JP2002514427A

JP2002514427A - デンプン合成に関与する小麦の酵素をコードする核酸分子

Info

Publication number: JP2002514427A
Application number: JP2000548479A
Authority: JP
Inventors: ホルスト・レルツ; シュテファーニエ・リュティケ; マルティーナ・ブロック
Original assignee: アベンティス・クロップサイエンス・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング
Priority date: 1998-05-08
Filing date: 1999-05-07
Publication date: 2002-05-21
Also published as: KR20010043457A; WO1999058688A3; WO1999058688A2; CA2328508A1; PL345092A1; CN1299415A; NO20005614L; EP1095152A2; US6890732B1; SK15772000A3; HUP0101833A2; AU4039199A; BR9910307A; NO20005614D0; DE19820607A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、植物におけるデンプンの合成に関与する酵素をコードする核酸分子に関する。これらの酵素は，小麦に由来する可溶性デンプンシンターゼに関係がある。本発明はまた、上記核酸分子を含有するベクターおよび宿主細胞、とくにトランスフォームされた植物細胞、およびそれらから再生され本発明のデンプンシンターゼの増大または低減した活性を示す植物に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は植物におけるデンプン合成に関与する小麦酵素をコードする核酸分子
に関する。この酵素は可溶性のタイプ−１デンプンシンターゼである。本発明はさらに、本発明の核酸分子からなるベクター、宿主細胞、植物細胞お
よび植物に関する。さらに、本発明の核酸分子の導入により変化した特性をもつデンプンを合成す
るトランスジェニック植物の発生方法を記載する。

【０００２】最近の、再生可能な原料物質としての植物構成成分に帰せられる重要性の増大
からみて、バイオテクノロジーの研究の目的の一つは、これらの植物原料物質の
加工産業の要求への適応に向けられている。さらに、再生可能な原料物質のでき
る限り多くの分野における使用を可能にするためには、物質の広範な多様性を発
生させなければならない。

【０００３】油脂、脂肪およびタンパク質とは別に、多糖は植物からの重要な再生可能原料
物質を構成する。セルロースを除いて、高級植物における最も重要な貯蔵物質の
一つであるデンプンは、多糖中の中心的な位置を占めている。この関係で、小麦
はヨーロッパ社会における総デンプン生産の約２０％を提供することから、最も
重要な穀類植物の一つである。

【０００４】多糖のデンプンは、化学的に均一な単位、すなわちグルコース分子のポリマー
である。しかしながら、それはそれらの重合の程度、グルコース鎖の分枝の存在
、およびそれらの鎖長に関して、さらには誘導化たとえばリン酸化されて異なり
、異なる分子種のきわめて複雑な混合物である。したがって、デンプンは均一な
原料物質を構成するものではない。とくに、１,４−グリコシド連結グルコース
分子の本質的に分岐のないポリマーであるアミロースデンプンは、一方、様々な
分枝を有するグルコース鎖の複雑な混合物を構成するアミロペクチンデンプンと
は異なっている。さらに１,６−グリコシド結合の存在によって分枝が起こる。
小麦ではアミロースデンプンは合成されるデンプンの約１１〜３７％を占める。

【０００５】適当なデンプンを、工業的需要の可能性ある最も広範な範囲において可能性あ
る最も広範な様式で使用することを可能にするためには、様々な目的にとくによ
く適用される改良されたデンプンを合成できる植物を提供することが望ましい。
このような植物を提供する一つの可能性は、植物の品種改良方法の適用である。
しかしながら、小麦の特質は倍数体（四倍体および六倍体）であるので、植物の
品種改良によって影響を与えることは、きわめて困難なことが証明されている。
「蝋質」（アミロースを含まない）小麦が、天然に存在する突然変異体の交配に
よって最近発生したばかりである（Nakamuraら, Mol. Gen. Genet. 248 (1985),
253-259）。

【０００６】植物の品種改良法の別法には、組換え法によるデンプン産生植物の特異的な改
良がある。しかしながら、この場合の前提条件は、デンプンの合成に関与する酵
素の同定と特性解明および／またはデンプンの修飾ならびにこれらの酵素をコー
ドする核酸分子の単離である。

【０００７】デンプンの合成を導く生化学的経路は本質的には知られている。植物細胞にお
けるデンプンの合成は色素体中で起こる。光合成的に活性な組織では、これらの
色素体は葉緑体であり、光合成的に不活性な、デンプン貯蔵組織では、それらは
アミロプラストである。

【０００８】デンプン合成に関与する重要な酵素は、デンプンシンターゼおよび分枝酵素で
ある。デンプンシンターゼ中には様々なアイソフォームが記載されていて、これ
らはすべて、グリコシル残基をＡＤＰ−グルコースからα−１,４−グルカンに
転移させることによって重合反応を触媒する。分枝酵素は線状のα−１,４−グ
ルカンへのα−２,６−分枝の導入を触媒する。

【０００９】デンプンシンターゼは２つに分類できる。すなわち、デンプン−顆粒−結合性
−デンプンシンターゼ（「顆粒−結合デンプンシンターゼ」；ＧＢＳＳ）および
可溶性デンプンシンターゼ（「可溶性デンプンシンターゼ」：ＳＳＳ）である。
一部のデンプンシンターゼは、デンプン−顆粒−結合型および固体型の両者に存
在するのでこの区別は各場合で明瞭ではない（Denyerら, Plant J. 4(1993), 19
1-198; Muら, Plant J. 6 (1994), 151-159）。一方、これらのクラス内の様々
な植物種について、多様なアイソフォームが報告されていて、互いにこれらのア
イソフォームは、それらのスターター分子に対する依存性（いわゆる、プライマ
ー依存性（II型）およびプライマー非依存性（Ｉ型）デンプンシンターゼ）によ
り異なっている。

【００１０】デンプン合成時の正確な機能はアイソフォームＧＢＳＳＩについてのみ決定
されており、ここではこの酵素活性が著しくまたは完全に低下した（脱落）がア
ミロースを含まない（いわゆる蝋状）のデンプンを合成する〔Shureら, Cell 35
(1983), 225-233; Visserら, Mol. Gen-Genet. 225 (1991), 289-296; WO 92／1
1376〕、したがってアミロースデンプンの合成における決定的な役割はこの酵素
によって行われると推定されている。この現象はまた、緑藻類のChlamydomonas
reinhardtiiの細胞中でも観察される（Delrueら, J. Bacteriol. 174 (1992), 3
612-3620）。さらに、ＧＢＳＳＩはアミロース合成に関与するのみではなく、
アミロペクチン合成においても重要な役割を果たしていることがChlamydomonas
で証明できた。ＧＢＳＳＩ活性をもたない突然変異体は、正常時に合成される
長鎖のグルカンを含有するアミロペクチンの特定の分画を欠いている。

【００１１】デンプン−顆粒−結合性デンプンシンターゼの他のアイソフォーム、とくにＧ
ＢＳＳ II、および可溶性デンプンシンターゼの機能はまだ分かっていない。可
溶性デンプンシンターゼは、分枝酵素とともにアミロペクチンの合成に関与し（
たとえばPonsteinら, Plant Physiol. 29 (1990), 234-241 参照）、またそれら
はデンプンの合成速度の調節に重要な役割を果たしていると推定される。

【００１２】小麦においては、デンプン−顆粒−結合デンプンシンターゼの少なくとも２種
類のアイソフォーム（６０kDaおよび１００〜１０５kDa）とさらに可溶性デンプ
ンシンターゼと考えられるもう１種のアイソフォーム（Denyerら, Planta 196 (
1995),256-265; Rahmanら, Aust. J. Plant Physiol. 22 (1995), 793-803）が
タンパク質のレベルで同定されている。数種のＳＳＳアイソフォームの存在が、
既に以前にクロマトグラフィー法を用いて検出されている（Rijven, Plant Phys
iol. 81 (1986), 448-453）。小麦ＧＢＳＳＩをコードするｃＤＮＡも以前に、
既に記載されている（Ainsworthら, Plant Mol. Biol. 22 (1993), 67-82）。

【００１３】小麦シンターゼアイソフォームをコードする核酸配列またはこのような核酸の
サブ配列は、ＷＯ９７／４５５４５によって今日では公知である。ＧＢＳＳＩ
以外のデンプンシンターゼをコードするｃＤＮＡ配列は、エンドウ（Dryら, Pla
nt J. 2 (1992), 193-202）、コメ（Babaら, Plant Physiol. 103 (1993), 565-
573）および馬鈴薯（Edwardsら, Plant J. 8 (1995), 283-294）について、これ
までに記載されているのみである。

【００１４】可溶性デンプンシンターゼは、小麦のみではなく、一連の他の植物種でも同定
されている。たとえば、可溶性デンプンシンターゼはエンドウ（Denyer & Smith
, Planta 186 (1992), 609-617）および馬鈴薯（Edwardsら, Plant J. 8 (1995)
, 283-294）から均一に単離されている。

【００１５】これらの場合、ＳＳＳ IIIとして同定された可溶性デンプンシンターゼのアイ
ソフォームは、デンプン-顆粒-結合性デンプンシンターゼＧＢＳＳ IIと同一で
あることが明らかにされている（Denyerら, Plant J. 4(1993), 191-198; Edwar
dsら,Plant J. 8(1995), 283-294）。複数個のＳＳＳアイソフォームの存在は、
一部の他の植物種についてもクロマトグラフィー法により、たとえば大麦の場合
に記載されている（Tyynelae & Schulman, Physiologica Plantarum 89 (1993),
835-841; Kreis, Planta 148 (1980), 412-416）。しかしながら、これらのタ
ンパク質をコードするＤＮＡ配列はまだ報告されていない。

【００１６】デンプン貯蔵植物、好ましくは穀類、とくに小麦を変えて、それらが改良され
たデンプンを合成できるようにするには、それぞれの場合に、デンプンシンター
ゼのアイソフォームをさらにコードするＤＮＡ配列を同定することが必要である
。

【００１７】したがって、本発明の目的は、遺伝的に修飾された植物を発生させて化学的お
よび／または物理的特性が変化した植物デンプンの産生を可能にする、デンプン
の生合成に関与する酵素をコードする核酸分子、とくに小麦からの核酸分子を提
供することにある。この目的は、請求の範囲に指示された使用形式を提供することによって達成さ
れる。

【００１８】本発明はしたがって、可溶性小麦デンプンシンターゼの活性を有するタンパク
質をコードする核酸分子、好ましくは配列番号２に示したアミノ酸配列から本質
的に構成されるタンパク質をコードするこのような分子に関する。とくに、本発
明は配列番号１に記載のヌクレオチド配列またはその部分を含有する核酸分子、
好ましくは配列番号１に記載のコード領域、とくに好ましくは配列番号１のヌク
レオチド９〜５７０を包含する核酸分子、および相当するリボヌクレオチド配列
に関する。

【００１９】本発明はさらに、本発明の核酸分子の一つとハイブリダイズする核酸分子に関
する。本発明はまた、遺伝子コードの縮重により上述の分子のヌクレオチド配列から
変異した配列を有する可溶性小麦デンプンシンターゼをコードする核酸分子に関
する。本発明はまた、上述の配列の一つの全部または部分に相補性の配列を有する核
酸分子に関する。

【００２０】本発明の関連で用いられる「ハイブリダイゼーション」の語は、慣用のハイブ
リダイゼーション条件下に、好ましくは緊縮条件下に、たとえば、Sambrookら,
Molecular Cloning, A Laboratory Manual, ２版, (1989), Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY に記載されたような条件下のハイ
ブリダイゼーションを意味する。

【００２１】「ハイブリダイゼーション」はとくに好ましくは以下の条件下に行われる。ハイブリダイゼーション緩衝液：２×ＳＳＣ；１０×デンハルト溶液（Ficoll
400＋ＰＥＧ＋ＢＳＡ；比１：１：１）；０.１％ＳＤＳ；５mM ＥＤＴＡ；５０
mM Ｎa₂ＨＰＯ₄；２５０μg／mlニシン精子ＤＮＡ；５０μg／ml ｔＲＮＡ；ま
たは０.２５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７.２；１mM ＥＤＴＡ；７％ＳＤＳハイブリダイゼーション温度：Ｔ＝６５〜７０℃ 洗浄緩衝液：０.２×ＳＳＣ；０.１％ＳＤＳ洗浄温度：Ｔ＝４０〜７５℃

【００２２】本発明の核酸分子とハイブリダイズする核酸分子は、原理的には、デンプンシ
ンターゼを発現する任意の小麦植物からのデンプンシンターゼをコードすること
ができる。本発明の分子とハイブリダイズする核酸分子は、たとえば小麦または小麦植物
組織のゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーから単離することができ
る。別法として、それらは組換え法により発生させるか化学的に合成することが
できる。

【００２３】このような核酸分子の同定および単離は、本発明の分子もしくはこれらの分子
の部分またはこれらの分子の逆補体を用いて、たとえば標準方法によるハイブリ
ダイゼーションによって行うことができる（たとえば、Sambrookら, Molecular
Cloning, A Laboratory Manual, 2版, (1989), Cold Spring Harbor Laboratory
Press, Cold Spring Harbor, NY 参照）。

【００２４】使用できるハイブリダイゼーションプローブは、たとえば正確にまたは本質的
に配列番号１に記載のヌクレオチド配列またはこの配列の部分を有する核酸分子
である。ハイブリダイゼーションプローブとして使用できるフラグメントは慣用
の合成技術を用いて調製された合成フラグメントでもよく、その配列は本発明の
核酸分子の配列と本質的に一致するものとすることができる。

【００２５】本発明の核酸分子とハイブリダイズする分子にはまた、本発明の小麦デンプン
シンターゼをコードする上述の核酸分子のフラグメント、誘導体および対立遺伝
子が包含される。フラグメントは、記載のタンパク質の１種をコードするような
十分な長さの核酸分子の部分を意味するものとして理解すべきである。この関連
での誘導体なる語は、これらの分子の配列が、上述の核酸分子の配列から１また
は２以上の位置で異なり、これらの配列と高度のホモロジーを有することを意味
する。ホモロジーとは少なくとも４０％の配列同一性、とくに少なくとも６０％
、好ましくは８０％以上とくに好ましくは９０％以上の同一性を意味する。上述
の核酸分子に対する変異は欠失、置換、挿入または組換えによって発生したもの
である。

【００２６】ホモロジーはさらに、問題の核酸分子またはそれらによってコードされるタン
パク質の間に、機能的および／または構造的等価性の存在することを意味する。
上述の核酸分子とホモロジーを示し、これらの分子の誘導体を構成する核酸分子
は一般的に同じ生物学的機能を発揮する修飾を構成するこれらの分子の変異体で
ある。それらは天然に存在する変異体、たとえば他の生物体からの配列でも、ま
た突然変異体であってもよく、これらの突然変異体は天然に存在するものでも、
また特異的な突然変異誘発により導入されたものでもよい。さらに、変異体は合
成により発生させた配列であってもよい。対立変異体は天然に存在する変異体お
よび合成的に発生させた変異体の両者または組換えＤＮＡ技術によって産生され
た変異体のいずれでもよい。

【００２７】本発明の核酸分子の様々な変異体によってコードされるタンパク質はある種の
特性を共有する。これらには、たとえば、酵素活性、分子量、免疫学的反応性、
コンフォーメーション等、その他の物理的性質、たとえばゲル電気泳動における
移動挙動、クロマトグラフィー的挙動、沈降係数、溶解度、分光分析学的特性、
荷電特性、安定性、至適ｐＨ、至適温度等が包含される。

【００２８】デンプンシンターゼの重要な特性は、ｉ）植物細胞の色素体の基質におけるそ
れらの局在、および ii）線状α−１,４−連結ポリグルカンを合成するそれらの
能力である。この活性はDenyer & Smithにより記載されているようにして決定さ
れる（Planta 186 (1992), 609-617）。本発明の核酸分子によってコードされる
タンパク質は可溶性小麦タイプＩデンプンシンターゼである。これらのタンパク
質は一部の領域で、以前に知られている他植物からの可溶性デンプンシンターゼ
とホモロジーを示す。

【００２９】本発明の核酸分子は、ＤＮＡ分子、とくにｃＤＮＡまたはゲノム分子である。
さらに、本発明の核酸分子はたとえば本発明の核酸分子の転写から生じたＲＮＡ
分子でもよい。本発明の核酸分子はたとえば天然のソースから得られるかまたは
組換え技術によって発生させるかもしくは合成される。

【００３０】本発明はまた、本発明による核酸分子と特異的にハイブリダイズするオリゴヌ
クレオチドに関する。このようなオリゴヌクレオチドは、少なくとも１０、とく
に少なくとも１５、とくに好ましくは少なくとも５０ヌクレオチドの長さを有す
ることが好ましい。本発明のオリゴヌクレオチドは、本発明による核酸分子と特
異的にハイブリダイズするものであり、すなわち、他のタンパク質とくに他のデ
ンプンシンターゼをコードする核酸配列とは全くまたはきわめて低度にしかハイ
ブリダイズしない。本発明のオリゴヌクレオチドは、たとえばＰＣＲ反応のため
のプライマーとして、または関連遺伝子の単離のためのハイブリダイゼーション
プローブとして使用することができる。同様に、それらはアンチセンス構築体ま
たは適当なリボザイムをコードするＤＮＡ分子の構成要素であってもよい。

【００３１】本発明はさらに、本発明の上述の核酸分子からなるベクターとくにプラスミド
、コスミド、ファージミド、ウイルス、バクテリオファージおよび遺伝子操作に
慣用される他のベクターに関する。このようなベクターは、原核または真核細胞
、好ましくは植物細胞のトランスフォーメーションに適している。

【００３２】これらのベクターはとくに、本発明の核酸分子を適宜その隣接調節領域ととも
に植物細胞のゲノム中にインテグレートすることを可能にする。その例としては
agrobacterium 仲介遺伝子移トランスファーに使用できるバイナリーベクターが
ある。好ましくは、本発明の核酸分子のセンスまたはアンチセンス方向でのイン
テグレーションはトランスフォームされた原核または真核細胞において翻訳可能
または、必要に応じて翻訳不能なＲＮＡが合成されることを保証する。

【００３３】「ベクター」の語は一般的に、一本鎖または二本鎖核酸分子を、宿主細胞たと
えばＤＮＡもしくはＲＮＡウイルス、ウイルスフラグメント、プラスミド構築体
中に、調節配列の不存在下または存在下、直接導入を可能にすることが熟練者に
は既知の適当な補助手段を意味し、核酸を細胞もしくは支持材料たとえばガラス
繊維またはパーティクルガン法に用いることができるような他の金属粒子にトラ
ンスファーするために適当であるが、化学的または物理的方法により細胞に直接
導入できる核酸分子も包含する。

【００３４】好ましい実施態様においては、ベクター内の核酸分子は、原核または真核細胞
中において翻訳可能なＲＮＡの転写および合成、所望により翻訳不能なＲＮＡの
合成を保証する調節要素に連結している。

【００３５】本発明による核酸分子の、原核細胞たとえば大腸菌における発現は、これらの
分子によってコードされる酵素の酵素活性のより詳細な特性解明に重要である。
とくに、植物細胞におけるデンプン合成に関与する他の酵素の不存在下において
問題の酵素によって合成された産物の特性を解明することができる。これは問題
のタンパク質が、植物細胞内においてデンプン合成時に発揮する機能に関しての
結論を可能にする。

【００３６】さらに、本発明の核酸分子には、分子生物学における慣用の技術によって様々
なタイプの突然変異を導入することが可能であり（たとえば、Sambrookら, 1989
, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2版, Cold Spring Harbor Labora
tory Press, Cold Spring Harbor, NY 参照）、生物学的性質の変化したタンパ
ク質が合成される。この場合、一方では、核酸分子がコードされたＤＮＡ配列の
５′−または３′−末端から連続的に欠失して発生する欠失突然変異体の発生が
可能であり、このことは相当する頭部切断タンパク質の合成をもたらす。ヌクレ
オチド配列の５′−末端におけるこのような欠失から、たとえば、酵素の色素体
への転座（一過性転座）の原因となるアミノ酸配列の同定が可能になる。これは
、問題の配列の除去により、色素体にはもはや局在せず、細胞質ゾルまたは、他
のシグナル配列の付加により他のコンパートメントに局在する酵素の発生を可能
にする。

【００３７】他方、アミノ酸配列を変化させることで、たとえば酵素活性または酵素調節に
影響を及ぼす位置における点突然変異の導入を考慮することもできる。この方法
で、たとえば変化したＫｍ値を有する突然変異体または細胞中に通常存在するア
ロステリックな調節もしくは共有結合の修飾を介した調節機構にもはや影響され
ない突然変異体を発生させることができる。

【００３８】さらに、本発明のタンパク質の基質または産物特異性が変化した突然変異体、
たとえばＡＤＰ−グルコースに代えてＡＤＰ−グルコース−６−リン酸を用いる
突然変異体を発生させることができる。さらに、本発明のタンパク質の活性−温
度プロファイルが変化した突然変異体を発生させることも可能である。

【００３９】原核細胞の組換え修飾を実施するためには、本発明の核酸分子またはこれらの
分子の部分を、突然変異誘発を起こすことを可能にするプラスミドまたは組換え
ＤＮＡ配列によって変化させる配列に導入することができる。塩基交換を実施す
るか、天然もしくは合成配列を標準方法を用いて添加する（Sambrookら, 1989,
Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 第2版, Cold Spring Harbor Labora
tory Press, Cold Spring Harbor, NY 参照）。ＤＮＡフラグメントを互いに連
結するためには、アダプターまたはリンカーをフラグメントに付加してもよい。
さらに、適当な制限切断部位の提供または余分なＤＮＡもしくは制限切断部位を
除去するの操作を用いることができる。挿入、欠失または置換が適当な場合には
、インビトロ突然変異誘発、プライマー修復、制限またはライゲーションが使用
できる。一般的に用いられる分析方法は配列分析、制限分析または生化学もしく
は分子生物学のその他の方法である。

【００４０】さらに他の実施態様においては、本発明は宿主細胞とくに本発明の上述の核酸
分子または本発明のベクターによりトランスフォームされた原核または真核細胞
、およびこのようにトランスフォームされた細胞に由来し、本発明の核酸分子ま
たはベクターからなる細胞に関する。それらは、原核または真核細胞であること
が好ましく、とくに植物細胞であることが好ましい。

【００４１】本発明はさらに、本発明の核酸分子によってコードされ、組換え技術によって
調製できるデンプンシンターゼ活性を有するタンパク質、ならびに本発明の宿主
細胞を熟練者には既知であり、本発明のタンパク質の合成を可能にする適当な条
件下に培養し、ついで宿主細胞および／または培養メジウムからそれを単離する
ことによるそれらの製造方法に関する。

【００４２】本発明の核酸分子が与えられれば、組換え方法を用いて、直接的様式で植物の
デンプン代謝に介入させることが可能になり、物理化学的性質たとえばアミロー
ス／アミロペクチン比、分枝の程度、平均鎖長、リン酸含量、ゼラチン化挙動、
ゲルもしくはフィルム形成性、デンプン顆粒サイズおよび／またはデンプン顆粒
形状が、既知のデンプンに比較して変化した改良デンプンが合成される。

【００４３】すなわち、問題のデンプンシンターゼの活性を増大させるために本発明の核酸
分子を植物細胞中で発現させ、またはこの酵素を自然には発現しない細胞に導入
することが可能である。さらに、もはや細胞固有の調節機構に支配されないか、
または温度−活性プロファイル、基質もしくは産物特異性が変化した本発明のデ
ンプンシンターゼを得るために、本発明の核酸分子を熟練者には既知の方法によ
って修飾することができる。

【００４４】本発明の核酸分子を植物中で発現させた場合、原理的には合成されるタンパク
質を植物細胞中の任意所望のコンパートメントに局在させることが可能である。
特定のコンパートメントへの局在を達成するためには、色素体における局在を保
証する配列を欠失させ、残ったコード領域を必要に応じて、問題のコンパートメ
ントへの局在を保証するＤＮＡ配列に連結しなければならない。このような配列
は既知である（たとえば、Braunら, EMBO J. 11 (1992), 3219-3227; Wolterら,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 846-850; Sonnewaldら, Plant J. 1(
1991), 95-106 参照）。

【００４５】したがって、本発明はまた、本発明の核酸分子または本発明のベクターが植物
細胞のゲノムにインテグレートした本発明の核酸分子またはベクターでトランス
フォームされたトランスジェニック植物細胞の発生方法、本発明の核酸分子もし
くはベクターでトランスフォームされたトランスジェニック植物細胞、ならびに
このようにしてトランスフォームされた細胞から誘導されるトランスジェニック
植物細胞に関する。本発明の細胞は、本発明の１個または２個以上の核酸分子ま
たはベクターからなり、これらは好ましくは植物細胞内での転写を保証する調節
ＤＮＡ要素、とくに適当なプロモーターに連結される。このような細胞は、とく
にこれらが、これらの細胞中には天然には存在しない本発明の核酸分子からなる
という事実、またはこのような分子が、他では起こらない細胞ゲノム内の位置に
インテグレートされ、すなわち異なるゲノム環境内に存在するという事実により
天然に存在する植物細胞から識別することができる。さらに、本発明によるこの
ようなトランスジェニック植物細胞は、必要に応じて細胞中に天然に存在するこ
のような分子のコピーに加えて、それらがそれらのゲノムに安定にインテグレー
トされた本発明の核酸分子、少なくとも１コピーからなるという事実により、天
然に存在する植物細胞から識別することができる。細胞内に導入された核酸分子
（単数または複数）が細胞内に既に天然に存在する分子への付加的なコピーであ
る場合には、そのときは、本発明の植物細胞は、とくにこの付加的なコピーまた
はこれらの付加的なコピーが天然には存在しないゲノム内の位置に局在するとい
う事実により、天然に存在する植物細胞から識別することができる。これは簡単
な方法により、熟練者には既知の方法によって、たとえばサザンブロット分析を
用いてチェックすることができる。

【００４６】植物ゲノム内に導入された核酸分子が植物細胞に対して異種である場合には、
トランスジェニック植物細胞は本発明の核酸分子の転写体を提示し、これは熟練
者には既知の方法により簡単にたとえばノーザンブロット分析によって検出する
ことができる。

【００４７】導入された本発明の核酸分子が植物細胞に対して同種である場合には、本発明
の細胞は、たとえば本発明の核酸分子の付加的な発現に基づいて天然に存在する
細胞から識別することができる。トランスジェニック植物細胞はより多い本発明
の核酸分子の転写体からなることが好ましい。これはたとえばノーザンブロット
分析によって検出することができる。この場合の「より多い」は好ましくは相当
するトランスフォームされていない細胞の場合よりも少なくとも10％以上、好ま
しくは少なくとも２０％以上、さらに好ましくは少なくとも５０％以上の転写体
を意味する。これらの細胞はさらに、好ましくは、本発明のタンパク質の活性に
おける相当する増大または減少を提示する（少なくとも１０％、２０％または５
０％）。トランスジェニック植物細胞は熟練者には既知の技術によって完全な植
物に再生することができる。

【００４８】本発明の他の主題は、１個または２個以上の本発明の核酸分子またはベクター
が植物細胞のゲノム中にインテグレートされ完全な植物が上記植物細胞から再生
されるトランスジェニック植物の発生方法である。本発明のトランスジェニック
植物細胞を再生させることによって得られる植物もまた本発明の主題である。本
発明は、さらに、上述のトランスジェニック植物細胞からなる植物に関する。原
理的には、トランスジェニック植物は任意の種の植物であってよく、すなわち単
子葉植物のみならず、双子葉植物であってもよい。それらは有用な植物であるこ
とが好ましく、好ましくはデンプン合成またはデンプン貯蔵植物、とくに好まし
くはライ麦、大麦、オート麦、小麦、サトウモロコシおよびキビ、サゴ、トウモ
ロコシ、コメ、エンドウ、マローファット豆、キャサバ、馬鈴薯、トマト、アブ
ラナ、大豆、アサ、ユリ、ヒマワリ、ササゲまたはアロールート、とくに小麦、
トウモロコシ、コメおよび馬鈴薯である。

【００４９】本発明はまた、本発明の植物の繁殖用材料たとえば果実、種子、塊茎、根茎、
実生、挿木、カルス、プロトプラスト、培養細胞等に関する。本発明はさらに本発明の上述の植物および／またはこのような植物のデンプン
貯蔵部分からデンプンを抽出する工程からなる改良されたデンプンの調製方法に
関する。

【００５０】植物または植物のデンプン貯蔵部とくに小麦からのデンプンの抽出方法は、熟
練者には周知である。たとえば、Eckhoffら（Cereal Chem. 73 (1996), 54-57)
“Starch: Chemistry and Technology（Eds.: Whistler, BeMiller and Paschal
l(1994), 2版, Academic Press Inc. London Ltd; ISBN 0-12-746270-8; たとえ
ば第12章412-468頁; Corn and sorghum starchs: production; by Watson; 第13
章469-479頁；Tapioca, arrowroot and sago starches: production; by Corbis
hley and Miller; 第14章479-490頁；Potato starch: production and uses; by
Mitch; 第15章491-506頁；Wheat starch: production, modification and uses;
by Knight and Oson; 第16章507-528頁；Rice starch:production and uses; b
yRohmer and Klem 参照。植物材料からのデンプンの抽出の過程に通常用いられ
る装置は、セパレーター、デカンター、ハイドロサイクロン、スプレードライヤ
ーおよび流動床ドライヤーである。

【００５１】本発明の核酸分子の発現により、本発明のトランスジェニック植物細胞および
植物では、物理化学的性質、たとえばアミロース／アミロペクチン比、分枝の程
度、平均鎖長、リン酸含量、ゼラチン化挙動、デンプン顆粒サイズおよび／また
はデンプン顆粒形状が野生型植物において合成されるデンプンに比較して変化し
たデンプンが合成される。とくに、このようなデンプンでは、既知のデンプンに
比較してデンプンから作成されるゲルの粘度および／またはフィルムもしくはゲ
ル形成性に関して変化している。

【００５２】本発明の更なる主題は、本発明の植物細胞および植物ならびにそれらの増殖物
から得られるデンプン、および本発明の上述の方法によって得られるデンプンで
ある。本発明の核酸分子を用いてさらに、本発明のタンパク質の活性が低下した植物
細胞および植物を発生させることが可能である。これはまた野生型植物細胞から
のデンプンと比較して、化学的および／または物理的性質が変化したデンプンの
合成を導く。

【００５３】したがって、本発明の更なる主題はまた、トランスフォームされていない細胞
に比較してデンプンシンターゼの活性が低下した本発明の核酸分子からなるトラ
ンスジェニック植物細胞である。

【００５４】デンプンシンターゼの活性が低下した植物細胞は、たとえば共抑制を達成する
ために適当なアンチセンスＲＮＡ、センスＲＮＡを発現させるか、デンプンシン
ターゼをコードし、本発明の核酸を利用する転写体を特異的に切断するように適
当に構築されたリボザイムを発現させることにより、熟練者に周知の方法によっ
て得られる。Jorgensen（Trends Biotechnol. 8 (1990), 340-344），Niebelら
（Curr. Top. Microbiol. Immunol. 197 (1995), 91-103），Flavellら（Curr.
Top. Microbiol. Immunol. 197 (1955), 43-46），Palaqui & Vaucheret（Plant
. Mol. Biol. 29 (1995), 149-159），Vaucheretら（Mol. Gen. Genet. 248 (19
95), 311-317），de Borneら（Mol.Gen. Genet. 243 (1994), 613-621）参照。

【００５５】本発明のデンプンシンターゼの活性を低下させるためには、たとえばアンチセ
ンスＲＮＡを発現させることにより、それをコードする転写体の数を植物細胞内
で低下させるのが好ましい。この場合、一方では、存在する隣接配列を含めて本発明のタンパク質をコード
するすべての配列を包含するＤＮＡ分子またはコード配列の部分のみを包含する
ＤＮＡ分子を利用することがで可能で、これらの部分は細胞にアンチセンス効果
を起こすのに十分な長さを有する必要がある。一般的に最低１５bpまでの長さの
配列、好ましくは１００〜５００bpの長さの配列、とくに５００bpを越える長さ
の配列が効率的なアンチセンス阻害に使用される。一般に５０００bpより短いＤ
ＮＡ分子、好ましくは２５００bpより短い配列が使用される。

【００５６】可能な限り本発明のＤＮＡ分子と高度のホモロジーを示すＤＮＡ配列が使用さ
れるが、完全に同一である必要はない。ホモロジーは最低約６５％以上でなけれ
ばならない。９５〜１００％のホモロジーを有する配列の使用が好ましい。本発明の他の主題は、本発明の細胞もしくは植物、および／またはこのような
植物のデンプン貯蔵部分からデンプンを抽出する工程を包含する改良されたデン
プンを製造するための方法である。

【００５７】本発明の更なる課題は、本発明の細胞または植物および繁殖用材料またはその
部分から得られるデンプン、ならびに本発明の方法によって得られるデンプンで
ある。本発明のデンプンは、熟練者に周知の方法により改良することが可能であり、
その非改良型または改良型において、食品または非食品分野における様々な用途
に適している。

【００５８】原理的に、本発明のデンプンの可能な用途は２つの重要な分野に分けることが
できる。１つの分野には酵素的または化学的方法で得られるデンプンの加水分解
物、主としてグルコースおよびグルカン単位が包含される。それらは、さらに化
学的な改良および処理たとえば発酵のための出発原料として使用される。コスト
を下げるために重要な点は、加水分解方法の単純化および経済的設計である。最
近ではアミログルコシダーゼを用いて酵素的に処理されている。実現可能なこと
は酵素の使用量を減らすことによる経済的節約である。これはたとえば顆粒の表
面積を増大させること、使用される酵素の接近を制限する分枝の程度または立体
構造を低く抑えて消化能力を容易にすることにより、デンプン構造を変えること
によってもたらされる。

【００５９】本発明のデンプンがそれらの重合構造により、いわゆるネイティブなデンプン
として使用できる他の分野は、さらに２つの適用分野に分けることができる。１．食品工業デンプンは多数の食品に対する伝統的な添加物であり、その機能は本質的に水
性添加物を結合させ、また粘度の上昇もしくはゲル化能を増大させることである
。重要な特性は、粘弾性、吸収特性、膨潤温度、ゲル化温度、粘度、増粘力、デ
ンプン溶解度、透明性およびゲル構造、熱安定性、剪断力安定性、酸に対する安
定性、逆行傾向、フィルム形成能、凍結−解凍安定性、塩溶液における粘度安定
性、消化能力、ならびに、たとえば無機および有機イオンとの錯体の形成能であ
る。

【００６０】２．非食品工業この重要な分野では、デンプンは様々な製造過程の補助剤として、または工業
製品における添加物として使用することができる。デンプンを補助剤として用い
る場合としては、とくに製紙および製本工業を挙げなければならない。デンプン
は主として遅延目的（固体維持）で、充填粒子および微粒子の結合のため、芯と
して、および脱水のために働く。その上、堅牢性、硬さ、頑健性、感触、光沢、
平滑性、結合力および表面性の有利な性質が利用される。

【００６１】２.１製紙および製本工業紙の製造過程において、４つの分野での適用が特筆されなければならない。す
なわち表面、コーティング、ストックおよびスプレーである。表面処理に関して
デンプンに対する要求は本質的に、高度の白さ、適当な粘度、高度な粘度安定性
、良好なフィルム形成性および低いダスト形成性である。コーティングに用いら
れた場合、固体含量、適当な粘度、高度な結合能および高度な色素親和性が重要
な役割を果たす。ストックに対する添加物として使用される場合は、急速で、均
一な、ロスのない分布、高度な機械的強度およびペパーウエブにおける完全な維
持が重要である。デンプンがスプレー部分に使用されるときには、この場合も適
当な固体含量、高い粘度および高度な結合能が重要である。

【００６２】２.２接着工業デンプンが適用される重要な分野は接着工業であり、ここで使用される可能性
は４つの準分野、すなわち、純粋なデンプンペーストとしての使用、特殊な化学
薬品で処理したデンプンペーストの使用、合成樹脂、およびポリマー分散液に対
する添加物としてのデンプンの使用、ならびに合成接着剤のエキステンダーとし
てのデンプンの使用がある。デンプンを基剤とした接着剤の９０％は、波形板の
製造、紙袋の製造、紙およびアルミニウムの合成材料の製造、ボール紙の製造、
および封筒、スタンプ等に塗布する接着剤の分野において使用される。

【００６３】２.３繊維工業および繊維ケア製品工業デンプンが補助剤および添加剤として適用される重要な分野は繊維および繊維
ケア製品の製造分野である。繊維工業中、以下の４つの適用分野がとくに目立っ
ている。サイジング剤、すなわちデンプンの使用、織布時に適用される張力から
保護するためのまくれ挙動の平滑化および強力化のための補助剤としておよび織
布時の摩耗抵抗を増大させるため、とくに漂白、染色等のような品質を低下させ
る前処理後の繊維仕上げ剤としてのデンプン、浸出を防止するための染色ペース
トの製造時における増粘剤としてのデンプンならびに縫糸のワーピング（warpin
g）剤への添加物としてのデンプンの使用がある。

【００６４】２.４建設材料工業適用の第４の分野は建設材料における添加物としてのデンプンの使用である。
例としては、石膏プラスターボードの製造に際して石膏スラリーに混合するデン
プンを水でゲラチン化し、プラスターコアの表面に分散させると、そこでボード
とコアが結合される。他の適用分野は、下塗りおよび無機繊維への混合である。
そのまま混合できるコンクリートの場合は、結合の遅延にデンプン生成物が使用
される。

【００６５】２.５土壌安定剤デンプンの他の市場に、土壌が人工的に荒らされた場合、水からの土壌の一時
的な保護のために使用される土壌安定剤の製造である。現時点の知識によれば、
デンプンとポリマー乳化液の製品の組み合わせは、それらの腐食およびクラスト
低下作用に関しては以前使用された製品と同等であるが、著しく安価である。

【００６６】２.６穀類保護製品および肥料における使用デンプンの使用のための一つの適用分野には、生成物の特異的な性質を変える
ための穀類保護生成物の分野がある。すなわちデンプンは穀類保護生成物および
肥料の湿潤性の改良、活性成分の制御放出、液体、揮発性および／または悪臭が
ある活性成分の微結晶性の、安定で、成型可能な物質への変換、非相溶性の化合
物の混合および分解の低減による活性期間延長のために使用することができる。

【００６７】２.７医薬、医療および化粧品工業他の適用分野は医薬、医療および化粧料工業の分野である。医薬工業において
は、デンプは錠剤の結合剤として、またはカプセルにおける結合剤の希釈のため
に用いられる。さらに、デンプンは膨潤後に液体を吸収し、短時間内に活性成分
を遊離させる程度まで膨潤するので、錠剤の崩壊剤として用いることができる。
医療用潤滑粉末および外傷散剤は質的な理由からデンプンを基剤とする。化粧品
の分野では、デンプンは、たとえば香料およびサリチル酸のような粉末添加物の
担体として使用される。デンプンの比較的大きな適用分野に練り歯磨がある。

【００６８】２.８木炭および練炭へのデンプンの添加デンプンの適用分野には木炭および練炭への添加物としての適用がある。デン
プンの添加により、木炭は固められ、高品質のすなわち早期には崩壊しない練炭
に加工される。バーベキュー用の木炭の場合は、デンプンの添加量は４〜６％、
発熱量の高い木炭では０.１〜０.５％である。しかも、木炭または練炭にデンプ
ンを添加した場合には、有害な物質の発生が著しく低下するので、デンプンは重
要になっている。

【００６９】２.９原鉱および石炭のスラリー処理さらに、デンプンは原鉱および石炭のスラリー処理の分野において凝集剤とし
て使用することができる。

【００７０】２.10 鋳造補助剤更なる適用分野は鋳造補助剤への添加剤としてである。様々な鋳造過程では結
合剤で処理された砂から作られるコアが必要とされる。現在最も多く用いられる
結合剤はベントナイトであり、これを改良されたデンプン、多くの場合、膨潤可
能なデンプンで処理する。デンプンを加える目的は、流動性を上昇させ、結合力を改善するためである。
さらに、膨潤可能なデンプンはたとえば冷水分散性、再水和可能性、容易な砂と
の混和性、および水との高度の結合能のような製造操作における他の要求に合致
する。

【００７１】２.11 ゴム工業における使用ゴム工業においては、デンプンは技術的および視覚的な品質を改良するために
使用される。理由は、表面の光沢の改良、取り扱いおよび外観の改良であり、こ
の目的のために、デンプンは、冷却硬化前に、ゴム原料の粘着性ゴムの表面に散
布され、またゴムの印刷性の改良にも用いられる。

【００７２】２.12 代用皮革の製造改良されたデンプンはさらに、代用皮革の製造用に販売されている。

【００７３】２.13 合成ポリマーにおけるデンプンポリマーの分野では、以下の適用分野が考えられる。すなわち、処理過程にお
けるデンプン分解生成物の導入（合成ポリマーとデンプンの間の直接結合はなく
、デンプンは充填剤としてのみ作用する）、または別法として、ポリマーの製造
時におけるデンプン分解生成物の導入（デンプンとポリマーは安定な結合を形成
する）である。

【００７４】純粋な充填剤としてのデンプンの使用は、他の物質たとえばタルクと比肩する
ほどではない。しかしながら、デンプンの特殊な性質が最終製品の性質のスペク
トルに衝撃的なすなわち著しい変化を与える場合には、別である。例えば、熱可
塑性樹脂たとえばポリエチレンの処理にデンプン生成物を使用する場合である。
この場合、デンプンと合成ポリマーは１：１の比での共発現によって混合して親
練りを与え、これから各種生成物が、慣用の処理技術を用いて顆粒化ポリエチレ
ンにより製造される。ポリエチレンフィルムにデンプンを導入することにより、
中空体の場合の物質透過性の増大、水蒸気透過性の増大、改良された帯電防止性
、改良されたアンチブロック挙動および水性インクを用いたときの改良された印
刷性が達成できる。

【００７５】他の可能性としては、ポリウレタンフォームにおけるデンプンの使用がある。
デンプン誘導体を適合させ、処理操作を至適化することにより、合成ポリマーと
デンプンのヒドロキシル基の間の反応を指示された様式で制御することが可能に
なる。このことからデンプンの使用により、以下の性質のスペクトルをポリウレ
タンフィルムが得られる。すなわち、低い熱膨張係数、低い縮小挙動、改良され
た圧−張力挙動、水の取り込みを変えることなしでの水蒸気透過性の上昇、低い
燃焼性、および最大抗張力の低下、可燃部分とのドロップ形成がない、ハロゲン
を含まない、またはその他のエージングの低減である。依然として存在する欠点
は低い圧縮強度および低い衝撃強度である。

【００７６】製品開発は、現在ではもはやフィルムに限定されない。固体のポリマー製品た
とえば、デンプン含有率５０％以上のポット、スラブおよびディッシュもまた製
造されている。さらに、生物分解性がはるかに高いので、デンプン／ポリマー混
合物はきわめて有利と考えられる。

【００７７】デンプングラフトポリマーが、そのきわめて高い水結合能によりきわめて重要
になっている。それらは遊離ラジカル鎖機構の原理に従って接木されたデンプン
骨格と合成モノマーの側鎖を有する製品である。現在使用されているデンプング
ラフトポリマーはデンプン１ｇあたり水１０００ｇまでの優れた結合および保持
能が高粘度と相俟って傑出している。これらの超吸水剤の適用分野は最近著しく
拡大していて、衛生材料の分野、生理用ナプキンおよびアンダーシートのような
製品、また農業分野では、たとえば種子のコーティングに使用される。

【００７８】新規な遺伝的に改良されたデンプンの適用を決定する重要な点は、一方では、
構造、水分含量、タンパク質含量、脂質含量、繊維含量、灰分／リン酸塩含量、
アミロース／アミロペクチン比、分子量分布、分枝の程度、顆粒サイズおよび顆
粒形状ならびに結晶性であり、また他方、以下の性質に影響する特性、すなわち
流動性および吸水性挙動、ゼラチン化温度、粘度、塩溶液における粘度安定性、
増粘力、溶解度、ゲル構造およびゲルの透明性、熱安定性、剪断力安定性、酸に
対する安定性、退化傾向、ゲル形成、凍結−解凍安定性、錯体形成性、ヨウ素結
合、フィルム形成、接着力、酵素安定性、消化能および反応性である。

【００７９】組換え法による改良デンプンの製造は、一方では、植物から誘導されたデンプ
ンの性質を、化学的または物理的方法による他の修飾がこれ以上要らないほどに
変えることができる。他方、組換え法で変えたデンプンをさらに化学的修飾に付
し、上述の一部の分野への適用のためにさらに品質の改良を行うこともできる。
これらの化学的改良の原理は周知である。これらには、とくに熱処理による修飾
、有機酸または無機酸による処理、酸化およびエステル化があり、たとえば、リ
ン酸デンプン、硝酸デンプン、硫酸デンプン、キサンテートデンプン、酢酸デン
プンおよびクエン酸デンプンを導く。さらに、強酸の存在下でモノまたはポリア
ルコールを用いて、デンプンエーテルを製造することができ、デンプンアルキル
エーテル、Ｏ−アリルエーテル、ヒドロキシアルキルエーテル、Ｏ−カルボキシ
メチルエーテル、Ｎ−含有デンプンエーテル、Ｐ−含有デンプンエーテル、Ｓ−
含有デンプンエーテル、架橋デンプンまたはデンプングラフトポリマーが得られ
る。

【００８０】本発明によるデンプンの好ましい使用は、一方ではパッケージ材料および使い
捨て製品の製造であり、他方では食品および食品前駆物質の製造である。

【００８１】本発明の核酸分子を植物細胞中でセンスまたはアンチセンス方向に発現させる
ためには、それらを植物細胞内での転写を保証する調節ＤＮＡ要素に連結する。
これらには、とくに、プロモーター、エンハンサーおよびターミネーターが包含
される。一般に、植物細胞内で活性な任意のプロモーターが発現に適している。

【００８２】前述のプロモーターはたとえば、発現が構成的であるか、または特定の組織で
のみ、植物の発生の経過の特定時間にのみまたは外部因子により決定されるとき
のみに起こるかによって選択される。植物に関してはプロモーターは同種でも異
種でもよい。適当なプロモーターの例には、構成的発現にはカリフラワーモザイ
クウイルス３５ＳＲＮＡプロモーターおよびトウモロコシユビキチンプロモー
ターがあり、塊茎特異的な発現にはパタチンプロモーター（Rocha-Sosaら, EMBO
J. 8 (1989), 23-29）、光合成に活性な組織のみでの発現を保証するプロモー
ターにはたとえばＳＴ−ＬＳ１プロモーター（Stockhausら, Proc. Natl. Acad.
Sci.USA 84 (1987), 7943-7947; Stockhausら, EMBO J. 8 (1989), 2445-2451
）、また内胚乳−特異的な発現には、小麦ＨＭＧプロモーター、ＵＳＰプロモー
ター、ファゾエリンプロモーターまたはトウモロコシゼイン遺伝子からのプロモ
ーターがある。

【００８３】転写を正しく終結させ転写体にポリ-Ａテールを付加する作用をもち、転写を
安定化する機能を有すると考えられるターミネーション配列が存在してもよい。
このような要素は文献に記載され（Gielenら, EMBO J. 8 (1989), 23-29）、所
望により交換が可能である。

【００８４】本発明は、可溶性小麦デンプンシンターゼ機能を有するタンパク質をコードす
る核酸分子を提供する。本発明の核酸分子は、デンプン生合成において機能的に
同一であるこの酵素の産生を可能にし、この酵素の活性が変化を受けしたがって
構造および物理化学的性質が組換え技術によって変えられた植物の発生を可能に
する。

【００８５】原理的に、本発明の核酸分子は本発明のデンプンシンターゼの活性を増大また
は低減させ、一方同時にデンプンの合成に関与する他の酵素の活性も変化させた
植物の発生に用いることもできる。植物におけるデンプンシンターゼ活性を変え
ると構造の変化したデンプンが合成される。さらにデンプンシンターゼをコード
する核酸分子または適当なアンチセンス構築体を、内因性のＧＢＳＳＩ，ＳＳ
ＳもしくはＧＢＳＳ IIタンパク質の合成がアンチセンス効果または突然変異の
ために既に阻害されているか、または分枝酵素の合成が既に阻害されている植物
細胞に導入することができる（たとえば、ＷＯ９２／１４８２７またはShannon
& Garwood,1984, in Whistler, BeMiller & Paschall, Starch: Chemistry and
Technology, Academic Press, London, 2nd Edition: 25-86 参照）。

【００８６】トランスフォームされた植物中のデンプン生合成に関与する数種の酵素の合成
の阻害を達成することが意図された場合、トランスフォーメーションは、適当な
プロモーターの制御下にアンチセンス方向に問題の酵素をコードする数個の領域
から同時になるＤＮＡ分子を包含する。この場合、別法として各配列をそれ自身
のプロモーターの制御下に置くか、または配列をジョイントプロモーターからの
融合体として転写するか、もしくはジョイントプロモーターの制御下置くことが
できる。最後に挙げた別法では、問題のタンパク質の合成がある程度までほぼ阻
害されるので、一般的に好ましい。このような構築体に用いられる個々のコード
領域の長さに関しては、アンチセンス構築体の発生について上述したことがこの
場合も同様にあてはまる。原理的には、１つのプロモーターから開始されるこの
ようなＤＮＡ分子中の転写されたアンチセンスフラグメントの数には上限はない
。しかしながら、形成された転写体は好ましくは１０kbの長さ、とくに５kbの長
さを越えない方が好ましい。

【００８７】このようなＤＮＡ分子中に存在するコード領域は、適当なプロモーターの背後
のアンチセンス方向の他のコード領域と組み合わせて、以下のタンパク質、すな
わち、デンプン-顆粒結合デンプンシンターゼ（ＧＢＳＳＩおよびII），および
可溶性デンプンシンターゼ（ＳＳＳＩおよびII）、分枝酵素（イソアミラーゼ
、プルラナーゼ、Ｒ−酵素、分枝酵素、脱分枝酵素）、デンプンホスホリラーゼ
および不均一酵素をコードするＤＮＡ配列から誘導することができる。以上の列
挙は例示にすぎない。他のＤＮＡ配列をこのような組み合わせのために使用する
ことも可能である。このような構築体であれば、この構築体でトランスフォームされた植物細胞中
で複数個の酵素の合成を同時に阻害することが可能である。

【００８８】さらに、１種または２種以上のデンプン生合成遺伝子が欠落した植物突然変異
体中に、上述の構築体を導入することができる（Shannon & Garwood, 1984, in
Whistler,BeMiller & Paschall, Starch: Chemistry and Technology, Academic
Press, London, 2nd Edition: 25-86 参照）。これらの欠損は以下のタンパク
質すなわち、デンプン-顆粒-結合性デンプンシンターゼ（ＧＢＳＳＩおよびII
）および可溶性デンプンシンターゼ（ＳＳＳＩおよびII）、分枝酵素（ＢＥＩ
およびII）、脱分枝酵素（Ｒ−酵素）、不均一酵素およびデンプンホスホリラー
ゼに関連する。この列挙は単なる例示である。

【００８９】このような操作で、複数個の酵素の合成を、それらによってトランスフォーム
された植物細胞内で同時に阻害することも可能である。高級植物に異種遺伝子の導入を準備するには、大腸菌に対する複製シグナルと
トランスフォームされた細菌細胞を選択するためのマーカー遺伝子を含有するク
ローニングベクターを利用できる。このようなベクターの例には、ｐＢＲ322、
ｐＵＣシリーズ、Ｍ13ｍｐシリーズ、ｐＡＣＹＣ184等がある。所望の配列を適
当な制限切断部位でベクターに導入することができる。得られたプラスミドを用
いて大腸菌細胞をトランスフォームする。トランスフォームされた大腸菌細胞を
適当なメジウム中で増殖させ、ついで収穫し、溶菌する。プラスミドは回収され
る。得られたプラスミドＤＮＡの特性を解明するための分析方法には、一般に制
限分析、ゲル電気泳動、および生化学および分子生物学の他の方法が用いられる
。それぞれの操作ののちに、プラスミドＤＮＡを切断し、得られたＤＮＡフラグ
メントを他のＤＮＡ配列に連結することができる。各プラスミドＤＮＡの配列を
同種または異種プラスミド中にクローン化することができる。

【００９０】ＤＮＡを植物宿主細胞中に導入するには、多くの技術を使用できる。これらの
技術にはトランスフォーメーション剤としてAgrobacterium tumefaciens または
Agrobacterium rhizogenesを使用するＴ−ＤＮＡによる植物細胞のトランスフォ
ーメーション、プロトプラスト融合、注入、ＤＮＡのエレクトロポレーション、
バイオリスティックな方法によるＤＮＡの導入などがある。

【００９１】植物細胞へのＤＮＡの注入およびエレクトロポレーションでは、用いるプラス
ミドに特段の要求はない。単純なプラスミド、たとえばｐＵＣ誘導体を用いるこ
とができる。しかしながら、この方法でトランスフォームされた細胞から完全な
植物を再生しようとする場合は、選択マーカー遺伝子の存在が必要である。

【００９２】所望の遺伝子の植物細胞中への導入方法によっては、さらにＤＮＡ配列が要求
される。たとえば、植物細胞のトランスフォーメーションにＴｉおよびＲｉプラ
スミドを使用した場合は、多くの場合ＴｉおよびＲｉプラスミドＴ−ＤＮＡの右
および左境界配列が使用されるが、その少なくとも右境界配列を隣接領域として
導入すべき遺伝子に連結しなければならない。

【００９３】 Agrobacteriumをトランスフォーメーションに用いる場合は導入すべきＤＮＡ
を特殊なプラスミド、中間ベクターまたはバイナリーベクターにクローン化しな
ければならない。中間ベクターは、Ｔ−ＤＮＡ中の配列にホモロジーを示す配列
により、相同組換えによってagrobacteriumのＴｉおよびＲｉプラスミドにイン
テグレートすることができる。上記プラスミドはＴ−ＤＮＡのトランスファーに
必要なｖｉｒ領域も含有する。中間ベクターはagrobacterium中で複製できない
。中間ベクターはヘルパープラスミドによってAgrobacterium tumefaciensにト
ランスファーさせることができる（接合）。バイナリーベクターは、大腸菌およ
び agrobacterium中で複製できる。それらは、選択マーカー遺伝子およびリンカ
ーまたはポリリンカーを含有し、それらは右および左Ｔ−ＤＮＡ境界領域により
枠取りされている。それらは直接 agrobacterium中にトランスフォームすること
ができる（Holstersら, Mol. Gen. Genet. 163 (1978), 181-187）。宿主細胞と
して働く agrobacteriumは、ｖｉｒ領域をもつプラスミドを含まなければならな
い。ｖｉｒ領域はＴ−ＤＮＡを植物細胞中にトランスファーする上で必要である
。付加的なＴ−ＤＮＡが存在してもよい。このようにトランスフォームされたag
robacteriumは植物細胞のトランスフォーメーションに使用することができる。

【００９４】植物細胞のトランスフォーメーションのためのＴ−ＤＮＡの使用は、徹底的に
研究されており、EP 120 516号、Hoekema, In: The Binary Plant Vector Syste
m Offset drukkerij Kanters B.V., Alblasserdam (1985), 第5章; Fraleyら, C
rit. Rev. Plant Sci. 4, 1-46 および Anら, EMBO J. 4 (1985), 277-287 に詳
細に記載されている。

【００９５】植物細胞にＤＮＡをトランスファーするには、植物の外植片をAgrobacterium
tumefaciensまたは Agrobacterium rhizogenesと共培養するのが便利である。つ
いで、特にある種の糖、アミノ酸、トランスフォームされた細胞を選択するため
の抗生物質または生物殺滅剤を含有する適当なメジウム中で、感染した植物材料
（たとえば、葉片、茎切片、根、プロトプラストまたは懸濁培養で増殖させた植
物細胞）から完全な植物を再生させることができる。ついで得られた植物につい
て導入されたＤＮＡの存在を調べることができる。ほかにバイオリスティックな
方法の使用またはプロトプラストトランスフォーメーションによる異種ＤＮＡの
導入の可能性も知られている（たとえば、Willmitzer, L., 1993, Transgenic p
lants. In: Biotechnology, A Multi-Volume Comprehensive Treatise (H. J. R
ehm, G.Reed, A. Puhler, P. Stadler編), Vol.2, 627-659, VCH Weinheim-New
York- Basel-Cambridge）。

【００９６】Ｔｉプラスミドベクター系による、Agrobacterium tumefaciensを用いた双子
葉植物のトランスフォーメーションは十分に確立されているが、さらに最近にな
って、単子葉植物でも実際、agrobacterium−ベースのベクターによりトランス
フォーメーションを受け入れ可能なことが示唆されている（Chanら, Plant Mol.
Biol. 22 (1993), 491-506; Hieiら, Plant J. 6 (1994), 271-282）。

【００９７】単子葉植物のトランスフォーメーションの別法としては、バイオリスティクな
方法によるトランスフォーメーション、プロトプラストトランスフォーメーショ
ン、または物理的もしくは化学的に誘発したＤＮＡのプロトプラストへの取り込
み、たとえば、部分的に透過性にした細胞のエレクトロポレーション、ガラス繊
維によるＤＮＡのトランスファー、花序へのＤＮＡのマクロインジェクション、
小胞子または前胚へのＤＮＡのマイクロインジェクション、発芽した花粉による
ＤＮＡの取り込み、ならびに膨潤による胚へのＤＮＡの取り込みがある（総説：
Potrykus, Physiol. Plant (1990), 269-273）。上述のトランスフォーメーション系の３つは各種穀類で過去に確立している。
すなわち、組織のエレクトロポレーション、プロトプラストのトランスフォーメ
ーション、ならびに再生可能な組織および細胞への粒子ボンバードによるＤＮＡ
トランスファーである（総説：Jaehneら, Euphytica 85 (1995), 35-44）。

【００９８】小麦のトランスフォーメーションについては様々な方法が文献に記載されてい
る（総説：Maheshwariら, Critical Reviews in Plant Science 14(2) (1995),
149-178）。Hessら（Plant Sci. 72 (1990), 233）は花粉とagrobacteriimを著
しく接近させて置くマクロインジェクション法を使用した。選択マーカーとして
ｎｐｔ II遺伝子を含有するプラスミドの移動性を、サザンブロット分析ならび
にＮＰＴ II試験で検出した。トランスフォーマントは正常な表現型を示し、繁
殖能力が認められた。２代の連続世代でカナマイシン抵抗性が検出された。

【００９９】マイクロプロジェクタイルに結合したＤＮＡでボンバード後に再生した最初の
トランスジェニックの繁殖能力がある小麦植物は、Vasilら（Bio／Technology 1
0(1992), 667-674）によって報告された。ボンバードの標的組織は胚形成カルス
培養（Ｃ型カルス）であった。使用された選択マーカーは、ホスフィノスリシン
アセチルトランスフェラーゼをコードするｂａｒ遺伝子であり、したがって除草
剤ホスフィノスリシンに対する抵抗性を誘発する。その他のシステムは、Weeks
ら（Plant Physiol. 102 (1993), 1077-1084）、および Beckerら（Plant J. 5(
2)(1994), 299-307）により報告された。この場合のＤＮＡトランスフォーメー
ションの標的組織は、予めインビボ相で刺激して体胚を誘発させた未成熟胚の胚
盤である。Beckerら（上述）により開発されたシステムにおけるトランスフォー
メーション効率は、変種「Florida」の胚８３個あたり１トランスジェニック植
物であり、これは変種「Bohwhite」の胚１０００個あたり１〜２トランスジェニ
ック植物を生じたWeeksらの確立したシステムよりも著しく高かった。 Beckerら（上述）により開発されたシステムは、実施例に記載したトランスフ
ォーメーション実験の基礎を形成する。

【０１００】導入されたＤＮＡが植物細胞のゲノムにインテグレートされたならば、それは
一般にそこで安定であり、最初にトランスフォームされた細胞の子孫にも維持さ
れる。それは通常、上述の選択マーカーの１つを含有し、それはトランスフォー
ムされた植物細胞に除草剤たとえばホスフィノスリシンまたは抗生物質たとえば
カナマイシン、Ｇ418、ブレオマイシンもしくはハイグロマイシンに対する抵抗
性を誘発し、ある種の糖またはアミノ酸の存否による選択を可能にする。それぞ
れに選択されたマーカーは、したがって、導入したＤＮＡを欠く細胞中でトラン
スフォームされた細胞の選択を可能にしなければならない。

【０１０１】植物では、トランスフォームされた細胞は通常の様式で増殖する（McCormick
ら, Plant Cell Reports 5 (1986), 81-84）。生成した植物は正常に生育し、同
じ生殖質または他の生殖質を有する植物と雑種繁殖する。生じた雑種個体は相当
する表現型の性質を有する。植物細胞からは種子が得られる。表現型特性が安定
に維持され、継承されることを保証するには、２世代またはそれ以上を生育させ
なければならない。また問題の表現型または他の性質が維持されたことを保証す
るためには、種子を収穫しなければならない。

【０１０２】〔実施例〕以下の実施例は本発明の例示を意図するものであり、いかなる意味でも本発明
を限定をするものではない。１．クローニング方法大腸菌へのクローニングには、ベクターｐBluescript II SK（Stratagene）を
使用した。

【０１０３】２．細菌株大腸菌株ＤＨ５α（Bethesda Research Laboratories. Gaithersburg, USA）
をBluescriptベクターおよびアンチセンス構築体のために使用した。インビボ切
除には大腸菌株ＸＬ１−Blueを用いた。

【０１０４】３．未成熟小麦胚のトランスフォーメーションメジウムＭＳ：１００ml／Ｌ多量塩、１ml／Ｌ少量塩、２ml／Ｌ Fe／NaEDTA、３０ｇ
／Ｌスクロース（D. Becker & H.Loerz, Plant Tissue Culture Manual (1996),
B 12: 1-20）＃30：ＭＳ＋２,４−Ｄ(２mg／Ｌ) ＃31：ＭＳ＋２,４−Ｄ(２mg／Ｌ)＋ホスフィノスリシン(ＰＰＴ，除草剤ＢＡ
ＳＴＡの活性成分）(２mg／Ｌ) ＃32：ＭＳ＋２,４−Ｄ(０.１mg／Ｌ)＋ＰＰＴ(２mg／Ｌ) ＃39：ＭＳ＋２,４−Ｄ(２mg／Ｌ)＋各０.５Ｎマンニトール／ソルビトール記載のメジウムはＫＯＨを用いてｐＨ５.６とし、０.３％Gerliteを用いて固
化した。

【０１０５】未成熟小麦胚のトランスフォーメーションの方法は Becker & Loerz（D.Becke
r & H. Loerz, Plant Tissue Culture Manual (1996), B 12: 1-20）によって開
発され、至適化されたものである。以下に記載の実験では、Becker & Loerz（上述）によって開発された操作に従
った。トランスフォーメーションは、発生段階、開花後１２〜１４日の穀果を有する
穂を収穫し、表面滅菌した。単離された胚盤を誘発メジウム＃30上、胚軸をメジ
ウムの方向に向けてプレーティングした。２〜４日間の前培養（２６℃、暗所）後、外植片を浸透前培養（２〜４時間、
２６℃、暗所）のためにメジウム＃39に移した。バイオリスティックトランスフォーメーションのために、数μgの標的ＤＮＡ
を予め沈殿させた約２９μgの金粒子を１回のショットに使用した。実施した実
験はコトランスフォーメーションであるので、沈殿バッチに添加した標的ＤＮＡ
は標的遺伝子と抵抗性マーカー遺伝子（ｂａｒ遺伝子）１：１からなる。

【０１０６】４．ＤＮＡフラグメントのＤＩＧ標識スクリーニングプローブとして用いたＤＮＡフラグメントは特異的ＰＣＲによ
りＤＩＧ−標識ｄＵＴＰ（Boehringer Mannheim）を導入して標識した。

【０１０７】実施例に用いたメジウム溶液２０×ＳＳＣ：１７５.３ｇＮａＣl、８８.２ｇクエン酸ナトリウム、２回蒸
留水で全量１０００mlとし、１０ＮＮａＯＨでｐＨ７.０に調整する。

【０１０８】プラスミドｐＴａＳＳＩ８／１はブダペスト条約に明記されたように、ＤＳ
ＭＺ, Braunschweig, Federal Republic of Germanyに受託番号ＤＳＭ 12794号
として寄託された。

【０１０９】実施例１：可溶性小麦デンプンシンターゼ（ＳＳ II）（Triticum aestivum L.,
cv Florida）をコードするｃＤＮＡの同定、単離および特性解析可溶性小麦デンプンシンターゼ（ＳＳＩ）のアイソフォームをコードする完
全なｃＤＮＡを同定するため、不均一スクリーニング戦略に従った。この目的で
は小麦ｃＤＮＡライブラリーを適当なオリゴヌクレオチドでスクリーニングした
。スクリーニングに用いたＳＳＩ特異的なオリゴヌクレオチドは、５′ＲＡＣ
Ｅ法（Rapid Amplification of cDNA ends）を用いて以下に記載のように単離し
た。

【０１１０】小麦ｃＤＮＡライブラリーは、Lambda Zap IIベクター中ポリ(Ａ)＋約２０日
齢の穎果（内乳）のＲＮＡから、製造業者（Lambda Zap II−ｃＤＮＡ合成キッ
ト、Stratagene GmbH, Heidelberg, Germany）の説明書に従って合成した。ｃＤ
ＮＡライブラリーの力価の決定後、初期力価１.２６×１０⁶pfu／mlが測定され
た。

【０１１１】ｃＤＮＡライブラリーを小麦からのＳＳＩプローブによってスクリーニング
した。５′ＲＡＣＥを用い、ＤＮＡフラグメントを単離し、５′末端を Boehrin
ger（Mannheim, Germany）による５′ＲＡＣＥキット（以下「キット」という）
で増幅した。すべての工程は製造業者の説明書に従って実施した。とくに記載の
ない限り、キットからの試薬および酵素のみを使用した。

【０１１２】最初に、ポリ(Ａ)＋約２０日齢の穎果のＲＮＡを一本鎖ｃＤＮＡに転写し、テ
ーリング反応に用いた。５′領域にオリゴ(ｄＡ)anchor＃９（キット）とともに
与えられている得られたｃＤＮＡを、プライマーオリゴ(ｄＴ)＃８（キット）
およびＢ２Ｆ５とともに第一の反応において以下の改良されたプロトコールに従
い増幅した。すなわち、５０μlのバッチ、５μlのテーリングしたｃＤＮＡ、５
μlの１０×反応緩衝液（Life Technologies）、０.２５μＭのＢ２Ｆ５プライ
マー、０.７５μＭのオリゴ(dT)＃8、０.２mMのｄＮＴＰ、および５ＵのＴａｑ
ポリメラーゼ（組換え、Life Technologies）を用いた。ＰＣＲプロファイルは
、９４℃３分／９４℃４５秒／５６℃１分／７２℃１分３０秒、２９サイクル／
７２℃５分とした。

【０１１３】ついで、プライマーオリゴ(ｄＴ)＃８（キット）、Ｂ２Ｆ５および５′に位
置するＢ２Ｆ６により、さらにＰＣＲを実施した。５０μlのバッチ、１μlのＰ
ＣＲ産物、５μlの１０×反応緩衝液（Life Technologies）、０.２５μＭのＢ
２Ｆ５プライマー、０.２５μＭのＢ２Ｆ６プライマー、０.７５μＭのオリゴ(
ｄＴ)＃８、０.２mMのｄＮＴＰ、および５ＵのＴａｑポリメラーゼ（組換え、Li
fe Technologies）を用いた。ＰＣＲプロファイルは９４℃３分／９４℃４５秒
／６０℃１分／７２℃１分３０秒、２９サイクル／７２℃５分とした。Ｂ２Ｆ５：５′ＣＣＴＣＣＣＡＡＴＴＣＡＡＧＧＡＴＴＡＧＴＧ−３′（配列
番号３）Ｂ２Ｆ６：５′ＣＣＴＣＧＣＡＴＧＣＡＧＣＡＴＡＧＣＡＡ−３′（配列番号
４）

【０１１４】上記方法により得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル中で分離し、８００bpを
越えるサイズを有するＤＮＡフラグメントを単離した。ＰＣＲフラグメントは、
ＰＣＲ−Script SK（＋）クローニングキット（Stratagene, Heidelberg）を用
いてクローン化した。クローン化されたサブフラグメントの配列分析により、ま
だ未知の約１５０bpのＳＳＩクローンの配列の同定が可能になった。

【０１１５】この新規な配列の５′領域から、オリゴヌクレオチドＢ２Ｒ００およびＢ２Ｆ
６.２を選択し、ＤＮＡフラグメント（ＳＳＩプローブ）を増幅し、これをつい
で記載したようにジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰで標識し、小麦ｃＤＮＡライ
ブラリーのスクリーニングのためのプローブとして使用した。ＳＳＩプローブ
はＰＣＲ反応により、“The DIG System User's Guide for Filter Hybridisati
on"（BoehringerMannheim）における指示に従って、プライマーＢ２Ｒ２００お
よびＢ２Ｆ６.２により標識した。Ｂ２Ｒ００：５′ＴＧＴＧＧＣＴＧＣＡＡＧＴＧＡＧＧＡＧＧ−３′（配列番
号５）Ｂ２Ｆ６.２：５′ＣＣＡＧＴＣＡＣＡＡＡＣＡＣＧＴＡＧＣＴＡＣＧ−３′
（配列番号６）

【０１１６】小麦ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするため約７０００００のファ
ージをプレーティングした。ファージをプレーティングし、標準プロトコールに
従いプレートをブロットした。フィルターを５×ＳＳＣ、３％Blocking（Boehri
nger Mannheim）、０.２％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０.１％ラウリ
ルザルコシンナトリウムおよび５０μg／mlのニシン精子ＤＮＡ中、６５℃でプ
レハイブリダイズし、ハイブリダイズした。１.３ng／mlのＤＩＧ−標識ＳＳＩ
プローブをハイブリダイゼーション溶液に加え、これを一夜インキュベートした
。フィルターをプロトコール“The DIG System User's Guide for Filter Hybri
disation”(Boehringer Mannheim）に記載されたように６５℃で洗浄した。陽性
のクローンをさらに２回のスクリーニングサイクルによって選び出した。単一ク
ローンはインビボ切断によりｐBluescript SK ファージミドとして得られた（操
作は製造業者の説明書に従った；Statagene, Heidelberg）。クローンをミニプレップにより解析し、プラスミドＤＮＡを制限したのち、ク
ローンＴａＳＳＩ８／１をさらに分析した。

【０１１７】実施例２：プラスミドｐＴａＳＳＩ８／１のｃＤＮＡ挿入体の配列分析プラスミドＤＮＡをクローンＴaＳＳＩ８／１から単離し、ｃＤＮＡ挿入体
の配列をジデオキシヌクレオチド法（Sangerら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 7
4 (1977), 5463-5467）によって決定した。クローンＴａＳＳＩ８／１の挿入
体は長さ２８０５bpであり完全なｃＤＮＡを構成する。ヌクレオチド配列は配列
番号１に示す。相当するアミノ酸配列は配列番号２に示す。既に公表されている
配列と比較して、配列番号１に示す配列は新規であり、完全なコード領域からな
ることが明らかにされた。

【０１１８】実施例３：植物トランスフォーメーションベクターｐＴａ−γ−ＳＳＩ−８／
１の発生実施例１で単離されたｃＤＮＡを発現させるために、植物トランスフォーメー
ションベクターｐＴａ−γ−ＳＳＩ−８／１を、基本プラスミドとしてｐＵＣ1
9を用いて構築した。ベクターの構築には、プラスミドｐＴａＳＳＩ８／１の
ｃＤＮＡ挿入体を完全にセンス方向にユビキチンプロモーターの３′末端に連結
する。このプロモーターはトウモロコシのユビキタン１遺伝子の第一非翻訳エキ
ソンおよび第一イントロンから構成される（Christensen A.H.ら, Plant Molecu
lar Biology 18(1992), 675-689）。ポリリンカーの部分ならびにＮＯＳターミ
ネーターはプラスミドｐＡＣＴ1.cas（CAMBIA, TG 0063；Cambia, GPO Box 3200
, Canberra ACT 2601, Australia）に由来する。ベクター構築体は、このターミ
ネーターならびにｐＡＣＴ1.casに基づいた構築体とともにMcElroyら（Molecula
r Breeding 1(1995), 27-37）により記載されている。得られたベクターはｐＵ
ｂｉ.casと命名された。

【０１１９】発現ベクターは、クローンＴａＳＳＩ８／１から制限酵素ＸｂａＩおよび
ＳｓｐＩでフラグメントを制限することによってクローン化した。フラグメン
トの末端はクレノウ反応によって充填し、フラグメントをついで発現ベクターｐ
Ｕbi.cas のＳｍａＩクローニング部位にライゲートした。得られた発現ベクタ
ーをｐＴＡ−γ−ＳＳＩ８／１と命名した。第二の構築体では、クローンＴａ
ＳＳＩ８／１の５′−非翻訳リーダーを最初にエキソヌクレアーゼ処理によっ
て除去した。それをついで発現ベクターｐＵbi.casにクローン化した。この構築
体をＴａ−γ−ＳＳＩ８／１−２と命名した。ベクターｐＴＡ−γ−ＳＳＩ８／１およびｐＴａ−γ−ＳＳＩ８／１−２
はついで小麦のトランスフォーメーションに使用する。

【０１２０】

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｃ４Ｃ０９０ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＤ，ＧＥ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ (72)発明者マルティーナ・ブロックドイツ連邦共和国デー−53111ボン．ゲオルクシュトラーセ40 Ｆターム(参考） 2B030 AD08 CA15 CA17 CA19 4B024 AA08 BA80 CA04 EA04 GA11 4B050 CC01 CC03 DD13 LL10 4B063 QA01 QA13 QA18 QQ04 QQ42 QQ53 QR55 QR62 QS25 QS34 4B065 AA88X AA88Y AA89X AB01 AC14 BA02 CA22 CA27 CA53 4C090 AA03 AA08 BA13 BC13 DA10 DA27 DA31

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】 (ａ) 配列番号２に示すアミノ酸配列からなるタンパク質を
コードする核酸分子、 (ｂ) 配列番号１に示すヌクレオチド配列もしくはその部分からなる核酸分子
、またはそれらに相当するリボヌクレオチド配列、 (ｃ) （ａ）もしくは（ｂ）に記載の核酸分子の一つとハイブリダイズする核
酸分子またはそれらと相補性の核酸分子、および (ｄ) ヌクレオチド配列が（ａ）、（ｂ）または（ｃ）に記載の核酸分子の配
列から遺伝子コードの縮重により変異している核酸分子からなる群より選択される、小麦デンプンシンターゼの機能を有するタンパク質
をコードする核酸分子。
【請求項２】ＤＮＡ分子である請求項１記載の核酸分子。
【請求項３】ｃＤＮＡ分子である請求項２記載のＤＮＡ分子。
【請求項４】調節要素を含有する請求項１〜３の一つまたはそれ以上に記
載の核酸分子。
【請求項５】ＲＮＡ分子である請求項１記載の核酸分子。
【請求項６】請求項１〜５のいずれかに記載の核酸分子と特異的にハイブ
リダイズする核酸分子。
【請求項７】長さが少なくとも１５ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドで
ある請求項６記載の核酸分子。
【請求項８】請求項１〜５のいずれかに記載のＤＮＡ分子を含有するベク
ター。
【請求項９】上記核酸分子が、原核細胞または真核細胞において翻訳可能
なＲＮＡの転写および合成を確実にする調節要素にセンス方向に連結している請
求項８記載のベクター。
【請求項１０】上記核酸分子が、原核細胞または真核細胞において翻訳不
能なＲＮＡの合成を確実にする調節要素にセンス方向に連結している請求項８記
載のベクター。
【請求項１１】上記核酸分子が、原核細胞または真核細胞において翻訳不
能なＲＮＡの合成を確実にする調節要素にアンチセンス方向に連結している請求
項８記載のベクター。
【請求項１２】請求項１〜５のいずれかに記載の核酸分子または請求項８
〜１１のいずれかに記載のベクターによってトランスフォームされた宿主細胞ま
たはそのような細胞から誘導された宿主細胞。
【請求項１３】請求項１〜４のいずれかに記載の核酸分子によってコード
されたタンパク質。
【請求項１４】請求項１３に記載のタンパク質を製造する方法において、
請求項１２記載の宿主細胞を上記タンパク質が合成される条件下に培養し、そし
て上記タンパク質を培養細胞および／または培地から単離する方法。
【請求項１５】ａ）請求項１〜５のいずれかに記載の核酸分子、またはｂ
）請求項８〜１１のいずれかに記載のベクターを植物細胞のゲノムにインテグレ
ートするトランスジェニック植物細胞を作製する方法。
【請求項１６】請求項１〜５のいずれかに記載の核酸分子または請求項８
〜１１のいずれかに記載のベクターによってトランスフォームされたトランスジ
ェニック植物細胞またはそのような細胞から誘導されたトランスジェニック植物
細胞。
【請求項１７】ａ１) 請求項１〜５のいずれかに記載の核酸分子または、
ａ２) 請求項８〜１１のいずれかに記載のベクターを、植物細胞のゲノムにイン
テグレートし、そしてｂ) その植物細胞から完全な植物を再生させる、トランス
ジェニック植物細胞を作製する方法。
【請求項１８】請求項１６記載の植物細胞を含有する植物。
【請求項１９】単子葉植物または双子葉植物である請求項１８記載の植物
。
【請求項２０】有用な植物である請求項１９記載の植物。
【請求項２１】デンプン貯蔵植物である請求項２０記載の植物。
【請求項２２】トウモロコシ、コメ、馬鈴薯または小麦植物である請求項
２１記載の植物。
【請求項２３】請求項１８〜２２のいずれかに記載の植物の増殖物。
【請求項２４】請求項１６記載の植物細胞、請求項１８〜２２のいずれか
に記載の植物または請求項２３記載の増殖物から得られるデンプン。
【請求項２５】食品または食品前駆体、好ましくは焼いた製品またはパス
タの製造のための請求項２４記載のデンプンの使用。
【請求項２６】パッケージング材料または使い捨て製品の製造のための請
求項２４記載のデンプンの使用。