JP2003517270A - デンプン合成に関連するコムギの酵素をコードする核酸分子 - Google Patents

デンプン合成に関連するコムギの酵素をコードする核酸分子

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、酵素をコードし植物でデンプンの合成に関連する核酸分子に関する。これらの酵素はコムギに由来するイソアミラーゼと関係を有する。本発明はまた、記載の核酸分子を含むベクターおよびホスト細胞、特に形質転換植物細胞およびそれらから再生される植物に関する。これらは、本発明のイソアミラーゼの活性の増加または低下を示す。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、植物のデンプン合成に関連するコムギの酵素をコードする核酸分子
に関する。本酵素はイソアミラーゼである。 さらに本発明は、本発明の核酸分子を含むベクター、ホスト細胞、植物細胞お
よび植物に関する。 さらにまた、本発明は遺伝子導入植物の製造方法を開示する。本遺伝子導入植
物は、本発明の核酸分子の導入により、性質が改変されたデンプンを合成する。
【０００２】 再生可能な原料として最近の植物成分に対する重要性の高まりのために、バイ
オテクノロジー研究の目的の１つは、加工産業のニーズにこれら植物性原料を対
応させることに向けられている。さらにまた、可能なかぎり多くの分野で再生可
能な原料の使用を可能にするために、多様な物質が創出されねばならない。 油、脂肪および蛋白質は別として、多糖類は植物の重要な再生可能な原料であ
る。セルロースは別として、デンプン（これは高等植物の最も重要な貯蔵物質の
１つである）は、多糖類の中では中心的な位置を占める。この場合、コムギは、
ヨーロッパ共同体で全デンプン生産の約２０％を供給するので最も重要な農作物
の１つである。
【０００３】 多糖類のデンプンは、化学的に均一な単位であるグルコース分子で構成された
ポリマーである。しかしながら、このデンプンは、重合度、グルコース鎖の分枝
の出現およびその鎖の長さが異なる種々の分子タイプの非常に複雑な混合物で、
さらに例えば燐酸化のように誘導されることがある。したがって、デンプンは均
一な原料を構成しない。特に、アミロースデンプンとアミロペクチンデンプンと
は区別される。前者は、本質的にアルファ−１,４−グリコシドとして連結した
グルコース分子の非分枝ポリマーで、後者は種々の分枝を有するグルコース鎖の
複雑な混合物を構成する。分枝はさらに別のアルファ−１,６−グリコシド結合
の出現によって発生する。コムギでは、アミロースデンプンは合成されるデンプ
ンの約１１〜３７％を構成する。
【０００４】 可能なもっとも広範囲の産業ニーズに対応してもっとも広範囲の可能な態様で
適切なデンプンの使用を可能にするために、多様な目的に特に適した改変デンプ
ンを合成することができる植物を提供することが望ましい。そのような植物を提
供する１つの可能性は、植物育種法を利用することである。しかしながら、コム
ギは特性として倍数体（４倍体および６倍体）であるので、植物育種による影響
の発揮は非常に困難であることが証明されている。“ワックス質（waxy)"（アミ
ロース非含有）コムギが、ごく最近天然に存在する変異体を交雑することによっ
て創出された（Nakamura et al., Mol. Gen. Genet. 248:253-259(1995))。
【０００５】 植物育種法に対する別の選択肢は、遺伝子組換え法によるデンプン産生植物の
特異的改変である。しかしながら、前提条件は、デンプン合成および／またはデ
ンプン改変に関連する酵素の特定並びに性状決定、並びにこれらの酵素をコード
する核酸分子の単離である。
【０００６】 デンプンの合成につながる生化学的経路は本質的に知られている。植物細胞の
デンプン合成は色素体で生じる。光合成活性を有する組織では、これらの色素体
はクロロプラストで、光合成活性をもたない場合は、デンプン貯蔵組織はアミロ
プラストである。
【０００７】 遺伝子組換え法による植物で合成されたデンプンの分枝の程度の更なる特異的
改変にもＤＮＡ配列の特定が必要である。このＤＮＡ配列はデンプン代謝、特に
デンプン分子内の分枝の導入または分解に関連する酵素をコードする。
【０００８】 いわゆるＱ酵素の他に（Ｑ酵素はデンプン分子に分枝を導入する）、分枝を分
解することができる酵素が植物に存在する。これらの酵素は脱分枝酵素と呼ばれ
、それらの基質特異性にしたがって以下の３つの群に分類される。 (ａ) プルラナーゼ（これはプルランの他にアミロペクチンも基質として利用
する）は、微生物（例えばクレブシーラ属（Klebsiella))および植物で見出され
る。植物では、これらの酵素はまたＲ酵素と称される。 (ｂ) イソアミラーゼ（これはプルランを利用しないが、グリコーゲンおよび
アミロペクチンを基質として利用する）は、微生物および植物でも見出される。
例えば、イソアミラーゼはトウモロコシ（Manners & Carbohydr. Res. 9:107 (1
969)）およびジャガイモ（Ishizaki et al., Agric. Biol. Chem. 47:771-779 (
1983)）で報告された。 (ｃ) アミロ−１,６−グルコシダーゼは哺乳類および酵母で報告され、グレ
ンズデキストリンを基質として利用する。
【０００９】 サトウダイコンでは、５つのエンドアミラーゼおよび２つのエキソアミラーゼ
の他にプルラナーゼ型の脱分枝酵素が１つ見出されただけである（Li et al., P
lant Physiol. 98:1277-1284(1992)）。この酵素（そのサイズは約１００kＤで
至適pＨは５.５である）はクロロプラストに局在する。ホウレンソウでもまた、
基質としてプルランを利用する脱分枝酵素が報告された。基質としてアミロペク
チンと反応する場合のホウレンソウの脱分枝酵素およびサトウダイコンの脱分枝
酵素の両方の活性は、基質としてプルランと比較したとき５倍低い（Ludwig et
al., Plant Physiol. 74:856-861 (1984); Li et al., Plant Physiol. 98:1277
-1284 (1992))。
【００１０】 農耕学的に重要なデンプン貯蔵農作物のジャガイモで脱分枝酵素の活性が調べ
られ（Hobson et al., J. Chem. Soc. 1451 (1951))、Ｑ酵素と対照的に、この
酵素は鎖の伸長活性をもたないが、単にアルファ−１,６−グリコシド結合を加
水分解するということを証明できた。しかしながら、これまでのところ詳細にこ
の酵素の性状を決定することは不可能であった。ジャガイモの場合、脱分枝酵素
の精製工程および当該精製蛋白質の部分的ペプチド配列は既に提唱されている（
ＷＯ９５／０４８２６）。一方、ホウレンソウの事例では脱分枝酵素の精製およ
び適切なｃＤＮＡの単離が報告された（Renz et al., Plant Physiol. 108:1342
(1995)）。
【００１１】 トウモロコシでは、今までのところ１つの脱分枝酵素の存在が文献に報告され
ているだけである。その基質特異性のために、この酵素はイソアミラーゼの群に
属するものとして分類されている（例えば以下の文献を参照されたい：Hannah e
t al., Scientia Horticulturae 55: 177-197 (1993); Garwood (1994), in Sta
rch Chemistry and Technology, R.L. Whistler, J.N. BeMiller, E.F. Puschal
l(eds.), Academic Press San Diego, New York, Boston, 25-86)。対応する変
異体は“甘味質（Sugary)"と称される。甘味質遺伝子座の遺伝子は最近クローニ
ングされた（James et al., Plant Cell 7:417-429 (1995)）。トウモロコシで
は、これまでのところこの甘味質遺伝子座の他には脱分枝酵素活性をもつ蛋白質
をコードする他の遺伝子座は知られていない。さらにまた、他の脱分枝酵素形態
がトウモロコシで存在するという示唆は今日まで得られていない。いずれにして
も、例えばアミロペクチンデンプンの分枝の程度を拡張するために、脱分枝酵素
活性をもはや全くもたない遺伝子導入トウモロコシを作製しようとするならば、
トウモロコシに存在する全ての脱分枝酵素形態を特定し、さらに対応する遺伝子
またはｃＤＮＡ配列を単離する必要がある。
【００１２】 任意のデンプン貯蔵植物、好ましくは穀類、特にコムギを改変する（したがっ
て改変デンプンを製造できるように）また別の可能性を提供するために、各々の
事例で分枝酵素のまた別のアイソフォームをコードするＤＮＡ配列を特定する必
要がある。
【００１３】 したがって、本発明の目的は、デンプン合成に関連する酵素をコードする核酸
分子を提供することである。この核酸は、その化学的および／または物理的性状
が改変された植物デンプンの産生を可能にする遺伝的に改変された植物の作製を
可能にする。 この目的は、本発明の特許請求の範囲に示した使用形態を提供することによっ
て達成される。
【００１４】 したがって、本発明は、コムギのイソアミラーゼの機能をもつ蛋白質、好まし
くは配列番号３または７に示すアミノ酸配列によって本質的に規定される蛋白質
をコードする核酸分子に関する。特に、本発明は、配列番号１、２もしくは６に
示したヌクレオチド配列またはその部分を含む核酸分子、好ましくは配列番号１
、２または６に示したコード領域を含む分子および対応するリボヌクレオチド配
列を含む分子に関する。特に好ましいものは、転写および適切な場合には当該核
酸分子の翻訳を確実にする調節エレメントをさらに含む核酸分子である。さらに
本発明の主題は、本発明の核酸分子の１つとハイブリダイズする核酸分子である
。
【００１５】 また本発明の主題はコムギのイソアミラーゼをコードする核酸分子であって、
その配列が遺伝コードの縮重のために上記の分子のヌクレオチド配列から外れた
ものである。 本発明はまた、上記の配列の１つの全体または部分と相補的な配列を有する核
酸分子に関する。
【００１６】 本明細書で用いられる“ハイブリダイゼーション”という用語は、通常のハイ
ブリダイゼーション条件下、好ましくはストリンジェントな条件下、例えば下記
文献に記載されているような条件下（Sambrook et al., Molecular Cloning, A
Laboratory Manual, 2nd Ed.(1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, C
old Spring Harbor, NY）でのハイブリダイゼーションを指す。
【００１７】 “ハイブリダイゼーション”は、特に好ましくは以下の条件下で実施される: ハイブリダイゼーション緩衝液：２×ＳＳＣ；１０×デンハルト溶液（フィコ
ール４００＋ＰＥＧ＋ＢＳＡ（比率１：１：１）；０.１％ＳＤＳ；５mＭのＥＤ
ＴＡ；５０mＭのＮａ2ＨＰＯ4；２５０μｇ／mlのニシン精子ＤＮＡ；５０μg／
mlのｔＲＮＡ；または０.２５Ｍ燐酸ナトリウム緩衝液（pＨ７.２）；１mＭ Ｅ
ＤＴＡ；７％ＳＤＳ ハイブリダイゼーションの温度：Ｔ＝６５〜７０℃ 洗浄緩衝液：０.２×ＳＳＣ；０.１％ＳＤＳ 洗浄温度：Ｔ＝４０〜７５℃
【００１８】 本発明の核酸分子とハイブリダイズする核酸分子は、原則としてイソアミラー
ゼを発現する任意のコムギ植物に由来するそのような蛋白質をコードすることが
できる。 本発明の分子とハイブリダイズする核酸分子は、例えばコムギまたはコムギ植
物組織のゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーから単離できる。また
別には、それらは遺伝子組換え法によって作製するか、または化学的に合成でき
る。
【００１９】 そのような核酸分子の特定および単離は、本発明の分子またはこれらの分子の
部分またはこれらの分子の逆相補体を用いて、例えば標準的方法によるハイブリ
ダイゼーションの手段によって実施できる（例えば以下の文献を参照されたい：
Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Ed.(1989),
Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)。
【００２０】 使用できるハイブリダイゼーションプローブは、例えば、正確にまたは本質的
に配列番号１、２もしくは６に記載されたヌクレオチド配列、またはこれら配列
の部分を有する核酸分子である。ハイブリダイゼーションプローブとして用いら
れるフラグメントはまた、通常の合成技術により製造した合成フラグメントであ
って、その配列が本質的に本発明の核酸分子の配列と一致する合成フラグメント
でもよい。
【００２１】 本発明の核酸分子とハイブリダイズする分子はまた、本発明のコムギのイソア
ミラーゼをコードする上記の核酸分子のフラグメント、誘導体および対立遺伝子
変種を包含する。フラグメントとは、記載の蛋白質の１つをコードするために十
分な長さを有する核酸分子の部分を指すと理解されるべきである。本明細書では
誘導体とは、これらの分子の配列が、１つまたは２つ以上の位置で上記の核酸分
子と異なり、さらにこれらの配列と高度な相同性を有することを意味する。相同
性とは、配列特異性が少なくとも４０％、特に少なくとも６０％、好ましくは８
０％以上、特に好ましくは９０％以上であることを意味する。上記の核酸分子に
対して誘導体は、欠失、置換、挿入または組換えによって作製されたものである
。
【００２２】 相同性とはさらに、機能的および／または構造的同等性が問題の核酸分子間、
またはそれらによってコードされた蛋白質間に存在することを意味する。上記の
分子と相同で、さらにこれら分子の誘導体を構成する核酸分子は一般にこれら分
子の変種で、同じ生物学的機能を示す改変物を構成する。それらは天然に存在す
る変種（例えば他の生物に由来する配列）であるか、または突然変異体（天然に
存在していたか、または誘導変異によって導入されたもの）である。さらにまた
、これら変種は合成によって生成された配列でもよい。対立遺伝子変種は、天然
に存在する変種および合成によって生じた変種または遺伝子組換えＤＮＡ技術に
よって生じた変種の両方である。
【００２３】 本発明の核酸分子の種々の変種によってコードされるイソアミラーゼはある種
の性状を共有する。これらには、例えば酵素活性、分子量、免疫学的反応性、配
座など、または他の物理的特性（例えばゲル電気泳動での泳動態様、クロマトグ
ラフィーの挙動、沈降係数、可溶性、分光特性、荷電特性、安定性、至適ｐＨ、
至適温度など）が含まれる。
【００２４】 本発明の核酸分子によってコードされる蛋白質はコムギのイソアミラーゼであ
る。これらの蛋白質は、既に判明している他の植物種由来のイソアミラーゼとあ
る種の相同性の範囲を示す。
【００２５】 本発明の核酸分子は、ＤＮＡ分子、特にｃＤＮＡまたはゲノム分子である。さ
らにまた、本発明の核酸分子はＲＮＡ分子でもよく、これは、例えば本発明の核
酸分子の転写から得ることができる。本発明の核酸分子は、例えば天然の供給源
から得てもよいし、それらはまた遺伝子組換え技術によって作製するか、または
合成してもよい。
【００２６】 本発明の主題はまた、本発明の核酸分子と特異的にハイブリダイズするオリゴ
ヌクレオチドである。そのようなオリゴヌクレオチドは、好ましくは少なくとも
１０ヌクレオチドの長さ、特に少なくとも１５ヌクレオチド、特に好ましくは少
なくとも５０ヌクレオチドの長さを有する。本発明のオリゴヌクレオチドは本発
明の核酸分子と特異的にハイブリダイズする：すなわち、他の蛋白質（特に他の
イソアミラーゼ）をコードする核酸配列とはハイブリダイズしないか、または極
めて低いレベルでハイブリダイズするだけである。本発明のオリゴヌクレオチド
は、例えばＰＣＲ反応のプライマーとして、または関連遺伝子の単離のためのハ
イブリダイゼーションプローブとして用いることができる。同様に、それらはア
ンチセンス構築物の構成成分または適切なリボザイムをコードするＤＮＡ分子の
構成成分でもよい。
【００２７】 本発明はさらにベクター、特にプラスミド、コスミド、ファージミド、ウイル
ス、バクテリオファージおよび、上記の本発明の核酸分子を含む遺伝子工学で普
通に用いられる他のベクターに関する。そのようなベクターは、原核細胞または
真核細胞、好ましくは植物細胞の形質転換に適している。
【００２８】 本ベクターは、特に好ましくは本発明の核酸分子の組込みを、適切な場合は隣
接する調節領域と一緒に植物細胞のゲノムへの組込みを許容する。それらベクタ
ーの例は、アグロバクテリア菌仲介遺伝子移転で用いられるバイナリーベクター
である。好ましくは、本発明の核酸分子のセンスまたはアンチセンス方向での組
込みは、翻訳可能な、または適切な場合には非翻訳性ＲＮＡが、形質転換原核細
胞または真核細胞で合成されることを確実にする。
【００２９】 “ベクター”という用語は、一般に、一本鎖または二本鎖核酸分子をホスト細
胞に誘導移転させる当業者に既知の適切な補助物を指し、例えばＤＮＡまたはＲ
ＮＡウイルス、ウイルスフラグメント、プラスミド構築物で、これらは調節エレ
メントを含むかまたは含まずに細胞内に核酸を移転させるために適している。さ
らに、例えば粒子銃法で用いることができるグラスファイバーまたは他の金属粒
子のような支持物質が上記の補助物質に含まれるが、また化学的もしくは物理的
方法によって細胞に直接導入できる核酸分子も包含される。
【００３０】 好ましい実施態様では、ベクター内の核酸分子は調節エレメントに連結され、
これらエレメントは、原核細胞または真核細胞内で翻訳可能なＲＮＡの転写およ
び合成を確実にし、さらにまた所望の場合は非翻訳性ＲＮＡの合成を確実にする
。
【００３１】 原核細胞、例えば大腸菌（Escherichia coli）での本発明の核酸分子の発現は
、これら分子によってコードされる酵素の酵素活性のより詳細な性状決定のため
に重要である。特に、植物細胞内でのデンプン合成に関連する他の酵素の非存在
下で問題の酵素によって合成される生成物の性状を決定することが可能である。
これによって、問題の蛋白質が植物細胞内でのデンプン合成時に発揮する機能を
決定することができる。
【００３２】 さらに、分子生物学の慣習的技術を用いて種々のタイプの突然変異を本発明の
核酸分子に導入し（例えば以下の文献を参照されたい：Sambrook et al., Molec
ular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Ed.(1989), Cold Spring Harbor Lab
oratory Press, Cold Spring Harbor, NY) 、その生物学的特性が改変された蛋
白質を合成できる。可能なものは、一方では欠失変異の作製である。この変異で
は、核酸分子はコードＤＮＡ配列の５′末端または３′末端からの連続的な欠失
によって作製され、対応する切端形蛋白質が合成される。ヌクレオチド配列の５
′末端のそのような欠失は、例えば色素体への当該酵素の転座に関連するアミノ
酸配列（輸送ペプチド）の特定を可能にする。このような手段によって、問題の
配列の除去のためにもはや色素体に局在しない（しかしサイトゾルに局在する）
か、または他のシグナル配列の付加のために他の区画に局在する酵素の生成を誘
導することができる。
【００３３】 他方では、改変アミノ酸配列が、例えば酵素活性または酵素の調節に影響を与
える位置で点変異を誘導することもまた可能である。この態様で、例えば改変Ｋ m 値をもつ変異体、またはもはやアロステリック調節または細胞に通常存在する
共有結合の修飾による調節メカニズムに従わない変異体を作製することが可能で
ある。
【００３４】 さらにまた、本発明の蛋白質の基質特異性または生成物特異性が改変された変
異体を作製することが可能である。さらにまた、本発明の蛋白質の活性−温度プ
ロフィールが改変された変異体を作製することが可能である。
【００３５】 原核細胞の遺伝子組換え改変を実施するために、本発明の核酸分子またはこれ
らの分子の部分を、突然変異をもたらすか、またはＤＮＡ配列を組み換えること
によって配列を改変することができるプラスミドに導入することができる。塩基
交換を実施するか、または天然もしくは合成配列を標準的な方法を用いて付加す
ることができる（例えば以下を参照：Sambrook et al., Molecular Cloning, A
Laboratory Manual, 2nd Ed.(1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, N
Y, USA)。ＤＮＡフラグメントを互いに連結するために、アダプターまたはリン
カーをフラグメントに付加できる。さらに、適切な制限切断部位を提供する操作
、または過剰なＤＮＡもしくは制限切断部位を除去する操作を利用できる。挿入
、欠失または置換が適切な場合は、in vitro変異誘発、プライマー修復、制限も
しくは連結を用いることができる。一般に用いられる分析方法は配列分析、制限
分析または生化学的もしくは分子生物学的な他の方法である。
【００３６】 さらに別の実施態様では、本発明は、上記の本発明の核酸分子または本発明の
ベクターによって形質転換されるホスト細胞、特に原核細胞または真核細胞に関
し、さらにこのように形質転換された細胞に由来し、本発明の核酸分子またはベ
クターを含む細胞に関する。それら細胞は、好ましくは原核細胞または真核細胞
、特に植物細胞である。
【００３７】 さらにまた、本発明の主題は、本発明の核酸分子によってコードされ、遺伝子
組換え技術によって製造されるイソアミラーゼ活性を有する蛋白質、およびそれ
らの製造方法である。本方法では、本発明のホスト細胞が、本発明の蛋白質の合
成が許容される当業者に既知の適切な条件下で培養され、続いてホスト細胞およ
び／または培地から当該蛋白質が単離される。
【００３８】 本発明の核酸分子の提供は、遺伝子組換え技術を利用して、植物のデンプン代
謝に誘導的態様で介入し、さらに物理化学的特性（例えばアミロース／アミロペ
クチン比、分枝度、鎖の平均長、燐酸含有量、ゼラチン化挙動、ゲルもしくはフ
ィルム形成特性、デンプン顆粒サイズおよび／またはデンプン顆粒形態）が既知
のデンプンと比較して改変されるように改変することを可能にする。
【００３９】 したがって、問題のイソアミラーゼの活性を高めるために、さらにこの酵素を
天然には発現しない細胞に本発明の核酸分子を導入するために、本発明の核酸分
子を植物細胞で発現させることが可能である。本発明の核酸分子の発現はまた、
植物細胞で本発明のイソアミラーゼ天然の活性レベルを低下させることを可能に
する。さらにまた、もはや細胞の固有の調節メカニズムに従わないか、または温
度−活性プロフィールまたは基質もしくは生成物特異性が改変された本発明のイ
ソアミラーゼを得るために、当業者に既知の方法によって本発明の核酸分子を改
変することが可能である。
【００４０】 植物で本発明の核酸分子を発現させる場合、原則として合成された蛋白質を植
物細胞の任意の所望区画に局在させることが可能である。特定の区画への局在を
達成するために、色素体への局在を確実にさせる配列を除去し、残存コード領域
を、必要な場合には問題の区画への局在を確実にするＤＮＡ配列に連結しなけれ
ばならない。そのような配列は知られている（例えば以下を参照されたい：Brau
n et al., EMBO J. 11:3219-3227 (1992); Wolter et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 85:846-850 (1988); Sonnewald et al., Plant J. 1:95-106 (1991)
）。
【００４１】 したがって本発明は、本発明の核酸分子またはベクターで形質転換した遺伝子
導入植物細胞（本発明の核酸分子または本発明のベクターが植物細胞のゲノムに
組み込まれている）を作製する方法、本発明のベクターまたは核酸分子によって
形質転換された遺伝子導入植物細胞、およびそのようにして形質転換された細胞
から派生した遺伝子導入植物細胞に関する。本発明の細胞は、本発明の１つまた
は２つ以上の核酸分子またはベクターを含み、これら核酸分子またはベクターは
、好ましくは植物細胞での転写を確実にする調節ＤＮＡエレメント、特に適切な
プロモーターに連結されている。そのような細胞は、天然に存在する植物細胞と
は、とりわけこれらの細胞中に天然には存在しない本発明の核酸分子をそれらが
含むという事実、または、そのような分子がそうでなければ決して存在しない（
すなわち異なるゲノム環境下では決して存在しない）細胞ゲノム内のある位置に
そのような分子が組み込まれて存在するとう事実によって区別される。
【００４２】 さらにまた、本発明のそのような遺伝子導入植物は、天然に存在する植物細胞
とは、それらが少なくとも１つの本発明の核酸分子コピーを（適切な場合には細
胞内に天然に存在するそのような分子の他に）安定に組み込まれた状態でゲノム
内に含むという事実によって区別される。細胞内に導入される核酸分子が、既に
細胞内に天然に存在する分子に対してさらに別に付加されたコピーである場合、
本発明の植物細胞は、天然に存在する植物細胞とは、特にこの付加コピー（また
はこれらの付加コピー）が、天然に存在しないゲノム内の位置に局在していると
いう事実によって、またはそれらは天然には存在しないという事実によって区別
される。これらは、例えばサザンブロット分析を利用してチェックすることがで
きる。
【００４３】 植物のゲノムに導入した本発明の核酸分子が当該植物細胞に対して異種である
場合、この遺伝子導入植物細胞は、当業者に既知の方法（例えばノザンブロット
分析）によって簡単な態様で検出可能な本発明の核酸分子の転写を明示する。
【００４４】 導入される本発明の核酸分子が植物細胞にとって同種である場合は、本発明の
細胞は、天然に存在する細胞とは例えば本発明の核酸分子の更なる発現を基準に
して区別することができる。遺伝子導入植物細胞は、好ましくは本発明の核酸分
子のより多くの転写物を含む。これは、例えばノザンブロット分析によって検出
できる。この場合”より多く”とは、対応する非形質転換細胞よりも好ましくは
少なくとも１０％以上、好ましくは少なくとも２０％以上、特に好ましくは少な
くとも５０％以上の転写物を意味する。更に好ましくはこれら細胞は、本発明の
蛋白質の活性の対応する増加または減少（少なくとも１０％、２０％または５０
％）を示す。遺伝子導入植物細胞は、当業者に既知の技術によって完全な植物体
に再生できる。
【００４５】 本発明のまた別の主題は、本発明の１つまたは２つ以上の核酸分子またはベク
ターが植物細胞のゲノムに組み込まれ、完全な植物が当該細胞から再生される、
遺伝子導入植物の作製方法である。さらに本発明の主題は上記の核酸導入植物細
胞を含む植物である。原則として、遺伝子導入植物は任意の種の植物、すなわち
単子葉植物だけではなく双子葉植物でもある。それらは、好ましくは有用な植物
、特にデンプン合成またはデンプン貯蔵植物、特に好ましくはライムギ、オオム
ギ、コムギ、モロコシ、アワ、サゴ、トウモロコシ、コメ、エンドウマメ、マロ
ーファットエンドウマメ、カッサバ、ジャガイモ、トマト、ナタネ、ダイズ、ア
サ、アマ、ヒマワリ、ササゲまたはクズウコン、特にコムギ、トウモロコシ、コ
メおよびジャガイモである。
【００４６】 本発明はまた本発明の植物の増殖物、例えば果実、種子、塊茎、根茎、苗木、
切り枝、カルス、プロトプラスト、細胞培養などに関する。 本発明はまた、本発明の上記の植物および／またはそのような植物のデンプン
貯蔵部分からデンプンを抽出する工程を含む改変デンプンの製造方法に関する。
【００４７】 植物（特にコムギ）または植物のデンプン貯蔵部分からデンプンを抽出する方
法は当業者には知られており、例えば以下のとおりである：Eckhoff et al., Ce
real Chem. 73:54-57 (1996); “Starch: Chemistry and Technology", Whistle
r, BeMiller & Paschall(Eds.), 2nd Edition, Academic Press Inc. London Lt
d; ISBN 0-12-746270-8 (1994), 例えば、Chapter XII, pages 412-468参照； C
orn and sorghum starches: production; by Watson, Chapter XIII, pages 469
-479; Tapioca, arrowroot and sago starches: production; by Corbishley &
Miller; Chapter XIV, pages 479-490; Potato starch:production and uses; b
y Mitch; Chapter XV, pages 491-506; Wheat starch: production, modificati
on and uses; by Knight and Oson; Chapter XVI, pages 507-528; Rice starch
: production and uses; by Rohmer & Klem)。植物材料からデンプンを抽出する
ために通常用いられる装置は分離器、デカンター、湿式サイクロン、噴霧乾燥機
、および流動層乾燥機である。
【００４８】 本発明の核酸分子が発現されるので、本発明の遺伝子導入植物細胞および植物
は、その物理化学的特性（例えばアミロース／アミロペクチン比、分枝度、平均
鎖長、燐酸含有量、ゼラチン化挙動、デンプン顆粒サイズおよび／またはデンプ
ン顆粒形）が、野性型植物で合成されるデンプンと比較して改変されているデン
プンを合成する。特に、知られているデンプンと比較して、そのようなデンプン
は、このデンプンから製造されるゲルの粘稠度および／またはフィルムもしくは
ゲル形成特性が変化している。
【００４９】 さらにまた、本発明の主題は、本発明の植物細胞および植物およびそれらの増
殖物質から得られるデンプン、および本発明の上記の方法によって得られるデン
プンである。 さらにまた、本発明の核酸分子を利用して、本発明の蛋白質の活性が低下して
いる植物細胞および植物を作製することが可能である。これはまた、野性型植物
細胞のデンプンと比較して化学的および／または生理的特性が異なるデンプンの
合成につながる。
【００５０】 本発明のさらに別の主題はしたがって、本発明の核酸分子を含む遺伝子導入植
物細胞であって、この細胞ではイソアミラーゼ活性は非形質転換細胞と比較して
減少している。
【００５１】 イソアミラーゼの活性が低下している植物細胞は、以下の当業者に既知の方法
を用い本発明の核酸分子を利用しながら、例えば、同時抑制作用を達成するため
に適切なアンチセンスＲＮＡ、センスＲＮＡを発現させることにより、またはイ
ソアミラーゼをコードする転写物を特異的に切断する適切に構築したリボザイム
を発現させることにより得られる：Jorgensen, Trends Biotechnol. 8:340-344
(1990); Niebel et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 197:91-103 (1995);
Flavell et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 197:43-46 (1995); Palaqu
i & Vaucheret, Plant. Mol. Biol. 29:149-159 (1995); Vaucheret et al., Mo
l. Gen. Genet. 248:311-317 (1995); de Borne et al., Mol. Gen. Genet. 243
:613-621 (1994))。
【００５２】 本発明のイソアミラーゼの活性を低下させるために、例えばアンチセンスＲＮ
Ａを発現させることによって植物細胞内でそれをコードする転写物の数を減少さ
せることが好ましい。
【００５３】 この場合、一方では、本発明の蛋白質をコードする配列の全て、存在しえる一
切の隣接配列も、またはコード配列の部分を含むだけのＤＮＡ分子も包含するＤ
ＮＡ分子を利用することが好ましい。これらの部分は、細胞内でアンチセンス作
用を引き起こすために十分に長いことが必要である。一般に、最小の長さが１５
ｂｐ、好ましくは１００〜５００ｂｐまでの配列が、特に５００ｂｐを越える長
さの個々の配列での効果的なアンチセンス抑制に用いられる。原則として、ＤＮ
Ａ分子は、５０００ｂｐよりも短いもの、好ましくは２５００ｂｐより短い配列
が用いられる。
【００５４】 さらに、本発明のＤＮＡ分子の配列と高い相同性を示すが完全に同一ではない
ＤＮＡ配列も用いることができる。最小限の相同性は約６５％を越えるべきであ
る。９５〜１００％の間の相同性をもつ配列の使用が好ましい。
【００５５】 本発明の主題はまた改変デンプンの製造方法で、本方法は、本発明の細胞また
は植物および／またはそのような植物のデンプン貯蔵部分からデンプンを抽出す
る工程を含む。 さらにまた本発明の主題は、本発明の細胞または植物およびそれらの増殖物質
または部分から得ることができるデンプンおよび本発明の方法によって得ること
ができるデンプンである。
【００５６】 本発明のデンプンは当業者の知る方法で改変できるが、それらの未改変形態ま
たは改変形態は食品産業または非食品産業分野の多様な用途に適している。 本発明のデンプンの可能な用途は、おおむね２つの重要な産業分野に分けるこ
とができる。１つの分野はデンプンの水解物、主にグルコースおよびグルカン単
位を包含し、これらは酵素的または化学的方法で得られる。それらは、更なる化
学的改変および加工（例えば醗酵）のための出発物質として用いられる。コスト
削減のために実現可能なものは、加水分解の方法の単純化および経済的なデザイ
ンである。現在のところ、アミノグリコシダーゼを用いて本質的には酵素による
処理が行われている。実現可能なことは、使用酵素の減少による経済的節約であ
る。これは、例えば顆粒の表面積を増すことにより、消化性の改善（例えば使用
酵素の利用を制限する低い分枝度または立体構造の改変による）によりデンプン
の構造を変えることによってもたらされる。
【００５７】 本発明のデンプンがいわゆるネイティブなデンプンとして（そのポリマー構造
のため）使用される他の産業分野は、さらに２つの利用分野に分けることができ
る。 １．食品工業 デンプンは、多数の食品類への伝統的な添加物で、その機能は本質的には、水
性添加剤を結合させること、または粘性を高めるか、またはゲル化を促進するこ
とである。重要な特性は、レオロジー、収着性、膨潤温度、ゼラチン化温度、粘
性、濃縮力、デンプン可溶性、透明度およびゲル構造、耐熱性、剪断安定性、耐
酸性、退化の起こりやすさ、フィルム形成能、凍結融解の安定性、塩溶液中での
粘性の安定性、消化性および例えば無機または有機イオンとの複合体形性能であ
る。
【００５８】 ２．非食品工業 この大きな産業分野では、デンプンは、種々の製造工程のために補助剤として
、または工業製品の添加剤として用いられる。デンプンを補助剤として用いる場
合は、特に製紙板紙工業について述べなければならない。デンプンは主に、減速
目的（固形物保持）のために、結合充填粒子および微細粒子として、硬化剤とし
て、さらに脱水のために作用する。さらにまた、硬度、強度、音響、手触り、光
沢、潤滑さ、結合強度および表面に関するデンプンの特性が利用される。
【００５９】 ２.１ 製紙板紙工業 製紙工程では４分野の用途が区別される。すなわち表面、被覆、ストックおよ
び噴霧である。表面処理に関してデンプンに要求されることは、本質的には強い
白さ、粘性適合、高い粘性安定性、良好なフィルム形成、および塵埃形成の低さ
である。被覆に使用される場合は、固形物含有量、適切な粘性、高結合能および
高い顔料親和性が重要な役割を果たす。ストックへの添加剤として用いられる場
合に重要なことは、迅速で均一なロスのない分布、高い機械的強度およびペーパ
ーウェブにおける完全な歩留りである。デンプンを噴霧セクターで用いる場合は
、再び固形物含有量の融通性、高い粘性および高い結合能が重要である。
【００６０】 ２.２ 接着剤工業 重要なデンプンの利用分野は接着剤工業で、ここでは潜在的な用途は以下の４
つの分野に分けられる：純粋なデンプンペーストとしての使用、特殊化学物質で
処理されたデンプンペーストでの使用、合成樹脂およびポリマー分散液への添加
剤としてのデンプンの使用、および合成添加剤のためのエキステンダーとしての
デンプンの使用。デンプンをベースとする主剤添加剤の９０％が、段ボール紙の
製造、紙袋製造、紙とアルミニウムの複合材料の製造、箱の製造、封筒、切手な
どの糊付け用接着剤の製造に用いられる。
【００６１】 ２.３ 繊維工業および繊維処理製品工業 補助剤および添加剤としてのデンプンの利用の重要な分野は、繊維および繊維
処理製品の製造セクターである。以下の４つの利用分野が繊維工業で区別されね
ばならない：サイジング剤としてのデンプンの使用、すなわち製織時にかかる引
張力から保護するために潤滑性および潤滑性強化を目的とし、さらに製織時に耐
摩耗性を高めるための補助剤として；特に品質を低下させる前処理の後で（例え
ば漂白、染色などの後で）繊維仕上げ剤として；にじみ防止のために染料ペース
ト調製液に加えられる濃縮剤として；縫糸の光滑剤への添加剤としてのデンプン
の使用である。
【００６２】 ２.４ 建築材料工業 第４の利用分野は、建築材料の添加剤としてのデンプンの使用である。一例は
石膏プラスターボードの製造で、この場合、石膏スラリーに混合されるデンプン
は水でゼラチン化され、プラスターコアの表面に分散し、そこでボードとコアを
結合させる。他の利用分野は、下塗りおよび鉱物線維への混合物である。レディ
ーミックスコンクリートの場合には、デンプン製品は結合減速のために用いられ
る。
【００６３】 ２.５ 土壌安定剤 デンプン製品の別の市場は土壌安定剤の製造で、これは土壌を人工的にかき乱
すときに水から土壌粒子を一時的に保護するために用いられる。現時点での情報
にしたがえば、デンプンとポリマー乳剤の混合製品は、それらの腐食の減少およ
びクラスト減少作用に関してはこれまで用いられてきた製品と同等であるが、極
めて安価である。
【００６４】 ２.６ 収穫物保護製品および肥料における使用 デンプンを使用する１つの利用分野は、生産物の固有の性質を改変することを
目的とする収穫物保護製品での使用である。したがって、デンプンは収穫物保護
製品および肥料の湿潤能の改善のために、活性成分の制御放出のために、液性、
既発性および／または悪臭発生活性成分を微晶質、安定な形状形成物質に変換す
るために、不適合化合物を混合するために、分解を低下させることによって作用
時間を延長させるために用いることができる。
【００６５】 ２.７ 医薬品、薬剤および化粧品工業 別の利用分野は医薬品、薬剤および化粧品工業である。医薬品工業では、デン
プンは、錠剤の結合剤として、またはカプセル中の結合剤の希釈に用いられる。
さらにまた、デンプンは、嚥下後に液体を吸収して活性成分を遊離できる程度に
短時間で膨潤するので、錠剤の崩壊剤として用いることができる。薬剤の潤滑化
粉末および創傷用粉末は、品質の理由からデンプンをベースとする。化粧品分野
では、デンプンは、例えば粉末添加剤（例えば香料およびサリチル酸）の担体と
して用いられる。デンプン利用の比較的大きな分野は歯磨きペーストである。
【００６６】 ２.８ 石炭および煉炭へのデンプンの添加 デンプン利用の分野は石炭および煉炭の添加剤としてである。デンプンの添加
により、石炭を高品質の固まりにすることができ、したがって煉炭の早すぎる分
解を防止することができる。バーベキュー用石炭の場合デンプン添加量は４から
６％で、高カロリー石炭の場合は０.１〜０.５％である。さらにまた、石炭およ
び煉炭にデンプンを添加したとき有害物質の放出が顕著に減少するので、デンプ
ンの結合剤としての重要性が増している。
【００６７】 ２.９ 原鉱研磨および石炭シルト処理 さらにまた、デンプンは原鉱研磨および石炭シルトの処理工程セクターで凝集
剤として用いることができる。
【００６８】 ２.１０ 鋳造補助剤 また別の応用分野は鋳造補助剤への添加剤としてである。種々の鋳造方法で、
結合剤処理砂で製造されたコアが要求される。最も用いられる結合剤は今日では
ベントナイトで、これは改変デンプン（ほとんどの事例では膨潤性デンプン）で
処理される。 デンプンを添加する目的は流動能を高め、結合力を改善するためである。さら
に、膨潤性デンプンは、他の製造操作の要求（例えば冷水分散性、再吸水性、砂
と容易に混合できること、および水との結合能が高いこと）を満たすことができ
る。
【００６９】 ２.１１ ゴム工業での使用 ゴム工業では、デンプンは技術的品質および視覚的品質の改善に用いられる。
その理由は、表面の光沢の改善、取り扱いおよび外見の改善（この目的のために
、冷硬化前にゴム材料の粘着性の表面にデンプンが分散される）、およびゴムの
印刷性能の改善である。 ２.１２ 皮革代替物の製造 改変デンプンはさらにまた皮革代替物のために販売される。
【００７０】 ２.１３ 合成ポリマーにおけるデンプン ポリマーセクターでは以下の利用分野が考えられる：加工工程でのデンプン分
解生成物の使用（デンプンは充填剤として作用するだけで、合成ポリマーとデン
プン間に直接結合は存在しない）、またはポリマー製造におけるデンプン分解生
成物の使用（デンプンとポリマーは安定な結合を形成する）。
【００７１】 純粋な充填剤としてのデンプンの使用は、他の物質（例えばタルク）と比較し
て競合的ではない。しかしながら、デンプンの固有の特性が強い影響を与え、し
たがって最終製品の特性のスペクトルを顕著に変える場合は別である。この一例
は、熱可塑性物質（例えばポリエチレン）の処理におけるデンプン生成物の使用
である。ここでは、デンプンおよび合成ポリマーを１：１の比で同時圧搾によっ
て混合させてマスターバッチが製造される。このマスターバッチから通常の加工
技術を用いて、種々の製品が顆粒化ポリエチレンにより製造される。ポリエチレ
ンフィルムでデンプンを使用することによって、中空体の場合には物質の透過性
が増し、水蒸気の透過性の改善、帯電防止性能の改善、非遮断性挙動の改善、お
よび水性インクの印刷性能の改善が達成できる。
【００７２】 別の可能性は、ポリウレタンフォームにおけるデンプンの使用である。デンプ
ン誘導体を適応させることによって、さらに工程処理操作の最適化によって、合
成ポリマーとデンプンのヒドロキシル基との間の反応を直接的に制御することが
可能である。その結果、デンプンの使用により以下の特性スペクトルをもつポリ
ウレタンフィルムが得られる：熱膨張率の低下、収縮挙動の低下、圧−張力挙動
の改善、水の取り込みに変化を与えない水蒸気の透過性の増大、可燃性の低下、
最終引張り強度の減少、可燃性部分のドロップ非形成性、ハロゲン非含有性また
はエージングの減少。なお存在する欠点は印刷性能の低下および衝撃強度の低下
である。
【００７３】 製品開発は現在ではもはやフィルムに限定されない。デンプン含有量が５０％
を越える固形ポリマー製品、例えばポット、平板および皿もまた製造できる。さ
らにまた、デンプン／ポリマー混合物は生物分解性がはるかに高いので有利であ
ると考えられる。
【００７４】 デンプングラフトポリマーは、その極めて高い水との結合能力のために非常に
重要になってきた。それらは、デンプン骨格および合成モノマーの側格子をもつ
生成物で、遊離ラジカル鎖メカニズムの原理にしたがってグラフトされる。現在
利用できるデンプングラフトポリマーは、高い粘性をもち、結合性の改善および
デンプン１ｇにつき１０００ｇまでの水の保持能力を特徴とする。これら超吸収
性物質の利用分野は近年大きく拡大され、衛生品セクターではおむつおよびパッ
ドのような製品、農業セクターでは例えば種子被覆のような製品がある。
【００７５】 新規で遺伝学的に改変されたデンプンの利用で決定的なことは、一方では、構
造、水分含有量、蛋白質含有量、脂質含有量、繊維含有量、灰分／燐酸含有量、
アミロース／アミロペクチン比、分子質量分布、分枝度、顆粒サイズおよび顆粒
形および結晶性で、他方では以下の特性に影響を与える性状である：流動および
収着挙動、ゼラチン化温度、粘性、塩類溶液での粘性の安定性、濃縮力、溶解力
、ゲル構造、およびゲルの透明性、耐熱性、剪断安定性、酸耐性、退化促進傾向
、ゲル形成、凍結融解安定性、複合体形成、ヨウ素結合、フィルム形成、粘着力
、酵素安定性、消化性および反応性である。
【００７６】 遺伝子組換えによる改変デンプンの製造は、一方では、化学的または物理的方
法による他の改変ではもはや要求することができないような態様で植物由来のデ
ンプンの特性を変化させることができる。他方、遺伝子組換え方法によって改変
したデンプンは、さらなる化学的改変に付すことが可能で、これは上記の利用分
野のいくつかについてさらに品質の改善をもたらす。これらの化学的改変はおお
むね既知である。特にそれらは以下による改変である：熱処理、有機または無機
酸による処理、酸化およびエステル化、これは例えば燐酸デンプン、硝酸デンプ
ン、硫酸デンプン、キサンタンデンプン、酢酸デンプンおよびクエン酸デンプン
である。さらにまた、強酸の存在下でデンプンエーテルを製造するために一価ま
たは多価アルコールを用い、デンプンアルキルエーテル、Ｏ−アリルエーテル、
ヒドロキシアルキルエーテル、Ｏ−カルボキシメチルエーテル、Ｎ−含有デンプ
ンエーテル、Ｐ−含有デンプンエーテル、Ｓ−含有デンプンエーテル、架橋デン
プンまたはデンプングラフトポリマーが得られる。
【００７７】 一方では、本発明のデンプンの好ましい用途は包装材料および使い捨て製品の
製造で、他方では、食品類または食品類前駆物質としてである。
【００７８】 植物細胞内でセンス方向またはアンチセンス方向で本発明の核酸分子を発現さ
せるために、それらは植物細胞内での転写を確実にする調節ＤＮＡエレメントに
連結される。調節ＤＮＡエレメントには、特にプロモーター、エンハンサーおよ
びターミネーターが含まれる。一般に、植物細胞で活性を有するいずれのプロモ
ーターも発現のために適切である。
【００７９】 プロモーターは、発現が構成的であるか、または植物の発生の特定の時期もし
くは外的要因で決定される時期に特定の組織でのみ惹起されるように選択できる
。その植物に対してプロモーターは同種でも異種でもよい。適切なプロモーター
の例は、構成的発現のためにはカリフラワーモザイクウイルスの３５ＳＲＮＡプ
ロモータおよびトウモロコシのユビキチンプロモーター、塊茎特異的発現のため
にはパタチンプロモーターＢ３３（Rocha-Sosa et al., EMBO J. 8:23-29(1989)
）、または光合成活性を有する組織でのみ発現を確実にするプロモーター、例え
ばＳＴ−ＬＳ１プロモーター（Stockhaus et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
, 84:7943-7947(1987); Stockhaus et al., EMBO J. 8:2445-2451(1989))、また
は内乳特異的発現のためには、コムギのＡＭＧプロモーター、ＵＳＰプロモータ
ー、ファセオリンプロモーターまたはトウモロコシのゼイン遺伝子に由来するプ
ロモーターである。
【００８０】 転写を正確に終了させ、ポリＡテールを転写物に付加するために機能する終止
配列（ポリＡテールは転写物を安定化させる機能をもつと考えられている）もま
た存在することができる。そのようなエレメントは文献に記載されており（Giel
en et al., EMBO J. 8:23-29(1989)）、所望に応じて交換することができる。
【００８１】 本発明は、コムギのイソアミラーゼ機能をもつ蛋白質をコードする核酸分子を
提供する。本発明の核酸分子は、デンプン生合成でその機能が特定される酵素の
産生を可能にし、本酵素の活性が改変され、その構造および物理化学的特性が改
変されたデンプンのそのように改変された植物における合成を可能にする遺伝子
組換え技術によって改変された植物の作製を可能にする。
【００８２】 原則として、本発明の核酸分子はまた、本発明のイソアミラーゼの活性が増加
または低下し、一方デンプン合成に参画する他の酵素の活性も同時に改変されて
いる植物の作製に用いることができる。植物のイソアミラーゼの活性を改変する
ことによって、改変された構造をもつデンプンの合成がもたらされる。さらにま
た、イソアミラーゼまたは適切なアンチセンス構築物をコードする核酸分子を、
内因性デンプンシンターゼまたは分枝酵素の合成がすでに抑制されている植物細
胞に導入することができる（例えば以下を参照されたい：WO92/1487; Shannon &
Garwood, 1984, in Whistler, BeMiller & Paschall, Starch: Chemistry and
Technology, Academic Press, London, 2nd Edition:25-86)。
【００８３】 形質転換植物でデンプン生合成に関連するいくつかの酵素の合成を抑制したい
場合は、適切なプロモータの制御下でアンチセンス方向で問題の酵素をコードす
るいくつかの領域を同時に含むＤＮＡ分子で形質転換を実施することができる。
ここで、各々の配列をそれ自身のプロモーターの制御下に置くことが可能であり
、またそれらの配列を融合物としてジョイントプロモータによって転写させるか
、もしくはジョイントプロモーターの制御下に置いてもよい。最後に述べた選択
肢が一般に好ましい。なぜならば、この場合には問題の蛋白質の合成はおおざっ
ぱに同じ程度に抑制されるはずであるからである。そのような構築物で用いられ
る個々のコード領域の長さに関しては、アンチセンス構築物作製について上記で
述べたことがここでもまた適用される。原則として、１つのプロモーターから出
発するそのようなＤＮＡ分子で転写されるアンチセンスフラグメントの数につい
ては上限はないが、形成される転写物は好ましくは１０ｋｂの長さ、特に５ｋｂ
の長さを超えるべきではない。
【００８４】 適切なプロモーターの後ろでアンチセンス方向に他のコード領域と組み合わさ
れたそのようなＤＮＡ分子内に存在するコード領域は、以下の蛋白質をコードす
るＤＮＡ配列に由来する：デンプン顆粒結合デンプンシンターゼ（ＧＢＳＳ Ｉ
およびII）および可溶性デンプンシンターゼ（ＳＳＳ ＩおよびII）、分枝酵素
（イソアミラーゼ、プルラナーゼ、Ｒ酵素、分枝酵素、脱分枝酵素）、デンプン
ホスホリラーゼおよび不均衡化酵素。この列挙は単なる例示である。そのような
組合せに他のＤＮＡ配列を使用することもまた可能である。 そのような構築物は、それらで形質転換した植物細胞で複数の酵素の合成を同
時に抑制する。
【００８５】 さらにまた、そのような構築物は１つまたは２つ以上のデンプン生合成遺伝子
が欠如している植物変異体に導入できる（Shannon & Garwood, 1984, in Whistl
er, BeMiller & Paschall, Starch: Chemistry and Technology, Academic Pres
s, London, 2nd Edition:25-86) 。これらの欠損は以下の蛋白質と関連を有する
：デンプン顆粒結合デンプンシンターゼ（ＧＢＳＳ ＩおよびII）および可溶性
デンプンシンターゼ（ＳＳＳ ＩおよびII）、分枝酵素（ＢＥ ＩおよびII）、脱
分枝酵素（Ｒ酵素）、不均衡化酵素、およびデンプンホスホリラーゼ。この列挙
は単なる例示である。さらにまた、そのような方法はそれらで形質転換した植物
細胞で複数の酵素の合成を同時に抑制させる。
【００８６】 高等植物に外来遺伝子を導入するために、大腸菌の複製シグナルおよび形質転
換細菌細胞選別用マーカー遺伝子を含む多数のクローニングベクターが利用可能
である。そのようなベクターの例は、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣシリーズ、Ｍ１３ｍ
ｐシリーズ、ｐＡＣＹＣ１８４などである。所望の配列は、適切な制限切断部位
でベクターに導入できる。得られたプラスミドを用いて大腸菌細胞を形質転換す
る。形質転換大腸菌細胞は、適切な培地中で増殖させ、続いて採集して溶解させ
る。プラスミドを回収する。得られたプラスミドＤＮＡの性状を決定する一般に
用いられる分析方法は、制限分析、ゲル電気泳動並びに更なる生化学的および分
子生物学的方法である。各操作の後、プラスミドＤＮＡを切断し、得られたＤＮ
Ａフラグメントを他のＤＮＡ配列と連結することができる。各プラスミドＤＮＡ
配列を同一または異なるプラスミドでクローニングできる。
【００８７】 ＤＮＡを植物ホスト細胞に導入するために多数の技術が利用できる。これらの
技術には、形質転換微生物としてアグロバクテリウム＝ツメファシエンス（Agro
bacterium tumefaciens)またはアグロバクテリウム＝リゾゲネス（A. rhizogene
s)を用いるｔ−ＤＮＡによる植物細胞の形質転換、プロトプラスト融合、注入、
ＤＮＡの電気穿孔、バイオリステックな手段によるＤＮＡの導入および他の方法
が含まれる。
【００８８】 植物細胞へのＤＮＡの注入および電気穿孔はそれ自体は使用プラスミドの特別
な態様を要求しない。単純なプラスミド、例えばｐＵＣ誘導体を用いることがで
きる。しかしながら、完全な植物をそのような形質転換細胞から再生させる場合
は、一般に選別マーカー遺伝子が必要である。
【００８９】 所望の遺伝子を植物細胞に導入する方法に応じて、さらに別のＤＮＡ配列が要
求される。例えば、ＴｉまたはＲｉプラスミドが植物細胞の形質転換に用いられ
る場合は、ＴｉおよびＲｉプラスミドのＴ−ＤＮＡの少なくとも右側の境界（し
ばしば左右の境界）は、側面領域として導入遺伝子に連結されていなければなら
ない。
【００９０】 形質転換にアグロバクテリウムを用いる場合は、導入されるべきＤＮＡは特定
のプラスミドにクローニングするか、または中間ベクターもしくはバイナリーベ
クターのいずれかにクローニングする必要がある。中間ベクターは、Ｔ−ＤＮＡ
中の配列に対して相同な配列のために相同組換えによってアグロバクテリウムの
ＴｉまたはＲｉプラスミドに組み込まれ得る。前者はまたｖｉｒ領域を含み、こ
れはＴ−ＤＮＡ移転に要求される。中間ベクターはアグロバクテリウムで複製で
きない。中間ベクターは、ヘルパープラスミドによってアグロバクテリウム＝ツ
メファシエンスに移すことができる（接合）。バイナリーベクターは大腸菌およ
びアグロバクテリウムで複製できる。それらは選別マーカー遺伝子およびリンカ
ーまたはポリリンカーを含み、これらは左および右のＴ−ＤＮＡ境界領域によっ
て囲まれている。それらは直接アグロバクテリウムに形質転換できる（Holster
et al., Mol. Gen. Genet. 163:181-187(1978)）。ホスト細胞として作用するア
グロバクテリウムは、ｖｉｒ領域をもつプラスミドを含有しているはずである。
ｖｉｒ領域は、Ｔ−ＤＮＡを植物細胞に移転させるために必要である。さらに別
のＴ−ＤＮＡが存在していてもよい。このように形質転換されたアグロバクテリ
ウムは、植物細胞の形質転換に用いることができる。
【００９１】 植物細胞を形質転換するためにＴ−ＤＮＡを使用することは徹底的に研究され
報告された（EP120516; Hoekema, In: The Binary Plant Vector System Offset
drukkerij Kanters B.V., Alblasserdam (1985), Chapter V; Fraley et al., C
rit. Rev. Plant. Sci., 4:1-46; An et al., EMBO J. 4:277-287(1985)）。
【００９２】 ＤＮＡを植物細胞に移すために、植物の外移植片を便宜的にアグロバクテリウ
ム＝ツメファシエンスまたはアグロバクテリウム＝リゾゲネスとともに同時培養
することができる。続いて、感染植物材料（例えば葉の切片、茎の切片、根、プ
ロトプラストまたは浮遊培養で増殖させた植物細胞）から適切な培地中で完全な
植物体を再び再生できる。適切な培地は、とりわけある種の糖、アミノ酸、形質
転換細胞選別用抗生物質または殺菌物質を含む。導入されたＤＮＡの存在につい
て得られた植物を続いて調べることができる。バイオリステッィクな方法を用い
てまたはプロトプラストの形質転換によって外来ＤＮＡを導入する他の可能性も
知られている（例えば以下を参照されたい：L. Willmitzer, 1993 Transgenic p
lants. In: Biotechnology, A Multi-Volume Comprehensive Treatise (H. J. R
ehm, G. Reed, A. Puehler, P. Stadler, eds), Vol.2, 627-659, VCH Weinheim
-New york-Basel-Cambridge）。
【００９３】 アグロバクテリウム＝ツメファシエンスを利用してＴｉプラスミドベクター系
での双子葉植物の形質転換は確立されているが、最近の研究によれば、単子葉植
物もアグロバクテリウム系ベクターによって実際に形質転換が可能であることが
示唆された（Chan et al., Plant Mol. Biol. 22:491-506(1993); Hiei et al.,
Plant J. 6:271-282(1994))。
【００９４】 単子葉植物を形質転換するまた別の方法は、バイオリスティックなアプローチ
、プロトプラストの形質転換、またはプロトプラストへの物理的もしくは化学的
誘発ＤＮＡ取り込み（例えば部分的に透過性にした細胞の電気穿孔）、グラスフ
ァイバーによるＤＮＡの移転、花へのＤＮＡのマクロインジェクション、小胞子
または前胚へのＤＮＡのマイクロインジェクション、発芽花粉によるＤＮＡの取
り込みおよび膨潤による胚のＤＮＡ取り込みである（概論として：Potrykus, Ph
ysiol. Plant 269-273(1990))。
【００９５】 上記の形質転換系の３つは過去に種々の穀類で確立された：組織の電気穿孔、
プロトプラストの形質転換および再生組織および細胞への粒子撃ち込みによるＤ
ＮＡ移転（概論として：Jaehne et al., Euphytica 85:35-44(1995)）。
【００９６】 コムギを形質転換する種々の方法が文献に記載されている（概論として：Mahe
shwari et al., Critical Reviews in Plant Science 14(2):149-178(1995)）。
Hessら（Plant Sci. 72:233(1990)）は、マクロインジェクション法を用いて花
粉とアグロバクテリウムを直ぐ近傍に置いた。ｎｐｔ II遺伝子を選別マーカー
として含むプラスミドの移動は、サザンブロット分析およびＮＰＴ II テストに
よって検出された。形質変換体は正常な表現型を示し、増殖性をもっていた。カ
ナマイシン耐性は２つの連続世代で検出された。
【００９７】 極小発射体と結合させたＤＮＡの撃ち込み後に再生させた、増殖能をもつ最初
の遺伝子導入コムギが報告された（Vasil et al., Bio/Technology 10:667-674(
1992))。撃ち込みのための標的組織は胚形成性カルス培養（Ｃ型カルス）であっ
た。用いた選別マーカーは、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼを
コードし、したがって除草剤ホスフィノトリシンに対する耐性を仲介するバー遺
伝子であった。さらに別の系が報告された（Weeks et al., Plant Physiol. 102
:1077-1084(1993); Becker et al., Plant J. 5(2):299-307(1994)）。ここで、
ＤＮＡ形質転換のための標的組織は、体性胚を誘発するために予備的にin vitro
で刺激した未成熟の胚の胚盤である。Beckerら（上掲書）が開発した系の形質転
換効率は、変種”フロリダ”の胚８３につき１遺伝子導入植物で、したがって、
Weeksらが確率した系よりも極めて高い（後者の系は、変種“ボーホワイト”の
胚１０００につき１〜２遺伝子導入植物である）。Beckerら（上掲書）が開発し
た系は実施例で述べる形質転換実験の基礎を形成する。
【００９８】 導入されたＤＮＡがいったん植物細胞のゲノムに組み込まれたら、原則として
そのＤＮＡは安定で、最初に形質転換された細胞の子孫で保持される。通常それ
は上記の選別マーカーの１つを含み、これは例えば殺生物（例えばホスフィノト
リシン）または抗生物質（例えばカナマイシン、Ｇ４１８、ブレオマイシンまた
はヒグロマイシン）に対する耐性を形質転換細胞に仲介するか、またはある種の
糖またはアミノ酸の有無による選別を可能にする。個々に選択されるマーカーは
したがって、導入ＤＮＡを欠く細胞から形質転換細胞の選別を可能にする。
【００９９】 植物内で、形質転換細胞は通常の態様で増殖する（以下の文献もまた参照され
たい：McCormick et al., Plant Cell Reports 5:81-84(1986)）。得られた植物
は正常に生長し、同じ形質転換生殖細胞質または他の生殖細胞質をもつ植物とハ
イブリッドを形成する。生じた個々のハイブリッドは対応する表現型特性を有す
る。この植物細胞から種子を得ることができる。表現型の特性が安定的に保持さ
れ、受け継がれることを確実にするために２または３世代以上増殖させるべきで
ある。また、問題の表現型またはその他の特性を保持することを確実にするため
に種子を採集するべきである。 以下の実施例は本発明を説明するものであり、何ら制限するものではない。
【０１００】 〔実施例〕 １. クローニング法 ベクターpBluescriptIISK(Stratagene）を大腸菌でのクローニングに用いた。
２. 細菌株 大腸菌株ＤＨ５α（Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, USA)を
Bluescriptベクターおよびアンチセンス構築物のために用いた。大腸菌株ＸＬ１
−Ｂｌｕｅをin vivo切り出しのために用いた。
【０１０１】 ３. 未成熟コムギ胚の形質転換 培地 ＭＳ：１００ml／Ｌのマクロソルト、１ml／Ｌのミクロソルト、２ml／ＬのＦ
ｅ／ＮａＥＤＴＡ、３０ｇ／Ｌのスクロース（D. Becker & H. Loerz, Plant Ti
ssue Culture Manual B12:1-20(1996)) ＃３０：ＭＳ＋２,４−Ｄ（２mg／Ｌ） ＃３１：ＭＳ＋２,４−Ｄ（２mg／Ｌ）＋ホスフィノトリシン（ＰＰＴ，除草
剤ＢＡＳＴＡの活性成分）（２mg／Ｌ)) ＃３２：ＭＳ＋２,４−Ｄ（０.１mg／Ｌ）＋ＰＰＴ（２mg／Ｌ） ＃３９：ＭＳ＋２,４−Ｄ（２mg／ml）＋各０.５Ｎのマンニトール／ソルビト
ール。 記載の培地はＫＯＨを用いてｐＨ５.６とし、０.３％Ｇelriteを用いて固形に
した。 未成熟のコムギ胚の形質転換方法を文献（D. Becker & H. Loerz, Plant Tiss
ue Culture Manual B12:1-20(1996))にしたがって開発し、さらに最適化させた。 下記に述べる実験では、Becker & Loerz（上掲書）が開発した方法に従った。 形質転換のためには、開花後１２〜１４日後の発生段階のカリオプス（caryop
se）をもつ穂を採集し、表面を殺菌した。単離した胚盤は、胚軸を培地方向に向
けて誘導培地＃３０上で平板培養した。 ２〜４日間の予備培養後（２６℃、暗所）、外移植片を浸透圧予備培養のため
に＃３９培地に移す（２〜４時間、２６℃、暗所）。 バイオリスティックな形質転換のために、表面に数μｇの標的ＤＮＡを予め沈
澱させた約２９μｇの金粒子を１ショットにつき用いた。実施した実験は同時形
質転換体であるので、標的遺伝子およびレジスタンスマーカー遺伝子（バー遺伝
子）が１：１の比で構成された標的ＤＮＡを沈澱バッチに添加した。
【０１０２】 ４. ＤＮＡフラグメントのＤＩＧ標識 スクリーニングプローブとして用いたＤＮＡフラグメントは、ＤＩＧ標識ｄＵ
ＴＰ（Boehringer Mannheim, Germany）の取り込みにより特異的ＰＣＲで標識し
た。
【０１０３】 この実施例で用いた培地および溶液： ２０×ＳＳＣ：１７５.３ｇのＮａＣｌ、８８.２ｇのクエン酸ナトリウム、２
回蒸留水で１０００mlにし、１０ＮのＮａＯＨでｐＨ７.０とする。
【１０４】 ブダペスト条約にしたがいＤＳＭＺ（Braunschweig, Germany）にプラスミド
ｐＴａＳＵ８Ａ（＃ＤＳＭ１２７９５）およびプラスミドｐＴａＳＵ１９（＃Ｄ
ＳＭ１２７９６）を寄託した。
【０１０５】 実施例１：コムギ（Triticum aestivum L., cv Florida）由来のイソアミラーゼ
（“甘味質”相同体）をコードするｃＤＮＡの特定、単離および性状決定 コムギのイソアミラーゼアイソフォーム（甘味質）をコードするｃＤＮＡを特
定するために、異種スクリーニング法にしたがった。この目的のために、コムギ
ｃＤＮＡライブラリーをトウモロコシ甘味質プローブでスクリーニングした。
【０１０６】 プローブ（甘味質プローブ）をＰＣＲ増幅を用いトウモロコシｃＤＮＡライブ
ラリーから特異的プライマーにより単離した。トウモロコシｃＤＮＡライブラリ
ーは、ポリ（Ａ）＋ＲＮＡ（等量の１３−、１７−、１９−、２０−、２２−、
２５−、および２８日（ＤＡＰ）齢のカリオプスの混合物由来）からラムダＺap
IIベクターで製造元の指示にしたがってクローニングした（ラムダＺap II−ｃ
ＤＮＡ合成キット；Stratagene GmbH, Heidelberg, Germany）。用いた全てのカ
リオプスで（１３日齢の穀粒を除き）胚はＲＮＡの単離前に除去した。 コムギｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングのためのプローブとして用いる
ＤＮＡフラグメントは以下のプライマーで増幅した： ｓｕ１ｐ−１：５′ＡＡＡＧＧＣＣＣＡＡＴＡＴＴＡＴＣＣＴＴＴＡＧＧ３′
（配列番号４） ｓｕ１ｐ−２：５′ＧＣＣＡＴＴＴＣＡＡＣＣＧＴＴＣＴＧＡＡＧＴＣＧＧＧ
ＡＡＧＴＣ３′（配列番号５）
【０１０７】 ＰＣＲ反応に用いた鋳型は２μｌの増幅トウモロコシｃＤＮＡライブラリーで
あった。さらにまたＰＣＲ反応は以下のものを含んでいた：１.５〜３ｍＭのＭ
ｇＣｌ2、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８.４）、５０ｍＭのＫＣｌ、０.８ｍ
ＭのｄＮＴＰミックス、１μＭのプライマーｓｕ１ｐ−１ａ、１μＭのプライマ
ーｓｕ１ｐ−２および２.５単位のＴａｑポリメラーゼ（リコンビナント、Life
Technologies)。増幅は、バイオメトラ（Biometra）のトリオブロック（Trioblo
ck)を用い以下の形式で実施した：４分／９５℃；１分／９５℃、４５秒／５８
℃；１分１５秒／７２℃；３０サイクル５分／７２℃。約９９０ｂｐの増幅ＤＮ
Ａバンドをアガロースゲルで分離し切り出した。第二の増幅は上記のスキームに
従いこのフラグメントから行った。この第二の増幅から得た９９０ｂｐフラグメ
ントを制限酵素Ｂam ＨＩで２２０ｂｐおよび７７０ｂｐフラグメントに切断し
た。
【０１０８】 この甘味質フラグメントを再びアガロースゲル中で分離し、バンドを切り出し
てフラグメントを単離した後、プローブをＤＩＧ標識した。５００ｎｇの甘味質
フラグメントをジゴキシゲニンによるランダム−プライム標識のために用いた。
１０μｌのランダムプライマーを標識されるべきフラグメントに加え、反応物を
９５−１００℃で５分間加熱した。加熱後、０.１ｍＭのｄＡＴＰ、０.１ｍＭの
ｄＧＴＰ、０.１ｍＭのｄＣＴＰおよび０.０６５ｍＭのｄＴＴＰ並びに０.０３
５ｍＭのジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰ（Boehringer Mannheim)、クレノウ緩
衝液（標準液）および１単位のクレノウポリメラーゼを添加した。反応をＲＴ（
室温）で一晩進行させた。標識をチェックするために、製造元の指示（“he DIG
System User's Guide for Filter Hybridization", Boehringer, Mannheim, Ge
rmany）に従いドットテストを実施した。
【０１０９】 製造元の指示に従い、コムギのｃＤＮＡライブラリーを約２１日齢（“デンプ
ン質”内乳）のカリオプスのポリ（Ａ）＋ＲＮＡからラムダＺａｐ IIベクター
で合成した（ラムダＺＡＰ II−ｃＤＮＡ合成キット；Stratagene GmbH, Heidel
berg)。ｃＤＮＡライブラリーの力価を決定した後、一次力価１.２６×１０6 pf
u／mlを得た。
【０１１０】 コムギｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために、約３５００００の
ファージを平板培養した。ファージを平板培養し、標準的プロトコルでこの平板
をブロットした。フィルターを予備ハイブリダイズし、さらに５×ＳＳＣ、３％
ブロッキング（Boehringer, Mannheim）、０.２％ＳＤＳ、０.１％ラウリルサル
コシンナトリウムおよび５０μｇ／mlのニシン精子ＤＮＡで５５℃でハイブリダ
イズした。このハイブリダイゼーション溶液に１ng／mlの標識甘味質プローブを
加えて一晩インキュベートした。フィルターを２×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ中でＲＴ
で５分、２回；１×ＳＳＣ、０.５％ＳＤＳ中で５５℃で１０分、２回；０.５×
ＳＳＣ、０.２％ＳＤＳ中で５５℃で１０分、２回洗浄した。陽性クローンを更
なるスクリーニングサイクルによって単離した。単一クローンをpBluescriptSK
ファージミド（製造元の指示と同様な方法；Stratagene, Heidelberg, Germany
）としてin vivo切り出しによって得た。
【０１１１】 プラスミドＤＮＡのミニプレップおよび制限切断によってクローンを分析した
後、クローンｐＴａＳＵ−１９を DSMZ Deutsche Sammlung fuer Mikroorganism
en und Zellkulturen GmbH に＃ＤＳＭ１２７９６の番号で寄託し、さらに詳細
に分析した。
【０１１２】 実施例２：プラスミドｐＴａＳＵ１９のｃＤＮＡ挿入物の配列分析 プラスミドＤＮＡをクローンｐＴａＳＵ１９から単離し、ｃＤＮＡ挿入物の配
列をジデオキシヌクレオチド法（Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
74:5463-5467(1977))によって決定した。 クローンＴａＳＵ１９の挿入物は長さが２９９７ｂｐで、部分的なｃＤＮＡを
構成する。そのヌクレオチド配列は配列番号１に示されている。すでに報告され
た配列との比較によって、配列番号１に示した配列は、他の生物のイソアミラー
ゼと相同性を有するコード領域を包含することが明らかになった。配列分析はま
た、このｃＤＮＡ配列内では２つのイントロンが、２９７−３９６位（イントロ
ン１）および１６１８−２１４４（イントロン２）位に配置されていることを明
らかにした。これらのイントロンが除去された場合、他の生物のイソアミラーゼ
の蛋白質配列と相同性を示す蛋白質配列が誘導される。配列番号１のコード領域
に対応するアミノ酸配列は配列番号３に示されている。
【０１１３】 実施例３：植物形質転換ベクターｐＴａ−アルファ−ＳＵ１９の作製 ＴａＳＵ１９−ｃＤＮＡに対応するアンチセンスＲＮＡを発現させるために、
植物形質転換ベクターｐＴａ−アルファ−ＳＵ１９を基本プラスミドｐＵＣ１９
をベースにしてプラスミドｐＴａ−アルファ−ＳＵ１９のｃＤＮＡ挿入物をアン
チセンス方向でユビキチンプロモーターの３′末端に連結することによって構築
した。このプロモーターは、トウモロコシユビキチン１遺伝子の最初の非翻訳エ
クソンおよび最初のイントロンで構成されている（A.H. Christensen et al., P
lant Molecular Biology 19:675-689(1992)）。ポリリンカーおよびＮＯＳター
ミネーターの部分はプラスミドｐＡｃｔ１.ｃａｓ（CAMBIA, TG0063;Cambia, GP
O Box3200, Canberra ACT2601, Australia)に由来する。このターミネーターを
含むベクター構築物およびｐＡｃｔ１.ｃａｓをベースにした構築物は文献に記
載されている（McElroy et al., Molecular Breeding 1:27-37(1995)）。このよ
うにして作製したベクターはｐＵｂｉ.ｃａｓと称した。 このベクターを制限酵素ＸbaＩでクローンＴａ−ＳＵ１９から２ｋｂフラグメ
ントを制限切断してクローニングした。このフラグメントの末端をクレノウ反応
によって充填し、続いて発現ベクターｐＵｂｉ.ｃａｓのＳmaＩクローニング部
位に連結した。 得られた発現ベクターはＴａ−アルファ−ＳＵ１９と称し、コムギの形質転換
に上記のように用いた。
【０１１４】 実施例４：コムギ（Triticum aestivum L., cv Florida）のイソアミラーゼ（甘
味質１相同体）をコードするさらに別のｃＤＮＡの単離および性状決定 クローンｐＴａＳＵ１９の一部分、すなわち配列番号１の部位４８９−１０４
１を表す甘味質プローブで、コムギｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした
。 ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングに用いるコムギ特異的ジゴキシゲニン
標識甘味質プローブをＰＣＲ増幅によって調製した。 この反応で用いたプライマーは以下のとおりであった： ＳＵＳＯ１：５′−ＧＣＴＴＴＡＣＧＧＧＴＡＣＡＧＧＴＴＣＧ−３′（配列番
号８）、および ＳＵＳＯ２：５′−ＡＡＴＴＣＣＣＣＧＴＴＴＧＴＧＡＧＣ−３′（配列番号
９）。
【０１１５】 １ngのプラスミドｐＴａＳＵ１９を鋳型として反応に用いた。さらにＰＣＲ反
応は、各事例で３００ｎＭのプライマーＳＵＳＯ１およびＳＵＳＯ２、各事例で
１００μＭのヌクレオチドｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、６５μＭのｄＴＴＰ
、３５μＭのジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰ（Boehringer Mannheim)、１.５
ｍＭのＭｇＣｌ2および２.５Ｕ（単位）のＴａｑポリメラーゼおよび１０μｌの
１０倍濃縮Ｔａｑポリメラーゼ反応緩衝液（ともに Life Technologies）を含ん
でいた。反応物の最終容積は１００μｌであった。増幅は以下の温度設定でＰＣ
Ｒ装置（ＴＲＩＯ（登録商標）Thermoblock, Biometra)で実施した：９５℃で３
分（１回）；９５℃で４５秒、５５℃で４５秒、７２℃で２分（３０サイクル）
；７２℃で５分（１回）。５５３ｂｐＤＮＡフラグメントが得られた。ジゴキシ
ゲニン−１１−ｄＵＴＰのＰＣＲ生成物への取り込みが、ジゴキシゲニン−１１
−ｄＵＴＰのないコントロール反応の生成物と比較してアガロースゲルでの移動
の低下のために明らかにされた。
【０１１６】 実施例１のカリオプス特異的コムギｃＤＮＡライブラリーを得られたジゴキシ
ゲニン標識プローブでスクリーニングした。 ハイブリダイゼーション工程は、１ng／mｌのジゴキシゲニン標識プローブの
存在する以下の溶液中で６８℃で一晩実施した：５×ＳＳＣ、０.２％ＳＤＳ、
０.１％ラウリルサルコシンナトリウムおよび５０μg／mlのニシン精子ＤＮＡ。
ハイブリダイゼーション後に、フィルターを以下のように洗浄した：２×ＳＳＣ
、１％ＳＤＳ中で室温で５分２回；１×ＳＳＣ、０.５％ＳＤＳ中で６８℃で１
０分２回；０.５×ＳＳＣ、０.２％ＳＤＳ中で６８℃で１０分２回。陽性クロー
ンは、少なくともさらに２回のスクリーニングサイクルによって選抜した。プラ
スミドは、in vivo切り出し（製造元の指示によるプロトコル：Stratagene, Hei
delberg, Germany）によって、ファージクローンpBluescriptSKから得た。得ら
れたクローンの制限分析後、クローンｐＴａＳＵ８Ａを＃ＤＳＭ１２７９５の番
号で寄託し（Deutsche Sammlung fuer Mikroorganismen und Zellkulturen）、
さらに詳細に調べた。
【０１１７】 実施例５：プラスミドｐＴａＳＵ８ＡのｃＤＮＡ挿入物の配列分析 プラスミドｐＴａＳＵ８ＡのｃＤＮＡ挿入物のヌクレオチド配列をジデオキシ
ヌクレオチド法によって決定した（配列番号６）。 クローンｐＴａＳＵ８Ａの挿入物は長さが２４３７ｂｐで、部分的なｃＤＮＡ
を構成する。すでに報告された配列との比較によって、配列番号６に示した配列
は、他の生物のイソアミラーゼと相同性を有するコード領域を含むことが明らか
になった。同様に、クローンｐＴａＳＵ８Ａのコード領域に由来し、配列番号７
に示す蛋白質配列は他の生物のイソアミラーゼの蛋白質配列と相同性を示す。ク
ローンｐＴａＳＵ１９（配列番号１）とｐＴａＳＵ８Ａ（配列番号６）の配列の
比較で９６.８％の類似性が得られた。それらの配列に関する違いのほとんどは
、ｃＤＮＡの３′非翻訳領域に存在する。コード領域の配列に関する残りの相違
は、誘導される蛋白質配列（配列番号３および７）の合計１２の位置でアミノ酸
の相違をもたらす。ｐＴａＳＵ１９およびｐＴａＳＵ８Ａに含まれるｃＤＮＡは
同一ではなくコムギのイソアミラーゼのアイソフォームをコードする。
【０１１８】 実施例６：植物形質転換ベクターｐＴａ−アルファ−ＳＵ８Ａの作製 ＴａＳＵ８ＡのｃＤＮＡに対応するアンチセンスＲＮＡを発現させるために、
植物形質転換ベクターｐＴａ−アルファ−ＳＵ８Ａを基本プラスミドｐＵＣ１９
をベースにしてユビキチンプロモーターの３′末端にＰＣＲ増幅で生成したＴａ
ＳＵ８ＡｃＤＮＡの一部分をアンチセンス方向に連結することによって構築した
。このプロモーターは、トウモロコシユビキチンＩ遺伝子の最初の非翻訳エクソ
ンおよび最初のイントロンで構成されている（A.H. Christensen et al., Plant
Molecular Biology 1:675-689(1992)）。ポリリンカーおよびＮＯＳターミネー
ターの部分はプラスミドｐＡｃｔ１.ｃａｓ（CAMBIA, TG0063; Cambia, GPO Box
3200, Canberra ACT2601, Australia)に由来する。このターミネーターを含むベ
クター構築物およびｐＡｃｔ１.ｃａｓをベースにした構築物は文献に記載され
ている（McElroy et al., Molecular Breeding 1:27-37(1995)）。ユビキチンプ
ロモーター、ポリリンカーおよびＮＯＳターミネーターを含み、ｐＵＣ１９をベ
ースにしたベクターはｐＵｂｉ.ｃａｓと称した。
【０１１９】 ｐＴａ−アルファ−ＳＵ８Ａをクローニングするために、ＴａＳＵ８ＡｃＤＮ
Ａの約２.２ｋｂ部分、すなわち配列番号６の１４０−２３０４位をＰＣＲによ
って増幅した。 この反応に用いたプライマーは以下のとおりであった： ＳＵＥＸ３：５′−ＧＣＧＧＴＡＣＣＴＣＴＡＧＡＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＡ
ＴＡＴＧＧＣＧＧＡＧＧＡＣＡＧＧＴＡＣＧＣＧＣＴＣ−３′（配列番号１０）
、および ＳＵＥＸ４：５′−ＧＣＴＣＧＡＧＴＣＧＡＣＴＣＡＡＡＣＡＴＣＡＧＧＧＣ
ＧＣＡＡＴＡＣ−３′（配列番号１１）。
【０１２０】 １ngのプラスミドｐＴａＳＵ８Ａを鋳型として反応に用いた。さらにＰＣＲ反
応は、各事例で３００ｎＭのプライマーＳＵＥＸ３およびＳＵＥＸ４、各事例で
２００μＭのヌクレオチドｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＴＴＰ、１.
６ｍＭのＭｇＣｌ2、６０ｍＭのトリス−ＳＯ4（ｐＨ９.１）、１８ｍＭの（Ｎ
Ｈ4）2ＳＰ4および１μｌのエロンガーゼ酵素ミックス（Elongase（登録商標）
；ＴａｑポリメラーゼとＤＮＡポリメラーゼとの混合物、Life Technologies）
を含んでいた。反応物の最終容積は５０μｌであった。増幅は以下の温度設定で
ＰＣＲ装置（ＴＲＩＯ（登録商標）Thermoblock, Biometra）で実施した：９４
℃で１分（１回）；９５℃で３０秒、５５℃で３０秒、６８℃で２分３０秒（３
０サイクル）；６８℃で１０分（１回）。反応で長さが２２０５ｂｐのＤＮＡフ
ラグメントが得られた。２.２ｋｂの生成物をＫpnＩおよびＳalＩで制限切断し
、発現ベクターｐＵｂｉ.ｃａｓ（先にＫpnＩおよびＳalＩで切断）に連結した
。得られた植物形質転換ベクターをｐＴａ−アルファ−ＳＵ８Ａと称し、コムギ
の形質転換のために上記のように使用した。
【配列表】
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１２年７月２８日（２０００．７．２８）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 9/44 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｃ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ， ＧＤ，ＧＥ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，Ｔ Ｍ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ (72)発明者 ゲルノート・アーベル ドイツ連邦共和国デー−20146ハンブルク． パーペンダム28 (72)発明者 ウルリヒ・ゲンシェル ドイツ連邦共和国デー−22769ハンブルク． アイムスビュッテラーシュトラーセ100ベ ー Ｆターム(参考） 2B030 AD08 CA15 CA17 CA19 4B024 AA08 BA12 CA04 DA01 EA04 HA01 4B050 CC03 DD13 LL05 4B065 AA88X AA88Y AB01 BA02 CA32 4C090 AA04 BA13 BB32 BB52 BC12 CA50 DA31

Claims (26)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 以下の群から選択されるコムギのイソアミラーゼの機能をも
    つ蛋白質をコードする核酸分子： (ａ) 配列番号３または配列番号７に示されるアミノ酸配列を含む蛋白質をコ
    ードする核酸分子； (ｂ) 配列番号１、配列番号２もしくは配列番号６に示されるヌクレオチド配
    列またはその部分、またはそれに対応するリボヌクレオチド配列を含む核酸分子
    ； (ｃ) (ａ)または(ｂ)で述べた核酸分子とハイブリダイズするか、またはそれ
    と相補的な核酸分子；および (ｄ) 遺伝コードの縮重のために、そのヌクレオチド配列が、(ａ)、(ｂ)また
    は(ｃ)で述べた核酸分子の配列から変異した核酸分子。
  2. 【請求項２】 ＤＮＡ分子である請求項１に記載の核酸分子。
  3. 【請求項３】 ｃＤＮＡ分子である請求項２に記載のＤＮＡ分子。
  4. 【請求項４】 調節エレメントを含む請求項１〜３のいずれかに記載の核酸
    分子。
  5. 【請求項５】 ＲＮＡ分子である請求項１に記載の核酸分子。
  6. 【請求項６】 請求項１〜５のいずれかに記載の核酸分子と特異的にハイブ
    リダイズする核酸分子。
  7. 【請求項７】 少なくとも１５ヌクレオチドの長さを有するオリゴヌクレオ
    チドである請求項６に記載の核酸分子。
  8. 【請求項８】 請求項１〜５のいずれかに記載のＤＮＡ分子を含むベクター
    。
  9. 【請求項９】 核酸分子が、原核細胞または真核細胞内で翻訳可能なＲＮＡ
    の転写および合成を確実にする調節エレメントとセンス方向で連結されている請
    求項８に記載のベクター。
  10. 【請求項１０】 核酸分子が、原核細胞または真核細胞内で翻訳不能なＲＮ
    Ａの合成を確実にする調節エレメントとセンス方向で連結されている請求項８に
    記載のベクター。
  11. 【請求項１１】 核酸分子が、原核細胞または真核細胞内で翻訳不能なＲＮ
    Ａの合成を確実にする調節エレメントとアンチセンス方向で連結されている請求
    項８に記載のベクター。
  12. 【請求項１２】 請求項１〜５のいずれかに記載の核酸分子、または請求項
    ８〜１１のいずれかに記載のベクターで形質転換されたホスト細胞、またはその
    ような細胞から変異したホスト細胞。
  13. 【請求項１３】 請求項１〜４のいずれかに記載の核酸分子によってコード
    される蛋白質。
  14. 【請求項１４】 請求項１２に記載のホスト細胞が、蛋白質を合成させるこ
    とができる条件下で培養され、さらに蛋白質が培養細胞および／または培地から
    単離される、請求項１３に記載の蛋白質の製造方法。
  15. 【請求項１５】 ａ）請求項１〜５のいずれかに記載の核酸分子；またはｂ
    ）請求項８〜１１のいずれかに記載のベクターが植物細胞のゲノムに組み込まれ
    た遺伝子導入植物細胞を作製する方法。
  16. 【請求項１６】 請求項１〜５のいずれかに記載の核酸分子、または請求項
    ８〜１１のいずれかに記載のベクターで形質転換された遺伝子導入植物細胞、ま
    たはそのような細胞から変異した遺伝子導入植物細胞。
  17. 【請求項１７】 ａ1） 請求項１〜５のいずれかに記載の核酸分子またはａ
    2） 請求項８〜１１のいずれかに記載のベクターが植物細胞のゲノムに組み込ま
    れ；さらにｂ）完全な植物が前記植物細胞から再生される遺伝子導入植物細胞を
    作製する方法。
  18. 【請求項１８】 請求項１６に記載の植物細胞を含む植物。
  19. 【請求項１９】 単子葉植物または双子葉植物である請求項１８に記載の植
    物。
  20. 【請求項２０】 農作物である請求項１９に記載の植物。
  21. 【請求項２１】 デンプン貯蔵植物である請求項２０に記載の植物。
  22. 【請求項２２】 植物がトウモロコシ、コメ、ジャガイモ、またはコムギで
    ある請求項２１に記載の植物。
  23. 【請求項２３】 請求項１８〜２２のいずれかに記載の植物の増殖物。
  24. 【請求項２４】 請求項１６に記載の植物細胞、請求項１８〜２２のいずれ
    かに記載の植物、または請求項２３に記載の増殖物から得られるデンプン。
  25. 【請求項２５】 完成または未完成食品類、好ましくはベークト製品または
    パスタ製造のための請求項２４に記載のデンプンの使用。
  26. 【請求項２６】 包装材料または使い捨て製品の製造のための請求項２４に
    記載のデンプンの使用。
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