MXPA01001365A - Elementos de control de la traduccion para la expresion de proteinas de alto nivel en los plastidos de plantas superiores y metodos de utilizacion de los mismos. - Google Patents

Abstract

Se proporcionan constructos de ADN que contienen elementos para el control de la traduccion. Estos segmentos reguladores 5' facilitan un alto nivel de expresion de transgenes introducidos en los plastidos de plantas superiores.

Description

Elementos de control de la traducción para la expresión de proteínas de alto nivel en los plástidos de plantas superiores y métodos de utilización de los mismos Esta solicitud reivindica prioridad a las Solicitudes • Provisionales Estadounidenses 60/095.163, presentada el 3 de Agosto de 1998, 60/112.257, presentada el 15 de Diciembre de 1998, 60/095.167, presentada el 3 de Agosto de 1998, 60/131.611, presentada el 29 de Abril de 1999 y 60/138.764, 10 presentada el 11 de Junio de 1999 de acuerdo con 35 U.S.C. §119 (e) . Las descripciones completas de cada una de las anteriores son aquí incorporadas a modo de referencia. De acuerdo con 35 U.S.C. §202 (c) , se reconoce que el Gobierno de los EE.UU. ostenta determinados derechos en la in- 15 vención aquí descrita, la cual fue realizada en parte con fondos de la National Science Foundation, Número de Subvención MCB-96-30763.

CAMPO DE LA INVENCIÓN 20 Esta invención se relaciona con los campos de las plantas transgénicas y la biología molecular. Más concretamente, la invención proporciona vectores que se dirigen al genoma del plástido, los cuales contienen elementos para el control de la traducción que facilitan altos niveles de expresión de ?¿ 5 proteínas en los plástidos de las plantas superiores. Tanto • las mono- como las dicotiledóneas son transformadas con éxito con los constructos de ADN aquí proporcionados .

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN 30 En esta solicitud, se hace referencia a varias publicaciones con objeto de describir más completamente el estado de la técnica a la que esta invención pertenece. La descripción de cada una de estas publicaciones es aquí incorporada a modo de referencia.

Los cloroplastos de las plantas superiores acumulan componentes individuales de la maquinaria fotosintética como una fracción relativamente grande de la proteína celular total. El mejor ejemplo es la enzima ribulosa-1, 5-bisfosfato car- 5 boxilasa-oxigenasa (Rubisco) , implicada en la fijación de C02, que puede constituir un 65% de la proteína total de las hojas (Ellis, R.J., 1979). Debido a los altos niveles potencialmente obtenibles de proteína, existe un significativo interés en la exploración de los cloroplastos como sistema alio ternativo para la expresión proteica. Hasta la fecha, los niveles de proteína expresados a partir de transgenes en cloroplastos están por debajo de los niveles de los genes altamente expresados de los cloroplastos. Los mayores niveles descritos hasta la fecha en las hojas son los siguientes: un 1% 15 de neomicina fosfotransferasa (Carrer y col., 1993), un 2,5% de -glucuronidasa (Staub y Maliga, 1993) y un 3-5% de toxinas cristalinas de Bacillus thuringiensis (Bt) (McBride y col., 1995) . Un sistema alternativo, basado en una T7 ARN polimerasa dirigida a plástidos codificada en el núcleo, puede 20 ofrecer mayores niveles de expresión proteica (McBride y col., 1994), aunque este rendimiento puede tener un precio. En bacterias, la etapa limitante de velocidad de la síntesis de proteínas es normalmente la iniciación de la traducción, que implica la unión del ARNt iniciador (formil-k r25 metionil-ARNtf) y del ARNm al ribosoma 70S, el reconocimiento del codon iniciador y la organización precisa de fases del marco de lectura del ARNm. La iniciación de la traducción depende de tres factores de iniciación (IF1, IF2, IF3) y requiere GTP. La subunidad 3OS es guiada al codon de iniciación 30 por emparejamiento de bases ARN-ARN entre el 3' del ARNr 16S y el sitio de unión a ribosomas del ARNm o secuencia de Shi- ne-Dalgarno (SD) , localizada aproximadamente 10 nucleótidos aguas arriba del codon de iniciación de la traducción (Voor- ma, 1996) . La interacción ARN-ARN entre la "caja aguas abajo" ("DB"), una secuencia de 15 nt aguas abajo del codon de iniciación de la traducción AUG, y secuencias complementarias en la secuencia 3' del ARNr 16S o caja anti-aguas abajo ( "ADB" ; posiciones nucleotídicas 1469-1483) puede también facilitar la carga del ARNm sobre la subunidad ribosomal 3OS (Sprengart y col., 1996) . Además, interacciones específicas proteína-ARN pueden también facilitar la iniciación de la traducción (Voorma, 1996) . Se han identificado componentes clave de la maquinaria de traducción procariótica en plástidos, incluyendo homólogos de los factores de iniciación bacterianos IF1, IF2 e IF3 y una proteína ribosomal de tipo SI (Stern y col., 1997) . La mayoría de los TARNm plastídicos (92%) contienen un sitio de unión a ribosomas o secuencia SD: GGAGG, o su variante trun-cada tri- o tetranucleotídica. Esta secuencia es similar al consenso SD bacteriano 5' -UAAGGAGGUGA-3 ' (Voorma, 1996). Es extremadamente deseable la expresión de alto nivel de genes extraños de interés en los plástidos de plantas superiores. La presente invención proporciona nuevos elementos para el control genético de la traducción para uso en vectores de transformación plastídicos. La incorporación de estos elementos en dichos vectores da lugar a niveles de expresión proteica comparables a los observados para genes cloroplásticos altamente expresados tanto en mono- como en dicotiledóneas. COMPENDIO DE LA INVENCIÓN Las regiones reguladoras genéticas 5' contienen promotores con distinta información de secuencia del ADN, que facilita el reconocimiento por la ARN polimerasa, y elementos para el control de la traducción, que facilitan la traducción. Ambos componentes actúan juntos para dirigir la expresión génica. Según la presente invención, se han construido regiones reguladoras 5' quiméricas que incorporan elementos para el control de la traducción. La incorporación de estas regiones reguladoras 5' quiméricas a vectores de transformación de plástidos, seguido de transformación de las células vegetales diana, dan lugar a niveles dramáticamente aumentados de expresión proteica. Estas regiones reguladoras 5' quiméricas pueden ser usadas con ventaja para expresar genes extraños de interés en un amplio rango de tejidos vegetales. Es un objeto de la presente invención proporcionar constructos de ADN y métodos para transformar establemente plástidos de plantas multicelulares que contienen dichos promotores. En una realización de la invención, se facilitan constructos de ADN recombinante para expresar al menos una pro-teína heteróloga en los plástidos de plantas superiores. Los constructos contienen una región reguladora 5 ' que incluye un elemento promotor, una secuencia líder y un elemento de caja aguas abajo operablemente unida a una región codificante de dicha al menos una proteína heteróloga. La región reguladora quimérica actúa potenciando la eficacia en cuanto a la traducción de una molécula de ARNm codificada por dicho constructo de ADN. También se contemplan en la presente invención vectores que contienen los constructos de ADN. Como ejemplos de constructos de ADN de la invención se incluyen las siguientes regiones reguladoras quiméricas: PrnnLatpB+DBwt , PrrnLatpB-DB, PrrnLatpB+DBm, PrrnLclpP+DBwt , PrrnclpP-DB, PrrnLrbcL+DBwt , PrrnLrbcL-DB, PrrnLrbcL+DBm, PrrnLpsbB+DBwt , PrrnLpsbB-DB, PrrnLpsbA+DBwt , PrrnLpsbA-DB, PrrnLpsbA-DB(+GC), PrrnLT7gl0+DB/Ec, PrrnLT7gl0+DB/pt y PrrnLT7gl0-DB . Las secuencias de la caja aguas abajo preferidas para uso en los constructos de la invención tienen las siguientes secuencias: 5' TCCAGTCACTAGCCCTGCCTTCGGCA 3' y 5' CCCAGTCATGAATCA-CAAAGTGGTAA 3'. Los segmentos reguladores 5' de la invención han sido exitosamente empleados para dirigir la expresión del gen bar de S. hydroscopicus en los plástidos de plantas superiores. También se han generado y expresado genes bar sintéticos usando los constructos de ADN de la presente invención. Estos constructos han sido sometidos a ingeniería para maximizar el contenido transgénico en los plástidos mediante la incorporación de codones raros a la región codificante que no son pre-feridos para la traducción de proteínas en microorganismos y hongos . En aún otra realización de la invención, se produce al menos una proteína de fusión utilizando los constructos de ADN de la invención. Un ejemplo de proteína de fusión tiene una primera y una segunda regiones codificantes operablemente unidas a las regiones reguladoras 5' aquí descritas, de tal forma que la producción de dicha proteína de fusión está regulada por dicha región reguladora 5' . En una realización, la primera región codificante codifica para un gen marcador se-leccionable y la segunda región codificante codifica para una molécula fluorescente para facilitar la visualización de las células vegetales transformadas. También entran dentro del alcance de la presente invención vectores que contienen un constructo de ADN codificante de dicha proteína de fusión. Un ejemplo de proteína de fusión consiste en una región codificante aadA operablemente unida a una región codificante de proteína fluorescente verde. Estos restos pueden estar unidos por ligantes peptídicos tales como ELVEGKLELVEGLKVA y ELAVEG-KLEVA. También se incluyen en la presente invención plásmidos para transformar los plástidos de las plantas superiores. Se seleccionan ejemplos de plásmidos entre el grupo consistente en pHK30 (B) , pHK31 (B) , pHK60, pHK32 (B) , pHK33 (B) , pHK34 (A) , pHK35 (A) , pHK64 (A) , pHK36 (A) , pHK37 (A) , pHK38 (A) , pHK39 (A) , pHK40 (A) , pHK41 (A) , pHK42 (A) , pHK43 (A) , pMSK56, pMSK57, pMSK48, pMSK49, pMSK35, pMSK53 y pMSK5 . Las plantas transgénicas, tanto monocotiledóneas como dicotiledóneas, que albergan los plásmidos antes indicados son también contempladas como dentro del alcance de la inven- cíon. En aún otra realización de la invención, se facilitan métodos para producir monocotiledóneas transplastómicas. Un método consiste en: a) obtener células embriogénicas; b) ex-poner dichas células a una molécula de ADN heterólogo en condiciones mediante las cuales dicho ADN entra en los plástidos de dichas células, cuya molécula de ADN heterólogo codifica al menos para una proteína exógena, cuya al menos una proteína exógena codifica para un marcador seleccionable; c) apli-car un agente de selección a dichas células para facilitar la diferenciación entre los plástidos no transformados y los plástidos transformados, cuyas células contienen plástidos transformados supervivientes que se dividen en presencia de dicho agente de selección; d) transferir dichas células su-pervivientes a medios selectivos para promover la regeneración de la planta y el crecimiento de los retoños, y e) enraizar dichos retoños, produciendo así plantas monocotiledóneas transplastómicas. La molécula de ADN heterólogo puede ser introducida en la célula vegetal mediante un procedimien-to seleccionado entre el grupo consistente en bombardeo bio-lístico, transformación mediada por Agrobacterium, microinyección y electroporación. En una realización de del método anteriormente descrito, se obtienen protoplastos a partir de las células embriogénicas y se introduce la molécula de ADN heterólogo en dichos protoplastos por exposición a polietilenglicol. Son agentes de selección adecuados para la práctica de los métodos de la invención la estreptomicina y la paromomicina. Entre las plantas monocotiledóneas que pueden ser transformadas usando los métodos de la invención se incluyen, aunque sin limitación, maíz, mijo, sorgo, caña de azúcar, arroz, trigo, cebada, avena, arroz y hierba para césped. En una realización preferida, se facilita un método para producir plantas de arroz transplastómicas. Este método conlleva las siguientes etapas: a) obtención de callos embriogé-nicos, b) inducción de la proliferación de los callos en medio CIM modificado, c) obtención de suspensiones de células embriogénicas de dichos callos proliferantes en medio AA líquido, d) bombardeo de dichas células embriogénicas con mi-croproyectiles revestidos con ADN plasmídico, e) transferencia de dichas células bombardeadas a medio AA líquido selectivo, f) transferencia de dichas células que sobreviven en medio AA a medio de regeneración RRM selectivo durante un período de tiempo suficiente para que aparezcan retoños verdes y g) enraizamiento de dichos retoños en medio salino MS selectivo. Como plásmidos adecuados para transformar arroz según se ha indicado anteriormente, se incluyen pMSK35 y pMSK53, pMSK54 y pMSK49. Las plantas de arroz transplastómicas así producidas son también contempladas como dentro del alcance de la invención. En aún una realización final de la invención, se proporcionan métodos para contener transgenes en plantas transformadas. Un método ejemplar incluye las siguientes etapas: a) determinar la utilización de codones en dicha planta que ha de ser transformada y en los microbios que se encuentran en asociación con dicha planta y b) someter a ingeniería genética dicha secuencia transgénica mediante la introducción de codones microbianos raros para abrogar la expresión de dicho transgén en dicho microbio asociado a la planta. En un ejemplo de realización del método descrito inmediatamente antes, el transgén es un gen bar y dichos codones raros son codones codificantes de arginina seleccionados entre el grupo consistente en AGA y AGG y el transgén no se expresa en E. coli . Las siguientes definiciones facilitarán la comprensión de la materia objeto de la presente invención: Heteroplastómico : hace referencia a la presencia de una población mixta de diferentes genomas plastídicos en un solo plástido o en una población de plástidos contenidos en las células o tejidos de la planta. Homoplastómico : hace referencia a una población pura de genomas plastídicos, ya sea dentro de un plástido o dentro de una población contenida en las células y tejidos de la planta. Los plástidos, células o tejidos homoplastómicos son genéticamente estables, ya que contienen sólo un tipo de genoma plastídico. Por ello, permanecen homoplastómicos incluso después de haber eliminado la presión de selección, y la propia progenie también es homo-plastómica. Para los fines de la presente invención, se puede hacer aquí referencia a las poblaciones heteroplastómicas de genomas que son funcionalmente homoplastómicas (es decir, que contienen sólo poblaciones menores de ADN de tipo salvaje o genomas modificados con variaciones de secuencia) como "funcionalmente homoplastómicas" o "substancialmente homoplastó-micas". Estos tipos de células o tejidos pueden ser fácilmente purificados a un estado homoplastómico por selección continua. Plastoma: el genoma de un plástido. Transplastoma : un genoma plastídico transformado. Transformación de plástidos: integración estable de ADN transformante en el genoma plastídico que se transmite a la progenie semilla de las plantas que contienen los plástidos transformados . Gen marcador seleccionable: el término "gen marcador se-leccionable" se refiere a un gen que, al expresarse, confiere una ventaja selectiva a los plástidos y un fenotipo mediante el cual se pueden identificar los plástidos o células o tej i-dos transformados con éxito que llevan el plástido transformado. ADN transformante: hace referencia a ADN homólogo o a ADN heterólogo flanqueado por ADN homólogo, que, al ser introducido en plástidos, se hace parte del genoma plastídico por recombinación homologa. Operablemente unido : hace referencia a dos regiones di-ferentes o dos genes separados ayustados entre sí en un constructo, de tal forma que ambas regiones funcionarán para promover la expresión génica y/o la traducción de proteínas. La descripción detallada que se da a continuación, pro-porciona ejemplos de métodos preferidos para preparar y utilizar los constructos de ADN de la presente invención y para llevar a la práctica los métodos de la invención. Cualquier técnica de clonación y de ADN recombinante no específicamente descrita es llevada a cabo por métodos estándar, según se ex-pone en general, por ejemplo, en Sambrook y col., "DNA Cloning, A Laboratory Manual" , Cold Spring Harbor Laboratory, 1989. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Figura ÍA. Los ARNm plastídicos y el ARN ribosomal pe-queño (16S) contienen secuencias complementarias aguas abajo de AUG, lo que implica interacciones entre el ARNm y el AR?r 16S durante la iniciación de la traducción en los plástidos. El modelo propuesto se basa en los datos obtenidos en E. coli (Sprengart y col., 1996); para la secuencia del AR?r 16S, véase ref. (Shinozaki y col., 1986b) . SD, secuencia de Shine-Dalgarno; ASD, región anti-SD; DB, caja aguas abajo; ADB, región anti-DB. Están marcados los emparejamientos de Watson-Crick (línea) y G-U (círculo cerrado) . Figura IB. Secuencia de las regiones de la anti-caja aguas abajo (secuencia ADB subrayada) del AR?r 16S en plástidos (pt; esta solicitud) y en E. coli (Ec, Sprengart y col., 1996) . La ADB de E. coli contiene secuencias entre los nucleótidos 1469-1483 del AR?r 16S (Sprengart y col., 1996) correspondientes a los nucleótidos 1416-1430 del AR?r 16S del tabaco (Dams y col., 1988; secuencia entre los nucleótidos 104173-104187 en Shinozaki y col., 1986). Figura 2A. Emparejamiento de bases entre la ADB plastí-dica y los AR?m atpB, clpP, rbcL, psbB y psbA (subrayados) . Se muestran múltiples interacciones DB-ADB alternativas. Los nucleótidos cambiados para reducir o alterar la interacción ARNm-ARNr están en letra minúscula. El número de parejas nu-cleotídicas potenciales formadas con la región ADB de 26 nt está entre paréntesis. El número de sucesos de emparejamiento afectados por la mutagénesis está en negrilla. Figura 2B. Complementariedad de los derivados líder del gen 10 del fago Prrn T7 con las secuencias de E. coli y de la ADB plastídica. Los nucleótidos cambiados para reducir o alterar la interacción ARNm-ARNr están en minúscula. El número de parejas nucleotídicas potenciales formadas con la región ADB de 26 nt está entre paréntesis. Figura 3A. Secuencia de ADN de los fragmentos promotores plastídicos Prrn quiméricos con regiones para el control de la traducción atpB y clpP. El nombre del plásmido que es la fuente del fragmento promotor es dado entre paréntesis. La secuencia promotora Prrn está subrayada; el nucleótido en el cual se inicia la transcripción en los plástidos del tabaco está marcado con un círculo negro; el codon de iniciación de la traducción (ATG) está en negrilla; SD está subrayada con una línea ondulada; los nucleótidos de los sitios de restricción 5' y 3' y las mutaciones puntuales están en minúscula. Figura 3B. Secuencia de ADN de los fragmentos promotores plastídicos Prrn quiméricos con regiones para el control de la traducción rbcL y psbB. Para detalles, véase la descrip-ción de la Fig. 3A. Figura 3C. Secuencia de ADN de los fragmentos promotores plastídicos Prrn quiméricos con regiones para el control de la traducción psbA . Para detalles, véase la descripción de la Fig. 3A. Figura 3D. Secuencia de ADN de los fragmentos promotores plastídicos Prrn quiméricos con el plástido (PrrnLT7glO+DB/Ec) del gen 10 del fago T7 (PrrnLT7glO+DB/pt) y DB sintética (PrrnLT7glO-DB) . Para detalles, véase la descripción de la Fig. 3A.

Figura 4A. Vector de transformación de plástidos pPRVlllA con genes neo quiméricos. Los números seriados plasmídicos, por ejemplo pHK34, designan derivados de vectores de transformación de plástidos pPRVlllA; los números de plásmi-dos adyacentes entre paréntesis (por ejemplo, pHK14) designan la fuente del gen neo quimérico en los vectores pUC118 o pBSIIKS+. Las flechas marcan la orientación del gen marcador seleccionable (aadA) y del gen neo quimérico. Las secuencias direccionalizadoras plastídicas están subrayadas en negrilla. Los componentes de los genes neo quiméricos son: Prrn, fragmento promotor del operón del ARNr; L, secuencia líder; DB, caja aguas abajo; el sitio Nhel que sirve como DB sintética está marcado por una línea gruesa; neo, región codificante de la neomicín-fosfotransferasa; TrbcL, región no traducida 3' de rbcL. lßSrDNA, trnV, rpsl2/7 son genes plastídicos (Shinozaki y col-, 1986). Los sitios de restricción marcados para: EcoRI, Sphl, Stul, Sacl, Nhel, Ncol, Xbal, HindIII, BamHI y Bglll. Los sitios de restricción entre paréntesis fueron eliminados durante la construcción. La iniciación de la traduc-ción de neo en el plásmido pHK36 está incluida en el sitio Ncol (no marcado) . La presencia y el orden relativo de los sitios de restricción Nhel (**) y Ncol (*) en los derivados plasmídicos pPRVlllA-DB (pHK35, pHK37, pHK40, pHK42, pHK43) están marcados mediante asteriscos. Las secuencias promotoras son mostradas en las Figuras 3B, C y D. Figura 4B. Vector de transformación de plástidos pPRVlllB con genes neo quiméricos. Véase la descripción de la Fig. 4A. Las secuencias promotoras están mostradas en la Fig. 3A. Figura 5. Construcción de fragmentos líder promotor-plástido Prrn por PCR (reacción en cadena de polimerasa) por extensión de solapamiento. Figura 6. Construcción por PCR del promotor PrrnLT7glO+DB/Ec (fragmento Sacl-Nhel) en el plásmido pHK18.

Figura 7. Construcción por PCR del promotor PrrnLT7glO+DB/pt (fragmento Sacl-Nhel) en el plásmido pHK19.

Figura 8. Mapa de restricción de los plásmidos pHK2 y pHK3 con el gen Prrn (L) rbcL (S) : : neo : :TrbcL. Los sitios de es-cisión por enzimas de restricción están marcados para: BamHI, EcoRI, HindIII, Ncol, Nhel, Sacl, Xbal. Figura 9. Secuencia de ADN del gen Prrn (L) rbcL (S) :: neo : :TrbcL en el plásmido pHK3. El plásmido pHK2 lleva un gen neo idéntico, excepto por el hecho de que hay un sitio EcoRI aguas arriba del sitio Sacl. Figura 10. Acumulación de NPTII en hojas de tabaco detectada por análisis de manchas en geles de proteína. La cantidad de proteína soluble total de hojas (µg) cargada en gel de SDS-PAGE está indicada por encima de las bandas. Las ban-das son designadas con el plásmido usado para la transformación de las plantas; los µg de proteína cargados por banda están indicados debajo. El patrón NPTII y los extractos Nt-pTNH32 fueron tratados como controles positivos; como controles negativos, se usaron extractos de plantas no transforma-das de tipo salvaje ("wt") . Figura 11. Los niveles del AR?m neo en las hojas transplastómicas. Las manchas fueron sondadas para neo (parte superior) y para el AR?r 25S citoplásmico como control de carga (parte inferior) . Las posiciones del AR?m neo monocistronico en el vector pPRVlllA (Figura 4A) , los transcriptos monocis-trónico neo y dicistrónico neo-aadA en el 'vector pPRVlllB (Figura 4B) y los transcriptos neo monocistrónico y rbcL-neo dicistrónico en plantas transformadas con pT H32 (Carrer y col., 1993) están marcadas. Las bandas son designadas con el número de serie de la planta transgénica. Se cargaron 4 µg de AR? celular total por banda. Figura 12. Fracción de un codon codificante de un aminoácido particular y frecuencia de tripletes por 1.000 codones en la región mutagenizadas atpB y rbcL DB . Los nucleóti- dos alterados están e? minúscula. Figura 13. Acumulación NPTII en raíces de tabaco detectada por análisis de manchas en geles de proteína. Las bandas son designadas con el plásmido usado para la transformación 5 de las plantas; los µg de proteína cargados por banda aparecen debajo. Se trató el patrón NPTII como control positivo; se usaron extractos de plantas no transformadas de tipo salvaje (wt) como controles negativos. Figura 13B. Niveles en estado estacionario de ARNm neo 10 en raíces de tabaco. La sonda neo detecta un ARNm monocistró- nico en plantas transformadas con el vector pPRVlllA (Figura 4A) y un transcripto neo monocistrónico y uno neo-aadA dicistrónico en plantas transformadas con el vector pPRVlllB (Fi-| gura 4B) . Las bandas son designadas con el número de serie de 15 la planta transgénica. Se cargaron 4 µg de ARN celular total por banda. Figura 14. Análisis de manchas en geles de proteína para detectar la acumulación de NPTII en semillas de tabaco. Las bandas son designadas con el plásmido usado para la transfor- 20 mación de las plantas; debajo se dan los µg de proteína cargados por banda. Se trató el patrón NPTII como control positivo; se usaron extractos de plantas no transformadas de tipo salvaje (wt) como controles negativos. Figura 15A. Diagrama que muestra la integración de los F25 genes quiméricos neo y aadA en el genoma plastídico por dos sucesos de recombinación homologa por medio de las secuencias de direccionalización a plástidos (subrayadas) . En la parte superior se muestra un diagrama de los plásmidos pHK30 y pHK32 en los derivados del vector de transformación de plás-30 tidos pPRVlllB (Zoubenko y col., 1994). Las flechas horizontales marcan la orientación del gen. Para la descripción de los genes neo quiméricos, véase la Figura 4B. 16SrDNA, trnV, rpsl2/7 son genes plastídicos (Shinozaki y col., 1986). Los sitios de restricción marcados para: EcoRI (E) , Sacl (S) , Nhel (N) , Xbal (X), HindIII (H) , BamHI (Ba) y Bglll. Los sitios de restricción entre paréntesis fueron eliminados durante la construcción. En el medio, se muestra la región de ADN de plástido de tipo salvaje ("Wt-ptDNA") buscada para la in-) 5 serción. Las líneas que conectan los plásmidos y ptDNA marcan los sitios de recombinación homologa al final de las regiones de direccionalización al plástido del vector. En la parte inferior, se muestra el mapa del segmento del genoma del plástido transformado (T-ptDNA) . Figura 15B. El análisis de manió chas en gel de ADN confirma la integración de los genes neo y aadA en el genoma del plástido. La mancha de la parte superior fue sondada con la secuencia de direccionalización hacia plástido (Sonda 1 en la Figura 15A) . Muestra fragmentos de 4,2 kb y 1,4 kb en líneas transplastómicas y un fragmento de > 15 3 , 1 kb en el tipo salvaje (véase la Figura 15A) . Obsérvese que la señal de 1,4 kb es débil en la mayoría de los clones. La mancha inferior fue sondada para secuencias neo, que están presentes sólo en las líneas transplastómicas. Figura 16A. Diagrama que muestra la integración del gen 20 bar en el genoma plastídico del tabaco. En la parte superior, se muestra el mapa de la región de direccionalización hacia plástidos en el plásmido pJEK6. La región buscada del genoma plastídico de tipo salvaje (wt-ptDNA) es mostrada en medio. En la parte inferior, se muestran los transgenes integrados |25 en el transplastoma (T-ptDNA) . Se muestran las posiciones del mapa para: el gen bar; aadA, el gen de resistencia a la espectinomicina seleccionable; 16SrDNA y rps!2/7, genes plastídicos (Shinozaki y col., 1986) . Las flechas indican la dirección de la transcripción. La posición del mapa de la sonda 30 (2,5 kb) está marcada mediante una línea gruesa; los fragmentos de tipo salvaje (2,9 kb) y transgénicos (3,3 kb, 1,9 kb) generados por digestión con Smal y BgrUl están marcados por líneas delgadas. Figura 16B. La mancha en gel de ADN confirma la integra- ción de bar en el genoma plastídico del tabaco. Se muestran datos para las líneas transplastómicas Nt-pJEK6-2A a E, Nt- pJEK6-5A a E y Nt-pJE 6-13A y B y la línea parental de tipo salvaje. Se sondó el ADN celular total digerido con Smal - 5 Bglll con la secuencia de direccionalización a plástido Apal - BaraHI de 2,5 kb marcada con una línea gruesa en la Figura 16A. Figura 17. El ensayo PAT confirma la expresión de bar en plástidos de tabaco. Se determinó la actividad PAT por con- 10 versión de PPT en acetil-PPT usando 14C-acetil-CoA radiomarcada. Se muestran los datos para las líneas transplastómicas Nt-pJEK6-2D, Nt-pJEK6-5A y Nt-pJEK6-13B, el transformante nuclear Nt-pDM307-10 y el tipo salvaje (wt) . ) Figura 18A. Las plantas de tabaco transplastómicas son 15 resistentes a herbicidas. Plantas de tipo salvaje y transformadas con pJEK6 13 días después de pulverizar con Liberty (5 ml, solución al 2%) . Figura 18B. Herencia materna de la resistencia a PPT en la progenie de las semillas. Las semillas de cruces recípro- 20 cos con plantas Nt-pJEK6-5A germinaron con 0, 10 y 50 mg/L de PPT. wt x pJEK6-5A, transplastómico usado como polen parental; pJEK6-5A x wt, parental femenino de línea transplastómi- ca. Las plántulas resistentes son verdes en medio PPT, mientras que las plántulas sensibles están blanqueadas. '25 Figura 19. La secuencia de ADN de la región codificante de bar bacteriana sometida a ingeniería en el plásmido pJEK3 y pJEK6 y la secuencia codificada de aminoácidos. Los nucleótidos codificantes de los cinco aminoácidos N-terminales rbcL están en minúscula. Los nucleótidos añadidos en el extremo 3' 30 durante la construcción están también en letra minúscula. Los sitios de clonación Ncol, Bglll y Xbal están marcados. Figura 20A. La secuencia de ADN del gen bar sintética y la secuencia codificada de aminoácidos. Las argininas codificadas por los codones AGA/AGG están en negrilla. Los núcleo-tidos originales están en mayúsculas y las bases alteradas están en minúsculas. Los sitios de restricción usados para la clonación están marcados . Figura 20B. La secuencia de ADN del gen s2-bar sintética y la secuencia codificada de aminoácidos. Las argininas codificadas por los codones AGA/AGG están en negrilla. Los nucleótidos originales están en mayúsculas y las bases alteradas están en minúsculas. Los sitios de restricción usados para la clonación están marcados . Figura 21. Genes bar sintéticos y bacterianos. La región codificante de bar está expresada en las cassettes Prrn/TrbcL. Obsérvese que los promotores Prrn difieren con respecto a la región de control de la traducción. Figura 22A. PAT se expresa en E. coli a partir de la re-gión codificante de bar, pero no de la de s-bar. La actividad PAT fue determinada por conversión de PPT en acetil-PPT usando 1C-acetil-CoA radiomarcada. Los datos son mostrados para E. coli transformada con los plásmidos pJEK6 y pK012, portadores del gen bar, y con pK08, portador de s-bar. Figura 22B. El ensayo PAT confirma la expresión de bar y s-bar en plástidos de tabaco. La actividad PAT fue determinada por conversión de PPT en acetil-PPT usando 14C-acetil-CoA radiomarcada. Los datos son mostrados para las líneas transplastómicas Nt-pJEK6-13B y Nt-pK03-24a, B, que llevan bar y s-bar, respectivamente. Figura 23A. Vector de transformación de plásticos con FLARE16-S como marcador seleccionable dirigido a la región de repetición invertida del plástido. Secuencia de ADN y proteína en la unión aadA-gfp. Los nucleótidos derivados de aadA y gfp están en mayúsculas, las secuencias de adaptadores y la mutación puntual usada para crear el sitio de restricción BstXl (negrilla) están en minúsculas. Figura 23B. Mapa físico de vector de transformación de plástidos con FLARE16-S como marcador seleccionable dirigido a la región de repetición invertida del plástido. Se muestran: el promotor (P) y 3 'UTR (T) de la región codificante aadA16pt-gfp y sus partes componentes (regiones codificantes de aadA y gfp) . Genes plastídicos rrnlß y rpsl2/7; sitios de endonucleasas de restricción HindIII (eliminado), Spel, Xbal, Ncol, BstXl, Nhel, EcoRI . En el plásmido pMSK56, se expresa aadA16pt-gfp a partir del promotor Prrn:LatpBDB y codifica para FLARE16-S1. En el pláámido pMSK57, se expresa aadA16pt-gfp a partir del promotor Prrn:LrbcLDB y codifica para FLA-RE16-S2. Figura 24. Localización de FLARE16-S en plástidos de tabaco por microscopía confocal de barrido con láser en tejido heteroplastómico. Las imágenes fueron procesadas para detec-tar la fluorescencia de FLARE16-S (verde) y de la clorofila (roja) y ambas en una vista fusionada. Se muestran secciones de plantas que expresan FLARE16-S1 (a,b) y FLARE16-S2 (3c-f) . Nótense los plástidos de tipo salvaje y los transformados en las hojas (3a,c,d), los cromoplastos de los pétalos (3b), los tricomas (3e) y los plástidos de raíces no verdes (f) . las flechas blancas marcan las organelas transplastómicas. Las barras representan 25 µm. Figura 25. Análisis de inmunotransferencia de la acumulación de FLARE16-S en cloroplastos. La cantidad de proteína cargada (µg) está indicada encima de las bandas. La cuantifi-cación de FLARE16-S1 (plantas Nt-pMSK56) y FLARE16-S2 (plantas Nt-pMSK57) se basa en la comparación con una serie de dilución de GFP purificado. Se usó el extracto de una planta de tipo salvaje (Nt) como control negativo. Figura 26A. La amplificación de fragmentos frontera con-firma la integración de los genes FLARE-S en el genoma del plástido. Mapas de las regiones de direccionalización hacia plástidos de los vectores de arroz (pMSK49) y de tabaco (pMSK57) , el segmento de los genomas de plástidos de arroz y de tabaco buscados por los vectores (Os-wt y Nt-wt) y las mismas regiones después de la integración de los genes FLARE- S. Los extremos de las regiones de direccionalización hacia plástidos están conectadas con secuencias afines en el genoma de plástidos de tipo salvaje. Los genes plastídicos IßSrDNA, 5 trtiV y rpsl2/7 están marcados sólo en los genomas plastídicos de tipo salvaje. La posición de los cebadores de PCR (01-06) y los fragmentos de PCR generados por los mismos son también mostrados . Figura 26B. La amplificación de fragmentos frontera con- 10 firma la integración de los genes FLARE-S en el genoma plastídico. Geles con fragmentos frontera a izquierda y a derecha amplificados por PCR y con fragmento aadA. Se muestran los resultados para líneas transplastómicas de arroz (0s-pMSK49-l f y Os-pMSK49-2) y de tabaco (Nt-pMSK57) y para arroz de tipo 15 salvaje (Os-wt) . Los marcadores de peso molecular son ? ADN digerido con EcoRI y con HindIII. Figura 27. Localización de FLARE11-S3 en cloroplastos de arroz en la línea 0s-pMSK49-5 por microscopía confocal de barrido con láser. Las imágenes fueron procesadas para detectar 20 la fluorescencia de FLARE11-S (verde) y de la clorofila (roja) y ambas en una vista fusionada. Las flechas señalan poblaciones mixtas de plástidos en las células. La barra representa 25 µm. Figura 28. Se muestra la secuencia de FLARE16-S. F25 Figura 29. Se muestra la secuencia de FLARE16-S1. Figura 30. Se muestra la secuencia de FLARE16-S2. Figura 31. Se muestra la secuencia de FLARE11-S. Figura 32. Se muestra la secuencia de FLARE11-S3. Figuras 33A y 33B. Se muestra la secuencia de pMSK35. 30 Figuras 34A y 34B. Se muestra la secuencia de pMSK49. Figura 35. Una tabla que describe los constructos FLARE de la invención. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Se proporcionan aquí cassettes de ADN para la expresión de proteínas a alto nivel en plástidos. Los ARNm de plástidos de plantas superiores contienen secuencias dentro de los 50 nt aguas abajo de AUG que son complementarias de la región 3 del ARNr 16S. Estas secuencias complementarias están aproxi-madamente en la misma posición que las secuencias DB en los ARNm de E. coli . Véanse las Figuras ÍA y 2A. Es interesante observar que la secuencia DB plastídica experimental se desvía significativamente del consenso DB de E. coli , ya que la secuencia del plástido de tabaco y de ARNr 16S de E. coli en la región de la anti -caja aguas abajo (ADB) es significativamente diferente (Figura IB) . La viabilidad de mejorar la expresión proteica incorporando secuencias DB en plástidos fue valorada construyendo una serie de regiones reguladoras 5' quiméricas consistentes en promotor de tipo s70 del operón del ARNr plastídico (Prrn-114; Svab y Maliga, 1993; Vera y Sugiura, 1995) y la secuencia líder de los ARNm plastídicos con las secuencias de DB nativa, DB mutagenizada y DB sintética. Los líderes de ARNm plastídico difieren con respecto a la presencia y a la posición de la secuencia SD. La eficacia de la traducción a partir de los promotores quiméricos fue determinada expresando el gen neo bacteriano en plástidos. El gen neo (o kan) codifica para la neomicín-fosfotransferasa (NPTII) y confiere resistencia a la kanamicina en bacterias y plástidos (Carrer y col., 1993). Hemos visto que la NPTII de los transcriptos neo quiméricos se acumula en el rango de un 0,2% a un 23% de la proteína soluble total de las hojas, lo que indica la importancia de las señales para el control de la traducción en la región 5' del ARNm para la expresión de proteínas a alto nivel . Existe un gran interés en la producción de proteínas re-combinantes en plástidos de plantas que, hasta la fecha, han sido expresadas a partir de genes nucleares solamente (Arnt-zen, 1997; Conrad y Fiedler, 1998; Kusnadi y col., 1997). Los niveles de proteína producidos a partir de las cassettes de expresión PrrnLrbcL+DBwt y PrrnLT7glO aquí descritas sobrepasan significativamente los niveles de proteínas descritos para los genes nucleares. La acumulación de NPTII procedente de los genes nucleares es típicamente <<0,1% (Alien y col., 1996), siendo el valor más alto el 0,4% de la proteína soluble total (Houdt y col., 1997) . Describimos con anterioridad la acumulación de un 1% de NPTII a partir de un transgén neo de plástido (Carrer y col., 1993) . Otros ejemplos para la acumulación de proteínas de transgenes de plástidos son un 2,5% de -glucuronidasa (GUS) (Staub y Maliga, 1993) y un 3,5% de las toxinas cristalinas de Bacillus thuringiensis (Bt) (McBride y col-, 1995) . En comparación con esta publicación anterior, hemos conseguido un aumento significativo en los niveles de NPTII, de hasta un 23% de la proteína soluble total. FLARE-S, una proteína obtenida fusionando una enzima inactivadora de antibiótico con la proteína de fluorescencia verde de Aequorea victoria, se acumulaba hasta en un 8% y un 18% de la proteína soluble total procedente de las cassettes PrrnLatpB+DBwt y PrrnLrbcL+DBwt aquí provistas. Véase el Ejemplo 8. La acumulación de proteínas a alto nivel procedente de las cassettes de la presente invención puede ser claramente atribuida a la ingeniería de la región para el control de la traducción ("TCR") de los genes quiméricos. Estos nue-vos elementos genéticos pueden ser usados en diferentes aplicaciones para dirigir la expresión de proteínas de importancia agronómica, industrial o farmacéutica. Existe una fuerte demanda de métodos que controlen el flujo de transgenes en cultivos de campo. La incorporación de los transgenes al genoma plastídico más que al genoma nuclear da como resultado un contenido natural de transgenes, ya que los plástidos no son transmitidos mediante el polen en la mayoría de los cultivos (Maliga, 1993) . La transformación plas-tídica en cultivos no ha sido ampliamente empleada, debido a la falta de tecnología. Una mayor expresión de marcadores selectivos tendría que dar eficacias de transformación superiores. Los promotores quiméricos de la presente invención faci-litan la extensión de la transformación plastídica a cultivos importantes desde el punto de vista agronómico e industrial. Ciertamente, la expresión de alto nivel a partir de la cassette PrrnLatpB+DBwt aquí descrita dio lugar a un aumento de ~25 veces en la frecuencia de líneas de tabaco transplastómicas resistentes a la kanamicina. Lo que es más importante, se han obtenido altos niveles de expresión de genes marcadores tras la transformación plastídica en arroz, la primera especie de cereal en la que se ha llevado a cabo con éxito la transformación plastídica. Los resultados son expuestos en el Ejemplo 8. Se facilitan los siguientes ejemplos para ilustrar diversas realizaciones de la presente invención. No se pretende con ellos limitar la invención en modo alguno. Los protocolos expuestos a continuación tienen el fin de facilitar la práctica de la presente invención. PREPARACIÓN DE CASSETTES 5' QUIMÉRICAS PARA LA EXPRESIÓN ELE¬ VADA DE PROTEÍNAS HETERÓLOGAS EN PLÁSTIDOS DE PLANTAS SUPERIORES Identificación de una caja aguas abajo potencial en ARNm de plástidos Se determinó la presencia o ausencia de elementos de caja aguas abajo en moléculas de ARNm para los siguientes genes: psbB (Tanaka y col., 1987) y psbA (Sugita y Sugiura, 1984), genes del fotosistema II; rbcL codificante de la subunidad grande de la ribulosa-1, 5-bisfosfato carboxila-sa/oxigenasa (Shinozaki y Sugiura, 1982) ; atpB, codificante de la subunidad de la ATPasa (Orozco y col., 1990), y clpP, codificante de la subunidad proteolítica de la proteasa plastídica dependiente de ATP Clp (Hajdukiewicz y col., 1997) . Es interesante el hecho de que la mayoría o todos los promotores PclpP-53 están aguas abajo del sitio de iniciación de la transcripción, por lo que se supone que los constructos PrrnLclpP contienen dos promotores: Prrn-114 y PclpP-53. Los sitios de iniciación de la transcripción para estos genes fueron descritos en las referencias citadas anteriormente; para la posición nucleotídica de los genes en el genoma del plástido, véase Shinozaki y col., 1986. Inicialmente, se supuso que la ADB plastídica es similar en tamaño y posición a la ADB de E. coli en el ARNr 16S. La ADB de E. coli se localiza en una estructura tronco conservada entre los nucleótidos 1469 y 1483 (15 nt) que corresponde a los nucleótidos 1416 y 1430 del ARNr 16S del plástido (Dams y col., 1988: Sprengart y col., 1996) . Aunque, en ambos casos, la ADB está contenida en el penúltimo tronco del ARNr 16S, la secuencia real de ADB es diferente en plástidos y en E. coli (Figura IB) . Se investigaron las regiones codificantes N-terminales de los genes plastídicos atpB, clpP, rbcL, petA, psaA, psbA, psbB, psbD y psbE en cuanto a secuencias DB potenciales. Se llevó a cabo la búsqueda de homologías con una secuencia de 26 nucleótidos centrada en la región tentativa DB (Figura IB) . La búsqueda reveló tramos cortos de homología imperfecta con soluciones alternativas. Dado que la posición de DB en el ARNm es bastante flexible (Etchegaray e Inouye, 1999) , mostramos cuatro interacciones potenciales DB-ADB para atpB y rbcL en la Figura 2A. Se seleccionaron dos ARNm plastídicos para estudiar el papel de DB en la traducción de los AR?m plastídicos: 1) el AR?m atpS carece de una secuencia SD y 2) el AR?m rbcL contiene una secuencia SD en el consenso procariótico. Además, se incluyó en el estudio el líder del gen 10 del fago T7 (T7gl0) . Este líder tiene una secuencia DB de E. coli bien caracterizada (Figura 2B; Sprengart y col., 1996) . Son AR?m plastídicos adicionales con secuencias DB potenciales mostrados en la Figura 2A clpP, psbB y psbA.

Estrategia experimental para estudiar la eficacia de las secuencias líder para la traducción Para comparar la eficacia de la traducción a partir del 5' -UTR de los genes seleccionados, se clonó el 5' -UTR aguas 5 abajo del promotor fuerte de tipo s70 del operón de ARNr plastídico (Prrn-114) (Svab y Maliga, 1993; Allison y col., 1996) , que inicia la transcripción a partir de múltiples nucleótidos adyacentes (-114, -113, -111; Sriraman y col., 1998) . Se construyeron los fragmentos de promotor como frag- 10 mentos Sacl-Nhel o SacI-NCoI. La construcción de los promotores quiméricos usando técnicas convencionales de biología molecular es expuesta con detalle en la siguiente sección. Se prepararon dos constructos para cada 5' -UTR seleccionado: uno con (+DB) y uno sin (-DB) una caja aguas abajo na- > 15 tiva. Resultará obvio por la discusión anterior que los constructos -DB tienen una DB sintética proporcionada por el sitio de restricción Nhel . Los promotores fueron clonados aguas arriba de la región codificante de un gen de resistencia a la kanamicina (neo) , que está disponible en un fragmento Nhel- 20 Xbal o Ncol-Xbal. Para la estabilización del ARNm, se clonó la región 3' no traducida del gen rbcL aguas abajo de neo como fragmento Xba-I-HindIII . Los genes neo pueden, por lo tanto, ser escindidos de los plásmidos pUC118 o pBSIIKS+ como fragmentos SacI-HindIII . Estas fuentes de plásmidos son enu-|25 meradas en la Tabla 1.

Tabla 1. Características sobresalientes de los promotores quiméricosa' a"SD+, SD en posición de consenso procariótico; SD- , sin SD en posición de consenso procariótico; DB wt, tipo salvaje; m, mutantes; s, sitio Nhel como DB sin- 5 tética. bEc o pt se refiere a constructo con secuencia DB de E. coli o plastídica. cpsbA (+GC) indica adición de GC a la A de tipo salvaje en el extremo 5' del ARNm. "lO dEn la fuente de gen psbB, el codon de iniciación de la traducción está en el sitio Ncol; por lo tanto, el constructo +DB pHK16 tiene este sitio Ncol aguas arriba del sitio Nhel; véase la Figura 9. eEl codon de iniciación de la traducción está incluido en el 15 sitio Ncol; el sitio Nhel está directamente aguas abajo en la región codificante kan; véase la Figura 8. El fragmento del promotor Prrn está disponible en el plásmido pPRVIOOA (Zoubenko y col., 1994). Los promotores fueron diseñados para que incluyeran secuencias entre -197 nt ^20 y -114 nt aguas arriba del extremo 5' del ARNr 16S maduro. El nucleótido -197 es el extremo 5' de los constructos del promotor Prrn utilizados para éstos y otros estudios (Svab y Maliga, 1993; -1 es el primer nucleótido aguas arriba del ARNr 16S maduro) . La G en la posición -114 es uno de tres sitios 25 de iniciación de la transcripción; los otros dos son el nucleótido C adyacente (-113) y el nucleótido A (-111) (Allison y col-, 1996; Sriraman y col., 1998) . El nucleótido en el cual se iniciaría la transcripción de Prrn está marcado por un círculo relleno en la figura 3A-D. En la mayoría de los 30 constructos, éste es una G (-114) como en el promotor nativo.

En dos constructos, la G fue substituida por una A, como en el promotor psbA, que es la fuente de la secuencia líder (pHK21, pHK22; véase más adelante) . DISEÑO DEL LÍDER 5' A PARTIR DE atpB Para el gen atpB, se mapearon múltiples extremos 5' del ARNm en hojas de tabaco que incluían al menos cuatro transcriptos primarios que indicaban la transcripción a partir de cuatro promotores y un extremo 5' procesado 90 nucleótidos aguas arriba del codon de iniciación de la traducción (Orozco y col., 1990) . El nucleótido terminal del extremo 5' de atpB procesado es una G. Por lo tanto, los promotores PrrnLatpB quiméricos fueron diseñados para iniciar la transcripción en una G, anticipando que la secuencia líder del transcripto quimérico será una reproducción perfecta del extremo 5' del ARNm de atpB procesado. De la región codificante de atpB, 42 y 6 nucleótidos están incluidos en los constructos +DBwt y -DB, respectivamente. Los 42 nucleótidos incluyen cuatro secuencias DB potenciales mostradas en la Figura 2A. Se diseñaron dos mutaciones puntuales en la secuencia lider para eli-minar los sitios de restricción ?hel (T a A) y EcoRI (G a A) sin afectar a la estructura secundaria 5' predicha del AR?m. En los constructos -DB, se retuvieron dos codones (6 nucleótidos) de la región codificante nativa aguas arriba del sitio de restricción ?hel (secuencia GCTAGC) , en donde el codon de parada está fuera de marco (Figura 3A) . Se introdujeron once mutaciones puntuales silenciosas en la región DB del constructo PrrnLatpB+Dbm para o bien minimizar el número de pares de bases, o bien cambiar la naturaleza del emparejamiento de bases (por ejemplo, G-C a G-U) (Figura 2A; Figura 3A) . DISEÑO DEL LÍDER 5' A PARTIR DE clpP Se mapearon dos extremos del ARNm mayor del gen clpP en hojas de tabaco (Hajdukiewicz y col., 1997) . El nucleótido terminal del transcripto primario proximal es una G. Por lo tanto, los promotores PrrnLclpP quiméricos fueron diseñados para iniciar la transcripción en una G, anticipando que la secuencia líder del transcripto quimérico sería una reproducción perfecta del líder transcrito a partir del promotor Pclp-53. De la región codificante de clpP, 48 y 6 nucleótidos están retenidos en los constructos +DBwt y -DB, respectivamente. Los 48 nucleótidos incluyen cuatro secuencias DB potenciales, según se muestra en la Figura 2A. En los constructos -DB, dos codones (6 nucleótidos) eran retenidos de la región codificante nativa aguas arriba del sitio de restricción Nhel (secuencia GCTAGC) , en donde el codon de parada está fuera de marco . DISEÑO DEL LÍDER 5' A PARTIR DE rJbcL Se mapearon un extremo 5' de ARNm primario y uno procesado en hojas de tabaco para el gen rbcL (Shinozaki y Sugiu-ra, 1982) . El nucleótidos terminal del extremo 5' procesado es una T. Los promotores PrrnLrbcL quiméricos fueron diseñados para iniciar la transcripción de una G, un nucleótido aguas abajo de la T terminal. Cuarenta y dos y 6 nucleótidos de la región codificante de rbcL están incluidos en los cons-tructos +DB y -DB, respectivamente. Los 42 nucleótidos incluyen cuatro secuencias DB potenciales, tal como se muestra en la Figura 2A. la mutación puntual (G a A) en la secuencia líder fue diseñada para eliminar un sitio de restricción EcoRI son afectar a la estructura secundaria 5' del ARNm predicha. En los constructos -DB, se retienen dos codones (6 nucleótidos) de la región codificante nativa aguas arriba del sitio de restricción Nhel (secuencia GCTAGC) , en donde el codon de parada está fuera de marco. Se introdujeron doce mutaciones puntuales silenciosas en la región DB del constructo PrrnLrbcL+DBm para minimizar el número de pares de bases o para cambiar la naturaleza del emparejamiento de bases (por ejemplo, G-C a G-U) (Figura 2A, Figura 3B) . DISEÑO DEL LÍDER 5' A PARTIR DE psbB Se identificaron tentativamente un extremo 5' de ARNm primario y uno procesado para el gen psbB en hojas de tabaco (Tanaka y col., 1987). Se diseñó la secuencia líder para iniciar la transcripción a partir de la G (-114) del promotor Prrn e incluye la estructura (truncal) secundaria intacta supuestamente implicada en la estabilización del ARNm. Cuarenta y cinco y 3 nucleótidos de la región codificante de psbB están incluidos en los constructos +DB y -DB, respectivamente. Los 45 nucleótidos incluyen cuatro secuencias DB potenciales mostradas en la Figura 2A. Dado que el ATG está incluido de forma natural en un sitio Ncol usado para fusionar la región codificante neo con el líder psbB, no se añade ningún aminoácido de la región codificante de psbB en el constructo -DB. DISEÑO DEL LÍDER 5' A PARTIR DE psbA Se mapeó un extremo 5' de ARNm para el gen psbA en hojas de tabaco (Sugita y Sugiura, 1984) . El nucleótido terminal del transcripto primario es una A. Por lo tanto, los promotores PrrnLpsbA quiméricos fueron diseñados para iniciar la transcripción en una A, anticipando que la secuencia líder del transcripto quimérico será una reproducción perfecta del líder transcrito a partir del promotor psbA . En los constructos +DB y -DB están incluidos 21 y 3 nucleótidos de la región codificante de psbA, respectivamente. Los 21 nucleótidos incluyen la secuencia DB potencial , tal como se muestra en la Figura 2A. Dado que la región codificante de neo estaba unida al promotor quimérico a través de un sitio Ncol que incluye el codon de iniciación de la traducción (ATG) , no se añade ningún aminoácido de la región codificante de psbA en los constructos -DB. Esto es cierto para un segundo promotor -DB, en el plásmido PHK23, en donde la transcripción está diseñada para iniciarse a partir de la G (-114) y la C (-113) del Prrn (Figura 3C) . DISEÑO DEL LÍDER DEL GEN 10 DEL FAGO T7 Se mostró que el líder del gen 10 del fago T7 (63 nu-cleótidos) promovía suficiente iniciación de la traducción en E. coli (Olins y col., 1988) . Este líder es usado en los vectores de expresión pET en E. coli (Studier y col., 1990; Novagen Inc.) . El nucleótido terminal en el extremo 5' es una G. Por lo tanto, los promotores PrrnT7gl0L quiméricos fueron diseñados para iniciar la transcripción en una G, anticipando que la secuencia líder del transcripto quimérico será una reproducción del ARNm del gen 10 del fago T7, , con la excepción de una mutación T a A que se introdujo para eliminar un sitio Xbal. Veinticuatro y 9 nucleótidos de la región codificante del gen 10 del fago T7 están incluidos en los constructos +DB/Ec (con la secuencia DB de E. coli) y -DB, respectivamente. Para comparar la eficacia de las secuencias DB de E. coli y plástido en plástidos, se construyó un segundo promotor +DB con la secuencia DB del tabaco (PrrnT7glOL+DB/pt) . El líder T7gl0 nativo tiene un sitio Nhel directamente aguas abajo del codon de iniciación de la traducción. Este sitio Nhel fue eliminado por una mutación puntual T a A en los constructos +DB (Figura 3D) . Para la introducción en el genoma del plástido, se clonaron los genes neo quiméricos en el vector de transformación de plástidos pPRVUA o pPRVlllB. Véase la Patente EE.UU. 5.877.402, cuya descripción es aquí incorporada como referencia. Los vectores pPRVlllA dirigen inserciones a la región de repetición invertida del genoma del plástido del tabaco y llevan un gen de resistencia a la espectinomicina (aadA) seleccionable. Las secuencias de los vectores han sido depositadas en GenBank (U12812, U12813) . El gen neo quimérico en el vector pPRVlllB es un tándem con el gen aadA, mientras que, en el vector pPRVlllA, el neo quimérico está orientado de un modo divergente. El perfil general del vector de transformación de plástidos con los genes neo quiméricos es mostrado en las Figuras 4A y 4B. CONSTRUCCIÓN DE PROMOTORES Prrn QUIMÉRICOS CON LÍDERES DE ARNm PLASTIDICO Se construyeron los fragmentos promotor Prrn quimérico/líder como un fragmento Sacl-Nhel o Sacl-Ncol (Tabla 1 a continuación) mediante PCR de extensión por solapamiento 5 ("SOE-PCR") , esencialmente según han descrito Lefebvre y col. (1995) . La construcción de los segmentos Prrn-líder plastídico es esquemáticamente mostrada en la Figura 5. El objetivo de la etapa PCR-1 es 1) amplificar el fragmento del promotor Prrn, mientras 2) se añade un sitio Sacl aguas arriba y un 10 solapamiento sin costuras con la secuencia líder aguas abajo específica. La reacción contiene: 1) un cebador (oligonucleótido) para añadir un sitio Sacl en el extremo 5' del fragmento, 2) una plantilla adecuada que contiene la secuencia del > promotor Prrn en el plásmido pPRVIOOA (Zoubenko y col., 1994) 15 y 3) un cebador para añadir el solapamiento con la secuencia líder en el 3' del producto amplificado. El objetivo de la etapa PCR-2 es crear el promotor quimérico con la secuencia DB usando: 1) el producto de la etapa PCR-1 como cebador, 2) una plantilla de ADN adecuada que contiene la secuencia líder 20 específica y 3) cebador (oligonucleótido) para incluir el sitio de restricción Nhel en el extremo 3 ' del producto de amplificación. El producto de la PCR-2 es el fragmento del promotor Prrn quimérico Sacl -Nhel con secuencia DB . El objetivo . de la etapa PCR-3 es eliminar la secuencia DB al tiempo cjue ^25 se introduce un sitio de restricción Nhel o Ncol adecuado. El producto de la PCR-3 es el fragmento del promotor Prrn quimérico Sacl-Nhel o Sacl-Ncol, en donde la secuencia DB está substituida con el sitio Nhel. El objetivo de la etapa PCR-4 es substituir la DB de tipo salvaje con una DB mutante. El 30 producto de la PCR-4 es un fragmento de promotor Prrn Sacl- Nhel. Los cebadores (oligonucleótidos) usados para la construcción de promotores quiméricos son enumerados en la Tabla 2. Los promotores quiméricos fueron obtenidos por PCR de ex-tensión por solapamiento usando oligonucleótidos y plantillas de ADN esquemáticamente mostrados en la Figura 5. Tabla 2 Oligonucleótidos usados para la construcción de promotores quiméricos #1 : 5 ' -CCCGAGCTCGCTCCCCCGCCGTCGTTC-3 ' #2 : 5 ' -CGAATTTAAAATAAATGTCCGCTTGCACGTCGATCGGTTAATTCTCCCA- GAAATATAGCCATCC-3 ' #3 : 5 -CCCGCTAGCCGTGGAAACCCCAGAACC-3 ' #4 : 5 -CCCGCTAGCTCTCATAATAATAAAATAAATAAATATGTC-3 ' #5 : 5 -TCACTTTGAGGTGGAAACGTAACTCCCAGAAATATAGCCATCC-3 ' #6 : 5 -CCCGCTAGCTTCCTCTCCAGGACTTCG-3 ' #7 : 5 -CCCGCTAGCAGGCATTAAATGAAAGAAAGAAC-3 ' #8 : 5 ' -TAAGAATTTTCACAACAACAAGGTCTACTCGACTCCCAGAAATATAGCC- ATCC-3' #9 : 5 ' -CCCGCTAGCTTTGAATCCAACACTTGCTTTAG-3 ' #10 : 5 ' -CCCGCTAGCTGACATAAATCCCTCCCTAC-3 ' #11: 5 ' -CAAAGATAAATAGACACTACGTAACTTTATTGCATTGCTCCCAGAAAT- ATAGCCATCC-3' #12 5 ' -CCCGCTAGCATCATTCAATACAACGGTATGAACACG-3 ' #13 5 ' -TTCTAGTGGGAAACCGTTGTGGTCTCCCTCCCAGAAATATAGCCATCC-3 ' #14 5 ' -CCCGCTAGCCATATGTATATCTCCTTCTTAAAG-3 ' #15 5 ' -CCCGCTAGCCTGTCCACCAGTCATGCTTGCCATA-3 ' #16 5 ' -CCCGCTAGCCAAGGCAGGGCTAGTGATTGCCATATGTATATCTCCTTC-3 ' #17 5 ' -TTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGGCAAGCATGACTGGT-GG- 3' #18 5 ' -CTCCTTCTT7AAAGTTAAACAAAATTATTTCTAGTGGGAAACCGTTGT-3 ' #19 5 ' -CAAAATAGAAAATGGAAGGCTTTTTGCTCCCAGAAATATAGCCATCCC-3 ' #20 5 ' -CAAAATAGAAAATGGAAGGCTTTTTTCCCAGAAATATAGCCATCCC-3 ' #21 5 ' -GGGCCATGGTAAAATCTTGGTTTATTTAATC-3 ' #22 5 ' -GGGGCTAGCTCTCTCTAAAATTGCAGT-3 ' #23: 5 ' -GAATAGCCTCTCCACCCA-3 ' #24 5 ' -CCCGCTAGCCGTGGACACCCCACTTCCACTTGTTGTCGGGTTTATTCT-CAT- 3' #25 : 5 ' -CCCGCTAGCTTTGAATCCfÁCTGAGGCTTTTGTTTCTGTTTGAGGACT-CAT- CONSTRUCCIÓN DE SEGMENTOS PROMOTOR Prrn QUIMÉRICO/LÍDER atpB PrrnLatpB+DBwt en el plásmido pHKIO (Producto de PCR-2) . PrrnLatpB-DB en el plásmido pHKll (Producto de PCR-3) . PrrnLatpB+DBm en el plásmido pHK50 (Producto de PCR-4) . PCR-1: Oligonucleótidos #1, #2 como cebadores; ADN del plásmido pPRVIOOA (Zoubenko y col., 1994) como plantilla. PCR-2 : Producto de la etapa PCR-1, Oligonucleótido #3 como cebador; ADN del plásmido pIK79 (véase a continuación) como plantilla. PCR-3: Oligonucleótidos #1, #4 como cebadores; Producto de la etapa PCR-2 como plantilla. PCR-4 : Oligonucleótidos #1, #24 como cebadores; Producto de la etapa PCR-2 como plantilla. El plásmido pIK79 es un derivado del fagémido Bluescript BS+ que lleva un fragmento de ADN plastídico del tabaco Pvull/Xhol entre los nucleótidos 55147-60484 que contiene la región intergénica rbcL-atpB con promotores divergentes para estos genes (Shinozaki y col., 1986) . CONSTRUCCIÓN DE SEGMENTOS PROMOTOR Prrn QUIMÉRICO/LÍDER clpP PrrnLclpP+DBwt en el plásmido pHK12 (Producto de PCR-2) . PrrnLclpP-DB en el plásmido pHK13 (Producto de PCR-3) . PCR-1: Oligonucleótidos #1, #5 como cebadores; ADN del plás-mido pPRVIOOA (Zoubenko y col., 1994) como plantilla. PCR-2 : Producto de la etapa PCR-1, Oligo #6 como cebadores; fragmento Sal8 ptDNA del tabaco (Shinozaki y col., 1986) como plantilla. PCR-3: Oligonucleótidos #1, #7 como cebadores; Producto de la etapa PCR-2 como plantilla. CONSTRUCCIÓN DE SEGMENTOS PROMOTOR Prrn QUIMÉRICO/LÍDER rbcL PrrnLrbcL+DBwt en el plásmido pHK14 (Producto de PCR-2) . PrrnLrbcL-DB en el plásmido pHK15 (Producto de PCR-3) . PrrnLrbcL+DBm en el plásmido pHK54 (Producto de PCR-4) .

PCR-1: Oligonucleótidos #1, #8 como cebadores; ADN del plásmido pPRVIOOA (Zoubenko y col., 1994) como plantilla. PCR-2 : Producto de la etapa PCR-1, Oligonucleótido #9 como cebadores; ADN del plásmido pIK79 (véase la descripción de pHKIO anterior) como plantilla. PCR-3 : Oligonucleótidos #1, #10 como cebadores; Producto de la etapa PCR-2 como plantilla. PCR-4 : Oligonucleótidos #1, #25 como cebadores; Producto de la etapa PCR-2 como plantilla.

CONSTRUCCIÓN DE SEGMENTOS PROMOTOR Prrn QUIMÉRICO/LÍDER psbB PrrnLpsbB+DBwt en el plásmido pHK16 (Producto de PCR-2) . PrrnLpsbB-DB en el plásmido pHK17 (Promotor procedente de pHK16, digerido con Sacl/Ncol) . 5 PCR-1: Oligonucleótidos #1, #11 como cebadores; ADN del plásmido pPRVIOOA (Zoubenko y col., 1994) como plantilla. PCR-2 : Producto de la etapa PCR-1, Oligo #12 como cebadores; fragmento Sal8 ptDNA del tabaco (Shinozaki y col., 1986) como plantilla. 10 La PCR-3 no fue necesaria, ya que el codon de iniciación de la traducción de psbB está incluido de forma natural en un sitio Ncol. Por lo tanto, se pudo obtener el derivado -DB por digestión con Sacl/Ncol de la etapa PCR-2. > CONSTRUCCIÓN DE SEGMENTOS PROMOTOR Prrn QUIMÉRICO/LÍDER psbA 15 PrrnLpsbA+DBwt en el plásmido pHK21 (Producto de PCR-2) . PrrnLpsbA-DB en el plásmido pHK22 (Producto de PCR-3) . PCR-1: Oligonucleótidos #1, #20 como cebadores; ADN del plásmido pPRVIOOA (Zoubenko y col., 1994) como plantilla. PCR-2 : Producto de la etapa PCR-1, Oligo #22 como cebadores; 20 fragmento Sal3 ptDNA del tabaco (Shinozaki y col., 1986) como plantilla. PCR-3: Oligonucleótido #1, #21 como cebadores; Producto de la etapa PCR-2 como plantilla. PrrnLpsbA(GC) -DB en el plásmido pHK23 (Producto de PCR-2). r25 PCR-1: Oligonucleótidos #1, #19 como cebadores; ADN del plásmido pPRVIOOA (Zoubenko y col., 1994) como plantilla. PCR-2: Producto de la etapa PCR-1, Oligo #21 como cebadores; fragmento Sal3 ptDNA del tabaco (Shinozaki y col., 1986) como plantilla. 30 En todos los casos anteriores, la amplificación por PCR fue llevada a cabo con ADN polimerasa AmpliTaq (Perkin Elmer) o ADN polimerasa Pfu (Stratagene) y se llevó a cabo una PCR "descendente", que utiliza una reducción gradual de las temperaturas de recocido (Hecker y Roux, 1996) . A continuación, se dan las condiciones exactas de amplificación para los promotores Prrn: :LatpB quiméricos. Las condiciones de amplificación para el resto de los promotores Prrn quimérico- líder plastídico fueron calculadas según Hecker _y Roux (1996) y sólo difieren en las temperaturas de recocido. A continuación, se da una descripción de las condiciones de PCR para la construcción de los promotores Prrn quiméricos con líderes de ARNm plastídico; para la interpretación de las etapas individuales, véase el esquema de la figura 5. Programa de PCR-1: 50 picomoles de ambos cebadores por 100 µl. 1.1 Desnaturalización 5 min. a 94 °C 2.1 Desnaturalización 1 min. a 94 °C 2.2 Recocido 0,5 min. a 72°C 3 ciclos 2.3 Extensión 0,5 min. a 72 °C 3.1 Desnaturalización 1 min. a 9 °C 3.2 Recocido 0,5 min. a 69°C 3 ciclos 3.3 Extensión 0,5 min. a 72 °C 4.1 Desnaturalización 1 min. a 94 °C 4.2 Recocido 0,5 min. a 66°C 3 ciclos 4.3 Extensión 0,5 min. a 72°C 5.1 Desnaturalización 1 min. a 94 °C 5.2 Recocido 0,5 min. a 63 °C 3 ciclos 5.3 Extensión 0,5 min. a 72 °C 6.1 Desnaturalización 1 min. a 94 °C 6.2 Recocido 0,5 min. a 60 °C 3 ciclos 6.3 Extensión 0,5 min. a 72 °C 7.1 Desnaturalización 1 min. a 94 °C 7.2 Recocido 0,5 min. a 57°C 20 ciclos 7.3 Extensión 0,5 min. a 72°C 8.1 Extensión 10 min. a 72°C 8.2 1 min. a 30 °C El programa de la PCR-2 era esencialmente idéntico al programa de la PCR-1 antes expuesto, con las siguientes modi- ficaciones : 1) los cebadores en 100 µl eran los productos de la primera reacción PCR y se usaron 50 picomoles del cebador oligonucleotídico y 2) la temperatura de recocido en la PCR descendente era de 67 °C a 52 °C. En consecuencia, se usaron > 5 las siguientes temperaturas de recocido: Etapa 2.2, 67 °C; Etapa 3.2, 64 °C; Etapa 4.2, 61 °C; Etapa 5.2, 58 °C; Etapa 6.2, 55 °C; Etapa 7.2, 52 °C. Los programas de la PCR-3 y de la PCR-4 eran esencialmente idénticos al programa de la PCR-1, con la siguiente mo- 10 dificación: 1) La temperatura de recocido en la PCR descendente era de 69 °C a 44 °C. En consecuencia, se usaron las siguientes temperaturas de recocido: Etapa 2.2, 69 °C; Etapa 3.2, 64 °C; Etapa 4.2, 59°C; Etapa 5.2, 54 °C; Etapa 6.2, 49°C; ft Etapa 7.2, 44 °C. En los casos en que el rendimiento de la re- 15 acción PCR final era demasiado bajo para una clonación eficaz, se amplificó el producto usando cebadores que fueron utilizados para generar los extremos. Los productos de la PCR final fueron digeridos con las enzimas de restricción apropiadas (Sacl y Nhel o Sacl y Ncol) y clonados en los plásmi- 20 dos pHK2 o pHK3 (véase a continuación) . CONSTRUCCIÓN DE PROMOTORES QUIMÉRICOS CON EL SEGMENTO LÍDER DEL ARNm DEL GEN 10 DEL FAGO T7 Se construyeron los fragmentos promotor Prrn quiméri-^ co/líder del gen 10 de T7 (PrrnLt7glO) como fragmentos Sacl- 25 Nhel (Tabla 1, a continuación) . Promotor PrrnLt7glO+DB/Ec en el plásmido pHK18 En ausencia de una plantilla de ADN apropiada, se construyó el PrrnLT7gl0+DB/Ec empleando una reacción en cadena de polimerasa modificada (Uchida, 1992) en dos etapas de PCR, 30 según se muestra esquemáticamente en la Figura 6. Las etapas PCR-1A y PCR-1B generan dos fragmentos en dos reacciones separadas (A y B) . El objetivo de la etapa PCR-1A es amplificar el fragmento del promotor Prrn mientras que se añade: 1) un sitio Sacl aguas arriba (Oligonucleótido #1 en la Tabla 2) y 2) un solapamiento sin costura con la secuencia líder aguas abajo específica (Oligonuc?eótido #13 en la Tabla 2) usando el plásmido pPRVIOOA (Zoubenko y col., 1994) como plantilla de ADN. El objetivo de la etapa PCR-1B es amplificar parte de 5 la secuencia líder de T7gl0 usando los oligonucleótidos solapantes #15 y #17 de la Tabla 2. Se introduce el sitio Nhel en el oligonucleótido #15. Ambas reacciones PCR-1A y PCR-1B fueron llevadas a cabo por PCR descendente según se ha descrito antes para la construcción de los promotores Prrn quiméricos. 10 La reacción PCR-2 que genera este promotor quimérico contenía: a) los productos de las reacciones PCR-1A y PCR-IB como plantillas de ADN; b) el oligonucleótido #18 (0,5 picomoles, Tabla 2) para ft 15 generar fragmentos solapantes con los productos de las reacciones PCR-1A y PCR-IB; c) los oligonucleótidos #1 y #15 (Tabla 2) para la amplificación del producto final, 50 picomoles de cada uno en 100 µl de volumen final. 20 Se amplificó el promotor por PCR descendente, según se ha descrito para los promotores Prrn quiméricos anteriores; las temperaturas de recocido estaban entre 72 °C y 57°C. Promotor PrrnLT7glO+DB/pt en el plásmido pHK19 Se obtuvo el fragmento del promotor en una etapa de PCR según se muestra en la Figura 7. La reacción contenía: a) el producto de la reacción PCR-2 que generó el promotor PrrnLT7glO+DB/Ec en el plásmido pHK18 como plantilla de ADN y b) los oligonucleótidos #1 y #16 (Tabla 2) , 50 picomoles 30 de cada uno en 100 µl de volumen final. Se amplificó el promotor por PCR descendente, según se ha descrito para la construcción de los promotores Prrn quiméricos anteriores; las temperaturas de recocido eran de entre 72°C y 52°C.

Promotor PrrnLT7glO-DB en el plásmido pHK20 Se obtuvo el fragmento del promotor en una etapa de PCR similar a la etapa PCR-3 de la Figura 5. La reacción contenía: " 5 a) el producto de la reacción PCR-2 que generó el promotor PrrnLT7glO+DB/Ec en el plásmido pHKld como plantilla de ADN y b) los oligonucleótidos #1 y #14 (Tabla 2) , 50 picomoles de cada uno en 100 µl de volumen final. 10 Se amplificó el promotor por PCR descendente, según se ha descrito para los promotores Prrn quiméricos anteriores; las temperaturas de recocido estaban entre 72 °C y 52 °C. Los productos de la PCR final fueron digeridos con las ) enzimas de restricción Sacl y Nhel y clonados en el plásmido 15 pHK3 para obtener los plásmidos pHK18, pHK19 y pHK20. Construcción de genes neo quiméricos La construcción de los promotores quiméricos fue descrita en las secciones precedentes. Para determinar los efectos sobre los niveles de acumulación de proteína, se clonaron los 20 promotores aguas arriba de un constructo codificante de resistencia a la kanamicina, que contenía la región codificante de neo y el 3 ' -UTR del gen rbcL plastídico. Dichos constructos están disponibles en los plásmidos pHK2 y pHK3, que llevan el mismo gen Prrn (L) rbcL (S) : -. neo : :TrbcL como fragmento ?2.5 SacI-HindIII . El plásmido pHK2 es un derivado del vector pUC118; pHK3 es un derivado de pBSIIKSp-. En la Figura 8, se muestran los mapas de plásmidos con sitios de restricción relevantes . La secuencia de ADN del gen neo en los plásmidos pHK2 y pHK3 es mostrada en la Figura 9. Obsérvese que, en el 30 plásmido pHK2 , el gen neo tiene un sitio EcoRI aguas arriba del sitio Sacl (Figura 8) . Prrn y TrbcL han sido descritos por Staub y Maliga, 1994; el gen neo deriva del plásmido pSCl (Chaudhuri y Maliga, 1996) . Los derivados plasmídicos pUClld y pBSIIKS+, que llevan los diversos constructos promotores, aparecen en la Tabla 1. Para determinar la secuencia de ADN de los fragmentos promotores, los plásmidos fueron purificados con el Kit de Purificación de Plásmidos QIAGEN siguiendo las recomendaciones del fabricante. Se llevó a cabo la secuenciación del ADN usando un kit de secuenciación de ADN T7 (versión 2.0 de ADN, Amersham Cat. N° US70770) y el cebador N° #23 de la Tabla 2, que es complementario de la secuencia codificante de neo. Estas secuencias promotoras son mostradas en la Figura 3A-D. Introducción de genes neo quiméricos en el genoma plastxdico del tabaco Se dispone de vectores adecuados para la introducción de genes extraños en el genoma de plástidos del tabaco. Dichos vectores son pPRVlllA y pPRVlllB, que llevan un gen seleccio-nable de resistencia a la espectinomicina (aadA) e inserciones diana en la región repetida del genoma del plástido (Zoubenko y col., 1994) . Los genes neo quiméricos fueron clonados en uno de estos vectores de transformación de plástidos (Tabla 1) e introducidos en el genoma de los plástidos del taba-co mediante el procedimiento biolístico. A partir de las células transformadas, las plantas fueron regeneradas por protocolos estándar (Svab y Maliga, 1993) . Se confirmó una población uniforme de copias del genoma plastídico transformado por análisis Southern. Para el análisis Southern, se preparó ADN celular total por el método CTAB (Saghai-Maroof y col., 1984). Se homogeneizaron dos hojas de cada planta transformada y se incubaron a 60 °C durante 30 minutos en un tampón que contenía CTAB (bromuro de tetradeciltrimetilamonio) 2%, NaCl 1,4 M, EDTA 20 mM (pH 8,0), Tris/HCl 1 mM (pH 8,0) y -mercaptoetanol 100 mM. Después de la extracción con cloroformo, se precipitó el ADN con alcohol isopropílico y se disolvió en agua o en tampón TE (Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0) . Se sometió el ADN digerido con una enzima de restricción apropiada a electrofore- sis en gel de agarosa al 0,8% y se transfirió a una membrana de nilón usando un aparato de Transferencia PosiBlot (Stratagene) . Se sondaron las manchas usando Tampón de Hibridación Rápida y secuencias dirigidas a plástidos como sonda marcada w 5 con imprimación aleatoria (32P, Boehringer Mannheim Cat. N° 1004760) . Se consiguió la transformación de los plástidos con cada uno de los plásmidos enumerados en la Tabla 1. Eran excepciones los plásmidos pHK41 y pHK42. Parece que la expresión de 10 NPTII con los derivados del líder psbA era tan alta que las plantas no eran viables. Se deduce que estos mismos líderes pueden ser usados con ventaja cuando se fusionan con promotores más débiles. Las plantas transplastómicas son designadas por Nt (N. 15 tabacum, la especie), el nombre del plásmido (por ejemplo, pHK30) y por un número de línea individual y una letra que identifican a las plantas regeneradas. Por ejemplo, las plantas Nt-pHK30-lD y Nt-pHK30-lC fueron ambas obtenidas por transformación con el plásmido pHK30, derivan del mismo suce- 20 so de transformación y fueron regeneradas a partir del mismo cultivo. Las plantas Nt-pHK30-2 derivan de un suceso de transformación independiente. Normalmente, se obtuvieron varias líneas transformadas por constructo. Sin embargo, sólo se muestran aquí datos para una: Nt-pHK30-lD, Nt-pHK31-lC, )k5 Nt-pHK60-5A, Nt-pHK32-2F, Nt-pHK33-2A, Nt-pHK34-9C, Nt-pHK35- 4A, Nt-pHK64-3A, Nt-pHK36-lC, Nt-pHK37-2D, Nt-pHK38-2E, Nt- pHK39-3B, Nt-pHK40-12B y Nt-pHK43-lC. Estudio de la acumulación de ARNm por análisis de manchas en gel de ARN (Northern) 30 Se llevó a cabo el análisis de manchas en gel de ARN para determinar los niveles en estado estacionario de ARNm cjui- mérico en las líneas transplastómicas. Se preparó AR? total de hojas a partir de las hojas y raíces de plantas crecidas en cultivo estéril según Stiekema y col. (1988) . Se sometió el ARN (4 µg por banda) a electroforesis en gel de agarosa al 1% y se transfirió a una membrana de nilón usando el aparato de Transferencia PosiBlot (Stratagene) . Las manchas fueron sondadas usando Tampón de Hibridación Rápida (Amersham) con una sonda neo marcada con 32P (Pharmacia, Kit de Imprimación Aleatoria Ready-To-Go) . Se obtuvo la sonda neo por aislamiento del fragmento ?hel/Xbal del plásmido pHK2. La plantilla para sondar el AR?r 25S citoplásmico del tabaco era un fragmento que fue amplificado por PCR a partir del AD? celular total del tabaco con los cebadores 5 ' -TCACCTGCCGAATCAACTAGC-3' y 5' -GACTTCCCTTGCCTACATTG-3' . Las señales de hibridación del AR? fueron cuantificadas usando un Phosphorlmager de Molecular Dynamics y normalizadas con respecto a la señal del AR?r 25S. Estudio de la acumulación de ?PTII por análisis de manchas en gel de protexna (Western) Se extrajo la proteína soluble total de las hojas, raíces o semillas de plantas de tabaco transgénicas crecidas en cultivo estéril. En el caso de las hojas crecidas en cultivo estéril, se homogeneizaron aproximadamente 200 mg de tejido de hojas en 1 ml de tampón que contenía Hepes 50 mM/KOH (pH 7,5), EDTA 1 mM, acetato de potasio 10 mM, acetato de magnesio 5 mM, ditiotreitol 1 mM y PMSF 2 mM. Se centrifugó el homogenado dos veces a 4°C para eliminar el material insolu-ble. Se determinó la concentración de proteína usando el kit de reactivo de Ensayo para proteínas de Biorad. Se usaron las plantas de tabaco transgénicas que expresaban neo en el genoma del plástido (?t-pT?H32-70, Carrer y col., 1993) y las plantas de tipo salvaje como controles positivo y negativo, respectivamente. Las proteínas fueron separadas en geles de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE; 15% acrilamida, urea 6 M) y transferidas a membranas de nitrocelulosa usando un aparato de transferencia semiseca (Bio-Rad) . Después de bloquear los sitios de unión inespecífica, la membrana fue incubada con antisuero policlonal de conejo diluido 4.000 veces y producido frente a NPTII (5Prime—3Prime Inc.). Se usó anticuerpo secundario conjugado a HRP, diluido 20.000 veces, y quimiolu- miniscencia ECL para la detección de las inmunomanchas en pe- 5 lícula de rayos X. Se cuantificó la NPTII en las inmunomanchas por comparación de las muestras experimentales con una serie de dilución de NPTII comercial (5Prime—»3Prime) . EJEMPLO 1 Las secuencias DB potencian la acumulación de protexna proce- 10 dente del líder rJc ; la acumulación de proteína procedente de las señales de control de la traducción de atpB es alta, pero independiente de DB Se estudió el papel de las secuencias DB en la traduc-t ción del ARNm usando neo como gen informador. El gen neo co- JL5 difica para la enzima bacteriana neomicín-fosfotransferasa (NPTII) (Beck y col., 1982). Los genes neo estudiados tienen el mismo promotor (Prrn) y finalizador de la transcripción (TrbcL) y difieren sólo con respecto a la región de control de la traducción (TCR) , que contiene la región no traducida 20 5' del ARNm y el extremo N de la región codificante. Se prepararon dos constructos con las TCR atpB y rbcL. Un constructo contenía la TCR de tipo salvaje, incluyendo la región no traducida 5' procesada y 42 nucleótidos del extremo N de la región codificante (PrrnLatpB+DBwt, plásmido pHK30, Figura fc 5 4B; PrrnLrbcL+DBwt, plásmido pHK34, Figura 4A) . El segundo constructo contenía mutaciones silenciosas en el segmento de 42 nucleótidos de las regiones codificantes N-terminales atpB y rbcL para eliminar o alterar el emparejamiento de bases del ARNm y del AR?r (plásmidos PrrnLatpB+DBm pHK60, figura 2A y 30 Figura 4B; PrrnLrbcL+DBm, pHK64 , figura 2A y Figura 4A) . Las mutaciones silenciosas alteraron la secuencia del AR?m sin afectar a la secuencia de aminoácidos. Por ejemplo, 13 pares de bases potenciales pueden formarse entre el AR?m atpB de tipo salvaje y la secuencia ADB mostrada en la parte inferior de la Figura 2A. Las 11 mutaciones silenciosas afectan a ocho sucesos de emparejamiento de bases para esta interacción ADB- DB particular. Después de la mutagénesis, existe una posibilidad para que haya diez sucesos de emparejamientos de bases, 5 la mayoría de los cuales son nuevos. Los genes neo quiméricos fueron introducidos en el genoma plastídico del tabaco por direccionalización homologa usando la aproximación biolística (Svab y Maliga, 1993; Zoubenko y col., 1994). Los niveles de NPTII y ARNm neo fueron entonces valorados en las hojas de 10 plantas transplastómicas. Dado que NPTII en plantas que contiene DB de tipo salvaje y que contienen DB mutante tiene exactamente la misma secuencia proteica, los niveles de proteína en las plantas reflejan directamente la eficacia de la ? traducción del ARNm. En el caso de la TCR atpB, la mutagéne- 15 sis de DB redujo la acumulación de proteína a ~4% en lugar de ~7% (Figura 10 y Tabla 3) . Por el contrario, la mutagénesis de DB rbcL tuvo un efecto dramático, reduciendo la acumulación de NPTII 35 veces. Así, la interacción DB-ADB es muy importante para la traducción del ARNm rbcL plastídico, pero es 20 menos importante para la traducción del ARNm atpB. También preparamos un tercer grupo de constructos con los líderes atpB y rbcL pero sin la DB nativa (PrrnLatpB-DB, plásmido pHK31, Figura 4B; PrrnLrbcL-DB, plásmido pHK35, Figura 4A) . La región codificante de neo en estos constructos W¿5 está directamente unida al promotor Prrn por medio de un sitio de restricción Nhel sintético. El sitio de restricción Nhel (GCTAGC) es totalmente complementario a la región ADB (Figura 2B) ; por lo tanto, se esperaba que funcionara como una secuencia DB. La utilidad del sitio Nhel como DB alterna- 30 tiva podría ser mejor juzgada por la acumulación de ?PTII procedente del líder rbcL, que es altamente dependiente de DB. Altos niveles de ?PTII procedentes del constructo Nhel (4,7%) en relación a la DB mutante (0,3%) indican que la unión de la región codificante a través de un sitio Nhel pro-porciona una DB adecuada para expresar polipéptidos extraños (figura 10., Tabla 3) .

Tabla 3 Niveles de NPTII y ARNm neo en hojas de tabaco DISCUSIÓN En bacterias, la mutagénesis o la deleción de la DB reduce la traducción de 2 a 34 veces, dependiendo del /ARNm individual (Etchegaray e Inouye, 1999; Faxén y col., 1991; Ito y col., 1993; Mitta y col., 1997; Sprengart y col., 1996). Más aún, la dependencia con respecto a la DB aumenta cuando se elimina la secuencia SD (Sprengart y col., 1996; Wu y Janssen, 1996) . En nuestros experimentos, no se hizo variación alguna en el 5 'UTR de atpB o rbcL, sino que sólo se alteraron secuencias aguas abajo del AUG. La mutagénesis de la región DB de atpB redujo los niveles de proteína ~2 veces. Aunque el ARNm a pB no tiene una SD directamente aguas arriba de AUG, especulamos que probablemente tiene un mecanismo alternativo para la indicación de la traducción que reduce su dependencia de la DB. Alternativamente, la iniciación de la traducción puede ser facilitada por proteínas activadores, según se ha descrito para cloroplastos de Chlamydomonas (Ro-chaix, 1996; Stern y col., 1997) . La consecuencia de la muta-génesis de DB sobre la traducción de rbcL fue una dramática caída de 35 veces en los niveles de ?PTII. En consecuencia, una eficaz traducción de rbcL es altamente dependiente de las interacciones DB-ADB. Los genes tanto de procariontes como de eucariontes muestran predisposiciones en la utilización de los 61 codones de aminoácidos y tienen una población de AR?t que se corresponde estrechamente con la predisposición global de codones de la población fija de AR?m. La incorporación de codones menores sinónimos en la región codificante puede reducir dramáticamente la traducción (Makrides, 1996) y desestabilizar el ARNm (Deana y col., 1998) . Un ejemplo bien caracterizado de codones menores que causan una reducida expresión en E. coli son los codones de arginina AGA/AGG reconocí-dos por el mismo AR?t que están presentes en una frecuencia de 2,6 y 1,6 por mil codones. Por lo tanto, hemos comparado la tendencia de utilización de codones y la frecuencia de tripletes por 1.000 nucleótidos en las regiones DB de atpB y rbcL de tipo salvaje y mutagenizadas. Como estudiamos la acu-mulación de ?PTII en hojas, los valores mostrados en la figura 12 fueron calculados para los genes fotosintéticos rbcL, psaA, psaB, psaC, psbA, psbB, psbC, psbD, psbE y psbF altamente expresados usando el programa de frecuencia de codones de Genetics Computer Group (GCG; Madison Wisconsin) . La ten- dencia de utilización de codones y la frecuencia de tripletes son comparables en las regiones DB de tipo salvaje y mutantes de atpB y de rbcL. Además, los ARNm para los constructos DB de tipo salvaje y mutantes se acumulan en niveles similares. 5 Por lo tanto, el dramático cambio en la acumulación de ?PTII procedente del promotor PrrnLrbcL+DBm en la línea ?t-pHK64 puede no ser atribuida a la incorporación de un codon raro en la región DB mutante . Hemos mostrado aquí que las secuencias aguas abajo del 10 codon de iniciación de la traducción pueden afectar de forma dramática a la traducción del AR?m. Por lo tanto, las mutaciones silenciosas en la región DB de las proteínas heterólogas puede mejorar significativamente la expresión en cloroplastos aumentando la complementariedad del AR?m con la pe-ft 15 núltima estructura truncal del AR?r plastídico. Existen diferencias significativas en la acumulación de NPTII procedente de transgenes neo con diferentes líderes y la misma DB sintética (Tabla 3) . Esto indica que el 5 'UTR es un determinante importante de la eficacia de la traducción. 20 Se dispone de muchos datos que respaldan la importancia de 5 'UTR como objetivo para el control de la traducción en plantas superiores (Hirose y Sugiura, 1996; Staub y Maliga, 1993; Staub y Maliga, 1994b) y el alga unicelular Chlamydomonas (Mayfield y col., 1994; ?ickelsen y col., 1999; Sakamoto y le5 col., 1993; Zerges y col., 1997) . Los datos aquí presentados demuestran que la eficacia de la traducción en plástidos está determinada por secuencias tanto aguas arriba como aguas abajo del AUG.

EJEMPLO 2 El estudio de las secuencias para el control de la traducción T7gl0 de fago indica que la DB eficiente en plástidos tiene una complementariedad laxa con ADB ? 5 Dado que la secuencia ADB real es diferente en plástidos y en E. coli , anticipamos (Sprengart y col., 1996; Etchegaray e Inouye, 1999) que la substitución de la DB de E. coli con una DB plastídica perfecta (100% complementariedad DB-ADB) aumentaría la traducción en plástidos. Elegimos la región de 10 control de la traducción T7gl0 de fago para el estudio, ya que tiene una DB de E. coli bien caracterizada. Se construyeron tres derivados del promotor Prrn. La cassette PrrnLT7gl0+DB/Ec consiste en Prrn fusionado con la TCR T7gl0 k nativa que contiene la DB de E. coli (plásmido pHK38; Figura 15 2B, Figura 4A) . La cassette PrrnLT7glO+DB/pt consiste en el promotor Prrn, el líder T7gl0 y la DB perfecta del tabaco (pHK39; Figura 2B, Figura 4A) . la cassette PrrnLT7glO-DB tiene el promotor Prrn y el líder T7gl0, pero carece de la secuencia DB T7gl0 (pHK40; Figura 2B, Figura 4A) . La región co- 20 dificante de neo en estos constructos está directamente unida al promotor Prrn a través de un sitio de restricción Nhel sintético. Los genes neo en las tres cassettes de expresión fueron introducidos en plástidos de tabaco por transformación (Svab y Maliga, 1993; Zoubenko y col., 1994) y las hojas del tabaco transplastómico fueron estudiadas en cuanto a la acumulación de NPTII y a los niveles de ARNm (Figuras 10, 11; Tabla 3) . Sorprendentemente, los niveles de NPTII procedentes de la TCR de T7gl0 heteróloga eran superiores (Nt-pHK38; ~16%) a 30 los niveles obtenidos de la TCR de rbcL (Nt-pHK34; ~11%) . Esperábamos que la incorporación de la DB plastídica con una complementariedad del 100% aumentaría aún más los niveles de NPTII . En lugar de ello, vimos que las plantas transformadas con el constructo <que tenía la DB plastídica perfecta (Nt- pHK39) contenían niveles de NPTII 100 veces menores que las plantas que expresaban NPTII procedente de la TCR de E. coli (Nt-pHK38; Figuras 10; Tabla 3) . Este resultado sugiere que, a diferencia de E. coli , un 100% de complementariedad reduce, 5 más que aumentar, la eficacia de la traducción. Ciertamente, ninguno de los genes plastídicos altamente expresados tiene una secuencia DB perfecta (Figura 2A) . Las manchas en gel de ARN mostradas en la Figura 11 indican que las plantas Nt- pHK39 con la DB perfecta contienen ~3 veces menos ARNm neo. 10 Por lo tanto, un factor contribuyente para la reducción de los niveles de NPTII en estas plantas parece ser una velocidad más rápida de renovación del ARNm. Más aún, la NPTII expresada por los derivados PrrnLT7gl0 difiere en los aminoáci-? dos codificados por DB en el extremo N. Por lo tanto, veloci- 15 dades diferenciales de renovación proteica pueden ser parte de la razón de las diferencias en la acumulación de NPTII. El mayor rendimiento de NPTII (23%) fue obtenido con la cassette de DB sintética que contenía Nhel . DISCUSIÓN 20 Este ejemplo que utiliza regiones de control de la traducción de rbcL revela que las secuencias aguas abajo del codon de iniciación de la traducción pueden afectar dramáticamente a la traducción del ARNm. Por lo tanto, las mutaciones silenciosas en la región DB de las proteínas heterólogas pue¬ I den mejorar significativamente la expresión en cloroplastos aumentando la complementariedad del ARNm con la penúltima estructura truncal del ARNr plastídico. Sin embargo, parece que no es deseable una complementariedad perfecta, ya que puede acelerar la renovación del AR?m y reducir la velocidad de 30 traducción. Este hallazgo destaca las diferencias en la maquinaría de traducción de plástidos y de E. coli , en donde una complementariedad perfecta potencia la traducción (Etchegaray e Inouye, 1999; Sprengart y col., 1996) . Es posible, sin embargo, que el cambiar la región de 35 complementariedad en relación a AUG o el dirigir una región relación a AUG o el dirigir una región ligeramente diferente del penúltimo tronco pueden facilitar una eficaz traducción de los ARNm con una DB perfectamente emparejada. Los constructos T7gl0 tienen uno o dos codones de serina AGC relativamente raros (4,7 por 1.000, Figura 12), uno de los cuales está codificado en el sitio Nhel. Este codon está presente en las plantas Nt-pHK38 y Nt-pHK40, que contienen los mayores niveles de NPTII. Se puede esperar una mayor mejora substituyendo el AGC con un codon de serina AGT. 10 EJEMPLO 3 Las TCR clpP, psbB y psbA tienen diferentes características de expresión La acumulación de NPTII fue estudiada en tabaco trans- plastómico portador de los derivados del promotor PrrnLclpP. ft 15 Las plantas PrrnLclpP+DBwt (Nt-pHK32-2F) y PrrnLclpP-DB (Nt- pHK33-2A) acumulan un 1,2% y un 0,2% de NPTII en sus hojas (Figura 10; Tabla 3) . Hemos visto que la sobreexpresión del 5' -UTR de clpP produce un fenotipo mutante manifestado como un color verde claro de las hojas y un crecimiento más lento. 20 Este fenotipo está normalizado en plantas más viejas. Suponemos que la causa primaria de este fenotipo mutante es la falta de proteína ClpP, el producto génico clpP. Este fenotipo mutante está ausente en plantas transformadas con otros 5 'UTR. Por lo tanto, pensamos que el fenotipo mutante es atribuible a la competencia por un factor nuclear específico de clpP. El gen clpP tiene dos intrones. El análisis preliminar de manchas en gel de ARN revela reducidos niveles de ARNm clpP monocistrónico maduro (~30% del tipo salvaje) y acumulación de pre-AR?m clpP que contiene intrón I en las hojas ver- 30 de pálido. La normalización del fenotipo coincide con el aumento de AR?m clpP monocistrónico traducible a niveles de tipo salvaje. La sobreexpresión de 5 'UTR clpP, por lo tanto, puede interferir con el ayustamiento del pre-ARNm clpP. lia acumulación de ?PTII fue también estudiada en tabaco transplastómico portador de los derivados del promotor PrrnLpsbB. Las plantas PrrnL psbB+DBwt (Nt-pHK36-lC) y PrrnL psbB-DB (Nt-pHK37-2D) acumulan un 2,2% y un 2,4% de NPTII en sus hojas (figura 10; Tabla 3) . Así, la secuencia DB sintética en el caso de la TCR psbB substituye eficazmente a la secuencia DB nativa. Por el contrario, puede basarse en un mecanismo alternativo para la iniciación de la traducción. Los constructos del promotor Prrn con el líder psbA fueron obtenidos como se ha descrito. Sin embargo, hemos podido introducir sólo uno de ellos, PrrnLpsbA-DB (+GC) en plástidos de tabaco en la línea Nt-pHK43-lC. Las plantas Nt-pHK43-lC acumulan NPTII en un nivel relativamente bajo (0,6%; Figura 10, Tabla 3) . Es concebible que la falta de éxito en la in-troducción del constructo +DB sea debida al nivel de expre-sión dramáticamente elevado de NPTII, que es tóxica para las plantas . DISCUSIÓN Los niveles obtenidos del promotor PrrnLclpP+DBwt (Nt-pHK32-2F) son relativamente bajos, de sólo un 1,2% de la pro-teína soluble total. Sin embargo, este promotor es deseable para dirigir la expresión de los genes marcadores selecciona-bles, ya que la recuperación de clones transplastómicos es relativamente eficaz cuando el gen neo se expresa a partir de este promotor, tal como se muestra en el Ejemplo 4. La expresión de neo a partir del promotor PrrnLclpP+DBwt no produce un fenotipo mutante en cultivo de tejidos. De este modo, es adecuado para dirigir la expresión de genes marcadores, en la medida en que el gen marcador sea posteriormente eliminado. Parece que la competencia por un factor codificado en el nú-cleo requerido para procesar los intrones clpP da lugar a la reducida expresión observada. Este intrón está ausente en los genes clpP en las monocotiledóneas arroz (Hiratsuka y col . , 1989) y maíz (Maier y col., 1995) . El promotor PrrnLclpP+DBwt puede ser, por lo tanto, usado con ventaja en la transforma- ción de monocotiledóneas. Más aún, el nivel del trans-factor requerido para el procesamiento del intrón clpP ha de ser probablemente expresado en diferentes niveles en dicotiledóneas. Anticipamos, por lo tanto, que la expresión de la TCR b 5 clpP no tendrá consecuencias no deseadas en otras especies de dicotiledóneas. Es también posible que las consecuencias fenotípicas de la expresión de la TCR clpP en plástidos sean una propiedad de la línea del tabaco, N. tabacum cv. Petit Havana, aquí utilizada y que estén ausentes en otras líneas 10 del tabaco. Esto haría de la TCR del gen clpP una herramienta deseable de expresión tanto en monocotiledóneas como en dicotiledóneas . Ambos derivados del líder psbB acumulan ?PTII en niveles comparables (2,2% y 2,4%, respectivamente; Tabla 3). Esta re- ^15 gión reguladora 5' es una buena alternativa al líder rbcL más comúnmente usado cuando se requiere una acumulación de pro- teína en el rango de ~2%. En el pasado, el constructo promotor y líder psbA daba niveles relativamente altos de expresión en hojas (2,5% GUS; 20 Staub y Maliga, 1993) . A pesar de ello, estos constructos no contenían elementos DB psbA. La presente invención describe la generación de promotores quiméricos que son adecuados para obtener expresión de proteínas a alto nivel, al tiempo que elucida el papel regulador desempeñado por las secuencias DB . 125 Prrn es el promotor más potente conocido en plástidos y, en consecuencia, proporciona altos niveles de traducción de ?PTII . Estos elevados niveles de ?PTII pueden ser tóxicos para la planta y, por lo tanto, es difícil obtener líneas transplastómicas con los mayores niveles esperados de ?PTII. 30 Una aproximación alternativa implica la unión operable del líder psbA a un promotor relativamente débil. Esta aproximación puede generar cassettes que sean adecuadas para obtener niveles relativamente altos de acumulación proteica a partir de niveles relativamente bajos de AR?m.

EJEMPLO 4 Acumulación de NPTII en raíces y semillas La regulación post-transcripcional es un importante mecanismo de expresión de genes plastídicos (Rochaix, 1996; > Stem y col., 1997) . Por lo tanto, esperamos que la acumulación de NPTII pueda ser específica de tejido, debido a la regulación de la expresión génica a nivel de la traducción del ARNm. Por lo tanto, se estudió la acumulación de NPTII en las raíces y en las semillas. 10 Se llevó a cabo el estudio de la acumulación de NPTII en raíces con un subgrupo de líneas transplastómicas (Tabla 4) . Se recogieron raíces para la extracción de proteínas de plantas crecidas en medio salino MS líquido (3% de sacarosa) en U cultivos estériles incubados en un agitador para facilitar la 15 aireación. Se extrajo la proteína de las raíces con el protocolo para hojas y se hizo un estudio de la acumulación de NPTII (Figura 13A) . Se ve el mayor nivel de NPTII, un 0,75%, en las raíces de plantas que expresan NPTII por la TCR clpP (constructo PrrnLclpP+DBwt ; pHK32) . El segundo valor más al- 20 to, un 0,3%, fue encontrado en las raíces de plantas transformadas con el plásmido pHK38, que expresa NPTII por la TCR T7gl0 (promotor PrrnLT7glO+DB/Ec) . El nivel de NPTII era aproximadamente el mismo, aproximadamente un 0,1%, en raíces que expresaban la proteína recombinante por la TCR atpB y ^5 rbcL en plantas transformadas con pHK30 y pHK34. Dado que los plástidos de las raíces son más pequeños que los de las hojas, esperábamos menores niveles de acumulación de NPTII en las raíces que en las hojas. Esto fue cierto para todas las raíces estudiadas, excepto para las de las 30 plantas Nt-pHK32. Es interesante el hecho de que la NPTII procedente de la TCR clpP se acumulaba casi en el mismo nivel en las raíces (0,75%, Tabla 4) que en las hojas (aproximadamente un 1%, Tabla 3) . Esto es probablemente atribuible a los altos niveles del TARNm neo en las raíces (Figura 13B) . Dado que el líder clpP incluye el promotor PclpP-53 mínimo (Srira- man y col., 1998a; NAR 26: 4874), especulamos que los niveles relativamente altos de ARNm son debidos a la activación de PclpP-53 en raíces. Los altos niveles de expresión hacen del líder clpP una TCR deseable para la expresión de proteína en las raíces. El líder T7gl0 (pHK38) era el más eficaz en raíces, a partir del cual se acumulaba la mayoría de la NPTII en relación al ARNm (Tabla 4) . Aunque en las plantas Nt-pHK38 el ARNm neo era 7 veces menor que en las plantas Nt-pHK32, los niveles de NPTII eran casi tan altos (aproximadamente un 0,30% en comparación con un 0,75%) como en los plástidos con la TCR clpP (pHK32) . El alto nivel de acumulación de NPTII procedente de la TCR T7gl0 en hojas (pHK38, pHK40, Tabla 3) y en raíces (pHK38; Tabla 4) indica la utilidad general de la región de control de la traducción T7gl0 de fago para la expresión de proteínas en plástidos. También se estudió la acumulación de proteínas en semillas recogidas de las plantas transgénicas (Figura 14) . Los niveles de proteína eran de un 0,05% en plantas transformadas con pHK32 (TCR clpP) y de aproximadamente un 0,01% en plantas transformadas con el plásmido pHK30 (TCR atpB) . No se detectaba nada de NPTII en plantas en las que se introdujo neo en el constructo TCR rbcL (plásmido pHK34) , lo que indica una acumulación diferencial de proteínas, que es dependiente de la elección de la TCR. Tabla 4 Niveles de NPTII y de ARNm neo en raíces de tabaco EJEMPLO 5 La expresión de alto nivel de NPTII facilita la eficaz recuperación de líneas transplastómicas por selección en cuanto a 5 resistencia a la kanamicina El genoma plastídico de plantas superiores es un ADN de doble hebra de 120 kb a 160 kb que está presente en 1.900 a 50.000 copias por célula de hoja (Bendich, 1987) . Para obtener líneas transplastómicas genéticamente estables, cada una 10 de las copias del genoma plastídico (ptDNA) debe ser uniformemente alterada en una planta. Dado que la integración de ADN extraño se produce siempre por recombinación homologa, los vectores de transformación de plástidos contienen segmen-k tos del genoma de plástido para dirigir inserciones a locali- 15 zaciones específicas. Se clonan genes útiles no selecciona- bles al lado de los genes marcadores seleccionables y son entonces introducidos en el genoma del plástido por unión al gen marcador seleccionable (Maliga, 1993) . El ADN transformante es introducido en los plástidos por el procedimiento 20 biolístico (Svab y col., 1990; Svab y Maliga, 1993) o por tratamiento con PEG (Golds y col., 1993; O'Neil y col., 1993) . La eliminación de las copias del genoma de tipo salvaje se produce durante divisiones celulares repetidas en un medio selectivo. El éxito en la transformación depende del ^5 éxito de la amplificación selectiva de las pocas copias del genoma inicialmente transformadas. Por lo tanto, la elección del antibiótico usado para la amplificación selectiva de las copias del genoma transformadas y el mecanismo mediante el cual las células de la planta se protegen de la acción del 30 antibiótico son un parámetro crítico que ha de ser considerado para generar con éxito plantas homoplásmicas. El antibiótico más comúnmente empleado para la selección de líneas transplastómicas es la espectinomicina, un inhibidor de la síntesis de proteínas sobre los ribosomas de los plástidos. Inicialmente, la transformación de plástidos en el tabaco fue llevada a cabo por selección en cuanto a resistencia en base a mutaciones en el ARNr 16S plastídico (Svab y col., 1990). La selección era ineficaz, dando aproximadamente un clon transplastomico por 50 muestras bombardeadas, probablemente debido a egue la mutación basada en el ARNr 16S es recesiva. La recuperación de líneas transplastómicas aumentó ~100 veces por selección en cuanto a un marcador dominante, la resistencia a la espectinomicina basada en la inactivación por la aminoglicósido-3" -adeniltransferasa, codificada en un gen aadA quimérico (Svab y Maliga, 1993) .

Además del tabaco, la selección en cuanto a la resistencia a la espectinomicina (aadA) pudo ser aplicada para recuperar líneas transplastómicas en Arabidopsis y en patata. El gen aadA en plantas confiere resistencia tanto a la espectinomicina como a la estreptomicina. La selección en cuanto a resistencia a la estreptomicina fue utilizada para la transformación plastídica en arroz, una especie resistente a la espectinomicina, después del bombardeo con un gen aadA quimérico. Véase el Ejemplo 8. La necesidad de un gen marcador alternativo para la manipulación de plástidos ha llevado a estudiar la resistencia a la kanamicina como marcador selectivo. Un gen neo quimérico (kan) , codificante de la neomicín-fosfotransferasa, era adecuado para recuperar líneas de tabaco transplastómicas. Sin embargo, la recuperación de líneas transplastómicas era relativamente ineficaz, dando sólo una línea transplastómica en ~25 muestras de hojas bombardeadas. Más aún, por cada suceso de transformación de plástidos, se obtuvieron ~25 a 50 líneas resistentes a la kanamicina en las que la integración del constructo neo plastídico en el genoma nuclear dio lugar a resistencia a la kanamicina (Carrer y col., 1993) . Informamos aquí de cjue la eficacia de la recuperación de clones trans-plastómicos mejora significativamente cuando se transforman cloroplastos de tabaco con un nuevo gen neo expresado a partir de un promotor con la región de control de la traducción atpB y clpP. El número de sucesos de transformación nuclear se reduce usando las cassettes de la presente invención. Es- > tos perfeccionamientos hacen del nuevo gen neo una herramienta práctica para las manipulaciones en el genoma del plástido. DISCUSIÓN Los genes neo quiméricos descritos en los Ejemplos 1-4 10 fueron introducidos en plástidos por selección en cuanto al gen de resistencia a la espectinomicina (aadA) ligada, ya que su adecuación para seleccionar directamente líneas transplastómicas era desconocida. Las líneas transplastómicas enumera- ^ das en la Tabla 3 fueron entonces estudiadas en cuanto a re- T.5 sistencia a la kanamicina por su capacidad para proliferar en un medio que contenía 50 mg/l de kanamicina. El medio RMOP usado para el estudio induce la formación de callos verdes y la regeneración de los retoños en ausencia de kanamicina. Los procedimientos del cultivo de tejidos utilizados para este 20 ejemplo están descritos en las referencias Carrer y col., 1993, y Carrer y Maliga, 1995. En el medio selectivo de kanamicina, sólo se forman callos blancos escasos a partir de secciones de hojas de tipo salvaje. La formación de callos verdes y retoños a partir de IC5 secciones de hojas de las plantas transformadas con plásmidos pHK de la Tabla 3, indica que la acumulación de NPTII confiere resistencia a la kanamicina. Nos pusimos a estudiar si los clones transplastómicos pueden ser directamente seleccionados por la resistencia a la kanamicina después del bombardeo con 30 los plásmidos pHK30 y pHK32. Los resultados están resumidos en la Tabla 5. El bombardeo de 25 hojas de tabaco con el plásmido pHK30 dio 45 líneas resistentes a kanamicina en un medio que contenía 50 mg/l de kanamicina. Se espera que las líneas neo transplastómicas sean resistentes a niveles mucho mayores, de 500 mg/l de kanamicina (Carrer y col., 1993) . Además, en el plásmido pHK30, el gen neo está físicamente unido a un gen de resistencia a la espectinomicina (aadA) . La resistencia a la i espectinomicina se manifiesta como la resistencia a la kanamicina: las secciones sensibles de las hojas forman callos blancos y ningún retoño, mientras que las secciones resistentes de las hojas forman callos verdes y retoños en un medio selectivo (500 mg/l) , medio RMOP. Suponemos, por lo tanto, que todas las líneas transplastómicas deben ser resistentes a 500 mg/l de kanamicina y a 500 mg/l de espectinomicina (Carrer y Maliga, 1995) . Al aplicar esta prueba, vimos que 22 de las 45 líneas cumplen estos criterios. La digestión del ADN plastídico con la enzima de restricción EcoRI y el sondaje con la región de direccionalización hacia el plástido deben detectar un fragmento de 3,1 kb en la línea de tipo salvaje y un fragmento de 4,2 kb y otro de 1,2 kb en las líneas transplastómicas (Figura 15A) . El análisis de manchas en gel de ADN de siete de las líneas resistentes a kanamicina- espectinomicina confirmó la integración de ambos transgenes en el genoma del plástido (Figura 15B) . Por lo tanto, suponemos que las 22 líneas kanamicina-espectinomicina son todas transplastómicas (Tabla 5) . El bombardeo de 30 hojas de tabaco con el plásmido pHK32 dio 28 líneas resistentes a la kanamicina en un medio que contenía 50 mg/l de kanamicina. Hemos identificado 11 líneas doblemente resistentes estudiando éstas en un medio que contenía 500 mg/l de kanamicina y 500 mg/l de espectinomicina. Las seis estudiadas eran todas transplastómicas por análisis de manchas en gel de ADN (Figura 15B) ; por lo tanto, pensamos que las once son todas transplastómicas (Tabla 5) . TABLA 5 SELECCIÓN DE CLONES DE TABACO TRANSPLASTÓMICOS POR LA RESISTENCIA A LA KANAMICINA (aCarrer y col., 1993) . DISCUSIÓN La eficacia de la transformación de plástidos debería ser comparable si dirigimos la misma región del genoma plastídico para inserción, utilizamos secuencias direccionaliza- doras de tamaño similar y el mismo método de introducción del ADN. Por lo tanto, las menores eficacias de transformación obtenidas por selección en cuanto a resistencia a la kanamicina con los viejos genes neo quiméricos era probablemente debida a la falta de recuperación de clones transplastómicos por selección. Hemos visto que la transformación con los genes neo expresados a partir de los promotores PrrnLatpB+DBwt y PrrnLclpP+DBwt es tan eficiente como con el gen aadA. Éste es un avance técnico significativo y facilitará la transformación de plástidos en cultivos en los que los tejidos regenerables contengan plástidos no verdes. Los objetivos más importantes son los plástidos no verdes de los cultivos de ce- reales. La selección por la kanamicina es ampliamente utilizada para obtener líneas transgénicas tras la transformación con genes neo quiméricos en dicotiledóneas. Sin embargo, la kanamicina es un agente selectivo no deseable en monocotile-doñeas, tales como los cultivos áe tejidos de cereales. Sin embargo, NPTII también inactiva la paromomicina, lo que puede ser usado para recuperar transformantes de genes nucleares con una eficacia extremadamente alta en cereales. Véase, por ejemplo, la solicitud PCT WO99/05296. EJEMPLO 6 La expresión del gen bar bacteriano en plástidos de tabaco confiere resistencia al herbicida fosfinotricina El bialafós, un herbicida no selectivo, es un tripéptido compuesto por dos residuos de L-alanina y un análogo del ácido glutámico conocido como fosfinotricina ("PPT"). Mientras que la PPT es un inhibidor de la glutamina sintetasa tanto en plantas como en bacterias, el tripéptido intacto tiene poco o ningún efecto inhibitorio in vitro. El bialafós es tóxico pa-ra bacterias y plantas, ya que las peptidasas eliminan los residuos de alanina y liberan PPT activa. El bialafós es producido por Streptomyces hygroscopicus . La bacteria es protegida de la toxicidad de la fosfinotricina por la fosfinotricina acetiltransferasa ("PAT"), el producto del gen bar. Esta enzima acetila la fosfinotricina o desmetilfosfinotricina (Thompson y col., 1987) . Se han obtenido cultivos resistentes a la PPT expresando el gen bar de S. hygroscopicus en el núcleo de la planta. Se obtuvieron líneas resistentes a herbicidas por selección directa en cuanto a la resistencia a la PPT en cultivo después de la introducción de ADN mediada por Agrobacterium tumefaciens en tabaco, patata, Brassica napus y Brassica olerácea (De Block y col., 1987, 1989) . La introducción biolística de ADN de genes bar cguiméricos ha sido empleada para obtener maíz (Spencer y col., 1990), arroz (Cao y col., 1992) y Arabidopsis thaliana (Sawaskaki y col., 1994) resistentes a PPT. La construcción de plantas de tabaco transplastómicas, en las que la resistencia a PPT se basa en la expresión de bar de S. hygroscopicus en plástidos es descrita en el presente ejemplo. Los vectores utilizados para expresar el gen bar contienen una región reguladora 5' quimérica ejemplar, según se ha expuesto en los ejemplos previos. El material y los métodos siguientes facilitan la práctica de este aspecto de la presente invención. " 5 Construcción de gen bar plastídico Se generó un fragmento de gen bar Ncol/Xbal por amplificación por PCR usando el plásmido pDM302 (Cao y col., 1992) con los siguientes cebadores: Pl, 5 ' -AAACCATGGCACCACAAACAGAGAGCCCAGAACGACG-CCC-3 ' 10 P2 , 5 ' - AAATCTAGATCATCAGATCTCGGTGACG-3 ' Se hizo que los extremos del fragmento PCR quedaran romos mediante tratamiento con el fragmento Klenow de la ADN polimerasa I. Se ligó entonces el fragmento en el sitio EcoRV de pBluescript II KS+ (Stratagene, la Jolla, CA) para crear 15 el plásmido pJEK3. El análisis de secuencia del ADN del plásmido pJEK3 reveló que el sitio Xbal que pretendíamos crear a través de la amplificación por PCR de pDM302 está ausente. Véase la Figura 19. El gen bar tiene los dos codones de finalización de la traducción, seguidos por secuencias vectoras. 20 Los últimos 20 pb de pJEK3 son: CCCGTCACCGAGATCTGATGAtcgaattcctgcagcccgggggatccactagttctaga. Las secuencias bar están en letras mayúsculas (codones de parada subrayados) , las secuencias vectoras están en letras minúsculas (sitio Xbal subrayado) . Dado que hay un sitio Xbal P5 presente en el vector a 40 pb del sitio Xbal pretendido, no fue necesario reparar este error. El fragmento Ncol -Xbal del plásmido pJEK3 fue ligado en el plásmido pGS104 digerido con Ncol-Xbal (Serino y Maliga, 1997) para generar el plásmido pJEK6. El plásmido pGS104 lleva una cassette de expresión 30 PrrnTrbcL en un vector de transformación de plástido pPRVlllB. En la Figura 16A se muestra un mapa de la región de direccionalización hacia plástido del plásmido pJEK6. Transformación de plástidos y regeneración de plantas Se hicieron crecer plantas de tabaco (Nicotiana tabacum cv. Petit Havana) asépticamente en medio solidificado con agar que contenía sales MS (Murashige y Skoog, 1962) y sacarosa (30 g/1) - Se pusieron las hojas con el lado abaxial hacia arriba en medio RMOP para el bombardeo. El medio RMOP consiste en sales MS, N6-bencil -adenina (1 mg/ml) , ácido 1-naftalenacético (0,1 mg/l), timina (1 mg/l), inositol (100 mg/l), agar (6 g/1), pH 5,8, y sacarosa (30 g/1) . Se introdujo el ADN en cloroplastos sobre la superficie de partículas de tungsteno de 1 µm usando la pistola Biolística PDSlOOOHe de DuPont (Maliga 1995) . Se seleccionaron clones resistentes a espectinomicina en medio RMOP que contenía 500 µg/ml de diclorhidrato de espectinomicina. Se regeneraron los retoños resistentes en el mismo medio selectivo y se enraizaron en medio agar MS (Svab y Maliga, 1993) . Las líneas independien-temente transformadas son designadas por el plásmido transformante (pJEK6) y un número de serie, por ejemplo pJEK6-2, pJEK6-5. Las plantas regeneradas a partir de la misma línea transformada se distinguen mediante letras, por ejemplo pJEK6-2A, pJEK6-2B. Análisis "Southern blot" Se aisló el ADN celular total de plantas resistentes a la espectinomicina de tipo salvaje y transgénicas con CTAB (Saghai-Maroof y col., 1984) . Se digirió el ADN con las endonucleasas de restricción Smal y Bglll, se separó en un gel de agarosa al 0,7% y se depositó en una membrana de nilón Hy-bond-N (Amersham, Ariington Heights, IL) por un secante de presión. Se híbrido la membrana durante la noche con un fragmento Apal/BamHI marcado con ( -32P)dCTP usando un Kit de Perlas de Mareaje de ADN dCTP (Pharmacia Inc., Piscataway, NJ) . Se lavó la membrana 2 veces con SSPE 0,1X, SDS 0,2X a 55°C durante 30 minutos. Se expuso la película a la membrana durante 30 minutos a temperatura ambiente. Ensayo PAT Se llevó a cabo el ensayo PAT según describen Spencer y col. (1990). Se homogeneizó tejido de hojas (100 mg) de taba-co de tipo salvaje (wt) , tabaco Nt-pDM307-10 transgénico (una línea transformada con el gen bar nuclear en el plásmido pDM307; Cao y col., 1992) y transformantes de gen bar plastídico en 1 volumen de tampón de extracción (Na2HP04 10 mM, NaCl 10 mM) . Se recogió el sobrenadante tras centrifugar en una microcentrífuga durante 10 Se añadió proteína (25 mg) a 1 mg/ml de PPT y acetil -CoA marcada con 14C. Se incubó la reacción a 37 °C durante 30 minutos y se depositó toda la reacción sobre una placa de TLC. Se llevó a cabo una cromatografía ascendente en una mezcla 3:2 de 1-propanol y NH4OH. Se expuso la película a la placa de TLC (cromatografía en capa fina) durante la noche a temperatura ambiente.

Aplicación del herbicida Se pulverizaron plantas de tipo salvaje y transgénicas con 5 ml de una solución al 2% de Liberty (AgrEvo, Wilmington, DE) con un pulverizador de aerosol. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Primeramente, se convirtió el gen bar bacteriano en un gen plastídico por clonación de la región codificante bar en una cassette de expresión en plástidos. Esta cassette consiste en un promotor de operón de ARNr plastídico sometido a ingeniería (Prrn) y TrbcL y el 3 'UTR del gen rbcL plastídico para la estabilización del ARNm. Se clonó entonces el gen bar plastídico en el vector de transformación de plástidos para obtener el plásmido pJEK6 y se introdujo en plástidos sobre la superficie de partículas de tungsteno microscópicas. El gen bar se integró en el genoma plastídico por dos sucesos de recombinación homologa a través de la secuencia dirigida a plástido, tal como se muestra en la Figura 16A. La selección para el gen aadA (resistencia a la espectinomicina) ligado en medio que contenía espectinomicina dio eventualmente lugar a células que llevaban una población de genoma plastídico uni-formemente transformado, con las cuales se regeneraron entonces plantas. La integración de bar y aadA fue verificada por análisis de manchas en gel de ADN. Se digirió el ADN celular total de plantas de tipo salvaje y transplastómicas con las enzimas de restricción Smal y Bglll y se sondó con el fragmento dirigido a plástido Apal-BamHI de 2,9 kb de N. tabacum (Figura 16B) . Los dos fragmentos esperados para las plantas transgénicas, de 3,3 kb y 1,9 kb, estaban presentes en cada una de las muestras transplastómicas mostradas en la Figura 16B. La ausencia del fragmento de tipo salvaje de 2,9 kb indicó que, hacia el momento en que estas plantas se habían regenerado, las copias de genoma plastídico de tipo salvaje se habían diluido en el medio selectivo. Para determinar si el gen bar plastídico había sido expresado, se estudiaron extractos de hojas en cuanto a la actividad fosfinotricín-acetiltransferasa (PAT) . La conversión de PPT en acetil-PPT indicó actividad PAT en cada una de las líneas transplastómicas estudiadas. Los datos de la Figura 17 son mostrados para las líneas transplastómicas ?t-pJEK6-2D, ?t-pJEK6-5A y ?t-pJEK6-13B . Es interesante el hecho de que la actividad PAT era significativamente mayor (>>10 veces) cuando se expresaba bar en los plástidos, en comparación con el gen bar expresado a partir del promotor 35S del virus del mo-saico de la coliflor en el núcleo de la planta ?t-pDM307-10.

La expresión de PAT confiere resistencia a PPT en cultivo de tejidos y en el invernadero. Cuando se hacen crecer secciones de hojas de tipo salvaje en cultivo de tejidos, 10 mg/l de PPT bloquean por completo la proliferación de los ca-líos. Esta misma concentración de PPT es adecuada para la selección de transformantes nucleares tras el bombardeo con el constructo bar nuclear en el plásmido pDM307. Las secciones de hojas en plantas que expresan bar en plástidos muestran resistencia en presencia de hasta 100 mg/l de PPT en el medio de cultivo. Hemos estudiado la resistencia a la PPT en el invernadero pulverizando las plantas de tipo salvaje y transplastómicas con Liberty, una formulación comercial de PPT, a la dosis de campo recomendada del 2%. Tal como se muestra en la Figura 18A, 13 días después del tratamiento las plantas de tipo salvaje habían muerto, mientras que las plantas transgénicas habían prosperado. Desde entonces, las plantas pulverizadas han florecido y dado semillas. La Figura 18B muestra la herencia materna de la resistencia a la PPT. La falta de transmisión de plástidos por el polen da como resultado una falta de resistencia al herbicida en la progenie polinizada con el polen transgénico. El gen bar bacteriano tiene un alto contenido en G+C (68,3%; N° de Acceso Genbank X17220) , mien-tras que los genes plastídicos tienen un contenido relativa-mente alto en A+T; por ejemplo, el contenido en G+C de los genes psbA y rbcL altamente expresados es del 42,7% y del 43,7%, respectivamente (N° de Acceso Genbank Z00044) . Las diferencias en el contenido en G+C también quedan reflejadas en las tendencias de utilización de codones. Es interesante que los datos aquí presentados indican que la expresión de bar procedente de S. hygroscopicus es suficientemente alta como para conferir resistencia a los niveles de campo del herbicida no selectivo PPT. Más aún, los niveles de enzima PAT obtenidos en las líneas transplastómicas son significativamente mayores que los observados en el transformante nuclear. Por lo tanto, se puede obtener un mayor perfeccionamiento de los niveles de expresión optimizando la utilización de codones para plástidos según se indica en el Ejemplo 7. Las ventajas de incorporar bar en el genoma del plástido son la posesión de resistencia al herbicida debido a la falta de transmisión por polen en la mayor parte de los cultivos. Más aún, la falta de segregación genética simplificaría el retrocruce para la introducción de resistencia al herbicida en líneas reproductoras adicionales.

EJEMPLO 7 Un gen bar sintético mejora el contenido y potencia la expresión en plástidos Se introdujo el gen bar bacteriano en el genoma plastídico del tabaco por transformación con el plásmido pJEK6, según se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 6. En el plásmido pJEK6, bar se expresa en una cassette consistente en el promotor Prrn(L) rbcL (S) y el finalizador de la transcripción TrbcL. Este plásmido confería resistencia a PPT a las plantas crecidas en presencia de PPT en el medio de cultivo de tejidos, pero la selección directa de líneas transformadas no fue posible. Aunque los niveles de PAT en las hojas homoplastómicas era alto, la cantidad de PAT producida por las pocas co-pias de Jbar de pJEK6 durante la etapa temprana de la trans-formación plastídica era probablemente insuficiente para proteger a toda la célula. Para mejorar la expresión de bar en los plástidos, se creó un gen sintético. Se modificó la utilización de codones para imitar la del gen plastídico fotosintético medio del ta-baco. El cambio en la utilización de codones dio lugar a un menor contenido en GC característico de los genes plastídicos de plantas superiores. Para ayudar a la clonación, se eliminaron las secuencias de reconocimiento de las enzimas de restricción y se añadieron según fuera necesario . La frecuencia de utilización de codones en bacterias refleja la abundancia relativa de ARNt : el uso frecuente de codones para ARNt raros puede reducir significativamente la eficacia de la traducción. Esperábamos que la utilización diferencial de codones en plástidos y bacterias redujera o evitara la expresión del gen sintético en bacterias, reduciendo así el riesgo de transferencia génica horizontal a microorganismos. También esperábamos que la mejor expresión de bar en nuestras nuevas cassettes de promotores permitiera la selección directa de transformantes plastídicos en medio egue contenía PPT.

Materiales y métodos para el Ejemplo 7 Las comparaciones de codones de los genes plastídicos fotosintéticos (rbcL, psaA, psaB, psaC, psbA, psbB, psbC, psbD, psbE, psbF) fueron recopiladas usando GCG (Genetics Computer Group, Madison, Wl) . Se introdujeron entonces mutaciones de ADN en el gen bar bacteriano, haciendo que su utilización de codones fuera más similar a los genes plastídicos, eliminando al mismo tiempo varios sitios de enzimas de restricción que podrían interferir con la clonación. Véase la Figura 28. El gen bar sintético ( s-bar) fue obtenido por montaje en una sola etapa de todo el gen s-bar a partir de 28 oligonucleótidos (un cebador de 44 nt, un cebador de 30 nt y veintiséis cebadores de 40 nt) usando PCR (Stemmer y col., 1995) . La hebra superior y la inferior de los cebadores se solapan entre sí en 20 nucleótidos. Se añadieron sitios Ncol y Nhel en el extremo 5' y se añadió un sitio Xbal en el extremo 3' a través de amplificación por PCR. Para obtener el gen s-bar completo, se amplificó una pequeña alícuota del producto del montaje PCR usando los cebadores ÍA y 14B. Los nucleótidos no cambiados están en mayúscula y los nucleótidos alterados están en minúscula en los cebadores enumerados a continuación. Cebador ÍA ccATGgctAGCCCAGAAaGAaGaCCGGCCGAtATtaGaCG Cebador IB GCATaTCaGCtTCtGTaGCACGtCtaATaTCGGCCGGtCt Cebador 2A TGCtACaGAaGCtGAtATGCCaGCaGTtTGtACaATCGTt Cebador 2B CTTGTtTCtATaTAaTGGTTaACGATtGTaCAaACtGCtG Cebador 3 AACCAtTAtATaGAaACAAGtACaGTaAACTTtaGaACtG Cebador 3B tTCtTGaGGTTCtTGaGGtTCaGTtCtaAAGTTtACtGTa Cebador 4A AaCCtCAaGAACCtCAaGAaTGGACtGAtGAtCTaGTCCG Cebador 4B AaGGATAGCGCTCtCGtAGACGGACtAGaTCaTCaGTCC Cebador 5A TCTaCGaGAGCGCTATCCtTGGCTtGTaGCaGAaGTtGAC Cebador 5B GCGATaCCaGCtACtTCaCCGTCaACtTCtGCtACaAGCC Cebador 6A GGtGAaGTaGCtGGtATCGCaTAtGCGGGCCCtTGGAAGG Cebador 6B CCAaTCaTAtGCaTTtCtTGCCTTCCAaGGGCCCGCaTAt Cebador 7A CAaGaAAtGCaTAtGAtTGGACaGCtGAaTCaACtGTtTA Cebador 7B GtTGaTGaCGTGGtGAaACGTAaACaGTtGAtTCaGCtGT Cebador 8A CGTtTCaCCaCGtCAtCAaCGtACaGGACTtGGtTCtACt Cebador 8B TTCAGtAGaTGtGTaTAtAGaGTaGAaCCaAGtCCtGTaC Cebador 9A CTaTAtACaCAtCTaCTGAAaTCttTGGAGGCACAaGGtT Cebador 9B aACAGCtACaACaCTCTTaAAaCCtTGTGCCTCCAaaGAt Cebador 10A TtAAGAGtGTtGTaGCTGTtATaGGatTGCCtAAtGAtCC Cebador 10B CtTCaTGCATGCGtACaCtTGGaTCaTTaGGCAatCCtAT Cebador 11A aAGtGTaCGCATGCAtGAaGCtCTaGGATATGCtCCaaGa Cebador 11B CCtGCaGCCCtCAaCATaCCtCttGGaGCATATCCtAGaG Cebador 12A GGtATGtTGaGGGCtGCaGGtTTCAAaCAtGGaAACTGGC Cebador 12B tTGCCAaAAACCtACaTCATGCCAGTTtCCaTGtTTGAAa Cebador 13A ATGAtGTaGGTTTtTGGCAaCTtGAtTTCAGtCTaCCaGT Cebador 13B GtAGaACtGGACGaGGaGGTACtGGtAGaCTGAAaTCaAG Cebador 14A ACCtCCtCGTCCaGTtCTaCCaGTtACtGAGATCTGATGA Cebador 14B tctagaTCATCAGATCTCaGTaACtG Se clonó entonces la región codificante de s-bar amplificada en un plásmido pBSIIKS+ (Stratagene, La Jolla, CA) y se secuenció (Figura 20A) . Se clonó el gen s-bar en cassettes con los promotores quiméricos PrrnLatpB+DBwt , PrrnLrbcL+DBwt y PrrnLT7gl0+DB/Ec . La Tabla 6 muestra los plásmidos usados en la práctica de este ejemplo.

Tabla 6. Plásmidos con genes bar Para disponer de un sitio de clonación adecuado en el extremo 3' del gen bacteriano, se substituyó el fragmento Ea- gl/BglII de s-bar con el fragmento afín de la región codificante de bar bacteriano. Dicho gen bar bacteriano es incorporado en el plásmido pK012 (Figura 21) . En el plásmido pK012, los 22 primeros nucleótidos de la región codificante de bar- bacteriano están substituidos con nucleótidos del s-bar. RESULTADOS El gen bar bacteriano sometido a ingeniería en pJEK6 se expresa tanto en E. coli como en plantas, tal como se muestra en el ejemplo anterior. Nos interesaba estudiar si la modificación del codon afecta a la expresión del gen s-bar en plástidos y en E. coli . En E. coli , se determinó la expresión de s-bar midiendo la actividad PAT. Se prepararon extractos a partir de bacterias portadoras de plásmidos pK03 y pK08 que expresaban s-bar a partir de los promotores PrrnLatpB+DBwt y PrrnLrbcL+DBwt, respectivamente. El ensayo radioactivo no detectó ninguna actividad, aunque los extractos de bacterias transformadas con los plásmidos pJEK6 y pK012 que llevaban los genes bar bacterianos dieron señales fuertes (Figura 22A) . En el plásmido pK012, los 22 primeros nucleótidos de la región codificante de bar bacteriano están substituidos con los nucleótidos del s-bar. Por lo tanto, la falta de expresión del s-bar en E. coli no es debida a cambios dentro de los 22 primeros nucleótidos. También se introdujo el s-bar en plástidos por transformación con el vector pK03. Se prepararon extractos a partir de plantas de tabaco transformadas con pK03 y pJEK6, que llevan los genes s-bar y bar, respectivamente. Los extractos de ambos tipos de plantas contenían actividad PAT significativa (Figura 22B) . Por lo tanto, el bar sintético se expresa en plástidos, pero no en E. coli . El cambio en la utilización de codones del gen bar abrogó la expresión del gen en E. coli . Esto es probablemente de-bido a la introducción de los codones raros de arginina AGA y AGG en la región codificante de s-bar. La frecuencia de tripletes por mil nucleótidos para AGA y AGG es la más baja en E. coli , lo que refleja una baja abundancia del ARNt requerido para la traducción de estos codones. Se ha visto que el ARNtArg (AGG/AGA) menor ¿e ]_a arginina es un factor limitante en la expresión bacteriana de varios genes de mamíferos. La coexpresión del gen ArgU (dnaY) , que codifica para el ARN-tArg (AGG/AGA) ¿u_0 como resultado un alto nivel de producción de la proteína diana (Makrides, 1996) . El gen bar bacteriano tiene 14 codones de arginina, ninguno de los cuales son los codones raros AGA/AGG. El gen s-bar tiene cinco de ellos, tres de los cuales se localizan en los primeros 25 codones. Por lo tanto, la explicación probable para la falta de expresión de s-bar en E. coli es la introducción de los codones raros de arginina AGA y AGG en la región codificante de s-bar. Hay proteínas que resultan tóxicas para E. coli , pero cuya expresión es deseable en plástidos, para los cuales no es tóxica. El procesamiento por ingeniería de estas proteínas en E. coli plantea un problema, ya que los promotores plastídicos PEP comúnmente utilizados son activos en E. coli , por lo que el gen será transcrito y el ARNm traducido. La incorporación de codones menores en la región codificante evitará la traducción de estas proteínas en E. coli . Es particularmente útil en este sentido la conversión de los codones de arginina a AGA/AGG. Si no hay presencia de arginina en la región ?-terminal, se puede diseñar una fusión ?-terminal que contenga múltiples codones AGA/AGG para prevenir la traduc-ción del AR?m. Las plantas que se hallan en condiciones de campo se asocian a microbios que viven en el suelo, sobre las hojas y en el interior de las plantas. El flujo de genes de los plás-tidos a estos microorganismos no ha sido mostrado. Sin embar-go, representaría una medida añadida de seguridad incorporar codones en genes de plástidos que sean raros en los microorganismos objeto, pero que se traduzcan eficazmente en plástidos. La incorporación de codones AGA/AGG a los genes marcadores selectivos y a los genes de interés evitarán la transfe-rencia de genes de las plantas a los microbios, que carecen de la capacidad para traducir eficazmente los codones AGA/AGG. En el caso de asociaciones específicas planta-microbio, en base a las diferencias en las preferencias de utilización de codones, se podrían diseñar genes que se expresaran en plástidos, pero no en microbios. Los intentos por seleccionar directamente clones trans-plastómicos tras el bombardeo con los constructos s-bar han fallado hasta la fecha. La región codificante s-bar en la Figura 20A contiene codones frecuentes y raros en proporciones características de los genes plastídicos. Es posible que codones relativamente raros en un contexto específico en una fase crítica eviten la recuperación de los sucesos de transformación de plástidos. Se conocen ejemplos para la traducción específica de tejidos de AR?m con dependencia de la dis- ponibilidad de ARNt (Zhou y col., 1999). Por lo tanto, diseñamos un segundo gen bar sintético, S2-bar, que contenía sólo codones frecuentes (Figura 20B) . La transformación de plástidos con el s2-bar permitirá la selección directa de sucesos ^5 de transformación de plástidos por resistencia a la PPT. EJEMPLO 8 MARCADOR FLUORESCENTE DE LA RESISTENCIA A ANTIBIÓTICOS PARA LA FÁCIL IDENTIFICACIÓN DE CLONES TRANSPLASTÓMICOS EN TABACO Y ARROZ 10 La transformación de plástidos en plantas superiores se consigue a través de un procedimiento gradual, durante el cual se alteran uniformemente las 300-10.000 copias de genoma plastídico. Los genes de resistencia a antibióticos incorporados en el genoma del plástido facilitan el mantenimiento de los transplastomas durante este procedimiento. Dado el alto número de copias del genoma del plástido en una célula, la transformación da lugar inevitablemente a tejidos quiméricos, en los cuales las células transplastómicas necesitan ser identificadas y regeneradas en plantas. En el tejido quiméri- 20 co, la resistencia a antibióticos no es autónoma de la célula: los sectores transplastómicos y de tipo salvaje son ambos verdes, debido al enmascaramiento fenotípico por las células transgénicas. En el presente ejemplo, se facilitan nuevos genes codificantes de FLARE-S, una enzima fluorescente de re-K5 sistencia a antibióticos que confiere resistencia a la espectinomicina y a la estreptomicina, cuyos nuevos genes fueron obtenidos por fusión a nivel de traducción de la aminoglicósido 3" -adenililtransferasa [AAD] con la proteína fluorescente verde de Aequorea victoria (GFP) . FLARE-S facilita la dis- 30 tinción de sectores transplastómicos y de tipo salvaje en el tejido quimérico, reduciendo así significativamente el tiempo y el esfuerzo necesarios para obtener líneas transplastómicas genéticamente estables. La utilidad de FLARE-S para seleccionar sucesos de transformación de plástidos quedó demostrada rastreando la segregación de los plástidos transplastómicos y de tipo salvaje en plantas de tabaco y de arroz después de la transformación con vectores plastídicos de FLARE-S y de la selección en cuanto a resistencia a espectinomicina y estreptomicina, respectivamente. Los vectores de transformación de plástidos contienen un gen marcador seleccionable y gen (es) pasaj ero (s) flanqueados por secuencias homologas dirigibles a plástidos (Zoubenko y col., 1994) y son introducidos en plástidos por introducción biolística de ADN (Svab y col., 1990; Svab y Maliga, 1993) o tratamiento con PEG (Golds y col., 1993; Koop y col., 1996; O'Neill y col., 1993). Los genes marcadores seleccionables pueden codificar para la resistencia a espectinomicina, estreptomicina o kanamicina. La resistencia a los fármacos es conferida por la expresión de los genes quiméricos aadA (Svab y Maliga, 1993) y neo (kan) (Carrer y col., 1993) en plástidos. Estos fármacos inhiben la acumulación de clorofila y la formación de retoños en el medio de regeneración de plantas . Las líneas transplastómicas son identificadas por la capaci-dad para formar retoños verdes en secciones de hojas de tipo salvaje blanqueadas. La obtención de una línea transplastómi-ca genéticamente estable implica el cultivo de las células en un medio selectivo, durante lo cual las células de dividen al menos 16 a 17 veces (Molí y col., 1990) . Durante este tiempo, los plástidos de tipo salvaje y los transformados y las copias del genoma del plástido se separan gradualmente. El prolongado período de separación de genoma y organelas da plantas quiméricas consistentes en sectores de células de tipo salvaje y transgénicas (Maliga, 1993) . En el tejido quiméri-co, la resistencia a antibióticos conferida por aadA o neo no es autónoma de las células : los sectores transplastómicos y de tipo salvaje son ambos verdes, debido a enmascaramiento fenotípico por el tejido transgénico. El quimerismo necesita un segundo ciclo de regeneración de las plantas en un medio selectivo. En ausencia de un marcador visual, éste es un procedimiento ineficaz, que implica selección de antibiótico e identificación de plantas transplastómicas por PCR o sondaje Southern. La viabilidad de la identificación visual de los i sectores transformados reduce en gran medida el esfuerzo requerido para obtener clones homoplastómicos. La proteína fluorescente verde de Aeguorea victoria (GFP) es un marcador visual, que permite la imagen directa del producto génico fluorescente en células vivas sin necesi- 10 dad de procedimientos de tinción histoquímica prolongados y letales. Su cromóforo se forma autocatalíticamente en presencia de oxígeno y da fluorescencia verde cuando absorbe luz azul o UV (Prasher y col., 1992; Chalfie y col., 1994; Heim y fc col., 1994) (revisado en la ref. Prasher, 1995; Cubitt y 15 col., 1995; Misteli y Spector, 1997). El gen gfp fue modificado en cuanto a expresión en el núcleo de la planta eliminando un intrón críptico, introduciendo mutaciones para aumentar el brillo y para mejorar la solubilidad de la GFP (Pang y col., 1996; Reichel y col., 1996; Rouwendal y col., 20 1997; Haseloff y col., 1997; Davis y Vierstra, 1998). Se utilizó GFP para seguir a la proteína en su movimiento hacia el núcleo, el citoplasma y los plástidos desde los genes nucleares (Sheen y col., 1995; Chiu y col., 1996; Kshler y col., 1997) y seguir el movimiento de virus en plantas (Baulcombe y 5 col., 1995; Epel y col., 1996). GFP ha sido también usada para detectar la expresión génica transitoria en plástidos (Hibberd y col., 1998). Se describe aquí la expresión de GFP por incorporación directa del gen gfp en el genoma plastídico. La incorporación 30 de un marcador visual, la proteína GFP, en los vectores de transformación de plástidos de la presente invención facilita la distinción de mutantes espontáneos resistentes a antibióticos y transformantes plastídicos (Svab y col., 1990) . Más aún, los sectores transplastómicos en el tejido quimérico pueden ser identificados visualmente, reduciendo significativamente el tiempo y el esfuerzo necesarios para obtener líneas transplastómicas genéticamente estables. La utilidad del marcador GFP descrito aquí es aún mayor gracias a su fusión con la enzima aminoglicósido 3" -adenililtransferasa [AAD], egue confiere resistencia a espectinomicina y estreptomicina en plantas. La utilización de un gen marcador codificante de una proteína bifuncional, FLARE-S ( "fluorescent antibiotic resistance enzyme, spectinomyein and streptomyein) , evita la separación física de los dos genes y simplifica el procedimiento de ingeniería. Más aún, los genes de resistencia a antibióticos fluorescentes permiten la extensión de la transformación de plástidos a cultivos de cereales, en los cuales la transformación de plástidos no se asocia a un fenotipo de cultivo de tejidos fácilmente identificable. Se dan los siguientes protocolos para facilitar la práctica del presente ejemplo. Construcción de vectores plastxdicos en tabaco. El gen aadAlßgfp codifica para la proteína de fusión FLARE16-S y puede ser escindido como fragmento Nhel-Xbal del plásmido pMSK51, un derivado pBSKSII+ (N° de Acceso Genbank no asignado todavía) . Se obtuvo la proteína de fusión por clonación de gfp (procedente del plásmido pCD3-326F) aguas abajo de aadA (en el plásmido pMSK38) ) , digestión del plásmido resultante con BstXl (en el extremo 3' de la región codificante aadA) y Ncol (incluyendo el codon de iniciación de la traducción de gfp) y unión de las dos regiones codificantes por un adaptador compatible con BstXI-NcoI. El adaptador fue obtenido recociendo los oligonucleótidos 5'-GTGGGCAAAGAACTTGTTGAAGGAAAAT-TGGAGCTAGTAGAAGGTCTTAAAGTCGC-3 ' y 5 ' -CATGGCGACTTTAAGACCT- TCTACTAGCTCCAATTTTCCTTCAACAAGTTCTTTGCCCACTACC-3' . El adaptador conecta AAD y GFP con un péptido de 16 residuos de aminoácido (ELVEGKLELVEGLKVA) .

El gen aadA de ingeniería (Chinault y col., 1986) en el plásmido pMSK38 (derivado pBSIIKS+) tiene sitios Ncol y Nhel en el extremo 5' y sitios BstXl y Xbal en el extremo 3' del gen. El sitio Ncol incluye el codon de iniciación de la traducción; los sitios Nhel y BstXl están en la región codificante próximos a los extremos 5' y 3', respectivamente; el sitio Xbal está aguas abajo del codon de parada. Las mutaciones fueron introducidas por PCR usando los oligonucleótidos 5 ' -GGCCATGGGGGCTAGCGA-AGCGGTGATCGCCGAAGTATCG-3 ' y 5 ' -CGAATTCTAGACATTATTTGCCCAC- ACCTTGGTGATCTC-3 ' . El gen gfp en el plásmido CD3-326F es el derivado del plásmido psmGFP, codificante de la versión modificada soluble de GFP (número de acceso U70495) obtenida bajo el número de orden CD3-326 del Arabidopsis Biological Resource Center, Co-lumbus, OH (Davis y Vierstra, 1998) . El gen gfp en el plásmido CD3-326F es expresado en la cassette de expresión PpsbA/TpsbA. El gen gfp en el plásmido CD3-326F fue obtenido a través de las siguientes etapas. El fragmento BamHI-SacI de CD3-326 fue clonado en el vector pBSKS+ para obtener el plás-mido CD3-326A. El sitio Sacl aguas abajo de la región codificante fue convertido en un sitio Xbal enromando y ligando con ligante (5' -GCTCTAGAGC; plásmido CD3-326B) . Se creó un sitio Ncol para que incluyera el codon de iniciación de la traducción y, al mismo tiempo, se eliminó el sitio interno Ncol por amplificación por PCR del extremo N de la región codificante con los cebadores 5' -CCGGATCCAAGGAGATATAACACC-ATGGCTAGTAAAGGAGAAGAACTTTTC-3 ' y 5 ' -GTGTTGGCCAAGGAACAGGT-AGTTTTCC-3'. Se digirió el fragmento amplificado por PCR con las enzimas de restricción BamHI y Mscl y se usó el fragmento resultante para substituir el fragmento BamHI-MscI en el plásmido CD3-326B y obtener el plásmido CD3-326C. Se cortó la región codificante gfp del plásmido CD3-326C como fragmento Ncol-Xbal y se clonó en una cassette psbA para obtener el plásmido CD3-326D. PpsbA y TpsbA son el promotor del gen psbA y la región no traducida 3' derivados de los plásmidos pJS25 (Staub y Maliga, 1993) . TpsbA ha sido truncado por inserción de un ligante HindIII aguas abajo del sitio BspHI modificado (Peter Hajdukiewcz, sin publicar) . Se cortó el gen PpsbA: :gfp: :TpsbA como fragmento EcoRI-HindIII y se clonó en pPRVlllA digerido con EcoRI y HindIII para obtener el plásmido CD3-326F. Se introdujo la región codificante aadAlßgfp del plásmido pMSK51 en dos cassettes de expresión. En el plásmido pMSK53, la región codificante aadAlßgfp se expresa en la cassette PrrnLrbcL+DBwt/TpsbA y codifica para la proteína FLA-RE16-S2 ("fluorescent antibiotic resistance enzyme, spectino-mycin) . PrrnLrbcL+DBwt está descrita en los ejemplos previos y deriva del plásmido pHK14. El constructo contiene un promo-tor quimérico compuesto por el promotor del operón rrn, el líder del gen rbcL y la secuencia de caja aguas abajo. TpsbA es la región no traducida 3' del gen psbA y funciona estabilizando el ARNm cguimérico. En el plásmido pMSK54, la región codificante aadAlßgfp se expresa en la cassette PrrnLatpB+DBwt/TpsbA y codifica para la proteína FLARE16-S1. PrrnLatpB+DBwt deriva del plásmido pHKIO y es un promotor quimérico compuesto por el promotor del operón rrn, el líder de atpB y la secuencia de la caja aguas abajo. Véanse los Ejemplos 1-4. Se introdujeron los genes quiméricos aadAlßgfp en el vector de transformación de plástidos del tabaco pPRVlllB (Zoubenko y col., 1994) . El gen aadA fue cortado del plásmido pPRVlllB con las enzimas de restricción EcoRI y Spel y substituido con el fragmento EcoRI-Spel de los plásmidos pMSK53 y pMSK54 para generar los plásmidos pMSK57 (aadAlßgfp-S2) y pMSK56 (aadAlßgfp- SI) . Construcción de vectores plas xdicos en arroz. El plásmido pMSK49 es un vector de transformación de plástidos específico del arroz que lleva el gen aadAllgfp-S3 como marcador selectivo en la región intergénica trnV/rpsl2/7 (Número de Acceso Genbank: aún no asignado) . El plásmido pMSK49 lleva el fragmento plastídico Smal-SnaBI del arroz (sitios de restricción en los nucleótidos 122488 y 125878 en el genoma, Hirat-suka y col., 1989) clonado en un vector pBSKSII+ (Stratagene) después de enromar los sitios de restricción Sacl y Kpnl . El sitio Xbal presente en el fragmento de ADN plastídico del arroz (posición en el nucleótido 125032 en el genoma (Hirat-suka y col., 1989)) fue eliminado rellenando y volviendo a ligar. Antes de clonar el marcador selectivo, se digirió el plásmido progenitor con la enzima de restricción Bglll, dando lugar a una deleción de 119 nucleótidos entre dos sitios Bglll proximales (posiciones en 124367 y 124491) . El gen aa-dAllgfp-S3 fue entonces clonado en los sitios Bglll romos. Se obtuvo el gen aadA en el plásmido pMSK49 por modificación del gen aadA en el plásmido pMSK38 (anterior) para obtener el plásmido pMSK39. La modificación implicaba la fusión a nivel de traducción del producto génico aadA en su extremo N con un epitopo de la proteína c-Myc humana (aminoácidos 410-419; EQKLISEEDL; Kolodziej y Young, 1991) . Se llevó a cabo el procedimiento de ingeniería genética ligando un adaptador obtenido por recocido de oligonucleótidos complementarios con salientes apropiados en el plásmido pMSK38 digerido con Ncol-Nhel. Los oligonucleótidos eran: 5'-CATGGGGGCTAGCGAACAAAAA-CTCATTTCTGAAGAAGACTTGc-3' y 5'-CTAGGCAAGTCTTCTTCAGAAATGA-GTTTTTGTTCGCTAGCCCC-3 ' . Se obtuvo el gen aadAllgfp codificante de FLARE11-S ligando AAD y GFP con el péptido 11-mero ELAVEGKLEVA. Para clonar aadA y gfp en el mismo sitio de policlonación, se clonó gfp (fragmento EcoRI-HindIII ; del plásmido CD3-326F) aguas abajo de aadA en el plásmido pMSK39 para obtener el plásmido pMSK41. Los genes fueron cortados juntos como fragmento Nhel-HindlII y clonados en el plásmido pMSK45 para substituir un gen de resistencia a la kanamicina, dando lugar al plásmido pMSK48. El plásmido pMSK45 es un derivado del plásmido pMSK35, que lleva el promotor PrrnLT7glO+DB/Ec . El promotor consiste en el promotor del operón del ARNr plastídico y la secuencia líder del líder del gen 10 del fago T7. En el plásmido pMSK48, aadA se expresa a partir del promotor PrrnLT7glO+DB/Ec. Los genes aadA y gfp fueron entonces fusionados a nivel de traducción con un adaptador BstXI-NcoI que une AAD y GFP con un péptido 11-mero. El adaptador fue obtenido recociendo los oligonucleótidos 5'-GTGGGCAAAGAACTTGCAGTTGAAGGAAAATTGGAGGTCGC-3' y 5'-CATGGC- GACCTCCAATTTTCCTTCAACTGCAAGTTCTTTGCCCACTACC-3' , ligándolo al ADN del plásmido pMSK48 digerido con BstXl/NcoI para obtener el plásmido pMSK49. El plásmido pMSK49 tiene las secuencias dirigidas a plástidos del arroz presentes en el plásmido pMSK35. Transformación de plástidos en tabaco. Se bombardearon hojas de tabaco de 4 a 6 semanas de edad con partículas de tungsteno revestidas de ADN usando la pistola Biolística PDSlOOOHe de Dupont (1100 psi) . Se identificaron los clones transplastómicos como retoños verdes regenerándose en secciones de hojas blanqueadas en medio RMOP que contenía 500 mg/l de diclorhidrato de espectinomicina (Svab y Maliga, 1993) . Se iluminaron los retoños resistentes a espectinomicina con luz UV (100AP Modelo B, UV Products, Upland, California, EE.UU.). Se transfirieron los retoños que emitían luz verde a medio MS libre de espectinomicina (Murashige y Skoog, 1962) (3% sacarosa) , en el que se formaron sectores fluorescentes (transplastómicos) y no fluorescentes (tipo salvaje) . Se cortaron los sectores fluorescentes y se transfirieron a medio selec-tivo (500 mg/l de espectinomicina) de regeneración de retoños (RMOP. Se estudiaron los retoños regenerados en cuanto a transformación uniforme por análisis Southern. Transformación de plástidos en arroz. Se indujo la formación de callos a partir de semillas de Oryza sativa cv.

Taipei 309 maduras en un medio CIM modificado (Tompson y col., 1986) que contenía sales MS y vitaminas (2 mg/l glicina, 0,5 mg/l ácido nicotínico, 0,5 mg/ml piridoxina y 0,1 mg/l tiamina) , 2 mg/l 2,4D, 1 mg/l cinetina y 300 mg/l hidrolizado enzimático de caseína de Tipo III (Sigma C-1026) y sacarosa (30 g/1) - Se obtuvieron suspensiones embriogénicas de los callos embriogénicos proliferantes en el medio AA (Muller y Grafe, 1978) . Para la transformación de plástidos por el procedimiento biolístico, se plaquearon células embriogénicas de arroz en un papel de filtro en medio CIM no selectivo modificado (Tompson y col., 1986). Se incubaron las células bombardeadas durante 48 horas, se transfirieron a medio AA líquido selectivo (Muller y Grafe, 1978) (una a dos semanas) y luego a medio de regeneración RRM modificado sólido (Zhang y Wu, 1988) que contenía sales MS y vitaminas, 100 mg/l mioi-nositol, 4 mg/l BAP, 0,5 mg/l IAA, 0,5 mg/l NAA, 30 g/1 sacarosa y 40 g/1 maltosa y 100 mg/l sulfato de estreptomicina, sobre el cual aparecieron retoños verdes en dos a tres semanas. Los retoños fueron enraizados en un medio salino MS se-lectivo (Murashige y Skoog, 1962) que contenía 30 g/1 sacarosa y 100 mg/l sulfato de estreptomicina. Se tomaron muestras de hojas para el análisis de PCR y la microscopía confocal de plantas en medio selectivo. Amplificación por PCR de fragmentos frontera. Se extrajo el ADN celular total según Mettier (Mettier, 1987) . Se llevó a cabo el análisis de PCR con una mezcla 9:1 de ADN polimerasas AmpliTaq (Stratagene) y Vent (New England Biolabs) en tampón de Vent siguiendo las recomendaciones del fabricante . Se amplificó el fragmento frontera de la izquierda con ceba-dores 03 (5' -ATGGATGAACTATA-CAAATAAG-3 ' ) y 04 (5'-GCTCCTATAGTGTGACG-3 ' ) . Se amplificó el fragmento frontera de la derecha con cebadores 05 (5' -ACTACCTCTGATAGTTGAGTCG-3 ' ) y 06 (5' -AGAGGTTAATCGTACTCTGG-3' ) . Se amplificó la parte aadA de los genes FLARE-S con los cebadores 01 (5'- GGCTCCGCAGTGGATGGCGGCCTG-3') y 02 (5 ' -GGGCTGATACTGGGCCGGCAGG- 3') . En la Fig. 5A, se muestran las posiciones de los cebadores . Obsérvese egue se pueden usar los mismos cebadores en las plantas de tabaco y de arroz transplastómicas que expresan FLARE-S. Detección de FLARE-S por fluorescencia. Se visualizaron los sectores que expresaban FLARE-S en las hojas por medio de un estereomicroscopio Olympus SZX equipado para la detección de GFP con un sistema de cámara CCD. Se verificó la localízalo ción subcelular de GFP por microscopía confocal de barrido con láser (Sarastro 2000 Confocal Image System, Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) . Este sistema incluye un láser de gas mixto de argón con líneas a 488 y 568 nm y canales detectores. Se ajustan los canales para imágenes de fluoresceína y '15 rodamina. Se detectó la fluorescencia de GFP en el canal FITC (488-514 nm) . Se detectó la fluorescencia de la clorofila en el canal TRITC (560-580 nm) . Se vieron las imágenes producidas por la fluorescencia de la GFP y de la clorofila en una pantalla de ordenador unida al microscopio y se procesaron 20 usando el programa Adobe Photoshop. Análisis de inmunotransferencia. Se congelaron hojas (0,5 g) recogidas de plantas en cultivo estéril en nitrógeno líquido y se trituraron a un polvo fino en un mortero con mano. Para la extracción de proteína, se transfirió el polvo a fe5 un tubo de centrífuga que contenía 1 ml de tampón [Hepes 50 mM/KOH (pH 7,5), EDTA 1 mM, acetato de potasio 10 mM, acetato de magnesio 5 mM, ditiotreitol 1 mM y PMSF 2 mM] y se mezcló dando golpecitos. Se eliminó el material insoluble por centrifugación a 4°C durante 5 min a 11.600 g. Se determinó la 30 concentración de proteína en el sobrenadante usando el reactivo de ensayo de proteínas Biorad. Se separaron las proteínas (20 µl por banda) en SDS 12%-PAGE (Laemmli, 1970) . Se transfirieron las proteínas separadas por SDS-PAGE a una membrana de nitrocelulosa Protran (Schleicher y Schuell) usando un aparato de electrotransferencia semiseca (Bio-Rad) . Se incubó la membrana con Anticuerpo Peptídico Living Colors (Clontech) diluido 1 a 200. Se visualizó la FLARE-S usando detección de inmunomanchas por quimioluminiscencia ECL en película de rayos X. Se cuantifico la FLARE-S en las manchas por comparación con una serie de dilución de GFP de tipo salvaje purificada disponible comercialmente (Clontech) . RESULTADOS Y DISCUSIÓN Vectores plastxdicos en tabaco con FLARE-S como marcador 10 seleccionable. Se estudiaron dos proteínas de fusión FLARE-S en E. coli . En una, AAD y GFP estaban unidas por un ligante 11-mero (ELAVEGKLEVA) y en el segundo por uno 16-mero (ELVEGKLEL- VEGLKVA) . Para la transformación en tabaco, se expresó la ref gión codificante aadAlßgfp (ligante 16-mero) en dos cassettes que se sabe median en la acumulación de altos niveles de proteína en plástidos. Ambos utilizan el promotor plastídico más potente conocido que dirige la expresión del operón del ARN ribosomal (Prrn) y del 3 ' -UTR del gen psbA altamente expresa- 20 do (TpsbA) para la estabilización de los ARNm quiméricos. Los promotores PrrnLatpB+wtDB (plásmido pMSK56) y PrrnLrbcL+DBwt (plásmido pMSK57) utilizan las secuencias líder de los genes atpB o rbcL y los extremos N de las regiones codificantes con la secuencia de la caja aguas abajo (DB) , respectivamente. K5 Debido a la inclusión de la secuencia DB en los genes quiméricos, las proteínas codificadas por los dos genes son ligeramente diferentes, con 14 aminoácidos de la subunidad de la ATPasa (productos génicos atpB) o de la ribulosa 1,5- bisfosfato carboxilasa/oxigenasa (producto génico rbcL) fu- 30 sionados a nivel de traducción con FLARE16-S (FLARE16-S1 y FLARE16-S2, respectivamente) . Para obtener un vector de transformación de plástidos con los genes fluorescentes de resistencia a la espectinomicina, se clonaron los genes quiméricos en la región intergénica plastídica trnV/rpsl2/7 en el vector plastídico pPRVlllB. Los plásmidos pMSK56 y pMSK57 (Fig. 23) expresan FLARE16-S1 y FLARE16-S2, respectivamente, como marcadores . Identificación de clones de tabaco transplastómicos por fluorescencia. Se llevó a cabo la transformación por introducción biolística de ADN de los plásmidos pMSK56 y pMSK57 en cloroplastos. Se transfirieron las hojas bombardeadas a medio selectivo (500 mg/l de espectinomicina) de regeneración de retoños. Las hojas de tipo salvaje en este medio se blanquean y forman callos blancos. Las células con plástidos transformados regeneran retoños verdes. Las hojas en el medio selectivo fueron inspeccionadas regularmente con una lámpara manual UV de onda larga en cuanto a la fluorescencia FLARE-S. No se pudo detectar ninguna fluorescencia en retoños jó-venes (3 a 5 mm de tamaño) que se desarrollaban en hojas bombardeadas con pMSK56. Sin embargo, se observó formación de sectores brillantes en las hojas cuando estos pequeños retoños fueron transferidos a medio de mantenimiento de plantas no selectivo. Por el contrario, los cultivos bombardeados con el plásmido pMSK57 dieron pequeños retoños fluorescentes en un estadio precoz. Estos retoños fluorescentes y algunos de los no fluorescentes se desarrollaron en plantas con sectores brillantes en medio de mantenimiento de plantas no selectivos. Por lo tanto, FLARE16-S2 es útil para la detección precoz de sucesos de transformación de plástidos. La fluorescencia de FLARE16-S2 en retoños jóvenes en un medio selectivo debería ser debida a niveles relativamente altos de FLARE16-S2. También vienen indicados niveles superiores de FLARE16-S2 por los sectores más brillantes que aparecen en hojas jaspea-das que expresan FLARE16-S2 en comparación con FLARE16-S1. El tamaño de los sectores era diferente en retoños individuales. La expresión de FLARE-S en las diferentes capas de las hojas era también obvia. Con la selección tradicional para la resistencia a la espectinomicina, los sectores trans-plastómicos y de tipo salvaje no son visibles. La regeneración de plantas con genomas plastídicos uniformemente transformados quedaba facilitada en gran medida por los sectores fluorescentes que expresaban FLARE-S, que podían ser fácilmente identificados por luz UV, disecados y transferidos para un segundo ciclo de regeneración de plantas en medio selectivo que contenía espectinomicina (500 mg/l) . Dados los altos niveles de acumulación de FLARE-S, estuvimos interesados en averiguar si FLARE-S es tóxica para las plantas. Esperábamos que la toxicidad se manifestara en forma de eficacias más bajas de transformación. El bombardeo de 30 hojas de tabaco con los plásmidos pMSK56 y pMSK57 dio 71 y 89 clones resistentes a espectinomicina, respectivamente. De éstos, 61 y 77 líneas fueron verificadas como transplastómicas por fluorescencia. La transformación de plástidos en un subgrupo de éstas quedó confirmada por microscopía de barrido con láser confocal (7 clones cada una, véase más adelante) y análisis Southern (4 clones) . La frecuencia de sucesos de transformación de plástidos con los genes que expresan FLARE-S era ligeramente superior (~2 en lugar de ~1 por bombardeo) que lo que se ha descrito anteriormente con un gen aadA quimérico en el mismo sitio de inserción (Svab y Maliga, 1993) . Por lo tanto, suponemos que la acumulación de FLARE-S a altos niveles no es perjudicial. La falta de toxicidad está también respaldada por el fenotipo aparentemente normal de las plantas en el invernadero (no mostrado) . Localización de FLARE-S en plástidos de tabaco por microscopía confocal. Debido al enmascaramiento fenotípico, los sectores transplastómicos y de tipo salvaje en una hoja qui-mérica son ambos verdes en un medio selectivo. Sin embargo, hemos visto que, en los sectores de hojas quiméricas, en las misma célula algunos plástidos expresan FLARE-S, mientras que otros no, cuando se observan por medio de microscopía confocal (Fig. 24) . Se detectaron FLARE-S y la fluorescencia de la clorofila por separado en los canales de fluoresceína y roda-mina, respectivamente. Las dos imágenes fueron entonces solapadas, confirmándose que la fluorescencia de FLARE-S deriva de los cloroplastos . La expresión de FLARE-S fue también estudiada en tipos de plástidos no verdes, incluyendo los cromoplastos de los pétalos y los plástidos no verdes de las células de la raíz (Fig. 24b, f) . Estos estudios fueron llevados a cabo en plantas que eran homoplastómicas para los transgenomas . El estado homoplastómico era importante, ya que, en tejidos no verdes, la clorofila no podía ser usada para la confirmación de las organelas como plástidos. Como la expresión de FLARE-S podía ser fácilmente detectada en cloroplastos, así como en plásti-dos no verdes, el promotor del operón del ARNr plastídico es aparentemente activo en todos los tipos de plástido. Acumulación de FLARE-S en hojas de tabaco. Se estudió la acumulación de FLARE-S en hojas homoplastómicas usando el anticuerpo GFP comercial que reconoce la porción GFP (239 residuos de aminoácido) de FLARE16-S (520 aminoácidos) . FLARE16-SI (532 aminoácidos) representaba ~8%, mientras que FLARE16-S2 (532 aminoácidos) representaba ~18% de la proteína soluble total de las hojas (Fig. 25) . Para calcular las concentraciones de FLARE16-S, se usó una serie de dilución de GFP como referencia y se incrementaron entonces los valores en 2 , 6 para corregir el mayor tamaño de las proteínas FLARE16-S1 y -S2. Rastreo de la transformación de plástidos en arroz por medio de la expresión de FLARE-S. En arroz, la regeneración de las plantas se hace a partir de células embriogénicas no verdes. Animados por la expresión de FLARE-S en plástidos de tabaco no verdes, intentamos transformar los plástidos no verdes de las células embriogénicas de cultivo de tejidos del arroz. Se llevó a cabo la transformación de plástidos usando un vector específico del arroz que expresaba FLARE11-S3 y di- rigiendo la inserción del gen aadAllgfp-S3 a la región intergénica trnV/rpsl2/7. La localización del sitio de inserción y el tamaño de las secuencias dirigidas a los plástidos en el vector del arroz son similares a los vectores del tabaco mos-fc5 trados en la Fig. 23. Se realizó la transformación de plástidos en arroz por bombardeo de células embriogénicas de arroz en cultivo en suspensión usando partículas de oro revestidas con el ADN del plásmido pMSK49. Las células del arroz, como la mayoría de 10 los cereales, son de forma natural resistentes a la espectinomicina (Fromm y col., 1987) . FLARE-S, sin embargo, confiere también resistencia a la estreptomicina (Svab y Maliga, 1993) . Por lo tanto, se llevó a cabo la selección de líneas transplastómicas en medio selectivo de estreptomicina (100 mg/l) . La estreptomicina, a esta concentración, inhibe el crecimiento de las células embriogénicas del arroz. Después del bombardeo, las células del arroz fueron primeramente seleccionadas en medio AA líquido embriogénico y luego en medio sólido de regeneración de plantas, sobre el cual las células 20 resistentes supervivientes regeneraron retoños verdes (12 en 25 placas bombardeadas) . Estos retoños enraizaron y crecieron hasta producir plantas. La amplificación por PCR de los fragmentos frontera en ADN aislado de las hojas de estas plantas confirmó la integración de secuencias aadAllgfp-S3 en el ge-K5 noma del plástido (Fig. 26) . Los fragmentos frontera de izquierda y de derecha no pueden ser amplificados si el gen se integra en el genoma nuclear, ya que uno de los cebadores (04 ó 06) de las parejas está fuera de las regiones que se dirigen a plástidos. 30 Se estudió la expresión de FLARE11-S3 en las hojas de dos de las plantas positivas a PCR por microscopía confocal de barrido con láser. En el arroz, como en el tabaco, el marcador FLARE-S confirmó la segregación de plástidos transplastómicos y de tipo salvaje (Fig. 27) . En el arroz, sólo una pequeña fracción de los cloroplastos expresó FLARE-S. Como las células individuales marcadas con flechas en la Fig. 27 contenían una población mixta de cloroplastos de tipo salvaje y transgénicos, FLARE-S en estas células pudo expresarse sólo a partir del genoma del plástido. La integración de aa- dAllgfp-S3 en el genoma nuclear aguas abajo del péptido de tránsito que se dirige a plástidos daría como resultado una expresión uniforme de FLARE-S en cada uno de los cloroplastos de la célula. 10 Las secuencias de los genes marcadores seleccionables de la invención son facilitadas en las Figuras 28-34. La Figura 35 representa una tabla que describe los genes marcadores seleccionables descritos en el presente ejemplo. La identificación visual directa de sectores transplas-ft 15 tómicos requiere una expresión de alto nivel de FLARE-S en los plástidos. Altos niveles de expresión de GFP en Arabidopsis resultaban tóxicos, lo que interfería con la regeneración de la planta. La toxicidad de la GFP de tipo salvaje (insoluble) estaba ligada a la acumulación de GFP en el núcleo y en 20 el citoplasma y pudo ser eliminada dirigiéndola al retículo endoplásmico (Haseloff y col., 1997) . Los agregados de GFP eran también citotóxicos para las células de E. coli (Crameri y col., 1996) . Para aumentar la intensidad de la fluorescencia y evitar la citotoxicidad, se obtuvieron versiones solubles de la GFP modificada por codones (Davis y Vierstra, 1998) . Hemos utilizado el gen para una GFP modificada soluble descrita por Davis y Vierstra (Davis y Vierstra, 1998) , para crear variantes de FLARE-S, una proteína de fusión que no tiene un efecto citotóxico aparente. La frecuencia de trans- 30 formación de plástidos, si es que llega a resultar afectada, más que disminuir aumenta. En el tabaco, normalmente obtenemos un clon transplastómico por muestra de hojas bombardeada (Svab y Maliga, 1993) , mientras que, con los genes FLARE-S, pudimos recuperar, como media, dos clones por muestra. Se ob-tuvo con facilidad la regeneración de plantas a partir de tejido altamente fluorescente y las plantas regeneradas tienen un fenotipo indistinguible del tipo salvaje. La transformación de plástidos en arroz requiere la expresión del marcador selectivo en plástidos no verdes. El operón de ARNr tiene dos promotores, uno para la ARN polimerasa de plástido de tipo eubacteriano (PEP) y uno para la de tipo fago (?EP) . El promotor que dirige la expresión de FLARE-S es reconocido sólo por la AR? polimerasa de plástido de tipo eubacteriano. Previamente, se supuso que el promotor de tipo eubacteriano es activo sólo en cloroplastos (Maliga, 1998) . La acumulación de FLARE-S en raíces y pétalos indica egue PEP es también activa en plástidos no verdes. La transformación de plástidos es un procedimiento que inevitablemente da lugar a plantas quiméricas, ya que las células las plantas superiores contienen un gran número (300 a 50.000) de copias del genoma del plástido (Bendich, 1987), de las cuales sólo se transforman inicialmente unas cuantas . La expresión de alto nivel de FLARE-S en plástidos proporciona el medio para la identificación visual de sectores transplastómicos, incluso si están presentes en un tejido quimérico. GFP y AAD podían ser expresadas a partir de dos genes diferentes en un vector de transformación de plástidos. Sin embargo, la transformación con un gen marcador codificante de una proteína bifuncional previene la separación de los dos genes y simplifica la ingeniería. El marcador selectivo fluorescente reducirá significativamente el trabajo requerido para obtener transformantes plastídicos genéticamente estables en tabaco, una especie en la que la transformación de plásti-dos es rutinaria. El obstáculo a la hora de aplicar la transformación de plástidos a la mejora de cultivos es la falta de tecnología. En el tabaco, los clones quiméricos con plástidos transformados son fácilmente identificados por regeneración de retoños (Svab y col., 1990) . En Arabidopsis, los clones con plástidos transformados son identificados por el enverde-cimiento (Sikdar y col., 1998) . Hemos mostrado aquí que FLARE-S es un marcador adecuado para seleccionar transplastomas en células de arroz embriogénicas, que carecen de los fenotipos de cultivo de tejidos visualmente identificables explotados en el tabaco y en Arabidopsis. Los datos aquí presentados son el primer ejemplo de integración estable de ADN extraño en el genoma de plástidos del arroz. Estas plantas de arroz son heteroplastómicas. Se obtendrán plantas de arroz unifor-memente transformadas por mayor selección en medio con estreptomicina y estudio selectivo de las células embriogénicas en cuanto a la expresión de FLARE-S. Así, el sistema marcador FLARE-S permitirá la extensión de la transformación de plástidos a los cultivos de cereales. La utilidad de los nuevos promotores quiméricos El promotor del operón del ARN ribosomal de plástidos de tipo s70, Prrn, es el promotor de plástidos más potente conocido expresado en todo tipo de tejidos. El producto final de este promotor en el plástido es ARN, no proteína. Por lo tan-to, se construyó una serie de promotores quiméricos para facilitar la acumulación de proteína a partir de Prrn usando la expresión de la enzima neomicín-fosfotransferasa (NPTII) como proteína de referencia. 1) Las cassettes de expresión tienen diferentes perfiles de expresión específicos de tejidos. Algunas de las cassettes de expresión aquí descritas facilitarán niveles relativamente altos de expresión de proteínas en todos los tejidos, incluyendo las hojas, las raíces y las semillas. Otras cassettes tienen diferentes perfiles de expresión: por ejemplo, facili-taran niveles moderados de acumulación de proteína en las hojas, dando lugar al mismo tiempo a niveles relativamente altos de acumulación de proteína en las raíces. La acumulación de una proteína a niveles de un 10% a un 50% de la pro-teína soluble total se considera como una expresión de pro- teína a alto nivel; niveles bajos de expresión de proteína estarían en el rango de <0,1% de la proteína celular soluble total . 2) La eficacia del gen marcador seleccionable depende fe 5 del ritmo al que se acumule el producto génico durante la etapa precoz de transformación. Dado que inicialmente están presentes sólo en unas cuantas copias por célula, los altos niveles de expresión a partir de unas cuantas copias proporcionarán protección frente a substancias tóxicas desde un molo mentó temprano en adelante, facilitando una recuperación eficaz de las líneas transformadas. Las cassettes de expresión serán útiles para dirigir la expresión de los genes que confieren resistencia a los antibióticos estreptomicina, espec- tinomicina e higromicina y a los herbicidas fosfinotricina y 15 glifosato. En dichas aplicaciones, la adición de aminoácidos en el extremo N es aceptable, en la medida en que no interfiera con la expresión de los genes marcadores selecciona- bles. NPTII es una enzima de este tipo. En casos como la NPTII, una fusión N-terminal y, por lo tanto, las secuencias 20 de la "Caja Aguas Abajo" del ARNm, dan un aumento adicional de al menos dos a cuatro veces en los niveles de proteína. El constructo -DB que se basaba en un sitio Nhel e implicaba la adición de un aminoácido (N-terminal) de la región codificante del gen fuente es conveniente, pero no necesario. Cuando la fusión a nivel de traducción no es factible debido a la inactivación de proteínas, se pueden crear constructos en marco libres de costuras por los métodos de PCR señalados en la solicitud. 3) Una segunda área mayor en la que la aplicación de los 30 promotores quiméricos resulta extremadamente útil es la expresión proteica fines farmacéuticos, industriales o agronómicos. Como ejemplos se incluyen, aunque sin limitación, la producción de vacunas, de productos para el cuidado de la salud, como la hemoglobina humana, y enzimas industriales o do-mésticas . REFERENCIAS Alien, G.C., Hall, G.J., Michalowski, S., Newman, W., Spiker, S., Weissinger, A.K. y Thompson, W.F. (1996). High-level transgene expression in plant cells: effects of a strong scaffold attachment región from tobáceo. Plant Cell, 8, 899-913. Allison, L.A., Simón, L.D., Maliga, P. (1996). Deletion of rpoB reveáis a second distinct transcription system in plastids of higher plants. EMBO J. 15: 2802-2809. Arntzen, C.J. 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Claims (28)

Reivindicaciones

1. Un constructo de ADN recombinante para expresar al menos una proteína heteróloga en los plástidos de plantas superiores, cuyo constructo consiste en una región reguladora 5' que incluye un elemento promotor, una secuencia líder y un elemento de caja aguas abajo operablemente unida a una región codificante de dicha al menos una proteína heteróloga, cuya región reguladora quimérica aumenta la eficacia en cuanto a traducción de una molécula de ARNm codificada por dicho constructo de ADN.

2. Un vector que contiene el constructo de ADN de la reivindicación 1.

3. Un constructo de ADN recombinante según se reivindica en la reivindicación 1, cuya región reguladora 5' es seleccionada entre el grupo consistente en PrrnLatpB+DBwt, SEC ID N° : 1, PrrnLatpB-DB, SEC ID N° : 2, PrrnLatpB+DBm, SEC ID N° : 3, PrrnLclpP+DBwt, SEC ID N° : 4, PrrnclpP-DB, SEC ID N° : 5, PrrnLrbcL+DBwt, SEC ID N° : 6, PrrnLrbcL-DB, SEC ID N° : 7, PrrnLrbcL+DBm, SEC ID N° : 8, PrrnLpsbB+DBwt , SEC ID N° : 9, PrrnLpsbB-DB, SEC ID N° : 10, PrrnLPsbA+DBwt , SEC ID N° : 11, PrrnLpsbA-DB, SEC ID N° : 12, PrrnLpsbA-DB (+GC) , SEC ID N° : 13.

. Un constructo de ADN recombinante según se reivindica en la reivindicación 1, cuya región reguladora 5' es seleccionada entre el grupo consistente en PrrnLT7gl0+DB/Ec, SEC ID ?° : 14, PrrnLT7glO+DB/pt, SEC ID ?° : 15, PrrnLT7glO-DB, SEC ID ?° : 15.

5. Un vector que contiene un constructo de AD? según se reivindica en la reivindicación 1.

6. Un constructo de ADN según se reivindica en la reivindicación 1, cuyo elemento de caja aguas abajo tiene una secuencia seleccionada entre el grupo consistente en 5' ) 5 TCCAGTCACTAGCCCTGCCTTCGGCA 3 ' y 5 ' CCCAGTCATGAATCACAAAGTGGTAA 3' .

7. Un constructo de ADN según se reivindica en la reivindicación 1, donde dicha proteína heteróloga se expresa a 10 partir de un gen bar codificado por S. hydroscopicus , cuyo gen bar está insertado en un plásmido seleccionado entre el grupo consistente en pK012 y pJEK3 , cuyo pJEK3 tiene la secuencia de la SEC ID N° : 18. "15

8. Un constructo de ADN según se reivindica en la reivindicación 1, donde dicha proteína heteróloga se expresa a partir de un ácido nucleico codificante de un bar sintético, cuyo ácido nucleico de bar sintético ha sido seleccionado entre el grupo consistente en la SEC ID N° : 19 y la SEC ID N° : 20 20.

9. Un constructo de ADN según se reivindica en la reivindicación 1, cuya al menos una proteína heteróloga consiste en una proteína de fusión.

10. Un constructo de ADN según se reivindica en la reivindicación 9, cuya proteína de fusión tiene una primera y una segunda región codificante operablemente unidas a dicha región reguladora 5', de tal forma egue la producción de dicha 30 proteína de fusión está regulada por dicha región reguladora 5', cuya primera región codificante codifica para un gen marcador seleccionable y cuya dicha segunda región codificante codifica para una molécula fluorescente con objeto de facilitar la visualización de las células vegetales transformadas.

11. Un vector que contiene el constructo de ADN de la reivindicación 10. >

12. Un constructo de ADN según se reivindica en la reivindicación 9, cuya proteína de fusión consiste en una región codificante de aadA operablemente unida a una región codificante de proteína fluorescente verde . 10

13. Un constructo de ADN según se reivindica en la reivindicación 10, cuya región codificante de aadA está operablemente unida a dicha región codificante de proteína fluorescente verde por medio de una molécula de ácido nucleico ^ codificante de un ligante peptídico que tiene una secuencia JL5 seleccionada entre el grupo consistente en ELVEGKLELVEGLKVA y ELAVEGKLEVA.

14. Un constructo de AD? según se reivindica en la reivindicación 10, cuyo constructo tiene una secuencia seleccio¬ 20 nada entre el grupo de las SEC ID ?° : 21-25 y 27.

15. Un plásmido para transformar los plástidos de las plantas superiores, cuyo plásmido es seleccionado entre el grupo consistente en pHK30 (B) , pHK31 (B) , pHK60, pHK32 (B) , pHK33 (B) , pHK34 (A) , pHK35 (A) , pHK64 (A) , pHK36 (A) , pHK37 (A) , pHK38(A), pHK39(A), pHK40 (A) , pHK41 (A) , pHK42 (A) , pHK43 (A) , pMSK56, pMSK57, pMSK48, pMSK49, pMSK35, pMSK53 y pMSK54.

16. Una planta transgénica que contiene un plásmido se¬ 30 gún se reivindica en la reivindicación 15.

17. Una planta transgénica según se reivindica en la reivindicación 15, cuya planta es seleccionada entre el grupo consistente en monocotiledóneas y dicotiledóneas.

18. Un método para producir monocotiledóneas transplastómicas, consistente en: a) obtener células embriogénicas; b) exponer dichas células a una molécula de ADN heteróloga en condiciones mediante las cuales el ADN entra en los plástidos de dichas células, cuya molécula de ADN heteróloga codifica para al menos una proteína exógena, cuya al menos una proteína exógena codifica para un marcador seleccionable; c) aplicar un agente de selección a dichas células para facilitar la separación de los plástidos no transformados con respecto a los plástidos transformados, cuyas células contienen plástidos transformados que sobreviven y se dividen en presencia de dicho agente de selección; d) transferir dichas células supervivientes a medio selectivo para promover la regeneración y el crecimiento de retoños, y e) enraizar dichos retoños, produciendo así plantas monocotiledóneas transplastómicas.

19. Un método según se reivindica en la reivindicación 18, donde dicha molécula de ADN heteróloga es introducida en dicha célula vegetal mediante un procedimiento seleccionado entre el grupo consistente en bombardeo biolístico, transformación mediada por Agrobacterium, microinyección y electroporación.

20. Un método según se reivindica en la reivindicación 18, donde se obtienen protoplastos de dichas células embriogénicas y se introduce dicha molécula de ADN heteróloga en dichos protoplastos por exposición a polietilenglicol.

21. Un método según se reivindica en la reivindicación 18, donde dicho agente de selección es seleccionado entre el grupo consistente en estreptomicina y paromomicina.

22. Una monocotiledónea transformada mediante el método de la reivindicación 18.

23. Una planta monocotileddnea transformada según se reivindica en la reivindicación 22, cuya planta monocotiledónea es seleccionada entre el grupo consistente en maíz, mijo, sorgo, caña de azúcar, arroz, trigo, cebada, avena, centeno y hierba para césped.

24. Un método para producir plantas de arroz transplastómicas, cuyo método consiste en: a) obtener callos embriogénicos, b) inducir la proliferación de los callos en medio CIM modificado, c) obtener suspensiones de células embriogénicas de dichos callos proliferantes en medio AA líquido, d) bombardear dichas células embriogénicas con microproyectiles revestidos de ADN plasmídico, e) transferir dichas células bombardeadas a medio AA líquido selectivo, f) transferir dichas células supervivientes en medio AA a medio de regeneración RRM selectivo durante un período de tiempo suficiente para que aparezcan retoños verdes y g) enraizar dichos retoños en un medio salino MS selectivo.

25. Un método según se reivindica en la reivindicación 24, cuyo ADN plasmídico es seleccionado entre el grupo de plásmidos consistente en pMSK35 y pMSK53 , pMSK54 y pMSK49.

26. Una planta de arroz transplastómica producida por el método de la reivindicación 24.

27. Un método para contener transgenes en plantas transformadas, consistente en: a) determinar la utilización de codones de en dicha planta que ha de ser transformada y en los microbios que se encuentran asociados con dicha planta y b) someter dicha secuencia transgénica a ingeniería genética mediante la introducción de codones raros para abrogar la expresión de dicho transgén en dicho microbio asociado con la planta.

28. Un método según se reivindica en la reivindicación 27, donde dicho transgén es un gen bar y dichos codones raros son codones codificantes de arginina seleccionados entre el grupo consistente en AGA y AGG.