JP4340148B2 - 複製ベクターに基づく色素体内での遺伝子発現 - Google Patents
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Description
分子クローニング技術全般の発達にともない、まもなく形質転換により高等植物を遺伝的に改変することが可能になった。植物の形質転換において主に強調されるのは、以前も今も核の形質転換であり、それは遺伝子(シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)の場合約26,000であり、その完全な配列が最近発表された(The Arabidopsis Genome Initiative、2000))の大部分が細胞核に存在するからである。核の形質転換は、アグロバクテリウム ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)などの生物学的ベクターが利用可能であり、それを改変して核の効率的な形質転換が可能であるので、容易に実施することができた(Galvin、1998)。また、核では外来の核酸をより直接的に利用することができ、一方、小器官は一般にDNAなどの巨大分子を通さない2つのエンベロープ膜に包囲されている。
(i)相同組換えによってプラストームへの前記DNAの可逆的組込みが起こるのに十分な程度に、複製をもたらす前記ヌクレオチド配列を、プラストーム配列に相同にすることができる。したがって、前記DNA又は前記ベクターを、前記プラストームによって間接的又は非自律的に複製することができる(図2参照)。前記組込みは可逆的なので、プラストームから前記DNAを切り出すことができ、それによって間接的に複製されたDNAが作製される。
(ii)複製をもたらす前記ヌクレオチド配列は、プラストーム複製とは無関係に前記DNAの自己複製を起こす複製開始点を含むことができる。
機序(ii)が有効であるとき、複製をもたらす前記ヌクレオチド配列及び/又は前記複製開始点が、機序(i)による可逆的組込みのためのプラストーム配列に十分相同であれば、機序(i)による複製も同時に有効になり得る。
(a)DNAを含む植物色素体を用意するステップであって、このDNAが
(i)植物細胞中で前記DNAの自己複製をもたらすヌクレオチド配列を含み、
(ii)少なくとも1つの目的とする配列を含み、
(iii)
(α)前記少なくとも1つの目的配列に作動可能に結合する転写開始及び/又は停止制御エレメントを欠くか、又は
(β)前記少なくとも1つの目的配列に作動可能に結合する転写停止制御エレメントを欠くが、前記少なくとも1つの目的配列に作動可能に結合する転写開始制御エレメントを含む、
転写用DNAである上記ステップと、
(b)前記DNAの複製を可能にするステップと、
(c)遺伝的に形質転換された色素体を有する細胞及び/又は植物を回収するステップとを含む、植物色素体の遺伝的形質転換方法を提供する。
(a)配列番号1の配列又は機能が保存された変異体又はそれらの一部と、
(b)配列番号2の配列又は機能が保存された変異体又はそれらの一部と、
(c)ストリンジェントな条件下で配列(a)又は(b)に相補的である配列とハイブリッド形成する配列と、
(d)前記DNAに自己複製をもたらす前記能力を低下又は増大させるために選択した突然変異を含む(a)又は(b)の配列と、
(e)配列番号1又は配列番号2と少なくとも80%が同一である配列と、
(f)配列番号1又は配列番号2又はそれらの一部の配列にオーソロガスな配列と、から選択される。
(a)DNAを用いて植物又は植物細胞の色素体を形質転換するステップであって、前記DNAが、
(i)植物細胞中で前記DNAの複製をもたらすヌクレオチド配列と、
(ii)少なくとも1つの目的配列と、
(iii)前記少なくとも1つの目的配列を色素体ゲノムに安定に組み込むのに必要な前記少なくとも1つの目的配列に隣接する配列と、
(iv)前記目的配列に隣接する前記配列の外側にある選択マーカーとを含むものである上記ステップと、
(b)前記少なくとも1つの目的配列を選択圧の存在下でプラストームに組み込むステップと、
(c)選択圧を解除することによって前記選択マーカー配列を消失させるステップと、
(d)プラストーム上で遺伝的に形質転換されており、前記選択マーカーを欠く細胞及び/又は植物を回収するステップ
とを含む。
3’−UTR: (→)コード領域下流の(→)遺伝子の転写されたが翻訳されていない領域;
5’−UTR: (→)コード領域上流の(→)遺伝子の転写されたが翻訳されていない領域;(→)色素体(→)遺伝子において、5’−UTRはその3’末端に近い翻訳開始のための配列情報(リボソーム結合部位、(→)RBS)を含む;
aadA: 抗生物質(→)選択阻害剤スペクチノマイシン及び/又はストレプトマイシンを解毒する、頻繁に使用されるタンパク質である細菌アミノグリコシドアデニルトランスフェラーゼの(→)コード領域;
aphA−6: 抗生物質(→)選択阻害剤カナマイシンを解毒するタンパク質である、細菌アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼA−6の(→)コード領域;
葉緑体: クロロフィルを含有する(→)色素体;
コード領域: a)ポリペプチドのアミノ酸配列又はb)機能性RNAのヌクレオチドに対する情報を含むヌクレオチド配列;コード領域は、場合によっては、1つ又は複数の(→)イントロンで中断される;
所望の遺伝子(配列): 改変又は新しく導入した配列:(→)形質転換を試行する目的;
フランク、フランキング領域:(→)色素体(→)形質転換(→)ベクター中の挿入断片の5’末端及び3’末端のDNA配列であり、二重相互(double reciprocal)(→)相同組換えによってフランク間にある配列を標的(→)プラストームへ組み込むのを媒介する。同じ機序によって、配列を改変し、又は標的(→)プラストームから取り出すことができる。したがって、(→)色素体(→)形質転換(→)ベクターのフランクによって、標的(→)プラストーム中の変化が(→)形質転換によりどの場所で発生するかが決定される。
遺伝子発現: 配列情報を機能に変えるプロセス;ポリペプチドをコードする(→)遺伝子において、遺伝子発現には、RNAポリメラーゼの活動を開始し誘導する(→)プロモーターの作用が必要であり、それによってメッセンジャーRNAが形成され、続いてポリペプチドに翻訳される;RNAをコードする(→)遺伝子においては、(→)プロモーターによって媒介されるRNAポリメラーゼの活動によって、コードされたRNAが生成する;
遺伝子: 機能、たとえば発現を独立して確実にするのに必要なエレメントのすべてをコードするヌクレオチド配列;遺伝子は、少なくとも1つの完全な(→)コード領域を含む(→)オペロン中に構成される;ポリペプチドをコードする(→)遺伝子において、これらのエレメントは、(1)(→)プロモーター、(2)5’非翻訳領域((→)5’−UTR)、(3)完全な(→)コード領域、(4)3’非翻訳領域((→)3’−UTR)である;RNAをコードする(→)遺伝子においては、(→)5’−UTR及び(→)3’−UTRが欠損している;2つ以上の(→)コード領域からなる(→)オペロンにおいて、2つの後続の完全な(→)コード領域は(→)スペーサーによって分離され、(→)プロモーター、(→)5’−UTR及び(→)3’−UTRの各エレメントは、(→)オペロンの(→)コード領域によって共有されている;
ゲノム: 細胞核又は細胞小器官の完全なDNA配列;
GFP: 緑色蛍光タンパク質
相同組換え: (→)ゲノム中の標的部位に十分相同な配列を含む(→)フランクの存在によって配列の交換、挿入又は欠失がもたらされるプロセス;
イントロン: (→)コード領域を中断する配列;
オペロン: プロモーターを共有するいくつかの(→)遺伝子の組織構造;
植物: その細胞中に(→)色素体を含む生物;本発明は特に多細胞(→)植物に関係する;これらには(マツ、エゾマツ、モミなどの)裸子植物及び(単子葉作物トウモロコシ、コムギ、オオムギ、イネ、ライムギ、ライコムギ、モロコシ、サトウキビ、アスパラガス、ニンニク、ヤシなど及び非作物単子葉植物及び双子葉類作物タバコ、ジャガイモ、トマト、アブラナ、テンサイ、カボチャ、キュウリ、メロン、コショウ、柑橘類、ナス、ブドウ、ヒマワリ、ダイズ、アルファルファ、ワタなどの)被子植物及び非作物双子葉類、並びにシダ類、ゼニゴケ類、コケ類及び多細胞緑藻類、紅藻類及び褐藻類のグループが含まれる;
色素体: (→)植物細胞中にそれら自体の遺伝機構(genetic machinery)を有する小器官であり、機能及び形態の異なる様々な形式、たとえばアミロプラスト、(→)葉緑体、有色体、エチオプラスト、ゲロントプラスト(gerontoplasts)、白色体、原色素体などとして存在する;
プラストーム: (→)色素体の完全なDNA配列;
プロモーター: 転写を開始し調節する機能を果たすヌクレオチド配列;
RBS、リボソーム結合部位:リボソーム結合及びそれぞれのRNA転写物からの翻訳開始を媒介する、(→)コード領域の(→)翻訳開始コドンの上流のDNA配列エレメント;RBSエレメントは、(→)5’−UTR又は(→)スペーサーの一部である;
選択阻害剤: 形質転換された細胞又は小器官よりも形質転換されていない細胞又は小器官の増殖及び成長を強く抑制する化合物;
目的配列: 改変した又は新しく導入した任意の長さの配列:(→)形質転換を試行する目的;配列の導入を意図しない場合、目的配列の長さをゼロとすることができ、すなわち目的配列を持たないことを目的とすることができる;
停止: 本発明の記述において、「停止」はDNA配列からのRNAの転写の中断に関係する;
ターミネーター: (→)停止の原因となる配列エレメント;
形質転換ベクター: (→)ゲノムの(→)形質転換を媒介するために作製したクローン化DNA分子;
形質転換: 少なくとも1つの(→)形質転換ベクターの使用を含めた(→)植物又は植物細胞の処置によってDNA配列を導入し、切り出し、又は改変する方法;
導入遺伝子(トランスジーン): 1つの(→)ゲノムに由来し、別のゲノムに導入されるDNA配列;
uidA: 頻繁に使用されるレポータータンパク質である細菌βグルクロニダーゼの(→)コード領域。
DNAを色素体に導入する方法の開発に加え、色素体形質転換を実施するにはさらに2つの要件を満たさなければならない。すなわち、遺伝子発現を制御する色素体配列エレメントの使用、及び新規な配列又は相同組換えによって改変した配列の部位特異的な組込みを可能にすることである。従来の色素体形質転換ベクターは、標的挿入部位の上流及び下流のプラストーム配列に由来するフランクを含んでいる(Zoubenko等、1994)。これらの諸要件の結果、高等植物色素体のプラストームに外来遺伝子を導入するために使用する色素体形質転換ベクターは、以下のエレメント、すなわち、(1)5’フランク、(2)プロモーター配列、(3)5’非翻訳領域、(4)タンパク質遺伝子又は(RNA遺伝子などの)非タンパク質遺伝子の完全な配列をコードするコード領域、(5)3’非翻訳領域及び3’フランクを共有する。また(7)色素体複製開始点は、プラストームへの配列の組込みを促進すると推論された(米国特許第5693507号)。
高等植物色素体染色体の複製に関する理解は以下のように要約することができる。すなわち、環状二本鎖分子(約130〜150kbp)は、「大きな単一コピー領域」、「反復A」、「小さな単一コピー領域」及び反復Aと配列は同一であるが向きが逆である「反復B」の4つの領域からなる。複製は、「ori A」及び「ori B」と呼ばれる配列エレメントから開始されると推定される。これらのエレメントは、タバコプラストームにおいて反復領域内に位置するので、エレメント各々の2つのコピーが存在する。初期の複製の特徴は「置換ループ」である。これらは、複製の進行につれ「ローリングサークル」に転化される(Kunnimalaiyaan及びNielsen、1997による総説)。
本発明に記載するベクターは、プラスミドによってコードされる遺伝子に対する転写停止及び/又は開始配列を含まない。それらはターミネーター配列を欠くことが好ましい。いくつかの遺伝子を人工オペロンとして1つの機能プロモーターから転写することができる。ポリシストロン性転写物のすべての単一目的配列を確実に効率的に翻訳するために、適切なリボソーム結合部位が、好ましくは、それぞれの目的配列を分離するスペーサーエレメント中に挿入されている。発現カセットを構築するためのクローニングの労力は実質的に軽減される。また、染色体外エレメントは環状であるので、(「ローリングサークル」様の)連続転写を起こすことができ、目的配列の発現レベルがより高くなる。
導入遺伝子の発現に必要な相同配列は、遺伝的不安定性を引き起こす恐れがあり、特に、形質転換されたプラストームと形質転換されていないプラストームが同じ小器官内に共存する限りそうである(Eibl等、1999)。
この戦略は、組込みカセットを含有する「脱着可能なシャトル」ベクターにも適用することができる(以下を参照)。
遺伝子発現は、プロモーター強度、RNA安定性、翻訳効率及びタンパク質ターンオーバーを含めた膨大な数のパラメータの影響を受ける。他の重要なパラメータは、DNAコード配列のコピー数である。コピー数と発現の直線的な依存関係をある程度想定することができる。本発明で使用するプラスミドは、プラストーム分子よりもコピー数がかなり増加する(2〜5倍の増加)。したがって、これらのプラスミドベクターは、色素体における極めて高い導入遺伝子発現レベルの最適な基盤を提供するものである。組換え遺伝子の発現レベルが極めて高いことは、タンパク質ベースの薬剤物質、生分解性原料又は他の任意のタンパク質の色素体コンパートメントにおける製造などいくつかの用途で極めて有用になり得る。強力な調節エレメントと高コピー数の両方を使用して、色素体中の染色体外プラスミドは、従来の植物形質転換方法では達成できない、並外れて高い濃度の外来タンパク質をもたらすことができる。
従来の葉緑体形質転換ベクターは、相同組換えを介する導入遺伝子の組込みのための相同フランクとして役立つ、標的植物種から単離された葉緑体ゲノム配列を含む。通常、発現カセットには、所望の組込み部位からの2つのプラストーム配列が隣接する。異なる種のプラストームは、全般的な構造と配列の両方ともかなり変動するので、形質転換ベクターの設計上、種特異的フランクを使用することが必要となる。また、ほとんどの植物種の色素体DNA配列及び遺伝子配列はまだ知られていない。このため、様々な植物種に対するクローニング形質転換ベクターの構築を通じてさらに労力が必要になる。本発明に記載する新規方法では、少なくともいくつかの実施形態において、導入遺伝子を安定に挿入するためにフランクのクローンを作る必要性が回避される。また、色素体DNAへの組込みは、調節エレメントを含むことができるいわゆる遺伝子間配列を標的にする場合でも、色素体遺伝子発現に望ましくない効果を及ぼす結果になる恐れがある。
いくつかの実施形態において、本発明は、(1)相同組換えのための色素体フランクを本質的に含まない、(2)DNA鋳型のコピー数を増すことによって、かつ、ターミネーターエレメントのない「ローリングサークル様」ポリシストロン性の転写を使用することによって著しく高い発現レベルを可能にし、(3)少なくともいくつかの実施形態において、トランスジェニック植物中のマーカー遺伝子の存在が回避される、ベクターを用いた新しい色素体形質転換方法の使用について記述する。
植物バイオテクノロジーの1つの主要な批判は、形質転換した植物中に(ほとんどが細菌の)抗生物質マーカー遺伝子が存在することである。このような遺伝子は、環境中に制御なしに放出されると、望ましくない異系統交配を通して野生種に出現し、又は土壌細菌が媒介する遺伝子水平転移を介して出現し得る懸念がある。第1のシナリオ(異系統交配)は、大部分が母性遺伝のプラストーム導入遺伝子では起こりそうにないが、後者(遺伝子水平転移)を完全に排除することはできない。したがって、抗生物質マーカーのないトランスジェニック植物を生じる遺伝子導入方法を確立することが大いに望まれている。この目標を達成する1つの可能性は、以前に(lamtham及びDay、2000)によって示された。彼らは、形質転換ベクター上の反復エレメントによって媒介される切り出し現象をスクリーニングすることによって、プラストーム形質転換体から抗生物質マーカーを除去できることを示した。本発明において、抗生物質選択マーカーを含まないトランスプラストームを生成するいくつかの異なる手順を記述する。
本発明は、プラストームに挿入すべき目的配列がない場合、たとえば選択マーカー遺伝子を欠くプラストーム欠失突然変異体の生成にも適用することができる。この場合、プラストーム中で欠失させるべき配列に隣接する2つの色素体DNA配列は、形質転換ベクター上の直近に位置する。従来の欠失ベクターにおいては欠失させるべき配列は選択マーカーで置換されるが、本発明者らの系においては選択マーカーには色素体DNA配列が隣接しない。マーカーのない突然変異体の生成は、選択マーカーの一過性の組込みを用いる上述したのと同じ原理によって達成することができる:第1の形質転換体は選択圧下で樹立され、したがって隣接色素体DNA配列の1つを介する第1の組換え現象によって完全な形質転換ベクターが組み込まれたプラストームを含む。選択圧を取り除いた後、第2の色素体DNAセグメントの2コピー間での第2の組換え現象によって、選択マーカーを含むベクター配列が切り出される。この技術によって、プラストーム配列を置換するよりも純粋な欠失が可能になる。また、突然変異体植物は選択マーカーを含まないので、同じ選択マーカーを用いてさらに形質転換を行うことができる。また、同じ技術をさらに用いてアミノ酸変化(amino acid changes)や改変調節エレメントなど既存のプラストーム配列の改変を導入することができる。
本発明は、さらに、一過性のマーカー組込みの方法によって生成される形質転換体をより効率的に識別するための技術を提供する。1つの考えられる方法は、形質転換体の視覚的識別を可能にする配列を挿入することである。このような配列の例は、実施例6に記載するように、色素体において発現され得る緑色蛍光タンパク質(GFP)をコードする配列である。この配列は、色素体DNAフランク間の形質転換ベクター中に目的配列と共に挿入され、したがってプラストームに安定に組み込まれた状態にすることができる。GFPを発現する色素体は緑色蛍光を示すので(Khan及びMaliga、1999;Sidorov等、1999)、このような色素体を含む細胞又はセクターは容易に識別することができる。第2の組換え現象が完全な形質転換ベクター配列を除去する場合、GFPコード配列も除去され、このようなプラストームを含むセクターはもはや蛍光を示さなくなる。これに対し、所望の第2の組換え現象(選択マーカーを含むベクター配列の切り出し及び目的配列の組込み)を示すプラストームは、依然として蛍光性の表現型を生じる。したがって、選択マーカーのないトランスプラストミック細胞又は組織の識別が極めて簡単になる。この手順は、前記配列を含むセクターの視覚的識別を可能にする任意の配列を用いて実施することができる。GFP遺伝子のような遺伝子は形質転換材料に選択上の優位性を付与しないので、遺伝子水平転移による制御のない伝播のリスクが大いに軽減される。また、このような遺伝子は、万一制御されずに伝播しても、ヒト、他の生物又は環境一般に対してなんら予測し得るリスクを含んでいない。
さらに、本発明は、トランスプラストミック植物に残留する唯一の外来配列が目的配列である方法も提供する。この方法は、2つの形質転換を要する2段階手順に基づいている。第1のステップでは、容易に識別可能な表現型を示す色素体突然変異体が産生される。この表現型は、改変された着色によって生じることが好ましい。このような突然変異体の例は、rpoA遺伝子機能が欠損して白色表現型を示す植物(実施例5参照)又はpetA遺伝子機能が欠損して強いクロロフィル蛍光(hcf)を伴う淡緑色表現型を示す植物(実施例2参照)である。別の例は、ycf3(実施例3)及びycf9それぞれの不活性化突然変異体である。遺伝子機能の破壊は、たとえば、遺伝子又はその一部の破損又は欠失によって起こり得る。このような突然変異体の生成は、好ましくは、上述した一過性の選択マーカーが組み込まれ、選択マーカーを欠いた植物が生じる方法を用いた色素体形質転換によって実施される。細胞の突然変異表現型によって、分離後選択なしで所望の植物材料を視覚的に識別することができる。このような突然変異体植物から得られる材料を、今度は第2の形質転換のための基質として使用することができ、1つ又は複数の目的配列がプラストームに導入される。この目的のための形質転換ベクターは、本発明において上述したのと同じ構造を有するが、突然変異体の破壊された遺伝子機能を修復する配列をさらに含む。この修復配列は、目的配列と共に色素体DNAフランク間の形質転換ベクターに挿入することができ、一方、選択マーカー配列はこのフランクの外側にある。形質転換されたプラストームを含む細胞は、野生型の表現型を示すので容易に識別することができる。完全な形質転換ベクターが第2の組換え現象によって切り出される場合、突然変異遺伝子型が再度形成され、その結果、このようなプラストームを含むセクターは突然変異表現型を示す。これに対し、所望の第2の組換え現象(選択マーカーを含むベクター配列の切り出し及び目的配列の組込み)を示すプラストームは野生型の表現型を有し、それによって所望のトランスプラストームを含む組織の識別が簡単になる。また、この方法によって産生されるトランスプラストミック植物は、所望の目的配列から離れたいかなる追加の配列も含まない。この方法に適したプラストーム突然変異体が生成されると、それは増殖し、任意所望の目的配列の導入に使用することができる;したがって、この方法は新しい目的配列ごとに2度の形質転換を必要とせず、単一の形質転換ステップで所望のトランスプラストミック植物を生成することができる。
これまでのところ、aadA及びnptIIが高等植物の色素体形質転換のために日常的に使用できる唯一の選択マーカー遺伝子である。したがって、高等植物の色素体形質転換のためのさらなる選択マーカーが求められている。
本発明は、以下のステップ、すなわち、
(a)細菌アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼA−6(aphA−6)をコードする配列を選択マーカーとして含むDNAを用いて前記多細胞植物の細胞又はプロトプラストの色素体を形質転換すること、
(b)前記形質転換された細胞又はプロトプラストの増殖を、前記増殖細胞又はプロトプラストを所定濃度のアミノグリコシド抗生物質に曝す条件下で可能にすること、
(c)所定濃度のアミノグリコシド抗生物質に曝す条件下での反復再生サイクル中に、形質転換されたプラストーム及び形質転換されていないプラストームの分離、並びに形質転換された色素体又は形質転換されていない色素体の分離を可能にすること、及び
(d)それらのプラストームにおいて遺伝的に形質転換された細胞及び/又は植物を回収することにより、プラストーム中で形質転換されたトランスジェニック多細胞多色素体(multi−plastidal)植物又はそれらの細胞を生成する方法を提供することによってこの問題を解決する。この方法を、好ましくは、PEGによって媒介された高等植物のプロトプラストの形質転換と組み合わせて実施する。上記方法は、すべての多細胞多色素体植物又はそれらの細胞に適用可能である。タバコ(Nicotiana)種が最も好ましい。
この方法で使用すべきアミノグリコシド抗生物質濃度、特にカナマイシン濃度は、形質転換方法に応じて20〜500μg/ml、好ましくは25〜250μg/ml、より好ましくは50〜200μg/mlである(実施例12参照)。
実施例
色素体形質転換ベクターpKCZ
pKCZは、相同組換えに使用される2つのフランクの間に選択マーカーがクローン化された従来の色素体形質転換ベクターである。このベクターは、タバコ色素体ゲノムの逆方向反復領域中のtrnRとtrnNの間に中立的に挿入されるように設計されている(Zou、2001)。pKCZは、相同組換えのための(GenBank受託番号Z00044のNicotiana tabacumプラストーム配列31106〜132277及び132278〜133396に対応する)2つのフランキング配列及び16s rRNAプロモーターの制御下にあるaadA色素体発現カセットを含む(Koop等、1996)。図3にプラスミド構築物の概略図を示す。
微粒子銃によって媒介される色素体形質転換及びその後の選択を実施例3のように実施した。形質転換体の選択は、aadA遺伝子産物によって付与される抗生物質スペクチノマイシン/ストレプトマイシン耐性を基にした。形質転換された色素体ゲノムを増幅し野生型ゲノムを除去するために、第1の形質転換体(サイクル0)を、スペクチノマイシンを含有する選択培地上でいくつかの追加の(小さな葉の外植片からの)再生ラウンドに供した(以下、サイクルI、サイクルIIなどと称する)。
DNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN、Hilden、Germany)を用いて単離したDNAすべてを使用してPCRにより色素体形質転換体(サイクル0)を同定した。aadA遺伝子の有無を決定するために、プライマーoSH81(5’−CTATCAGAGGTAGTTGGCGTC−3’)及びoFCH60(5’−CACTACATTTCGCTCATCGCC−3’)を使用した。PCRプログラムを以下のようにした:94℃3分、1サイクル;94℃45秒、55℃45秒、72℃2分、30サイクル;最終伸張72℃10分。その結果、(打ち込んだ6つの葉の)54分析からの48系が504bpの予想増幅産物を与えた。タバコプラストームにaadAカセットが正確に組み込まれたことを証明するために、プライマーoSH58(5’−TATTCCGACTTCCCCAGAGC−3’)及びoFCH60(5’−CACTACATTTCGCTCATCGCC−3’)を使用した。プライマーoSH58は、タバコプラストーム中のpKCZの右フランク外側(下流)に位置し、oFCH60と組み合わせて逆方向反復におけるtrnRとtrnNの間にあるaadA発現カセットの組込みから予想される2106bpの産物のみを生成することができる。PCRプログラムを以下のようにした:94℃5分、1サイクル;94℃45秒、55℃45秒、72℃3.5分、35サイクル;最終伸張72℃7分。aadA PCR陽性系のうち全48個が予想された2106bpの右フランクaadA産物を与えた。
サイクル0形質転換体のうち10個(1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、2:1、2:4、2:5、2:6及び2:7)を選択してさらに分析を進めた。
通常、安定な色素体形質転換体の産生は、(図1に示すように)形質転換分子の左右各フランクとプラストームの間で起こる2つの同時組換え現象を経て起こると考えられる。図4に、従来の色素体形質転換ベクターpKCZを用いた別の機序を例として示す。ここで、仮想の不安定中間体を生成する結果となる1つの(左又は右)フランクのみとプラストームの組換えによるpKCZベクターの完全な組込みが始めに起こる。続いて、さらなる組換え現象がこの分子のフランク対間で起こり、野生型の状態(ケースI)又は安定に組み込まれたaadAカセット(ケースII)を生成することができる。図4にpKCZの左フランクを介した組換えから得られる状態のみを示す。ただし、右フランクを完全なベクター組込みに使用した場合も同様な状態が起こり得る。この可能性を試験するためにプライマーoSH3(5’−GGCATCAGAGCAGATTG−3’)及びoSH58(5’−TATTCCGACTTCCCCAGAGC−3’)を用いてPCRを実施した。プライマーoSH3はpKCZ(pUC18)のベクターバックボーン中に存在し、プライマーoSH58はタバコプラストーム中のpKCZの右フランク外側(下流)に位置する。図4に示すように完全なpKCZ組込みが起きたとき、これら2つのプライマーを用いて2638bpの産物のみを得ることができる。oSH3の結合部位がないので、(左及び右フランクを含む)野生型プラストーム断片からは予想サイズのPCR産物が得られないはずである。PCRプログラムは以下のとおりであった:94℃5分、1サイクル;94℃45秒、55℃45秒、72℃3.5分、35サイクル;最終伸張72℃7分。分析した10個のサイクル0形質転換体のうち9個が2.6kbのPCR産物を示し、これらの系内の色素体ゲノムへのpKCZの完全な組込みと一致した(図5A)。野生型コントロール又は試料1:1においては正確なサイズの産物は認められなかった。pKCZの完全な組込みは不安定中間体が生成する結果となるので、時間の経過とともにこの分子のフランク対間のさらなる組換え現象によって、野生型の状態(ケースI)又は安定に組み込まれたaadAカセット(ケースII)がもたらされると予想される。そのため、サイクルI及びサイクルII植物材料から調製されるDNA試料を、プライマーoSH3及びoSH58を用いてPCRで分析した。図4に示すモデルが正しい場合、プライマーoSH3及びoSH58が2638bpバンドを増幅できる確率は、選択の各再生サイクルによって減少するはずである。その結果、分析した10個のサイクルI系のうちわずか5個のみが予想サイズの強いPCR産物を与えたことから(図5B)、このことは実際に当てはまることが示唆された。また、サイクルIIでは、予想された2638bpバンドが明確に増幅される系の数はさらに減少した。
図4に示すモデルから、完全なベクター組込みに対して陰性であるサイクルIIの系すべてが、先に記述した分子再配列のために、安定に組み込まれたaadAカセット(ケースII)と一致するPCRシグナルを依然として示すはずであることも予想される。タバコプラストームへのaadAカセットの組込を証明するために、プライマーoSH58(5’−TATTCCGACTTCCCCAGAGC−3’)及びoFCH60(5’−CACTACATTTCGCTCATCGCC−3’)を使用した。PCRプログラムは以下のとおりであった:94℃5分、1サイクル;94℃45秒、55℃45秒、72℃3.5分、35サイクル;最終伸張72℃7分。サイクルII形質転換体のうち10個すべてが予想された2106bpの右フランクaadA産物を示し(図5D)、図4に示すケースIIシナリオと一致した。
色素体petA遺伝子の不活性化のための形質転換ベクターplCF558の構築
Ausubel等、1999に記載された標準手順を用いてすべてのクローニング手順を実施した。
ベクターplCF558は、(GenBank受託番号Z00044のNicotiana tabacumプラストーム配列63335〜64334及び65598〜66597に対応する)2つのフランキング配列及びその間のaadAカセット(pUC16SaadA Sma vollst、Koop等、1996)を含む。組換え用相同フランクはpetA遺伝子の各1kbの5’及び3’配列であった。petA遺伝子(962bp)及びpetA 3’領域の300bpをaadAカセットで置換した。
以下のオリゴ対をプライマーとして用いて、PCRにより両方のフランキング断片を増幅した。すなわち、oSK13(5’−GGAATTCCATATGGTATAAAACTCATGTGTGTAAGAAA−3’)とoSK14(5’−TCCCCCGGGGGTCCAATCATTGATCGCGAAA−3’)により断片末端にNdeI及びSmaI部位を形成し、oSK15(5’−TTCCCCGGGTTCTAAATAGAAAGAAAG TCAAATTTG−3’)とoSK16(5’−CATGCATGCGAATGAATAAGATTCTCTTAGCTC−3’)により断片末端にSmaI及びSphI部位を形成した。使用したPCRプログラムは以下のとおりであった:94℃3分、1サイクル;94℃45秒、55℃45秒、72℃1.5分、30サイクル;最終伸張72℃10分。消化された断片(左/右フランク)及びSmaI断片としてaadAカセットを1段でクローン化してpUC19ベクターとし、これをNdeI及びSphIで開いてベクターplCF558を作製した。構築物plCF558を制限消化によって分析し、PCR増幅断片の配列を決定してフランキング領域の配列が正確かどうかを試験した。形質転換ベクターplCF558を図6及び8に示す。
petA遺伝子の欠失を修復し同時に新しい目的遺伝子(uidA)を導入する第2の形質転換のために、ベクターplCF820を構築した。すなわち、petAコード配列及び(5’/3’調節エレメントを含む)遺伝子カセットを、(ベクターplCF558の場合に用いたのと同じく)左/右フランキング各配列の間にクローン化した。さらに、aphA−6発現カセットを、一過性の発現のためにベクターバックボーン中にクローン化した。1kb左フランク、petA遺伝子配列(962bp)及びpetA遺伝子3’領域の300bpを含む約2.2kbの断片を、以下のオリゴ対をプライマーとして用いてPCR増幅した。すなわち、oSK13(5’−GGAATTCCATATGGTATAAAACTCATGTGTGTAAGAAA−3’)とoSK71(5’−TCCCCCGGGTAGAAAACTATTGATACGTCTTATGG−3’)により断片末端にNdeI及びSmaI部位を形成した。使用したPCRプログラムは以下のとおりであった:94℃3分、1サイクル;94℃45秒、55℃45秒、72℃3分、30サイクル;最終伸張72℃10分。(ベクターplCF558におけると同じく)この断片及び右フランクを一緒にクローン化してNdeI/SphIで開かれたpUC19ベクターとし、ベクターplCF561を得た。このベクターは、Nicotiana tabacumプラストーム配列63335〜66597(GenBank受託番号Z00044)に対応する1kb左フランク、petAコード配列、petA 3’領域の300bp及び1kb右フランクを含む。
構築物すべてを制限消化によって分析し、PCR増幅断片の配列を決定してフランキング領域の配列が正確かどうかを試験した。形質転換ベクターplCF820を図7及び9に示す。
ベクターplCF558を用いた微粒子銃による色素体形質転換及び選択を実施例3に記載したように実施した。PEGによって媒介される、ベクターplCF558を用いた色素体形質転換及び選択を実施例3に記載したように実施した。形質転換体の選択を、aadA遺伝子産物によって付与されるスペクチノマイシン/ストレプチノマイシン(streptinomycin)耐性に基づいて行った。
ベクターplCF820を用いた微粒子銃による色素体形質転換を実施例3に記載したように実施した。PEGによって媒介される、ベクターplCF820を用いた色素体形質転換を実施例3に記載したように実施した。第2の形質転換体の選択を、形質転換色素体におけるaphA−6遺伝子の一過性発現のため、カナマイシン含有培地(25mg/l)上で実施した(完全なベクター組込みによって、カナマイシンマーカーの短期発現が促進される;図9参照)。aphA−6の発現によって付与されたカナマイシン耐性に加えて、形質転換体は、petA遺伝子の再構成を示す濃緑色野生型様表現型を示す。濃緑色再生体(regenerant)を選択培地から取り出し、第1のシュートをB5培地に移して、発根させ生長させた。再構成系は、B5培地上で正常に生長するのに対し、ΔpetA突然変異体はB5培地上での生長が極めて不十分であり発根しない。
植物DNAを単離するため、PCR分析及びサザンブロッティング標準手順を実施例3に記載したように用いた。aadA遺伝子の有無を決定するために、プライマーoFCH59(5’−TGCTGGCCGTACATTTGTACG−3’)及びoFCH60(5’−CACTACATTTCGCTCATCGCC−3’)を用いた。aadAカセットが正確に挿入されたことを証明するために、プライマーoFCH60及びoSK116(5’−AAAATAGATTCATTAGTCCGATACC−3’)を用いた。プライマーoSK116は、左フランクの上流に位置する。使用したPCRプログラムは以下のとおりであった:94℃3分、1サイクル;94℃45秒、55℃45秒、72℃2分、30サイクル;最終伸張72℃10分。PCRの結果から44の再生系が正確にプラストーム挿入されたaadA遺伝子を有することが示された(24打ち込み)。
植物DNAを単離するため、PCR分析及びサザンブロッティング標準手順を実施例3に記載したように用いた。uidA遺伝子の有無を決定するために、プライマーoSM61(5’−TCACACCGATACCATCAGCG−3’)及びoSM62(5’−ATTGTTTGCCTCCCTGCTGC−3’)を用いた。uidAカセットが正確に挿入されたことを証明するために、プライマーoSM61及びoSK138(5’−AATCGTACCAGTCTCTACTGG−3’)を用いた。プライマーoSK138は、右フランクの下流に位置する。petA遺伝子の再構成は、プライマーoSK116及びoSM62を用いたPCRにより証明することができ、欠失petA遺伝子/petA 3’UTR及び新しい挿入uidA遺伝子の各配列を含むPCR増幅断片が示された。使用したPCRプログラムは以下のとおりであった:94℃3分、1サイクル;94℃45秒、55℃45秒、72℃2〜3分、30サイクル;最終伸張72℃10分。
ほとんどの場合、形質転換ベクターplCF820を完全に組み込むことが可能であることがさらに分析して証明された。これは、oSH2/oSK116又はoSH3/oSK138のプライマー組合せを用いたPCRによっても同様になされた。使用したPCRプログラムは以下のとおりであった:94℃3分、1サイクル;94℃45秒、55℃45秒、72℃3分、30サイクル;最終伸張72℃10分。
サザンブロッティングによりさらに分析して、形質転換された系がホモプラストミックとヘテロプラストミックのどちらであるかかが示された。DNAブロット分析を、実施例3に記載したように実施した:植物DNAすべてをNcoI又はBglIIで消化し、断片をゲルで分離し、メンブレン上にブロットした。プロービングのために、DIG標識断片(形質転換ベクターからの左又は右フランク)を用いて野生型と形質転換プラストームを識別した。
ycf3は、最近、タバコにおいて光化学系I(PSI)複合体を安定に蓄積するために必要であることが示された(Ruf等、1997)。この遺伝子が破壊されると、明るいところで条件的な色素欠乏表現型になる。ホモプラスミックΔycf3植物は、標準照度条件(3.5〜4W/m2)下、薬物及び植物ホルモンを含まない培地上で再生すると完全な白色表現型を示し、一方、低照度条件(0.4〜0.5W/m2)下では表現型はそれよりもかなり改善(ライトグリーン)される。
ycf3の(プラストームヌクレオチド46042〜46206(GenBank受託番号Z00044.1による位置番号)に対応する)第1のエキソン及びスプライシング部位をaadAコード領域で置換することによってycf3遺伝子を不活性にするように設計された形質転換ベクターを構築した。このベクターは、(aadAマーカー遺伝子用だけでなく、内在性のycf3又はtRNA遺伝子用の)いかなる3’調節エレメントも含まない。また、プロモーターエレメントは導入されず、aadA遺伝子は内在性のycf3上流調節エレメントによって転写及び翻訳されると予想された。
タバコの種子(Nicotiana tabacum cv.petit havanna)の表面を滅菌し(70%エタノール中1分、5%Dimanin C(Bayer、Leverkusen、Germany)中10分)、無菌水中で10分間3回洗浄し、B5培地(調製については下記参照)上に置いた。25℃、16時間明/8時間暗サイクル(0.5〜1W/m2、Osram L85W/25 Universal−White蛍光灯)で植物を生長させた。
− 破裂板900psi(6.2MPa)
− ヘリウム圧力1100psi(7.6MPa)
− 真空度26〜27 inches Hg(88〜91kPa)
− マクロキャリア:トップレベル
− 葉片:第3レベル
6葉片それぞれに金懸濁液5.4μlを打ち込んだ。打ち込み後、葉片をRMOP培地上で2日間25℃でインキュベートした。
RMOP(KOHでpH5.8):NH4NO3(1650μg/ml)、KNO3(1900μg/ml)、CaCl2・2H2O 440(μg/ml)、MgSO4・7H2O(370μg/ml)、KH2PO4(170μg/ml)、EDTA−Fe(III)Na(40μg/ml)、KI(0.83μg/ml)、H3BO3(6.2μg/ml)、MnSO4・H2O(22.3μg/ml)、ZnSO4・7H2O(8.6μg/ml)、Na2MoO4・2H2O(0.25μg/ml)、CuSO4・5H2O(0.025μg/ml)、CoCl2・6H2O(0.025μg/ml)、イノシトール(100μg/ml)、チアミンHCl(1μg/ml)、ベンジルアミノプリン(1μg/ml)、ナフタレン酢酸(0.1μg/ml)、スクロース(30000μg/ml)、精製寒天(8000μg/ml)。
B5(KOHでpH5.7):KNO3(2500μg/ml)、CaCl2・2H2O(150μg/ml)、MgSO4・7H2O(250μg/ml)、NaH2PO4・H2O(150μg/ml)、(NH4)2SO4(134μg/ml)、EDTA−Fe(III)Na(40μg/ml)、KI(0.75μg/ml)、H3BO3(3μg/ml)、MnSO4・H2O(10μg/ml)、ZnSO4・7H2O(2μg/ml)、Na2MoO4・2H2O(0.25μg/ml)、CuSO4・5H2O(0.025μg/ml)、CoCl2・6H2O(0.025μg/ml)、イノシトール(100μg/ml)、ピリドキシン−HCl(1μg/ml)、チアミン−HCl(10μg/ml)、ニコチン酸(1μg/ml)、スクロース(20000μg/ml)、精製寒天(7000μg/ml)。
VBW(KOHでpH5.8):NH4NO3(1650μg/ml)、KNO3 1900(μg/ml)、CaCl2・2H2O(440μg/ml)、MgSO4・7H2O(370μg/ml)、KH2PO4(170μg/ml)、EDTA−Fe(III)Na(40μg/ml)、KI(0.83μg/ml)、H3BO3(6.2μg/ml)、MnSO4・H2O(22.3μg/ml)、ZnSO4・7H2O(8.6μg/ml)、Na2MoO4・2H2O(0.25μg/ml)、CuSO4・5H2O(0.025μg/ml)、CoCl2・6H2O(0.025μg/ml)、イノシトール(100μg/ml)、ピリドキシン−HCl(0.5μg/ml)、チアミン−HCl(1μg/ml)、グリシン(2μg/ml)、ニコチン酸(0.5μg/ml)、インドリル酢酸(2μg/ml)、キネチン(0.2μg/ml)、スクロース(30000μg/ml)、カゼイン加水分解物(500μg/ml)、精製寒天(7000μg/ml)。
色素体形質転換体をPCR増幅によって同定した。24独立系の第1の再生体から単離したDNAすべてをPCR用の鋳型として用いた。2セットのプライマー(配列は実施例3を参照)、すなわちoFCH59とoFCH60、oFCH52とoFCH53を用いてトランスプラストミック植物を分析した。oFCH52とoFCH53によって、野生型プラストームから900bpの増幅産物が生成し、形質転換プラストームから1476bpの産物が生成するはずであるのに対し、oFCH59とoFCH60では、形質転換植物から480bpの増幅産物が生成し、野生型からは産物は生成しないはずである。その結果、14系の形質転換体が色素体ゲノム中に正確なaadA挿入断片を有していることがわかる。データはそれぞれの系の表現型にも一致し、色素欠乏がycf3の欠失と相関することが示されている。
ycf3遺伝子を再構成し、aadA遺伝子を除去し、同時にuidA遺伝子を導入し、1フランク組込みによってカナマイシン耐性を付与するaphA−6遺伝子を一過性に導入する目的で、突然変異Δycf3系を形質転換するように形質転換ベクターplCF7611を設計した。
プロトプラストへのPEG媒介膜貫通DNA導入は、高等植物の色素体形質転換のための再現性のよい方法である(Golds等、1993;O’Neill等、1993)。最近、Dovzhenko等、1998によってプロトプラスト再生が最適化された。
A.プロトプラスト単離:低照度条件下の固体VBW培地で生長させた無菌ホモプラストミックΔycf3突然変異体からの葉を1mm細片に切り、F−PIN培地に溶解した0.25%セルラーゼR10及び0.25%macerozyme R10(Yakult、Honsha Japan)と共に終夜インキュベートした。ろ過、浮遊及び沈降の各標準操作(Koop等、1996)に従って、プロトプラストを形質転換培地に再懸濁し、プロトプラストの総数を決定し、密度を5×106プロトプラスト/mlに調整した。
F−PIN媒体(pH5.8(KOH)、浸透圧モル濃度:550mOsm):KNO3(1012μg/ml)、CaCl2・2H2O(440μg/ml)、MgSO4・7H2O(370μg/ml)、KH2PO4(170μg/ml)、コハク酸アンモニウム(10mlの2M保存溶液)、EDTA−Fe(III)・Na−塩(40μg/ml)、KJ(0.75μg/ml)、H3BO3(3μg/ml)、MnSO4・H2O(10μg/ml)、ZnSO4・7H2O(2μg/ml)、Na2MoO4・2H2O(0.25μg/ml)、CuSO4・5H2O(0.025μg/ml)、CoCl2・6H2O(0.025μg/ml)、イノシトール(200μg/ml)、ピリドキシン−HCl(2μg/ml)、チアミン−HCl(1μg/ml)、ビオチン(0.02μg/ml)、ニコチン酸(2μg/ml)、BAP(1μg/ml)、NAA(0.1μg/ml)、両性バッファー74(10ml)、スクロース(〜130000μg/ml)。
変換媒体(pH5.8(KOH)、浸透圧モル濃度:550mOsm):MgCl2・6H2O(3050μg/ml)、MES(1000μg/ml)、マンニトール(〜80000μg/ml)。
F−PCN媒体(pH5.8(KOH)、浸透圧モル濃度:550mOsm):KNO3(1012μg/ml)、CaCl2・2H2O(440μg/ml)、MgSO4・7H2O(370μg/ml)、KH2PO4(170μg/ml)、コハク酸アンモニウム(10mlの2M保存溶液)、EDTA−Fe(III)・Na−塩(40μg/ml)、KJ(0.75μg/ml)、H3BO3(3μg/ml)、MnSO4・H2O(10μg/ml)、ZnSO4・7H2O(2μg/ml)、Na2MoO4・2H2O(0.25μg/ml)、CuSO4・5H2O(0.025μg/ml)、CoCl2・6H2O(0.025μg/ml)、イノシトール(200μg/ml)、ピリドキシン−HCl(2μg/ml)、チアミン−HCl(1μg/ml)、ビオチン(0.02μg/ml)、ニコチン酸(2μg/ml)、BAP(1μg/ml)、NAA(0.1μg/ml)、両性バッファー 74(10ml)、スクロース(〜20000μg/ml)、グルコース(65000μg/ml)。
F−アルギン酸媒体(pH5.8(KOH)、浸透圧モル濃度:550mOsm):MES(1370μg/ml)、MgSO4・7H2O(2500μg/ml)、MgCl2・6H2O(2040μg/ml)、マンニトール(77000μg/ml)、アルギン酸(24000μg/ml)。
Ca 2+ −媒体(pH5.8(KOH)、浸透圧モル濃度:550mOsm):MES(1950μg/ml)、CaCl2・2H2O(2940μg/ml)、マンニトール(82000μg/ml)、精製寒天(10000μg/ml)。
色素体形質転換体をPCR増幅により同定した。緑色表現型を示し光独立栄養的に生長可能である第1の形質転換体から単離したDNAすべてを、以下のオリゴヌクレオチドプライマー、すなわち、oSM61(uidAコード領域の5’部分由来の5’−TCACACCGATACCATCAGCG−3’)、oSM62(uidAコード領域の3’部分由来の5’−ATTGTTTGCCTCCCTGCTGC−3’)、oFCH27(5’−TGC TCA AGA CTT TAG TGG ATC−3’、プラストームヌクレオチド44799〜44819でアニーリング)、oSM58(5’−TATTCCGACTTCCCCAGAGC−3’、プラストームヌクレオチド109138〜109157でアニーリング)、oFCH168(aphA−6コード領域の5’部分由来の5’−TCA GTC GCC ATC GGA TGT TT−3’)及びoFCH169(aphA−6コード領域の3’部分由来の5’−ACC AAT CTT TCT TCA ACA CG−3’)を用いるPCR分析の鋳型として使用した。再構成植物から500bpの増幅産物を生成し、未変化の第1のラウンドの形質転換体からは産物を生成しないはずであるoSM61及びoSM62を、uidA遺伝子の存在を検出するために用いた。oFCH27とoSM61の組合せは、正確に形質転換されたプラストームからの約3000bpの産物を増幅することによって、第2のラウンドの形質転換体が正確なgus挿入断片を有するか否かを決定することができる。oFCH168及びoFCH169を、aphA−6遺伝子の存在を検出するために用いた。oSM58及びoFCH169を、1相同フランクを介した(aphA−6遺伝子を含む)完全なベクター配列の組込みを検出するために用いた。合計2つの独特なycf3再構成タバコ色素体形質転換体が、1つのPEG形質転換実験から得られた。データから、uidA遺伝子が2つの相同フランクを介する組込みによって色素体ゲノムに組み込まれるのに対し、aphA−6遺伝子が1つのフランクを介する組込みによって導入されることが示されている。
形質転換及びカナマイシン耐性形質転換体の選択
形質転換ベクターplCF7611(構築については実施例3を参照)を、PEG媒介方法(詳細は実施例3を参照)によって野生型タバコに形質転換した。
色素体形質転換体をPCR増幅によって同定した。緑色表現型及びカナマイシン耐性を示す第1の形質転換体から単離したDNAすべてを、以下のオリゴヌクレオチドプライマー、すなわち、oSM61(uidAコード領域の5’部分由来の5’−TCACACCGATACCATCAGCG−3’)、oSM62(uidAコード領域の3’部分由来の5’−ATTGTTTGCCTCCCTGCTGC−3’)、oFCH27(5’−TGC TCA AGA CTT TAG TGG ATC−3’、プラストームヌクレオチド44799〜44819でアニーリング)、oSM58(5’−TATTCCGACTTCCCCAGAGC−3’、プラストームヌクレオチド109138〜109157でアニーリング)、oFCH168(aphA−6コード領域の5’部分由来の5’−TCA GTC GCC ATC GGA TGT TT−3’)及びoFCH169(aphA−6コード領域の3’部分由来の5’−ACC AAT CTT TCT TCA ACA CG−3’)を用いるPCR分析の鋳型として使用した。形質転換体から500bpの増幅産物を生成し、野生型からは産物を生成しないはずであるoSM61及びoSM62を、uidA遺伝子の存在を検出するために用いた。oFCH27とoSM61の組合せは、正確に形質転換されたプラストームからの約3000bpの産物を増幅することによって、形質転換体が正確なuidA挿入断片を有するか否かを決定することができる。oFCH168及びoFCH169を、aphA−6遺伝子の存在を検出するために用いた。oSM58及びoFCH169を、1相同フランクを介した(aphA−6遺伝子を含む)完全なベクター配列の組込みを検出するために用いた。合計2つのタバコ色素体形質転換体が、1つのPEG形質転換実験から得られた。データから、uidA遺伝子が2つの相同フランクを介する組込みによって色素体ゲノムに安定に組み込まれるのに対し、aphA−6遺伝子が1つのフランクを介する組込みによって導入されることが示されている。
色素体染色体は、4つのRNAポリメラーゼ遺伝子、すなわち、真正細菌の3つのRNAポリメラーゼコア遺伝子に類似している設計されたrpoA、B、C1及びC2をコードする。rpoB、C1及びC2の遺伝子は(NEPによって転写された)オペロン中に整列し、一方、rpoAの遺伝子は、リボソームタンパク質を主にコードする大きな遺伝子クラスター中に位置する。PEP(色素体によってコードされるポリメラーゼ)突然変異体においてはrpoA遺伝子のセンス転写物レベルが減少するので(Krause等、2000)、rpoAはPEPによって転写されている可能性がある。
(プラストームヌクレオチド81359〜81468に対応する)rpoAコード領域の第1の110bpをuidAコード領域で置換することによってrpoA遺伝子を不活性化するように設計した形質転換ベクターを構築した。このベクターは、いかなる3’調節エレメントも含まない。また、プロモーターエレメントは導入されず、Gus遺伝子は内在性のrpoA上流調節エレメントによって転写され翻訳されると予想される。
形質転換ベクターplCF836を、PEG媒介方法(詳細は実施例3を参照)によって野生型タバコに形質転換した。
色素体形質転換体をPCR増幅によって同定した。カナマイシン耐性を示す第1の形質転換体から単離したDNAすべてを、以下のオリゴヌクレオチドプライマー、すなわち、oSM61(uidAコード領域の5’部分由来の5’−TCA CAC CGA TAC CAT CAG CG−3’)、oSM62(uidAコード領域の3’部分由来の5’−ATT GTT TGC CTC CCT GCT GC−3’)、oFCH121(タバコプラストーム配列80240〜80259に対応する5’−TAA ATC CCT AAC TTT AGG TC−3’)、oFCH168(aphA−6コード領域の5’部分由来の5’−TCA GTC GCC ATC GGA TGT TT−3’)及びoFCH169(aphA−6コード領域の3’部分由来の5’−ACC AAT CTT TCT TCA ACA CG−3’)を用いるPCR分析のための鋳型として使用した。形質転換体から500bpの増幅産物を生成し、野生型からは産物を生成しないはずであるoSM61及びoSM62を、uidA遺伝子の存在を検出するために用いた。oFCH121とoSM61の組合せは、正確に形質転換されたプラストームからの約1620bpの産物を増幅することによって、形質転換体が正確なgus挿入断片を有するか否かを決定することが可能である。oFCH168及びoFCH169を、約500bpの産物を増幅することによってaphA−6遺伝子の存在を検出するために用いた。合計4つのタバコ色素体形質転換体が、1つのPEG形質転換実験から得られた。その結果、uidA遺伝子が2つの相同フランクを介する組込みによって色素体ゲノムに安定に組み込まれるのに対し、aphA−6遺伝子が1つのフランクを介する組込みによって導入されることが示されている。このデータは、それぞれの系の表現型にも一致し、色素欠乏がrpoAの欠失と相関することが示された。
rpoA遺伝子を再構成し、同時にインターフェロン遺伝子を導入し、カナマイシン耐性を付与するaphA−6遺伝子を一過性に導入する目的で、突然変異体ΔrpoA系を形質転換するように形質転換ベクターplCF838を設計した。
Prrn16Sプロモーター−インターフェロン断片を、まずPst I/Kpn Iを用いてplCF781−3から切断し、次いでPst I/Kpn Iを用いて線形化したpUC19に連結してplCF834を得た。2つの増幅されたフランクを対応する酵素で消化し、Prrn16Sプロモーター−インターフェロン断片と共にplCF834に逐次連結してplCF837を得た。
形質転換ベクターplCF838を、PEG媒介方法(詳細は実施例3参照)によってΔrpoA突然変異体系に形質転換した。
色素体形質転換体をPCR増幅により同定した。緑色表現型を示し光独立栄養的に生長可能である第1の形質転換体から単離したDNAすべてを、以下のオリゴヌクレオチドプライマー、すなわち、oMF228(インターフェロンコード領域の5’部分由来の5’−GGA ATT CCAT ATG TGT GAT CTG CCT CAA ACC CAC AG−3’)、oMF229(インターフェロンコード領域の3’部分由来の5’−CGGGGTACCTCATTCCTTACTTCTTAAACTTTC−3’)、oFCH121(タバコプラストーム配列80240〜80259に対応する5’−TAA ATC CCT AAC TTT AGG TC−3’)、oFCH168(aphA−6コード領域の5’部分由来の5’−TCA GTC GCC ATC GGA TGT TT−3’)及びoFCH169(aphA−6コード領域の3’部分由来の5’−ACC AAT CTT TCT TCA ACA CG−3’)を用いるPCR分析の鋳型として使用した。再構成植物から500bpの増幅産物を生成し、未変化の第1のラウンドの形質転換体からは産物を生成しないはずであるoMF228及びoMF229を、インターフェロン遺伝子の存在を検出するために用いた。oFCH121とoMF228の組合せは、正確に形質転換されたプラストームからの約1730bpの産物を増幅することによって、第2のラウンドの形質転換体が正確なインターフェロン挿入断片を有するか否かを決定することが可能である。oFCH168及びoFCH169を、aphA−6遺伝子の存在を検出するために用いた。合計11個の独特なrpoA再構成タバコ色素体形質転換体が、1つのPEG形質転換手順から得られた。データから、インターフェロン遺伝子が2つの相同フランクを介する組込みによって色素体ゲノムに組み込まれるのに対し、aphA−6遺伝子が1つのフランクを介する組込みによって導入されることが示されている。
本実施例は、分離中の形質転換組織の視覚識別がGFP発現によって補助される、一過性のマーカー組込みを用いた、抗生物質耐性遺伝子を欠くトランスプラストミック植物の生成について記述する。本実施例に記載する形質転換ベクター(plCF846)は、rpoA再構成ベクターplCF838(実施例5参照)を基にしている。すなわち、このベクターは、突然変異体の再構成だけでなく、野生型植物の形質転換にも使用でき、それによってプラストーム中のrpoAの上流に目的配列(この場合、インターフェロンコード配列)が挿入される。形質転換体の視覚識別を可能にするために、GFPをコードする配列を、インターフェロンとrpoAコード配列の間に挿入する。この目的のために、人工リボソーム結合部位(Eibl等、1999)、タバコrbcL遺伝子から下流のボックス及びGFPコード配列からなるカセットをプラスミドplCF837(実施例5参照)のKpnI制限部位に挿入する;その後、上述したように(実施例5)、aphA−6マーカーカセットをフランキング領域外側のScaI部位に挿入する。
色素体形質転換ベクターplCFB1の構築
タバコrrn16プロモーターの制御下にあり大腸菌に由来するアミノグリコシド3’−アデニルトランスフェラーゼ(aadA)からなるカセットを、以下のようにクローン化した。すなわち、rrn16プロモーターを含むDNA断片を、プライマー「5−24」(5’−ccgaattcgccgtcgttcaatgag−3’)及び「3−21」(5’−cacgatatcgcccggagttg−3’)を含むタバコ(Nicotiana tabacum cv.Petite Havana)DNAからPCRによって増幅した。増幅断片をEcoRI及びEcoRVで切断した。
タバコrbcL遺伝子のリボソーム結合部位(RBS)を含むリンカーDNA断片を、プライマー「5−rbs」(5’−ctcgatatcactagttgtagggaggga−3’)及びプライマー「3−rbs」(5’−gtgccatggatccctcct−3’)をアニールすることによって構築した。KlenowDNAポリメラーゼでオーバーハングを平滑末端化し、断片をEcoRV及びNcoIで切断した。
Chlamydomonas reinhardtii rbcL下流領域の440bp断片に融合した細菌aadAコード配列を含む(Dr.M.Goldschmidt−Clermont、Department of Plant Biology and Molecular Biology、University of Geneva、Switzerland;Goldschmidt−Clermont、1991によって提供された)プラスミドpUC−atpX−AADを、EcoRI及びNcoIで切断して本来のプロモーター断片を除去した。EcoRV及びNcoIで処理したRBS断片並びにEcoRI及びEcoRVで処理したrrn16プロモーター断片を、プロモーターのないpUC−atpX−AADベクターに同時に挿入して、プラスミドpUC16SaadAを得た。リンカーオリゴヌクレオチド(gaattcccgggaattc)をEcoRI部位(pUC16SaadA−Sma)に挿入することによって、rrn16プロモーター上流にさらにSmaI/XmaI部位を作製した。
タバコの種子(Nicotiana tabacum cv.petite Havana)の表面を滅菌し(70%エタノール中1分、5%Dimanin C(Bayer、Leverkusen、Germany)中10分)、無菌水中で10分間3回洗浄し、B5培地(下記参照)上に置いた。25℃、16時間明/8時間暗サイクル(0.5〜1W/m2、Osram L85W/25 Universal−White蛍光灯)で植物を生長させた。
破裂板900psi(6.2MPa);ヘリウム圧力1100psi(7.6MPa);真空度26〜27 inches Hg(88〜91kPa);マクロキャリア トップレベル;葉片 第3レベル
植物DNAの単離
ミキサーミルMM 300(Retsch、Germany)を用い、1個の3mmタングステンカーバイドビーズを含む1.5mlマイクロ遠心管に入れて、AP1緩衝液(DNeasy植物ミニキット、QIAGEN、Hilden、Germany)200μlと試薬DX(発泡抑制、QIAGEN)1μl中で新鮮な葉組織100mgを粉砕した(2×1分25Hz)。次いで、DNeasy植物ミニキットを用いてDNAを精製した。
分析植物当たり合計1μgの植物DNAをNcoIで消化し、1%アガロースゲルで分離した。標準手順(Ausubel等、1999:Short protocols in molecular biology、Wiley、第4版、ユニット2.9A)に従い、DNAを変性させ、正に帯電したナイロンメンブレン(Hybond−N+、Amersham Pharmacia Biotech、UK)に移した。メンブレンを250mMリン酸ナトリウム、7%SDS中65°でα32P標識プローブとハイブリダイズし、同じ温度で0.5×SSC、0.1%SDSで洗浄した。ハイブリダイゼーションシグナルをPhosphoimager(Fujifilm BAS 1500)を用いて検出した。
植物中での増殖後における形質転換ベクターの完全性を試験するために、トランスプラストミック植物系239−2(3サイクルの繰り返しシュート再生)から単離した植物DNAを用いて大腸菌の形質転換を行った(標準CaCl2法)。この形質転換によって、アンピシリン耐性細菌コロニーが生成し、これを用いて標準アルカリ溶解法に従ってプラスミドを調製した。これらのコロニーから単離したプラスミドの制限分析から、最初の色素体形質転換ベクターplCFB1と同じ制限パターンが得られ(図18)、プラスミドが組換え再配列(recombinatory rearrangements)なしにトランスプラストミック植物中で増殖し、当初の形質転換ベクターとして回収できることが実証された。
フランキング相同組換え現象によってプラストーム中にそれらの一部が組み込まれるのを防止する自己複製色素体形質転換ベクターを構築するために、プラスミドplCFB1を1本の色素体配列のみを含むように改変した。また、キメラaadA遺伝子のターミネーター配列を除去して環状プラスミドを廻る連続転写を可能にした。
プラスミドplCFB1(実施例7参照)をPstIで切断し、続いて再連結することによって、ターミネーターのないaadA配列と共にplCFB1の左色素体DNAフランク(図19)のみを含む形質転換ベクターplCF652を作製した。
plCFB1から右フランクをSacI及びXbaIを用いて切り出し、T4DNAポリメラーゼで処理した1.1kb断片をプラスミドpUC16SaadA−Smaに挿入し(実施例7参照)、PstI及びHindIIIで切断し、T4DNAポリメラーゼで処理してターミネーター配列を除去することによって、ターミネーターのないaadA配列と共にplCFB1の右フランク(図20)のみを含む形質転換ベクターplCF653を作製した。連結によって2つの向きに挿入断片を有する2つの異なるプラスミド、すなわちplCF6531及びplCF6532が生じ、これら両方を植物形質転換に使用した。
ターミネーターのないaadA配列と共にplCFB1の右フランクの部分のみを含む形質転換ベクターplCF654及びplCF655(図21及び22)を、plCFB1からの0.3kb ScaI−XbaI断片(plCF654の場合)又は0.8kb SacI−ScaI断片(plCF655の場合)を使用する以外はplCF653と同様にして構築した。
色素体における自己複製に必須のエレメントを規定するために、得られたプラスミドを用いて、実施例7に記載したようにタバコの形質転換を行った。
形質転換された植物系の色素体における自己複製色素体形質転換ベクターの有無及び相対的なコピー数を、実施例7に記載したように、3サイクルの繰り返しシュート再生後に検討する。
実施例8に従って同定した、色素体において自己複製をもたらす断片を選択して導入遺伝子発現カセットを構築する。これらの発現カセットにおいて、翻訳をもたらす5’上流配列を含む目的遺伝子を、ターミネーターのないaadAカセットの下流に挿入する。この目的のために、タバコrps19/rpl22遺伝子間領域(ctgcagataaaaaaaatctacatgcttatgattcagtagtaggaggcaaacc)の非コード配列からの52bp断片と組み合わせたuidAコード配列を、プラスミドplC582(実施例11参照)からPstI及びKpnIを用いて切り出し、T4DNAポリメラーゼを用いて平滑末端化する。この断片を、plCF652のT4DNAポリメラーゼで処理したPstI部位に挿入して、色素体発現ベクターplCF652−GUSを得る。同様に、この断片を、plCF653及びplCF655のT4DNAポリメラーゼ処理KpnI部位にも挿入して、それぞれ色素体発現ベクターplCF653−GUS及びplCF655−GUSを作製する。色素体発現ベクターplCF654−GUSを構築するため、実施例8に記載したように、前記断片を0.3kb ScaI−XbaI断片と共にPstI/HindIIIで切断したプラスミドpUC16SaadA−Smaに連結する。発現カセットの正確な向きを制限分析によって決定する。得られたプラスミドを用いて、実施例7に記載したように、タバコを形質転換する。
プラスミドpetAOri1−4は、選択マーカーとしてpetA遺伝子が用いられる以外は、実施例8の実験で定義したのと同じ複製エレメントを含む。これらのベクターは、petA欠乏植物を形質転換して、光独立栄養生長能力を回復するように設計されている。aadAカセットによりpetAコード配列が欠失するplC558の形質転換によって、PetA欠乏タバコ植物を作製した。ベクターpetAOri0は、5’調節エレメント、petAコード配列、スペーサー(RBS)及び目的遺伝子のコード配列(uidA)で構成されるジシストロン(dicistronic)オペロンを含む。このベクターから、自己複製をもたらす追加のDNA断片を含む4つの誘導体が構築される(petAOri1、petAOri2、petAOri3、petAOri4)。
すべてのクローニング手順を、実施例7及びAusubel等、1999に記載された標準手順を用いて実施した。
ベクターplC558は、aadAカセット(pUC16SaadA−Sma、Koop等、1996、実施例7参照)に隣接するタバコプラストームから誘導される2つのフランキング配列を含む。相同配列は、petA遺伝子の各1kbの5’領域及び3’領域である。aadAカセットによって、petA遺伝子(962bp)及びpetA3’領域の300bpが置換される。
プライマーとして以下のオリゴヌクレオチド対、すなわち、末端にNdeI及びSmaI部位を生じるoSK13(5’−GGAATTCCATATGGTATAAAACTCATGTGTGTAAGAAA−3’)とoSK14(5’−TCCCCCGGGGGTCCAATCATTGATCGCGAAA−3’)、及び断片末端にSmaI及びSphI部位を生じるoSK15(5’−TTCCCCGGGTTCTAAATAGAAAGA AAGTCAAATTTG−3’)とoSK16(5’−CATGCATGCGAATGAATAAGATTCTCTTAGCTC−3’)を用いてPCRによって両方のフランキング断片を増幅した。使用したPCRプログラムは以下のとおりであった:94℃3分、1サイクル;94℃45秒、55℃45秒、72℃1.5分、30サイクル;最終伸張72℃10分。消化した断片(左/右フランク)及びSmaI断片としてaadAカセットを、NdeI及びSphIで消化したpUC19ベクターに1段でクローン化した。構築物plC558を制限実験により分析した。PCR増幅断片の配列を決定し、フランキング領域の配列が正確なことを証明した。
ベクターplC558を用いた微粒子銃による色素体形質転換及び選択を実施例7に記載したように実施した。ホモプラストミックpetA欠乏植物を、ベクターpetAOri1、petAOri2、petAOri3、petAOri4を用いた色素体形質転換の標的として使用することができる。
形質転換体候補の分析を実施例7に記載したように実施した。
ベクターpetAOri1、petAOri1、petAOri2、petAOri3、petAOri4の構築を以下のように実施した。すなわち、5’末端にBamHI制限部位を生じるプライマー「petAfor」(5’aaaaggarccatgcaaactagaaatgctttttcttg3’)及び「petArev」(5’ctagaaattcatttcggccaattgaa3’)を用いてPCRによってpetAコード配列を増幅した。使用したPCRプログラムは以下のとおりであった:94℃3分、1サイクル;94℃45秒、55℃45秒、72℃1.5分、30サイクル;最終伸張72℃10分。ベクターpUC16SaadA−Sma(Koop等、1996、実施例7参照)の5’調節エレメントをEcoRI/BamHI消化によって切り出した。増幅したpetA遺伝子断片及び5’調節エレメントを、EcoRI及びSmaiで消化したベクターpUC19に1段でクローン化した。
petA遺伝子に対して下流にあるRBS及びuidA遺伝子をクローン化するために、RBS及びuidA遺伝子を含むDNA断片をベクターpUC16SRBSuidA(Koop等、1996)からKpnI及び部分的なEcoRV消化によって切り出した。単離した断片を平滑末端化し、petAコード配列及び5’調節エレメントを含むベクターに連結した。この連結のためのクローニング部位として、同様に平滑末端化したXbaI部位を用いた。
この構築物を制限実験によって分析し、PCR増幅petAコード配列の配列を決定して、配列が正確であることを証明した。
このベクターpetAOri0を使用してベクターpetAOri1、petAOri2、petAOri3、petAOri4を構築した。すなわち、petAOri0をHindIIIで切断し、その付着末端をT4DNAポリメラーゼで処理して平滑末端化した。ベクターpetAOri1を構築するために、ベクターplCFB1(実施例7参照)の左フランクをSmaIで消化して切り出し、ベクターpetAOri0の平滑末端化したHindIII部位に連結した。ベクターpetAOri2を構築するために、ベクターplCFB1の右フランクをSacI/XbaIで消化して切り出し、平滑末端化し、平滑末端化したHindIII部位に連結した。ベクターpetAOri3を構築するために、ベクターplCFB1の右フランクの0.3kb断片をScaI/XbaIで消化して切り出し、平滑末端化し、平滑末端化したHindIII部位に連結した。ベクターpetAOri4を構築するために、ベクターplCFB1の右フランクの0.8kb断片をSacI/ScaIで消化して切り出し、平滑末端化し、平滑末端化したHindIII部位に連結した。
これらの構築物を制限実験で分析して、クローニングが正確であることを証明した。色素体形質転換ベクターpetAOri0を図23に示す。
ベクターpetAOri1、petAOri2、petAOri3、petAOri4を用いた色素体形質転換のための標的としてホモプラストミックpetA欠乏植物を使用することができる。これらのベクターを用いた微粒子銃による色素体形質転換を実施例7に記載したように実施する。形質転換体の選択を、RMOP培地上でスクロース含量を削減して(0.3%)実施する。petAが再構成された形質転換体は、生長のために光合成エネルギーを利用することができる。再生サイクルの増加中に形質転換体はhcf(高いクロロフィル蛍光)の減少も示すはずである。形質転換体候補の分析を実施例7に記載したように実施する。
1つ又は複数の目的遺伝子をプラストームに安定に組み込むシャトルベクターを構築するために、色素体において(実施例8に従って同定された)自己複製を媒介する断片を選択した。
EcoRI及びSphI各認識部位間にあるプラスミドpUC19のマルチクローニング部位を、合成オリゴヌクレオチド5’−AATTCGGGCCCGTCGACCCTGCAGGCCCGGGGATCCATATGCCATGGTCTAGATGATCATCATCACCATCATCACTAATCTAGAGAGCTCCTCGAGGCGGCCGCGCATGCATG−3’で置換し、プラスミドplCF567を得た。
プラスミドplCF567をBsp120I及びHindIIIで消化した。2641bpのベクター断片をアガロースゲル電気泳動により精製し、断片plCF567−B/Hを得た。bp357〜1335のN.tabacumプラストームpsbA 3’領域をプライマー5’−TATAGGGCCCAGCTATAGGTTTACATTTTTACCC−3’及び5’−CATGCTGCAGCAAGAAAATAACCTCTCCTTC−3’を用いNicotiana tabacum cv.Petite Havanaから単離したDNAを鋳型としてPCRにより増幅した。bp155394〜353のN.tabacumプラストームrpl2 3’領域をプライマー5’−TTTCCTGCAGTTATTCATGATTGAGTATTC−3’及び5’−CCAGAAAGAAGTATGCTTTGG−3’を用いNicotiana tabacum cv.Petite Havanaから単離したDNAを鋳型としてPCRにより増幅した。増幅されたpsbA 3’領域をBsp120I及びPstIで消化し、Qiagen(Hilden、Germany)のPCR精製キットを用いて精製し、左フランクB/Pを得た。増幅されたrpl2 3’領域をHindIII及びPstIで消化し、Qiagen(Hilden、Germany)のPCR精製キットを用いて精製し、右フランクP/Hを得た。3つの断片plCF567−B/H、左フランクB/P及び右フランクP/HをT4リガーゼにより同時に連結してプラスミドplCF569を得た。
大腸菌aadA遺伝子を、プライマー5’−TGAATTCCCATGGCTCGTGAAGCGG−3’及び5’−TATGGATCCTTGCCAACTACCTTAGTGATCTC−3’を用いてプラスミドpFaadA II(Koop等、1996)を鋳型としてPCRにより増幅した。PCR産物をNcoI及びBamHIで消化し、同じ制限酵素で予め消化したplC567に連結して、plCF506を得た。N.tabacum rpl32 3’−UTRを、プライマー5’−ACAAGAGCTCATAAGTAATAAAACGTTCGAATAATT−3’及び5’−AATTCCTCGAGTAGGTCGATGGGGAAAATG−3’を用いて、N.tabacumDNAを鋳型としてPCRにより増幅した。N.tabacum rpl32 3’−UTRをSacI及びXhoIで消化し、同じ制限酵素で予め消化したplCF506に連結して、plCF519を得た。
大腸菌aadA配列及びN.tabacum rpl32−3’−UTRを、プライマー5’−GGATCCATGCGTGAAGCGGTTATCGCCG−3’及び5’−AATTCCTCGAGTAGGTCGATGGGGAAAATG−3’を用いてPCRにより増幅した。大腸菌uidA配列を、プライマー5’−CTGGGTACCTTATTGTTTGCCTCCCTGCTGCG−3’及び5’−CATGCCATGGTCCGTCCTGTAGAA−3’を用いて、プラスミドpRAJ275(Mike Bevan、GenBank受託番号U02456.1)を鋳型としてPCRにより増幅した。各PCR産物をQiagenのPCR精製キットで精製してそれぞれaadA+Trpl32及びuidAを得た。6pmolのaadA+Trpl32及び50pmolのオリゴヌクレオチド5’−GGGGTACCAGTTGTAGGGAGGGATCCATGCGTGAAGC−3’をTaqポリメラーゼと0.2mM dNTPを含有する1×Taq緩衝液(MBI)中、72℃で20分間インキュベートした。得られた断片は5’RBS領域を含み、RBS+aadA+Trpl32が得られた。これをKpnI及びXhoIで消化してRBS+aadA+Trpl32−K/Xを得た。PCR産物uidAをKpnI及びNcoIで消化してuidA−N/Kを得た。プラスミドplCF567をPstI及びXbaIで消化し、0.8%アガロースゲル上で精製した。2690bpにおけるベクター断片を精製し、plCF567−P/Xを得た。plCF567−P/X 0.6pmol及び300pmolの合成オリゴヌクレオチドSrps19/rpl22(5’−CTATACCATGGTTTGCCTCCTACTACTGAATCATAAGCATGTAGATTTTTTTTATCTGCA−3’)をT4リガーゼと共にインキュベートし、続いて第2の鎖をTaqポリメラーゼを用いて72℃で平滑化した。得られた産物をNcoI及びXhoIで消化してplCF567−N/Xを得た。plCF567−N/X 25fmol、uidA−N/K 25fmol及びRBS+aadA+Trpl32−K/X 25fmolをT4リガーゼを用いて連結して、ベクターplCF576を得た。
プラスミドplCF576をPstI及びMph1103Iで消化した。SpsaA/B+uidA+RBS+aadA+Trpl32を含む断片をアガロースゲル上で精製し、PstIを用いて予め線形化したplCF569に連結して、プラスミドplCF582を得た。
plCF582からのaadA遺伝子をKpnI及びSacIで消化して除去した。Klenow断片を用いて突出末端を除去し、T4リガーゼを用いてベクターを移して(relegate)、plCF582Aを得た。異種uidA遺伝子を含めたpsbA−rpl2各フランクをplCF582AからBsp120I及びHindIIIを用いて除去した。psbA−uidA−rpl2断片末端をKlenow断片で平滑化し、予めNdeIで線形化しKlenow断片で平滑末端化したプラスミドplCF6521に連結し(実施例8参照)、plCMF1を得た。
plCF6521の代わりにplCF6531(実施例8参照)を用いた以外はplCMFl1に対して記述したのと同様に構築を実施した。
aadAに先行するベクター領域を、プライマー5’−gatcggtaccatgttctttcctgcgttat−3’及び5’−gatcggtaccaaagtgtaaagcctggggtg−3’を用いてPCRによりplCMF2から増幅した。PCR産物をKpnIで消化し、KpnIを用いて予め線形化したplCMFl2に連結した。得られたプラスミドの配列を決定し、aadAの組み込まれたPCR産物3’の向きがaadAの鋳型領域5’の場合と同じであるプラスミド(plCMFR)を選択して、aadA配列をダイレクトリピートに隣接させる。したがって、これら2つの配列エレメント間の相同組換えによってaadAカセットを切り出すことができる。
ベクタークローニング
a)形質転換ベクターplCF6061及びplCF6062の構築
逆方向反復領域中のtrnNとtrnRの遺伝子間に外来配列を導入するためのベクターは、相同組換え用タバコフランク(GenBank受託番号Z00044によるプラストームヌクレオチド131106〜132277及び132278〜133396)を含むベクターpKCZ(Zou、2001)に基づく。これらのフランク間のaadA発現カセット(Koop等、1996)をNotI消化により除去し、中間体構築物(plCF603)からBsp120I/NotI断片として得られるaphA−6発現カセットで置換する。Bsp120IとNotIは互換性があるので、2つのクローン、すなわちplCF6061(右フランクの近位にある16S rRNAプロモーター)及びplCF6062(左フランクの近位にある16S rRNAプロモーター)が得られる。発現カセットを、PCR増幅色素体調節エレメントの16S rRNAプロモーター(プラストームヌクレオチド102571〜102659)、psbA 5’UTR(1598〜1680)、rpl32 3’UTR(115221〜115511)及びaphA−6コード配列(pSK.KmR、Bateman及びPurton 2000)から構築する。
大きな単一コピー領域中のpetAとorf99の遺伝子間にaphA−6発現カセットを導入するため、2つのフランク(プラストームヌクレオチド63335〜65597及び65598〜66597)をPCRにより増幅して、断片末端(NdeI/SmaI及びSmaI/SphI)に所望の制限部位を付加した。両方のフランクを対応する酵素で消化し、(SmaIl断片として調製した)aphA−6カセットと共に、NdeI/SphIを用いて線形化したpUC19に連結してplCF599を得た。このプラスミド中の発現ユニットは、タバコ色素体16S rRNAプロモーター、合成リボソーム結合部位(RBS、atcactagttgtagggagggatcc、Koop等 1996)、aphA−6コード配列、及びpetA遺伝子と同じ読み取り方向のrpl32 3’−UTRを含んでいる。aphA−6カセットは、pUC16S−aadA−SmaI(完全なカセット切り出しのための追加のSmaI部位を含む改変pUC16S−aadA、Koop等 1996)に基づく中間体構築物から、NcoI/NotI消化及び再連結後にC.reinhardtiiに由来するaadAコード配列及びrbcL−3’−UTRをベクターplCF606に由来するaphA−6コード配列及びrpl32 3’−UTRで置換して得られた。
大きな単一コピー領域中のycf3コード領域の上流位置にaphA−6コード配列を導入するために、2つのフランク(プラストームヌクレオチド45033〜46266及び46269〜47205)をPCRにより増幅して断片末端に所望の制限部位を付加した(SphI/PstI及びNcoI/SmaI)。また、合成RBS(atcactagttgtagggagggatcc、Koop等 1996)をPstI部位とycf3遺伝子用翻訳シグナルとして働くycf3コード領域の間にPCRにより導入した。両方のフランク断片を対応する酵素で消化し、(pSK.KmRからのPstI/NcoI断片として調製した)aphA−6コード配列と共に、SmaI/SphIにより線形化したpUC19に連結してplCF637を得た。したがって、aphA−6及びycf3遺伝子の各コード配列は、内在性ycf3上流調節エレメントの制御下に同じ方向に転写されて、形質転換されたプラストーム中に新しい人工オペロンが形成される。
Nicotiana tabacum L.cv.Petit Havanaの表面を滅菌した種子を、2%スクロース及び0.6%寒天を含むB5培地(Gamborg等 1968)上で出芽させた。B5培地100mlを含む700mlガラス瓶に実生を移した。蓋に作製した発泡栓インサート(foam plug insert)により追加の空気を供給した。培養条件は、27±1℃で日長16時間(約0.5〜1.0W/m−1、Sylvania標準F58W/125−T8 Universal−Whiteランプ)であった。
プロトプラスト単離及びアルギン酸包埋を、基本的にDovzhenko等(1998)及びKoop等(1996)に記載されたものにわずかな改変を加えて行った。包埋の前にプロトプラストをF−PCNに密度1.7×105プロトプラスト/mlで再懸濁し、次いで等体積のアルギン酸と混合して最終プレーティング密度5.5×104/グリッドとした。
グリッド打ち込み及びPEG形質転換後にカナマイシン耐性再生体を選択するための諸条件を、アルギン酸包埋した8日齢のミクロコロニーを含むグリッドをRMOP培地上に置き様々な濃度のカナマイシン(0、10、25、50、75、100mg/l)で選択試験を行い決定した。培養室で4週間インキュベーションした後に、適切な選択条件を評価した。
a)葉打ち込み:3〜4週齢のタバコ葉(約45×55mm)をRMOP培地上で1日前培養し、次いでDuPont粒子銃を用いてMuhlbauer等(2002)に記載されたDNA被覆金粒子を打ち込んだ。打ち込みから2日後、葉を小片(2×2mm)に切断し、選択培地(RMOP+25〜50mg/lカナマイシン)に移した。新鮮な培地への移動を、3〜4週ごとに定期的に実施した。
b)グリッド打ち込み:アルギン酸包埋プロトプラストを32〜64細胞期に到達するまで液体培地(F−PCN)中で6〜7日間培養した。グリッドを排液した後、それらを固体培地(RMOP)に移し、1日前培養してから打ち込みに使用した。金の充填、打ち込み及び選択を上述のとおり実施した。
c)PEG形質転換:ポリエチレングリコールによって媒介される葉緑体へのDNA移動をKoop等(1996)及びKofer等(1998)に記載されたとおりに実施した。形質転換から7日後に、アルギン酸包埋プロトプラストを25〜50mg/lカナマイシンを含み寒天で凝固したRMOP培地に移すことによって、形質転換された細胞の選択を開始した。新鮮な培地への移動を、最長12週の選択全期間にわたり3週ごとに実施した。
プラスミド調製キット(Qiagen、Hilden、Germany)を用い、製造者の手順に従ってベクターDNAを単離した。さらに、PEG形質転換用に調製したDNAを、酢酸Na/エタノールで沈殿させ、TE緩衝液pH5.6に溶解した。全植物DNAを植物DNA単離キット(Qiagen DNeasy)を用いて単離した。カルス又は葉組織(100〜200mg)を1.5ml Eppendorf管にMixer Mill MM 300(Retsch、Haan、Germany)及びタングステンカーバイドビーズ(3mm)を用いて製造者の手順書に記載されたとおりに浸軟した。100μl溶出緩衝液でDNAを溶出させ、蛍光光度計(VersaFluor、Biorad、Munchen、Germany)及び蛍光DNA定量化キット(Biorad)を用いて濃度を測定した。
無菌コルクボーラー(直径5mm)を用いて葉を円板状に切り、様々な濃度のカナマイシン(0〜200mg/l)を含むRMOP培地にそれらを置くことによって、様々な形質転換体のカナマイシン耐性濃度を決定した。培養の4週後に外植片の生長を評価した。
ガラス温室内で生長した野生型及び自家受粉の形質転換体から採取した種子を用いて子孫の分析(T1)を実施した。複数のさやからの種子を、表面を滅菌し、寒天凝固B5培地又はカナマイシン200mg/lを含むB5培地上で出芽させた。標準培養条件下での培養2週後に実生が出現するかどうか評価した。
大腸菌中でのaphA−6遺伝子の発現
植物形質転換前に、すべてのベクターの機能性を大腸菌において試験した。プラスミドplCF599、plCF6061/2(16S rRNAプロモーターの制御下にあるaphA−6遺伝子)は少なくとも50mg/lのカナマイシンに対する耐性をもたらし、一方、plCF637はわずか25mg/lのカナマイシン耐性しかもたらさなかった(ycf3プロモーターによって制御されるaphA−6遺伝子)。
アルギン酸包埋プロトプラスト由来のミクロコロニーに対して適切なカナマイシン選択濃度を決定するために、様々な濃度のカナマイシン(0〜100mg/l)を含むRMOP培地上にグリッドを置いた。25mg/l未満のカナマイシン濃度は生長を抑えるには不十分であるのに対し、50mg/lを超える濃度は過酷過ぎて、広範な褐変をもたらし、コロニー増殖を抑制した。したがって、グリッドの打ち込み後に、まず25mg/l濃度のカナマイシンを用いて形質転換体を選択した。16S rRNAプロモーターによって制御されるaphA−6遺伝子が最高200〜500mg/lカナマイシンの耐性をもたらし得ることが証明された後、選択濃度を50mg/lカナマイシンに増加した。類似のカナマイシン濃度でPEG処理プロトプラストを選択した。
a)グリッド打ち込み
カナマイシン選択と組み合わせたaphA−6遺伝子を用いて、プロトプラストに由来するミクロコロニーの打ち込みを実施した。この技術を成功させるために極めて重要なことは、グリッドが正確な発生段階(32〜64細胞)のミクロコロニーを含むこと、及びプレーティング効率が高いことである。表2に、aphA−6遺伝子を選択マーカーとして用いたすべての形質転換実験から得られた結果を要約する。カナマイシン耐性再生体は、打ち込み後12週の選択期間にわたって得られた。わずか培養24日後に早期の現象が見られることもあった。
b)PEG形質転換
PEGによって媒介されるDNA送達後にカナマイシン耐性形質転換体を回収するためにaphA−6遺伝子を使用した。plCF599を用いてなされた2つの実験から、いくつかの再生体が、カナマイシン25mg/lでのグリッドの選択後に得られた(表2参照)。耐性再生体が出現するのに要する期間は、グリッド打ち込みに対して記載した期間にほぼ類似する。
グリッド打ち込み及びPEG形質転換からの材料を用いて、PCR分析による緑色再生体の第1の分析を実施した(プライマー配列は表1を参照されたい)。aphA−6遺伝子の有無を示すために、プライマーoFCH168及びoFCH169を用いて最初の分析を行った。20の試験系のうち19が予想された480bpの断片を与えた。aphA−6遺伝子が様々なプラストーム挿入部位に正確に組み込まれたことを証明するために、1つの内部aphA−6プライマー及び相同組換えに使用したフランクの1つの外側に位置する第2のプライマーを用いてPCRを実施した。plCF6061及びplCF6062は、フランキング配列に対して異なる向きにクローン化されている同じaphA−6発現カセットを含む。このため、2つの異なるプライマーの組合せ(oSH58とoFCH169、oSH58とoFCH168)が、タバコプラストーム中のtrnNとtrnRの間の組込みを示すのに必要であった。再生体T101−1及びT177−1(plCF6061形質転換体)の分析の場合、oSH58とoFCH169のプライマー組合せを用いて、両方の例で1978bpの予想されたバンドが得られた。逆向きの場合、再生体T349−1(plCF6062形質転換体)をプライマーoSH58及びoFCH168を用いて分析し、2297bpの正確な産物が得られた。petAとorf99の間にaphA−6遺伝子が導入されたことが、再生体T330−2及びT330−4(plCF599形質転換体)で示されている。これを分析するために、プライマーoSK116及びoFCH169を用い、2961bpの断片を得た。第3の挿入部位に関して、プラストーム組込みが正確であると、ycf3調節エレメントの制御下にあるaphAコード領域を含む人工オペロンが形成される。oFCH27とoFCH168のプライマーの組合せを用いて再生体T109−1、T109−2及びT109−3(plCF637形質転換体)を分析し、予想された2239bpの断片を得た。野生型植物から調製したDNAを用いた上述のプライマー組合せの各々を用いて、コントロール反応を実施した。
全3つの挿入部位のPCR陽性系をサザンハイブリダイゼーションによりさらに分析して予想されたプラストーム組込みを確認した。これらの系における非形質転換プラストームと形質転換プラストームの比を推定するために、形質転換プラストームと野生型プラストームの両方にハイブリダイズするプローブを選択した。plCF6061形質転換体及び形質転換されていないコントロールからの全DNAをBamHIで消化し、左フランク(1117bp)を覆うプローブP1とハイブリダイズした。コントロールが7076bpの断片を示したのに対し、両方の形質転換体(T101−1、T177−1)では、追加のBamHI部位を有するaphA−6発現カセットのために、予想された2753bpの断片が得られた。plCF599形質転換体を分析するために、全DNAをBglIIで切断し、左フランクの300bp断片であるプローブP2にハイブリダイズした。野生型コントロールは、7661bpの断片を示したのに対し、aphA−6発現カセットにおけるBglII部位の存在のために4426bpのシグナル(T330−2及びT330−4系)がトランスジェニックプラストームから生成された。第3の例では、plCF637形質転換体及び形質転換されていないコントロールからの各DNAをXmaJIで消化し、右フランクの外側に位置する518bp断片であるP3でプローブすることによって分析した。野生型コントロールが2198bpのバンドを示したのに対し、3つの形質転換された系T109−1、T109−2及びT109−3すべてにおいて、aphA−6コード配列が挿入されたために、3028bpのより大きな断片が認められた。
各系におけるトランスジェニックプラストーム含量がサザン分析に基づいて同等であるように選択により再生された植物を用いて、葉外植片におけるaphA−6発現試験を実施した。ycf3調節エレメントの制御下にあるaphA−6を有する形質転換体(plCF637形質転換体)に比べて、16S rRNAプロモーターによって制御されたaphA−6遺伝子を含む形質転換体(plCF6061形質転換体)はカナマイシン耐性に関して変動が認められた。カナマイシン0、25及び200mg/lを含むRMOP培地上に葉外植片を置き、4週後に評価した。plCF6061からの形質転換体は、すべての試験濃度で同等に生長した。これとは対照的に、plCF637形質転換体は、最高濃度のカナマイシンでは生長できなかったが、25mg/lでは生長した。16S rRNAプロモーターは、現在まで記述された最も強力な色素体プロモーターであるのに対し、ycf3発現を制御するプロモーターの強度は未知である。野生型葉からのコントロール外植片は、選択したカナマイシン濃度のいずれでも生長することができなかった。追加の実験において、カナマイシン耐性の上限が決定され、16S rRNAプロモーター制御aphA−6遺伝子を有する植物の場合は耐性濃度が500mg/lであり、ycf3調節エレメントの制御下にあるaphA−6マーカーを有する植物の場合50mg/lであった。
複数サイクルのカナマイシン選択後インビトロで選択したトランスプラストミック植物を、ガラス温室に移して自家受粉させた後種子を回収した。野生型種子はB5培地上で正常に出芽したが、カナマイシン200mg/lを含むB5培地上では発芽後退色した。これとは対照的に、plCF599及びplCF637の各形質転換体からの種子は出芽し、カナマイシン200mg/lでも緑色のままであったが、非選択培地に蒔いたトランスジェニック種子よりはわずかに育ちが悪かった。形質転換された系のいずれもカナマイシン耐性に関して偏りを示さず、いずれもホモプラストミックであることが示された。
Claims (18)
- プラストーム上で少なくとも1つの目的ヌクレオチド配列で形質転換されており、かつ選択マーカーを欠くトランスジェニック植物又は植物細胞を生成する方法であって、
(a)DNAを用いて植物又は植物細胞の色素体を形質転換するステップであって、前記DNAが、
(i)前記少なくとも1つの目的ヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列と、
(ii)相同組換えをもたらすのに十分な長さを有する前記プラストームの2つの別々のヌクレオチド配列とそれぞれ同じである2つのヌクレオチド配列、又は前記2つのヌクレオチド配列の中にさらに数個の欠失、置換若しくは付加を有しかつ相同組換えをもたらす2つのヌクレオチド配列と、
(iii)選択阻害剤の存在下での植物又は植物細胞の成長を可能にする選択マーカーヌクレオチド配列
とを含むものであり、
前記2つのヌクレオチド配列の各々が、前記少なくとも1つの目的ヌクレオチド配列を含む前記ヌクレオチド配列の各々の末端に隣接し、
前記2つのヌクレオチド配列が前記プラストームの前記2つの別々のヌクレオチド配列と同じ順序及び方向で配置され、かつ
前記選択マーカーヌクレオチド配列が、前記DNA中において、前記2つのヌクレオチド配列に挟まれかつ前記少なくとも1つの目的ヌクレオチド配列を含む前記ヌクレオチド配列を含んでいる領域の、外側に配置されている、
上記ステップと、
(b)前記DNAを植物又は植物細胞に導入し、前記植物又は植物細胞を前記選択阻害剤の存在下で成長させるステップと、
(c)前記植物又は植物細胞を選択阻害剤の非存在下で成長させるステップと、
(d)プラストーム上で遺伝的に形質転換されており、かつ前記選択マーカーヌクレオチド配列を欠く細胞及び/又は植物を回収するステップとを含む、
上記方法。 - 前記DNAが、
(iv)色素体中で前記DNAの複製をもたらすヌクレオチド配列
をさらに含む、請求項1に記載の方法。 - 色素体中で前記DNAの複製をもたらす前記ヌクレオチド配列が、
色素体複製開始点oriAのヌクレオチド配列、
色素体複製開始点oriBのヌクレオチド配列、
配列番号1に記載のヌクレオチド配列、
配列番号2に記載のヌクレオチド配列、及び
これらのヌクレオチド配列に数個の欠失、置換若しくは付加をさらに有しかつ色素体中で前記DNAの複製をもたらすヌクレオチド配列
からなる群から選択される、請求項2に記載の方法。 - 複製が、前記DNAをプラストームに可逆的に組み込むことによって非自律的にもたらされる、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記DNAの複製をもたらす前記ヌクレオチド配列が、前記色素体において複製開始点として機能し、したがって前記DNAに自己複製をもたらす配列を含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記色素体において複製開始点として機能する別の配列を含むヌクレオチド配列であり、複製をもたらすヌクレオチド配列を前記DNAがさらに含む、請求項5に記載の方法。
- DNAの複製をもたらすヌクレオチド配列が、植物色素体の外側にある前記DNAの自己複製を起こし、それによってその後色素体に移動する前記DNAの複数のコピーを生成する、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 形質転換すべき植物又は植物細胞が、容易に識別可能な表現型をもたらす突然変異をプラストーム中に含み、前記方法が前記容易に識別可能な突然変異表現型を修復し、それによって形質転換された細胞の識別が可能になる、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 先行する1ステップにおいて、光合成関連遺伝子が機能不全になる又は除去される、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記光合成関連遺伝子が、以下の群、すなわちrpoA、petA、ycf3、ycf9及びrpoBから選択される、請求項9に記載の方法。
- 前記DNAが、前記形質転換のポジティブ選択を可能にするために機能する前記光合成関連遺伝子を含む、請求項9又は10に記載の方法。
- 選択マーカーが、細菌のアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼA−6である、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記プラストームの前記2つの別々のヌクレオチド配列に挟まれたプラストームのヌクレオチド配列を除去するために使用される、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 点突然変異をプラストーム中に生じさせるために使用される、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- DNAを含む形質転換ベクターであって、該DNAが、
(i)前記少なくとも1つの目的ヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列と、
(ii)相同組換えをもたらすのに十分な長さを有する前記プラストームの2つの別々のヌクレオチド配列とそれぞれ同じである2つのヌクレオチド配列、又は前記2つのヌクレオチド配列の中にさらに数個の欠失、置換若しくは付加を有しかつ相同組換えをもたらす2つのヌクレオチド配列と、
(iii)選択阻害剤の存在下での植物又は植物細胞の成長を可能にする選択マーカーヌクレオチド配列
とを含むものであり、
前記2つのヌクレオチド配列の各々が、前記少なくとも1つの目的ヌクレオチド配列を含む前記ヌクレオチド配列の各々の末端に隣接し、
前記2つのヌクレオチド配列が前記プラストームの前記2つの別々のヌクレオチド配列と同じ順序及び方向で配置され、かつ
前記選択マーカーヌクレオチド配列が、前記DNA中において、前記2つのヌクレオチド配列に挟まれかつ前記少なくとも1つの目的ヌクレオチド配列を含む前記ヌクレオチド配列を含んでいる領域の、外側に配置されている、
上記形質転換ベクター。 - 請求項15に記載の形質転換ベクターであって、
前記DNAが、
(iv)植物色素体中で前記DNAの複製をもたらすヌクレオチド配列
をさらに含み、
前記DNAの複製をもたらす前記ヌクレオチド配列が、前記色素体において複製開始点として機能し、したがって前記DNAに自己複製をもたらす配列を含む、
上記形質転換ベクター。 - 前記色素体において複製開始点として機能する別の配列を含むヌクレオチド配列であり、複製をもたらすヌクレオチド配列を前記DNAがさらに含む、請求項16に記載の形質転換ベクター。
- DNAの複製をもたらすヌクレオチド配列が、植物色素体の外側にある前記DNAの自己複製を起こし、それによってその後色素体に移動する前記DNAの複数のコピーを生成する、請求項16又は17に記載の形質転換ベクター。
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