CN1299415A - 编码小麦淀粉合成相关酶的核酸分子 - Google Patents

Abstract

本发明涉及编码酶的核酸分子,所述酶参与植物淀粉的合成。这些酶中涉及得自小麦的可溶性淀粉合酶。本发明还涉及含有上述核酸分子的载体和宿主细胞,尤其是经转化的植物细胞以及由其再生的植物,它们表现出本发明淀粉合酶的活性增加或降低。

Description

编码小麦淀粉合成相关酶的核酸分子

本发明涉及编码参与植物淀粉合成之小麦酶的核酸分子。所述酶是可溶性的1-型淀粉合酶。

本发明还涉及含有本发明的核酸分子的载体，宿主细胞，植物细胞和植物。

另外，本发明还描述了产生转基因植物的方法，所述转基因植物因导入了本发明的核酸分子而能合成特性有所改变的淀粉。

最近，由于能用作可再生原料的植物成分的重要性日渐增加，生物技术研究的一个目的致力于改变这些植物原料以适应加工业的需求。另外，为了使可再生的原料能用于尽可能多的领域，必须产生多种多样的材料。

除了油，脂肪和蛋白质外，多糖构成了重要的植物可再生原料。除了纤维素外，淀粉(高等植物中最重要的贮存物之一)在多糖中占据核心位置。从此意义上讲，小麦是最重要的作物之一，因为它所提供的淀粉约占欧盟淀粉总产量的20％。

多糖淀粉是化学均一单位-葡萄糖分子的聚合物。然而，它是不同分子类型高度复杂的混合物，其不同体现在下列几个方面，即聚合化程度，葡萄糖链分支的出现及其链长，另外，它还可以被衍生化，例如磷酸化。因此，淀粉不能构成均一的原料。尤其是，直链淀粉(实质上是由1,4-糖苷键连接的葡萄糖分子的未分支的聚合物)与支链淀粉有所不同，后者构成具有不同分支的葡萄糖链的复杂混合物。因1,6-糖苷键的额外出现而产生分支。在小麦中，直链淀粉约占所合成淀粉总量的11至37％。

为了以尽可能多的方式将适当的淀粉用于范围尽可能宽的工业需求，需要提供能合成对多种目的特别适用的经修饰淀粉的植物。提供这种植物的一个可能的方法是应用植物育种法。然而，由于小麦的特征为多倍体(四-和六倍体)，已证实植物育种很难对淀粉合成施加影响。最近，通过使天然突变体杂交才产生了“蜡质”(不含直链淀粉的)小麦(Nakamura等，Mol.Gen.Genet.248(1995)，253-259)。

另一种植物育种法是通过重组方法特异性修饰产淀粉植物。然而，该方法的前提条件是鉴定并表征参与淀粉合成和/或淀粉修饰的酶并分离编码这些酶的核酸分子。

导致淀粉合成的生物化学途径实际上是已知的。植物细胞中的淀粉合成在质体中进行。在具有光合作用活性的组织中，这些质体是叶绿体，在不具有光合作用活性的淀粉贮存组织中，这些质体是造粉体。

参与淀粉合成的重要的酶是淀粉合酶和分支酶。已有人描述了多种淀粉合酶同工型，它们都能通过将ADP-葡萄糖上的葡糖基残基转移至α-1,4-葡聚糖上而催化聚合反应。分支酶催化将α-2,6-分支导入线性α-1,4-葡聚糖。

淀粉合酶可分为两类：即与淀粉粒结合的淀粉合酶(“结合淀粉粒的淀粉合酶”；GBSS)和可溶性淀粉合酶(“可溶性淀粉合酶”；SSS)。这种区别方式总是不确定的，因为一些淀粉合酶能同时以与淀粉粒结合的形式和固体形式存在(Denyer等，植物学杂志，4(1993),191-198；Mu等，植物学杂志，6(1994),151-159)。另外还有人依次描述了多种植物的上述两类淀粉合酶的多种同工型，这些同工型彼此之间的不同之处在于它们对启动分子的依赖性(所谓的引物依赖型(Ⅱ型)和非引物依赖型(Ⅰ型)淀粉合酶)。

迄今为止，仅测定了同工型GBSSⅠ在淀粉合成过程中的确切功能，其中该酶合成不含直链淀粉的(所谓的蜡质)淀粉的活性大大降低或全面降低(Shure等，细胞35(1983),225-233；Visser等，Mol.Gen-Genet.225(1991),289-296；WO92/11376),由这一结果可推测得到下列假说，即该酶在直链淀粉的合成过程中起着决定性的作用。在绿藻雷氏衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)的细胞中也观察到这一现象(Delrue等，细菌学杂志，174(1992),3612-3620)。另外，在衣藻属中可以阐明GBSSⅠ不仅参与直链淀粉的合成，对支链淀粉的合成也起着一定的作用。不具有GBSSⅠ活性的突变体缺乏正常合成的含有较长链葡聚糖的特定支链淀粉组分。

迄今为止，仍不清楚与淀粉粒结合的淀粉合酶(尤其是GBSS Ⅱ)和可溶性淀粉合酶的其它同工型的功能。推测可溶性淀粉合酶与分支酶一起参与支链淀粉的合成(例见Ponstein等，植物生理学，29(1990),234-241)，它们在调节淀粉合成速率方面起着重要作用。

对小麦而言，已在蛋白质水平上鉴定了至少两个与淀粉粒结合的淀粉合酶同工型(60kDA和100-105kDA)和另一个可能代表可溶性淀粉合酶的同工型(Denyer等，Planta 196(1995),256-265；Rahman等，澳大利亚植物生理学杂志，22(1995),793-803)。早先已借助于层析法检测到几种SSS同工型的存在(Rijven，植物生理学，81(1986),448-453)。编码小麦GBSSⅠ的cDNA已经有人描述(Ainsworth等，植物分子生物学，22(1993),67-82)。

迄今为止，已从WO97/45545中得知编码小麦淀粉合酶同工型的核酸序列或该核酸的亚序列。但编码除GBSS Ⅰ外的淀粉合酶的cDNA序列仅在豌豆(Dry等，植物学杂志，2(1992),193-202)，水稻(Baba等，植物生理学，103(1993),565-573)和马铃薯(Edwards等，植物学杂志，8(1995),283-294)中得以描述。不仅在小麦中，也在一系列其它的植物种中鉴定了可溶性的淀粉合酶。例如，已从豌豆(Denyer和Smith,Planta 186(1992),609-617)和马铃薯(Edwards等，植物学杂志，8(1995),283-294)中分离到均一的可溶性淀粉合酶。在这些情况下，被鉴定为SSS Ⅲ的可溶性淀粉合酶同工型和与淀粉粒结合的淀粉合酶GBSS Ⅱ相同(Denyer等，植物学杂志，4(1993),191-198;Edwards等，植物学杂志，8(1995),283-294)相同。借助于层析法，还在诸如大麦的其它一些种类的植物中鉴定出多种SSS同工型的存在(Tyynela和Schulman,Physiologica Plantarum 89(1993)835-841；Kreis,Planta 148(1980),412-416)。然而，至今无人描述过编码这些蛋白质的DNA序列。

为了提供另一些能改变任何贮存淀粉的植物，优选为谷类植物，尤其是小麦，使得它们能合成经修饰淀粉的方法，在每种情况下都必须鉴定出编码淀粉合酶其它同工型的DNA序列。

因此，本发明的目的是提供核酸分子，尤其是得自小麦的核酸分子，所述核酸分子编码参与淀粉生物合成的酶，这样就可以产生经基因修饰的植物，从而产生化学和/或物理特性有所改变的植物淀粉。

通过提供在专利权利要求书中所描述的使用形式即可达到此目的。

因此，本发明涉及核酸分子，其编码的蛋白质具有可溶性小麦淀粉合酶的活性，优选所述核酸分子编码的蛋白质实质上含有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。本发明特别地涉及含有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列或其部分及其相应的核糖核苷酸序列的核酸分子，优选核酸分子含有SEQ ID NO：1所示的编码区，尤其优选核酸分子含有SEQ ID NO：1的第9至570位核苷酸。

本发明还涉及与本发明的核酸分子之一可杂交的核酸分子。

本发明还涉及编码可溶性小麦淀粉合酶的核酸分子，其序列因遗传密码的简并性而与上述分子的核苷酸序列有所不同。

本发明还涉及具有与上述序列之一的全部或部分互补之序列的核酸分子。

本发明上下文中所用术语“杂交”指的是在常规杂交条件下，优选在严紧条件下进行杂交，所述条件描述于例如Sambrook等，分子克隆，实验室手册，第2版(1989)，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约。尤其优选在下列条件下进行“杂交”：

杂交缓冲液：2×SSC；10×Denhardt溶液(Ficoll 400+PEG+BSA；比例1∶1∶1)；0.1％SDS；5mM EDTA；50mM Na₂HPO₄；250μg/ml鲱精DNA;50μg/m tRNA；或0.25M磷酸钠缓冲液pH7.2；1mM EDTA；7％SDS

杂交温度：  T=65至70℃

洗涤缓冲液：0.2×SSC；0.1％SDS

洗涤温度：  T=40至75℃

原则上，与本发明的核酸分子可杂交的核酸分子能编码得自任何表达淀粉合酶之小麦植物的淀粉合酶。

与本发明的分子可杂交的核酸分子能分离自例如小麦或小麦植物组织的基因组文库或cDNA文库，或者也可通过重组方法或化学合成方法产生。

使用本发明的分子或其部分或其反向互补序列，通过例如按标准方法(例见Sambrook等，分子克隆，实验室手册，第2版(1989)，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约)进行杂交可鉴定和分离这种核酸分子。可以使用的杂交探针是例如具有与SEQ ID NO：1所示相同或基本上相同的核苷酸序列或其部分的核酸分子。用作杂交探针的片断也可以是借助于常规合成技术制备而成的合成片断，该片断的序列与本发明核酸分子的序列基本上一致。

与本发明的核酸分子可杂交的分子也包括编码本发明之小麦淀粉合酶的上述核酸分子的片断，衍生物和等位基因变体。应理解，“片断”指的是长度足以编码所述蛋白质之一的核酸分子部分。本文所用术语“衍生物”指的是这些分子的序列与上述核酸分子的序列有一个或多个位置不同，并与这些序列有高水平的同源性。“同源性”指的是序列同一性至少为40％，尤其是同一性至少为60％，优选同一性大于80％，尤其优选大于90％。相对于上述核酸分子而言的差异是通过缺失，取代，插入或重组产生的。

另外，“同源性”也指本发明的核酸分子或其编码的蛋白质之间存在功能和/或结构等同性。与上述分子同源并构成这些分子的衍生物的核酸分子原则上是这些分子的变异，其构成表现出相同生物功能的修饰。它们可以是天然变异，例如得自其它生物体的序列，或者也可以是突变，其中突变可以是天然的，也可以通过定点诱变导入。另外，变异可以是合成产生的序列。等位基因变体既可以是天然变体也可以是合成产生的变体或通过重组DNA技术产生的变体。

由本发明的核酸分子的多种变体编码的蛋白质具有某些共同的特征。所述特征包括例如酶活性，分子量，免疫反应性，构象等，或者物理特性，如在凝胶电泳中的迁移特性，层析特性，沉降系数，溶解性，光谱特征，带电特征，稳定性；最适pH，最适温度等。

淀粉合酶的重要特征是：ⅰ)它们位于植物细胞质体的基质中；ⅱ)它们能合成线性α-1,4-连接的葡聚糖。按Deyer和Smith(Plante186(1992),606-617)所述可测定该活性。由本发明的核酸分子编码的蛋白质是可溶性的小麦Ⅰ型淀粉合酶。这些蛋白质具有某些与先前已知的其它植物的可溶性淀粉合酶同源的区域。

本发明的核酸分子可以是DNA分子，尤其是cDNA或基因组分子。另外，本发明的核酸分子可以是RNA分子，它可由例如本发明的核酸分子转录得到。本发明的核酸分子可以得自例如天然来源，或者可通过重组技术或合成产生。

本发明还涉及与本发明的核酸分子特异性杂交的寡核苷酸。所述寡核苷酸的长度优选至少为10个，尤其是至少为15个，特别优选至少为50个核苷酸。本发明的寡核苷酸能与本发明的核酸分子特异性杂交，即与编码其它蛋白质，尤其是其它淀粉合酶的核酸序列不杂交或仅有很低程度的杂交。本发明的寡核苷酸可用作例如PCR反应的引物或用作杂交探针以分离相关基因。同样，它们可以是反义构建体的组分或编码适当核酶的DNA分子的组分。

本发明还涉及载体，尤其是质粒，粘粒，噬粒，病毒，噬菌体和基因工程常规使用的其它载体，所述载体含有本发明的上述核酸分子。所述载体适于转化原核或真核细胞，优选转化植物细胞。

如果载体与侧翼调节区适当连接，即能特别适用于将本发明的核酸分子整合至植物细胞的基因组中。例如，农杆菌-介导的基因转移中使用的二元载体。优选在有义或反义方向上整合本发明的核酸分子以确保在转化的原核或真核细胞中合成可翻译的，或(适当时合成)不可翻译的RNA。

术语“载体”一般指的是本领域技术人员已知的适当辅助物，它可以将单链或双链核酸分子直接转移至宿主细胞，例如DNA或RNA病毒，病毒片断，当缺乏或存在调节元件时适于将核酸转移至细胞中的质粒构建体，或支持材料，如玻璃纤维或颗粒枪法中所用的金属颗粒，也可包括通过化学或物理方法直接导入细胞的核酸分子。

在优选的实施方案中，载体中的核酸分子与调节元件相连，这样可确保在原核或真核细胞中转录和合成可翻译的RNA，或必要时确保合成不可翻译的RNA。

在原核细胞，例如大肠杆菌中表达本发明的核酸分子对于更详细地鉴定由这些分子编码的酶的活性至关重要。尤其是，当植物细胞中缺乏其它参与淀粉合成的酶时，由此可鉴定上述酶的合成产物。从而清楚地了解上述蛋白质在植物细胞淀粉合成过程中所发挥的作用。

另外，可通过常规的分子生物学技术(例见Sambrook等，分子克隆实验室手册，第2版(1989)，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约)，在本发明的核酸分子中导入多种形式的突变，从而合成生物特性有所改变的蛋白质。一方面，可以产生缺失突变体，其中通过连续缺失编码DNA序列的5’或3’末端而产生核酸分子，从而合成相应的截短蛋白质。核苷酸序列5’末端的缺失能够鉴定出例如何种氨基酸序列负责将酶运送至质体(转运肽)。这样就可以直接产生因除去了上述序列而不再位于质体，但位于胞质溶胶中的酶，或者产生因添加了其它信号序列而位于其它区室中的酶。

另一方面，可在改变其氨基酸序列能影响例如酶活性或酶调节的位置处导入点突变。通过这种方法，可以产生例如Km值有所改变的突变体，或产生不再受细胞中正常存在的别构调节或共价修饰之类的调节机制影响的突变体。

另外，通过例如使用ADP-葡萄糖-6-磷酸替代ADP-葡萄糖可以产生底物或产物特异性有所改变的本发明蛋白质的突变体。另外，可以产生活性-温度分布图有所改变的本发明蛋白质的突变体。

为了对原核细胞进行重组修饰，可将本发明的核酸分子或其部分导入允许发生诱变的质粒中，或者通过重组DNA序列来改变序列。可进行碱基交换，或借助于标准方法(例见Sambrook等，分子克隆，实验室手册，第2版(1989)，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约)添加天然或合成的序列。为了使DNA片断彼此相连，可在片断中添加衔接子或接头。另外，还可进行一些操作以提供适当的限制性裂解位点或消除多余的DNA或限制性裂解位点。在适于插入，缺失或取代之处，可进行体外诱变，引物修复，限制性切割或连接。通常使用的分析方法是序列分析，限制性分析或生物化学和分子生物学的其它方法。

在另一个实施方案中，本发明涉及被本发明的上述核酸分子或本发明的载体转化的宿主细胞，尤其是原核或真核细胞，并涉及由这些转化细胞衍生得到的，含有本发明的核酸分子或载体的细胞。优选这些细胞是原核或真核细胞，尤其是植物细胞。

本发明还涉及具有淀粉合酶活性的蛋白质，所述蛋白质由本发明的核酸分子编码并可通过重组技术制备，本发明还涉及所述蛋白质的制备方法，所述方法包括在本领域技术人员已知的能合成本发明的蛋白质的适当条件下培养本发明的宿主细胞，随后从宿主细胞和/或培养基中分离出该蛋白质。

只要提供了本发明的核酸分子，即可借助于重组方法直接干预植物的淀粉代谢并使其发生变化以合成物理化学特性相对于已知淀粉而言有所变化的经修饰淀粉，所述物化特性如下：直链淀粉/支链淀粉的比例，分支的程度，平均链长，磷酸含量，胶凝特性，形成凝胶或薄膜的特性，淀粉粒大小和/或淀粉粒形状。

因此，可以在植物细胞中表达本发明的核酸分子以增加所述淀粉合酶的活性，或者将本发明的核酸分子导入本身不表达该酶的细胞中。另外，可以通过本领域技术人员已知的方法修饰本发明的核酸分子以得到本发明的淀粉合酶，该酶经修饰后不再受细胞内在调节机制的控制或具有经改变的温度-活性分布图或者底物或产物特异性。

当在植物中表达本发明的核酸分子时，原则上，所合成的蛋白质可以位于植物细胞中的任何所需区室。为了将该蛋白质定位于特定的区室，必须缺失确保定位于质体的序列，必要时，必须将其余的编码区与确保定位于所需区室的DNA序列连接。所述定位序列是已知的(例见Braun等，EMBO J.11(1992),3219-3227；Wolter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85(1988),846-850；Sonnewald等，植物学杂志，1(1991),95-106)。

因此，本发明还涉及产生被本发明的核酸分子或载体转化的转基因植物细胞的方法，其中本发明的核酸分子或本发明的载体整合至植物细胞，被本发明的载体或核酸分子转化的转基因植物细胞，和由这些转化细胞得到的转基因植物细胞的基因组中。本发明的细胞含有一个或多个本发明的核酸分子或载体，它们优选与确保在植物细胞中进行转录的调节DNA元件，尤其是适当的启动子相连接。这些细胞与天然植物细胞的不同之处特别地体现于下列事实：即它们含有这些细胞本身不具有的本发明的核酸分子，或者所述核酸分子整合于细胞基因组的某个非正常(即所述核酸分子一般不会在此出现的)位置，即位于不同的基因组环境中。另外，本发明的转基因植物细胞与天然植物细胞的不同之处还体现在：必要时，除了该细胞中天然出现的核酸分子拷贝外，它们还含有至少一个拷贝稳定整合至其基因组中的本发明的核酸分子。如果导入细胞中的一个或多个核酸分子对已天然存在于细胞中的核酸分子而言是添加的拷贝，那么也可特别地通过下列事实很容易地区分本发明的植物细胞和天然的植物细胞，即这一添加的拷贝或这些添加的拷贝位于基因组中它或它们一般不会出现的位置。借助于例如本领域技术人员众所周知的Southern印迹分析法，以简单的方式即可检查出它们之间的区别。

如果已导入植物基因组中的核酸分子对植物细胞而言是异源序列，转基因植物细胞产生的本发明核酸分子的转录物可使用本领域技术人员已知的方法，例如Northern印迹分析，以简单的方式进行检测。

如果导入的本发明的核酸分子对植物细胞而言为同源序列，可在本发明核酸分子的额外表达的基础上区分本发明的细胞和天然细胞。优选转基因的植物细胞含有更多的本发明核酸分子转录物。通过例如Northern印迹分析可以对其进行检测。在此意义上的“更多”指的是比相应的未经转化的细胞优选至少多10％，优选至少多20％，尤其优选至少多50％转录物。另外，优选细胞表现出相应增加或减少的本发明蛋白质的活性(至少10％，20％或50％)。通过本领域技术人员已知的技术可将转基因的植物细胞再生为完整的植物。

本发明的另一个主题是产生转基因植物的方法，所述方法包括将一个或多个本发明的核酸分子或载体整合至植物细胞的基因组中，再由所述植物细胞再生完整的植物。通过再生本发明的转基因植物细胞得到的植物也是本发明的主题。本发明还涉及含有上述转基因植物细胞的植物。原则上，转基因植物可以是任何一种植物，即不仅是单子叶植物，也可以是双子叶植物。优选它们是有用的植物，优选为合成淀粉或贮存淀粉的植物，尤其优选为黑麦，大麦，燕麦，小麦，高粱和小米，西米，玉米，水稻，豌豆，大豌豆(marrowfat peas)，木薯，马铃薯，番茄，油菜子，大豆，大麻，亚麻，向日葵，豇豆或竹芋(arrowroot)，尤其优选小麦，玉米，水稻和马铃薯。

本发明还涉及本发明植物的繁殖材料，例如果实，种子，块茎，根状茎，幼苗，插条，愈伤组织，原生质体，细胞培养物等。

本发明还涉及制备经修饰淀粉的方法，所述方法包括从上述本发明的植物和/或该植物的贮存淀粉的部位提取淀粉的步骤。

本领域技术人员已知从植物或该植物的贮存淀粉的部位，尤其是从小麦中提取淀粉的方法，参见例如Eckhoff等(谷类植物化学，73(1996)54-57)“淀粉：化学和技术”(编辑：Whistler,BeMiller和Paschall(1994),第2版，Academic Press Inc.London Ltd;ISBN0-12-746270-8；例见第Ⅻ章，p412-468：玉米和高粱淀粉：生产；Watson；第ⅩⅢ章，p469-479；木薯淀粉，竹芋和西米淀粉：生产；Corbishley和Miller；第ⅩⅣ章，p479-490：马铃薯淀粉：生产和用途；Mitch；第ⅩⅤ章，p491-506：小麦淀粉：生产，修饰和用途；Knight和Oson；和第ⅩⅥ章，p507-528：水稻淀粉：生产和用途；Rohmer和Klem)。通常，用于从植物原料中提取淀粉的方法所用的装置为分离器，倾析器，旋液分离器，喷雾干燥器和流化床干燥器。

由于本发明的转基因植物细胞和植物表达本发明的核酸分子，因此，能合成物理化学特性相对于野生型植物合成的淀粉而言有所改变的淀粉，所述物化特性如下：直链淀粉/支链淀粉的比例，分支的程度，平均链长，磷酸含量，胶凝特性，淀粉粒大小和/或淀粉粒形状。尤其是，相对于已知淀粉而言，由这种淀粉制备的凝胶的粘度和/或形成薄膜或凝胶的特性有所改变。

本发明的另一个主题是可得自本发明的植物细胞和植物及其繁殖材料的淀粉，和可通过上述本发明方法得到的淀粉。

另外，使用本发明的核酸分子还可以产生植物细胞和植物，其中本发明蛋白质的活性降低。使用上述核酸分子还可以合成化学和/或物理特性相对于野生型植物细胞产生的淀粉而言有所改变的淀粉。

因此，本发明的另一个主题是含有本发明的核酸分子的转基因植物细胞，所述细胞中的淀粉合酶活性比未经转化的细胞低。

通过例如本领域技术人员已知的方法，使用本发明的核酸分子经表达适当的反义RNA，有义RNA以获得共抑制作用或通过表达适当构建的可特异性裂解编码淀粉合酶之转录物的核酶，即可得到淀粉合酶活性降低的植物细胞，参见Jorgensen(Trends Biotechnol,8(1990),340-344),Niebel等(Curr.Top.Microbiol.Immunol.197(1995),91-103),Flavell等(Curr.Top.Microbiol.Immunol.197(1995),43-46),Palaqui和Vaucheret(植物分子生物学，29(1995),149-159),Vaucheret等(Mol.Gen.Genet.248(1995),311-317),de Borne等(Mol.Gen.Genet.243(1994),613-621)。

为了降低本发明的淀粉合酶的活性，优选通过例如表达反义RNA来降低植物细胞中编码所述淀粉合酶的转录物的数目。

一方面，可以使用包含本发明之蛋白质的全部编码序列(其中包括任何可能存在的侧翼序列)的DNA分子，或者可使用仅包含部分编码序列的DNA分子，但这些部分序列必须足够长以对细胞施加反义作用。通常，使用长度最低为15bp，优选长度为100-500bp，尤其是长度大于500bp的序列足以进行反义抑制。原则上，所用的DNA分子小于5000bp，优选序列小于2500bp。

还可以使用与本发明的DNA分子的序列具有高水平的同源性，但又不完全相同的DNA序列。同源性最低应大于约65％，优选使用同源性为95至100％的序列。

本发明的另一个主题是产生经修饰淀粉的方法，所述方法包括从本发明的细胞或植物和/或该植物贮存淀粉的部位提取淀粉的步骤。

本发明的另一个主题是可得自本发明的细胞或植物及其繁殖材料或其部分的淀粉，以及可通过本发明的方法得到的淀粉。

通过本领域技术人员已知的方法可修饰本发明的淀粉，未经修饰或经修饰的淀粉形式适于食品或非食品部门的多种用途。

原则上，本发明的淀粉的可能的用途可分成两类。一类包括通过酶解或化学方法得到的淀粉水解液，主要是葡萄糖和葡聚糖单位。它们可用作起始物质以进一步进行化学修饰和加工，例如发酵。简化水解方法和对其进行节约设计对于降低成本具有显著意义。目前是使用淀粉葡糖苷酶进行酶解。通过减少酶的用量来节约成本较为简单易行。通过改变淀粉的结构，例如增加淀粉粒的表面积，降低限制所用酶接近的分支或立体结构水平而使淀粉更容易被消化可实现上述目的。

本发明的淀粉因其聚合物结构可用作所谓的天然淀粉的其它用途可再分为两个应用领域：

1．食品工业

淀粉是多种食品中的传统添加剂，其功能基本上是结合含水的添加剂或导致粘度增加或使形成凝胶的能力增加。其重要的特性是粘弹性，吸着特性，溶胀温度，胶凝温度，粘度，增稠能力，淀粉溶解性，透明度和凝胶结构，热稳定性，剪切稳定性，酸稳定性，经受退减的趋势，成膜能力，冻融稳定性，在盐溶液中的粘稠稳定性，消化能力和与例如无机或有机离子形成复合物的能力。

2．非食品工业

在这一重要领域中，淀粉可用作多种制备方法的助剂或用作工业产物的添加剂。当将淀粉用作助剂时，尤其应提及纸和纸板业。淀粉主要用于阻滞的目的(留着固体)，用于结合填充物颗粒和碎屑，用作硬化剂和用于脱水。另外，还利用了淀粉在挺度，硬度，牢固性，触感，光泽度，平滑度，粘附力和外观方面的有利特性。

2.1．纸和纸板业

在造纸业中，必须区分4个应用领域，即表面处理，涂布，纸料和喷淋。表面处理对淀粉的需求实质上是高白度，适合的粘度，高粘稠稳定性，良好的成膜能力和低的尘埃形成能力。当用于涂布时，固体含量，适当的粘度，高结合能力和高色素亲和力起着重要作用。当用作纸料添加剂时，重要的是快速，均匀，无损失的分布，高的机械强度和在纸幅中完全留着。如果淀粉被用于喷淋，重要的是适合的固体含量，高粘度和高结合能力。

2.2．粘合剂工业

淀粉的重要应用领域是粘合剂工业，其潜在的用途被次分为下列4类：用作纯粹的淀粉糊剂，用于已用特定化合物处理过的淀粉糊剂，将淀粉用作合成树脂和聚合物分散物的添加剂，和将淀粉用作合成粘合剂的增量剂。基于淀粉的粘合剂有90％用于生产瓦楞纸板，生产纸袋，生产纸和铝的复合材料，生产盒纸板和信封、邮票上的涂胶粘合剂等。

2.3．纺织业和织物护理品工业

淀粉用作助剂和添加剂的重要应用领域是生产织物和织物护理品。在纺织业中必须区分下列4个应用领域：将淀粉用作上浆剂，即平滑和加固除草刺性能以使织物免受纺织过程中所施加张力的影响，和增加织物在纺织过程中的耐磨度的助剂；将淀粉用作织物整理剂(尤其是在使品质降低的预处理，如漂白，染色等之后)；将淀粉用作制备染料糊剂所用的增稠剂以防止渗色；将淀粉用作缝线整经剂中的添加剂。

2.4．建筑材料工业

第四个应用领域是将淀粉用作建筑材料中的添加剂。例如生产糊墙纸板，其中与石膏浆混合的淀粉与水发生胶凝作用，扩散至石膏心板的表面，将纸板与心板结合在一起。其它应用领域是抹灰掺加剂和矿物纤维。在即用即混的混凝土中，使用淀粉产物延迟粘结。

2.5．土壤稳定作用

淀粉的另一个市场是生产土壤稳定剂，当土壤被人为地扰乱时，使用该稳定剂可临时保护土壤颗粒免受水的侵袭。根据目前的知识看，淀粉和聚合物乳剂的混合产物与以前使用的产品在降低腐蚀和防止结硬皮的作用上是等价的，但价格较便宜。

2.6．用于作物保护产品和肥料

淀粉的一个应用领域是用于作物保护产品中改变产品的特定特性，因此，淀粉可用于改善作物保护产品和肥料的湿度，控制活性成分的释放，将液态、易挥发的和/或恶臭的活性成分转变为微晶状的、稳定的、可成形的物质，混合不相容的化合物和通过降低分解来延长作用时间。

2.7．医药品和化妆品工业

另一个应用领域是医药品和化妆品工业。在药品工业中，淀粉可用作片剂的结合剂或用于稀释胶囊中的结合剂。另外，淀粉可用作片剂崩解剂，因为吞咽后它们可吸收液体并在短时间内溶胀到一定程度，使得活性成分被释放出来。为了保证质量，药用润滑粉末和治创伤的粉末是基于淀粉制备的。在化妆品工业中，淀粉可用作例如粉末添加剂(芳香物质和水杨酸)的载体。淀粉的相对大的应用领域是牙膏。

2.8．在木炭和炭砖中加入淀粉

淀粉的一个应用领域是用作木炭和炭砖中的添加剂。由于加入了淀粉，大量木炭可以粘结或成砖，从而防止炭砖过早地崩解。对于烧烤用木炭而言，淀粉的加入量为4至6％，对经过热化处理的木炭而言，淀粉的加入量为0.1至0.5％。另外，淀粉还有一个重要用途是用作结合剂，因为当在木炭和炭砖中加入淀粉时可显著降低有害物质的发散。

2.9．矿石和煤浆加工

另外，淀粉还可在矿石和煤浆加工业中用作絮凝剂。

2.10．铸造助剂

另一个应用领域是用作铸造助剂中的添加剂。多个铸造工序需要用经结合剂处理过的沙子制备型芯。目前广泛使用的结合剂是用经修饰的淀粉(在大多数的情况下是可溶胀的淀粉)处理过的膨润土。

添加淀粉的目的是增加流动性和改善结合力。另外，可溶胀的淀粉还能满足生产工艺的其它需求，例如可在冷水中分散，可重新水合，易于与沙子混合并具有高的与水结合的能力。

2.11．用于橡胶工业在橡胶工业中，淀粉可用于改善技术性能和外观性能，原因是能改

善表面光泽度，改善手感和外观，为此，可在冷硫化之前将淀粉涂布于橡胶材料发粘的表面，另外，淀粉还能改善橡胶的可印刷能力。

2.12．生产皮革替代物

另外，还可出售经修饰的淀粉以生产皮革替代物。

2.13．淀粉用于合成聚合物

在聚合物工业中，可以联想到下列应用领域：在加工步骤中掺入淀粉降解产物(淀粉仅用作填充剂，合成聚合物和淀粉之间没有直接的连键)，或者，在生产聚合物时掺入淀粉降解产物(淀粉和聚合物形成稳定的连键)。

淀粉用作纯粹的填充剂与其它物质(例如滑石)相比是没有竞争力的，但是，当淀粉的特性能影响，因而显著改变终产物的特征谱时，情况就大不相同了。例如，将淀粉产物用于加工热塑塑料，如聚乙烯。此时，使用常规加工技术，以1∶1的比例混合淀粉和合成聚合物而得到母炼胶，从中可产生多种产物和粒状聚乙烯。通过将淀粉掺入聚乙烯薄膜中，可获得增加的物质通透性(对空心体而言)，改善的水蒸汽通透性，改善的防静电性能，改善的防粘结性能和改善的墨水书写能力。

还可在聚氨基甲酸酯泡沫中使用淀粉。通过调整淀粉衍生物和使加工工艺最优化，可以直接控制合成聚合物和淀粉的羟基之间的反应。由于使用了淀粉，导致聚氨基甲酸酯薄膜获得了下列特性谱：热膨胀系数降低，皱缩性能降低，压力-张力性能改善，水蒸汽的通透性增加但不会改变对水的摄取，易燃性降低，最终的拉伸强度降低，可燃部分不会形成滴状物，不含卤素或者延缓老化。仍然存在的缺点是压缩强度降低和冲击强度降低。

目前，产品开发不再局限于薄膜，也可生产淀粉含量超过50％的固体聚合物产品，例如罐，平板和盘子。另外，淀粉/聚合物的混合物也被认为是有利的，因为它们的生物可降解性更高。

淀粉移植物聚合物已变得非常重要，因为它们与水结合的能力非常高。它们是根据自由基链机制的原理移植的具有淀粉骨架和合成单体侧链的产品。目前使用的淀粉移植物聚合物的独特之处在于：对水的结合和留着能力较高(1000g水/克淀粉)以及高粘度。最近几年，这些超级吸附剂的应用领域迅速扩展，例如用于卫生领域，如尿布和卫生巾，和用于农业领域，例如用于种子外被。

一方面，决定新的，经基因修饰的淀粉的应用是基于其结构，水含量，蛋白质含量，脂质含量，纤维含量，灰分/磷酸含量，直链淀粉/支链淀粉的比例，分子量分布，分支程度，颗粒大小和颗粒形状和结晶性，另一方面，也基于影响下列特征的特性：流动和吸着性能，胶凝温度，粘度，在盐溶液中的粘稠稳定性，增稠能力，溶解性，凝胶结构和凝胶透明度，热稳定性，剪切稳定性，酸稳定性，经受减退的趋势，凝胶形成，冻融稳定性，复合物形成，碘结合，膜形成，粘附力，酶稳定性，消化能力和反应性。

通过重组方法生产经修饰的淀粉一方面可以改变得自植物之淀粉的特性，从而似乎不再需要通过化学或物理的方法进行其它修饰。另一方面，可对通过重组方法改变的淀粉进行进一步的化学修饰，以进一步改善上述应用领域中的一些性能。原则上，这些化学修饰是已知的。尤其是，它们是通过热处理，用有机酸或无机酸处理，氧化和酯化进行修饰，导致例如形成磷酸淀粉，硝酸淀粉，硫酸淀粉，黄原酸淀粉，醋酸淀粉和柠檬酸淀粉。另外，也可在强酸存在下使用单-或多羟基醇以生产淀粉醚，导致形成淀粉烷基醚，O-烯丙基醚，羟基烷基醚，O-羧甲基醚，含N淀粉醚，含P淀粉醚，含S淀粉醚，交联淀粉或淀粉移植物聚合物。

本发明之淀粉的优选用途一方面是生产包装材料和一次性使用的物品，另一方面是用作食品或食品前体。

为了在植物细胞中在有义或反义方向上表达本发明的核酸分子，可将它们与确保在植物细胞中转录的调节DNA元件连接。所述调节元件特别地包括启动子，增强子和终止子。通常，在植物细胞中具有活性的任何启动子都适于表达。

可选择启动子，以使表达为组成型或使表达仅在特定组织，植物发育的特定时间点或由外部因子决定的时间点发生。对植物而言，启动子可以是同源或异源的。适当启动子的例子为组成型表达的花椰菜花叶病毒35S RNA启动子和玉米遍在蛋白启动子，在块茎中特异性表达的patatin启动子B33(Rocha-Sosa等，EMBO J.8(1989),23-29)，或确保仅在具有光合活性的组织中表达的启动子，如ST-LS1启动子(Stockhaus等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84(1987),7943-7947；Stockhaus等，EMBO J.8(1989),2445-2451)，或者在胚乳中特异性表达的启动子，小麦HMG启动子，USP启动子，云扁豆蛋白启动子或玉米醇溶蛋白基因启动子。

也可存在终止序列，它们可用于正确终止转录并为转录物添加poly-A尾，据认为这样可起到稳定转录物的作用。文献中已描述过该元件(参见EMBO J.8(1989),23-29)，必要时可以交换。

本发明提供了编码具有可溶性小麦淀粉合酶功能之蛋白质的核酸分子。本发明的核酸分子可以产生功能体现于淀粉生物合成的酶，产生通过重组技术改变过的植物，其中该酶的活性已经改变，因此所合成的淀粉的结构和物理化学特性也有所改变。

原则上，本发明的核酸分子也可用于产生另一种植物，其中本发明之淀粉合酶的活性增加或降低，而同时，参与淀粉合成的其它酶的活性也有所改变。改变植物中的淀粉合酶活性导致合成结构有所改变的淀粉。另外，可将编码淀粉合酶的核酸分子或适当的反义构建体导入植物细胞，所述植物细胞中内源性GBSSⅠ，SSS或GBSSⅡ蛋白已因反义作用或突变而被抑制，或者分支酶的合成已被抑制(例见WO92/14827或Shannon和Garwood,1984,Whistler,BeMiller和Paschall，淀粉：化学和技术，Academic Press,London，第2版：25-86)。

如果想抑制经转化的植物中参与淀粉生物合成的几个酶的合成，转化可包括在反义方向上同时含有几个所述酶的编码区的DNA分子，所述DNA分子处于适当启动子的控制之下。或者各个序列也可以受其自身启动子的控制，或者由联合启动子将序列转录成融合体，或者使序列处于联合启动子的控制之下。一般优选最后一种方式，因为此时所述蛋白质的合成被抑制在大致相同的水平上。至于该构建体中所用各个编码区的长度，上文中提及的产生反义构建体所用的序列长度在此也适用。原则上，对该DNA分子中由一个启动子启动转录的反义片断的数目没有上限，但是，所形成的转录物的长度优选不超过10kb，优选其长度不超过5kb。

在反义方向上，与其它编码区一起位于该DNA分子中的适当启动子之后的编码区可以得自编码下列蛋白质的DNA序列：与淀粉粒结合的淀粉合酶(GBSSⅠ和Ⅱ)和可溶性的淀粉合酶(SSSⅠ和Ⅱ)，分支酶(异淀粉酶，支链淀粉酶，R-酶，分支酶，脱支酶)，淀粉磷酸化酶和歧化酶。上面列举的仅是一些例子。也可联合使用其它DNA序列。

在被上述构建体转化的植物细胞中，所述构建体可以合成多种同时被抑制的酶。

另外，可将构建体导入一个或多个淀粉生物合成基因缺损的植物突变体(Shannon和Garwood,1984,Whistler,BeMiller和Paschall，淀粉：化学和技术，Academic Press,London，第2版：25-86)。这些缺损可涉及下列蛋白质：与淀粉粒结合的淀粉合酶(GBSSⅠ和Ⅱ)和可溶性的淀粉合酶(SSSⅠ和Ⅱ)，分支酶(BEⅠ和Ⅱ)，脱支酶(R-酶)，歧化酶和淀粉磷酸化酶。上面列举的仅是一些例子。

在被上述构建体转化的植物细胞中，该方法还可以合成多种同时被抑制的酶。

为了将外源基因导入高等植物中，可以使用多种含有大肠杆菌复制信号和标记基因的克隆载体，所述标记基因可用于选择经转化的细菌细胞。这种载体的例子有pBR322,pUC系列，M13mp系列，pACYC184等。可将所需序列导入载体的适当限制性裂解位点。使用所得质粒转化大肠杆菌细胞。在适当培养基上培养经转化的大肠杆菌细胞，随后收集细胞并裂解之。回收质粒，一般用于鉴定所得质粒DNA的分析方法是限制性分析，凝胶电泳和其它生物化学和分子生物学方法。每次操作之后，裂解质粒DNA，将所得DNA片断与其它DNA序列连接。将各个质粒DNA序列克隆至相同或不同的质粒中。

可使用多种技术将DNA导入植物宿主细胞。这些技术包括使用根瘤农杆菌或毛根农杆菌为转化剂，用T-DNA转化植物细胞，原生质体融合，注射，电穿孔DNA，利用biolistic法导入DNA和其它方法。

将DNA注射和电穿孔至植物细胞中对所用质粒没有特别的需求。可使用诸如pUC衍生物的简单质粒。然而，如果由按此方法转化的细胞再生完整的植物，那么就需要存在选择标记基因。

根据将所需基因导入植物细胞的方法，还需要其它DNA序列。例如，如果使用，Ti或Ri质粒转化植物细胞，至少必须将Ti和Ri质粒T-DNA的右边界序列，但常常需要将右和左边界序列与需导入的基因连接作为侧翼区域。

如果使用农杆菌进行转化，必须将欲导入的DNA克隆至特定的质粒中，或者导入中间载体或者导入二元载体。由于中间载体的序列与T-DNA中的序列同源，因此中间载体可通过同源重组整合至农杆菌Ti或Ri质粒中。所述质粒也含有T-DNA转移所需的vir区域。中间载体不能在农杆菌中复制。利用辅助质粒(接合)可将中间载体转移至根瘤农杆菌中。二元载体能在大肠杆菌和农杆菌中复制。它们含有选择标记基因和接头或多接头，并位于右和左T-DNA边界区之间。可直接将其转化至农杆菌中(Holster等，Mol.Gen.Genet.163(1978),181-187)。用作宿主细胞的农杆菌应该含有携有vir区域的质粒。vir区域是将T-DNA转移至植物细胞所需的。也可存在其它T-DNA。可使用如此转化的农杆菌转化植物细胞。

已深入研究了使用T-DNA转化植物细胞的方法，其详细描述于EP120516；Hoekema，二元植物载体系统Offsetdrukkerij Kanters B.V.,Alblasserdam(1985)，第Ⅴ章；Fraley等，Crit.Rev.Plant.Sci.,4,1-46和An等，EMBO J.4(1985),277-287。

为了将DNA转移至植物细胞中，可便利地将植物外植体与根瘤农杆菌或毛根农杆菌共培养。然后，在特别地含有某些糖，氨基酸，抗生素或抗微生物剂(用于选择转化细胞)的适当培养基中，由被感染的植物材料(例如叶片区，茎区，根，原生质体或在悬浮培养物中生长的植物细胞)再生完整的植物。然后检查所得植物中是否存在已导入的DNA。使用biolistic法或通过原生质体转化导入外源DNA的其它方法是已知的(例见Willmitzer,L.,1993转基因植物，生物技术，大量综合性论文(H.J.Rehm,G.Reed,A.Puhler,P.Stadler编)，Vol.2,627-659,VCH Weinheim-New York-Basel-Cambridge)。

尽管借助于根瘤农杆菌，经由Ti-质粒载体系统转化双子叶植物的方法已经完善地建立，但近期的工作表明：利用基于农杆菌的载体实际上甚至能够转化单子叶植物(Chan等.，植物分子生物学，22(1993),491-506；Hiei等，植物学杂志，6(1994),271-282)。

另一种转化单子叶植物的方法是利用biolistic法进行转化，原生质体转化，或经物理或化学诱导将DNA摄入原生质体，例如通过电穿孔部分透化的细胞，利用玻璃纤维转移DNA，将DNA大量注射至花序中，将DNA微量注射至小孢子或原胚，通过萌发的花粉摄取DNA和通过溶胀将DNA摄入胚中(参见：Potrykus，植物生理学(1990),269-273)。

过去，已在多种谷类植物中建立了上述的三种转化系统：对组织进行电穿孔，原生质体转化和通过颗粒轰击将DNA转移至可再生的组织和细胞(参见：Jahne等.，Euphytica 85(1995),35-44)。

转化小麦的不同方法描述于文献中(参见：Maheshwari等.，Critical Reviews in Plant Science 14(2)(1995),149-178)：Hess等(植物科学，72(1990),233)利用大量注射法使花粉和农杆菌直接靠近。通过Southern印迹分析和NPTⅡ试验检测含有nptⅡ基因作为选择标记的质粒的转移。转化子显示出正常的表型，并且是可育的。在连续2代中检测卡那霉素抗性。

第一个用与微粒结合的DNA轰击之后再生的转基因可育小麦植物是由Vasil等(Bio/Technology 10(1992),667-674)描述的。轰击的靶组织是胚发生的愈伤组织培养物(C型愈伤组织)。所用选择标记是编码膦丝菌素乙酰转移酶因而可介导对除草剂膦丝菌素之抗性的bar基因。Weeks等(植物生理学，102(1993),1077-1084)和Becker等(植物学杂志，5(2)(1994),299-307)描述了另一个系统。其中，DNA转化的靶组织是不成熟胚的盾片，在体外初级阶段对其进行刺激可诱导体细胞胚。Becker等(文献同上)所研制系统的转化效率是“Florida”品种的每83个胚产生1株转基因植物，显著高于Weeks等建立的系统，后者的转化效率是“Bohwhite”品种的每1000个胚产生1至2株转基因植物。

Becker等(文献同上)所研制的系统形成了实施例所述转化实验的基础。

一旦导入的DNA整合至植物细胞的基因组，它原则上能保持稳定，并且在最初的转化细胞的后代中也能维持。它一般含有上述选择标记之一，以赋予转化的植物细胞以除草剂(如膦丝菌素)抗性或抗生素(卡那霉素，G418，博来霉素或潮霉素)抗性，或者可经由某些糖或氨基酸的存在或缺乏进行选择。因此，选定的每个标记都可以选择有DNA导入的转化细胞。

在植物中，转化细胞按常规方式生长(例见McCormick等，植物细胞报道5(1986),81-84)。所得植物可正常生长并与具有相同的转化种质或其它种质的植物杂交。所得杂种个体具有相应的表型特性，种子可得自植物细胞。应培养两代或更多代以确保表型特征能稳定维持和遗传。另外，应收获种子以确保保留所需表型或其它特性。

下列实施例是想阐明本发明，而不是对本发明进行任何意义上的限制。1．克隆方法

载体pBluescript Ⅱ SK(Stratagene)被用于克隆至大肠杆菌。2．细菌菌株

Bluescript载体和反义构建体使用大肠杆菌菌株DH5α(BethesdaResearch Laboratories,Gaithersburg,USA)。体内切除使用的是大肠杆菌菌株XLl-Blue。3．转化不成熟的小麦胚培养基MS：100ml/l macrosalt(D.Becker和H.Lorz，植物组织培养手册

                (1996),B 12：1-20)

1ml/l microsalt

2ml/l Fe/NaEDTA

30g/l蔗糖#30：MS+2,4-D(2mg/l)#31：MS+2,4-D(2mg/l)+膦丝菌素(除草剂BASTA的PPT活性成分(2mg/l))#32：MS+2,4-D(0.1mg/l)+PPT(2mg/l)#39：MS+2,4-D(2mg/l)+各为0.5N的甘露糖醇/山梨糖醇

使用KOH将上述各培养基调节至pH5.6，并使用0.3％Gelrite固化。

Becker和Lorz(D.Becker和H.Lorz，植物组织培养手册(1996)，B12：1-20)开发并优化了转化不成熟的小麦胚的方法。

在下述实验中，遵循Becker和Lorz(文献同上)所开发的方法。

为了进行转化，收集开花后发育12至14天的具有颖果的复穗状花序并进行表面灭菌。将分离的盾片铺于诱导培养基#30上，使胚轴朝向培养基。

预培养2至4天(26℃，黑暗中)之后，将外植体转移至培养基#39中进行渗透预培养(2至4小时，26℃，黑暗中)。

为了进行biolistic转化，每次轰击使用约29微克其上预先沉淀了几微克靶DNA的金粒。由于进行的实验是共转化，每批沉淀中加入的靶DNA由比例为1∶1的靶基因和抗性标记基因(bar基因)组成。4．对DNA片断进行DIG标记

经由特异性PCR掺入经DIG-标记的dUTP(Boehringer Mannheim，德国)以标记用作筛选探针的DNA片断。实施例中所用的介质溶液：20×SSC    175.3g NaCl

          88.2g柠檬酸钠

          加双蒸水至1000ml

          10N NaOH至pH7.0

根据布达佩斯条约的规定，将质粒pTaSS1 8/1保藏于DSMZ(Braunschweig，联邦德国)，保藏号为DSM 12794。实施例1：鉴定，分离和表征编码可溶性小麦淀粉合酶(SSⅡ)(Triticum aestivum L.,cv Florida)的cDNA

为了鉴定编码可溶性小麦淀粉合酶(SSⅠ)同工型的完整的cDNA，遵循了异源筛选策略。为此，用适当的寡核苷酸筛选小麦cDNA文库。可按下述，使用5’RACE法(快速扩增cDNA末端)分离筛选所用的SSⅠ特异性寡核苷酸。

根据厂商说明(λZAPⅡ-cDNA合成试剂盒，Stratagene GmbH,Heidelberg，德国)，由位于λZAPⅡ载体中的约20天龄颖果(胚乳)的poly(A)+RNA合成小麦cDNA文库。测定cDNA文库的滴度之后，得出初始滴度为1.26 ×10⁶ pfu/ml。

用得自小麦的SSⅠ探针筛选cDNA文库，使用5’-RACE分离DNA片断，用Boehringer(Mannheim，德国)提供的5’RACE试剂盒(下文称之为试剂盒)扩增5’末端。根据厂商说明进行所有步骤。除非另有说明，仅使用试剂盒中的试剂和酶。

首先，将约20天龄颖果的poly(A)+RNA转录成单链cDNA并用于加尾反应。在第一个反应中，根据改良的方法，按下述用引物寡(dT)#8(试剂盒)和B2F5扩增用寡(dA)锚#9(试剂盒)在5’区域提供的cDNA：在50μl一批的反应中，使用5μl加尾cDNA,5μl 10×反应缓冲液(Life Technologies),0.25μM B2F5引物，0.75μM寡(dT)#8,0.2mM dNTP和5U Taq聚合酶(重组的，Life Technologies)。PCR方案是：94℃3分钟/94℃45秒/56℃1分钟/72℃1分钟30秒，29个循环/72℃ 5分钟。

随后，用引物寡(dT)#8(试剂盒)，B2F5和位于5’的引物B2F6进行另一个PCR反应。在50μl一批的反应中，使用1μl PCR产物，5μl10×反应缓冲液(Life Technologies),0.25μM B2F5引物，0.25μMB2F6引物，0.75μM寡(dT)#8,0.2mM dNTP和5U Taq聚合酶(重组的，Life Technologies)。PCR方案是：94℃3分钟/94℃45秒/60℃ 1分钟/72℃1分钟30秒,29个循环/72℃5分钟。B2F5：     5’CCTCCCAATTCAAGGATTAGTG 3’ (Seq ID No.3)B2F6：     5’CCTCGCATGCAGCATAGCAA 3’   (Seq ID No.4)

在琼脂糖凝胶中分离通过上述方法得到的PCR产物，分离大于800bp的DNA片断。使用由Stratagene(Heidelberg)提供的pCR-Script SK(+)克隆试剂盒克隆PCR片断。对克隆的亚片断进行序列分析鉴定出约150bp迄今未知的SSⅠ克隆序列。

从该新序列的5’区域选择寡核苷酸B2R00和B2F6.2以扩增DNA片断(SSⅠ探针)，随后，用地高辛配基-11-dUTP标记该片断并用作探针以筛选小麦cDNA文库。根据“用于滤膜杂交的DIG系统使用者指南(Boehringer Mannheim)”中的说明，通过用引物B2R00和B2F6.2进行PCR反应以标记SSⅠ探针。B2R00：    5’TGTGGCTGCAAGTGAGGAGG 3’         (Seq ID No.5)B2F6.2     5’CCAGTCACAAACACGTAGCTACG 3′      (Seq ID No.6)

为了筛选小麦cDNA文库，平铺了700000个噬菌体。将噬菌体铺于平板上，根据标准方法对平板进行印迹。于65℃,在5×SSC,3％Blocking(Boehringer Mannheim),0.2％十二烷基硫酸钠(SDS),0.1％十二烷基肌氨酸钠和50μg/ml鲱精DNA中对滤膜进行预杂交和杂交，在杂交溶液中加入1.3ng/ml经DIG-标记的SSⅠ探针，将杂交溶液保温过夜。于65℃，按“用于滤膜杂交的DIG系统使用者指南(BoehringerMannheim)”中所述的方法洗涤滤膜。通过另外2次筛选循环挑选出单个阳性克隆。经由体内切除得到的单个克隆为pBluescript SK噬粒(方法遵照厂商说明；Stratagene,Heidelberg)。

经由微量制备法分析克隆之后和限制性消化质粒DNA之后，进一步分析克隆TaSS Ⅰ 8/1。实施例2：对质粒pTaSS Ⅰ 8/1的cDNA插入物进行的序列分析

由克隆pTaSS Ⅰ 8/1分离质粒DNA，利用双脱氧核苷酸法(Sanger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74(1977),5463-5467)测定cDNA插入物的序列。克隆TaSS Ⅰ 8/1中插入物的长度为2805 bp,构成了完整的cDNA。核苷酸序列示于SEQ ID NO：1。相应的氨基酸序列示于SEQ ID NO：2。与已知序列的比较揭示出SEQ ID N0：1所示的序列是新的并含有完整的编码区。实施例3：产生植物转化载体pTa-γ-SSⅠ-8/1

为了表达实施例1中分离的cDNA,以pUC19为基础质粒构建植物转化载体pTa-γ-SSⅠ-8/1。为了构建载体，在有义方向上将质粒TaSSI8/1的完整cDNA插入物与遍在蛋白启动子的3’末端连接。该启动子由玉米遍在蛋白1基因(Christensen A.H等，植物分子生物学，18(1992),675-689)的第一个未翻译的外显子和第一个内含子组成。多接头和NOS终止子部分得自质粒pACT1.cas(CAMBIA,TG0063;Cambia,GPO Box 3200,Canberra ACT 2601，澳大利亚)。McElroy等(分子育种1(1995),27-37)描述了具有该终止子的载体构建体和基于pACT1.cas的构建体，所得载体被称为pUbi.cas。

通过用限制性酶XbaⅠ和SspⅠ限制性消化得自克隆TaSS Ⅰ 8/1的片断来克隆表达载体。利用Klenow反应补平片断末端，随后，将片断连接至表达载体pUbi.cas的SmaⅠ克隆位点。所得表达载体被称为pTA-γ-SSⅠ8.1。在第二个构建体中，通过用外切核酸酶处理首次除去了克隆TaSSⅠ-8.1的5’-非翻译前导序列。然后将其克隆至表达载体pUbi.cas。该构建体被称为Ta-γ-SSⅠ8/1-2。

随后，用载体pTa-γ-SSⅠ-8/1和pTa-γ-SSⅠ-8/1-2转化小麦。

                 序列表<110> Hoechst Schering AgrEvo GmbH<120> Nucleic acid molecules encoding wheat enzymes<150> DE 198 20607.0<151> 1998-05-08<160> 6<210> 1<211> 2771<212> DNA<213> Triticum aestivum<220><221> CDS<222> (280) … (2547)<400> 1CGCCAC TCCACTCGCC TTGCCCCACT      26CCCACTCTTC TCTCCCCGCG CACACCGAGT CGGCACCGGC TCATCACCCA TCACCTCGGC      86CTCGGCCACC GGCAAACCCC CCGATCCGCT TTTGCAGGCA GCGCACTAAA ACCCCGGGGA      146GCGCGCCCCG CGGCAGCAGC AGCACCGCAG TGGGAGAGAG AGGCTTCGCC CCGGCCCGCA      206CCGAGCGGGG CGATCCACCG TCCGTGCGTC CGCACMCCT CCGCCTCCTC CCCTGTCCCG       366CGCGCCCACA CCC ATG GCG GCG ACG GGC GTC GGC GCC GGG TGC CTC GCC         315Met Ala Ala Thr Gly Val Gly Ala Gly Cys Leu Ala1               5                  10CCC AGC GTC CGC CTG CGC GCC GAT CCG GCG ACG GCG GCC CGG GCG TCC        363Pro Ser Val Arg Leu Arg Ala Asp Pro Ala Thr Ala Ala Arg Ala Ser15                  20                  25GCC TGC GTC GTC CGC GCG CGG CrC CGG CGC TTG GCG CGG GGC CGC TAC         411Ala Cys Val Val Arg Ala Arg Leu Arg Arg Leu Ala Arg Gly Arg Tyr30                  35                  40GTC GCC GAG CTC AGC AGG GGC CCC GCG GCG CGC CCC GCG CAG CAG            459Val Ala Glu Leu Ser Arg Glu Gly Pro Ala Ala ArG Pro Ala Gln Gln45                  50                  55                  60CAG CAA CTG GCC CCG CCG CTC GTGCCA GGC TTC CTC GCG CCG CCG CCG         507Gln Gln Leu Ala Pro Pro Leu Val Pro Gly Phe Leu Ala Pro Pro Pro65                  70                  75CCC GCG CCC GCC CAG TCG CCG GCC CCG ACG CAG CCG CCC CTG CCG GAC        555Pro Ala Pro Ala Gln Ser Pro Ala Pro Thr Gln Pro Pro leu Pro Asp80                  85                  90GCC GGC GTG GGG GAA CTC GCG CCC GAC CTC GAA CTC GAA GGG ATT GCT         603Ala Gly Val Gly Glu Leu Ala Pro Asp Leu Leu Leu Glu Gly Ile Ala95                 100                 105GAG GAT TCC ATC GAC AGC ATA ATT GTG GCA GCA AGT GAG CAG GAT TCT         651Glu Asp Ser Ile Asp Ser Ile Ile Val Ala Ala Ser Glu Gln Asp Ser110                 115                 120GAG ATC ATG GCT GCG AAT GAG CAA CCT CAA GCT AAA GTT ACA CGT AGC         699Glu Ile Met Agp Ala Asn Glu Gln Pro Gln Ala Lys val Thr Arg Ser125                 130                 135                 140ATC GTG TTT GTG ACT GGT GAA GCT GCT CCT TAT GCA AAG TCA GGG GGG         747Ile Val Phe Val Thr Gly Glu Ala Ala Pro Tyr Ala Lys Ser Gly Gly145                 150                 155TTG GGA GAT GTT TGT GGT TCG TTA CCA ATT GCT CTT GCT GCT CGT GGT         795Leu Gly Asp Val Cys Gly Ser Leu Pro Ile Ala Leu Ala Ala Arg Gly160                 165                 170CAC CGA GTG ATG GTT GTA ATG CCA AGA TAC TTA AAT GGG TCC TCT GAT         843His Arg val Met Val Val MeT Pro Arg Tyr Leu Agn Gly Ser Ser Asp175                 180                 185AAA AAC TAT GCA AAG GCA TTA TAC ACT GCG AAG CAC ATT AAG ATT CCA         891Lys Asn Tyr Ala Lys Ala Leu Tyr Thr Ala Lys His Ile Lys Ile Pro190                 195                 200TGC TTT GGG GGA TCA CAT GAA GTG ACC TTT TTT CAT GAG TAT AGA GAC         939Cys Phe Gly Gly Ser His Glu Val Thr Phe Phe His Glu Tyr Arg Asp205                 210                 215                 220AAC GTC GAT TGG GTG TTT GTC GAT CAT CCG TCA TAT CAC AGA CCA GGA         987Asn Val Asp Trp Val Phe Val Asp His Pro Ser Tyr His Arg Pro Gly225                 230                 235AGT TTA TAT GGA GAT AAT TTT GGT GCT TTT GGT GAT AAT CAG TTC AGA         1035Ser Leu Tyr Gly Asp Ash Phe Gly Ala Phe Gly Asp Asn Gln Phe Arg240                 245                 250TAC ACA CTC CTT TGC TAT GCT GCA TGC GAG GCC CAA CTA ATC CTT GAA         1083Tyr Thr Leu Leu Cys Tyr Ala Ala Cya Glu Ala Pro Leu Ile Leu Glu255                 260                 265TTG GGA GGA TAT ATT TAT GGA CAG AAT TGC ATG TTT GTT GTG AAC GAT         1131Leu Gly Gly Tyr Ile Tyr Gly Gln Asn Cys Met Phe Val Val Asn Asp270                 275                 280TGG CAT GCC AGC CTT GTG CCA GTC CTT CTT GCT GCA AAA TAT AGA CCA         1179Trp His Ala Ser Leu Val Pro Val Leu Leu Ala Ala Lys Tyr Arg Pro285                 290                 295                 300TAC GGT GTT TAC AGA GAT TCC CGC AGC ACC CTT GTT ATA CAT AAT TTA         1227Tyr Gly Val Tyr Arg Asp Ser Arg Ser Thr Leu Val Ile His Asn Leu305                 310                 315GCA CAT CAG GGT GTG GAG CCT GCA AGT ACA TAT CCT GAT CTG GGA TTG         1275Ala His Gln Gly Val Glu Pla Ala Ser Thr Tyr Pro Asp Leu Gly Leu320                 325                 330CCT CCT GAA TGG TAT GGA GCT TTA GAA TGG GTA TTT CCA GAA TGG GCA         1323Pro Pro Glu Trp Tyr Gly Ala Leu Glu Trp Val Phe Pro Glu Trp Ala335                 340                 345AGG AGG CAT GCC CTT GAC AAG GGT GAG GCA GTT AAC TTT TTG AAA GGA         1371Arg Arg His Ala Leu Asp Lys Gly Glu Ala Val Asn Phe Leu Lys Gly350                 355                 360GCA GTT GTG ACA GCA GAT CGG ATT GTG ACC GTC AGT CAG GGT TAT TCA         1419Ala Val Val Thr Ala Asp Arg Ile Val Thr Val Ser Gln Gly Tyr Ser365                 370                 375                 380TGG GAG GTC ACA ACT GCT GAA GGT GGA CAG GGC CTC AAT GAG GTC TTA         1467Trp Glu Val Thr Thr Ala Glu Gly Gly Gln Gly Leu Asn Glu Leu Leu385                 390                 395AGC TCC CGA AAA AGT GTA TTG AAT GGA ATT GTA AAT GGA ATT GAC ATT         1515Ser Ser Arg Lys Ser Val Leu Asn Gly Ile Val Asn Gly Ile Asn Ile400                 405                 410AAT GAT TGG AAC CCC ACC ACA GAC AAG TGT CTC CCT CAT CAT TAT TCT         1563Asn Asp Trp Asn Pro Thr Thr Asp Lys Cys Leu Pro His His Tyr Ser415                 420                 425GTC GAT GAC CTC TCT GGA AAG GCC AAA TGT AAA GCT GAA TTG CAG AAG         1611Val Asp Asp Leu Ser Gly Lys Ala Lys Cys Lys Ala Glu Leu Gln Lys430                 435                 440GAG TTG GGT TTA CCT GTA AGG GAG GAT GTT CCT CTG ATT GGC TTT ATT         1659Glu Leu Gly Leu Pro Val Arg Glu Asp Val Pro Leu Ile Gly Phe Ile445                 450                 455                 460GGA AGA CTG GAT TAC CAG AAA GGC ATT GAT CTC ATT AAA ATG GCC ATT         1707Gly Arg Leu Asp Tyr Gln Lys Gly Ile Asp Leu Ile Lys Met Ala Ile465                 470                 475CCA GAG CTC ATG AGG GAG GAC GTG CAA TTT GTC ATG CTT GGA TCT GGG         1755Pro Glu Leu Met Arg Glu Asp Val Gln Phe Val Met Leu Gly Ser Gly480                 485                 490GAT CCA ATT TTT GAA GGC TGG ATG AGA TCT ACC GAG TCG AGT TAC AAG         1803Asp Pro Ile Phe Glu Gly Trp Met Arg Ser Thr Glu Ser Ser Tyr Lys495                 500                 505GAT AAA TTC CGT GGA TGG GTT GGA TTT AGT GTT CCA GTT TCC CAC AGA       1851Asp Lys Phe Arg Gly Trp Val Gly Phe Ser Val Pro Val Ser His Arg510                 515                 520ATA ACT GCA GGT TGC GAT ATA TTG TTA ATG CCA TCG AGA TTT GAA CCT       1899Ile Thr Ala Gly Cys Asp Ile Leu Leu Met Pro Ser Arg Phe Glu Pro525                 530                 535                 540TGC GGT CTT AAT CAG CTA TAT GCT ATG CAA TAT GGT ACA GTT CCT GTA       1947Cys Gly Leu Asn Gln Leu Tyr Ala Met Gln Tyr Gly Thr Val Pro Val545                 550                 555GTT CAT GGA ACT GGG GGC CTC CGA GAC ACA GTC GAG ACC TTC AAC CCT       1995Val His Gly Thr Gly Gly Leu Arg Asp Thr Val Glu Thr Phe Asn Pro560                 565                 570TTT GGT GCA AAA GGA GAG GAG GGT ACA GGG TGG GCG TTC TCA CCG CrA        2043Phe Gly Ala Lys Gly Glu Glu Gly Thr Gly TrP Ala Phe Ser Pro Leu575                 580                 585ACC GTG GAC AAG ATG TTG TGG GCA TTG CGA ACC GCG ATG TCG ACA TTC        2091Thr Val Asp Lys Met Leu Trp Ala Leu Arg Thr Ala Met Ser Thr Phe590                 595                 600AGG GAG CAC AAG CCG TCC TGG GAG GGG CTC ATG AAG CGA GGC ATG ACG        2139Arg Glu His Lys Pro Ser Trp Glu Gly Leu Met Lys Arg Gly Met Thr605                 610                 615                 620AAA GAC CAT ACG TGG GAC CAT GCC CCG AGC AGT ACG AGC AGA TCT TCG        2187Lys Asp His Thr Trp Asp His Ala Pro Ser Ser Thr Ser Arg Ser Ser625                 630                 635AGT GGG CCT TCG TGG ACC AAC CCT ACG TCA TGT AGA CGG GGA CTG GGG        2235Ser Gly Pro Ser Trp Thr Asn Pro Thr Ser Cys Arg Arg Gly Leu Gly640                 645                 650AGG TCC AAG TGC GAG TCT CCT TCA GCT CTG AAG ACA TCC TCT TCA TCC        2283Arg Ser Lys Cys Glu Ser Pro Ser Ala Leu Lys Thr Ser Ser Ser Ser655                 660                 665TTC CGC GGC CCG GAA GGA TAC CCC TGT ACA TTG CGT TGT CCT GCT ACA        2331Phe Arg Gly Pro Glu Gly Tyr Pro Cys Thr Leu Arg Cys Pro Ala Thr670                 675                 680GTA GAG TCG CAA TGC GCC TGC TTG CTT TGG TTC GCC GGT TCG AGA ACA       2379Val Glu Ser Gln Cys Ala Cys Leu Leu Trp Phe Ala Gly Ser Arg Thr685                 690                 695                 700TAT GAC GGC TGT GCT GCT GCG GCG GTG ACA GCT TCG GGT GGA CGA CAG       2427Tyr Asp Gly Cys Ala Ala Ala Ala Val Thr Ala Set Gly Gly Arg Gln705                 710                 715TTA CAF TTT TGG GGA ATA AGG AAG GGA TGT GCT GCA GGA TGG TTA ACA       2475Leu Gln Phe Trp Gly Ile Arg Lys Gly Cys Ala Ala Gly Trp Leu Thr720                 725                 730GCA AAG CAC CAC TCA GAT GGC AGC CTC TCT GTC CGT GTT ACA GCT GAA       2525Ala Lys His His Ser Asp Gly Ser Leu Ser Val Arg Val Thr Ala Glu735                 740                 745ATC AGA AAC CAA CTG GTG ACT CTT TAGCCTTAGT GATTGTGAAG TTTGTTGCCT      2577Ile Arg Asn Gln Leu Val Thr Leu750                 755TCTGTGTATG TTGTCTTGTC CTTAGCTGAC AAATATTTGA CCTGTTGGAG AAATTAATCT     2637TTGCTGCTGT TATAATTTAA TCAAAAGAGG GGGTTTCCTC CGATTTCATT AAAAAAAAAA     2697AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA     2757AAAAAAAAAA AAAA                                                       2771<210> 2<211> 756<212> PRT<213  Triticum aestivum<400> 2Met Ala Ala Thr Gly Val Gly Ala Gly Cys Leu Ala Pro Ser Val Arg1               5                  10                  15Leu Arg Ala Asp Pro Ala Thr Ala Ala Arg Ala Ser Ala Cys Val Val20                  25                  30Arg Ala Arg Leu Arg Arg Leu Ala Arg Gly Arg Tyr Val Ala Glu Leu35                  40                  45Ser Arg Glu Gly Pro Ala Ala Arg pro Ala Gln Gln Gln Gln Leu Ala50                  55                  60Pro Pro Leu Val Pro Gly Phe Leu Ala Pro Pro Pro Pro Ala pro Ala65                  70                  75                  80Gln Ser Pro Ala Pro Thr Gln Pro Pro Leu Pro Asp Ala Gly Val Gly85                  90                  95Glu Leu Ala Pro Asp Leu leu LEu Glu Gly Ile Ala Glu Asp Ser Ile100                 105                 110Asp Ser Ile Ile Val Ala Ala Ser Glu Gln Asp Ser Glu Ile Met Asp115                 120                 125Ala Asn Glu Gln Pro Gln Ala Lys Val Thr Arg Ser Ile Val Phe Val130                 135                 140Thr Gly Glu Ala Ala Pro Tyr Ala Lys Ser Gly Gly Leu Gly Asp Val145                 150                 155                 160Cys Gly Ser Leu Pro Ile Ala Leu Ala Ala Arg Gly His Arg Val Met165                 170                 175Val Val Met Pro Arg Tyr Leu Asn Gly Ser Ser Asp Lys Asn Tyr Ala180                 185                 190Lys Ala Leu Tyr Thr Ala Lys His Ile Lys Ile Pro Cys Phe Gly Gly195                 200                 205Ser His Glu Val Thr Phe Phe His Glu Tyr Arg Asp Asn Val Asp Trp210                 215                 220Val Phe Val Asp His Pro Ser Tyr His Arg Pro Gly Ser Leu Tyr Gly225                 230                 235                 240Asp Asn Phe Gly Ala Phe Gly Asp Asn Gln Phe Arg Tyr Thr Leu Leu245                 250                 255Cys TyT Ala Ala Cys Glu Ala Pro Leu Ile Leu Glu Leu Gly Gly Tyr260                 265                 270Ile Tyr Gly Gln Asn Cys Met Phe Val Val Asn Asp Trp His Ala Ser275                 280                 285Leu Val Pro Val Leu Leu Ala Ala Lys Tyr Arg Pro Tyr Gly Val Tyr290                 295                 300Arg Asp Ser Arg Ser Thr Leu Val Ile His Asn Leu Ala His Gln Gly305                 310                 315                 320Val Glu Pro Ala Ser Thr Tyr Pro Asp Leu Gly Leu Pro Pro Glu Trp325                 330                 335Tyr Gly Ala Leu Glu Trp Val Phe Pro Glu Trp Ala Arg Arg His Ala340                 345                 350Leu Asp Lys Gly Glu Ala Val Asn Phe Leu Lys Gly Ala Val Val Thr355                 360                 365Ala Asp Arg Ile Val Thr Val Ser Gln Gly Tyr Ser Trp Glu Val Thr370                 375                 380Thr Ala Glu gly Gly Gln Gly Leu Asn Glu Leu leu Ser Ser Arg Lys385                 390                 395                 400Ser Val Leu Asn Gly Ile Val Asn Gly Ile Asp Ile Asn Asp Trp Asn405                 410                 415Pro Thr Thr Asp Lys Cys Leu Pro His His Tyr Ser Val Asp Asp Leu420                 425                     430Ser Gly Lys Ala Lys Cys Lys Ala Glu Leu Gln Lys Glu Leu Gly Leu435                 440                 445Pro Val Arg Glu Asp Val Pro Leu Ile Gly Phe Ile Gly Arg Leu Asp450                 455                 460Tyr Gln Lys Gly rle Asp Leu Ile Lys Met Ala Ile Pro Glu Leu Met465                 470                 475                 480Arg Glu Asp Val Gln Phe Val Met Leu Gly Ser Gly Asp Pro Ile Phe485                 490                 495Glu GIy Trp Met Arg Ser Thr Glu Ser Ser Tyr Lys Asp Lys Phe Arg500                 505                 510Gly Trp Val Gly Phe Ser Val Pro Val Ser His Arg Ile Thr Ala Gly515                 520                 525Cys Asp Ile Leu Leu Met Pro Ser Arg Phe Glu Pro Cys Gly Leu Ash530                 535                 540Gln Leu Tyr Ala Met Gln Tyr Gly Thr Val Pro Val Val His Gly Thr545                 550                 555                 560Gly Gly Leu Arg Asp Thr Val Glu Thr Phe Asn Pro Pne Gly Ala Lys565                 570                 575Gly Glu Glu Gly Thr Gly Trp Ala Phe Ser Pro Leu Thr Val Asp Lys580                 585                 590Met Leu Trp Ala Leu Arg Thr Ala Met Ser Thr Phe Arg Glu His Lys595                 600                 605Pro Ser Trp Glu Gly Leu Met Lys Arg Gly Met Thr Lys Asp His Thr610                 615                 620Trp Asp His Ala Pro Ser Ser Thr Ser Arg Ser Ser Ser Gly Pro Ser625                 630                 635                 640Trp Thr Asn Pro Thr Ser Cys Arg Arg Gly Leu Gly Arg Ser Lys Cys645                 650                 655Glu Ser Pro Ser Ala Leu Lys Thr Ser Ser Ser Ser Phe Arg Gly Pro660                 665                 670Glu Gly Tyr Pro Cys Thr Leu Arg Cys Pro Ala Thr Val Glu Ser Gln675                 680                 685Cys Ala Cys Leu Leu Trp Phe Ala Giy Ser Arg Thr Tyr Asp Gly Cys690                 695                 700Ala Ala Ala Ala Val Thr Ala Ser Gly Gly Arg Gln Leu Gln Phe Trp705                 710                 715                 720Gly Ile Arg Lys Gly Cys A la Ala Gly Trp Leu Thr Ala Lys His His725                  730                 735Ser Asp Gly Ser Leu Ser Val Arg Val Thr Ala Glu Ile Arg Asn Gln740                 745                 750Leu Val Thr Leu755<210> 3<211> 22<212>人工序列<220><223>引物<400> 3CCTCCCAATT CAAGGATTAG TG                                                 22<210> 4<211> 20<212>人工序列<220><223>引物<400> 4CCTCGCATGC AGCATAGCAA                                                    20<210> 5<211> 20<212>人工序列<220><223>引物<400> 5TGTGGGCTGCA AGTGAGGAGG                                            20<210> 6<211> 23<212>人工序列<220><223>引物<400> 6CCAGTCACAA ACACGTAGCT ACG                                         23

Claims (26)

1．编码具有小麦淀粉合酶之功能的蛋白质的核酸分子，其选自

(a)编码含有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的蛋白质的核酸分子，

(b)含有SEQ ID NO：1所示核苷酸序列或其部分，或与其相对应的核糖核苷酸序列的核酸分子，

(c)与(a)或(b)所述的核酸分子之一可杂交或与其互补的核酸分子，和

(d)其核苷酸序列因遗传密码的简并性而与(a)，(b)或(c)所述核酸分子的序列有所不同的核酸分子。

2．权利要求1所述的核酸分子，其为DNA分子。

3．权利要求2所述的DNA分子，其为cDNA分子。

4．权利要求1至3中的一项或多项所述的核酸分子，其含有调节元件。

5．权利要求1所述的核酸分子，其为RNA分子。

6．核酸分子，所述分子能与权利要求1至5中任一项所述的核酸分子特异性杂交。

7．权利要求6所述的核酸分子，其为长度至少为15个核苷酸的寡核苷酸。

8．载体，其含有权利要求1至5中任一项所述的DNA分子。

9．权利要求8所述的载体，其中所述核酸分子在有义方向上与调节元件相连，该调节元件能确保在原核或真核细胞中转录和合成可翻译的RNA。

10．权利要求8所述的载体，其中所述核酸分子在有义方向上与调节元件相连，该调节元件能确保在原核或真核细胞中合成不可翻译的RNA。

11．权利要求8所述的载体，其中所述核酸分子在反义方向上与调节元件相连，该调节元件能确保在原核或真核细胞中合成不可翻译的RNA。

12．宿主细胞，所述宿主细胞是被权利要求1至5中的一项或多项所述的核酸分子或者权利要求8至11中的一项或多项所述的载体转化的细胞或衍生自该细胞的细胞。

13．由权利要求1至4中的一项或多项所述的核酸分子编码的蛋白质。

14．制备权利要求13所述的蛋白质的方法，其中在能合成所述蛋白质的条件下培养权利要求12所述的宿主细胞，随后从经培养的细胞和/或培养基中分离出所述蛋白质。

15．产生转基因的植物细胞的方法，其中将

a)权利要求1至5中的一项或多项所述的核酸分子，或

b)权利要求8至11中的一项或多项所述的载体

整合至植物细胞的基因组中。

16．转基因的植物细胞，所述细胞是被权利要求1至5中的一项或多项所述的核酸分子或者权利要求8至11中的一项或多项所述的载体转化的细胞或衍生自该细胞的细胞。

17．产生转基因的植物细胞的方法，其中将

a1)权利要求1至5中的一项或多项所述的核酸分子，或

a2)权利要求8至11中的一项或多项所述的载体

整合至植物细胞的基因组中，和

b)由所述植物细胞再生完整的植物。

18．含有权利要求16所述的植物细胞的植物。

19．权利要求19所述的植物，其为单子叶植物或双子叶植物。

20．权利要求19所述的植物，其为有用的植物。

21．权利要求20所述的植物，其为贮存淀粉的植物。

22．权利要求21所述的植物，其为玉米，水稻，马铃薯或小麦植物。

23．权利要求18至22中的一项或多项所述植物的繁殖材料。

24．淀粉，其可得自权利要求16所述的植物细胞，权利要求18至22中的一项或多项所述的植物或者权利要求23所述的繁殖材料。

25．权利要求24所述的淀粉用于生产食品或食品前体，优选为生产烘烤食品或浆糊的用途。

26．权利要求24所述的淀粉用于生产包装材料或一次性用品的用途。