 단백질을 원칙적으로 식물 세포의 어떤 원하는 대립물에 국소화시키는 것이 가능하다. 특정 대립물내 국소화를 달성하기 위해서는 색소체내 국소화를 보장하는 서열이 결실되어야 하고 잔존하는 암호화영역은 필요하다면 당해 대립물내 국소화를 보장하는 DNA 서열에 연결되어야 한다. 그러한 서열은 공지되어 있다(예컨대 문헌[Braun et al., EMBO J. 11 (1992), 3219-3227; Wolter et al., Proc. Natl., Acad. Sci. USA 85 (1988), 846-859; Sonnewald et al., Plant J. 1 (1991), 95-106] 참조).

따라서 본 발명은 또한 본 발명에 따른 핵산 분자 또는 본 발명에 따른 벡터를 식물 세포의 게놈에 삽입하는, 본 발명에 따른 핵산 분자 또는 벡터에 의해 형질전환된 트랜스제닉 식물 세포의 생성방법, 본 발명에 따른 벡터 또는 핵산 분자에 의해 형질전환된 트랜스제닉 식물 세포, 및 이와 같이 형질전환된 세포로부터 유래된 트랜스제닉 식물 세포에 관한 것이다. 본 발명에 따른 세포는 본 발명에 따른 핵산 분자 또는 벡터를 하나 이상 포함하고, 이들은 바람직하게는 식물 세포에서의 전사를 보장하는 조절 DNA 요소, 특히 적당한 프로모터에 연결된다. 이러한 세포는 특히 이들 세포에서 자연발생하지 않는 본 발명에 따른 핵산 분자를 포함하는 사실에 의해, 또는 이러한 분자는 이것이 다른 방법으로는, 즉 상이한 게놈 환경하에서는 발생하지 않는 세포 게놈내 위치에 삽입되어 존재하는 사실에 의해, 이들 세포에서 자연발생하는 식물 세포와 구별될 수 있다. 더욱이 본 발명에 따른 이러한 트랜스제닉 식물 세포는 적당하다면 이 세포에서 자연발생하는 그러한 분자의 카피 이외에, 게놈에 안정하게 삽입된 본 발명에 따른 핵산 분자의 적어도 하나의 카피를 포함하는 사실에 의해 자연발생 식물 세포와 구별될 수 있다. 세포에 도입되는 핵산 분자(들)가 세포에서 이미 자연발생하고 있는 분자에 대한 추가 카피이면, 본 발명에 따른 식물 세포는 특히 이 추가 카피 또는 이들 추가 카피들이 이것 또는 이것들이 자연발생하지 않는 게놈내 위치에 국소화되는 사실에 의해 자연발생 식물 세포와 구별될 수 있다. 이것은 예컨대 서던블롯분석의 도움으로 검사할 수 있다.

식물 게놈에 도입된 본 발명에 따른 핵산 분자가 식물 세포와 이종이면, 본 트랜스제닉 식물 세포는 본 발명에 따른 핵산 분자의 전사체를 나타내고 이것은 숙련자에게 공지된 방법, 예컨대 노던블롯분석에 의해 간단한 방식으로 검출될 수 있다.

도입된 본 발명에 따른 핵산 분자가 식물 세포와 상동이면, 본 발명에 따른 세포는 예컨대 본 발명에 따른 핵산 분자의 추가 발현에 의거하여 자연발생 세포와 구별될 수 있다. 본 트랜스제닉 식물 세포는 바람직하게는 본 발명에 따른 핵산 분자의 전사체를 보다 많이 포함한다. 이것은 예컨대 노던블롯분석에 의해 검출될 수 있다. 본 명세서에서 "보다 많다"란 대응하는 비형질전환 세포보다 바람직하게는 적어도 10% 더 많고, 바람직하게는 적어도 20% 더 많고, 특히 바람직하게는 적어도 50% 더 많은 전사체를 포함함을 의미한다. 더욱이 이 세포는 바람직하게는 본 발명에 따른 단백질 활성의 상응하는 증가 또는 감소를 나타낸다(적어도 10%, 20% 또는 50%). 본 트랜스제닉 식물 세포는 숙련자에게 공지된 기술에 의해 비손상 식물로 재생될 수 있다.

본 발명의 또 하나의 요지는 본 발명에 따른 하나 이상의 핵산 분자 또는 벡터를 식물 세포의 게놈에 삽입하고, 이 식물 세포로부터 완전한 식물을 재생하는, 트랜스제닉 식물의 재생방법이다. 본 발명의 요지는 또한 상기 트랜스제닉 식물 세포를 포함하는 식물이다. 원칙적으로 트랜스제닉 식물은 모든 종의 식물, 즉 외떡잎식물 뿐만 아니라 쌍떡잎식물일 수도 있다. 이들은 바람직하게는 유용 식물, 되도록이면 전분 합성 또는 전분 저장 식물, 특히 바람직하게는 호밀, 보리귀리, 밀, 수수 및 기장, 사고, 옥수수, 벼, 완두콩, 알이 굵은 완두콩(marrowfat pea), 카사바, 감자, 토마토, 지방종자 평지, 콩, 삼, 아마, 해바라기, 동부 또는 칡뿌리, 특히 밀, 옥수수, 벼 및 감자이다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 식물의 번식물, 예컨대 과일, 종자, 덩이줄기, 근경, 묘목, 삽수, 칼리, 원형질체, 세포배양물 등에 관한 것이다.

본 발명은 또한 본 발명에 따른 상기 식물 및/또는 이러한 식물의 전분 저장 부분으로부터 변형 전분을 추출하는 단계를 포함하는 변형 전분의 제조방법에 관한 것이다.

식물 또는 식물의 전분 저장 부분, 특히 밀로부터 전분을 추출하는 방법은 숙련자에게 공지되어 있다(비고: 예컨대 엑코프(Eckhoff) 등(Cereal Chem. 73 (1996) 54-57); 전분: Chemistry and Technology(Eds.: Whistler, BeMiller and Paschall (1994), 2nd Edition, Academic Press Inc. London Ltd; ISBN 0-12-746270-8; 예컨대 다음을 참조: XII장 412-468면: 옥수수 및 수수 전분: 제조법; 왓슨(Watson); XIII장, 469-479면; 타피오카, 칡뿌리 및 사고 전분: 제조법; 코르비실리(Corbishley) 및 밀러(Miller); XIV장, 479-490페이지: 감자 전분: 제조법 및 용도; 미치(Mitch); XV장, 491-506페이지: 밀 전분: 제조법, 변형 및 용도; 나이트(Knight) 및 오슨(Oson); XVI장, 507-528페이지: 쌀 전분: 제조법 및 용도; 로머(Rohmer) 및 클렘(Klem)). 식물 재료로부터 전분을 추출하는 방법에 통상 사용되는 장치는 분리기, 디캔터, 하이드로사이클론, 스프레이건조기 및 유동층건조기이다.

본 발명에 따른 핵산 분자의 발현으로 인하여 본 발명에 따른 트랜스제닉 식물 세포 및 식물은 야생형 식물에서 합성되는 전분과 비교하여 물리화학적 성질, 예컨대 아밀로오스/아밀로펙틴 비, 분지도, 평균 사슬길이, 인산염 함량, 젤라틴화 작용, 전분과립 크기 및/또는 전분과립 형상이 변경된 전분을 합성한다. 특히 이러한 전분은 공지 전분과 비교하여 이 전분으로부터 만들어지는 겔의 점도 및/또는 막 또는 겔 형성 특성에 대하여 변경될 수 있다.

본 발명의 요지는 또한 본 발명에 따른 식물 세포 및 식물 그리고 그것의 번식물로부터 얻을 수 있는 전분 및 본 발명에 따른 상기 방법에 의해 얻을 수 있는 전분이다.

또한 본 발명에 따른 핵산 분자의 도움으로, 본 발명에 따른 단백질의 활성이 감소된 식물 세포 및 식물을 생성하는 것이 가능하다. 이것은 또한 야생형 식물 세포로부터의 전분과 비교하여 변경된 화학적 및/또는 물리적 특성을 갖는 전분의 합성으로 이어진다.

따라서 본 발명의 추가의 요지는 또한 이소아밀라아제의 활성이 비형질전환 세포와 비교하여 감소된 본 발명에 따른 핵산 분자를 포함하는 트랜스제닉 식물 세포이다.

이소아밀라아제의 활성이 감소된 식물 세포는 예컨대 본 발명에 따른 핵산 분자를 사용하여 숙련자에게 공지된 방법으로 적당한 안티센스 RNA, 공동억제효과를 달성하기 위한 센스 RNA를 발현시킴으로써 또는 이소아밀라아제를 암호화하는 전사체를 특이적으로 절단하는 적합하게 구성된 리보자임를 발현시킴으로써 얻어질 수 있다(비고: 조르겐센(Jorgensen) 등(Trends Biotechnol. 8 (1990), 340-344), 니벨(Niebel) 등(Curr. Top. Microbiol. Immunol. 197 (1995), 91-103), 플라벨(Flavell) 등(Curr. Top. Microbiol. Immunol. 197 (1995), 43-46), 플라퀴(Plaqui) 및 바우체렛(Vaucheret)(Plant. Mol. Biol. 29 (1995), 149-159), 바우체렛 등(Mol. Gen. Genet, 248 (1995), 311-317), 데 보른(de Borne) 등(Mol. Gen. Genet, 243 (1994), 613-621)).

본 발명에 따른 이소아밀라아제의 활성을 감소시키기 위해서는 식물 세포에서 그것을 암호화하는 전사체의 수를, 예컨대 안티센스 RNA를 발현시킴으로써 감소시키는 것이 바람직하다.

한편, 여기서는 존재할 수 있는 어떤 측면 서열, 아니면 코딩 서열의 일부만을 포함하는 DNA 분자를 포함하여, 본 발명에 따른 단백질을 암호화하는 서열의 전부를 포함하는 DNA 분자를 사용하는 것이 가능하고, 이들 부분은 세포에서 안티센스 효과를 내도록 충분히 긴 것이 필요하다. 일반적으로 길이가 500bp를 넘는 특정 서열에서 효과적인 안티센스 저해를 위해서는 최소길이 15bp 이하, 바람직하게는 길이 100-150bp의 서열이 사용될 수 있다. 보통은 500bp보다 짧은 DNA 분자, 바람직하게는 2500bp보다 짧은 서열이 사용된다.

또한 본 발명에 따른 DNA 분자의 서열과 높은 상동도를 나타내나 완전히 동일하지는 않은 DNA 서열의 사용도 가능하다. 최소 상동성은 약 65%를 초과한다. 95 내지 100%의 상동성을 갖는 서열을 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 요지는 또한 본 발명에 따른 세포 또는 식물로부터 및/또는 이러한 식물의 전분 저장 부분으로부터 변형 전분을 추출하는 단계를 포함하는 변형 전분의 제조방법이다.

본 발명의 요지는 또한 본 발명에 따른 세포 또는 식물 및 그것의 번식물 또는 그것의 일부로부터 얻어질 수 있는 전분, 및 본 발명에 따른 방법으로 얻어질 수 있는 전분이다.

본 발명에 따른 전분은 숙련자에게 공지된 방법으로 변형될 수 있고 그것의 변형 또는 비변형 형태로 식품 또는 비식품 부문에서의 다양한 용도에 적합하다.

원칙적으로 본 발명에 따른 전분의 가능 용도는 중요한 두가지 부문으로 나누어질 수 있다. 한가지 부문에는 효소적 또는 화학적 방법으로 얻어지는 전분의 가수분해물, 주로 글루코스 및 글루칸 단위가 포함된다. 이들은 추가의 화학적 변형 및 발효와 같은 가공을 위한 출발물질로서 사용된다. 비용을 감소시키기 위해 실행할 수 있는 것은 가수분해방법의 단순화 및 경제적 설계이다. 이것은 현재는 본질적으로 아밀로글루코시다아제를 사용하여 효소적으로 진행되고 있다. 실행가능한 것은 보다 적은 효소를 사용함으로써 경제적으로 절약하는 것이다. 이것은 전분의 구조를 변경시킴으로써, 예컨대 과립의 표면적, 예컨대 보다 낮은 분지도로 인한 보다 양호한 분해력 또는 사용되는 효소에 대한 접근을 제한하는 입체구조를 증가시킴으로써 초래될 수 있었다.

본 발명에 따른 전분이 그것의 중합체구조로 인하여 소위 천연 전분으로서 사용될 수 있는 다른 부문은 2가지의 적용분야로 더 나누어질 수 있다.

1. 식품 산업

전분은 다수의 식품에 대한 전통적인 첨가제이고 그것의 기능은 본질적으로 수성 첨가제를 결합하거나 또는 점도 증가, 아니면 겔화 증가를 야기하는 것이다. 중요한 특성은 유동성, 수착 특성, 팽창 온도, 젤라틴화 온도, 점도, 증점력, 전분 용해도, 투명도 및 겔구조, 열안정성, 전단안정성, 산에 대한 안정성, 노화되는 경향, 막형성능, 동결해동 안정정, 염용액에서의 점도안정성, 분해력 및 무기 또는 유기 이온과 착체를 형성하는 능력이다.

2. 비식품 산업

이 큰 부문에서는 전분을 다양한 제조공정을 위한 보조제로서 또는 공업 제품의 첨가제로서 사용할 수 있다. 전분을 보조제로서 사용하는 경우에는 특히 종이 및 판지 산업을 언급해야 한다. 전분은 지연 용도(고체를 유지)를 위해, 충전제 입자 및 미세분을 결합시키기 위해, 스티프너로서 그리고 탈수를 위해 주로 작용한다. 더욱이 스티프니스, 강도, 소리, 촉감, 광택, 평활도, 결합강도 및 표면의 유리한 성질이 이용된다.

2.1. 종이 및 판지 산업

제지공정에서는 4가지 적용분야, 즉 표면, 코팅, 저장 및 분무를 구별해야 한다. 표면처리와 관련하여 전분에 요구되는 것은 본질적으로 높은 백색도, 적당한 점도, 높은 점도안정성, 양호한 막형성 및 낮은 분진형성이다. 코팅에 사용할 때는 고형분 함량, 적합한 점도, 높은 결합력 및 높은 안료친화성이 중요한 역할을 한다. 저장물에 대한 첨가제로서 사용할 때 중요한 것은 신속하고 균일하며 손실 없는 분배, 높은 기계적 강도 및 종이 웨브의 완전한 유지이다. 전분을 분무 부문에 사용하면 역시 적당한 고형분 함량, 높은 점도 및 높은 결합력이 중요하다.

2.2. 접착제 산업

전분에 대한 하나의 중요한 적용분야는 접착제 산업이고, 여기서는 잠재적 용도를 4가지 소부문, 즉 순수 전분 페이스트로서 사용하는 것, 특수 화학약품으로 처리된 전분 페이스트에서 사용하는 것, 전분을 합성 수지 및 중합체 분산액에 대한 첨가제로서 사용하는 것 및 전분을 합성 접착제용 증량제로서 사용하는 것으로 나눌 수 있다. 골판지 제조, 종이 봉지 및 가방의 제조, 종이와 알루미늄의 복합재료 제조, 상자 제조 및 엔벨로프, 스탬프 등을 위한 고무 접착제 부문에서는 90%의 전분 기재 접착제가 사용된다.

2.3. 섬유 산업 및 섬유 보호제품 산업

보조제 및 첨가제로서의 전분에 대한 중요한 적용분야는 섬유 및 섬유 보호제품의 제조 부문이다. 섬유 산업에서는 다음의 4가지 적용분야를 구별해야 한다. 즉 전분을 사이징제, 즉 짜는 동안 가해지는 인장력으로부터의 보호로서의 평활화 작용을 완화 및 강화하기 위한 보조제 및 짜는 동안 내마모성을 증가시키기 위한 보조제로서 사용하는 것, 전분을 특히 표백, 염색 등과 같은 품질을 감소시키는 전처리후의 섬유마무리제로서 사용하는 것, 전분을 염료 페이스트의 제조에서 배어나오는 것을 방지하기 위해 증점제로서 사용하는 것, 및 전분을 실을 꿰매기 위한 광택제에 대한 첨가제로서 사용하는 것으로 구별해야 한다.

2.4. 구조재료 산업

네 번째 적용분야는 전분을 구조재료의 첨가제로서 사용하는 것이다. 한 예는 석고 플라스터보드의 제조이고, 여기서는 석고 슬러리에 혼합된 전분을 물로 젤라틴화하여 석고 코어의 표면에 확산시키고 거기서 그 코어에 판지를 결합한다. 하나의 적용분야는 렌더링섬유 및 광섬유에 대한 혼합물이다. 쉽게 혼합되는 콘크리트의 경우에는 전분제품이 결합을 지연시키기 위해 사용된다.

2.5. 토양 안정화

전분제품의 또 하나의 시장은 토양을 인공적으로 변형시킬 때 물로부터 토양입자를 임시로 보호하기 위해 사용되는 토양 안정화제의 제조이다. 현재의 지식에 따르면 전분과 중합체 에멀젼의 제품조합은 그것의 침식 및 크러스터 감소 효과와 관련하여 이전에 사용된 제품과 같으나 훨씬 덜 비싸다.

2.6. 작물보호제품 및 비료에서의 용도

전분을 사용하는 한가지 적용분야는 제품의 특정 성질을 변경하기 위한 작물보호제품이다. 따라서 전분은 작물보호제품 및 비료의 젖음성을 개선하기 위해, 활성 성분의 제어방출을 위해, 액상의 휘발성 및/또는 악취를 풍기는 활성 성분을 미세결정성의 안정하고 형태를 이루는 물질로 바꾸기 위해, 비상용성 화합물을 혼합하기 위해 그리고 분해를 감소시킴으로써 작용 기간을 연장시키기 위해 사용될 수 있다.

2.7. 약학, 의학 및 화장품 산업

또 하나의 적용분야는 약학, 의학 및 화장품 산업 부문이다. 약학 산업에서는 전분을 정제용 결합제로서 또는 이 결합제를 캅셀에서 희석하기 위해 사용할 수 있다. 더욱이 전분은 삼킨 후 유체를 흡수하여 활성 성분이 유리될 정도로 단시간내에 팽창하기 때문에 정제붕괴제로서 사용될 수 있다. 의학적 윤활 분말 및 유상 분말은 품질상의 이유로 전분을 기재로 한다. 화장품 부문에서는 전분이 예컨대 방향물질 및 살리실산과 같은 분말 첨가제의 담체로서 사용된다. 전분의 비교적 큰 적용분야는 치약이다.

2.8. 전분의 석탄 및 연탄으로의 첨가

전분의 한가지 적용분야는 석탄 및 연탄에 대한 첨가제로서이다. 전분의 첨가에 의해 석탄은 많은 양으로 응집되거나 또는 연탄화되어 연탄의 조기 분해를 방지할 수 있다. 구운 석탄의 경우에는 전분 첨가량이 4 내지 6%이고, 열석탄의 경우에는 0.1 내지 0.5%이다. 또한 전분은 석탄 또는 연탄에 가해질 때 유해물질의 방출을 현저하게 감소시킬 수 있기 때문에 결합제로서 중요성을 얻고 있다.

2.9. 광석 슬릭 및 석탄 슬릿 가공

또한 전분은 광석 슬릭 및 석탄 슬릿 가공 부문에서 응결제로서 사용될 수 있다.

2.10. 주조 보조제

추가의 적용분야는 주조 보조제에 대한 첨가제로서이다. 다양한 주조공정은 결합제로 처리된 모래로 제조된 코어를 필요로 한다. 요즘 지배적으로 사용되고 있는 결합제는 변형 전분으로 처리되고, 대개의 경우에는 팽창성 전분으로 처리된 벤토나이트이다. 전분을 첨가하는 목적은 유동성을 증가시키고 결합력을 개선하는 것이다. 더욱이 이 팽창성 전분은 예컨대 냉각수분산가능하고 재수화가능하고 모래와 쉽게 혼화가능하고 물결합용량이 높을 것과 같은, 제조공학의 다른 요구를 충족할 수 있다.

2.11. 고무 산업에서의 용도

고무 산업에서는 전분이 기술적 및 시각적 품질을 개선하기 위해 사용된다. 그 이유는 표면광택의 개선, 감촉 및 외관의 개선(이를 위해 전분을 냉각경화전에 고무물질의 점성 고무질 표면에 뿌린다) 및 고무의 인쇄성 개선이다.

2.12. 가죽 대용품의 제조

변형 전분은 또한 가죽 대용품의 제조를 위해 판매될 수도 있다.

2.13. 합성 중합체의 전분

중합체 부문에서는 다음의 적용분야가 고려될 수 있다. 즉 가공공정에서의 전분분해생성물의 사용(전분은 충전제로서만 작용하고 합성 중합체와 전분 사이에 직접적인 결합은 없다) 또는 대안으로 중합체 제조에서의 전분분해생성물의 사용(전분과 중합체는 안정한 결합을 형성한다)이 고려될 수 있다.

전분을 순수 충전제로서 사용하는 것은 활석과 같은 다른 물질과 비교하여 경쟁적이지 않다. 그러나 이것은 전분의 특정 성질이 효과를 내고 이로써 최종제품의 특성 범위를 현저하게 변경할 때는 다르다. 이것의 예로는 전분제품을 폴리에틸렌과 같은 열가소성 물질의 가공에 사용하는 것이 있다. 여기서는 전분 및 합성 중합체를 공동발현에 의해 1:1의 비로 조합하여 마스터 배치를 얻고, 이것으로부터 과립상 폴리에틸렌과 함께 종래의 가공기술을 사용하여 여러 가지 제품을 제조한다. 폴리에틸렌 필름에 전분을 사용함으로써, 중공 몸체의 경우 물질 투과성 개선, 수증기 투과성 개선, 정전기방지작용 개선 및 수성 잉크에 의한 인쇄성 개선이 달성될 수 있다.

또 하나 가능한 것은 전분을 폴리에탄 발포체에 사용하는 것이다. 전분 유도체의 채택 및 가공공학의 최적화에 의해 합성 중합체와 전분의 히드록실기 사이의 반응을 지정 방법으로 제어하는 것이 가능하다. 이 때문에 전분의 사용으로 인하여 다음 범위의 성질을 갖는 폴리에탄 필름이 얻어진다. 즉 열팽창계수가 감소하고, 수축작용이 감소하고, 온도-장력작용이 개선되고, 물의 흡수를 변경시키지 않으면서 수증기 투과성이 증가하고, 인화성이 감소하며 궁극적 인장강도가 감소하고, 연소성 부분이 적하하여 형성되지 않고, 할로겐을 함유하지 않고, 아니면 노화가 감소한다. 여전히 존재하는 단점은 인쇄성 감소 및 충격강도 감소이다.

현재는 제품개발이 더 이상 필름에 한정되지 않는다. 전분 함량이 50%를 넘는 포트, 슬래브 및 접시와 같은 고체 중합체 제품도 또한 제조될 수 있다. 더욱이 전분/중합체 혼합물은 생물분해성이 훨씬 더 높으므로 이로운 것으로 여겨진다.

전분 그래프트 중합체는 그것의 극히 높은 물결합능 때문에 대단히 중요해져 왔다. 이들은 다음의 자유라디칼 메카니즘의 원리로 그래프트된, 합성 단량체의 측면 격자 및 전분 골격과의 생성물이다. 현재 구입가능한 전분 그래프트 중합체는 높은 점도와 함께 겸비되는 전분 g당 물 1000g 이하의 보다 양호한 결합유지능에 의해 구별된다. 이들 초흡수제의 적용분야는 최근에 확대되어 왔고 위생학 부문, 기저귀 및 패드와 같은 제품 및 농업 부문, 예컨대 종자피복이다.

신규하고 유전학적으로 변형된 전분의 적용에 결정적인 것은 한편으로는 구조, 수분 함량, 단백질 함량, 지질 함량, 섬유 함량, 회분/인산염 함량, 아밀로오스/아밀로펙티 비, 분자량분포, 분지도, 과립크기 및 과립형상 그리고 결정화도이고, 다른 한편으로는 또한 유동 및 흡수 작용, 젤라틴화, 온도, 점도, 염용액에서의 점도안정성, 증점력, 용해력, 겔구조 및 겔투명도, 열안정성, 전단안정성, 산에 대한 안정성, 노화되는 경향, 겔형성, 동결해동 안정성, 복합체 형성, 요오드결합, 막형성, 접착력, 효소안정성, 분해력 및 반응성의 특징에 영향을 미치는 특성이다.

재조합법에 의한 변형 전분의 제조는 한편으로는 식물로부터 유래되는 전분의 성질을, 화학적 또는 물리적 가공에 의한 다른 변형이 더 이상 요구되지 않도록 변경할 수 있다. 다른 한편으로는, 재조합법에 의해 변경된 전분에 추가의 화학적 변형을 실시할 수 있고, 이것은 상기 적용분야 중 일부에 대한 품질 개선으로 이어진다. 이들 화학적 변형은 원칙적으로 공지되어 있다. 이들 변형은 특히 열처리, 유기 또는 무기산에 의한 처리, 산화 및 에스테르화에 의한 변형이고, 이것은 예컨대 인산 전분, 질산 전분, 황산 전분, 크산탄산 전분, 아세트산 전분 및 시트르산 전분을 형성하게 된다. 더욱이 강산 존재하에 1가 또는 다가 알코올을 전분 에테르의 제조에 사용하여 전분 알킬에테르, O-알킬에테르, 히드록시알킬에테르, O-카르복시메틸에테르, N-함유 전분 에테르, P-함유 전분 에테르, S-함유 전분 에테르, 가교 전분 또는 전분 그래프트 중합체를 생성할 수 있다.

본 발명에 따른 전분의 바람직한 용도는 한편으로는 포장재료 및 일회용품의 제조이고, 다른 한편으로는 식품 또는 식품 전구체로서이다.

본 발명에 따른 핵산 분자를 식물 세포에서 센스 또는 안티센스 배향으로 발현시키기 위해서는 그것을 식물 세포에서의 전사를 보장하는 조절 DNA 요소에 연결시킨다. 이들 요소로는 특히 프로모터, 엔핸서 및 종료암호를 들 수 있다. 일반적으로는 식물 세포에서 활성인 모든 프로모터가 발현에 적합하다.

프로모터는 특정 식물발달 시점에서 또는 외부인자에 의해 결정되는 시점에서 특정 조직에서만 발현이 일어나도록 선택될 수 있다. 식물에 대해서는 프로모터가 상동성이거나 또는 이종성일 수 있다. 적합한 프로모터의 예로는 구조적 발현을 위한 콜리플라워 모자이크 바이러스 35S RNA 프로모터 및 옥수수 우비퀴틴 프로모터, 덩이줄기 특이적 발현을 위한 파타틴 프로모터 B33(Rocha-Sosa et al., EMBO J. 8 (1989), 23-29) 또는 광합성에 활성인 조직에서만 발현을 보장하는 프로모터, 예컨대 ST-LS1 프로모터(Stockhaus et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), 7943-7947; Stockhaus et al., EMBO J. 8 (1989), 2445-2451) 또는 내배유 특이적 발현을 위한 프로모터, 밀 AMG 프로모터, USP 프로모터, 파세올린 프로모터 또는 옥수수 제인 유전자로부터의 프로모터가 있다.

전사를 올바르게 종결하고 전사체에 폴리-A 꼬리를 첨가하는 역할을 하며 전사체를 안정화시키는 기능을 가지는 것으로 여겨지는 종결서열도 또한 존재할 수 있다. 이러한 요소는 문헌(비고: Gielen et al., EMBO J. 8(1989), 23-29)에 기재되었고 요구에 따라 교체가능하다.

본 발명은 밀 이소아밀라아제의 기능을 갖는 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 제공한다. 본 발명에 따른 핵산 분자는 전분 생합성에서의 기능적 동정이 가능한 상기 효소의 제조, 및 재조합기술에 의해 변경된 식물의 생성을 가능하게 하고, 상기 효소의 활성은 변경되고 따라서 그와 같이 변형된 식물 세포에서는 구조가 변경되고 물리화학적 성질이 변경된 전분이 합성될 수 있게 된다.

원칙적으로 본 발명에 따른 핵산 분자는 또한 본 발명에 따른 이소아밀라아제의 활성이 증가 또는 감소하고 동시에 전분 합성에 관여하는 다른 효소의 활성이 변경된 식물을 생성하는데 사용될 수 있다. 식물내의 이소아밀라아제의 활성을 변경하면 변경된 구조를 갖는 전분이 합성된다. 더욱이 이소아밀라아제 또는 적합한 안티센스 구조체를 암호화하는 핵산 분자는 내인성 전분 신타아제 또는 분지효소의 합성이 이미 저해된 식물세포에 도입될 수 있다(예컨대 WO 92/14827 또는 문헌[Shannon and Garwood, 1984, in Whistler, BeMiller and Paschall, Starch: Cemistry and Technology, Academic Press, London, 2nd Edition: 25-86]에 기재되어 있는 바와 같음).

형질전환 식물에서 전분 생합성에 관여하는 몇가지 효소의 합성을 저해하고자 한다면, 형질전환은 당해 효소를 적당한 프로모터의 제어하에 안티센스 배향으로 암호화하는 몇 개의 영역을 동시에 포함하는 DNA 분자를 수반할 수 있다. 여기서는 각 서열을 그 자체의 프로모터의 제어하에 있게 하거나 또는 서열을 결합프로모터에 의해 융합물로서 전사되게 하거나 또는 결합프로모터의 제어하에 있게 하는 것이 가능하다. 마지막에 언급한 대안이 일반적으로 바람직한데, 이 경우에는 당해 단백질의 합성이 동일한 정도로 대략 저해되어야 하기 때문이다. 그러한 구조체에 사용되는 각 코딩영역의 길이에 관해서는, 안티센스 구조체의 생성에 대하여 위에서 언급한 것을 여기에도 또한 적용한다. 원칙적으로, 하나의 프로모터로부터 출발하는 그러한 DNA 분자에서 전사되는 안티센스 단편의 수에 대한 상한은 없다. 그러나 형성되는 전사체는 바람직하게는 10kb의 길이, 특히 5kb의 길이를 초과하지 않아야 한다.

안티센스 배향의 다른 코딩영역과 조합되어 이러한 DNA 분자에 국소화된 코딩영역은 다음 단백질을 암호화하는 DNA 서열로부터 유래될 수 있다: 전분-과립 결합 전분 신타아제(GBSS I 및 II) 및 가용성 전분 신타아제(SSS I 및 II), 분지효소(이소아밀라아제, 풀룰라나아제, R 효소, 분지효소, 탈분지효소), 전분인산화효소 및 불균화효소. 이 열거는 단지 예에 불과하다. 이러한 조합의 목적을 위한 다른 DNA 서열의 사용도 또한 가능하다.

이러한 구조체는 복수의 효소의 합성을 그것들에 의해 형질전환된 식물 세포에서 동시에 저해되도록 할 수 있다.

또한 이 구조체는 하나 이상의 전분생합성 유전자가 결여된 식물 돌연변이체에 도입될 수 있다(Shannon and Garwood, 1984, in Whistler, BeMiller and Paschall, Starch: Chemistry and Technology, Academic Press, London: 2nd Edition; 25-86). 이러한 결여는 다음 단백질에 관한 것일 수 있다: 전분-과립 결합 전분 신타아제(GBSS I 및 II) 및 가용성 전분 신타아제(SSS I 및 II), 분지효소(BE I 및 II), 탈분지효소(R 효소), 불균화효소 및 전분인산화효소. 이 열거는 단지 예에 불과하다.

또한 이러한 절차는 복수의 효소를 그것들에 의해 형질전환된 식물 세포에서 동시에 저해되도록 할 수 있다.

외래 유전자의 고등식물로의 도입을 준비하기 위해서는, 대장균에 대한 복제신호 및 형질전환 박테리아 세포를 선택하기 위한 마커 유전자를 포함하는 다수의 클로닝 벡터가 이용가능하다. 그러한 벡터의 예로는 pBR322, pUC 계열, M13mp 계열, pACYC184 등이 있다. 원하는 서열을 적당한 제한절단 부위에서 벡터에 삽입할 수도 있다. 얻어진 플라스미드는 대장균 세포를 형질전환하는데 사용된다. 형질전환된 대장균 세포를 적당한 배지에서 성장시키고 계속해서 수거 및 용균한다. 플라스미드는 회수한다. 일반적으로 사용되는 얻어진 플라스미드 DNA를 특성화하는 분석방법은 제한분석, 겔전기이동 및 추가의 생화학 및 분자생물학 방법이다. 각 조작후 플라스미드 DNA를 절단하고, 얻어진 DNA 단편을 다른 DNA 서열에 연결할 수 있다. 각 플라스미드 DNA 서열은 동일 또는 상이한 플라스미드에 클로닝될 수 있다.

다수의 기술이 DNA를 식물 숙주 세포에 도입하는데 이용가능하다. 이들 기술에는 아그로박테리움 투메라시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 또는 아그로박테리움 리조겐스(Agrobacterium rhizogenes)를 형질전환제로서 사용한 t-DNA에 의한 식물 세포 형질전환, 원형질체 융합, 주입, DNA의 일렉트로포레이션, 생물적 방법(biolistic method)에 의한 DNA의 도입 및 다른 가능한 방법이 포함된다.

식물 세포 그 자체로의 DNA의 주입 및 일렉트로포레이션은 사용되는 플라스미드의 특정 양태를 전혀 요구하지 않는다. 예컨대 pUC 유도체와 같은 간단한 플라스미드가 사용될 수 있다. 그러나 상기 형질전환 세포로부터 비손상 식물을 재생해야 한다면 일반적으로 선택성 마커 유전자가 존재할 것이 요구된다.

원하는 유전자를 식물 세포에 도입하는 방법에 따라 추가의 DNA 서열이 요구될 수 있다. 예컨대 Ti 또는 Ri 플라스미드가 식물 세포를 형질전환하는데 사용되는 경우에는, Ti 및 Ri 플라스미드 T-DNA의 적어도 오른쪽 가장자리, 그러나 대개는 좌우 가장자리를 도입되는 유전자에 측면영역으로서 연결하여야 한다.

아그로박테리아가 형질전환에 사용되는 경우에는, 도입되는 DNA를 특정 플라스미드에 중간 벡터 또는 이원성 벡터로 클로닝하여야 한다. 중간 벡터는 T-DNA내의 서열과 상동인 서열 때문에 상동 재조합에 의해 아그로박테리아 Ti 또는 Ri 플라스미드에 삽입될 수 있다. 전자는 또한 T-DNA 전달에 요구되는 vir 영역을 함유할 수 있다. 중간 벡터는 아그로박테리아에서 복제할 수 없다. 중간 벡터는 헬퍼 플라스미드에 의해 아그로박테리움 투메파시엔스(접합체)에 전달될 수 있다. 이원성 벡터는 대장균 및 아그로박테리아에서 복제할 수 있다. 이들은 좌우 T-DNA 가장자리 영역으로 둘러싸인, 선택마커 유전자 및 링커 또는 폴리링커를 함유한다. 이들은 아그로박테리아로 직접 형질전환될 수 있다(Holsters et al., Mol. Gen. Genet. 163 (1978), 181-187). 숙주 세포로서 작용하는 아그로박테리아는 vir 영역을 가진 플라스미드를 함유하여야 한다. vir 영역은 T-DNA를 식물 세포에 전달하는데 요구된다. 추가의 T-DNA가 존재할 수도 있다. 이와 같이 형질전환된 아그로박테리아는 식물 세포를 형질전환하는데 사용될 수 있다.

T-DNA를 식물 세포의 형질전환에 사용하는 것은 집중적으로 연구되어 왔고 유럽특허 제 120516 호; 및 문헌[Hoekema, The Binary Plant Vector System Offsetdrukkerij Kanters B.V., Alblasserdam (1985), Chapter V; Fraley et al., Crit. Rev. Plant. Sci., 4, 1-46 및 An et al., EMBO J. 4 (1985), 277-287]에 기재되었다.

DNA를 식물 세포에 전달하기 위해서는 편의상 식물 외이식편을 아그로박테리움 투메파시엔스 또는 아그로박테리움 리조겐스와 공동배양할 수 있다. 그 다음 형질전환 세포를 선택하기 위해 특히 일정한 당, 아미노산, 항생물질 또는 생물치사제를 함유할 수 있는 적합한 배지에서, 감염된 식물재료(예컨대 잎 조각, 줄기 조각, 뿌리 뿐만 아니라 현탁배양으로 성장된 식물세포 또는 원형질체)로부터 비손상 식물을 다시 재생할 수 있다. 그 다음 얻어진 식물을 도입된 DNA의 존재 여부에 대해 실험할 수 있다. 생물적 방법을 사용하거나 또는 원형질체 형질전환으로 외래 DNA를 도입하는 다른 가능한 방법은 공지되어 있다(비고: 예컨대 문헌[Willmitzer, L., 1993 Transgenic plants. In Biotechnology, A Multi-Volume Comprehensive Treatise(H.J. Rehm, G. Reed, A. Puhler, P. Stadler, eds.), Vol.2, 627-659, VCH Weinheim-New York-Basel-Cambridge)] 참조).

아그로박테리움 투메파시엔스의 도움으로 Ti-플라스미드 벡터 시스템을 통해 쌍떡잎식물을 형질전환하는 것은 잘 확립되어 있으나, 보다 최근의 연구는 외떡잎식물도 아그로박테리 기재 벡터에 의한 형질전환에 사실상 이용할 수 있음을 제안하고 있다(Chan et al., Plant Mol. Biol. 22 (1993), 491-506; Hiei et al., Plant J. 6 (1994), 271-282).

외떡잎식물의 형질전환을 위한 대안적 방법은 생물적 접근법, 원형질체 형질전환, 또는 예컨대 부분투과성화 세포의 일렉트로포메이션, 유기섬유에 의한 DNA 전달, 꽃으로의 DNA 미량주입, 소포자 또는 전배로의 DNA 미량주입, 꽃가루의 발아에 의한 DNA 흡수 및 팽창에 의한 배내 DNA 흡수에 의한, 물리적 또는 화학적으로 유발되는 원형질체로의 DNA 흡수에 의한 형질전환이다(참고: Potrykus, Physiol. Plant (1990), 269-273).

상술한 형질전환 시스템 중 세가지, 즉 조직의 일렉트로포레이션, 원형질체의 형질전환 및 재생성 조직 및 세포로의 입자충격에 의한 DNA 전달은 과거에 여러 가지 곡물에 대해 확립되었다(참고: Jahne et al., Euphytica (1985), 35-44).

밀을 형질전환하는 다른 방법은 문헌에 기재되었다(참고: Maheshwari et al., Critical Reviews in Plant Science 14 (2) (1995), 149-178). 헤스(Hess) 등(Plant Sci. 72 (1990), 233)은 꽃가루 및 아그로박테리아를 바로 주변으로 가져오기 위해 미량주입법을 사용하고 있다. 선택마커로서 nptll 유전자를 함유한 플라스미드의 이동성은 서던블롯 분석 및 NPTII 시험으로 검출하였다. 이 형질전환체는 정상적인 표현형을 나타내었고 수정능력이 있었다. 카나마이신 내성은 두 번의 연속 생성으로 검출하였다.

미량발사체(microprojectile)에 결합된 DNA에 의한 충격 후 재생된 최초의 수정능력 있는 트랜스제닉 밀 식물은 바실(Vasil) 등(Bio/Technology, 10 (1992), 667-674)에 의해 기재되었다. 충격을 위한 표적 조직은 배발생 캘루스배양물(C형 캘루스)이었다. 사용된 선택마커는 포스피노트리신 아세틸 전이효소를 암호화하고 따라서 농약 포스피노트리신에 대한 내성을 조정하는 바아 유전자이었다. 추가의 시스템은 위크스(Weeks) 등(Plant Physiol. 102 (1993), 1077-1084) 및 벡커(Becker) 등(Plant J. 5(2) (1994), 299-307)에 의해 기재되었다. 여기서 DNA 형질전환을 위한 표적 조직은 체세포배를 유발하도록 예비 시험관내 상에서 자극된 미숙 배의 배반이다. 벡커 등(위의 인용문 중)이 개발한 이 시스템의 형질전환 효율은 품종 "플로리다(Florida)"의 배 83개당 트랜스제닉 식물 1개이고 따라서 품종 "보화이트(Bohwhite)"의 배 1000개당 트랜스제닉 식물 1 내지 2개를 산출하는 위크스 등에 의해 확립된 시스템보다 현저히 더 높다.

벡커 등(위의 인용문헌 중)이 개발한 시스템은 실시예에 기재된 형질전환 실험에 대한 기초를 이루었다.

일단 도입된 DNA가 식물 세포의 게놈에 삽입되기만 하면 그것은 보통 안정하고 또한 최초에 형질전환된 세포의 자손에 보유된다. 그것은 예컨대 형질전환 식물 세포에 대해 포스피노트리신과 같은 생물치사제 또는 카나마이신, G 418, 블레오마이신 또는 하이그로마이신과 같은 항생물질에 대한 내성을 조정하거나 또는 일정한 당 또는 아미노산의 존재 또는 부재를 통한 선택을 가능하게 하는, 상술한 선택마커 중의 하나를 통상 함유한다. 따라서 개별적으로 선택된 이 마커는 도입되는 DNA가 결여된 세포보다 형질전환 세포를 선택하는 것을 가능하게 해야 한다.

식물내에서는 형질전환 세포가 통상적인 방식으로 성장한다(문헌[McCormick et al., Plant Cell Reports 5 (1986), 81-84] 참조). 얻어진 식물은 정상적으로 재배되고, 동일한 형질전환 생식질 또는 기타 생식질을 갖는 식물과 하이브리드화될 수 있다. 얻어진 하이브리드 개체는 대응하는 표현형 특성을 갖는다. 이 식물 세포로부터 종자를 얻을 수 있다. 이 표현형 특성이 안정하게 보유되어 유전되는 것을 보장하기 위해서는 2 이상의 세대가 재배되어야 한다. 또한 당해 표현형 또는 기타 특성이 보유되는 것을 보장하기 위해서는 종자를 채취해야 한다.

하기 실시예는 본 발명을 예시하고자 하는 것이며 어떤 한정도 하지 않는다.

1. 클로닝 방법

벡터 pBluescript II SK(스트래터진(Stratagene)사)를 대장균내 클로닝에 사용하였다.

2. 박테리아 균주

대장균 균주 DH5α(미국 게이터스버그의 베체다 리서치 레보러토리스(Bethesda Research Laboratories)사)를 Bluescript 벡터 및 안티센스 구조체에 사용하였다. 대장균 균주 XL1-Blue를 생체내 절제에 사용하였다.

3. 미숙한 밀 배의 형질전환

배지

MS: 100ml/l의 매크로염, 1ml/l의 마이크로염, 2ml/l의 Fe/NaEDTA, 30g/l의 수크로오스(D. Becker and H. Lorz, Plant Tissue Culture Manual (1996), B 12:1-20)

#30: MS+2,4-D(2mg/l)

#31: MS+2,4-D(2mg/l)+포스피노트리신(PPT, 농약 BASTA의 활성 성분(2mg/l))

#32: MS+2,4-D(0.1mg/l)+PPT(2mg/l)

#39: MS+2,4-D(2mg/l)+각각 0.5N의 만니톨/소르비톨

기재한 배지는 KOH를 사용하여 pH 5.6이 되도록 하고 0.3% 겔라이트(Gelrite)를 사용하여 응고시켰다.

미숙 밀 배를 형질전환하는 방법은 벡커 및 뢰츠에 의해 개발 및 최적화되었다(D. Becker and H. Lorz, Plant Tissue Culture Manual (1996), B12: 1-12).

하기한 실험에서는 벡커 및 뢰츠(위의 인용문헌 중)에 의해 개발된 방법을 따랐다.

형질전환을 위해, 발달단계가 개화후 12 내지 14일인 곡과가 달린 이삭을 채취하여 표면을 멸균하였다. 분리된 배반을 유발 배지 #30에 플레이팅하였고 배축을 배지쪽을 향하게 하였다.

2 내지 4일 동안의 예비배양(26℃, 암실)후, 외이식체를 삼투성 예비배양(2 내지 4시간, 26℃, 암실)을 위해 배지 #39로 옮긴다.

생물적 형질전환을 위해, 몇 ㎍의 표적 DNA를 사전에 침강시킨 약 29㎍의 금 입자를 산탄마다 사용하였다. 수행된 실험은 동시형질전환이므로, 비 1:1의 표적 유전자 및 내성 마커 유전자(바아 유전자)로 구성된 표적 DNA를 침강 배치에 가한다.

4. DNA 단편의 DIG 표지화

스크리닝 프로브로서 사용된DNA 단편은 특정 PCR을 통해 DIG 표지 dUPT(독일의 보링거 맨하임(Boehringer Mannheim)사)를 혼입하여 표지하였다.

실시예에 사용된 배지 및 용액은 다음과 같다.

20×SSC: NaCl 175.3g, 시트르산나트륨 88.2g, 2회 증류한 H₂O 1000ml까지, 10N NaOH pH 7.0까지.

부타페스트조약에 명시된 바와 같이 독일연방공화국 브라운치바이그 소재의 DSMZ에 플라스미드 pTaSU 8A는 No. DSM 12795로, 플라스미드 pTaSU19는 NO. DSM 12796으로 기탁하였다.

실시예 1: 밀(Triticum aestivum L., cv Florida) 유래의 이소아밀라아제("슈거리" 상동체)를 암호화하는 cDNA의 동정, 분리 및 특성화

밀 이소아밀라아제 이소형(슈거리)을 암호화하는 cDNA를 동정하기 위해 이종 스크리닝법에 따랐다. 이를 위해 밀 cDNA 라이브러리를 옥수수 슈거리 프로브로 스크리닝하였다.

프로브(슈거리 프로브)는 PCR 증폭을 사용하여 특이적 프라이머에 의해 옥수수 cDNA 라이브러리로부터 분리하였다. 옥수수 cDNA 라이브러리는 λ Zap II 벡터중의 같은 양의 13, 17, 19, 20, 22, 25 및 28일(DAP) 된 곡과 혼합물로부터의 폴리(A)+RNA로부터 제조업자의 지시에 따라 클로닝하였다(λ ZAP II-cDNA 신시시스 키트(Synthesis Kit), 독일 하이델베르크의 스트래터진사). 13일 된 열매를 제외하고는 사용된 모든 곡과에 있어서 RNA를 분리하기 전에 배를 제거하였다.

밀 cDNA 라이브러리를 스크리닝하기 위한 프로브로서 사용된 DNA 단편은 다음 프라이머로 증폭하였다.

su1p-1:5'AAAGGCCCAATATTATCCTTTAGG3'(서열번호: 9)

su1p-2:5'GCCATTTCAACCGTTCTGAAGTCGGGAAGTC3'(서열번호: 10)

PCR 반응에 사용된 주형은 증폭된 옥수수 cDNA 라이브러리 2μl이었다. 또한 PCR 반응물은 1.5-3mM MgCl₂, 20mM 트라이스-HCl(pH 8.4), 50mM KCl, 0.8mM dNTP 혼합물, 1μM 프라이머 su1p-1a, 1μM 프라이머 su1p-2 및 2.5단위의 Taq 중합효소(재조합체, 라이프 테크놀로지스(Life Technologies)사)를 함유하였다.

증폭은 바이오메트라(Biometra)사제 트라이오블록(Trioblock)을 사용하여 4분/95℃; 1분/95℃; 45초/58℃; 1분 15초/72℃; 5분/72℃ 30주기의 계획안에 따라 수행하였다. 약 990bp의 증폭된 DNA 밴드를 아가로스겔 중에서 분리하여 절제하였다. 제 2 증폭은 이 단편으로부터 상기한 바와 같은 계획안에 따라 하였다. 이 제 2 증폭으로부터 얻어진 990bp 단편은 제한효소 BAM HI에 의해 220bp 및 770bp 단편으로 절단하였다. 이 슈거리 단편을 아가로스겔 중에서 다시 분리한 후 밴드는 절제하고 단편은 분리하고 프로브는 DIG로 표지하였다. 슈거리 단편 500ng를 디곡시게닌으로 랜덤-프라임 표지화에 사용하였다. 랜덤 프라이머 10μl를 표지할 단편에 가하고 반응물을 95-100℃에서 5분 동안 가열하였다. 가열 후 0.1mM dATP, 0.1mM dGTP, 0.1mM dCTP 및 0.065mM dTTP와 0.035mM 디곡시게닌-11-dUTP(보링거 맨하임사) 및 클레나우(Klenow) 완충액(표준) 그리고 1단위의 클레나우 중합효소를 가하였다. 반응은 실온에서 하룻밤 진행되도록 하였다. 표지화를 검사하기 위해 도트 테스트를 제조업자의 지시에 따라 수행하였다(독일의 보링거 맨하임사에 의한 "The DIG System User's Guide for Filter Hybridization").

밀 cDNA 라이브러리는 λ Zap II 벡터 중의 약 21일("전분질" 내배유) 된 곡과로부터의 폴리(A)+RNA로부터 제조업자의 지시에 따라 합성하였다(λ ZAP II-cDNA 신시시스 키트, 하이델베르크의 스트래터진사). cDNA 라이브러리의 역가 측정 후 1.26×10⁶pfu/ml의 1차 역가가 측정되었다.

밀 cDNA 라이브러리를 스크리닝하기 위해 약 350,000개의 파지를 플레이팅하였다. 이 파지를 플레이팅하고 플레이트를 표준 프로토콜에 의해 블로팅하였다. 여액을 5×SSC, 3% 블로킹(보링거 맨하임사), 0.2% SDS, 0.1% 나트륨 라우릴사르코신 및 50㎍/ml의 청어 정자 DNA 중에서 55℃에서 예비하이브리드화 및 하이브리드화하였다. 1ng/ml의 표지된 슈거리 프로브를 이 하이브리드화 용액에 가하고 하이브리드화물을 하룻밤 배양하였다. 여액을 실온에서 2×SSC, 1% SDS로 2×5분; 55℃에서 1×SSC, 0.5% SDS로 2×10분; 55℃에서 0.5×SSC, 0.2% SDS로 2×10분 세척하였다. 양성 클론을 추가의 스크리닝 주기에 의해 선별해 내었다. 단일 클론을 생체내 절제를 통해 pBluescript SK 파게미드로서 얻었다(제조업자의 지시와 유사한 방법; 독일 하이델베르크의 스트래터진사).

이 클론을 미니프렙스를 통한 분석 및 플라스미드 DNA의 제한 후, 클론 pTaSU-19는 DSMZ(도이췌 잠룽 푸르 미크로오르가니스멘 운트 첼쿨투렌 게엠베하)에 No. DSM 12796으로 기탁하고 보다 상세히 분석하였다.

실시예 2: 플라스미드 pTaSU-19의 cDNA 삽입체의 서열분석

플라스미드 DNA를 클론 pTaSU-19로부터 분리하고 cDNA 삽입체의 서열을 디데옥시뉴클레오티드법에 의해 결정하였다(Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977), 5463-5467).

클론 TaSU-19의 삽입체는 길이가 2997bp이고 부분 cDNA를 구성한다. 뉴클레오티드 서열은 서열번호: 1로 나타낸다. 이미 공개된 서열과 비교한 결과 서열번호: 1로 나타낸 서열은 다른 유기체로부터의 이소아밀라아제와 상동성을 갖는 코딩영역을 포함함이 밝혀졌다.

또한 서열 분석 결과 2개의 인트론이 cDNA 서열 중에 위치 297-396(인트론 1) 및 1618-2144(인트론 2)에 위치함이 밝혀진다. 이들 인트론을 제거하면, 다른 유기체의 이소아밀라아제의 단백질 서열과 상동을 나타내는 단백질 서열이 유도될 수 있다. 서열번호: 1의 코딩영역에 대응하는 아미노산 서열은 서열번호: 8로 나타낸다.

실시예 3: 식물 형질전환 벡터 pTa-α-SU19의 생성

TaSU19-cDNA에 대응하는 안티센스 RNA를 발현시키기 위해, 기본 플라스미드 pUC19에 기초하여 플라스미드 pTa-α-SU19의 cDNA 삽입체를 우비퀴틴 프로모터의 3' 말단에 안티센스 배향으로 연결함으로써 식물 형질전환 벡터 pTa-α-SU19를 구성하였다. 이 프로모터는 옥수수 우비퀴틴 1 유전자의 첫 번째 미번역 엑손과 첫 번째 인트론으로 구성되었다(Christensen A. H. et al., Plant Molecular Biology 19 (1992), 675-689). 폴리링커 및 NOS 종료암호의 일부는 플라스미드 pAct1.cas로부터 유도된다(CAMBIA, TG 0063; 오스트레일리아 캔버라 ACT 2601 GPO 박스 3200 캄비아). 이 종료암호를 갖는 벡터 구조체 및 pAct1.cas를 기재로 한 구조체는 맥컬로이(McElroy) 등이 기재하고 있다(Molecular Breeding 1 (1995), 27-37). 이와 같이 형성된 벡터는 pUbi.cas로 명명하였다.

벡터는 제한효소 Xba I에 의해 클론 Ta-SU19로부터 2kb 단편을 제한함으로써 클로닝하였다. 이 단편은 클레나우 제한에 의해 말단을 채우고 계속해서 발현벡터 pUbi.cas의 Sma I 클로닝 부위에 라이게이션하였다.

얻어진 발현벡터를 Ta-α-SU19로 명명하고 밀을 형질전환하기 위해 상기한 바와 같이 사용한다.

실시예 4: 밀(Triticum aestivum L., cv. Florida) 유래의 이소아밀라아제(슈거리 1 상동체)를 암호화하는 추가 cDNA의 분리 및 특성화

밀 cDNA 라이브러리는 클론 pTaSU19의 일부, 즉 서열번호: 1의 위치 489-1041을 나타내는 슈거리 프로브로 스크리닝하였다.

이 cDNA 라이브러리를 스크리닝하는데 사용된 밀 특이적 디곡시게닌 표지 슈거리 프로브를 PCR 증폭에 의해 제조하였다. 이 반응에 사용된 프라이머는 다음의 것이었다.

SUSO1: 5'-GCT TTA CGG GTA CAG GTT CG-3'(서열번호: 13) 및

SUSO2: 5'-AAT TCC CCG TTT GTG AGC-3'(서열번호: 14).

이 반응에는 1ng의 플라스미드 pTaSU19를 주형으로서 사용하였다. 게다가 PCR 반응물은 각각 300nM의 프라이머 SUSO1 및 SUSO2, 각각 100μM의 뉴클레오티드 dATP, dGTP, dCTP, 65μM dTTP, 35μM 디곡시게닌-11dUTP(보링거 맨하임사), 1.5mM MgCl₂, 그리고 2.5U(단위)의 Taq 중합효소 및 10μl의 10배 농축 Taq 중합효소 반응완충액(양자 모두 라이프 테크놀로지스사)을 함유하였다. 반응물의 최종부피는 100μl이었다. 증폭은 PCR 장치(트라이오^R서모블록(TRIO^RThermoblock), 바이오메트라(Biometra)사)에서 다음 온도로 수행하였다: 95℃에서 3분(1회); 95℃에서 4초 - 55℃에서 45초 - 72℃에서 2분(30주기); 72℃에서에서 5분(1회). 553bp의 DNA 단편이 얻어졌다. 디곡시게닌-11-dUTP가 PCR 생성물에 혼입된 것은 디곡시게닌-11-dUTP 부재하의 제어반응 생성물과 비교하여 아가로스겔에서의 이동성이 감소되었기 때문임이 밝혀졌다.

얻어진 디곡시게닌 표지 프로브로 실시예 1의 곡과 특이적 밀 cDNA 라이브러리를 스크리닝하였다.

하이브리드화 단계는 5×SSC, 0.2% SDS, 0.1% 나트륨 라우릴사르코신 및 50㎍/ml의 청어 정자 DNA 중에서 68℃에서 1ng/ml의 디곡시게닌 표지 프로브의 존재하에 하룻밤 수행하였다. 하이브리드화 후, 여액을 실온에서 2×SSC, 1% SDS로 2×5분; 68℃에서 1×SSC, 0.5% SDS로 2×10분; 68℃에서 0.5×SSC, 0.2% SDS로 2×10분 세척하였다. 양성 클론을 적어도 2회 추가의 스크리닝 주기에 의해 선별해 내었다. 플라스미드를 생체내 절제를 통해 pBluescript SK 파게미드로서 얻었다(제조업자의 지시에 따른 프로토콜; 독일 하이델베르크의 스트래터진사). 얻어진 클론의 제한 분석 후, 클론 pTaSU8A를 DSMZ에 No. DSM 12795로 기탁하고 보다 상세히 연구하였다.

실시예 5: 플라스미드 pTaSU8A 중의 cDNA 삽입체의 서열분석

플라스미드 pTaSU8A 중의 cDNA 삽입체의 뉴클레오티드 서열을 디데옥시뉴클레오티드법에 의해 결정하였다(서열번호: 11).

클론 pTaSU8A의 삽입체는 길이가 2437bp이고 부분 cDNA를 구성한다. 이미 공개된 서열과 비교한 결과 서열번호: 11로 나타낸 서열은 다른 유기체로부터의 이소아밀라아제와 상동성을 갖는 코딩영역을 포함함이 밝혀졌다. 마찬가지로 클론 pTaSU8A의 코딩영역으로부터 유래되고 서열번호: 12에 나타낸 단백질 서열은 다른 유기체 이소아밀라아제의 단백질 서열과 상동성을 나타낸다. 클론 pTaSU19(서열번호: 1) 및 pTaSU8A(서열번호: 11)의 서열을 분석하면 96.8%의 유사성이 얻어진다. 서열에 관한 차이의 대부분은 cDNA의 3'-미번역 영역에 있다. 코딩영역내 서열에 관한 나머지 차이는 유래된 단백질 서열(서열번호: 8 및 12)의 총 12개 위치의 아미노산을 서로 다르게 한다. pTaSU19 및 pTaSU8A에 함유된 cDNA는 동일하지 않고 밀 이소아밀라아제의 이소형을 암호화한다.

실시예 8: 식물 형질전환 벡터 pTa-α-SU8A의 생성

TaSU8A cDNA에 대응하는 안티센스 RNA를 발현시키기 위해, 기본 플라스미드 pUC19에 기초하여, PCR 증폭으로 생성된 TaSU8A cDNA의 일부를 우비퀴틴 프로모터의 3' 말단에 안티센스 배향으로 연결함으로써 식물 형질전환 벡터 pTa-α-SU8A를 구성하였다. 이 프로모터는 옥수수 우비퀴틴 1 유전자의 첫 번째 미번역 엑손과 첫 번째 인트론으로 구성되었다(Christensen A. H. et al., Plant Mol. Biol 1 (1992), 675-689). 폴리링커 및 NOS 종료암호의 일부는 플라스미드 pAct1.cas로부터 유도된다(CAMBIA, TG 0063; 오스트레일리아 캔버라 ACT 2601 GPO 박스 3200 캄비아). 이 종료암호를 갖는 벡터 구조체 및 pAct1.cas를 기재로 한 구조체는 맥컬로이 등이 기재하고 있다(Molecular Breeding 1 (1995), 27-37). 우비퀴틴 프로모터, 폴리링커 및 NOS 종료암호를 함유하고 pUC19를 기재로 한 벡터는 pUbi.cas로 명명하였다.

pTa-α-SU8A를 클로닝하기 위해, TaSU8A cDNA의 약 2.2kb 단백질, 즉 서열번호: 11의 위치 140-2304를 PCR에 의해 스크리닝하였다.

이 반응에 사용된 프라이머는 다음과 같았다.

SUEX3: 5'-GCG GTA CCT CTA GAA GGA GAT ATA CAT ATG GCG GAG GAC AGG TAC GCG CTC-3'(서열번호: 15) 및

SUEX4: 5'-GCT CGA GTC GAC TCA AAC ATC AGG GCG CAA TAC-3'(서열번호: 16).

이 반응에는 1ng의 플라스미드 pTaSU8A를 주형으로서 사용하였다. 게다가 PCR 반응물은 각각 300nM의 프라이머 SUEX3 및 SUEX4, 각각 200μM의 뉴클레오티드 dATP, dGTP, dCTP 및 dTTP, 1.6mM MgCl₂, 60mM 트라이스-SO₄(pH 9.1), 18mM (NH₄)₂SP₄그리고 1μl의 엘론가아제(Elongase)^R효소 혼합물(Taq 중합효소와 DNA 중합효소의 혼합물, 라이프 테크놀로지스사)을 함유하였다. 반응물의 최종부피는 50μl이었다. 증폭은 PCR 장치(트라이오 서모블록, 바이오메트라사)에서 다음 온도로 수행하였다: 94℃에서 1분(1회); 95℃에서 30초 - 55℃에서 30초 - 68℃에서 2분 30초(30주기); 68℃에서에서 10분(1회). 이 반응으로 길이 2205bp의 DNA 단편이 생성되었다.

이 2.2kb의 생성물은 KpnI 및 SaII로 제한하고, 이전에 KpnI 및 SaII로 절단된 발현벡터 pUbi.cas에 라이게이션시켰다. 얻어진 식물 형질전환 벡터를 pTa-α-SU8A로 명명하고 밀을 형질전환하기 위해 상기한 바와 같이 사용하였다.

Claims

(a) 서열번호: 8 또는 서열번호: 12로 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 암호화하는 핵산 분자,

(b) 서열번호: 1, 서열번호: 7 또는 서열번호: 11로 나타낸 뉴클레오티드 서열 또는 그것의 일부 또는 그것에 대응하는 리보뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자,

(c) (a) 또는 (b)로 언급된 핵산 분자와 하이브리드화되거나 또는 그것과 상보적인 핵산 분자, 및

(d) 뉴클레오티드 서열이 유전암호의 축퇴로 인하여 (a), (b) 또는 (c)로 언급된 핵산 분자의 서열로부터 벗어난 핵산 분자

로 구성된 군으로부터 선택되는, 밀 이소아밀라아제의 기능을 갖는 단백질을 암호화하는 핵산 분자.
제 1 항에 있어서, DNA 분자인 핵산 분자.
제 2 항에 있어서, cDNA 분자인 DNA 분자.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 조절요소를 함유하는 핵산 분자.
제 1 항에 있어서, RNA 분자인 핵산 분자.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 기재된 핵산 분자와 특이적으로 하이브리드화된 핵산 분자.
제 6 항에 있어서, 적어도 15 뉴클레오티드의 길이를 갖는 올리고뉴클레오티드인 핵산 분자.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 기재된 DNA 분자를 함유하는 벡터.
제 8 항에 있어서, 상기 핵산 분자가 원핵생물 또는 진핵생물 세포에서 번역성 RNA의 전사 및 합성을 보장하는 조절요소에 센스 배향으로 연결되는 벡터.
제 8 항에 있어서, 상기 핵산 분자가 원핵생물 또는 진핵생물 세포에서 비번역성 RNA의 합성을 보장하는 조절요소에 센스 배향으로 연결되는 벡터.
제 8 항에 있어서, 상기 핵산 분자가 원핵생물 또는 진핵생물 세포에서 비번역성 RNA의 합성을 보장하는 조절요소에 안티센스 배향으로 연결되는 벡터.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 기재된 핵산 분자 또는 제 8 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 기재된 벡터에 의해 형질전환된 숙주 세포 또는 이러한 세포로부터 유래되는 숙주 세포.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 기재된 핵산 분자에 의해 암호화되는 단백질.
제 13 항에 기재된 단백질의 제조방법에 있어서, 제 12 항에 기재된 숙주 세포를 상기 단백질을 합성될 수 있도록 하는 조건하에서 배양하고, 배양된 세포 및/또는 배양 배지로부터 상기 단백질을 분리하는 방법.
트랜스제닉 식물 세포를 생성하는 방법에 있어서,

a) 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 기재된 핵산 분자 또는

b) 제 8 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 기재된 벡터

를 식물 세포의 게놈에 삽입하는 방법.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 기재된 핵산 분자 또는 제 8 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 기재된 벡터에 의해 형질전환된 트랜스제닉 식물 세포 또는 이러한 세포로부터 유래되는 트랜스제닉 식물 세포.
트랜스제닉 식물 세포를 생성하는 방법에 있어서,

a) a1) 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 기재된 핵산 분자 또는

a2) 제 8 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 기재된 벡터를 식물 세포의 게놈에 삽입하고,

b) 상기 식물 세포로부터 비손상 식물을 재생하는 방법.
제 16 항에 기재된 식물 세포를 함유하는 식물.
제 19 항에 있어서, 외떡잎식물 또는 쌍떡잎식물인 식물.
제 19 항에 있어서, 작물인 식물.
제 20 항에 있어서, 전분 저장 식물인 식물.
제 21 항에 있어서, 옥수수, 벼, 감자 또는 밀 식물인 식물.
제 18 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 기재된 식물의 번식물.
제 16 항에 기재된 식물 세포, 제 18 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 기재된 식물 또는 제 23 항에 기재된 번식물로부터 얻을 수 있는 전분.
가공 또는 미가공 식품, 바람직하게는 구운 상품 또는 파스타의 제조를 위한 제 24 항에 기재된 전분의 용도.
포장재료 또는 일회용품의 제조를 위한 제 24 항에 기재된 전분의 용도.