CN1299416A - 编码参与淀粉合成的小麦酶的核酸分子 - Google Patents

Abstract

本文公开了编码参与植物淀粉合成的酶的核酸分子。这些酶是小麦异淀粉酶。此外,本发明涉及含有上述核酸分子的载体和宿主细胞,特别是转化的植物细胞,以及可由它们再生的本发明的异淀粉酶活性增加或降低的植物。

Description

编码参与淀粉合成的小麦酶的核酸分子

本发明涉及编码参与植物体内淀粉合成的小麦酶的核酸分子。这种酶为一种异淀粉酶。

本发明还涉及含有本发明中的核酸分子的载体、宿主细胞以及植物细胞和植物。

另外，本发明描述了生产转基因植物的方法，由于导入了本发明的核酸分子，这种转基因植物合成特征发生变化的淀粉。

鉴于近来将植物成分作为可更新原料的重要性越来越大，作为生物技术研究的主题之一，正努力使植物原料适应加工工业的要求。为了在尽可能多的应用领域使用可更新原料，必需产生多种多样的材料。

除了油、脂肪和蛋白质外，多糖也是植物的重要可更新原料。多糖中占主要地位的除了纤维素外就是淀粉，它是高等植物体内最重要的储存物质。在此，小麦是最重要的农作物之一，因为欧共体的淀粉产量中大约20％是从小麦获取的。

多糖淀粉是化学上相同的基本结构单元-葡萄糖分子-的聚合物。但是这里，涉及的是由不同分子形式组成的很复杂的混合物，这些分子在聚合度、葡萄糖链的支化及其链长方面不同，此外还可能衍生化，例如磷酰化。因此，淀粉不能构成均一的原料。人们特别区别了直链淀粉，一种由α-1,4-葡萄糖苷键连接的葡萄糖分子形成的基本上无支化的聚合物，与支链淀粉，它是由不同支化的葡萄糖链的复杂的混合物构成。这里，支化是通过发生附加的α-1,6-葡萄糖苷键连接而产生的。小麦中合成的淀粉含有约11-37％的直链淀粉。

为了将合适的淀粉尽可能多样性地应用于不同的工业需求，希望提供这样的植物，其能够合成特别适于不同应用目的的改性淀粉。提供这种植物的一种可能性是植物育种措施。但由于小麦是多倍体性状(四倍体和六倍体)，已证明植物育种很难施加影响。最近才通过自然出现的突变体的杂交生产了“蜡态”(无直链淀粉)的小麦(Nakamura等，Mol.Gen.Genet.248(1995),253-259)。

替代植物育种方法，可通过重组方法实现生淀粉植物的特异性改变。但是对此，前提是识别和表征参与淀粉合成和/或淀粉改性的酶以及分离编码这些酶的核酸分子。

导致淀粉合成的生化途径基本上是已知的。植物细胞中淀粉的合成在质体中进行。在光合成活性的组织中，这些质体是叶绿体，在无光合成活性的组织中淀粉储存组织是造粉体。

借助重组方法实现植物体内合成淀粉支化度的进一步控制改变，仍然要求识别编码参与淀粉代谢、特别是淀粉分子内引入和降解支化的酶的DNA序列。

除了在淀粉分子中引入支化的所谓Q-酶以外，在植物酶中还有能够解除支化的酶。这些酶称为脱支酶，根据其底物特异性分为三组：a)支链淀粉酶，它们除了普鲁兰外，还利用支链淀粉作为底物，出现在微生物如克雷伯氏杆菌属和植物体中。植物体中这些酶也称为R-酶。b)异淀粉酶，它不利用普鲁兰，而是利用糖原和支链淀粉作为底物，同样出现在微生物和植物体中。例如，异淀粉酶已在玉米(Manners ＆ Carbohydr.Res.9(1969),107)和马铃薯(Ishizaki等，Agric.Biol.Chem.47(1983),771-779)中报道过。c)淀粉-1,6-葡萄糖苷酶，据报道存在于哺乳动物和酵母体内，利用临界糊精作底物。

Li等证明，在甜菜中除了5种内淀粉酶和2种外淀粉酶以外，只有一种支链淀粉菌酶型的脱支酶(Plant Physiol.98(1992),1277-1284)。该酶的大小为约100kD，最适pH值是5.5，位于叶绿体中。据报道菠菜中也含有脱支酶，它利用普鲁兰作底物。菠菜和甜菜中的脱支酶在与支链淀粉底物反应时的活性都比与普鲁兰底物反应时的活性小5倍(Ludwig等，Plant Physiol.74(1984),856-861;Li等，Plant Physiol.98(1992),1277-1284)。

在农业中重要的储存淀粉的农作物－马铃薯方面，Hobson等研究了脱支酶的活性(J.Chem.Soc.,(1951),1451)。成功地证明，与Q-酶不同，该酶不具有链增长活性，而只是水解α-1,6-葡萄糖苷键。但是这种酶至今还未能准确加以表征。就马铃薯来说，已经提出了脱支酶的提纯方法以及提纯蛋白质的部分肽序列(WO95/04826)。在此期间报道了菠菜中脱支酶的提纯以及相应的cDNA的分离(Renz等，Plant Physiol.108(1995),1342)。

对于玉米，目前在文献中只报道了一种脱支酶的存在。根据其底物的特异性，该酶被列入异淀粉酶一类(参见例如Hannah等，Scientia Horticulturae 55(1993),177-197或Garwood(1984),Starch Chemistry and Teehnology,Whistler,R.L.,BeMiller,J.N.,Puschall,E.F.(编者),AcademicPress San Diego,New York,Boston,25-86)。相应的突变体称为“糖样的”。最近克隆了糖样基因座的基因(参见James等，Plant Cell 7(1995),417-429)。目前在玉米中除了糖样基因座外，还不知道其它的编码具有脱支酶活性的蛋白质的基因座。至今还没有任何说明在玉米中存在其它形式脱支酶的报道。如果希望生产不再具有任何脱支酶活性的转基因玉米植株，例如为了增加支链淀粉的支化度，需要鉴别玉米中存在的所有脱支酶形式，分离相应的基因或cDNA序列。

为提供改变任何储存淀粉的植物，优选谷类，特别优选小麦，使其合成改性的淀粉的其它途径，都要求识别编码支化酶其它的同工型的DNA序列。

因此，本发明的目的是提供编码参与淀粉合成的酶的核酸分子，由此可能生产遗传改性的植物，它们能产生化学和/或物理特性改变的植物淀粉。

这一目的通过权利要求书中定义的应用形式来达到。

因此，本发明涉及编码具有小麦异淀粉酶功能的蛋白质的核酸分子，优选编码基本如Seq ID No.3或7所述氨基酸序列定义的蛋白质的核酸分子。本发明特别涉及核酸分子包含Seq ID No.1、2或6所述核苷酸序列或其一部分的核酸分子，优选含有Seq ID No.1、2或6所述编码区以及相应的核糖核苷酸序列的分子。更特别优选另外含有调节基因元件的核酸分子，这些元件保证上述的核酸分子的转录以及可能的翻译。此外，本发明还涉及与本发明的核酸分子杂交的核酸分子。

本发明还涉及一种编码小麦异淀粉酶的核酸分子，它的序列由遗传密码子的简并性而与上述分子的核苷酸序列不同。

本发明也涉及一种序列与上述序列的全部或部分互补的核酸分子。

术语“杂交”在本发明范围内是指在传统杂交条件，优选在严格的条件下的杂交，例如参见Sambrook,Molecular Cloning,ALaboratory Manual,第二版(1989)Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,NY中所述。

“杂交”特别优选在下列条件下进行：杂交缓冲液：2×SSC；10×Denhardt溶液(Fikoll 400+PEG+BSA；比例为1∶1∶1)；0.1％SDS；5mM EDTA；50mM Na₂HPO₄；250μg/ml鲱鱼精子DNA；50μg/ml tRNA；或0.25M磷酸钠缓冲液pH为7.2；1mM EDTA；7％SDS杂交温度：      T=65～70℃洗涤缓冲液：    0.2×SSC；0.1％SDS洗涤温度：      T=40～75℃

与本发明的核酸分子杂交的核酸分子原则上能编码任何表达这种蛋白的小麦植物中的异淀粉酶。

与本发明的分子杂交的核酸分子例如可从小麦或小麦植物组织的基因组或cDNA文库中分离。还可选择通过重组方法或通过化学合成的方法来生产。

这类核酸分子的识别和分离可以应用本发明的分子或这种分子的一部分或者这种分子的反向互补部分来完成，例如借助于按照标准方法进行的杂交(参见Sambrook,1989,Molecular Cloning,ALaboratory Manual,第二版Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor,NY中所述)。

杂交探针例如应用严格或基本上具有Seq ID No.1、2或6所述核苷序列或此序列的一部分的核酸分子。用作杂交探针的片段也可以是合成片段，借助于常规合成技术来生产，它们的序列基本上与本发明的核酸分子的序列一致。

与本发明的核酸分子杂交的分子还包括上述编码本发明的小麦异淀粉酶的核酸分子的片段、衍生物以及等位变体。所谓的片段这里指核酸分子的一部分，它的长度足以编码上述一种蛋白质。本文中的衍生物是指这种分子的序列与上述核酸分子的序列在一个或多个位置不同，并与这些序列具有高度同源性。同源性这里指至少40％序列相同，特别是至少60％的序列相同，优选80％以上，更优选超过90％的序列相同。与上述核酸分子的偏差可能由缺失、取代、插入或重组造成。

同源性还意味着，在涉及的核酸分子或它们编码的蛋白之间存在功能和/或结构相当性。与上述分子同源的并构成这些分子的衍生物的核酸分子，一般涉及这些分子的变化，即所谓的改性，它们发挥同样的生物功能。这里涉及自然发生的变化，例如来自其它有机体的序列，或可能自然产生的突变或通过定位诱变形成产生的突变。对于这种变化还可能涉及合成产生的序列。等位变体不仅涉及到自然产生的变体，还涉及到合成产生的或通过DNA重组技术产生的变体。

由本发明的核酸分子的不同变体编码的异淀粉酶具有一定的共同特征。对此可能有酶活性、分子量、免疫活性、构型等以及物理特性，例如在凝胶电泳中的迁移性能、色谱性能、沉降系数、溶解性、光谱特性、电荷特征、稳定性；最适pH值、最适温度等。

本发明的核酸分子编码的蛋白质为小麦异淀粉酶。这些蛋白质与目前已知的其它种植物中的异淀粉酶具有一定的同源性范围。

本发明的核酸分子可以是DNA分子，特别是cDNA或基因组分子。本发明的核酸分子还可以是RNA分子，它可通过本发明的核酸分子转录得到。本发明的核酸分子可以从天然来源获得或通过重组技术或合成来生产。

本发明还涉及与本发明的核酸分子专一性杂交的寡核苷酸。这类寡核苷酸优选的长度至少含10个，特别是至少15个，更优选至少50个核苷酸。本发明的寡核苷酸与本发明的核酸分子专一性杂交，也就是说，没有或只有极少量编码其它蛋白质的核酸序列，特别是编码其它异淀粉酶的核酸序列。本发明的寡聚糖苷酸可以用作PCR反应的引物或分离相关基因的杂交探针。它们同样也可以是反义结构的组分，或编码合适的核酶的DNA分子的组分。

本发明还涉及含有上述本发明核酸分子的载体，特别是质粒、粘粒、噬菌粒、病毒、噬菌体和其它在遗传工程中常规使用的载体。这类载体适于原核或真核细胞、优选植物细胞的转化。

该载体特别优选允许在植物细胞的基因组中整合本发明的核酸分子，适当时一并带有位于两侧的调节区域。载体的实例有可农杆菌介导的基因转移中使用的二元载体。优选本发明的核酸分子以有义或反义方向整合，以保证在转化的原核或真核细胞中合成可翻译或不可翻译的RNA。

术语“载体”一般代表一种本领域技术人员熟知的合适助剂，它能实现单链或双链核酸分子向宿主细胞中的指定转移，例如DNA-或RNA-病毒、病毒片段、质粒结构，它们在有或无调节元件存在下适于核酸分子向细胞中的转运，或载体材料如玻璃纤维或在“粒子枪”方法中可使用的金属粒子，但是还可能包括可通过化学或物理方法直接导入细胞的核酸分子。

优选的实施方案中，载体中的核酸分子与调节元件连接，这些元件保证在原核或真核细胞中可翻译RNA的转录和合成，或如必要进一步保证不可翻译RNA的合成。

本发明的核酸分子在原核细胞如在大肠杆菌中的表达对更详细地表征这些分子编码的酶的酶活性来说很重要。特别是可能表征在植物细胞中其它参与淀粉合成的酶不存在的情况下，由相应的酶合成的产物。这样就可以得出结论，植物细胞中淀粉合成时相应的蛋白质是否起了作用。

此外，可以能借助分子生物学的常规技术(参见Sambrook等，1989年，Molecular Cloning,A Laboratory Manual,第2版Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spting Harbor,NY)在本发明的核酸分子中引导各种类型的突变，由此合成具有可能改变的生物特性的蛋白质。这里，可能产生缺失突变体，其中通过DNA编码序列在5’-端或3’-端的逐渐缺失产生核酸分子，它们合成相应的较短的蛋白质。例如可能通过这种核苷序列在5’-端的缺失来识别负责质体中酶易位的氨基酸序列(转运肽)。这允许定向生产通过去除相应的序列而不再位于质体内而在细胞液中的酶，或由于其他信号序列的加入而定位于其它的区室的酶。

另一方面还能在那些氨基酸序列的改变对例如酶活性或酶调节有影响的位置引发点突变。通过这种方法可能生产Km值改变或不再受细胞中正常存在的别构调节机制或共价修饰调节的突变体。

此外还能生产改变本发明蛋白质的底物专一性或产物专一性改变的突变体。另外还能生产改变了本发明蛋白质的活性-温度特性的突变体。

对于原核细胞的重组修饰，可将本发明的核酸分子或这些分子的一部分引入质粒中，它们允许发生诱变或通过DNA序列的重组改变序列。借助标准方法(参看Sambrook等，1989,MolecularClonign:A Laboratory manual,Cold Spring HarborLaboratory Press,NY,USA)，可对天然或合成序进行碱基交换。对于DNA片段彼此的连接，可以使用片段接头或连接子。此外还可采取控制适当措施限制切割位点或除去多余的DNA或限制切割位点。对于插入、缺失或取代，可应用体外诱变、引物修补、限制性切割或连接。常用的分析方法是序列分析、限制位点分析或其它生化和分子生物学方法。

另一个实施方案中，本发明涉及用上述本发明的核酸分子或本发明的载体转化的宿主细胞，特别是原核或真核细胞，以及从如此转化的细胞衍生并含有本发明的核酸分子或载体的细胞。这里优选涉及原核或真核细胞，特别是植物细胞。

本发明还涉及可重组生产的由本发明的核酸分子编码的具有异淀粉酶活性的蛋白质，以及它们的生产方法，其中本发明的细胞在本领域技术人员熟悉的允许本发明蛋白质合成的合适条件下培养，然后从宿主细胞和/或培养基分离。

利用本发明的核酸现可能借助重组方法定向干预植物的淀粉代谢，将其作如下改变以得到理化性质改变的改性淀粉，例如直链淀粉/支链淀粉比、支化度、平均链长、磷酸含量、胶凝特性、成凝胶或成膜性能、淀粉颗粒大小和/或淀粉颗粒形状等与已知淀粉相比有所改变。

因此，可能在植物细胞中表达本发明的核酸分子，以便提高相应的异淀粉酶活性或将它们引入不表达该酶的细胞中。通过本发明核酸分子的表达还可能降低植物细胞中本发明异淀粉酶的天然活性。还可能将本发明的核酸分子按照本领域技术人员熟悉的方法改变，以得到本发明的异淀粉酶，它们不再经受细胞固有的调节机制，或具有改变了的温度-活性特征或者底物或产物专一性。

本发明的核酸分子在植物中表达时原则上有可能将合成的蛋白质定位在植物细胞的任何区室中。为实现在特定区室中的定位，必需缺失保证在质体中定位的序列，留下的编码区域需要时必需与保证在各自的区室中定位的DNA序列连接。这类序列是已知的(参见Braun等，EMBO J.11(1992),3219-3227;wolter等，Proc.Natl.Acal.Sci.USA 85(1988),846-850;Sonnewald等，Plant J.1(1991),95-106)。

所以本发明还涉及用本发明的核酸分子或载体转化的转基因植物细胞的生产方法，其中本发明的核酸分子或本发明的载体被整合在植物细胞的基因组中，还涉及用本发明的核酸分子或载体转化的转基因细胞以及由如此转化的细胞产生的转基因植物细胞。本发明的细胞含有一个或多个本发明的核酸分子或载体，它们优选与能保证植物细胞内的转录的调节性DNA元件连接，特别是与合适的启动子连接。这类细胞与天然细胞的不同之处特别在于，它们含有本发明的核酸分子而这在天然细胞中不存在，或者这种分子整合在细胞基因组内中的不同位置(原本没有)，即处于不同的基因组环境内。此外，这类本发明的转基因植物细胞与天然植物细胞的不同之处可在于，它们含有稳定整合在基因组内的至少一拷贝本发明核酸分子，同时可能还有细胞中自然存在的这种分子的几个拷贝。如果在细胞中天然存在的分子拷贝基础上在细胞中引导额外的核酸分子，本发明的植物细胞与天然植物细胞特别不同之处是，这些额外的拷贝位于基因组内天然不存在该拷贝的位置。这可例如借助Southern印迹分析来检查。

如果引入的本发明的核酸分子对于植物细胞是异源的，该转基因植物细胞含有本发明分子的转录本，这可以用本领域技术人员熟知的方法如Southern印迹分析简单地检测。

如果引入的本发明的核酸分子对于植物细胞是同源的，本发明的细胞与天然细胞例如基于本发明核酸分子的额外表达而不同。转基因细胞优选含有更多的本发明核酸分子的转录本。这可以例如通过Northern印迹分析来检测。“更多”这里指比相应的未转化的细胞优选至少多10％，更优选至少多20％，特别优选至少多50％的转录本。此外优选这些细胞提高相应的活性(至少10％，20％或50％)或同样可能降低本发明的蛋白质的活性。转基因植物细胞可按照本领域技术人员熟知的技术再生为全植株。

本发明还涉及生产转基因植物的方法，其中一个或多个本发明的核酸分子或载体整合在植物细胞的基因组内，由所述细胞再生为完整的植株。此外本发明还涉及含有上述转基因植物细胞的植物。在转基因植物方面，原则上涉及任何植物物种的植物，也就是既涉及单子叶植物，又涉及双子叶植物。优选涉及有用的植物，更优选合成淀粉或储存淀粉的植物，更优选黑麦、大麦、燕麦、小麦、高粱和小米、西米、玉米、水稻、豌豆、大豌豆、木薯、马铃薯、番茄、油菜、大豆、大麻、亚麻、向日葵，豇豆或竹芋，特别是小麦、玉米、水稻和马铃薯。

本发明还涉及本发明植物的繁殖材料，例如果实、种子、块茎、根茎、幼苗、插条、愈伤组织、原生质，细胞培养物等。

本发明还涉及改性淀粉的生产方法，包括从上述本发明植物和/或这种植物的储存淀粉部分提取淀粉的步骤。

从植物特别是小麦或植物储存淀粉的部分中提取淀粉的方法已为本领域技术人员所知，参见Eckhoff等(Cereal Chem.73(1996)54-57),“Starch:Chemistry and Technology(编者：Whistler,BeMiller and PaSchall(1994),第二版，Academic Press Inc.London Ltd;ISBN 0-12-746270-8；参见第十二章第412-468页；玉米和高梁淀粉；生产；Watson；第十三章，第469-479页；木薯、竹芋和西米淀粉：生产；Corbi hley和Miller；第十四章，第479-490页；马铃薯淀粉：生产和应用；Mitch；第十五章；第491-506页；小麦淀粉：生产，改性和应用；Knight和Oson；第十六章，第507-528页；水稻淀粉：生产和应用；Rohmer和Klem)。从植物材料中抽提淀粉的工艺中一般应用的设备是分离器，倾析器，水力旋流器，喷雾干燥器和流化床干燥器。

由于本发明核酸分子的表达，本发明转基因植物细胞和植物合成如下物理-化学性能与野生植物合成的淀粉相比有所改变的淀粉，例如直链淀粉/支链淀粉比、支化度、平均链长、磷酸含量、胶凝性能、淀粉颗粒大小和/或淀粉颗粒形状。特别是，这种淀粉与已知的淀粉相比，其粘度和/或成膜或成胶特性方面也可改变。

本发明还涉及一种可由本发明植物细胞、植物以及它们的繁殖材料中得到的淀粉和可通过上述本发明方法得到的淀粉。

此外，还可能借助本发明的核酸分子生产本发明的蛋白质活性减小的植物细胞和植物。这同样导致具有与野生植物细胞合成的淀粉相比有所改变的化学和/或物理性能的淀粉合成。

所以，本发明的进一步涉及转基因植物细胞，它们含有本发明的核酸分子且其中异淀粉酶活性比未转化的细胞减小。

异淀粉酶活性降低的植物细胞的生产可以例如通过按本领域技术人员熟知的方法表达适宜的反义RNA、用于实现共抑制效果的有义RNA，或表达适当构建的特异性切割编码异淀粉酶的转录本的核酶，应用本发明的核酸来完成，参见Jorgensen(TrendsBiotechnol.8(1990),340-344),Niebel等(Curr.Top.Microbiol. Immunol.197(1995),91-103),Flavell等(Curr.Top.Microbiol.197(1995),43-46),Palaqui和Vaucheret(Plant.Mol.Biol.29(1995),149-159),Vaucheret等(Mol.Gen.Genet.248(1995),311-317),deBorne等(Mol.Gen.Genet.243(1994),613-621)。

为了降低植物细胞中本发明异淀粉酶的活性，优选例如通过反义RNA的表达来减少编码异淀粉酶的转录本的总数。

对此，一方面可用包含，编码本发明蛋白质包括任何可能存在的位于两侧的序列的总序列的DNA分子，也可应用只包括部分编码序列的DNA分子，这些部分序列必需具有足够的长度以在细胞中起到反义作用。一般来说，可以应用最小长度为15bp，优选100-500bp长的序列，为实现有效的反义抑制作用，特别优选长度为500bp以上的序列。一般应用的DNA分子比5000bp短，优选比2500bp短的序列。

也可以应用与本发明的DNA分子序列有高度同源性但不完全相同的DNA序列。最小同源性应该大于约65％。优选应用同源性为95-100％的序列。

本发明还涉及包括从本发明的细胞或植物和/或从这种植物的储存淀粉的部分中提取淀粉步骤的生产改性淀粉的方法。

本发明的主题物还有从本发明的细胞、植物以及繁殖材料或它们的一部分中可得的淀粉以及通过本发明的方法可得到的淀粉。

本发明的淀粉可以按照本领域技术人员熟知的方法改性，未改性或改性形式适合于在食品或非食品领域的不同应用。

原则上，本发明淀粉的使用可分为两个大的方面。一个方面包括淀粉的水解产物，主要是葡萄糖和葡聚糖单元，它们通过酶或化学方法得到。它们用作其它化学改性和工艺如发酵的原料。这里为了降低成本，水解方法的简单性和经济性设计有重要的意义。目前基本上应用淀粉葡糖苷酶由酶催化进行。通过减少酶的用量可节约成本。淀粉的结构改变，例如颗粒的表面积增大，由于例如较小的支化度或限制所用酶的可接近性的立体结构较少而较易消化，这些可引起酶用量的减少。

另一个应用本发明淀粉的方面是使用所谓的天然淀粉(由于其聚合物结构)，这又划分为两个应用领域：1．食品工业

淀粉是许多食品的传统增加剂，其功能基本上是与水性添加剂的粘合作用或是提高粘度或是提高成胶作用。重要的性能特征是流动性和吸附性，溶胀温度和胶凝温度，粘度和增稠效力，淀粉的溶解性，透明性和凝胶结构，热、剪切和酸稳定性，退化趋势，成膜能力，冻-熔稳定性，盐溶液中的粘度稳定性，可消化性以及与例如无机或有机离子形成复合物的能力。2．非食品工业

在这个大领域内，淀粉用作不同生产工艺的助剂或用作工业产品的添加剂。在用淀粉作助剂时这里必需特别提到纸和纸板工业。这里，淀粉主要用于阻滞目的(保持固体材料)，粘合填料和细小材料作为加固材料以及用于除水。此外，还可利用淀粉的如下有利特性：硬度、强度、声音、手感、光泽、光洁度、粘合强度以及表面。2.1纸和纸板林业

造纸工艺中区别为四个应用领域，即表面、涂层、备料和喷雾。表面处理方面要求淀粉基本上有白度高、有合适的粘度、高粘度稳定性、良好的成膜性以及弱成尘性。在涂层的应用方面，固体含量、合适的粘度、高粘合能力以及高颜料亲和性起着重要的作用。作为备料的添加剂，重要的是快速、均匀、无损耗地分布、高度机械强度和纸流中完全保持。淀粉在喷雾领域使用，重要的同样是适当的固体含量、高粘度以及高粘合能力。2.2粘合剂工业

淀粉的一个重要使用领域是粘合剂工业，其中这种应用可以划分为四个分领域：作为纯淀粉浆使用，用专门的化学物质预处理的淀粉浆的应用，淀粉作为合成树脂和聚合物分散的添加剂的应用以及淀粉作为合成粘合剂的增充剂的应用。90％的淀粉基黏合剂用在下列领域：波纹纸板的生产、纸袋和包的生产、纸和铝的复合材料的生产、纸箱的生产和用于信封、邮票等的润湿胶的生产等。2.3纺织工业和织物保养剂工业

淀粉用作助剂和添加剂的一个重要应用领域是纺织品和织物保养剂产品领域。在纺织品工业中必需区别下面4种领域：淀粉用作上浆剂，也就是作为平滑和增滑的助剂用于抵抗编织时牵引的张力以及提高编织时的耐磨强度，淀粉用作织物整理剂，特别是降低质量的预处理如漂白、染色等之后使用，淀粉用作染料浆生产时的增稠剂以防止染料渗出以及淀粉用作针线束缚剂的添加剂。2.4建材工业

第四个应用领域是淀粉用作建材添加剂。例如石膏板板材的生产，其中在石膏浆中混合的淀粉与水胶凝，渗到石膏芯的表面并在那儿将板材与芯粘合。另一个使用领域是与灰底纤维和矿物纤维的混合。在即用的混凝土中使用淀粉产品减慢其硬化。2.4土壤稳定剂

淀粉产品的另一个市场是土壤稳定剂的生产，它们可在土壤受人工侵扰时暂时保护土壤颗粒避免失水。淀粉和聚合物乳液相结合的产物据目前了解，在减少腐蚀和锈蚀的作用方面可与以前使用的产品相提并论，但是价格明显比它们低。2.6作物保护剂和肥料方面的应用

淀粉应用的一个领域是用于改变制剂的特定特性的植物保护产品。因此，淀粉可用于改善植物保护剂和肥料的可润湿性，活性成分的控制释放，转换液态、挥发性和/或不良气味的有效物质为微晶、稳定、可塑的物质，以及通过减少分解而延长作用时间。2.7药物、医疗和化妆品工业

此外，应用领域还有药物、医疗和化妆品工业方面。在制药工业，淀粉可用作片剂的粘合剂或用于胶囊内粘合剂的稀释。另外，淀粉能用作片剂崩解剂，因为它们在吞咽后即吸收液体并在短时间内溶胀，从而释放有效物质。医用的润滑粉和伤口外用药粉从定性角度都基于淀粉。化妆品领域中淀粉例如可用作粉添加剂如香精和水扬酸的载体。淀粉的一个更大的应用领域是牙膏。2.8淀粉用于煤和煤球

淀粉用于煤和煤球的添加剂领域。添加淀粉后煤可以大量聚集或压制成为煤砖，由此防止煤砖过早地崩解。淀粉添加剂在焦煤中含量为4-6％，在高热煤中为0.1-0.5％。以淀粉作粘接剂还有别的重要意义，通过向煤和煤球中添加淀粉，减少了有害物质的发散。2.9矿砂和煤的洗选

淀粉还可在矿砂和煤的洗选时用作凝聚剂。2.10铸造业助剂

另一个应用领域是作为铸造业助剂的添加剂。在不同铸造方法中都需要由粘合剂处理的砂子作为核。粘合剂目前主要使用膨润土，其用改性淀粉、主要是可溶胀淀粉处理。

添加淀粉的目的是提高流动性以及改善粘合强度。此外，可溶胀淀粉还可满足其它生产技术方面的要求，如在冷水中可分散、可重水化、与砂子可很好混合以及高水结合能力。2.11橡胶工业中的应用

橡胶工业中淀粉可用于改善技术和视觉质量。这里的原因是为改善表面光泽，改善手感和外观，为此淀粉在冷固化前分散到橡胶材料粘性、涂胶的面上，以及改善橡胶的可印花性。2.12皮革替代品的生产

改性淀粉还可能用于生产皮革替代品。2.13合成聚合物中的淀粉

在聚合物领域，可以想象下列应用领域：在加工工艺中淀粉降解产物的应用(淀粉只是填料，合成聚合物和淀粉之间没有直接键合)或在聚合物生产中淀粉降解产物的应用(淀粉和聚合物形成稳定的键)。

淀粉用作纯填料时与其它材料如滑石相比，并不具有竞争力。但如果淀粉的某一专一特性产生影响，由此明显改变终产物的性能特征时情况就不同了。对此例如，淀粉产品用于热塑性聚合物如聚乙烯的加工。这里，淀粉和合成聚合物通过共同作用以1∶1的比例结合成母材料，由此用惯用的方法技术从聚乙烯粒子可生产各种产品。聚乙烯薄膜中使用淀粉可提高空心孔体的物质通透性，改善水蒸汽透过性，改善抗静电性，改善抗堵塞性以及改善用水性染料的印花性。

淀粉还可能用于聚氨酯泡沫中。采用淀粉衍生物以及通过工艺技术的优化可能定向控制合成聚合物和淀粉羟基的反应。结果得到通过使用淀粉而具有下列特征的聚氨酯薄膜：热膨胀系数减小，收缩减少，改善压力-应力行为，增加水蒸汽透过率同时不改变水的吸收，减小可燃性和终抗拉强度，可燃部分无液滴形成，无卤素，老化减慢。目前还存在的缺点是可印花性减小以及冲击强度减小。

产品开发不再限制于薄膜。可生产淀粉含量50％以上的固体聚合物产品，如盆，盘和碗。此外，淀粉/聚合物的混合物被认为是有利的，因为它们具有高得多的生物可降解性。

越来越重要的是基于极高水结合能力的淀粉接枝聚合物。它们是淀粉为骨架和按自由基机理的原理由合成单体接枝作侧链的产物。目前可用的淀粉接枝聚合物的特征是，较好的粘合能力和每克高粘度淀粉直到1000克水的保留能力。这种超吸收剂的反应领域在近年来大幅度变宽，在卫生领域有产品如尿裤和底布，以及在农业方面，例如在种子包衣方面。

对于这种新型的遗传改造的淀粉十分重要的是结构、含水量、蛋白质含量、脂含量、纤维含量、灰份/磷酸含量、直链淀粉/支链淀粉比、分子量分布、支化度、颗粒大小和形状以及结晶性，另外还有影响下列性能的特征：流动和吸附行为、胶凝温度、粘度、盐溶液中粘度稳定性、增稠效率、溶解性、凝胶结构和凝胶透明性、热、剪切和酸稳定性、退化趋势、成胶性、冻-熔稳定性、复合物形成、碘结合、成膜性、粘接力、酶稳定性、可消化性和反应性。

借助重组方法生产改性淀粉可改变植物中获得的淀粉的性能，从而不再需要借助化学或物理方法的其它改性。另外，通过重组方法改变的淀粉进行其它化学改性，这会进一步改善某种上述应用领域的质量。这些化学改性基本上是已知的。这特别包括通过热处理、用有机或无机酸处理、氧化和酯化等的改性，导致例如形成磷酸淀粉、硝酸淀粉、硫酸淀粉、黄原酸淀粉、醋酸淀粉和柠檬酸淀粉。此外还可在强酸存在下加入一元或多元醇产生淀粉醚，得到淀粉-烷基醚，O-烯丙基醚，羟基烷基醚，O-羧甲基醚，含N的淀粉醚，含P的淀粉醚，含S的淀粉醚，交联淀粉或淀粉接枝聚合物。

本发明淀粉优选的应用是在生产包装材料和一次性物品方面以及作食品和食品初产品方面。

为了本发明的核酸分子在植物细胞中以有义和反义方向上表达，将它们与保证在植物细胞中转录的调节性DNA元件相连接。这特别包括启动子、增强子和终止子。一般对于植物细胞有活性的任何启动子都适于表达。

可选择启动子使表达组成性的或只在特定组织中、在植物生长的某一时刻或外界因素决定的某一时刻发生。对植物而言，启动子可以是同源的或异源的。合适的启动子例如有花椰菜花叶病毒的35SRNA启动子和玉米中的遍在蛋白启动子用于组成性表达，Patatin的B33启动子(Rocha-Sosa等，EMBO J.8(1989),23-29)用于块茎专一性表达，或保证只在光合成活性组织中表达的启动子，例如ST-LSI启动子(Stockhaus等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA84(1987),7943-7947;Stockhaus,EMBO J.8(1989),2445-2451)，或用于胚乳专一性表达的启动子，小麦的AMG启动子，USP启动子，菜豆蛋白启动子或玉米中玉米蛋白基因的启动子。

此外还可存在终止序列，它用于正确地终止转录以及在转录本上添加Poly-A尾端，后者被认为具有稳定转录本的作用。这类元件在文献中已报道(参见Gielen等，EMBO J.8(1989),23-29),并在必要时可互换。

本发明提供编码具有小麦异淀粉酶作用的蛋白质的核酸分子。本发明的核酸分子允许生产已鉴定其在淀粉生物合成中之功能的酶，生产重组技术改变的其中酶活性改变的植物，因此可能在这类改性植物中合成结构改变和物理化学特性改变的淀粉。

本发明的核酸分子原则上也可用于生产其中本发明的异淀粉酶的活性提高或降低而同时其它参与淀粉合成的酶的活性也改变的植物。通过改变植物中异淀粉酶的活性导致合成结构改变的淀粉。此外还可向内源性淀粉合成酶或支化酶的合成已被抑制的植物细胞中引入编码异淀粉酶或适当的反义结构的核酸分子(例如，WO92/14827中或Shannon和Garwood 1984,Whistler,BeMiller和Paschall,Starch:Chemistry and Technology,AcademicPress,London,第2版：25-86)。

如果希望抑制被转化植物中的多种参与淀粉生物合成的酶的合成，可能将在合适的启动子控制下同时含有反义方向的数种酶编码区域的DNA分子用于转换。这里每个序列都可以在自己的启动子控制下，或多个序列作为融合体在共同的启动子下转录或在共同启动子的控制之下。上述最后形式一般是优选的，因为这种情况下相应的多种蛋白质的合成应以约同样的程度被阻止。对于在这类结构中应用的各编码区域的长度，上面用于反义结构生产的描述在这里也适用。从一种启动子开始的这种DNA分子中转录的反义片段的数目一般没有上限。但是所形成的的转录本优选不超过10kb的长度、特别优选5kb的长度。

适当启动子后的这类DNA分子中的编码区域和其它反义方向的编码区域相，可来源于为下列蛋白质的编码DNA序列：淀粉颗粒结合形淀粉合成酶(GBSSⅠ和Ⅱ)和可溶性淀粉合成酶(SSSⅠ和Ⅱ)，支化酶(异淀粉酶，支链淀粉酶，R-酶，支化酶，脱支酶)，淀粉磷酸化酶和歧化酶。这只是举例说明。也可设想在此类结合中应用其它DNA序列。

借助这类结构可以同时抑制随之转化的植物细胞中多种酶的合成。

此外，这些结构可能被引入植物突变体中，后者中淀粉生物合成的一种或多种基因来是缺陷的(Shannon和Garwood,1984,在Whistler,BeMiller和Paschall,Starch:Chemistry andTechnology,Academic Press,London,第2版：25-86)。这些缺陷可能涉及下列蛋白质：淀粉颗粒结合性淀粉合成酶(GBSSⅠ和Ⅱ),可溶性淀粉合成酶(SSSⅠ和Ⅱ)，支化酶(BEⅠ和Ⅱ)，脱支酶(R-酶)，歧化酶和淀粉磷酸化酶。这只是举例说明。

借助这类方法还可同时抑制随之转化的植物细胞中多种酶的合成。

为向高等植物中引入外来基因，已有大量的含有大肠杆菌复制信号和挑选转化的细菌细胞的标记基因的克隆载体。这类载体的例子有pBR322,pUC系列，M13mp系列，pACYC184等。希望的序列可以引入在载体中合适的限制酶剪切位点上。得到的质粒用于转化大肠杆菌细胞。转化的大肠杆菌细胞在合适的培养基中培养，然后收获和溶解。回收质粒。作为用于表征所得质粒DNA的分析方法一般使用限制酶分析，凝胶电泳和其它生化-分子生物学方法。每种操作后，质粒DNA都可被切割，所得到的DNA片段与其它DNA序列连接。每个质粒DNA序列都可在同样或不同质粒中克隆。

已有向植物宿主细胞中引入DNA的大量技术。这些技术包括在应用根癌农杆菌或毛根农杆菌作为转化试剂用T-DNA转化植物细胞，原生质体融合，注射，DNA的电穿孔，基因抢方法引入DNA，以及其他方法。

植物细胞中DNA的注射和电穿孔本身对所用的质粒没有特别的要求。可以应用简单的质粒，例如pUC衍生物。但是如果要从这类转化细胞再生出完整的植物，一般要求有可挑选的标记基因。

按照向植物细胞引入目标基因的方法，可能还需要其它DNA序列。例如如果应用Ti-或Ri-质粒转化植物细胞，至少Ti-和Ri-质粒T-DNA的右边界，然而经常是右边界和左边界，作为侧翼区必需与引入的基因连接。

如果农杆菌用于转化，所要引入的DNA必须克隆在特定的质粒中，或者在中间载体或二元载体中。中间载体可基于与T-DNA中序列的同源性，通过同源重组而整合在农杆菌Ti-或Ri-质粒中。它除此外还含有T-DNA转移必需的vir-区域。中间载体不能在农杆菌中复制。借助于辅助质粒，中间载体可被转移(接合)到农杆菌中。二元载体既可在大肠杆菌中也可在农杆菌中复制。它们含有(在T-DNA的左右边界区域之间)选择标记基因或多接头。它们可以直接转化到农杆菌中(Holsters等，Mol.Gen.Genet.163(1978),181-187)。这种作为宿主细胞用的农杆菌应含有带vir-区域的质粒。vir-区域对T-DNA转移到植物细胞中是必要的。可存在附加的T-DNA。如此转化的脓杆菌可用于转化植物细胞。

对T-DNA用于植物细胞的转化进行了深入研究，并在EP120516;Hoekema,The Binary Plant Vector System OffsetdrukkerijKarters B.V.,Alblasserdam(1985),第5章；Fraley等，Crit.Rev.Plant.Sci.,4,1-46和An等，EMBO J.4(1985),277-287中有记载。

对于DNA向植物细胞中的转移，可以方便地将植物外植体与根癌农杆菌或毛根农杆菌共同培养。由这种被感染的植物材料(例如叶块，茎节，根，但也有原生质或悬浮培养的植物细胞)在合适的培养若中再生为完整的植物，培养基中含有一定的糖、氨基酸、抗生素或杀生物剂以挑选转化的细胞。所得的植物可用于检查所引入DNA的存在。其他使用基因抢方法或通过原生质转化引入外来DNA的可能性是已知的(参见例如willmitzer,L.,1993 Transgenic plants.In：Biotechnology, A Multi-Volume ComprehensiveTreatise(H.J.Rehm,G.Reed,A.Pühler,P.Stadler编)，第2卷，627-659,VCH WEINHEIM-New York-Basel-Cambridge)。

借助根癌农杆菌通过Ti-质粒载体系统对双子叶植物的转化已成熟，新的工作指明，借助根癌农杆菌载体的转化即时对于单子叶植物也很可能达到(Chan等，Plant Mol.Biol.22(1993),491-506;Hiei等，Plant J.6(1994),271-282)。

单子叶植物的转化的替换方法有借助于基因抢方法的转化，原生质体转化或物理或化学诱导的原生质体中DNA的摄入，例如通过部分通透化细胞的电穿孔，借助于玻璃纤维进行的DNA转移，花序中DNA的注射，在小孢子或原胚中DNA的微注射，通过萌发的花粉的DNA摄入和通过肿胀在胚胎中DNA的摄入(综述：Potrykus,Physiol,Plant(1990),269-273)。

过去已对各种谷物建立了三种上述的转化体系：组织的电穿孔，原生质体转化，和在可再生组织和细胞中通过粒子轰击进行的DNA转移(综述：Jhne等，Euphytica 85(1995),35-44)。

在文献中已描述了小麦的不同转化方法(综述：Maheshwari等，Critical Reviews in Plant Science 14(2)(1995),149～178)：Hess等(Plant Sci.72(1990),233)应用宏观注射方法，将花粉和农杆菌直接接近。含有nptⅡ基因作为可挑选标记的质粒的移动，借助Southern Blot分析和NPTⅡ试验来检测。转化子显示正常表型并且可育.在连续两代中检测卡那霉素抗性.

第一个可育的转基因小麦植株，用结合在微发射颗粒上的DNA轰击后再生而成，由Vasil等(Bio/Technology 10(1992),667-674)报道。轰击的目标组织是胚胎发生性愈伤组织培养物(C型愈伤组织)。作为挑选标记使用bar基因，它编码膦丝菌素乙酰基转移酶，因此介导对除草剂膦丝菌素的抗性。另一个体系由Weeks等(PlantPhysiol.102(1993),1077-1084)以及Becker等(PlantJ.5(2)(1994),299-307)报道。这里用于DNA转化的目标组织是不成熟胚的胚鳞，它在预先在体外被刺激以诱导体细胞胚。转化的效率在Becker等(loc cit.)发展的体系中为每83个“Florida”品种胚1个转基因植株，明显高于Weeks等所建立体系的每1000个“Bohwhite”品种胚1至2个转基因植株。Becker等(Ioc.Cit)发展的体系是实施例中所述的转化实验的基础。

一旦引入的DNA整合在植物细胞的基因组中，它一般很稳定，也保留在原始转化细胞的后代中。它正常情况下含有上面提及的选择标记之一，该选择标记介导转化植物细胞例如对杀生物剂如膦丝菌素或抗生素如卡那霉素，G418，博来霉素或湿霉素的抗性，允许通过某种糖或氨基酸的存在与否来选择。因此每个选择的标记都应该允许从未导入DNA的细胞中挑选相转化的细胞。

转化的细胞在植物体内按常规方式生长(参见McCormick等，Plant Cell Reports 5(1986),81-84)。得到的植物可正常生长，与具有相同转化种质或其它种质的植物杂交。由此形成的杂交个体具有相应的表型特征。从植物细胞可获得种子。应该培养两代或多代以保证这种表型特征保持稳定并遗传。也应取得种子以保证保持相应的表型或其它特征。

下列实施例将举例说明本发明，并不构成任何限制。1．克隆方法

应用载体pBluescriptⅡSK(Stratagene)在大肠杆菌中克隆。2．细菌菌株

对于Bluescript载体和反义结构，应用大肠杆菌菌株DH5α(Bethesda Research Laboratories,Gaitherburg,USA)。对于体内切割应用大肠杆菌菌株xL1-Blue。3．未成熟小麦胚的转化培养基MS：100ml/l宏观盐    (D.Becker和H.Lorz,Plant Tissue

1ml/l微观盐      Culture Manual(1996),B12：1-20)

2ml/l            Fe/NaEDTA

30g/l            蔗糖#30：MS+2,4-D(2mg/l)#31：MS+2,4-D(2ml/l)+膦丝菌素(PPT,除草剂BASTA的活性组分(2mg/l))#32：MS+2,4-D(0.1mg/l)+PPT(2mg/l)#39：MS+2,4-D(2mg/ml)+每次0.5N甘露醇/山梨醇所给出的培养基用KOH调节到pH值为5.6,并用0.3％Gelrite固化。

用于转化小麦的不成熟胚的方法由Becker和Lorz(D.Becker和H.Lrz.Plant Tissue Culture Manual(1996),B12：1-20)发展和优化。

下面描述的实验是根据Becker和Lrz(Ioc.Cit)开发的方法进行的。

用于转化，收取开花期后12-14天成长阶段的小颖果的穗状花序，并表面消毒。分离出的胚鳞以胚轴面对培养基铺到诱导培养基#30上面。

在2-4天预培养(26℃，暗)后，将外植体转移到培养基#39上进行渗透预培养(2-4h，26℃，暗)。

对于基因枪转化，每次发射使用约29μg金粒子，在其上面沉积有几μg的目标DNA。因为进行的是共转化实验，目标DNA以1∶1的比例由目标基因和抗性标记基因(bar基因)组成，添加到沉积层。4．DNA片段的DIG标记

用作筛选探针的DNA片段，通过特定的PCR使用DIG标记的dUTP(Boehringer Mannheim，德国)来标记。

实施例中应用的培养基和溶液：20×SSC    175.3 g NaCl

       88.2g  柠檬酸钠

       用双蒸水加至1000ml

       用10N NaOH调节pH值为7.0

质粒pTaSU 8A根据布达佩斯条约以保藏号DSM12795保藏在德国Braunschweig的DSMZ，质粒pTaSU19的保藏号为DSM12796.实施例1：识别，分离和鉴定编码小麦(Triticum aestivum L.,cvFlorida)异淀粉酶(糖样同系物)的cDNA

为了识编码小麦异淀粉酶(糖样)的同工型的cDNA，采用了异源筛选的策略。为此，将小麦的cDNA文库用玉米的糖样探针筛选。

探针(糖样探针)是从玉米cDNA文库借助特异引物通过PCR扩增而分离的。玉米cDNA文库按生产厂家的说明(λZAPⅡ-cDNA合成试剂盒，Stratagene GmbH,Heidelberg，德国)克隆自λZapⅡ载体中的等量13,17,19,20,22,25和28天龄(DAP)颖果混合物的poly(A)+RNA。在所用的所有颖果中，除了13天龄的核外都在RNA分离前去除了胚。

作为探针用于筛选小麦cDNA文库的DNA片段用下面的引物扩增：sulp-1：5’AAAGGCCCAATATTATCCTTTAGG 3’(SEQ ID No.4)sulp-2：5’GCCATTTCAACCGTTCTGAAGTCGGGAAGTC 3’(SEQ ID No.5)

作为PCR反应的模板，使用2μl扩增的玉米cDNA文库。PCR反应还含有1.5-3mM的MgCl₂,20mM Tris-HCl(pH为8.4),50mM KCl,0.8mM dNTP混合物，1μM引物sulp-1a,1μM引物sulp-2和2.5单位Taq聚合酶(重组，Life Technologies)。扩增实验使用Biometra公司的Trioblock按照以下方案进行：4’(分钟)/95℃;1’/95℃；45″(秒)/58℃；1’15″/72℃；30个循环5’/72℃。约990bp的扩增DNA带在琼脂糖凝胶中分离并切下。由这个片段按上述同样的方案进行第二次扩增。由第二次扩增得到的990bp片段用限制酶BAM HI切割为220bp和770bp的片段。在糖样片段在琼脂糖凝胶中再次分离，切下条带并分离片段后，探针用DIG标记。对于用地高辛配基的随机引物标记，使用500ng糖样片段。为此将10μl随机引物加入到欲标记的片段中，反应加热至95-100℃5分钟。加热后，添加0.1mM dATP,0.1mM dGTP,0.1mM dCTP和0.065mM dTTP和0.035mM地高辛配基-11-dUTP(Boehringer Mannheim)，以及Klenow缓冲液(标准)和1单位Klenow聚合酶。反应在室温下过夜进行。为了检查标记情况，按生产厂家说明(德国Boehringer,Mannheim公司的“The DIG System User’s Guidefor Filter Hybridization”)进行点杂交试验。

小麦cDNA文库是按生产厂家的说明(λZAPⅡ-cDNA合成试剂盒，Stratagene GmbH,Heidelberg)从λZapⅡ载体中的约21天龄(淀粉样胚乳)颖果的poly(A)+RNA合成的。测定cDNA文库的滴度后，测得1.26×10⁶pfu/ml的原滴度。

为筛选小麦cDNA文库，约350,000噬菌体铺板。噬菌体的铺板和板的印迹按标准程序来完成。滤膜在5×SSC,3％包封剂(Boehringer,Mannheim)，0.2％SDS，0.1％月桂基肌氨酸钠和50μg/ml的鲱鱼精子DNA在55℃下进行预杂交和杂交。向杂交溶液中加入1ng/ml的标记糖样探针，将杂交混合物保温过夜。滤膜的洗涤如下：在2×SSC，1％SDS中在室温下2×5分；在1×SSC中，0.5％SDS，55℃下2×10分；在0.5×SSC，0.2％SDS，55℃下2×10分。单个阳性克隆通过进一步的筛选循环来分离。通过体内切割得到作为pBluescript SK噬粒的单个克隆(按类似生产厂家的说明进行；Stratagene,Heidelberg，德国)。

在通过小量制备和质粒DNA的限制性分析之后，克隆pTaSU-19在DSMZ-德国微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlungfur Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)以DSM 12796号保藏，并进一步分析。实施例2：质粒pTaSU19的cDNA插入片段的序列分析

从克隆pTaSU19中分离质粒DNA，借助二脱氧核糖核苷酸方法(Sanger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74(1977),5463-5467)测定cDNA插入片段的序列。

克隆TaSU-19的插入片段长度是2997bp,构成部分cDNA。核苷酸序列示于Seq.ID No.1。与已发表的序列比较表明，Seq ID No.1所包含的编码序列与其它生物体的异淀粉酶具有同源性。

序列分析还表明，在cDNA序列中位置297-396(内含子1)和1618-2144(内含子2)存在两个内含子。如果去除这两个内含子，可衍生出与其它生物体异淀粉酶的蛋白质序列有同源性的蛋白质序列。Seq ID No.1编码区域相应的氨基酸序列示于Seq ID No.3。实施例3植物转化载体pTa-α-SU19的产生

为了表达TaSU19-cDNA相应的反义RNA，在基础质粒pUC19的基础上构建了植物转化载体pTa-α-SU19，其中质粒pTa-α-SU19的cDNA插入片段以反义方向与遍在蛋白启动子的3’端连接。该启动子由玉米遍在蛋白1基因的第一个不翻译的外显子和第一个内含子组成(Christensen A.H.等，Plant Mo1ecular Bio1ogy 19(1992),675-689)。多接头和NOS终止子部分来自质粒pActl.cas(CAMBIA,TG0063；Cambia,GPO Box3200,Canberra ACT 2601，澳大利亚)。带此终止子的载体结构和基于pActl.cas的结构由MCEIroy等有报道(Molecular Breeding 1(1995),27-37)。这样得到的载体称为pUbi.caS。

载体的克隆如下：由克隆Ta-SU19用限制酶Xbal切下2kb片段，这个片段借助Klenow反应填平末端，然后连接在表达载体pUbi.caS的Smal克隆位点。

产生的表达载体称为Ta-α-SU19,用于按上述转化小类。实施例4：从小麦(Triticum aesivum L,,cv Florida)分离和鉴定其它编码异淀粉酶(糖样1-同系物)的cDNA

小麦的cDNA文库用代表克隆pTaSU19的一部分即Seq.ID No.1的489-1041位的糖样探针筛选。

用于筛选cDNA文库的小麦特异性地高辛配基标记的糖样探针，借助于PCR扩增来制备。这个反应中使用的引物是：SUS01：5’-GCT TTA CGG GTA CAG GTT CG-3’(Seq.ID No.8)和SUS02：5’-AAT TCC CCG TTT GTG AGC-3’(Seq.ID No.9)

作为模板，在反应中使用1ng pTaSU19质粒。另外，PCR反应含有各300nM的引物SUS01和SUS02，各100μM的核苷酸dATP,dGTP,dCTP，65μM TTP，35μM的地高辛配基-11-dUTP(BoehringerMannheim)，1.5mM MgCl₂,以及2.5U(单位)Taq聚合酶和10μl 10倍浓度的Taq聚合酶反应缓冲液(两者均来自Life Technologies)。反应的终体积为100μl。扩增在下列温度程序下在PCR仪(TRIO^Thermoblock,Biometra)上完成：在95℃，3分(一次)；在95℃，45秒-在55℃，45秒-在72℃，2分(30个循环)；在72℃，5分(1次)。得到553bp的DNA片段。地高辛配基-11-dUTP加入PCR产品中与没有地高辛配基-11-dUTP的对照反应的产物相比，显示出在琼脂糖凝胶中较小的迁移率。

实施例1中的颖果特异性小麦cDNA文库用得到的地高辛配基标记的探针筛选。

杂交一步在5xSSC，0.2％SDS，0.1％月桂基肌氨酸钠和50μg/ml鲱油精子DNA中，在68℃下，在1ng/ml的地高辛配基标记的探针存在下完成。杂交后，将滤膜如下洗涤：在2xSSC，1％SDS中室温下2x5分，在1xSSC，0.5％SDS中68℃下2x10分；在0.5xSSC，0.2％SDS中68℃下2×10分。单个阳性克隆通过至少另两个筛选循环而挑选出。通过体内切割从噬菌体克隆pBluescript SK获得质粒(按生产厂家的说明；Stratagene,Heidelberg，德国)。限制性分析得到的克隆后，克隆pTaSU8A以DSM12795保藏在德国微生物和细胞培养物保藏中心(DSMZ)并进一步研究。实施例5：质粒pTaSU8A中cDNA插入片段的序列分析

质粒pTaSU8A中cDNA插入片段的核苷酸序列借助二脱氧核糖核苷酸方法测定(Seq.ID No.6)。

克隆pTaSU8A的插入片段长度为2437bp,构成部分cDNA。与已经发表的序列相比表明，Seq.ID No.6所示序列包括与其它生物体异淀粉酶具有同源性的编码区。同样，由克隆pTaSUSA的编码区推导的蛋白质序列(如Seq.ID No.7所示)与其它生物体的异淀粉酶的蛋白质序列具有同源性。比较克隆pTaSU19(Seq.ID No.1)和pTaSU8A(Seq.ID No.6)的序列，得到的相似性为96.8％。大多数序列差别位于cDNA的3’非翻译区。其余在编码区中的序列差别导致推导的蛋白序列(Seq.ID No.3和7)中共12个位置上的氨基酸不同。pTaSU19和pTaSU8A含有的cDNA不完全相同，都编码小麦异淀粉酶的同工形式。实施例6：植物转化载体pTa-α-SU8A的生产

为了表达相应于TaSUSA cDNA的反义RNA，基于基础质粒pUC19构建了植物转化载体pTa-α-SU8A，其中通过PCR扩增产生的TSU8A cDNA的一部分以反义方向和遍在蛋白启动子的3’端连接。该启动子由玉米遍在蛋白1基因的第一个非翻译外显子和第一个内含子组成(Christensen A.H.等，Plant Mol.Biol.18(1992),675-689)。多接头和NOS终止子部分来自质粒pAct1.cas(CAMBIA,TG0063；Cambia，GPO Box 3200，Canberra ACT 2601，澳大利亚)。带有该终止子的载体结构以及基于pActl.cas的结构，由McElroy等(Molecular Breeding 1(1995),27-37)报道。带有遍在蛋白启动子、多接头和NOS终止子并基于pUC19的载体称为pUbi.cas。

对于pTa-α-SU8A的克隆，借助PCR扩增TaSU8A-cDNA的约2.2kb部分，即Seq.ID No.6的140-2304位。

本反应中使用的引物是：SUEX3：5’-GCG GTA CCT CTA GAA GGA GAT ATA CAT ATG GCGGAG GAC AGG TAC GCG CTC-3’(Seq.ID No.10)和SUEX4：5’-GCT CGA GTC GAC TCA AAC ATC AGG GCG CAA TAC-3’(Seq.ID No.11)。

作为模板，反应中使用1ng质粒pTaSU8A。此外PCR反应含有：各300nM的引物SUEX3和SUEX4，各200μM的核苷酸dATP、dGTP、dCTP和dTTP，1.6mM MgCl₂，60mM Tris-SO₄(pH为9.1)，18mM(NH₄)₂SO₄以及1μl Elongase酶混合物(Taq聚合酶和DNA聚合酶的混合物，Life Technologies)。反应的终体积为50μl。在PCR仪上(TRIOThermoblock Biometra)在下列温度程序下进行扩增：94℃,1分(1次)；95℃，30秒-55℃，30秒-68℃，2分30秒(30个循环)；68℃，10分(1次)。反应得到长度为2205bp的DNA片段。

2.2kb的产物用KpnI和Sal Ⅰ限制性酶切,与预先用Kpn 1和Sal Ⅰ切割的表达载体pUbi.cas连接。这样得到的植物转化载体称为pTa-α-SU8A，如上所述用于小麦的转化。

              序列表<110>Hoechst Schering AgrEvo GmbH<120>编码参与淀粉合成的小麦酶的核酸分子<150> DE 198 20 608.9<151> 1998-05-08<160> 11<210> 1<211> 2997<212> DNA<213> Triticum aestivum L.cv. Florida<220><221> CDS<222> (3)  … (296)；(397)  …  (1617)；  (2145)  …  (2960)GG TCG GGG CCG GCG CCG CGC CTG CGA CGG TGG CGA CCC AAT GCG ACG           47Ser G1y Pro Ala Pro Arg Leu Arg Arg Trp Arg Pro Asn Ala Thr1               5                  10                  15GCG GGG AAG GGG GTC GGC GAG GTG TGC GCC GCG GTT GTC GAG GCG GCG           95Ala Gly Lys Gly Val Gly Glu Val Cys Ala Ala Val Val Glu Ala Ala20                  25                  30ACG AAG GTA GAG GAC GAG GGG GAG GAG GAC GAG CCG GTG GCG GAG GAC         143Thr Lys Val Glu Asp Glu Gly Glu Glu Asp Glu Pro Val Ala Glu Asp35                  40                  45AGG TAC GCG CTC GGC GGC GCG TGC AGG GTG CTC GCC GGA ATG CCC GCG         191Arg Tyr Ala Leu Gly Gly Ala Cys Arg Val Leu Ala Gly Met Pro Ala50                  55                  60CCG CTG GGC GCC ACC GCG CTC GCC GGC GGG GTC AAT TTC GCC GTC TAT         239Pro Leu Gly Ala Thr Ala Leu Ala Gly Gly Val Asn Phe Ala Val Tyr65                  70                  75TCC GGC GGA GCC ACC GCC GCG GCG CTC TGC CTC TTC ACG CCA GAA GAT         287Ser Gly Gly Ala Thr Ala Ala Ala Leu Cys Leu Phe Thr Pro Glu Asp80                  85                  90                  95CTC AAG GCG GTGGGGTTGC CTCCCGAGTA GAGTTCATCA GCTTTGCGTG                 336Leu Lys AlaCGCCGCGCGC CCCTTTTTTG GGCCTGCAAT TTAAGTTTTG TACTGGGGCA AATGCTGCAG       396GAT AGG GTG ACC GAG GAG GTT CCC CTT GAC CCC CTG ATG AAT CGG ACC         444Asp Arg Val Thr Glu Glu Val Pro Leu Asp Pro Leu Met Asn Arg Thr1               5                  10                  15GGG AAC GTG TGG CAT GTC TTC ATC GAA GGC GAG CTG CAC AAC ATG CTT         492Gly Asn Val Trp His Val Phe Ile Glu Gly Glu Leu His Asn Met Leu20                  25                  30TAC GGG TAC AGG TTC GAC GGC ACC TTT GCT CCT CAC TGC GGG CAC TAC        540Tyr Gly Tyr Arg Phe Asp Gly Thr Phe Ala Pro His Cys Gly His Tyr         35                  40                  45CTT GAT GTT TCC AAT GTC GTG GTG GAT CCT TAT GCT AAG GCA GTG ATA        588Leu Asp Val Ser Asn val Val Val Asp Pro Tyr Ala Lys Ala Val Ile50                  55                  60AGC CGA GGG GAG TAT GGT GTT CCA GCG CGT GGT AAC AAT TGC TGG CCT        636Ser Arg Gly Glu Tyr Gly Val Pro Ala Arg Gly Asn Asn Cys Trp Pro65                  70                  75                  80CAG ATG GCT GGC ATG ATC CCT CTT CCA TAT AGC ACG TTT GAT TGG GAA        684Gln Met Ala Gly Met Ile Pro Leu Pro Tyr Ser Thr Phe Asp Trp Glu85                  90                  95GGC GAC CTA CCT CTA AGA TAT CCT CAA AAG GAC CTG GTA ATA TAT GAG        732Gly Asp Leu Pro Leu Arg Tyr Pro Gln Lys Asp Leu Val Ile Tyr Glu100                 105                 110ATG CAC TTG CGT GGA TTC ACG AAG CAT GAT TCA AGC AAT GTA GAA CAT        780Met His Leu Arg Gly Phe Thr Lys His Asp Ser Ser Asn Val Glu His115                 120                 125CCG GGT ACT TTC ATT GGA GCT GTG TCG AAG CTT GAC TAT TTG AAG GAG         828Pro Gly Thr Phe Ile Gly Ala Val Ser Lys Leu Asp Tyr Leu Lys Glu130                 135                 140CTT GGA GTT AAT TGT ATT GAA TTA ATG CCC TGC CAT GAG TTC AAC GAG         876Leu Gly Val Asn Cys Ile Glu Leu Met Pro Cys His Glu Phe Asn Glu145                 150                 155                 160CTG GAG TAC TCA ACC TCT TCT TCC AAG ATG AAC TTT TGG GGA TAT TCT         924Leu Glu Tyr Ser Thr Ser Ser Ser Lys Met Asn Phe Trp Gly Tyr Ser165                 170                 175ACC ATA AAC TTC TTT TCA CCA ATG ACA AGA TAC ACA TCA GGC GGG ATA         972Thr Ile Asn Phe Phe Ser Pro Met Thr Arg Tyr Thr Ser Gly Gly Ile180                 185                 190AAA AAC TGT GGG CGT GAT GCC ATA AAT GAG TTC AAA ACT TTT GTA AGA         1020Lys Asn Cys Gly Arg Asp Ala Ile Asn Glu Phe Lys Thr Phe Val Arg195                 200                 205GAG GCT CAC AAA CGG GGA ATT GAG GTG ATC CTG GAT GTT GTC TTC AAC         1068Glu Ala His Lys Arg Gly Ile Glu Val Ile Leu Asp Val Val Phe Ash210                 215                 220CAT ACA GCT GAG GGT AAT GAG AAT GGT CCA ATA TTA TCA TTT AAG GGG         1116His Thr Ala Glu Gly Asn Glu Asn Gly Pro Ile Leu Ser Phe Lys Gly225                 230                 235                 240GTC GAT AAT ACT ACA TAC TAT ATG CTT GCA CCC AAG GGA GAG TTT TAT         1164Val Asp Asn Thr Thr Tyr Tyr Met Leu Ala Pro Lys Gly Glu Phe Tyr                245                 250                 255AAC TAT TCT GGC TGT GGG AAT ACC TTC AAC TGT AAT CAT CCT GTG GTT        1212Asn Tyr Ser Gly Cys Gly ASh Thr Phe Asn Cys Asn His Pro Val Val260                 265                 270CGT CAA TTC ATT GTA GAT TGT TTA AGA TAC TGG GTG ACG GAA ATG CAT        1260Arg Gln Phe Ile Val Asp Cys Leu Arg Tyr Trp Val Thr Glu Met His275                 280                 285GTT GAT GGT TTT CGT TTT GAT CTT GCA TCC ATA ATG ACC AGA GGT TCC        1308Val Asp Gly Phe Arg Phe Asp Leu Ala Ser Ile Met Thr Arg Gly Ser290                 295                 300AGT CTG TGG GAT CCA GTT AAC GTG TAT GGA GCT CCA ATA GAA GGT GAC        1356Ser Leu Trp Asp Pro Val Asn Val Tyr Gly Ala Pro Ile Glu Gly Asp305                 310                 315                 320ATG ATC ACA ACA GGG ACA CCT CTT GTT ACT CCA CCA CTT ATT GAC ATG        1404Met Ile Thr Thr Gly Thr Pro Leu Val Thr Pro Pro Leu Ile Asp Met325                 330                 335ATC AGC AAT GAC CCA ATT CTT GGA GGC GTC AAG CTC ATT GCT GAA GCA        1452Ile Ser Asn Asp Pro Ile Leu Gly Gly Val Lys Leu Ile Ala Glu Ala340                 345                 350TGG GAT GCA GGA GGC CTC TAT CAA GTA GGT CAA TTC CCT CAC TGG AAT        1500Trp Asp Ala Gly Gly Leu Tyr Gln Val Gly Gln Phe Pro His Trp Asn355                 360                 365GTT TGG TCT GAG TGG AAT GGG AAG TAC CGG GAC ATT GTG CGT CAA TTC        1548Val Trp Ser Glu Trp Asn Gly Lys Tyr Arg Asp Ile Val Arg Gln Phe370                 375                 380ATT AAA GGC ACT GAT GGA TTT GCT GGT GGT TTT GCC GAA TGT CTT TGT        1596Ile Lys Gly Thr Asp Gly Phe Ala Gly Gly Phe Ala Glu Cys Leu Cys385                 390                 395                 400GGA AGT CCA CAC CTA TAC CAG GTAAGTTGTG GCAATACTTG TAAATGAGTT           1647Gly Ser Pro His Leu Tyr Gln405GAGTGAATGT CACCTGGATT TTTTATATAT ACCACATGAT GATACACATC TAAATATATA      1707ACAATCATAG TGTATGCATA TGCATTTGGC TAAGAAGTAT TAGTGTATAC ACTAGTGCTA      1767TATATAGGTT TTAACACCCA ACTTGCCAAT GAAGGAACAT AGGGCTTTCT AGTTATCTTA      1827TTTATTTGTC CGGTGAATAA TCCACTGAAA AATTCCAGCC ATGTCATTTT TTAGGGGGGG      1887AGAAGAAACT ATATTGATTT GCCCCCCTAA AAGAAGCCAT CTCAGAATTC ATAGGTAAGT      1947TGCTTTTCTG TAAAGAAAGG AAAACGACTT CATACTTTCT ATCGGTGCTA ACTTAGCTCG      2007ATGTATATTT GTAAGATGAA TGCCAAATTT AATTTGTCGG ATAATTTGAT CTGTTATTCA      2067CAAATTTCTA TTTGGTTTCT CTAGAAATCA AACCAGTAAC TTGTTATTGG CACTGCAACT       2127TCTTATTGAT TAATCAG GCA GGA GGA AGG AAA CCT TGG CAC AGT ATC AAC          2177Ala Gly Gly Arg Lys Pro Trp His Ser Ile Ash1               5                  10TTT GTA TGT GCA CAT GAT GGA TTT ACA CTG GCT GAT TTG GTA ACA TAT         2225Phe Val Cys Ala His Asp Gly Phe Thr Leu Ala Asp Leu Val Thr Tyr15                  20                  25AAT AAG AAG TAC AAT TTA CCA AAT GGG GAG AAC AAC AGA GAT GGA GAA         2273Asn Lys Lys Tyr Asn Leu Pro Asn Gly Glu Asn Asn Arg Asp Gly Glu30                  35                  40AAT CAC AAT CTT AGC TGG AAT TGT GGG GAG GAA GGA GAA TTC GCA AGA         2321Asn His Asn Leu Ser Trp Asn Cys Gly Glu Glu Gly Glu Phe Ala Arg45                  50                  55TTG TCT GTC AAA AGA TTG AGG AAG AGG CAG ATG CGC AAT TTC TTT GTT         2369Leu Ser Val Lys Arg Leu Arg Lys Arg Gln Met Arg Asn Phe Phe Val60                  65                  70                  75TGT CTC ATG GTT TCT CAA GGA GTT CCA ATG TTC TAC ATG GGT GAT GAA         2417Cys Leu Met Val Ser Gln Gly Val Pro Met Phe Tyr Met Gly Asp Glu80                  85                  90TAT GGC CAC ACA AAA GGG GGC AAC AAC AAT ACA TAC TGC CAT GAT TCT         2465Tyr Gly His Thr Lys Gly Gly Asn Asn Asn Thr Tyr Cys His Asp Ser95                 100                 105TAT GTC AAT TAT TTT CGC TGG GAT AAA AAA GAA CAA TAC TCT GAG TTG         2513Tyr Val Asn Tyr Phe Arg Trp Asp Lys Lys Glu Gln Tyr Ser Glu Leu110                 115                 120CAC CGA TTC TGC TGC CTC ATG ACC AAA TTC CGC AAG GAG TGC GAG GGT         2561His Arg Phe Cys Cys Leu Met Thr Lys Phe Arg Lys Glu Cys Glu Gly125                 130                 135CTT GGC CTT GAG GAC TTT CCA ACG GCC AAA CGG CTG CAG TGG CAT GGT         2609Leu Gly Leu Glu Asp Phe Pro Thr Ala Lys Arg Leu Gln Trp His Gly140                 145                 150                 155CAT CAG CCT GGG AAG CCT GAT TGG TCT GAG AAT AGC CGA TTC GTT GCC         2657His Gln Pro Gly Lys Pro Asp Trp Ser Glu Asn Ser Arg Phe Val Ala160                 165                 170TTT TCC ATG AAA GAT GAA AGA CAG GGC GAG ATC TAT GTG GCC TTC AAC         2705Phe Ser Met Lys Asp Glu Arg Gln Gly Glu Ile Tyr Val Ala Phe Asn175                 180                 185ACC AGC CAC TTA CCG GCC GTT GTT GAG CTC CCA GAG CGC GCA GGG CGC         2753Thr Ser His Leu Pro Ala Val Val Glu Leu Pro Glu Arg Ala Gly Arg        190                 195                 200CGG TGG GAA CCG GTG GTG GAC ACA GGC AAG CCA GCA CCA TAC GAC TTC        2801Arg Trp Glu Pro Val Val Asp Thr Gly Lys Pro Ala Pro Tyr Asp Phe205                 210                 215CTC ACC GAC GAC TTA CCT GAT CGC GCT CTC ACC ATA C AC CAG TTC TCG       2849Leu Thr Asp Asp Leu Pro Asp Arg Ala Leu Thr Ile His Gln Phe Ser220                 225                 230                 235CAT TTC CTC TAC TCC AAC CTC TAC CCC ATG CTC AGC TAC TCA TCG GTC        2897His Phe Leu Tyr Ser Asn Leu Tyr Pro Met Leu Ser Tyr Ser Ser Val240                 245             250ATC CTA GTA TTG CGC CCT GAT GTT TGA GAG ACC AAT ATA TAC AGT AAA        2945Ile Leu Val Leu Arg Pro Asp Val  *  Glu Thr Asn Ile Tyr Ser Lys255                 260                 265TAA TAT GTC TAT ATG TAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAA           2997*  Tyr Val Tyr Met270<210>                         2<211>                         2295<212>                         DNA<213>                         Triticum aestivum L. cv. Florida<220><223>                         cDNA<400>                         2GGTCGGGGCC GGCGCCGCGC CTGCGACGGT GGCGACCCAA TGCGACGGCG GGGAAGGGGG          60TCGGCGAGGT GTGCGCCGCG GTTGTCGAGG CGGCGACGAA GGTAGAGGAC GAGGGGGAGG         120AGGACGAGCC GGTGGCGGAG GACAGGTACG CGCTCGGCGG CGCGTGCAGG GTGCTCGCCG         180GAATGCCCGC GCCGCTGGGC GCCACCGCGC TCGCCGGCGG GGTCAATTTC GCCGTCTATT         240CCGGCGGAGC CACCGCCGCG GCGCTCTGCC TCTTCACGCC AGAAGATCTC AAGGCGGTGG         300GGTTGCCTCC CGAGTAGAGT TCATCAGCTT TGCGTGCGCC GCGCGCCCCT TTTTTGGGCC         360TGCAATTTAA GTTTTGTACT GGGGCAAATG CTGCAGGATA GGGTGACCGA GGAGGTTCCC         420CTTGACCCCC TGATGAATCG GACCGGGAAC GTGTGGCATG TCTTCATCGA AGGCGAGCTG         480CACAACATGC TTTACGGGTA CAGGTTCGAC GGCACCTTTG CTCCTCACTG CGGGCACTAC         540CTTGATGTTT CCAATGTCGT GGTGGATCCT TATGCTAAGG CAGTGATAAG CCGAGGGGAG         600TATGGTGTTC CAGCGCGTGG TAACAATTGC TGGCCTCAGA TGGCTGGCAT GATCCCTCTT         660CCATATAGCA CGTTTGATTG GGAAGGCGAC CTACCTCTAA GATATCCTCA AAAGGACCTG         720GTAATATATG AGATGCACTT GCGTGGATTC ACGAAGCATG ATTCAAGCAA TGTAGAACAT      780CCGGGTACTT TCATTGGAGC TGTGTCGAAG CTTGACTATT TGAAGGAGCT TGGAGTTAAT      840TGTATTGAAT TAATGCCCTG CCATGAGTTC AACGAGCTGG AGTACTCAAC CTCTTCTTCC      900AAGATGAACT TTTGGGGATA TTCTACCATA AACTTCTTTT CACCAATGAC AAGATACACA      960TCAGGCGGGA TAAAAAACTG TGGGCGTGAT GCCATAAATG AGTTCAAAAC TTTTGTAAGA     1020GAGGCTCACA AACGGGGAAT TGAGGTGATC CTGGATGTTG TCTTCAACCA TACAGCTGAG     1080GGTAATGAGA ATGGTCCAAT ATTATCATTT AAGGGGGTCG ATAATACTAC ATACTATATG     1140CTTGCACCCA AGGGAGAGTT TTATAACTAT TCTGGCTGTG GGAATACCTT CAACTGTAAT     1200CATCCTGTGG TTCGTCAATT CATTGTAGAT TGTTTAAGAT ACTGGGTGAC GGAAATGCAT     1260GTTGATGGTT TTCGTTTTGA TCTTGCATCC ATAATGACCA GAGGTTCCAG TCTGTGGGAT     1320CCAGTTAACG TGTATGGAGC TCCAATAGAA GGTGACATGA TCACAACAGG GACACCTCTT     1380GTTACTCCAC CACTTATTGA CATGATCAGC AATGACCCAA TTCTTGGAGG CGTCAAGCTC     1440ATTGCTGAAG CATGGGATGC AGGAGGCCTC TATCAAGTAG GTCAATTCCC TCACTGGAAT     1500GTTTGGTCTG AGTGGAATGG GAAGTACCGG GACATTGTGC GTCAATTCAT TAAAGGCACT     1560GATGGATTTG CTGGTGGTTT TGCCGAATGT CTTTGTGGAA GTCCACACCT ATACCAGGTA     1620AGTTGTGGCA ATACTTGTAA ATGAGTTGAG TGAATGTCAC CTGGATTTTT TATATATACC     1680ACATGATGAT ACACATCTAA ATATATAACA ATCATAGTGT ATGCATATGC ATTTGGCTAA     1740GAAGTATTAG TGTATACACT AGTGCTATAT ATAGGTTTTA ACACCCAACT TGCCAATGAA     1800GGAACATAGG GCTAICTAGT TATCTTATTT ATTTGTCCGG TGAATAATCC ACTGAAAAAT     1860TCCAGCCATG TCATTTTTTA GGGGGGGAGA AGAAACTATA TTGATTTGCC CCCCTAAAAG     1920AAGCCATCTC AGAATTCATA GGTAAGTTGC TTTTCTGTAA AGAAAGGAAA ACGACTTCAT     1980ACTTTCTATC GGTGCTAACT TAGCTCGATG TATATTTGTA AGATGAATGC CAAATTTAAT     2040TTGTCGGATA ATTTGATCTG TTATTCACAA ATTTCTATTT GGTTTCTCTA GAAATCAAAC     2100CAGTAACTTG TTATTGGCAC TGCAACTTCT TATTGATTAA TCAGGCAGGA GGAAGGAAAC     2160CTTGGCACAG TATCAACTTT GTATGTGCAC ATGATGGATT TACACTGGCT GATTTGGTAA     2220CATATAATAA GAAGTACAAT TTACCAAATG GGGAGAACAA CAGAGATGGA GAAAATCACA     2280ATCTTAGCTG GAATTGTGGG GAGGAAGGAG AATTCGCAAG ATTGTCTGTC AAAAGATTGA     2340GGAAGAGGCA GATGCGCAAT TTCTTTGTTT GTCTCATGGT TTCTCAAGGA GTTCCAATGT      2400TCTACATGGG TGATGAATAT GGCCACACAA AAGGGGGCAA CAACAATACA TACTGCCATG      2460ATTCTTATGT CAATTATTTT CGCTGGGATA AAAAAGAACA ATACTCTGAG TTGCACCGAT      2520TCTGCTGCCT CATGACCAAA TTCCGCAAGG AGTGCGAGGG TCTTGGCCTT GAGGACTTTC      2580CAACGGCCAA ACGGCTGCAG TGGCATGGTC ATCAGCCTGG GAAGCCTGAT TGGTCTGAGA      2640ATAGCCGATT CGTTGCCTTT TCCATGAAAG ATGAAAGACA GGGCGAGATC TATGTGGTCT      2700TCAACACCAG CCACTTACCG GCCGTTGTTG AGCTCCCAGA GCGCGCAGGG CGCCGGTGGG      2760AACCGGTGGT GGACACAGGC AAGCCAGCAC CATACGACTT CCTCACCGAC GACTTACCTG      2820ATCGCGCTCT CACCATACAC CAGTTCTCGC ATTTCCTCTA CTCCAACCTC TACCCCATGC      2880TCAGCTACTC ATCGGTCATC CTAGTATTGC GCCCTGATGT TTGAGAGACC AATATATACA      2940GTAAATAATA TGTCTATATG TAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAA         2997210>                        3<211>                       764<212>                       PRT<213>                       Triticum aestivum L. cv. Florida<400>                       3Ser Gly Pro Ala Pro Arg Leu Arg Arg Trp Arg Pro Asn Ala Thr Ala1               5                  10                  15Gly Lys Gly Val Gly Glu Val Cys Ala Ala Val Val Glu Ala Ala Thr20                  25                  30Lys Val Glu Asp Glu Gly Glu Glu Asp Glu Pro Val Ala Glu Asp Arg35                  40                  45Tyr Ala Leu Gly Gly Ala Cys Arg Val Leu Ala Gly Met Pro Ala Pro50                  55                  60Leu Gly Ala Thr Ala Leu Ala G1y G1y Val Asn Phe Ala Val Tyr Ser65                  70                  75                  80Gly Gly Ala Thr Ala Ala Ala Leu Cys Leu Phe Thr Pro Glu Asp Leu85                  90                  95Lys Ala Asp Arg Val Thr Glu Glu Val Pro Leu Asp Pro Leu Met Asn100                 105                 110Arg Thr Gly Asn Val Trp His Val Phe Ile Glu Gly Glu Leu His Asn115                 120                 125Met Leu Tyr Gly Tyr Arg Phe Asp Gly Thr Phe Ala Pro His Cys Gly130                 135                 140His Tyr Leu Asp Val Ser Asn Val Val Val Asp Pro Tyr Ala Lys Ala145                 150                 155                 160Val Ile Ser Arg Gly Glu Tyr Gly Val Pro Ala Arg Gly ASn Asn Cys165                 170                 175Trp Pro Gln Met Ala Gly Met Ile Pro Leu Pro Tyr Ser Thr Phe Asp180                 185                 190Trp Glu Gly Asp Leu Pro Leu Arg Tyr Pro Gln Lys Asp Leu Val Ile195                 200                 205Tyr Glu Met His Leu Arg Gly Phe Thr Lys His Asp Ser Ser Asn Val210                 215                 220Glu His Pro Gly Thr Phe Ile Gly Ala Val Ser Lys Leu Asp Tyr Leu225                 230                 235                 240Lys Glu Leu Gly Val Asn Cys Ile Glu Leu Met Pro Cys His Glu Phe245                 250                 255Asn Glu Leu Glu Tyr Ser Thr Ser Ser Ser Lys Met Asn Phe Trp Gly260                 265                 270Tyr Ser Thr Ile Asn Phe Phe Ser Pro Met Thr Arg Tyr Thr Ser Gly275                 280                 285Gly Ile Lys Asn Cys Gly Arg Asp Ala Ile Asn Glu Phe Lys Thr Phe290                 295                 300Val Arg Glu Ala His Lys Arg Gly Ile Glu Val Ile Leu Asp Val Val305                 310                 315                 320Phe Asn His Thr Ala Glu Gly Asn Glu Asn Gly Pro Ile Leu Ser Phe325                 330                 335Lys Gly Val Asp Asn Thr Thr Tyr Tyr Met Leu Ala Pro Lys Gly Glu340                 345                 350Phe Tyr Asn Tyr Ser Gly Cys Gly Asn Thr Phe Asn Cys Asn His Pro355                 360                 365Val Val Arg Gln Phe Ile Val Asp Cys Leu Arg Tyr Trp val Thr Glu370                 375                 380Met His Val Asp Gly Phe Arg Phe Asp Leu Ala Ser Ile Met Thr Arg385                 390                 395                 400Gly Ser Ser Leu Trp Asp Pro Val Asn Val Tyr Gly Ala Pro Ile Glu405                 410                 415Gly Asp Met Ile Thr Thr Gly Thr Pro Leu Val Thr Pro Pro Leu Ile420                 425                 430Asp Met Ile Ser Asn Asp Pro Ile Leu Gly Gly Val Lys Leu Ile Ala435                 440                 445Glu Ala Trp Asp Ala Gly Gly Leu Tyr Gln Val Gly Gln Phe Pro His450                 455                 460Trp Asn Val Trp Ser Glu Trp Asn Gly Lys Tyr Arg Asp Ile Val Arg465                 470                 475                 480Gln Phe Ile Lys Gly Thr Asp Gly Phe Ala Gly Gly Phe Ala Glu Cys485                 490                 495Leu Cys Gly Ser Pro His Leu Tyr Gln Ala Gly Gly Arg Lys Pro Trp500                 505                 510His Ser Ile Asn Phe Val Cys Ala His Asp Gly Phe Thr Leu Ala Asp515                 520                 525Leu Val Thr Tyr Asn Lys Lys Tyr Asn Leu Pro Asn Gly Glu Asn Asn530                 535                 540Arg Asp Gly Glu Asn His Asn Leu Ser Trp Asn Cys Gly Glu Glu Gly545                 550                 555                 560Glu Phe Ala Arg Leu Ser Val Lys Arg Leu Arg Lys Arg Gln Met Arg565                 570                 575Asn Phe Phe Val Cys Leu Met Val Ser Gln Gly Val Pro Met Phe Tyr580                 585                 590Met Gly Asp Glu Tyr Gly His Thr Lys Gly Gly Asn Asn Asn Thr Tyr595                 600                 605Cys His Asp Ser Tyr Val Asn Tyr Phe Arg Trp Asp Lys Lys Glu Gln610                 615                 620Tyr Ser Glu Leu His Arg Phe Cys Cys Leu Met Thr Lys Phe Arg Lys625                 630                 635                 640Glu Cys Glu Gly Leu Gly Leu Glu Asp Phe Pro Thr Ala Lys Arg Leu645                 650                 655Gln Trp His Gly His Gln Pro Gly Lys Pro Asp Trp Ser Glu Asn Ser660                 665                 670Arg Phe Val Ala Phe Ser Met Lys Asp Glu Arg Gln Gly Glu Ile Tyr675                 680                 685Val Ala Phe Asn Thr Ser His Leu Pro Ala Val Val Glu Leu Pro Glu690                 695                 700Arg Ala Gly Arg Arg Trp Glu Pro Val Val Asp Thr Gly Lys Pro Ala705                 710                 715                 720Pro Tyr Asp Phe Leu Thr Asp Asp Leu Pro Asp Arg Ala Leu Thr Ile725                 730                 735His Gln Phe Ser His Phe Leu Tyr Ser Asn Leu Tyr Pro Met Leu Ser740                 745                 750Tyr Ser Ser Val Ile Leu Val Leu Arg Pro Asp Val755                 760<2l0><211>    24<212>    DNA<213>    人工序列<220><223>    引物<400>    4AAAGGCCCAA TATTATCCTT TAGG    24<210>    5<211>    31<212>    DNA<213>    人工序列<220><223>    引物<400>                         5GCCATTTCAA CCGTTCTGAAGTCGGGAAGT C                                                     31<210>                         6<211>                         2437<212>                         DNA<213>                         Triticum aestivum L. cv. Florida<220><222>                         CDS<223>                         (16)  …  (2304)<400>                          6GAATTCGGCA CGAGG CCG GCG CCG CGC CTG CGA CGG TGG CGG CCC AAT GCG          51Pro Ala Pro Arg Leu Arg Arg Trp Arg Pro Asn Ala1               5                  10ACG GCG GGG AAG GGG GTC GGC GAG GTC TGC GCC GCG GTT GTC GAG GTG           99Thr Ala Gly Lys Gly Val Gly Glu Val Cys Ala Ala Val Val Glu Val         15                  20                  25GCG ACG AAG GCC GAG GAT GAG GGG GAG GAG GAC GAG CCG GTG GCG GAG         147Ala Thr Lys Ala Glu Asp Glu Gly Glu Glu Asp Glu Pro Val Ala Glu30                  35                  40GAC AGG TAC GCG CTC GGC GGC GCG TGC AGG GTG CTC GCC GGA ATG CCC         195Asp Arg Tyr Ala Leu Gly Gly Ala Cys Arg Val Leu Ala Gly Met Pro45                  50                  55                  60ACG CCG CTG GGC GCC ACC GCG CTC GCC GGC GGG GTC AAT TTC GCC GTC         243Thr Pro Leu Gly Ala Thr Ala Leu Ala Gly Gly Val Asn Phe Ala Val65                  70                  75TAC TCC GGC GGA GCC ACA GCC GCG GCG CTC TGC CTC TTC ACG CCA GAA         291Tyr Ser Gly Gly Ala Thr Ala Ala Ala Leu Cys Leu Phe Thr Pro Glu80                  85                  90GAT CTC AAG GCG GAT AGG GTG ACG GAG GAG GTT CCC CTT GAC CCC CTG         339Asp Leu Lys Ala Asp Arg Val Thr Glu Glu Val Pro Leu Asp Pro Leu95                 100                 105ATG AAT CGG ACT GGG AAC GTA TGG CAT GTC TTC ATC GAA GGC GAG CTG         387Met Asn Arg Thr Gly Asn Val Trp His Val Phe Ile Glu Gly Glu Leu110                 115                 120CAG GAC ATG CTT TAC GGG TAC AGG TTC GAC GGC ACC TTT GCT CCT CAC         435Gln Asp Met Leu Tyr Gly Tyr Arg Phe Asp Gly Thr Phe Ala Pro His125                 130                 135                 140TGC GGG CAC TAC CTT GAT GTT TCC AAT GTC GTG GTG GAT CCT TAT GCT         483Cys Gly His Tyr Leu Asp Val Ser Asn Val Val Val Asp Pro Tyr Ala145                 150                     155AAG GCA GTG ATA AGC CGA GGG GAG TAT GGT GTT CCG GCG CGT GGT AAC         531Lys Ala Val Ile Ser Arg Gly Glu Tyr Gly Val Pro Ala Arg Gly Asn160                 165                 170AAT TGC TGG CCT CAG ATG GCT GGC ATG ATC CCT CTT CCA TAT AGC ACG         579Asn Cys Trp Pro Gln Met Ala Gly Met Ile Pro Leu Pro Tyr Ser Thr175                 180                 185TTT GAT TGG GAA GGC GAC CTA CCT CTA AGA TAT CCT CAA AAG GAC CTG         627Phe Asp Trp Glu Gly Asp Leu Pro Leu Arg Tyr Pro Gln Lys Asp Leu190                 195                 200GTA ATA TAT GAG ATG CAC TTG CGT GGA TTC ACG AAG CAT GAT TCA AGC         675Val Ile Tyr Glu Met His Leu Arg Gly Phe Thr Lys His Asp Ser Ser205                 210                 215                 220AAT GTA GAA CAT CCC GGT ACT TTC ATT GGG GCT GTG TCG AAG CTT GAC         723Asn Val Glu His Pro Gly Thr Phe Ile Gly Ala Val Ser Lys Leu Asp                225                 230                 235TAT TTG AAG GAG CTT GGA GTT AAT TGT ATT GAG TTA ATG CCC TGC CAT         771Tyr Leu Lys Glu Leu Gly Val Asn Cys Ile Glu Leu Met Pro Cys His240                 245                 250GAG TTC AAC GAG CTG GAG TAC TCA ACC TCT TCT TCC AAG ATG AAC TTT         819Glu Phe Asn Glu Leu Glu Tyr Ser Thr Ser Ser Ser Lys Met Asn Phe255                 260                 265TGG GGA TAT TCT ACC ATA AAC TTC TTT TCA CCA ATG ACG AGA TAC ACA         867Trp Gly Tyr Ser Thr Ile Asn Phe Phe Ser Pro Met Thr Arg Tyr Thr270                 275                 280TCA GGC GGG ATA AAA AAC TGT GGG CGT GAT GCC ATA AAT GAG TTC AAA         915Ser Gly Gly Ile Lys Asn Cys Gly Arg Asp Ala Ile Asn Glu Phe Lys285                 290                 295                 300ACT TTT GTA AGA GAG GCT CAC AAA CGG GGA ATT GAG GTG ATC CTG GAT         963Thr Phe Val Arg Glu Ala His Lys Arg Gly Ile Glu Val Ile Leu Asp305                 310                 315GTT GTC TTC AAC CAT ACA GCT GAG GGT AAT GAG AAT GGT CCA ATA TTA        1011Val Val Phe Asn His Thr Ala Glu Gly Asn Glu Asn Gly Pro Ile Leu320                 325                 330TCA TTT AGG GGG GTC GAT AAT ACT ACA TAC TAT ATG CTT GCA CCC AAG        1059Ser Phe Arg Gly Val Asp Asn Thr Thr Tyr Tyr Met Leu Ala Pro Lys335                 340                 345GGA GAG TTT TAT AAC TAT TCT GGC TGT GGG AAT ACC TTC AAC TGT AAT        1107Gly Glu Phe Tyr Asn Tyr Ser Gly Cys Gly Asn Thr Phe Asn Cys Asn350                 355                 360CAT CCT GTG GTT CGT CAATTC ATT GTA GAT TGT TTA AGA TAC TGG GTG         1155His Pro Val Val Arg Gln Phe Ile Val Asp Cys Leu Arg Tyr Trp Val365                 370                 375                 380ACG GAA ATG CAT GTT GAT GGT TTT CGT TTT GAT CTT GCA TCC ATA ATG        1203Thr Glu Met His Val Asp Gly Phe Arg Phe Asp Leu Ala Ser Ile Met385                 390                 395ACC AGA GGT TCC AGT CTG TGG GAT CCA GTT AAC GTG TAT GGA GCT CCA        1251Thr Arg Gly Ser Ser Leu Trp Asp Pro Val Asn Val Tyr Gly Ala Pro400                 405                 410ATA GAA GGT GAC ATG ATC ACA ACA GGG ACA CCT CTT GTT ACT CCA CCA        1299Ile Glu Gly Asp Met Ile Thr Thr Gly Thr Pro Leu Val Thr Pro Pro415                 420                 425CTT ATT GAC ATG ATC AGC AAT GAC CCA ATT CTT GGA GGC GTC AAG CTC        1347Leu Ile Asp Met Ile Ser Asn Asp Pro Ile Leu Gly Gly Val Lys Leu    430                 435                 440GTT GCT GAA GCA TGG GAT GCA GGA GGC CTC TAT CAA GTA GGT CAA TTC       1395Val Ala Glu Ala Trp Asp Ala Gly Gly Leu Tyr Gln Val Gly Gln Phe445                 450                 455                 460CCT CAC TGG AAT GTT TGG TCT GAG TGG AAT GGG AAG TAC CGG GAC ATT       1443Pro His Trp Asn Val Trp Ser Glu Trp Asn Gly Lys Tyr Arg Asp Ile465                 470                 475GTG CGT CAA TTC ATT AAA GGC ACT GAT GGA TTT GCT GGT GGT TTT GCC       1491Val Arg Gln Phe Ile Lys Gly Thr Asp Gly Phe Ala Gly Gly Phe Ala480                 485                 490GAA TGT CTT TGT GGA AGT CCA CAC CTA TAC CAG GCA GGA GGA AGG AAA       1539Glu Cys Leu Cys Gly Ser Pro His Leu Tyr Gln Ala Gly Gly Arg Lys495                 500                 505CCT TGG CAC AGT ATC AAC TTT GTA TGT GCA CAC GAT GGA TTT ACA CTG       1587Pro Trp His Ser Ile Asn Phe Val Cys Ala His Asp Gly Phe Thr Leu510                 515                 520GCT GAT TTG GTA ACA TAT AAT AAC AAG TAC AAT TTA CCA AAT GGG GAG       1635Ala Asp Leu Val Thr Tyr Asn Asn Lys Tyr Asn Leu Pro Asn Gly Glu525                 530                 535                 540AAC AAC AGA GAT GGA GAA AAT CAC AAT CTT AGC TGG AAT TGT GGG GAG       1683Asn Asn Arg Asp Gly Glu Asn His Asn Leu Ser Trp Asn Cys Gly Glu545                 550                 555GAA GGA GAA TTC GCA AGA TTG TCT GTC AAA AGA TTG AGG AAG AGG CAG       1731Glu Gly Glu Phe Ala Arg Leu Ser Val Lys Arg Leu Arg Lys Arg Gln560                 565                 570ATG CGC AAT TTC TTT GTT TGT CTC ATG GTT TCT CAA GGA GTT CCA ATG       1779Met Arg Asn Phe Phe Val Cys Leu Met Val Ser Gln Gly Val Pro Met575                 580                 585TTC TAC ATG GGT GAT GAA TAT GGC CAC ACA AAA GGG GGC AAC AAC AAT       1827Phe Tyr Met Gly Asp Glu Tyr Gly His Thr Lys Gly Gly Asn Asn Asn590                 595                     600ACA TAC TGC CAT GAT TCT TAT GTC AAT TAT TTT CGC TGG GAT AAA AAA       1875Thr Tyr Cys His Asp Ser Tyr Val Ash Tyr Phe Arg Trp Asp Lys Lys605                 610                 615                 620GAA CAA TAC TCT GAC TTG CAC CGA TTC TGT TGC CTC ATG ACC AAA TTC       1923Glu Gln Tyr Ser Asp Leu His Arg Phe Cys Cys Leu Met Thr Lys Phe625                 630                 635CGC AAG GAG TGC GAG GGT CTT GGC CTT GAG GAT TTT CCA ACG GCC GAA       1971Arg Lys Glu Cys Glu Gly Leu Gly Leu Glu Asp Phe Pro Thr Ala Glu            640                 645                 650CGG CTG CAG TGG CAT GGT CAT CAG CCT GGG AAG CCT GAT TGG TCT GAG        2019Arg Leu Gln Trp His Gly His Gln Pro Gly Lys Pro Asp Trp Ser Glu655                 660                 665AAT AGC CGA TTC GTT GCC TTT TCC ATG AAA GAT GAA AGA CAG GGC GAG        2067Asn Ser Arg Phe Val Ala Phe Ser Met Lys Asp Glu Arg Gln Gly Glu670                 675                 680ATC TAT GTG GCC TTC AAC ACC AGC CAC TTA CCG GCC GTT GTT GAG CTC        2115Ile Tyr Val Ala Phe Asn Thr Ser His Leu Pro Ala Val Val Glu Leu685                 690                 695                 700CCG GAG CGC ACA GGG CGC CGG TGG GAA CCG GTG GTG GAC ACA GGC AAG        2163Pro Glu Arg Thr Gly Arg Arg Trp Glu Pro Val Val Asp Thr Gly Lys705                 710                 715CCA GCA CCA TAC GAC TTC CTC ACT GAC GAC TTA CCT GAT CGC GCT CTC        2211Pro Ala Pro Tyr Asp Phe Leu Thr Asp Asp Leu Pro Asp Arg Ala Leu720                 725                 730ACC ATA CAC CAG TTC TCT CAT TTC CTC AAC TCC AAC CTC TAC CCC ATG        2259Thr Ile His Gln Phe Ser His Phe Leu Asn Ser Asn Leu Tyr Pro Met735                 740                 745CTC AGC TAC TCATCG GTC ATC CTA GTA TTG CGC CCT GAT GTT TGAGAGGCGG      2311Leu Ser Tyr Ser Ser Val Ile Leu Val Leu Arg Pro Asp Val750                 755                 760ATATACAGTAAATAATATGT ATATATGTAG TCCTTTGGCG TATTATCAGT GTGCACAATT       2371GCTCTATTGC CAATGATCTA TTCGATCCAC AGATACATGT GCAAAAAAAA AAAAAAAAAA      2431CTCGAG                                                                 2437<210>                           7<211>                           764<212>                           PRT<213〉                          Triticum aesTivum L.cv. Florida<400>                           7Pro Ala Pro Arg Leu Arg Arg Trp Arg Pro Asn Ala Thr Ala Gly Lys1               5                  10                  15Gly Val Gly Glu Val Cys Ala Ala Val Val Glu Val Ala Thr Lys Ala20                  25                  30Glu Asp Glu Gly Glu Glu Asp Glu Pro Val Ala Glu Asp Arg Tyr Ala35                  40                  45Leu Gly Gly Ala Cys Arg Val Leu Ala Gly Met Pro Thr Pro Leu Gly50                  55                  60Ala Thr Ala Leu Ala Gly Gly Val Asn Phe Ala Val Tyr Ser Gly Gly65                  70                  75                  80Ala Thr Ala Ala Ala Leu Cys Leu Phe Thr Pro Glu Asp Leu Lys Ala85                  90                  95Asp Arg Val Thr Glu Glu Val Pro Leu Asp Pro Leu Met Asn Arg Thr100                 105                 110Gly Asn Val Trp His Val Phe Ile Glu Gly Glu Leu Gln Asp Met Leu115                 120                 125Tyr Gly Tyr Arg Phe Asp Gly Thr Phe Ala Pro His Cys Gly His Tyr130                 135                 140Leu Asp Val Ser Asn Val Val Val Asp Pro Tyr Ala Lys Ala Val Ile145                 150                 155                 160Ser Arg Gly Glu Tyr Gly Val Pro Ala Arg Gly Asn Asn Cys Trp Pro165                 170                 175Gln Met Ala Gly Met Ile Pro Leu Pro Tyr Ser Thr Phe Asp Trp Glu180                 185                 190Gly Asp Leu Pro Leu Arg Tyr Pro Gln Lys Asp Leu Val Ile Tyr Glu195                 200                 205Met His Leu Arg Gly Phe Thr Lys His Asp Ser Ser Asn Val Glu His210                 215                 220Pro Gly Thr Phe Ile Gly Ala Val Ser Lys Leu Asp Tyr Leu Lys Glu225                 230                 235                 240Leu Gly Val Asn Cys Ile Glu Leu Met Pro Cys His Glu Phe Asn Glu245                 250                 255Leu Glu Tyr Ser Thr Ser Ser Ser Lys MeT Asn Phe Trp Gly Tyr Ser260                 265                 270Thr Ile Asn Phe Phe Ser Pro Met Thr Arg Tyr Thr Ser Gly Gly Ile275                 280                 285Lys Asn Cys Gly Arg Asp Ala Ile Asn Glu Phe Lys Thr Phe Val Arg290                 295                 300Glu Ala His Lys Arg Gly Ile Glu Val Ile Leu Asp Val val Phe Asn305                 310                 315                 320His Thr Ala Glu Gly Asn Glu Asn Gly Pro Ile Leu Ser Phe Arg Gly325                 330                 335Val Asp Asn Thr Thr Tyr Tyr Met Leu Ala Pro Lys Gly Glu Phe Tyr340                 345                 350Asn Tyr Ser Gly Cys Gly Asn Thr Phe Asn Cys Asn His Pro val val355                 360                 365Arg Gln Phe Ile Val Asp Cys Leu Arg Tyr Trp Val Thr Glu Met His370                 375                 380Val Asp Gly Phe Arg Phe Asp Leu Ala Ser Ile Met Thr Arg Gly Ser385                 390                 395                 400Ser Leu Trp Asp Pro Val Asn Val Tyr Gly Ala Pro Ile Glu Gly Asp405                 410                 415Met Ile Thr Thr Gly Thr Pro Leu Val Thr Pro Pro Leu Ile Asp Met420                 425                 430Ile Ser Asn Asp Pro Ile Leu Gly Gly Val Lys Leu Val Ala Glu Ala435                 440                 445Trp Asp Ala Gly Gly Leu Tyr Gln Val Gly Gln Phe Pro His Trp Asn450                 455                 460Val Trp Ser Glu Trp Asn Gly Lys Tyr Arg Asp Ile Val Arg Gln Phe465                 470                 475                 480Ile Lys Gly Thr Asp Gly Phe Ala Gly Gly Phe Ala Glu Cys Leu Cys485                 490                 495Gly Ser Pro His Leu Tyr Gln Ala Gly Gly Arg Lys Pro Trp His Ser500                 505                 510Ile Asn Phe Val Cys Ala His Asp Gly Phe Thr Leu Ala Asp Leu Val515                 520                 525Thr Tyr Asn Asn Lys Tyr Asn Leu Pro Asn Gly Glu Asn Asn Arg Asp530                 535                 540Gly Glu Asn His Asn Leu Ser Trp Asn Cys Gly Glu Glu Gly Glu Phe545                 550                 555                 560Ala Arg Leu Ser Val Lys Arg Leu Arg Lys Arg Gln Met Arg Asn Phe565                 570                 575Phe Val Cys Leu Met Val Ser Gln Gly Val Pro Met Phe Tyr Met Gly580                 585                 590Asp Glu Tyr Gly His Thr Lys Gly Gly Asn Asn Asn Thr Tyr Cys His595                 600                 605Asp Ser Tyr Val Asn Tyr Phe Arg Trp Asp Lys Lys Glu Gln Tyr Ser610                 615                 620Asp Leu His Arg Phe Cys Cys Leu Met Thr Lys Phe Arg Lys Glu Cys625                 630                 635                 640Glu Gly Leu Gly Leu Glu Asp Phe Pro Thr Ala Glu Arg Leu Gln Trp645                 650                 655His Gly His Gln Pro Gly Lys Pro Asp Trp Ser Glu Asn Ser Arg Phe660                 665                 670Val Ala Phe Ser Met Lys Asp Glu Arg Gln Gly Glu Ile Tyr Val Ala675                 680                 685Phe Asn Thr Ser His Leu Pro Ala Val Val Glu Leu Pro Glu Arg Thr690                 695                 700Gly Arg Arg Trp Glu Pro Val Val Asp Thr Gly Lys Pro Ala Pro Tyr705                 710                 715                 720Asp Phe Leu Thr Asp Asp Leu Pro Asp Arg Ala Leu Thr Ile His Gln725                 730                 735Phe Ser His Phe Leu Asn Ser Asn Leu Tyr Pro Met Leu Ser Tyr Ser740                 745                 750Ser Val Ile Leu Val Leu Arg Pro Asp Val755                 760<210>    8<211>    20<212>    DNA<213>    人工序列<220><223>    引物<400>    8GCTTTACGGG TACAGGTTCG       20<210>      9<211>      18<212>      DNA<213>     人工序列<223>     引物<400>     9GCTTTACGGG TACAGGTT        18<210>    10<211>    51<213>    人工序列<220><223>    引物<400>    10GCGGTACCTC TAGAAGGAGA TArACATATG GCGGAGGACA GGTACGCGCT C    51<210>     11<211>     33<212>     DNA<213>    人工序列<220><223>    引物<400>    11GCTCGAGTCG ACTCAAACAT CAGGGCGCAA TAC                         33

Claims (26)

1．一种编码具有小麦异淀粉酶功能的蛋白质的核酸分子，选自如下：

(a)编码包含Seq ID No.3或Seq ID No.7所示氨基酸序列的蛋白质的核酸分子，

(b)包含Seq ID No.1、Seq ID No.2或Seq ID No.6所示核苷酸序列或其一部分或其相应的梳糖核苷酸序列的核酸分子，

(c)与(a)或(b)所述核酸分子杂交或与之互补的核酸分子，和

(d)核苷酸序列由于遗传密码子的简并性而与(a)，(b)或(c)所述核酸分子的序列不同的核酸分子。

2．权利要求1的核酸分子，其特征为，它是DNA分子。

3．权利要求2的DNA分子，其特征为，它是cDNA分子。

4．权利要求1至3中的一项或多项的核酸分子，它含有调节元件。

5．权利要求1的核酸分子，其特征为，它是RNA分子。

6．与权利要求1至5中之一的核酸分子特异性杂交的分子。

7．权利要求6的核酸分子，它是长度至少为15个核苷酸的寡核苷酸。

8．含有权利1至5之一的DNA分子的载体。

9．权利要求8的载体，其中所述核酸分子以有义方向与调节元件相连接，这些调节元件可以保证在原核或真核细胞中的转录和可翻译RNA的合成。

10．权利要求8的载体，其中所述核酸分子以有义方向与调节元件连接，这些调节元件可以保证在原核或真核细胞中非翻译性RNA的合成。

11．权利要求8的载体，其中所述核酸分子以反义方向与调节元件相连，这些调节元件保证在原核或真核细胞中非翻译性RNA的合成。

12．一种用权利要求1至5中一项或多项的核酸分子或权利要求8至11中一项或多项的载体转化的宿主细胞或从这种细胞产生的宿主细胞。

13．权利要求1至4中一项或多项的核酸分子编码的蛋白质。

14．一种生产权利要求13的蛋白质的方法，其中权利要求12的宿主细胞在允许所述蛋白质合成的条件下培养，然后从培养的细胞和/或培养基中分离所述蛋白质。

15．一种生产转基因植物细胞的方法，其中将

a)权利要求1至5中一项或多项的核酸分子，或

b)权利要求8至11中一项或多项的载体整合在植物细胞的基因组中。

16．一种用权利要求1至5中的一项或多项的核酸分子或权利要求8至11中一项或多项的载体转化的转基因植物细胞或由这种细胞产生的细胞。

17．一种生产转基因植物细胞的方法，其中

a1)权利要求1至5中一项或多项的核酸分子，或

a2)权利要求8至11中一项或多项的载体被整合在植物细胞的基因组中，和

b)由所述植物细胞再生整株植物。

18．一种含有权利要求16的植物细胞的植物。

19．权利要求19的植物，它是单子叶或双子叶植物。

20．权利要求19的植物，它是作物植物。

21．权利要求20的植物，它是储存淀粉的植物。

22．权利要求21的植物，它是玉米，水稻，马铃薯或小麦植物。

23．权利要求18至22中一项或多项的植物的繁殖材料。

24．一种可从权利要求16的植物细胞、权利要求18至22中一项或多项的植物或从权利要求23的繁殖材料得到的淀粉。

25．权利要求24的淀粉在生产食品或食品半成品、优选烘烤食品或膏状食品的用途。

26．权利中要求24的淀粉在生产包装材料或一次性物品中的用途。