JP5594683B2 - プロモーター - Google Patents

Description

本発明は、プロモーター、特に植物での遺伝子発現に有用なプロモーターに関する。

菜種や大豆などの植物による貯蔵油脂は食用のみならず、バイオディーゼルの原料としても利用され得る大変有用な農産物である。植物油脂の合成に関わる遺伝子として、脂肪酸合成関連酵素遺伝子、及びトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）合成関連酵素遺伝子が知られている。前者は登熟初期から発現して、開花後１０日目以降は発現量が低下する。一方、後者は登熟１０日目前後から発現して、登熟後期までその発現量が比較的に高いレベルで持続する（非特許文献１）。

脂肪酸合成関連酵素遺伝子として、アブラナ科アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）遺伝子が知られており、ＡＣＣａｓｅはＢＣＣＰ、ＢＣ、ＣＴα及びＣＴβの４つのサブユニットからなり、そのうち、ＣＴβ以外の遺伝子は核にコードされており、ＣＴβはプラスチドにコードされている。また、シロイヌナズナのＢＣＣＰ遺伝子はＢＣＣＰ１と、ＢＣＣＰ２との２つがある。ＴＡＧ合成関連酵素遺伝子、さらに脂肪酸修飾に関わる遺伝子としては、ＦＡＥ１（Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄ Ｅｌｏｎｇａｓｅ １）、及び、ＦＡＤ３（Ｆａｔｔｙ Ａｃｉｄ Ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ ３）が知られている。

また、ＡＰ２型転写活性化因子ＷＲＩＮＫＬＥＤ１（ＷＲＩ１）は、登熟期において炭素源の貯蔵油脂の合成への流れを制御するとの報告もある（非特許文献２）。ＷＲＩ１結合配列は脂肪酸合成酵素関連遺伝子の上流領域に存在する。

しかし、脂肪酸合成関連酵素遺伝子及びＴＡＧ合成関連酵素遺伝子の発現の制御に関わる発現プロモーターについてはまだ決定されていない。

Ｒｕｕｓｋａ，Ｓ．Ａ．ら、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ（２００２）１４、１１９１−１２０６ Ｋｅｎｉｃｈｉｒｏ Ｍａｅｏら、Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ（２００９）６０、４７６−４８７

本発明は、遺伝子操作によって植物で所望の遺伝子発現を制御できる、新規なプロモーターを提供することを目的とする。

本発明者らが上記課題を解決するため鋭意研究の結果、ＦＡＥ１遺伝子の翻訳開始上流領域の約１．２ｋｂの核酸とＢＣＣＰ２遺伝子の５’非翻訳領域の約２００ｂの核酸とを連結した、プロモーター活性を有する核酸は、登熟８日目から登熟後期までの間にその下流に位置するリポーター遺伝子を持続的に発現させることができるとの知見を見出し、本発明の完成に至った。

すなわち、本発明はＦＡＥ１及びＦＡＤ３からなる群より選択される１つの遺伝子の翻訳開始上流１，０００ｂのうちの５００ｂ以上の連続的配列を有する、第１の核酸と、ＢＣＣＰ１、ＢＣＣＰ２、ＣＴα、及びＢＣからなる群より選択される１つの遺伝子の５’上流非翻訳領域のうちの、少なくとも１つのＷＲＩ１結合配列を含み、かつ、１００ｂ以上の連続的配列を有する、第２の核酸とが連結してなる、プロモーターを提供する。

本発明のプロモーターにおいて、第２の核酸が、ＢＣＣＰ１、ＢＣＣＰ２、ＣＴα及びＢＣからなる群より選択される１つの遺伝子の、（１）５’上流非翻訳領域のうちの、少なくとも１つのＷＲＩ１結合配列を含み、かつ、１００ｂ以上の連続的配列、及び（２）転写開始上流２００ｂ以上の配列を有することが好ましい。

本発明はまた、配列番号１に記載の塩基配列を有する核酸と、配列番号２に記載の塩基配列を有する核酸とが連結してなる、プロモーターを提供する。本発明はまた、配列番号３に記載の塩基配列を有する、プロモーターを提供する。

本発明はさらに、上記いずれかのプロモーターを含む植物形質転換用ベクター、該植物形質転換用ベクターが導入される種子、及び、該種子を育成して得られる植物を提供する。

本発明のプロモーターは、脂肪酸合成関連酵素遺伝子のプロモーター及びトリアシルグリセロール合成関連酵素遺伝子のプロモーターの両者の活性を併せ持つため、本発明のプロモーターを用いれば、植物において登熟早期から登熟後期に渡って持続的に所望の遺伝子を発現させることができる。例えば、プロモーターの下流に脂肪酸合成関連酵素遺伝子を導入した場合、植物種子において登熟後期まで脂肪酸の合成期間が延長されるため、植物油脂の収穫量の増加が期待できる。一方、トリアシルグリセロール合成関連酵素遺伝子を導入した場合、トリアシルグリセロールの合成が登熟早期から開始されるため、同様に植物油脂の収穫量の増加が期待できる。

図１はＡＣＣａｓｅの各サブユニットの遺伝子におけるプロモーター候補の模式図である。 図２はプロモーター候補のＤＮＡ断片が導入された組み換えベクターの部分的模式図である。 図３はＢＣＣＰ１におけるプロモーター候補が導入されたシロイヌナズナの開花後莢及び種子におけるＧＵＳ染色の結果を示す図である。 図４はＢＣＣＰ２におけるプロモーター候補が導入されたシロイヌナズナの開花後莢及び種子におけるＧＵＳ染色の結果を示す図である。 図５はＣＴαにおけるプロモーター候補が導入されたシロイヌナズナの開花後莢及び種子におけるＧＵＳ染色の結果を示す図である。 図６はＢＣにおけるプロモーター候補が導入されたシロイヌナズナの開花後莢及び種子におけるＧＵＳ染色の結果を示す図である。 図７はＦＡＥ１−１ｋ及びＦＡＤ３−１ｋが導入されたシロイヌナズナの開花後莢及び種子におけるＧＵＳ染色の結果を示す図である。 図８はＡＣＣａｓｅ各サブユニット遺伝子におけるプロモーター候補領域の模式図である。 図９はプロモーター候補が導入されたシロイヌナズナの開花後莢及び種子におけるＧＵＳ染色の結果を示す図である。

以下、本発明の好適な実施形態について詳細に説明する。

ＢＣＣＰ１（ＣＡＣ１−１）、ＢＣＣＰ２（ＣＡＣ１−２）、ＣＴα（ＣＡＣ３）及びＢＣ（ＣＡＣ２）は、脂肪酸合成関連酵素遺伝子であるアブラナ科植物のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣａｓｅ）遺伝子の４つのサブユニットである。これらの遺伝子の塩基配列は既に解析されており、それぞれＢＣＣＰ１（Ａｔ５ｇ１６３９０）、ＢＣＣＰ２（Ａｔ５ｇ１５５３０）、ＣＴα（Ａｔ２ｇ３０４０）、及びＢＣ（Ａｔ５ｇ３５３６０）として遺伝子データベースに登録されている。また、トリアシルグリセロール合成酵素遺伝子であるアブラナ科植物のＦＡＥ１（Ａｔ４ｇ３４５２０）及びＦＡＤ３（Ａｔ２ｇ２９９８０）も遺伝子データベースに登録されている。これらの遺伝子は特に植物の種子において特異的に発現される。

本発明の第１の実施形態は、第１の核酸と第２の核酸とが連結してなるプロモーターである。第１の核酸は、ＦＡＥ１及びＦＡＤ３からなる群より選択される１つの遺伝子の翻訳開始上流１，０００ｂのうちの５００ｂ以上の連続的配列を有するものである。ＦＡＥ１及びＦＡＤ３の翻訳開始上流１，０００ｂのうちの５００ｂ以上の連続的配列を有する核酸は、それぞれＦＡＥ１プロモーター活性及びＦＡＤ３プロモーター活性を有するため、第１の核酸は植物においてその下流に位置する遺伝子を登熟１０日目前後から発現させ、登熟後期まで発現量を持続させることができる。ここで、「翻訳開始上流１，０００ｂのうちの５００ｂ以上の連続的配列」とは、翻訳開始点直前の上流塩基を−１ｂとして、その−１ｂから−１，０００ｂまでの配列のうちの５００ｂ以上の連続的配列を意味する。第１の配列は、ＦＡＥ１及びＦＡＤ３からなる群より選択される１つの遺伝子の翻訳開始上流１，０００ｂのうちの好ましくは７００ｂ以上又は８００ｂ以上、より好ましくは９００以上の配列を有することが好ましい。

第２の核酸は、ＢＣＣＰ１、ＢＣＣＰ２、ＣＴα及びＢＣからなる群より選択される１つの遺伝子の５’上流非翻訳領域のうちの、少なくとも１つのＷＲＩ１結合配列を含み、かつ、１００ｂ以上の連続的配列を有する。図８に示すように、ＢＣＣＰ１、ＣＴα及びＢＣの５’非翻訳領域には、それぞれ１つのＷＲＩ１結合配列が存在し、ＢＣＣＰ２の５’非翻訳領域には２つのＷＲＩ１結合配列が存在する。これらのＷＲＩ１結合配列がＡＣＣａｓｅのサブユニットのプロモーター活性を有すると推測されるため、第２の核酸は植物においてその下流に位置する遺伝子を登熟初期から発現させることができるが、開花後１０日目以降は発現量が低下してしまう性質を有する。一方、ＣＴα及びＢＣの転写開始上流領域にもそれぞれ１つのＷＲＩ１結合配列が存在するが、これらのＷＲＩ１結合配列はプロモーター活性に殆ど寄与していないため、必ずしも第２の核酸に含まれる必要はない。ここで、「５’上流非翻訳領域」とは、転写開始点から翻訳開始点の直前の上流塩基までの領域を意味する。第２の核酸は、好ましく各遺伝子の５’上流非翻訳領域における１１０ｂ以上又は１４０ｂ、より好ましく１９０ｂ又は３５０ｂ以上の連続的配列を有する。

第２の核酸が、ＢＣＣＰ１、ＢＣＣＰ２、ＣＴα及びＢＣからなる群より選択される１つの遺伝子の、（１）５’上流非翻訳領域のうちの、少なくとも１つのＷＲＩ１結合配列を含み、かつ、１００ｂ以上の連続的配列、及び（２）転写開始上流２００ｂ以上の配列を有してもよい。ここで、「転写開始上流２００ｂ以上」とは、転写開始点直前の上流塩基を−１ｂとして、その−１ｂから−２００ｂ以上までの配列を意味する。例えば、−１ｂ〜−２５０ｂの配列や−１ｂ〜−３００ｂの配列などが挙げられる。本発明者らの知見によれば、これらの遺伝子の転写開始上流領域の配列はプロモーター活性への寄与度が低いため必ずしも必要でないが、第２の核酸に含まれてもよい。

第１の核酸及び第２の核酸は、完全合成又は部分的合成によって得てもよいが、好ましくはシロイヌナズナのゲノミックＤＮＡを鋳型として、適切なプライマーを用いてＰＣＲ増幅によって得る。ＦＡＥ１及びＦＡＤ３、並びに、ＢＣＣＰ１、ＢＣＣＰ２、ＣＴα及びＢＣの配列は既知であるため、当業者にとって所望の領域を増幅させるためのプライマーの設計や、ＰＣＲ条件の設定は常套の手法である。第１の核酸と第２の核酸との連結は特に順番が限定されないが、両者のプロモーター活性が維持されるように連結する必要がある。すなわち、両者は順方向で連結される必要がある。また、両者を直接に連結してもよく、必要があれば両者の間にプロモーター活性を影響しない核酸配列（制限酵素サイトやその他の必要な核酸配列）を導入してもよい。

本発明のプロモーターは、脂肪酸合成関連酵素遺伝子プロモーター活性及びトリアシルグリセロール合成酵素遺伝子プロモーター活性の両方を併せ持つため、植物において登熟早期から登熟後期に渡って持続的に下流に位置する遺伝子を発現させることができる。本プロモーターの下流に必要に応じて、所望の遺伝子を導入することで、植物において登熟早期から登熟後期に渡ってこの遺伝子の発現量を増加させることができる。また、本発明のプロモーターは種子特異性があるため、特に種子において遺伝子の発現量を増加させることが望ましいときに好適に用いられる。そのため、植物油脂の合成に関わる遺伝子をプロモーターの下流に導入し、種子において油脂の合成量を増加させることが可能である。また、インターフェロンや抗体などのタンパク質性医薬品をコードする遺伝子を導入すれば、植物の種子においてこれらの医薬品を産生させることもできる。

本発明の第２の実施形態は、配列番号１に記載の塩基配列を有する核酸と、配列番号２に記載の塩基配列を有する核酸とが連結してなる、プロモーターである。配列番号１に記載の塩基配列を有する核酸は、ＦＡＥ１翻訳開始上流領域の約１．２ｋｂの核酸であり、ＦＡＥ１プロモーター活性を有する。配列番号２に記載の塩基配列を有する核酸は、ＢＣＣＰ２の５’上流非翻訳領域の約２００ｂの核酸であり、ＢＣＣＰ２プロモーター活性を有する。両者を連結すれば、ＦＡＥ１プロモーター活性及びＢＣＣＰ２プロモーター活性の両方を併せ持つプロモーターとなり、植物において登熟早期から登熟後期に渡って持続的に下流に位置する遺伝子を発現させることができる。ここで、連結は第１の実施形態における連結と同義である。

本発明の第３の実施形態は、配列番号３に記載の塩基配列を有する、プロモーターである。このプロモーターはＦＡＥ１プロモーター活性及びＢＣＣＰ２プロモーター活性の両方を併せ持つプロモーターであり、植物において登熟早期から登熟後期に渡って持続的に下流に位置する遺伝子を発現させることができる。

本発明の第４の実施形態は、本発明のプロモーターを含む植物形質転換用ベクターである。ベクターは植物形質転換用であれば、特に限定されないが、例えば、ｐＢＩ１０１が用いられる。プロモーターをベクターへの導入は、当業者が通常用いられる手法にしたがって行えばよく、例えば、ベクターのクローニングサイトへ、適当な制限酵素を用いてクローニングする手法が用いられる。本発明の植物形質転換用ベクターを用いて、植物形質転換体を作製し、プロモーターの下流に位置する遺伝子を特に種子において特異的に発現させることができる。この場合、発現する遺伝子をプロモーターの下流に機能的に連結させるように、植物形質転換用ベクターに組み換える必要がある。発現する遺伝子は、目的に応じて当業者が適宜に選択することができるが、種子において植物油脂の貯蓄量を増加させる目的で、イネＡＣＣａｓｅ、アブラナ科ＴＡＧ１、又はアブラナ科ＰＤＡＴが好適に用いられる。

本発明の第５の実施形態は、上記植物形質転換用ベクターが導入される種子である。種子は植物形質転換用ベクターが機能し得る種子であれば特に限定されないが、例えば、シロイヌナズナやナタネなどのアブラナ科植物の種子が挙げられる。植物形質転換用ベクターの導入方法は、当業者が通常用いられる手法にしたがって行えばよく、例えば、アグロバクテリウムを介した遺伝子導入法が挙げられる。

本発明の第６の実施形態は、上記種子を育成して得られる植物である。植物の育成は当業者が通常用いる手法によって行えばよい。本発明の種子によって育成した植物において、登熟早期から登熟後期に渡って、プロモーターの下流に機能的に連結した遺伝子を持続的に発現させることができる。

以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。

実施例１ プロモーター候補の選出
（ＰＣＲによるプロモーター候補ＤＮＡ断片の増幅）
シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ Ｃｏｌｕｍｂｉａ）のゲノミックＤＮＡを鋳型として、下記に示すプライマーを用いて、ＰＣＲ法によって、脂肪酸合成関連酵素遺伝子ＡＣＣａｓｅの各サブユニット（ＣＴα、ＢＣＣＰ１、ＢＣＣＰ２、及びＢＣ）、並びに、ＴＡＧ合成関連酵素遺伝子のＦＡＥ１及びＦＡＤ３の上流領域から以下のプロモーター候補ＤＮＡ断片を増幅した。一部のプロモーター候補の模式図は図１に示す。ＰＣＲは、９８℃２分の後、９８℃１０秒、５５℃１５秒、７２℃１分を３５サイクルし、最後に７２℃５分で行った。

（１）ＢＣＣＰ１転写開始上流領域９９０ｂのＤＮＡ断片（ＢＣＣＰ１−１ｋ）
ＢＣＣＰ１−１ｋ ＳａｌＦ：５’−ＧＣＧＴＣＧＡＣＴＴＴＧＴＴＣＴＴＣＴＴＴＴＴＣＣＧ−３’（配列番号４）
ＢＣＣＰ１−１ｋｔ ＢａｍＲ：５’−ＧＣＧＧＡＴＣＣＡＧＡＡＧＡＴＧＴＣＧＧＡＴＴＣＧＧ−３’（配列番号５）
（２）ＢＣＣＰ１−１ｋ＋ＢＣＣＰ１上流の５’非翻訳領域の１１０ｂ（ＢＣＣＰ１−５’ＵＴＲ）
ＢＣＣＰ１−１ｋ ＳａｌＦ：５’−ＧＣＧＴＣＧＡＣＴＴＴＧＴＴＣＴＴＣＴＴＴＴＴＣＣＧ−３’（配列番号４）
ＢＣＣＰ１ｐ ＢａｍＲ：５’−ＧＣＧＧＡＴＣＣＴＣＧＴＣＴＴＣＴＴＡＴＴＧＴＴＡＴＴＧ−３’（配列番号６）
（３）ＢＣＣＰ１転写開始上流領域５００ｂのＤＮＡ断片（ＢＣＣＰ１−５００）＋ＢＣＣＰ１−５’ＵＴＲ
ＢＣＣＰ１−５００ｂ ＳａｌＦ：５’−ＧＣＧＴＣＧＡＣＧＡＴＧＣＡＴＴＴＴＧＴＴＴＡＴＡＧ−３’（配列番号７）
ＢＣＣＰ１ｐ ＢａｍＲ：５’−ＧＣＧＧＡＴＣＣＴＣＧＴＣＴＴＣＴＴＡＴＴＧＴＴＡＴＴＧ−３’（配列番号６）
（４）ＢＣＣＰ１転写開始上流領域２９６ｂのＤＮＡ断片（ＢＣＣＰ１−３００）＋ＢＣＣＰ１−５’ＵＴＲ
ＢＣＣＰ１−３００ｂ ＳａｌＦ：５’−ＧＣＧＴＣＧＡＣＡＡＴＴＧＧＡＧＡＣＡＣＣＧＡＣＡＧ−３’（配列番号８）
ＢＣＣＰ１ｐ ＢａｍＲ：５’−ＧＣＧＧＡＴＣＣＴＣＧＴＣＴＴＣＴＴＡＴＴＧＴＴＡＴＴＧ−３’（配列番号６）

（５）ＢＣＣＰ２転写開始上流領域１０００ｂのＤＮＡ断片（ＢＣＣＰ２−１ｋ）
ＢＣＣＰ２−１ｋ ＳａｌＦ：５’−ＧＣＧＴＣＧＡＣＡＴＣＡＧＡＣＡＡＡＡＧＡＧＡＧＡＣＡＡＣ−３’（配列番号９）
ＢＣＣＰ２ｔ ＢａｍＲ：５’−ＧＣＧＧＡＴＣＣＣＣＡＡＡＣＣＧＣＴＣＣＴＴＴＴＧＴＣ−３’（配列番号１０）
（６）ＢＣＣＰ２−１ｋ＋ＢＣＣＰ２上流の５’非翻訳領域の１９２ｂ（ＢＣＣＰ２−５’ＵＴＲ）
ＢＣＣＰ２−１ｋ ＳａｌＦ：５’−ＧＣＧＴＣＧＡＣＡＴＣＡＧＡＣＡＡＡＡＧＡＧＡＧＡＣＡＡＣ−３’（配列番号９）
ＢＣＣＰ２ｐ ＢａｍＲ：５’−ＧＣＧＧＡＴＣＣＴＧＴＴＧＡＧＡＣＡＧＴＧＧＡＣＧＡＴＧ−３’（配列番号１１）
（７）ＢＣＣＰ２転写開始上流領域８００ｂのＤＮＡ断片（ＢＣＣＰ２−８００）＋ＢＣＣＰ２−５’ＵＴＲ
（６）で得られたＢＣＣＰ２−１ｋ＋ＢＣＣＰ２−５’ＵＴＲのＰＣＲ断片を後述の方法にてｐＣＲ ＢｌｕｎｔのＥｃｏＲＶサイトに導入した後、ＰｓｔＩ／ＢａｍＨＩ制限酵素でＤＮＡ断片を切り出し、再びｐＢＳＫのＰｓｔＩ／ＢａｍＨＩサイトに導入し、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩ制限酵素で処理して得たＤＮＡ断片をＢＣＣＰ２−８００＋ＢＣＣＰ２−５’ＵＴＲとした。ＢＣＣＰ２−８００＋ＢＣＣＰ２−５’ＵＴＲを後述の方法によってｐＢＩ１０１のＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩサイトに導入した。
（８）ＢＣＣＰ２転写開始上流領域３１８ｂのＤＮＡ断片（ＢＣＣＰ２−３００）＋ＢＣＣＰ２−５’ＵＴＲ
ＢＣＣＰ２−３００ｂ ＳａｌＦ：５’−ＧＣＧＴＣＧＡＣＴＡＴＣＴＧＣＡＴＴＴＡＣＴＧＡＡＧ−３’（配列番号１２）
ＢＣＣＰ２ｐ ＢａｍＲ：５’−ＧＣＧＧＡＴＣＣＴＧＴＴＧＡＧＡＣＡＧＴＧＧＡＣＧＡＴＧ−３’（配列番号１１）

（９）ＣＴα転写開始上流領域９８０ｂのＤＮＡ断片（ＣＴα−１ｋ）
ＣＴα−１ｋ ＳａｌＦ：５’−ＧＣＧＴＣＧＡＣＴＡＡＴＡＣＣＣＴＴＡＴＴＡＡＡＧＧＣＣ−３’（配列番号１３）
ＣＴαｔ ＢａｍＲ：５’−ＧＣＧＡＡＴＣＣＡＴＣＣＴＴＣＣＴＴＧＣＣＡＡＴＴＧ−３’（配列番号１４）
（１０）ＣＴα転写開始上流領域６０８ｂのＤＮＡ断片（ＣＴα−６００）
（９）で得られたＣＴα１ｋのＰＣＲ断片を後述の方法によってｐＣＲ ＢｌｕｎｔのＥｃｏＲＶサイトに導入した後、ＰｓｔＩ／ＢａｍＨＩ制限酵素でＤＮＡ断片を切り出し、再びｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ＋のＰｓｔＩ／ＢａｍＨＩサイトに導入し、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩ制限酵素で処理して得たＤＮＡ断片をＣＴα−６００とした。ＣＴα−６００を後述の方法によってｐＢＩ１０１のＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩサイトに導入した。
（１１）ＣＴα−１ｋ＋ＣＴα上流の５’非翻訳領域の４５０ｂ（ＣＴα−５’ＵＴＲ）
ＣＴα−１ｋ ＳａｌＦ：５’−ＧＣＧＴＣＧＡＣＴＡＡＴＡＣＣＣＴＴＡＴＴＡＡＡＧＧＣＣ−３’（配列番号１３）
ＣＴαｐ ＢａｍＲ：５’−ＧＣＧＧＡＴＣＣＴＴＴＴＴＧＣＧＴＴＧＡＧＴＴＣＴＴ−３’（配列番号１５）
（１２）ＣＴα転写開始上流領域２５１ｂのＤＮＡ断片（ＣＴα−２５０）＋ＣＴα−５’ＵＴＲ
（１１）で得られたＣＴα−１ｋ＋ＣＴα−５’ＵＴＲのＰＣＲ断片を後述の方法によってｐＣＲ ＢｌｕｎｔのＥｃｏＲＶサイトに導入した後、ＳｍａＩ／ＢａｍＨＩ制限酵素でＤＮＡ断片を切り出し、再びｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ＋のＥｃｏＲＶ／ＢａｍＨＩサイトに導入し、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩ制限酵素で処理して得たＤＮＡ断片をＣＴα−２５０＋ＣＴα−５’ＵＴＲとした。ＣＴα−２５０＋ＣＴα−５’ＵＴＲは後述の方法によってｐＢＩ１０１のＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩサイトに導入した。

（１３）ＢＣ転写開始上流領域１０１０ｂのＤＮＡ断片（ＢＣ−１ｋ）
ＢＣ−１ｋ ＳａｌＦ：５’−ＧＣＧＴＣＧＡＣＴＡＡＴＡＴＡＴＣＴＴＣＴＴＡＴＧＡＣ−３’（配列番号１６）
ＢＣｔ ＢａｍＲ：５’−ＧＣＧＧＡＴＣＣＣＴＴＧＡＡＴＣＣＴＣＣＧＣＣＣＧＡＣＴＧ−３’（配列番号１７）
（１４）ＢＣ−１ｋ＋ＢＣ上流の５’非翻訳領域の１４２ｂ（ＢＣ−５’ＵＴＲ）
ＢＣ−１ｋ ＳａｌＦ：５’−ＧＣＧＴＣＧＡＣＴＡＡＴＡＴＡＴＣＴＴＣＴＴＡＴＧＡＣ−３’（配列番号１６）
ＢＣｐ ＢａｍＲ：５’−ＧＣＧＧＡＴＣＣＴＴＴＣＣＡＡＡＴＧＣＡＧＧＡＧＧＣ−３’（配列番号１８）
（１５）ＢＣ転写開始上流領域２０３ｂのＤＮＡ断片（ＢＣ−２００）＋ＢＣ−５’ＵＴＲ
（１４）で得られたＢＣ１ｋｐ＋ ＢＣα５’ＵＴＲのＰＣＲ断片をｐＣＲ ＢｌｕｎｔのＥｃｏＲＶサイトに導入した後、ＨｉｎｄＩＩ／ＢａｍＨＩ制限酵素で切り出して得られたＤＮＡ断片をＢＣ−２００＋ＢＣ−５’ＵＴＲとした。ＢＣ−２００＋ＢＣ−５’ＵＴＲは後述の方法によってｐＢＩ１０１のＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩに導入した。

（１６）ＦＡＥ１翻訳開始上流領域１，２０７ｂのＤＮＡ断片（ＦＡＥ１−１ｋ）
まず、下記のプライマーを用いて、ＦＡＥ１翻訳開始上流領域１，９９８ｂのＤＮＡ断片を増幅した（配列番号２３）。
ＦＡＥ１−２ｋ ＳａｌＦ：５’−ＣＧＴＣＧＡＣＧＧＡＴＣＣＣＧＧＡＴＴＣＴＡＴＴＣＡＣＴＣＴＡＴＣ−３’（配列番号１９）
ＦＡＥ１ ＳａｌＲ：５’−ＧＴＣＧＡＣＴＣＴＧＴＴＴＧＴＧＴＣＧＧＡＡＡＡＴＡＡＴＧＧ−３’（配列番号２０）
次に、得られた約２ｋｂのＰＣＲ断片をｐＣＲ ＢｌｕｎｔのＥｃｏＲＶサイトに導入した後、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＳａｌＩ制限酵素で処理して得られたＤＮＡ断片をＦＡＥ１−１ｋとした（配列番号１）。
（１７）ＦＡＤ３翻訳開始上流領域９８３ｂのＤＮＡ断片（ＦＡＤ３−１ｋ）
ＦＡＤ３−１ｋ ＨｉｎｄＦ：５’−ＣＧＡＡＧＣＴＴＴＴＴＧＣＴＣＧＡＴＴＴＧＴＧＴＴＧ−３’（配列番号２１）
ＦＡＤ３−１ｋ ＳｍａＲ：５’−ＧＣＣＣＣＧＧＧＴＡＡＴＧＴＧＧＴＧＡＡＧＡＡＡＧＧＧＴＴＴＧ−３’（配列番号２２）

（プロモーター候補ＤＮＡ断片を植物形質転換用ベクターへの組み換え）
ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動にて分離した。ＰＣＲ産物をＤＭＴ ＧＫＯ１ Ｇｅｔ Ｐｕｒｅ ＤＮＡ Ｋｉｔ （Ｄｏｊｉｎｄｏ）で回収した。ベクターｐＣＲ ｂｌｕｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をセルフライゲーションにより環状にし、さらに制限酵素ＥｃｏＲＶで処理した。ＰＣＲ産物と酵素処理したベクターとをモル比で約３：１となるように混合し、さらに混合液と同量のｌｉｇａｔｉｏｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＴＡＫＡＲＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ）を加え、１６℃、３時間反応させた。コンピテントセル（Ｅ．ｃｏｌｉ ＸＬ１ ｂｌｕｅ）にライゲーション溶液を１μＬ入れ、エレクトロポーレーション法によってＤＮＡを導入した。

エレクトロポーレーション後は、ＳＯＣ培地１ｍＬに菌を移し、３７℃で１時間振盪した後、ＬＢプレートにまいた。ＬＢプレートには、予めカナマイシン（Ｋｍ）が終濃度５０μｇ／ｍＬ、イソプロピル−ｂ−Ｄ−ラクトピラノシド（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−ｂ−Ｄ−ｔｈｉｏ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ＩＰＴＧ））が終濃度１ｍＭになるように加えた。コンピテントセルをまいてから、３７℃で１４〜１６時間培養した。コロニーからアルカリ抽出法によりプラスミドを得た。得られたサブクローンされたＤＮＡ断片について、必要があればＴｈｅｒｍｏ ｓｅｑｕｅｎａｓｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｌａｂｅｌｅｄ Ｐｒｉｍｅｒ ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔ （Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いたシーケンスにより、核酸配列を確認した。

得られたプラスミドを制限酵素ＳａｌＩ／ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＳａｌＩ、又はＨｉｎｄＩＩＩ／ＳｍａＩで処理し、アガロースゲル電気泳動にて分離し、ＤＮＡ断片をＤＭＴ ＧＫＯ１ Ｇｅｔ Ｐｕｒｅ ＤＮＡ Ｋｉｔ （Ｄｏｊｉｎｄｏ）で回収した。回収したＤＮＡ断片をそれぞれＨｉｎｄＩＩＩ／ＳａｌＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＢａｍＨＩ又はＨｉｎｄＩＩＩ／ＳｍａＩで処理した植物形質転換用ベクターｐＢＩ１０１に導入した。

ＤＮＡ断片が導入された組み換えベクターの部分的模式図を図２に示す。図２中ＮＴＰＩＩはカナマイシン耐性遺伝子、ＮＯＳはノパリン合成酵素のポリアデニル化シグナルである。図２中のプロモーター部分に、１７のプロモーター候補がそれぞれ導入されていた。ベクターにおいてプロモーター候補はβーグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）構造遺伝子の上流側に隣接して位置するため、プロモーター候補がプロモーターとして機能する場合、ＧＵＳ構造遺伝子の発現を制御することとなる。

（組み換えベクターを植物細胞への導入による形質転換体の作製及び育成）
上記得られた組み換えベクターはまず、エレクトロポーレーション法によってアグロバクテリウムＧＶ３１０１に遺伝子導入した。次に、アグロバクテリウムＧＶ３１０１を用いてフローラルディップ法によりシロイヌナズナ（Ｃｏｌｏｍｂｉａ）を形質転換した。形質転換は、組み換えベクターを持つアグロバクテリウムＧＶ３１０１を、１００μＬ／ｍＬリファンピシン及び５０μＬ／ｍＬカナマイシンを含むＬＢ培地８０ｍＬに移し、２８℃で１６時間振盪培養した。得られた培養液を遠心して菌体を沈殿させて上清を捨て、４０ｍＬ浸潤用懸濁液（１／２Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ−Ｓｋｏｏｇ塩、１／２Ｇａｍｂｏｒｇ Ｂ５ビタミン、５％スクロース、４４ｎＭベンジルアミノプリン、０．０２％ｓｉｌｗｅｔ Ｌ−７７，ｐＨ５．７）に懸濁した。シロイヌナズナの鉢を逆さにして、花芽をアグロバクテリウムの懸濁液に２分間つけた。植物を懸濁液から取り出して水洗し、約３〜４週間で種子の収穫をすることにより、形質転換したシロイヌナズナ種子を得た。

得られた形質転換された種子は、５０％ブリーチ（次亜塩素酸）に１０分間浸水後、滅菌水で３〜５回水洗することにより表面滅菌した。表面滅菌後の種子を０．１％の滅菌寒天溶液に懸濁後、選択プレート培地（１／２Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ−Ｓｋｏｏｇ塩、Ｇａｍｂｏｒｇ Ｂ５ビタミン、１％スクロース、３０ｍｇ／ｍｌカナマイシン、０．２％ゲランガム）にまいて、２３℃で２週間静置培養して生育してくる植物体を選択することにより形質転換体を得た。

得られた形質転換植物の莢（種子を含む）を、開花後４、１０及び１５日目、又は３及び１４日目に採取し、ＧＵＳ染色によってプロモーター活性を検討した。ＧＵＳ染色は、染色対象のサンプルを９０％アセトンに３０−４５分浸漬し（氷上）、その後ＧＵＳ染色液に浸漬し、バキューム装置によって組織に浸透させ、３７℃で一晩静置することによって行った。また、観察に際しては、染色を行ったサンプルを７０％エタノールに移した後、エタノール／酢酸（６：１）溶液に浸漬することによって、クロロフィル色素を除去した。さらに７０％エタノール液に戻した後、実体顕微鏡にて観察した。

開花後莢及び種子におけるＧＵＳ染色の結果は図３〜７及び表１に示した。図３〜７及び表１からは、ＡＣＣａｓｅ各サブユニット遺伝子に対するプロモーター候補のうち、５’ＵＴＲを有しないものは、下流遺伝子を発現させることはできなかったが、５’ＵＴＲを有するものは下流遺伝子を発現させることができた。一方、ＦＡＥ１及びＦＡＤ３の翻訳開始上流領域の約１ｋｂｐＤＮＡ断片は下流遺伝子を発現させることができた。ＡＣＣａｓｅの各サブユニット遺伝子の５’ＵＴＲは下流遺伝子の発現の制御に重要な役割を果たしていることが示唆された。

ＡＣＣａｓｅ各サブユニット遺伝子におけるプロモーター候補領域の模式図は図８に示した。そのうち、ＷＲＩ１は、登熟期において炭素源の貯蔵油脂の合成への流れを制御するとの報告があるため（非特許文献２）、５’ＵＴＲにおけるＷＲＩ１結合配列はプロモーター活性を有するために不可欠であると推測される。一方、５’ＵＴＲではなく、転写開始上流領域におけるＷＲＩ１結合配列は必ずしも必要でないことは本実施例によって証明された。

実施例２ ＦＡＥ１−１ｋとＢＣＣＰ２−５’ＵＴＲとの連結プロモーターの作製
（ＢＣＣＰ２−５’ＵＴＲの単離）
シロイヌナズナのゲノミックＤＮＡを鋳型として、以下のプライマーを用いて、ＰＣＲ法によってＢＣＣＰ２上流の１９２ｂｐのＤＮＡ断片（ＢＣＣＰ２−５’ＵＴＲ）の増幅を行った。ＰＣＲは、９８℃２分の後、９８℃１０秒、５５℃１５秒、７２℃１分を３５サイクルし、最後に７２℃５分で行った。
ＢＣＣＰ２−５’ＵＴＲ ＸｈｏＩ Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ：
５’−ＧＣＧＣＴＣＧＡＧＡＣＡＡＡＡＧＧＡＧＣＧＧＴＴＴＧＧ−３’（配列番号２４）
ＢＣＣＰ２−５’ＵＴＲ ＳａｌＩ Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ：
５’−ＧＣＧＧＴＣＧＡＣＴＧＡＣＧＣＣＡＴＴＧＴＴＧＡＧＡＣ−３’（配列番号２５）

実施例１と同様に、ＰＣＲ産物をベクターｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にライゲーションし、コンピテントセル（Ｅ．ｃｏｌｉ ＸＬ１ ｂｌｕｅ）に導入した。さらに、コンピテントセルをカナマイシン（Ｋｍ）によって選択し、培養したコロニーからアルカリ抽出法によりプラスミドを得た。得られたサブクローンされたＤＮＡ断片について、Ｔｈｅｒｍｏ ｓｅｑｕｅｎａｓｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｌａｂｅｌｅｄ ｒｉｍｅｒ ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔ （Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いたシーケンスによって核酸配列を確認した（配列番号２）。さらに、得られたプラスミドを制限酵素ＸｈｏＩ及びＳａｌＩで処理し、アガロースゲル電気泳動にて分離した約２００ｂの断片をＤＭＴ ＧＫＯ１ Ｇｅｔ Ｐｕｒｅ ＤＮＡ Ｋｉｔ（Ｄｏｊｉｎｄｏ）で回収し、ＢＣＣＰ２−５’ＵＴＲとした。

（ＦＡＥ１−１ｋとＢＣＣＰ２−５’ＵＴＲとの連結）
ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ ＳＫ＋をＨｉｎｄＩＩＩ／ＳａｌＩで処理し、上記実施例１の（１６）でＨｉｎｄＩＩＩ／ＳａｌＩによって処理して得られたＦＡＥ１−１ｋ断片及び上記得られたＢＣＣＰ２−５’ＵＴＲ断片を、制限酵素処理したベクターに対してそれぞれモル比で約３：１となるようにベクターと混合し、さらに混合液と同量のｌｉｇａｔｉｏｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＴＡＫＡＲＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ）を加え、１６℃、３時間反応させた。コンピテントセル（Ｅ．ｃｏｌｉ ＸＬ１ ｂｌｕｅ）にライゲーション溶液を１μＬ入れ、エレクトロポーレーション法によってＤＮＡを導入した。

エレクトロポーレーション後は、ＳＯＣ培地１ｍＬに菌を移し、３７℃で１時間振盪した後、ＬＢプレートにまいた。ＬＢプレートには、予めアンピシリン（Ａｍｐ）が終濃度５０μｇ／ｍＬ加えてあり、さらに１００ｍＭイソプロピル−ｂ−Ｄ−ラクトピラノシド（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−ｂ−Ｄ−ｔｈｉｏ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ＩＰＴＧ））３０μＬ、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ｂ−Ｄ−ガラクトピラノシド（５−ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｌｙｌ−ｂ−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ （Ｘ−ｇａｌ）２５μＬを塗布した。

コンピテントセルをまいてから、３７℃で１４〜１６時間培養した。コロニーからアルカリ抽出法によりプラスミドを得た。得られたサブクローンされたＤＮＡ断片について、Ｔｈｅｒｍｏ ｓｅｑｕｅｎａｓｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｌａｂｅｌｅｄｐｒｉｍｅｒ ｃｙｃｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔ （Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いたシーケンスにより、ＦＡＥ１−１ＫとＢＣＣＰ２−５’ＵＴＲとの連結部分の配列が正しいことを確認した。連結されたプロモーターの配列を配列番号３に示す。配列番号３に記載の配列において、１，２０８〜１，２１３番目の核酸（ＧＴＣＧＡＧ）はＦＡＥ１−１ｋとＢＣＣＰ２−５’ＵＴＲとを連結する部位である。

（バイナリーベクターの構築）
上記得られた連結プロモーターを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＳａｌＩで処理し、アガロースゲル電気泳動にて分離し、約１．４ｋｂのＤＮＡ断片をＤＭＴ ＧＫＯ１ Ｇｅｔ Ｐｕｒｅ ＤＮＡ Ｋｉｔ （Ｄｏｊｉｎｄｏ）で回収した。ｐＢＩ１０１をＨｉｎｄＩＩＩ及びＳａｌＩで処理し、回収した約１．４ｋｂの断片を導入した。これをｐＣｈｉｍＰｒｏと命名した。

ｐＣｈｉｍＰｒｏにおいて、ＦＡＥ１−１ＫとＢＣＣＰ２−５’ＵＴＲとの連結プロモーターはβーグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）構造遺伝子の上流側に隣接して位置し、連結プロモーターがプロモーターとして機能する場合、ＧＵＳ構造遺伝子の発現を制御することとなる。

（形質転換体の作製及び育成）
実施例１と同様にして、ｐＣｈｉｍＰｒｏによって形質転換したシロイヌナズナ種子を得、種子を培養して生育してくる植物体を選択することにより形質転換体を得た。

得られた形質転換植物の莢（種子を含む）を、開花後４，８，１０，１５日目に採取し、実施例１と同様にＧＵＳ染色によってプロモーター活性を検討した。対照として、ＢＣＣＰ２−３００＋５’ＵＴＲをＧＵＳ遺伝子の上流に挿入したものが導入されているシロイヌナズナ、及び、ＦＡＥ１−１ｋをＧＵＳ遺伝子の上流に挿入したものが導入されているシロイヌナズナの莢及び種子におけるＧＵＳ染色も行った。

開花後莢及び種子におけるＧＵＳ染色の結果は図９に示した。その結果、ＢＣＣＰ２−３００＋５’ＵＴＲは、開花後８日目あたりに強い活性を示し、１５日目には活性が見られなくなった。一方、ＦＡＥ１−１Ｋは開花後１０日目あたりから活性がみられ、１５日には強い活性が見られた。これらに対して、ＦＡＥ１−１ＫとＢＣＣＰ２−５’ＵＴＲの連結プロモーターは、開花後８日目から少なくとも１５日目まで強い活性を示した。ＦＡＥ１−１ＫとＢＣＣＰ２−５’ＵＴＲとの連結プロモーターは、ＦＡＥ１−１ＫとＢＣＣＰ２−５’ＵＴＲとの両方の活性を併せ持つことが示された。このプロモーターの下流に例えばＡＣＣａｓｅやＴＡＧ１を導入し、植物細胞に形質転換した場合、登熟早期から後期に渡って遺伝子を発現させることができ、それによって植物油脂の合成量の増加が期待できる。

Claims (7)

1. ＦＡＥ１及びＦＡＤ３からなる群より選択される１つの遺伝子の翻訳開始上流１，０００ｂのうちの５００ｂ以上の連続的配列を有する、第１の核酸と、
   ＢＣＣＰ１、ＢＣＣＰ２、ＣＴα及びＢＣからなる群より選択される１つの遺伝子の５’上流非翻訳領域のうちの、少なくとも１つのＷＲＩ１結合配列を含み、かつ、１００ｂ以上の連続的配列を有する、第２の核酸と
   が連結してなる、プロモーター。
2. 前記第２の核酸が、ＢＣＣＰ１、ＢＣＣＰ２、ＣＴα及びＢＣからなる群より選択される１つの遺伝子の、
   （１）５’上流非翻訳領域のうちの、少なくとも１つのＷＲＩ１結合配列を含み、かつ、１００ｂ以上の連続的配列、及び
   （２）転写開始上流２００ｂ以上の配列
   を有する、請求項１に記載のプロモーター。
3. 配列番号１に記載の塩基配列を有する核酸と、配列番号２に記載の塩基配列を有する核酸とが連結してなる、プロモーター。
4. 配列番号３に記載の塩基配列を有する、プロモーター。
5. 請求項１〜４のいずれか一項に記載のプロモーターを含む、植物形質転換用ベクター。
6. 請求項５に記載の植物形質転換用ベクターが導入される、種子。
7. 請求項６に記載の種子を育成して得られる、植物。