JP5594683B2 - プロモーター - Google Patents
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Description
(PCRによるプロモーター候補DNA断片の増幅)
シロイヌナズナ(Arabidopsis Columbia)のゲノミックDNAを鋳型として、下記に示すプライマーを用いて、PCR法によって、脂肪酸合成関連酵素遺伝子ACCaseの各サブユニット(CTα、BCCP1、BCCP2、及びBC)、並びに、TAG合成関連酵素遺伝子のFAE1及びFAD3の上流領域から以下のプロモーター候補DNA断片を増幅した。一部のプロモーター候補の模式図は図1に示す。PCRは、98℃2分の後、98℃10秒、55℃15秒、72℃1分を35サイクルし、最後に72℃5分で行った。
BCCP1−1k SalF:5’−GCGTCGACTTTGTTCTTCTTTTTCCG−3’(配列番号4)
BCCP1−1kt BamR:5’−GCGGATCCAGAAGATGTCGGATTCGG−3’(配列番号5)
(2)BCCP1−1k+BCCP1上流の5’非翻訳領域の110b(BCCP1−5’UTR)
BCCP1−1k SalF:5’−GCGTCGACTTTGTTCTTCTTTTTCCG−3’(配列番号4)
BCCP1p BamR:5’−GCGGATCCTCGTCTTCTTATTGTTATTG−3’(配列番号6)
(3)BCCP1転写開始上流領域500bのDNA断片(BCCP1−500)+BCCP1−5’UTR
BCCP1−500b SalF:5’−GCGTCGACGATGCATTTTGTTTATAG−3’(配列番号7)
BCCP1p BamR:5’−GCGGATCCTCGTCTTCTTATTGTTATTG−3’(配列番号6)
(4)BCCP1転写開始上流領域296bのDNA断片(BCCP1−300)+BCCP1−5’UTR
BCCP1−300b SalF:5’−GCGTCGACAATTGGAGACACCGACAG−3’(配列番号8)
BCCP1p BamR:5’−GCGGATCCTCGTCTTCTTATTGTTATTG−3’(配列番号6)
BCCP2−1k SalF:5’−GCGTCGACATCAGACAAAAGAGAGACAAC−3’(配列番号9)
BCCP2t BamR:5’−GCGGATCCCCAAACCGCTCCTTTTGTC−3’(配列番号10)
(6)BCCP2−1k+BCCP2上流の5’非翻訳領域の192b(BCCP2−5’UTR)
BCCP2−1k SalF:5’−GCGTCGACATCAGACAAAAGAGAGACAAC−3’(配列番号9)
BCCP2p BamR:5’−GCGGATCCTGTTGAGACAGTGGACGATG−3’(配列番号11)
(7)BCCP2転写開始上流領域800bのDNA断片(BCCP2−800)+BCCP2−5’UTR
(6)で得られたBCCP2−1k+BCCP2−5’UTRのPCR断片を後述の方法にてpCR BluntのEcoRVサイトに導入した後、PstI/BamHI制限酵素でDNA断片を切り出し、再びpBSKのPstI/BamHIサイトに導入し、HindIII/BamHI制限酵素で処理して得たDNA断片をBCCP2−800+BCCP2−5’UTRとした。BCCP2−800+BCCP2−5’UTRを後述の方法によってpBI101のHindIII/BamHIサイトに導入した。
(8)BCCP2転写開始上流領域318bのDNA断片(BCCP2−300)+BCCP2−5’UTR
BCCP2−300b SalF:5’−GCGTCGACTATCTGCATTTACTGAAG−3’(配列番号12)
BCCP2p BamR:5’−GCGGATCCTGTTGAGACAGTGGACGATG−3’(配列番号11)
CTα−1k SalF:5’−GCGTCGACTAATACCCTTATTAAAGGCC−3’(配列番号13)
CTαt BamR:5’−GCGAATCCATCCTTCCTTGCCAATTG−3’(配列番号14)
(10)CTα転写開始上流領域608bのDNA断片(CTα−600)
(9)で得られたCTα1kのPCR断片を後述の方法によってpCR BluntのEcoRVサイトに導入した後、PstI/BamHI制限酵素でDNA断片を切り出し、再びpBluescriptII SK+のPstI/BamHIサイトに導入し、HindIII/BamHI制限酵素で処理して得たDNA断片をCTα−600とした。CTα−600を後述の方法によってpBI101のHindIII/BamHIサイトに導入した。
(11)CTα−1k+CTα上流の5’非翻訳領域の450b(CTα−5’UTR)
CTα−1k SalF:5’−GCGTCGACTAATACCCTTATTAAAGGCC−3’(配列番号13)
CTαp BamR:5’−GCGGATCCTTTTTGCGTTGAGTTCTT−3’(配列番号15)
(12)CTα転写開始上流領域251bのDNA断片(CTα−250)+CTα−5’UTR
(11)で得られたCTα−1k+CTα−5’UTRのPCR断片を後述の方法によってpCR BluntのEcoRVサイトに導入した後、SmaI/BamHI制限酵素でDNA断片を切り出し、再びpBluescriptII SK+のEcoRV/BamHIサイトに導入し、HindIII/BamHI制限酵素で処理して得たDNA断片をCTα−250+CTα−5’UTRとした。CTα−250+CTα−5’UTRは後述の方法によってpBI101のHindIII/BamHIサイトに導入した。
BC−1k SalF:5’−GCGTCGACTAATATATCTTCTTATGAC−3’(配列番号16)
BCt BamR:5’−GCGGATCCCTTGAATCCTCCGCCCGACTG−3’(配列番号17)
(14)BC−1k+BC上流の5’非翻訳領域の142b(BC−5’UTR)
BC−1k SalF:5’−GCGTCGACTAATATATCTTCTTATGAC−3’(配列番号16)
BCp BamR:5’−GCGGATCCTTTCCAAATGCAGGAGGC−3’(配列番号18)
(15)BC転写開始上流領域203bのDNA断片(BC−200)+BC−5’UTR
(14)で得られたBC1kp+ BCα5’UTRのPCR断片をpCR BluntのEcoRVサイトに導入した後、HindII/BamHI制限酵素で切り出して得られたDNA断片をBC−200+BC−5’UTRとした。BC−200+BC−5’UTRは後述の方法によってpBI101のHindIII/BamHIに導入した。
まず、下記のプライマーを用いて、FAE1翻訳開始上流領域1,998bのDNA断片を増幅した(配列番号23)。
FAE1−2k SalF:5’−CGTCGACGGATCCCGGATTCTATTCACTCTATC−3’(配列番号19)
FAE1 SalR:5’−GTCGACTCTGTTTGTGTCGGAAAATAATGG−3’(配列番号20)
次に、得られた約2kbのPCR断片をpCR BluntのEcoRVサイトに導入した後、HindIII/SalI制限酵素で処理して得られたDNA断片をFAE1−1kとした(配列番号1)。
(17)FAD3翻訳開始上流領域983bのDNA断片(FAD3−1k)
FAD3−1k HindF:5’−CGAAGCTTTTTGCTCGATTTGTGTTG−3’(配列番号21)
FAD3−1k SmaR:5’−GCCCCGGGTAATGTGGTGAAGAAAGGGTTTG−3’(配列番号22)
PCR産物をアガロースゲル電気泳動にて分離した。PCR産物をDMT GKO1 Get Pure DNA Kit (Dojindo)で回収した。ベクターpCR blunt(Invitrogen)をセルフライゲーションにより環状にし、さらに制限酵素EcoRVで処理した。PCR産物と酵素処理したベクターとをモル比で約3:1となるように混合し、さらに混合液と同量のligation solution(TAKARA Ligation kit)を加え、16℃、3時間反応させた。コンピテントセル(E.coli XL1 blue)にライゲーション溶液を1μL入れ、エレクトロポーレーション法によってDNAを導入した。
上記得られた組み換えベクターはまず、エレクトロポーレーション法によってアグロバクテリウムGV3101に遺伝子導入した。次に、アグロバクテリウムGV3101を用いてフローラルディップ法によりシロイヌナズナ(Colombia)を形質転換した。形質転換は、組み換えベクターを持つアグロバクテリウムGV3101を、100μL/mLリファンピシン及び50μL/mLカナマイシンを含むLB培地80mLに移し、28℃で16時間振盪培養した。得られた培養液を遠心して菌体を沈殿させて上清を捨て、40mL浸潤用懸濁液(1/2Murashige−Skoog塩、1/2Gamborg B5ビタミン、5%スクロース、44nMベンジルアミノプリン、0.02%silwet L−77,pH5.7)に懸濁した。シロイヌナズナの鉢を逆さにして、花芽をアグロバクテリウムの懸濁液に2分間つけた。植物を懸濁液から取り出して水洗し、約3〜4週間で種子の収穫をすることにより、形質転換したシロイヌナズナ種子を得た。
(BCCP2−5’UTRの単離)
シロイヌナズナのゲノミックDNAを鋳型として、以下のプライマーを用いて、PCR法によってBCCP2上流の192bpのDNA断片(BCCP2−5’UTR)の増幅を行った。PCRは、98℃2分の後、98℃10秒、55℃15秒、72℃1分を35サイクルし、最後に72℃5分で行った。
BCCP2−5’UTR XhoI Forward primer:
5’−GCGCTCGAGACAAAAGGAGCGGTTTGG−3’(配列番号24)
BCCP2−5’UTR SalI Reverse primer:
5’−GCGGTCGACTGACGCCATTGTTGAGAC−3’(配列番号25)
ベクターpBluescriptII SK+をHindIII/SalIで処理し、上記実施例1の(16)でHindIII/SalIによって処理して得られたFAE1−1k断片及び上記得られたBCCP2−5’UTR断片を、制限酵素処理したベクターに対してそれぞれモル比で約3:1となるようにベクターと混合し、さらに混合液と同量のligation solution(TAKARA Ligation kit)を加え、16℃、3時間反応させた。コンピテントセル(E.coli XL1 blue)にライゲーション溶液を1μL入れ、エレクトロポーレーション法によってDNAを導入した。
上記得られた連結プロモーターを制限酵素HindIII及びSalIで処理し、アガロースゲル電気泳動にて分離し、約1.4kbのDNA断片をDMT GKO1 Get Pure DNA Kit (Dojindo)で回収した。pBI101をHindIII及びSalIで処理し、回収した約1.4kbの断片を導入した。これをpChimProと命名した。
実施例1と同様にして、pChimProによって形質転換したシロイヌナズナ種子を得、種子を培養して生育してくる植物体を選択することにより形質転換体を得た。
Claims (7)
- FAE1及びFAD3からなる群より選択される1つの遺伝子の翻訳開始上流1,000bのうちの500b以上の連続的配列を有する、第1の核酸と、
BCCP1、BCCP2、CTα及びBCからなる群より選択される1つの遺伝子の5’上流非翻訳領域のうちの、少なくとも1つのWRI1結合配列を含み、かつ、100b以上の連続的配列を有する、第2の核酸と
が連結してなる、プロモーター。 - 前記第2の核酸が、BCCP1、BCCP2、CTα及びBCからなる群より選択される1つの遺伝子の、
(1)5’上流非翻訳領域のうちの、少なくとも1つのWRI1結合配列を含み、かつ、100b以上の連続的配列、及び
(2)転写開始上流200b以上の配列
を有する、請求項1に記載のプロモーター。 - 配列番号1に記載の塩基配列を有する核酸と、配列番号2に記載の塩基配列を有する核酸とが連結してなる、プロモーター。
- 配列番号3に記載の塩基配列を有する、プロモーター。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載のプロモーターを含む、植物形質転換用ベクター。
- 請求項5に記載の植物形質転換用ベクターが導入される、種子。
- 請求項6に記載の種子を育成して得られる、植物。
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