PT1331845E - Cevada com reduzida atividade ssii e produtos contendo amido com um conteúdo de amilopectina reduzido - Google Patents

Cevada com reduzida atividade ssii e produtos contendo amido com um conteúdo de amilopectina reduzido Download PDF

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Description

1
DESCRIÇÃO "CEVADA COM REDUZIDA ATIVIDADE SSII E PRODUTOS CONTENDO AMIDO COM UM CONTEÚDO DE AMILOPECTINA REDUZIDO"
Esta invenção diz respeito a uma planta de cevada com uma reduzida atividade da enzima SSII, conduzindo a um amido com um conteúdo de amilopectina reduzido. A invenção também contém amido e grãos, bem como produtos alimentares obtidos a partir destes.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
Uma descoberta em ciências da nutrição é que o amido resistente tem importantes implicações na saúde intestinal, em particular na saúde do intestino grosso. Os efeitos benéficos do amido resistente resultam do fornecimento de um nutriente ao intestino grosso, pelo qual é fornecida à microflora intestinal uma fonte de energia que é fermentada para formar, inter alia, ácidos gordos de cadeia curta. Estes ácidos gordos de cadeia curta fornecem nutrientes aos colonócitos, aumentam a absorção de certos nutrientes através do intestino grosso e promover a atividade fisiológica do cólon. De uma forma geral, caso amido resistente ou outra fibra dietética não for fornecida, o cólon é relativamente inativo metabolicamente.
Nos últimos anos tem-se tentado conseguir fornecer amidos resistentes de várias fontes, para o tratamento das doenças intestinais. Concomitantemente, foram desenvolvidos amidos, com elevada amilose, em certos cereais, como no milho, para o uso em alimentos, como meio de promoção da saúde intestinal. A estrutura física do amido pode ter um impacto importante nas propriedades nutricionais e no manuseamento de amido 2 nos produtos alimentares. Certas características podem ser tomadas como uma indicação da estrutura do amido, incluindo a distribuição da dimensão da cadeia de amilopectiva, o grau de cristalinidade e a presença de formas cristalinas, como a forma cristalina de amido complexo-V. As formas com estas caracteristicas podem também ser tomadas como um indicador das propriedades nutricionais e de manuseamento de alimentos contendo estes amidos. Assim, amilopectinas com cadeias de dimensão curta podem ser um indicador de uma baixa cristalinidade e uma baixa gelatinização e pensa-se igualmente que têm uma correlação com uma retrogradação reduzida da amilopectina. Adicionalmente, pensa-se que uma distribuição reduzida da dimensão das cadeias de amilopectina, reflita propriedades organoléticas dos alimentos, nos quais o amido seja incluido em quantidades significativas. A cristalinidade reduzida de um amido pode ser igualmente indicativa de uma temperatura de gelatinização reduzida e pensa-se adicionalmente estar associado a propriedades organoléticas aumentadas. A presença de cristalinidade do complexo-V, ou outros lípidos associados a amido, vai aumentar o nivel de amido resistente e assim as fibras da dieta.
Linhagens de cevada contendo amido com conteúdos de amilose elevados foram identificadas no passado. Estas resultaram em apenas um aumento relativamente modesto no conteúdo de amilose, a um máximo de cerca de 45 % do amido total, como é o caso da variedade de cevada conhecida como High Amylose Glacier (AC38). Apesar de amidos de elevada amilose deste tipo serem úteis, são preferidos amidos com um conteúdo de amilose mais elevado, e certos tipos de cereais são cruzados para conterem amidos com elevados conteúdos de amilose, com niveis na gama do percentil 90. Estes são 3 muito resistentes à digestão e conferem um maior beneficio de saúde. Há um problema em fornecer amidos com elevado conteúdo de amilose por estes também terem uma elevada temperatura de gelatinização. A temperatura de gelatinização é um reflexo da energia de pulverização, necessária para o processamento de tais alimentos. Assim, temperaturas elevadas são normalmente necessárias para o processamento de cereais ou farinha para o fabrico de alimentos a partir de tais cereais ou amidos. Por isso, produtos contendo amidos com elevada amilose são, de uma forma geral, mais caros. Da mesma forma, do ponto de vista do consumidor podem ser necessários tempos mais longos e temperaturas mais elevadas para a preparação dos alimentos manufaturados, ou para a produção de alimentos a partir de farinha contendo amidos de elevada amilose. Assim, há uma desvantagem significativa no fornecimento de amidos de elevada amilose em alimentos.
Outro componente nutricional de cereais e em particular da cevada são os β-glucanos. O β-glucano consiste em unidades de glicose ligadas por ligações β(1-4) e/ou β(1-3)-glicosídicas e também não são degradadas pelas enzimas do sistema digestivo humano, o que os torna adequados como fonte de fibras de dieta. Os β-glucanos podem ser parcialmente digeridos por bactérias colónicas endógenas, cujo processo de fermentação origina ácidos gordos de cadeia curta (predominantemente acetato, propionato e butirato) os quais são benéficos para as células da mucosa que delimitam o intestino e o cólon (Sakata e Engelhard, Comp. Biochem Physiol. 74a:459-462 (1983)). A ingestão de β-glucano tem também o efeito de aumentar a excreção de ácido biliar conduzindo a uma redução do colesterol total no soro e das lipoproteínas de baixa 4 densidade (LDL), com a concomitante redução do risco de doença coronária. De forma semelhante os β-glucanos atuam pela atenuação das excursões pós-prandiais na concentração de glicose no sangue. Pensa-se que ambos os efeitos sejam baseados num aumento da viscosidade dos conteúdos no estômago e intestinos. A composição dos alimentos contendo amidos e a relação próxima destes amidos com outros componentes nutricionais ou outros, pode ter um impacto significativo no valor nutricional destes alimentos ou nas caracteristicas funcionais destes componentes na preparação ou na estrutura dos alimentos.
Embora os amidos modificados ou β-glucanos, por exemplo, possam ser utilizados em alimentos que forneçam uma funcionalidade não normalmente fornecida por fontes não modificadas, tal processamento tem a tendência para ou alterar outros componentes de valor, ou estar associado a uma perceção de serem indesejados, devido aos processos envolvidos na modificação. Por isso, é preferível que sejam fornecidas fontes de constituintes, que possam ser usados sob a forma não modificada, em alimentos. A variedade de cevada MK6827 está disponível na coleção de cevada Germplasma (USDA-ARS National Small Grain Germplasma Research Facility, Aberdeen, Idaho 831290). O cereal de MK6827 é reduzido e tem uma casca altamente colorida e uma forma alongada e, nas mãos dos inventores, este cereal é muito difícil de processar incluindo ser muito resistente à moagem. As propriedades do cereal MK6827 não foram caracterizadas anteriormente, nem foi determinada a natureza da mutação, nem é considerado adequado para produzir alimentos. 5
RESUMO DA INVENÇÃO
Esta invenção deriva do isolamento e caracterização de mutantes SSII de plantas de cevada, cujo grão se descobriu conter amido que exibe um conteúdo reduzido de amilopectina e por isso, niveis de amilose relativamente elevados e por isso, tem niveis elevados de fibras dietéticas. 0 grão do mutante e o grão de cruzamentos com certos enquadramentos genéticos exibe adicionalmente um nivel elevado de β-glucano. A combinação de um nivel elevado de β-glucano com amido resistente, contribuindo para uma fibra altamente dietética, é encarada pelos inventores como sendo única da presente invenção.
Adicionalmente, pelo menos em alguns enquadramentos genéticos, descobriu-se que o grão destes mutantes contém amido com conteúdos relativamente elevados de amilose, e que também tem temperaturas baixas de gelatinização. As caracteristicas de baixa expansão de tal amido durante e no seguimento da gelatinização também tem vantagens em certas aplicações dietéticas e de processamento de alimentos.
Adicionalmente, foi descoberto que grãos destes mutantes contêm amido com niveis de amilose relativamente elevados, os quais são superiores a 50 % do conteúdo em amido, o que é um nivel superior a qualquer um alguma vez encontrado em amido não modificado obtido a partir de cevada. O amido dos mutantes e das linhagens retrocruzadas derivadas destes mutantes (na medida em que estes retrocruzamentos foram testados) exibem um amido resistente, com uma estrutura alterada, indicada pelas caracteristicas fisicas especificas, incluindo uma ou mais do grupo incluindo a presença de um conteúdo relativamente 6 elevado de amilose, inacessibilidade física devido ao elevado conteúdo de β-glucano, morfologia de grânulo modificada, e pela presença de lípidos associados a amido, sendo que a estrutura alterada é indicada por uma ou mais características escolhidas do grupo incluindo baixa cristalinidade, reduzida distribuição da dimensão da cadeia de amilopectina e a presença de uma quantidade apreciável de lípidos associados a amido.
Adicionalmente, até ao momento, o grão derivado das plantas mutantes de cevada pode ser usado diretamente em procedimentos de processamento de alimentos. A presente invenção reside por um lado num grão de uma panta de cevada contendo um gene mutado de SSII, de tal forma que a atividade SSII codificada pelo referido gene SSII mutado é abolida e o conteúdo total de amido do referido grão tem um conteúdo de amilose relativo de pelo menos 50 % (massa/peso), e que a) a proporção de cadeias de amilopectina contidas no amido do referido grão que tenham um comprimento no intervalo de 6 a 11 resíduos ser pelo menos 30 %, e b) a proporção das cadeias de amilopectina contidas no amido do referido grão que tenham uma dimensão no intervalo de 12 a 30 resíduos é inferior a 65 %, e c) a proporção de cadeias de amilopectina contidas no amido do referido grão que têm um comprimento no intervalo de 31 a 60 resíduos ser inferior a 10 %. A invenção reside por outro lado numa planta capaz de produzir um grão de acordo com a presente invenção. A invenção reside num aspeto adicional, em amido de uma planta de cevada, caracterizado por o referido amido ter um conteúdo relativo de amilose de pelo menos 50 % (massa/peso) e caracterizado por a) a proporção das cadeias de amilopectina no amido, as quais tenham um comprimento de 6 a 11 resíduos ser pelo menos 30 7 %, e b) a proporção de cadeias de amilopectina contidas no amido que tenham um comprimento no intervalo de 12 a 30 residuos ser inferior a 65 %, e c) a proporção de cadeias de amilopectina contidas no amido do referido grão que tenham um comprimento no intervalo entre 31 e 80 resíduos ser inferior a 10 %. A presente invenção reside igualmente na utilização de uma construção de ADN para reduzir a expressão do gene SSII na planta de cevada, de tal forma a que o amido do grão obtido da referida planta tenha um conteúdo relativo de amilose de pelo menos 50 % (massa/peso) e que a) a proporção de cadeias de amilopectina contidas no amido do referido grão, que tenham um comprimento entre 6 e 11 resíduos, ser de pelo menos 30 %, e b) a proporção de cadeias de amilopectina contidas no amido do referido grão, que tenham um comprimento no intervalo de 12 a 30 resíduos ser inferior a 65%, e c) a proporção de cadeias de amilopectina contidas no amido do referido grão que tenham um comprimento no intervalo de 31-60 resíduos seja inferior a 10 %, caracterizado por a referida construção de ADN conter uma sequência que codifica a) uma molécula de ARN antisense capaz de interferir com a transcrição ou processamento da enzima SSII, b) uma ribozima, c) uma cópia extra na mesma orientação que o gene que codifica a enzima SSII, d) uma molécula de ARN dupla cadeia, ou e) uma construção em gancho desenhada para dar origem a uma molécula de ARN de dupla cadeia capaz de suprimir a atividade de SSII endógena. A presente invenção reside igualmente na aplicação de a) uma molécula de ARN antisense capaz de interferir com a transcrição ou processamento da enzima SSII, b) uma ribozima, c) uma cópia adicional com a mesma orientação do gene que codifica a enzima SSII, d) uma molécula de ARN de dupla cadeia, ou e) uma construção em alfinete, desenhada para dar origem a uma molécula de ARN de dupla cadeia capaz de suprimir a atividade de SSII endógena para reduzir a expressão do gene de SSII numa planta de cevada, de forma a que o amido do grão obtido da planta referida tenha um conteúdo relativo de amilose de pelo menos 50 % (massa/peso) , e que a) a proporção de cadeias de amilopectina contidas no amido do grão referido, as quais tenham um comprimento no intervalo de 6 a 11 residuos seja pelo menos de 30 %, e b) a proporção de cadeias de amilopectina contidas no amido do referido grão, as quais tenham um comprimento no intervalo 12 a 30 residuos seja inferior a 65 %, e c) a proporção de cadeias de amilopectina contidas no amido do grão referido que tenham um comprimento no intervalo de 31 a 60 residuos seja inferior a 10 %. A presente invenção pode ser referida, por um lado, por residir em amido obtido a partir do grão de uma planta de cevada contendo um nivel reduzido de atividade SSII, por os referidos grânulos de amido terem um elevado conteúdo de amilos devido a terem um conteúdo reduzido de amilopectina. A presente invenção pode ser referida noutro aspeto, como residindo, em geral, num grão útil para a produção de alimentos, obtido a partir de uma planta de cevada que tenha um nivel de atividade de SSII reduzido, sendo que o amido do grão referido tem um conteúdo de amilose elevado, por ter um conteúdo de amilopectina reduzido.
Num outro aspeto adicional, a presente invenção pode ser referida em geral por consistir numa planta de cevada com uma atividade de SSII reduzida, sendo a referida planta de 9 cevada capaz de produzir grãos, contendo o amido dos referidos grãos um elevado conteúdo de amilose, devido a ter um reduzido conteúdo de amilopectina, sendo este grão adequado para o fabrico de alimentos.
Em alternativa, a presente invenção pode ser referida como consistindo numa molécula isolada de ácido nucleico, a qual codifique uma proteína SSU de cevada, sendo que o referido ácido nucleico é capaz de hibridar sob condições restritivas com a SEQ 1D NO 1, ou uma célula contendo um vetor replicativo recombinante contendo a referida molécula de ácido nucleico. Numa forma adicional da presente invenção, pode ser isolada a molécula de ácido nucleico capaz de hibridar especificamente com a SEQ ID NO 1.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
Para um melhor entendimento a invenção será agora descrita com referência a uma série de exemplos.
Figura 1 Análise da distribuição de tamanho molecular do amido, determinado por separação por HPLC do amido em 90% de DMSO. (a) Himalaya (b) AC38 (c) 342 (d) 292
Figura 2 Fotografias mostrando a morfologia do grão das linhagens mutantes e parentais, (a) Himalaya (b) AC38 (c) 292 (d) Waxiro (e) 342 (f) Tantangara (g) MK6827 (h) Sloop. As dimensões do comprimento (L), largura (W) e espessura (T) são apresentadas no painel (a).
Figura 3 Análise da distribuição do tamanho da cadeia de amidos selvagens e de vários mutantes usando FACE. (a) distribuição normalizada do comprimento da cadeia (b) comparação das distribuições do 10 10 Figura 4
Figura 5
Figura 6
Figura 7
Figura 8 comprimento da cadeia por gráfico de diferença. As amostras foram 342 () , 292 (·) . Tantangara (s) . AC38 (¢-), MK6827 (♦) e Himalaya ( + ) .
Análise de RVA das amostras de amido de cevada.
Amostras eram Himalaya (*) , Namoi (Δ) , AC38 (o) , 342 (V), 292 (A) e MK6827 (). O perfil de temperatura utilizado durante o perfil é indicado pela linha continua.
Dados de difração de raios X para linhagens selvagem e mutantes.
Micrografias de varrimento eletrónico de amidos isolados de cevada, (a) Himalaya (b) Waxiro (c) AC38 (d) 292 (e) 342 (f) MK6827.
Loci no cromossoma 7H de cevada mostrando a proximidade dos loci nudl e sex6. Diagrama de acordo com GrainGenes (http://wheat.pw.usda.govn, Barley morphological genes, 7H map, autor; Franckowiak JD).
Relações entre dimensões de semente e a distribuição do comprimento das cadeias de amido para as linhagens duplamente haplóides 292 x Tantangara. As linhagens marcadas por (+) deram origem a um padrão de PCR Himalaya e linhagens marcadas por (o) deram um resultado de PCR semelhante a 292. Painel (A), a razão do comprimento da semente face à espessura é apresentado no gráfico, em função da percentagem de cadeias de amido com DP entre 6 e 11; Painel (B) é apresentado o gráfico do peso das sementes 11 em função da percentagem de cadeias de amido com DP entre 6 e 11.
Figura 9 Sequência de um cADN de SSII de cevada (SEQ ID NO 1) do cultivare Himalaya
Figura 10 A estrutura dos genes SSII de (1) T. tauschii (trigo diploide), (2) cevada, cultivar Morex. As linhas espessas representam exões e as linhas finas intrões. A linha reta debaixo de cada exemplo indica a região das sequências dos genes. A linha ponteada representa a região do gene SSII de cevada, a partir do intrão 7, que não foi sequenciada, mas a qual foi determinada, por análise de PCR, ter aproximadamente um comprimento de 3 kb.
Figura 11 Comparações dos cADNs SSII previstos de MK6827 (SEQ ID NO 2), Morex (SEQ ID NO 3) e 292 (SEQ ID NO 4), e a sequência de cADN de Himalaya (SEQ ID NO 1). As sequências previstas foram geradas pela identificação de regiões das sequências genómicas presentes no cADN de SSII de Himalaya. O codão de iniciação ATG e o codão STOP selvagem são indicados, bem como os codões stop adicionais presentes em MK6827 (#) e 292 (&), respetivamente.
Figura 12 Comparação das sequências de aminoácidos deduzidas a partir dos genes que codificam SSII das linhagens de cevada 292 (SEQ ID NO 7), Morex (SEQ ID NO 5), MK6827 (SEQ ID NO 8), Himalaya (SEQ ID NO 9) . Os codões stop adicionais 12 existentes em 292 e MK6827 são indicados com os símbolos (&) e (#) , respetivamente.
Figura 13 Posição das mutações em MK6827 (SEQ ID NO 2) e 292 (SEQ ID NO 4) no gene SSII de cevada.
Figura 14 Desenvolvimento e uso de um ensaio de PCR para a mutação 292. (a) representação esquemática de uma região de SSII da variante Himalaya amplificada pelos oligonucleótidos de iniciação ZLSS2P4 e ZLBSSIIP5 (b) representação da região amplificada a partir do gene SSII de 292 usando ZLSS2P4 e ZLBSSIIP5, mostrando a ausência do local de restrição NlalV (c) eletroforese em gel de agarose dos produtos de cevada digeridos com NlalV; poço M: marcador de pesos moleculares de ADN, poço 1: MK6827, poço 2: Himalaya/ poço 3:
Tantangara; poço 4: 292/ poço 5: 342.
Figura 15 Representação esquemática das construções de ADN desenhadas para reduzir a expressão de SSII, após a transfeção estável de cevada (1) 0 gene SSII dos nucleótidos 1 a 2972 (ver Figura 9 para a sequência) está inserido entre o promotor e o terminador na sua orientação sense. (2) 0 gene SSII está inserido entre o promotor e o terminador na sua orientação antisense, dos nucleótidos 2972 a 1 (ver Figura 9 para a sequência). (3) construção duplex na qual o intrão 3 do gene SSII da cevada (entre os nucleótidos 1559 e 2851) da sequência genómica de SSII da variante Morex foi inserido entre os exões 2 e 3 do cADN de SSII da cevada da variante Himalaya (nucleótidos 363 a 1157 da Figura 9). 13
Figura 16 Eletroforese em SDS-PAGE de proteínas de grânulos de amido. Painel (A) gel SDS-PAGE de 8 % de acrilamida (37,5:1 Acril/Bis), transferido por eletricidade e analisado com um anticorpo anti-SSII, produzido contra proteína SSII ligada a grânulos purificada a partir de trigo. (B) gel de 12,5 % de acrilamida (30:0,135 acrilo/bis), corado com prata. A migração dos marcadores de peso molecular de massa definida (unidades são kDa) são indicadas em cada lado da figura.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
Definições índice glicémico. É uma comparação do efeito de um alimento de teste como pão branco ou glicose em excursões de concentração de glicose no sangue. O índice glicémico é uma medida do efeito provável do alimento no que diz respeito à concentração de glicose no soro pós-prandial e a necessidade de insulina para a homeostase da glicose no sangue.
Amido resistente. A soma do amido e produtos da digestão do amido não absorvidos no intestino delgado de humanos saudáveis mas que passam para o intestino grosso. Assim, amido resistente exclui produtos da digestão que são absorvidos no intestino delgado.
Amidos resistentes podem ser classificados em 4 grupos. RS1 amido fisicamente inacessível. Exemplos desta forma de amido surgem quando o amido está aprisionado no interior de uma proteína ou matriz similar ou no interior da parede celular da planta, ou pode possivelmente ser 14 devido a uma maceração parcial do grão ou em legumes após o arrefecimento. RS2 grânulos resistentes. Estes são geralmente amidos crus tais como aqueles que derivam de batata crua ou bananas imaturas, alguns vegetais e amidos com elevada amilose. RS3 amidos retrógrados. Estes surgem pelo tratamento por calor/humidade de amido ou alimentos de amido como o que ocorre em batatas cozinhadas ou arrefecidas, pão e flocos de milho. RS4 modificados quimicamente. Estes surgem por modificações quimicas como substituição ou reticulação. Esta forma de amido é usada normalmente em alimentos processados.
Fibra dietética. Nesta especificação inclui-se a soma de hidratos de carbono ou produtos da digestão de hidratos de carbono que não é absorvida no intestino delgado de humanos saudáveis mas que entra no intestino grosso. Isto inclui amido resistente, β-glucano e outros polímeros de hidratos de carbono solúveis e insolúveis. É um objetivo a inclusão da porção de hidratos de carbono que sejam fermentáveis, pelo menos parcialmente, no intestino grosso pela microflora residente.
Gelatinização é o colapso (disrupção) da ordenação molecular no interior do grânulo de amido com as concomitantes e irreversíveis mudanças nas propriedades como expansão granular, fusão cristalina, perda de bi-refringência, desenvolvimento de viscosidade e solubilização de amido. 15 A presente invenção surge do isolamento e caracterização de plantas de cevada mutantes em SSII, cujo grão se descobriu conter amido que tem um conteúdo reduzido de amilopectina e por isso niveis relativamente elevados de amilose e por isso tem niveis elevados de fibras dietéticas.
Tais mutantes têm um número de caracteristicas particularmente desejadas, e foi demonstrado que cruzamentos em outros enquadramentos genéticos variados mantêm pelo menos algumas daquelas caracteristicas. 0 grão do mutante e o grão dos cruzamentos em certos enquadramentos genéticos tem adicionalmente um nivel mais elevado de β-glucano. Os inventores consideram que a combinação do nivel mais elevado de β-glucano e fibras dietéticas elevadas é único da presente invenção.
Adicionalmente, pelo menos em alguns dos enquadramentos genéticos foi descoberto que o grão proveniente destes mutantes contém amido que tem niveis relativamente elevados de amilose, e que possuem temperaturas baixas de gelatinização. As caracteristicas de expansão da gelatinização de um amido deste género também conferem a vantagem de serem de baixa expansão, o que tem vantagens em certas aplicações dietéticas e de processamento de alimentos.
Adicionalmente, o grão destes mutantes contém amido que exibe niveis relativamente elevados de amilose, sendo que os niveis de amilose são superiores a 50 % do conteúdo de amido, o que representa um valor nunca visto anteriormente em amido não modificado obtido a partir de cevada. 16 0 amido dos mutantes, e até ao ponto que os retrocruzamentos foram testados, exibem um amido resistente, com uma estrutura alterada, indicada por caracteristicas fisicas especificas incluindo uma, ou mais caracteristicas, do grupo que inclui a presença de um conteúdo relativamente elevado de amilose, inacessibilidade física devido a conter um elevado conteúdo de β-glucano, uma morfologia de grânulo alterada, e a presença de lípidos associados a amido, e uma estrutura alterada sendo indicada por uma característica selecionada a partir do grupo composto por baixa cristalinidade, uma distribuição reduzida do comprimento das cadeias de amilopectina e a presença de uma uma quantidade apreciável de lípidos associados a amido.
Adicionalmente, o grão derivado destas plantas mutantes de cevada pode ser usado diretamente em procedimentos de processamento alimentar.
Numa das formulações preferíveis, o grão destes mutantes contém amido que tem conteúdos relativamente elevados de fibras dietéticas, mais em particular amilose bem como um nível elevado de β-glucano. Os inventores consideram que a combinação do nível elevado de β-glucano e de amilose é única da presente invenção e fornecem uma fonte única de uma combinação de β-glucano e amido resistente, a qual não necessita, pelo menos nas formas mais latas da presente invenção, da mistura de β-glucano e fibras dietéticas solúveis em conjunto ou a modificação de partes dos componentes.
No melhor do conhecimento dos inventores, a planta de cevada de acordo com a presente invenção é a primeira que possui um grão de cevada com níveis de fibras dietéticas 17 relativamente elevadas sob a forma de amido resistente contendo um nivel elevado de amilose, que também possua niveis elevados de β-glucano que estão próximo, ou são superiores, ao limite superior dos niveis de β-glucano tipicos. Grãos que têm um conteúdo de β-glucano ainda superior, estão associados ao fenótipo waxy e por isso têm niveis reduzidos de amilose. É conhecido que existe uma grande variação dos niveis de β-glucano em cevada, variando de cerca de 4% a cerca de 18% em massa/peso de cevada, sendo tipicamente de 4 a 8 % (Izydorcyk et al., (2000) Journal of Agricultural and Food Chemistry 48, 982-989/ Zheng et al., (2000) Cereal Chemistry 77, 140-144/ Elfverson et al., (1999) Cereal Chemistry 76, 434-438/ Andersson et al., (1999) Journal of the Science of Foods and Agriculture 79, 979-986/ Oscarsson et al., (1996) J Cereal Science 24, 161-170/ Fastnaught et al., (1996) Crop Science 36, 941-946). Foram desenvolvidas estirpes de cevada melhoradas, por exemplo Prowashonupana, que têm um conteúdo de β-glucano entre cerca de 15% e cerca de 18% em massa/peso mas que está associado a um fenótipo waxy. Esta variedade tem sido comercializada sob a designação Sustagrain™, (ConAgra™ Specially Grain Products Company, Omaha, Neb. EUA).
Os níveis de β-glucano contemplados na presente invenção podem depender do enquadramento genético no qual a atividade da enzima de síntese de amilopectina se encontra reduzida. No entanto, foi proposto que a redução da atividade de síntese de amilopectina tem um efeito no aumento do nível relativo de fibras dietéticas, o que, em parte toma a forma de amilose e ao mesmo tempo eleva o nível de β-glucano. Uma explicação para o concomitante aumento dos níveis de β-glucano com níveis relativamente 18 elevados de amilose prende-se que tal aumento pode ser o resultado de um efeito de concentração devido a se ter um endosperma reduzido e que pode ser adicionalmente aumentado através do desvio do carbono da sintese de amido para a sintese de β-glucano.
Assim, o grão da planta de cevada possui um conteúdo de β-glucano superior a 6% do total do peso do grão sem casca, ou mais preferivelmente superior a 7%, sendo ainda mais preferivel que seja superior a 8%, contudo os niveis de β-glucano num mutante waxy foram medidos, podendo-se situar entre 15 e 18 %, e a presente invenção pode contemplar niveis tão ou mais elevados que estes.
Numa segunda forma preferivel de apresentação, o grão da planta de cevada exibe uma temperatura reduzida de gelatinização (medida por calorimetria diferencial de varrimento) adicionalmente ao conteúdo relativamente elevado de amilose. Baseados nos dados apresentados para a cevada do exemplo, esta temperatura de gelatinização reduzida não é apenas reduzida quando comparada com o amido produzido pela cevada com um conteúdo relativamente elevado de amilose mas também quando comparada com amido com um conteúdo normal de amilose. Assim, enquanto que a invenção contempla temperaturas reduzidas de gelatinização em relação a amido com um correspondente elevado conteúdo de amilose, pode igualmente contemplar uma temperatura de gelatinização reduzida em relação a amido com niveis normais de amilose.
Adicionalmente, nos enquadramentos genéticos testados até agora, o amido caracteriza-se igualmente por uma expansão em excesso de água aquecida que é inferior à expansão de outros amidos testados. 19 0 amido de acordo com a presente invenção tem conteúdos de amilose superiores a 50% do conteúdo de amido, o que é um nivel nunca anteriormente encontrado em amido não modificado derivado de cevada. O amido da presente planta de cevada tem um conteúdo relativamente elevado de amilose e um conteúdo ainda mais elevado que o esperado para uma mutação no gene de SSII ou outro gene de sintetase de amido. Assim, mutações em SSII de trigo resultam em niveis relativamente elevados de amilose, correspondendo a cerca de 35% do amido. O conteúdo de amilose do amido pode ser considerado elevado quando o conteúdo é suficientemente superior aos cerca de 25% presentes em grãos normais de cevada, o que pode assim ser superior a 30% em massa/peso do amido total. As plantas de amido conhecidas que se considera conterem um elevado conteúdo de amilose têm um conteúdo de 35 a 45 %. A presente invenção contudo fornece cevada com um conteúdo de amilose que é superior a 50%, o que é um nivel nunca encontrado em amido não modificado derivado de cevada. O conteúdo de amilose relativo pode ser superior a 60% e mais preferivelemnte, superior a 70%. Pode ser desejado obter-se niveis ainda mais elevados e é assim possível conseguirem-se níveis ainda mais elevados em outras plantas por cruzamento de plantas com mutações simples, de forma a que estes níveis se aproximem de 90%. Assim, a presente invenção pode incluir níveis de amilose superiores a 80% ou mesmo superiores a 90%.
Numa quarta forma preferível, o amido possui igualmente uma estrutura alterada que dá origem a amido resistente. Esta pode surgir a partir de um conteúdo elevado de amilose. O 20 amido resistente pode surgir igualmente devido à existência de β-glucano em niveis elevados, o que provavelmente tem um efeito protetor devido à associação do β-glucano com o grânulo de amido, a intimidade da associação fornece potencialmente um efeito protetor ao amido, de forma a fornecer uma resitência que pode ser caracterizada por ser sob a forma de RSl, tornando-o parcialmente inacessível à digestão. De forma semelhante, a presença da associação amido-lipido, medida através da cristalinidade do complexo V contribui igualmente de forma provável para o nivel de amido resistente. Neste caso a resistência é provavelmente devida à inacessibilidade fisica do amido em virtude da presença do lipido e desta forma, este amido se considerar RSl. É conhecido que amido retrógrado que assume a configuração complexo V é altamente resistente à digestão e desta forma é assumido que amilopectina que faça parte da estrutura cristalina em complexo V também seja resistente à digestão. O amido da planta de cevada do exemplo pode ser resistente à digestão devido à estrutura do grânulo e dessa forma ser amido RS2. Cada uma destas caracteristicas pode existir separadamente ou como duas ou mais destas caracteristicas em combinação. O conteúdo mais elevado em fibras dietéticas pode assumir, pelo menos parcialmente, a forma de amido resistente, o que pode ser caracterizado por um conteúdo de amilose elevado dos grânulos de amido como referido anteriormente. O conteúdo relativo de amilose pode ser superior a 60% e de preferência superior a 70%. Pode igualmente ser desejado obter-se niveis ainda mais elevados e foi possivel atingir-se niveis ainda mais elevados em outras plantas, pelo cruzamento de mutações simples, de forma a que os niveis obtidos se aproximem dos 90%. Assim, a invenção pode 21 incluir igualmente niveis de amilose superiores a 80% ou mesmo superiores a 90%.
Pode ser desejável que a planta de cevada exprima adicionalmente um nivel de atividade alterado de uma ou mais outras enzimas envolvidas na síntese de amilose. Assim, a planta de cevada pode conter uma mutação adicional que reduz ainda mais ou altera a biossíntese de amilopectina, ou uma mutação ou enquadramento genético que aumente a biossíntese de amilose. Por exemplo a planta de cevada pode exibir um genótipo expansor de amilose, como o associado a uma planta de cevada contendo a mutação amol. Um exemplo de uma planta deste género é uma variedade conhecidoa como AC38 (também conhecida como High Amylose Glacier). É entendido que o nível relativo de amilose é em relação ao conteúdo total de amido, e por isso, o remanescente do amido pode ser predominantemente de um tipo intermediário de amido ou ser predominantemente amilopectina ou uma mistura de ambos. Na cevada analisada, o nível elevado de amilose resulta de níveis de amilopectina reduzidos, e em consonância o nível relativo de amilose não resulta de um aumento da síntese de amilose. É conhecido que o β-glucano tem o efeito de abrandar a digestão no intestino delgado simplesmente pela sua presença quando em conjunto com qualquer outro componente alimentar. De uma forma semelhante é sabido que moléculas resistentes que tenham uma justaposição próxima com os grãos de amido ajudam a mascarar o amido e contribuem para a sua resistência, por o tornarerem fisicamente inacessível. Níveis elevados de amilose e outras formas de amido, como as que podem ter origem da associação de 22 lípidos, são adicionalmente aumentadas devido à presença e justaposição fisica dos grãos de amido. Assim, é fornecido um aumento significativo dos efeitos do amido resistente, bem como um fornecimento de outros efeitos benéficos derivados de niveis de β-glucano elevados.
Adicionalmente é conhecido que existe uma resposta doseada em termos dos efeitos benéficos do amido resistente e do β-glucano. É por isso proposto que o nivel aumentado de β-glucano em conjunto com os niveis aumentados de amido resistentes forneçam benefícios de saúde aumentados. A combinação dos niveis de β-glucano e amido resistente pelo menos das formulações preferidas de acordo com a presente invenção não foram descobertas anteriormente e seguramente não de uma única fonte sem algum grau de modificação ou purificação, e por isso as formulações de acordo com a presente invenção fornecem uma fonte única e prática destes benefícios.
Outro aspeto preferido do amido é que, apesar do conteúdo relativamente elevado de amido, tem também uma temperatura de gelatinização reduzida, medida por calorimetria diferencial de varrimento. Isto contrasta com a descoberta generalizada que amidos com elevada amilose tendem a ter uma temperatura de gelatinização mais elevada o que introduz restrições na forma como os amidos com elevada amilose podem ser utilizados. Com base nos dados apresentados para a cevada do exemplo, esta temperatura de gelatinização reduzida não é reduzida apenas quando comparada com amido produzido a partir de cevada com amido contendo níveis normais de amilose. Assim, ainda que um aspeto preferido da presente invenção inclua temperaturas de gelatinização reduzidas em relação a amidos correspondentes contendo amilose elevada, pode incluir 23 igualmente uma temperatura de gelatinização inferior em relação àquela do amido amido com niveis de amilose normais. Para amidos com elevada amilose existem aspetos de processamento que requerem temperaturas elevadas e por isso necessitam inerentemente um maior fornecimento de energia, o que é caro e pode destruir a funcionalidade de outros componentes alimentares. De forma semelhante, do ponto de vista do consumidor final, alimentos com amido de elevada amilose podem ser menos convenientes devido à sua mais elevada temperatura de preparação ou tempo de preparação necessário. Assim, por exemplo, nesta formulação preferida da presente invenção é agora possível o fornecimento de um produto, como um produto de massa que necessita a adição, a um contentor, de água a ferver ou aquecida, como uma chávena e não necessitar aquecimento por um período de tempo prolongado e ao mesmo tempo assegurando o fornecimento de amidos resistentes e outros constituintes com valor nutricional ao intestino grosso.
Um efeito maior das temperaturas reduzidas de gelatinização destes amidos prende-se com os requisitos de baixa temperatura e por isso a necessidade de energia de cominução dos alimentos. Um corolário prende-se igualmente com, como pode ser o caso do processamento de certos alimentos, enquanto que a mistura ocorre à temperatura ambiente e é em seguida aquecida, a temperatura de gelatinização mais reduzida reduz igualmente o tempo necessário para se obter a gelatinização. Adicionalmente, a um intervalo de temperaturas inferiores à temperatura de gelatinização total do amido normal, ocorrerá uma gelatinização mais completa do amido de acordo com a presente invenção do que do amido normal. 24
Uma medida da capacidade de gelatinização refelecte-se nas propriedades térmicas, medidas por calorimetria diferencial de varrimento. 0 aparecimento do primeiro pico (pico de gelatinização) na DSC pode ser inferior a 53 °C, preferivelmente inferior a 50 °C e ainda mais preferivel que seja inferior a 47 °C. O aparecimento do primeiro pico pode ser encarado como o inicio da gelatinização. O amido produzido do grão de cevada pode ter o primeiro pico a menos de cerca de 60 °C, preferivelmente inferior a 55 °C, sendo especialmente preferivel que seja inferior a 52 °C. A deltaH (entalpia= do primeiro pico pode ser inferior a cerca de 3,5, preferivelmente inferior a cerca de 1,0, sendo preferivelmente inferior que cerca de 0,5.
Uma outra descoberta àcerca da gelatinização de farinhas contendo amidos de acordo com a presente invenção diz respeito à redução da expansão. O volume de expansão é medido tipicamente pela mistura de ou amido ou farinha com um excesso de água e aquecimento até temperaturas elevadas, tipicamente superiores a 90 °C. A amostra é recolhida em seguida por centrifugação e o volume de expansão é expresso como a massa do material sedimentado dividido pelo peso seco da amostra. Os volumes de expansão da farinha de amidos de cevada waxy e normal são superiores a cerca de 5,5. Os volumes de expansão de farinha feita a partir de grão com elevada amilose (AC38) é cerca de 3,75, enquanto que a feita a partir dos grãos dos mutantes e dos cruzamentos examinados, é inferior a 3,2, de preferência inferior a 3,0 mas geralmente superior a cerca de 2.
Esta caracteristica de baixa expansão de gelatinização é particularmente útil no caso de ser desejável o amento do conteúdo de amido para a preparação de alimentos, em particular a preparação de alimentos hidratados. No caso apresentado pode ser desejável o aumento do conteúdo de 25 fibras dietéticas de uma solução ou preparação liquida, quando possa haver uma restrição no fornecimento da preparação alimentar.
Esta caracteristica, em combinação com uma reduzida temperatura de gelatinização exibida pelo amido apresentado fornece uma possibilidade de aumentar significativamente os benefícios nutricionais dos alimentos onde seja necessária uma rápida preparação, como as sopas instantâneas e as massas instantâneas.
Foi postulado que os efeitos da temperatura de gelatinização são um resultado da alteração da estrutura de amilopectina no endosperma deste cereal, e uma medição desta estrutura é a distribuição dos comprimentos das cadeias (graus de polimerização) das moléculas de amido no seguimento da remoção das cadeias laterais pela isoamilase. Uma análise do comprimento das cadeias do conteúdo de amilopectina do amido dos mutantes SSII do exemplo mostrou que quando removidas as cadeias laterais, estas têm uma distribuição situada no intervalo entre 5 e 60, o que é mais curto que a distribuição obtida a partir de amido de linhagens de plantas não mutantes, após remoção das cadeias laterais. Amido com cadeias mais curtas também terá um aumento concomitante na frequência de ramificação. Assim, o amido pode também ter uma distribuição de cadeias mais curtas de amilopectina. A proporção das cadeias de amido que têm um grau de polimerização que se situa entre 6 e 11 residuos é, superior a 30%, sendo preferencialmente superior a 35%. A proporção de cadeias de amido que tenham um grau de polimerização que se situe entre 12 e 30 residuos é inferior a 65%, de preferência inferior a 60% e especialmente preferível inferior a 55%. A proporção de cadeias de amido com um grau de polimerização que se situe 26 no intervalo de 31 a 60 resíduos é inferior a 10%, de preferência inferior a cerca de 8% mas é igualmente preferível que seja superior a 5%, sendo especialmente preferível que seja superior a 6%. A combinação das proporções dos três intervalos de comprimentos de cadeias é tomado como uma indicação que o amido é de um tipo de acordo com a presente invenção. A redução da distribuição do comprimento das cadeias contribui provavelmente para uma redução da temperatura de gelatinização. Pensa-se que uma redução da cadeia lateral aumenta as propriedades organoléticas do amido, em particular o gosto na boca, contribuindo talvez por isso para um produto aveludado. Adicionalmente, foi postulado que um comprimento de cadeia de amilopectina reduzido posse diminuir o grau de degrdação da amilopectina, o que tem um impacto na qualidade do alimento, pensando-se ter um efeito importante por exemplo no endurecimento do pão.
Adicionalmente, a estrutura do amido no amido do exemplo é diferente no grau de cristalinidade, o qual é reduzido, quando comparado com amido normal isolado de cevada. Quando combinado com uma distribuição de comprimentos de cadeia de amilopectina reduzidos, a cristalinidade granular reduzida pode indicar que a temperatura de gelatinização será reduzida. Pensa-se que a cristalinidade reduzida do amido esteja associada a uma melhoria das propriedades organoléticas e, como no caso do comprimento reduzido das cadeias de amilopectina, contribua para um gosto mais aveludado. Assim, o amido pode exibir adicionalmente uma cristalinidade reduzida resultante dos níveis reduzidos da atividade de uma ou mais enzimas de síntese de amilopectina. A proporção de amido exibindo cristalinidade 27 pode ser inferior a cerca de 20 %, sendo preferivelmente inferior a cerca de 15%.
Uma medida adicional das propriedades do amido da presente invenção é a medição da viscosidade. Foi descoberto que usando um Rapid Visco Analyser, que o pico de viscosidade do amido da presente invenção é significativamente diferente do observado para os amidos normal e waxy e amidos de elevada amilose obtidos de cevada. Estas medições foram realizadas em farinha integral, no entanto as propriedades do amido irão predominar nestas medições. Os amidos normais e waxy têm um pico de viscosidade entre cerca de 900 e cerca de 500 unidades RVA, sendo que o amido de elevada amilose conhecido tem um pico de viscosidade superior a 200, ao passo que plantas de cevada de acordo com a presente invenção têm um pico de viscosidade inferior a 100, tendo a maioria um máximo inferior a cerca de 50, sendo que em algumas plantas é tão reduzido como cerca de 10 unidades RVA. Será entendido pelo especialista que os parâmetros fornecidos, referências a unidades empíricas e os resultados citados são destinados a indicar o desempenho relativo destes amidos em instrumentos RVA ou similares, como o amilógrafo.
Adicionalmente à cristalinidade reduzida referida anteriormente, o amido da presente invenção pode ser caracterizado pela presença da forma complexo V de amido. Os inventores consideram que esta é a primeira vez que esta forma de amido está presente em quantidades apreciáveis em grânulos de amido de um cereal. Esta forma de amido está normalmente associada a amido retrógrado, em particular naquele em que houve contato com lípidos. No caso da presente invenção é postulado que a estrutura do amido permite a formação de uma relação intima entre os lípidos 28 da planta e o amido, o que resulta na estrutura do complexo V. Pensa-se que esta forma de amido possa conferir benefícios de saúde devido à sua digestibilidade reduzida e pode por isso contribuir para o amido resistente.
Outras formas de estrutura podem resultar gualmente da interação lípido-amido e incluir complexos lípido-amido não cristalinos. Assim, a presente invenção pode também ser referida por incluir uma planta de cevada exibindo quantidades apreciáveis de complexos amido-lípido no conteúdo de amido do endosperma do seu grão, resultando de níveis de atividade reduzidos de uma ou mais enzimas de síntese de amilopectina. Os amidos que contêm complexos de lípido-amido, incluindo aqueles que exibem uma estrutura em complexo V, são normalmente também resistentes à digestão e dessa forma contribuem para os níveis de fibras dietéticas. Preferencialmente, a proporção de amido cristalino exibindo uma forma cristalina característica de um complexo lípido-amido é superior a cerca de 50 % e mais preferivelmente superior a 80 %. O amido adicional à presença do complexo V do amido pode também exibir quantidades não apreciáveis de formas de amido do complexo A. A ausência do complexo A pode ser tomada como um indicador da presença de um amido de acordo com a presente invenção.
Foi também descoberto que a temperatura de liquidificação de amidos e produtos feitos a partir do cereal de acordo com a presente invenção são consideravelmente elevados. As temperaturas de liquidificação de amidos conhecidos é inferior a 70 °C e esta é válida tanto para amidos normais como para amidos com elevada amilose. Os amidos de acordo com a presente invenção, no entanto, exibem uma temperatura 29 de liquidificação superior a 75°C ou mais preferencialmente superior a 80 °C. É de notar que estas são medições empíricas e podem ser tomadas em relação às medições obtidas para os outros amidos.
Descobriu-se que o amido da planta de cevada do exemplo tem uma quantidade significativa de fibras dietéticas e amido resistente, sendo presumivelmente este aumento em parte o resultado do nível relativamente elevado de amilose, podendo no entanto haver igualmente uma contribuição das fibras dietéticas devido aos complexos amido/lípido, incluindo o complexo V, ou devido à associação próxima entre amilose ou amilopectina com o β-glucano. De uma forma semelhante, o nível elevado de β-glucano pode da mesma forma simplesmente contribuir de forma significativa para o aumento da fibra dietética.
Os níveis relativamente elevados de amilose no endosperma da planta de cevada do exemplo resulta com maior probabilidade da produção alterada de amilopectina como resultado da redução do nível de atividade da enzima SSII. É expectável que mutações no gene que codifica esta enzima exibam um conteúdo de amilose mais elevado e/ou uma diminuição no nível de amilopectina. Ao passo que só a síntese de amilopectina é reduzida, o amido exibe um aumento do nível relativo de amilose. A atividade alcoolizada da enzima de síntese de amilopectina pode ser atingida por mutações adequadas no gene respetivo ou nas sequências regulatórias do gene. As mutações exemplificadas desta invenção, sendo mutações SSII em cevada, são mutantes truncados e estes são conhecidos por terem um grande impacto na natureza do amido. Outros 30 rearranjos cromossómicos podem incluir deleções, duplicações ou mutações pontuais.
Tais mutações podem ser introduzidas em enquadramentos genéticos desejados por tanto se mutagenizar as variedades de interesse, como também, com mais fiabilidade, se cruzar o mutante com a planta do enquadramento genético desejado e realizando em seguida um número adequado de retrocruzamentos para, desta forma, remover o enquadramento genético parental indesejado. O isolamento das mutações pode ser atingido através do rastreio de plantas mutagenizadas.
Como alternativa aos métodos convencionais pode ser seguida uma abordagem de biologia molecular. A sequência de SSII é apresentada na presente invenção para esta especificação. Os vetores contendo as mutações desejadas e um marcador seletivo podem ser introduzidos em plantas em cultura de tecidos, ou sistemas vegetais adequados como protoplastos. As plantas nas quais a mutação tenha sido integrada num cromossoma para substituir um alelo selvagem existente podem ser analisadas por, por exemplo, se usar uma sonda de ácido nucleico especifica adequada para a deteção da mutação e por observação fenotipica. Os métodos para transformação de plantas monocotiledóneas como cevada e para a regeneração de plantas a partir de protoplastos ou embriões vegetais imaturos são conhecidos no estado da arte, ver por exemplo, pedido de patente canadiana 2092588 da Nehra, pedido de patente australiana número 6178194 do Conselho Nacional de Investigação do Canadá, a patente australiana número 667939 da Japan Tobacco, Inc., pedido de patente internacional WO 97/48814 da Monsanto Companhy, a patente US 5589617, e outros métodos são apresentados na especificação da patente W099/14314. 31
Podem ser adotadas outras abordagens conhecidas, para a alteração da atividade da enzima de síntese de amilopectina, para além do uso das mutações. Assim, por exemplo, estas podem incluir a expressão de moléculas antisense adequadas que interfiram com a transcrição ou processamento do gene ou genes que codificam a enzima de síntese de amilopectina. Estas podem ser baseadas na sequência de ADN do gene SSII de cevada, apresentada na presente invenção. Estas sequências antisense podem ter como alvo os genes estruturais ou sequências que afetam o controlo da expressão génica ou processo de processamento. Estas sequências já foram referidas acima. Os métodos para o desenho das sequências antisense são bem conhecidos no estado da arte e exemplos destes podem ser encontrados em, por exemplo, patente US 5190131, especificações da patente europeia 0467349 Al, especificações da patente europeia 0223399 Al e especificações da patente europeia 0240208. Os métodos para a introdução e manutenção destas sequências também estão publicados e são conhecidos.
Uma variação na técnica de antisense é a utilização de ribozimas. As ribozimas são moléculas de ARN com função enzimática que podem clivar outras moléculas de ARN em locais específicos com uma sequência antisense. A clivagem do ARN leva ao bloqueio da expressão do gene alvo No presente documento é feita referência às especificações da patente europeia 0321201 e as especificações contidas em WO 97/45545.
Uma outra abordagem de biologia molecular que pode ser igualmente usada é a cosupressão. O mecanismo de cosupressão não é ainda bem conhecido, mas envolve a colocação de uma cópia adicional de um gene numa planta, na sua orientação normal. Em alguns casos, a cópia adicional 32 do gene interfere com a expressão do gene alvo da planta. É feita referência às especificações da patente WO 97/20936 e da patente europeia 0465572 para métodos para a implementação de abordagens de cosupressão.
Um método adicional que pode ser aplicado usando sequências de ADN é a supressão génica mediada por ARN de dupla cadeia ou duplex. Neste método, é usado um ADN, o qual dirige e determina a sintese do produto de ARN de dupla cadeia. A presença da molécula de dupla cadeia origina a resposta do sistema de defesa da planta, o qual destrói tanto o ARN de dupla cadeia como também o ARN proveniente do gene alvo da planta, reduzindo de uma forma eficaz ou eliminando a atividade do gene alvo. É feita referência às especificações da patente australiana 99/292514-A e da patente WO 99/53050 no que diz respeito a métodos que implementem esta técnica. É entendido que a invenção possa surgir como o resultado de reduzir os niveis de atividade de dois ou mais genes descritos acima, usando uma abordagem de biologia molecular.
Um produto importante que pode ser equacianado, em particular como resultado de um conteúdo elevado de amilose e de β-glucano é um produto de baixo valor calorifico com um indice glicémico reduzido. Um produto de baixo valor calorífico pode ser baseado na inclusão de farinha produzida a partir de grão moído. Pode ser desejado, no entanto, que o cereal seja primeiro descascado, removendo assim talvez 10 a 20 % em massa/peso do cereal, removendo desta forma a camada de aleurona e na redução maior, removendo igualmente o endosperma. O efeito do passo de descascamento é a redução do conteúdo lipídico e assim a 33 redução do valor calorífico do alimento. Os alimentos deste tipo terão um efeito de gerarem satisfação do apetite, melhorarão a saúde intestinal, reduzindo a concentração pós-prandial de glucose e de lípidos no soro, bem como fornecendo um produto alimentar de baixo teor calorífico. 0 uso do produto descascado resulta na redução dos benefícios nutricionais conferidos pela camada de aleurona e pelo endosperma. É natural que a farinha produzida do produto descascado tenha uma melhor aparência, uma vez que o produto tende a ser mais branco.
Os aspetos de acordo com a presente invenção derivam também da combinação da camada de aleurona e do endosperma em combinação com níveis elevados de fibras dietéticas. Estes derivam especificamente dos níveis relativamente elevados de aleurona e de endosperma presentes no grão do cereal do exemplo. Em primeiro lugar, a cevada tem uma camada de aleurona significativamente maior que outros cereais disponíveis comercialmente, sendo o resultado de possuir uma camada de aleurona com três células. Em segundo lugar, o grão de cevada exemplificado é também reduzido, o que significa que o endosperma está presente em quantidades mais reduzidas, cujo corolário é que a camada de aluerona e o endosperma estão presente em quantidades relativas elevadas. Assim, a cevada tem um nível relativamente elevado de certos elementos benéficos ou vitaminas em combinação num sistema de fornecimento de amido resistente, sendo que estes elementos incluem catiões divalentes como Ca++ biodisponível e vitaminas como folato ou antioxidantes como tocoferóis e tocotrienóis. Por isso, o cálcio está estabelecido como material de provisão para o crescimento e deposição de osso e outros tecidos calcificados e na redução do risco de osteoporose numa fase tardia da vida. 0 ácido fólico protege contra os defeitos do tubo neural 34 quando consumido no período periconcepção e diminui o risco de doença cardiovascular, melhorando assim os efeitos da combinação do amido resistente e β-glucano. Pensa-se igualmente que o ácido fólico tem um efeito na redução do risco de certos cancros. Tocoferol e tocotrienóis possuem os benefícios de antioxidantes e pensa-se que reduzam o risco de cancro e de doenças coronárias, e também têm o efeito de reduzirem os efeitos indesejados da oxidação dos componentes dos alimentos como ácidos gordos, o que pode resultar em ranço. Estes componentes, presentes nesta forma preferível do grão de cevada ou produtos feitos a partir dele, constituem uma forma conveniente de empacotamento com o cereal. Uma forma específica do produto moído pode ser uma na qual a camada de aleurona está incluída no produto moído. Um processo particular de moagem pode ser executado para melhorar a quantidade da camada de aleurona no produto moído. Um método deste género é referido em Fenech et al., ((1999) J. Nutr 129: 1114-1119). Assim, qualquer produto derivado do grão moído ou processado de outra forma para incluir a camada de aleurona e o endosperma terá benefícios nutricionais adicionais, sem necessitar da adição destes elementos de fontes separadas. É entendido que a planta de cevada de acordo com a presente invenção tem preferivelmente um grão que é útil para a produção alimentar e em particular para a produção de alimentos comerciais. Uma produção deste género pode incluir o fabrico de farinha ou outro produto que possa ser um ingrediente na produção comercial de alimentos. Um nível mais reduzido de utilidade pode ser um conteúdo de amido superior a 12 % ou possivelmente superior a cerca de 15 %. De uma forma semelhante, pode incluir a capacidade de moer o grão; assim, enquanto que cevada descascada pode ser produzida a partir da maioria das formas de grão, certas configurações de grão são particularmente resistentes à 35 moagem. Uma outra caracteristica que pode ter um impacto numa variedade de cereal que produza um grão comercialmente utilizável diz respeito à descoloração do produto produzido. Por isso, nos casos em que a casca ou outra parte do grão exibe uma coloração significativa, por exemplo roxo, esta passará para o produto e limita as suas aplicações comerciais a aplicações de nicho de mercado, como sendo um componente de pão contendo cereais coloridos inteiros ou partidos. É geralmente também mais conveniente que as plantas de cevada sejam descascadas, por a presença de casca nos grãos de cevada introduzir uma maior dificuldade no processamento do grão. Outro aspeto que pode aumentar o valor de uma planta de cevada é baseado na extração de amido do grão, sendo que extrações mais elevadas são mais úteis. A forma do grão é também uma outra caracteristica que pode ter impacto na facilidade ou não, com que o grão possa ser moido, e por isso, o grão de cevada da planta MK6827, por exemplo, tem uma morfologia de grão pouco usual, muito alongada, o que dificulta a moagem e o processamento do grão. Uma medida conveniente da utilidade desta forma alongada é o rácio entre as duas caracteristicas morfológicas, o comprimento do grão em relação à espessura (rácio C/E). Este rácio é frequentemente ditado pela natureza do amido. Foi descoberto pelos inventores que MK6827 tem um rácio C/E superior a 6. As plantas de cevada assim analisadas, contendo o gene SSII mutante têm um rácio C/E situado no intervalo entre cerca de 4 a cerca de 5, apesar de ser expectável que este se estenda num intervalo ainda maior e ainda assim ser útil, sendo talvez inferior a cerca de 5,8 ou pelo menos 5,5. 0 enquadramento genético desejado incluirá considerações de rendimento comercial e outras caracteristicas. Estas 36 características podem incluir se é desejável uma cevada de inverno ou primavera, desempenho agronómico, resistência a doenças e resistência ao stress abiótico. Na Austrália, pode-se pretender cruzar a planta da presente invenção com outras cultivares de cevada, como Sloop, Schooner, Chebec, Franklin, Arapiles, Tantangara, Galleon, Gairdner ou Picola. Os exemplos apresentados são específicos para uma região de produção australiana, e outras variedades serão adequadas para outras regiões de cultivo.
Pode ser desejável um grão mais volumoso para se obterem maiores rendimentos e certos benefícios de acordo com a presente invenção, como a produção de amido com níveis elevados de amilose, ou em alternativa, amido com uma distribuição alterada do comprimento de cadeia. Outros aspetos da presente invenção podem, contudo, ser melhor atingidos através de um grão menos volumoso. Assim, a proporção da camada de aleurona ou endosperma em relação a amido pode ser mais elevada num grão menos volumoso, fornecendo dessa forma uma farinha de cevada ou outro produto que contém mais constituintes benéficos na camada de aleurona. 0 produto com uma elevada camada de aleurona pode assim conter uma quantidade mais elevada de certas vitaminas, como folato, ou pode conter uma quantidade mais elevada de certos minerais, como cálcio, o que combinado com níveis mais elevados de amido resistente e/ou níveis mais elevados de β-glucano, pode fornecer efeitos sinergísticos como possibilitar uma melhoria da absorção de minerais no intestino grosso.
Para se maximizar a quantidade de amilose pode ser desejável que a planta de cevada possua outras características fenotípicas adicionais, para além da atividade reduzida de uma ou mais enzimas de síntese de 37 amilopectina. 0 enquadramento genético pode por isso incluir um fenópitpo de elevada amilose, por exemplo a mutação amol em AC38 (causa génica desconhecida) e a mutação waxy (encontrada por exemplo na variedade Waxiro) . Pode ser adicionalmente desejável produzirem-se mutações duplas em outros mutantes de cevada disponíveis, com endospermas shrunken, nos quais o gene responsável é ainda desconhecido.
Num outro aspeto adicional da presente invenção, esta pode residir num grão produzido a partir de uma planta de cevada, como o descrito na presente invenção.
Também é entendido que a presente invenção inclui um grão processado, incluindo um grão de cereal, moido, prensado, partido, descascado ou rolado, ou um produto obtido a partir do grão do cereal inteiro ou processado, obtido de uma planta de cevada de acordo com a presente invenção, incluindo farinha. Estes produtos podem ser usados em seguida em vários produtos alimentares, ou aditivos alimentares, como espessantes ou para o fabrico de bebidas de malte ou outras bebidas à base de cevada, massas e sopas instantâneas.
Alternativamente a presente invenção contém amido isolado a partir do grão de uma planta de cervada de acordo com a presente invenção. 0 amido pode ser isolado através de técnicas conhecidas.
Entende-se que um beneficio da presente invenção é o fornecimento de um ou mais produtos que têm um benefício nutricional particular, e adicionalmente, conferem-no sem que seja necessária a modificação do amido ou outros constituintes do grão de cevada. 38
Contudo, pode ser desejável realizar modificações ao amido, β-glucano ou outro constituinte do grão de cereal, e a presente invenção inclui igualmente este constituinte modificado. inclui-se nos já conhecidos, amido ou β-glucano ou outro métodos convencionais e a para a sua forma resistente 0 método de modificação incluindo a extração do constituinte através de modificação dos amidos desej ável.
Assim, o amido ou o β-glucano podem ser modificados tanto através do uso de um tratamento, simples ou múltiplo, escolhido de entre o grupo constituído por, mas não limitado a, calor e/ou humidade, fisico (por exemplo moagem em bola), enzimaticamente (usando por exemplo a- ou β-amilase, pululanase ou similares) , hidrólise quimica (húmida ou seca, usando reagentes líquidos ou gasosos), oxidação, reticulação com reagentes difuncionais (por exemplo trimetafosfato de sódio, oxicloreto fosfórico) , ou carbóxi-metilação. 0 conteúdo em fibras dietéticas do grão de cevada exemplificado não resulta apenas do conteúdo de amilose endospérmica relativamente mais elevado. Uma razão primária prende-se com o β-glucano estar presente em níveis mais elevados e contribuir significativamente para o nível de fibras dietéticas. Também é provável que existam efeitos protetores devido à associação do β-glucano com o grânulo de amido, em que a intimidade da associação fornece potencialmente um efeito protetor ao amido e assim confere uma resistência que pode ser caracterizada como sendo da forma RS1, tornando-o relativamente inacessível à digestão. 39
De uma forma semelhante, a presença da associação lípido-amido, medida pela cristalinidade do complexo V contribui provavelmente para o nivel de hidratos de carbono resistentes. Neste caso a resistência é provavelmente devida à inacessibilidade física devido à presença dos lípidos e por isso, esta forma de amido pode ser considerada como amido RS1. Assim, é conhecido que o amido retrógrado, que assuma a configuração do complexo V é altamente resistente à digestão e por isso é expectável que a amilopectina que faça parte do grânulo de amido com a forma estrutural cristalina de complexo V irá ter uma mais elevada resistência à digestão. Em terceiro lugar, o amido da planta de cevada do exemplo pode ser resistente à digestão devido à estrutura do grânulo de amido e por isso ser classificado como amido RS2. É entendido que, apesar de terem sido apresentadas várias indicações acerca de diferentes aspetos da presente invenção, esta pode residir em combinações de dois ou mais aspetos da presente invenção. 40 EXEMPLO 1 Enquadramento A síntese de amido no endosperma de plantas superiores é levada a cabo por um conjunto de enzimas que catalizam quatro passos fundamentais. Em primeiro lugar a pirofosforilase de ADP-glucose ativa o precursor monomérico de amido através da síntese de ADP-glucose a partir de G-l-P e ATP. Em segundo lugar, o dador ativado de glicosilo, a ADP-glucose é transferida, pelas sintetases de amido, para a extremidade não reduzida de uma ligação cxl-4 pré-existente. Em terceiro lugar, as enzimas de ramificação de amido introduzem pontos de ramificação através da clivagem de uma região do glucano ligado em al-4, seguido pela transferência da cadeia clivada para uma cadeia aceitadora, formando assim uma nova ligação al-6. Finalmente, estudos genéticos demonstraram que as enzimas que removem as ramificações de amido são essenciais para a síntese de quantidades normais de amido em plantas superiores, contudo, o mecanismo pelo qual estas enzimas atuam está ainda por elucidar (Myers et al., 2000).
Apesar de estar claro que pelo menos quatro atividades são necessárias para a síntese normal do grânulo de amido em plantas superiores, existem múltiplas isoformas de cada uma das quatro atividades no endosperma das plantas superiores e foram propostos papeis específicos para isoformas individuais com base em análises mutacionais (Wang et al., 1998, Buleon et al., 1998) ou através da modificação dos níveis de expressão génica usando abordagens transgénicas (Abel et al., 1996, Jobling et al., 1999, Scwall et al., 2000). No entanto, as contribuições exatas de cada isoforma para cada atividade na biosíntese de amido são ainda desconhecidas, e é igualmente ainda desconhecido se estas 41 contribuições diferem notoriamente entre espécies. No endosperma do cereal, estão presentes duas isoformas de pirofosforilase de ADP-glucose, uma forma contida no amiloplasto e outra forma no citoplasma (Denyer et al., 1996, Thorbjornsen et al., 1996). Cada forma é composta por dois tipos de subunidades. Os mutantes shrunken (sh2) e brittle (bt2) de milho representam lesões nas subunidades maior e menor, respetivamente (Girouz e Hannah, 1994). Existem quatro classes de sintetase de amido no endosperma do cereal, sendo que uma isoforma se localiza exclusivamente no interior do grânulo de amido, a sintetase de amido ligada ao grânulo (GBSS), duas formas estão divididas entre o grânulo e a fração solúvel (SSI, Li et al., 1999a, SSU, Li et al., 1999b) e uma quarta forma que está integralmente localizada na fração solúvel, SSIII (Cao et al, 2000, Li et al., 1999b, Li et al., 2000). Foi mostrado que a GBSS é essencial para a síntese de amilose (Shure et al., 1983) e foi demonstrado que mutações em SSII e SSIII alteram a estrutura de amilopectina (Gao et al., 1998, Craig et al., 1998). Não foram ainda descritas mutações que permitam definir o papel da atividade de SSI. São expressas três formas da enzima de ramificação no endosperma do cereal, a enzima de ramificação I (BEI), a enzima de ramificação lia (BEIIa) e a enzima de ramificação Ilb (BEIIb) (Hedman e Boyer, 1982, Boyer e Preiss, 1978, Mizuno et al., 1992, Sun et al., 1997). Foi demonstrado em milho e arroz que fenótipos com elevada amilose resultam de lesões no gene BEIIb (Boyer e Preiss, 1981, Mizuno et al., 1993) . Nestes mutantes, o conteúdo de amilose é significativamente elevado, e a frequência de ramificação da amilopectina residual é reduzida. Adicionalmente, existe uma quantidade significativa de material que é definida como "intermédia", entre amilose e amilopectina (Boyer et 42 al., 1980, Takeda et al., 1993). Não foram ainda descritas mutações que definam os papeis de BEIIa e BEI, no entanto a redução da atividade de BEI causa efeitos mínimos na estrutura do amido (Filpse et al., 1996) . No entanto, em batata, a combinação da redução da atividade de BEII e de BEI conduz a um conteúdo de amilose muito mais elevado que o obtido apenas com a redução de atividade de BEII (Schwall et al., 2000). Existem dois tipos de enzimas de remoção de ramificações em plantas superiores, as quais são definidas com base nas suas especificidades de substrato, enzimas de remoção de ramificação do tipo isoamilase e do tipo pululanase (Myers et al., 2000). As mutações Sugary-1 em milho e arroz estão associadas a deficiências em ambas as enzimas de remoção de ramificações (James et al., 1995, Kubo et al., 1999) contudo a mutação causal associada foi mapeada como estando no mesmo local que o gene que codifica a enzima de remoção de ramificação do tipo isoamilase. No mutante de Chlamydomonas sta-7 (Mouille et al., 1996), o análogo da mutação sugary-1 em milho, apenas a atividade de isoamilase está reduzida. A variação conhecida da estrutura de amido em cevada é limitada em relação à variação disponível em milho. As mutações melhor caracterizadas são waxy e a mutação de elevado conteúdo de amilose identificada como AC38. Foram também construídos e analisados duplos mutantes (Schondelmaier et al., 1992, Fujita et al., 1999). Foram descritas um grande número de características da variação na estrutura de amido e as suas propriedades (Czuchajowska et al., 1992; Schondelmaier et al., 1992; Vasanthan e Bhatty, 1995; Morrison et al., 1984; Gerring and DeHaas, 1974; Bankes et al., 1971; Persson and Chrisierson, 1997;. Vasunthan and Bhatty, 1998; Czuchajowska et al., 1998; Song and Jane, 2000; Andreev et al., 1999; Yoshimoto et al., 43 2000), e propriedades do grão do cereal (Swantson 1992, Ahokas 1979;, Oscarsson et al, 1997; Oscarsson et al., 1998; Andersson et al., 1999; Elfverson et al., 1999; Bhatty 1999; Zheng et al. , 2000 ; Izydorczyk et al., 2 0 0 0;
Andersson et al., 2000) e a utilidade dos mutantes foi investigada em ensaios de ração animal (Xue et al., 1996; Newman et al. , 1978; Calvert et al., 1976; Wilson et al., 1975; Sundberg et al., 1998; Bergh et al., 1999), alimentos humanos (Swanston et al., 1995; Fastnaught et al., 1996; Persson et al., 1996; Pomeranz et al., 1972) e nutrição humana (Pomeranz 1992; Granfeldt et al., 1994; Oscarsson et al., 1996; Akerberg et al., 1998.)
No presente exemplo, isolámos a partir da cevada, uma nova classe de mutantes com conteúdo elevado de amilose. Estas linhas de mutantes têm um conteúdo em amilose (65-70%) acima daquele que é conhecido, para o bem caracterizado mutante, High Amylose Glacier (AC38) (45-48%) (Walker et al., 1968), e têm amido com uma estrutura de amilopectina que tem um aumento da frequência da cadeia ramificada de amido, o que contrasta com a reduzida frequência de cadeias ramificadas associada ao mutante amilose extender no milho (Takeda et al., 1993).
As características do grão e do amido do presente mutante foram estudadas em detalhe e a mutação causal mapeada. As mutações isoladas são alélicas do mutante shrunken, já conhecido, na cevada, o sexô, e demonstrou-se que a mutação causal está localizada no gene da sintetase II do amido. Os efeitos desta mutação trouxeram novidades ao processo de biossintese do amido e mostram como as mutações em genes específicos podem ter impactos diferentes na estrutura do amido, de uma espécie para a outra. 44
Materiais e Métodos Mutagénese e Screening A variedade de cevada sem casca "Himalaya" foi mutada utilizando azida de sódio, segundo Zwar e Chandler (1995). A seleção das variantes com a morfologia do grão alterada foi realizada de acordo com Green et al (1997). Um total de 75 linhagens com um fenótipo de endosperma shrunken foram identificadas e conservadas de acordo com Green et al (1997).
Isolamento do Amido 0 amido foi isolado a partir da cevada utilizando o método de Schulman et al (1991). Métodos para a Determinação da Amilose
As determinações da proporção amilose/amilopectina através de um método de HPLC para separar as cadeias de amido não ramificadas, e de um método de ligação a iodo, foram realizadas como descrito por Batey and Curtin, (1996) . As análises da proporção amilose/amilopectina através da análise das cadeias de amido ramificadas removidas foi realizada de acordo com Case et al, (1998).
Determinação do Conteúdo em Amido 0 amido foi determinado utilizando o kit de análise de amido total fornecido pela Megazyme (Bray, Co Wicklow, República da Irlanda)
Conteúdo Proteico 0 azoto foi determinado pelo método de Kjeldahl, e o conteúdo proteico foi calculado usando um fator de 5,7. 45 Níveis de β-Glucano 0 β-glucano foi determinado utilizando o kit fornecido pela Megazyme (Bray, Co Wicklow, República da Irlanda).
Distribuição do comprimento das cadeias de amido
As ramificações das cadeias de amido foram quebradas e a distribuição dos comprimentos das cadeias foi analisada com 0 recurso a a eletroforese de hidratos de carbono assistida por fluóforos (FACE), utilizando uma eletroforese capilar de acordo com Morell et al (1998) .
DSC A gelatinização foi medida num calorímetro diferencial de varrimento Pyris 1 (Perkin Elmer, Norwalk CT, USA). O amido foi misturado com água numa proporção de 2 partes de água: 1 parte de amido e esta mistura (40-50 mg exatamente pesadas) foram colocadas numa panela de aço inoxidável e seladas. A amostra foi analisada a 10°C por minuto, dos 20°C aos 140°C, tendo uma panela de aço inoxidável vazia como referência. As temperaturas de gelatinização e a entalpia foram determinadas utilizando o software Pyris.
Análise RVA A viscosidade foi determinada num Rapid-Visco-Analyser (RVA, Newport Scientific Pty Ltd, Warriewood, Sydney) utilizando as condições descritas por Batey et al. 1997 para farinhas integrais. De modo a inibir as a-amilases, foi incluído nitrato de prata em todos os ensaios, numa concentração de 12 mM. Os parâmetros medidos foram a viscosidade do pico (a viscosidade máxima da colagem quente), a força de coesão, a viscosidade final e a temperatura de colagem. Além disso, foram calculadas a separação (viscosidade de pico menos a força de coesão) e a reversão (viscosidade final menos a força de coesão). 46
Expansão da Farinha 0 volume de expansão da farinha foi determinado de acordo com o método de Konik-Rose et ai (2001) .
Dados de Raios-X
Os dados de difração por Raios-X foram recolhidos utilizando técnicas padronizadas (Buleon et al., 1998).
Microscopia Eletrónica de Varrimento A microscopia eletrónica de varrimento foi realizada num aparelho Joel JSM 35C. Os amidos purificados foram revestidos com pulverização catódica de ouro e analisados à temperatura ambiente a 15 kV.
Produção de linhagens duplamente haplóides
Linhagens duplamente haplóides foram produzidas através de plantas Fl, provenientes do cruzamento entre 292 e Hordeum vulgare cv Tantangara, e entre 342 e H. vulgare cv Tantangara, por Dr. P. Davies, Waite Institute, Adelaide, Austrália.
Análise das ligações
Os dados genéticos de ligação foram calculados utilizando o MapManager.
Construção de uma biblioteca de cADN de cevada
Cinco mgs de polyA+ mARN de tecido de endosperma de cevada, de 10, 12 e 15 dias post anthesis foi utilizado para a síntese de cADN de acordo com os protocolos (Life Technology). O oligonucleótido Notl-(dT)18 (Pharmacia Biotech) foi utilizado para a primeira plataforma de síntese de cADN. Os cADNs de dupla cadeia foram ligados com adaptador Sall-Xhol e clonados para os braços Sall-Notl de ZipLox (Life Technology) após digestão de cADNs com Notl, 47 seguido de fracionamento por tamanho (SizeSep 400 spun Column of Pharmacia Biotech). Os cADNs ligados foram acondicionados com extrato de empacotamento Gigapack III Gold (Stratagene). O titulo da biblioteca foi de 2xl06 ufc testados com cadeias Y1090 de E. coli.
Clonagem de regiões específicas do cADN da sintetase II do amido da cevada utilizando PCR O clone cADN, wSSIIpl, foi utilizado para o rastreio de uma biblioteca de cADN da cevada. O clone de cADN, wSSIIpl foi originado por PCR utilizando os oligonucleótidos sslla (TGTTGAGGTTCC ATGGCACGTTC SEQ.ID. NO 9) e ssllb (AGTCGTTCTGCCGTATGATGTCG SEQ. ID. NO 10), amplificando as regiões entre as posições dos nucleótidos 1435 e 1835 de wSSIIA (nr. de acesso GenBank: AF 155217). A amplificação foi realizada utilizando um sequenciador térmico (Corbett, Australia) por 1 ciclo de 95°C durante 2 minutos; 35 ciclos de 95°C durante 30 segundos, 60°C durante 1 minuto, 72°C durante 2 minutos e 1 ciclo de 25°C por 1 minuto. O fragmento wSSIIpl foi clonado num vetor pGEM-T (Promega).
Rastreio da biblioteca de cADN da cevada
Uma biblioteca de cADN, construída a partir de ARN do endosperma da cevada cv Himalaya, foi rastreado com um fragmento de cADN 347-bp, wSSIIpl nas condições de hibridação como descrito previamente (Rahman et al., 1998). A hibridação foi realizada em 50% de formamida, 6 x SSPE, 0.5% SDS, 5 x Denhardt' s e 1,7 yg/mL de ADN de esperma de salmão a 42 °C durante 16 h, depois lavado 3 x com 2 x SSC contendo 0,1% SDS a 65°C duranter 1 h por lavagem. 48
Rastreio de uma biblioteca genómica de cevada
Uma biblioteca genómica de cevada (cevada cv Morex) foi construída e rastreada essencialmente, como foi descrito em Gubler et al., (2000) utilizando cADN SSII de cevada como sonda.
Sequenciação de clones genómicos O gene Morex SSII foi subclonado, em vetores plasmídicos, e sequenciado. Os genes 292 e MK6827 foram sequenciados através de amplificação por PCR de regiões sobrepostas do gene, utilizando oligonucleótidos desenhados na base da sequência Morex. Os fragmentos de PCR foram ou sequenciados diretamente ou subclonados e sequenciados de plasmídeos.
Identificação de regiões expressas
As regiões das sequências genómicas 292 e MK6827, que se previa que estivessem presentes nos cADNs foram definidas tendo como referência a sequência de cADN Himalaya e a sequência genómica Morex.
Análise PCR da mutação de transição de G para A no gene SSII
Foram desenhados oligonucleótidos de PCR que amplificam a região que contém a mutação de G para A identificada em 292. As sequências do oligonucleótido são: ZLSS2P4 (C C T G GAACAC TTCAGACTGTACG SEQ. ID. NO 11) e ZLBSSII5 (CTTCAGGGAGAAGTTGGTGTAGC SEQ ID NO 12) . A amplificação foi realizada utilizando um sequenciador térmico (Corbett, Australia), por 1 ciclo de 95°C durante 2 minutos; 35 ciclos de 95°C durante 30 segundos, 60°C durante 1 minuto, 72°C durante 2 minutos e 1 ciclo de 25°C durante 1 minuto. 49
Análise SDS-PAGE de proteínas de endosperma da cevada
Foi preparado amido de endosperma maduro e em desenvolvimento, de cevada e trigo e as proteínas foram removidas da superfície com proteínase K como descrito (Rahman et al, 1995). Foram extraídas proteínas dos grânulos de amido, de 20 mg de amido (peso seco), utlizando O. 5 mL de um tampão de extração que continha 50 mM Tris pH 6,8, 10% SDS e 10 % de 2-mercaptoetanol. Após gelatinização através de fervura durante 10 min, e recolha do amido através de centrifugação, 15 microlitros do sobrenadante foram colocados em cada um dos poços.
Produção de linhagens duplamente haplóides
Foram produzidas linhagens duplamente haplóides de plantas Fl, derivadas do cruzamento entre 292 e Hordeum vulgare cv Tantangara, e entre 342 e H. vulgare cv Tantangara, por Dr P. Davies, Waite Institute, Adelaide, Australia.
Estratégia de Retrocruzamento
Foram realizados cruzamentos entre 292 e Hordeum vulgare cv Sloop para dar origem a semente Fl. Plantas originadas através semente Fl foram cruzadas entre si para dar origem a sementes de uma população F2. As plantas que cresceram destas sementes F2 foram testadas utilizando um ensaio de PCR e plantas homozigóticas para a mutação 292 foram retrocruzadas com Sloop (BC1) . As plantas Fl resultantes de BC1 foram de novo testadas através de PCR e foram selecionadas plantas heterozigóticas para a mutação 292, e retrocruzadas com Sloop (BC2). As plantas Fl derivadas de BC2 foram novamente analisadas através de PCR e foram selecionadas plantas heterozigóticas para a mutação 292. Estas plantas foram ou cruzadas entre si para originar uma população BC2F2 ou cruzadas de novo com Sloop (BC3) . As plantas Fl derivadas de BC3, foram mais uma vez analisadas, 50 através de PCR e selecionadas plantas heterozigóticas para a mutação 292. Estas plantas foram cruzadas entre si para dar origem a uma população BC3F2. Plantas originadas por esta semente foram testadas por PCR e foram selecionadas plantas homozigóticas para a mutação 292 para descendência de uma única semente e aumento de semente.
Resultados
Seleção de mutantes A identificação de uma gama de mutantes na variedade de cevada sem casca "Himalaya" induzida pelo tratamento com azida de sódio foi descrita anteriormente por Zwar e Chandler (1995) . Um grupo de 75 mutantes de grão shrunken foram identificados pelos inventores e o conteúdo de amilose do amido da semente shrunken foi determinado por HPLC (Figura 1) . Foram descobertas duas linhagens, 292 e 342, que exibiam conteúdos de amilose de 71 e 62,5 %, respetivamente (Tabela 1). Os conteúdos de amilose de 292 e 342 eram substancialmente superiores aos descritos anteriormente para a linhagem AC38 (47% de amilose (ver Tabela 1) . Este estudo define a base genética para o novo fenótipo de elevada amilose encontrado e exibido por 292 e 342, e descreve a mutação que causa as alterações da estrutura do amido e do grão, bem como da sua funcionalidade.
Características do grão Tamanho e morfologia do grão:
Os efeitos da mutação no peso do grão e na morfologia são evidentes (Tabela 2). O peso do grão é reduzido de 51 mg da linhagem parental Himalaya, para 32 mg para 292 e 35 mg para 342. Os mutantes retêm o comprimento e largura da 51 estirpe selvagem, mas são, em comparação, achatados (de 2,82 mm de espessura média em Himalaya para 1,58 e 1,75 mm em 292 e 342 respetivamente) e exibem uma região central essencialmente vazia. A Figura 2 mostra fotografias do grão do mutante e do selvagem. As dimensões do grão são medidas de forma rotineira, o comprimento do grão (C) , a largura d do grão no seu ponto mais largo (L) e a espessura (E) como indicado na Figura 2. 0 rácio entre o comprimento (C) e a espessura (E) do grão é uma caracteristica diagnosticante útil da mutação, com valores > 3,5 a estarem tipicamente associados com sementes contendo as mutações 292 e 342, e valores < 3,5 a cevadas não mutantes.
Composição do grão: 0 conteúdo de amido das linhagens mutantes é reduzido, de 49,0 % observado para Himalaya para 17,7 e 21,9% para 292 e 342, respetivamente (ver Tabela 1). A subtração do peso do amido do peso total do grão, para dar origem ao peso total do conteúdo não amidico do grão, mostrou que a diminuição do conteúdo de amido corresponde à perda de peso do grão, de acordo com os pesos não amidicos determinados de 26,0, 26,3 e 27,3 mg para a variante Himalaya, 292 e 342 respetivamente. O conteúdo proteico de 292 e 342 está aumentado, em relação à linha parental, Himalaya (Tabela 1), contido, este efeito é devido à perda de amido do grão e não é devido a nenhum aumento da síntese proteica por cariopse.
Os níveis de β-glucano dos mutantes 292 e 342 estão também aumentados, e são mais elevados que o esperado tendo em conta o efeito de redução do conteúdo de amido (Tabela 1). Em ambos os casos, o conteúdo de β-glucano está aumentado em cerca de 20 % por cariopse, representando possivelmente 52 um desvio de uma pequena proporção do carbono originado a partir da síntese de amido para a síntese de β-glucano.
Composição e funcionalidade do amido Conteúdo em amilose e amilopectina 0 conteúdo em amilose foi determinado usando duas técnicas, em primeiro lugar, exclusão por tamanho por HPLC em 90% (v/v) DMSO, e em segundo lugar, um valor por azul de iodo. Os conteúdos de amilose determinados por cada método foram semelhantes e os dados de HPLC são apresentados na Tabela 1. A quantidade de amilose depositada por cada grão pode ser calculada a partir dos dados do conteúdo de amilose e de peso do grão para as linhagens mutante e selvagem. Esta análise mostra que existe um decréscimo da quantidade de amilose por grão, de 6,2 mg/cariopse em Himalaya, para 4,0 mg/cariopse em 292 e 4,8 mg/cariopse em 342. Em contraste, existe uma redução dramática na síntese de amilopectina por cariopse, de 18,7 mg em Himalaya para 1,6 mg em 292 e 2,9 mg em 342.
Distribuição do comprimento da cadeia A análise da distribuição do comprimento da cadeia do amido após a remoção das ramificações por isoamilase foi realizada usando eletroforese de hidratos de carbono assistida por fluoroforos (FACE). A distribuição do comprimento da cadeia dos mutantes 292 e 342, e Himalaya, são mostradas na Figura 3a. A Figura 3b mostra um gráfico de diferença, no qual as distribuições normalizadas do comprimento da cadeia para os mutantes 292 e 342 são subtraídas da distribuição normalizada obtida para a variedade Himalaya. As percentagens de comprimentos de 53 cadeia de DP 6-11, DP 12-30 e DP 31-65 foram calculadas e são apresentadas na Tabela 3. Existe uma mudança evidente na distribuição do comprimento de cadeia dos mutantes 292 e 342, de forma a que existe uma percentagem mais elevada de cadeias na região de DP 6-11 comparada com DP 12-30.
Calorimetria diferencial de varrimento A temperatura de gelatinização dos mutantes foi investigada usando a calorimetria diferencial de varrimento, e os dados são apresentados na Tabela 4. Ambas as variedades 292 e 342 exibem amidos que têm uma temperatura de gelatinização vincadamente mais reduzida que os amidos da variedade Himalaya, no que diz respeito às temperaturas de inicio, máximo e final do pico de gelatinização. A entalpia do máximo de gelatinização para os mutantes 292 e 342 é também grandemente reduzida, em comparação com o selvagem. O máximo da temperatura de inicio amilose/lipido encontra-se igualmente reduzido para os mutante 292 e 342, contudo a entalpia é aumentada, sendo consistente com um conteúdo de amilose aumentado para os referidos mutantes.
Viscosidade de amido por RVA A análise por RVA de amostras de cevada integral foi conduzida de forma a examinar a sua viscosidade de colagem. Estudos anteriores mostraram que a análise de amostras integrais está fortemente correlacionada com a análise de amidos isolados (Batey et al., 1997). A análise mostra que existem grandes diferenças entre os genótipos de cevada estudados (ver Tabela 5 e Figura 4) . Duas variedades de cevada contendo amido selvagem, Himalaya e Namoi, exibem perfis de RVA tipicos, nos quais existe um pico de viscosidade proeminente, seguido de um declinio da viscosidade para uma força de coesão, seguida de um aumento da viscosidade para uma viscosidade final, à medida que a 54 temperatura é reduzida. Como é geralmente observado para amidos de cevada, a viscosidade final dos amidos selvagens é semelhante, ou inferior ao pico de viscosidade (Tabela 5) . Em AC38, foi obtido um máximo proeminente de viscosidade, no entanto, devido ao conteúdo de amilose mais elevado desta linhagem, a viscosidade final obtida foi superior ao máximo da viscosidade. Contudo, nas variedades 292, 342 e MK6827, foi obtido um perfil muito diferente. Não foi observado um aumento inicial evidente na viscosidade, correspondente ao pico de viscosidade observado para outros amidos de cevada, e por isso, não é possivel calcular o valor para a decomposição. Os valores do pico de viscosidade apresentados na Tabela 5 para 292, 342 e MK8627 representam as viscosidades registadas ao tempo do pico de viscosidade determinado para a variante Himalaya. Em 292, 342 e MK8627, a viscosidade aumentou ao longo da análise para atingir uma viscosidade final comparável com outras amostras integrais. Quando normalizada em função do conteúdo de amido, os amidos 292 e 342 exibiam viscosidades finais muito elevadas (ver Tabela 5) . O volume de expansão é um método para medir as propriedades da farinha e amido, que investiga o comportamento do material face à exposição a calor e excesso de água. Um aumento da absorção de água é medido através da pesagem da amostra antes e depois de se misturar a amostra em água a temperaturas definidas e no seguimento da colheita do material gelatinizado. A análise mostra que as amostras controlo, Himalaya e Tantangara, expandem 6 a 8 vezes o seu peso seco, ao passo que 292 e 342 expandem apenas 2-3 vezes o seu peso seco (Tabela 9). 55
Cristalinidade
A estrutura dos amidos foi investigada em maior detalhe por cristalografia de raios X (ver Tabela 6 e Figura 5) . A variante Himalaya apresenta o padrão expectável para um amido de cereal, contendo predominantemente uma cristalinidade do tipo "A" e tanto AC38 como Waxiro exibem padrões de difração de raios X muito semelhantes, apesar de os niveis de cristalinidade serem inferiores para AC38 e mais elevados para Waxiro. No caso dos mutantes 292 e 342, o padrão de difração de raios X alterou-se para uma mistura dos padrões V e B. Adicionalmente a esta mudança no padrão de difração, a quantidade de cristalinidade foi largamente reduzida nos mutantes 292 e 342, para 9 e 12 % respetivamente. Este resultado é consistente com um conteúdo reduzido de amilopectina dos amidos 292 e 342.
Morfologia dos grânulos A morfologia dos grânulos de amido foi investigada com recurso a microscopia eletrónica de varrimento (Figura 6). 0 tamanho e forma dos grânulos de Himalaya (Figura 6, painel A) , cevada waxy (Waxiro, Figura 6 painel b) , e AC38 (Figura 6, painel c) foram consistentes com observações publicadas anteriormente de grânulos de amido em linhagens de cevada normais. A morfologia do tipo "A" de grânulos de amido nas linhagens de mutantes 292 (Figura 6, painel d), 342 (Figura 6, painel e) e MK6827 (Figura 6, painel f) , está claramente alterada, com os grânulos a exibirem uma superfície complexa em comparação com a forma lenticular lisa das cevadas normais.
Fibras dietéticas A análise das fibras dietéticas foi realizada de acordo com o procedimento AOAC e mostra que existe um aumento das fibras dietéticas em 292 e 342 e que este aumento das 56 fibras dietéticas se deve a um aumento das fibras dietéticas insolúveis e não de fibras dietéticas solúveis (Tabela 1) , o que é consistente com os componentes das fibras dietéticas serem amido resistente e β-glucano. É de notar que esta medida das fibras dietéticas é determinada quimicamente, a qual é muito distinta da medida fisiológica relevante do ponto de vista nutricional.
Base genética da mutação Rácio de segregação 0 cruzamento da mutação em variedades de cevada que não exibam o fenótipo shrunken do endosperma de 292 e 342 demonstrou que a mutação é uma mutação recessiva normal, exibindo uma relação de segregação na geração F2 de 3 normal : 1 shrunken em sementes de populações cruzadas com estirpes selvagens e uma relação de segregação de 1 normal : 1 shrunken nas sementes de uma população duplamente haplóide, no seguimento de um cruazmento simples com uma estirpe selvagem (ver Tabela 6) . Normal é definido como sendo uma semente com um rácio C/E é < 3,5, sendo uma semente shrunken uma semente em que o rácio C/E é > 3,5.
Natureza alélica dos mutantes
Foi demonstrado que as mutações 292 e 342 são alélicas, através da análise da progenia dos cruzamentos de 292 e 342. Todas as sementes da geração F1 derivadas de cruzamentos recíprocos evidenciaram fenótipos do peso do grão e morfologia do grão dentro dos intervalos dos tamanhos e formas observados para as linhagens 292 e 342 parentais, e fora da gama de tamanhos de sementes e formas encontrados para a linhagem parental Himalaya. Adicionalmente, todas as sementes F2 derivadas de plantas 57 da geração F1 292 X 342 exibem o fenótipo típico de sementes shrunken associado aos mutantes 292 e 342. A análise da morfologia do grão e características de amido de uma série de mutantes de grão disponível através da coleção Germplasm de cevada (USDA-ARS, National Small Grains Germplasm Research Facility, Aberdeen, Idaho 83210, USA) sugeriu que a linhagem MK6827 (BGS31, também referida como GSHO 2475) contendo a mutação sex6 exibia um conjunto de características de amido e grão muito semelhantes às exibidas pelas mutações 292 e 342. Foram estabelecidos cruzamentos entre 292 e MK6827 e todos os grãos da geração F1 exibiam o fenótipo típico de 292 no que diz respeito ao peso do grão e ao fenótipo shrunken da semente. As sementes da geração F2 derivadas das plantas da geração F1 do cruzamento 292 X MK6827, exibiam todas um fenótipo shrunken do endosperma, com rácios C/E >4. Em contraste, as sementes da geração F2 de um cruzamento entre 2 92 e a cultivar de cevada Sloop, disponível comercialmente, resultaram numa distribuição bimodal, exibindo um rácio de segregação 3:1 entre sementes shrunken e cheias (Tabela 6). As sementes F1 geradas a partir dos cruzamentos entre 292 e 5 outras linhagens com fenótipos shrunken do endosperma (BGS 380, shrunken endosperm 4, 7HL (Jarvi et al., 1975); BGS 381, shrunken endosperm 5, 7HS (Jarvi et al., 1975); BGS 382, sexl, 6HL (Eslick and Ries 1976) ; BGS 396, Shrunken endosperm 6, 3HL (Ramage and Eslick 1975); BGS 397, Shrunken endosperm 7, não mapeada, (Ramage and Eslick 1975) originaram todas grãos com uma morfologia de semente cheia. Com base nestes resultados, as mutações 292, 342 e MK6827 foram consideradas alélicas e com base nas localizações mapeadas do locus sex6 publicadas anteriormente, as mutações 292 e 342 estão mapeadas ao braço curto do cromossoma 7H de cevada, cerca de 4 cM de distância do 58 centrómero (Netsvetaev, 1990, Netsvetaev and Krestinkov, 1993, Biyashev et al., 1986, Netsvetaev, 1992).
Análise de associação génica
Uma população duplamente haplóide foi gerada a partir de um cruzamento entre 292 e uma variedade de cevada comercial, usada na produção de malte, Tantangara, a qual contém 90 linhagens da progenia (Tabela 8).
As linhagens foram analisadas para a morfologia da semente (semente cheia versus semente shrunken), distribuição do comprimento da cadeia por FACE (percentagem de cadeias com DP entre 6 e 11), cobertura das sementes (descascadas ou cobertas) , e para um marcador de PCR (ver abaixo) . Estes dados são fornecidos na Tabela 8. A caracteristica de semente shrunken e a distribuição de FACE semelhante a 292 cosegregaram precisamente nesta população, como seria esperado se a alteração do tamanho e forma do grão fosse uma consequência da deposição alterada de amido. A cosegregação das caracteristicas é ilustrada na Figura 8 O painel A mostra a relação entre o comprimento da cadeia de amido (ilustrado pela percentagem de cadeias entre DP 6 e 11) e o rácio comprimento/espessura. Os circulos abertos indicam linhagens que contêm o marcador selvagem, determinado por PCR. Existe uma clara distinção entre os dois grupos de linhagens. A figura 8, painel B mostra a relação entre o comprimento da cadeia de amido e o peso da semente, e mostra que o peso da semente é uma caracteristica menos diagnosticante da mutação que o rácio comprimento/espessura.
Em cevada, a presença ou ausência da casca é controlada pelo locus nud, localizado no cromossoma 7H, e como Tantangara é uma cevada com casca, e 2 92 é uma cevada sem 59 casca, esta característica pode ser analisada numa progenia duplamente haplóide. A análise de associação génica da característica com/sem casca com os dados FACE mostrou que neste cruzamento, a mutação 292 foi mapeada a menos de 16,3 cM do locus nud. Esta localização é consistente com dados de mapeamento anteriores para a mutação alélica sex6 (Netsvetaev, 1990, Netsvetaev e Krestinkov, 1993, Biyashev et al., 1986, Netsvetaev, 1992).
Identificação do gene causador
Foi demonstrado que o gene nud está localizado no cromossoma 7H de cevada (Figura 8, Fedak et al., 1972). Em trigo, existem três sintetases de amido (GBSS, SSI e SSII) e uma enzima de remoção das ramificações do tipo isoamilase (S. Rahman, comunicação pessoal) que estão localizados no braço curto do cromossoma 7, o cromossoma homólogo (Yamamori e Endo, 1996, Li et al., 1999a, Li et al., 1999b, Li et al., 2000) . A proximidade da associação génica ao locus nud sugere que o gene candidato mais provável é o gene SSII. O gene SSII de trigo foi clonado ao nível do cADN (Li et al., 1999b; N° de acesso Genbank AF155217) e ao nível genómico (Li et al., comunicação pessoal), e um cADN de cevada foi isolado e clonado (Figura 9) . A sequenciação das sequências genómicas de SSII de cevada e de trigo mostra que os genes têm estruturas exão/intrão semelhantes, no entanto, os comprimentos das regiões intrónicas diferem entre as sequências (Figura 10). A comparação da sequência genómica Morex com a sequência de um cADN de Himalaya (Figura 9) conduziu à identificação de sequências de cADN deduzidas a partir de Morex, 292 e MK2827.
Foi encontrada uma transição de G para A no gene SSII de 292 na posição que corresponde a 1862 do alinhamento mostrado na Figura 11. Esta mutação introduz um codão stop 60 na grelha de leitura aberta de SSII de 292 (Figura 12) . A análise da sequência de Tantangara e Himalaya mostrou que ambos os genes selvagens eram idênticos nesta região e que tanto 292 como 342 possuíam a mesma mutação de transição G para A. O codão stop introduzido truncará o produto deste gene de tal forma que todo o domínio catalítico C-terminal do gene da sintetase II de amido não seria traduzido e é por isso altamente provável que a totalidade da atividade de SSII seja abolida por esta mutação.
Uma transição G para A também está presente em MK6827, na posição 242 do alinhamento mostrado na Figura 11 e da sequência de cADN de Himalaya na Figura 9. Esta mutação também introduz um codão stop na grelha de leitura de SSII de 292 (Figura 12) e preveniria a tradução de mais de 90% do gene de SSII, abolindo a atividade SSII codificada por este gene. A transição G para A em 292 remove um local de restrição (NlalV) no gene de SSII de cevada. A localização deste local de restrição diagnosticante é mostrada na Figura 14, painéis (a) e (b) . A Figura 14c mostra a eletroforese em gel de agarose dos produtos digeridos com NlalV de cevada, mostrando que o padrão diagnosticante associado à mutação 292 está presente em 292 e 342 mas não em MK6827, Himalaya ou Tantangara. O marcador de PCR da transição G para A foi analisado nas 90 linhagens da população duplamente haplóide de 292 x Tantangara e descobriu-se que co-segregam precisamente com os fenótipos de semente shrunken e distribuição do comprimento de cadeia por FACE, indicando que a mutação 292 está perfeitamente associada a este fenótipo de amido e que é altamente provável que esta mutação seja a mutação 61 causadora do fenótipo evidenciado por 292. A Figura 14d mostra a análise das linhagens da população duplamente haplóide de 292 x Tantangara.
Evidências bioquímicas da perda de atividade SSII A composição das enzimas biosintéticas de amido em linhagens de cevada normais e mutantes foi investigada, com o recurso a uma gama de técnicas de eletroforese em gel. A análise da fração solúvel do endosperma em desenvolvimento demonstrou que todas as linhagens continham BEI, BEIIa, BEIIb, SSI e SSIII e que o conteúdo destas isoformas de BE e SS, respetivamente, estavam essencialmente inalteradas. Contudo, a análise do grânulo de amido indicou que faltavam várias bandas. Em primeiro lugar, a análise por SDS-PAGE (Figura 16, painel A) mostrou que uma banda de 90 kDa não estava presente em 292, 342 ou MK6827, ao passo que estava presente em Himalaya, Tantangara e AC38. Comprovou-se, por imunoblotting, que esta banda contém SSII (Figura 16, painel B) e BEIIa e BEIIb. A descoberta que BEIIa e BEIIb estão presentes na fração solúvel mas não no grânulo indica que houve uma alteração da distribuição destas enzimas nos mutantes 292, 342 e MK6827, em detrimento de uma mutação que impeça a expressão. Em contraste, não foi descoberta qualquer prova da expressão de SSI, quer na fração solúvel quer na fração do grânulo (Figura 1, painéis A e B), o que é consistente com a evidência genética ligando diretamente a mutação em SSII ao fenótipo observado em 292, 342 e MK6827.
Produção e cruzamento de linhagens contendo a mutação 292
Foram utilizadas duas estratégias para a transferência da mutação 292 para genótipos de cevada alternativos. 62
No primeiro exemplo, as linhas duplamente haplóides foram geradas a partir de um cruzamento entre 292 e Tantangara. Os dados da cobertura da semente, peso da semente, rácio C/E, distribuição do comprimento das cadeias e o resultado do marcador de ADN SSII são apresentados na Tabela 8. Uma análise mais completa da composição destas linhas é fornecida na Tabela 9, incluindo análise RVA, conteúdo de β-glucano e volume de expansão da farinha. Os dados mostram que as linhagens contendo a mutação 292 têm parâmetros de RVA significativamente diferentes (como exemplificado para o rácio do máximo da viscosidade/viscosidade final), um maior conteúdo de β-glucano e volumes de expansão de farinha alterados.
No segundo exemplo, a mutação foi transferida pela execução de dois retrocruzamentos de 292 com uma cultivar com propriedades de amido normais (cv Sloop). As sementes F2 de três retrocruzamentos com duas plantas F1 foram recolhidas para análise. As sementes F2 foram categorizadas em sementes com um rácio C/E > 3,5 e com um rácio C/E < 3, 5. A distribuição das sementes entre estas duas classes foi consistente com as expetativas para um único gene recessivo. 0 volume de expansão da farinha para as categorias de sementes derivadas de cada planta são mostrados na Figura 10 e mostra que a caracteristica de expansão do amido foi claramente transferida através do processo de produção e cruzamento em linhagens com uma média de 75 % do enquadramento genético Sloop.
Discussão
Descrevemos o isolamento de novos mutantes, 292 e 342, em cevada que têm um fenótipo shrunken do endosperma. A análise da composição do grão demonstrou que o fenótipo shrunken se deve a um decréscimo significativo do conteúdo 63 de amido, e a análise da composição do amido mostra que este decréscimo se manifesta sob a forma de um fenótipo de elevada amilose, que ocorre devido ao decréscimo da síntese de amilopectina.
Os mutantes 2 92 e 342 possuem uma combinação única de propriedades de grão e amido, por conterem ambos níveis mais elevados de β-glucano e amido resistente. Os níveis de β-glucano das linhagens estão aumentados em aproximadamente 15 % acima do expectável pelo efeito da redução do conteúdo de amido, sugerindo que o carbono incapaz de ser convertido em amido é desviado para a síntese de β-glucano. A determinação dos níveis de fibras dietéticas demonstra que o grão dos mutantes tem níveis mais elevados de fibras dietéticas e que este aumento é devido a um aumento da fibra dietética insolúvel.
Esta combinação de propriedades indica que estes mutantes possam ter um potencial muito interessante enquanto componentes da dieta humana. Em primeiro lugar, os níveis mais elevados de β-glucano sugere que as linhagens podem ser úteis na redução dos níveis de colesterol. Em segundo lugar, a presença de amido resistente indica que estas linhagens podem ser benéficas numa perspetiva de melhoramento da saúde intestinal, através da capacidade bem estabelecida e reconhecida dos amidos resistentes promoverem a fermentação colónica (Topping et al., 1997, Topping 1999). Em terceiro lugar, a composição do grão indica que as linhagens têm uma baixa densidade energética e que podem ser digeridas lentamente, indicando que podem contribuir para a formulação de alimentos com um índice glicémico reduzido. 64
As propriedades do amido das linhagens apresentadas são também únicas, ao combinarem um amido com elevada amilose que também possui uma temperatura de baixa gelatinização. Isto contrasta com mutações com elevada amilose resultando de mutações na enzima de ramificação Ilb na qual a temperatura de gelatinização normalmente aumenta, como é o caso da mutação amilose extender em milho ( (Ng et al., 1997, Katz et al., 1993, Krueger et al., 1987, Fuwa et al., 1999) . Apesar de o conteúdo de amilose de 292 ser comparável com linhagens amilose extender , a estrutura do componente de amilopectina dos amidos difere drasticamente (Wang et al. , 1993) . Em 292 e 342, a distribuição do comprimento de cadeia de amilopectina altera-se no sentido de um menor grau de polimerização, enquanto que em amilose extender, a distribuição do comprimento de cadeia se altera para um maior grau de polimerização. Isto sugere que a amilopectina, em vez do conteúdo de amilose, é o principal determinante da temperatura de gelatinização e que este efeito é mediado através da força da interação entre as cadeias externas da molécula de amilopectina. Foram observados efeitos similares para uma gama de amidos por Jane et al., 1999.
Os dados de viscosidade obtidos pela análise de RVA indicam que o amido das linhagens mutantes SSII é vincadamente diferente do de cevadas normais e AC38. As cevadas mutantes em SSII não têm essencialmente qualquer pico de viscosidade, normalmente observado à medida que a temperatura é aumentada progressivamente até aos 95 °C, no inicio de um perfil de temperatura de RVA. Em vez disso, nestes mutantes a viscosidade aumenta constantemente até se atingir uma viscosidade final, se presente. Estes dados são consistente com o conteúdo reduzido de amilopectina dos grânulos, o nivel reduzido de cristalinidade de 65 amilopectina no grânulo e a reduzida temperatura de gelatinização e entalpia observada por calorimetria diferencial de varrimento. Uma elevada viscosidade final é obtida quando a amilose é libertada do grânulo após o aquecimento sob excesso de água e agitação. Estas caracteristicas de RVA são únicas para um amido de um cereal e fornecem uma nova fonte de amido para aplicações alimentares e industriais, onde é necessária uma reduzida viscosidade de colagem e ao mesmo tempo uma elevada viscosidade final.
As observações feitas acerca da temperatura de gelatinização em DSC estão refletidas nos resultados dos estudos de difração de raios X. Os grânulos de 292 e 342 têm niveis reduzidos de cristalinidade e a forma cristalina altera-se da forma do tipo A, típica de amidos de cereais para uma mistura dos tipos V e B. O tipo V é típico de amilose e reflete o componente de amilose do amido complexado com os ácidos gordos, enquanto que o tipo B é derivado de amilopectina e reflete presumivelmente o conteúdo de amilopectina residual do amido (Buleon et al., 1998) . A análise da base genética das mutações 292 e 342 demonstra que as mutações são simples mutações recessivas que dão lugar a rácios tipicamente mendelianos em experiências de cruzamentos. Os estudos de cruzamentos demonstram que 292 e 342 são mutações alélicas. A análise adicional da interação entre 292 e outras mutações shrunken de endosperma em experiências de cruzamentos demonstrou que as mutações 292/342 são também alélicas com a mutação sex6 na linhagem MK6827. Esta mutação tinha sido mapeada e identificada anteriormente, estando localizada a 3 cM do centrómero do braço curto do cromossoma 7H (Netsvetaev, 1990, Netsvetaev 66 e Krestinkov, 1993, Biyashev et al., 1996, Netsvetaev, 1992) .
Uma população duplamente haplóide entre a cevada com casca Tantangara e o mutante sem casca 292 foi estabelecida e a mutação shrunken do endosperma foi mapeada, estando localizada no braço curto do cromossomoa 7HS, a menos de 16 cM do gene nud, uma localização consistente com a localização mapeada para a mutação sex6. A localização do gene numa região adjacente ao centrómero no braço curto do cromomssoma 7HS demonstra que a mutação causadora (sex6) está num gene diferente da mutação que origina um maior conteúdo de amilose em AC38 (amol), a qual foi mapeada no cromossoma 1H (Schondelmeier et al., 1992). A localização no mapa sugere que um candidato do gene mutado na mutação sex6/292 seja a sintetase de amido II, conhecida em trigo e localizada na mesma região do cromossoma (Yamamori e Endo, 1996, Li et al., 1999b). A análise das sequências dos mutantes de 292 e 342 mostrou que possuem uma mutação de transição G para A neste gene, o que pode causar uma interrupção do gene e levar a que a região C-terminal, contendo o sitio ativo da enzima não seja traduzido, conduzindo presumivelmente à síntese de uma proteína completamente inativa. Adicionalmente, a sequenciação do gene SSII de MK6827 mostrou uma mutação por transição G para A na posição 242, o que causaria igualmente a interrupção do gene. Este resultado confirma a natureza alélica das mutações 292 e MK6827. A identificação de mutações no gene SSII levou ao desenvolvimento de um marcador por PCR, diagnosticante da mutação em 292. Este marcador de PCR foi analisado ao longo das 91 plantas da população da progenia de 292 x Tantangara 67 e foi demonstrado que co-segrega a 100% com o fenótipo de endosperma shrunken e com o fenótipo de reduzida distribuição do comprimento da cadeia de amido. A descoberta de mutações alélicas nos genes SSII de cevada de diversos enquadramentos genéticos (292 e MK6827), que originavam fenótipos semelhantes, e a perfeita associação genética da mutação com o fenótipo de grão shrunken fornece um elevado grau de certeza de que as mutações presentes nos genes SSII de 292, 342 e MK6827 são as mutações causadoras que dão origem à caracteristica de endosperma shrunken. O fenótipo observado na presente invenção, para a mutação SSII em cevada é semelhante a fenótipos associados a mutações em SSII em outras plantas, em alguns aspetos, no entanto, essas mutações em SSII não dão origem a conteúdos de amilose tão elevados como os encontrados associados a 292/342. Mutantes em SSII são conhecidos em ervilha (rug5, Craig et al., 1998) e Chlamydomonas (Fontaine et al., 1993) e dão origem a amilopectinas com distribuições reduzidas de comprimento de cadeia, como observado na presente invenção. Há também evidências que sugerem que a mutação shrunken-2 em milho deriva de uma mutação do gene SSII apesar de esta hipótese ter de ser ainda conclusivamente demonstrada (Ham et al., 1998, Knight et al., 1998) . Em milho, a mutação Shrunken2 dá origem a amidos com temperaturas de gelatinização reduzidas (Campbell et al., 1994). Em trigo, Yamamori desenvolveu uma linhagem triplamente deletada, em que a proteina Sgp-1 não existe (Yamamori 1998) que foi usada por Li et al. (Li et al., 1999b) para demonstrar que é o produto do gene SSII. Em trigo, é observados que o conteúdo de amilose é aumentado em cerca de 35% e que os grânulos de amido são anormais, exibindo uma cristalinidade alterada e uma temperatura de gelatinizaçao alterada (Yamamori 1998). As diferenças das propriedades entre os 68 mutantes de SSII de cevada e mutantes de SSII de outras espécies foram muito surpreendentes.
Foi demonstrado que a mutação em SSII é passível de ser transferida por cruzamento de um enquadramento genético para outro e originar a morfologia de grão diagnosticante e a composição tipica do 292, 342 e MK6827 original. Na tabela 9 são apresentados os dados das linhagens duplamente haplóides de 292 x Tantangara para os parâmetros rácio C/E, conteúdo de β-glucano, distribuição de comprimento de cadeia, RVA e volume de expansão da farinha e demonstram que as linhagens contendo a mutação 292 exibem fenótipos tipicos da linhagem parental 292. Numa demonstração adicional, a segregação da semente da própria progenia, cruzada entre si, de um segundo retrocruzamento de 292 com Sloop mostra que o rácio de segregação é consistente, com uma segregação 3 : 1 para o fenótipo normal (74 sementes com um rácio C/E < 3,5) e shrunken (21 sementes rácio C/E >3,5) . A disponibilidade da sequência do gene de SSII e dos sistemas de transformação de cevada fornece as ferramentas necessárias para fazer a disrupção do gene SSII usando tecnologias de supressão génica, de forma a produzir um fenótipo comparável àquele encontrado com as mutações em SSII. Uma estratégia desenvolvida recentemente altamente eficaz é a produção de uma construção de uma estrutura em alfinete, desenhada para produzir ARN de dupla cadeia o qual poderá suprimir a atividade de SSII endógena. Apesar de mutantes completamente reprimidos análogos das mutações descritas na presente invenção poderem ser interessantes, o uso de construções de ADN com promotores diferentes, e a recuperação dos transgenes com niveis diferentes de expressão da construção em alfinete, poderia permitir 69 avaliar o impacto de titrar a expressão do gene desde os níveis normais até à repressão completa.
Foi demonstrado que as mutações podem ser transferidas de 292 para outros enquadramentos genéticos de cevada, mantendo ao mesmo tempo características essenciais da mutação original 292. Nas tabelas 9 e 10, são mostrados os dados fenotípicos da progenia duplamente haplóide de 292 x Tantangara, e a semente do segundo retrocruzamento com Sloop e indica que os fenótipos são transferidos através do processo de produção.
Tabela 1
Composição do cereal de cevada | Conteúdo | em amido | (%)a | Conteúdo j de | amidose 1 por HPLC | (%)b Conteúdo de amidose por ligação a iodo (%) Conteúdo proteico (%)a 1 1 | glucano j (%)a | Fibra dietética total3 (%) Fibra dietética insolúvel' (%) Fibra dietética solúvel3 (%) Glacier | n.d. 1 31,0 n.d. 11,5 1 4'3 1 21,6 16, 6 5 AC 3 8 | 47 I 47,4 60, 6 10,4 I 5,8 | 24,9 28, 8 6,1 Himalaya | 49 I 25 25,4 10, 0 I 4,8 | 27,1 18,1 9 292 I 17,7 1 71 68, 9 15, 0 I 9,5 I 30, 3 21,4 8,9 342 1 21,9 1 62,5 71,7 15,7 | 8,3 I 28, 3 19,4 8,9 MK6827 | 10,2 1 n.d. 44,4 21,3 1 n.d. ! n.d. n.d. n.d. Waxiro 1 42,8 | n.d. 5, 0 14,6 1 n.d. I 19, 8 12,7 7,1, Tantanga ra | 51,6 | n.d. 29,5 14,6 I n.d. 1 17,2 12,7 4,5, a % peso do cereal, 14% de humidade b % do conteúdo total de amido n.d. não determinado
Tabela 2 — Peso do grão (mg) Dimensões Comprimento do grão (mm) do grão Largura do \Espessura do grão (mm) |grão (mm) Rácio C/E Himalaya 51,01 ± 6, 63a 7,01 ± 0.51 3,58 ± 0,34 I2,82 ± 0,36 2,48 70
Dimensões do grão 70 ; ÍPeso do Comprimento do i igrão (mg) ijgrão (mm) ÍTantangaraÍ50,40 ± M ,22 ± 0.98 | Ϊ 6,51a j ÍWaxiro 145,71 ± :7,54 ± 0.47 j 15,21 ! AC38 !50, 79 ± \l, 62 ± 0.65 18,22 j 292 í32,13 ± Ϊ7,05 ± 0.49 i 4,67 I i342 135,45 ± :7,28 ± 0.55 í 6, 01 IMK6827 :44,89 ± M1,20 ± 0.58 13,78 í
Largura do jEspessura do IRácio grão (mm) sgrão (mm) :|C/E 3,60 ± 0,25 12,73 ± 0,21 12,64 3,40 ± 0,20 ]2,67 ± 0,19 12,82 3,35 ± 0,27 12,64 ± 0,25 12,89 3.63 ± 0,55 11,58 ± 0,20 j4,46 3,76 ± 0, 38 11, 75 ± 0,18 i4,16 3.63 ± 0,27 11,77 ± 0,33 16,33 :N=50, exceto quando indicado por a, n=200
Tabela 3
Distribuição do comprimento da cadeia obtido por remoção das ramificações do amido por isoamilase : Dpa Himalaya %b ; Tantangara %b i AC38 %b 342 %b : 292 %b | MK6827 %b 1 DP 6-11 24,15 | 22,40 j 26,33 co \—1 co 00 38, 96 I 37,8 ; j DP 30 12- 69, 12 ! 67,59 i 67,12 54,14 i 53, 42 | 55,60 : í DP 60 31- 6, 73 \—1 O o \—1 6, 05 7,68 ! 7,62 I 6,42 ! ia grau de polimerização :b percentagem da distribuição de oligossacáridos expressa em imolaridade.
Tabela 4
Propriedades térmicas do amido de cevada medidas por DSC \ Pico 1 Pico 2 Início | Pico | Fim I ΔΗ \ Início ) Pico S Fim ΔΗ j jGlacier : 55, 4 I 59,3 | 65,3 j 4,2 | 93,9 : 101,4 : 107,7 : 0, 87 ; ÍAC38 ! 55, 0 I 62,2 | 68,2 1 3,9 | 89,3 ! 100,1 í 106,9 ϊ 1,195 í : Himalaya \ 56, 8 | 60,9 \ 68, 0 | 4,5 \ 93,1 ; 101,8 ; 108,3 ; 0,78 ! í 2 92 i 46, 0 \ 51,2 | 58,1 | 0,29 | 88,7 i 97,7 í 104,9 í 1,34 ! : 342 : 45,2 1 50,4 1 56, 8 \ 0,47 \ 86,5 1 97,0 ! 105,0 1 1,59 ii
Tabela 5
Parâmetros RVA para amidos de cevada 71 \ Pico de iDegradaçI Força |Recu |Viscosidas Viscosida jTemperaturaj jviscosida ; ão j de j o j de Final ;i de Final j de j | de I I supor \ \ $ Normaliza jliquidifica j j| te ij ξ da* j ção (C) ; iHimala § ÍYa § 871,5 j 653, 1 |218,4 1235, ! I 8 | 454,2 i 926 | 64,9 ! ÍNamoi | 621,7 j 367,5 1254,2 | 375, I I 3 ! 629,5 i 1284 \ 65,9 í ÍAC38 | 226,7 | 87,3 j 139,4 1188, ! | 4 ! 327,8 ! 697 I 68,9 ; j 2 92 | 92,1** j k k k !133,9 1 230 I 363,9 i 2055 | 89,5 ! i 342 | 110,9** 1 k k k i 144,9 1264, I ! 5 ! 409,4 ; 1869 | 87,9 | ÍMK6827 § 18,2** Í k k k | 25,7 j 43,3 j 69 ) 676 \ n.d. ! i* a viscosidade final dividida pelo conteúdo de amido do cereal : integral §** o valor registado no momento do pico de viscosidade para a estirpe : Himalaya ;*** o valor era inferior a zero in.d. não determinado
Tabela 6
Dados da cristalinidade do amido ; Amostra j % H20 (W.B) ; j Cristalinidade %* í A %* ; B %* i V %* j i 2 92 | 29,6 ! 9 j - j 13 ! 87 ! i 342 | 35,8 ! 1 12 j - i 18 j 81 í AC38 I 26,1 : i 19 i 93 ! 7 ! (vestígios) j ; Himalaya | 27,7 i 27 ! 93 i 7 | (vestígios) j iWaxiro i 29,7 i 41 ! 94 li 6 1 i (* ± 5%)
Tabela 7
Análise da progenia iCruzamento | Shrunken |fu11 jl Calculado valor χ2α i 1292 x Sloopa 145 1155 § /(3:1) = 1,0 | 1292 x Tantangarab 145 §46 §χ1 2 (1:1) = 0,01 ij 1 a progenia de um cruzamento padrão ib progenia duplamente haplóide 2 :c em cada caso, χ2 (0,05), df=l = 3,84, e por isso a população : resultante do cruzamento 292 x Sloop enquadra-se na segregação 3:1 e a Ipopulação duplamente haplóide 292 x Tantangara enquadra-se na isegregação 1:1 72
Tabela 8
Marcação das linhagens duplamente haplóides de 292 x Tantangara ; ; Número de j i linhaa j Casca13 | Peso da 1 S semente (mg) j Rácio C/E c i DP6-11 | (%)d ) Conteúdo de ; S amilose3 j PCR3 í i 1 j N 1 26 j 3, 8 i 35,87 | 50,2 i 292 i i 2 | N i 24 ! 4,21 i 36,87 \ 56,2 ! 292 í ; 3 | H I 43 i 3,32 j 25,45 1 18,3 ! Wt í i 5 | N ] 40 ! 4,58 i 39,47 1 55,5 i 292 j i 7 | N 1 34 ! 4,28 | 19,63 I 43,0 ! 292 j I 8 | H 1 48 j 3, 02 i 21,6 1 46,7 ! wt i i 9 | N i 31 ! 2,76 i 22,89 \ 25,9 ! Wt i : 10 ! N ] 26 : 3, 02 i 27,56 1 21 / 1 I Wt : i ii | N \ 34 j 3,55 | 37,90 1 44,7 ! 292 j i 12 | H i 50 ! 2,94 i 26,37 | 32,8 i Wt i i 13 | N 1 27 | 4,29 i 38,68 I 48,4 i 292 í i 14 | H ] 56 ! 3, 07 i 22,98 1 20,8 i wt i i 15 | H j 4 6 Í 2,74 Í 24,88 I 22,9 i Wt : i 16 | H i 43 ! 2,78 i 25,40 \ 18,3 i Wt i i 17 | N i 31 ! 3, 8 1 37,37 \ 54,2 ! 292 í i 18 | N ] 31 j 4,51 Í 37,46 1 57,5 i 292 i i 19 | H \ 26 j 3,1 | 29,57 1 22,7 ! wt i i 20 | H i 53 j 3, 04 i 25,42 | 23,8 | Wt i i 21 | N i 31 ! 4,5 i 38,51 \ 59,1 ! 292 í i 22 \ N j 27 j 4,63 | 37,25 I 27,2 i 2 92 j \ 23 | H 1 47 ! 2,73 Ϊ 24,11 1 21,2 ! wt i i 24 | N i 27 ! 4,58 i 36,89 | 42,0 i 292 í i 26 | H 1 35 j 3,57 i 19,50 i 15'4 : Wt i i 27 | H 1 22 i 4,3 i 36,81 1 48,6 i 292 j i 28 | N 1 31 ! 4,34 Í 38,88 | 37,0 i 292 j i 30 | N i 30 ! 4,04 i 38,05 | 48,4 ! 292 í i 31 | N i 23 j 4,25 i 37,07 \ 51,7 ! 292 í i 32 ! H ] 48 i 2,62 i 20,67 | 13,0 | wt i i 33 | N i 25 i 4,92 | 35,68 I 33,3 ! 292 j i 34 | N I 31 i 4,01 : 38,34 1 46, 1 ; 292 í i 35 | H i 43 ! 3, 16 i 20,07 \ 23,6 ! Wt i i 36 | N ] 26 ! 4,33 i 36,93 1 29,7 ! 292 j i 38 | H | 38 i 3, 01 ϊ 21,11 j 9,1 ; wt i i 39 | H i 33 ! 2,92 i 20,49 \ 23,5 i Wt i ; 40 | H i 36 : 2,99 i 19,57 I 2,2 I Wt : i 41 | N ] 30 ! 4,05 i 37,82 1 40,9 i 292 j 73
Marcação das linhagens duplamente haplóides de 292 x Tantangara i I Número de j i linhaa j Casca13 \ Peso da 1 \ semente (mg) j Rácio C/E c i DP6-11 | (%)d \ Conteúdo de I S amilose3 1 PCR3 í i 42 | H i 47 ! 2,95 1 20,80 \ 11,9 ! wt i i 43 | N 1 40 | 3,24 i 21,97 | 18,1 i Wt í i 45 | H i 52 ! 2,78 i 19,97 \ 14,5 ! Wt i i 46 | N ] 29 i 4,44 i 35,87 I 32,1 ! 292 i i 47 | N \ 35 j 3, 69 i 36,34 I 92,9 ! 292 j i 48 | H | 31 ! 2,54 | 20,27 I 13,4 i Wt í i 49 \ H i 54 ! 2,94 i 22,29 1 19,3 i Wt i i 50 | H ] 50 ! 2,94 i 21,92 1 20,6 ! wt i i 51 ! H 1 43 i 3,73 i 20,59 I 18,1 ! Wt i i 53 | N i 31 ! 4, 12 i 36,52 | 55,3 ! 292 í i 54 | N | 34 j 4,02 i 35,17 I 57,i 1 292 í i 55 | H ] 32 j 4,19 i 41,35 1 60,4 ! 292 j i 56 | N \ 29 j 3, 17 1 21,48 1 18,1 ! wt i i 57 | H | 30 | 4,85 i 36,66 I 46,3 ! 2 92 í i 58 | N i 32 ! 2,97 i 23,83 \ 13,8 ! Wt i i 59 | N 1 46 j 2,91 I 24,15 1 9'2 ! wt i i 60 | H i 44 ! 2,74 i 22,39 1 13,5 ! wt i i 61 | N i 31 ! 4,47 i 35,67 i 6!,3 ! 292 í i 63 | N 1 32 j 4,3 i 36,94 1 39,4 ! 292 í i 64 | H ] 39 ! 2,93 i 21,95 1 20,5 ! wt i i 65 | N 1 2 6 j 3, 87 i 37,51 I 20,7 | 2 92 j i 66 | N i 30 ! 4,03 i 36,89 | 48,7 ! 292 í i 67 | H i 36 ! 3, 17 i 20,24 \ 14,4 i Wt i i 68 | N ] 43 j 2,65 i 22,53 ! 8'4 i wt i i 69 | N \ 32 | 3, 93 i 36,34 1 54,7 i 292 j : 70 | H i 43 | 2,77 : 22,28 1 17,6 : Wt í i 71 \ N i 29 ! 3,73 i 38,73 \ 31,5 ! 292 í i 72 | H i 47 ! 2,65 i 22,00 i 20,8 ! wt i i 73 | N i 36 | 4,09 1 39,58 I 49,0 i 292 í i 74 | N i 24 ! 4,18 i 36,15 | 47,8 ! 292 í i 75 | H i 34 i 2,99 i 24,42 i 14,2 i Wt i i 76 | N ] 31 ! 4,35 i 35,95 1 49,9 ! 292 j i 77 | H i 49 ! 3, 19 Ϊ 21,22 I 17,0 ! wt i i 78 | H | 33 1 2,78 i 21,27 | 15,6 i Wt í i 79 | H i 31 ! 2,85 i 23,04 \ 21,2 i Wt i i 80 | H ] 38 i 3, 18 i 19,88 I 18,9 ! wt i i 81 ! H | 37 ! 2,84 Ϊ 24,22 1 16,2 i wt i 74
Marcação das linhagens duplamente haplóides de 292 x Tantangara : Número de j linhaa j Casca13 S Peso da \ semente (mg) j Rácio j ! C/E c j DP6-11 (%)d S Conteúdo de S amilosee j PCR' ! 82 ! H 1 33 | 4,64 j 39, 99 \ 45,3 ! 292 | ! 84 | N | 28 j 3,62 | 36, 98 | 28,9 í 292 | 85 | N | 26 j 6,44 i 44,43 I 41,3 \ 292 ! 1 86 | H | 32 í 2,87 j 30,73 | 16,1 j Wt í 88 \ N 1 26 | 4,62 j 46,12 I 39,3 | 292 ; \ 89 | H | 38 :í 2,88 i 31,25 \ 16,3 I wt i 90 \ H | 32 j 3,19 j 31,11 | 13,8 j Wt ! \ 91 | N 1 31 ! 4,17 j 42,86 1 37,3 I 292 í 92 1 N I 27 i 3,99 I 45,30 | 44,6 ;; 292 ; ! 93 | H | 37 í 2,99 j 30, 77 i 12,5 i Wt ! 94 | H 1 43 ! 3,67 j 29, 46 | 21,9 j wt i i 96 | N | 33 ! 5,69 j 47,34 1 52,2 ! 292 í 97 ! N I 23 j 3,41 | 31,36 1 17,1 i Wt | i 98 | N | 32 í 5,95 ! 45,27 | 52,4 1 292 ! 99 1 N 1 19 !Í 3,68 ! 38, 36 i 1'7 j 292 í i 100 | H | 36 j 3,1 | 31,92 1 15,4 i wt ΐ i 101 | N I 58 i 3,29 í 24,71 I 2,9 \ wt i :a linha duplamente haplóide 292 x Tantangara ib fenótipo da casca. N, despida; H, com casca ic rácio C/E: rácio comprimento face à espessura ;d Percentagem de cadeias de amido não ramificado com DP6 a DP11, icalculado em molaridade como uma percentagem de cadeias eluidas entre j DP6 e DP65 ie valor do conteúdo de amilose determinada bpor azul de iodo. ;f resultado PCR. 292, o produto da reação de PCR dá origem a uma banda icom 169 bp e a uma outra banda adicional de 103 pbs após digestão com ÍNlalV; Wt, o produto da reação de PCR origina uma banda com 111 pbs, juma outra com 103 pbs e uma banda adicional de 57 pbs após a digestão icom NlalV. 75
Tabela 9
Análise detalhada das linhagens duplamente haplóides
;Linha Controlo j Rácio ! C/E FACE j Pico de viscosidade (unidades RVA) Viscosidade i final de RVA : (unidades i RVA) | Rácio da viscosidade máxima/final i Conteúdo de i β-glucano | (%) Volume de i expansão : da i farinha : iSloop ! 2,78 23,5 ! 535, 8 483,5 í 1,11 2,3 7,54 j jTantanga ; ra i 2,64 22,4 ! 507 395,1 j 1,28 j 5, 16 5,97 í ; Himalaya | 2,48 24,2 | 873, 9 449,3 1 1,94 í 8,53 8,18 í ÍAC38 ! 2,89 26,33 ! 226, 7 327,8 j 0, 69 ! 5, 8 3,75 j : 2 92 : 4,46 38, 9 : 92,1 363,9 i 0,25 i 13,09 O o CM ÍMK6827 ! 6, 33 37,98 ! 18,2 69 | 0,26 | n . d. 2,11 I
Linha iduplamen :te ÍHaplóide ; Wild i Type : 8 3, 02 i 21,6 : 527,9 431,3 i 1,22 i 8,9 | 6,47 i i 43 3, 24 ! 25,4 i 566, 6 527,4 i 1,07 i 7,77 i 6, 04 í i 56 3, 17 | 24,9 ! 703, 1 523,5 | 1,34 | 7,81 i 6, 95 I i 58 2, 97 i 27,9 | 726, 8 588,8 i 1,23 i 9,65 i 6,23 j i 59 2, 91 ! 27,0 ! 655 435,8 i 1,50 i 7,16 i 7,21 í i 68 2, 65 j 22,5 i 876, 3 465,5 i 1,88 i 8,87 i 8,63 i Í101 3, 29 ! 34,71 ! 471,3 410,3 i 1,15 ! 6,54 | 6,26 I Mutante ÍSSII i 5 4, 58 | 39.5 j 68.7 316.6 | 0.217 i 9.87 ! 2.55 j 111 3, 55 ! 48,2 ! 51,5 240,8 i 0,21 i 8,36 i 2,58 j U3 4, 29 | 38,7 i 43,7 265,5 | 0, 16 i 11,13 i 2,92 í i 27 4, 30 00 CO 00 20,3 96,6 ; 0,21 i 13,11 i 2,71 i i 30 4, 04 ! 38,05 1 57,3 251,1 i 0,23 ! 10,56 | 2,27 j í 31 4, 25 i 37,1 j 17,6 124,5 i 0, 14 i 11,35 | 2,48 j i 33 4, 92 | 35,7 i 11,7 83,5 | 0, 14 i 7,22 i 2,13 í i 36 4, 33 ! 36, 9 i 14,5 93, 6 i 0, 15 i 7,20 i 2,20 í i 4 6 4, 44 i 35,9 | 31,3 175,8 i 0, 18 i 10,02 i 2,32 i í 91 4, 17 i 42,9 ! 35, 8 189,5 i 0, 19 ! 11,3 i 2,43 j in.d. não determinado 76
Tabela 10
Dados de expansão da farinha para a semente BC2F2
Linha
I 2,118 6, 913 2,382 7,565 2,409 6,707 C5/1 Planta 1 L:T>3.5 C5/1 Planta 1 L:T<3.5 65/2 Planta 1 L:T>3.5 65/2 Planta 1 L:T<3.5 65/2 Planta 2 L:T>3.5 5/2 Planta 2 L:T<3.5 EXEMPLO 2
Desenho e construção dos vetores
As regiões do gene de SSII de cevada (como definido na Figura 15) foram clonadas em vetores para transformação. Três construções foram preparadas para cada gene alvo, recorrendo a estratégias de supressão génicas, (1) cosuppressão "sense", (2) cosupressão "antisense" e (3) supressão mediada por estrutura em duplex. A Figura 16 ilustra a configuração das sequências nas contruções de ADN desenhadas para suprimir a expressão do gene alvo endógeno. O promotor pode ser selecionado a partir do grupo dos específicos de endosperma (como o promotor de glutenina de elevado peso molecular, o promotor de SSI de trigo, promotor de BEII de trigo) ou promotores não específicos do endosperma (como ubiquitina ou 35S). A construção pode conter adicionalmente outros elementos que aumentam a transcrição como o elemento nos 3 do OCS. As regiões de ADN ilustradas serão incorporadas em vetores contendo sequências de genes seletivos adequados e outros 77 elementos, ou em vetores que são co-transformados com os vetores contendo estas sequências.
Transformação do cereal
Os métodos para a transformação de cevada (Tingay et al., 1997; Wan et al, 1994) aveias (Somers et al., 1992, 1994;
Gless et al., 1998; Zhang et al., 1999, Cho et al., 1999) e centeio (Castillo et al., 1994; Pena et al., 1984) foram já descritos e podem ser usados para a transferência de construções de ADN para a geração de plantas transgénicas.
Análise dos transgénicos A identificação das plantas transgénicas é levada a cabo através da identificação do ADN da construção de ADN através de reação de PCR ou através da hibridação de Southern. Os níveis de expressão dos genes próprios da cevada envolvidos na via de biossíntese do amido são avaliados pela medição do nível de expressão de mARN e de proteína, através de técnicas padrão como a hibridação de Northern e Western blotting, respetivamente. 0 conteúdo de amido e do grão, bem como as suas composições são medidas usando técnicas padrão como as exemplificadas no Exemplo 1.
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LISTA DE SEQUÊNCIAS <110> Commonwealth Scientific and Industrial Research Organisation <120> Cevada com atividade de SSII reduzida e amido e produtos contendo amido com um conteúdo reduzido de amilopectina 83 <13Ο> Β07473 <14Ο> ΕΡ01983291 <141> 2001-11-09 <160> 12
<210> 1 <211> 2920 <212> ADN <213> Hordeum vulgare <22 0>
<223> cADN de SSII <4 0 0> 1 cctcgaggtg cgtttacccc acacagagta cactccaact ccagCccaaC ccagcccacC 60 gccgcttctg cccgcccatc gtaccgtcgc ccgccccgat cccggccgcc gccatgtcgt 120 cggcggtcgc gtcccccgcg tccttcctcg cgctcgcgtc cgcctcgccc gggagatcat 180 cacggaggag ggcgagggtg ggcgcgtcgc caacccgcgc Cggggccggc aggctgcaat 240 ggcggccgtc gccgctgcag cgcacggctc gcgacggagc ggtggccgcg cgcgccgccg 300 ggatcgacga cgccgcgccc ggtaggcagc cccgcgctcg ccgctatggc gccgccacca 360 aggtcgcgga tcccgtcaag acgctcgatc gcgacgccgc ggaaggtggt gggccgtccc 420 cgccggcacc gaggcaggac gccgcccgtc Cgccgagtaa gaacggcacg ctgaCcaacg 480 gtgagaacaa acccaccggc ggcggtggcg cgaccaaaga cagcgggctt gccacacccg 540 cacgcgcgcc ccatctgcca atccaaaaca gagtaccggt gaacggCgaa aacaaacaca 600 aggtcgcctc gccgccgacc agcatagtgg atgtcgcgtc tccgggttcc gcagccaaca 660 tttecatcag taacaaggtg ccgccgtecg ttgtcccaae caagaagacg cegccgtcgt 720 ccgttttccc ggccaagaag acgctgccgt cgtccggctc aaactttgtg tcctcggcct 780 ctgctcccag gctggacact gtcagcgatg tggaacCCgc acagaagaag gatgcgctga 840 ttgtcaaaga agctccaaaa ccaaaggctc tttcggcccc tgcagccccc gctgtacaag 900 aagacctttg ggatttcaag aaatacattg gtttcgagga gcccgtggag gccaaggatg 960 atggctcggc tgttgcagat gatgcgggtt cctttgaaca tcaccagaat catgattccg 1020 gacctctggc aggggagaac gtcatgaacg Cggtcgtcgt tgctgcçgaa tgttctccct 1080 ggtgcaaaac aggtggcctc ggagatgttg cgggtgcttt gcccaaggcc ttggctaaga 1140 gaggacatcg tgttatggtt gtggtaccaa ggtatgggga ctatgaggaa gcctacgatg 1200 tcggagtccg aaaatactac aaggctgcCg gacaggatat ggaagtgaat tattttccatg 1260 cttatatcga tggagtggat tttgtgttca ttgacgctcc tctcttccga caccgtcagc 1320 aagacaccta tgggggcagc agacaggaaa ccacgaagcg cacgaccccg ccccgcaagg 1380 ccgctgtcga ggttccttgg cacgttccat gcggcggtgt cccttacggg gatggaaatc 1440 tggtcttcat tgcaaatgat tggcacacgg cactcctgcc tgtctatctg aaagcatact 1500 acagggacca tggtttgatg caatacagcc gctccgecat ggtgatacae aacatcgctc 1560 accagggccg tggccctgta gatgaattcc cgttcaccga gttgccCgag cactacctgg 1620 aacacctcag actgtacgac cccgtcggcg gtgagcacgc caactaottc gccgccggcc 1680 cgaagatggc ggaccaggtc gtcgtcgtga gccccgggta cccgtgggag ccgaagacgg 1740 tggagggcgg ctgggggctt cacgacatca tacggcagaa cgactggaag acccgcggca 1800 tcgtgaacgg catcgacaac atggagtgga accctgaggc ggacgCccac ctgaagtcgg 1860 acggctacac caacttctcc ctgaagacgc tggactccgg caagcggcag tgcaaggagg 1920 ccctgcagcg cgagctgggg ctgcaggtcc gcggcgacgt gccgctgctc gggttcatcg 1980 ggcggccgga cgggcagaag ggcgcggaga tcatcgcgga cgcgacgccc tggatcgtga 2040 84 gccaggacgt gcagctggCg atgctgggca cggggcgcca cgacctggag agcatgccgc 2100 agcactecga gcgggagcac cacgacaagg tgcgcgggtg ggCggggttc tccgcgcgcc 2160 tggcgcaccg gatcacggcg ggcgccgacg cgctcctcat gccctcccgg ttcgagccgt 2220 gcgggctgaa ccagcCcCac gcgatggccC acggcaccgt ccccgtcgtg cacgccgtcg 2280 gcggcttgag ggataccgtg ccgccgttcg accccttcaa ccactccggg ctcgggtgga 2340 cgcccgaccg cgccgaggcg cacaagccga tcgaggcgcc cgggcactgc ccccgcacct 2400 accgggacca caaggagagc tggaggggcc tccaggagcg cggcatgtcg caggacttca 2460 gctgggaaca Cgccgccaag ctctacgagg acgtcctcgt ccaggccaag taccagtggt 2520 gaacgctgcc acccggtcca gccccgcatg cgtgcatgag aggatggaaa tgcgcattgc 2580 gcacttgcag atttggcgca cgcaggaacg tgccgtcctt ctegacgaga acgccggcat 2640 ccgcgaggtt gagacgctga ttccgatctg gtccgtcgca gagtagagtg aaacgctcct 2700 tgttgcaggt atatgggaat gttttttttc cttttttttt gcgagggagg tatatgggaa 2760 tgttaacttg gtattgtaat gCggtatgct gtgtgcatta ttacatcggt tgttgttgct 2B20 tattcttgct agctaagtcg gaggccaaga gcgaaagcta gctcacatgt ctgatgtatg 2880 caagegacat ggttggctcg aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2920
<210> 2 <211> 2950 <212> ADN <213> Hordeum vulgare <220> <221> mutação <222> 235 <223> cADN do gene SSII da linhagem MK6827 de cevada <400> 2 85 gtgcgtttac cccacacaga gtacactcca actccagtcc agtccagccc actgccgctt 60 ctgcccgccc atcgtaccgc cgcccgcccc gatcccggcc gccgccatgt cgtcggcggt 120 cgcgtccccc gcgtccttcc tcgcgctcgc gtccgcctcg cccgggagat catcacggag 180 gagggcgagg gcgggcgcgc cgccaacccg cgccggggcc ggcaggccgc aatgacggcc 240 gtcgccgctg cagcgcacgg ctcgcgacgg agcggtggcc gcgcgcgccg ccgggatcga 300 cgacgccgcg cccggtaggc agccccgcgc tcgccgctat ggcgccgcca ccaaggtcgc 360 ggatcccgtc aagacgctcg atcgcgacgc cgcggaaggt ggtgggccgt ccccgccggc 420 accgaggcag gacgccgccc gtcCgccgag taagaacggc acgctgatca acggtgagaa 480 caaacctacc ggcggcggtg gcgcgaccaa agacagcggg ctgcccacac ccgcacgcgc 540 gccccatctg tcaatccaga acagagtacc ggtgaacggt gaaaacaaac ataaggtcgc 600 ctcgccgccg accagcatag tggatgtcgc gtctccgggt tccgcagcta acatttccat 660 cagtaacaag gtgccgccgt ccgttgtccc agccaagaag acgccgccgt cgtccgtttt 720 cccggccaag aaggcgccgc cgtcgtccgt tgtcccggcc aagaagaogc tgccgtcgtc 780 cggctcaaat tttgtgtcct cggcctctgc Ccccaggctg gacactgtca gcgatgtgga 840 acttgcacag aagaaggatg cgctgatCgt caaagaagct ccaaaaccaa aggctctetc 900 ggcccctgca gcccccgccg cacaagaaga cccctgggat ttcaagaaat acatcggcet 960 cgaggagccc gcggaggcca aggatgaCgg ctcggctgtt gcagatgatg cgggttcctt 1020 tgaacatcac cagaatcatg attccggacc cttggcaggg gagaacgtca tgaacgtggt 1080 cgtcgttgct gctgaatgtC ctccctggtg caaaacaggt ggtcttggag atattgcggg 1140 tgctttgccc aaggctttgg ctaagagagg acatcgtgtt atggttgtgg taccaaggta 1200 cggggactat gaggaagccc acgacgccgg agcccgaaaa tactacaagg ctgceggaca 1260 ggatatggaa gegaateaCt tccacgccta tatcgatgga gtggatCCtg tgttcattga 1320 cgctcctccc ttccgacacc gtcagcaaga cactcatggg ggcagcagac aggaaatcac 1380 gaagcgcatg attttgttct gcaaggccgc tgtcgaggtt ccttggcacg ttccatgcgg 1440 cggtgtccctt tacggggatg gaaatctggt cttcattgca aatgattggc acacggcact 1500 cctgcctgtc CaCcCgaaag catactacag ggaccatggt ttgatgcaat acagtcgctc 1560 cgttatggtg atacataaca tcgctcacca gggccgtggc ccCgtagatg aattcccgte 1620 caccgagCtg cctgagcact acctggaaca ctccagactg tacgaccccg tcggcggcga 1680 gcacgccaac tacttcgccg ccggcctgaa gatggcggac caggttgtcg tcgtgagccc 1740 cgggtacctg tgggagctga agacggcgga gggcggctgg gggcttcacg acatcataeg 1800 gcagaacgac tggaagaccc gcggcatcgt gaacggcatc gacaacatgg agtggaaccc 1860 tgaggtggac gtccacctga agccggacgg ctacaccaac tcccccctga agacgctgga 1920 ctccggcaag cggcagtgca aggaggccct gcagcgcgag ctggggctgc aggtccgcgg 1980 cgacgtgccg ctgctcgggc ccatcgggcg gctggacggg cagaagggcg tggagatcat 2040 cgcggacgcg atgccctgga tcgtgagcca ggacgtgcag ctggtgatgc tgggcacggg 2100 gcgcoaogac ccggagagca cgctgcagca cttcgagcgg gagcaccacg acaaggtgcg 2160 cgggtgggtg gggttctccg Cgcgcctggc gcaccggatc acggcgggcg ccgacgcgct 2220 cctcatgccc tcccggttcg agccgtgcgg gctgaaccag cCctacgcga tggcctacgg 2280 caccatccct gtcgtgcacg ccgtcggcgg cctgagggat accgtgccgc cgttcgaccc 2340 cttcaaccac tccgggctcg ggtggacgtc cgaccgcgcc gaggcgcaca agctgaccga 2400 ggcgctcggg cactgcctcc gcacctaccg ggaccacaag gagagctgga ggggcctcca 2460 ggagcgcggc atgtcgcagg acttcagctg ggaacatgcc gccaagctct acgaggacgt 2520 cctcgtccag gccaagtacc agtggtgaac gctgctaccc ggtccagccc cgcatgcgtg 2580 catgagagga tggaaatgcg cattgcgcac ttgcagatct ggcgcatgca ggaacgcgcc 2640 gtccttcttg acgggaacgc cggcatccgc gaggctgaga cgctgatccc gatcCggtcc 2700 gtcgcagagt agagtgaaac gctccCtgtt gcaggtatat gggaatgtct tttttttcct 2760 tttttttttt gcgagggagg tatatgggaa tgttaacttg gtattgtaat gtggtatgct 2820 gtgtgcatta ttacatcggt tgttgttgct tattcttgct agctaagtcg gaggccaaga 2880 gcgaaagcta gctcacatgt ctgatgtatg caagtgacat ggttggtttg gttgtgcagt 2940 gcaaacggca 2950
<210> 3 <211> 2951 <212> ADN <213> Hordeum vulgare <220> 86 <223> cADN do gene SSII da cultivar Morex de cevada <400> 3 gtgcgtttac cccacacaga gtacactcca actccagtcc agtccagccc actgccgctt 60 ctgcccgccc atcgtaccgt cgcccgoccc gatcccggcc gccgccatgt cgtcggcggt 120 cgcgtccccc gcgtccttcc tcgcgctcgc gtccgcctcg cccgggagat catcacggag 180 gagggcgagg gtgggcgcgc cgccaacccg cgccggggcc ggcaggctgc aacggcggcc 240 gtcgccgctg cagcgcacgg cccgcgacgg agcggtggcc gcgcgcgccg ccgggaccga 300 cgacgccgcg cccggCaggc agccccgcgc tcgccgctat ggcgccgcca ccaaggccgc 360 ggatcccgtc aagacgctcg accgcgacgc cgcggaaggt ggtgggccgt ccccgccggc 420 accgaggcag gacgccgccc gtctgccgag taagaacggc acgctgatca acggtgagaa 480 caaacctacc ggcggcggtg gcgcgactaa agacagcggg ctgcccacac ccgcacgcgc 540 gccccatctg tcaatccaga acagagtacc ggtgaacggt gaaaacaaac ataaggtcgc 600 ctcgccgccg accagcatag tggatgCcgc gtctccgggt cccgcagcta acaCtCccat 660 cageaacaag gtgccgccgt ccgttgCccc agccaagaag acgccgccgt cgtccgtttt 720 cccggccaag aaggcgccgc cgtcgcccgc tgtcccggcc aagaagacgc tgccgtcgtc 780 cggctcaaat ccegtgtcct cggcctctgc tcccaggctg gacactgtca gcgacgtgga 840 acttgcacag aagaaggatg cgctgattgt caaagaagct ccaaaaccaa aggctctttc 900 ggcccctgca gcccccgctg tacaagaaga cctttgggat ttcaagaaac acactggttt 960 cgaggagccc gtggaggcca aggatgatgg ctcggctgtt gcagatgatg cgggttcctt 1020 tgaacatcac cagaatcatg attccggacc tCtggcaggg gagaacgtca tgaacgtggt 1080 cgtcgttgct gctgaatgtt ctcccCggCg caaaacaggt ggccttggag acgctgcggg 1140 tgctttgccc aaggctetgg ctaagagagg acatcgtgtt atggttgtgg taccaaggta 1200 tggggactat gaggaagcct acgatgtcgg agtccgaaaa tactacaagg ctgctggaca 1260 ggacacggaa gtgaattatc tccatgctta taecgatgga gtggattttg tgttcattga 1320 cgctcctccc ttccgacacc gtcagcaaga catttatggg ggcagcagac aggaaattat 1380 gaagcgcatg attttgttct gcaaggccgc tgtcgaggtt ccttggcacg ttccatgcgg 1440 cggtgtccct tacggggaCg gaaatctggt cttcattgca aatgattggc acacggcact 1500 cctgcctgtc cacccgaaag catattacag ggaccatggc ttgatgcaac acagtcgctc 1560 cgttatggtg atacataaca tcgctcacca gggccgtggc cctgtagatg aattcccgtt 1620 caccgagttg cctgagcact acctggaaca cttcagactg tacgaccccg tcggcggtga 1680 gcacgccaac tacttcgccg ccggcctgaa gatggcggac caggttgtcg tcgtgagccc 1740 cgggcacccg tgggagcCga agacggcgga gggcggcCgg gggcttcacg acatcacacg 1800 acag&acgac tejgaagaccc gcggcatcgt gaacggcatc gacaacatgg agtggaaccc 1860 bgaggtggac gtccacctga agtcggacgg ctacaccaac ttctccctga agacgccgga 1920 ctccggcaag cggcagtgca aggaggccct gcagcgcgag ctggggctgc aggtccgcgg 1980 cgacgtgccg ctgctcgggt tcatcgggcg gctggacggg cagaagggcg tggagaccac 2040 cgcggacgcg atgccccgga tcgtgagcca ggacgcgcag ctggcgatgc cgggcacggg 2100 gcgccacgac ctggagagca tgctgcagca cttcgagcgg gagcaccacg acaaggtgcg 2160 cgggtgggtg gggCtctccg CgcgccCggc gcaccggatc acggcgggcg ccgacgcgct 2220 cctcatgccc tcccggttcg agccgtgcgg gctgaaccag ctctacgcga tggcccacgg 2280 caccatccct gtcgtgcacg ccgtcggcgg cctgagggat accgtgccgc cgtecgaccc 2340 cttcaaccac tccgggctcg ggtggacgcc cgaccgcgcc gaggcgcaca agccgaccga 2400 ggcgctcggg cactgcctcc gcacctaccg ggaccacaag gagagctgga ggggcctcca 2460 ggagcgcgge atgtcgcagg acttcagctg ggaacatgcc gccaagctct acgaggacgt 2520 cctcgtccag gccaagtacc agtggtgaac gctgctaccc ggtccagccc cgcatgcgtg 2580 catgagagga tggaaatgcg cattgcgcac ttgcagattt ggcgcatgca ggaacgtgcc 2640 gtccttcttg atgggaacgc cggcacccgc gaggttgaga cgctgatccc gatctggccc 2700 gtcgcagagt agagtgaaac gctccttgtt gcaggtatat gggaatgctt tttttttcct 2760 cttttttttt tgcgagggag gcatatggga atgtcaactc ggtattgtaa cgcggcacgc 2820 tgtgtgcatt attacatcgg ttgttgttgc ttattcttgc tagctaagtc ggaggccaag 2880 agcgaaagct agctcacatg tctgatgtat gcaagtgaca tggttggttt ggttgtgcag 2940 tgcaaacggc a 2951 <210> 4 <211> 2946 87
<212> ADN <213> Hordeum vulgare <22 0> <221> mutação <222> 1855 <223> cADN do gene de SSII da linhagem de cevada 292 <400> 4 gtgcgcttac cccacacaga gtacactcca actccagtcc agcccagccc actgccgctt 60 ctgcccgccc atcgtaccgt cgcccgcccc gatcccggcc gccgccatgt cgtcggcggt 120 cgcgtccccc gcgtccttcc tcgcgcCcgc gtccgcctcg cccgggagat catcacggag ISO gagggcgagg gtgggcgcgt cgccaacccg cgctggggcc ggcaggctgc aatggcggcc 240 gtcgccgctg cagcgcacgg ctcgcgacgg agcggtggcc gcgcgcgccg ccgggatcga 300 cgacgccgcg cccggtaggc agccccgcgc tcgccgctat ggcgccgcca ceaaggtcgc 360 ggatcccgtc aagacgctcg accgcgacgc cgcggaaggc ggtgggccgt ccccgccggc 420 accgaggcag gacgccgccc gtctgccgag taagaacggc acgctgatca acggCgagaa 430 caaacccacc ggcggcggtg gcgcgactaa agacagcggg ctgcccacac ccgcacgcgc 540 gccccatctg tcaatccaga acagagtacc ggtgaacggt gaaaacaaac ataaggtcgc 600 ctcgccgccg accagcatag tggatgtcgc gtctccgggt tccgcagcca acatttccat 660 cagtaacaag gtgccgccgt ccgttgtccc agccaagaag acgccgccgt cgtccgtttt 720 cccggccaag aaggcgccgc cgtcgtccgt tgtcccggcc aagaagacgc tgccgccgtc 780 cggctcaaat cttgegtcct cggcctctgc tcccaggctg gacaccgtca gcgatgCgga 840 acttgcacag aagaaggatg cgctgattgt caaagaagct ccaaaaccaa aggctctttc 900 ggcccctgca gcccccgctg cacaagaaga cctttgggat tecaagaaac acattggttt 960 cgaggagccc gtggaggcca aggatgatgg cccggctgtt gcagatgatg cgggtccctt 1020 tgaacaccac cagaatcatg attccggacc cctggcaggg gagaacgtca tgaacgtggt 1080 cgtcgttgct gctgaatgtt cCccctggtg caaaacaggt ggtcttggag atgttgcggg 1140 CgcCtCgccc aaggcctcgg ceaagagagg acatcgtgtt atggccgtgg caccaaggCa 1200 tggggactat gaggaagcct acgatgtcgg agtccgaaaa tactacaagg ctgctggaca 1260 ggatatggaa gtgaattacc tccatgctta tatcgatgga gtggactttg cgtccaccga 1320 cgctcctctc ttccgacacc gtcagcaaga catttatggg ggcagcagac aggaaattac 1380 gaagcgcaCg attttgttct gcaaggccgc tgtcgaggct ccctggcacg tCccatgcgg 1440 cggtgtccct tacggggatg gaaatctggt cttcattgca aatgactggc acacggcact 1500 cctgcctgtc tatctgaaag catattacag ggaccatggt ttgatgcaat acagtcgcCc 1560 cgttatggtg atacataaca tcgctcacca gggccgtggc cctgtagatg aattcccgtt 1620 caccgagttg cctgagcact acctggaaca cttcagactg tacgaccccg tcggcggtga 1680 gcacgccaac tacttcgccg ccggcccgaa gatggcggac caggtcgccg ccgtgagccc 1740 cgggtacctg tgggagctga agacggtgga gggcggctgg gggcttcacg acatcatacg 1800 gcagaacgac cggaagaccc gcggcaccgt gaacggcacc gacaacatgg agtgaaaccc 1860 tgaggtggac gtccacctga agtcggacgg ctacaccaac ttctccctga agacgctgga 1920 ctccggcaag cggcagtgca aggaggccct gcagcgcgag ctggggccgc aggtccgcgg 1980 cgacgtgccg ctgctcgggt ccatcgggcg gctggacggg cagaagggcg tggagaccat 2040 cgcggacgcg acgccccgga ccgcgagcca ggacgcgcag ccggcgacgc tgggcacggg 2100 gcgccacgac ctggagagca tgctgcagca cttcgagcgg gagcaccacg acaaggtgcg 2160 cgggcgggtg gggttctccg tgcgcccggc gcaccggatc acggcgggcg ccgacgcgct 2220 cctcatgccc tcccggttcg agccgtgcgg gctgaaccag ctctacgcga tggcctacgg 2280 caccatccct gtcgtgcacg ccgtcggcgg cctgagggat accgtgccgc cgttcgaccc 2340 cttcaaccac tccgggctcg ggtggacgtt cgaccgcgcc gaggcgcaca agctgatcga 2400 ggcgctcggg cactgcctcc gcacctaccg ggaccacaag gagagctgga ggggcctcca 2460 ggagcgcggc atgtcgcagg aceccagctg ggaacatgcc gccaagctct acgaggacgt 2520 cctcgtccag gccaagtacc agtggtgaac gctgctaccc ggtccagccc cgcatgcgtg 2580 catgagagga tggaaatgcg cattgcgcac ttgcagattt ggcgcacgca ggaacgtgcc 2640 geccttcttg acgagaacgc cggeatccgc gaggttgaga cgctgattcc gatctggCcc 2700 gtcgcagagt agagtgaaac gctccttgtt gcaggtatat gggaatgttt tttttccttt 2760 ttttttgcga gggaggtata tgggaatgtt aacCtggtat tgtaatgtgg tacgctgtgt 2820 gcattattac atcggttgtt gttgctcatt cttgctagct aagtcggagg ccaagagcga 2880 aagctagctc acatgtctga tgtatgcaag tgacatggtt ggtttggttg tgcagtgcaa 2940 acggca 2946 <210> 5
<211> 802 <212> PRT <213> Hordeum vulgare <22 0> <223> Sequência de aminoácidos de SSII deduzida da cultivar Morex de cevada <400> 5
Met Ser ser Ala Vai Ala Ser Pro Ala Ser Phe Leu Ala Leu Ala 15 10 15
Ser Ala Ser Pro Gly Arg Ser Ser Arg Arg Arg Ala Arg Vai Gly 20 25 30
Ala Ser Pro Thr Arg Ala Gly Ala Gly Arg Leu Gin Trp Arg Pro 35 40 45 89
Ser Pro Leu Gin Arg Thr Ala Arg Asp Gly Ala Val Ala Ala Arg 50 55 60 Ala Ala Gly Ile Asp Asp Ala Ala Pro Gly Arg Gin Pro Arg Ala es 70 75 Arg Arg Tyr Gly Ala Ala Thr Lys Val Ala Asp Pro Val Lys Thr 80 85 90 Leu Asp Arg Asp Ala Ala Glu Gly Gly Gly Pro Ser Pro Pro Ala 95 100 105 Pro Arg Gin Asp Ala Ala Arg Leu Pro Ser Lys Asn Gly Thr Leu 110 115 120 Ile Asn Gly Glu Asn Lys Pro Thr Gly Gly Gly Gly Ala Thr Lys 125 130 135 Asp Ser Gly Leu Pro Thr Pro Ala Arg Ala Pro His Leu Ser Ile 140 145 150 Gin Asn Arg Val Pro Val Asn Gly Glu Asn Lys His Lys Val Ala 155 160 165 Ser Pro Pro Thr Ser Ile Val Asp Val Ala Ser Pro Gly Ser Ala 170 175 180 Ala Asn Ile Ser Ile Ser Asn Lys Val Pro Pro Ser Val val Pro 185 190 195 Ala Lys Lys Thr Pro Pro Ser Ser Val Phe Pro Ala Lys Lys Thr 2 00 205 210 Leu Pro Ser Ser Gly Ser Asn Phe Val Ser Ser Ala Ser Ala Pro 215 220 225 Arg Leu Asp Thr Val Ser Asp Val Glu Leu Ala Gin Lys Lys Asp 230 235 240 Ala Leu Ile Val Lys Glu Ala Pro Lys Pro Lys Ala Leu Ser Ala 245 250 255 Pro Ala Ala Pro Ala Val Gin Glu Asp Leu Trp Asp Phe Lys Lys 260 265 270 Tyr Ile Gly Phe Glu Glu Pro Val Glu Ala Lys Asp Asp Gly Ser 275 280 285 Ala Val Ala Asp Asp Ala Gly Ser Phe Glu His His Gin Asn His 290 295 300 &en • —sr Ser Γ31 V --J prn Leu Ala m v — j Glu Asn Val Met Asn Val Val Val 305 310 315 Val Ala Ala Glu Cys Ser Pro Trp Cys Lys Thr Gly Gly Leu Gly 320 325 330 Asp Val Ala Gly Ala Leu Pro Lys Ala Leu Ala Lys Arg Gly His 335 340 345 Arg Val Met Val Val Val Pro Arg Tyr Gly Asp Tyr Glu Glu Ala 350 355 360 Tyr Asp Val Gly Val Arg Lys Tyr Tyr Lys Ala Ala Gly Gin Asp 365 370 375 Met Glu Val Asn Tyr Phe His Ala Tyr Ile Asp Gly val Asp Phe 380 385 390 Val Phe Ile Asp Ala Pro Leu Phe Arg His Arg Gin Gin Asp Ile 395 400 405 Tyr Gly Gly Ser Arg Gin Glu Ile Met Lys Arg Met Ile Leu Phe 410 415 420 Cys Lys Ala Ala Val Glu Val Pro Trp His Val Pro Cys Gly Gly 425 430 435 90
Val Pro Tyr Gly Asp Gly Asn Leu Val Phe Ile Ala Asn Asp Trp 440 445 450 His Thr Ala Leu Leu Pro Val Tyr Leu Lys Ala Tyr Tyr Arg Asp 455 460 465 His Gly Leu Met Gin Tyr Ser Arg Ser Val Met Val Ile His Asn 470 475 480 Ile Ala His Gin Gly Arg Gly Pro val ASp Glu Phe Pro Phe Thr 485 490 495 Glu Leu Pro Glu His Tyr Leu Glu His Phe Arg Leu Tyr Asp Pro 500 505 510 Val Gly Gly Glu His Ala Asn Tyr Phe Ala Ala Gly Leu Lys Met 515 520 525 Ala Asp Gin Val Val Val Val Ser Pro Gly Tyr Leu Trp Glu Leu 530 535 540 Lys Thr val Glu Gly Gly Trp Gly Leu His Asp Ile Ile Arg Gin 545 550 555 Asn Asp Trp Lys Thr Arg Gly Ile val Asn Gly Ile Asp Asn Met 560 565 570 Glu Trp Asn Pro Glu Val Asp Val His Leu Lys Ser Asp Gly Tyr 575 580 585 Thr Asn Phe Ser Leu Lys Thr Leu Asp Ser Gly Lys Arg Gin Cys 590 595 600 Lys Glu Ala Leu Gin Arg Glu Leu Gly Leu Gin Val Arg Gly Asp 605 610 615 Val Pro Leu Leu Gly Phe Ile Gly Arg Leu Asp Gly Gin Lys Gly 620 625 630 Val Glu Ile Ile Ala Asp Ala Met Pro Trp Ile Val Ser Gin Asp 635 640 645 Val Gin Leu Val Met Leu Gly Thr Gly Arg His Asp Leu Glu Ser 650 655 660 Met Leu Gin His Phe Glu Arg Glu His His Asp Lys Val Arg Gly 665 670 675 Trp Val Gly Phe Ser Val Arg Leu Ala His Arg Ile Thr Ala Gly 680 685 690 Ala Asp Ala Leu Leu Met Pro Ser Arg Phe Glu Pro Cys Gly Leu 695 700 705 Asn Gin Leu Tyr Ala Met Ala Tyr Gly Thr Ile Pro Val Val His 710 715 720 Ala Val Gly Gly Leu Arg Asp Thr Val Pro Pro Phe Asp Pro Phe 725 73 0 735 Asn His Ser Gly Leu Gly Trp Thr Phe Asp Arg Ala Glu Ala HÍ3 740 745 750 Lys Leu Ile Glu Ala Leu Gly His Cys Leu Arg Thr Tyr Arg Asp 755 760 765 His Lys Glu Ser Trp Arg Gly Leu Gin Glu Arg Gly Met Ser Gin 770 775 780 Asp Phe Ser Trp Glu His Ala Ala Lys Leu Tyr Glu Asp Val Leu 785 790 795 Val Gin Ala Lys Tyr Gin Trp 800
<210> 6 <211> 802 <212> PRT <213> Hordeum vulgare <22 0> <223> Sequência de aminoácidos de SSII deduzida da cultivar Himalaya de cevada 91<4 Ο Ο > 6
Met Ser Ser Ala Vai Ala Ser Pro Ala Ser Phe Leu Ala Leu Ala 1 S 10 15 Ser Ala Ser Pro Gly Arg Ser Ser Arg Arg Arg Ala Arg Vai Gly 20 25 30 Ala Ser Pro Thr Arg Ala Gly Ala Gly Arg Leu Gin Trp Arg Pro 35 40 45 Ser Pro Leu Gin Arg Thr Ala Arg Asp Gly Ala Vai Ala Ala Arg 50 55 60 Ala Ala Gly Ile Asp Asp Ala Ala Pro Gly Arg Gin Pro Arg Ala 65 70 75 Arg Arg Tyr Gly Ala Ala Thr Lys Vai Ala Asp Pro Vai Lys Thr 80 85 90 Leu Asp Arg Asp Ala Ala Glu Gly Gly Gly Pro Ser Pro Pro Ala 95 100 105 Pro Arg Gin Asp Ala Ala Arg Leu Pro Ser Lys Asn Gly Thr Leu 110 115 120 Ile Asn Gly Glu Asn Lys Pro Thr Gly Gly Gly Gly Ala Thr Lys 125 130 135 Asp Ser Gly Leu Pro Thr Pro Ala Arg Ala Pro His Leu Ser Ile 140 145 150 Gin Asn Arg Vai Pro Vai Asn Gly Glu Asn Lys His Lys Vai Ala 155 160 165 Ser Pro Pro Thr Ser Ile Vai Asp Vai Ala Ser Pro Gly Ser Ala 170 • 175 180 Ala Asn Ile Ser Ile Ser Asn Lys Vai Pro Pro Ser Vai Vai Pro 185 190 195 Ala Lys Lys Thr Pro Pro Ser Ser Vai Phe Pro Ala Lys Lys Thr 200 205 210 Leu Pro Ser Ser Gly Ser Asn Phe Vai Ser Ser Ala Ser Ala Pro 215 220 225 Arg Leu Asp Thr vai Ser Asp Vai Glu Leu Ala Gin Lys Lys Asp 230 235 240 Ala Leu Ile Vai Lys Glu Ala Pro Lys Pro Lys Ala Leu Ser Ala 245 250 255 Pro Ala Ala Pro Ala Vai Gin Glu Asp Leu Trp Asp Phe Lys Lys 260 265 270 Tyr Ile Gly Phe Glu Glu Pro Vai Glu Ala Lys Asp Asp Gly Ser 275 280 285 Ala Vai Ala Asp Asp Ala Gly Ser Phe Glu His His Gin Asn His 290 295 300 Asp Ser Gly Pro Leu Ala Gly Glu Asn Vai Met Asn Vai Vai Vai 305 310 315 Vai Ala Ala Glu Cys Ser Pro Trp Cys Lys Thr Gly Gly Leu Gly 320 325 330 Asp Vai Ala Gly Ala Leu Pro Lys Ala Leu Ala Lys Arg Gly His 335 340 ♦ 345 92
Arg Vai Met Val Val Val Pro Arg Tyr Gly Asp Tyr Glu Glu Ala 350 355 360 Tyr Asp Vai Gly Val Arg Lys Tyr Tyr Lys Ala Ala Gly Gin Asp 365 370 375 Met Glu Val Asn Tyr Phe His Ala Tyr Ile Asp Gly Val Asp Phe 380 385 390 Vai Phe Ile Asp Ala Pro Leu Phe Arg His Arg Gin Gin Asp Ile 395 400 405 Tyr Gly Gly Ser Arg Gin Glu Ile Met Lys Arg Met Ile Leu Phe 410 415 420 Cys Lys Ala Ala Val Glu Val Pro Trp His Val Pro Cys Gly Gly 425 430 435 Vai Pro Tyr Gly Asp Gly Asn Leu Val Phe Ile Ala Asn Asp Trp 440 445 450 His Thr Ala Leu Leu Pro Val Tyr Leu Lys Ala Tyr Tyr Arg Asp 455 460 465 His Gly Leu Met Gin Tyr Ser Arg Ser Val Met Val Ile His Asn 470 475 480 Ile Ala His Gin Gly Arg Gly Pro Val Asp Glu Phe Pro Phe Thr 485 490 495 Glu Leu Pro Glu His Tyr Leu Glu His Phe Arg Leu Tyr Asp Pro 500 505 510 Vai Gly Gly Glu His Ala Asn Tyr Phe Ala Ala Gly Leu Lys Met 515 52 0 525 Ala Asp Gin Val Val Val Val Ser Pro Gly Tyr Leu Trp Glu Leu 530 535 540 Lys Thr Val Glu Gly Gly Trp Gly Leu His Asp Ile Ile Arg Gin 545 550 555 Asn Asp Trp Lys Thr Arg Gly Ile Val Asn Gly Ile Asp Asn Met 560 565 570 Glu Trp Asn Pro Glu Val Asp Val His Leu Lys Ser Asp Gly Tyr 575 580 585 Thr Asn Phe Ser Leu Lys Thr Leu Asp Ser Gly Lys Arg Gin Cys 590 595 600 Lys Glu Ala Leu Gin Arg Glu Leu Gly Leu Gin Val Arg Gly Asp 605 610 615 Vai Pro Leu Leu Gly Phe Ile Gly Arg Leu Asp Gly Gin Lys Gly 620 625 630 Vai Glu Ile Ile Ala Asp Ala Met Pro Trp Ile Val Ser Gin Asp 635 640 645 Vai Gin Leu Val Met Leu Gly Thr Gly Arg His Asp Leu Glu Ser 650 655 660 Met Leu Gin His Phe Glu Arg Glu His His Asp Lys Val Arg Gly 665 670 675 Trp val Gly Phe Ser Val Arg Leu Ala His Arg Ile Thr Ala Gly 680 685 690 Ala Asp Ala Leu Leu Met Pro Ser Arg Phe Glu Pro Cys Gly Leu 695 700 705 Asn Gin Leu Tyr Ala Met Ala Tyr Gly Thr Ile Pro Val Val HiS 710 715 720 Ala Val Gly Gly Leu Arg Asp Thr Val Pro Pro Phe Asp Pro Phe 725 730 735 93
Asn His Ser Gly Leu Gly Trp Thr Phe Asp Arg Ala Glu Ala His 740 74 5 750 Lys Leu Ile Glu Ala Leu Gly His Cys Leu Arg Thr Tyr Arg Asp 755 760 765 His Lys GlU Ser Trp Arg Gly Leu Gin Glu Arg Gly Mec Ser Gin 770 775 780 Asp Phe Ser Trp Glu His Ala Ala Lys Leu Tyr Glu Asp Vai Leu 785 790 795 Vai Gin Ala Lys Tyr Gin Trp 800
<210> 7 <211> 571 <212> PRT <213> Hordeum vulgare <22 0> <221> SITE <222> 583 <223> Sequência de aminoácidos de SSII com terminação prematura, deduzida da linhagem 292 de cevada <400> 7 94
Met Ser Ser Ala Vai Ala Ser Pro Ala Ser Phe Leu Ala Leu Ala 1 5 10 15 Ser Ala Ser Pro Gly Arg Ser Ser Arg Arg Arg Ala Arg Vai Gly 20 25 30 Ala Ser Pro Thr Arg Ala Gly Ala Gly Arg Leu Gin Trp Arg Pro 35 40 45 Ser Pro Leu Gin Arg Thr Ala Arg Asp Gly Ala Vai Ala Ala Arg 50 55 60 Ala Ala Gly Ile Asp Asp Ala Ala Pro Gly Arg Gin Pro Arg Ala 65 70 75 Arg Arg Tyr Gly Ala Ala Thr Lys Vai Ala Asp Pro Vai Lys Thr 80 85 90 Leu Asp Arg Asp Ala Ala Glu Gly Gly Gly Pro Ser Pro Pro Ala 95 100 105 Pro Arg Gin Asp Ala Ala Arg Leu Pro Ser Lys Asn Gly Thr Leu 110 115 120 Ile Asn Gly Glu Asn Lys Pro Thr Gly Gly Gly Gly Ala Thr Lys 125 130 135 Asp Ser Gly Leu Pro Thr Pro Ala Arg Ala Pro His Leu Ser Ile 140 145 150 Gin Asn Arg Vai Pro Vai Asn Gly Glu Asn Lys His Lys Vai Ala 155 160 165 Ser Pro Pro Thr Ser Ile Vai Asp Vai Ala Ser Pro Gly Ser Ala 170 175 180 Ala Asn Ile Ser Ile Ser Asn Lys Vai Pro Pro Ser Vai Vai Pro 185 190 195 Ala Lys Lys Thr Pro Pro Ser Ser Vai Phe Pro Ala Lys Lys Thr 200 205 210 Leu Pro Ser Ser Gly Ser Asn Phe Vai Ser Ser Ala Ser Ala Pro 215 220 225 Arg Leu Asp Thr Vai Ser Asp Vai Glu Leu Ala Gin Lys Lys Asp 95 230 235 240 Ala Leu Ile Vai Lys Glu Ala Pro Lys Pro Lys Ala Leu Ser Ala 245 250 255 Pro Ala Ala Pro Ala Vai Gin Glu Asp Leu Trp Asp Phe Lys Lys 260 265 270 Tyr Ile Gly Phe Glu Glu Pro Vai Glu Ala Lys Asp Asp Gly Ser 275 280 285 Ala Vai Ala Asp Asp Ala Gly Ser Phe Glu His His Gin Asn His 290 295 300 Asp Ser' Gly Pro Leu Ala Gly Glu Asn Vai Met Asn Vai Vai Vai 305 310 315 Vai Ala Ala Glu Cys Ser Pro Trp Cys Lys Thr Gly Gly Leu Gly 320 325 330 Asp Vai Ala Gly Ala Leu Pro Lys Ala Leu Ala Lys Arg Gly His 335 340 345 Arg Vai Met Vai Vai Vai Pro Arg Tyr Gly Asp Tyr Glu Glu Ala 350 355 360 Tyr Asp Vai Gly Vai Arg Lys Tyr Tyr Lys Ala Ala Gly Gin Asp 365 370 375 Met Glu Vai Asn Tyr Phe His Ala Tyr Ile Asp Gly Vai Asp Phe 380 385 390 Vai Phe Ile ASp Ala Pro Leu Phe Arg HiS Arg Gin Gin Asp ile 395 400 405 Tyr Gly Gly Ser Arg Gin Glu Ile Met Lys Arg Met Ile Leu Phe 410 415 420 Cys Lys Ala Ala Vai Glu Vai Pro Trp His vai Pro Cys Gly Gly 425 430 435 Vai Pro Tyr Gly Asp Gly Asn Leu Vai Phe Ile Ala Asn Asp Trp 440 445 450 His Thr Ala Leu Leu Pro Vai Tyr Leu Lys Ala Tyr Tyr Arg Asp 455 460 465 His Gly Leu Met Gin Tyr Ser Arg Ser Vai Met Vai Ile His Asn 470 475 480 Ile Ala His Gin Gly Arg Gly Pro Vai Asp Glu Phe Pro Phe Thr 485 490 495 Glu Leu Pro Glu His Tyr Leu Glu His Phe Arg Leu Tyr Asp Pro 500 505 510 Vai Gly Gly Glu His Ala Asn Tyr Phe Ala Ala Gly Leu Lys Met 515 52 0 525 Ala Asp Gin Vai Vai Vai Vai Ser Pro Gly Tyr Leu Trp Glu Leu 530 535 540 Lys Thr Vai Glu Gly Gly Trp Gly Leu His Asp Ile Ile Arg Gin 545 550 555 Asn Asp Trp Lys Thr Arg Gly Ile Vai Asn Gly Ile Asp Asn Met 560 565 570
<210> 8 <211> 43 <212> PRT <213> Hordeum vulgare <22 0> <221> SITE <222> 42 <223> Sequência de aminoácidos de SSII, com terminação prematura deduzida da linhagem de cevada MK6827 96 <4Ο0> 8
Met Ser Ser Ala Vai Ala Ser Pro Ala Ser Phe Leu Ala Leu Ala 1 5 10 15 Ser Ala Ser Pro Gly Arg Ser Ser Arg Arg Arg Ala Arg Vai Gly 20 25 30 Ala Ser Pro Thr Arg Ala Gly Ala Gly Arg Leu Gin 35 40 <210> 9 <211> 23 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido de iniciação PCR sslla <400> 9 tgttgaggtt ccatggcacg ttc 23 <210> 10 <211> 23 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido de iniciação PCR ssllb <4 0 0> 10 agtcgttctg ccgtatgatg tcg 23 <210> 11 <211> 23 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido de iniciação PCR ZLSS2P4 97 <4 Ο 0> 11 cctggaacac ttcagactgt acg 23 <210> 12 <211> 23 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Oligonucleótido de iniciação PCR ZLBSSIIS <4 0 0> 12 cttcagggag aagttggtgt age 23
Lisboa, 30 de Março de 2012

Claims (28)

1/23 REIVINDICAÇÕES 1. Grão de uma planta de cevada incluindo um gene SSII mutado, de forma a que a atividade de SSII codificada pelo referido gene SSII mutado é abolida e que o conteúdo total de amido do referido grão tem um conteúdo relativo de amilose de pelo menos 50% (massa/peso) como determinado por HPLC, e no qual a. a proporção de cadeias de amilopectina no amido do referido grão, as quais têm um comprimento no intervalo entre 6 e 11 residuos é de pelo menos 30%, e b. a proporção de cadeias de amilopecina contidas no amido do referido grão, as quais tenham uma dimensão no intervalo de 12-30 residuos, é inferior a 65%, e c. a proporção das cadeias de amilopectina do amido do referido grão têm um comprimento na gama dos 31-60 residuos, é inferior a 10%.
2. Grão de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o gene SSII referido conter a sequência apresentada na SEQ ID n°l e a mutação é selecionada de um mutante truncado, ou compreendendo uma deleção, inversão, duplicação ou mutação pontual.
3. Grão de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por o referido gene SSII mutado ser um mutante truncado, de forma a que o domínio catalítico C-terminal do gene SSII mutado não seja traduzido. 2/23
4. Grão de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a sequência de cADN do referido gene SSII ser apresentada em SEQ ID n°4.
5. Grão de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por a. a proporção das cadeias de amilopectina contidas no amido do referido grão, as quais têm um comprimento no intervalo de 6 a 11 resíduos representar apenas 35% e b. a proporção de cadeias de amilopectina contidas no amido do referido grão, as quais têm um comprimento no intervalo de 12 a 30 resíduos ser inferior a 60%, e c. a proporção de cadeias de amilopectina contidas no amido do referido grão e que têm um comprimento de 31 a 60 resíduos ser inferior a 8%.
6. Grão de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por a farinha ou farinha integral feita a partir do grão, tem um volume de expansão inferior a 3,2.
7. O grão de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado por a farinha feita a partir deste grão ter um volume de expansão de pelo menos 2.
8. Grão de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado por o referido grão conter pelo menos 6% de β-glucano, como uma percentagem do peso total do grão sem caixa. 3/23
9. Grão de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 8, caracterizado por o referido grão possuir uma caracteristica selecionada do grupo constituído por: possuir um conteúdo de amido superior a 12% do amido sem casca, não ter casca, ou tendo um limite de rácio entre o comprimento e a espessura inferior a 5,8.
10. Grão de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado por o referido grão exibir um rácio de comprimento face à espessura inferior a 5,5.
11. Grão de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por o referido grão exibir um rácio de comprimento / espessura entre 4 e 5.
12. Grão de acordo com qualquer uma das reivindições de 1 a 11, em que o amido do referido grão é caracterizado por pelo menos uma das opções seguintes: a. o início do primeiro pico de gelatinização detetado por calorimetria diferencial de varrimento ser inferior a 53 °C, b. o primeiro pico de gelatinização detetado por calorimetria diferencial de varrimento ser inferior a 60 °C, e c. a entalpia (ΔΗ) do primeiro pico de gelatinização detetado por calorimetria diferencial de varrimento ser inferior a 3,5.
13. Grão de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 12, caracterizado por o amido do referido grão ter uma temperatura de colagem superior a 75 °C. 4/23
14. Grão de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado por a proporção de amido do referido grão exibindo uma cristalinidade ser inferior a 20 %.
15. Grão de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado por a proporção do amido cristalino contida no amido do referido grão que exibe a forma de cristalinidade caracteristica de um complexo amido-lipido ser superior a 50%.
16. Grão de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado por o conteúdo total de amido do referido grão conter pelo menos 60% (massa/peso) de amilose, como o determinado por HPLC.
17. Grão de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado por a proporção de cadeias de amilopectina contidas no amido do referido grão, que têm um comprimento das cadeias no intervalo de 31 a 60 resíduos, ser superior a 5%.
18. Planta capaz de produzir um grão de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 17.
19. Amido de uma planta de cevada, caracterizada por o amido ter um conteúdo relativamente elevado de amilose, de pelo menos 50 % (massa/peso) , como o determinado por HPLC e no qual: a. a proporção de cadeias de amilopectina contidas no amido que têm um comprimento no intervalo entre 6 e 11 resíduos é de pelo menos 30%, e b. a proporção de cadeias de amilopectina contidas no amido que têm um comprimento no intervalo entre 12 e 30 resíduos é inferior a 65 %, e 5/23 c. a proporção de cadeias de amilopectina contidas no amido que têm um comprimento no intervalo entre 31 e 60 residuos é inferior a 10 %.
20. Amido de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por a. a proporção de cadeias de amilopectina contidas no amido que têm um comprimento no intervalo entre 6 e 11 residuos é de pelo menos 35%, e b. a proporção de cadeias de amilopectina contidas no amido que têm um comprimento no intervalo entre 12 e 30 residuos é inferior a 60%, e c. a proporção de cadeias de amilopectina contidas no amido que têm um comprimento no intervalo entre 31 e 60 residuos é inferior a 8%.
21. Amido de acordo com as reivindicações 19 ou 20, contendo lipidos associados a amido, caracterizado por o amido com os lipidos associados exibir a forma cristalina de complexo V, caracterizado por a forma cristalina V representar pelo menos 10 % do amido cristalino.
22. Amido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizado por o referido grão ser esmagado, moido, partido, descascado ou rolado.
23. Produto alimentar ou suplemento alimentar contendo amido, de acordo com a reivindicação 19, 20 ou 21 ou um grão de cereal de acordo com a reivindicação 22. 6/23
24. Produto alimentar ou suplemento alimentar de acord com a reivindicação 23 caracterizado por o referido produto ou suplemento alimentar ser escolhido de entre o grupo constituído por farinha, pães, bolos, biscoitos, espessantes, bebidas de malte, bebidas de cevada, massas, sopas de massa ou instantâneas.
25. Uso de amido de acordo com a reivindicação 19, 20 ou 21 ou de um grão de cereal de acordo com a reivindicação 22 para a preparação de um produto alimentar.
26. Uso de uma planta de cevada contendo um gene SSII mutado, de forma a que a atividade SSII codificada pelo gene mutado referido ser abolida e a que o conteúdo total de amido do grão obtido a partir da planta referida tenha um conteúdo relativo de amilose de pelo menos 50 % (massa/peso) como determinado por HPLC, e a que a. a proporção de cadeias de amilopectina contidas no amido que têm um comprimento no intervalo entre 6 e 11 resíduos é de pelo menos 30%, e b. a proporção de cadeias de amilopectina contidas no amido que têm um comprimento no intervalo entre 12 e 30 resíduos é inferior a 65%, e c. a proporção de cadeias de amilopectina contidas no amido que têm um comprimento no intervalo entre 31 e 60 resíduos é inferior a 10 %. Para produzir um grão de cevada, em que o conteúdo de amido total do grão referido, inclui um conteúdo relativo de amilose superior a 50 % (massa/peso) determinado por HPLC. 7/23
27. Uso de uma construção de ADN para reduzir a expressão do gene SSII numa planta de cevada, de forma a que o amido obtido do grão da referida panta tenha um conteúdo relativo de amilose superior a 50% (massa/peso), determinado por HPLC e a que a. a proporção de cadeias de amilopectina contidas no amido que têm um comprimento no intervalo entre 6 e 11 resíduos é de pelo menos 30%, e b. a proporção de cadeias de amilopectina contidas no amido que têm um comprimento no intervalo entre 12 e 30 resíduos é inferior a 65%, e c. a proporção de cadeias de amilopectina contidas no amido que têm um comprimento no intervalo entre 31 e 60 resíduos é inferior a 10%, caracterizado por a referida construção de ADN conter uma sequência que codifica a. uma molécula de ARN antisense, capaz de interferir com a transcrição ou processamento da enzima SSII, ou b. uma ribozima, ou c. uma cópia adicional, na mesma orientação, do gene que codifica a enzima SSII, ou d. uma molécula de ARN de dupla cadeia, ou e. uma construção em alfinete desenhada para produzir uma molécula de ARN de dupla cadeia, capaz de suprimir a atividade endógena de SSII. 8/23
28. Uso de a. uma molécula de ARN antisense, capaz de interferir com a transcrição ou processamento da enzima SSII, ou b. uma ribozima, ou c. uma cópia adicional, na mesma orientação, do gene que codifica a enzima SSII, ou d. uma molécula de ARN de dupla cadeia, ou e. uma construção em alfinete desenhada para produzir uma molécula de ARN de dupla cadeia, capaz de suprimir a atividade endógena de SSII, para reduzir a expressão do gene de SSII numa planta de cevada, de forma a que o amido do grão obtido a partir da referida planta tenha um conteúdo relativo de amilose superior a 50 % (massa/peso) determinado por HPLC, e a que a. a proporção de cadeias de amilopectina contidas no amido que têm um comprimento no intervalo entre 6 e 11 resíduos é de pelo menos 30%, e b. a proporção de cadeias de amilopectina contidas no amido que têm um comprimento no intervalo entre 12 e 30 resíduos é inferior a 65%, e c. a proporção de cadeias de amilopectina contidas no amido que têm um comprimento no intervalo entre 31 e 60 resíduos é inferior a 10%. Lisboa, 30 de Março de 2012
PT01983291T 2000-11-09 2001-11-09 Cevada com reduzida atividade ssii e produtos contendo amido com um conteúdo de amilopectina reduzido PT1331845E (pt)

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