WO2006112034A1 - 形質転換アイスプラントの作出方法 - Google Patents

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WO2006112034A1
WO2006112034A1 PCT/JP2005/007670 JP2005007670W WO2006112034A1 WO 2006112034 A1 WO2006112034 A1 WO 2006112034A1 JP 2005007670 W JP2005007670 W JP 2005007670W WO 2006112034 A1 WO2006112034 A1 WO 2006112034A1
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plant
medium
culture
ice plant
ice
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PCT/JP2005/007670
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English (en)
French (fr)
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Sakae Agarie
Akihiro Nose
Toyoaki Anai
Haruki Sunagawa
Makiko Umemoto
Original Assignee
Saga University
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Priority to PCT/JP2005/007670 priority patent/WO2006112034A1/ja
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
    • C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
    • C12N15/8205—Agrobacterium mediated transformation

Definitions

  • the present invention relates to an ice plant transformation method, an ice plant transformant production method, and a transformed ice plant.
  • a halophyte is a special plant with high salt tolerance that can grow under conditions that absorb aqueous NaCl solution of UOOmM, which cannot be grown by normal plants. Ice plant, metals such as Cd and Cu, and high ability to absorb inorganic salts such as NaCl, for example, for the NaCl, is said to as possible out to approximately 15g absorbed per animal, which lm 2 This corresponds to a surprising amount of absorption of 200g per lha and 2t per lha.
  • transformation will be essential in the functional analysis of various genes and the creation of improved individuals based on the determined nucleotide sequences. Become. For such purposes, it is extremely important to be able to transform quickly and efficiently.
  • plant transformation methods include direct methods such as particle gun method, electro-boration method, and polyethylene glycol (PEG) method, and microorganisms belonging to the genus Agrobacterium (hereinafter referred to as “Agrobacterium”). Sometimes referred to as “bacteria.”) Indirect methods such as gene transfer using bacteria are known.
  • the problem to be solved by the present invention is to provide a method for transforming an ice plant by a gene introduction method using a microorganism belonging to the genus Agrobacterium, and a method for producing a transformed ice plant, and Is to provide a unique transformed ice plant.
  • the present inventor has intensively studied to solve the above problems. As a result, it was discovered that the redifferentiation activity of a specific tissue in an ice plant is extremely high compared to other tissues or callus, and this specific tissue can be used as an infection target for microorganisms belonging to the genus Agrobacterium. The present inventors have found that an ice plant can be easily transformed, and that a transformed ice plant can be easily produced.
  • the present invention is as follows.
  • a method for transforming an ice plant comprising a step of transforming a cotyledon node of an ice plant with a microorganism belonging to the genus Agrobacterium which contains a desired gene.
  • the cotyledonary node may be, for example, a juvenile cotyledonary node, and the juvenile may be, for example, 4 to 10 days after seeding.
  • examples of the plant hormone include, And at least one selected from the group consisting of (TDZ), forkulofenuron (CPPU), benzyladenine (BA), and naphthenene-1-acetic acid (NAA).
  • concentration (total concentration) of the above-mentioned plant hormones can be, for example, 0.:! To 10 mg / L.
  • concentration of the above-mentioned tizazuron is, for example, 0.:! Can be ⁇ 5mg / L.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of the procedure of a method for producing a transformant of an ice plant using agrobacterium in Example 1.
  • FIG. 2 is a photograph showing the results of electrophoresis of PCR products in Example 1.
  • Lane 1 shows the case where chromosomal DNA extracted from the transformant was used as a cocoon
  • lane 2 shows PCR using chromosomal DNA extracted from the non-transformant as a cocoon.
  • Lane M is one DNA size marker.
  • FIG. 3 is a graph showing the results of examining the effect of the plant hormone composition in the preculture medium on the transformation efficiency (survival rate, shoot differentiation rate) of ice plan koji in Example 2.
  • the present invention relates to a method for transforming an ice plant and a method for producing a transformant of an ice plant.
  • the present invention makes it possible for the first time in the present invention to produce a stable transformant plant. Is the method. Until now, ice plant transformants have not been obtained. The reason is that regeneration from tissues infected with Ryu bacteria has not been efficiently and reliably performed.
  • the material such as the tissue to be infected
  • the material used for transformation with the bacteria of the genus Agropathacterum varies, and some of them have planted or damaged growth points like the model plant Arabidopsis thaliana.
  • infect There is a special case to infect.
  • a cultured tissue that is in the dedifferentiation process or has been dedifferentiated is often used as the material.
  • a period of 3 to 4 weeks for dedifferentiation induction is usually required to prepare the tissue before infection, and after infection, it is further necessary to redifferentiate into a complete individual. Since it takes several weeks, it is not quick.
  • the inventor of the present invention repeated experiments and examinations as to whether there are any various tissues and organs (roots, stems, leaves, etc.) of the ice plant that are particularly excellent in the ability to differentiate into individuals.
  • the re-differentiation activity of a specific tissue for example, cotyledonary node, preferably juvenile cotyledonary node
  • a transformant of an ice plant can be easily obtained. I found out that I can.
  • the present invention has been completed based on such findings.
  • the present inventor further increases the redifferentiation activity of the tissue by culturing the specific tissue (at least after culturing after infection) in the presence of a specific plant hormone (ie, tizazuron). It was also found that a transformant of ice plan cocoon can be obtained efficiently.
  • a specific plant hormone ie, tizazuron
  • the ice plant transformation method of the present invention comprises a step of transforming a cotyledonary node of a plant with a microorganism belonging to the genus Agropathacterium (Agrobacterium genus bacteria) containing a desired gene. Specifically, it is characterized by infecting the cotyledonary node of the obtained ice plant with an Agrobacterium having the desired gene, and then culturing the cotyledonary node in the presence of the bacterium (microorganism). .
  • a cotyledon is a part where two cotyledons of a dicotyledonous plant (including an ice plant) are joined together, and is a part including the growth point of a new leaf.
  • a medium for germination a known medium can be used, and is not limited.
  • filter paper moistened with water can be preferably used.
  • the culture vessel may be any known one, and is not limited.
  • a glass or plastic petri dish or the like can be used, and the same applies to any of the culture steps described later.
  • the cotyledon node used in the transformation method of the present invention is not limited, but is preferably a cotyledon node of an ice plant juvenile. Specifically, it is preferably 4 to: L0 days after seeding the ice plant, more preferably 5 to 7 days later. A juvenile satisfying the above range is preferable in that a cotyledon node having higher redifferentiation activity can be obtained.
  • the method for obtaining the cotyledonary nodes is not limited, but when the ice plant shoots are deployed, the tweezers are observed with a microscope in a petri dish such as glass. It is preferable that the cotyledon part is excised using a scalpel or the like (preferably, one cotyledon is excised in a state including the cotyledon part).
  • the number of acquired cotyledonary nodes (the number used in the next preculture step) is not limited, but is preferably 20 to 100, and more preferably 40 to 50. An obtained number that satisfies the above range is preferable in that it can be cultured at an appropriate interval between the cotyledon nodes in the petri dish in the next step.
  • the purpose of the pre-culture step is to culture the cotyledon nodes obtained as described above (specifically, cotyledons containing cotyledon nodes) so that they become suitable culture tissues that can be used in the next infection step.
  • the obtained cotyledon nodes are cultured until they become small shoots.
  • a medium used for the preculture a known medium can be used, and is not limited.
  • a medium for example, MS agar medium
  • a medium used for seeding is preferably used.
  • the medium preferably contains a plant hormone, specifically, from the group consisting of thidazuron (TDZ), forucoru fenuron (CPPU), benzyladenine (BA), and naphthalene-1-acetic acid (NAA). It preferably contains at least one selected, more preferably contains thidiazuron, and particularly preferably contains thidiazuron and naphthalene-1-acetic acid. Inclusion of these plant hormones, particularly tiaziron, increases the number of shoot fractionation, maintains the shoot integrity, and as a result promotes redifferentiation.
  • TDZ thidazuron
  • CPPU forucoru fenuron
  • BA benzyladenine
  • NAA naphthalene-1-acetic acid
  • the concentration of the plant hormones is preferably 0.1 to: I0 mg / L, more preferably 0.5 to: L0 mg / L, still more preferably 1 to 10 mg / L, particularly preferably relative to the whole medium. Is 1-6 mg / L. Especially for TDZ, the concentration is 0.:! It is preferably ⁇ 5 mg / L, more preferably 0.5 to 5 mg / L, still more preferably 1 to 5 mg / L, and particularly preferably 2.5 to 5 mg / L.
  • the concentration of CPPU is preferably 0.1 to 5.0 mg / L based on the whole medium.
  • the concentration of BA is preferably 0.1 to 20 mg / L, more preferably 1.0 to the entire medium.
  • the concentration of NAA is preferably 0.1-:! Omg / L, more preferably 0.1-5 mg / L, relative to the whole medium. More preferably, it is 0.1 to: lmg / L.
  • Pre-culture is preferably performed under light irradiation conditions.
  • the brightness is not limited, but it is sufficient that the light is strong enough for the plant to grow healthy.
  • it is preferably 50 to 100 mol • in ⁇ 2 ⁇ si.
  • the culture temperature in the preculture is, for example, preferably 20 to 33, more preferably 25 to 30 ° C.
  • the period required for the pre-culture is, for example, preferably 1 to 10 days, more preferably 3 to 5 days, but is not limited, and a stage where a cultured tissue that can be used for the next infection process is obtained.
  • the culture can be appropriately terminated at any later stage (usually 3 days).
  • the cultured tissue obtained in the pre-culture process (specifically, the cells of the cultured tissue) is infected with a microorganism belonging to the genus Agrobacterium that contains the desired gene (Agrobacterium bacterium).
  • Agrobacterium bacterium a microorganism belonging to the genus Agrobacterium that contains the desired gene
  • a Ti plasmid or a Ri plasmid which has been conventionally used for transformation of dicotyledonous plants, is preferably mentioned.
  • Agrobacterium tumefaciens More envy than power.
  • rlyum bacteria have a plasmid vector containing the vir region (or DNA derived from it) of Ti plasmid derived from agrobacterium, umefafaciens, and the traits to be given to plants.
  • the desired gene (transforming gene) responsible for is inserted into this vector or is present in a plasmid vector other than this vector ( ⁇ PBR322 etc.) Can be inserted in vivo. Therefore, in the present invention, an attempt is made to introduce it into the genome of a cultured tissue cell.
  • the desired gene is inserted (arranged) between the boundary sequences of the T region in the same manner as before.
  • the desired gene may be inserted into Ti plasmid in a bacterium belonging to the genus Agrobacterium, or may be inserted into another plasmid, and is not limited.
  • insertion of a desired gene into various plasmids can be performed by appropriately adopting a gene recombination technique known to those skilled in the art based on information such as the GenBank accession number (for example, Molecular cloning 2nd ed., Sambrook, J., et al "Cold Spring Harbor Laboratory Press USA, 1989).
  • the “desired gene” means a DNA that encodes a desired protein to be expressed in an ice plant cell, and a DNA that includes DNA necessary for transcription, translation, etc. of the DNA.
  • a “desired gene” is a specific antibiotic that is used to easily select a transformant and a non-transformant in a selective culture step in the production method of the present invention described later.
  • selectable marker gene to resistant Te e.g., Hy g r, and Kmr etc.
  • Plasmids into agrobacterium can be carried out by a method using a conventionally known gene recombination technique.
  • a bacterial three-way hybridization method (Ditta, G. et al., Pro Natl. Acad. Sci. USA, vol. 77, p.7347-7351 (1980)).
  • the culture of agrobacterium used in the infection process can be performed by a conventionally known culture method, and is not limited to, for example, a stock of the bacterium (for example, glycerol stock (-80 ° C)). It is preferable to remove the cells with a sterilized platinum loop etc., apply to a suitable medium (for example, AB medium), and incubate in a place (for example, at 28 ° C for 3 days).
  • a suitable medium for example, AB medium
  • Methods for infecting cotyledonary nodes with Agrobacterium are not limited. For example, (i) Incubating cultured Agrobacterium with TDZ, Acetosylingon, and MS medium inorganic salts Suspend in a liquid medium for infection treatment containing A method of immersing the cotyledon node after pre-culture in the suspension and sonicating (sonication treatment), (ii) a method of performing vacuum infiltration treatment instead of sonication in the method of (i) above, (Iii) In the method of (i) or (ii) above, a method of adding a surfactant to a liquid medium for infection treatment without sonication or vacuum infiltration treatment and immersing in this medium for a certain period of time, And (iv) In the above method (i) or (ii), a method of immersing in a liquid medium for infection treatment (without addition of a surfactant) for a certain period of time without performing ultrasonic treatment or vacuum soaking treatment, etc
  • the ultrasonic irradiation time is not limited, but is preferably 0.2 to 60 seconds, more preferably 2 seconds.
  • the immersion time is not limited, but is preferably 5 to 20 minutes, and more preferably 5 to 6 minutes.
  • the adhesion amount of agrobacterium is an appropriate amount.
  • the purpose of the co-cultivation process is to cultivate the cotyledon nodes after the infection process in the presence of agrobacterium.
  • a desired gene foreign gene
  • a desired gene can be incorporated into the genome of a cell of a cotyledon node as a cultured tissue, that is, an ice plant can be transformed.
  • the suspension after the infection step is first poured onto a sterilized filter paper that has been dried together with the cotyledon nodes, and then only the cotyledon nodes are transferred onto a new sterile filter paper. It is preferable to remove excess microbial cells from water.
  • a known medium can be used, and is not limited.
  • a medium obtained by adding acetosyringone to the medium (MS agar medium, etc.) used in the pre-culture process or the above medium
  • an agar medium containing only acetosyringone and water is preferred.
  • Co-cultivation may be performed under light irradiation conditions or in the dark. Although it is not determined, when it is carried out under light irradiation conditions, for example, photosynthesis can be performed, so that the cotyledon node is kept healthy, and the damage caused by agrobacterium infection is suppressed. Therefore, it is preferable.
  • the light irradiation conditions at the time of co-cultivation are not limited, but are preferably 50 to 200 / mol′m ⁇ 2′s ⁇ 1 , more preferably, in terms of obtaining the above effect more effectively. 50 ⁇ 70 ⁇ ' ⁇ ⁇ ⁇ 1 .
  • the culture temperature in the co-culture is, for example, preferably 18 to 33 C, and more preferably 25 to 30 ° C.
  • the period required for co-cultivation is, for example, preferably 3 to 10 days, more preferably 3 to 5 days, but is not limited, for example, a slight enlargement of cotyledonal tissue is observed.
  • the culture can be appropriately terminated at the stage or any later stage (usually 3 to 7 days).
  • transformation method of the present invention for example, by performing ultrasonic treatment on a cultured tissue (cotyledonal node) that has been pre-cultured for 3 days, Infection with Mus genus bacteria, and then co-cultivation is carried out for 3 days under light irradiation using a medium containing only aceticillingon and water, and many transformants can be obtained.
  • the method for producing a transformed ice plant of the present invention is a method characterized in that cotyledon nodes obtained by the above-described transformation method of the present invention are grown in the presence of a plant hormone. That is, the method of the present invention is also a method for producing a transformed ice plan cake.
  • an embodiment of the production method of the present invention will be illustrated and explained step by step for each step. However, the method is not limited to only those steps, and technical common sense and creative ability of those skilled in the art. In addition, other steps may be included within the range.
  • the cotyledon node obtained by the transformation method of the present invention described above is used.
  • the purpose is to selectively obtain cotyledonary nodes after transformation by culturing in a medium containing an appropriate antibiotic and eradicating the coexisting bacteria of the genus Agrobacterium.
  • a known medium can be used, and is not limited.
  • a medium (MS agar medium, etc.) used in the preculture step is preferably exemplified.
  • Antibiotics contained in the medium have the effect of inhibiting the growth and / or growth of agrobacterium used for transformation, but do not substantially adversely affect the growth of cotyledons in ice plants Specifically, for example, calpenicillin, vancomycin, clarforan, and orderbenin are preferable, and among them, calpenicillin and vancomycin are more preferable.
  • the use concentration of various antibiotics is not limited, and can be set as appropriate within a known effective concentration range.
  • the medium contains at least one selected from the group consisting of, for example, thidazuron (TDZ), forkulophene fenuron (CPPU), benzyladenine (BA), and naphthalene-1-acetic acid (NAA) as a plant hormone. It is preferable to contain it, and thizazuron is more preferable.
  • TDZ thidazuron
  • CPPU forkulophene fenuron
  • BA benzyladenine
  • NAA naphthalene-1-acetic acid
  • the concentration (total concentration) of the plant hormone is preferably, for example, 0.1 to 10 mg / L, more preferably 0.5 to 10 mg / L, more preferably 1 to 10 mg, based on the whole medium. / L, particularly preferably 1 to 6 mg / L.
  • the concentration is preferably 0.:! To 5 mg / L, more preferably 0.5 to 5 mg / L, still more preferably 1 to 5 mg / L, based on the whole medium. Particularly preferred is 2.5 to 5 mg / L.
  • the CPPU concentration is 0.:! -5.0 mg / L, more preferably 1.0-5.0 mg / L, even more preferably 2.5-5 mg / L.
  • the concentration of BA is 0.1-20 mg / L with respect to the whole medium. It is preferable that 1.0 to 10 mg / L, more preferably 1.0 to 5 mg / L, and the concentration of NAA is preferably 0.1 to 10 mg / L with respect to the whole medium. More preferably, 0.1 to 5 mg / L, still more preferably 0 :! ⁇ Lmg / L.
  • the concentration of plant hormones used in the sterilization culture process especially the concentration of thizazuron
  • concentration of thizazuron By setting the degree within the above range, it is possible to suppress the development of a tissue having a distorted form, so that the growth of the plant body is maintained well, and as a result, the sterilization can be performed efficiently. Can be obtained.
  • the culture temperature in the sterilization culture is, for example, preferably 20 to 33 ° C, and more preferably 20 to 25 ° C.
  • the period required for sterilization culture is, for example, preferably 2 to 7 days, and more preferably 3 to 5 days, but is not limited, for example, on a medium in contact with a cotyledon node or a plant
  • the culture can be appropriately terminated at the stage where no growth of agrobacterium is observed on the body, or at any stage thereafter (usually 3-5 days).
  • the transformed cotyledon node obtained in the sterilization culture process is further cultured in a medium containing an appropriate antibiotic, and a desired gene (a predetermined antibiotic as a selection marker) is cultured.
  • a desired gene a predetermined antibiotic as a selection marker
  • the purpose is to selectively obtain (transformants) that have been transformed by introduction of (including resistance genes).
  • a medium used for selective culture a known medium can be used, and is not limited.
  • a medium (MS agar medium, etc.) used in the pre-culture step is preferably exemplified.
  • examples of the antibiotic corresponding to the above selection marker include hygromycin and kanamycin. Among them, hygromycin is preferable, and other antibiotics are excluded.
  • Antibiotics used in culturing the bacteria can be preferably used in combination.
  • the use concentration of various antibiotics is not limited, and can be set as appropriate within a known effective concentration range.
  • the medium contains at least one selected from the group consisting of, for example, thidazuron (TDZ), forkulophene fenuron (CPPU), benzyladenine (BA), and naphthalene-1-acetic acid (NAA) as a plant hormone. It is preferable to contain it, and thizazuron is more preferable.
  • TDZ thidazuron
  • CPPU forkulophene fenuron
  • BA benzyladenine
  • NAA naphthalene-1-acetic acid
  • the concentration of the plant hormones is, for example, 0.1 ⁇ : LOmg / L, preferably 0.5 ⁇ : 10nxg / L, more preferably 1 ⁇ : LOmg / L, particularly preferably l-6mg / L.
  • the concentration is 0.:! ⁇ 5 mg / L, preferably 0.5-5 mg / L, more preferably:! ⁇ 5 mg / L, particularly preferably 2.5 to 5 mg / L.
  • the CPPU concentration is 0.:! -5.0 mg / L, preferably 1.0-5.011 ⁇ /, more preferably 2.5-5 mg / L, and the concentration of BA is 0.:!-20 mg / L with respect to the whole medium.
  • L preferably 1.0 to: I0 mg / L, more preferably 1.0 to 5 mg / L, and the concentration of NAA should be 0.1 to 10 mg / L with respect to the whole medium.
  • concentration of NAA should be 0.1 to 10 mg / L with respect to the whole medium.
  • the concentration of plant hormones used in the selective culturing process particularly the concentration of thizazuron
  • the concentration of plant hormones used in the selective culturing process particularly the concentration of thizazuron
  • the concentration of plant hormones used in the selective culturing process particularly the concentration of thizazuron
  • the selective culture may be performed under light irradiation conditions or under certain conditions, and is not limited. However, when it is performed under light irradiation conditions, for example, photosynthesis can be performed. This is preferable because an effect of obtaining a healthy plant body having high resistance to pacterium is obtained.
  • the light irradiation conditions during selective culture are not limited, but are preferably 50 to 200 mol'm-2's- 1 and more preferably SO in terms of obtaining the above effect more effectively. TO nioI 'm- s- 1 .
  • the culture temperature in the selective culture is, for example, preferably 20 to 33 ° C, more preferably 20 to 25 ° C.
  • the period required for selective culture is, for example, preferably 3-6 weeks, more preferably 4-5 weeks, but is not limited, for example, the distinction between live and dead individuals becomes clear, etc.
  • the culture can be appropriately terminated at the stage where this condition is observed or at any stage thereafter (usually 3 to 4 weeks).
  • the cotyledon nodes obtained in the selective culture process are further cultured.
  • the purpose of this study is to promote the formation of various organs and tissues such as adventitious bud induction and rooting by utilizing redifferentiation activity, and to obtain a transformed ice plant as a stable complete individual (young or adult).
  • a known medium can be used for both adventitious bud formation and rooting. Although it is not limited, for example, it was used in the preculture step.
  • a medium MS agar medium, etc. is preferred.
  • the culture is preferably carried out aseptically without using antibiotics, but is not limited, and appropriately using various antibiotics such as hygromycin and kanamycin at known effective concentrations. Also good.
  • plant hormones such as thidazuron (TDZ), forkulophaneuron (CPPU), benzyladenine (BA), and naphthalene-1-acetic acid (NAA)
  • Tizazuron thidazuron
  • CPPU forkulophaneuron
  • BA benzyladenine
  • NAA naphthalene-1-acetic acid
  • concentration of the plant hormone is, for example, preferably 0.1 to 10 mg / L, more preferably 0.5 to 10 mg / L, and even more preferably 1 to 10 mg / L, based on the whole medium. Particularly preferred is 1 to 6 mg / L.
  • the concentration is preferably 0.1 to 5 mg / L, more preferably 0.5 to 5 mg / L, still more preferably 1 to 5 mg / L, and particularly preferably. 2.5 to 5 mg / L.
  • the concentration of CPPU is preferably 0.1 to 5.0 mg / L with respect to the whole medium, more preferably 1.0 to 5.0111 / more preferably 2.5 to 5 mg / L, and the concentration of BA is The total amount of the medium is preferably 0.:! To 20 mg / L, more preferably 1.0 to 10 mg / L, and still more preferably 1.0 to 5 mg / L.
  • the concentration of NAA is The total amount of the medium is preferably 0.1 to: I0 mg / L, more preferably 0.1 to 5 mg / L, and still more preferably 0.1 to 1 mg / L.
  • the concentration of plant hormones used in the redifferentiation process, especially thizazuron within the above range, the cells can rapidly divide, and the number of distorted tissues can be suppressed to a low level. It is possible to obtain effects such as a large number of In general, these plant hormones are not added to the rooting medium, but are not limited thereto.
  • Culture for redifferentiation may be performed under either light irradiation conditions or under drought conditions for both adventitious bud formation and rooting, but is not limited, but is performed under light irradiation conditions.
  • the light irradiation conditions at the time of the cultivation are not limited, but are preferably 50 to 200 i mo rn ⁇ 's- 1 , for example, more preferably from the viewpoint that the above effect can be obtained more effectively.
  • the culture temperature in the culture for redifferentiation is, for example, preferably 20 to 33 ° C, more preferably 25 to 30 ° C.
  • the period required for culture for adventitious bud formation is 10 to: 3 to 8 weeks after the operation of subculture to a new medium every 14 days is repeated 2-3 times (that is, after transplantation to the regeneration medium) It is preferable that there is no limitation on the force, which is more preferably 3 to 4 weeks. For example, a state in which a bladder cell found in an individual under normal conditions is formed on the surface of a newly formed tissue is observed.
  • the culture can be terminated as appropriate at any given stage or any subsequent stage (usually 4 to 5 weeks) and transferred to a rooting culture system.
  • the period required for culturing for rooting is 10 to: 2 to 5 weeks after repeating the operation of subculture to a new medium every L4 days 2-3 times (ie after transplantation of rooting medium) More preferably, it is 2 to 3 weeks, but is not limited, for example, a stage where a root of about 1 cm is rooted or any stage after that ( Usually, the culture can be completed in 2 to 3 weeks.
  • the transformed ice plant can be transferred to a conditioned medium (conditioned medium) and cultured (so-called conditioned culture) to grow as a stable transformant. preferable.
  • a known medium can be used, and is not limited.
  • a sterilized bamyquilite, or a fluorite 552 (Nisshinbo Co., Ltd.) containing MS inorganic salts is preferable. It is done.
  • conditioned culture it is generally not necessary to actively add antibiotics and plant hormones to the medium, but there is no limitation, and they may be added as needed.
  • conditioned culture is preferably performed under light irradiation conditions, and the light irradiation amount may be set appropriately.
  • the culture temperature in the conditioned culture is not limited, and is preferably 20 to 33 ° C, and more preferably 20 to 25 ° C, for example.
  • the period required for the conditioned culture is not limited, and is preferably, for example, 10 days to 4 weeks, more preferably 10 days to 2 weeks.
  • the method of acclimation culture is not limited, but for example, is as follows. That is, adventitious shoots rooted during the redifferentiation process are transplanted to the conditioned medium described above. After rooting is promoted, individuals whose roots have grown are transplanted into a plastic box (for example, width 30crn x depth 50cm x height 15cm) containing vermiculite with sterilized water. Cover this with a Saran wrap, etc. and place under the light conditions and temperature conditions described above. Open a hole in the lid after an appropriate period of time has elapsed since transplantation (eg, 2 days after transplantation), and remove the lid after an appropriate period of time (eg, 4 days after transplantation).
  • a plastic box for example, width 30crn x depth 50cm x height 15cm
  • the desired gene foreign gene
  • PCR is performed using appropriate primers corresponding to the introduced desired gene sequence or a partial region thereof, and the amplified fragment is obtained by electrophoresis or the like.
  • B Using the DNA fragment of the transgene as a probe, chromosomal DNA isolated from the transformant was digested with an appropriate restriction enzyme and hybridized with that immobilized on the membrane. It can be confirmed by a method for confirming the presence or absence (dienomits-xazan blotting method) or the like. Any of the above confirmation methods can be carried out by appropriately adopting means and conditions known to those skilled in the art.
  • the transformed ice plant of the present invention is a transformant of an ice plant in which a desired gene (foreign gene) is integrated in the genome.
  • the method for producing the transformed ice plant of the present invention may be any method as long as it is a method for obtaining a transformant in which a desired foreign gene is incorporated into the genome of the ice plant, but is not limited thereto.
  • the production method of the present invention described above can be preferably applied. Therefore, it can be said that the transformed ice plant of the present invention is obtained by the production method of the present invention described above.
  • the present invention transforms Ais spplanant is a stable and stable material.
  • the functional analysis of the functional gene of the Ais spp. In relation to the improvement and production of good species, etc. of Ispspranrantto, it is extremely high in usefulness. .
  • the present invention will be explained more concretely by giving examples of practical implementation examples, but the present invention is These are not limited to these, but they are not. .
  • the cotyledonary node of the ice plant is transformed with an Agrobacterium containing the desired gene (force namycin resistance gene (Kmr: npt II))
  • Kmr force namycin resistance gene
  • MS agar medium Stew ice plant seeds with 2% hypochlorous acid for 10 minutes, 3% sucrose and 0.8% Aseptically seeded on MS agar medium supplemented with% agar. Seven days after sowing, the cotyledons were excised at the time of germination development of the germinated shoots. 50 cotyledon nodes were obtained.
  • MS agar medium the following composition was used (the same applies hereinafter).
  • Nitrate power 1900mg / L
  • Lithium iodide 0.83mg / L
  • Nicotinic acid 0.01mg / L
  • the obtained cotyledonary nodes were placed on an MS agar medium containing tizazuron (TDZ; 2.5 mg / L) and cultured for 3 days.
  • TDZ tizazuron
  • the EHA101 strain has a kanamycin resistance gene (Kmr), a hygromycin resistance gene (Hyg), and a binary vector (pBI) linked to an EGFP fluorescent protein expression gene as an agrobacterium used to infect cotyledonary nodes.
  • Kmr kanamycin resistance gene
  • Hyg hygromycin resistance gene
  • pBI binary vector linked to an EGFP fluorescent protein expression gene as an agrobacterium used to infect cotyledonary nodes.
  • agrobacterium was transformed according to the freeze-thaw method, that is, the above-described vector lg (2 to 10 L) was transformed into 1.5 mL of Eppendorfchu. -Added to the frozen agro-actuary combination cell in the box. The tube was capped and incubated in a 37 ° C water bath for 5 minutes. The tube was then transferred to ice and cooled for 1 minute.
  • YEP medium containing 50 ig / mL kanamycin 1 mL of YEP medium containing 50 ig / mL kanamycin was added and cultured at 26 ° C for 2 hours. The cells were collected by centrifugation (7500 rpm) for 30 seconds at room temperature. Thereafter, YEP medium lOO i L containing 50 g / mL kanamycin was added to dissolve the cells, and the whole amount was applied to a YEP solid medium containing kanamachine and hygromycin at a concentration of 50 g / mL. The cells were spread over the entire medium and cultured at 26 ° C for 48 to 72 hours until a single mouth was formed.
  • a single colony of transformed agrobacterium was inoculated into 5 mL of YEP medium and cultured with shaking at 28 ° C for 1 mm. 1 mL of this culture solution and 1 mL of a sterilized 50% glycerol aqueous solution were mixed, frozen and stored at -80 ° C. This stock was streaked on a YEP agar medium with white fungus ears and cultured at 25 ° C for 2 days under drought. Thereafter, colonies were suspended in 30 mL of the treatment solution used for ultrasonic treatment, and the turbidity at a wavelength of 600 nm was adjusted to 0.2.
  • Agrobacterium is suspended in a liquid medium for infection treatment containing TDZ (2.5 mg / L), acetosyringone (10 mg / L), and inorganic salts for MS medium (Nippon Pharmaceutical Co., Ltd., 4.6 g / L). The turbidity at 600 nm was adjusted to 0.2.
  • TDZ 2.5 mg / L
  • acetosyringone 10 mg / L
  • MS medium MS medium
  • agar (agar: 8 g / L) was used to culture under light irradiation condition of about 60 ⁇ 1 ⁇ ⁇ ⁇ 2 ⁇ 8 ⁇ ⁇ 3 days.
  • MS agar containing TDZ (2.5 mg / L), Cb (100 mg / L), Vm (300 mg / L), and hygromycin (Hyg; 20 mg / L) after sterilization culture The cells were transferred to a medium, subcultured about once every two weeks, and cultured for a total of four weeks.
  • the rooted adventitious buds were transplanted into sterilized bamquilite (or Florite 552 (Nisshinbo Co., Ltd.) containing sterilized water), and gradually dried and acclimated to strong light.
  • Chromosomal DNA of the obtained transformed ice plant was extracted by the CTAB method. Using this chromosomal DNA as a saddle and using the following primer based on the nucleotide sequence of the Kmr gene (npt II), the presence or absence of the gene (npt ll) introduced by the bacterium belonging to the genus Agrobacterium was determined by PCR, The PCR product was confirmed by agarose gel electrophoresis. Figure 2 shows the results of this electrophoresis (photo).
  • Figure 2 shows that when the chromosomal DNA extracted from the transformant was used in PCR, PCR product bands indicating the presence of the transgene (npt II) were detected (lane 1). The band was not detected in the transformant (lane 2), confirming that the gene of interest was introduced into the transformant.
  • the medium to be used was changed from MS agar medium containing thiazuron (TDZ; 2.5 mg / L) to thidazuron (TDZ; 5 mg / L) and naphthalene-1-acetic acid (
  • An ice plant transformant was produced in the same manner as in Example 1 except that it was changed to MS agar medium containing two plant hormones (NAA; O.lmg / L).
  • Example 1 For the number of cotyledonary nodes used for transformation (for 50 individuals), the survival rate after transformation (%;) and shoot differentiation rate (%) were as in Example 1 (2.5 mg / L TDZ). Comparison was made in the case of Example 2 (5 mg / L TDZ, O.lmg / L NAA). The results are shown in Figure 3 (graph).
  • the present invention it is possible to provide a method for transforming an ice plant by a gene introduction method using a microorganism belonging to the genus Agropathacterium, and a method for producing a transformed ice plant, which has been impossible in the past.

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Abstract

本発明は、アグロバクテリウム属に属する微生物を用いた遺伝子導入法によるアイスプラントの形質転換方法、及び形質転換アイスプラントの作出方法を提供する。また本発明は、安定な形質転換アイスプラントを提供する。

Description

形質転換アイスプラントの作出方法
技術分野
本発明は、 アイスプラントの形質転換方法、 アイスプラントの形質転換体の 作出方法、 及び形質転換アイスプラントに関する。
背景技術 明 アイスプラント Mesembryanthem um crystallin urn L.)は、 ザクロソゥ科マ 書
ツバギク属に属する 1年生草本であり、 海水を含む土壌でも生育できる塩生植 物である。一般に、塩生植物とは、通常の植物では生育できなレ UOOmMの NaCl 水溶液を吸収させる条件下でも生育し得る、 耐塩性の高い特殊な植物を言う。 アイスプラントは、 Cd及び Cu等の金属、 並びに NaCl等の無機塩類を吸収する 能力が高く、 例えば、 NaClについては、 1個体当たり約 15g吸収することがで きると言われており、 これは lm2当たり 200g、 lha当たりでは 2tという驚くベ き吸収量に相当する。
現在、 世界の耕地面積の約 10 %において、 塩類の集積のために農耕が困難で あることが問題となっており、 我が国日本も同様の問題を抱えている。 特に佐 賀県においては、 約 65 %もの耕地がもともと干拓地であるという事情のため、 問題は深刻である。
ところで、 アイスプラン卜は、 塩、 強光、 又は乾燥等の一般に良好でないと される環境下におかれると、 その光合成様式を、 ダイズゃイネ等にみられる C3 型から、 サボテン等でみられる CAM型に変換する。 このため、 このような光合 成様式の変換メカニズムや、 前述した無機塩類等の耐性メカニズムを解明する ためのモデル植物として、 アイスプラントは多くの研究の対象となっている。 そこで、 近年、 イネゃシロイヌナズナ等の周知のモデル植物と同様に、 アイス プラントについても、そのゲノム DNAの全塩基配列を決定するための解析が行 われようとしている。 したがって、 今後、 決定された塩基配列をもとに種々の 遺伝子の機能解析や改良個体の作出等を行うに当たっては、 他のモデル植物の 場合と同様に、 アイスプラントにおいてもその形質転換が必須となる。 また、 このような目的のためには、 迅速かつ高効率に形質転換できることが極めて重 要となる。
一般に、 植物の形質転換法としては、 パーティクルガン法、 エレクトロボレ —シヨン法、 及びポリエチレングリコール (PEG)法などの直接的な方法と、 ァ グロパクテリゥム属に属する微生物 （以下 「ァグロパクテリゥム属細菌」 と言 うことがある。 ） 細菌を用いた遺伝子導入法などの間接的な方法とが知られて いる。 しかし、 パーティクルガン法においては、 （i) 遺伝子導入が表層細胞に 限られる、 （ii) 最終的な導入断片に組換えや欠失が起こりやすい、 （iii) 形質転 換体がキメラになりやすい、 （iv) 高価な機器が必要である、 （V) 微細な金属微 粒子の飛散のため人体への危険性がある等の問題があり、 エレクトロポレーシ ヨン法においては、 （i) DNA導入に際し細胞壁を通過させることが細菌ほど容 易ではないため、 導入効率の低下や細胞損傷等が不可避である、 （ii) プロトプ ラストを導入対象とするためプロトプラス卜からの個体再生系が確率されて いない植物種には適用できず、 利用頻度が極めて低い、 （iii) 長期の培養期間を 要するため、 変異率が高くなり目的の正常な形質転換体を得る確率が低下する 等の問題があり、 PEG法においては、 エレクトロボレ一シヨン法と同様の問題 (例えば、 導入効率の低下 （実際にはさらに低くなる） や細胞損傷等が不可避 であること） がある。 従って、 現時点では、 ァグロパクテリゥム属細菌を用い た遺伝子導入法が最も確実かつ有用であると考えられている。 この方法では、 ァグロパクテリゥム属細菌そのものを生物学的なベクタ一として、 それ自身の 持つ組換え配列 （T-DNA領域） 及び組換え酵素を利用することにより目的の DNA (組換え遺伝子等） を植物ゲノムに組み込むことができる。
ァグロパクテリゥム属細菌を用いた遺伝子導入法は、 現在までに、 様々な植 物種で確立されており、 安定な形質転換植物が数多く作出されている。
しかしながら、 アイスプラントに関しては、 ァグロパクテリゥム属細菌の感 染が可能であること （すなわち外来遺伝子の導入が可能であること） は、 根端 細胞や培養細胞に遺伝子を導入した例から示唆されるものの （Andolfatto et al., Physiol. Plant., vol.90, p.708-714 (1994)； Ishimaru, Plant Cell Tissue Organ Culture, vol.57, p.61-63 (1999)) 、 その後の再分化率が極めて低く ( Cushman et al., Plant Cell Rep., vol.19, p.459-463 (2000)) 、 安定な形質転換 体が得られるまでには至っていない。 発明の開示
そこで、 本発明が解決しょうとする課題は、 ァグロパクテリゥム属に属する 微生物を用いた遺伝子導入法によるアイスプラントの形質転換方法、 及び形質 転換アイスプラントの作出方法を提供すること、 並びに安定な形質転換アイス プラントを提供することにある。
本発明者は、 上記課題を解決するべく鋭意検討を行った。 その結果、 アイス プラントにおける特定の組織の再分化活性が、 他の組織又はカルスに比べ極め て高いことを発見し、 この特定の組織をァグロパクテリゥム属に属する微生物 の感染対象として用いれば、 アイスプラントを容易に形質転換でき、 また形質 転換アイスプラントを容易に作出できることを見出して、 本発明を完成するに 至った。
すなわち、 本発明は以下の通りである。
(1) アイスプラントの子葉節を、所望の遺伝子を含有するァグロパクテリゥム 属に属する微生物により形質転換する工程を含むことを特徴とする、 アイスプ ラントの形質転換方法。
上記形質転換方法においては、 上記子葉節は、 例えば、 幼体の子葉節であつ てもよく、 また当該幼体は、 例えば、 播種してから 4〜： 10日後のものであって もよい。
(2) 上記 (1)の形質転換方法により得られた子葉節を植物ホルモンの存在下で 生育させることを特徴とする、 形質転換アイスプラントの作出方法。
上記作出方法において、 上記植物ホルモンとしては、 例えば、 チジァズロン (TDZ) 、 ホルクロ口フエニュロン (CPPU) 、 ベンジルアデニン (BA) 、 及 びナフ夕レン- 1 -酢酸 （NAA) からなる群より選ばれる少なくとも 1種が挙げ られる。 また上記植物ホルモンの濃度 （合計濃度） は、 例えば、 0.：!〜 10mg/L とすることができ、 特に上記チジァズロンの濃度については、 例えば、 0.：！〜 5mg/Lとすることができる。
(3) 上記 (2)の作出方法により得られる形質転換アイスプラント。 図面の簡単な説明
図 1は、 実施例 1における、 ァグロパクテリゥムを用いたアイスプラントの形 質転換体の作出方法の手順の概略図である。
図 2は、 実施例 1における、 PCR産物の電気泳動の結果を示す写真である。 な お、 レーン 1は、 形質転換体から抽出した染色体 DNAを铸型にして PCRを行つ た場合であり、 レーン 2は、 非形質転換体から抽出した染色体 DNAを錶型にし て PCRを行った場合であり、 レーン Mは、 DNAサイズマーカ一である。
図 3は、 実施例 2における、 前培養培地中の植物ホルモン組成がアイスプラン 卜の形質転換効率 (生存率、苗条分化率）に及ぼす影響を調べた結果を示すダラ フである。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明について詳しく説明するが、 本発明の範囲はこれらの説明に拘 束されることはなく、 以下の例示以外についても、 本発明の趣旨を損なわない 範囲で適宜変更し実施することができる。 また、 本発明の説明のために引用す る文献は、 すべて参照として本明細書全体に組込まれるものとする。
1 . 概要
本発明は、 アイスプラントの形質転換方法、 及びアイスプラントの形質転換 体の作出方法に関するものであり、 安定した形質転換ァイスプラントを作出す ることを本発明において初めて可能にした極めて利用価値の高い方法である。 これまで、 アイスプラントの形質転換体が得られなかったのは、 ァグロバクテ リゥム属細菌が感染した組織から個体への再分化が効率よくかつ確実に行わ れなかつたことが理由となっている。
通常、 植物の種類により、 ァグロパクテリゥム属細菌で形質転換するための 材料 （感染対象となる組織等） は異なり、 中にはモデル植物のシロイヌナズナ のように花器又は傷をつけた生長点に感染させる特殊な場合がある。 しかし、 一般には、 脱分化過程にあるか又は脱分化した培養組織 （いわゆるカルス） が 上記材料として使用されることが多い。 このような培養組織を用いる場合は、 通常、感染前に当該組織を作製するために 3〜4週間の脱分化誘導期間が必要と なり、 感染後は、 完全な個体に再分化させるためにさらに数週間必要となるた め、 迅速性に欠ける。 また脱分化過程、 及びカルスから再分化個体を誘導する 過程において、 体細胞変異が起きる危険性がある。
またこれまでに、 アイスプラントでは、 カルス以外に、 胚軸 （幼植物の茎部 分） や根等の各種組織及び器官から個体に再分化する試みがなされてきたが、 いずれも、 その再分化効率は非常に低いものであり、 確実に形質転換体を得る ことは極めて困難であった。
そこで本発明者は、 アイスプラントの各種組織及び器官 （根、 茎及び葉等） の中で個体への再分化能に特に優れたものがないか、 改めて実験及び検討を繰 り返した結果、 特定の組織 （例えば子葉節、 好ましくは幼体の子葉節） の再分 化活性が極めて高いこと、 及びこれを感染対象として用いて形質転換処理を行 えばアイスプラントの形質転換体を容易に得ることができることを見出した。 本発明はこのような知見に基づき完成されたものである。
また本発明者は、 上記特定の組織の培養 （少なくとも感染後の培養） を、 特 定の植物ホルモン （すなわちチジァズロン等） の存在下で行うようにすれば、 より一層、 当該組織の再分化活性を向上させ効率的にアイスプラン卜の形質転 換体が得られることも見出した。
2 . アイスプラントの形質転換方法
本発明のアイスプラントの形質転換方法は、 前述したように、 アイスプラン トの子葉節を、 所望の遺伝子を含有するァグロパクテリゥム属に属する微生物 (ァグロパクテリゥム属細菌） により形質転換する工程を含むことを特徴とす る。 詳しくは、 取得したアイスプラントの子葉節に、 所望の遺伝子を含有する ァグロパクテリゥム属細菌を感染させ、 その後、 当該細菌 （微生物） の共存下 で子葉節を培養することを特徴とする。
以下、 本発明の形質転換方法の一実施形態について、 各工程ごとに順を追つ て例示説明するが、 当該方法は、 これらの工程のみからなるものに限定はされ ず、 当業者の技術常識及び創作能力の範囲内で、 さらに他の工程を含むもので あってもよい。
(1) 子葉節の取得
本発明の形質転換方法においては、 アイスプラントの子葉節を、 ァグロパク テリゥム属細菌の感染対象組織として形質転換を行うことが重要である。 子葉 節とは、 双子葉植物 （アイスプラントも含む） の 2枚の子葉が合わさつている 部分を言い、 新しい葉の生長点を含む部分である。
子葉節の取得に当たっては、 まずアイスプラントを播種し、 発芽させること が必要である。 発芽させるための培地としては、 公知の培地を用いることがで き、 限定はされないが、 例えば、 MS寒天培地等のほか、 場合により、 水で湿 らせた濾紙も好ましく用いることができる。
培養容器としては、 公知のものであればよく、 限定はされないが、 例えば、 ガラス製やプラスチック製のシャーレ等を用いることができ、 後述するいずれ の培養工程においても同様である。
本発明の形質転換方法に用いる子葉節としては、 限定はされないが、 アイス プラントの幼体の子葉節であることが好ましい。 具体的には、 アイスプラント を播種してから 4〜： L0日後の幼体であることが好ましく、 より好ましくは 5〜7 日後である。 上記範囲を満たす幼体であれば、 より再分化活性の高い子葉節が 得られる点で好ましい。
子葉節の取得方法は、 限定はされないが、 アイスプラント苗条の子葉展開時 に、 例えば、 ガラス製等のシャーレ中で、 顕微鏡で観察しながら、 ピンセット 及びメス等を用いて、 子葉節部分を切除し （好ましくは、 子葉節部分を含む状 態で一方の子葉ごと切除し） 取得することが好ましい。
子葉節の取得数 （次の前培養工程に用いる数） は、 限定はされないが、 20〜 100個とすることが好ましく、 より好ましくは 40〜50個である。 上記範囲を満 たす取得数であれば、 次の工程でシャーレ中の子葉節間に適当な間隔を空けて 培養できるという点で好ましい。
(2) 子葉節の前培養
前培養工程は、 上述のようにして取得した子葉節 （詳しくは子葉節を含む子 葉） を、 次の感染工程に用い得る適当な培養組織となるよう培養することを目 的とする。 本工程では、 一般には、 取得した子葉節が、 小さな苗条を形成した 状態となるまで培養することが好ましい。
前培養に用いる培地としては、 公知の培地を用いることができ、 限定はされ ないが、 例えば、 播種に用いた培地 （例えば MS寒天培地） 等が好ましく挙げ られる。
また上記培地は、 植物ホルモンを含むものであることが好ましく、 具体的に は、 チジァズロン (TDZ) 、 ホルクロ口フエニュロン (CPPU) 、 ベンジルァ デニン （BA) 、 及びナフタレン- 1 -酢酸 （NAA) からなる群より選ばれる少な くとも 1種を含むものであることが好ましく、 より好ましくはチジァズロンを 含むものであり、特に好ましくはチジァズロンとナフタレン- 1-酢酸とを含むも のである。 これら植物ホルモン、 特にチジァズロンを含むことにより、 苗条分 化数が増加し、 苗条の健全性が保たれ、 結果として再分化が促進される等の効 果が得られる。
上記植物ホルモンの濃度 （合計濃度） は、 培地全体に対して、 0.1〜： I0mg/L であることが好ましく、 より好ましくは 0.5〜： L0mg/L、 さらに好ましくは 1〜 10mg/L, 特に好ましくは l〜6mg/Lである。 特に、 TDZについては、 その濃度 は、培地全体に対して、 0.：！〜 5mg/Lであることが好ましく、より好ましくは 0.5 〜5mg/L、 さらに好ましくは l〜5mg/L、 特に好ましくは 2.5〜5mg/Lである。 また、 CPPUの濃度は、 培地全体に対して、 0.1〜5.0mg/Lであることが好まし く、 より好ましくは 1.0〜5.0mg/L、 さらに好ましくは 2.5〜5mg/Lであり、 BA の濃度は、 培地全体に対して、 0.1〜20mg/Lであることが好ましく、 より好ま しくは 1.0〜： 10mg/L、 さらに好ましくは 1.0〜5mg/Lであり、 NAAの濃度は、 培地全体に対して、 0.1〜： !Omg/Lであることが好ましく、 より好ましくは 0.1 〜5mg/L、 さらに好ましくは 0.1〜： lmg/Lである。
前培養は、 光照射条件下で行うことが好ましい。 その明るさは限定はされな いが、 植物が健全に生育できる強さの光であればよく、 例えば、 50〜100 mol • in-2 · s-iであることが好ましい。
前培養における培養温度は、 例えば、 20〜33でであることが好ましく、 より 好ましくは 25〜30°Cである。
前培養に要する期間は、 例えば、 1〜10日であることが好ましく、 より好ま しくは 3〜5日であるが、 限定はされず、 次の感染工程に用い得る培養組織が得 られた段階又はそれ以降の任意の段階 （通常は 3日） で適宜培養を終了するこ とができる。
(3) 子葉節へのァグロパクテリゥム属細菌の感染
感染工程では、 前培養工程で得られた培養組織 （詳しくは当該培養組織の細 胞） に、 所望の遺伝子を含有するァグロパクテリゥム属に属する微生物 （ァグ ロバクテリゥム属細菌） を感染させることを目的とする。
感染工程で使用するァグロパクテリゥム属細菌としては、 Tiプラスミド又は Riプラスミドを有し、 従来から双子葉植物の形質転換に常用されているものが 好ましく挙げられ、 中でもァグロバクテリ ウム ·ッメファシエンス （ Agrobacterium tumefaciens) 力 より奸ましレ 。 これらァクロノ ク： rリゥム 細菌の多くは、 ァグロパクテリゥム，ッメファシエンス由来の Tiプラスミ ドの vir領域（又はそれに由来する DNA)を含むプラスミドベクターを有しており、 植物に付与しょうとする形質を担う所望の遺伝子 （形質転換遺伝子） は、 この ベクター中に挿入されるか、 又はこのべクタ一とは別のプラスミドベクタ一 （ ^えば PBR322等） 中に存在し相同組換え等により Tiプラスミド中に in vivoで 挿入され得る。 よって、 本発明では、 培養組織細胞のゲノムに導入しようとす る所望の遺伝子は、従来と同様に T領域の境界配列の間に挿入（配置） される。 この場合、 所望の遺伝子は、 ァグロパクテリゥム属細菌中の Tiプラスミ ドに揷 入されてもよいし、 他のプラスミドに挿入されてもよく、 限定はされない。 各 種プラスミドへの所望の遺伝子の揷入は、例えば GenBankのァクセッション番 号等の情報を基にし、 当業者において周知の遺伝子組換え技術を適宜採用して 行うことができる （例えば、 Molecular cloning 2nd ed.， Sambrook, J., et al" Cold Spring Harbor Laboratory Press U.S.A., 1989を参照) 。
なお本発明において 「所望の遺伝子」 とは、 アイスプラントの細胞内で発現 させようとする所望のタンパク質をコードする DNA、 及び当該 DNAの転写及 び翻訳等に必要な DNAを含む DNAであることが好ましいが、 限定はされず、 上記所望のタンパク質をコードする DNAのみであってもよいし、任意のオリゴ ヌクレオチドやポリヌクレオチドであってもよい。 また、 一般に、 「所望の遺 伝子」 としては、 後述する本発明の作出方法における選択培養工程において、 形質転換体とそうでないものとを容易に選別するために、 所定の抗生物質に対 して耐性を示すよう選択マーカー遺伝子 （例えば、 Hygr、 及び Kmr等） を含有 させることが好ましい。
ァグロパクテリゥム属細菌へのプラスミドの導入は、 従来公知の遺伝子組換 え技術を用いた方法により行うことができ、 例えば、 細菌の三系交雑手法 （ Ditta, G. et al., Pro. Natl. Acad. Sci. USA, vol.77, p.7347-7351 (1980)) 等が 好ましく挙げられる。
感染工程に用いるァグロパクデリゥム属細菌の培養は、 従来公知の培養方法 により行うことができ、 限定はされないが、 例えば、 当該細菌のストック （例 えばグリセロールストック（-80°C)) から滅菌した白金耳等で菌体を取り、 適当 な培地 （例えば AB培地） に塗布し、 喑所下で培養する （例えば 28°Cで 3日間） 方法が好ましい。
子葉節にァグロパクテリゥム属細菌を感染させる方法としては、 限定はされ ないが、 例えば、 （i) 培養したァグロパクテリゥム属細菌を、 TDZ、 ァセトシ リンゴン、 及び MS培地用無機塩類を含む感染処理用液体培地に懸濁し、 この 懸濁液に前培養後の子葉節を浸漬させて超音波処理 （ソニケ一シヨン処理） す る方法、 （ii) 上記 (i)の方法において超音波処理の代わりに減圧浸潤処理を行う 方法、 （iii) 上記 (i)又は (ii)の方法において、 超音波処理又は減圧浸潤処理を行 わずに、 感染処理用液体培地に界面活性剤を添加し、 この培地に一定時間浸漬 させる方法、 及び、 （iv) 上記 (i)又は (ii)の方法において、 超音波処理又は減圧浸 潤処理を行わずに、 感染処理用液体培地 （界面活性剤の添加無し） に一定時間 浸漬させる方法等が好ましく、 中でも本発明においては上記 ωの方法がより好 ましい。
上記 (i)の方法においては、 超音波の照射時間は、 限定はされないが、 0.2〜 60秒が好ましく、より好ましくは 2秒である。照射時間が上記範囲内のときは、 外植体組織が破壊されない点で好ましい。 また浸漬させる時間 （超音波処理の 時間も含む） は、 限定はされないが、 5〜20分であることが好ましく、 より好 ましくは 5〜6分である。 浸漬時間が上記範囲内のときは、 ァグロパクテリゥム の付着量が適当量となる点で好ましい。
(4) 感染後の共存培養
共存培養工程では、 感染工程後の子葉節を、 ァグロパクテリゥム属細菌の共 存下で培養することを目的とする。 先に述べた感染工程と本工程とにより、 培 養組織としての子葉節の細胞のゲノム中に所望の遺伝子 （外来遺伝子） を組み 込むこと、 すなわちアイスプラントの形質転換を行うことができる。
本工程では、 共存培養を実際に行うに先立ち、 まず感染工程後の懸濁液を子 葉節とともに乾燥させた滅菌ろ紙上に注ぎ、 次いで、 子葉節のみを新しい滅菌 ろ紙上に移す等して、 余分な菌体ゃ水分を除去しておくことが好ましい。
共存培養に用いる培地としては、 公知の培地を用いることができ、 限定はさ れないが、 例えば、 前培養工程で用いた培地 （MS寒天培地等） にァセトシリ ンゴンを添加した培地や、 上記培地に適当な濃度の植物ホルモンとァセトシリ ンゴンを添加した培地のほか、 ァセトシリンゴンと水のみを含む寒天培地等が 好ましく挙げられる。
共存培養は、 光照射条件下及び暗所下のいずれの条件下で行ってもよく、 限 定はされないが、 光照射条件下で行う場合、 例えば、 光合成を行うことができ るため子葉節の健全性が保たれ、 ァグロパクテリゥムの感染による障害が抑え られる等の効果が得られるため好ましい。 共存培養時の光照射条件としては、 限定はされないが、 上記効果がより有効に得られる点で、 例えば、 50〜200 / mol ' m-2 ' s-1であることが好ましく、 より好ましくは 50〜70 ιηοΐ ' ηι^ ^·1であ る。
共存培養における培養温度は、 例えば、 18〜33 Cであることが好ましく、 よ り好ましくは 25〜30°Cである。
共存培養に要する期間は、 例えば、 3〜10日であることが好ましく、 より好 ましくは 3〜5日であるが、 限定はされず、 例えば、 子葉節組織の肥大がわずか に認められた段階又はそれ以降の任意の段階 （通常は 3〜7日） で適宜培養を終 了することができる。
ここで、 上述した本発明の形質転換方法において、 特に好ましい実施形態と しては、 例えば、 前培養を 3日間行った培養組織 （子葉節） に、 超音波処理を 施すことによってァグロパクテリゥム属細菌を感染させ、 その後、 共存培養を ァセトシリンゴンと水のみを含む培地を用いて光照射下で 3日間行う態様が挙 げられ、 多くの形質転換体を得ることができる。
3 . 形質転換アイスプラントの作出方法
本発明の形質転換アイスプラントの作出方法は、 前述したように、 上記本発 明の形質転換方法により得られた子葉節を植物ホルモンの存在下で生育させ ることを特徴とする方法である。 すなわち本発明の方法は、 形質転換アイスプ ラン卜の製造方法でもある。 以下、 本発明の作出方法の一実施形態について、 各工程ごとに順を追って例示説明するが、 当該方法は、 これらの工程のみから なるものに限定はされず、 当業者の技術常識及び創作能力の範囲内で、 さらに 他の工程を含むものであってもよい。
(1) 除菌培養
除菌培養工程では、 まず上記本発明の形質転換方法により得られた子葉節を 適当な抗生物質を含む培地で培養し、 共存しているァグロパクテリゥム属細菌 を除菌して、 形質転換処理後の子葉節を選択的に取得することを目的とする。 除菌培養に用いる培地としては、 公知の培地を用いることができ、 限定はさ れないが、 例えば、 前培養工程で用いた培地 （MS寒天培地等） 等が好ましく 挙げられる。
当該培地に含有させる抗生物質としては、 形質転換に用いたァグロパクテリ ゥム属細菌の増殖及び 又は生育を阻害する作用を有するが、 アイスプラント の子葉節の生育には実質的に悪影響を与えないものが好ましく、 具体的には、 例えば、 カルペニシリン、 バンコマイシン、 クラフォラン、 及びオーダべニン 等が好ましく挙げられ、 中でも、 カルペニシリン、 及びバンコマイシンがより 好ましい。 なお、 各種抗生物質の使用濃度は、 限定はされず、 公知の有効濃度 範囲内で適宜設定できる。
また当該培地には、 植物ホルモンとして、 例えば、 チジァズロン （TDZ) 、 ホルクロ口フエニュロン (CPPU) 、 ベンジルアデニン (BA) 、 及びナフタレ ン - 1 -酢酸 （NAA) からなる群より選ばれる少なくとも 1種を含有させること が好ましく、 チジァズロンがより好ましい。
上記植物ホルモンの濃度 （合計濃度） は、 例えば、 培地全体に対して、 0.1 〜： 10mg/Lであることが好ましく、 より好ましくは 0.5〜： I0mg/L、 さらに好まし くは 1〜： 10mg/L、 特に好ましくは l〜6mg/Lである。 特に TDZについては、 そ の濃度は、 培地全体に対して、 0.：!〜 5mg/Lであることが好ましく、 より好まし くは 0.5〜5mg/L、 さらに好ましくは l〜5mg/L、 特に好ましくは 2.5〜5mg/Lで ある。 また、 CPPUの濃度は、 培地全体に対して、 0.：！〜 5.0mg/Lであることが 好ましく、 より好ましくは 1.0~5.0mg/L、 さらに好ましくは 2.5〜5mg/Lであ り、 BAの濃度は、 培地全体に対して、 0.1〜20mg/Lであることが好ましく、 よ り好ましくは 1.0〜： I0mg/L、 さらに好ましくは 1.0〜 5 mg/Lであり、 NAAの濃 度は、 培地全体に対して、 0.1~10mg/Lであることが好ましく、 より好ましく は 0.1〜5mg/L、 さらに好ましくは 0.：！〜 lmg/Lである。
除菌培養工程において使用する植物ホルモンの濃度、 特にチジァズロンの濃 度を、 上記範囲内とすることにより、 歪な形態をもつ組織の発達を抑えること ができるため、 植物体の発育が良好に保たれ、 結果として除菌を効率よく行う ことができる等の効果を得ることができる。
除菌培養における培養温度は、 例えば、 20〜33°Cであることが好ましく、 よ り好ましくは 20〜25°Cである。
除菌培養に要する期間は、 例えば、 2〜7日であることが好ましく、 より好ま しくは 3〜5日であるが、 限定はされず、 例えば、 子葉節が接している培地上、 あるいは植物体上にァグロパクテリゥムの増殖がない等の状態が認められた 段階又はそれ以降の任意の段階 （通常は 3〜5日） で適宜培養を終了することが できる。
(2) 選択培養
選択培養工程では、 除菌培養工程で得られた形質転換処理後の子葉節を、 さ らに適当な抗生物質を含む培地で培養し、 所望の遺伝子 (選択マ一カーとして の所定の抗生物質耐性遺伝子を含む） の導入により形質転換がなされているも の （形質転換体） を選択的に取得することを目的とする。
選択培養に用いる培地としては、 公知の培地を用いることができ、 限定はさ れないが、 例えば、 前培養工程で用いた培地 （MS寒天培地等） 等が好ましく 挙げられる。
当該培地に含有させる抗生物質のうち、 上記選択マーカ一に対応する抗生物 質としては、 例えば、 ハイグロマイシン、 及びカナマイシン等が挙げられ、 中 でもハイグロマイシンが好ましく、 その他の抗生物質としては、 除菌培養の際 に用いた抗生物質を好ましく併用することができる。 なお、 各種抗生物質の使 用濃度は、 限定はされず、 公知の有効濃度範囲内で適宜設定できる。
また当該培地には、 植物ホルモンとして、 例えば、 チジァズロン （TDZ) 、 ホルクロ口フエニュロン （CPPU) 、 ベンジルアデニン （BA) 、 及びナフタレ ン - 1 -酢酸 （NAA) からなる群より選ばれる少なくとも 1種を含有させること が好ましく、 チジァズロンがより好ましい。
上記植物ホルモンの濃度 （合計濃度） は、 例えば、 培地全体に対して、 0.1 〜： lOmg/Lであることが好ましく、 より好ましくは 0.5〜： 10nxg/L、 さらに好まし くは 1〜： LOmg/L、 特に好ましくは l〜6mg/Lである。 特に TDZについては、 そ の濃度は、 培地全体に対して、 0.：！〜 5mg/Lであることが好ましく、 より好まし くは 0.5〜5mg/L、 さらに好ましくは：！〜 5mg/L、 特に好ましくは 2.5〜5mg/Lで ある。 また、 CPPUの濃度は、 培地全体に対して、 0.：！〜 5.0mg/Lであることが 好ましく、 ょり好ましくは1.0〜5.011^/ さらに好ましくは 2.5〜5mg/Lであ り、 BAの濃度は、 培地全体に対して、 0.：!〜 20mg/Lであることが好ましく、 よ り好ましくは 1.0〜： I0mg/L、 さらに好ましくは 1.0〜5mg/Lであり、 NAAの濃 度は、 培地全体に対して、 0.1〜10mg/Lであることが好ましく、 より好ましく は 0.：！〜 5mg/L、 さらに好ましくは 0.1〜： lmg/Lである。
選択培養工程において使用する植物ホルモンの濃度、 特にチジァズロンの濃 度を、 上記範囲内とすることにより、 苗条分化数が増加し、 苗条の健全性が保 たれ、 結果として再分化が促進される等の効果が得られる。
選択培養は、 光照射条件下及び喑所下のいずれの条件下で行ってもよく、 限 定はされないが、 光照射条件下で行う場合、 例えば、 光合成を行えるため、 抗 生物質ゃァグロパクテリゥムに対して耐性の高い、 健全な植物体を得ることが できる等の効果が得られるため好ましい。 選択培養時の光照射条件としては、 限定はされないが、 上記効果がより有効に得られる点で、 例えば、 50〜200 mol ' m-2 ' s-1であることが好ましく、 より好ましくは SO TO nioI' m- s-1であ る。
選択培養における培養温度は、 例えば、 20〜33°Cであることが好ましく、 よ り好ましくは 20〜25°Cである。
選択培養に要する期間は、 例えば、 3〜6週であることが好ましく、 より好ま しくは 4〜5週であるが、 限定はされず、 例えば、 生存個体と枯死個体の区別が 明確になる等の状態が認められた段階又はそれ以降の任意の段階（通常は 3〜4 週） で適宜培養を終了することができる。
(3) 再分化
再分化工程では、 選択培養工程で得られた子葉節をさらに培養し、 その高い 再分化活性を利用して、 不定芽誘導及び発根等の各種器官形成又は組織形成を 促進させ、 安定な完全個体 （幼体又は成体） としての形質転換アイスプラント を得ることを目的とする。
再分化のための培養に用いる培地としては、 不定芽の形成、 及び発根のいず れに対しても公知の培地を用いることができ、 限定はされないが、 例えば、 前 培養工程で用いた培地 （MS寒天培地等） 等が好ましく挙げられる。
当該培養は、 一般には、 抗生物質を用いず無菌的に行うことが好ましいが、 限定はされず、 適宜、 公知の有効濃度で各種抗生物質、 例えば、 ハイグロマイ シン、 及びカナマイシン等を使用してもよい。
不定芽の形成には、 除菌培養や選択培養と同様に、 植物ホルモンとして、 例 えば、 チジァズロン (TDZ) 、 ホルクロ口フエニュロン (CPPU) 、 ベンジル アデニン （BA) 、 及びナフタレン- 1 -酢酸 （NAA) からなる群より選ばれる少 なくとも 1種を含有させることが好ましく、 チジァズロンがより好ましい。 上記植物ホルモンの濃度 （合計濃度） は、 例えば、 培地全体に対して、 0.1 〜10mg/Lであることが好ましく、 より好ましくは 0.5〜10mg/L、 さらに好まし くは l〜10mg/L、 特に好ましくは l〜6mg/Lである。 特に TDZについては、 そ の濃度は、 培地全体に対して、 0.1〜5mg/Lであることが好ましく、 より好まし くは 0.5〜5mg/L、 さらに好ましくは l〜5mg/L、 特に好ましくは 2.5〜5mg/Lで ある。 また、 CPPUの濃度は、 培地全体に対して、 0.1〜5.0mg/Lであることが 好ましく、 ょり好ましくは1.0〜5.0111 / さらに好ましくは 2.5〜 5 mg/Lであ り、 BAの濃度は、 培地全体に対して、 0.：!〜 20mg/Lであることが好ましく、 よ り好ましくは 1.0〜： 10mg/L、 さらに好ましくは 1.0〜5 mg/Lであり、 NAAの濃 度は、 培地全体に対して、 0.1〜： I0mg/Lであることが好ましく、 より好ましく は 0.1〜5mg/L、 さらに好ましくは 0.1〜lmg/Lである。
再分化工程において使用する植物ホルモンの濃度、 特にチジァズロンの濃度 を、 上記範囲内とすることにより、 細胞の分裂が早く、 歪な形態の組織を少な く抑え、 細胞のガラス化の少ない健全な苗条が数多く得られる等の効果を得る ことができる。 なお、 発根のための培地には、 これらの植物ホルモンは添加しないのが一般 的ではあるが、 限定はされない。
再分化のための培養は、 不定芽の形成、 及び発根のいずれも、 光照射条件下 及び喑所下のどちらの条件下で行ってもよく、 限定はされないが、 光照射条件 下で行う場合、 例えば、 光合成を行うことができるため新たな組織の形成が促 進され、 健全な植物体の発育を促す等の効果が得られるため好ましい。 当該培 養時の光照射条件としては、 限定はされないが、 上記効果がより有効に得られ る点で、 例えば、 50〜200 i moレ rn^ ' s-1であることが好ましく、 より好ましく は 50〜 70 a mol · m · s—1である。
再分化のための培養における培養温度は、 例えば、 20〜33°Cであることが好 ましく、 より好ましくは 25〜30°Cである。
不定芽形成のための培養に要する期間は、 10〜： 14日ごとに新しい培地へ継代 する操作を 2〜3回繰り返した後 （つまり再分化培地への移植後） 、 3〜8週であ ることが好ましく、 より好ましくは 3〜4週である力 限定はされず、 例えば、 新たに生じた組織の表面に、 通常条件の個体にみられるブラッダー細胞が形成 される等の状態が認められた段階又はそれ以降の任意の段階 （通常は 4〜5週） で、 適宜培養を終了し、 発根用の培養系に移すことができる。
発根のための培養に要する期間は、 10〜： L4日ごとに新しい培地へ継代する操 作を 2〜3回繰り返した後 （つまり発根用培地移植後） 、 2〜5週であることが好 ましく、 より好ましくは 2〜3週であるが、 限定はされず、 例えば、 1cm程度の 根が発根している等の状態が認められた段階又はそれ以降の任意の段階 （通常 は 2〜3週） で適宜培養を終了することができる。
(4) その他の工程
本発明の作出方法においては、 その他の工程として、 例えば、 以下の (i)及び (ii)に説明する工程を含むことができる。
(i) 馴化
再分化工程の後、 形質転換アイスプラントを馴化培地 （ならし培地） に移し て培養し （いわゆる馴化培養） 、 安定した形質転換体として生育させることが 好ましい。
馴化培地としては、 公知の培地を用いることができ、 限定はされないが、 例 えば、 滅菌したバ一ミキユライト、 あるいはフロリァライト 552 (日清紡社製 ) に MS用無機塩類をふくませたもの等が好ましく挙げられる。
馴化培養では、 一般には、 抗生物質や植物ホルモンを積極的に培地に添加し て行うことは要しないが、 限定はされず、 必要に応じ適宜添加してもよい。 馴化培養は、 一般には、 光照射条件下で行うことが好ましく、 光照射量は適 宜設定すればよい。
馴化培養における培養温度は、 限定はされず、 例えば、 20〜33°Cであること が好ましく、 より好ましくは 20〜25°Cである。
馴化培養に要する期間は、 限定はされず、 例えば、 10日〜 4週であることが 好ましく、 より好ましくは 10日〜 2週である。
馴化培養の方法は、 限定はされないが、 例えば以下のとおりである。 すなわ ち、 再分化過程で発根した不定芽を、 上述した馴化用培地に移植する。 発根を 促した後、 根の繁茂した個体を、 滅菌水を含ませたバーミキユライトを入れた プラスチックボックス （例えば、 幅 30crn X奥行き 50cm X高さ 15cm) 等に移植 する。 これにサランラップ等で蓋をして上述した光条件、 及び温度条件の下に おく。 移植してから適当な期間経過後 （例えば移植から 2日後） に蓋に穴を開 け、 さらに適当な期間経過後 （例えば移植から 4日後） に蓋をとり外す。 その 後 （例えば移植から 5日後） 、 適当な光強度 （例えば 350 / mol · m-2 · s- に 調整した人口気象室に移し、 所定の時間 （例えば 24時間） 強光に馴化させ、 そ の後、 市販の培養土 （例えば、 商品名：花と野菜の土、 江北産業社製） に定植 する。
(ii) 遺伝子の導入確認
得られた形質転換アイスプラントについて、 実際にそのゲノム中に所望の遺 伝子 (外来遺伝子)が導入されているか否かを直接的に確認することができる。 具体的には、 例えば、 （a) 導入した所望の遺伝子配列又はその一部の領域に対 応する適当なプライマーを用いて PCRを行い、 電気泳動等によりその増幅断片 の存在を確認する方法のほか、 （b) 導入遺伝子の DNA断片をプローブにして、 形質転換体から単離した染色体 DNAを適当な制限酵素で消化しメンブレンに 固定したものとハイブリダィズし、 遺伝子の有無を確認する方法 （ジエノミツ クサザンブロッテイング法） 等により確認することができる。 なお、 上記確認 方法は、 いずれも当業者において公知の手段及び条件等を適宜採用して行うこ とができる。
4 . 形質転換アイスプラント
本発明の形質転換アイスプラントは、 ゲノム中に所望の遺伝子 （外来遺伝子 ) が組み込まれているアイスプラントの形質転換体である。
本発明の形質転換アイスプラントを作出する方法としては、 アイスプラント のゲノム中に所望の外来遺伝子が組み込まれた形質転換体を得る方法であれ ば何れの方法であってもよく、 限定はされないが、 例えば、 前述した本発明の 作出方法が好ましく適用できる。 したがって、 本発明の形質転換アイスプラン トは、 前述した本発明の作出方法により得られるものと言うこともできる。 本本発発明明のの形形質質転転換換アアイイススププラランントトはは、、 安安定定
Figure imgf000019_0001
卜卜のの形形質質転転換換体体ででああるるたためめ、、 例例ええばば、、 アアイイススププラランントトのの遺遺伝伝子子のの機機能能解解析析やや、、 アアイイススププラランントトのの改改良良種種のの作作出出等等にに関関ししてて、、 極極めめてて有有用用性性のの高高いいももののででああるる。。 以以下下にに、、 実実施施例例をを挙挙げげてて本本発発明明ををよよりり具具体体的的にに説説明明すするるがが、、 本本発発明明ははここれれらら にに限限定定さされれるるももののででははなないい。。
実施例 1
図 1に示す手順 （概略） で、 アイスプラントの子葉節を、 所望の遺伝子 （力 ナマイシン耐性遺伝子 (Kmr： npt II)) を含有するァグロバクテリゥム属細菌に より形質転換して、 上記遺伝子が導入された形質転換アイスプラントを作出し た。 以下に、 具体的な方法及び手順並びに条件等を説明する。
(1) 子葉節の取得
アイスプラントの種子を 2%次亜塩素酸で 10分間殺菌し、 3 %ショ糖及び 0.8 %寒天を添加した MS寒天培地に無菌的に播種した。 播種してから 7日後、 発芽 した苗条の子葉展開時に子葉節を切除した。 子葉節は 50個体分取得した。 なお 上記 「MS寒天培地」 としては、 下記の組成のものを使用した （以下同様） 。
MS寒天培地の組成
· MS培地用無機塩類 (日本製薬社製）：合計 4.6g/L
硝酸アンモニゥム： 1650mg/L
硝酸力リウム： 1900mg/L
塩化カルシウム二水和物： 440mg/L
硫酸マグネシウム七水和物： 370mg/L
リン酸ニ水素力リウム： 170mg/L
ホウ酸： 6.2mg/L
硫酸マンガン四水和物： 22.3mg/L
硫酸亜鉛七水和物： 8.6mg/L
ヨウ化力リウム： 0.83mg/L
モリブデン (VI)酸ニナトリゥムニ水和物： 0.25mg/L
硫酸銅 (II)五水和物： 0.025mg/L
塩化コバルト六水和物： 0.025mg/L
エチレンジァミン四酢酸ニナトリウム： 37.3mg/L 硫酸鉄 (II)七水和物： 27.8mg/L)
·ショ糖： 30g/L
- B5ビタミン類
ニコチン酸： 0.01mg/L
塩酸ピリ ドキシン： O.Olmg/L
塩酸チアミン： O.lmg/L
ミオイノシトール： lmg/L
•寒天： 8g/L
(2) 子葉節の前培養
取得した子葉節を、 チジァズロン (TDZ； 2.5mg/L)を含む MS寒天培地に置床 し、 3日間培養した。
(3) 子葉節へのァグロパクテリゥム属細菌の感染
(i) ァグロパクテリゥム属細菌の形質転換体の作製
子葉節への感染に用いるァグロパクテリゥムとして、 カナマイシン耐性遺伝 子 （Kmr) 、 ハイグロマイシン耐性遺伝子 （Hygり 、 及び EGFP蛍光タンパク 質発現遺伝子を連結したバイナリ—ベクター （pBI) を有する EHA101株を用 いた。 具体的には、 凍結融解法に従い、 ァグロパクテリゥムを形質転換した。 すなわち、 上述したベクター l g (2〜10 L) を、 1.5mLエツペンドルフチュ —ブ内にある凍結状態のァグロパクテリゥムコンビテン卜セルに加えた。 この チューブに蓋をし、 37°Cのウォーターバス中で 5分間インキュベートした。 そ の後チューブを氷中に移し 1分間冷却した。 50 i g/mLのカナマイシンを含む YEP培地 lmLを加え、 26°Cで 2時間培養した。 室温で 30秒間遠心分離 （ 7500rpm) して集菌した。 その後、 50 g/mLのカナマイシンを含む YEP培地 lOO i Lを加え菌体を溶解し、全量をカナマシンとハイグロマイシンをそれぞれ 50 g/mLの濃度で含む YEP固形培地に塗布した。 培地全体に菌体を広げて、 26°C喑所で単一コ口ニーができるまで 48〜72時間培養した。
(ii) 形質転換されたァグロバクテリウム属細菌の培養
形質転換したァグロパクテリゥムの単一コロニーを 5mLの YEP培地に植菌 し、 28°Cで 1晚振盪培養した。 この培養液 lmLと、 滅菌した 50%グリセロール 水溶液 lmLとを混合し、 -80°Cで凍結させ保存した。 このストックを白菌耳で YEP寒天培地に画線し、 25°C、 喑所下で 2日間培養した。 その後、 超音波処理 に用いた処理液 30mLにコロニーを懸濁し、波長 600nmにおける濁度が 0.2にな るよう調整した。
(iii) 子葉節への感染
ァグロパクテリゥムを、 TDZ(2.5mg/L)、 ァセトシリンゴン（10mg/L)、 及び MS培地用無機塩類（日本製薬社製、 4.6g/L)を含む感染処理用液体培地に懸濁し て、 600nmにおける濁度が 0.2になるよう調整した。 容積 15mL ( ΐδπιιη) の ポリプロピレン製チューブに、 上記懸濁液を 2.5mL入れ、 さらに前培養後の子 葉節 （外植体） を 50個体分入れた後、 ソニケ一夕一 （井内社製、 製品名 ： ULTRASONIC CLEANER AS-150) に 2秒間浸漬して超音波処理した。
(4) 感染後の共存培養
超音波処理後、 5分間そのまま懸濁液に浸潰させ、 その後、 滅菌ろ紙上で余 分なァグロパクテリゥム懸濁液を除去した子葉節 （外植体） を、 ァセトシリン ゴン (10mg/L)の寒天培地 (寒天：8g/L)を用い、 約 60 ΠΙΟ1· ΠΙ·2 · 8·Ιの光照射条件 下で 3日間培養した。
(5) 除菌培養 共存培養後の子葉節 （外植体） を、 TDZ(2.5mg/L)、 カルペニシリン (Cb ; 100mg/L), 及びバンコマイシン (Vm； 300mg/L)を含む MS寒天培地に移植し、 3日間培養した。
(6) 選択培養
除菌培養後の子葉節 （外植体） を、 TDZ(2.5mg/L)、 Cb(100mg/L)、 Vm(300mg/L)、及びハイグロマイシン (Hyg;20mg/L)を含む MS寒天培地に移植 して、 約 2週間に一度の割合で継代し、 合計 4週間培養した。
(7) 再分化
選択培養で生存した個体を、 TDZ(2.5mg/L)を含む MS寒天培地上に置床し、 10〜： 14日後、 新しい培地へ継代培養することを 2〜3回繰り返した後、 不定芽を 誘導した。 さらに植物ホルモンを含まない上記培地に移植し、 10〜14日間隔で 新しい培地に継代することを 2〜3回繰り返し根を誘導した。
(8) 馴化
発根した不定芽は、 滅菌したバ一ミキユライ ト （又は、フロリァライ ト 552( 日清紡社製)に滅菌水をふくませたものでもよい） に移植し、 徐々に乾燥、 強光 に馴化させた。
(9) PCRによる導入遺伝子の確認
得られた形質転換アイスプラントの染色体 DNAを CTAB法により抽出した。 この染色体 DNAを铸型にし、 Kmr遺伝子 (npt II)の塩基配列に基づく下記のプ ライマーを用いて、ァグロパクテリゥム属細菌により導入された遺伝子 (npt ll) の有無を、 PCR法、 及び PCR産物のァガロースゲル電気泳動により確認した。 この電気泳動の結果 （写真） を図 2に示す。
Fプライマ一：
GTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCA (配列番号 1) Rプライマー：
TCATAGAAGGCGGCGGTGGAATCGAAATCT (配列番号 2) なお、 PCRは、 以下の反応組成液を用い、 94°Cで 30秒の熱変性、 65°Cで 60 秒のアニーリング、 72°Cで 60秒間の伸長のサイクルを 1サイクルとして、 これ を 30サイクル行った。 PCR反応組成液
鍀型 DNA： l ll h
DNAポリメラ一ゼ： 2.oumt
Fプライマー： 0.5 L
Rプライマー： 0.5 L
dNTP(2.5mM)： 4 ^ L
10 X Buffer：
滅菌水： 適量 (約 38 L)
α口 Τ . 50 x L
図 2より、 形質転換体から抽出した染色体 DNAを錶型にして PCRした場合に は、 導入遺伝子 (npt II)の存在を示す PCR産物のバンドが検出されたが （レー ン 1) 、 非形質転換体ではそのバンドは検出されず （レーン 2) 、 形質転換体に 目的の遺伝子が導入されたことが確認された。
実施例 2
実施例 1における子葉節の前培養工程において、 使用する培地を、 チジァズ ロン (TDZ； 2.5mg/L)を含む MS寒天培地から、 チジァズロン (TDZ； 5mg/L)及 びナフタレン- 1 -酢酸 (NAA； O.lmg/L)の 2種の植物ホルモンを含む MS寒天培 地に変えた以外は、 実施例 1と同様にして、 アイスプラントの形質転換体を作 出した。
形質転換に用いた子葉節の数（50個体分）に対し、形質転換後の生存率 (％；)、 及び苗条分化率 (％)を、実施例 1の場合 (2.5mg/L TDZ)と、実施例 2の場合 (5mg/L TDZ, O.lmg/L NAA)とで比較した。 その結果を図 3(グラフ）に示す。
図 3より、 前培養の培地に用いる植物ホルモンの種類を、 実施例 2のごとく特 定の種類の組合せ及び濃度とすることにより、 生存率及び苗条分化率のいずれ についても向上することが確認された。
産業上の利用可能性
本発明によれば、 従来不可能であった、 ァグロパクテリゥム属に属する微生 物を用いた遺伝子導入法によるアイスプラントの形質転換方法、 及び形質転換 アイスプラントの作出方法を提供することができ、 安定な完全個体としての形 質転換アイスプラントを提供することができるため、 例えば、 アイスプラント の遺伝子の機能解析、 及びアイスプラントの改良種の作出等に関し、 極めて有 用性の高いものと言える。 配列表フリーテキスト
配列番号 1 ： プライマー
配列番号 2 ： プライマー

Claims

1 . アイスプラントの子葉節を、 所望の遺伝子を含有するァグロパクテリゥム 属に属する微生物により形質転換する工程を含むことを特徴とする、 アイ スプラントの形質転換方法。
2 . 前記子葉節は幼体の子葉節である、 請求項 1に記載の方法。
3 . 前記幼体は播種してから 4〜： 10日後のものである、 請求項 2に記載の方法。
4 . 請求項 1から 3までのいずれかに記載の方法により得られた子葉節を植物ホ
一一
主目
ルモンの存在下で生育させることを特徴とする、 形質転換アイスプラント の作出方法。
5 . 前記植物ホルモンはチジァズロン、 ホルクロ口フエニュロン、 ベンジルァ 囲
デニン、及びナフ夕レン- 1 -酢酸からなる群より選ばれる少なくとも 1種で ある、 請求項 4に記載の方法。
6 . 前記植物ホルモンの合計濃度が 0.1〜： 10mg/Lである、 請求項 4又は 5に記載 の方法。
7 . 前記チジァズロンの濃度が 0.：！〜 5mg/Lである、 請求項 5又は 6に記載の方 法。 '
8 . 請求項 4から 7までのいずれかに記載の方法により得られる形質転換ァィス プラント。
9 . ゲノム中に所望の外来遺伝子が組み込まれたものである、 請求項 8に記載 の形質転換アイスプラント。
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