SK15772000A3 - Molekuly nukleových kyselín kódujúce enzýmy z pšenice, ktoré sa podieľajú na syntéze škrobu - Google Patents

Molekuly nukleových kyselín kódujúce enzýmy z pšenice, ktoré sa podieľajú na syntéze škrobu Download PDF

Info

Publication number
SK15772000A3
SK15772000A3 SK1577-2000A SK15772000A SK15772000A3 SK 15772000 A3 SK15772000 A3 SK 15772000A3 SK 15772000 A SK15772000 A SK 15772000A SK 15772000 A3 SK15772000 A3 SK 15772000A3
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
nucleic acid
starch
plant
acid molecule
synthesis
Prior art date
Application number
SK1577-2000A
Other languages
English (en)
Inventor
Horst L�Rz
Stephanie L�Tticke
Martina Block
Original Assignee
Aventis Cropscience Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Aventis Cropscience Gmbh filed Critical Aventis Cropscience Gmbh
Publication of SK15772000A3 publication Critical patent/SK15772000A3/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A21—BAKING; EDIBLE DOUGHS
    • A21D—TREATMENT, e.g. PRESERVATION, OF FLOUR OR DOUGH, e.g. BY ADDITION OF MATERIALS; BAKING; BAKERY PRODUCTS; PRESERVATION THEREOF
    • A21D2/00—Treatment of flour or dough by adding materials thereto before or during baking
    • A21D2/08—Treatment of flour or dough by adding materials thereto before or during baking by adding organic substances
    • A21D2/14—Organic oxygen compounds
    • A21D2/18—Carbohydrates
    • A21D2/186—Starches; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L29/00—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof
    • A23L29/20—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof containing gelling or thickening agents
    • A23L29/206—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof containing gelling or thickening agents of vegetable origin
    • A23L29/212—Starch; Modified starch; Starch derivatives, e.g. esters or ethers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8243—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine
    • C12N15/8245—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits involving biosynthetic or metabolic pathways, i.e. metabolic engineering, e.g. nicotine, caffeine involving modified carbohydrate or sugar alcohol metabolism, e.g. starch biosynthesis

Description

MOLEKULY NUKLEOVÝCH KYSELÍN KÓDUJÚCE ENZÝMY Z PŠENICE, KTORÉ SA PODIEĽAJÚ NA SYNTÉZE ŠKROBU
Oblasť techniky
Tento vynález sa týka molekúl nukleových kyselín, kódujúcich enzým z pšenice, ktorý sa podieľa na syntéze škrobu v rastlinách. Týmto enzýmom je rozpustná škrobová syntáza, typ I.
Ďalej sa tento vynález týka vektorov, hostiteľských buniek a rovnako rastlinných buniek a rastlín, ktoré obsahujú molekuly nukleových kyselín podľa tohto vynálezu.
Ďalej je opísaný postup na získavanie transgénnych rastlín, ktoré po zavedení molekúl nukleových kyselín podľa tohto vynálezu syntetizujú škrob s jednou alebo viac pozmenenými vlastnosťami.
Doterajší stav techniky
V poslednej dobe neustále stúpa význam rastlinných zložiek ako obnoviteľných zdrojov surovín, a preto je jedna z úloh biotechnologického výskumu usilovať o prispôsobenie týchto rastlinných surovín požiadavkám spracovateľského priemyslu. Aby bola oblasť použiteľnosti týchto obnoviteľných surovín čo najširšia, je nevyhnutné okrem toho dosiahnuť ich maximálnu rozmanitosť.
Polysacharidy predstavujú okrem olejov, tukov a proteínov dôležitú obnoviteľnú rastlinnú surovinu. Najdôležitejšie postavenie medzi polysacharidmi zaujíma okrem celulózy škrob, ktorý je jeden z najdôležitejších zásobných látok vo vyšších rastlinách. Jednou z najdôležitejších kultúrnych rastlín je pšenica, z ktorej sa získava 20 % z celkovej výroby škrobu v európskom spoločenstve.
Polysacharid škrob je polymérom skladajúcim sa z chemicky jednotných
31574 T ·· ·· ·· ·· ·· • · · · ···· ··· 9 9 9 9 9 9 9 9
9 9 9 9 9 9 9
9999 99 9999 99 9 základných jednotiek, a to z molekúl glukózy. Pritom ide o veľmi zložitú zmes rôznych molekulárnych foriem, ktoré sa líšia svojim polymerizačným stupňom, vetvením glukózových reťazcov a ich dĺžkou, a ktorú je okrem toho možné derivátizovať, napríklad fosforylovať. To teda znamená, že škrob nepredstavuje jednotnú surovinu. Amylóza, ktorá je tvorená v podstate nerozvetveným polymérom skladajúcim sa z 1,4-glykozidicky viazaných molekúl glukózy, sa odlišuje od amylopektínu, ktorý je tvorený komplexnou zmesou rôzne rozvetvených glukózových reťazcov. Na tomto rozvetvení sa podieľajú i 1,6glykozidické väzby. Škrob syntetizovaný v pšenici obsahuje cca 11 až 37 % amylózy.
Aby bolo možné zaistiť pokiaľ možno mnohostrannú použiteľnosť vhodných škrobov pre najrôznejšie priemyselné účely, je potrebné mať k dispozícii také rastliny, ktoré sú schopné syntetizovať modifikované škroby, ktoré by boli obzvlášť vhodné na rôzne účely použitia. Jedna z možností na získavanie takýchto rastlín sú šľachtiteľské opatrenia. Šľachtiteľské opatrenia sa však vzhľadom na polyploidný charakter pšenice (tetra- a hexyploid) uplatňujú veľmi ťažko. Iba nedávno sa podarilo krížením prírodných mutantov pšenice získať voskovitú ”waxy“ pšenicu, ktorá neobsahuje amylózu (Nakamura a spol., Mol. Gen. Genet. 248 (1995), 253-259).
Alternatívou k šľachtiteľským opatreniam je cielená génovotechnologická modifikácia rastlín produkujúcich škrob. Predpokladom na to však je identifikácia a charakterizácia enzýmov, ktoré sa podieľajú na syntéze alebo na modifikácii škrobu a rovnako izolácia molekúl nukleových kyselín, ktoré tieto enzýmy kódujú.
Cesty biochemickej syntézy vedúce k výstavbe škrobu sú v podstate známe. Syntéza škrobu v rastlinných bunkách prebieha v plastidoch. Vo fotosynteticky aktívnych tkanivách sú to chloroplasty, vo fotosynteticky inaktívnych škrobových zásobných tkanivách to sú amyloplasty.
Dôležitými enzýmami, podieľajúcimi sa na syntéze škrobu, sú škrobové syntézy a rozvetvujúce enzýmy. Pri škrobovej syntéze boli opísané rôzne
31574 T ·· ·· ·· ·· ·· • · · » · · · · · · ·
I · · · · · · · ··· ··· · · ·· ···· ·· ···· ·· · izoformy, ktoré katalyzujú všetky polymerizačné reakcie prenosom glukózového zvyšku zADP-glukózy na a-1,4-glukán. Rozvetvujúce enzýmy katalyzujú zavedenie a-2,6-rozvetvenia do lineárneho a-1,4-glukánu.
Škrobové syntézy je možné rozdeliť do dvoch tried: škrobové syntézy viazané na škrobové zrno (“granule-bound starch synthases“ ; GBSS) a rozpustné škrobové syntézy (soluble starch synthases“; SSS). Toto rozdelenie nie je vždy jednoznačné, pretože niektoré škrobové syntézy sa vyskytujú tak vo forme viazanej na škrobové zrná, ako i v rozpustnej forme (Denyer a spol., Plánt J. 4 (1993), 191 - 198; Mu a spol. Plánt J. 6 (1994), 151 - 159). Pri rôznych rastlinných druhoch sú v rámci týchto tried opísané rôzne izoformy, ktoré sa líšia svojou závislosťou na molekule štartéra (škrobové syntézy tzv. “primér dependent“ (Typll) a “primér independent“ (Typ I)).
Presnú funkciu pri syntéze škrobu sa doposiaľ podarilo určiť iba u izoformy GBSS I, u ktorých je enzýmová aktivita silne alebo úplne potlačená, pri syntéze bezamylózového (tzv waxy“) škrobu (Shure a spol., Celí 35 (1983), 225 - 233; Visser a spol., Mol. Gen. Genet. 225 (1991), 289 - 296; WO 92/11376), to znamená, že tento enzým má zrejme rozhodujúcu úlohu pri syntéze amylózy. Tento jav bol pozorovaný i u buniek zelenej rasy Chlamydomonas reinhardtii (Delrue a spol., J. Bacteriol. 174 (1992), 3612 3620). U Chlamydomonas bolo ďalej dokázané, že GBSS I sa nepodieľa iba na syntéze amylózy, ale že má vplyv i na syntézu amylopektínu. U mutantov, ktoré nevykazovali žiadnu GBSS I- aktivitu chýba určitá frakcia, inak normálne syntetizovaného amylopektínu, obsahujúca glukány s dlhším reťazcom.
Funkcie iných izoforiem syntáz, viazaných na škrobové zrno, najmä GBSS II, a rozpustných škrobových syntáz, nie je dosiaľ celkom jasná. Predpokladá sa, že rozpustné škrobové syntázy spolu s rozvetvujúcimi enzýmami sa podieľajú na syntéze amylopektínu (pozri napr. Ponstein a spol., Plánt Physiol. 29 (1990), 234 - 241) a že majú dôležitú funkciu pri regulácii rýchlosti syntézy škrobu.
V pšenici boli na proteínovej úrovni identifikované minimálne dve
31574 T a· ·· ·· ·· ·· ···· · · · · ··· ··· a · · a a · a· ···· ·· ···· ·· ··· izoformy škrobovej syntézy, viazané na škrobové zrno (60 kDA a 100 - 105 kDA), a jedna ďalšia izoforma, ktorá zrejme predstavuje rozpustnú škrobovú syntázu (Denyer a spol., Planta 196 (1995), 256 - 265; Rahman a spol., Aust.
J. Plánt Physiol. 22 (1995), 793 - 803). Existencia niekoľkých SSS- izoforiem bola dokázaná pomocou chromatografických metód už skôr (Rijven, Plánt Physiol, 81 (1986), 448 - 453). Bola už opísaná i jedna pšeničná GBSS I, kódujúca cDNA (Ainsworth a spol., Plánt Mol. Biol. 22 (1993), 67- 82).
Sekvencia nukleových kyselín, kódujúcich izoformy pšeničnej škrobovej syntázy, resp. dielčie sekvencie týchto nukleových kyselín sú opísané vo WO 97/45545.
Sekvencie cDNA, kódujúce iné škrobové syntázy ako je GBSS I, boli doteraz opísané iba pri hrachu (Dry a spol., Plánt J. 2 (1992), 193 - 202), ryži (Baba a spol., Plánt Physiol. 103 (1993), 565 - 573) a zemiakoch (Edwards a spol., Plánt J. 8 (1995), 283 - 294). Rozpustné škrobové syntázy boli okrem pšenice identifikované i v rade ďalších rastlinných druhov. Rozpustné škrobové syntázy boli izolované až do formy homegénneho preparátu napr. z hrachu (Denyer a Smith, Planta 186 (1992), 609 - 617) a zemiakov (Edward a spo.,
Plánt J. 8(1995), 283-294).
Ukázalo sa, že izoforma, ktorá bola v týchto prácach označená ako SSS III, bola identická so škrobovou syntézou, viazanou na škrobové zrná GBSS II (Denyer a spol., Plánt J. 4 (1993), 191 - 198; Edwards a spol., Plánt J. 8 (1995), 283-294).
Pri niektorých ďalších rastlinných druhoch bola prítomnosť niekoľkých SSS-izoforiem dokázaná pomocou chromatografických metód, ako napr. pri jačmeni (Tyynelä a Schulman, Physiologica Plantarum 89 (1993) 835 - 841;
Kreis, Planta 148 (1980), 412 - 416). DNA- sekvencie kódujúce tieto proteíny však dosiaľ neboli opísané.
Na získanie ďalších možností na uskutočňovanie zmien akýchkoľvek škrobnatých rastlín, prednostne obilia, a najmä pšenice tak, aby tieto rastliny syntetizovali modifikovaný škrob, je potrebné identifikovať príslušné DNA31574 T ·· ·· • · 9 4» • β · · · ·· ···· · · 9
9 9 9
9 ·
9 9
9999
9
9 99
9 9
9 9
99 9 sekvencie, ktoré kódujú ďalšie izoformy škrobových syntéz.
Cieľom tohto predkladaného vynálezu bola príprava molekúl nukleových kyselín, najmä nukleových kyselín z pšenice, ktoré kódujú enzýmy, podieľajúce sa na biosyntéze škrobu a ich pomocou získavať génovo-technicky modifikované rastliny, ktoré umožnia výrobu rastlinných škrobov so zmenenými chemickými a/alebo fyzikálnymi vlastnosťami.
Podstata vynálezu
Tento vynález sa teda týka molekúl nukleových kyselín, kódujúcich proteíny s aktivitou rozpustnej škrobovej syntázy z pšenice, pričom tieto molekuly kódujú predovšetkým proteíny, obsahujúce aminokyselinovú sekvenciu uvedenú pod Seq ID No.2. Tento vynález sa najmä týka molekúl nukleových kyselín, ktoré obsahujú nukleotidovú sekvenciu uvedenú pod Seq ID No.1 alebo jej časť, výhodne molekuly obsiahnuté v kódujúcom regióne uvedenom v Seq ID No.1, obzvlášť výhodne nukleotid č. 9 až 530 zo Seq ID No.1 a rovnako príslušné ribonukleotidové sekvencie.
Ďalej sa tento vynález týka molekúl nukleových kyselín hybridizovaných s jednou z molekúl nukleových kyselín podľa tohto vynálezu.
Predmetom tohto vynálezu sú rovnako molekuly nukleových kyselín, ktoré kódujú rozpustnú škrobovú syntázu z pšenice a ich sekvencie, ktoré sa od nukleotidových sekvencií skôr opísaných molekúl líšia degeneráciou genetického kódu.
Tento vynález sa týka rovnako molekúl nukleových kyselín, obsahujúcich sekvenciu, ktorá je komplementárna k celým vyššie uvedeným sekvenciám alebo ich častiam.
Pojem hybridizácia znamená v rámci tohto vynálezu hybridizáciu za konvenčných hybridizačných podmienok, výhodne za prísne definovaných podmienok, opísaných napríklad v publikácii Sambrook a spol., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. vyd. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory
31574 T * · ·· ···· ····
Press, Cold Spring Harbor, NY).
Obzvlášť výhodne sa hybridizácia“ uskutočňuje za nasledujúcich podmienok:
Hybridizačný pufor: 2 x SSC; 10 x roztok Denhardt (Fikoll 400 + PEG + BSA;
pomer 1 :1 : 1); 0,1 % SDS; 5 mM EDTA; 50 mM Na2HPO4; 250 μg/ml DNA sledie spermie (Heringssperma-DNA); 50 pg/ml tRNA; alebo 0,25 M nátriumfosfátový pufor pH 7,2;
mM EDTA; 7 % SDS
Hybridizačná teplota: T = 65 až 70 ° C Premývací pufor: 0,2 x SSC; 0,1 % SDS Premývacia teplota: T = 40 až 75 °C.
Molekuly nukleových kyselín hybridizované s molekulami nukleových kyselín podľa tohto vynálezu môžu principiálne kódovať škrobové syntázy z akejkoľvek rastliny pšenice, ktorá tieto proteíny exprimuje.
Molekuly nukleových kyselín, hybridizované s molekulami nukleových kyselín podľa tohto vynálezu, môžu byť napríklad izolované zgénomických pšeníc alebo pšeničných tkanív alebo z cDNA-knihovní pšeníc alebo pšeničných tkanív. Alternatívne môžu byť pripravené génovo-technickými metódami alebo chemickou syntézou.
Identifikáciu a izoláciu týchto molekúl nukleových kyselín je možné uskutočňovať s použitím molekúl podľa tohto vynálezu alebo časti týchto molekúl respektíve s použitím reverzných komplementov týchto molekúl, napríklad pomocou hybridizácie podľa štandardného postupu (pozri napríklad Sambrook a spol., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. vyd. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).
Ako vzorku pre hybridizáciu je možné napríklad použiť molekuly nukleových kyselín, obsahujúce presne rovnaké alebo v podstate rovnaké nukleotidové sekvencie alebo ich časti, uvedené pod Seq ID No.1. Pri týchto
31574 T ·· · ·· ·· • Ο ··· · 9 · • · ···· ···· • · · · · · · · ·· ···· ·· ···· ·· · fragmentoch, použitých ako vzorka pre hybridizáciu, môže ísť i o syntetické fragmenty pripravené pomocou bežných syntetických techník, ktorých sekvencia v podstate zodpovedá molekulám nukleových kyselín podľa tohto vynálezu.
Molekuly, hybridizované s molekulami nukleových kyselín podľa tohto vynálezu, zahrňujú i fragmenty, deriváty a alelické varianty vyššie uvedených molekúl nukleových kyselín, ktoré kódujú pšeničné škrobové syntázy podľa tohto vynálezu. Fragmentárni sa pritom rozumejú časti molekúl nukleových kyselín, ktoré sú dostatočne dlhé na to, aby boli schopné kódovať uvedené proteíny. Výraz derivát“ v tejto súvislosti znamená, že sekvencia tejto molekuly sa od sekvencií vyššie uvedených molekúl nukleových kyselín líšia na jednom alebo niekoľkých miestach a že vykazujú vysoký stupeň homológie s týmito sekvenciami. Homológia znamená identitu sekvencie minimálne 40 %, najmä identitu minimálne 60 %, prednostne 80 % a obzvlášť výhodne 90 %. Odchýlky od skôr opísaných molekúl nukleových kyselín môžu vznikať vyštiepením, substitúciou, inzerciou alebo rekombináciou.
Homológia ďalej znamená, že existuje funkčná a/alebo štruktúrna ekvivalencia medzi príslušnými molekulami nukleových kyselín alebo nimi kódovanými proteínmi. Pri molekulách nukleových kyselín, ktoré sú homologické s vyššie uvedenými molekulami a predstavujú deriváty týchto molekúl, ide spravidla o variácie týchto molekúl, ktoré predstavujú modifikácie s rovnakými biologickými funkciami. Pritom môže ísť tak o prirodzene sa vyskytujúce variácie, napríklad o sekvencie z iných organizmov, ako aj o mutanty, pričom tieto mutanty môžu mať prirodzený výskyt alebo môžu byť zavádzané cielenou mutagenézou. Ďalej ide o variácie synteticky pripravených sekvencií. Pri alelických variantoch môže ísť ako o varianty s prirodzeným výskytom, tak i o varianty pripravené synteticky alebo získané rekombinantnou DNA-technikou.
Proteíny, kódované rôznymi variantmi molekúl nukleových kyselín podľa tohto vynálezu, vykazujú určité spoločné vlastnosti. K nim patria napríklad
31574 T ·· ·· ·· · ·· ···· · · · · · · • · · · · · · · ··· · · ·· ·· ···· ·· ···· ·· · enzýmová aktivita, molekulová hmotnosť, imunologická reaktivita, konformácia a podobne a rovnako fyzikálne vlastnosti, ako je napríklad pohyblivosť pri gólovej elektroforéze, chovanie pri chromatografii, sedimentačné koeficienty, rozpustnosť, spektroskopické vlastnosti, elektrický náboj, stabilita; pH-optimum, teplotné optimum a podobne.
Dôležité vlastnosti škrobovej syntázy sú ;
i) jej lokalizácia v strome plastidov rastlinných buniek;
ii) jej schopnosť syntetizovať lineárny a-1,4-viazaný polyglukán.
Túto aktivitu je možné stanoviť spôsobom ktorý uvádzajú Denyer a Smith (Plante 186 (1992), 606 - 617). Pritom proteínom kódovaným molekulami nukleových kyselín je rozpustná škrobová syntáza typ I zo pšenice. Tieto proteíny vykazujú určité homologické oblasti s dosiaľ známymi rozpustnými škrobovými syntázami z iných rastlinných druhov.
Molekulami nukleových kyselín podľa tohto vynálezu môžu byť DNAmolekuly, najmä cDNA alebo génomické molekuly. Ďalej môžu byť nukleovými kyselinami podľa tohto vynálezu RNA-molekuly, ktoré môžu vzniknúť napríklad transkripciou niektorej molekuly nukleových kyselín podľa tohto vynálezu. Nukleové kyseliny podľa tohto vynálezu môžu byť napríklad získavané z prírodných zdrojov alebo technikou rekombinácie či synteticky.
Predmetom tohto vynálezu sú i oligonukleotidy špecificky hybridizované s niektorou molekulou nukleových kyselín podľa tohto vynálezu. Takéto oligonukleotidy majú výhodne dĺžku minimálne 10, obzvlášť minimálne 15 a obzvlášť výhodne minimálne 50 nukleotidov. Oligonukleotidy podľa tohto vynálezu sa vyznačujú tým, že sa hybridizujú špecificky s molekulami nukleových kyselín podľa tohto vynálezu, tzn., že sa sekvenciami nukleových kyselín, ktoré kódujú iné proteíny, najmä iné škrobové syntázy, nepodliehajú hybridizácii alebo sa hybridizujú iba v nepatrnom rozsahu. Oligonukleotidy podľa tohto vynálezu môžu byť použité napríklad ako primér pre PCR -reakciu alebo ako hybridizačná vzorka pre izoláciu príbuzných génov. Môžu tvoriť i
31574 T ·· ·· ·· ·· ·· ···· ···· ··· • · · · · · · · ··· · · · · · ·· ···· ·· ···· ·· · súčasť antisense-konštruktov alebo molekúl DNA, kódujúcich vhodné ribozýmy.
Tento vynález dalej zahrňuje vektory, najmä plazmidy, kozmidy, fagemidy, víurusy, bakteriofágy a iné vektory, bežné v génovej technike, ktoré v sebe obsahujú vyššie uvedené molekuly nukleových kyselín podľa tohto vynálezu. Tieto vektory sú vhodné na transformáciu prokaryontických alebo eukaryontických, prednostne rastlinných buniek.
Obzvlášť výhodné sú vektory, umožňujúce integráciu molekúl nukleových kyselín podľa tohto vynálezu do genómu rastlinnej bunky, prípadne s spolu s tieniacimi regulačnými oblasťami. Ako príklady je možné uviesť binárne vektory, ktoré je možné použiť pri transfere génov sprostredkovanom agrobaktériami. Výhodná je syntéza prenositeľných alebo prípadne neprenositeľných molekúl nukleových kyselín podľa tohto vynálezu v transformovaných pre- alebo eukaryontických bunkách integráciou molekuly nukleových kyselín v sense- alebo anti-sense-orientácii.
Pojem vektor“ označuje všeobecne vhodný, odborníkom známy pomocný prostriedok, umožňujúci cielený transfer jednej jedno- alebo dvojreťazcovej molekuly nukleových kyselín do hostiteľskej bunky, ktorou môže byť napríklad DNA- alebo RNA- vírus, fragment vírusu, plazmidový konštrukt ktorý za prítomnosti alebo neprítomnosti regulačných prvkov môže byť vhodný pre transfer nukleových kyselín do buniek, nosné materiály ako sú sklenené vlákna alebo i častice kovov, požívané napríklad pri postupe particle gun“, môže však ísť i o molekulu nukleových kyselín, ktorú je možné vložiť priamo do bunky vhodným chemickým alebo fyzikálnym postupom.
Pri výhodnom spôsobe uskutočnenia sú molekuly nukleových kyselín, obsiahnuté vo vektoroch, viazané s regulačnými prvkami, ktoré umožňujú transkripciu a syntézu prenositeľnej RNA do pre- alebo eukaryontických buniek alebo - pokiaľ je to žiadúce - ktoré umožňujú syntézu neprenositeľnej RNA.
Expresia molekúl nukleových kyselín podľa tohto vynálezu v prokaryontických bunkách, napríklad v Escherichia coli, má význam na presnejšiu charakterizáciu enzymatickej aktivity enzýmov, ktoré kódujú tieto
31574 T ·· ·· ·· ·· ·· ···· · · · · ··· • · · · · · · · • · · β · · · · ·· ···· ·· ···· ·· · molekuly. Obzvlášť je možné charakterizovať produkt, syntetizovaný príslušnými ezýmami, za neprítomnosti iných enzýmov, podieľajúcich sa na syntéze škrobu v rastlinných bunkách. To umožňuje vyvodzovať závery o funkcii príslušného proteínu pri syntéze škrobu v rastlinných bunkách.
Okrem toho je možné pomocou bežných postupov molekulárnej biológie (pozri napríklad Sambrook a spol., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. vyd. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) zavádzať rôzne mutácie do molekúl nukleových kyselín podľa tohto vynálezu, pričom sa pri tejto syntéze získajú proteíny s prípadne premenenými biologickými vlastnosťami. To umožňuje prípravu delečných mutantov, v ktorých postupným vyštepovaním z 5'- alebo 3'- konca je možné získať kódujúcu DNA-sekvenciu molekúl nukleových kyselín, ktoré vedú k syntéze príslušných skrátených proteínov. Táto delécia na 5'-konci nukleotidovej sekvencie umožňuje napríklad identifikovať aminokyselinové sekvencie, ktoré spôsobujú translokáciu enzýmov vplaztidoch (transitpeptidy). To umožňuje cielenú prípravu enzýmov, ktoré po odstránení príslušných sekvencii už nie sú lokalizované v plastidoch, ale v cytosole, alebo ktoré sú po adícii iných signálnych sekvencii lokalizované v iných častiach bunky.
Ďalej je možné uskutočňovať zavádzanie lokálnych mutácii do pozícií, v ktorých zmena aminokyselinovej sekvencie ovplyvňuje napríklad enzýmovú aktivitu alebo reguláciu enzýmov. Týmto spôsobom je možné napríklad získať mutanty so zmenenou hodnotou Km alebo mutanty, ktoré už nepodliehajú normálnym regulačným mechanizmom v bunke pôsobením alosterickej regulácie alebo kovalentnej modifikácie.
Ďalej je možné získať mutanty so zmenenou substrátovou alebo produktovou špecificitou proteínov podľa tohto vynálezu, ktoré využívajú napríklad ADP-glukózo-6-fosfát namiesto ADP-glukózy. Okrem toho je možné pripravovať mutanty proteínov podľa tohto vynálezu, ktoré vykazujú zmenený profil aktivita - teplota.
Pri uskutočňovaní génovo-technickej modifikácie prokaryontických
31574 T ·· ·· ·· ·· ·· ···· ···· ··· • · 9 9 9 9 9 9 ··· · · · · · «· ·»·· ·· ···· ·· buniek je možné vkladať molekuly nukleových kyselín podľa tohto vynálezu alebo ich častí do plazmidov, ktoré umožňujú uskutočňovať mutagenézu alebo zmenu sekvencie rekombináciou DNA-sekvencií. Pomocou štandardných postupov (pozri Sambrook a spol., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1. vyd. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA) je možné uskutočňovať zámeny báz alebo pripojovať prirodzené alebo syntetické sekvencie. Na vzájomné spojovanie DNA-fragmentov je možné k týmto fragmentom pripojiť spojovacie alebo viažuce skupiny (adaptory alebo linkéry). Rovnako je možné používať manipulácie, ktoré uvoľňujú príslušné reštrikčné miesta štiepenia, alebo ktoré nadbytočnú DNA alebo reštrikčné miesta odstraňujú. V prípadoch, kde prichádzajú do úvahy inzercie, delécie alebo substitúcie, je možné pri mutagenéze in vitro používať primér repair“, reštrikciu alebo ligáciu. Ako analytické metódy bola všeobecne použitá sekvenčná analýza, reštrikčná analýza alebo iné biochemické alebo molekulárne-biologické metódy.
V ďalšej forme uskutočňovania sa tento vynález týka hostiteľských buniek, najmä pre- alebo eukaryontických buniek, ktoré sú transformované s jednou z vyššie uvedených molekúl nukleových kyselín podľa tohto vynálezu alebo s jedným z vektorov podľa tohto vynálezu, a rovnako buniek, ktoré z takto transformovaných buniek vznikajú a obsahujú jednu molekulu nukleových kyselín podľa tohto vynálezu alebo jeden vektor. Pritom prednostne ide o pro- alebo eukaryontické bunky, najmä o rastlinné bunky.
Premetom tohto vynálezu sú ďalej proteíny, ktoré je možné pripraviť rekombinantným spôsobom, a ktoré majú aktivitu škrobovej syntézy, kódované molekulami nukleových kyselín podľa tohto vynálezu, ďalej postup ich prípravy, pričom hostiteľská bunka podľa toto vynálezu je kultivovaná za vhodných, odborníkom známych podmienok, umožňujúcich syntézu proteínu podľa tohto vynálezu, a konečná izolácia tohto proteínu z hostiteľských buniek a/alebo z kultivačného média.
Získané molekuly nukleových kyselín podľa tohto vynálezu teraz
31574 T ·· ·· ·· ·· ·· ···· ···· ··· • · ··· · · · ··· · · · β·· ·· ···· ·· ···· ·· ··· umožňujú pomocou génovo-technických metód uskutočňovať cielené zásahy do metabolizmu škrobu v rastlinách a tento metabolizmus meniť do tej miery, že dôjde k syntéze takých modifikovaných škrobov, ktoré v porovnaní so známymi škrobmi budú mať iné fyzikálno-chemické vlastnosti, ako sú napríklad pomer amylózy a amylopektínu, stupeň rozvetvenia reťazca, priemerná dĺžka reťazca, obsah fosfátov, vlastnosti pri mazovatení, vlastnosti pri tvorbe gélu alebo filmu, veľkosť škrobových zŕn a/alebo ich tvar.
Je možné rovnako uskutočňovať expresiu molekúl nukleových kyselín podľa tohto vynálezu v rastlinných bunkách na zvýšenie aktivity príslušnej škrobovej syntézy, alebo zavádzať molekuly nukleových kyselín podľa tohto vynálezu do buniek, ktoré tento enzým normálne neexprimujú. Ďalej je možné molekuly nukleových kyselín podľa tohto vynálezu modifikovať postupmi, ktoré sú odborníkom známe, aby sa získali škrobové syntézy podľa tohto vynálezu, ktoré už nepodliehajú prirodzeným regulačným mechanizmom vlastnej bunky, respektíve ktoré majú zmenený profil teplota - aktivita alebo zmenené špecifické vlastnosti substrátu respektíve produktu.
Pri expresii molekúl nukleových kyselín podľa tohto vynálezu v rastlinách existuje v zásade možnosť lokalizovať syntetizovaný proteín do ľubovoľnej časti rastlinnej bunky. Aby bolo možné uskutočniť lokalizáciu do určitej časti rastlinnej bunky, musí sa vyštiepiť sekvencia, zaisťujúca lokalizáciu v plastidoch a zbývajúcu kódujúcu oblasť, prípadne spojiť s DNA-sekvenciami, ktoré zaisťujú lokalizáciu do príslušného miesta. Takéto sekvencie sú známe (pozri napr. Braun a spol., EMBO J. 11 (1992), 3219 - 3227; Wolter a spol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 846 -850; Sonnenwald a spol., Plánt J. 1 (1991), 95-106).
Tento vynález sa týka i postupu prípravy transgénnych rastlinných buniek, ktoré sa transformujú s molekulou nukleových kyselín alebo s vektorom podľa tohto vynálezu, pričom molekula nukleových kyselín podľa tohto vynálezu alebo vektor podľa toto vynálezu sa integruje do genómu rastlinnej bunky, a ďalej sa týka i transgénnych rastlinných buniek, transformovaných
31574 T ·· ·· ·· ·· ·· ···· ···· ··· ·· · · · ··· ··· · · · · · ·· ···· ·· ···· ·· · pomocou niektorej molekuly nukleových kyselín alebo vektora podľa tohto vynálezu, a rovnako zahrňuje transgénne rastlinné bunky, ktoré sú z takto transformovaných buniek odvodené. Bunky podľa tohto vynálezu obsahujú jednu alebo viac molekúl nukleových kyselín alebo vektorov podľa tohto vynálezu, pričom tieto molekuly alebo vektory sú prednostne spojené s regulačnými DNA- prvkami, ktoré zaisťujú transkripciu v rastlinných bunkách, najmä s vhodným promótorom. Tieto bunky je možné odlíšiť od prirodzených rastlinných buniek okrem iného i podľa toho, že obsahujú molekuly nukleových kyselín podľa tohto vynálezu, ktoré sa v týchto bunkách normálne nevyskytujú, alebo podľa toho, že táto molekula je integrovaná na určitom mieste genómu bunky, kde sa inak nevyskytuje, to znamená v inom génomickom okolí. Ďalej je možné tieto transgénne rastlinné bunky podľa tohto vynálezu odlíšiť od prirodzených rastlinných buniek tým, že tieto bunky obsahujú vo svojom genóme stabilne integrovanú minimálne jednu kópiu molekuly nukleových kyselín podľa tohto vynálezu, prípadne naviac ku kópiám tejto molekuly s prirodzeným výskytom v bunkách. Ak ide pri molekule alebo molekulách nukleových kyselín, zavedených do buniek, o kópie naviac k molekulám s prirodzeným výskytom v bunke, je možné rastlinné bunky podľa tohto vynálezu od prirodzených buniek odlíšiť najmä tým, že táto alebo tieto kópie naviac sú lokalizované v genóme na mieste alebo miestach, na ktorých sa v prírode nevyskytuje alebo nevyskytujú. To je možné ľahko dokázať napríklad pomocou Southern-Blot-analýzy podľa postupov, ktoré sú odborníkom známe.
Ak je molekula nukleových kyselín podľa tohto vynálezu, ktorá bola zavedená do rastlinného genómu, vo vzťahu k rastlinnej bunke heterológna, obsahujú transgénne rastlinné bunky transkripty molekúl nukleových kyselín podľa tohto vynálezu, čo je možné ľahko dokázať napríklad Norther-Blotanalýzou podľa postupov, ktoré sú odborníkom známe.
Ak je molekula nukleových kyselín podľa tohto vynálezu vo vzťahu k rastlinnej bunke homológna, je možno bunky podľa tohto vynálezu odlíšiť od prirodzene sa vyskytujúcich buniek napríklad podľa ďalšej expresie molekúl
31574 T ·· ·· ·· ·· ·· ···· ···· ··· • · · · · ··· ··· · · · ·· ·· ···· ·· ···· ·· · nukleových kyselín podľa tohto vynálezu. Transgénne rastlinné bunky obsahujú prednostne viac transkriptov molekúl nukleových kyselín podľa tohto vynálezu. To je možné dokázať napríklad pomocou Norter-Blot-analýzy. Viac“ znamená pri tom prednostne minimálne o 10 % viac, obzvlášť o 20 % viac a obzvlášť výhodne minimálne o 50 % viac transkriptov ako zodpovedajúce netransformované bunky. Prednostne vykazujú tieto bunky rovnako zodpovedajúce (minimálne 10 %, 20 %, respektíve 50 %) zvýšenie aktivity alebo prípadne zníženie aktivity proteínov podľa tohto vynálezu. Z transgénnych rastlinných buniek je možné regenerovať celé rastliny pomocou postupov, ktoré sú odborníkom známe.
Predmetom tohto vynálezu je i postup získavania transgénnych rastlín, pričom jedna alebo niekoľko molekúl nukleových kyselín alebo vektorov podľa tohto vynálezu sa integruje do genómu rastlinnej bunky a celá rastlina sa z tejto bunky regeneruje. Rastliny získané regeneráciou transgénnych rastlinných buniek podľa tohto vynálezu sú rovnako jeho predmetom. Ďalej sú predmetom tohto vynálezu rastliny, ktoré vyššie uvedené transgénne rastlinné bunky obsahujú. Tieto transgénne rastliny môžu byť principiálne rastliny akéhokoľvek rastlinného druhu, tzn. ako rastliny monokotylné, tak i dikotylné. Prednostne ide o úžitkové rastliny, obzvlášť o rastliny ktoré syntetizujú respektíve ukladajú škrob, obzvlášť výhodne žito, jačmeň, ovos, pšenicu, proso, ságo, kukuricu, ryžu, hrach, dreňový hrach, maniok, zemiaky, rajčiny, repku, sójové boby, konope, ľan, slnečnicu, kŕmny hrach alebo marantu, predovšetkým pšenicu, kukuricu, ryžu a zemiaky.
Tento vynález s rovnako týka množiteľského materiálu rastlín podľa tohto vynálezu, ako sú napríklad plody, semená, hľuzy, časti koreňov, semenáče, sadenice, pletivá protoplasty, bunkové kultúry a podobne.
Tento predkladaný vynález sa ďalej týka postupu na výrobu modifikovaného škrobu, zahrňujúci operáciu extrakcie škrobu z vyššie uvedených rastlín podľa tohto vynálezu a/alebo zo škrobnatých častí týchto rastlín.
31574 T ·· »1 ·· ·· ·· ···· ···· · · · • · ··· ··· • · · · · · · · ·· ·»·· ·· ···· ·· ·
Postupy pre extrakciu škrobu z rastlín alebo z ich škrobnatých častí, najmä z pšenice, sú pre odborníkov známe, pozri napríklad Eckhoff a spol. (Cereal Chem. 73 (1996) 54 - 57 Škrob - Chemie a technológie (vydavateľ: Whistler, BeMiller a Paschall (1994), 2. vydanie, Academic Press Inc. London Ltd; ISBN 0-12-746270-8; pozri napr. kapitola XII, str. 412 - 368; Škroby z kukurice a sorghumu: Výroba; Watson; kapitola XIII, str. 469 - 479; Tapiokový, marantový /arrowroot/ a ságový škrob: Výroba; Corbishley a Miller; kapitola XIV, str. 479 - 490; Zemiakový škrob: Výroba a použitie; Mitch; kapitola XV, str. 491 - 506: Pšeničný škrob: Výroba, modifikácia a použitie; Knight a Oson; a kapitola XVI. str. 507 až 528: Ryžový škrob: Výroba a použitie; Rohmer a Klem). K zariadeniam, ktoré sa spravidla na extrakciu škrobu z rastlinného materiálu používajú, patria separátory, dekantéry, hydrocyklony, sprayové sušiarne a sušiarne na sušenie vo fluidnej vrstve.
Transgénne rastlinné bunky a rastliny podľa tohto vynálezu syntetizujú na základe expresie molekúl nukleových kyselín podľa tohto vynálezu škroby, ktoré so svojimi fyzikálno-chemickými vlastnosťami, ako je napríklad pomer amylózy a amylopektínu, stupeň rozvetvenia reťazca, priemerná dĺžka reťazca, obsah fosfátov, vlastnosti pri mazovatení, veľkosť škrobových zŕn a/alebo ich tvar, líšia od škrobov syntetizovaných prírodnými rastlinami. Pri týchto škroboch sa môže meniť najmä ich viskozita a/alebo ich vlastnosti pri tvorbe filmu a vlastnosti vzniknutých škrobových mazov v porovnaní s vlastnosťami známych škrobov.
Premetom tohto predkladaného vynálezu je ďalej škrob, ktorý je možné získať z rastlinných buniek, rastlín a z ich množiteľského materiálu podľa tohto vynálezu a škrob, ktorý je možno získať vyššie uvedenými postupmi podľa tohto vynálezu.
Ďalej je možné pomocou molekúl nukleových kyselín podľa tohto vynálezu produkovať rastlinné bunky rastliny, v ktorých je aktivita proteínu podľa tohto vynálezu znížená. To vedie rovnako k syntéze škrobu so zmenenými chemickými a/alebo fyzikálnymi vlastnosťami v porovnaní so
31574 T
·· ·· ·· ·· ··
• • • · • • · · • • • ·
• • • • • · • •
•
• ·· • • ···· • ·· • · ···· • ·· • • ·
škrobmi z pôvodných rastlinných buniek.
Ďalším predmetom tohto vynálezu sú transgénne rastlinné bunky, obsahujúce molekulu nukleových kyselín podľa tohto vynálezu, v ktorých je aktivita škrobovej syntázy v porovnaní s netransformovanými bunkami znížená.
Prípravu rastlinných buniek so zníženou aktivitou škrobovou syntázy je možné napríklad uskutočňovať expresiou jednej príslušnej anti-sense-RNA, jednej sense-RNA na dosiahnutie ko-supresného efektu alebo expresného jedného, zodpovedajúcim spôsobom konštruovaného ribozýmu, ktorý špecificky štiepi transkript kódujúci škrobovú syntázu s použitím molekúl nukleových kyselín podľa tohto vynálezu podľa postupu, ktorý je odborníkom známy, pozri Jorgensen (Trends Biotechnol. 8 (1990), 340 - 344), Niebel a spol., (Curr. Top. Microbiol. Immunol. 197 (1995), 91 - 103), Flavell a spol. (Curr. Top. Microbiol. Immunol. 197 (1995), 43 - 46), Palaqui a Vaucheret (Plánt. Mol. Biol. 29 (1995), 149 - 159), Vaucheret a spol. (Mol. Gen. Genet. 248 (1995), 311 317), de Borne a spol., (Mol. Gen. Genet. 243 (1994), 613-621).
Výhodne sa na zníženie aktivity škrobovej syntázy podľa tohto vynálezu používa zníženie počtu kódujúcich transkriptov v rastlinných bunkách, napríklad expresiou antisense-RNA.
Pri tom je možné použiť molekulu DNA, ktorá obsahuje úplnú sekvenciu kódujúcu protein podľa tohto vynálezu vrátane prípadne prítomných tieniacich sekvencií, a rovnako DNA-molekuly, obsahujúce iba časti kódujúcej sekvencie, pričom tieto časti musia byť dostatočne dlhé na to, aby v bunkách vyvolali antinsense-efekt. Všeobecne sa môžu požívať sekvencie s minimálnou dĺžkou 15 bp, prednostne s dĺžkou 100 - 500 bp, na účinnú antisense-inhibíciu najmä sekvencie s dĺžkou nad 500 bp. Spravidla sa používajú DNA-molekuly, ktoré sú kratšie ako 5000 bp, prednostne sekvencie, ktoré sú kratšie ako 2500 bp.
Je možné používať i DNA-sekvencie, ktoré vykazujú vysoký stupeň homológie so sekvenciami molekúl DNA podľa tohto vynálezu, ktoré však nie sú celkom identické. Minimálna homológia by mala byť vyššia ako cca 65 %. Prednostne sa používajú sekvencie so stupňom homológie medzi 95 a 100 %.
31574 T • · ·· ·· ·· ·· ···· ···· · · · • · ··· ··· ··· ··· ··· ·· ···· ·· ···· ·· ···
Premetom tohto vynálezu je i postup prípravy modifikovaného škrobu, zahrňujúci postup extrakcie škrobu z bunky alebo z rastliny podľa tohto vynálezu a/alebo zo škrobnatých častí týchto rastlín.
Predmetom tohto vynálezu je ďalej škrob, ktorý je možné získať z buniek, rastlín a rovnako množiteľského materiálu alebo jeho častí podľa tohto vynálezu a ďalej škrob, ktorý je možné získať postupom podľa tohto vynálezu.
Škroby podľa tohto vynálezu je možné modifikovať postupmi, ktoré sú odborníkom známe, pričom tieto škroby v modifikovanej alebo nemodifikovanej forme sú vhodné na rôzne použitie v potravinárskej alebo nepotravinárskej oblasti.
Možnosti použitia škrobov podľa tohto vynálezu sa v podstate delia do dvoch veľkých oblastí. Jedna oblasť zahrňuje produkty hydrolýzy škrobu, najmä glukózu a glukánové stavebné jednotky, ktoré je možné získať enzymatickými alebo chemickými postupmi. Tieto látky slúžia ako východiskové suroviny pre ďalšie chemické modifikácie a procesy, ako je napríklad fermentácia. Na zníženie finančných nákladov môže mať v tomto prípade značný význam jednoduchosť a nie príliš nákladné uskutočnenie hydrolytického postupu. V súčasnej dobe sa táto hydrolýza uskutočňuje prevažne enzymaticky s použitím amyloglukozidázy. Možno predpokladať, že úspory nákladov by sa mohli dosiahnuť znížením množstva použitých enzýmov. Určitý vplyv by mohla mať i štruktúrna premena škrobu, ako je napríklad zníženie stupňa rozvetvenia alebo zmena sférickej štruktúry, ktorá určuje prístupnosť molekuly pre použité enzýmy.
Druhá oblasť, v ktorej by sa škroby podľa tohto vynálezu mohli vzhľadom na ich polymerizačnú štruktúru používať ako takzvané natívne škroby, sa delia na dve hlavné oblasti použitia:
1. Potravinársky priemysel
Škrob je klasickou prísadou do radu potravín, v ktorých spravidla plní
31574 T ·· e· ·· ·· ·· ···· · · · · ··· ·· · · · ··· ··· ··· · · · ·· ··· ·· ···· ·· ··· funkciu spojiva pre vodné zložky respektíve používa sa na zvýšenie viskozity alebo spôsobuje zvýšenú tvorbu gélu. Dôležitými vlastnosťami sú pritom tekutosť a sorpcia, teplota bobtnania a mazovatenia, viskozita a zahusťovacia schopnosť, rozpustnosť škrobu, priehľadnosť a štruktúra škrobového mazu, stálosť voči pôsobeniu tepla, strižných síl a kyselín, tendencie k retrogradácii, schopnosť tvorby filmov, stabilita pri zmrazovaní/rozmrazovaní, viskozitná stálosť v soľných roztokoch, stráviteľnosť a rovnako schopnosť tvorby komplexov napríklad s anorganickými alebo organickými iónami.
2. Nepotravinársky priemysel
V tejto širokej oblasti je možné používať škrob ako pomocnú látku pri rôznych výrobných procesoch, resp. ako prísadu do technických produktov. Škrob ako pomocná látka sa používa najmä v papierenskom priemysle a v priemysle výroby lepenky. Škrob sa v tejto aplikácii používa predovšetkým na retardáciu (viazanie pevných látok), viazanie plnidiel a jemných častíc, ako stužovací prostriedok a prostriedok na odvodňovanie. Okrem toho sa využívajú výhodné vlastnosti škrobu na dosiahnutie tuhosti, tvrdosti, akustických vlastností, požadovaného omaku, lesku, hladkosti, odolnosti proti rozštiepeniu a rovnako na dosiahnutie požadovaných vlastností povrchu..
2.1. Priemysel výroby papiera a lepenky
Pri výroba papiera sa rozlišujú štyri oblasti použitia, a to úprava povrchu, natieranie, úprava vlastností papierenskej hmoty a postrek. Požiadavky na škrob na úpravu povrchu sú najmä vysoký stupeň belosti, zodpovedajúca viskozita, vysoká viskozitná stálosť, dobrá schopnosť na tvorbu filmov a minimálna tvorba prachu. Pri použití škrobu pre nátery je dôležitý obsah pevných látok, zodpovedajúca viskozita, vysoká väzbovosť a rovnako vysoká afinita k pigmentom. Pri použití škrobu ako prísady do papierenskej hmoty sa požaduje jeho rýchle, rovnomerné a bezstratové rozptýlenie, vysoká mechanická stabilita a úplné zadržanie
31574 T ·· ·· ·· ·· ·· ···· ···· ··· ·· ··· · · · ··· ··· ·· ·· ···· ·· ··«· ·· · škrobu v prúde papieroviny. Pri použití škrobu na postrekovanie sú rovnako dôležitými vlastnosťami zodpovedajúci obsah pevných látok, vysoká viskozita a vysoká väzbovosť.
2.2. Priemysel výroby lepidiel
Priemysel výroby lepidiel predstavuje širokú oblasť použitia škrobov, ktorú je možné rozdeliť na štyri dielčie oblasti: použitie ako čisté škrobové lepidlo, použitie do škrobových lepidiel s prísadou špeciálnych chemikálií, použitie škrobu ako prísady k syntetickým živiciam a k disperzným polymérom a nakoniec použitie škrobov ako nastavovacieho prostriedku do syntetických lepidiel. 90 % lepidiel na báze škrobu sa používa pri výrobe vlnitej lepenky, papierových sáčkov, vreciek a kornútkov, na výrobu spojovacích materiálov na papier a hliník, na výrobu kartonáže a ako zvlhčovacie lepidlo na dopisné obálky, známky apod.
2.3. Textilný priemysel a priemysel pomocných textilných prípravkov
Veľkým odberateľom škrobov je textilný priemysel a priemysel textilných prípravkov, kde sa škroby používajú ako pomocný prostriedok a prísada. V rámci textilného priemyslu je možné rozlíšiť štyri oblasti použitia: použitie škrobu ako šlichtovacieho prostriedku, tj. ako pomocného prostriedku na vyhladenie, spevnenie a zvýšenie súdržnosti textilných surovín na ochranu proti pôsobeniu ťahových síl pri spriadaní a tkaní a rovnako na zvýšenie odolnosti proti oderu pri tkaní, použitie škrobu ako prostriedku na zušľachťovanie textilu najmä po úpravách zhoršujúcich kvalitu ako je bielenie, farbenie apod., škrob sa ďalej používa ako zahusťovací prostriedok pri výrobe farbiacich pást na potlačenie difúzie farieb a nakoniec sa škrob používa ako prísada do prostriedkov na spojovanie nití.
2.4. Stavebníctvo
Štvrtou oblasťou použitia je používanie škrobu ako prísady do stavebnín.
31574 T ·· • · • · ·· ·· ·· • · · · • · · • · · ·· ···· ·· • · · · • · · • · · ·· ···· • · ··
Ako príklad je možné uviesť sadrokartónové panely, kde škrob pridaný do sadrovej kaše pôsobením vody mazovatie, difunduje na povrch sadrovej dosky a viaže kartón na túto dosku. Ďalšou oblasťou použitia je pridávanie škrobu do omietok a minerálnych vlákien. Pri preprave betónu sa škrobové produkty používajú na spomalenie tvrdnutia betónu.
2.5. Stabilizácia pôdy
Ďalšou oblasťou spotreby škrobu je výroba prostriedkov na stabilizáciu pôdy, ktoré sa používajú pri umelých pohyboch pôdy na dočasnú ochranu častíc pôdy proti vode. Kombinované produkty skladajúce sa zo škrobu a emulzií polymérov sú podľa súčasných znalostí vo svojich účinkoch na znižovanie erózie a tvorby krusty porovnateľné s doteraz používanými výrobkami, sú však podstatne lacnejšie.
2.6. Použitie v prostriedkoch na ochranu rastlín a v hnojivách
V tejto oblasti sa škrob používa do prostriedkov na ochranu rastlín na úpravu ich špecifických vlastností. Škroby sa používajú na zlepšené zmáčanie prostriedkov na ochranu rastlín a hnojív, na postupné uvoľňovanie účinných látok, na premenu kvapalných, prchavých a/alebo zapáchajúcich látok na mikrokryštalické, stabilné a tvarovateľné látky, na miešanie nekompatibilných zlúčenín a na predĺženie doby účinnosti spomalením rozkladu.
2.7. Farmaceutický, zdravotnícky a kozmetický priemysel
Ďalšou oblasťou používania škrobu je farmaceutický, zdravotnícky a kozmetický priemysel. Vo farmaceutickom priemysle sa škrob používa ako spojivo na tablety alebo na zried’ovanie spojív v kapsulách. Ďalej sa škrob používa ako prostriedok na rýchly rozpad tabliet (Tablettensprengmittel), kde tablety po zhltnutí absorbujú tekutinu a po krátkej dobe nabobtnajú, pričom uvoľňujú účinnú látku. Lekárske zásypy a púdre na zasypávanie rán obsahujú ako základnú látku škrob.
V oblasti kozmetiky sa škroby používajú napr. ako nosiče prísad, ako sú
31574 T ·· • · ·· • · · • · • · · • · ···· ·· ·· • · · · • · · • · · · • · · ·· ···· ·· vonné látky a salicylová kyselina, do púdrov. Pomerne značné množstvo škrobov sa používa do zubných pást.
2.8. Pridávanie škrobov do uhlia a brikiet
Škroby sa pridávajú i do uhlia a brikiet. Uhlie sa po prídavku škrobu lepšie aglomeruje resp. briketuje, čo bráni predčasnému rozpadu brikiet. Do grilovacieho uhlia sa pridáva 4 až 6 % škrobu, do uhlia na vykurovanie 0,1 až 0,5 %. Šroby ako spojivá do uhlia nadobúdajú stále väčší význam, pretože prídavok škrobu do uhlia a brikiet môže značne znížiť emisie škodlivých látok.
2.9. Úprava rudných a uhoľných kalov
Škroby je možné používať i na úpravu rudných a uhoľných kalov ako flokulačný prostriedok.
2.10. Pomocné prostriedky v zlievarenstve
Ďalšou oblasťou je použitie škrobu ako prísady do pomocných zlievarenských prostriedkov. Pri rôznych postupoch odlievania sú potrebné jadra, ktoré sa vyrábajú z pieskov s prísadou spojiva. Ako spojivo sa v súčasnej dobe používa prevažne bentonit, do ktorého sa pridávajú modifikované škroby, najmä bobtnavé škroby (Quellstärken). Prídavok škrobu sa používa na zvýšenie pevnosti pri toku (Fliessfestigkeit) a na zlepšenie väzbovosti (Bindefestigkeit). Okrem toho môžu bobtnavé škroby spĺňať ďalšie technické požiadavky, ako je dispergovateľnosť v studenej vode, ľahká rehydratácia, dobrá miešateľnosť s pieskom a vysoká schopnosť viazať vodu.
2.11. Použitie v gumárenskom priemysle
V gumárenskom priemysle sa môže škrob používať na zlepšenie technickej a optickej kvality výrobkov. Používa sa na zlepšenie lesku povrchu, na zlepšenie omaku (GrifT) a vzhľadu, pričom sa pred vulkanizáciou za studená popráši škrobom lepivej pogumovanej plochy. Škrob sa rovnako používa i na zlepšenie potlačovateľnosti pryžových
31574 T ·· ·· ·· • · · · • · · • · · · • · · ·· ···· ·· ·· • · · · • · · • · · • · · ·· ···· ·· · výrobkov.
2.12. Výroba náhražok kože
Ďalšou oblasťou uplatnenia modifikovaných škrobov je výroba náhražok kože.
2.13. Škroby v syntetických polyméroch
V oblasti plastov sa škroby používajú na nasledujúce účely: prídavok škrobových produktov pri spracovaní (škrob funguje iba ako plnidlo, medzi syntetickým polymérom a škrobom nevzniká priama väzba) alebo alternatívne na viazanie škrobových produktov pri výrobe polymérov (škrob a polymér vytvárajú pevnú väzbu).
Používanie škrobu ako samotného plnidlá nie je v porovnaní s inými látkami, ako je napríklad mastenec, perspektívne. Iná je však situácia, ak sa uplatnia špecifické vlastnosti škrobu a dôjde k podstatnej zmene vlastností konečného produktu. Ako príklad je možné uviesť použitie škrobových produktov pri spracovaní termoplastov, ako je polyetylén. Pri tom sa škrob a polymér spracujú koexpresiou v pomere 1 : 1 na predzmes, z ktorej sa s granulovaným polyetylénom za použitia bežných technologických postupov vyrábajú rôzne produkty. Naviazanie škrobu v polyetylénových fóliách môže zvýšiť látkovú priepustnosť fóliových dutých telies, zlepšiť priepustnosť pre vodnú paru, zlepšiť antistatické vlastnosti a rovnako zlepšiť potlačovateľnosť farbami riediteľnými vodou.
Ďalšou možnosťou je použitie škrobu do polyuretánových pien. Úpravou škrobových derivátov a rovnako optimalizáciou technologických parametrov je možné cielene riadiť reakciu medzi syntetickými polymérmi a hydroxylovými skupinami škrobu. Výsledkom sú polyuretánové fólie, ktorým použitie škrobu dodáva nasledujúce vlastnosti: zníženie koeficientu tepelnej rozťažnosti, zníženie zrážanlivosti, zlepšenie vlastností pri pôsobení tlaku/ťahu, vzrast priepustnosti pre vodnú paru bez zmeny schopnosti prijímať vodu, zníženie zápalnosti a možnosti roztrhnutia, nedochádza k odkvapkávaniu horiacich
31574 T ·· ·· • · · · • · · • · · ·· ···· • · ·· ·· • · · · • · · • · · • · · ·· ···· ·· · dielov, absencia halogénov a spomalené starnutie. Nevýhodami, ktoré sa v súčasnej dobe prejavujú, sú znížená pevnosť v tlaku a znížená rázová odolnosť. Vývoj výrobkov sa však neobmedzil iba na fólie. V súčasnej dobe sa vyrábajú i masívne výrobky, ako sú napr. hrnčeky, taniere a misky, obsahujúce i viac ako 50 % škrobu. Okrem toho sú zmesi škrobu a polymérov hodnotené veľmi priaznivo z ekologického hľadiska, pretože majú podstatne vyššiu biologickú odbúrateľnosť.
Mimoriadny význam získali vzhľadom na ich extrémne schopnosti viazať vodu vrúbkované škrobové polymerizáty. Ide o produkty ktorých hlavný reťazec tvorí škrob a na tento reťazec sú podľa princípu radikálového mechanizmu vrúbkované postranné vedľajšie reťazce syntetického monoméru. Vrúbkované škrobové polymerizáty, ktoré sú v súčasnej dobe k dispozícii, sa vyznačujú zlepšenou schopnosťou viazať a zadržovať vodu, a to až do množstva 1 000 g vody na 1 g škrobu pri vysokej viskozite. Oblasti použitia týchto superabsorpčných látok sa v posledných rokoch veľmi rozšírili a tieto látky sa uplatňujú v oblasti hygieny ako plienky a vložky a rovnako v poľnohospodárstve, ako napríklad na poťahovanie osiva.
Na použitie nových génovo-technicky premenených škrobov sú rozhodujúce jednak ich štruktúra, obsah vlhkosti, obsah proteínov, obsah lipidov, obsah vlákniny, obsah popola/fosfátov, pomer amylóza/amylopektín, rozloženie molárnych hmotností, stupeň rozvetvenia, veľkosť zŕn a ich tvar a kryštálinita, a jednak vlastnosti, z ktorých vyplývajú nasledujúce charakteristiky: chovanie pri toku a sorpčné vlastnosti, teplota mazovatenia, viskozita, stálosť viskozity v soľných roztokoch, zahusťovacia schopnosť, rozpustnosť, štruktúra a transparencia škrobového mazu, odolnosť voči teplu, strižným silám a kyselinám, tendencia k retrogradácii, tvorba gélov, stabilita pri zmrazovaní/rozmrazovaní, schopnosť tvoriť komplexy, viazanie jódu, tvorba filmov, pevnosť lepeného spoja, stálosť voči enzýmom, stráviteľnosť a reaktivita.
U modifikovaných škrobov, získaných z príslušných rastlín pomocou
31574 T • · λ
·· · ·· ·· • · · · • · · • · · • · · ·· ···· ·· ·· • · · · ♦ · · · · • · · ·· ···· génovo-technických postupov, môže dôjsť k takej zmene ich vlastností, že ďalšia modifikácia pomocou chemických alebo fyzikálnych postupov už nie je nutná. Inak je možné škroby pozmenené génovo-technickými postupmi ďalej modifikovať chemickými postupmi, takže sa dosiahne ďalšie zlepšenie kvality pre vyššie uvedené účely použitia. Tieto chemické úpravy sú v zásade známe. Pri tom sa používajú najmä úpravy pôsobením tepla, pôsobením organických alebo anorganických kyselín, oxidácie a reesterifikácie, pričom vznikajú napríklad fosfáty, nitráty, sulfáty, xantáty, acetáty alebo citráty škrobu. Ďalej je možné použiť jedno- alebo viacfunkčné alkoholy za prítomnosti silných kyselín na prípravu éterov škrobu, pričom vznikajú alkylétery, O-allylétery, hydroxyalkylétery a O-karboxymetylétery škrobu, dusík obsahujúce étery škrobu, fosfor obsahujúce étery škrobu, síru obsahujúce étery škrobu, zosieťované škroby alebo vrúbkované škrobové polyméry. Výhodným použitím škrobov podľa tohto vynálezu je jednak výroba obaľovaných materiálov a výrobkov na jedno použitie a jednak použite týchto škrobov ako potravín a potravinárskych polotovarov.
Na expresiu molekúl nukleových kyselín podľa tohto vynálezu v sensealebo antisense-orientácii v rastlinných bunkách sa tieto molekuly spoja s regulačnými DNA-prvkami, ktoré potom uskutočňujú transkripciu v rastlinných bunkách. K tomu sa ešte priraďujú najmä promótory, enhancéry a terminátory. Všeobecne sa expresie môže zúčastniť ktorýkoľvek aktívny promótor v rastlinnej bunke.
Promótor je pri tom možné voliť tak, aby expresia prebiehala konštitutívne, alebo iba v určitom tkanive, v určitom časovom úseku vývoja rastliny alebo v určitom okamihu, stanovenom vonkajšími vplyvmi. Vo vzťahu k rastline môže byť tento promótor homologický alebo heterologický. Vhodnými promótormi na konštitutívnu expresiu sú napríklad promótor 35S RNA vírusu karfiolovej mozaiky a ubiquitínový promótor z kukurice, na expresiu špecifickú pre hľuzy (knollenspezifische E.) je vhodný patatínový promótor B33 (RochaSosa a spol., EMBO J. 8 (1989), 23 - 29), ako promótor zaisťujúci expresiu iba
31574 T ·· • · · • · • · · • · ···· e t ·· • · · · • · · ·
• · · ·· ···· ·· · vo fotosynteticky aktívnych tkanivách je vhodný napríklad promótor ST-LS-1 (Stockhaus a spol., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), 7943 - 7947; Stockhaus a spol., EMBO J. 8 (1989), 2445 - 2451), pre endosperm-špecifickú expresiu je možné použiť HMG-promótor z pšenice, USP-promótor, faseolínpromótor alebo promótory zo zeínových génov kukurice.
Ďalej môže byť k dispozícii terminačná sekvencia, ktorá zaisťuje správne ukončenie transkripcie a zaisťuje rovnako adíciu poly-A-konca na transkript, ktorému je pripisovaná funkcia pri stabilizácii transkriptov. Tieto prvky sú v literatúre opísané (pozri napr. Gielen a spol., EMBO J. 8 (1989) a sú ľubovoľne zameniteľné.
Tento predkladaný vynález poskytuje molekuly nukleových kyselín, ktoré kódujú protein s funkciou rozpustnej škrobovej syntázy zo pšenice. Molekuly nukleových kyselín podľa tohto vynálezu umožňujú získavanie tohto enzýmu, ktorý sa funkčne zúčastní biosyntézy škrobu a ktorý umožňuje získavanie génovo-technicky zmenených rastlín, v ktorých je aktivita tohto enzýmu zmenená a umožňuje tak v takto modifikovaných rastlinách uskutočňovať syntézu škrobu so zmenenou štruktúrou a so zmenenými fyzikálno-chemickými vlastnosťami.
Molekuly nukleových kyselín podľa tohto vynálezu môžu byť principiálne používané i na získavanie rastlín, v ktorých je aktivita škrobovej syntázy podľa tohto vynálezu zvýšená alebo znížená a súčasne v nich je aktivita iných enzýmov, ktoré sa podieľajú na syntéze škrobu, zmenená. Táto zmena aktivity škrobovej syntázy v rastlinách vedie k syntéze škrobu s pozmenenou štruktúrou. Ďalej môžu byť vnášané molekuly nukleových kyselín, ktoré kódujú škrobovú syntézu, alebo zodpovedajúce anti-sense konštrukty do rastlinných buniek, v ktorých už bola inhibovaná syntéza endogénnych GBSSI-, SSSalebo GBSS ll-proteínov pôsobením antisense-efektu alebo mutácií (ako napr. vo WO 92/14827 alebo Shannon a Garwood, 1984, v publikácii Whistler, BeMiller a Paschall, Škrob: Chemie a technológie, Academic Press, Londýn, 2. vyd.: 25-86).
31574 T • · ·· ·· • · · · • · · » e · • · · ·· ···· ·· ·· • · · · • · · • · · • · · ·· ···· • · ·· ·
Ak sa má dosiahnuť v transformovaných rastlinách inhibícia viac enzýmov podieľajúcich sa na biosyntéze, je možné pre transformáciu použiť DNA-molekuly, ktoré súčasne obsahujú viac oblastí, kódujúcich zodpovedajúce enzýmy v antisense-orientácii za kontroly vhodného promótoru. Pri tom môže byť alternatívne buď každá sekvencia kontrolovaná jedným vlastným promótorom, alebo môžu byť sekvencie transkribované ako fúzie jedným spoločným promótorom alebo môžu byť všetky sekvencie kontrolované jedným spoločným promótorom. Spravidla sa preferuje táto posledná alternatíva, pretože v tomto prípade je syntéza príslušných proteínov inhibovaná približne v rovnakej miere. Pre dĺžku jednotlivých kódujúcich oblastí využívanú v získanom konštrukte platí to, čo bolo už skôr uvedené pri príprave antisensekonštruktov. Horná hranica počtu antisense-transkribovaných fragmentov v promótore jednej DNA molekuly principiálne neexistuje. Vznikajúci transkript by však nemal byť dlhší ako 10 kb, výhodne by nemal prekročiť dĺžku 5 kb.
Kódujúce oblasti, ktoré sú lokalizované v týchto DNA-molekulách, v kombinácii s ostatnými kódujúcimi oblasťami v antisense-orientácii za príslušným promótorom, môžu pochádzať z DNA-sekvencií, ktoré kódujú nasledujúce proteíny: syntáza viazaná na škrobové zrno (GBSS I a II) a rozpustné syntázy (SSS I a II), enzýmy ovplyvňujúce rozvetvovanie (izoamylázy, pullulanázy, R-enzým, Branching“-enzým, ”Debranching“-enzým), škrobové fosforylázy a disproporcionačný enzým. Tento výpočet je iba orientačný. V rámci týchto kombinácií je možné použiť i iné DNA-sekvencie.
Tieto konštrukty umožňujú v rastlinných bunkách, ktoré sú ich pôsobením transformované, súčasne inhibovať syntézu viac enzýmov.
Ďalej je možné tieto konštrukty vkladať do rastlinných mutantov, ktoré sú pre jeden alebo viac génov biosyntézy škrobu defektné (Shannon a Garwood, 1984, v publikácii Whistler, BeMiller a Paschall, Škrob: Chemie a technológie, Academic Press, Londýn, 2. vyd.: 25-86). Tieto defekty sa môžu týkať nasledujúcich enzýmov: syntáza viazaná na škrobové zrno (GBSS I a II) a rozpustné syntázy (SSS I a II), enzýmy ovplyvňujúce rozvetvovanie (BE I a II),
31574 T ·· • · ”Debranching“-enzým (R-enzým), disproporcionačné enzýmy a škrobové fosforylázy. Tento výpočet je iba orientačný.
Pomocou tohto postupu je ďalej možné v rastlinných bunkách transformovaných týmto spôsobom súčasne inhibovať syntézu niekoľkých enzýmov.
Pre zavedenie cudzích génov do vyšších rastlín je k dispozícii veľký počet klonovacích vektorov, ktoré obsahujú replikačný signál pre E. coli a markérový gén pre selekciu transformovaných bakteriálnych buniek. Ako príklady týchto vektorov je možné uviesť pBR322, pUC-série, M13mp-série, pACYC184 a ďalšie. Požadovanú sekvenciu je možné zaviesť do vektora v príslušnom reštrikčnom štiepnom mieste. Získaný plazmid sa použije na transformáciu buniek E.coli. Transformované bunky E.coli sa kultivujú vo vhodnom médiu, nakoniec sa uskutoční ich izolácia a lýzia. Plazmid sa regeneruje. Ako analytické metódy na charakterizáciu získanej plazmid-DNA sa všeobecne používajú reštrikčná analýza, gélová elektroforéza a ďalšie biochemické a molekulárne-biologické metódy. Po každej manipulácii je možné plazmid-DNA rozštiepiť a získané DNA-fragmenty viazať na iné DNAsekvencie. Každú sekvenciu plazmid-DNA je možné klonovať v rovnakom plazmide alebo v iných plazmidoch.
Na zavedenie DNA do rastlinnej hostiteľskej bunky existuje rad postupov. K týmto postupom patria transformácie rastlinných buniek sT-DNA s použitím Agrobacterium tumefaciens alebo Agrobacterium rhizogenes ako transformačným prostriedkom, fúzie protoplastov, injekcie, elektroporácie DNA, vkladanie DNA pomocou biolistickej metódy a ďalšie možnosti.
Pri injikácii a elektroporácii DNA do rastlinných buniek nie sú na použité plazmidy kladené žiadne špeciálne požiadavky. Je možné použiť jednoduché plazmidy ako napríklad pUC-deriváty. Ak sa však má z takto transformovaných buniek regenerovať celá rastlina, je spravidla nutná prítomnosť príslušného markérového génu.
V závislosti od spôsobu zavedenia požadovaných génov do rastlinnej
31574 T ·· ·· • · · • · • · · • · ·· · • a · · • · · · • · · • · · • · · ·« ···· • · • · · · • · • · · · • » · «· ···· bunky môže byť potrebné použiť ďalšiu DNA-sekvenciu. Ak sa napríklad pre transformáciu rastlinnej bunky požíva Ti- alebo Ri-plazmid, musí byť aspoň pravé ohraničenie, často však pravé i ľavé ohraničenie Ti- a Ri- plazmidu TDNA spojené ako chrániaca oblasť so zavádzaným génom.
Ak sa pre transformáciu používajú agrobaktérie, musí byť zavádzaná DNA klonovaná v špeciálnom plazmide, a to buď v intermediárnom vektore alebo v binárnom vektore. Intermediárne vektory je možné na základe sekvencii homologických so sekvenciami v T-DNA integrovať do Ti- alebo Riplazmidu agrobaktérií pomocou homologickej rekombinácie. Tento plazmid obsahuje navyše i vírus-región potrebný pre transfer T-DNA. Intermediárne vektory nie je možné replikovať v agrobaktériách. S použitím pomocného plazmidu je možné intermediárny vektor prenášať na Agrobacterium tumefaciens (konjugácia). Binárne vektory je možné replikovať tak v E.coli, ako i v agrobaktériách. Tieto vektory obsahujú jeden selekčný markérový gén a jeden väzbový člen (linker alebo polylinkér), ktoré rámujú sprava a zľava hraničnú oblasť T-DNA. Tieto vektory je možné transformovať priamo v agrobaktériách (Holsters a spol., Mol. Gen. Genet. 163 (1978), 181 - 187). Agrobaktérium ako hostiteľská bunka by mala obsahovať plazmid nesúci vírusregión. Tento vírus-región je nutný pre transfer T-DNA do rastlinnej bunky. Môžu byť prítomné i ďalšie T-DNA. Takto transformované bunky Agrobacterium je možné použiť na transformáciu rastlinných buniek.
Používanie T-DNA na transformáciu rastlinných buniek je predmetom intenzívneho štúdia a je dostatočne opísané v EP 120 516; Hoekema, v publikáciách The Binary Plánt Vector Systém, Offsetdrukkerij Kanters B.V, Alblasserdam (1985), kapitola V; Fraley a spol., Crit Rev. Plánt. Sci., 4, 1 - 46 a An a spol., EMBO J. 4 (1985), 277 - 287.
Na transfer DNA do rastlinnej bunky je možné účelne ko-kultivovať rastlinné explantáty s Agrobacterium tumefaciens alebo Agrobacterium rhizhogenes. Z infikovaného rastlinného materiálu (ako sú napríklad kúsky listov, časti stoniek, korene, ale i protoplasty alebo suspenzne kultivovanej
31574 T ·· ·· ·· • · · · • · · • · · • · · e· ···· ·· ·· » · · ·
B · · rastlinné bunky) je potom možné vo vhodnom médiu, obsahujúcom okrem iného určité cukry, aminokyseliny, antibiotiká alebo biocídy na selekciu transformovaných buniek, regenerovať opäť celé rastliny. V takto získaných rastlinách je potom možné sledovať prítomnosť zavedenej DNA. Sú známe i iné možnosti na zavedenie cudzej DNA s použitím biolistického postupu alebo pomocou transformácie protoplastov (pozri napríklad Willmitzer, L., 1933 Transgenic plants, v publikácii Biotechnology, A Multi-Volume Comprehensive Treatise (edit. H. J. Rehm, G. Reed, A. Puhler, P. Stadler), diel 2, 627 - 659, VCH Weinheim-New York-Basel-Cambridge).
Zatiaľ čo transformácia dikotylných rastlín prostredníctvom Tiplazmidových vektorových systémov pomocou Agrobacterium je známa dostatočne, ukazujú novšie práce, že transformáciou pomocou vektorov vychádzajúcich z Agrobacterium je možné uskutočňovať i v monokotylných rastlinách (Chán a spol., Plánt Mol. Biol. 22 (1993), 491 - 506; Hiei a spol., Plánt J. 6(1994), 271 -282).
Alternatívnymi postupmi na transformáciu monokotylných rastlín sú použitie biolistických postupov, transformácie protoplastov alebo fyzikálne alebo chemicky indukované vloženie DNA do protoplastov, napríklad pomocou elektroporácie čiastočne permeabilizovaných buniek, transfer DNA pomocou sklenených vlákien, makroinjekcie DNA do kvetenstva, mikroinjekcia DNA do mikrospór alebo pro-embryónov, vkladanie DNA pomocou klíčiaceho peľu a vkladanie DNA do embryónov bobtnaním (Prehľad: Potrykus, Physiol. Plánt (1990), 269-273).
Tri z vyššie uvedených transformačných systémov boli už skôr používané na rôzne druhy obilia: elektroporácia tkaniva, transformácia protoplastov a DNA-transfer vstrelovaním častíc do regenerovateľného tkaniva a buniek (Prehľad: Jähne a spol., Euphytica 85 (1995), 25 - 44).
Transformácia pšenice bola opísaná v rade prác (Prehľad: Maheswari a spol., Critical Rewievs in Plánt Science 14 (2) (1995), 149 až 178). Hess a spol. (Plánt Sci 72 (1990), 233) použili postup makroinjekcie, aby dostali do
31574 T ·· ·· • · · * • · 1 ·· ·· » · · t » · · bezprostrednej vzájomnej blízkosti peľ a agrobaktérie. Mobilizácia plazmidu obsahujúceho nptll gén ako voliteľný markér bola dokázaná pomocou Southern-Blot-analýzy a NPTII testom. Tieto transformanty vykazovali normálny fenotyp a boli fertilné. V dvoch po sebe idúcich generáciách bolo možné dokázať rezistenciu voči kanamycínu.
Prvú transgénnu fertilnú rastlinu pšenice, ktorú bolo možné regenerovať po vstrelovaní DNA viazanej na mikroprojektily opísali Vasil a spol. (Bio/Technology 10 (1992), 667 - 674). Cieľovým tkanivom na vstrelovanie bola embryogénna kultúra kalu (Kallus typ C). Ako selekčný markér bol použitý čistý gén (bar Gen) kódujúci fosfinotricín-acetyltransferázu a zaisťoval tak rezistenciu proti herbicídu Phosphinothricin. Ďalší systém opísali Weeks a spol. (Plánt Physiol. 102 (1993), 1077- 1084) a Becker a spol. (Plánt J. 5(2) (1994), 299 - 307). V tomto prípade bolo cieľovým tkanivom pre DNAtransformáciu skutelum nezrelých embryónov, ktoré boli v počiatočnej in vitrofáze stimulované k indukcii somatických embryónov. Stupeň účinnosti tejto transformácie bol pri systéme, ktorý vyvinuli Becker a spol. (citácia pozri skôr), s 1 transgénnou rastlinou na 83 embryónov druhu Florida“ podstatne vyšší ako pri systéme ktorý vypracovali Weeks a spol. s 1 až 2 transgénnymi rastlinami na 1 000 embryónov druhu Bohwhite“.
Systém, ktorý vyvinuli Becker a spol. (citácia pozri skôr) tvorí základ transformačných pokusov opísaných v Príkladoch.
Akonáhle sa vložená DNA integruje do genómu, zostáva v ňom uložená spravidla stabilne a zostáva zachovaná i v potomstve pôvodných transformovaných buniek. Obsahuje spravidla jeden z vyššie uvedených selekčných markérov, ktorý zaisťuje transformovaným rastlinným bunkám napr. odolnosť proti biocídnym prostriedkom ako je Phosphinothricin alebo proti antibiotikám ako je kanamycín, G418, Bleomycín alebo Hygromycín alebo umožňuje uskutočňovať selekciu za prítomnosti alebo neprítomnosti určitých cukrov alebo aminokyselín. Individuálne zvolený markér by mal preto umožňovať selekciu transformovaných buniek za bunky, ktorým vložená DNA
31574 T •
• · • · · • · • · • · · • · · • · * * • · · ·· ···· ·· · chýba.
Transformované bunky rastú v rastline normálnym spôsobom (pozri pozri McCormick a spol., Plánt Celí Reports 5 (1986), 81 - 84). Výsledné rastliny je možné normálne pestovať a je možné ich krížiť s rastlinami, ktoré majú rovnaké alebo odlišné dedičné vlastnosti. Takto vzniknuté hybridné indivíduá majú zodpovedajúce fenotypové vlastnosti. Z rastlinných buniek je možné získať semená.
Aby bolo zaistené, že fenotypová vlastnosť zostala zachovaná a že je dedičná, je potrebné uskutočniť pestovanie dvoch alebo niekoľkých generácii. Je potrebné zozbierať i semená, aby bolo zaistené, že zostal zachovaný príslušný fenotyp alebo ostatné charakteristické vlastnosti.
Nasledujúce príklady ilustrujú tento vynález, v žiadnom prípade ho však nevymedzujú.
31574 T ··
Príklady uskutočnenia vvnálezu ·· • · · • · • · · • · ···· ·· ·· • · · · • · · • β · • · · ·· ···· • · ·· ·
Príklad 1
Postup klonovania
Pre klonovanie E.coli bol použitý vektor pBluescript II SK (stratagén).
Príklad 2
Kmene baktérií
Pre vektor Bluescript a pre antisense-konštrukty bol použitý E.coli kmeň DH5cc (Bethesda Laboratories, Gaithersburg, USA). Pre excisiu uskutočnenú in vivo bol použitý E.coli kmeň LX1-Blue.
Príklad 3
Transformácie nezrelých pšeničných embryónov
Médiá:
MS: 100 ml/makrosoľ ml/1 mikrosoľ ml/1 Fe/NaEDTA 30 g/1 sacharóza (D.Becker a H.Lórz,
Plánt Tissue Culture Manual (1996), B 12 : 1 - 20) #30: MS + 2,4-D (2 mg/1) # 31: MS + 2,4-D (2 mg/1) + Phosphinothricín (PPT, aktívny komponent herbicídu BAŠTA (2 mg/1) # 32: MS + 2,4-D (0,1 mg/1) + PPT (2 mg/1) # 39: MS + 2,4-D (2 mg/1) + po 0,5 N mannit/sorbit
V uvedených médiách bola hodnota pH nastavená pomocou ΚΟΗ na 5,6
31574 T a médiá boli stužené 0,3 % prípravku Gelrite.
Metódu transformácie nezrelých embryónov z pšenice vyvinuli a optimalizovali Becker a Lórz, Plánt Tissue Culture Manual (1996), B 12 : 1 až 20).
V ďalej opísaných pokusoch bol dodržovaný protokol, ktorý vypracovali Becker a Lôrz (citácia pozri skôr).
Pre transformáciu boli klasy s karyopsami v stupni vývoja 12 až 14 dní po antézii zberané a povrchovo sterilizované. Izolované skutely boli nanesené s pre médium vhodnými embryónami na indukčné médium # 30.
Po dvojdennej až štvordennej predbežnej kultivácii (26 °C, tma) boli explantáty prevedené na médium # 39 pre osmotickú predbežnú kultiváciu (2 až 4 hodiny, 26 °C, tma).
Pri biolistickej transformácii bolo pre jedno vstrelovanie (Schuss) použité cca 29 pg častíc zlata, na ktoré bolo predtým vyzrážané niekoľko pg cieľovej DNA. Vzhľadom na to, že pri uskutočňovaných pokusoch išlo o kotransformanty, bola cieľová DNA na zrážanie pridávaná s cieľovým génom a rezistentným markérovým génom (bar-Gén) v pomere 1:1.
Príklad 4
DIG-značenie DNA-fragmentov
Značenie DNA- fragmentov použitých ako screeningové sondy bolo uskutočnené pomocou špecifickej PCR s vkladaním DIG-značeného dUTP (Boehringer Mannheim, Nemecko).
Médiá a roztoky použité v príkladoch :
20xSSC 175,3 g NaCI
88,2 g nátriumcitrát doplniť do 1 000 ml redest. vodou úprava na pH 7,0 roztokom 10 N NaOH
31574 T ·· ·· · ·· ·· • · · · • · · • · · • · · ·· ···· ·· ·· • · · · • · · • · · • · · ·· ····
V zbierke mikroorganizmov a bunkových kultúr DSMZ v Braunschweigu, SRN, bolo uskutočnené uloženie plazmidu pTaSSI 8/1 podľa budapešťskej zmluvy pod číslom DSM 12794.
Príklad A
Identifikácia, izolácia a charakterizácia cDNA, kódujúcej rozpustnú škrobovú syntázu (SS I) z pšenice (Triticum aestivum L., odroda Florida)
Na identifikáciu úplnej cDNA, kódujúcej izoformu rozpustnej škrobovej syntázy (SS I) z pšenice, bola použitá stratégia homologického screeningu. Pri tom bola cDNA-banka z pšenice preskúmaná (bol uskutočnený screening) pomocou vhodných oligonukieotidov. SSI-špecifický oligonukleotid, ktorý bol použitý pre screening, bol izolovaný pomocou postupu 5'RAČE (Rapid Amplification of cDNA Ends - rýchla amplifikácia cDNA koncov), ako je opísané ďalej.
Syntéza pšeničnej cDNA-banky bola uskutočnená v poly (A) + RNA z cca 20 dní starých karyopsov (endosperm) vo vektore Lambda Zap II podľa údajov výrobcu (Sada /kit/ pre syntézu Lambda ZAP ll-cDNA, Stratagene GmbH, Heidelberg, Nemecko). Po stanovení titra cDNA-banky bola stanovená hodnota primárneho titra 1,26 x 106 pfu/ml.
Hodnotenie cDNA-banky bolo uskutočnené pomocou sondy SS I z pšenice. Pomocou postupu 5'RACE bol izolovaný fragment DNA a amplifikácia 5'-konca bola uskutočnená pomocou sady 5'-RACE (ďalej len sada -kit“) od firmy Boehringer (Mannheim, Nemecko). Všetky kroky boli uskutočnené podľa údajov výrobcu. Boli použité iba enzýmy a chemikálie z uvedeného kitu, pokiaľ nie je uvedené inak.
Najskôr boli poly(A) + RNA cca dvadsať dní starej karyopsy transkribované v cDNA s jedným reťazcom a bola uskutočnená tailing-reakcia. Vzniknutá cDNA, ktorá mala v oblasti 5'pripojený Oligo(dA)Anker # 9 (Kit), bola pri prvej reakcii sprimérom Oligo(d/T) #8 (Kit) a B2F5 podľa upraveného
31574 T ·· ·· ·· ·· • · · · • · · • · · • · · ·· ···· • · · · • · · • · · · • · · ·· ···· ·· · protokolu ampifikovaná nasledujúcim spôsobom: Do 50 μΙ násady bolo pridané 5 μΙ upravenej cDNA, 5 μΙ 10x reakčného pufru (Life Technologies), 0,25 μΜ priméru B2F5, 0,75 μΜ Oligo(dT) #8, 0,2 mM dNTP a prípravok 5U Taq Polymeráza (rekombinantné, Life Technologies). PCR profil bol nasledujúci:
94’C 3794’C 45”/56’C 1772 °C 1'30” , 29 cyklov/72’C 5'.
Potom nasledovala ďalšia PCR s primérom Oligo(dT) #8 (Kit), B2F5 a vhodným 5'-primérom B2F6. Do 50 μΙ násady bol pridaný 1 μΙ PCR-produktov, 5μΙ 10x reakčného puftu (Life Technologies), 0,25 μΜ B2F5-priméru, 0,25 μΜ B2F6-priméru, 0,75 μΜ B2F5, 0,75 μΜ Oligo(dT) #8, 0,2 mM dNTP a prípravok 5U TAQ Polymeráza (rekombinantná, Life Technologies).
PCR -profil bol nasledujúci:
94°C3794°C 45/60°C 1772’C 1'30” ;
cyklov/72 ’C 5'
B2F5: 5'CCTCCCAATTCAAGGATTAGTG 3'(Seq. ID No. 3)
B2 F6 : 5'CCTCGCATGCAGCATAGCAA 3'(Seq. ID No.4)
PCR-produkty získané podľa uvedených postupov boli rozdelené na agarosovom gély a boli izolované fragmenty DNA s veľkosťou nad 800 bp. Klonovanie týchto PCR-fragmentov bolo uskutočnené pomocou sady pCRScript SK(+) Cloning Kit od firmy Stratagene (Heidelberg). Pomocou sekvenčnej analýzy klonovaných subfragmentov bola identifikovaná dosiaľ neznáma sekvencia klonu SS I s veľkosťou cca 150 bp.
Z oblasti 5 ' tejto novej sekvencie boli vybrané oligonukleotidy B2R00 a B2F6.2 pre amplifikáciu DNA-fragmentu (SS l-sonda), ktorý bol potom označený opísaným spôsobom prípravkom Digoxygenin-11-dUTP a ktorý bol použitý ako sonda pre screening pšeničnej cDNA-banky. Značkovanie tejto SS l-sondy bolo uskutočnené pomocou PCR-reakcie s primérami B2R00 a B2F6.2 podľa údajov v príručke The DIG systém User's Guide for Filter Hybridisation“ (Boehringr Mannheim).
31574 T ·· • · · • · • · • · ·· ·
·· ·· • · · • · • · • · · ·· ····
B2R00 : 5'TGTGGCTGCAAGTGAGGAGG 3'(Seq. ID No. 5)
B2F6.2 5'CCAGTCACAAACACGTAGCTACG 3'(Seq. ID No. 6)
Pre prieskum pšeničnej cDNA-banky bolo nanesené na dosku cca 700,00 fágov. Nanášanie fágov (Ausplattieren) a snímanie (Abziehen) dosiek bolo uskutočnené podľa štandardného protokolu. Predbežná hybridizácia a hybridizácia filtra boli uskutočnené v roztoku, ktorý tvorili 5X SSC, 3 % Bocking (Boehringer Mannheim), 0,2 % nátriumdodecylsulfát (SDS), 0,1 % nátriumlaurylsarkozín a 50 pg/ml DNA sledieho spermatu (Heringssperma) pri 65 °C. Do hybridizačného roztoku bolo pridané 1,3 ng/ml DIG-značené SS Isondy a hybridizácia bola uskutočnená inkubáciou cez noc. Filter bol premytý podľa protokolu opísaného v príručke The DIG systém User's Guide for Filter Hybridisation“ (Boehringer Mannheim) pri teplote 65 °C. Pozitívne klony boli spojené pri dvoch nasledujúcich kolách screeningu. In vivo exciziou boli získané spojené klony ako pBluescript SK Phagemide (uskutočňovanie podľa údajov výrobcu: Stratagene, Heidelberg).
Podľa analýzy tohto klonu pomocou miniprepacácie a reštrikcie PlazmidDNA bol kloň TaSSI 8/1 ďalej analyzovaný.
Príklad 2
Sekvenčná analýza cDNA-inzerciou plazmidu pTaSSI 8/1
Z klonu TaSSI 8/1 bol izolovaný plazmid-DNA a sekvencia cDNAinzercií bola stanovená didezoxynukleotidovou metódou (Sanger a spol., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 74 (1977), 5463-5467). Inzercia klonu TaSSI 8/1 má dĺžku 2805 bp a predstavuje úplnú cDNA. Nukleotidová sekvencia je uvedená pod označením Seq ID No.1. Príslušná sekvencia aminokyselín je uvedená pod označením Seq ID No.2. Z porovnania s už publikovanými sekvenciami vyplynulo, že sekvencia uvedená pod označením Seq No.1 je nová a že zahrňuje úplnú kódujúcu oblasť.
31574 T • · · · • · · • · · · • · · ·· ···· • · • · · • · • · ··
··
Príklad 3
Príprava rastlinného transformačného vektora pTa-gamma-SSI-8/1
Pre expresiu izolovanej cDNA podľa príkladu A bol konštruovaný na základe základného plazmidu pUC19 rastlinný transformačný vektor pTagamma-SSI-8/1. Pri konštrukcii tohto vektora bola cDNA-inzercia plazmidu TaSSI 8/1 úplne spojená v sense-orientácii s 3'-koncom ubiquitinového promótoru. Tento promótor sa skladá z prvého neprenosného exónu (untranslatierter Exon) a prvého intrónu génu ubiquitín 1 z kukurice (Christensen A. H. a spol., Plánt Molecular Biology 18 (1992), 675 - 689). Časti polylinkéru a NOS-terminátora pochádzajú z plazmidu pACTI.cas (CAMBIA, TG 0063; Cambia, GPO Box 3200, Canberra ACT 2601, Austrália). Vektorové konštrukty s týmto terminátorom a konštrukcie založené na pACTI.cas sú opísané v práci MCElroy a spol. (Molecular Breeding 1 (1995), 27 - 37). Takto vzniknutý vektor bol pomenovaný pUbi.cas.
Klonovanie tohto expresného vektora bolo uskutočnené reštrikciou fragmentu z klonu TaSSI 8/1 pomocou reštrikčných enzýmov Xba I a Ssp.l. Tento fragment bol na koncoch doplnený pomocou Klenowovej reakcie a potom bol naviazaný na klonovacie miesto Srna I expresného vektora pUbi.cas. Vzniknutý expresný vektor bol označený pTA-gamma-SSI 8/1. V druhom konštrukte bol 5'-neprenosný leader klonuTaSSI-8/1 najprv odstránený pôsobením exonukleázy. Potom bolo uskutočnené klonovanie v expresnom vektore pUbi.cas. Tento konštrukt bol označený Ta-gamma-SSI-8/1-2.
Vektory pTa-gamma-SS 1-8/1 a pTa-gamma-SSI-8/1-2 boli potom použité pre transformáciu pšenice.

Claims (26)

1. Molekuly nukleových kyselín, kódujúce proteín s funkciou škrobovej syntézy z pšenice, vybrané zo skupiny, ktorú tvoria (a) molekula nukleovej kyseliny, kódujúca proteín, ktorá zahrňuje sekvenciu aminokyselín uvedenú pod Seq ID NO.2.
(b) molekula nukleovej kyseliny, zahrňujúca nukleotidovú sekvenciu uvedenú pod Seq ID NO. 1 alebo jej časť alebo tomu zodpovedajúcu ribonukleotidovú sekvenciu, (c) molekula nukleovej kyseliny, hybridizované s niektorou z molekúl nukleovej kyseliny uvedenej pod (a) alebo (b) alebo je s ňou komplementárna, a (d) molekula nukleovej kyseliny, ktorej nukleotidová sekvencia je na základe degenerácie genetického kódu odlišná od sekvencie molekúl nukleovej kyseliny uvedenej pod (a), (b) alebo (c).
2. Molekula nukleovej kyseliny podľa nároku 1, vyznačujúca sa tým, že ide o molekulu DNA.
3. DNA-molekula podľa nároku 2, vyznačujúca sa tým, že ide o molekulu cDNA.
4. Molekula nukleovej kyseliny podľa jedného alebo viac z nárokov 1 až
3, ktorá obsahuje regulačné prvky.
5. Molekula nukleovej kyseliny podľa nároku 1, vyznačujúca sa tým, že ide o molekulu RNA.
31574 T ·· • · · • · • t • · ·· ·· ·· • · · • · • · · • · ···· • · · • · • · • · ····
6. Molekula nukleovej kyseliny špecificky hybridizovaná s molekulou nukleovej kyseliny podľa niektorého z nárokov 1 až 5.
7. Molekula nukleovej kyseliny podľa nároku 6, ktorá je oligonukleotidom s dĺžkou minimálne 15 nukleotidov.
8. Vektor, obsahujúci DNA-molekulu podľa niektorého z nárokov 1 až 5.
9. Vektor podľa nároku 8, v ktorom je uvedená molekula nukleovej kyseliny spojená s regulačnými prvkami v sense-orientácii, ktorá zaisťuje transkripciu a syntézu prenositeľnej RNA do prokaryontických alebo eukaryontických buniek.
10. Vektor podľa nároku 8, v ktorom je uvedená molekula nukleovej kyseliny spojená s regulačnými prvkami v sense-orientácii, ktorá zaisťuje transkripciu a syntézu neprenositeľnej RNA do prokaryontických alebo eukaryontických buniek.
11. Vektor podľa nároku 8, v ktorom je uvedená molekula nukleovej kyseliny spojená s regulačnými prvkami v antisense-orientácii, ktorá zaisťuje transkripciu a syntézu neprenostieľnej RNA do prokaryontických alebo eukaryontických buniek.
12. Hostiteľská bunka, transformovaná molekulou nukleovej kyseliny podľa jedného alebo viac z nárokov 1 až 5 alebo vektorom podľa jedného alebo viacerých patentových nárokov 8 až 11 alebo bunka z takejto bunky odvodená.
13. Proteín, kódovaný molekulou nukleovej kyseliny podľa jedného alebo viac z nárokov 1 až 4.
14. Spôsob výroby proteínu podľa nároku 13, pri ktorom je hostiteľská bunka podľa nároku 12 kultivovaná za podmienok, umožňujúcich syntézu uvedeného proteínu a tento uvedený proteín sa z kultivovaných buniek a/alebo z kultivačného média izoluje.
31574 T ·· • · · · • · · • · ·
9 · · ·· 9999
9 9
9 9 · • · • · • ·
9999
9 9 9
9 9
9 · ·
9 9
99 9
15. Spôsob výroby transgénnej rastlinnej bunky, pri ktorom sa
a) molekula nukleovej kyseliny podľa jedného alebo viac nárokov 1 až 5 alebo
b) vektor podľa jedného alebo viac nárokov 8 až 11 integruje do genómu rastlinnej bunky.
16. Transgénna rastlinná bunka transformovaná molekulou nukleovej kyseliny podľa jedného alebo viac nárokov 1 až 5 alebo vektorom podľa jedného alebo viac nárokov 8 až 11 alebo bunka z takejto bunky pochádzajúca.
17. Spôsob výroby transgénnej rastlinnej bunky, pri ktorom sa a1) molekula nukleovej kyseliny podľa jedného alebo viac nárokov 1 až 5 alebo a2) vektor podľa jedného alebo viac nárokov 8 až 11 integruje do genómu rastlinnej bunky a
b) z uvedenej rastlinnej bunky sa regeneruje celá rastlina.
18. Rastlina, obsahujúca rastlinnú bunku podľa nároku 16.
19. Rastlina podľa nároku 19, ktorá je monokotylnou alebo dikotylnou rastlinou.
20. Rastlina podľa nároku 19, ktorá je úžitkovou rastlinou.
21. Rastlina podľa nároku 20, ktorá je rastlinou ukladajúcou škrob.
22. Rastlina podľa nároku 21, ktorou je rastlina kukurice, ryže, zemiakov alebo pšenice.
23. Množiteľský materiál rastliny podľa jedného alebo viac nárokov 18 až
22.
31574 T • · · · • · · • · · • · · ·· ···· ·· ·· ·· • · · • · • · · • · ····
24. Škrob, získateľný z rastlinnej bunky podľa nároku 16, z rastliny podľa jedného alebo viac nárokov 18 až 22 alebo z množiteľského materiálu podľa nároku 23.
25. Použitie škrobu podľa nároku 24 na výrobu potravín alebo potravinárskych polotovarov, výhodne pečiva alebo cestovín.
26. Použitie škrobu podľa nároku 24 na výrobu obaľových materiálov alebo výrobkov na jedno použitie.
SK1577-2000A 1998-05-08 1999-05-07 Molekuly nukleových kyselín kódujúce enzýmy z pšenice, ktoré sa podieľajú na syntéze škrobu SK15772000A3 (sk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19820607A DE19820607A1 (de) 1998-05-08 1998-05-08 Nucleinsäuremoleküle codierend Enzyme aus Weizen, die an der Stärkesynthese beteiligt sind
PCT/EP1999/003156 WO1999058688A2 (de) 1998-05-08 1999-05-07 Nucleinsäuremoleküle codierend enzyme aus weizen, die an der stärkesynthese beteiligt sind

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SK15772000A3 true SK15772000A3 (sk) 2001-06-11

Family

ID=7867091

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK1577-2000A SK15772000A3 (sk) 1998-05-08 1999-05-07 Molekuly nukleových kyselín kódujúce enzýmy z pšenice, ktoré sa podieľajú na syntéze škrobu

Country Status (14)

Country Link
US (1) US6890732B1 (sk)
EP (1) EP1095152A2 (sk)
JP (1) JP2002514427A (sk)
KR (1) KR20010043457A (sk)
CN (1) CN1299415A (sk)
AU (1) AU4039199A (sk)
BR (1) BR9910307A (sk)
CA (1) CA2328508A1 (sk)
DE (1) DE19820607A1 (sk)
HU (1) HUP0101833A2 (sk)
NO (1) NO20005614L (sk)
PL (1) PL345092A1 (sk)
SK (1) SK15772000A3 (sk)
WO (1) WO1999058688A2 (sk)

Families Citing this family (183)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070246683A1 (en) * 2006-04-24 2007-10-25 David Paul Miller Reduced dusting gypsum composites and method of making them
CL2007003743A1 (es) * 2006-12-22 2008-07-11 Bayer Cropscience Ag Composicion que comprende fenamidona y un compuesto insecticida; y metodo para controlar de forma curativa o preventiva hongos fitopatogenos de cultivos e insectos.
CL2007003744A1 (es) * 2006-12-22 2008-07-11 Bayer Cropscience Ag Composicion que comprende un derivado 2-piridilmetilbenzamida y un compuesto insecticida; y metodo para controlar de forma curativa o preventiva hongos fitopatogenos de cultivos e insectos.
EP1969934A1 (de) 2007-03-12 2008-09-17 Bayer CropScience AG 4-Cycloalkyl-oder 4-arylsubstituierte Phenoxyphenylamidine und deren Verwendung als Fungizide
EP1969929A1 (de) 2007-03-12 2008-09-17 Bayer CropScience AG Substituierte Phenylamidine und deren Verwendung als Fungizide
EP1969931A1 (de) * 2007-03-12 2008-09-17 Bayer CropScience Aktiengesellschaft Fluoalkylphenylamidine und deren Verwendung als Fungizide
JP2010520900A (ja) 2007-03-12 2010-06-17 バイエル・クロツプサイエンス・アクチエンゲゼルシヤフト フェノキシ置換されたフェニルアミジン誘導体及び殺真菌剤としてのその使用
BRPI0808798A2 (pt) * 2007-03-12 2014-10-07 Bayer Cropscience Ag Fenoxifenilamidinas 3,5-dissubstituídas e seu uso como fungicidas
EP2136627B1 (de) 2007-03-12 2015-05-13 Bayer Intellectual Property GmbH Dihalogenphenoxyphenylamidine und deren verwendung als fungizide
BRPI0810654B1 (pt) * 2007-04-19 2016-10-04 Bayer Cropscience Ag tiadiazoliloxifenilamidinas, seu uso e seu método de preparação, composição e método para combate de micro-organismos indesejados, semente resistente a micro-organismo indesejado, bem como método para proteger a dita semente contra micro-organismos
DE102007045953B4 (de) 2007-09-26 2018-07-05 Bayer Intellectual Property Gmbh Wirkstoffkombinationen mit insektiziden und akariziden Eigenschaften
DE102007045919B4 (de) 2007-09-26 2018-07-05 Bayer Intellectual Property Gmbh Wirkstoffkombinationen mit insektiziden und akariziden Eigenschaften
DE102007045920B4 (de) 2007-09-26 2018-07-05 Bayer Intellectual Property Gmbh Synergistische Wirkstoffkombinationen
DE102007045922A1 (de) * 2007-09-26 2009-04-02 Bayer Cropscience Ag Wirkstoffkombinationen mit insektiziden und akariziden Eigenschaften
DE102007045956A1 (de) * 2007-09-26 2009-04-09 Bayer Cropscience Ag Wirkstoffkombination mit insektiziden und akariziden Eigenschaften
BRPI0818691A2 (pt) * 2007-10-02 2014-09-30 Bayer Cropscience Ag Métodos para melhorar o crescimento vegetal.
EP2090168A1 (de) 2008-02-12 2009-08-19 Bayer CropScience AG Methode zur Verbesserung des Pflanzenwachstums
EP2072506A1 (de) 2007-12-21 2009-06-24 Bayer CropScience AG Thiazolyloxyphenylamidine oder Thiadiazolyloxyphenylamidine und deren Verwendung als Fungizide
EP2113172A1 (de) * 2008-04-28 2009-11-04 Bayer CropScience AG Verfahren zur verbesserten Nutzung des Produktionspotentials transgener Pflanzen
EP2168434A1 (de) 2008-08-02 2010-03-31 Bayer CropScience AG Verwendung von Azolen zur Steigerung der Resistenz von Pflanzen oder Pflanzenteilen gegenüber abiotischem Stress
WO2010017902A1 (de) 2008-08-14 2010-02-18 Bayer Cropscience Aktiengesellschaft Insektizide 4-phenyl-1h-pyrazole
DE102008041695A1 (de) * 2008-08-29 2010-03-04 Bayer Cropscience Ag Methoden zur Verbesserung des Pflanzenwachstums
EP2201838A1 (de) 2008-12-05 2010-06-30 Bayer CropScience AG Wirkstoff-Nützlings-Kombinationen mit insektiziden und akariziden Eigenschaften
EP2198709A1 (de) 2008-12-19 2010-06-23 Bayer CropScience AG Verfahren zur Bekämpfung resistenter tierischer Schädlinge
EP2204094A1 (en) 2008-12-29 2010-07-07 Bayer CropScience AG Method for improved utilization of the production potential of transgenic plants Introduction
CN102333445B (zh) 2008-12-29 2014-09-03 拜尔农作物科学股份公司 改善利用转基因植物生产潜力的方法
EP2223602A1 (de) 2009-02-23 2010-09-01 Bayer CropScience AG Verfahren zur verbesserten Nutzung des Produktionspotentials genetisch modifizierter Pflanzen
EP2039772A2 (en) 2009-01-06 2009-03-25 Bayer CropScience AG Method for improved utilization of the production potential of transgenic plants introduction
EP2039770A2 (en) 2009-01-06 2009-03-25 Bayer CropScience AG Method for improved utilization of the production potential of transgenic plants
EP2039771A2 (en) 2009-01-06 2009-03-25 Bayer CropScience AG Method for improved utilization of the production potential of transgenic plants
US8487118B2 (en) 2009-01-19 2013-07-16 Bayer Cropscience Ag Cyclic diones and their use as insecticides, acaricides and/or fungicides
EP2227951A1 (de) 2009-01-23 2010-09-15 Bayer CropScience AG Verwendung von Enaminocarbonylverbindungen zur Bekämpfung von durch Insekten übertragenen Viren
WO2010086311A1 (en) 2009-01-28 2010-08-05 Bayer Cropscience Ag Fungicide n-cycloalkyl-n-bicyclicmethylene-carboxamide derivatives
AR075126A1 (es) 2009-01-29 2011-03-09 Bayer Cropscience Ag Metodo para el mejor uso del potencial de produccion de plantas transgenicas
CN102317259B (zh) 2009-02-17 2015-12-02 拜尔农科股份公司 杀真菌n-(苯基环烷基)羧酰胺，n-(苄基环烷基)羧酰胺和硫代羧酰胺衍生物
EP2218717A1 (en) 2009-02-17 2010-08-18 Bayer CropScience AG Fungicidal N-((HET)Arylethyl)thiocarboxamide derivatives
TW201031331A (en) 2009-02-19 2010-09-01 Bayer Cropscience Ag Pesticide composition comprising a tetrazolyloxime derivative and a fungicide or an insecticide active substance
DE102009001469A1 (de) 2009-03-11 2009-09-24 Bayer Cropscience Ag Verfahren zur verbesserten Nutzung des Produktionspotentials transgener Pflanzen
DE102009001681A1 (de) 2009-03-20 2010-09-23 Bayer Cropscience Ag Verfahren zur verbesserten Nutzung des Produktionspotentials transgener Pflanzen
DE102009001732A1 (de) 2009-03-23 2010-09-30 Bayer Cropscience Ag Verfahren zur verbesserten Nutzung des Produktionspotentials transgener Pflanzen
DE102009001730A1 (de) 2009-03-23 2010-09-30 Bayer Cropscience Ag Verfahren zur verbesserten Nutzung des Produktionspotentials transgener Pflanzen
DE102009001728A1 (de) 2009-03-23 2010-09-30 Bayer Cropscience Ag Verfahren zur verbesserten Nutzung des Produktionspotentials transgener Pflanzen
US8846567B2 (en) 2009-03-25 2014-09-30 Bayer Cropscience Ag Active compound combinations having insecticidal and acaricidal properties
EP2232995A1 (de) 2009-03-25 2010-09-29 Bayer CropScience AG Verfahren zur verbesserten Nutzung des Produktionspotentials transgener Pflanzen
WO2010108508A2 (de) 2009-03-25 2010-09-30 Bayer Cropscience Ag Wirkstoffkombinationen mit insektiziden und akariziden eigenschaften
MX2011009918A (es) 2009-03-25 2011-10-06 Bayer Cropscience Ag Combinaciones de principios activos propiedades insecticidas y acaricidas.
US9012360B2 (en) 2009-03-25 2015-04-21 Bayer Intellectual Property Gmbh Synergistic combinations of active ingredients
US8828907B2 (en) 2009-03-25 2014-09-09 Bayer Cropscience Ag Active ingredient combinations having insecticidal and acaricidal properties
EP2239331A1 (en) 2009-04-07 2010-10-13 Bayer CropScience AG Method for improved utilization of the production potential of transgenic plants
CN102458125B (zh) 2009-05-06 2015-04-29 拜尔农作物科学股份公司 环戊二酮化合物及其用作杀昆虫剂、杀螨剂和/或杀菌剂的用途
AR076839A1 (es) 2009-05-15 2011-07-13 Bayer Cropscience Ag Derivados fungicidas de pirazol carboxamidas
EP2251331A1 (en) 2009-05-15 2010-11-17 Bayer CropScience AG Fungicide pyrazole carboxamides derivatives
EP2255626A1 (de) 2009-05-27 2010-12-01 Bayer CropScience AG Verwendung von Succinat Dehydrogenase Inhibitoren zur Steigerung der Resistenz von Pflanzen oder Pflanzenteilen gegenüber abiotischem Stress
CN105165832B (zh) 2009-06-02 2019-08-13 拜耳知识产权有限责任公司 琥珀酸脱氢酶抑制剂在控制核盘菌属真菌中的应用
CN103548836A (zh) 2009-07-16 2014-02-05 拜尔农作物科学股份公司 含苯基三唑的协同活性物质结合物
WO2011015524A2 (en) 2009-08-03 2011-02-10 Bayer Cropscience Ag Fungicide heterocycles derivatives
EP2292094A1 (en) * 2009-09-02 2011-03-09 Bayer CropScience AG Active compound combinations
EP2343280A1 (en) 2009-12-10 2011-07-13 Bayer CropScience AG Fungicide quinoline derivatives
CN102725282B (zh) 2009-12-28 2015-12-16 拜尔农科股份公司 杀真菌剂肟基-四唑衍生物
KR20120102133A (ko) 2009-12-28 2012-09-17 바이엘 크롭사이언스 아게 살진균제 히드록시모일-테트라졸 유도체
KR20120102142A (ko) 2009-12-28 2012-09-17 바이엘 크롭사이언스 아게 살진균제 히드록시모일-헤테로사이클 유도체
NZ601341A (en) 2010-01-22 2014-02-28 Bayer Ip Gmbh Acaricide and/or insecticide active substance combinations
WO2011107504A1 (de) 2010-03-04 2011-09-09 Bayer Cropscience Ag Fluoralkyl- substituierte 2 -amidobenzimidazole und deren verwendung zur steigerung der stresstoleranz in pflanzen
CN102933078A (zh) 2010-04-06 2013-02-13 拜耳知识产权有限责任公司 4-苯基丁酸和/或其盐用于提高植物应激耐受性的用途
BR112012025848A2 (pt) 2010-04-09 2015-09-08 Bayer Ip Gmbh uso de derivados do ácido (1-cianociclopropil) fenilfosfínico, os ésteres do mesmo e/ou os sais do mesmo para aumentar a tolerância de plantas a estresse abiótico.
WO2011134911A2 (en) 2010-04-28 2011-11-03 Bayer Cropscience Ag Fungicide hydroximoyl-tetrazole derivatives
JP2013525400A (ja) 2010-04-28 2013-06-20 バイエル・クロップサイエンス・アーゲー 殺菌剤ヒドロキシモイル−複素環誘導体
BR112012027559A2 (pt) 2010-04-28 2015-09-08 Bayer Cropscience Ag composto, composição fungicida e método para controlar os fungos fitopatogênicos de culturas
UA110703C2 (uk) 2010-06-03 2016-02-10 Байєр Кропсайнс Аг Фунгіцидні похідні n-[(тризаміщений силіл)метил]-карбоксаміду
MX2012013897A (es) 2010-06-03 2012-12-17 Bayer Cropscience Ag N[(het)ariletil)]pirazol (tio)carboxamidas y sus analogos heterosustituidos.
BR112012030607B1 (pt) 2010-06-03 2018-06-26 Bayer Cropscience Ag Composto, composição fungicida e método para controlar fungos fitopatogênicos de culturas
AU2011264075B2 (en) 2010-06-09 2015-01-29 Bayer Cropscience Nv Methods and means to modify a plant genome at a nucleotide sequence commonly used in plant genome engineering
EP2580336B1 (en) 2010-06-09 2017-05-10 Bayer CropScience NV Methods and means to modify a plant genome at a nucleotide sequence commonly used in plant genome engineering
EP2595961B1 (en) 2010-07-20 2017-07-19 Bayer Intellectual Property GmbH Benzocycloalkenes as antifungal agents
AU2011298423B2 (en) 2010-09-03 2015-11-05 Bayer Intellectual Property Gmbh Substituted fused pyrimidinones and dihydropyrimidinones
US20140056866A1 (en) 2010-09-22 2014-02-27 Bayer Intellectual Property Gmbh Use of biological or chemical control agents for controlling insects and nematodes in resistant crops
EP2460406A1 (en) 2010-12-01 2012-06-06 Bayer CropScience AG Use of fluopyram for controlling nematodes in nematode resistant crops
CN103338638B (zh) 2010-10-07 2016-04-06 拜尔农科股份公司 包含四唑基肟衍生物和噻唑基哌啶衍生物的杀真菌剂组合物
MX2013004278A (es) 2010-10-21 2013-06-05 Bayer Ip Gmbh N-bencil carboxamidas heterociclicas.
MX2013004286A (es) 2010-10-21 2013-06-05 Bayer Ip Gmbh 1(heterociclico carbonil) piperidinas.
CN103298802B (zh) 2010-11-02 2016-06-08 拜耳知识产权有限责任公司 N-杂芳基甲基吡唑基羧酰胺
BR112013012082A2 (pt) 2010-11-15 2016-07-19 Bayer Ip Gmbh 5-halogenopirazolcarboxamidas
US20130231303A1 (en) 2010-11-15 2013-09-05 Bayer Intellectual Property Gmbh 5-halogenopyrazole(thio)carboxamides
AR083875A1 (es) 2010-11-15 2013-03-27 Bayer Cropscience Ag N-aril pirazol(tio)carboxamidas
EP2460407A1 (de) 2010-12-01 2012-06-06 Bayer CropScience AG Wirkstoffkombinationen umfassend Pyridylethylbenzamide und weitere Wirkstoffe
AP3519A (en) 2010-12-01 2016-01-11 Bayer Ip Gmbh Use of fluopyram for controlling nematodes in crops and for increasing yield
CN103380124A (zh) 2010-12-29 2013-10-30 拜耳知识产权有限责任公司 杀真菌剂肟基-四唑衍生物
EP2474542A1 (en) 2010-12-29 2012-07-11 Bayer CropScience AG Fungicide hydroximoyl-tetrazole derivatives
EP2471363A1 (de) 2010-12-30 2012-07-04 Bayer CropScience AG Verwendung von Aryl-, Heteroaryl- und Benzylsulfonamidocarbonsäuren, -carbonsäureestern, -carbonsäureamiden und -carbonitrilen oder deren Salze zur Steigerung der Stresstoleranz in Pflanzen
EP2494867A1 (de) 2011-03-01 2012-09-05 Bayer CropScience AG Halogen-substituierte Verbindungen in Kombination mit Fungiziden
JP2014513061A (ja) 2011-03-10 2014-05-29 バイエル・インテレクチユアル・プロパテイー・ゲー・エム・ベー・ハー 処理された種子の種子安全性を保護するためのリポキト−オリゴ糖化合物の使用
CN103502238A (zh) 2011-03-14 2014-01-08 拜耳知识产权有限责任公司 杀真菌剂肟基-四唑衍生物
JP2014512358A (ja) 2011-04-08 2014-05-22 バイエル・インテレクチユアル・プロパテイー・ゲー・エム・ベー・ハー 殺菌剤ヒドロキシモイル−テトラゾール誘導体
AR085568A1 (es) 2011-04-15 2013-10-09 Bayer Cropscience Ag 5-(biciclo[4.1.0]hept-3-en-2-il)-penta-2,4-dienos y 5-(biciclo[4.1.0]hept-3-en-2-il)-pent-2-en-4-inos sustituidos como principios activos contra el estres abiotico de las plantas
EP2511255A1 (de) 2011-04-15 2012-10-17 Bayer CropScience AG Substituierte Prop-2-in-1-ol- und Prop-2-en-1-ol-Derivate
AR090010A1 (es) 2011-04-15 2014-10-15 Bayer Cropscience Ag 5-(ciclohex-2-en-1-il)-penta-2,4-dienos y 5-(ciclohex-2-en-1-il)-pent-2-en-4-inos sustituidos como principios activos contra el estres abiotico de las plantas, usos y metodos de tratamiento
AR085585A1 (es) 2011-04-15 2013-10-09 Bayer Cropscience Ag Vinil- y alquinilciclohexanoles sustituidos como principios activos contra estres abiotico de plantas
EP2699093B1 (en) 2011-04-22 2015-11-04 Bayer Intellectual Property GmbH Active compound combinations comprising a carboximide derivative and a fungicidal compound
EP2718443B1 (en) 2011-06-06 2017-11-29 Bayer CropScience NV Methods and means to modify a plant genome at a preselected site
WO2013004652A1 (de) 2011-07-04 2013-01-10 Bayer Intellectual Property Gmbh Verwendung substituierter isochinolinone, isochinolindione, isochinolintrione und dihydroisochinolinone oder jeweils deren salze als wirkstoffe gegen abiotischen pflanzenstress
US9265252B2 (en) 2011-08-10 2016-02-23 Bayer Intellectual Property Gmbh Active compound combinations comprising specific tetramic acid derivatives
BR112014003919A2 (pt) 2011-08-22 2017-03-14 Bayer Cropscience Ag métodos e meios para modificar um genoma de planta
US20140206726A1 (en) 2011-08-22 2014-07-24 Juergen Benting Fungicide hydroximoyl-tetrazole derivatives
EP2561759A1 (en) 2011-08-26 2013-02-27 Bayer Cropscience AG Fluoroalkyl-substituted 2-amidobenzimidazoles and their effect on plant growth
BR112014005262A2 (pt) 2011-09-09 2017-04-04 Bayer Ip Gmbh método para aprimorar um vegetal e utilização de um composto de fórmula (i) ou (ii)
CN103874681B (zh) 2011-09-12 2017-01-18 拜耳知识产权有限责任公司 杀真菌性4‑取代的‑3‑{苯基[(杂环基甲氧基)亚氨基]甲基}‑1,2,4‑噁二唑‑5(4h)‑酮衍生物
BR112014006217B1 (pt) 2011-09-16 2019-01-15 Bayer Intellectual Property Gmbh utilização de acilsulfonamidas para melhorar o rendimento de plantas,método para induzir respostas de regulação de crescimento em plantas úteis ou plantas de cultura e composição.
AU2012307324A1 (en) 2011-09-16 2014-03-06 Bayer Intellectual Property Gmbh Use of phenylpyrazolin-3-carboxylates for improving plant yield
AU2012307322B2 (en) 2011-09-16 2016-07-14 Bayer Intellectual Property Gmbh Use of 5-phenyl- or 5-benzyl-2 isoxazoline-3 carboxylates for improving plant yield
US9226505B2 (en) 2011-09-23 2016-01-05 Bayer Intellectual Property Gmbh 4-substituted 1-phenylpyrazole-3-carboxylic acid derivatives as agents against abiotic plant stress
EP2764101B1 (en) 2011-10-04 2017-03-29 Bayer Intellectual Property GmbH RNAi FOR THE CONTROL OF FUNGI AND OOMYCETES BY INHIBITING SACCHAROPINE DEHYDROGENASE GENE
WO2013050324A1 (de) 2011-10-06 2013-04-11 Bayer Intellectual Property Gmbh Abiotischen pflanzenstress-reduzierende kombination enthaltend 4- phenylbuttersäure (4-pba) oder eines ihrer salze (komponente (a)) und eine oder mehrere ausgewählte weitere agronomisch wirksame verbindungen (komponente(n) (b)
US9617286B2 (en) 2011-11-21 2017-04-11 Bayer Intellectual Property Gmbh Fungicide N-[(trisubstitutedsilyl)methyl]-carboxamide derivatives
MX2014006350A (es) 2011-11-30 2014-06-23 Bayer Ip Gmbh Derivados de n-bicicloalquil- y n-tricicloalquil-(tio)carboxamida fungicidas.
IN2014CN04325A (sk) 2011-12-19 2015-09-04 Bayer Cropscience Ag
EP2797891B1 (en) 2011-12-29 2015-09-30 Bayer Intellectual Property GmbH Fungicidal 3-[(pyridin-2-ylmethoxyimino)(phenyl)methyl]-2-substituted-1,2,4-oxadiazol-5(2h)-one derivatives
US9326515B2 (en) 2011-12-29 2016-05-03 Bayer Intellectual Property Gmbh Fungicidal 3-[(1,3-thiazol-4-ylmethoxyimino)(phenyl)methyl]-2-substituted-1,2,4-oxadiazol-5(2H)-one derivatives
NZ722687A (en) 2012-02-22 2017-03-31 Bayer Ip Gmbh Use of succinate dehydrogenase inhibitors (sdhis) for controlling wood diseases in grape.
PT2819518T (pt) 2012-02-27 2017-12-11 Bayer Ip Gmbh Combinações de compostos activos contendo uma tiazoilisoxazolina e um fungicida
WO2013139949A1 (en) 2012-03-23 2013-09-26 Bayer Intellectual Property Gmbh Compositions comprising a strigolactame compound for enhanced plant growth and yield
CN104245687B (zh) 2012-04-12 2016-12-14 拜尔农科股份公司 作为杀真菌剂的n-酰基-2-(环)烷基吡咯烷和哌啶
CN104244717A (zh) 2012-04-20 2014-12-24 拜尔农科股份公司 N-环烷基-n-[(三取代的甲硅烷基苯基)亚甲基]-(硫代)羧酰胺衍生物
CA2865599C (en) 2012-04-20 2020-10-27 Bayer Cropscience Ag N-cycloalkyl-n-[(heterocyclylphenyl)methylene]-(thio)carboxamide derivatives
WO2013160230A1 (en) 2012-04-23 2013-10-31 Bayer Cropscience Nv Targeted genome engineering in plants
BR112014027643B1 (pt) 2012-05-09 2019-04-24 Bayer Cropscience Ag Pirazole-indanil-carboxamidas.
EP2847171A1 (en) 2012-05-09 2015-03-18 Bayer CropScience AG 5-halogenopyrazole indanyl carboxamides
EP2662360A1 (en) 2012-05-09 2013-11-13 Bayer CropScience AG 5-Halogenopyrazole indanyl carboxamides
EP2662361A1 (en) 2012-05-09 2013-11-13 Bayer CropScience AG Pyrazol indanyl carboxamides
EP2662363A1 (en) 2012-05-09 2013-11-13 Bayer CropScience AG 5-Halogenopyrazole biphenylcarboxamides
EP2662364A1 (en) 2012-05-09 2013-11-13 Bayer CropScience AG Pyrazole tetrahydronaphthyl carboxamides
EP2662370A1 (en) 2012-05-09 2013-11-13 Bayer CropScience AG 5-Halogenopyrazole benzofuranyl carboxamides
EP2662362A1 (en) 2012-05-09 2013-11-13 Bayer CropScience AG Pyrazole indanyl carboxamides
AR091104A1 (es) 2012-05-22 2015-01-14 Bayer Cropscience Ag Combinaciones de compuestos activos que comprenden un derivado lipo-quitooligosacarido y un compuesto nematicida, insecticida o fungicida
EP2871958A1 (en) 2012-07-11 2015-05-20 Bayer CropScience AG Use of fungicidal combinations for increasing the tolerance of a plant towards abiotic stress
US20150216168A1 (en) 2012-09-05 2015-08-06 Bayer Cropscience Ag Use of substituted 2-amidobenzimidazoles, 2-amidobenzoxazoles and 2-amidobenzothiazoles or salts thereof as active substances against abiotic plant stress
EA026839B1 (ru) 2012-10-19 2017-05-31 Байер Кропсайенс Аг Комбинации активных соединений, содержащие карбоксамидные соединения
CA2888556C (en) 2012-10-19 2020-07-07 Bayer Cropscience Ag Method of plant growth promotion using carboxamide derivatives
US20150250176A1 (en) 2012-10-19 2015-09-10 Bayer Cropscience Ag Method for enhancing tolerance to abiotic stress in plants using carboxamide or thiocarboxamide derivatives
JP6104395B2 (ja) 2012-10-19 2017-03-29 バイエル・クロップサイエンス・アクチェンゲゼルシャフト カルボキサミドまたはチオカルボキサミド誘導体を用いる殺菌剤に対して抵抗性の真菌に対する植物の処理方法
WO2014079957A1 (de) 2012-11-23 2014-05-30 Bayer Cropscience Ag Selektive inhibition der ethylensignaltransduktion
EP2735231A1 (en) 2012-11-23 2014-05-28 Bayer CropScience AG Active compound combinations
JP6359551B2 (ja) 2012-11-30 2018-07-18 バイエル・クロップサイエンス・アクチェンゲゼルシャフト 三元殺菌剤混合物
WO2014083033A1 (en) 2012-11-30 2014-06-05 Bayer Cropsience Ag Binary fungicidal or pesticidal mixture
EA030236B1 (ru) 2012-11-30 2018-07-31 Байер Кропсайенс Акциенгезельшафт Тройные фунгицидные и пестицидные смеси
CA3082683A1 (en) 2012-11-30 2014-06-05 Bayer Cropscience Ag Binary fungicidal mixtures
WO2014083031A2 (en) 2012-11-30 2014-06-05 Bayer Cropscience Ag Binary pesticidal and fungicidal mixtures
US20150305334A1 (en) 2012-12-05 2015-10-29 Bayer Cropscience Ag Use of substituted 1-(aryl ethynyl)-, 1-(heteroaryl ethynyl)-, 1-(heterocyclyl ethynyl)- and 1-(cycloalkenyl ethynyl)-cyclohexanols as active agents against abiotic plant stress
EP2740720A1 (de) 2012-12-05 2014-06-11 Bayer CropScience AG Substituierte bicyclische- und tricyclische Pent-2-en-4-insäure -Derivate und ihre Verwendung zur Steigerung der Stresstoleranz in Pflanzen
EP2740356A1 (de) 2012-12-05 2014-06-11 Bayer CropScience AG Substituierte (2Z)-5(1-Hydroxycyclohexyl)pent-2-en-4-insäure-Derivate
WO2014090765A1 (en) 2012-12-12 2014-06-19 Bayer Cropscience Ag Use of 1-[2-fluoro-4-methyl-5-(2,2,2-trifluoroethylsulfinyl)phenyl]-5-amino-3-trifluoromethyl)-1 h-1,2,4 tfia zole for controlling nematodes in nematode-resistant crops
AR093996A1 (es) 2012-12-18 2015-07-01 Bayer Cropscience Ag Combinaciones bactericidas y fungicidas binarias
US9428459B2 (en) 2012-12-19 2016-08-30 Bayer Cropscience Ag Difluoromethyl-nicotinic- tetrahydronaphtyl carboxamides
CN105705490A (zh) 2013-03-07 2016-06-22 拜耳作物科学股份公司 杀真菌的3-{苯基[(杂环基甲氧基)亚氨基]甲基}-杂环衍生物
CN105121650A (zh) 2013-04-02 2015-12-02 拜尔作物科学公司 真核生物中的靶向基因组工程
US9550752B2 (en) 2013-04-12 2017-01-24 Bayer Cropscience Aktiengesellschaft Triazolinthione derivatives
MX2015014365A (es) 2013-04-12 2015-12-07 Bayer Cropscience Ag Derivados de triazol novedosos.
MX358633B (es) 2013-04-19 2018-08-28 Bayer Cropscience Ag Metodo de uso mejorado del potencial de produccion de plantas transgenicas.
JP2016519687A (ja) 2013-04-19 2016-07-07 バイエル・クロップサイエンス・アクチェンゲゼルシャフト バイナリー殺虫または農薬混合物
TW201507722A (zh) 2013-04-30 2015-03-01 Bayer Cropscience Ag 做為殺線蟲劑及殺體內寄生蟲劑的ｎ－（２－鹵素－２－苯乙基）－羧醯胺類
WO2014177514A1 (en) 2013-04-30 2014-11-06 Bayer Cropscience Ag Nematicidal n-substituted phenethylcarboxamides
US9770022B2 (en) 2013-06-26 2017-09-26 Bayer Cropscience Ag N-cycloalkyl-N-[(bicyclylphenyl)methylene]-(thio)carboxamide derivatives
EA201600097A1 (ru) 2013-07-09 2016-06-30 Байер Кропсайенс Акциенгезельшафт Применение выбранных пиридон карбоксамидов или их солей в качестве активных веществ против абиотического стресса растений
WO2015082587A1 (en) 2013-12-05 2015-06-11 Bayer Cropscience Ag N-cycloalkyl-n-{[2-(1-substitutedcycloalkyl)phenyl]methylene}-(thio)carboxamide derivatives
TW201609661A (zh) 2013-12-05 2016-03-16 拜耳作物科學公司 Ｎ－環烷基－ｎ－｛［２－（１－經取代環烷基）苯基］亞甲基｝－（硫代）甲醯胺衍生物
AR101214A1 (es) 2014-07-22 2016-11-30 Bayer Cropscience Ag Ciano-cicloalquilpenta-2,4-dienos, ciano-cicloalquilpent-2-en-4-inas, ciano-heterociclilpenta-2,4-dienos y ciano-heterociclilpent-2-en-4-inas sustituidos como principios activos contra el estrés abiótico de plantas
AR103024A1 (es) 2014-12-18 2017-04-12 Bayer Cropscience Ag Piridoncarboxamidas seleccionadas o sus sales como sustancias activas contra estrés abiótico de las plantas
CN104673923B (zh) * 2015-02-15 2016-10-05 中国农业科学院作物科学研究所 用于小麦淀粉合酶基因TaSSIV等位变异检测的引物SSIV-1b及其检测方法
WO2016166077A1 (en) 2015-04-13 2016-10-20 Bayer Cropscience Aktiengesellschaft N-cycloalkyl-n-(biheterocyclyethylene)-(thio)carboxamide derivatives
WO2016205749A1 (en) 2015-06-18 2016-12-22 The Broad Institute Inc. Novel crispr enzymes and systems
RU2019104918A (ru) 2016-07-29 2020-08-28 Байер Кропсайенс Акциенгезельшафт Комбинации активных соединений и способы защиты материала размножения растений
US20190281828A1 (en) 2016-09-22 2019-09-19 Bayer Cropscience Aktiengesellschaft Novel triazole derivatives
BR112019005668A2 (pt) 2016-09-22 2019-06-04 Bayer Ag novos derivados de triazol
US20190225974A1 (en) 2016-09-23 2019-07-25 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Targeted genome optimization in plants
CN109890204A (zh) 2016-10-26 2019-06-14 拜耳作物科学股份公司 Pyraziflumid用于在种子处理应用中控制核盘菌属种的用途
BR112019011616A2 (pt) 2016-12-08 2019-10-22 Bayer Ag uso de inseticidas no controle de larvas
EP3332645A1 (de) 2016-12-12 2018-06-13 Bayer Cropscience AG Verwendung substituierter pyrimidindione oder jeweils deren salze als wirkstoffe gegen abiotischen pflanzenstress
WO2018108627A1 (de) 2016-12-12 2018-06-21 Bayer Cropscience Aktiengesellschaft Verwendung substituierter indolinylmethylsulfonamide oder deren salze zur steigerung der stresstoleranz in pflanzen
WO2018204777A2 (en) 2017-05-05 2018-11-08 The Broad Institute, Inc. Methods for identification and modification of lncrna associated with target genotypes and phenotypes
WO2019025153A1 (de) 2017-07-31 2019-02-07 Bayer Cropscience Aktiengesellschaft Verwendung von substituierten n-sulfonyl-n'-aryldiaminoalkanen und n-sulfonyl-n'-heteroaryldiaminoalkanen oder deren salzen zur steigerung der stresstoleranz in pflanzen
JP2020535802A (ja) 2017-09-21 2020-12-10 ザ・ブロード・インスティテュート・インコーポレイテッド 標的化核酸編集のための系、方法、及び組成物
US10968257B2 (en) 2018-04-03 2021-04-06 The Broad Institute, Inc. Target recognition motifs and uses thereof
BR112020024615A2 (pt) 2018-06-04 2021-03-02 Bayer Aktiengesellschaft benzoilpirazóis bicíclicos de ação herbicida
CN113544266A (zh) 2018-12-17 2021-10-22 博德研究所 Crispr相关转座酶系统和其使用方法

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9524938D0 (en) * 1995-12-06 1996-02-07 Zeneca Ltd Modification of starch synthesis in plants
DE19619918A1 (de) 1996-05-17 1997-11-20 Planttec Biotechnologie Gmbh Nucleinsäuremoleküle codierend lösliche Stärkesynthasen aus Mais
DE19636917A1 (de) * 1996-09-11 1998-03-12 Hoechst Schering Agrevo Gmbh Nucleinsäuremoleküle codierend Enzyme aus Weizen, die an der Stärkesynthese beteiligt sind
DE19621588A1 (de) * 1996-05-29 1997-12-04 Hoechst Schering Agrevo Gmbh Nucleinsäuremoleküle codierend Enzyme aus Weizen, die an der Stärkesynthese beteiligt sind
CZ389098A3 (cs) * 1996-05-29 1999-02-17 Hoechst Schering Agrevo Gmbh Molekuly nukleové kyseliny kódující enzymy z pšenice účastnící se syntézy škrobu
EP0935665B1 (en) * 1996-09-30 2008-03-19 BASF Plant Science GmbH Encapsulation of polypeptides within the starch matrix
ATE417924T1 (de) * 1997-09-12 2009-01-15 Commw Scient Ind Res Org Regulation der genexpression in pflanzen

Also Published As

Publication number Publication date
WO1999058688A3 (de) 2000-01-13
HUP0101833A2 (hu) 2001-10-28
BR9910307A (pt) 2001-01-09
JP2002514427A (ja) 2002-05-21
CA2328508A1 (en) 1999-11-18
NO20005614D0 (no) 2000-11-07
KR20010043457A (ko) 2001-05-25
PL345092A1 (en) 2001-12-03
EP1095152A2 (de) 2001-05-02
DE19820607A1 (de) 1999-11-11
NO20005614L (no) 2001-01-04
AU4039199A (en) 1999-11-29
US6890732B1 (en) 2005-05-10
CN1299415A (zh) 2001-06-13
WO1999058688A2 (de) 1999-11-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
SK15772000A3 (sk) Molekuly nukleových kyselín kódujúce enzýmy z pšenice, ktoré sa podieľajú na syntéze škrobu
US6791010B1 (en) Nucleic acid molecule coding for beta-amylase, plants synthesizing a modified starch, method of production and applications
US6794558B1 (en) Nucleic acid module coding for αglucosidase, plants that synthesize modified starch, methods for the production and use of said plants, and modified starch
US6951969B1 (en) Nucleic acid molecules which code for enzymes derived from wheat and which are involved in the synthesis of starch
US6590141B1 (en) Nucleic acid molecules from plants encoding enzymes which participate in starch synthesis
EP1681352B1 (en) Nucleic acid molecules encoding enzymes from wheat which are involved in starch synthesis
US6686514B2 (en) Nucleic acid molecules encoding starch phosphorylase from maize
KR20000011160A (ko) 가용성 옥수수 전분 신타아제를 코딩하는 핵산분자
CZ20004154A3 (cs) Molekuly nukleových kyselin kódující enzymy z pšenice, které se podílejí na syntéze škrobu
CZ20004155A3 (cs) Molekuly nukleových kyselin kódující enzymy z pšenice, které se podílejí na syntéze škrobu
MXPA00010987A (en) Nucleic acid molecules which code for enzymes derived from wheat and which are involved in the synthesis of starch
AU2004200536A1 (en) Nucleic acid molecules