PT826061E

PT826061E - ''melhoramentos na composição de amido vegetal ou relacionados com o mesmo''

Info

Publication number: PT826061E
Application number: PT96912161T
Authority: PT
Inventors: Michael John Gidley; David Cooke; Martine Debet; Stephen Al Jobling; Richard Safford; Sidebottom Christopher Michael; Westcott Roger John
Original assignee: Brunob Ii Bv
Priority date: 1995-05-05
Filing date: 1996-05-03
Publication date: 2007-10-16
Also published as: WO1996034968A2; US20030166919A1; ES2290956T3; US20050246793A1; DK0826061T3; US6825342B1; ATE366318T1; DE69637153T8; EP0826061A2; WO1996034968A3; CA2217878A1; DE69637153T2; AU5509996A; US6974894B2; EP0826061B1; DE69637153D1; AU706009B2

Description

ΡΕ0826061 1 DESCRIÇÃO "MELHORAMENTOS NA COMPOSIÇÃO DE AMIDO VEGETAL OU RELACIONADOS COM O MESMO"

Campo do invento

Este invento está relacionado com novas sequências nucleotídicas, polipeptídeos codificados pelas mesmas, vectores e células hospedeiras e organismos hospedeiros compreendendo uma ou mais das novas sequências, e com um método de alteração de uma ou mais características de um organismo. 0 invento também está relacionado com amido tendo novas propriedades e com utilizações do mesmo.

Fundamento do invento 0 amido é a principal forma de reserva de carbono nas plantas, constituindo 50% ou mais do peso seco de muitos órgãos de reserva - e.g. tubérculos, sementes de cereais. O amido é usado em numerosas aplicações alimentares e industriais. Em muitos casos, no entanto, é necessário modificar os amidos nativos, através de meios químicos ou físicos, de forma a produzir propriedades distintas, adequadas a aplicações particulares. Será altamente desejável conseguir produzir-se amidos com as propriedades necessárias directamente na planta, eliminando assim a ΡΕ0826061 necessidade de modificação adicional. Para se atingir este objectivo, através da engenharia genética, é necessário conhecer a via metabólica da biossintese do amido. Isto inclui a caracterização de genes e produtos de genes codificados que catalisam a síntese de amido. 0 conhecimento da regulação da biossintese do amido levanta a possibilidade de "reprogramar" as vias de biossintese para criar amidos com novas propriedades, os quais poderão ter novas aplicações comerciais.

As propriedades comercialmente úteis do amido derivam da capacidade da forma granular nativa inchar e absorver água quando do tratamento adequado. Geralmente, é necessário calor para provocar o inchamento dos grânulos, num processo conhecido como gelatinização, o qual foi definido (W A Atwell et al., Cereal Foods World 33, 306-311, 1988) como "... o colapso (disrupção) da ordem molecular dentro do grânulo de amido, manifestado em alterações irreversíveis em propriedades tais como inchamento granular, fusão de cristalitos nativos, perda de birrefrin-gência e solubilização de amido. O ponto de gelatinização inicial e a gama ao longo da qual ocorre são governados pela concentração do amido, método de observação, tipo de grânulo e heterogeneidades dentro da população de grânulos sob observação". Existe uma série de técnicas para determinação de gelatinização induzida pelo calor, sendo um método conveniente e preciso o da calorimetria de varrimento diferencial, o qual detecta a gama de temperatura e entalpia associada ao colapso da ordem molecular dentro do 3 ΡΕ0826061 grânulo. Para se obter resultados precisos e significativos, é geralmente determinado o valor máximo e/ou temperatura do inicio da endotérmica observada por calorimetria de varrimento diferencial. A consequência do colapso da ordem molecular dentro dos grânulos de amido é que os grânulos serem capazes de captar água num processo conhecido como empastamento, que foi definido (W A Atwell et al. Cereal Foods World 33, 306-311, 1988) como " ... o fenómeno após gelatinização na dissolução do amido. Envolve o inchamento granular, exsu-dação dos componentes moleculares do grânulo e, eventualmente, disrupção total dos grânulos". O melhor método de avaliação das propriedades de empastamento é considerado a viscoamilografia (Atwell et al., 1988 referido atrás) em que a viscosidade de uma suspensão de amido em agitação é monitorizada sob um regime definido de tempo/temperatura. Um perfil de viscoamilografia tipico para o amido da batata mostra uma subida inicial na viscosidade, que é considerada como sendo devida a inchamento de grânulos. Para além da forma global da resposta de viscosidade numa viscoamilo-grafia, uma medida quantitativa adequada é a temperatura do desenvolvimento inicial de viscosidade (estabelecimento). A Figura 1 mostra um perfil de viscosidade tipico para o amido de batata, durante e após o cozimento, e inclui as fases A-D que correspondem ao inicio da viscosidade (A), viscosidade máxima (B), dispersão completa (C) e reassocia-ção de moléculas (ou retrogradação, D). Na figura, a linha a tracejado representa viscosidade (em unidades de número 4 ΡΕ0826061 de agitação) de uma suspensão a 10% p/p de amido e a linha continua mostra a temperatura em graus centígrados. Num determinado ponto, definido como o pico da viscosidade, o inchamento dos grânulos é tão extenso que as estruturas altamente expandidas resultantes são susceptiveis de fragmentação induzida mecanicamente nas condições de agitação usadas. Com o aumento do aquecimento e manutenção a 95°C, posterior redução da viscosidade é observada devido ao aumento da fragmentação dos grânulos inchados. Este perfil geral foi consistentemente encontrado para o amido nativo da batata.

Após aquecimento de amidos em água a 95 °C e manutenção a esta temperatura (tipicamente durante 15 minutos), o subsequente arrefecimento até 50°C resulta num aumento da viscosidade devido ao processo de retrogradação ou de recesso. A retrogradação (ou recesso) é definida (Atwell et al., 1988 referido atrás) como "... um processo que ocorre quando as moléculas compreendendo amido gelatínizado começam a reassociar-se numa estrutura ordenada ...". A 50°C, é principalmente o componente amilose que se reassocia, conforme indicado pelo aumento na viscosidade na viscoamilografia do amido derivado de milho normal (21,6% amilose) comparado com amido de milho ceroso (1,1% amilose) como se mostra na Figura 2. A Figura 2 é um viscoamilografia de suspensões de amido a 10% p/p derivado milho ceroso (linha a cheio), milho convencional (pontos e traços), variedade teor elevado de amilose (hylon5, linha a ponteado) e uma variedade teor de amilose muito elevado 5 ΡΕ0826061 (hylon 7, cruzes). 0 perfil de temperatura é igualmente mostrado pela linha a cheio, como na Figura 1. 0 grau de aumento da viscosidade na viscoamilografia quando do arrefecimento e manutenção a 50°C depende da quantidade de amilose que é capaz de se reassociar devido à sua exsudação dos grânulos de amido durante os processos de gelatinização e empastamento. Uma caracteristica dos amidos ricos em amilose derivados das plantas de trigo é que muito pouca amilose é exsudada dos grânulos por gelatinização e empastamento até 95°C, provavelmente devido ao inchamento restrito dos grânulos. Isto está ilustrado na Figura 2, que mostra baixas viscosidades para amido com amilose elevada (44,9%) (Hylon 5) derivado de milho durante a gelatinização e empastamento a 95°C e pouco aumento da viscosidade quando do arrefecimento e manutenção a 50°C. Este efeito é mais extremo para um teor de amilose mais elevado (58%, como em Hylon 7), o qual mostra viscosidades ainda mais baixas no teste de viscoamilograf ia (Figura 2) . Para os amidos de amilose elevada comercializados (actualmente disponíveis a partir de plantas de milho, tais como as descritas atrás), o processamento a mais de 100°C é geralmente necessário de forma a gerar os benefícios de teores de amilose elevados relativamente a aumentos de velocidades e forças de reasso-ciação, mas a utilização de tais temperaturas elevadas é energeticamente desfavorável e dispendiosa. Assim, mantém-se a necessidade de amidos de alto teor de amilose que podem ser processados abaixo de 100°C e ainda apresentarem níveis elevados de reassociação, conforme indicado, por exemplo, por medições de viscoamilografia. 6 ΡΕ0826061

As propriedades do amido da batateira são úteis numa variedade de aplicações alimentares e não alimentares (papel, têxteis, adesivos, etc.)· No entanto, para muitas aplicações, as propriedades não são as óptimas e várias modificações químicas e físicas bem conhecidas da área são efectuadas de forma a melhorar as propriedades úteis. Os dois tipos de manipulação de propriedades que seriam usados são: a alteração controlada das temperaturas de gelatinização e empastamento; e a utilização de amidos que sofrem menos fragmentação granular durante o empastamento do que os amidos convencionais.

Actualmente, as únicas formas de manipulação das temperaturas de gelatinização e empastamento do amido de batata são através da inclusão de aditivos tais como açúcares, compostos poli-hidroxilados de sais (Evans & Haisman, Starke 34, 224-231. 1982) ou por extensivos pré-tratamento físicos ou químicos (e.g. Stute, Starke 44, 205-214, 1992). A redução da fragmentação dos grânulos durante o empastamento pode ser conseguido através de extenso pré-tratamento físico (Stute, Starke 44, 205-214, 1992) ou através da ligação química cruzada. Tais processos são inconvenientes e ineficientes. É assim desejável obter plantas que produzam amido que possua intrinsecamente tais propriedades vantajosas. O amido consiste em dois polissacáridos principais, amilose e amilopectina. A amilose é um polímero 7 ΡΕ0826061 geralmente linear, contendo unidades de glucose ligadas em a-1,4, enquanto a amilopectina é um polimero altamente ramificado consistindo num esqueleto de glucano ligado em a-1,4 com ramificações de glucano ligadas em a-1,6. Na maior parte das reservas de aramazenamento de plantas, a amilopectina constitui cerca de 75% do teor de amido. A amilopectina é sintetizada pela acção concertada da sintetase de amido solúvel e da enzima de ramificação do amido [a-1,4 glucano 6-glicosiltransferase, EC 2.4.1.18]. A enzima de ramificação do amido (SBE) hidrolisa as ligações a-1,4 e volta a ligar o glucano clivado, através de uma ligação a-1,6, a uma cadeia aceitadora para produzir uma estrutura ramificada. As propriedades físicas do amido são fortemente afectadas pela abundância relativa de amilose e amilopectina, e SBE é portanto uma enzima crucial na determinação da quantidade e da qualidade dos amidos produzidos em sistemas vegetais.

Na maior parte das plantas até agora estudadas, e.g. milho (Boyer & Preiss, 1978 Biochem. Biophys. Res.80, 169-175), arroz (Smyth, 1988 Plant Sei. 57, 1-8) e ervi-lheira (Smith. Planta 175, 270-279), foram identificadas duas formas de SBE, cada uma delas codificada por um gene separado. Uma revisão recente de Burton et al., (1995 The Plant Journal 7, 3-15) demonstrou que as duas formas de SBE constituem classes distintas da enzima de tal forma que, em geral, as enzimas da mesma classe derivadas de diferentes plantas podem apresentar maior similaridade entre si do que enzimas de diferentes classes derivadas da mesma planta. Na ΡΕ0826061 sua revisão, Burton et ai., designou as duas famílias de enzimas respectivamente por classe "A" e classe "B" e o leitor pode recorrer a estas referências (e às referências ai citadas) para uma discussão detalhada das distinções entre as duas classes. Uma distinção geral de salientar parece ser a presença, nas moléculas SBE classe A, de um dominio N-terminal flexível, que não é encontrado nas moléculas da classe B. As distinções salientadas por Burton et al., são aqui usadas para definir moléculas SBE classe A e classe B, termos esses que serão interpretados em concordância.

No entanto, na batata apenas uma isoforma da molécula SBE (pertencente à classe B) foi até agora descrita e apenas um gene foi clonado (Blennow & Johansson, 1991 Phytochem. 30, 437-444 e Kobmann et al., 1991 Mol. Gen. Genet. 230, 39-44). Ainda, as tentativas publicadas para modificar as propriedades do amido em plantas de batateira (através da prevenção da expressão da única SBE conhecida), de um modo geral, não tiveram êxito (e.g. Muller-Rober & Kobmann 1994 Plant Cell and Environment 17, 601-613) .

Sumário do invento

Num primeiro aspecto o invento proporciona uma sequência nucleotídica isolada, codificadora de um poli-peptídeo compreendendo a sequência de aminoácidos dos resíduos 49-882 na sequência apresentada na Figura 5, ou o seu complemento. 9 ΡΕ0826061 A sequência de aminoácidos mostrada na Figura 5 (Seq ID N° 15) inclui uma sequência lider que dirige o polipeptídeo, quando sintetizado em células de batateira, para o amiloplasto. Os familiarizados com a área reconhecerão que a sequência lider é removida para produzir uma enzima madura e que a sequência lider não é pois essencial para a actividade enzimática. Assim, uma "fracção eficaz" do polipeptídeo é uma que possua actividade SBE suficiente para complementar a mutação da enzima de ramificação em células E. coli KV 832 (descrito abaixo) e que é activa quando expressa em E. coli no ensaio de estimulação da fosforilação. Um exemplo de um polipeptídeo incompleto que, no entanto, constitui uma "fracção eficaz" é a enzima madura sem a sequência líder. Por analogia com a sequência SBE classe A de ervilheira, a sequência classe A da batata, apresentada na Figura 5, provavelmente possui uma sequência líder de aproximadamente 48 resíduos de aminoácidos, de forma que a sequência de aminoácidos N-terminal comece à volta do resíduo de ácido glutâmico (E) na posição 49 (EKSSYN... etc.). Os familiarizados com a matéria sabem que uma fracção eficaz da enzima pode bem omitir outras partes da sequência mostrada ma Figura sem substancial efeito prejudicial. Por exemplo, a região C-terminal rica em ácido glutâmico poderá ser reduzida em tamanho, ou possivelmente eliminada na sua totalidade, sem abolir a actividade SBE classe A. Uma comparação com outras sequências SBE conhecidas, especialmente outras sequências SBE da classe A (ver por exemplo, Burton et al., 1995 atrás 10 ΡΕ0826061 referido), deverá indicar os segmentos que são altamente conservados (e assim provavelmente essenciais para a actividade) e os segmentos menos bem conservadas (e assim provavelmente suportarão mais alterações da sequência sem perda substancial da actividade enzimática).

Por conveniência, a sequência nucleotidica compreenderá substancialmente os nucleótidos 289 a 2790 da sequência de DNA (Seq ID NO:14) mostrada na Figura 5 (nucleótidos esses que codificam a enzima madura) ou um seu equivalente funcional, e pode também incluir outros nucleótidos no extremo 5' ou 3', Por exemplo, por facilidade de expressão, a sequência compreenderá preferencialmente um codão de iniciação da tradução ATG na mesma grelha de leitura e pode também codificar uma sequência líder. Assim, numa realização, a sequência ainda compreende os nucleótidos 145 a 288 da sequência mostrada na Figura 5. Outras realizações são os nucleótidos 228 a 2855 da sequência designada "psbe2con.seq" na Figura 8 e os nucleótidos 57 a 2564 da sequência mostrada na Figura 12 (de preferência compreendendo uma codão de iniciação ATG na mesma grelha de leitura, como seja a sequência de nucleótidos 24 a 56 na mesma Figura) ou equivalentes funcionais das referidas sequências. O termo "equivalente funcional", como aqui aplicado a sequências nucleotídicas, destina-se a englobar as sequências que diferem na sua composição nucleotidica da apresentada na Figura 5 mas que, devido à degenerescência 11 ΡΕ0826061 do código genético, codificam polipeptideos tendo sequências de aminoácidos idênticas ou substancialmente idênticas. Pretende-se que o termo também se aplique a sequências que sejam suficientemente homólogas da sequência do invento de forma a poderem hibridar com o seu complemento em condições de hibridação restringentes - tais equivalentes possuirão de preferência pelo menos 85%, mais de preferência pelo menos 90% e, mais de preferência pelo menos 95% de homologia de sequência com a sequência do invento, conforme exemplificado pelos nucleótidos 289 a 2790 da sequência de dna mostrada na Figura 5. Será aparente para os familiarizados com a matéria que a sequência nucleotidica do invento pode igualmente encontrar uma aplicação útil quando presente como sequência complementar da sequência codificadora. Assim, as sequências funcionalmente equivalentes também incluirão as sequências que podem hibridar, em condições de hibridação restringente, com a sequência do invento (em lugar do seu complemento). Tais equivalentes da sequência complementar da sequência codificadora possuirão, de preferência pelo menos 85%, mais de preferência pelo menos 90% e, mais de preferência 95% de homologia de sequência com o complemento da sequência do invento, conforme exemplificado pelos nucleótidos 289 a 2790 da sequência de DNA mostrada na Figura 5. Equivalentes funcionais particulares estão apresentados, por exemplo, nas Figuras 8 e 10 (se não atendermos às mutações de mudança de leitura ali presentes). O invento também proporciona vectores, particu- 12 ΡΕ0826061 larmente vectores de expressão, compreendendo a sequência de nucleótidos do invento. 0 vector tipicamente compreenderá um promotor e um ou mais sinais reguladores dos tipos conhecidos dos familiarizados com a matéria. 0 invento também inclui a obtenção de células transformadas (termo esse que inclui transdução e transfecção) com um vector compreendendo a sequência nucleotidica do invento. 0 invento ainda proporciona um polipeptideo SBE classe A, obtido a partir de batateiras e codificado pela sequência de ácido nucleico do primeiro aspecto do invento. Em particular, o invento proporciona o polipeptideo numa forma substancialmente pura, especialmente numa forma sem outros componentes derivados de plantas (especialmente derivados de batateira), o qual pode ser facilmente conseguido pela expressão da sequência nucleotidica relevante num hospedeiro não vegetal adequado (como seja qualquer uma das estirpes de levedura usadas de rotina para fins de expressão, e.g. Pichia spp. ou Saccharomyces spp.). Tipicamente, a enzima compreenderá substancialmente a sequência de resíduos de aminoácidos 49 a 882 mostrada na Figura 5 (pondo de lado a sequência MNKRIDL, que não faz parte da enzima) ou um seu equivalente funcional. 0 polipeptideo do invento pode ser usado num método de modificação de amido in vitro, compreendendo tratamento de amido em condições adequadas (e.g. temperatura, pH, etc adequados) com uma quantidade eficaz do polipeptideo de acordo com o invento. 13 ΡΕ0826061 0 termo "equivalente funcional", conforme aqui aplicado às sequências de aminoácidos, destina-se a englobar sequências de aminoácidos substancialmente semelhantes à apresentada na Figura 5, de forma que o polipeptídeo possui actividade suficiente para complementar a mutação da enzima de ramificação em células de E.coli KV832 (descrito abaixo) e que é activa em E. coli no ensaio de estimulação da fosforilação. Tipicamente, tais sequências de aminoácidos funcionalmente equivalentes possuirão, de preferência, pelo menos 85%, mais de preferência pelo menos 90%, e ainda mais de preferência pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos da enzima madura (i.e. sem a sequência lider) mostrada na Figura 5. É do conhecimento dos familiarizados com a matéria que podem ser feitas substituições conservadas, geralmente ao longo da molécula sem afectar substancialmente a actividade da enzima. Ainda, podem ser toleradas algumas substituições não conservadas, especialmente nas regiões menos conservadas da molécula. Tais substituições podem ser feitas, por exemplo, para modificar ligeiramente a actividade da enzima. O polipeptídeo pode, caso se pretenda, incluir uma sequência líder, como a exemplificada pelos resíduos 1 a 48 da sequência de aminoácidos mostrada na Figura 5, se bem que outras sequências líder e peptídeos sinal e similares possam ser incluídos.

Uma fracção da sequência nucleotídica do invento pode ser introduzida numa planta e afectar as caracte-rísticas da planta. Em particular, a introdução da 14 ΡΕ0826061 sequência do invento, operacionalmente ligada na orientação contrária à da cadeia codificadora a um promotor adequado, reduz a quantidade de moléculas de amido ramificadas na planta. Ainda, foi recentemente demonstrado noutros sistemas experimentais que a "supressão com a cadeia complementar da cadeia codificadora" pode também ocorrer (i.e. a expressão de uma sequência introduzida, operacionalmente ligada na mesma orientação pode interferir, por algum mecanismo desconhecido, com a expressão do gene nativo), como descrito por Matzke & Matzke (1995 Plant Physiol. 107, 679-685). Qualquer um dos métodos referidos por Matzke & Matzke poderá, teoricamente, ser usado para afectar a expressão num hospedeiro de um gene SBE homólogo.

Pensa-se que os métodos que utilizam sequências complementares da sequência codificadora operem através da produção de um mRNA complementar do mRNA da sequência codificadora, inibindo a sua tradução em polipeptideo funcional, possivelmente fazendo com que o hibrido de RNA seja degradado (e.g. Sheehy et ai., 1988 PNAS 85, 8805-8809; Van der Krolet al., Mol. Gen. Genet. 220, 204-212). A supressão com sequências codificadoras também requer homologia entre a sequência introduzida e o gene alvo, mas o mecanismo exacto é pouco claro. É aparente, no entanto, que em relação à supressão com sequência complementar da sequência codificadora e sequência codificadora, nem uma sequência nucleotídica de tamanho completo, nem uma sequência "nativa" é essencial. De preferência, a "fracção eficaz" usada no método compreenderá pelo menos um terço da 15 ΡΕ0826061 sequência completa mas, através de tentativa e erro, podem ser encontrados outros fragmentos (menores ou maiores) que sejam funcionais na alteração das caracteristicas da planta.

Assim, num outro aspecto o invento proporciona um método de alteração das caracteristicas de uma planta, compreendendo a introdução numa planta de uma fracção da sequência do invento operacionalmente ligada a um promotor adequado activo na planta, de forma a afectar a expressão de um gene presente na planta. Convenientemente, a sequência será ligada ao promotor na orientação oposta à codificadora. De preferência, a planta é uma batateira. Por conveniência, a caracteristica alterada está relacionada com o teor e/ou composição do amido da planta (i.e. quantidade e/ou tipo de amido presente na planta). De preferência, o método de alteração das caracteristicas da planta compreenderá igualmente a introdução de uma ou mais sequências adicionais para além de uma fracção da sequência do invento. A sequência introduzida do invento e uma ou mais de outras sequências (que podem ser sequências codificadoras ou sequências complementares de sequências codificadoras) podem ser operacionalmente ligadas a um único promotor (que assegurará que ambas as sequências sejam transcritas essencialmente em simultâneo) ou podem ser operacionalmente ligadas a promotores separados (que podem ser necessários para expressão óptima). Sempre que sejam empregues promotores separados, estes podem ser idênticos uns aos outros ou diferentes. Promotores ade- 16 ΡΕ0826061 quados são conhecidos dos familiarizados com a área e incluem os de tipo constitutivo e de tipo induzível. Os exemplos incluem o promotor 35S de CaMV (e.g. simples ou repetido em tandem) e o promotor da patatina. Vantajosamente, o promotor será especifico de tecido. É desejável que o promotor cause expressão da sequência operacionalmente ligada em níveis substanciais, apenas no tecido da planta em que ocorra substancialmente a síntese e/ou armazenamento de amido. Assim, por exemplo, quando a sequência é introduzida numa batateira, o promotor operacionalmente ligado pode ser específico do tubérculo, como seja o promotor de patatina. É desejável que a sequência adicional compreenda uma fracção da sequência codificadora da molécula SBE classe B de batatateira. É desejável, por exemplo, que o método compreenda também a introdução de uma fracção de uma sequência codificadora de uma SBE classe B, operacionalmente ligada na orientação contrária à codificadora a um promotor adequado activo na planta. Convenientemente, a sequência adicional compreenderá uma fracção eficaz da sequência descrita por Blennow & Johansson (1991 Phytochem. 30, 437-444) ou a descrita em W092/11375. Mais de preferência, a sequência adicional compreenderá pelo menos uma fracção da sequência descrita no Pedido de Patente Internacional N° WO95/26407. A utilização de sequências complementares da sequência codificadora contra SBE classe A e classe B em combinação foi desenvolvida pelos presentes inventores e resulta na produção de amido tendo 17 ΡΕ0826061 propriedades fortemente alteradas (ver abaixo). Os familiarizados com a matéria reconhecerão a possibilidade de, no caso da planta já compreender uma sequência codificadora ou complementar da sequência codificadora que eficazmente inibe a actividade SBE classe B, a introdução de uma sequência codificadora ou complementar da sequência codificadora para inibir a actividade SBE classe A (produzindo assim uma planta com inibição da actividade classe A e classe B) deverá alterar fortemente as propriedades do amido na planta, sem necessidade de introdução mais sequências. Assim, a sequência do invento é convenientemente introduzida em plantas tendo já níveis baixos de actividade SBE classe A e/ou classe B, de forma a que a inibição que resulta da introdução da sequência do invento tenha um efeito mais pronunciado. A sequência do invento, e uma ou mais de outras sequências, caso se pretenda, pode ser introduzida na planta através de qualquer uma de várias técnicas bem conhecidas (e.g., transformação mediada por Agrobacterium ou por métodos "balísticos"). As sequências serão provavelmente mais eficazes na inibição da actividade SBE em batateiras, mas teoricamente poderão ser introduzidas em qualquer planta. Exemplos desejáveis incluem ervilheira, tomateiro, milho, trigo, arroz, cevada, batata-doce e mandioca. De preferência, a planta compreenderá um gene natural codificadora de uma molécula SBE que apresenta homologia razoável com a sequência de ácido nucleico introduzida do invento. 18 ΡΕ0826061

Num outro aspecto, o invento proporciona uma célula vegetal ou uma planta ou descendência da mesma, que compreende uma construção tendo a sequência do primeiro aspecto do invento. A descendência da planta alterada pode ser obtida, por exemplo, através de propagação vegetativa ou através do cruzamento da planta alterada e recolha da semente assim obtida. 0 invento também proporciona partes da planta alterada, como sejam órgãos de reserva. Por conveniência, por exemplo, o invento proporciona tubérculos compreendendo amido alterado, os referidos tubérculos sendo obtidos a partir de uma planta alterada ou descendência da mesma. Os tubérculos da batateira obtidos a partir de plantas alteradas (ou sua descendência) serão materiais particularmente úteis em determinadas aplicações industriais e para a preparação e/ou processamento de produtos alimentares e podem ser usados, por exemplo, para preparar panquecas e batatas fritas com baixo teor de gordura (a amilose sendo geralmente usada como revestimento para prevenir a ingestão de gordura) e para preparar puré de batata (especialmente puré de batata "instantâneo") tendo caracteristicas particulares. 0 invento também proporciona amido como definido em qualquer uma das reivindicações 1-16 nas reivindicações apensas. A utilização de sequências nucleotidicas de acordo com o invento tem permitido aos presentes inventores produzir amidos de batata tendo uma grande variedade de novas propriedades. ΡΕ0826061

Em particular, o invento proporciona o seguinte: uma planta (especialmente uma batateira) contendo amido que, quando extraído da planta através de moagem a húmido, à temperatura ambiente, tem uma elevada temperatura de inicio de viscosidade (convenientemente aumentada em 10-25°C) avaliada por viscoamilografia, efectuada de acordo com o protocolo definido na reivindicação 7 das reivindicações apensas, comparativamente com o amido extraido de uma planta não alterada geneticamente idêntica; uma planta (especialmente uma batateira) contendo amido que, quando extraido da planta através de moagem a húmido, à temperatura ambiente, tem um máximo de viscosidade mais baixo (convenientemente mais baixo 240-700 SNUs) avaliado por viscoamilografia, realizada de acordo com o protocolo definido na reivindicação 7 das reivindicações apensas, comparativamente com amido extraido de uma planta não alterada, geneticamente idêntica; uma planta (especialmente uma batateira) contendo amido que, quando extraído da planta através de moagem a húmido à temperatura ambiente, possui uma maior viscosidade de empastamento (convenientemente aumentada em 37-260 SNUs) avaliada pela viscoamilo-grafia, efectuada de acordo com o protocolo definido na reivindicação 7 das reivindicações apensas, comparativamente com amido extraido de uma planta não alterada, geneticamente idêntica; uma planta (especialmente batateira) contendo amido que, quando extraído da planta através de moagem a húmido à temperatura ambiente, possui um aumento de viscosidade de retrogradação (convenientemente 20 ΡΕ0826061 aumentada em 224-313 SNUs) avaliado por viscoamilografia, realizada de acordo com o protocolo definido na reivindicação 7 das reivindicações apensas, comparativamente com amido extraído de uma planta não alterada, geneticamente idêntica; uma planta (especialmente batateira) contendo amido que, quando extraído da planta através de moagem a húmido à temperatura ambiente, possui um abaixamento da viscosidade de retrogradação (convenientemente aumentada em 224-313 SNUs) avaliado por viscoamilografia, realizada de acordo com o protocolo definido na reivindicação 7 das reivindicações apensas, comparativamente com amido extraído de uma planta não alterada geneticamente idêntica; uma planta (especialmente batateira) contendo amido que, quando extraído da planta através de moagem a húmido à temperatura ambiente, possui um teor elevado de amilose, avaliado pelo ensaio iodométrico de acordo com o método de Morrison & Laignelet 1983. (referido atrás) comparativamente com amido extraído de uma planta não alterada, geneticamente idêntica. O invento também proporciona amido tendo as propriedades atrás referidas.

Em particular, o invento proporciona amido que, quando extraído da planta através de moagem a húmido à temperatura ambiente, possui uma ou mais das seguintes propriedades, avaliadas por análise de viscoamilografia realizada de acordo com as condições definidas abaixo: temperatura de início de viscosidade na gama de 70-95°C); viscosidade máxima na gama de 500-12 unidades de número de agitação; viscosidade de empastamento na gama de 214-434 21 ΡΕ0826061 unidades de número de agitação; viscosidade de retrogradação na gama 450-618 ou 14-192 unidades de número de agitação; ou não apresenta aumento significativo na viscosidade durante a viscoamilografia. As viscosidades máxima, de empastamento e de retrogradação estão definidas abaixo. A temperatura de início da viscosidade é a temperatura a que ocorre um aumento súbito marcado na viscosidade relativamente aos níveis basais durante a viscoamilografia e é um termo conhecido dos familiarizados com a matéria.

Noutras realizações particulares, o invento proporciona amido que quando extraído a partir de batateira por moagem a húmido à temperatura ambiente tem uma viscosidade máxima na gama de 200 -500 SNUs e uma viscosidade de retrogradação na gama de 275-618 SNUs, avaliado por viscoamilografia de acordo com o protocolo definido abaixo; e amido que quando extraído a partir de batateira por moagem a húmido tem uma viscosidade que não diminui entre o início da fase de aquecimento (passo 2) e o início da fase de manutenção (passo 5) e tem uma viscosidade de retrogradação de 303 SNUs, ou inferior, avaliado por viscoamilografia de acordo com o protocolo definido abaixo.

Para fins do presente invento, as condições da viscoamilografia são entendidas como relativas à análise de uma suspensão aquosa a 10% (p/p) de amido à pressão atmosférica, usando um analisador Newport Scientific Rapid 22 ΡΕ0826061

Visco com um perfil de aquecimento de : manutenção a 50°C durante 2 minutos (passo 1), aquecimento entre 50 e 95°C a uma velocidade de 1,5°C por minuto (passo 2), manutenção a 95°C durante 15 minutos (passo 3), arrefecimento de 95 para 50°C a uma velocidade de 1,5°C por minuto (passo 4) e depois manutenção a 50°C durante 15 minutos (passo 5) . O pico de viscosidade pode ser definido para fins do presente invento como a viscosidade máxima atingida durante a fase de aquecimento (passo 2) ou a fase de manutenção (passo 3) da viscoamilografia. A viscosidade de empastamento pode ser definido como a viscosidade atingida pelas suspensões de amido no final da fase de manutenção (passo 3) da viscoamilografia. A viscosidade de retrogradação pode ser definida como a viscosidade da suspensão de amido no final do passo 5 da viscoamilografia.

Ainda num outro aspecto, o invento proporciona amido a partir de batateira tendo um teor em amilose aparente (%p/p) de pelo menos 35%, avaliado por ensaio iodométrico de acordo com o método descrito por Morrison & Laignelet (1983 J. Cereal Science 1, 9-20). De preferência, o amido terá uma teor de amilose de pelo menos 40%, mais de preferência pelo menos 50% e, mais de preferência pelo menos 66%. O amido obtido directamente a partir de uma batateira e tendo tais propriedades até agora nunca foi até agora conseguido. De facto, como resultado do presente invento, é agora possível gerar in vivo amido de batata que possui algumas propriedades análogas aos amidos com amilose muito elevada (e.g. Hylon 7) obtidos a partir de milho. 23 ΡΕ0826061

Os amidos com elevados teores de amilose (pelo menos 35%) apresentam aplicação comercial por, entre outras razões, o componente de amilose do amido reassociar-se mais fortemente e rapidamente do que o componente amilopectina durante os processos de retrogradação. Isto pode resultar, por exemplo, em pastas com viscosidades mais elevadas, géis de maior coesão ou filmes de mais força para amidos com teores de amilose elevados (pelo menos 35%) comparativamente com amidos de teores de amilose normais (menos de 35%). Como alternativa, podem ser obtidos os amidos com teores de amilose muito elevados, de forma a que a estrutura do grânulo seja substancialmente preservada durante o aquecimento, resultando em suspensões de amido que não apresentam aumento substancial na viscosidade durante o cozimento (i.e. não existe aumento de viscosidade significativo durante as condições de viscoamilografia definidas atrás). Tais amidos tipicamente apresentam um aumento de viscosidade inferior a 10% (de preferência menos de 5%) durante a viscoamilografia nas condições definidas atrás.

No comércio, estas propriedades importantes são normalmente obtidas a partir de amidos de alto teor de amilose derivados de plantas de milho. Será importante em termos comerciais ter uma fonte alternativa de amidos com elevado teor de amilose a partir da batata, uma vez que outras caracteristicas tais como tamanho do grânulo, propriedade organolépticas e qualidades de textura podem distinguir os desempenhos práticos dos amidos com elevado 24 ΡΕ0826061 teor de amilose derivados de plantas do milho e da batateira.

Assim, amido com elevado teor de amilose obtido pelo método do presente invento pode ter aplicação em muitos campos tecnológicos diferentes, os quais podem ser classificados de um modo genérico em dois grupos: produtos alimentares e de processamento; e aplicações "industriais". No campo dos produtos alimentares, os novos amidos do presente invento podem ter aplicação como, por exemplo, filmes, barreiras, revestimentos ou agentes de gelificação. Em geral, os amidos com alto teor de amilose do invento podem ser vantajosamente usados na preparação de produtos fritos com baixo teor em gordura (e.g. batatas fritas, batatas fritas onduladas e similares). Os novos amidos podem também ser empregues com vantagem em confeitaria e em amidos granulares e "resistentes" à retrogradação. Amido "resistente" é amido que é resistente à digestão por a-amilase. Como tal, o amido resistente não é digerido pela α-amilase presente no intestino delgado humano, mas passa para o cólon onde apresenta propriedades semelhantes à fibra dietética solúvel e insolúvel. 0 amido resistente é assim uma mais valia nos produtos alimentares devido ao seu baixo valor calórico e ao seu elevado teor em fibra dietética. 0 amido resistente é formado pela retrogradação (semelhante à recristalização) de amilose a partir dos géis de amidos. Tal retrogradação é inibida pela amilopectina. Assim, os amidos de elevado teor de amilose do presente invento são materiais de partida excelentes para a 25 ΡΕ0826061 preparação de amido resistente. Métodos adequados para a preparação de amido resistente são do conhecimento dos familiarizados com a matéria e incluem, por exemplo, os descritos em US 5051271 e US 5281276. Por conveniência os amidos resistentes proporcionados pelo presente invento compreendem pelo menos 5% da fibra dietética total, avaliado pelo método de Prosky et al., (1985 J. Assoe. Off. Anal. Chem. 68, 677), referido em US 5281276.

Com a designação de aplicações "industriais", os novos amidos do invento podem ser vantajosamente empregues, por exemplo, em adesivos ondulados, em produtos biodegradáveis tais como embalagens pouco cheias e formas esponjosas e na produção de fibras de vidro e têxteis.

Os familiarizados com a matéria reconhecerão que os novos amidos do invento podem, caso se pretenda, ser sujeitos in vítro a modificação enzimática, física e/ou química, como seja ligação cruzada, introdução de grupos hidrofóbicos (e.g. ácido octenilsuccínico) ou derivatização (e.g. por meio de esterificação ou eterificação). O invento proporciona amidos com elevado teor de amilose (35% ou mais) que podem gerar viscosidades de pasta superiores às obtidas a partir de amidos de elevado teor de amilose derivados de plantas de milho após processamento a temperaturas abaixo de 100°C. isto proporciona a vantagem de tratamentos de gelatinização e empastamento de amido mais económicos, através da utilização de temperaturas de 26 ΡΕ0826061 processamento mais baixas do que actualmente é necessário para amidos de elevado teor de amilose derivados de plantas de milho. 0 invento será agora descrito através de exemplos ilustrativos e com referência aos desenhos, dos quais:

Figura 1 mostra uma viscoamilografia tipica para uma suspensão a 10% p/p de amido de batata;

Figura 2 mostra viscoamilografias para suspensões a 10% p/p de amido de várias variedades de milho;

Figura 3 é uma representação esquemática da estratégia de clonagem usada pelos presentes inventores;

Figura 4a mostra o alinhamento de aminoácidos da fracção C-terminal das isoformas de enzimas de ramificação de amido derivadas de várias fontes; os residuos de aminoácidos coincidentes com a sequência de consenso estão a sombreado;

Figura 4b mostra o alinhamento de sequências de DNA de várias isoformas de enzimas de ramificação de amido que codificam uma sequência de aminoácidos conservada;

Figura 5 mostra a sequência de DNA (Seq ID N° 14) e a sequência de aminoácidos prevista (Seq ID N° 15) de um ΡΕ0826061 clone de cDNA de SBE classe A, de tamanho completo de batata, obtido por PCR;

Figura 6 mostra uma comparação da parte mais conservada das sequências de aminoácidos das moléculas SBE de batata classe A (sequência superior) e classe B (sequência inferior);

Figura 7 mostra uma comparação das sequências de aminoácidos completas das moléculas SBE de batata classe A (sequência superior) e classe B (sequência inferior);

Figura 8 mostra um alinhamento de DNA de vários clones de SBE classe A, de tamanho completo, obtidos pelos inventores;

Figura 9 mostra a sequência de DNA de um clone de SBE classe A de batata, determinado por sequenciação directa de produtos de PCR, juntamente com a sequência de aminoácidos prevista;

Figura 10 é um alinhamento múltiplo de DNA de vários clones completos de SBE A de batata obtidos pelos inventores;

Figura 11 é uma ilustração esquemática do plasmideo pSJ64; 28 ΡΕ0826061

Figura 12 mostra a sequência de DNA e a sequência de aminoácidos prevista do clone completo de SBE classe A de batata presente no plasmideo pSJ90; e

Figura 13 mostra viscoamilografias para suspensões a 10% p/p de amido derivado de várias batateiras transgénicas preparadas pelo método relevante do invento.

Exemplos

Exemplo 1

Clonagem de SBE classe A de batata A estratégia para clonagem da segunda forma de enzima de ramificação de amido derivada de batata está apresentada na Figura 3. As setas pequenas representam sequências iniciadoras usadas pelos inventores em protocolos de PCR e RACE. O tamanho aproximado dos fragmentos isolados está indicado pelos números à direita da Figura. A titulo explicativo, uma comparação das sequências de aminoácidos de várias enzimas de ramificação de amido (SBE) derivadas de milho (classe A), ervilheira (classe A), milho (classe B), arroz (classe B) e batata (classe B), assim como enzima de ramificação de glicogénio humana, permitiu aos inventores identificar uma região no terço carboxi-terminal da proteína, que é quase comple tamente conservada (GYLNFMGNEFGHPEWIDFPR) (Figura 4a) . Um ΡΕ0826061 alinhamento múltiplo das sequências de DNA (humana, ervi-lheira classe A, batata classe B, milho classe B, milho classe A e arroz classe B, respectivamente) correspondendo a esta região está apresentado na Figura 4b e foi usado para desenhar um oligonucleótido que potencialmente hibridará com todas as enzimas de ramificação do amido: AATTT(C/T)ATGGGIAA(C/T)GA(A/G)TT(C/T)GG (Seq ID N°20). PCR a partir de uma biblioteca 0 isolamento inicial de um clone parcial de cDNA de SBE classe A de batata foi a partir de uma biblioteca de cDNA de tubérculo de batata amplificada no vector Xzap (Stratagene) . Meio μΐ de uma biblioteca de cDNA de batata (titulo 2,3 x 109 pfu/ml) foi usado como matriz numa reacção de 50 μΐ, contendo 100 pmoles de uma sequência iniciadora POTSBE 16 vezes degenerada e 25 pmoles de uma sequência iniciadora T7 (presente no vector ÀZap, 3' relativamente às sequências de cDNA - ver Figura 3), dNTPs 100 μΜ, 2,5 U de Polimerase Taq e o tampão fornecido com a Polimerase Taq (Stratagene). Todos os componentes, excepto a enzima, foram adicionados a um tubo de microcentrífuga de 0,5 ml, cobertos com óleo mineral e incubados a 94°C durante 7 minutos e depois mantidos a 55°C, enquanto a Polimerase Taq foi adicionada e misturada por pipetagem. O PCR foi então realizado através da incubação durante 1 min a 94°C, 1 min a 58°C e 3 minutos a 72°C durante 35 ciclos. Os produtos de PCR foram extraídos com fenol/clorofórmio, precipitados com etanol e ressuspensos em TE pH 8,0 antes da clonagem no vector T/A pT7BlueR (Invitrogen). 30 ΡΕ0826061 Vários fragmentos entre 600 e 1300 pb foram amplificados. Estes foram isolados num gel de agarose e clonados no vector de clonagem T/A pT7BlueR. O mapeamento de restrição de 24 clones, seleccionados ao acaso, mostrou que pertenciam a vários grupos diferentes (baseado no tamanho e presença/ausência de locais de restrição). Inicialmente, foram escolhidos quatro clones para sequenciação. Destes quatro, encontrou-se que dois correspondiam à sequência conhecida da SBE classe B de batata, no entanto os outros dois, ainda que homólogos, diferiam significativamente e eram mais semelhantes à sequência SBE classe A de ervilheira, sugerindo que pertencessem à família da classe A de enzimas de ramificação (Burton etal., 1995 The Plant Journal, referido atrás). Os dois últimos clones (« 800 pb) foram totalmente sequenciados. Ambos continham o extremo 5' da sequência correspondendo ao oligonucleótido degenerado usado no PCR e tinham uma grelha de leitura aberta deduzida de 192 aminoácidos. A sequência de amino-ácidos deduzida era altamente homóloga da SBE classe A de ervilheira. O fragmento de cDNA de « 800 pb derivado do PCR (correspondendo aos nucleótidos 2281 a 3076 da sequência psbe2con.seq mostrada na Figura 8) foi usado como sonda para testar a biblioteca de cDNA de tubérculo de batata. A partir de cento e oitenta mil placas, foram obtidos sete clones positivos no primeiro rastreio. A análise por PCR mostrou que cinco destes clones eram mais pequenos do que o ΡΕ0826061 clone de cDNA original de 800 pb, pelo que não foram mais analisados. Os dois outros clones (designados 3.2.1 e 3.1.1) tinham aproximadamente 1200 e 1500 pb de comprimento, respectivamente. Estes foram sequenciados a partir dos extremos 5' e a sequência de consenso combinada alinhada com a sequência dos clones gerados por PCR. O clone de cDNA 3.2.1 foi removido do vector fágico, o DNA de plasmí-deo foi preparado e o inserto totalmente sequenciado. Várias tentativas para obter clones maiores a partir da biblioteca foram infrutíferas, assim os clones contendo o extremo 5' do gene de tamanho completo foram obtidos usando RACE (amplificação rápida dos extremos de cDNA).

Condições de amplificação rápida dos extremos de cDNA (RACE) e de PCR

Efectuou-se RACE essencialmente de acordo com Frohman (1992 Amplifications 11-15). Duas pg de RNA total a partir de tubérculos de batata maduros foram aquecidas a 65°C durante 5 minutos e rapidamente arrefecidas em gelo. O RNA foi então sujeito transcrição reversa em 20 μΐ de reacção, durante 1 hora a 37°C, usando transcriptase reversa de MMLV da BRL e tampão com 1 mM DTT. dNTPs 1 mM, 1 υ/μΐ de RNasina (Promega) e 500 pmoles de hexâmeros ao acaso (Pharmacia) como sequências iniciadoras. As sequências iniciadoras em excesso foram removidas numa coluna Centricon 100 e o cDNA foi recuperado e precipitado com isopropanol, o cDNA foi dotado de uma cauda poli-A num volume de 20 μΐ usando 10 Unidades de transferase terminal (BRL), dATP 200 32 ΡΕ0826061 μΜ, durante 10 minutos a 37°C, seguido de 5 minutos a 65°C. A reacção foi então diluida para 0,5 ml com TE μΐ pH 8 e guardada a 4°C, enquanto os clones de cDNA derivados do cDNA total eram isolados através de amplificação por PCR usando as sequências iniciadoras R0RidTi7, R0 e POTSBE24. O PCR foi realizado em 50 μΐ usando uma técnica de inicio a quente: 10 μΐ do cDNA total foram aquecidos a 94°C em água, durante 5 min, com 25 pmoles de POTSBE24, 25 pmoles de Ro e 2,5 pmoles de R0RidTi7 e arrefecidos até 75°C. Cinco μΐ de tampão de PCR lOx (Stratagene), dNTPs 200 μΜ e 1,25 unidades de Polimerase Taq foram adicionados, a mistura foi aquecida a 45°C durante 2 minutos e 72°C durante 40 minutos seguido de 35 ciclos a 94°C durante 45 segundos, 50°C durante 25 segundos, 72°C durante 1,5 minutos e uma incubação final a 72°C durante 10 min. Os produtos de PCR foram separados por electroforese em géis de 1% de agarose de baixo ponto de fusão e o arrastamento cobrindo a gama de fragmentos de 600-800 pb foi removido e usado numa segunda volta de amplificação por PCR com 25 pmoles das sequências Ri e POTSBE25, numa reacção de 25 μΐ (28 ciclos de 94°C durante 1 minuto, 50°C 1 minuto, 72°C 2 minutos) . Os produtos foram purificados por extracção com clorofórmio e clonados em pT7Blue. O PCR foi usado para testar as colónias e os clones mais longos foram sequenciados. A primeira reacção de RACE apenas prolongou o comprimento da sequência SBE em aproximadamente 100 bases, portanto foi construída uma nova biblioteca de cDNA com cauda poli-A usando o oligonucleótido POTSBE24 especifico ΡΕ0826061 de SBE classe A (10 pmoles) numa tentativa para recuperar produtos de RACE mais longos. A primeira e segunda reacção de PCR foram realizadas usando novas sequências iniciadoras para SBE classe A (POTSBE 28 e 29 respectivamente) derivadas dos novos dados de sequências. As condições foram como anteriormente, excepto o passo de elongação no primeiro PCR ser de 3 min e o segundo PCR consistir em 28 ciclos a 94°C durante 45 segundos, 55°C durante 25 segundos e 72°C durante 1 min 45 segundos.

Os clones com um tamanho entre 400 pb e 1,4 Kb foram isolados e sequenciados. A sequência combinada dos produtos mais longos de RACE e os clones de cDNA previam um gene de tamanho completo de aproximadamente 3150 nucleótidos, excluindo a cauda poli(A) (psbe 2con.seq na Fig. 8).

A medida que a sequência da metade 5' do gene foi compilada a partir da sequência de vários produtos de RACE gerados usando Polimerase Taq, era possível observar que a sequência compilada não representava a de uma única espécie de mRNA e/ou tinha alterações na sequência nucleotídica. As 1600 pb 5' do gene foram assim novamente isoladas por PCR usando Ultma, uma DNA polimerase termostável que, devido a possuir actividade de exonuclease 3'-5', tem uma menor taxa de erro comparativamente com a polimerase Taq. Vários produtos de PCR foram clonados e mapeados por restrição e encontrou-se diferirem no número de locais HindIII, SspI e EcoRI. Estas diferenças não representam artefactos de PCR 34 ΡΕ0826061 uma vez que foram observados em clones obtidos a partir de reacções de PCR independentes (dados não apresentados) e indicam que existem várias formas do gene SBE classe A transcritas em tubérculos de batateira.

Para assegurar que a sequência do clone de cDNA de tamanho completo derivava de uma única espécie de mRNA foi portanto necessário fazer a amplificação por PCR do gene num único fragmento, preparou-se cDNA de acordo com o protocolo RACE, excepto ter sido usado o oligonucleótido adaptador R0RidTi7 (5 pmoles) como sequência iniciadora e após a sintese a reacção ser diluida para 200 μΐ com TE pH 8 e guardada a 4°C. Dois μΐ do cDNA foram usados numa reacção de PCR de 50 μΐ usando 25 pmoles das sequências iniciadoras pBERl e PBERT especificas de SBE classe A (ver abaixo) e trinta ciclos de 94°C durante 1 min, 60°C durante 1 min e 72°C durante 3 min. No caso de ser usada polimerase Taq, os produtos de PCR foram clonados em pT7Blue, enquanto que no caso de se usar polimerase Ultma os produtos de PCR eram purificados por extracção com clorofórmio, precipitação com etanol e fosforilados num volume de 20 μΐ (e depois clonados em pBSSK IIP que foi previamente cortado com EcoRV e desfosforilado). Foram isoladas pelo menos quatro classes de cDNA, as quais novamente diferiam na presença ou ausência de locais HindIII, SspI e EcoRI. Três destes clones foram totalmente sequenciados, no entanto um clone não se conseguiu isolar em quantidade suficiente para sequenciar. 35 ΡΕ0826061 A sequência de um dos clones (número 19) está apresentada na Figura 5. 0 primeiro codão da metionina (iniciação) inicia uma pequena grelha de leitura aberta (ORF) de 7 aminoácidos que está fora da grelha de leitura da ORF seguinte deduzida, de 882 aminoácidos, com uma massa molecular (Mr) de aproximadamente 100 Kd. Os nucleótidos 6-2996 correspondem à sequência SBE, o resto da sequência mostrada deriva do vector. A Figura 6 mostra uma comparação da parte mais conservada da sequência de aminoácidos de SBE classe A de batata (resíduos 180-871, linha superior) com SBE classe B de batata (linha inferior, resíduos 98-792); a linha do meio indica o grau de similaridade, resíduos idênticos sendo designados pela letra comum, as alterações conservadas dois pontos e as alterações neutras um único ponto. Os traços indicam intervalos introduzidos para optimizar o alinhamento. A proteína SBE classe A tem 44% de identidade ao longo do seu comprimento com SBE classe B de batata e 56% de identidade com a mesma no domínio central conservado (Figura 6), avaliado pelo programa "Mesalign" (DNASTAR). No entanto, a Figura 7 mostra uma comparação entre SBE classe A de batata (linha superior, resíduos 1-873) e SBE classe A de ervilheira (linha inferior, resíduos 1-861), a partir do que se pode observar que o gene de batata clonado é mais homólogo com a enzima de ervilheira classe A, em que a identidade é de 70% ao longo de quase todo o comprimento e aumenta para 83% ao longo da região conservada central (começando em IPPP na posição «170). É claro a partir desta análise que este gene de SBE de batata clonado pertence à família da classe A de genes SBE. 36 ΡΕ0826061

Uma cultura em E. colí, contendo o plasmídeo pSJ78 (que dirige a expressão de um gene SBE classe A de batata de tamanho completo), foi depositada (em 3 de Janeiro de 1996) nos termos do Tratado de Budapeste na The Nationa Collections of Industrial and Marine Bactéria Limited (23 St Machar Drive, Aberdeen, AB2 1RY, United Kingdom), com o número de acesso NCIMB 40781. O plasmídeo pSJ78 é equivalente ao clone 19 descrito atrás. Representa um cDNA SBE A de tamanho completo ligado com extremidades cerses ao vector pBSSKHP.

Polimorfismo dos genes SBE classe Ά A análise da sequência dos outros dois genes SBE classe A de tamanho completo mostrou que continham mutações geradoras de mudança de grelha de leitura e seriam portanto incapazes de codificar as proteínas de tamanho completo e, de facto, foram incapazes de complementar a deficiência em enzima de ramificação no mutante KV832 (descrito abaixo). Um alinhamento das sequências de DNA de tamanho completo está apresentado na Figura 8: "lOcon.seq" (Seq ID No. 12), "19con.seq" (Seq ID N° 14) e "llcon.seq" (Seq ID N° 13) representam a sequência dos clones completos 10, 19 e 11 obtidos por PCR usando as sequências iniciadoras PBERl e PBERT (ver abaixo), enquanto "psbe2con.seq" (Seq ID N°18) representa a sequência de consenso dos clones RACE e o clone de cDNA 3.2.1. Os nucleótidos que diferem da sequência de consenso global (não apresentada) estão a 37 ΡΕ0826061 sombreado. Os traços indicam intervalos introduzidos para optimizar o alinhamento. Para além das mutações geradoras de mudança da grelha de leitura, estes clones são altamente homólogos. Deverá ser salientados que a sequência 5' de psbe2con é maior devido a ser o maior produto de RACE e também conter várias alterações comparativamente com outros clones. O codão de metionina a montante ainda está presente neste clone, mas a ORF a jusante está encurtada em 3 aminoácidos e existe ainda uma deleção de 10 bases no lider não traduzido 5'. A outra região importante de variação é a região terminal carboxilo da região codificadora da proteína. Uma análise mais detalhada desta região revela uma estrutura de repetições do trinucleótido GAA que varia de comprimento entre os quatro clones. Estas são características típicas de uma região repetida micro-satélite. O clone mais divergente é #11 que tem apenas um tripleto GAA, enquanto o clone 19 tem onze repetições perfeitas e os outros dois clones possuem cinco e sete repetições GAA. Todas estas deleções mantêm a ORF, mas alteram o número de resíduos de ácido glutâmico no extremo carboxilo da proteína. A maior parte das outras diferenças entre os clones são diferenças de bases isoladas. É muito possível que algumas destas sejam erros de PCR. Para avaliar esta questão foi feita sequenciação directa dos fragmentos de PCR amplificados a partir da primeira cadeia de cDNA. A Figura 9 mostra a Sequência de dna, e a sequência de aminoácidos deduzida, obtida através de tal sequenciação 38 ΡΕ0826061 directa. Determinados locais de restrição estão igualmente assinalados. Os nucleótidos que puderam ser assinalados sem ambiguidade estão indicados usando a notação convencional da IUPAC e, quando a incerteza afecta a sequência de aminoácidos prevista, é usado um ponto de interrogação. As sequências nos extremos 5' e 3' do gene não puderam ser determinadas devido à heterogeneidade observada nos diferentes genes clonados nestas regiões (ver parágrafo anterior). No entanto isto pode ser considerado evidência indirecta de que estas diferenças são reais e não são artefactos de PCR ou de clonagem. Não existe absolutamente evidência para as mutações de mudança de grelha de leitura na sequência derivada por PCR e parece que estas mutações são um artefacto do processo de clonagem, resultante da pressão selectiva negativa em E. coli. isto é apoiado pelo facto de ter sido extremamente difícil clonar os produtos de PCR de tamanho completo, uma vez que foram observadas muitas deleções grandes e os clones de tamanho completo obtidos terem todos sido clonados numa só orientação (oposta ao promotor LacZ), talvez sugerindo que a expressão do gene seja tóxica para as células. Dificuldades desta natureza podem ter sido responsáveis, pelo menos em parte, pela incapacidade de outros investigadores obterem o presente invento.

Uma comparação de todas as sequências de tamanho completo está apresentada na Figura 10. Para além dos clones 10, 11 e 19, estão apresentadas as sequências de um 39 ΡΕ0826061 produto BglII-Xhol clonado directamente no vector de expressão QE32 ("86CON. SEQ", Seq ID N° 16) e a sequência de consenso dos produtos de PCR directamente sequenciados ("pcrsbe2con.seq". Seq ID N° 17) . Os nucleótidos que diferem da sequência de consenso (não apresentada) estão a sombreado. Os traços indicam intervalos introduzidos para optimizar o alinhamento. Existem 11 diferenças de nucleó-tidos previstos como estando presentes na população de mRNA, os quais estão indicados por asteriscos acima e abaixo da sequência. As outras diferenças são provavelmente artefactos de PCR ou possivelmente erros de sequenciação.

Complementação de um mutante de E. coli deficiente na enzima de ramificação.

Para determinar se o gene de SBE isolado codifica uma proteína activa, i.e. uma que tenha actividade de enzima de ramificação, foi efectuado um teste de complementação em E. coli estirpe KV832. Esta estirpe é incapaz de produzir glicogénio bacteriano uma vez que o gene da enzima de ramificação do glicogénio foi eliminado (Keil et al.r 1987 Mol. Gen. Genet. 207, 294-301). Quando as células selvagens são crescidas na presença de glucose sintetizam glicogénio (um polímero de glucose altamente ramificado) que cora de cor castanha com iodo, enquanto as células KV832 fazem apenas um polímero de glucose de cadeia linear que cora de verde azulado com iodo. Para determinar se o gene SBE clonado poderá restaurar a capacidade das células KV832 para fazerem um polímero ramificado, o clone pSJ90 (Seq ID N° 19) foi usado e construído como abaixo 40 ΡΕ0826061 descrito. A construção é um fragmento de tamanho completo essencialmente derivado de PCR (produzido usando as sequências iniciadoras PBE 2B e PBE 2X, detalhadas abaixo), o qual foi cortado com Bglll e Xhol e clonado nos locais BamHl/SalI do vector de expressão pQE32 (Qiagen) com cauda de histidinas. Este clone, pSJ86, foi sequenciado e encontrou-se ter uma mutação geradora de mudança de grelha de leitura de duas bases na metade 5' do gene. Esta mudança de grelha de leitura foi removida por digestão com Nsil e SnaB I e substituída com o fragmento correspondente de um vector de expressão gerado por PCR com Taq). O polipeptídeo codificado por pSJ90 corresponde aos aminoácidos 46-882 da sequência codificadora completa de SBE. A construção pSJ90 foi usada para transformar as células KV832 deficientes na enzima de ramificação e os transformantes foram crescidos em meio PYG sólido (0,85% KH2P04, 1,1% K2HP04, 0,6% de extracto de levedura) contendo 1,0% de glucose. Para testar a complementação, uma ansada de células foi removida por raspagem e ressuspensa em 150 μΐ de água, a que se adicionou 15 μΐ de solução de Lugol (2 g de Kl e 1 g de l2 por 300 ml de água). Observou-se que as células KV832 transformadas com o fragmento de SBE de batata agora coravam de cor castanho amarelado com iodo, enquanto que as células testemunha contendo apenas o vector pQE32 continuaram a corar de verde azulado.

Expressão de SBE classe Ά de batata em E. coli

Colónias isoladas de KV832, contendo um dos plasmídeos pQE32, pAGCRl ou pSJ90, foram picadas para 50 ml 41 ΡΕ0826061 de meio 2xYT contendo carbenicilina, canamicina e estreptomicina conforme adequado (100, 50 e 25 mg/1, respectivamente) num frasco de 250 ml e crescidas durante 5 horas, com agitação, a 37°C. Adicionou-se então IPTG para uma concentração final de 1 mM para induzir a expressão e os frascos foram ainda incubados durante a noite a 25°C. As células foram colhidas por centrifugação e ressuspensas em tampão fosfato de sódio 50 mM (pH 8,0) contendo NaCl 300 mM, 1 mg/ml de lisozima e PMSF 1 mM e deixadas em gelo durante 1 hora. Os lisados celulares foram então sonicados (3 pulsos de 10 segundos a uma potência de 40% usando uma micro-sonda) e clarificados por centrifugação a 12000 g durante 10 minutos a 4°C. Os lisados clarificados foram concentrados aproximadamente 10 vezes numa unidade de filtração Centricon™30. Amostras de 10 μΐ, em duplicado, do extracto resultante foram avaliadas relativamente a actividade de SBE através do método de estimulação da fosforilação, como descrito no Pedido de Patente Internacional N° PCT/GB95/00634. Resumidamente, a mistura de reacção do ensaio padrão (0,2 ml) foi tampão ácido 2-(N-morfolino)etanossulfónico (MES) 200 mM pH 6,5, contendo 100 nCi de 14C glucose-l-f osf ato a 50 mM, 0,05 mg de fosfori-lase A de coelho e lisado de E. coli. A mistura de reacção foi incubada durante 60 minutos a 30°C e a reacção terminada e o polímero de glucano precipitado pela adição de 1 ml de metanol a 75% (v/v), 1% (p/v) de hidróxido de potássio e depois 0,1 ml de glicogénio (10 mg/ml). Os resultados estão apresentados abaixo: 42 ΡΕ0826061

Construção Actividade SBE (cpm) pQE32 (testemunha) 1 829 pSJ90 (SBE classe A de batata) 14 327 pAGCRl (SBE classe a de ervilha) 29 707 A actividade de SBE classe A de batata é 7-8 vezes acima dos níveis de fundo. Concluiu-se assim que o gene SBE classe A de batata foi capaz de complementar a mutação SBE no ensaio de estimulação da fosforilação e que o gene clonado de facto codifica a actividade da enzima de ramificação.

Oligonucleótidos

Foram usados os oligonucleótidos sintéticos que se seguem (Seq ID Nos 1-11, respectivamente)

RoRidTi7 Ro Ri POTSBE24 POTSBE25 POTSBE28 POTSBE29 PBERl PBERT PBE2B PBE2X AAGGATCCGTCGACATCGATAATACGACTCACTATAGGGA (T) 17

AAGGATCCGTCGACATC

GACAT C GATAATAC GAC

CAT C CAAC CACCATCTCGCA

T T GAGAGAAGATAC C TAAGT

ATGTTCAGTCCATCTAAAGT

AGAACAACAATTCCTAGCTC

GGGGCCTTGAACTCAGCAAT

CGTCCCAGCATTCGACATAA

CTTGGATCCTTGAACTCAGCAATTTG

TAACTCGAGCAACGCGATCACAAGTTCGT 43 ΡΕ0826061

Exemplo 2

Produção de plantas transgénicas

Construção de vectores de transformação de plantas com genes de enzimas de ramificação de amido complementares da sequência codificadora

Um fragmento Sacl-Xhol de 1200 pb, codificador de aproximadamente a metade -COOH da SBE classe A de batata (isolada a partir do clone recuperado 3.2.1 de Xzap), foi clonado nos locais Sacl-Sall do vector de transformação de plantas pSJ29 para criar o plasmideo pSJ64, o qual está ilustrado esquematicamente na Figura 11. Na Figura, a linha a cheio representa a sequência de DNA. A linha a tracejado representa o esqueleto de plasmideo bacteriano (contendo a origem de replicação e a marca de selecção bacteriana), a qual não está mostrada na sua totalidade. Os triângulos a cheio na linha significam os limites do T-DNA (RB = fronteira direita, LB = fronteira esquerda). Os locais de restrição relevantes estão apresentados acima da linha a cheio, com as distâncias aproximadas (em quilobases) entre os locais (marcados com asteriscos) apresentadas abaixo da linha. As setas mais estreitas indicam sinais de poli-adenilação (panos = nopalina sintetase, pAg7 = gene 7 de Agrobacterium), as setas de espessura intermédia significam regiões codificadoras de proteína (SBE li = SBE classe A de batata, HYG = gene de resistência à higromicina) e as setas mais de maior espessura representam regiões de promotor (P- 44 ΡΕ0826061 2x35 = duplo promotor CaMV 35S, Pnos = promotor da nopalina sintetase). Assim, pSJ64 continha o fragmento do gene SBE classe A numa orientação contrária à da sequência codificadora entre o promotor 2X 35S CaMV e o sinal de poli-adenilação da nopalina sintetase.

Para informação, pSJ29 é um derivado do vector binário pGPTV-HYG (Becker et al., 1992 Plant Molecular Biology 20, 1195-1197) modificado como se segue: um fragmento de aproximadamente 750 pb (Saci, extremos cerses com T4 DNA polimerase - Sall) de pJlT60 (Guerineau et al., 1992 Plant Mol. Biol. 18, 815-818), contendo o duplo promotor do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV) e 35S (estirpe Cabb-Jl, equivalente aos nucleótidos 7040 a 7376 duplicados a montante de 7040 a 7433, Frank et al., 1980, Cell 21, 285-294), foi clonado nos locais HindIII (reparado com polimerase Klenow) - Sall de pGTV-HYG para criar pSJ29.

Transformação de plantas A transformação foi conduzida em dois tipos de explantes de batateira; minitubérculos não transformados selvagens (de forma a dar transformantes isolados contendo apenas a construção complementar da sequência codificadora da classe A) ou minitubérculos derivados de três linhas de culturas de tecidos (que deram origem às plantas #12, #15, #17 e #18 indicadas na Tabela 1) as quais tinham sido já transformadas com êxito com a construção complementar da sequência codificadora (SBE I) classe B contendo o promotor 45 ΡΕ0826061 35S em tandem (de forma a obter plantas duplos transfor-mantes, contendo sequências complementares da sequência codificadora para as enzimas da classe A e da classe B) .

Os detalhes do método de transformação com Agrobacterium e do crescimento de plantas transformadas, estão descritos no Pedido de Patente Internacional N° WO 95/26407, excepto o meio usado conter 3% de sucrose (não 1%) até à transferência final e a incubação inicial com Agrobacterium (estirpe 3850) ser realizada no escuro. Os transformantes contendo a sequência complementar da sequência codificadora classe A foram seleccionados em meio contendo 15 mg/1 de higromicina (a construção da sequência complementar da sequência codificadora classe A compreendendo o gene HYG, í.e. fosfotransferase de higromicina). A transformação foi confirmada em todos os casos pela produção de um fragmento de DNA do gene complementar da sequência codificadora, após PCR na presença de sequências iniciadoras adequadas e de um extracto bruto de DNA genómico para cada rebento regenerado.

Caracterização de amido derivado de batateiras O amido foi extraído a partir de plantas como se segue: tubérculos de batata foram homogeneizados em água durante 2 minutos num misturador Waring operando a velocidade elevada. O homogenato foi lavado e filtrado (inicialmente através de filtros de 2 mm, depois através de 1 mm) usando cerca de 4 litros de água por 100 g de tubérculo (6 46 ΡΕ0826061 extracções). Os grânulos de amido foram finalmente extraídos com acetona e secos ao ar. 0 amido extraído a partir de batateiras transformadas com um único gene (complementar da sequência codificadora classe a/SBE II ou complementar da sequência codificadora classe B/SBE I), ou a partir de duplos transformantes (complementar da sequência codificadora classe A/SBE II e classe B/SBE I) ou a partir de plantas testemunha controlo não transformadas, foi parcialmente caracterizado. Os resultados estão apresentados na Tabela 1. A Tabela mostra a quantidade de actividade SBE (unidades/grama de tecido) em tubérculos derivados de cada uma das plantas transformadas. A temperatura do pico da endotérmica (°C) de amido extraído a partir de várias plantas foi determinada por DSC e a temperatura de empastamento (°C) foi determinada por referência a viscoamilo-grafia ("RVA"), como descrito em WO 95/26407. A visco-amilografia foi como se segue: passo 1 - 50°C durante 2 minutos; passo 2 - aumento da temperatura de 50°C para 95°C a uma velocidade de 1,5°C por minuto; passo 3 - manutenção a 95°C durante 15 minutos; passo 4 - arrefecimento de 95°C até 50°C a uma velocidade de 1,5°C por minuto; e finalmente, passo 5 - manutenção a 50°C durante 15 minutos. A Tabela 1 mostra a viscosidade máxima, de empastamento e retrogradação em unidades do número de agitação ("stirring number units, SNUs"), que é uma medida da quantidade de binário necessário para agitar as suspensões. A viscosidade do pico pode ser definida, para 47 ΡΕ0826061 os presentes fins, como a viscosidade máxima atingida durante a fase de aquecimento (passo 2) ou a fase de manutenção (passo 3) da viscoamilografia. A viscosidade de empastamento pode ser definida como a viscosidade atingida pelas suspensões de amido no final da fase de manutenção (passo 3) da viscoamilografia. A viscosidade de retrogradação pode ser definida como a viscosidade da suspensão de amido no final do passo 5 da viscoamilografia.

Uma determinação do teor aparente em amilose (% p/p) foi igualmente efectuada, usando o método do ensaio iodométrico de Morrison & Laignelet (1983 J. Cereal Sei. 1, 9-20). Os resultados (percentagem de amilose aparente) estão apresentados na Tabela 1. As plantas testemunha não transformadas e transformadas deram origem a amidos tendo teores aparentes em amilose na gama de 29(+/-3%).

De um modo geral valores semelhantes para o teor em amilose foram obtidos a partir do amido extraído da maioria das plantas transformadas com um único gene contendo a sequência complementar da sequência codificadora da classe A (SBE II) . No entanto, algumas plantas (#152, 249) deram origem a amido tendo um teor aparente de amilose de 37-38%, fortemente superior ao valor do controlo. O amido extraído a partir destas plantas tinha temperaturas de empastamento marcadamente elevadas e o amido derivado da planta 152 também apresentou uma temperatura do pico da endotérmica elevada (o amido derivado da planta 249 não foi testado por DSC). ΡΕ0826061

Tabela 1 DSC Viscoamilografia (RVA) Teor aparente Teor de Descrição da amostra Número Actividade Temperatura Temperatura inicial(°C) Viscosidade Viscosidade Viscosidade de amilose (% fósforo da SBE no máxima (°C) máxima (SNU) de de p/p) (mg/100 g) amostra tubérculo empastamento retrogração (U/g de (SNU) amido) Testemunha não transformada 146 7,6 65,8 65,5 545 161 260 31,2 68 243 22,2 nd 62,6 761 135 241 29,1 SBE classe A "antisense" 152 12,7 69,5 70,9 467 380 529 37,5 89 249 13,9 nd 70,0 497 434 518 38,5 SBE Classe B (17) (testemunha) 145 0,7 66,9 66,8 669 177 305 29,8 111 "antisense" 150 0,6 74,0 86,0 214 214 303 53,1 198 SBE Classe B (17) "antisense" + 161 0,5 73,0 76,6 349 324 618 40,9 206 SBE Classe A "antisense" SBE Classe B (18) (testemunha) 144 1,6 64,5 64,7 714 154 258 29,0 97 "antisense" SBE Classe B (18) "antisense" + 149 3,0 68,5 69,9 474 267 482 35,6 127 SBE Classe A "antisense" SBE Classe B (15) (testemunha) 172 0,22 nd 65,4 707 167 290 28,8 130 "antisense" SBE Classe B (15) "antisense" 201 0,10 Nd >95 Sem pico 12 13 66,4 210 + SBE Classe A "antisense" 208a 0,10 Nd >95 Sem pico 15 17 64,1 208 0,30 72,8-80,5 >95 Sem pico 14 19 62,8 240 202 0,02 nd 89,4 Sem pico 172 245 57,9 212 1,40 nd 78,0 308 296 541 49,5 220 1,40 nd 75,8 355 345 593 44,1 SBE Classe B (12) (testemunha) 170 0,2 nd 66,5 768 202 303 27,8 "antisense" SBE Classe B (15) "antisense" 236 0,7 nd 95,0 Sem pico 23 14 60,4 + SBE Classe A "antisense" 236a 0,9 nd 91,2 Sem pico 139 192 56,7 230a 0,8 nd 77,6 244 239 450 48,2

Perfil RVA 50°C (2 min), 50-95°C (l,5°C/min), 95°C (15 min), 95-50°C (l,5°C/min), 50°C (15 min)

Viscosidade de empastamento (47 min) no final de 50°C (2 min), 50-95°C (l,5°C/min), 95°C (15 min)

Viscosidade de retrogradação (92 min) no final do perfil SBE Enzima de ramificação de amido não determinado SNU "Unidades número de agitação" do instrumento (unidades arbitrárias); Nd ΡΕ0826061 49 r

ΡΕ0826061 50

ΡΕ0826061 51 -

ν :<4’ «ns· ^ v5 O n-í ΛΝ;. >·Ν Λ f' í <5 fi semm&fa ««sitíA ?dwm& «*« Ãg-iAaçI^ {m£4$ã#$4®fe*í3SÍÍí»®0 m & $ <$ v* f s & *Ϋ j i iS* V -wt >«í Ϊ* <& f-í S <$ :\ £* ts* s> w & 1 A \vt S» íiC; V: & m ΡΕ0826061 52

53 ΡΕ0826061

Deve-se notar que, mesmo que outros transfor-mantes com um único gene não sejam aproveitados para obter amido com uma razão amilose/amilopectina alterada, o amido derivado de tais plantas ainda possuirá propriedades diferentes relativamente ao amido derivado de plantas convencionais (e.g. peso molecular médio diferente ou padrões de ramificação de amilopectina diferentes), que deverão ser úteis.

Plantas duplos transformantes, contendo sequências complementares da sequência codificadora para enzimas da classe A e da classe B, tinham actividade SBE grandemente reduzida (unidades/g) comparativamente com plantas não transformadas ou transformantes complementares da sequência codificadora classe A. (como se mostra na Tabela 1) . Ainda, determinadas plantas duplos transformantes continham amido tendo propriedades significativamente muito alteradas. Por exemplo, o amido extraído a partir das plantas #201, 202, 208, 208a, 236 e 236a tinha as proporções amilose/amilopectina drasticamente alteradas, até ao ponto da amilose ser o principal constituinte do amido destas plantas. As temperatura de empastamento do amido derivado destas plantas foram também as mais aumentadas (em cerca de 25-30°C). O amido de plantas tais como #150, 161, 212, 220 e 230a representou uma gama de intermediários, uma vez que tal amido apresentava um aumento mais modesto do teor de amilose e da temperatura de empastamento. Os resultados tendem a sugerir que existe, de 54 ΡΕ0826061 um modo geral, uma correlação entre o teor de % de amilose e a temperatura de empastamento, o que está de acordo com o comportamento dos amidos derivados de outras fontes, principalmente de milho. 0 aumento marcado do teor de amilose obtido por inibição apenas de SBE classe A, comparativamente com a inibição de SBE classe B sozinha (ver PCT/GB95/00634), sugere que seria vantajoso transformar plantas primeiro com uma construção para suprimir a expressão de SBE classe A (provavelmente, na prática, uma construção complementar da sequência codificadora), seleccionar as plantas que dão origem a amido com as propriedades mais alteradas e depois transformar novamente com uma construção que suprima a expressão de SBE classe B (novamente, na prática, provavelmente uma construção complementar da sequência codificadora) , de forma a tornar máximo o grau de modificação do amido.

Para além das temperaturas de empastamento, outras caracteristicas do perfil da viscoamilografia e.g. os amidos derivados das plantas #149, 150, 152, 161, 201, 236 e 236a mostraram diferenças significativas relativamente aos amidos das plantas testemunha, conforme ilustrado na Figura 13. Relativamente à Figura 13, é apresentada uma série de linhas de viscoamilografia. A legenda é a seguinte: quadrado cheio - amido normal de batata testemunha (28,9% de teor de amilose); círculos cheios - amido 55 ΡΕ0826061 da planta 149 (35,6% de amilose); triângulo cheio, apontando para cima - planta 152 (37,5%); triângulo cheio, apontando para baixo - planta 161 (40,9%); lozango cheio -planta 150 (53,1%); quadrado vazio - planta 236a (56,7%); círculo vazio - planta 236 (60,4%); triângulo vazio, voltado para cima - planta 201 (66,4%); triângulo vazio, voltado para baixo - amido Hylon V, de milho (44,9% de amilose). A linha estreita representa o perfil de aquecimento.

Com o teor crescente de amilose, decrescem as viscosidades máximas durante o processamento a 95°C e a queda da viscosidade máxima até ao fim da temperatura de manutenção a 95°C também, de uma forma geral, diminui (de facto, para algumas das amostras de amido existe um aumento da viscosidade durante este período) . Ambos os resultados indicam fragmentação reduzida dos grânulos e, portanto, aumento da estabilidade dos grânulos durante o empastamento. Esta propriedade não existia até agora para o amido de batata sem prévia modificação química ou física. Para aplicações em que se pretende uma viscosidade máxima após o processamento a 95°C (i.e. correspondendo à viscosidade após 47 minutos no teste da viscoamilografia), o amido da planta #152 será seleccionado, uma vez que os amidos com teores de amilose baixos (testemunha, #149) e elevados (#161, #150) possuem viscosidades mais baixas após este regime de gelatinização e empastamento (Figura 13 e Tabela 1). Pensa-se que a viscosidade nesta fase seja determinada ΡΕ0826061 por uma combinação do grau de inchamento do grânulo e da resistência dos grânulos inchados à fragmentação mecânica. Para qualquer comportamento de viscosidade pretendido, os familiarizados com a área seleccionarão um amido de batata de uma gama contendo diferentes teores de amilose produzidos de acordo com o invento, realizando-se testes de viscosidade convencionais adequados.

Quando do arrefecimento das pastas de 95°C para 50°C, os amidos de batata derivados da maior parte das plantas transformadas de acordo com o invento mostraram um aumento na viscosidade da viscoamilografia, como seria de esperar para a reassociação parcial da amilose. Os amidos das plantas #149, 152 e 161 mostram todas viscosidades a 50°C significativamente excessivas relativamente aos amidos das plantas testemunha (Figura 13 e Tabela 1). Isto contrasta com o efeito dos teores elevados de amilose em amidos de plantas de milho (Figura 2) que apresentam viscosidades muito baixas no teste da viscoamilografia. Note-se o facto de, para teores de amilose semelhantes, o amido da batateira #150 (53% de amilose) mostrar marcado aumento de viscosidade comparativamente com o amido Hylon 5 (44,9% de amilose) ilustrado na Figura 13. Isto demonstra que propriedades úteis que requeiram níveis elevados de amilose (35% ou mais) podem ser conseguidas através do processamento de amidos de batateira abaixo de 100°C, enquanto que um processamento que requer mais energia é necessário para gerar propriedades úteis semelhantes a 57 ΡΕ0826061 partir de amidos de elevado teor de amilose derivados de plantas de milho. A viscosidade final no teste de viscoamilografia (viscosidade de retrogradção após 92 minutos) é superior para o amido da planta #161 (40,9% de amilose) de entre os testados (Figura 13 e Tabela 1) . O decréscimo das viscosidades finais foi obtido para amidos derivados da planta #152 (37,5% de amilose), #149 (35,6% de amilose) e #150 (53,1% de amilose). A viscosidade de retrogradação ocorre quando as moléculas de amilose, exsudadas do grânulo de amido durante a formação de pasta, começam a reassociar-se fora do grânulo e formam uma substância do tipo gel viscoso. Pensa-se que os valores da viscosidade de

retrogradação dos amidos derivados de batateiras transgénicas representem um equilíbrio entre o teor de amilose inerente aos amidos e a capacidade da fracção de amilose para ser exsudada do grânulo durante o empastamento e, portanto, ficará disponível para o processo de reassociação que resulta no aumento da viscosidade. Para os amidos com baixo teor de amilose, o aumento do teor de amilose tende a que haja mais amilose para reassociação, aumentando assim a viscosidade de retrogradação. No entanto, acima de um valor patamar, pensa-se que o aumento do teor de amilose iniba o inchamento do grânulo, evitando assim a exsudação de amilose a partir do grânulo de amido e redução da quantidade de amilose disponível para reassociação. Isto é apoiado pelos resultados de RVA 58 ΡΕ0826061 obtidos para os amidos de batata com teores de amilose muito elevados observados nos perfis da viscoamilografia na Figura 13. Para qualquer comportamento de viscosidade pretendido, após recesso ou retrogradação para qualquer temperatura pretendida ao longo de qualquer escala de tempo, os familiarizados com a matéria seleccionarão um amido de batata de entre uma gama contendo diferentes teores de amilose, produzidos de acordo com o invento, fazendo testes de viscosidade convencionais.

Outras experiências com amido derivado das plantas #201 e 208 mostraram que este tinha um teor de amilose aparente acima de 62% (ver Tabela 1). Os estudos de viscoamilografias mostraram que o amido destas plantas tem propriedades radicalmente alteradas e comporta-se de forma semelhante ao amido Hylon 5 das plantas de milho (Figura 13) . Nas condições empregues na viscoamilografia, este amido apresentou inchamento dos grânulos extremamente limitado (quase indetectável). Assim, por exemplo, ao contrário do amido derivado das plantas testemunhas, o amido das plantas 201, 208 e 208a não apresenta um pico de viscosidade bem definido durante a fase de aquecimento. A análise microscópica confirmou que a estrutura do grânulo de amido sofreu apenas um pequeno inchamento durante o processo de aquecimento experimental. Esta propriedade pode ser particularmente útil em determinadas aplicações, como será aparente para familiarizados com a matéria. 59 ΡΕ0826061

Encontrou-se que algumas plantas que foram novamente cultivadas ainda aumentaram mais o teor aparente de amilose do amido extraído a partir delas. Tais aumentos podem ser devidos a: i) 0 crescimento e o desenvolvimento da primeira geração de plantas transformadas podem ter sido afectados, até certo ponto, pelas hormonas de crescimento exógenas presentes no sistema de cultura de tecidos, hormonas exógenas essas que não estavam presentes durante o crescimento das plantas da segunda geração; e ii) As gerações subsequentes cresceram em condições do campo, as quais podem permitir atingir maior maturidade do que o crescimento em condições laboratoriais, sendo geralmente sustentado que o teor de amilose do amido de batata aumenta com a maturidade do tubérculo da batata. Assim, deverá ser possível obter batateiras que dão origem a tubérculos com amido tendo um teor de amilose acima do nível dos 66% agora atingido, simplesmente analisando um maior número de plantas transformadas e/ou novo crescimento das plantas transgénicas ao longo de uma ou mais gerações nas condições do campo. A Tabela 1 mostra que uma outra característica do amido que é afectada pela presença de sequências complementares da sequência codificadora de SBE é o teor em fósforo. 0 amido das plantas controlo não transformadas 60 ΡΕ0826061 tinha um teor em fósforo de aproximadamente 60-70 mg/100 g de peso seco (determinado de acordo com o "AOAC Official Methods of Analysis, 15a Edição, Método 948.09 "Fósforo na farinha"). Observou-se que a introdução na planta de uma sequência complementar da sequência codificadora de SBE B causou um modesto aumento (cerca de duas vezes) do teor de fósforo, o que está de acordo com os resultados anteriores descritos em encontros científicos. De forma semelhante, a sequência complementar da sequência codificadora de SBE A sozinha causa apenas um pequeno aumento no teor de fósforo relativamente às testemunhas não transformadas. No entanto, a utilização de sequências complementares da sequência codificadora de SBE A e B em combinação resulta num aumento até quatro vezes no teor em fósforo, o qual é muito superior a qualquer teor de fósforo in planta anteriormente encontrado para amido de batata.

Isto é útil pelo facto de para determinadas aplicações o amido dever ser fosforilado in vitro através de modificação química. A capacidade para se obter amido de batata que, quando extraído da planta, já tenha um teor de fósforo elevado reduzirá a quantidade de fosforilação in vitro necessária para modificar o amido. Assim, num outro aspecto o invento proporciona amido que, quando extraído da planta, possui um teor de fósforo com um excesso de 200 mg/lOOg de peso seco de amido. Tipicamente o amido terá um teor de fósforo na gama de 200-240 mg/100 g de peso seco de amido. 61 ΡΕ0826061

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÃO GERAL: (I) REQUERENTE: (A) NOME: National Starch and Chemical Investment Holding

Corporation (B) RUA: 501 Silverside Road. Suite 27 (C) CIDADE: Wilmington (D) ESTADO: Delaware (E) PAÍS: Estados Unidos da América (F) CÓDIGO POSTAL: 19809 (ii) TÍTULO DO INVENTO: Melhoramentos na composição de amido vegetal ou relacionados com o mesmo (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 20 (iv) FORMA LEGÍVEL EM COMPUTADOR: (A) TIPO DE MEIO: Disquete (B) COMPUTADOR: IBM PC compatível

(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, Versão #1.30 (EPO) (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 57 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:l: AAGGATCCGT CGACATCGAT AATACGACTC ACTATAGGGA TTTTTTTTT TTTTTTT 57 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 17 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:2: AAGGATCCGT CGACATC 17 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:3: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 17 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico 62 ΡΕ0826061 (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:3 GACATCGATA ATACGAC (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:4: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:4 CATCCAACCA CCATCTCGCA (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:5: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:5 TTGAGAGAAG ATACCTAAGT (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:6: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:6 ATGTTCAGTC CATCTAAAGT (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:7: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:7 AGAACAACAA ttcctagctc (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:8: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: 63 ΡΕ0826061 (A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:8: GGGGCCTTGA ACTCAGCAAT 20 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:9: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:9: CGTCCCAGCA TTCGACATAA 20 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:10: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 26 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:10: CTTGGATCCT TGAACTCAGC aatttg 26 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:11: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 29 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:11: TAACTCGAGC aacgcgatca CAAGtTCGT 29 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:12: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 3003 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:12: ΡΕ0826061 64 saimcct wmmc mmac itmnm mmm mrr^m AicTCTATTT τπππτμ uccMCCAA mmmiA mmm mmmtA artmm mmmA mmrm ipm tckt rnmmn ttccbc^t vxmm wmim mmm castmtggt mmm mmm ttctoitc rmmc Acrcrcrrrc acggaagatc ttgqçtsaaa mtmm caattccsm immr amm Mmam umom mmm ccmmmr mmm momm tcaãtttbas rtmwm mmm mmm mmm mmm namm mcmu wmmm mmm mmm mmm mmm mmm mmm rmcrrçÂ wamtc mmm immm mmcm mmm immm mmm rmimrc immm mmm mitccm AccTSQAcrr mmm mmm asaccccot mmm atcstcmca tmmrm mmm mmm !€mmm mmwá mmm ΡΕ0826061 64 60 120 180 420 48δ S40 720 780 immm mrnmz mcmm mmim mmm mmm mmm TÁTaSACAGT €CATC« mmm mmm jmmm tmmm srsram mmm cfenssrsc mmm mmmpc Jtmmm macnm mttcctcat TTMSGATTC CATTCCTGCT ΛΤΜΠ&ΜΓ ATATTÂTGAT mma

topos» mmmm mmm mmm TÍTOSMtT KAGAim mmm mmmm mmcm mcmm mmm mmm& mmmw MtctCÃM 900 1020 ts3wtgasj mmm ammm ctcataot wmrm mmm tosscata mm$r mimm mmm mmm tmmm cFAttAm TÂGTTTTGGT tatcatstca cmatttttt tscacoasc mmm 1140 1200 1280 1320 1380 ΡΕ0826061 65 wm&m wcxtm itrtwm trmmm tmnmk Anairom um icm&rn rmmm mmm mmm? msgacii ei m mmm rmmm ttfdctctí sasciras mrmm mw^rr mm tccgcctctt rnimm tact%ssta tcttctctca mmmm igso mmnmA wmtm rnmm rrmãttm topgacâ tçaatgátst mo mmam <mmm mmmm ammk smmm mma® um cmmm mmmn mim® rmmm cmmm mmm m rmmm mmm mrmmm itmmr mmm murras mm rrttmm sesrsmsc nisAcwe sotcaiat toâttsct mmmk im tfmtoct mmm mmmm mmm mmm isso cmmm mmm. mimam mmcm mami umitim zm m^rncÂ mmm rmmm tatotmt ttotsctc nm W raaiCA rrmmrt mmm mmmê mmm: zm tistmcm »tt» mtmm mmm mmm mnmc zm àzcamn satoto com mmma ctosato tçastmttc zm ccasmacca mmtki mmm mmm wmm ®mmi zm atttaaêata ccsmms (mmm mmm mmmrr mmrmr mu awtttat «âcttcasaa cãccasttca taitowa mrmm mmm zm rmmm tmmc amrrm rmrmm ramm massctait m ®&mm catoctgc mmcm (mmm mmcm mrmm m metem rmmrt mmm mmm cmmm accttoaas m&

OTGTÂTGA TGATCSTCCT CSTTCMTTA TSGTGTATGC mmm ACAÔCA» Z7M tctatoct aqtasâcaaa mmmm mmm mrtsmu mmmm zm mmm mmmm mmmr mmmz tmm® a®acata m cerrais Aesmms cmmm nmmm cmmm rernum gsao mrt®m temam mmmm mmrm mmm mmm zm CAAWtATA BTAAAATCS ATGAATFTAf GÍCSAATáCT mmm MTFtCTO 3@S KC 3D03 66 ΡΕ0826061 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:13: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 2975 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:13: mw mmm mmmk cmmm macot wtâisa m Miatwr TTfimm e» mmm. immn mtrmm m mtatm mmmm mmm mmm rnmta iso mtmm τbwmtc mimm wtgçtmt m mmm lawm ommxr mmm immm mma m TACMTTCÍG MTTCCSAGC TTCTACAÓTT GCASCâTCGS mmm wcm 360 mm® mmmrc mrom gccaatts mrtcfcm ymam m mmrccc amrm mmmr mwcmm mmm mccmn m mm mmm mmm mmçrm cassaasigt ismgasctg m mmm ce mpcmm mmm rmmtc rmmm m mmm mmm nrmm mmpm wmm m mcrnc rtmtmA mrtKím kimmt rmmm tmmm m amvm tomam MXtmm mmm mmm mmm im {&TGGTTT8S MSC17TTCT tSTSSTTATS AAAAAATGSG TTTCACTCSÍ AGTSCTAGAG 840 mimm costs^tgs eeraseTs cccastcagc toccctcatt mmrm m CAATT» CGCMATGbT GAS&TTATSA CTCGfiAATGA ATITGGTGTC IWGATTT 9® TTCTGCCAM TMTflSWT OTCTCCTS CAATÍCCICA TS3STCCASA SISAASATAC 1823 statocac tccatot mmmr mim® rtmmc immtm ioss mumrn mmrm mmom immm immm mmm nm Ammm kpúxmm mmm mmm mmm miem* nm nmmm tastos» cctamatta mmm mmtm mmmz nm ttccttot mmm mvom cgosomí mmm cmmrt isso ÇTTATTATGC TASTTíTGGT TATCATGTCA CMATTTTTT TGCACCM0C ASC€61T17S 1380 67 ΡΕ0826061 GAÁCGCCCSA CGACCTÍAAG ÍCTfCGATTS ATAAAGCTCA 1SASCTAS6A ÂríGTTSTTC 1440 TCATGGACAT CSTTCACA6C CATKATCftA ATMTâCTTT AGAT6&CFS AACâTSTÍTS 1680 ACSSCACCGA TAGTTgme TTTCACTCTS SAGCTCGT63 TTATCATIGG ATSTGGGATT 1560 CCGCCTCTTT MCTATGSAA ACTGSjAGGT ACTTASjTAT CTTCTCTCAA ATGCGASATG 1620 GTGGTCGGAT 6AGTTCAMT 1TQÃTGGATT TAGATTÇGAT GETGTGACAT CMTGAT5TA 1680 TACTCACCAC fíSATTATGSS T^fíSATTCftC TSGGAACTAC SAG6AATACT TTGSACTCfiC 1?40 AACTGATGTB GATGCTGTTG TGTATtTfiAT GCTGGTCAAC GATOTATTC ATAGSCTTTT 1800 CCCAGATGCA ATTACCATTG GTGAAGATGT TAGCG3WS CCSACATTTT STAÍTCCCST 1860 TCAASAT® 6GTGTTGSCT HSACWCG GCTGCATATG GCAATIGCTS ATAAATQ&AT 1920 1980 2040 2100 2160 tgagttsctc mmmz atosatts gasastsgst mmmc atacactgac

aaatagaaga tsêtcssaaa agtgtstttc atacgctgaa AGTOT5ATC

CSGTGATMA ACTATASCAT TCTGGOBT SGACAASGAT ATGTATGATF HAMCTCT GGATAGACCS CCAACATCAT TAATAGATCS TSàSÂTAGCA TT5CACAAGA ISATrAGÊCT

tgtaactats CGCTSAST0S C83MACCAA

HTAÃSATAC

ΤδΑβΤΓΓΑΤα TisTATTTliAÁ .AGACTATC6C

SSATFAGSAS ATTGATTTCC TTCAGTTATG CÂTG2GTTAC ACTTCASAAC AGA6SAAACC ATAGGCTGCC

6AGAAGGGTA CCTAMTTTC AÍGGGAAATG MTTDGGCCA GCC4CACC7T TCTSATGSCT CAGTAATTCC AOSSAGAITT GA€CT®S AH3CASAATA C1SGGCTATS CASTATCTT5 AA8ATAAATA ATCACSAAAS GAlGAAGGAG ATASSATSAT αΤΤΜΤΤΓΤ CACTGGACAA ATAGCTATTC AAAATACAAS GTTGTCTTGG ACTCAGATSA 2220

ATAAATGMÊ AAGAATT1SA ACPfiTTCAT TAGTTfTCGT K5AWSCCTQS TCCÂCTTTTT SGTGGCTTCG GGAGAATTGA TCATAAT0ÇC GAATATTTCA CCTCT&AASE ATCGJÂTGAT SATCGíCCTT GT1CAATTAT 6OTATGCA CCTASTASAA CAGCAÊT65T CTATCCACTA GT.AGACAAAC TAGMCTAGC ASTASTAGAA 6AACCCATTG AAGAATGAAC 6AACTTGTGA TCGCSTTGAA AGATTTGAAC GTTACTTGGT CATCDCAÍA GAGCTTCTTS ACÂTCftSTtT TG3CSGAã:TT gcatgtgaca acaasgtttg casttctttc CACTATTAGT ASTCCACCGA TATACGCAGA GATGMGTGC T6MCM4CA TATGTAAAAT CGATGAATTT atgtcsaatg ctgssacsat osmttcctg cascc 2400 2460 2520 2580 2640 2820 2340 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:14: 29? 68 ΡΕ0826061 (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 3033 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CÓDIGO: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 145..2790 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:14: TF&I sgc ; ÍACTCA 0Í :ααγ ITGAC AC1 ÍCAS1 ITAG TTAC :ac?í Π ATCACTTATC 60 agatctctãt rmrcTcn aattcí 1MCC MGGAA i 'SM TAAMSSATA gatttgtam 120 Ma f ym tô H %AG í crs m i m i 1CA ( 1TC tct GGA GTT 1 :gt UI Net Vã1 1 1 Tyr Thr Leu Ser í 5 Sly Val i ^rg ITT CCT act m CCA TCA m :.AC AM TCT AAT m TTC ASC AST AAT 219 Phe Pro Thr Val Pro Ser Vsl Tyr Lys Ser Asn Sly Phe Ser Ser Asn 10 15 20 25 m GAT CGG AG6 MT GCT AÂT srr tct GTA TTC TTG AAA MG CAC TCT 26? Sly Asp Ar§ Arç Asn Ala ASO Val Ser val pne Leu lys lys Hís Ser 30 35 40 CTT m coe MS ATC TTfi GCT GAA MG TCT TCT 1AC AAT ICC m TTC 315 Leu Ser Arg Lys 11 e Leu Ala Glu Ly$ Ser Ser Tyr Asn Ser Glu Phe 45 50 55 A·*·' fr U3>H CCT TCT ACA GTT OCA SCÂ h. u wh AM GTC CTT ers CCT GGA ACC 363 Aro Pro Ser Vfil Ala Ala Ser Gly Lys Val leu Val Pro Gly Thr 60 65 70 CAS AGI GAT AGC ICC TCA ICC TCA ACA SAC CM TTT GAG TTC ACT GAS 411 Gin Ser 75 Asp Ser Sêr Ser Ser áõ Ser Thr Asp Gin Phe 85 Glu Pm Thr Glu aca TCT CCA GAA MT TCC CCA GCA TCA ACT GAT GTA GAT AGTTCA ACA 459 !· jh.f' Sêr Pro 61 u Asn Ser Pro Ala Ser Thr Asp val Asp Ser Ser Thr '90 95 ISO 105 ATS SAA CAC GCT AGC CAG att m ACT 6AG MC GAT 6AC GTT GAG GCG 50? m m His Ala VW'. Gin lie lys inr Glu Asn Asp Asp Val Glu Pra 110 115 120 TCA AGI CAI CTT ACA GGA AGI sttgm GAG CT5 GAT rrr GCT TCA TCA 555 Ser Ser ASp Leu Thr Gly Ser Val m Gly Leu Asp Phe Ala Ser Ser 125 133 136 69 ΡΕ0826061 CTA m CIA CM GAA GGT GGT AAA CTG SAG GAS TCT AM CA TTA MT 6D3 L&j Gin Liu Gin Sb G1y Gly Lys Leu Glu SI o Ser Lys Thr teu Asn 140 ‘ 145 150 ACT TCT SM m ACA ATT ATT GAT GM TCT GAT AGS ATC ASA GAG A8G 651

Thr Ser Slu Gly Thr íle 11 e Aso Gly Ser Asp Ara .Ile Arg Gly Are 155 160 ' 165 CSC AIC CCT CCA ca 5SA CTT GGT CAG MG ATT TAT GAA ATA GAC CCC B9

Sly Ile Pro Pro Pro Slv leu Gly Gin lys Ile Tyr Gly He Asa Pro

170 175 IBS IBS CTT Τϊδ ACA .AAC TAT CGT CAA CAG CTT SAT TAC ASG TAT TCA CAG TAC 747

Leu Leu Thr Asa Tyr Árg Gin His Leu Aso Tyr Arq Tyr Ser Sln tyr 136 195 ' 20Ô m MA CTG m GAG GCA ATT GAC AAS TAT GAG GST GGT TTG GAA CCC 795

Lys Lys Leu Arg Glu Ala Ile Asp Lys Tyr Glu Gly Gly ím Gly Ala 205 210 ' 215 ITT TCT GGT GGT TAT GAA AAA. ATC GGT TTC ACT CGT MT GCT ACA GGT 843

Phe Ser Arg Gly Tyr Glu Lys Het Gly Phe Thr Arg Ser AU Thr Glv 220 225 233 ATC ACT TAC CGT SÂG TGG 'GCT CTT GGT GCC CAG TCA SCT GCC CTC ATT 191 lie Br Tyr Arg Glu Tm Ala Leu Gly Ala Glá Ser AU ÂU Leu íle 235 246 245 GGA GAT TTC AAC AAT TGG GAC GCA MT GCT GAC ATT ATG ACT Çm MT 939

Gly Asp Phe Aso Asn Tm Ãsp Ala Asn Ala Aso I1e Het Thr Arg Asn 250 255 250 265 GM ITT SST ÊTC m GAG ATT TH CTG CCA MT MT GTG GAT GGT TCT 98?

Glu Phô Glv Vai Trp Glu Ilê Phe Lm Pro Asn Asn Vai Aso Gly Ser M 275 ' 280 CCT GCA ATT CCT CAI m TCC ASA GTG AAS ATA CGT ATG GAC ACT CCA 1035

Pro Ala Ile Pro His Gly Ser Arg Vai Lvs IIe Arg Kêt ASô Thr Prs 285 290 295 TCA S6T STT AAS GÃT TCC ATT CCT SCT 1(35 ATC AAC TAC TCT TÍA CAG 1083

Ser Glv Vai Lvs Asp Ser fie Pro Ala Trp íle Asn Tyr Ser Leu Gin ' 300 305 310 CTT CCT SAT SAÂ Απ CCA TAT AAT GSA ATA CAI TAT SAT CCA CCC GAA 1131

Lm Pm Aso Glu Ile Pro Tyr Asn Gly íle His Tyr Asp Pro Pro Glu 315 ' 320 325 $AS GAG m TAT ATC TTC CM CAC CCA CGS CCA AAS AAA CCA AAS TCG 1179

Glu Glu Arg ívr Ile Phe GU Hu Pro Arg Prs tys lys Pro lys Ser 33 D ' 335 340 345 CTG ASA ATA TAT GAA TCT CAÍ ATT GSA ATS ÂST MT CCS GAG CCT AM 1227 leu Arg Ile ívr Glu Ser His Ile S?y Het Ser Ser Pro Glu Pro Lys ‘ 350 355 360 1323 1323 70 tpj» \X. ΡΕ0826061

ATT MC TCÂ TAC STG MT TTT ASA GAT GAA GTT CTT CCT CSC ATA AAA

He· Asn Ser Tyr Vel Àsn Phe Ar§ Asp Giu Vai leu Pro Ârg Ile lys 3¾ 370 375

MG CTT G6G TAC AAT GCG CTG CM ATT ATS SCT ATT CM GÀS CAT TCT ln leu Sly Tyr Asn À1â leu Gin He Het Áia Ile Gin 61 u His Ser 380 385 390

TAT TAC SCI AST TTT GGT TAT CAT GTC ACA AAT TTT ITT GCA CCA AGC

Tvr Tyr Ala Ser Phe -31 v Tyr Nis Vai Thr Asn Phe Phe Ala Aro Ser m J 400 405

AGC CGT TTTOGAACS CCC SAC GAC CTT MS TCT TIS ATT GAT AM SCT

Ser Arg Phe Gly Thr Pro Asp Asp Uw lys Ser leu He Asp lys Ala 410 ' 415 420 425

CAT 6A6 CTA GGA ATT m STT CTC ATS GAC ATT GTT CAC ASC CAT GCA

His Gly leu Gly Ile Vai Vai leu Het Asp Ile Vai His Ser His Ala 430 435 440

A MT AAT ACT TTA GAT GGA CTG AAC ATS ITT GAC TGC ACC GAT AST

Ser Aso Asn Thr Leu Asp Gly Leu A$n Net Phe Asp Cvs Thr Aso Ser 445 450 ‘ * 455 '

TGT TAC TTT CAC TCT GGA SCT CGT GGT TAT CAT TS8 ATS TGG GAT TCC

Cys Tyr Phe His Ser Gly Ala 4¾ Gly Tyr His Tro Het Tfp Asa Sér 465 1 470 CGC CTC m AAC TAT GSA MC TGG GAS 5TA CTT AGG TAT CTT CTC TCA Arg Leu Phe Asa Tyr Gly Asn Trp Gly Vai leu Arg Tyr im leu Ser 475 480 485 "

MT GCG ÂGA TGG TGG TTG GAT GCG TTC AAA TTT GAT GGA TTT ASA TTT

Asn Ala Arg Trp Trp Uu Asp Ala Phe lys Phe Asp Gly Phe Ara Phe 490 495 500 505 m SGT GTG AÇA TCA ATG ATG TAT ATT CAC CAC GGA TTA TC6 STG m

Asp Gly Vai Thr Ser Het. Het Tyr lie His His Gly leu Ser vai siv 510 515 520

TTC ACT GGG AAC TAC GAS SM TAC TTT GGA CTC GCA ACT GAT SIS GAT

Phe Thr Gly Asn Tyr 61 u Gly Tyr Phe Gly Leu Ais Thr Asp Vai Asp 525 530 535

GCT OIT GTG TAT CTC ATS CTG GTC .AAC GAT CTT ATT CAT 6GS CTT TTC

Ala vai Vai Tyr leu Het Leu Vai Mn Asp Leu He His Gly leu Phe 540 54b ‘ 55Q ‘

CCA GAT GCA ATT ACC ATT GGT GAA GAT GTT AGC SSA ATG CCG ACÂ TTT

Pro Ala He Thr lie Gljj 61 u Asp Vai Ser Gly Het Pro Thr Phe Ψ att ccc. stc mm mm m sse πτ gac tat cgg ctg cat vn He Pro m Gin Glu Gly Gly Vai Gly Phe Asp Tvr Ara Leu His

5*5 580 ' S&S

1419 1463 ISIS 1611 1659 1707 1851 1899 570 71 ΡΕ0826061 m m att sei m m m atí m m cic aag ma cgg gat gag 194?

Het Ala He Ala Aso Lvs Arq lie Glu Leu Leu lys lys Arg Asp Glu 590 ' 595 ' 603 GAT TSG ASA SIS SST GAT ATT GTT CAT ÃCA CTG ACA MT ASA ÂGA TGS 1995

Asd Tro Ara Vai Glv Asp Ile Vai Hss Thr Leu Thr Asn Arg Arg Trp ' 605 610 615 TCG GAA m TGT GTT TCA TAC GCT GAA AST CAT GAT CAA GCT CIA STC 2043

Ser Glu Lys Cvs Vai Ser Tyr Ala Glu Ser .Aso Gin Ala Leu Vai 620 625 ' 630 . GST GAT m ACT ATA GCA HC TGS CHS ATS GAC MS GAT ATS TAT GAT 2091

Gly Â$p Lys Thr Ile Ala Phe Trp leu Het Asp Lys Asp Het Tyr Asp

635 64Ò 64S TTT AT5 GCT CTG GAT AGA CCS TCA ACA TCA TTA ATA GAT CGT GGG ATA 2139

Phe «et AU Leu Asp Ara Pro Ser Thr Ser Leu Me Aso Ara GW IIê 650 ' 655 660 ' ” 665 SCA TTSCAC AAS ATS ATT AGG CTT GTA ACT ATS GSA TTA GGA GSA GAA 218? AI δ Léu Bis lys Het He Arq Leu VãT Thr Het Gly Leu Gly S1y Glu 670 ’ 675 " 680 m TAC CTA MT TTC ATS GGA MT GAA TTC CSC CAC CCT GÂG TGG ATT 2235

Gly Tyr Leu Asn Phe Het Gly Asa Glu Phe Gly His Pro Glu Trp Ile 665 690 695 GAT TTC. CCT m GCT GAA CM CAC CTC TCT GAT GGC TCA GTA ATC CCC 2283

Asp Phe Pro Arg AU Glu Gin His leu Ser Asp Gly Ser Vai Ile Pro T00 ?os no GSA MC CM TTC AGI TAT GAT AAA TGC ASA CGG AGA TTT OAC CTG GSA 2331.

Slv Asn Sin Phe Ser Tvr Asp Lys Cvs Arg Arg Arq Phe Asp Leu Gly 715 720 ' 725 GAT SCA GAA TAT TTA ASA TAC CGT 6SG TTG CM GAA TFT GAC CGG CCT 2379

Aso AU Glu Tyr Leu Arg Tyr Arg Gly leu Gin Glu Phe Asp Arg Pro ?3Ò ' /35 * 740 745 ATS CAG TAT CTT SM GAT AM TAT GAG TTT ATG ACT TCA SM CAC CAG 2427

Het Gin Tvr leu Glu Aso Lys Tvr Glu Phe Het Thr Ser Glu His Gin

v ..... 750 ' 755 ?6S TTÇ. ATA TCA CSA AAS GAT GAA GGÃ GAT AGG ATG ATT GTA TTT GAA AM 2475

Phe Ile Ser Arq Lvs Aso Glu Gly Asa Ara Het Ile Vai Phe Glu Lys 763 ' ' 770 ' 775 SGA MC CTA STF7TT STC TTT MT ITT CAC TGG ACA MA ASC TAT TCA 2523

Glv Asn Leu vai Phe Vai Phe Asn Phe His Tro íhr lys Ser Tyr Ser 7E0 786 730 GAC TAT CSC ATA SCC TGC CTG MG CCT GSA AM TAC AAG GTT SCC TTG 2571

Aso Tvr Ara Ile Ala Cvs leu Lys Pro Gly Lys Tyr lys Vai Ala Leu

‘795 ' SOO ' ' SOS 72 ΡΕ0826061 SAC TCA GAT SAT CCA CTT TTt SST G6C TTC 503 AGA ATT GAT CAT MT 2619

Aso Ser aso Aso Pro Leu Phe Gly Sly Phe Sly Arg lie Asp His A$n 819 ' ‘ 815 * 820 025 GCC SAA TAT TTC ACC TTT SM 65A IBS TAT GAT GAT CGT CCT CGT TCA 2667

Ala Gly Tyr Phe Thr Phe Glu Gly Trp Tyr Asp Asp Arg Pm Arg Ser 830 835 849 Απ AT6 GTG TAT GCA CCT TST AM ACA GCA 6TG 6TC TAT GCA CTA GTA 2715

He Het Vai Tvr AU Pro Cys Lys Thr Ala Vai Vai Tyr AU Leu Vai 845 850 855 GAC AAA SAA GAA GM GAA GAA SAA SAA SM GAA SM SM GTA 6CA GCA 2763

Asp Lys 51 u Glu SI o SU GU Glu Gly Glu Glu Gly Slu Vai Ala AU 860 865 870 STA SM GAA GTA GTA STA GAA SM GAA TGMCGMCT TGTSATCSCG 2810

Vai SU GU Vai Vai Vai GU Slu Glu 28?í

TT5AAA3ATT TSMCSCTAC ATASAGCTTC TTSACSTATC TfíSCMTATT SCATCASTCT TGSCS0AATT TCATGTGACA CAAGSTTTGC AATTCTTTCC ACTATOTA STSCAACÊA.T AWmm ATSAASTSCT SAACMACAT ATSTAAMTC SAISMTTTA TSTQSAATSC TG0SACSATC GMTTCCT6C A63CCGG8G6 ACCCCTTAGT TCT (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:15: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 882 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:15:

Ket Vai Tyr Thr Leu Ser 61y Vá! Arg Phe Pm Thr Vai Pro Ser Vai 15 16 15

Tyr lys Ser Asn Gly Phe Ser Ser Asn Gly Aso Arg Arg Asn AU Asn 20 25 30

Vai Ser Vai Phe leu Lys Lys His Ser leu Ser Arg ty$ ne teu AU 35 40 45

Slu Lys Ser Ser Tyr Asn Ser Slu Phe Arg Prç Ser Thr Vai AU A1a 50 55 68

Ser Gly Lys Vai Leu Vai Pro Gly Thr Gin Ser Asp Ser $er Ser Ser 6S 79 75 ~ 'gg

Ser Thr Aso 61 n Phe Glu Phe Thr Glu Thr Ser Pro Glu km <»r Pro 85 90 ~ 05 ' 73 ΡΕ0826061 AU Ser Ihr Asp Vai Asp Ser Ser Ur Hêí Glu His Ala Ser Gin He íft 105 m

Lys Thr Glu Âsn Asp A$o Va i Glu Pro Ser Ssr Asp leu Thr Gly Ser 115 ' 120 ' 125

Vai Glu Glu Leu Asp Phe Ala Ser Ser Leu Gin Leu Gin Glu Gly Slv 130 135 140 ' v

Lys Leu Glu Glu Ser lys Thr Leu Âsn Thr Ser Slu G.1u Thr lis Ile 145 150 155 160

Asp Glu Ser Am Arg He .Arg Glu Arg Glv Ile Pro Pro Pro Gly Leu 165 170 !?5

Gly Gin Lys Ile Tyr Gly lie Asp Pro Leu Leu Thr Asn Tyr Arg: Gin 180 ' 185 190 200

His Leu Asp Tyr Arg Tyr Ser Gin Tyr Lys Lys Leu Arg Glu Ala lie 215

Mp Lys Tyr Glu Gly Gly leu Glu Ais Pt» Ser Arg Gly Tyr Glu Lys

Het Gly Phe Thr Âm Ser Ala Thr Gly Ile Thr Tyr Arg Glu Trp Ala 225 ” 230 235 240

Leu Gly AI3 Gin Ser Ali Ala Leu Ile §]jj Asp Phe .Asn Asn Trp Asp

Alg Âsn Ala A$:p Ile Het Thr Arg Asn Glu Phe Gly Vai Tro Glu Ile 250 ' 265 270

Phe Uu Pro Asn Asn Vai Asp Gly Ser Pro Ala Ile Pro His Gly Ser 275 2:80 285

Arg Vai Lys He Arg .Het Asp Thr Pm Ser Gly Vai Lys Asp Ser Ile ' 290 295 300

Pro Ala Trp He Asn Tyr Ser Leu Gin Leu Pro Asp Glu He Pro Tyr 305 310 315 320

Asn Gly Ile His Tyr Asp Pro Pro Glu Glu Glu Aro Tyr Ile Phe Gin 325 ' 330 ^ " 335

His Pro Arg Pm lys Lys Pro Lys Ser Leu Arg Ile Tyr Slu Ser His 343 34S 350 ile Glv Het Ser Ser Pro Gly Pro Lys ile Asn Ser Tyr Vai Asn Phe ' 355 350 355

Arg Asn Glu Vai leu Pro Arg Ile Lys Lys Léu 61v Tyr Asn Ala leu “ 371) 375 380

Gin ile Het Ala Ile Gin Glu His Ser Tyr Tyr Ala Ser Phe % Tyr 385 390 395 400 74 ΡΕ0826061

Vai Tt«r Asn Phe Phe Ais Pro Ser Ser Arg Phe Sly Thr Pro Asp 410

Asp Leu lys Ser Leu lie Asp Lys Ala Hi$ Glu leu Sly lie Vai Vai lea Mçt Asp He Vai His Ser Hts Ala Ser Ãsn Asn Thr Uu Asp Gly 440 44$

Leu Asp Het Phe Asp Cys Thr Asp Ser Cys Tyr Phe Hrs Ser Giv Ala 450 455 460

Ara Sly Tyr H1s Trp «et Trp Asp Ser Arg Leu Phe Asn Tyr Gly Asn 465 470 475 480

Trp Glu Vai Leu Arg Tyr Leu Leu Ser Asn Ala Arg Trp Trp Leu Asp asc iton ^

Ala Phe Lvs Phe Asp Gly Phe Ara Phe Asp Gly Vôl Thr Ser «et Het 510

Tyr IIe His His Gly teu Ser Vai Gly Phe Thr Gly Asn Tyr Gly Glu

Tyr Phe Gly Leu Ala Thr Asp Vai Asp Ala Vai Vai Tyr Leu Het leu 530 535 540

Vai Asn Asp Leu íle His Gly Leu Phe Pro Asp Ala II# Thr De Gly

Glu Asp Vai Ser Gly Het Prô Thr Phe Cys IIe Pro Vai Gin Glu Gly 565 570 575 31 y Vai Gly Phe Asp Tyr Arg leu His Het Ala lie Ais Asp lys Arg 580

He Glu leu Leu Lys Lys Arg Asp Glu Asp Trp Arg Vai Gly Asp lie 600

Vai His Thr Leu Thr Asn Arg Arg Trp Ser Glu Lys Cys Vai Ser Tyr 610 615 620

Ala Glu Ser His Asp Gin Ala leu Vai Gly Asp Lys Thr lie Ala Phe 625 630

Trp teu Het Asp Lys Asp «et Tyr Asp Phe Het Ala Leu Asp Arg Pro 545 * 650 665

Ser Thr Ser Leu íle Asp Arg Glv Ile Ala Léu His lys Het lie Arg 660 ' 665 §70

Leu Vai Thr Het Gly Leu Gly G1jr Glu Gly Tyr Leu Asn Phe Het Gly

Asn Glu Pbs Qly His Pro Glu Trp De Asp Phe Pro Arg Ala Glu Gin

..... ' TOO 75 ΡΕ0826061

His leu Ser Aso Slv Ser Va1 Ile Prs Glv Asn Sln Phe Ser Tyr Asp 705 ' ’ 710 * 715 720 lys Cys Aro Ara Ara Phe Aso teu Sly .Asp Ala Glu Tyr léu Arg Tyr v 725 ' 730 735

Ara Slv leu Gin Glu Phe Asp Arg Pro Het 61 n Tyr Lai Glu Asp lys 740 ' 745 ?S0

Tvr Slu Phe Het Thr Ser m His Sb Phe íle Sr Arg Lys Asp Glu 755 758 765 STv* Asp Arg Het 11 e Vsl Phe STu Lys G1y A$n leu Vai Phe Vai Phe ‘ 770 77$ 780

Asn Phe His Trp Thr Lys Ser Tyr Ser Asp Tyr Arg Ile Ala Cys la» 785 750 795 . 800

Lys Pro Gly Lys Tyr Lvs Vai Ala Leu Asp Ser Asp Asp Pro Leu Phe 805 * 816 815

Sly 81y Phe Slv Arg Ile Asp His Asn Ais Glu Tyr Phe Thr Phe Glu 820 825 830

Qlv Trp Tyr Asp Asp Arg Pro Arg Ser He Het Vai Tyr Ala Pro Cys 835 ’ 840 845

Lys Thr Ala Vai Vai Tyr Ala leu Vai Asp lys Glu Glu Glu Glu Glu 850: 855 860

Glu Glu Glu Glu Glu Glu Vai Ala Ala Vil Glu Glu Va1 Vai Vai Glu 865 870 875 880

Glu Glu (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:16: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 2576 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:16: mmm mmm® metam imm& mmm mmm mmrr® mmmt mmmt tmaspsca mmm mtam mmm emmmh metmt atmm mmm mcmm atocswa mnmm mamsa mmmr immm MMm® mmm mmm gocpcw oatctwas ΡΕ0826061 76

OMamim mami ττταακΑί cctacaaot mmmx mmm mmm mmm actctgms mmmi mimm mmatca wk catbxtcca ccmcrra tsmmm ttatgamtâ scccccrrr isacaaoi tímmc cnwmcA íw mmm mrmm mmmi mrmm armam mmim mmm laa&m m*cm Atoam tootc wmm mmm CCCTCÁTM AGATTTCAAC MTTGSGACG CÂMTSCTGÀ CATTOCT CSGAA1WTπ» δ»πτττ (mtmik mrmm ttctccto mm&m mttmm mmm mrnmz mzrnm rmmct mmmn GSATCAACTA CTCTACftfiCT OTGAT0AA ÂTTCCATATA ATSGMTATA miSATCCA

cccmws ATATATSMTmmmm GCTATTCAftS

CD^CASDC

CTAGOAATTS OSACTSAACÁ CATOATS? OCfCAAATG PGÃCÁIÍM GAATAcrrm cmncAis «fff® ATTOTATA

ASfiSSÍATATammm AASTTCITCC ASCATTCTTA srmesAAC TTBJICTCAI im&fteos 0GGATTO8 CGAGAMTG 1TOTOC

ammmmmtm T03CATAM.4 TTATGCTA8T CCACSSCCM AGAÀÇCMA cç «cem amimctc mmmr acmtoct GTcacim Atmm mmnm itttjt ' 1TOTTATC AT6TCACAM GCCCGACSAC CÍÍAAGlOT ΤδΑΠδΑΤΜ AfiCTCAW mmm caicaaatm TGTTACTÍTC: áctctssagc m m 480 S40 «89m 720 ?ao 840 900 360 1820 1880 .1140

CSCMC

HTCÀTA

CAWCAAS ΤΑΙδΑΠΤΤΑ CCÂASÁT3A GSCTfTTCCC rrcccsrrcA Μ7δ8ΑΠ£Αziummimxtm n^scimi «attst? CACCSATAG! CCTTTTOC GimiGAG TCACCACSB TGATGTGuAT agatgcaattmmm 3TTGCTCMS TÁSMGATGG MIMMCT B3Ã0OTmmm

TCG1S61TAT

«WGV 1380 TOAATHB AIG5ATTO TTATOraS SATKA» GCTGTT6W ATCTSA1SCT carrra mmnm OTSCmS ACTATW? tcsgaáaâgt swmcATÃ ΑΓΑΚΑΠζϊ TOSATOmtmtrn rmrm® TOWfi âeai

ÁTOMIIST

GSTCAACSAT CSSWTOS Asiessiw C6CTGAM8T CAAGSATATS mmtm

1440 1800 1S6D 1680 1748 1088 1860 192Õ 1988 ΡΕ0826061 77 GGAAATGAAT TC8GCCA0CCGATGACTCÃS TMTTCCCfie ctsgsagats mmm mcnms aiaaatatgaGAASSASATA fiftTBATTST TGSACMMA GCTATTCAGA GCC17SGÂCT CAGATGATCC T4TTTCACCT TTSMGGAÍG TBTAGAACAG CAGTGGTCTA êaagaastag castágtasa

TGâCsTSGATT oatttcccta gsgctgmga AMCCAATTC ASTTÂTGATA AATSCAGACS AASATACCGT GSGTTSCMS AATimCG GHTATSACT Kimc&t AíITTCATâTC ATTTGAMAA GGAAACCTA5 TTTTTGTCTT ctatcgcata ggctgc ctgâ mmm ACTTTTTGGT GGCTTCGGGA GA4T7GATCA GTATGATSAT CGTCCTCGTT CMTFÂTGGT TSCACTAÊTA GCAMGMG AAGMGAAGA AGAAGTAGTA GTAGAAGAAG MTSAACGAA

ACâCÇTCTCT GAGATTTSAC SSCWSCAG ACGAAAGGATTMHTTCAC ATACAAGGTT TMTSCCGAA STATSCACCT A6AASAAGM

210C 2220 2280 2520 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:17: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 2529 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:17:

SGATGCTM7 AAAGTCTTCT TGTGCCTGGA 6ACATCTCCA TAGCCA3ATT TÍAAGAGCTG

GTTTCT5TAT

TACAATTCCG AYCCASAGTQ GAAAATTCCC AAAACTBAGA GATTTTGCTT

TCTTGAAAAA AATCCCGACC AlASCTCCTC CMCATCAAC TGATGIAGAT ACGAíGACST TGAGCCGTGA CATCACTACA ACTACAAfíAA

GCACTCTCTT TCACGSAAGA TTCTACAGTT QCASCATCSS ATCCTCAACA GACCAATÍTG AGTTCAACAA AGTSATCTTA SGTGGTAAAC

TCTTSGCIGA GGAAA6TCCT ASTTCACfSA T5GMCACSC CAâGAÁGTGT TGGAGGAGTC

TAAAACÃTTA: MTACrrCTS Amsmr TâTTGATGAA TCTSATAGSA TCAGtóAGAG GGGCATCCCT CCACCTGGAC TTGGTCAQAA SATTTATGAA ATAGACCCCC TTTTGACAAA CTATCGTCAA CACCTT6AT7 ACAÓSTATTC ACAGTACAAS MACTGáGSÔ MGCAATTGA CAAGTATGAG GSTGSTTTGG AAGCTTÍTTC TCÊTSSTTAí GÁÂÁAAATSG gtttcactog TASTSCTXA G5TATCAGTT ACOfiTGAGTG GGCTCCTGGT GCCCAGTCAG CTGCCCTCAT ISGASATTTC AACAAÍT^G ACGCAAATGC TGACATOIS CÍCSSâATG MTTrSSTST CTGGGAGATT TT7CTGCCM ATMTSTQGÂ TGSTTCTCCT GCAATTCCTC ATGSGKXAS 60 120 1B0: 240 300 360 420 m 540 509 660 720 780 ΡΕ0826061 78 atoaêata cmwm amam tettaasgat tccattccts cttotcm bao CTACTCTTTA CASCTTCCtB ATSAMTTCC ATATMTGGA ATâTâTTâIG ATCCAOXGA 900 mmm TAiRTcrrcc mcacccacs gccaaagam ccãmgtcgc tgasmtata 9« TSMTCTCAT ATTGGAA76A SIASTCCG3A fiCCTMAATÍ MCTCÁTACG TSÂAITTTAG 1030 AGÂTSAA67T CTTCCTCGCA TMAAAASCT TGGGTACAAT GCGGTfíCAAA TTATSStfAT 1080 TCAASAGCAT TCTÍATTAT5 CTAGTTTTG^ TTATCATSTC ACAAATTfTT TOACCAAG 1140 CAGCCGlTíT SSMCSCCCS ACSACCTTM GTCTTTGLATT GATMAGCTC A1SASCTAGS 1200 MTTSTT3TT CTO3GACA TTGTTCACAQ CCA1GCATCA GAACATGTTT GCKCACAG ATAfiTTSTTA CTTTCCTCT SATGTSSSAT TCCCSCCTCT TTACTATGG AAACTGGGAG MATGCGAGA TGGTGGTTGG ATGAfíTTCAA ATTT&ATGGA ATCMTGATG TATACTCACC ACGGAHATC GMGAITC crrroat êcmctgatg tsgatgctst tgtgtatctg TCACGõGCTT TTCCCAGATS CMTTACCAT TGGTGAAGAT TUsTATTCCC GTTCAAGATG eassnsTO ctttsactat ΤΒΑΤΑΑΑΤΘ6 ATISASmC TCAASAAACG GGATGAGÊAT íCATAcra acaaatasaa satggtc^a amotstt TCAAGCTCTA STCGSTôATA AAAÇTAXAGC ÂTYCTGGCTS TTTTATSaCT CTGÊATAGAC CGYDAACAYC ATTMTASAT SATGÁTTAGG cttgtmcta tsgsattass asgagmsgs TÊAA1TCGGC CACCCTSA6T GGATTGATTT CCCTAGGSCT ctcAGiAATT rnmmz mcmm mtmw mmom tatttaagat aòcatgsgtt gcaagaattt TGMGAIAM. TATSAGTTTA TGACTTCAGA ACACCAGTTC AGATAGSATS ATTGTATTTS MAJ^GGAAA CCTASTTm AAATA6CTAT TGAGACTATC GCATAGGCT5 CCXSAASCCT mxvm GAiccACTTT rnsmar mmri CâCCTCTGAA fMTCGTATG ATGATCÊTCC TCSTOAn MTAATACT? BGPGGACT SSASCTCGTS GfTATCAÍTG. GTACTTAiSGT atcttctctc TTTAGATTTS ATGGTGTSAC ACTGSGAACT ACGAGSAATA ATGCUjGTCA acsatotat ijTTAGCGGM TGCCGACATT CSGCTGCâTA TGGCAATTGCrmmiQ& mmmr TCATNCSCTÊ M4GTCATGA ATGGACA4G6 ATATGTATGA CGT&SATAS CATTGCACM TACCTAAATT TCATGGSAAA mâacâcc TCTCTGAtGG pmmmr fgacctggg 5ACCG6GCTA TBCAGTATCT ATATCACGAA /ffiGATGAASG GTCTTTAATT TTCACTGGAC ggmaataca asgttsgctt SATCÂTMIB CC8AATÂTT?

AiasiGTATS mcmm 1260 1380 1740 1860 1980 2160 2280 2340 2400 2460 79 PE0826061 AACASCASTS 6TCTATGCAC TâSIÁGâCM ANTAGÂAGNA GM3AAGAAG MGMNCCGN 2520 f>>

NGAAfiMTT (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:18: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 3231 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:18:

CAfíTCTTGGG ACACTCAGTT CCAAGGMTS TCTCT0SA5T ATGGTSATOS AGATuTTSGC CGSGGAAA6T TIGÂliTTCÁC CMTGGMCA TTACASG.AA5 MCTQGàGEA GSATCASAGA

GACTCACTAT AGGGATTTTT s ATCTCTCTCT CTCTTCACGC TTCTCTTGGG AGTTACACTC CTATCACTCA TCASATCTCT imm ttasatttm rnrnm

TCGTTTTCCT ACTSTTCCAT CAGTSTACM GA6GMT3CT MTGTTTCTG TATTCTTStt TGAMASTCT ICTTACSATT CCSAATCCCS CCTTGTACCT ffiWTCCAGA çm%£Tt TGMACAGCT CCAÊAAM.TT CCCCASCATC CGCTAGCCAG ATTAAAACTG AGAACGATGA mSAAGAS π62ΑΠΤΤ0 CTTCATCACT GTCTAAAACA TTMATACTT CT6AASASAC SAÊGS&ATC CCTCCACrm SÁCTTSGTCA

ITTTAAAAAC CTCCTCCACT SCCT7GAACT CA6CMTTTG ATT7TTTCTC TTMTTCCM AAGMâSâTS fiTSTATACAC ATCTMTSGA TTCASCAGTA MAGCACTCT ctttcacsgâ ACCTTCTACA SITKAQCAT CTCÁTCCTCA CAGÂCCAAT ãactsatgtg gatagttcaa CSHWGCCG TCMSTSATC acmcxacaa mmmik AATTATTGâT gastctgatâ SAASÁTTTÂT uMÁTAGÃCC 60 120

ISO 240 300 360 420 480 540 m CCCrrrTGAC AAACTATCST CMCACCTTG AWACAGGTA TTCACAGTAC AASAAWT6A 840 GGSÃGSCAAT TSÃCMGW SAâSSTSSFÍ TGGÂASOTT TTCTCGTCGT TATGÂAMAA 900 TSâorncAc tcgtagtgct acasstatca cttaccgtoa msctcct qêtscccagt %% CASCTSCTC7 CÃTTÊGAGAT TTCAACAAIT GSGAtStAAA TGCTGACATT AH3AGTC3SA 10^0 ATGMTTTGS TGTCTSsGAG ATTTTTCTGC CAAATMTST GGATESTTCT CCTGCMTTC 1080 CTCATGGÊTC mmm atacscatsg acacttcatc agstgttaag gattccattc CT&CTTSGAT CAACTACTCT TTâCASCTTC CTGATSAMT TCCaTATMT GGAATATATT 1200 ATSATCCACC CGAASASGAG AGGTATÊTCT TCCMCACCC ACSSCCM^j AAACCAAAGT iggg 1320 1320 80 ΡΕ0826061

CGCTuASMT ÂTATGAATCT CATATTSGM TW fiGASCCTAM ATTMCTÇAT ACGTG.ÃÀTTT JMmim GTTCTTCCTC SCATAAAAAA CCTTGC^TAC 4ÂTSCSST6C ÂAATTATGGC WTCMSAG CATTCTTATT ATGCTASTTT TSSTÍATCAT 6TCACAAATT rnmcACc mtMCsr mornc-sc ccsacgacct rmicrm mw/m cmmtr tsmnm gttctcatgg acattsttca cagccaiçca tcaaatmta

CT7TAGAT8S ACTGAACATG TTTGACGGÍA CAGATAGTTG TTACTTTCAC TCfêGAGCTC GTSSTTATCA TTG6AITO GATTCCCGCC TCTTTAACTA MAÂACTSS GAGETACTTA fiGTATCTTcr ctcaaato mmmr mm#*® cmmm gsatttagat rmmw ®mcm atstatactc accacgsah atcggiggga ttcactssga

ACTACGASGA ATACTTTGGA CTOAACTG ATGTRGAT6C TGCCGTGTAT CT&TOGS CCAACGATCT TATTCATS3QG ÇTTTTCCCÁfí ATGCAÁTTÁC CATTOGAA GATGTTASCG GMISCCSAC ΑΤΠΤδΤΑΤΤ CCCGTTCAÂG ATGGGSSTGT T6GCTTTSAC TATCGGCTSC ATATQSCAAT TCOGATAM TSSATÍGAGT TSCTCAÃGAA A03SSATGA6 mmm T8GGT6ATAT HGTTCATACA C1SACAAATA SAA6ATSGTC GGAAAASTST GTTTCATACS

a&mm imcma ctmmQ aimãactat ascattos ctgatggca ASGÂlÂTGTA TWTTTATS GCTTTSSATA mmCMC atcattaata sat-cotga TAGCA7TSCA CAÁSAIBATT A^CTTSTAA CTATSsSATT ASGAGGAGAA SS3TACCTAA ATTTCA.TGGG MATGMTTC GGCO&CCTS AGTGGATTGA mCCCTAGS GC1BAA£AC ACCTCTCTGA mtCASTA ATltCGSGAA ACCAATTCAG TTATSATAAA 1SCAGAGGSA GAmSACCT GSSASATGCA GMTATTTM GATACCSTGS GTTSCAASAA TTTSAC» CTATGCASTA TCTTGAÁfiAT AAATATSflfíT TTATGÂCTTC AGMCACCAG TTCATATCAC SAAASGATGA AGGAGATAÊG ATGATTSTÃT TípAAAAAGG AÃÂCCTASTT TTTBTCTTTA ATmCACTS aCAAAAAGC TATTCA5ACT ATCSCATAGG CTSGCTWS OTOAAMT ACAAGGTTS: CTTGGACTCA GATGATCCAC TTTTOTGS CTTCGS3AÊA ATTGATCATA ÂTÊCCGAATG TTTCACCTTT GAÃS8AT86T ATGATSATCG TCCTCGTTCA ATTATGGTST atscâcctag tagaacasca totctatg gactagtasa caaasaâgm gaagaagaag AAGTAGCAST AGTÂGAAGAA GTASTASTAS AASAAGMTS AACGAACTTG TGATCGCGTT' GAMfiATTTE aaosctacat ASAGCTTtTT fitóSTATtTS GCMTATTGC ATCASTCTTfí 1680 1740 1800 1860 2160 zm 2280 2340 2400 2460 2640: 2760 2760 2820 2830 2840 ΡΕ0826061 81 GCGGAATTTC ATGTGACAAA ACSCAGAGÂT SAAOTSCTGA SM3GGCTT CAGCAGSÍTT GAGCCCACTA swtcmtt TOÍATCTA ATGATQmr ASSTTISCAA rrCTTTCCC tattagt^t GCMCGAW ACAAACATAT GTAAMTCGA TSAATTTATS TCGÃATGCTG TSCTWTBA GHCT5TMA TfSTCÁTCTC TFTANÂTGTA AWTSASACC TMAAMCM TAACGATMA AT3SAAÂTAG MCÔi» MãAMAàÁA AAAMCTC6A 5

300D 3:120 3180 3231 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:19: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 2578 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:19:

tcãttmâsa ggasaaattâ 7SSCTGAMA STCTTCTTAC MGTCCTTÈT ÊCCTSGAAtX TCACTSAfiAC ATCTCCAfiAA AACACGCTAG CCASCTTAAA gaastgttsa mcimi mmc m aacattaaat GAGAGASGGG CATCOCTCCA

ACTATGAGAG AATTCCGMT

CAGAGTGATA immn& imamc

CAÂTT6ACM GTÃTGASÊGT TCACTCGTAG TGCÍÃCA3GT CCCTCATTGG A6ATT7ÍA4C TTGGTGTCÍG GGAGÃTTTTT GSTCCAGAGT GMGATACGT

MTTCCCCAê ACTfiAfiAACG TTTSCTTCAT ACTTCTGAAG CCTGGAC7TG enwrmcA GSTTT&GÂAG ATCAOTACC AATTGGGAC5 CTGCCAÁATA ãT&GACãCTC

GATCTCACCA 7CACCATC4C CATGGGATCT TCCGACCTTC TACA8TTGCA saicssa* GCTCCTCATC CTCMCÂMC CAAT7TGAST CATCMCTGA TSTAÊATAST TCMCAATSfi ATGACG7TGA GCCGTCAÂGT GATTÍTÂCAS CACTACAACT ACMGAAGGT C-GIMOSS ASACMTTAT TGAI5MTCT SjATAGGATCA GTCAGAASAT T7ATGAAATA GACCCCCTTT GGTATÍCÂCA GTACMGAAA OTAGMG CITITTCTCG TGGTTATGM MMTGGETT ST6AMSC TCCTSGT5CC CAGTCAGCTG CAAATGCTGA CATTATGACT CGGMTGMT mmm ttctcosca attcctcattg CATCA5GTST TAAG5ATTCC ATTCCTSCTT 50 120 180 240 300 360 420 480 .540 600 660

GGAímiA CTCTTCACAG CTTCC1GATG AMTTCCATA TAATGSAATA TATTATGATC CACCCGAASA GSA&AGSTAT OTTCCAAC ACGCACGGCC MAfiftAACCÃ AAGTCGCTGA GAATATAT6A âTCTCATm SSAATGASTA STCOSGAGCC TAAAAHAÂC TCATACenSA ATTTTAGAGA TGAAGTTCTT CCTCGCATAA AAMGCTTGG GTACAATGCG GTSCÂAÃTTA 720 780 840 300 960 1020 1080 ΡΕ0826061 82 TGâCTArrCA ASAGCATTCT TATTAIGCTA δΤΤΤ^πΑ TCÂISTCACA ΜΤΤΠΤΤΙβ 1140

CACCMSCÁG CCGTTim AC3CCCGAC€ ACCTTAAGTC TTTGATfSAT AMGCTCATG ASCTAGSAAT TWST^TC ATSSâCATÍG TTCACASCCA TGCATCMAT ΜΙΑζΤΠΑΒ atgsactgaa catotítísAc sgcagcgata otttctt tcactctqsa gcestggtf ATCATTGGAT SWATTCC (ΒΧΠΤΓΪΑ ACTATGGAM CTGGGAGGTA. CTTASsTATC TTCTCTCAM tgcgasatsg igsttoíg asttcaaatt tgatgsattt AGATITGATG

mmm mtgatgtat actcaccacs sattatcsgt gggâttcact gggmciacg AGGAATACTT TG3ACTC3CA ACTGATGTGG ATGCTGTTGT GTÂTCTGATG CTGGTCAACG ÂTCTtATTCA TbGGCTTTTC CCAGATGCAA TTACCATTGG TGMATSn AGCGGAATGC

CGACATÍTTS TATTCCCGTT CAASATSSGG CAATTOCTGA TAAATSSATT OASTT&CTtA ATATTÊTTCA TÂCACTGACA MTAGAAGAT G7CATGATCA AfiCTCTASTC GGTGATAAAA TSTATGATTT TATGGCTCTS GATAGACCSC TGCACA4SAT GATTAÍ&CTT STAWTATSS TSÊSAMISâ ATTCSGCCAC CCTGAST8GA CTSA1KSACTC AGTAATÍC.te SGAAACCAAT mmm mmm ttaagatacc AGTATCTTGA ÁGÃTAAATAT GASTTTATSA ATSAAGGAGA TAGSATGâTT STATÍTSAM ACTGGACAAA AAfitTATTCA GACTATCGCA TÍSCCim CTCAGàTGAT CCACTTTÍTG AATATTTCAC CTRW6SA TGGTATGATG CTTSTAGAAC AGCAGTGSTC TATGCAGTAG MSAASAAGT A8CAGTÀBTA GAAGMGTAG

GTGTTGSCTT.mmmm ggtcgsaaaa tfATAfiCATT CMCATCATT

TTGATTTCCC TCASTTAT6A GMGTTGCA

CTTCAGAACA

AASGAAACCF TASGCTGCCT GTGGCTTCGG ATCGTCCTCS TAGACMAGA TAGTAGAAGA (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:20: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:

TGACTATCGG CTGCATA7SG TGAGGATTSS AGAGTSGSTS GTGTGTÍTCA TACGCTGAAA CTSGCT6ATG GACAAGSATA

AGÂASSGIAC CÍAAATTTCA TAGSGCTGAA CAACÂCCTCT TAAA7GCAGA CGGAGATTTG AGAATTTGAC CGGGCTATGC CCAGTTCATA TCACSMAAGS AGTTTÍTSTC TTTMTTTTC GAASCCTBGA AMTACAAGG GAGAATTSAT CATMTOG TTCAATTATG GTQTATGCAC ASAAGMSM SAASAAGAAS AGAATtiAAib AACTTGTG 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1860 1920 1980 2040

2220 2280 2340 2400 2460 2520 25TB (A) COMPRIMENTO: 23 pares de bases 83 ΡΕ0826061 (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear

(xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:20 AATTTYATGG GNAAYGARTT YGG

Lisboa, 3 de Outubro de 2007

Claims

ΡΕ0826061 1 REIVINDICAÇÕES 1. Amido extraído de uma batateira e tendo um teor de amilose de pelo menos 35%, avaliado pelo método de ensaio iodométrico de Morrison & Laignelet (1983 J. Cereal Science 1, 9-20) .
2. Amido de acordo com a reivindicação 1, tendo um teor de amilose de pelo menos 37%, avaliado pelo método definido na reivindicação 1.
3. Amido de acordo com a reivindicação 1, tendo um teor de amilose de pelo menos 40%, avaliado pelo método definido na reivindicação 1.
4. Amido de acordo com a reivindicação 1, tendo um teor de amilose de pelo menos 50%, avaliado pelo método definido na reivindicação 1.
5. Amido de acordo com a reivindicação 1, tendo um teor de amilose de pelo menos 66%, avaliado pelo método definido na reivindicação 1.
6. Amido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-5, tendo um teor de amilose de 35-66%, avaliado pelo método definido na reivindicação 1.
7. Amido de acordo com qualquer uma das reivin- 2 ΡΕ0826061 dicações anteriores que, quando extraído de uma batateira através de moagem a húmido à temperatura ambiente, possui uma temperatura de início de viscosidade na gama de 70-95 °C, avaliado pela viscoamilografia de uma suspensão aquosa a 10% p/p do mesmo, realizada à pressão atmosférica usando o Analisador Newport Scientific Rapid Visco 3C com um perfil de aquecimento de manutenção a 50 °C durante 2 minutos, aquecimento de 50 para 95°C a uma velocidade de 1,5 °C por minuto, manutenção a 95°C durante 15 minutos, arrefecimento de 95 para 50°C a uma velocidade de 1,5°C por minuto e depois manutenção a 50°C durante 15 minutos.
8. Amido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-6 que, quando extraído de uma batateira por moagem a húmido à temperatura ambiente, tem um máximo de viscosidade na gama de 500-12 unidades de número de agitação (SNUs), avaliado através de viscoamilografia realizada de acordo com o protocolo definido na reivindicação 7.
9. Amido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-6 que, quando extraído de uma batateira por moagem a húmido à temperatura ambiente, tem uma viscosidade de empastamento na gama de 214-434 SNUs, avaliado através de viscoamilografia realizada de acordo com o protocolo definido na reivindicação 7.
10. Amido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-6 que quando extraído de uma batateira por moagem a húmido, à temperatura ambiente, tem uma visco- 3 ΡΕ0826061 sidade de retrogradação na gama de 450-618 SNUs, avaliado através de viscoamilografia realizada de acordo com o protocolo definido na reivindicação 7.
11. Amido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-6 que, quando extraído de uma batateira por moagem a húmido à temperatura ambiente, tem uma viscosidade de retrogradação na gama de 14-192 SNUs, avaliado através de viscoamilografia realizada de acordo com o protocolo definido na reivindicação 7.
12. Amido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-6, que quando extraído de uma batateira por moagem a húmido à temperatura ambiente, tem um pico de viscosidade gama de 200-500 SNUs e uma viscosidade de retrogradação na gama de 275-618 SNUs, avaliado através de viscoamilografia realizada de acordo com o protocolo definido na reivindicação 7.
13. Amido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-6 que, quando extraído de uma batateira por moagem a húmido à temperatura ambiente, tem uma viscosidade que não diminui entre o início da fase de aquecimento (passo 2) e o início da fase final de manutenção (passo 5) e tem uma viscosidade de retrogradação na gama de 303 SNUs ou inferior, avaliado através de viscoamilografia realizada de acordo com o protocolo definido na reivindicação 7. 4 ΡΕ0826061
14. Amido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-6 que, quando extraído de uma batateira por moagem a húmido à temperatura ambiente, não apresenta um decréscimo significativo da viscosidade avaliado através de viscoamilografia realizada de acordo com o protocolo definido na reivindicação 7.
15. Amido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-6 que, quando extraído de uma batateira por moagem a húmido à temperatura ambiente, está de acordo com a reivindicação 7 e de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 14.
16. Amido de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, que quando extraído de uma batateira tem um teor de fósforo em excesso de 200 mg/100 g de peso seco de amido.
17. Utilização de amido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-16 na preparação ou processamento de um produto alimentar.
18. Utilização de amido de acordo com a reivindicação 17, em que é usado amido para se obter uma película, revestimento ou agente gelificante.
19. Utilização de acordo com a reivindicação 17, para preparar composições de amido resistentes. 5 ΡΕ0826061
20. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-16 na preparação ou processamento de adesivos ondulados, produtos biodeqradáveis, embalagens, fibras de vidro e têxteis.
21. Uma molécula de ácido nucleico isolada codificadora de um polipeptideo compreendendo a sequência de aminoácidos resíduos 49 a 882 da sequência mostrada na Figura 5, ou o seu complemento.
22. Uma molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 21, compreendendo substancialmente a sequência de nucleótidos 289 a 2790 da sequência mostrada na Figura 5 ou o seu complemento.
23. Uma molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 22, compreendendo ainda a sequência de nucleótidos 145 a 288 da sequência mostrada na Figura 5 ou o seu complemento.
24. Uma molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 21, compreendendo a sequência de nucleótidos 228 a 2855 da sequência designada psbe2con.seq na Figura 8 ou o seu complemento.
25. Uma molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 21, compreendendo a sequência de nucleótidos 57 a 2564 da sequência designada psbe2con.seq na Figura 12 ou o seu complemento. 6 ΡΕ0826061
26. Uma molécula de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 25, compreendendo um codão de iniciação ATG na mesma qrelha de leitura e facultativamente incluindo uma região não traduzida 5' e/ou 3' .
27. Uma molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 21, compreendendo a sequência de nucle-ótidos 45 a 3200 da sequência designada psbe2con.seq na Figura 8 ou o seu complemento.
28. Uma construção de ácido nucleico compreendendo uma molécula de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 27.
29. Um vector compreendendo uma construção de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 28.
30. Uma célula hospedeira isolada compreendendo um vector de acordo com a reivindicação 29.
31. Um polipeptideo SBE classe A obtido a partir de batateira e codificado por uma sequência de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 29.
32. Um polipeptideo de acordo com a reivindicação 31, compreendendo ainda a sequência de aminoácidos 1 7 ΡΕ0826061 a 48 da sequência apresentada na Figura 5.
33. Um polipeptideo de acordo com a reivindicação 31 ou 32 substancialmente isolado de outros constituintes derivados da planta.
34. Um método para alterar as caracteristicas de uma planta, compreendendo a introdução na planta de uma molécula de ácido nucleico de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 a 29, operacionalmente ligado a um promotor adequado activo na planta, de forma afectar a expressão de um gene presente na planta, gene esse que codifica uma enzima de ramificação do amido Classe A.
35. Um método de acordo com a reivindicação 34, em que a sequência nucleotidica está operacionalmente ligada na orientação contrária à da cadeia codificadora a um promotor adequado activo na planta.
36. Um método de acordo com a reivindicação 34, em que a sequência introduzida compreende uma ou mais das sequências que se seguem ligadas operacionalmente, na orientação correcta, a um promotor activo na planta, de forma a causar a supressão da expressão da sequência codificadora de uma enzima naturalmente expressa na planta: uma região não traduzida 5', uma região não traduzida 3' ou uma região codificadora da enzima de ramificação do amido SBE Classe A da batateira. 8 ΡΕ0826061
37. Um método de acordo com qualquer uma das reivindicações 34, 35 ou 36, compreendendo ainda a introdução na planta de uma ou mais sequências adicionais.
38. Um método de acordo com a reivindicação 37, em que uma ou mais das sequências adicionais estão operacionalmente ligadas, na orientação contrária à da expressão, a um promotor adequado activo na planta.
39. Um método de acordo com a reivindicação 37 ou 38, em que a sequência adicional compreende uma fracção de uma sequência nucleotidica de SBE Classe B.
40. Um método de acordo com qualquer uma das reivindicações 34 a 39, eficaz na alteração da composição de amido de uma planta.
41. Uma planta ou célula vegetal ou a descendência de tal planta ou parte de tal planta, compreendendo um vector de acordo com a reivindicação 29.
42. Uma planta de acordo com a reivindicação 41, seleccionada entre uma das seguintes: batateira, ervilhei-ra, tomateiro, milho, trigo, arroz, cevada, batata-doce e mandioca.
43. Um tubérculo ou outro órgão de reserva derivado de uma planta de acordo com a reivindicação 41 ou 42. 9 ΡΕ0826061
44. Utilização de um tubérculo ou órgão de reserva de acordo com a reivindicação 43, na preparação e/ou processamento de um produto alimentar.
45. Uma planta de acordo com a reivindicação 41 ou 42, contendo amido que, extraído da planta por moagem a húmido à temperatura ambiente, possui uma temperatura de início de viscosidade elevada, avaliado através de viscoamilografia realizada de acordo com o protocolo definido na reivindicação 7, comparativamente com amido extraído de uma planta idêntica não alterada geneticamente.
46. Uma planta de acordo com a reivindicação 45, em que a temperatura de início de viscosidade está aumentada em 10 a 25°C.
47. Uma planta de acordo com a reivindicação 41 ou 42 contendo amido que, quando extraído da planta por moagem a húmido à temperatura ambiente, possui um decréscimo da viscosidade máxima, avaliado através de viscoamilografia realizada de acordo com o protocolo definido na reivindicação 7, comparativamente com amido extraído de uma planta idêntica não alterada geneticamente.
48. Uma planta de acordo com a reivindicação 47, em que o máximo da viscosidade é inferior em 240 a 700 SNUs. 10 ΡΕ0826061
49. Uma planta de acordo com a reivindicação 41 ou 42 contendo amido que, quando extraído da planta por moagem a húmido à temperatura ambiente, possui um aumento da viscosidade de empastamento, avaliado através de viscoamilografia realizada de acordo com o protocolo definido na reivindicação 7, comparativamente com amido extraído de uma planta idêntica não alterada geneticamente.
50. Uma planta de acordo com a reivindicação 49, em que a viscosidade quando da empastamento varia entre 37 e 260 SNUs.
51. Uma planta de acordo com a reivindicação 41 ou 42 contendo amido que, quando extraído da planta por moagem a húmido à temperatura ambiente, possui um aumento da viscosidade de retrogradação, avaliado através de viscoamilografia realizada de acordo com o protocolo definido na reivindicação 7, comparativamente com amido extraído de uma planta idêntica não alterada geneticamente.
52. Uma planta de acordo com a reivindicação 51, em que a viscosidade de retrogradação está aumentada em 224 a 313 SNUs.
53. Uma planta de acordo com a reivindicação 41 ou 42 contendo amido que, quando extraído da planta por moagem a húmido à temperatura ambiente, possui um decréscimo da viscosidade de retrogradação, avaliado através de viscoamilografia realizada de acordo com o 11 ΡΕ0826061 protocolo definido na reivindicação 7, comparativamente com amido extraído de uma planta idêntica não alterada geneticamente.
54. Uma planta de acordo com a reivindicação 41 ou 42 contendo amido que, quando extraído da planta por moagem a húmido à temperatura ambiente, possui um elevado teor aparente de amilose, avaliado pelo ensaio iodométrico de acordo com o método de Morrison & Laignelet, comparativamente com amido extraído de uma planta idêntica não alterada geneticamente.
55. Uma planta de acordo com a reivindicação 41 ou 42, contendo amido que, quando extraído da planta, possui um excesso de teor de fósforo de 200 mg/100 g de peso seco de amido.
56. Um método de modificação de amido in vitro, compreendendo o tratamento do amido em condições adequadas com uma quantidade eficaz de um polipeptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 a 33. Lisboa, 3 de Outubro de 2007