KR20230129379A - 바이러스에 영향받은 조성물 및 암 치료를 위해 이를 사용하여 기존 면역 반응을 재지향시키는 방법 - Google Patents

바이러스에 영향받은 조성물 및 암 치료를 위해 이를 사용하여 기존 면역 반응을 재지향시키는 방법 Download PDF

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Abstract

바이러스-영향받은 조성물 및 이의 제조 방법이 개시되되, 조성물은 캡시드 백본을 자발적으로 형성하고 에피토프를 포함하는 펩타이드에 접합되어 면역 재지향자 캡시드(IRC)를 형성하는 돌연변이 유두종바이러스 L1 단백질을 포함한다. 펩타이드 상의 에피토프는 감염 또는 백신접종을 통해 대상체가 에피토프에 과거에 노출된 것으로부터 발달된 대상체의 기존 면역 기억에 기초하여 대상체의 면역 시스템에 의해 인식되도록 설계된다. 돌연변이 유두종바이러스 L1 단백질은 아미노-말단 절단, 카복시-말단 절단 및 나선 4에서의 절단을 포함하는 3개의 돌연변이를 갖는다. L1 단백질의 이러한 돌연변이는 비정규 T=1 기하학적 캡시드 백본을 형성하는 캡소미어를 산출한다. 필요로 하는 대상체에서 암을 치료 및/또는 예방함에 있어서 조성물의 용도 및 사용 방법이 개시된다.

Description

바이러스에 영향받은 조성물 및 암 치료를 위해 이를 사용하여 기존 면역 반응을 재지향시키는 방법
발명의 기술분야
캡시드 백본을 형성하고 대상체의 기존 면역계 반응 기억에 의해 인식되는 하나 이상의 항원을 포함하는 하나 이상의 펩타이드에 부착되는 돌연변이된 유두종바이러스 단백질, 특히 L1 주요 캡시드 단백질을 포함하는 조성물, 및 대상체의 암의 치료, 예방 및/또는 암의 발병률 감소에서의 사용 방법이 개시된다.
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2020년 10월 19일자로 출원된 미국 특허 가출원 일련 번호 63/093,525 및 2021년 7월 10일자로 출원된 미국 특허 가출원 일련 번호 63/220,485에 대한 우선권을 주장하며, 각각의 전체 내용은 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
서열 목록의 포함
본 출원은 컴퓨터 판독 가능 형식(CRF)으로 제출된 서열 목록을 포함한다. 서열 목록의 종이 사본과 CRF는 동일하며 본 명세서에 참조에 의해 원용된다. 서열 목록은 2021년 10월 19일자로 생성된 "2021-10-19 8005US_ST25.txt"라는 명칭의 하나의 파일을 포함하고, 그 크기는 64KB이다.
전형적인 암 치료는 화학요법, 방사선 및 수술을 포함한다. 그러나, 수술은 매우 침습적이고, 특히 전이 후 흔히 실패한다. 화학요법 및 방사선은 효과적일 수 있지만, 대상체의 삶의 질을 심하게 저감시키는 가혹한 부작용을 초래한다. 이러한 치료에도 불구하고, 많은 암이 치료에 불응성인 채로 있고, 치료가 원발성 종양을 감소 또는 제거하는 데 성공적인 경우에도 전이성 암의 퇴치에 효과가 없을 수 있다. 표적화된 전달은 암 치료를 개선하기 위한 가장 유망한 기회 중 하나로 되었지만, 이러한 접근법은 또한 가장 어려운 과제를 제시한다. 암 백신과 같은 면역요법은 면역계를 자극한 다음 이 반응을 사용하여 암 세포의 표면에 우선적으로 존재하는 과발현된 단백질을 특이적으로 표적화하여, 암 세포의 표적화된 제거를 일으키는 능력으로 인해 매력적인 옵션으로서 부상하였다. 이러한 요법은 표적 특이적이며 비특이적 자가 면역 없이 잠재적으로 덜 독성이라는 점에서 매력적이다. 이러한 표적 요법은 또한 수술, 방사선 또는 화학요법에 비해 덜 침습적이거나 외상이 적은 것으로 간주된다. 그러나 암-연관 항원을 기반으로 하는 암 백신은, 예를 들어, 불량한 임상 면역원성, 면역 관용 및 비표적 효과로 인해 제한적인 성공을 거둘 수 있다. 게다가, 그러한 방법은 전형적으로 암의 효과적인 표적화를 달성하기 위해 주어진 환자의 암에 특이적인 암-연관 항원을 식별하는 것을 필요로 한다. 따라서, 이 접근법은 대부분의 암-연관 항원이 면역계에서 허용되는 자가-항원이어서 불량한 면역 반응을 초래하기 때문에 여러 경우에 실패하였다.
암 치료 및 예방에 대한 다른 접근법은 키메라 항원 수용체(CAR)-형질도입된 T 세포(CAR-T)의 입양 전달 또는 암-특이적 항원의 힘든 식별을 필요로 하는 단일 클론 항체의 주입을 기반으로 하며 암 유형 또는 하위유형의 하위집합에만 적용할 수 있다. 마지막으로, 생체외에서 확장된 종양-특이적 림프구의 입양 전달은 자연 발생 항종양 반응을 이용하는 것을 목표로 하는 방법론이다. 이러한 모든 접근법은 유사하게 고도로 개인화되고 대상체의 특정 암의 식별 암 에피토프 및/또는 생체외 환자 자가 세포의 확장을 필요로 한다. 중요하게도, 황금 표준 동물 모델에서 이러한 특정 암 항원 접근법에 의해 입증된 성공이 항상 인간에게 전환 가능한 것은 아니다. 마지막으로 덧붙일 중요한 것으로, 암을 앓고 있는 모든 환자가 종양에서 동일한 항원을 발현하는 것은 아니므로, 이러한 접근법의 광범위한 적용 가능성에 몇 가지 중요한 제한이 있다.
개별화된 표적 치료 및 암 제거 문제에 대한 해결책은 그 자체로 바이러스 감염 이력의 형태로 제시된다. 이러한 접근법에서, 대상체의 감염 이력은 세포독성 기억 T-세포를 통해 과거 바이러스 감염 면역 반응을 재개시키는 데 사용된다. 과거의 바이러스 감염에 기초한 이러한 요법은 대상체 자신의 면역학적 기억에 의해 인식되는 에피토프를 암 세포에 침착시킴으로써 특정 암을 표적화하도록 정밀하게 조정될 수 있다. 바이러스 L1 단백질은 암 세포 표적에 에피토프 표지를 전달하기 위한 주요 기능을 제공함으로써, 대상체 자신의 기존 면역계 성분을 모집하고 활성화하여 표지된 암 세포를 표적화하고 제거한다.
마우스 유두종바이러스 L1 단백질은 보다 양호한 더욱 개인화된 암 치료에 대한 이러한 지속적인 요구를 해결하기 위한 좋은 후보이다. 마우스 유두종바이러스 L1 단백질에서의 특정 돌연변이가 전형적으로, 예를 들어, 인유두종바이러스(HPV)로 형성된 것과 같은 바이러스 L1 단백질에 의해 형성된 정상 T=7 캡시드보다 작은 열두(12)개의 캡소미어(capsomere)로 구성된 캡시드 백본이라고 하는 더 작은 크기의 T=1 바이러스 캡시드의 형성을 유도한다는 것이 우연히 발견되었다. 이러한 더 작은 크기의 캡시드 백본은 매우 안정적이어서, 더 높은 접합 효율을 허용하고, 더 작은 크기로 인해 침윤성 고형 종양 또는 종양 미세환경에서 더 적은 입체 장애를 제시한다.
다양한 실시형태에서, 복수의 돌연변이 마우스 유두종바이러스 L1 단백질을 포함하는 조성물이 개시된다. 조성물은 하나 이상의 펩타이드는 각각 유두종바이러스과(Papillomaviridae) 항원성 펩타이드 이외의 하나 이상의 병원체로부터의 하나 이상의 에피토프를 각각 포함하는 하나 이상의 펩타이드를 더 포함한다. 유두종바이러스과 L1 단백질의 돌연변이된 아미노산 서열은 야생형 L1 단백질 서열에 대해서 적어도 다음의 돌연변이: (a) 아미노-말단으로부터 적어도 5개의 아미노산 잔기의 결실 및 (b) 나선 4 영역으로부터 적어도 10개의 아미노산 잔기의 결실을 포함한다. 하나 이상의 펩타이드는 복수의 바이러스 단백질에 부착된다. 복수의 바이러스 단백질은 종양 세포에서 발현되는 프로테오글리칸에 결합하는 삼각화 수(triangulation number) T가 1인 이십면체 또는 십이면체 캡시드 백본을 형성하도록 자발적으로 조립된다. 따라서, 조성물은 복수의 돌연변이 유두종바이러스과 단백질 및 하나 이상의 이러한 펩타이드를 포함한다. 달리 말하면, 조성물은 복수의 돌연변이 유두종바이러스과 L1 단백질에 부착된 하나 이상의 펩타이드를 포함한다.
일부 실시형태에서 돌연변이 L1 단백질은 L1 단백질의 카복시 말단으로부터 적어도 30개의 아미노산 잔기의 결실을 더 포함한다. 일부 실시형태에서 펩타이드는 돌연변이 유두종바이러스과 L1 단백질과 펩타이드의 잔기 사이의 다이설파이드, 말레이미드, 또는 아마이드 결합을 통해서 L1 단백질에 접합된다.
일부 실시형태에서 L1 단백질의 적어도 25% 내지 85% (w/w)가 펩타이드 중 적어도 하나에 부착된다. 일부 실시형태에서 펩타이드는 또한 선택적으로 퓨린 절단 서열, 기질 금속프로테아제 절단 서열, 또는 디스인테그린 및 메탈로프로테아제(ADAM) 절단 서열로부터 선택되 선택된 프로테아제 절단 서열을 포함한다.
에피토프는, 치료될 대상체가 이전에 노출된 적이 있고 대상체가 이에 대해 면역 반응성을 발달시키거나, 재노출 시 대상체의 면역계가 에피토프를 보유하는 세포를 인식하여 공격하도록 이전 노출의 면역 기억을 갖는 항원으로부터 유래되어야 한다는 것 외에는 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 에피토프는 소아 백신으로부터 유래될 수 있다. 다른 경우에, 에피토프는 대상체가 회복된 과거 병원성 감염으로부터 유래될 수 있다.
면역 재지향자 캡시드(immune redirector capsid: IRC) 분자를 포함하는 조성물은 세포 표면에 위치된 헤파린 설페이트 프로테오글리칸에 결합한다. IRC 분자는 T=7 캡시드를 형성하지 않는다. 일부 실시형태에서, 돌연변이 L1 단백질은 마우스 L1 단백질로부터 유래된다.
본 명세서에서 고려되는 것은, 대상체에게 약제학적 유효량의 본 명세서에 기재된 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 필요로 하는 대상체에서 암을 치료, 예방 및/또는 암의 발생을 감소시키는 방법이다. 또한, 대상체에게 약제학적 유효량의 본 명세서에 기재된 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 필요로 하는 대상체에서 암 종양 성장, 진행 및/또는 전이를 저해하는 방법이 제공된다. 기재된 방법에서 기재된 조성물의 사용이 또한 본 명세서에서 고려된다.
이러한 방법은, 일부 실시형태에서, 대상체로부터 종양 조직 샘플을 얻는 단계 및 종양 조직 샘플에서 하나 이상의 종양 세포에 의해 발현되는 하나 이상의 MHC 분자의 서열을 종양 조직에서 식별하는 것을 더 포함한다.
소정의 실시형태에서, 하나 이상의 에피토프는 대상체로부터 얻어진 종양 조직 샘플에서 종양 세포에 의해 발현되는 하나 이상의 MHC 분자와 복합체화 가능하다. 이러한 방법에 유용한 약제의 제조를 위한 용도에서와 같이, 기재된 조성물의 2차 용도도 고려된다.
기재된 조성물을 제조하는 방법이 본 명세서에 추가로 제공된다. 방법은 다음과 같은 다양한 단계를 포함한다: (a) 원핵 세포를 L1 단백질의 핵산 서열을 암호화하는 백현 벡터로 형질전환시키는 단계; (b) 형질전환된 원핵 세포를 L1 단백질의 발현을 촉진시키는 조건하에 배양하는 단계; (c) 형질전환된 원핵 세포를 용해시켜 발현된 L1 단백질을 방출시키는 단계; (d) 발현된 L1 단백질로부터 세포 파편을 분리시키고 L1 단백질을 봉입체로서 회수하는 단계; (e) 선택적으로 L1 단백질 봉입체를 세척하는 단계; (f) L1 단백질 봉입체를 가용화시키는 단계; (g) 환원제의 존재하에 리폴딩 완충제에서 L1 단백질을 리폴딩하는 단계; 및 (h) 동일한 리폴딩 완충제에서 삼각화 수 T가 1인 이십면체 또는 십이면체 캡시드를 형성시키는 단계. 이러한 방법은, 일부 실시형태에서, 하나 이상의 펩타이드의 존재 중 환원 조건하에 조립된 L1 단백질을 인큐베이션함으로써 접합 완충제에서 하나 이상의 펩타이드를 조립된 L1 단백질에 접합시키는 단계 및/또는 삼각화 수 T가 1인 상기 이십면체 또는 십이면체 캡시드를 형성할 때 조립 완충제로부터 변성제를 제거하지만 환원제를 유지시키는 단계를 더 포함한다.
이 발명의 내용 부문은 본 개시내용의 전체 범위 및 범주를 대표하는 것으로 의도되지도 않고 해석되어서도 안 된다. 게다가, 본 명세서에서 "본 개시내용" 또는 이의 양상에 대해 이루어지는 언급은, 본 개시내용의 소정의 실시형태를 의미하는 것으로 이해되어야 하며, 반드시 모든 실시형태를 특정 설명으로 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 본 개시내용은 본 발명의 내용 부문뿐만 아니라 첨부된 도면 및 실시형태의 설명에서 다양한 세부 수준으로 제시되며, 본 발명의 내용 부문에서 요소, 성분 등의 포함 또는 비포함에 의해 본 개시내용의 범위에 대한 제한이 의도되지도 않는다. 본 개시내용의 추가의 양상은 특히 도면과 함께 취해질 때 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용 부문으로부터 용이하게 명백해질 것이다
도 1A는 야생형 마우스 유두종바이러스 L1(MPV L1) 및 연관된 영역의 개략적 유전자 지도이다.
도 1B는 함께 조합되어 T=1 이십면체 유두종바이러스 캡시드 백본을 형성하는 다중 카피인 삼중 절단 마우스 유두종바이러스 L1 단백질(MPV.10.34.d)의 개략적 유전자 지도이다.
도 2는 대응하는 인간 HPV16 L1 단백질 서열(서열번호 128)과 정렬된 MusPV L1 단백질 서열(서열번호 127)의 아미노 서열 정렬이다.
도 3은, 형성 시 후속하여 펩타이드에 접합되어 면역 조절 캡시드(IRC)를 형성하는, MPV.10.34.d 캡시드 백본의 제조로 이어지는 방법 단계들의 순서도이다.
도 4A는 제조 과정(도 3 및 실시예 1에 기재된 바와 같음)을 통해서 숙주 세포 단백질 오염물로부터 MPV.10.34.d 캡시드 백본의 증분식 정제를 도시하는 염색된 SDS-PAGE 겔의 사진이며, 이는 숙주 세포 단백질 불순물이 정제 과정 전반에 걸쳐서 상당히 감소되는 것을 입증한다(MW = 표준 분자량 밴드, 겔의 좌측에 있는 숫자는 킬로달톤(kDa)의 분자량을 나타내고, 맨위 행 숫자는 마이크로그램 단위로 로딩된 단백질의 양을 나타낸다).
도 4B는 은 염색이 시행된 SDS-PAGE 겔의 사진이며, 각 레인은 제조 과정(도 3 및 실시예 1에 기재된 바와 같음)을 통해서 숙주 세포 단백질 오염물로부터 정제된 바와 같은 MPV.10.34.d 캡시드 백본의 샘플에 해당하며, 이는 숙주 세포 단백질 불순물이 정제 과정 전반에 걸쳐서 상당히 감소되는 것을 입증한다(MW = 표준 분자량 밴드, 겔의 좌측에 있는 숫자는 킬로달톤(kDa)의 분자량을 나타내고, 맨위 행 숫자는 마이크로그램 단위로 로딩된 단백질의 양을 나타낸다).
도 5는 도 3 및 실시예 1에 기재된 바아 같은 제조 및 정제 단계 후 정제된 MPV.10.34.d 캡시드 백본의 500nm의 스케일 바를 갖는 투과형 전자 현미경(TEM) 이미지의 사진이다. 캡시드 백본은 이 이미지를 기준으로 직경이 대략 20nm 내지 30nm이다.
도 6A는 리폴딩 단계 후이지만 2-칼럼 크로마토그래피 정제 전 MPV.10.34.d 캡시드 백본의 입자 크기 분포의 강도를 나타내는 동적 광 산란 (DLS) 플롯이다. X-축은 직경 크기 분포(nm)를 나타내고, Y-축은 퍼센트 강도 데이터를 제공한다.
도 6B는 리폴딩 단계 후이지만 2-칼럼 크로마토그래피 정제 전 정제된 MPV.10.34.d 캡시드 백본의 집단 크기를 나타내는 동적 광 산란 플롯이다. X-축은 직경 크기 분포(nm)를 나타내고, Y-축은 부피 퍼센트 데이터를 제공한다.
도 7A는 다음이 첨가된 완충제에서 MPV.10.34.d L1 단백질 리폴딩을 나타내는 동적 광 산란 플롯이다: 1mM 다이티오트레이톨(DTT), 1mM 에틸렌다이아민 테트라아세트산(ETDA) 및 1mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드(PMSF). X-축은 직경 크기 분포(nm)를 나타내고, Y-축은 부피 퍼센트 데이터를 제공한다.
도 7B는 1mM DTT가 첨가된 완충제에서 MPV.10.34.d L1 단백질 리폴딩을 나타내는 동적 광 산란 플롯이다. X-축은 직경 크기 분포(nm)를 나타내고, Y-축은 부피 퍼센트 데이터를 제공한다.
도 7C는 1mM ETDA가 첨가된 완충제에서 MPV.10.34.d L1 단백질 리폴딩을 나타내는 동적 광 산란 플롯이다. 화살표는 전체적으로 샘플의 집단 크기를 측정하는 부피 강도 플롯에 의해 검출된 바와 같이 정확하게 리폴딩되지 않은 응집된 단백질을 나타낸다. X-축은 직경 크기 분포(nm)를 나타내고, Y-축은 부피 퍼센트 데이터를 제공한다.
도 7D는 DTT, EDTA 또는 PMSF가 첨가되지 않은 완충제에서 MPV.10.34.d L1 단백질 리폴딩을 나타내는 동적 광 산란 플롯이다. 화살표는 전체적으로 샘플의 집단 크기를 측정하는 부피 강도 플롯에 의해 검출된 바와 같이 정확하게 리폴딩되지 않은 응집된 단백질을 나타낸다. X-축은 직경 크기 분포(nm)를 나타내고, Y-축은 부피 퍼센트 데이터를 제공한다.
도 8A는 1mM DTT, 1mM ETDA 및 1mM PMSF가 첨가된 정확하게 리폴딩된 MPV.10.34.d L1 단백질 리폴딩된 완충제의 포획을 나타내는 크로마토그램이다. Y-축은 좌측에 흡광도 단위(mAU)를, 우측에 mS/cm를 제공하고, X-축은 용출 부피(mL)를 나타낸다.
도 8B는 1mM DTT가 첨가된 정확하게 리폴딩된 MPV.10.34.d L1 단백질 리폴딩된 완충제의 포획을 나타내는 크로마토그램이다. Y-축은 좌측에 흡광도 단위(mAU)를, 우측에 mS/cm를 제공하고, X-축은 용출 부피(mL)를 나타낸다.
도 8C는 1mM ETDA가 첨가된 정확하게 리폴딩된 MPV.10.34.d L1 단백질 리폴딩된 완충제의 포획을 나타내는 크로마토그램이다. 화살표는 불량한 포획 및 용출을 나타내며, 이는 덜 정확하게 리폴딩된 MPV.10.34.d 캡시드 백본이 A 및 B와 비교하여 조건 C 및 D 하에 관찰된 것을 나타낸다. Y-축은 좌측에 흡광도 단위(mAU)를, 우측에 mS/cm를 제공하고, X-축은 용출 부피(mL)를 나타낸다.
도 8D는 DTT, EDTA 또는 PMSF가 첨가되지 않은 완충제 단독의 존재하에 리폴딩된 정확하게 리폴딩된 MPV.10.34.d L1의 포획을 나타내는 크로마토그램이다. 화살표는 불량한 포획 및 용출을 나타내며, 이는 덜 정확하게 리폴딩된 MPV.10.34.d 캡시드 백본이 A 및 B와 비교하여 조건 C 및 D하에 관찰된 것을 나타낸다. Y-축은 좌측에 흡광도 단위(mAU)를, 우측에 mS/cm를 제공하고, X-축은 용출 부피(mL)를 나타낸다.
도 9A는 용출된 MPV.10.34d L1 단백질에 대한 강도(Y-축)에 기초한, 20nm 내지 30nm의 평균 입자 크기를 나타내는 입자 크기(직경, nm) 분포(X-축)를 나타내는 MPV.10.34.d L1 단백질을 나타내는 크로마토그램이다.
도 9B는 용출된 MPV.10.34d L1 단백질에 대한 부피(다른 오염물, 즉, 숙주 박테리아 세포 단백질에 관하여 리폴딩된 단백질의 상대 비율, Y-축)에 기초한, 20nm 내지 30nm의 평균 입자 크기를 나타내는 입자 크기(직경, nm) 분포 (X-축)를 나타내는 MPV.10.34.d L1 단백질을 나타내는 동적 광 산란 플롯이다.
도 9C는 도로 정제된 가용성 발현된 MPV.10.34.d 캡시드 백본을 나타내는 100nm의 스케일 바를 포함하는 투과형 전자 현미경 (TEM) 현미경사진이다.
도 10은 가용성 및 리폴딩된 MPV.10.34.d 캡시드 백본이 상이한 pH 조건하에 동일한 T=1 형태를 갖는 것을 나타내는 리폴딩된 MPV.10.34.d 캡시드 백본에 입체형태적 MPV L1-A4 형태-특이적 단클론성 항체를 결합함으로써 얻어진 ELISA 데이터의 그래프이다. Y-축은 450nm에서의 광학 밀도를 제공하고, X-축은 MPV.10.34.d 캡시드 백본의 양(ng)을 제공한다.
도 11은 IRC, 즉, 접합된 MPV.10.34.d L1 캡시드 백본을 생성하는 단계의 개략적 표현이다.
도 12는 비접합 MPV.10.34.d 캡시드 백본(레인 3) 및 IRC(레인 4)를 나타내는 염색된 SDS-PAGE 겔의 사진을 나타낸다. 레인 1은 분자량 표준을 나타내고 레인 2는 의도적으로 블랭크인 채로 두었다.
도 13은 MPV.10.34.d 캡시드 백본이 야생형 HPV16 캡시드 백본(레인 3)에 비해서 더 높은 정도의 펩타이드 접합(레인 5)을 경험하는 것을 나타내는 염색된 SDS-PAGE 겔의 사진이다. 레인 2 및 4는 각각 비접합 야생형 HPV16 및 MPV.10.34.d 캡시드 백본이다. 레인 1은 분자량 표준을 나타낸다.
도 14는 환원제 대 L1 단백질의 비가 0(비접합 대조군, 레인 2 및 9), 10:1(레인 2 및 10), 100:1(레인 3 및 11) 및 1000:1(레인 4 및 12)로 첨가된 환원제의 존재하에 야생형 HPV16 IRC 또는 MPV.10.34.d IRC 또는 HPV16 캡시드 백본의 샘플을 나타내는 염색된 SDS-PAGE 겔의 사진이다. 이어서, 샘플을 10회 여과하고 나서, 동일한 방식으로 SDS-PAGE에 의해 분석하였다. 미접한 대조군은 레인 5 및 12에 있고, 환원제 대 L1 단백질의 10:1비는 레인 6 및 13에 있고, 환원제 대 L1 단백질의 100:1 비는 레인 7 및 14에 있고, 환원제 대 L1 단백질의 1000:1 비는 레인 8 및 15에 있다.
도 15A는 10회 여과를 거쳐 원으로 나타낸 바와 같이 IRC가 파괴된 야생형 HPV16 IRC의 150,000X에서의 TEM 현미경사진이다.
도 15B는 10회 여과를 거쳐 원으로 나타낸 바와 같이 IRC가 파괴된 야생형 HPV16 IRC의 200,000X에서의 TEM 현미경사진이다.
도 15C는 10회 여과를 거친 MPV.10.34.d IRC의 120,000X에서의 TEM 현미경사진이다. MPV.10.34.d IRC는 어떠한 파괴도 나타내지 않았다.
도 15D는 10회 여과를 거친 MPV.10.34.d IRC의 200,000X에서의 TEM 현미경사진이다. MPV.10.34.d IRC는 어떠한 파괴도 나타내지 않았다.
도 16은 MPV.10.34.d L1 펩타이드 백본의 펩타이드 접합에 대한 펩타이드 농도의 영향을 나타내는 염색된 SDS-PAGE 겔이며, 여기서 환원제((트리스(2-카복시에틸)포스핀, TCEP)가 5:1의 환원제 대 L1 농도 비로 존재할 경우 펩타이드는 접합 반응 동안 5:1, 10:1 및 25:1의 펩타이드:L1 비로 존재한다(레인 1, 4 및 7). 환원제 대 L1 비가 10:1(레인 2, 5 및 8) 또는 20:1(레인 3, 6 및 9)인 샘플에서 펩타이드 농도에 대한 접합률의 의존성은 보이지 않았다. 레인 6은 10:1의 환원제 대 L1 단백질 및 10:1의 펩타이드 대 L1 농도 비를 함유하는 참조 샘플이다. (실시예 6 참조). 이것은 밀도측정법(밀도측정법)에 의해 결정된 바와 같이 대략 50% 펩타이드 접합을 일관되게 제공하는 조건이다. CEX-FB035로 표기된 레인(좌측)은 MPV.10.34.d 캡시드 백본 대조군이다.
도 17은 MPV.10.34.d 캡시드 백본의 펩타이드 접합에 대한 펩타이드 농도의 영향을 나타내는 염색된 SDS-PAGE 겔이며, 여기서 환원제((트리스(2-카복시에틸)포스핀, TCEP)가 5:1의 환원제 대 L1 농도 비로 존재할 경우 펩타이드는 접합 반응 동안 5:1, 10:1 및 25:1의 펩타이드:L1 비로 존재한다(레인 3, 6 및 9). 레인 1, 4 및 7은 1:1의 환원제 대 L1 농도 비로 노출된 샘플이다. 레인 2, 5 및 8은 2.5:1의 환원제 대 L1 농도 비로 노출된 샘플이다. R은 밀도측정법(densitometry)에 의해 결정된 바와 같이 대략 50% 수준의 펩타이드 접합을 일관되게 제공하는, 10:1의 펩타이드 대 L1 비 및 환원제 대 L1 비를 함유하는 참조 샘플이다. CEX-FB035로 표기된 레인(좌측)은 MPV.10.34.d 캡시드 백본 대조군이다.
도 18A는 MPV.10.34.d 캡시드 백본 및 다양한 MPV.10.34.d IRC의 결합 검출을 나타내는 세포 계수치, 즉, 세포수 대 형광 강도의 유세포 분석기 히스토그램이고, 이는 IRC가 헤파린 설페이트 프로테오글리칸(HSPG) 결합을 통해서 종양 세포에 대한 특이성을 유지하는 것을 나타낸다. 데이터는 MPV.10.34.d 및 대응하는 CMV pp65 IRC(실선), MPV.10.34.d 및 대응하는 E7 IRC(두꺼운 실선), MPV.10.34.d 및 대응하는 OVA IRC(두꺼운 대시선) 및 MPV.10.34.d 캡시드 백본(대시선)을 포함한다. 샘플은 피크가 우측으로 이동한 것에 의해 입증되는 바와 같이 종양 세포에 대해서 특이성을 나타내었다. 이들 실험에서의 양성 대조군은 야생형 MPV 캡시드 백본(점선)이었다. 음성 대조군은 IRC도, L1도 함유하지 않는 샘플(긴 대시선)을 포함하였다.
도 18B는 모든 MPV.10.34.d IRC가 HSPG가 발현되지 않는 세포에 결합되지 않은 것을 나타내는 세포수 대 형광 강도의 유세포 분석기 히스토그램이다. 데이터는 MPV.10.34.d 및 대응하는 CMV pp65 IRC(실선), MPV.10.34.d 및 대응하는 E7 IRC(두꺼운 실선), MPV.10.34.d 및 대응하는 OVA IRC(두꺼운 대시선) 및 MPV.10.34.d 캡시드 백본(대시선)을 포함한다. 모든 샘플은 피크가 우측으로 이동한 것에 의해 입증되는 바와 같이 종양 세포에 대해서 특이성을 나타내었다. 이들 실험에서의 양성 대조군은 야생형 MPV 캡시드 백본(점선)이었다. 음성 대조군은 IRC도, L1도 함유하지 않는 샘플(긴 대시선)을 포함하였다.
도 19는 OVA(SIINFEKL, 서열번호 95)/Kb(MHC-I) 복합체의 종양 세포 표면 디스플레이의 검출을 나타내는 세포수 대 형광 강도의 유세포 분석기 히스토그램이다. 결과는, OVA-접합된 HPV16 IRC(실선) 및 OVA-접합된 MPV.10.34.d IRC(두꺼운 실선)의 몰 농도를 나란히 비교했을 때, OVA(SIINFEKL, 서열번호 95)-접합된 MPV.10.34.d IRC가 OVA(SIINFEKL, 서열번호 95)-접합된 HPV16 IRC와 비교하여 종양 세포 MHC 수용체에 더 많은 에피토프를 로딩할 수 있음을 나타낸다. 음성 대조군은 긴 대시선으로 표시된다. 1μg/mL의 펩타이드(SIINFEKL, 서열번호 95)를 함유하지 않는 양성 대조군은 짧은-대시선으로 표시된다.
도 20A는 CMV-접합된 MPV.10.34.d IRC가 HCT116 세포에서 인간 종양 세포 MHC 수용체에 인간 CMV 바이러스 에피토프를 로딩할 수 있는 것을 나타내는, CMV(NLAPMVATV, 서열번호 129)/HLA-A*0201(MHC-I) 복합체의 종양 세포 표면 세포수의 검출을 나타내는 세포수 대 형광 강도의 유세포 분석기 히스토그램이다. 데이터 점은 비관련 대조군 펩타이드(가는 대시선), MPV.10.34.d 캡시드 백본(가는 실선), MPV.10.34.d 및 대응하는 CMV pp65 IRC(두꺼운 실선) 및 HCMV 무함유 펩타이드(두꺼운 대시선)를 포함한다.
도 20B는 CMV(NLAPMVATV)(서열번호 129)/HLA-A*0201(MHC-I) 복합체의 종양 세포 표면 세포수의 검출을 나타내는 세포수 대 형광 강도의 유세포 분석기 히스토그램이다.
도 21A는 샘플에 미리 혼합된 10 mg/mL 가용성 헤파린(대시선)을 갖는 MC38 종양 세포에 대한 OVA-접합된 MPV.10.34.d IRC의 결합의 경쟁적 저해를 나타내는 검출을 나타내는 세포수 대 형광 강도의 유세포 분석기 히스토그램이다. 실선은 OVA 펩타이드 로딩이 없는 것을 나타내는 음성 대조군이다. 대시선과 중첩하는 실선은 OVA 펩타이드 로딩이 없는 것을 나타내는 음성 대조군이다.
도 21B는 샘플에 미리 혼합된 5 mg/mL 가용성 헤파린(대시선)을 갖는 MC38 종양 세포에 대한 OVA-접합된 MPV.10.34.d IRC의 결합의 경쟁적 저해의 검출을 나타내는 세포수 대 형광 강도의 유세포 분석기 히스토그램이다. 실선은 OVA 펩타이드 로딩이 없는 것을 나타내는 음성 대조군이다. 대시선과 중첩하는 실선은 OVA 펩타이드 로딩이 없는 것을 나타내는 음성 대조군이다. 대시선과 중첩하는 실선은 OVA 펩타이드 로딩이 없는 것을 나타내는 음성 대조군이다.
도 21C는 샘플에 미리 혼합된 1 mg/mL 가용성 헤파린(대시선)을 갖는 MC38 종양 세포에 대한 OVA-접합된 MPV.10.34.d IRC의 결합의 경쟁적 저해의 검출을 나타내는 세포수 대 형광 강도의 유세포 분석기 히스토그램이다. 실선은 OVA 펩타이드 로딩이 없는 것을 나타내는 음성 대조군이다. 대시선과 중첩하는 실선은 OVA 펩타이드 로딩이 없는 것을 나타내는 음성 대조군이다.
도 22A는 50μM의 농도의 퓨린 저해제가 OVA-접합된 MPV.10.34.d IRC가 종양 세포 MHC 수용체에 OVA 에피토프의 로딩을 방지하는 것을 나타내는 세포수 대 형광 강도의 유세포 분석기 히스토그램이다(암흑선으로 지시되는 화살표). 샘플은 비처리 세포(가는 선) 또는 다이메틸 설폭사이드(DMSO) 단독 및 퓨린 저해제 무함유로 처리된 세포(대시선), 및 음성 대조군(가는 선)을 포함한다.
도 22B는 5μM의 농도의 퓨린 저해제가 OVA-접합된 MPV.10.34.d IRC가 종양 세포 MHC 수용체에 OVA 에피토프의 로딩을 방지하는 것을 나타내는 세포수 대 형광 강도의 유세포 분석기 히스토그램이다(암흑선으로 지시되는 화살표). 샘플은 비처리 세포(가는 선) 또는 다이메틸 설폭사이드(DMSO) 단독 및 퓨린 저해제 무함유로 처리된 세포(대시선), 및 음성 대조군(가는 선)을 포함한다.
도 22C는 0.5μM의 농도의 퓨린 저해제가 OVA-접합된 MPV.10.34.d IRC가 종양 세포 MHC 수용체에 OVA 에피토프의 로딩을 방지하는 것을 나타내는 세포수 대 형광 강도의 유세포 분석기 히스토그램이다(암흑선으로 지시되는 화살표). 샘플은 비처리 세포(가는 선), 또는 다이메틸 설폭사이드(DMSO) 단독 및 퓨린 저해제 무함유로 처리된 세포(대시선), 및 음성 대조군(가는 선)을 포함한다.
도 23A는 OVA-접합된 MPV.10.34.d IRC가 뮤린 종양 세포주 ID8-Luc에서 OVA-접합된 HPV16 IRC와 유사한 OVA-특이적 뮤린 T-세포의 면역 재지향(immune redirection)을 유도하는 것을 나타내는 막대 그래프이다.
도 23B는 OVA-접합된 MPV.10.34.d IRC가 뮤린 종양 세포주 B16-Luc에서 OVA-접합된 HPV16 IRC와 유사한 OVA-특이적 뮤린 T-세포의 면역 재지향을 유도하는 것을 나타내는 막대 그래프이다.
도 24A는 E7-접합된 HPV16 IRC가 뮤린 종양 세포주 ID8-Luc에서 OVA-접합된 HPV16 IRC와 유사한 OVA-특이적 뮤린 T-세포의 면역 재지향을 유도하는 것을 나타내는 막대 그래프이다.
도 24B는 E7-접합된 HPV16 IRC가 뮤린 종양 세포주 B16-Luc에서 OVA-접합된 HPV16 IRC와 유사한 OVA-특이적 뮤린 T-세포의 면역 재지향을 유도하는 것을 나타내는 막대 그래프이다.
도 25A는 인간 CMV-접합된 MPV.10.34.d IRC가 인간 종양 세포주 HCT-116에서 CMV-접합된 HPV16 IRC와 유사한 CMV-특이적 CD8 T-세포의 면역 재지향을 유도하는 것을 나타내는 막대 그래프이다.
도 25B는 인간 CMV-접합된 MPV.10.34.d IRC가 인간 종양 세포주 Ovarcar3에서 CMV-접합된 HPV16 IRC와 유사한 CMV-특이적 CD8 T-세포의 면역 재지향을 유도하는 것을 나타내는 막대 그래프이다.
도 25C는 인간 CMV-접합된 MPV.10.34.d IRC가 인간 종양 세포주 MCF7에서 CMV-접합된 HPV16 IRC와 유사한 CMV-특이적 CD8 T-세포의 면역 재지향을 유도하는 것을 나타내는 막대 그래프이다.
도 26은 종양 세포에 OVA-접합된 MPV.10.34.d IRC의 결합과 OVA-접합된 MPV.10.34.d IRC를 통해서 종양 세포 표면 MHC-I 분자에 OVA(SIINFEKL, 서열번호 95)의 펩타이드 로딩의 높은 통계학적 상관을 입증하는 그래프이다.
도 27A는 10 mg/mL의 농도의 헤파린과의 인큐베이션에 의한 0.625μg/mL OVA-접합된 MPV.10.34.d IRC의 결합 차단을 나타내는 세포독성 퍼센트 대 E:T 비의 그래프이고, OVA-특이적 뮤린 T-세포의 면역 재지향 반응은 유도되지 않았다(대시선). 점선은 MPV.10.34.d 캡시드 백본의 음성 대조군을 나타낸다. 실선은 헤파린이 없는 양성 대조군 샘플을 나타낸다.
도 27B는 10 mg/mL의 농도의 헤파린과의 인큐베이션에 의한 0.3125μg/mL OVA-접합된 MPV.10.34.d IRC의 결합을 차단을 나타내는 세포독성 퍼센트 대 E:T 비의 그래프이고, OVA-특이적 뮤린 T-세포의 면역 재지향 반응은 유도되지 않았다(대시선). 점선은 MPV.10.34.d 캡시드 백본의 음성 대조군을 나타낸다. 실선은 헤파린이 없는 양성 대조군 샘플을 나타낸다.
도 27C는 10 mg/mL의 농도의 헤파린과의 인큐베이션에 의한 0.156μg/mL OVA-접합된 MPV.10.34.d IRC의 결합의 차단을 나타내는 세포독성 퍼센트 대 E:T 비의 그래프이고, OVA-특이적 뮤린 T-세포의 면역 재지향 반응은 유도되지 않았다(대시선). 점선은 MPV.10.34.d 캡시드 백본의 음성 대조군을 나타낸다. 실선은 헤파린이 없는 양성 대조군 샘플을 나타낸다.
도 28은 세포-결합 검정 및 세포독성 검정의 용량 적정으로부터 얻어진 데이터표이다. 연구는 2회 반복되었다(각각 적어도 3회 반복). 기하 평균 형광 강도(MFI)의 평균값은 두 실험으로부터 보고된다. 이들 데이터는 OVA-접합된 MPV.10.34.d IRC 결합 및 세포독성의 통계학적 상관관계를 평가하는 데 사용되었다.
도 29는 OVA-접합된 MPV.10.34.d IRC 결합 및 세포독성의 높은 통계학적 상관관계를 입증하는 세포독성 퍼센트 대 MFI의 그래프이다.
도 30A는 2.5μg/mL의 OVA-접합된 MPV.10.34.d IRC와 GARDASIL®9-백신접종된 혈청(1:200)의 공동-인큐베이션이 OVA-특이적 뮤린 T-세포의 면역 재지향을 저해하지 않았음을 나타내는 세포독성 퍼센트 대 E:T 비의 그래프이다.
도 30B는 0.625μg/mL의 OVA-접합된 MPV.10.34.d IRC와 GARDASIL®9-백신접종된 혈청(1:200)의 공동-인큐베이션이 OVA-특이적 뮤린 T-세포의 면역 재지향을 저해하지 않았음을 나타내는 세포독성 퍼센트 대 E:T 비의 그래프이다.
도 30C는 0.156μg/mL의 OVA-접합된 MPV.10.34.d IRC와 GARDASIL®9-백신접종된 혈청(1:200)의 공동-인큐베이션이 OVA-특이적 뮤린 T-세포의 면역 재지향을 저해하지 않았음을 나타내는 세포독성 퍼센트 대 E:T 비의 그래프이다.
도 31A는 표적 종양 세포에 대한 결합에 대한 MPV.10.34.d와 항-MPV.10.34.d 혈청의 인큐베이션의 효과를 테스트하는 두 ELISA 검정으로부터 얻어진 데이터의 450nm에서의 흡광도 대 희석 배율의 그래프이다.
도 31B는 MPV.10.34.d IRC와 항-MPV.10.34.d 혈청의 인큐베이션의 효과를 테스트하는 두 ELISA 검정으로부터 얻어진 데이터의 450nm에서의 흡광도 대 희석 배율의 그래프이다. 결과는 혈청이 MPV.10.34.d 캡시드 백본을 특이적으로 인식하고 이에 결합하는 것을 나타낸다.
도 32A는 2.5μg/mL의 OVA-접합된 MPV.10.34.d IRC와 MPV-특이적 혈청(1:200)의 공동-인큐베이션이 OVA-특이적 뮤린 T-세포의 면역 재지향을 저해하지 않았음을 나타내는 세포독성 퍼센트 대 E:T 비의 그래프이다.
도 32B는 0.625μg/mL의 OVA-접합된 MPV.10.34.d IRC와 MPV-특이적 혈청(1:200)의 공동-인큐베이션이 OVA-특이적 뮤린 T-세포의 면역 재지향을 저해하지 않았음을 나타내는 세포독성 퍼센트 대 E:T 비의 그래프이다.
도 32C는 0.156μg/mL의 OVA-접합된 MPV.10.34.d IRC와 MPV-특이적 혈청(1:200)의 공동-인큐베이션이 OVA-특이적 뮤린 T-세포의 면역 재지향을 저해하지 않았음을 나타내는 세포독성 퍼센트 대 E:T 비의 그래프이다.
도 32D는, 당해 혈청이 OVA-접합된 MPV.10.34.d IRC에 특이적으로 결합되었다는 사실에도 불구하고, 2.5μg/mL의 OVA-접합된 MPV.10.34.d IRC와 항-MPV.10.34.d 혈청(1:200)의 공동-인큐베이션이 OVA-특이적 뮤린 T-세포의 면역 재지향을 저해하지 않았음을 나타내는 세포독성 퍼센트 대 E:T 비의 그래프이다.
도 32E는, 당해 혈청이 OVA-접합된 MPV.10.34.d IRC에 특이적으로 결합되었다는 사실에도 불구하고, 0.625μg/mL에서 OVA-접합된 MPV.10.34.d IRC와 항-MPV.10.34.d 혈청(1:200)의 공동-인큐베이션이 OVA-특이적 뮤린 T-세포의 면역 재지향을 저해하지 않았음을 나타내는 세포독성 퍼센트 대 E:T 비의 그래프이다.
도 32F는, 당해 혈청이 OVA-접합된 MPV.10.34.d IRC에 특이적으로 결합되었다는 사실에도 불구하고, 0.156μg/mL에서 OVA-접합된 MPV.10.34.d IRC와 항-MPV.10.34.d 혈청(1:200)의 공동-인큐베이션이 OVA-특이적 뮤린 T-세포의 면역 재지향을 저해하지 않았음을 나타내는 세포독성 퍼센트 대 E:T 비의 그래프이다.
도 33A는 도 32A, 도 32B 및 도 32C에 그래프화된 데이터에 해당하는 데이터의 표이며, MPV 혈청(1:200) 희석물의 존재 중 상이한 샘플 농도하에 종양 세포에 대한 OVA-접합된 MPV.10.34.d IRC의 검출을 나타낸다. 결과는 MPV 혈청이 또한 OVA-접합된 MPV.10.34.d IRC에 특이적으로 결합한다는 사실에도 불구하고 OVA-접합된 MPV.10.34.d IRC의 결합을 나타낸다.
도 33B는, 항-MPV.10.34.d IRC 혈청(1:200) 희석액의 존재 중 상이한 샘플 농도하에 종양 세포에 대한 OVA-접합된 MPV.10.34.d IRC의 결합의 검출을 나타내는, 도 32D, 도 32E 및 도 32F에 그래프로 표시된 데이터에 대응하는 데이터의 표이다. 결과는 MPV.10.34.d IRC 혈청이 OVA-접합된 MPV.10.34.d IRC에 또한 특이적으로 결합하는 것을 나타내었다는 사실에도 불구하고 종양 세포에 대한 OVA-접합된 MPV.10.34.d IRC의 결합을 나타낸다.
도 34는 OVA(SIINFEKL, 서열번호 95)/Kb(MHC-I) 복합체의 종양 세포 표면 디스플레이를 검출하는 OVA-접합된 MPV.10.34.d IRC(ng/mL)의 농도의 기하 평균 형광 강도의 그래프이다. 그 결과는 OVA-접합된 MPV.10.34.d IRC가 MHC 세포내 처리 경로가 결핍된 종양 세포의 표면에 있는 MHC 수용체에 OVA 펩타이드를 세포외 로딩함을 나타낸다.
정의
본 명세서는 본 개시내용의 예시적인 실시형태 및 적용을 기재한다. 그러나, 본 개시내용은 이러한 예시적인 실시형태 및 적용으로 또는 예시적인 실시형태 및 적용이 작동하거나 본 명세서에 기재된 방식으로 제한되지 않는다. 본 교시내용의 다양한 실시형태, 특징, 목적 및 이점은 설명 및 첨부된 도면, 그리고 청구범위로부터 명백할 것이다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "포함하다(comprise)", "포함한다(comprises)", "포함하는(comprising)", "함유하다", "함유한다", "함유하는", "가지다", "가지는", "포함하다(include)", "포함한다(includes)", 및 "포함하는(including)", 및 이들의 변형어는 제한적인 것으로 의도되지 않고, 포괄적이거나 개방적이며, 추가적인 언급되지 않은 첨가제, 구성성분, 정수, 요소 또는 방법 단계를 배제하지 않는다. 예를 들어, 특징 목록을 포함하는 공정, 방법, 시스템, 조성물, 키트 또는 장치는 반드시 해당 특징으로만 제한되는 것은 아니지만, 이와 같은 공정, 방법, 시스템, 조성물, 키트, 또는 장치에 명시적으로 열거되지 않았거나 내재하지 않는 다른 특징을 포함할 수 있다.
"약"은 값이 이 값을 결정하는 데 이용되는 장치 또는 방법에 대한 오류의 표준 편차를 포함하는 것을 나타내는 데 사용된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "면역 재지향자 캡시드" 또는 "IRC"는 캡시드 백본에 결합되거나, 부착되거나 또는 접합된 펩타이드를 또한 포함하는 캡시드 백본이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "절단 서열"은, 예를 들어, 특정 펩타이드 서열, 또는 보다 종종, 부위-특이적 프로테아제가 단백질을 절단 또는 자르는 펩타이드 모티프를 포함헌다. 절단 부위는, 예를 들어, 친화성 태그를 절단하여 천연 단백질 서열을 복원하거나 단백질을 불활성화시키거나 단백질을 활성화시키는 데 사용된다. 본 개시내용에서, "절단"은 단백질분해 절단을 지칭한다. 다양한 실시형태에서, 단백질분해 절단은 단백질의 최종 성숙 전에 펩티다제, 프로테아제 또는 단백질분해 절단 효소에 의해 촉매된다. 단백질은 또한, 예를 들어, 미스폴딩된 단백질의 세포내 처리의 결과로서 절단될 수 있다. 단백질의 단백질분해 처리의 또 다른 예는, 세포외 환경 또는 특정 세포소기관으로 방출되기 전에 특정 신호 펩티다제에 의해 제거되는 신호 펩타이드를 가지는, 세포소기관을 표적으로 하는 단백질 또는 분비 단백질이다. 본 개시내용의 일 실시형태에서, 절단 서열은 접합된 IRC로부터 펩타이드를 절단 및 방출하는 퓨린에 의해 특이적으로 인식되어, 펩타이드를 종양 표면 수용체 상에 로딩하게 하거나 또는 종양 표면 수용체에 의해 결합하는 데 이용할 수 있게 한다. 다양한 실시형태에서, 절단 서열은 시스테인, 라이신 및/또는 아르기닌 잔기로 구성되며, 이들은 펩타이드가 캡시드 백본으로부터 절단될 수 있게 할 뿐만 아니라, 일부 경우에, 절단 단백질, 예컨대, 종양 부위에서, 즉, 종양 미세환경에 풍부하거나 선택적으로 존재하는 퓨린에 의해 방출될 때까지 캡시드 단백질에 펩타이드를 접합시키는 앵커로서 작용한다.
"에피토프" 또는 "항원" 또는 "항원성 에피토프"는 특정 면역글로불린에 의해 인식이 일어나거나 이에 의해 인식되는 아미노산 잔기의 세트, 또는 T 세포의 맥락에서, T 세포 수용체 단백질 및/또는 주조직적합성(MHC) 수용체에 의한 인식에 필요한 아미노산 잔기의 세트이다. 에피토프의 아미노산 잔기는 인접할/연속적일 필요는 없다. 면역계 세팅에서, 생체내 또는 시험관내에서, 에피토프는, 일부 경우에, 함께 면역글로불린, T 세포 수용체 및/또는 HLA 분자에 의해 인식되는 3차원 구조를 형성하는, 1차, 2차 및 3차 펩타이드 구조, 및 전하와 같은 분자의 집합적 특징의 복합체이다.
"HPV" 및 "인유두종바이러스"는 인간을 감염시킬 수 있는 유두종바이러스과 계열의 구성원을 지칭한다. 향성(tropism)에 의해 정의되는 HPV의 2가지 주요 그룹(생식기/점막 및 피부 그룹)이 있으며, 이들 각각은 다수의 바이러스 "유형" 또는 "균주/유전자형", 예컨대, HPV 16, HPV 18, HPV 31, HPV 32 등을 함유한다.
"MusPV", "MMuPV1", "MPV" 및 "마우스 유두종바이러스"는 모두 대안적으로 그리고 호환 가능하게 마우스(무스 무스쿨루스(Mus musculus))에 감염될 수 있는 유두종바이러스과 계열의 공지된 구성원을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "인간 백신"은 인간에서 특정 질환에 대한 면역력을 개선시키는 생물학적 제제를 의미한다. 백신은 전형적으로 질환-유발제(병원체)와 유사한 항원성 작용제(들)를 포함하고, 종종 미생물의 약화되거나 사멸된 형태, 이의 독소 또는 질환 유발제의 하나 또는 여러 가지의 면역유전적 표면 단백질로 제조된다. 항원성 작용제는 신체의 면역계를 자극하여 질환 유발제를 이물질로 인식하고, 이를 파괴하며, 이를 "기억"하여, 실제로 장래 감염/노출이 일어날 경우 면역계가 이들 병원체 중 임의의 것을 더 용이하게 인식하고 파괴할 수 있게 한다. 인간 백신은 바이러스성 질환 및 박테리아성 질환에 대한 백신을 포함한다. 다양한 실시형태에서, 바이러스성 질환에 대한 백신은 A형, B형, E형 간염 바이러스, 인유두종바이러스, 인플루엔자 바이러스, 일본뇌염 바이러스, 홍역 바이러스, 유행성이하선염 바이러스, 폴리오 바이러스, 공수병 바이러스, 로타바이러스, 풍진 바이러스, 진드기-매개 뇌염 바이러스, 수두대상포진 바이러스, 천연두 바이러스, 및 황열 바이러스를 포함한다. 현재 개발중인 바이러스 질환에 대한 인간 백신은, 예를 들어, 뎅기 백신, 동부 말 뇌염 바이러스, HTLV-1 T 림프구 백혈병 백신, 및 호흡기 세포융합 바이러스 백신을 포함한다. 일부 실시형태에서, 이러한 백신은 현재 개발중인 백신 또는 현재 미국 식품의약국(United States Food and Drug 투여: FDA)-승인 백신이다. 본 명세서에 기재된 조성물 및 방법과 양립 가능한 백신의 예의 비제한적인 예는 표 2에 열거되어 있다. 그러나, 본 명세서에 기재된 실시형태는 이들 열거된 백신으로 제한되지 않으며, 인간 대상체에서 면역력을 제공하기 위해 개발된 임의의 백신에 적용하도록 고려된다.
본 명세서에서 사용될 때, "저해", "감소", "예방", 또는 "발생의 감소" 및 유사한 용어는, 원하는 결과를 달성하기 위해 임의의 측정 가능한 감소 또는 완전한 저해/감소 또는 제거, 예컨대, 종양 질량, 진행 및/또는 전이의 저해, 감소, 또는 예방 또는 이의 발생의 감소 또는 이의 감소를 포함한다.
"MHC" 또는 "주조직적합 복합체"는 면역계가 외래 물질을 인식하는 데 도움을 주는 세포의 표면에서 발견되는 단백질을 암호화하는 유전자 그룹이다. MHC 단백질(수용체 또는 분자)은 모든 고등 척추동물에 의해 발현된다. MHC 분자에는 2가지 주요 유형, 즉, MHC 클래스 I 및 MHC 클래스 II가 있다. 인간에는 MHC 클래스 I 분자(인간의 MHC-분자는 인간 백혈구 항원(HLA)으로도 지정됨)를 암호화하는 3가지 상이한 유전자좌, 즉, HLA-A, HLA-B 및 HLA-C가 있다. HLA-A*0l, HLA-A *02 및 HLA-A * 11은 이들 유전자좌로부터 발현될 수 있는 상이한 MHC 클래스 I 대립유전자의 예이다.
"유두종바이러스"는 유두종바이러스 과(파필로마비리대(Papillomaviridae))의 모든 구성원을 지칭한다. 유두종바이러스 유형 및 각각의 캡시드 백본을 만드는 능력에 대한 광범위한 목록은 간행물: "Classification of papillomaviruses (PVs) based on 189 PV types and proposal of taxonomic amendments", de Villers et al., 401(1):70-79, 2010, PMID: 20206957(모든 표는 모든 목적을 위하여 본 명세서에 참조에 의해 구체적으로 원용됨)을 사용하여 참조할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "우선적으로 절단된 단백질"은 펩타이드가 종양 부위 또는 종양 미세환경에서 캡시드 또는 캡소미어(capsomere) 또는 L1 단백질로부터 우선적으로 절단됨을 의미한다. 어떠한 특정 이론에 의해서서 얽매이길 원치 않지만, 우선적인 종양-부위 절단은, 일부 경우에, (1) 펩타이드 상의 특유한 절단 서열 및/또는 (2) 특유한 종양 미세환경에 기인할 수 있다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 펩타이드는, 유기체에서 다른 곳에서와 비교 시 종양 세포 주위에서 비교적 고농도로 발현되는 것으로 알려진 효소 퓨린에 의해 우선적으로 절단되는 절단 서열을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "단백질", "폴리펩타이드" 및 "펩타이드"는, 아미노산의 임의의 특정 수로 제한되지 않으며; 이들 용어는 때때로 본 명세서에서 호환 가능하게 사용된다. 본 명세서에 기재된 단백질, 및 이를 암호화하는 핵산의 특성 및 아미노산 서열은 잘 알려져 있고 일상적으로 결정될 뿐만 아니라, 다양한 알려진 데이터베이스로부터 다운로드받을 수 있다(예를 들어, NCBI GenBank 데이터베이스 참조). 일부 펩타이드 서열이 본 명세서에서 제공된다. 그러나, 일부 펩타이드 서열 정보는 (예를 들어, 이전 기재사항의 실수를 수정하기 위하여) 정기적으로 업데이트되므로, 단백질 및 이를 암호화하는 핵산에 대한 업데이트된(수정된) 정보가 본 출원에 포함된다. 본 명세서에서 논의되는 서열 데이터베이스에서 제공되는 정보는 참조에 의해 원용된다.
면역 "반응"은, 세포 반응에서, 대상체, 또는 이미 노출된 그 대상체에 존재하는 백신 또는 다른 병원체에 의해 프라이밍되는 항원-프라이밍된 세포독성 T 세포, Th1 T 세포, Th2 T 세포, 및/또는 B 세포가 에피토프 또는 항원에 결합하는 대상체의 면역계의 호르몬 및/또는 세포 반응이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 용어 "기존 면역 반응"은, 본 명세서에 기재된 본 발명의 암 치료 방법을 개시하기 전에 개체에 존재하는 면역 반응을 의미한다. 따라서, 기존 면역 반응을 갖는 개체는 암을 치료하기 위해 본 명세서에 기재된 바와 같은 항원으로 치료하는 방법을 개시하기 전에 항원에 대한 그의 기억 T 세포 또는 다른 면역계 구성요소 내에 저장된 면역 반응 능력을 갖는다. 기존 면역 반응은 어떤 경우에는 자연 발생 면역 반응이다. 다른 경우에, 기존 면역 반응은 유도된 면역 반응. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 자연 발생 기존 면역 반응은 개체가 개별적으로 의도치 않게 접촉되거나 수축된 박테리아, 진균, 기생충, 또는 바이러스 항원과 같은 항원에 대한 반응으로 유도된 개체에서의 면역 반응이다. 즉, 기존 면역 반응을 가진 개체는 어떤 경우에는 항원에 대한 면역 반응을 생성하려는 의도로 항원에 노출되지 않았다. 유도된 기존 면역 반응은 백신을 투여받을 때와 같이 항원에 의도적으로 노출되어 발생하는 면역 반응이다. 기존 면역 반응은 어떤 경우에는 자연 발생 면역 반응이거나, 다른 경우에는 기존 면역 반응은 유도된 면역 반응이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "대상체" 또는 "이를 필요로 하는 대상체"는, 종양/암을 가지거나, 종양/암을 앓았던 적이 있거나, 전암성 의학적 병태 또는 세포를 갖거나, 유전적 또는 다른 감수성, 소인, 또는 암 또는 종양 발병의 직업적 위험을 갖는 임의의 동물을 포함한다. 적합한 대상체(환자)는 마우스, 래트, 토끼, 기니피그 또는 돼지와 같은 실험실 동물, 소와 같은 농장 동물, 개 또는 말과 같은 스포츠 동물, 말, 개 또는 고양이와 같은 가축 또는 애완 동물, 비인간 영장류 및 인간을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 "T 세포 반응"은 T 세포가 항원을 만날 때 T 세포에 의해 유도되는 면역 반응을 지칭한다. 미경험 성숙 T 세포는 B 세포, 대식세포 및 수지상세포가 제시한 항원을 만날 때 활성화되고, 이에 따라 이어서 무장된 효과기 T 세포를 생성한다. 효과기 T 세포는 어떤 경우에는 세포독성 T 세포로 분화하는 CD8+ T 세포, 또는 주로 체액성 면역 반응을 유도하는 CD4+ T 세포이다. T 세포 면역 반응은 동일한 또는 유사한 에피토프를 포함하는 동일한 또는 유사한 병원체에 의한 대상체의 후속 공격으로부터 보호를 제공하는 면역학적 기억을 추가로 생성한다. 다양한 실시형태에서, T 세포 반응은 총 CD8+ T 세포의 기준선보다 적어도 2배 높은 역치에 있다. 다양한 실시형태에서, CD8+ T 세포는 또한 CD69+이다.
"치료용 조성물"은, 암과 같은 질환의 치료 용도를 위하여, 환자에 대해 지정되고 투여되는 조성물이다. 치료용 조성물, 예컨대, 치료용 IRC-함유 조성물이 양성 또는 악성 종양 또는 비고형 암과 같은 이러한 종양에 걸릴 위험이 있는 환자/대상체를 치료하는 데 사용된다. 일부 실시형태에서, IRC는 종양/암의 저해 또는 재발을 향상시키기 위한 노력으로 이전에 종양이 있었고 현재 명백하게 종양/암이 없는 대상체에게 투여된다.
"캡시드 백본"은 바이러스 구조 단백질, 예컨대, 어떤 경우에는 바이러스와 유사하지만 바이러스 유전 물질이 없는 캡소미어로 자가-조립되는 외피 또는 캡시드 단백질, 예컨대, L1 단백질과 같은 바이러스 구조 단백질로 구성된 다중-단백질 구조를 지칭한다. 캡시드 백본은 비-감염성이고 비-복제성이지만, 형태학적으로 바이러스와 유사하다. 본 명세서에 개시된 캡시드 백본은 종양 세포에 결합하거나 이에 대한 고유한 향성을 보유한다.
캡시드 구조
바이러스는 많은 상이한 형태로 존재하며 일반적으로 직경이 20nm에서 300nm 사이인 박테리아보다 크기가 작지만, 일부 필로바이러스는 필라멘트 길이가 최대 1400nm이다. 바이러스 또는 바이러스 캡시드 백본의 시각화는 광학 현미경보다 더 강력한 투과형 전자 현미경(TEM)을 필요로 한다. 바이러스는 입자 모양이며 캡시드라고 불리는 단백질 보호막으로 둘러싸인 핵산을 가진 비리온으로 존재한다. 이러한 캡시드는 또한 결과적으로 어떤 경우에는 표면 단백질, 수용체 등을 포함할 수 있는 보호 지질 이중층으로 둘러싸여 있다.
캡시드는 복수의 동일한 캡소미어로 형성된다. 캡시드는 일반적으로 더 복잡한 구조를 가진 박테리오파지를 제외하고는 나선형 또는 이십면체 구조에 속한다. 가장 통상적인 이십면체 형상은 20개의 정삼각형 면으로 구성되며 전체 형상이 3-차원 구와 유사하다. 나선형 캡시드는 3차원 원통 형태의 통상의 스프링 형상과 유사하다. 캡시드의 각 면은 1 내지 3개의 서로 다른 단백질 또는 단량체 단위(프로토머(protomer))로 구성된다. 캡시드는, 유두종바이러스 게놈을 둘러싸지 않을 때, 당업계에서 통상적으로 바이러스 유사 입자로 지칭되거나, 본 명세서에서 캡시드 백본으로 지칭된다. 즉, 바이러스 게놈 물질이 없는 빈 캡시드는 본 명세서에서 때때로 캡시드 백본으로 지칭된다. 캡시드 백본은 특히 인체에서 다양한 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 우수한 전달 분자인데, 그 이유는 비감염성이며 선택적으로 종양 세포를 특이적으로 표적화하거나 결합하도록 재설계되기 때문이지만, 위에서 기재된 바와 같이, 대부분의 캡시드 백본은 추가의 조작 없이도 고유한 조직 향성을 보유한다.
캡소미어는 개별 서브유닛 또는 프로토머로 형성된다. 천연 L1 프로토머는 분자간 이황화 결합을 통해 자가-조립되어 오량체(캡소미어)를 형성한다. 위에서 언급한 바와 같이, 캡시드는 많은 캡소미어로 구성된다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "캡소미어"는 전장 L1 단백질, 또는 이의 단편 및 돌연변이를 포함하는 유두종바이러스 L1 폴리펩타이드의 오량체 조립체를 의미하는 것으로 의도된다. 표준 이십면체 캡시드는 20개의 면으로 구성되고 12개의 정점을 포함하는 다면체이다. 정점은 오각형 캡소미어로 구성되고 캡시드의 면은 육각형 캡소미어로 구성된다. 바이러스 유형에 따라서 임의의 주어진 캡시드에는 항상 12개의 오각형(펜톤)과 다양한 수의 육각형(헥손)이 있다. 외인성 펩타이드가 부착되지 않은 캡시드는 본 명세서에서 "캡시드 백본"이라 명명된다.
대부분의 바이러스에서 발견되는 이십면체 구조는 매우 통상적이며 위에서 언급된 바와 같이 20개의 삼각형 면과 12개의 5겹 꼭짓점으로 구성된다. 캡시드에 포함된 캡소미어의 수는 1937년에 Michael Goldberg가 처음 설명한 Goldberg 다면체에서 발견된 것과 같은 잘 알려진 수학적 원리를 따른다. 구조는 두 개의 정수 h 및 k로 색인될 수 있고, h는 1보다 크거나 동일하고 k는 0보다 크거나 동일하며, 그 구조는 오량체의 가장자리에서부터 h 스텝을 취하고, 반시계 방향으로 60도 회전한 다음, k 스텝을 취하여 다음 오량체로 이동함으로써 시각화된다. 따라서 이러한 유형의 캡시드에 대한 삼각화 수 "T"는 T = h 2 + h·k + k 2로 정의된다. 이 스킴에서, 이십면체 캡시드는 12개의 오량체와 10(T - 1)개의 육량체를 포함한다. (문헌[Carrillo-Tripp, et al., Nuc. Acids Res., 37(Database issue):D436-D442, 2009). 따라서, "T" 수, 또는 삼각화 수는 주어진 캡시드의 크기와 복잡성을 나타냄을 알 수 있다. 그러나, 예를 들어, 때때로 유사 T=7 격자에서 6가 위치에 육량체 대신 5량체를 소유할 수 있는 유두종바이러스과 계열의 바이러스에서 발견되는 이 일반적인 "경험 법칙"에 대한 많은 알려진 예외가 있다. 정규 T=7 캡시드 구조 외부에는, T=1, T=2 및 T=3과 같은 다른 구조가 알려져 있다. T=1 삼각화 값은 캡시드가 단지 이십면체 또는 십이면체임을 나타낸다.
일부 바이러스는 외피로 둘러싸여 있으며 캡시드 구조를 둘러싸는 지질막 코팅을 더 포함한다. 외피는 숙주 세포내 막으로부터 획득된다. 핵산 물질은 DNA 또는 RNA이며 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다.
유두종바이러스과 계열의 바이러스는 외피가 없는 이중 가닥 DNA 바이러스이다. 유두종바이러스과 계열 내에는 수백개의 계열 구성원이 있고, 이들의 각각은 가장 잘 알려진 포유류와 새, 뱀, 거북이, 물고기와 같은 다른 척추동물을 감염시키는 "유형"으로 지칭된다. 유두종바이러스과 계열 구성원은 상대적으로 숙주- 및 조직-향성이 높은 것으로 간주되며, 이는 그 구성원이 일반적으로 특정 조직 향성(감염 표적에 대한 선호도)과 숙주 유형에 대한 선호도를 가지며 종 간에 거의 전염되지 않는다는 것을 의미한다. 예를 들어, 유두종바이러스과 계열 구성원인 인유두종바이러스(HPV) 유형 1은 발바닥에 대해 향성을 나타내는 반면, HPV 유형 2는 손바닥 조직을 선호하는 것으로 알려져 있다. 유두종 바이러스는 각질세포에서만 배타적으로 복제된다.
알파파필로마바이러스, 베타파필로마바이러스, 감마파필로마바이러스, 무파필로라바이러스 및 누파필로마바이러스를 포함하여 서열 결정된 170가지 이상의 기지의 인간 파필로마바이러스 유형이 있고 5개 속으로 나뉜다. 더 많은 인유두종바이러스가 확인되었지만 아직 서열 결정되지 않았다.
유두종바이러스는 72개의 별 형상 캡소머(capsomer)로 구성된 캡시드를 형성하는 데 필요하고도 충분한 L1 단백질 또는 주요 캡시드 단백질 L1이라 불리는 단일 프로토머를 가지고 있다. 유두종바이러스 계열 구성원 캡시드는 외피가 없고 이십면체이다. 유두종바이러스 게놈은 또한 L1보다 덜 풍부하게 발현되는 L2라고 불리는 제2 구조 단백질을 포함한다. 캡시드에 L2가 존재하는 것은 선택적이며 바이러스 기능 또는 캡시드 형성에 필요하지 않다. 유두종바이러스과 계열의 캡소미어는 모두 단백질 사이의 오량체 상호작용으로 만들어진다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 돌연변이 L1 단백질 등을 기술할 때, 이러한 돌연변이체, 및 캡소머, 및 이들로부터 제조된 캡시드는, 단지 인간 또는 마우스 계열 구성원이 아니라 모든 유두종바이러스과 계열 구성원을 포함하는 것을 의미한다. 따라서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 돌연변이 L1 단백질은 일반적으로 모든 L1 단백질, 어떤 경우에는 특별히 특히 유두종바이러스과 계열 L1 단백질을 포함하는 것을 의미한다.
인유두종바이러스 L1 단백질 및 이의 마우스 대응물의 아미노산 도메인 및 서열은 도 1 및 도 2에 제시된다. 유두종바이러스과 계열의 이러한 모든 L1 단백질에 걸쳐서 일반적으로 상당히 높은 수준의 서열 보존이 관찰되고, 또한 이 정렬에 반영된다. L1 서열의 가능한 돌연변이의 부위가 도 2에 추가로 도시되어 있다. 이들 돌연변이 중 일부는 L1 단백질의 아미노- 또는 N-말단으로부터 10개의 아미노산의 결실과 같이 역사적으로 공지되어 있다. (예를 들어, 문헌[Conway et al., J. Dent. Res., 88(4):307-317, 2009] 참조). 유두종바이러스과 계열 구성원에서 L1 단백질의 펩타이드 서열의 다른 구조적 돌연변이, 예컨대, 절단 돌연변이에서 카복시- 또는 C-말단 잔기의 제거가 알려져 있다.
캡시드의 고해상도 구조 분석을 위한 단백질의 안정적인 결정 구조를 얻기 위하여 L1의 N-말단 절단 돌연변이체의 연구가 부분적으로 시작되었다. 따라서, 전장 HPV16 L1은 대부분 테스트 조건하에 결정화될 수 없었지만, 10개의 N-말단 잔기의 제거 시, 추가의 연구를 위하여 결정이 형성될 수 있음을 발견하였다. (Conway et al., 2009). 놀랍게도, 이들 10개의 N-말단 잔기의 제거 시, 캡소머는 (총 60개의 프로토머에 대해) 12개의 L1 오량체로 만들어진 이십면체 격자를 포함하는 T=1 캡시드 구조를 형성한 것으로 밝혀졌다. 위에서 언급된 바와 같이, 유두종바이러스과 계열 구성원 캡시드의 자연 구조는 T=7 구조를 형성하는 72개의 L1 오량체의 구조이다. HPV16의 N-말단 절단 돌연변이체의 T=1 구조는 야생형 HPV16 캡시드에서 캡시드 형성 동안 통상적으로 형성되는 소정의 이황화 결합을 결여한다. 연구는 C428의 세린에서 시스테인으로의 돌연변이 또는 인유두종바이러스 L1 캡시드 단백질에서 나선 4 영역의 결실은 T=1 또는 T=7 캡시드 백본 형성 둘 다를 방해하는 것으로 나타났다. (문헌[Varsani et al., Virus Res., 122(1-2):154-163, 2006, 및 et al., 상게서] 참조).
유두종바이러스 L1 단백질의 전체 구조는 도 1A 및 도 1B에 제시되고, 고전적인 "젤리 롤" β-샌드위치를 형성하는 β-가닥의 코어와 일반적으로 당업계에서 루프 BC, DE, EF, FG 및 HI로 지칭되는 5개의 표면-노출된 루프 영역을 지지하는 5개의 C-말단 α-나선을 포함하는 다양한 2차 구조로 이루어진 3차 구조를 가지고 있다. (문헌[Chen et al., Mol. Cell, 5:557-567, 2000, 및 Bissett et al., Scientific Reports, 6:39730, 2016] 참조). 통상 h2, h3 및 h4로 지칭되는 3개의 α-나선은 다른 단량체 및 오량체와 접촉하는 표면을 형성한다(도 1B). (문헌[Chen et al., 도 4, 페이지 561] 참조). 5개의 α-나선은 일반적으로 L1 서열의 카복시-말단에 존재한다.
돌연변이 L1 단백질의 설계 및 생산
5개의 L1 단백질로 만들어진 10 nm 내지 15 nm 캡소미어의 형성을 용이하게 하기 위하여 MPV L1 서열의 결실이 이루어졌다. HPV16 L1 단백질의 아미노-, 나선-4 및 카복시-말단 잔기의 절단이 캡소미어 형성을 초래하는 것은 이전에 밝혀졌다. (문헌[Bishop et al., Virol. J., 4:3, 2007, 및 et al., J. Virol., 83(15):7690-7705, 2009] 참조). 한편, HPV11 및 HPV16에서 L1의 아미노-말단 10개 잔기의 절단은 단독으로 T=1 이십면체 캡시드 백본을 생성하는 것으로 나타났다. 이들 T=1 이십면체 캡시드 백본은 직경이 대략 20 nm 내지 30 nm이고 60개의 L1 단백질(또는 12개의 캡소머)로 이루어진다. 카복시-말단에서 최대 34개 아미노산의 결실은 T=1 형성을 저해하였다. 그러나, L1의 나선-4 영역에서 결실이 발생하면(아미노산 411 내지 436), N-말단 또는 C-말단 절단의 존재에도 T=1의 형성이 제거될 것이다. 모든 순열에서, 캡소머가 관찰될 것이다. (Chen et al., Mol. Cell, 5(3):557-567, 2000, 및 WO 2000054730). 이들 결과는 이. 콜라이(E. coli)에서 또는 곤출 세포에서 생성된 유두종바이러스 유형 16 L1과 일치하였다. (문헌[ et al., J. Virol., 83(15):7690-7705, 2009] 참조). 종합하면, 이 연구의 저자들은 더 고차의T=1 및 T=7 이십면체 구조로 캡소머의 조립을 위하여 나선-4 구조가 필요하다고 결론지었다. (문헌[Bishop et al., Virol., 4:3, 2007] 참조).
MPV L1 서열의 다양한 결실이 생성되어, 도 1B에 개략적으로 나타낸 "MPV.10.34.d"라는 작제물이 얻어졌다. 이 작제물은 치료 플랫폼으로서 MPV 캡소미어를 생성하도록 설계되었다. MPV L1 단백질은 인간이 대부분 MPV에 노출되지 않았기 때문에 HPV L1 대신에 담체 비히클 작제물로서 선택되었으며, 따라서 MPV로부터의 비리온-유래 캡시드는 HPV L1 단백질에서 볼 수 있는 것처럼 선천적 면역 반응에 민감하지 않을 것으로 가정되었다.
최근에 HPV L1 서열의 아미노-말단 10개 잔기가 제거된 HPV16 L1의 ΔN10 결실이 결정화되었고, T=1 캡시드 백본의 형상과 일치하는 것으로 밝혀졌다. (문헌[Chen et al., 2000] 참조). 이 구조는 L1의 잔기 384에서 446까지의 카복시 말단 세그먼트가 루프와 회전을 연결하는 3개의 나선으로 폴딩되는 것으로 드러났다. 이들 나선은 조립된 T=1 캡시드 백본에서 주요 오량체 간 결합 접촉부이다. 이들 나선이 캡시드 백본 조립에도 영향을 미치는지 여부를 테스트하기 위하여, HPV16(잔기 408 내지 431) 및 HPV11(잔기 409 내지 429) 둘 다에 대해서 나선 4의 특정 결실로 ΔN10 결실을 포함하는 L1 단백질을 생성하였다. 오량체는 FPLC에 의해 정제되었고 전자 현미경(EM)에 의해 관찰된 바와 같이 "도넛" 형상을 갖는 것으로 나타났다. 이러한 오량체로부터의 캡시드 백본의 조립체는 테스트된 어떠한 조건하에서도 발견되지 않았는데, 이는 이 카복시-말단 나선형 도메인이 T=1 또는 T=7 캡시드 백본 조립체에 필수적임을 시사한다. T=1 캡시드 백본의 결정학적 분석은 하나의 캡소미어의 α-나선 2 및 3과 인접한 캡소미어의 α-나선 4 사이의 소수성 상호작용에 의해 오량체간 접촉이 확립되는 것으로 드러났다. (Chen et al., 2000). 결과적으로, 나선 4가 결실된 돌연변이 L1은 균질한 캡소미어를 형성했지만 T=1 및 T=7 캡시드 백본을 형성하지 못하였다. (문헌[Bishop et al., 2006] 참조). 나선 4가 결실된 작제물은, 이전 보고서와 일관되게, 자체 조립 능력을 나타내지 않았다. (문헌[Schadlich et al., J. Virol., 83(15):7690-7705, 2009] 참조).
본 설명의 목적상, 용어 돌연변이 L1 단백질은 하나 이상의 비-야생형 서열을 포함하는 L1 단백질 또는 프로토머를 의미한다. 이러한 비-야생형 서열은 (서열의 내부 또는 말단에) 절단 또는 결실, 단일 잔기 치환 등을 포함한다. 예를 들어, 돌연변이 L1 단백질은 다음 중 임의의 것이 참인 L1 단백질을 포함한다: 1) 소정 수의 N-말단 잔기가 결실됨, 소정 수의 C-말단 잔기가 결실됨, 및/또는 3) 소정 수의 내부 잔기가 어떤 경우에는 서열 내에서 내부적으로 하나 이상의 위치에서 결실됨.
돌연변이 L1 단백질은 일부 실시형태에서야생형 유두종바이러스 L1 단백질로부터 유되된다. 임의의 유두종바이러스 L1 단백질이 현재 기재된 조성물에 유용하다. L1 단백질 서열은 상대적으로 보존된다. 따라서, 이하의 마우스 유두종바이러스 돌연변이 L1 단백질에 대한 설명은 예시적이며, 유두종바이러스 계열의 다른 L1 단백질에서 이루어진 동일한 돌연변이가 유사한 결과를 산출할 것으로 예상된다. 다양한 실시형태에서, 유두종바이러스 L1 단백질 및/또는 유두종바이러스 L2 단백질을 포함하는 캡시드 백본이 제공된다. 따라서, 캡시드 백본은 일부 실시형태에서 유두종 L1 및 L2 단백질 둘 다를 포함한다. 다른 실시형태에서, 캡시드 백본은 L1 단백질만으로 구성된다. 일부 실시형태에서 L1 단백질은 단일 L1 서열로 함께 병합된 하나 초과의 공급원으로부터의 L1 서열로 구성된 하이브리드 또는 키메라 단백질이다.
L1 단백질 서열은 현재까지 확인된 실질적으로 모든 유두종바이러스 유전자형에 대해 알려져 있으며, 이러한 L1 서열 또는 단편 중 임의의 것이 본 조성물에 포함되는 것으로 고려된다. L1 폴리펩타이드의 예는, 제한 없이, 전장 L1 폴리펩타이드, 예컨대, HPV16 L1 폴리펩타이드, 서열번호 128, 천연 C-말단의 임의의 하나 이상의 잔기가 결여된 L1 절단부, 천연 N-말단의 임의의 하나 이상의 잔기가 결여된 L1 절단부, 및 임의의 하나 이상의 내부 위치에 임의의 하나 이상의 내부 도메인 잔기가 결여된 L1 절단부를 포함한다. L1 단백질은 어떤 경우에는 변형된 L1 단백질, 예컨대, 변형된 HPV16 또는 MPV16 L1 단백질로서 예시되며, HPV16 L2 아미노산 17 내지 36(RG1 에피토프)은 HPV16 L1의 DE-표면 루프 내에 삽입된다. (문헌[Schellenbacher et al., J. Invest. Dermatol., 133(12):2706-2713, 2013; Slupetzky et al., Vaccine, 25:2001-2010, 2007; Kondo et al., J. Med. Virol., 80:841-6, 2008; Schellenbacher et al., J. Virol., 83:10085-10095, 2009; 및 Caldeira et al., Vaccine, 28:4384-93, 2010] 참조).
L2 폴리펩타이드는 일부 실시형태에서 전장 L2 단백질 또는 L2 폴리펩타이드 단편이다. L2 서열은 현재까지 확인된 실질적으로 모든 유두종바이러스 유전자형에 대해 알려져 있고, 이들 L2 서열 또는 단편 중 임의의 것이 본 개시내용에서 이용될 수 있다. L2 폴리펩타이드의 예는, 제한 없이, 전장 L2 폴리펩타이드, 예컨대, HPV16 L2 폴리펩타이드(서열번호 1), 또는 마우스 유두종바이러스 L2(서열번호 2), 임의의 하나 이상의 천연 C-말단이 없는 L2 절단부, 임의의 하나 이상의 천연 N-말단이 없는 L2 절단부, 및 임의의 하나 이상의 개소에 임의의 하나 이상의 내부 도메인 잔기가 없는 L2 절단부를 포함한다.
유두종바이러스 캡시드 백본은 일부 실시형태에서 L1 및 선택적으로 임의의 동물 유두종바이러스 유래의 L2 폴리펩타이드, 또는 이들의 유도체 또는 단편을 사용하여 형성된다. 따라서, 인간, 소, 말, 양, 돼지, 사슴, 개, 고양이, 설치류, 토끼 등의 유두종바이러스의 임의의 알려진(또는 이후에 확인된) L1 및 선택적으로 L2 서열이 본 명세서에 기재된 캡시드 백본을 제조하는 데 이용된다(유두종바이러스 유전자형 및 이들의 관련성에 대한 현재의 설명에 대해서는, 모든 목적을 위하여 본 명세서에 참조에 의해 원용되는 문헌[de Villiers et al., Virology, 324:17-27, 2004]을 참조한다).
소정의 실시형태에서, L1 및 선택적으로 캡시드 백본을 형성하는데 사용되는 L2 폴리펩타이드는 비-인유두종바이러스 또는 HPV6, HPV11, HPV16 및 HPV18 이외의 인유두종바이러스 유전자형으로부터 유래된다. 예를 들어, L1 및/또는 L2 단백질은 일부 실시형태에서 HPV 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 15, 17, 23, 27, 31, 33, 35, 38, 39, 45, 51, 52,58, 66, 68, 70, 76 또는 92로부터 유래된다.
위에서 기재된 바와 같이, 인유두종바이러스 HPV16에서, L1 단백질의 몇 가지 상이한 돌연변이가 특성규명되어 있다. (예를 들어, 문헌[Chen et al., 2000] 참조). 이들 돌연변이의 일부는 표 1에서의 다음을 포함한다. (Chen et al., 2000, 표 1, 558 페이지):
표 1에서, 델타 기호(Δ)는 결실을 지정하고, "N" 또는 "C"는 결실이 각각 N-말단 또는 C-말단에 위치하는지를 각각 지정한다. 이들 두 기호 다음의 숫자는 결실된 L1 서열의 잔기 수를 나타낸다. Chen 등은 단일 L1 단백질 내에서 임의의 이중, 삼중 또는 더 높은 수의 돌연변이를 보고하지 않았음에 유의한다.
따라서, 본 명세서에 기재된 L1 돌연변이 단백질은 N-말단 절단 L1 돌연변이 단백질을 포함한다. N 말단부는 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 아미노산에 의해 절단된다. 일부 실시형태에서 N-말단 절단부는 5개의 아미노산이다. 일부 실시형태에서 N-절단부는 10개의 아미노산이다. 일부 실시형태에서 N-말단 절단부는 37, 38, 39 또는 심지어 40개의 아미노산이다.
본 명세서에 기재된 L1 돌연변이 단백질은 C-말단 절단 L1 돌연변이 단백질을 더 포함한다. C 말단은 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 아미노산에 의해 절단된다. 일부 실시형태에서 C-말단 절단부는 5개의 아미노산이다. 일부 실시형태에서 C-절단부는 10개의 아미노산이다.
본 명세서에 기재된 L1 돌연변이 단백질은 임의의 수의 내부 잔기가 결실된 L1 돌연변이를 추가로 포함한다. 놀랍게도, 나선-4 영역의 보유는 일부 실시형태에서 T=1 기하구조를 갖는 캡시드 백본의 형성에 필요한 반면, 문헌에서는 위에서 논의된 바와 같이 그의 결실이 임의의 캡시드 백본 조립체를 산출하는 것으로 가정되지 않음이 보고되어 있다. 일반적으로, 기재된 돌연변이 L1 단백질에서 결실된 내부 잔기는 도 1 및 도 2에 나타낸 것들이다. 나선 4(H4) 영역에서 34개 잔기의 결실도 고려된다. 일부 경우에, L1 단백질의 내부 잔기의 절단부는 길이가 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 또는 심지어 40개 잔기이다
C-말단 및/또는 N-말단 및/또는 내부 잔기 중 어느 하나 이상이 동시에 결실된 L1 돌연변이 단백질이 또한 본 명세서에 기재된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서 돌연변이 L1 단백질은 유사한 또는 다양한 길이의 C- 및 N-말단 절단 돌연변이 둘 다를 갖는다. 다른 실시형태에서, 돌연변이 L1 단백질은 C-말단 절단부 및 내부 잔기 절단부를 갖는다. 일부 실시형태에서, 돌연변이 L1 단백질은 N-말단 절단부 및 내부 절단부를 갖는다. 소정의 실시형태에서, 돌연변이 L1 단백질은 모두 3개의 위치에 동시에 절단부, 즉, C-말단, N-말단 및 내부 절단부를 갖는다.
본 명세서에 기재된 돌연변이 L1 단백질은 일반적으로 재조합적으로 생산되지만, 임의의 공지된 단백질 발현 방법에 의해서도 생산된다. 예를 들어, 돌연변이 L1 단백질은, 실시예 부문에서 이하에 더욱 상세히 설명되는 바와 같이, 먼저 야생형 L1 서열에 상보적인 DNA 프라이머를 설계한 다음 야생형 L1 서열을 절단하나 다르게는 돌연변이시키도록 설계된 프라이머의 존재 하에 서열의 PCR 증폭을 수행함으로써 생성된다. (또한 문헌[Touze et al., J. Clin. Microbiol., 36(7):2046-2051, 1998] 참조). 적절한 프라이머 서열 및 PCR 프로토콜의 설계 및 구현이 알려져 있으며, 이러한 방법은 궁극적으로 돌연변이 L1 단백질이 발현되는 목적하는 돌연변이 L1 단백질 핵산 서열을 생성하는 데 사용된다.
이어서, 돌연변이 L1 단백질 핵산 서열은 일부 실시형태에서 발현이 수행되는 유기체에 따라 더 나은 단백질 발현 및 생산을 위해 코돈-최적화된다. 소정의 발현 벡터 및 숙주 발현 시스템에 대한 상이한 코돈 최적화 방법의 활용은 당업계에 공지되어 있다. (예를 들어, 문헌[Mauro and Chappell, Trends in Molecular Medicine, 20(11):604-613, 2014] 참조).
이어서, 돌연변이 L1 단백질 핵산 서열을 허용 가능하게 준비되고 단백질 발현을 위해 설계된 상업적으로-입수 가능한 발현 벡터에 결찰시킨다. 소정 발현 숙주에 대한 기능성을 갖는 다양한 유형의 발현 벡터는 널리 상업적으로 입수 가능하다. 본 명세서에 기재된 재조합 돌연변이 L1 단백질은 진핵 세포뿐만 아니라 박테리아에서도 발현되며, 소정 실시형태에서는 시험관 내에서 발현 가능하다.
종종 박테리아 숙주에서 재조합체 단백질의 발현은 봉입체(IB)의 형성을 초래한다. 따라서, 어떤 경우에는, IB로 발현되는 재조합체 돌연변이 L1 단백질은 공지된 절차를 사용하여 가용화된다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 발현된 돌연변이 L1 단백질의 IB의 가용화는, 예를 들어, 도 3 및 실시예 3에 제시된 단계들을 포함한다. 방법은 다음과 같은 다양한 단계를 포함한다: (a) 원핵 세포를 L1 단백질을 암호화하는 발현 벡터로 형절전환시키는 단계; (b) 형질전환된 원핵 세포를 L1 단백질의 발현을 촉진시키는 조건하에 배양하는 단계; (c) 형질전환된 원핵 세포를 용해시켜 발현된 L1 단백질을 방출시키는 단계; (d) 발현된 L1 단백질로부터 세포 파편을 분리시키고 L1 단백질을 IB 형태로 회수하는 단계; (e) 선택적으로 L1 단백질 IB를 세척하는 단계; (f) L1 단백질 IB를 가용화시키는 단계; (g) L1 단백질을 선택적으로 하나 이상의 변성제, 환원제, 등의 존재하에 리폴딩시키는 단계; 및 (h) 리폴딩된 L1 단백질을 조립 완충제에서 인큐베이션함으로써 삼각화 수 T가 1인 이십면체 또는 십이면체 캡시드를 형성하는 단계. 이러한 방법은, 일부 실시형태에서, 하나 이상의 펩타이드의 존재 중 환원 조건 하에 조립된 L1 단백질을 인큐베이션하고/하거나 접합 완충액으로부터 변성제를 제거하는 한편 삼각화 수 T가 1인 이십면체 또는 십이면체 캡시드를 형성할 때 환원제를 유지함으로써 접합 완충액에서 하나 이상의 펩타이드를 조립된 L1 단백질에 접합시키는 단계를 추가로 포함한다.
기재된 돌연변이 L1 단백질을 생성하고 정제하기 위한 기재된 방법 및 공정은 유두종바이러스 캡시드의 조립을 위하여 당업계에 기재된 그러한 공정과는 많은 측면에서 상이하다. 실제로, 고차 유두종바이러스 캡시드로의 조립은 L1 단백질이 먼저 환원제를 포함하는 분해 완충액에 노출되어야 한다는 것이 당업계에 공지되어 있다. 그런 다음 이 단계는 종종 L1 단백질을 조립 완충제에 적용하고 나서 환원제를 제거한다. 이 레거시 방법론(legacy methodology)은 향상된 특성을 가진 안정적인 캡시드를 생성한다. (문헌[McCarthy et al., 10.1128/JVI.72.1.32-41, 1998, Zhao et al., Virol. J., 9:52, 2012, Mach et al., J. Pharm. Sci., 95:2195-2206, 2006] 및 미국 특허 번호 6,436,402 참조).
돌연변이 L1 단백질로부터 형성된 캡시드 백본의 현저한 특성
소정의 돌연변이 L1 단백질이 유익하고 예상치 못한 특성을 갖는다는 것이 본 명세서에 기재된 연구 동안 우연히 발견되었다. 예를 들어, 소정의 돌연변이 L1 단백질은 도움이 되고 예상치 못한 접합 특성을 갖는 T=1 캡시드 백본의 형성을 주로 유도하였다. T=7 캡시드 백본 대신에 T =1 캡시드 백본의 형성은 환원 조건 하에서 더 높은 안정성을 초래하므로, T=7 캡시드 백본을 형성하는 야생형 서열과 비교하여 더 높은 접합 효율을 초래한다.
예를 들어, 돌연변이 캡시드 백본, 예컨대, MPV.10.34.d 백본이 펩타이드와 접합될 수 있는 효율은 25 내지 85% (w/w)이다. 일부 실시형태에서, 접합 효율은 약 25%이다. 다른 실시형태에서, 접합 효율은 약 25, 약 35, 약 45, 약 55, 약 65, 약 75, 또는 심지어 약 85% (w/w)이다.
대조적으로, 야생형 T=7 캡시드 백본은 일반적으로 약 25% 미만인 더 낮은 접합 효율을 갖는다. 예를 들어, WO 2020/139978을 참조한다. T=7 캡시드 백본에 비해서 T=1 캡시드 백본에 접합된 더 많은 양의 펩타이드를 달성하는 능력은 T=7 캡시드 백본으로부터의 IRC 형태와 비교하여 전반적으로 더 낮은 IRC 투여량으로 표적 종양 또는 암에 더 많은 수의 펩타이드를 전달할 수 있게 한다.
또한, T=7 캡시드 백본과 비교하여 더 작은 기하학적 형태 또는 크기를 갖는 T=1 캡시드 백본은 T=1 캡시드 백본으로부터 만들어진 IRC가 대상체에게 주입되고 IRC가 종양 미세환경에 침투함으로써 덜 입체 장애를 허용한다. 이 유익하고 예상치 못한 효과는 동등한 T=7 또는 더 고차의 캡시드 백본-기반 IRC와 동일한 효과를 달성하는 데 필요한 더 낮은 IRC 용량으로 이어진다.
T=1 캡시드 백본 기하구조의 이들 및 기타 추가적인 유익한 특징은 이하에서 더 상세히 기재된다.
돌연변이 L1 단백질 IRC 및 작용 메커니즘
일부 실시형태에서, 돌연변이 L1 단백질은 또 다른 펩타이드에 접합된다. 돌연변이 L1 단백질로 구성된 캡시드 또는 캡시드 백본에 더 유익한 기능을 추가하기 위하여, 추가의 펩타이드가 이러한 캡시드의 표면에 접합된다. 이들 펩타이드는 캡시드에 유익한 기능을 추가하고 이를 필요로 하는 대상체에서 암 치료와 같은 추가 기능을 초래한다.
일 실시형태에서, 접합된 유두종바이러스 캡시드 백본은 L1 캡시드 단백질 및 펩타이드를 포함한다. 다른 실시형태에서, IRC는 (적어도 하나의) L1 캡시드 단백질, (적어도 하나의) L2 캡시드 단백질 및 적어도 하나의 펩타이드를 포함한다. L1 폴리펩타이드는 일부 실시형태에서는 전장 L1 단백질이거나 또는 다른 실시형태에서는 L1 폴리펩타이드 단편이다. 구체적인 실시형태에서, 전장 L1 단백질 또는 L1 폴리펩타이드 단편은 캡시드 백본 조립체-적격(competent)이고; 즉, L1 폴리펩타이드는 고차 구조 기하형태로 자가-조립할 수 있는 적절한 조건 하에 자가-조립하여 캡소미어를 형성함으로써, 캡시드 백본을 형성할 것이다. 보다 구체적인 실시형태에서, 캡시드 백본은 T=1 입자, 직경이 약 20nm 내지 30nm인 구조를 포함하고, 12개의 캡소미어 또는 60 카피의 L1 단백질로 구성된다. 다른 실시형태에서, 캡시드 백본은 약 50 nm의 구조이고 72개 캡소미어 또는 360 카피의 L1 단백질로 구성된 완전 조립된 유두종바이러스 캡시드를 포함한다.
다양한 실시형태에서, 본 명세서에 제시된 IRC는 하나 이상의 암세포에 특이적으로 또는 비특이적으로 결합하거나, 또는 다르게는 접촉한다. 이는 부분적으로는 어떤 경우에는 종양 세포에 특이적이거나 또는 종양 세포에 의해 더 높은 풍부도로 발현되는 단백질 및/또는 분자에 대한 캡시드 백본의 선택성(향성)에 기인한다. 다양한 실시형태에서, IRC는 헤파린 설페이트 프로테오글리칸(HSPG)의 소정의 하위 계열 유형에 결합하며, 이는 종양 세포에 우선적으로 발현된다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "암세포에 결합하는"은, IRC가 종양 세포에 매우 근접하게 되고 펩타이드가 캡시드 백본으로부터 절단되고, 이어서 펩타이드가 종양 세포 표면 상에 존재하는 MHC 수용체에 결합하거나, 이에 의해 결합되거나 또는 다르게는 상호작용하도록 IRC의 캡시드 단백질과 종양 세포 간의 비공유 상호작용의 형성을 지칭한다.
다양한 실시형태에서, 펩타이드는 대상체에 이미 존재하는 T 세포 또는 T 세포 집단에 의해 인식되는 에피토프이다. 다양한 실시형태에서, 이러한 기존 T 세포 또는 T 세포 집단은 사전 감염 또는 백신접종 때문에 존재한다. 다양한 실시예에서, 펩타이드는 T 세포에 의해 결합될 수 있는 에피토프이다. 다양한 실시예에서, 펩타이드는 개체에 이미 존재하는 T 세포에 의해 결합될 수 있는 에피토프이다. 이러한 맥락에서 "결합될 수 있는"은 "에피토프"가 MHC 분자에 결합되는 세포의 표면에 제시된다는 것을 의미한다. MHC 클래스 I 수용체에 의해 제시될 수 있는 T 세포 에피토프는 세포독성 CD8 T 림프구(CD8 T 세포 또는 CTL)의 T 세포 수용체에 의해 결합된다. MHC 클래스 I 분자에 의해 제시될 수 있는 T 세포 에피토프는 전형적으로 약 9 내지 약 12개 아미노산 길이의 펩타이드이다. 다양한 실시예에서, 방출 시 하나 이상의 암 또는 종양 세포의 표면에서 발현되는 하나 이상의 MHC 분자에 의해 직접 결합되고 그에 따라 적절하게 제시될 수 있는 T 세포 반응-유도 펩타이드를 방출하는 IRC가 제공된다. 방출된 펩타이드는 사이토졸에서 항원 처리 기계에 의한 처리를 필요로 하지 않기 때문에, T 세포 반응-유발 펩타이드는 짧은 시간 내에 표적 세포의 표면에 제시된다. IRC로부터 이러한 펩타이드의 방출 및 표적 세포의 MHC 분자에 의한 펩타이드의 후속 결합 과정은 이들 종양 또는 암 세포에 표지, 태그부착 또는 다르게는 "마킹"하는 것과 유사하다. 이 태그부착 또는 마킹은 대상체의 면역계의 다른 구성 요소에 의한 신속한 식별을 유도함으로써, 다양한 공지된 세포 파괴 경로를 통해 암 또는 종양 세포를 제거하기 위해 대상체의 면역계의 이러한 구성 요소를 모집한다.
그러므로, 본 명세서에 기재된 기재된 방법, 용도 및 조성물의 일 실시형태에서, 대상체에게 IRC 용량의 투여 후 약 8.5시간 미만에, IRC는 자연적으로 표적 세포로 이동한 후 IRC로부터 방출된 T 세포 반응-유도 펩타이드는 암세포 상에서 MHC 분자에 의해 결합되고, 이어서 인식을 위해 MHC 클래스 I 분자를 통해 대상체의 면역계의 다른 구성 요소에 표적 세포의 표면 상에서 제시된다. 본 발명의 또 다른 실시형태에서, 표적 세포에 IRC 도입 후 23.5시간 미만에, T 세포 반응 유도 펩타이드는 MHC 클래스 I 분자를 통해 표적 세포의 표면에 제시된다. 본 발명의 다른 실시형태에서, IRC는 표적 세포에 IRC 투여 후 6시간 미만 이내에 표적 세포에 대한 T 세포 세포독성을 매개할 수 있다.
다양한 실시형태에서, 펩타이드는 하나의 에피토프를 포함하거나 또는 적어도 2개의 에피토프를 포함한다. 펩타이드 에피토프는 어떤 경우에는 상이한 단백질로부터 유래되거나, 또는 다른 실시형태에서는 동일한 단백질(또는 항원)로부터 유래된 에피토프이다. 다양한 실시형태에서, 병원체는 바이러스, 박테리아, 진균, 기생충, 또는 이들의 조합이다.
다양한 실시형태에서, 대상체의 기존의 T 세포는 백신 에피토프에 특이적이다. 다양한 실시형태에서 에피토프는 소아, 유아기, 청소년, 또는 중장년(노인) 백신으로부터 유래된다. 다양한 실시형태에서 대상체의 기존의 면역력은 인간 백신의 투여 전의 결과이다. 본 명세서에 기재된 펩타이드에 혼입되는 에피토프를 포함하는 본 명세서에 기재된 항원은 기지의 임의의 감염체, 예컨대, 바이러스, 박테리아, 기생충, 진균 등에서 발견된다. 다양한 실시형태에서, 펩타이드는 표 2에 제공된 목록으로부터 선택된다.
예를 들어, 일부 실시형태에서 기재된 펩타이드에 혼입되는 에피토프를 보유하는 항원이 유래되는 바이러스의 비제한적인 예는, 예를 들어, 백시니아 바이러스, 수두 대상포진 바이러스, 헤르페스바이러스, 예컨대, 대상포진 바이러스 또는 거대세포바이러스 또는 엡스타인-바 바이러스, 풍진, 간염 바이러스, 예컨대, A형 간염 바이러스 또는 B형 간염 바이러스 또는 간염 C 바이러스, 인플루엔자, 예컨대, 유형 A 또는 유형 B, 홍역 바이러스, 유행성이하선염 바이러스, 소아마비 바이러스, 천연두(smallpox) 바이러스, 공수병 바이러스, 코로나바이러스, 뎅기열 바이러스, 에볼라 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 황열 바이러스, 또는 지카 바이러스를 포함한다.
예를 들어, 일부 실시형태에서, 기재된 펩타이드에 혼입되는 에피토프를 보유하는 항원이 유래되는 박테리아의 비제한적인 예는, 예를 들어, 보르데텔라 페르투시스(Bordetella pertussis), 클라미디아 트라코마티스(chlamydia trachomatis), 클로스트리듐 테타니(Clostridium tetani), 디프테리아, 헤모필루스 인플루엔자(Hemophilus influenza), 수막염균(Meningococcus), 폐렴구균(pneumococcus), 비브리오 콜레라(vibrio cholera), 마이코박테륨 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), BCG, 장티푸스, 이.콜라이, 살모넬라(salmonella), 레지오넬라 뉴모필라(Legionella pneumophila), 리케치아(rickettsia), 트레포네마 팔리듐 팔리듐(Treponema pallidum pallidum), 스트렙토코커스(Streptococcus) A군 또는 B군, 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumonia), 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis), 클로스트리듐 보툴리늄(Clostridium botulinum), 또는 예르시니아 종(Yersinia sp.) 박테리아를 포함한다.
일부 실시형태에서, 기재된 펩타이드에 혼입되는 에피토프로를 보유하는 항원이 유래되는 기생충의 비제한적인 예는, 엔트아메바 히스토리티카(Entamoeba histolytica), 톡소플라스마 곤디이(Toxoplasma gondii), 트리키넬라 종(Trichinella sp.), 예컨대, 트리키넬라 스피랄리스(Trichinella spiralis), 트리코모나스 종(Trichomonas sp.), 예컨대, 트리코모나스 바기날리스(Trichomonas vaginalis), 트리파노소마 종(Trypanosoma sp.), 예컨대, 트리파노소마 브루세이 감비엔스(Trypanosoma brucei gambiense), 트리파노소마 브루세이 로데시엔스(Trypanosoma brucei rhodesiense) 또는 트리파노소마 크루지(Trypanosoma cruzi), 또는 플라스모듐(Plasmodium), 예컨대, 플라스모듐 팔시파룸(Plasmodium falciparum), 플라스모듐 비박스(Plasmodium vivax) 또는 플라스모듐 말라리애(Plasmodium malariae)를 포함한다.
다양한 실시형태에서 에피토프는 소아 백신, 유아기, 청소년 또는 중장년(노인) 백신과 같은 하나 이상의 알려진 인간 백신에서 발견된다. 다양한 실시형태에서 백신은 유아기 백신이다. 기재된 펩타이드와 양립 가능한 이러한 에피토프가 발견되는 적합한 백신의 소정의 비제한적 예는 표 3에 열거되어 있다.
다양한 실시형태에서, 에피토프는 IRC로부터 펩타이드의 단백질분해 절단 후에 방출된다. IRC로부터의 펩타이드의 단백질분해 절단 후, 에피토프는 MHC, 선택적으로 MHC 클래스 I, 분자에 결합한다. MHC 분자는 일부 실시형태에서 HLA-A, B, 및/또는 HLA C 계열로부터 유래된다. MHC 클래스 I 분자에 결합하는 구체적인 에피토프는 당업계에서 어디서나 발견되는 표 2 또는 표 3에 열거되거나 또는 당업계의 어느 곳인가에서 발견되는 임의의 것이다. MHC 클래스 I 분자 자체는, 일부 실시형태에서, 다음의 비제한적인 예 중 하나 이상이다: HLA-A*02:01, HLA-A*03:01, HLA-A*11:01, HLA-A*201, HLA-A*020101, HLA-A*0203, HLA-A*0206, HLA-A2, HLA-A2.1, 또는 HLA-A*02.
기재된 방법, 용도 및 조성물의 양상에서, 에피토프는 약 8개 아미노산 내지 약 50 아미노산 길이, 또는 약 8개 아미노산 내지 약 45 아미노산 길이, 또는 약 8개 아미노산 내지 약 40 아미노산 길이, 약 8개 아미노산 내지 약 35 아미노산 길이, 또는 약 8개 아미노산 내지 약 30 아미노산 길이, 약 8개 아미노산 내지 약 25 아미노산 길이, 약 8개 아미노산 내지 약 20 아미노산 길이, 또는 약 8개 아미노산 내지 약 15 아미노산 길이이다. 본 발명의 양상에서 펩타이드는 약 13개 아미노산 내지 약 50 아미노산 길이, 또는 약 13개 아미노산 내지 약 45 아미노산 길이, 또는 약 13개 아미노산 내지 약 40 아미노산 길이, 약 13개 아미노산 내지 약 35 아미노산 길이, 또는 약 13개 아미노산 내지 약 30 아미노산 길이, 약 13개 아미노산 내지 약 25 아미노산 길이, 약 13개 아미노산 내지 약 20 아미노산 길이, 또는 약 13개 아미노산 내지 약 15 아미노산 길이이다. 일부 실시형태에서, CD8+ T 세포 에피토프는, 예컨대, 약 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 또는 약 17개 아미노산 길이이다.
절단 서열. 다양한 실시형태에서, 절단 시, 펩타이드가 IRC로부터 방출될 수 있고 이어서 펩타이드가 종양 또는 암세포 표면 상에서 MHC에 자유롭게 결합되게 하는 하나 이상의 프로테아제 절단 서열이 IRC에 혼입된다. 다양한 실시형태에서, IRC는 엔도솜을 탈출하고, 분해되고, 치료용 카고(therapeutic cargo)를 기능적 형태의 사이토졸로 방출해야 한다. 다양한 실시형태에서 IRC 및/또는 IRC의 펩타이드는 종양 미세환경 내에서, 즉, 종양 또는 종양 세포를 둘러싸고 있는 인근의 간극 공간에서 단백질분해 효소에 의한 절단에 민감하고, IRC 또는 펩타이드에서 표적 절단 서열의 위치는 표적 부위의 절단이 IRC로부터 CD8+ T 세포 에피토프를 포함하는 펩타이드의 전부 또는 일부를 방출하고, 이어서 대상체의 종양 세포의 표면 상에서 발현되는 MHC 분자에 자유롭게 결합하고/하거나 이와 복합체를 형성하게 하도록 한다. 이러한 최종 목표를 달성하는 데 요구되는 IRC의 약제학적으로 유효한 또는 치료적 양은 시험관내 세포 배양 기술, 동물 모델 연구 및 소규모 내지 대규모 인간 임상 시험을 활용하는 공지의 임상 방법에 의해 당업자에 의해 결정된다. 본 명세서에 기재된 방법 및 본 명세서에서의 용도에서 이를 필요로 하는 대상체에게 투여되는 IRC의 양은, 예컨대, 대상체의 특징, 예컨대, 연령, 체중, 성별, 및/또는 의학적 상태/병력, 유전적 구성 및 대상체 또는 대상체의 부류에 관련된 기타 요인에 따라 좌우될 것이고 종양의 특징, 예컨대, 유형, 부피 및 발달 상태도 임상 연구를 찾는 용량 범위를 설계할 때 고려될 것임이 이해될 것이다.
단백질분해 절단 서열은 일부 실시형태에서 종양 세포에, 그 부근에 또는 인근에 존재하는 임의의 프로테아제에 의해 인식된다. 적어도 약 569개의 공지된 프로테아제가 기재되어 있다. (문헌[Lopez-Otin, et al., Nature Reviews Cancer, 7(10):800-808, 2007] 참조). 현재까지 확인된 모든 인간 단백질분해 효소는 메탈로프로테이나제, 세린, 트레오닌, 시스테인 및 아스파르트산 프로테아제의 5가지 촉매 부류로 분류 가능하다. 잠재적인 프로테아제의 비제한적 목록은 표 4에 설명되어 있으며, 이는 5개의 주목된 부류로 분포된 가장 잘 연구된 프로테아제의 예시를 요약한 표이다. (문헌[Choi, Ki Young et al., "Protease-activated drug development," Theranostics, (2)2:156-78, 2012] 참조). 이들 프로테아제 중 몇몇은 건강한 세포에 비해 암세포에서 과발현되는 것으로 밝혀졌다.
다양한 실시형태에서, 단백질분해 절단 서열은 매트릭스 메탈로프로테이나제(MMP)인 프로테아제 퓨린에 의해 인식되고, 이 중 몇 가지 상이한 구성원, 예컨대, MMP, 1, 2, 3, 7, 8, 9, 11, 13, 14 또는 19, ADAM(디스인테그린 및 메탈로프로테이나제), 예컨대, ADAMS 8, 9, 10, 15, 17 또는 28, 카텝신, 예컨대, 카텝신 D, G, H, 또는 N이 확인되어 있다. 본 명세서에서는 프로테아제 엘라스타제, 프로테이나제-3, 아주로시딘 및 ADAMTS-1도 고려된다. 다양한 실시형태에서, 절단 서열은 위에서 언급된 프로테아제 중 임의의 하나 이상에 의해 인식되고, 소정의 실시형태에서, 서열은 인간 퓨린 프로테아제에 의해 인식된다. 다양한 실시형태에서, 절단 서열은 적어도 약 4개의 아미노산 잔기를 포함하고, 이 중 적어도 약 3개는 아르기닌 잔기이다. 다양한 실시형태에서, 절단 서열은 적어도 4 아미노산 잔기를 포함하고, 이 중 적어도 약 3개는 아르기닌 잔기이고 이 중 하나는 라이신 잔기 또는 아르기닌 잔기이다. 다양한 실시형태에서, 절단 서열은 R-X-R/K-R(서열번호 89)이다. 다양한 실시형태에서, 절단 서열은 추가의 잔기를 포함한다. 다양한 실시형태에서, 절단 서열은 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 약 9개의 추가의 아르기닌 잔기를 더 포함한다. 아르기닌은 양으로 하전된 것으로 알려져 있으며, 양전하를 띤 아르기닌 잔기의 더 긴 사슬이 더 음으로 하전된 캡시드 백본의 표면에 펩타이드를 더 가깝게 가져올 것이라는 것이 발견되었다.
다양한 실시형태에서, 펩타이드는 이하에 더욱 상세히 기재된 바와 같이 캡시드 백본에 결합된다. 펩타이드가 캡시드 백본과 회합되거나 이에 결합될 수 있는 다수의 공지된 수단이 있다. 본 개시내용의 다양한 실시형태에서, 절단 서열은 말레이미드 결합 또는 아미드 결합(아래에서 논의됨)에 의해 화학적으로 접합된다. 펩타이드는 일반적으로 캡시드 백본의 임의의 잔기에 연결되지만; 이황화 결합, 말레이미드 결합 및 아미드 결합은 캡시드 백본을 포함하는 돌연변이 L1 단백질의 시스테인, 라이신 또는 아르기닌 잔기에 펩타이드를 접합함으로써 형성된다.
다양한 실시형태에서 펩타이드는 적어도 하나의 프로테아제 절단 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 프로테아제 절단 서열은 종양 세포에 의해 또는 종양 세포 근처에서 우선적으로 절단될 수 있는 임의의 서열이다. 이 절단 서열을 펩타이드에 삽입하면 IRC가 종양 미세환경에 들어갈 때까지 단백질이 캡시드 백본 담체에 부착된 채로 유지할 수 있다. 암 조직 또는 종양 미세환경에서 특정 프로테아제의 상승된 활성을 이용함으로써, 펩타이드는 캡시드 백본으로부터 대부분 방출되지 않고 펩타이드가 종양 미세환경에 들어갈 때까지 MHC 수용체를 능동적으로 코팅할 수 있다. 몇몇 프로테아제는 종양 미세환경에서 활성인 것으로 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 여러 메탈로-, 시스테인 및 세린 프로테아제가 알려져 있다. 암 요법의 관점에서, 추가적인 매력은 전구약물 절단을 담당하는 프로테아제가 암세포뿐만 아니라 종양의 간질 성분으로부터도 나올 수 있기 때문에 종양 미세환경으로의 활성 약물 방향의 방출이 암세포에 의해서만 발현되는 표적에 의존하지 않는다. 대신에, 표적을 나타내는 것은 전체 종양 생태계이다.
L1 단백질에 펩타이드를 부착시키는 방법
본 명세서에 기재된 캡시드 백본은 일부 실시형태에서 우선 캡시드 백본과 회합된 하나 이상의 펩타이드를 함유하는 에피토프를 표적 세포로 전달하도록 기능화되고, 이에 의해서 파괴를 위하여 종양 또는 암세포를 표지화한다. 다양한 실시형태에서, 펩타이드는 캡시드 단백질 상의 시스테인 잔기를 통해 캡시드 백본에 접합된다. 이러한 시스테인 분자는 캡시드 백본의 표면에 자연적으로 또는 돌연변이에 의해 제시된다. 다양한 실시형태에서, 캡시드 백본은 캡시드 백본의 캡시드-유사 이십면체 구조를 유지하면서 캡시드 백본의 표면 상의 시스테인 잔기의 설프하이드릴기를 환원시키기에 충분한 환원 조건에 적용된다. 시스테인은, 유리 설프하이드릴기 때문에, 산화 조건에서 다른 설프하이드릴-함유 리간드와 쉽게 그리고 자발적으로 이황화 결합을 형성한다. 대안적으로, 일련의 화합물은 pH 약 6.5 내지 약 7.5에서 시스테인 잔기와 쉽게 그리고 비가역적으로 티오에스터 결합을 형성하는 수용성 기질에 말레이미드 모이어티를 첨가하는 것으로 알려져 있다. 따라서, 일 실시형태에서, 펩타이드는 말레이미드 결합을 통해 캡시드 백본과 회합된다.
다양한 실시형태에서, 펩타이드는 캡시드 백본 상의 라이신 잔기에 접합된다. 라이신 잔기는 1차 아민 모이어티로 인해 쉽게 변형된다. n-하이드록시석신이미드(NHS) 에스터 반응이라 불리는 반응을 사용하여(NHS가 반응의 일부로서 방출되기 때문에), 캡시드 백본 상의 표면-노출된 라이신 잔기에서 아미드 결합이 형성된다. NHS 반응은 약 pH 7.2와 약 pH 9 사이에서 자발적으로 발생한다.
다양한 실시형태에서, 펩타이드는 아스파테이트 또는 글루타메이트 잔기에 접합된다. 시스테인 및 라이신기를 수반하는 화학적 결합 전략과 달리, 아스파테이트 또는 글루타메이트 잔기에의 화학적 커플링은 여러 단계를 필요로 한다. 먼저, 1-에틸-3-(3-다이메틸아미노프로필)카보다이이미드 하이드로클로라이드(EDC) 또는 유사한 화학적 가교 시약을 사용하여 아스파테이트 또는 글루타메이트의 카복실산을 활성화시킨다. 일단 활성화되면, 이 부가물은 NHS와 반응하여 NHS 에스터를 형성할 것이다. 이어서, NHS 에스터는 노출된 1차 아민을 가진 리간드와 반응하여 안정적인 아마이드 결합을 형성한다.
다양한 실시형태에서, 캡시드 백본은 양으로 하전된 아미노산의 영역을 포함하는 융합 단백질에 결합할 수 있는 표면 노출 영역에 음으로 하전된 아미노산의 영역을 포함한다. 다양한 실시형태에서, 음으로 하전된 아미노산의 영역은 다가음이온:시스테인 또는 보다 구체적으로 폴리글루탐산:시스테인 또는 폴리아스파르트산:시스테인으로 지칭되는, 하나 이상의 시스테인 잔기에 의해 한쪽 또는 양쪽에 측접된다. 이와 같은 경우에, 캡시드 백본 및 펩타이드의 접합은 캡시드 백본과 펩타이드의 상보적 아미노산 전하 사이의 비-공유 결합 및 시스테인 사이의 이황화 결합으로 인해 생성될 것이다. 다양한 실시형태에서, 시스테인(들)은 임의의 2차/3차 구조가 하전된 아미노산 영역을 시스테인(들)에 매우 근접하게 만들도록 하전된 아미노산의 영역으로부터 떨어진 하나 이상의 아미노산이다. 다양한 실시형태에서, 펩타이드는 말단 시스테인과 CD8+ T 세포 에피토프 사이에 위치하는 효소 절단 부위 및 상보적인 다가이온:시스테인 서열을 포함하는 캡시드 백본에 펩타이드를 부착하기 위한 다가이온:시스테인 및 적어도 하나의 펩타이드를 포함한다. 다양한 실시형태에서, 펩타이드는 말단 시스테인, 적어도 하나의 펩타이드, 및 말단 시스테인과 펩타이드(들) 사이에 위치한 효소 절단 서열을 포함한다.
기재된 IRC를 생성하는 데 사용될 수 있는 음으로 하전된 아미노산은, 예를 들어, 글루탐산 및 아스파르트산을 포함한다. 이들 아미노산, 일부 실시형태에서, 예를 들어, 폴리글루탐산은 단독으로, 또는 조합하여 사용된다. 구체적인 실시형태에서, 음으로 하전된 영역은 글루탐산을 포함한다. 음으로 하전된 아미노산의 수는 다양할 수 있으며, 약 4 내지 약 20개 아미노산, 약 6 내지 약 18개 아미노산, 또는 약 8 내지 약 16개 아미노산 등을 포함할 수 있다. 구체적인 실시형태에서, 음으로 하전된 영역은 약 8개의 음으로 하전된 아미노산을 포함한다. 보다 구체적인 실시형태에서, 음으로 하전된 영역은 EEEEEEEEC(E8C)(서열번호 130)를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 음으로 하전된 영역은 CEEEEEEEEC(서열번호 131)를 포함한다. 이황화 결합을 통해 캡시드 백본에 펩타이드를 접합시키는 방법은 알려져 있다. 예를 들어, 펩타이드 상의 폴리아르기닌-시스테인 모이어티의 존재는 캡시드 백본의 다양한 루프에 존재하는 다가음이온 부위(EEEEEEEEC, E8C, 서열번호 130)에 펩타이드의 도킹을 가능하게 한다. 2개의 시스테인 잔기 사이의 공유 가교결합은 산화 조건 하에서 이러한 회합을 비가역적으로 만들 것이다. 접합 반응에 있어서, 정제된 캡시드 백본을 접합 완충액(20mM Tris/HCl pH = 7.5, 150mM NaCl, 5% 글리세롤, 0.5mM CaCl2)으로 투석한 다음, 펩타이드와 산화 시약을 첨가하여, 4℃에서 16시간 동안 반응이 진행될 수 있게 한다. 인큐베이션 종료 시, 반응 혼합물을 크기-배제 컬럼(예컨대, SEPHADEX® G-100, Pharmacia, 미국 뉴저지주 소재, 부피 20㎖, 유량 1 ml/분, 10mM Tris/HCl(pH 약 7.4), 150mM NaCl, 0.5mM CaCl2)에 적용하여 접합되지 않은 펩타이드를 제거하고 완충액을 교환한다. 공극 부피에서 용리되는 IRC는 SDS-PAGE 상의 L1 단백질의 존재에 의해 확인된다. 접합된 캡시드 백본(IRC)은 이어서 선택적으로 전자 현미경에 의해 분석된다.
다양한 실시형태에서, 펩타이드는 L1 단백질에 유전적으로 융합된다. 다양한 실시형태에서, 펩타이드는 캡시드 백본에 공유적으로 또는 비-공유적으로 연결된다. 예컨대, 음으로 및 양으로 하전된 아미노산의 결합을 통해, 또는 말레이미드 기반 접합을 통해 펩타이드를 캡시드 백본에 부착하는 대신에, 펩타이드를 암호화하는 핵산 서열이 일부 실시형태에서 L1 단백질을 암호화하는 핵산으로 삽입되어, 발현 시 펩타이드가 생성되도록 할 수 있으며, 여기서 펩타이드는 캡시드 단백질의 루프에 삽입되고 캡시드 백본의 표면 상에 표시된다.
다양한 실시형태에서, 비천연 아미노산이 펩타이드를 캡시드 백본에 접합시키는 데 사용된다. 20가지의 천연 아미노산 이외에, 다수의 비-천연 아미노산이 부위-특이적 단백질 접합 반응에 사용되었다. 예를 들어, 아지도호모알라닌(AHA) 또는 p-아미노-페닐알라닌(pAF)은 접합을 위해 캡시드 백본 코트 단백질에 통합될 수 있다. 이들 아미노산은 2가지 방식, 즉, 전체 메티오닌 대체 및 앰버 정지 코돈 억제로 단백질에 통합된다. AHA는 메티오닌과 매우 유사하기 때문에, AHA는 메티오닌 공급이 속도 제한적인 경우 각각의 AUG에 통합될 것이며, 이는 전체 메티오닌 대체라고 한다. 메티오닌 또는 무세포 단백질 합성을 위한 박테리아 영양요구성을 사용하여 메티오닌 가용성을 제한할 수 있다. 앰버 정지 코돈 억제는 pAF를 통합할 것이다. 앰버 정지 코돈 억제는 비천연 합성효소 및 천연 아미노산과 반응하지 않는 tRNA를 사용하여 앰버 정지 코돈 UAG에서 비-천연 아미노산을 통합한다. 아지드를 표시하는 AHA는 구리(I)-촉매된 아지드-알킨 첨가환화("클릭" 반응)에 참여하여 알킬-포함 리간드와 공유 트라이졸 고리를 형성할 것이다.
다양한 실시형태에서, IRC는 L1 단백질의 적어도 1/10이 펩타이드를 표시하는 것을 포함한다. 다양한 실시형태에서, L1 단백질의 적어도 1/5는 펩타이드를 표시한다. 다양한 실시형태에서, L1 단백질의 약 절반은 펩타이드를 표시한다. 다양한 실시형태에서, L1 단백질의 약 2/3은 리콜 펩타이드를 표시한다. 다양한 실시형태에서, 거의 모든 L1 단백질은 펩타이드를 표시한다.
IRC 및 임상 요법에서의 이의 용도
다양한 실시형태에서, 캡시드 백본은 종양 세포에 우선적으로 결합한다. 캡시드 백본의 종양 선호도는, 일부 실시형태에서, 캡시드 백본의 전하(양성 또는 음성), 형상 및 크기(상이한 종횡비 필라멘트 및 직경 구체), 차폐(다양한 크기 및 밀도의 자가-단백질/펩타이드 및 중합체), 및 표적화(다양한 밀도로 상이한 링커 상에 표시되는 환경 인자 또는 수용체에 대한 리간드)와 같은 여러 출처로부터 비롯된다.
전하의 측면에서, 다양한 실시형태에서, 캡시드 백본은 양성 표면 전하를 포함한다. 양으로 하전된 캡시드 백본은 일부 연구에서 대상체에게 주사될 때 순환에서 더 오래 머무르는 것으로 나타났다. 음전하를 부여하는 세포막에 프로테오글리칸이 풍부하게 존재하고 양전하를 부여하는 종양 간질 공간 내에 콜라겐이 풍부하게 존재하므로, 양으로 하전된 IRC는 비하전된 또는 음으로 하전된 IRC와 비교해서 포유동물 세포에 대한 결합력이 향상될 가능성이 더 높고, 따라서 응집을 회피하고, 그 결과 종양 조직으로 침투를 더 잘 하게 된다. 이러한 전하-기반 효과를 입증하는 일부 예는 인간 자궁경부암에서 천연 CPMV보다 8배 더 효율적으로 사용되는 것으로 밝혀진 폴리아르기닌-장식 동부콩 모자이크 바이러스(cowpea mosaic virus: CPMV)를 포함한다. (Wen et al., Chem. Soc. Rev., 45(15):4074-4126, 2016).
형상과 관련하여, 캡시드 백본의 형상 및 가요성은, 어떤 경우에는 종양 전체에 걸쳐 확산되는 캡시드 백본의 능력에서 추가적인 기능적 역할을 한다. 스페로이드 모델을 사용하여 CPMV 및 TMV로 구형 및 막대 형상 입자의 확산 프로파일 간의 비교를 수행하였다. 이 연구에서, CPMV(구체)는 안정된 확산 프로파일을 경험한 반면, TMV(막대 형상)는 매우 빠른 초기 로딩 단계를 수반하여, 바늘처럼 작동하는 축 방향의 움직임에 기인할 수 있는 2-상의 확산 거동을 나타낸 것으로 밝혀졌다. (Wen et al., Chem. Soc. Rev., 45(15):4074-4126, 2016). 세장형 입자에 의해 부여되는 일부 다른 유리한 특성은 혈관 벽쪽으로 더 나은 변연화 및 상호작용을 위한 더 큰 표면적으로 인한 더 강한 부착력을 포함하며, 이는 종양 귀소뿐만 아니라 심혈관 질환의 표적화 향상에도 영향을 미친다.
수동적인 종양 귀소 특성 이외에, 바이러스와 특정 세포의 자연적인 상호작용이 또한 활용될 수 있다. CPMV는 특히 내피, 암 및 염증 세포에서 발견되는 표면 비멘틴과 상호작용하는 데 특유한 특이성을 나타낸다. (Wen et al., Chem. Soc. Rev., 45(15):4074-4126, 2016). 표면 비멘틴에 대한 CPMV의 고유한 친화성은 최대 500 μm 깊이까지 미세혈관계의 고해상도 영상화를 가능하게 하며, 이는 다른 나노입자는 응집하고 혈관구조를 차단하는 경향이 있기 때문에 다른 나노입자의 사용을 통해 달성될 수 없다. 이러한 상호작용은 자궁경부암, 유방암 및 결장암 세포주를 포함하는 암세포의 패널로의 전달, 죽상판경화증 병변의 윤곽묘사(delineation), 및 종양 혈관구조 및 혈관신생의 생체내 영상화와 같은, 다양한 응용에 이용될 수 있다. 기존 내인성 회합의 또 다른 예는, 세포로의 철 수송에 중요한 수용체로서 수많은 암 세포주에 의해 고도로 상향조절되는 트랜스페린 수용체(TfR)가 있는 개 파보바이러스(CPV)이다. 심지어 염료 표지화 후에도, CPV는 TfR에 대한 특이성을 보유하며 HeLa 자궁경부암 세포, HT-29 결장암 세포, 및 MDA-MB-231 유방암 세포에서 발견되는 수용체에 결합하는 것으로 나타났다. (Wen et al., Chem. Soc. Rev., 45(15):4074-4126, 2016).
다양한 실시형태에서, 캡시드 백본은 대상체의 종양 세포 표면 상에서 우선적으로 발현되는 단백질을 표적화한다. 이러한 단백질은 전형적으로 종양 세포의 표면 상에서 과발현되지만, 전부는 아니지만 일부는 또한 혈액, 즉, 혈청에서도 발견된다. 이러한 표면 마커의 비제한적인 예는 CEA(암태아성 항원), E-카드헤린, EMA(상피막 항원; MUC-1로도 알려짐), 비멘틴, 피브로넥틴, Her2/neu(인간 상피세포 성장 인자 수용체 2형, 또한 Erb b2로도 불림), αvβ3 인테그린, EpCAM(상피 세포 접착 분자), FR-α(엽산 수용체-알파), PAR(유로키나제형 플라스미노겐 활성화제 수용체) 및 트랜스페린 수용체(종양 세포에서 과발현됨)를 포함한다.
펩타이드는 종종 막관통 단백질의 인식을 기반으로 암성 세포를 표지화하는 데 사용된다. 가장 통상적으로 사용되는 펩타이드는 L-아르기닌, 글리신 및 L-아스파트산으로 구성된 아르기닐글리실아스파트산(RGD)이다. RGD는 처음에 인테그린에 결합하는 당단백질인 피브로넥틴의 세포-결합 도메인으로부터 단리되었으며, 콜라겐, 피브린 및 프로테오글리칸에 결합함으로써 세포-세포 및 세포-세포외 기질(ECM) 부착 및 신호전달에 관여한다. RGD 펩타이드는 종양 내피 세포에서 고도로 발현되지만 정상 내피 세포에서는 발현되지 않는 세포 표면 인테그린인 αvβ의 유형에 대해 가장 높은 친화성을 갖는다. 다양한 실시형태에서, 이러한 펩타이드 서열은 IRC에 혼입된다.
IRC를 이를 필요로 하는 환자에게 투여함으로써 암 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법, 및 기재된 IRC 조성물의 관련 용도가 본 명세서에 기재되어 있다. 본 명세서에 기재된 방법은, 예를 들어, 종양 성장, 진행 또는 전이를 저해하는 데 충분한 양, 즉, 치료량 또는 용량으로 본 명세서에 기재된 IRC를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 다양한 실시형태에서, IRC는, 대식세포 및 자연 살해 세포의 세포독성 활성을 자극하는 것을 포함하여, 사이토카인 생성 및/또는 세포 면역력, 특히 선천성 면역력을 자극하는 데 충분한 양으로 이를 필요로 하는 대상체에게 투여된다. 본 명세서에 기재된 다양한 실시형태에서, 이를 필요로 하는 대상체는 종양에 대해 이전에 치료를 받은 적이 있고 현재 의료 표준에 따라 암이 없거나 질환이 없는 것으로 간주되는 대상체이다.
간단히 말해서, 기재된 IRC의 작용 메커니즘인 것으로 여겨지는 다양한 이해되는 양상이 하기에 기재되고 실시예에 의해 뒷받침된다. IRC는 먼저 종양 세포에 결합하고, 일부 실시형태에서 이 결합은 특이적이다. (실시예 9, 도 18A 및 도 18B 참조). 이어서, IRC 상의 펩타이드 에피토프는, 일부 실시형태에서, 퓨린에 의해 또는 종양 미세환경에서 과발현되는 종양 세포 인근의 임의의 다른 거주 프로테아제에 의해 단백질분해 방식으로 절단된다. 이는 결국 IRC로부터 펩타이드의 방출 및 종양 세포의 표면 상에 발현되는 MHC 분자에 의한 펩타이드의 로딩 또는 결합("에피토프 코팅")을 야기한다. (실시예 10 및 16, 및 도 19, 도 21, 도 22 및 도 34 참조). 이어서, 에피토프-코팅된 종양 세포는 MHC 분자에서 결합된 특정 펩타이드에 반응성인 하나 이상의 T-세포 및 기존 CD8 T 세포에 의해 병원체-감염 세포로 인식되어, 촉발된 면역 재유도 반응을 생성한다. (실시예 11 및 12 참조). 즉, 이러한 인식 사건은 병원체에 대한 대상체의 기존 면역 기억 및 종양에 대한 소아 백신의 촉발 또는 활성화를 야기하여, 대상체의 종양을 공격하고 파괴한다.
종양 세포의 파괴는 암 세포 항원에 노출된 기존 면역 반응의 성분을 생성할 수 있다. 따라서, 살해된 종양 세포로부터 방출된 항원은 추가의 면역 반응을 개시하여 추가적인 종양-특이적 CD8 T 세포, 또는 T 세포의 "제2 물결"을 동원하고, 그 다음 해당 부위에서 추가적인 종양 세포의 공격을 진행한다. 이는 암 세포 항원에 대한 내인성 면역 반응(어떤 경우에는 "에피토프 확산"으로 지칭됨)의 유발을 초래할 수 있고, 항-종양 면역 기억으로 이어진다.
따라서, 본 명세서에 개시된 방법 및 용도는 암 세포를 공격하기 위해 대상체 자신의 기존 적응성 기억 면역계를 이용함으로써 또는 재배향시킴으로써 일어나는 이를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법이다. 본 명세서에 기재된 방법 및 용도는, 대상체가 어떤 경우에는 원래 암에 대한 반응으로 유발되지 않았지만 대신 일상적인 백신접종에 의해 또는 기생충 또는 병원체에 의한 자연 감염을 통해 유발된 기존 면역 반응을 가지고 있다는 사실을 이용한다. 암 세포는 보통 기존 면역 반응을 유도하는 이러한 에피토프를 발현하지 않을 것이기 때문에, 이러한 면역 반응이, 보통 외인적 개입 없이, 임의의 암세포를 공격하지 않을 것으로 예상되지 않는다. 그러나, 본 명세서에 기재된 본 발명의 방법 및 용도에 의해서, 이러한 기존 면역 반응은 대상체에서 암을 공격, 사멸 및 제거하기 위하여 용이하게 동원된다. 따라서, 이러한 동원 또는 재창출 효과는 본 발명의 IRC 조성물에 의해 달성되는데, 이는 이들 IRC가 대상체에서 기존 면역 반응에 의해 인식되는 것으로 알려진 하나 이상의 에피토프를 대상체에 주사 또는 다른 전달 수단에 의해 암의 표면 내로 또는 암의 표면 상에 도입하여, 항원-표시 암 세포를 공격하는 면역 반응의 세포를 초래하기 때문이다.
따라서, 임의의 특정 이론에 의해 얽매이길 원치 않지만, 본 명세서에 기재된 방법, 용도 및 조성물은 기존 면역 반응이 암세포를 공격하고 사멸시키도록, 대상체의 기존 면역 반응을 암 부위로 동원함으로써 실행된다. 따라서, 일반적으로 기재된 방법에는 하기를 포함하는 4 또는 5개 단계가 포함된다: 1) IRC를 종양 세포에 결합시키는 단계, 2) IRC로부터 에피토프를 절단하는 단계; 3) 종양 세포 표면에 표시하기 위해 에피토프를 MHC 결합시키는 단계, 4) 에피토프에 대해 대상체의 기존 리콜된 면역력에 의해 로딩된 MHC를 인식하는 단계, 및 선택적으로 5) 제2 파동 및 장기간 항-종양 면역력을 촉발시키는 단계.
세포배양 분석 및 동물 연구로부터 얻어진 데이터는 흔히 인간에서 사용하기 위한 투약량 범위를 처방하는 데 사용된다. 이러한 조성물의 투약량은 바람직하게는 독성이 거의 없거나 전무한 ED50을 포함하는 순환 농도 범위 내에 있다. 투약량은 이용되는 투약 형태 및 이용되는 투여 경로에 따라 이 범위 내에서 달라진다. 본 명세서에 기재된 방법에서 사용되는 임의의 조성물에 있어서, 치료적 유효 용량은 초기에 세포 배양 분석으로부터 추정될 수 있다. 용량은 세포 배양에서 결정된 바와 같이 IC50(증상의 최대-절반 저해를 달성하는 테스트 조성물의 농도)을 포함하는 순환 혈장 농도 범위를 획득하기 위해 동물 모델에서 처방된다. 이어서 이러한 정보는 인간에서 유용한 용량을 정확하게 결정하는 데 사용된다. 혈장 내 수준은, 예를 들어, 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 측정된다.
많은 경우에, 보통 최대, 적어도 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15회, 또는 그 이상을 초과하지 않는(그 사이의 모든 범위를 포함함) 용량의 IRC-함유 조성물의 다회 투여를 하는 것이 바람직할 것이다. 투여는 보통 1, 2, 3, 4, 5, 6, 내지 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 내지 12주/개월/년 간격(그 사이의 모든 값 및 범위를 포함함)일 것이며, 보다 일반적으로 3 내지 5주 간격이다.
다양한 실시형태에서, 유효량의 본 명세서에 기재된 IRC를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여함으로써 대식세포 및 자연 살해(NK) 세포의 세포독성 활성을 자극하는 방법이 제공된다. 대식세포 및 자연 살해 세포는 어떤 경우에는 종양 미세환경에 존재하는 것이다. 일 양상에서, IRC는 종양 미세환경에 이미 존재하는 대식세포 및 자연 살해 세포의 세포독성 활성을 자극하는 데 효과적인 양으로 대상체에게 투여된다. 다양한 다른 실시형태에서, IRC는 대식세포 및 자연 살해 세포를 종양 미세환경으로 유인하기에 효과적인 양으로 대상체에게 투여된다. 다양한 실시형태에서, IRC는 대식세포, 호중구 및 자연 살해 세포를 유인하고 자극하기 위해 펩타이드 또는 IRC 캡시드 자체에 충분한 수의 항체를 결합시키기에 효과적인 양으로 대상체에게 투여된다.
다양한 실시형태에서, 유효량의 본 명세서에 기재된 IRC를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여함으로써 기존 기억 CD8+ T 세포의 세포독성 활성을 종양 세포 또는 종양 미세환경으로 재지향시키는 방법 및 용도가 제공된다. 바람직하게는, IRC의 펩타이드의 T 세포 에피토프는 대상체가 백신접종한 병원체 또는 이전에 대상체를 감염시킨 병원체로부터 유래되고, 대상체는 종양 세포 상의 MHC 클래스 I 분자와의 복합체로 T 세포 에피토프를 인식하는 기억 CD8+ T 세포를 갖는다. 본 명세서에 기재된 일 양상에서, 본 명세서에 기재된 IRC 조성물의 유효량 또는 치료량은 기억 CD8+ T 세포를 종양 미세환경으로 유인하기에 충분한 양이다. 또 다른 대안적인 양상에서, IRC의 유효량은 종양 미세환경에 존재하는 기억 CD8+ T 세포를 자극시키기에 충분한 양이다.
다양한 실시형태에서, 종양은 소세포 폐암, 간세포암종, 간암, 간세포암종, 흑색종, 전이성 흑색종, 부신암, 항문암, 재생불량성 빈혈, 담관암, 방광암, 골암, 뇌종양/CNS 암, 유방암, 원발부위 불명암, 캐슬만병, 자궁경부암, 결장/직장암, 자궁내막암, 식도암, 유잉 종양 패밀리, 안암, 담낭암, 위장관 카르시노이드 종양, 위장관 기질 종양(gist), 임신 융모 질환, 호지킨병, 카포시 육종, 신장암, 후두 및 하인두암, 백혈병, 간암, 폐암, 림프종, 악성 중피종, 다발성 골수종, 골수이형성 증후군, 비강 및 부비동암, 비인두암, 신경모세포종, 구강 및 구인두암, 골육종, 난소암, 췌장암, 음경암, 뇌하수체 종양, 전립선암, 망막모세포종, 횡문근육종, 침샘암, 육종, 피부암, 위암, 고환암, 흉선암, 갑상선암, 자궁 육종, 질암, 외음부암, 발텐스트롬 마크로글로불린혈증, 윌름스 종양, 비-호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 버킷 림프종, 림프모구 림프종, 외투세포 림프종(MCL), 다발성 골수종(MM), 소림프구 림프종(SLL), 비장 변연부 림프종, 변연부 림프종(결절 외 또는 결절), 성인의 혼합 세포 유형 미만성 공격형 림프종, 성인의 대세포 유형 미만성 공격형 림프종, 성인의 대세포 면역모세포 미만성 공격형 림프종, 성인의 소형 비절단 세포 미만성 공격형 림프종, 또는 소포성 림프종, 두경부암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 비소세포폐암, 골육종, 교모세포종, 또는 전이성 암이다. 바람직한 실시형태에서, 암은 유방암, 자궁경부암, 난소암, 췌장암, 또는 흑색종이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 용어 "암"은 증식성 질환, 예컨대, 림프종, 림프구성 백혈병, 폐암, 비소세포폐(NSCL) 암, 기관지폐포 세포 폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 항문 부위 암, 위암(stomach cancer), 위암(gastric cancer), 결장암, 유방암, 자궁암, 나팔관 암종, 자궁내막 암종, 자궁경부 암종, 질 암종, 외음부 암종, 호지킨병, 식도암, 소장암, 내분비계암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 방광암, 신장 또는 요관암, 신세포 암종, 신우 암종, 중피종, 간세포암, 담도암, 중추신경계(CNS) 신생물, 척추축 종양, 뇌간 신경교종, 다형성 교모세포종, 성상세포종, 신경초종, 뇌실막세포종, 수모세포종, 수막종, 편평세포 암종, 뇌하수체 선종 및 유잉 육종을 지칭하며, 상기 암 중 임의의 것의 불응성 형태, 또는 상기 암 중 하나 이상의 조합을 포함한다.
본 명세서에 기재된 양상은 본 명세서에 기재된 IRC를 대상체에게 투여함으로써 암 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하는 방법이며, 여기서 펩타이드의 CD8+ 에피토프는 바이러스-유도 암, 예컨대, HPV 자궁경부암, HPV+ 구강암, EBV 비인두암에 대한 실패한 치료용 암 백신("치료용 백신")의 것이다. 따라서, 본 명세서에 기재된 방법 및 용도는 대상체가 능동적으로 백신접종을 받았지만 치료에 대하여 항-종양 효과로 반응하지 않았는지의 여부를 결정하는 단계를 포함한다. 이어서 IRC 조성물은 유효량의 본 발명의 IRC가 대상체에게 투여되고, 여기서 펩타이드의 CD8+ 에피토프는 대상체를 감염시킨 대상체에게 이전에 투여된 백신의 항원 결정기의 것이다.
캡시드 백본은 애주번트 특성을 갖는다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 IRC 조성물의 면역원성은 애주번트로 알려진 면역 반응의 추가적인 비특이적 자극제와의 조합에 의해 더욱 향상된다. 적합한 애주번트는 모든 허용 가능한 면역자극 화합물, 예컨대, 사이토카인, 독소, 또는 명반과 같은 합성 조성물을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
애주번트는 수중유 에멀션, 유중수 에멀션, 미네랄 염, 폴리뉴클레오타이드, 및 천연 물질을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 사용될 수 있는 특정 애주번트는 IL-1, IL-2, IL-4, IL-7, IL-12, γ-인터페론, GM-CSF, BCG, 알루미늄염, 예컨대, 수산화알루미늄 또는 다른 알루미늄 화합물, 메틸렌다이옥시페닐(MDP) 화합물, 예컨대, thur-MDP 및 nor-MOP, CGP(MTP-PE), 지질 A, 및 모노포스포릴 지질 A(MPL), 또는 비활성 미생물제를 포함한다. 2% 스쿠알렌/Tween 80 에멀션 중 박테리아로부터 추출된 3가지 성분인, MPL, 트레할로스 다이마이콜레이트(TOM), 및 세포 벽 골격(CWS)을 함유하는 RIBI. MHC 항원도 사용될 수 있다.
IRC 조성물에 대한 애주번트 효과를 달성하는 다양한 방법은 통상적으로 포스페이트 완충 식염수 중 약 0.05 내지 약 0.1% 용액으로 사용되는 수산화알루미늄 또는 인산알루미늄(명반)과 같은 작용제의 사용, 약 0.25% 용액으로서 사용되는 당(CARBOPOL®)의 합성 중합체와의 혼합물, 각각 30초 내지 2분의 기간 동안 약 70℃ 내지 약 101℃ 범위의 온도로의 열 처리에 의한 조성물 중 단백질의 응집을 포함한다. 알부민에 대한 펩신-처리(Fab) 항체를 이용한 재활성화에 의한 응집; 박테리아 세포, 예를 들어, 그람-음성 박테리아의 씨. 파르붐(C. parvum), 내독소 또는 지질다당류 성분과의 혼합물; 생리학적으로 허용 가능한 오일 비히클, 예를 들어, 만나이드 모노올레에이트(Aracel A™) 중 에멀션, 또는 블록 대체물로서 사용되는 퍼플루오로카본의 20% 용액이 있는 에멀션(FLUOSOL-DA®)이 또한 애주번트 효과를 생성하는 데 이용될 수 있다. 전형적인 애주번트는 완전 프로인트 애주번트(살해된 마이코박테륨 튜베르쿨로시스를 포함함), 및 불완전 프로인트 애주번트, 및 수산화알루미늄이다.
인간에게 투여하기 위해, 다양한 적합한 애주번트가 숙련된 작업자에게 명백할 것이다. 이는, 예컨대, 애주번트로서 명반-MPL, 또는 비슷한 제형, ASO4(이는 승인된 HPV 백신인 CERVARIX®에서 사용됨), AS03, AS02, MF59, 몬타나이드, 사포닌-기반 애주번트, 예컨대, GPI-0100, CpG-기반 애주번트, 또는 이미퀴모드를 포함한다. 본 발명의 실시형태에서, 애주번트는 단순히 캡시드 백본과 혼합되는 것이 아니라, 캡시드 백본과 물리적으로 커플링되거나, 캡시드 백본에 의해 캡슐화된다. 애주번트에 추가적으로, 면역 반응을 향상시키기 위해 생물학적 반응 조절제(BRM)를 공동 투여하는 것이 바람직할 수 있다. BRM은 T 세포 면역력을 상향조절하거나 억제제 세포 활성을 하향조절하는 것으로 나타났다. 이와 같은 BRM은 시메티딘(CIM; 1200 ㎎/d)(Smith/Kline, 미국 펜실베이니아주 소재); 또는 저용량 사이클로포스파마이드(CYP; 300 ㎎/㎖)(Johnson/Mead, 미국 뉴저지주 소재) 및 사이토카인, 예컨대, γ-인터페론, IL-2 또는 IL-12, 또는 면역 헬퍼 기능에 관련된 단백질을 암호화하는 유전자, 예컨대, B-7을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 본 명세서에 기재된 실시형태에서, 이들 유전자는 캡시드 백본에 의해 캡슐화되어 대상체로의 전달을 용이하게 한다.
활성 성분으로서 폴리펩타이드 또는 펩타이드 서열(들)을 포함하는 조성물의 제조는 일반적으로 당업계에서 잘 이해된다. 전형적으로, 이와 같은 조성물은 액체 용액 또는 현탁액으로서 주사제로 제조되고; 또한 주사 전에 액체 중의 용액 또는 현탁액에 적합한 고체 형태로 제조될 수 있다. 제제는 어떤 경우에는 유화될 수 있다. 활성 면역원성 성분은 일부 실시형태에서 약제학적으로 허용 가능하고 활성 성분과 양립 가능한 부형제와 혼합된다. 적합한 부형제는, 예를 들어, 물, 식염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등 및 이들의 조합물이다. 추가적으로, 원하는 경우, 조성물은 일정 양의 보조 물질, 예컨대, 습윤제 또는 유화제, pH 완충제, 또는 백신의 유효성을 향상시키는 애주번트를 포함할 수 있다. 구체적인 실시형태에서, 백신은 물질의 조합으로 제형화된다.
본 개시내용의 IRC를 포함하는 조성물은 대상체에게 생체내 투여에 적합한 생물학적으로 양립 가능한 형태이다. 약제학적 조성물은 하나 이상의 선택적인 약제학적으로 허용 가능한 담체를 더 포함한다. 용어 "약제학적으로 허용 가능한"은 연방 또는 주 정부의 규제 기관, 예컨대, FDA에 의해 승인되거나 동물, 보다 특히 인간에서의 사용을 위해 미국 약전 또는 다른 일반적으로 인정되는 약전에 열거된 것을 의미한다. 용어 "담체"는 캡시드 백본과 함께 투여되는 희석제, 애주번트, 부형제 또는 비히클을 지칭한다. 이러한 약제학적 담체는, 예를 들어, 멸균 액체, 예컨대, 물 및 오일을 포함할 수 있으며, 이는 땅콩유, 대두유, 광유, 참기름 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 석유, 동물성, 식물성 또는 합성 기원의 것을 포함한다. 어떤 경우에는, 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물이 경구로 투여될 때에는 물이 담체이다. 예를 들어, 약제학적 조성물이 정맥내로 투여될 때에는 식염수 및 수성 덱스트로스가 담체이다. 식염수 용액과 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액이, 예를 들어, 주사용 용액에 대한 액체 담체로서 이용된다. 적합한 약제학적 부형제는, 제한 없이, 전분, 글루코스, 락토스, 수크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 백악, 실리카겔, 스테아르산나트륨, 글리세롤 모노스테아레이트, 활석, 염화나트륨, 탈지분유, 글리세롤, 프로필렌, 글라이콜, 물, 에탄올 등을 포함한다. 일부 실시형태에서 약제학적 조성물은 선택적으로 소량의 습윤제 또는 유화제, 또는 pH 완충제를 함유한다.
본 개시내용의 IRC를 포함하는 약제학적 조성물은, 예를 들어, 용액, 현탁액, 에멀션, 정제, 환제, 캡슐, 분말, 서방성 제형 등의 형태를 취한다. 경구 제형은 일부 실시형태에서 표준 담체, 예컨대, 제약 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 사카린, 셀룰로스, 마그네슘 카보네이트 등을 포함한다. 구체적인 실시형태에서, 약제학적 조성물은 대상체에게 적절한 투여 형태를 제공하기 위해 적합한 양의 약제학적으로 허용 가능한 담체와 함께 유효량의 본 개시내용의 IRC를 포함한다. 제형은 투여 방식에 적합해야 한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 정맥내, 근육내, 관절내, 기관지내, 복부내, 피막내, 연골내, 강내, 복내, 소뇌내, 뇌실내, 결장내, 자궁경관내, 위내, 간내, 심근내, 골내, 골강내, 골반내, 심낭내, 복강내, 흉막내, 전립선내, 폐내, 직장내, 신장내, 망막내, 척수내, 활액막내, 흉곽내, 자궁내, 방광내, 볼루스, 경구, 비경구, 피하, 질, 직장, 협측, 설하, 비강내, 이온영동 수단, 또는 경피 수단을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 임의의 특정 투여 경로에 의해 투여될 수 있다. 대부분의 적합한 경로는 정맥내 주사 또는 경구 투여이다. 특정 실시형태에서, 조성물은 표적 영역 또는 그 근처에, 예를 들어, 종양내 주사로 투여된다.
예를 들어, 수용액에서의 비경구 투여의 경우, 용액은 필요에 따라 적합하게 완충되어야 하며, 액체 희석제는 먼저 충분한 식염수 또는 글루코스로 등장성이 되도록 하여야 한다. 이러한 특정 수용액은 특히 정맥내, 근육내, 종양내, 피하, 및 복강내 투여에 적합하다. 이와 관련하여, 이용될 수 있는 멸균 수성 매질은 본 개시내용에 비추어 당업자에게 알려질 것이다. 예를 들어, 1회 투약량을 등장성 NaCl 용액에 용해하고 대량피하주사액에 첨가하거나 제안된 주입 부위에 주사할 수 있다. (예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 1990] 참조). 대상체의 상태에 따라 투약량의 일부 변화가 필연적으로 발생한다. 투여 담당자는 어떠한 상황에도 개별 대상체에 대한 적절한 용량을 결정할 것이다.
본 명세서에 기재된 IRC-함유 조성물은, 일부 실시형태에서, 흡입에 의해 투여된다. 특정 실시형태에서, 조성물은 에어로졸로 투여된다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 용어 "에어로졸" 또는 "에어로졸화 조성물"은 기체 중 고체 또는 액체 입자의 현탁액을 지칭한다. 이들 용어는 일반적으로 기화되거나, 분무되거나, 그렇지 않으면 고체 또는 액체 형태에서 현탁된 고체 또는 액체 약물 입자를 포함하는 흡입 가능한 형태로 전환된 조성물을 지칭하기 위하여 사용된다. 이와 같은 에어로졸은 호흡기계를 통해 조성물을 전달하는 데 사용될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "호흡기계"는 산소의 흡입 및 이산화탄소의 배출을 담당하는 신체 기관의 시스템을 지칭한다. 상기 시스템은 일반적으로 코에서 폐포까지의 모든 공기 통로를 포함한다. 포유동물에서, 이는 일반적으로 폐, 기관지, 세기관지, 기관, 비강, 및 횡경막을 포함하는 것으로 간주된다. 본 개시내용의 목적을 위해, 호흡기계로의 조성물의 전달은 약물이 호흡기계의 하나 이상의 공기 통로, 특히 폐로 전달됨을 나타낸다.
다른 투여 방식에 적합한 추가적인 제형은 좌약(항문 또는 질 적용용), 및 일부 경우에 경구 제형을 포함한다. 좌약의 경우, 전통적인 결합제 및 담체, 예를 들어, 폴리알칼렌 글라이콜 또는 트라이글리세라이드를 포함할 수 있고; 이와 같은 좌약은 활성 성분을 약 0.5% 내지 약 10%, 바람직하게는 약 1% 내지 약 2%의 범위로 포함하는 혼합물로부터 형성될 수 있다. 경구 제형은, 예를 들어, 제약 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 사카린, 셀룰로스, 마그네슘 카보네이트 등으로서 보통 이용되는 부형제를 포함한다. 이들 조성물은 용액, 현탁액, 정제, 환제, 캡슐, 서방성 제형, 또는 분말의 형태를 취하며 약 10% 내지 약 95%, 바람직하게는 약 25% 내지 약 70%의 활성 성분을 포함한다.
본 명세서에 기재된 IRC 조성물은, 어떤 경우에는, 천연 또는 염 형태로 백신으로 제형화된다. 약제학적으로 허용 가능한 염은 산 부가 염(펩타이드의 유리 아미노기로 형성됨), 및 예를 들어 염산 또는 인산과 같은 무기산, 또는 아세트산, 옥살산, 타타르산, 만델산 등과 같은 유기산으로 형성된 염을 포함한다. 유리 카복실기와 형성된 염은 또한, 예를 들어, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화암모늄, 수산화칼슘, 또는 수산화제이철과 같은 무기 염기, 및 아이소프로필아민, 트라이메틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인 등과 같은 유기 염기로부터 유래될 수 있다.
본 개시내용의 약제학적 조성물은, 소정의 실시형태에서, 또한 유효량의 추가적인 애주번트를 포함한다. 본 명세서에 언급된 바와 같이, 유두종바이러스 캡시드 백본은 애주번트 특성을 갖는다. 적합한 추가적인 애주번트는 프로인트 완전 또는 불완전 애주번트, 미네랄 겔, 예컨대, 수산화알루미늄, 표면 활성 물질, 예컨대, 리솔레시틴, 플루로닉 폴리올, 다가음이온, 펩타이드, 오일 에멀션, 다이나이트로페놀, 및 잠재적으로 유용한 인간 애주번트, 예컨대, 바실 칼메트 게랭(BCG), 코리네박테륨 파르붐(Corynebacterium parvum), 및 무독성 콜레라 독소를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
통상적인 저장 및 사용 조건 하에서, 기재된 IRC 조성물은 일부 실시형태에서 미생물의 성장을 방지하기 위해 방부제를 함유한다. 모든 경우에, 약제학적 형태는 멸균 상태이어야 하고 용이하게 주사될 수 있을 정도로 유동적이어야 한다. 또한 제조 및 저장 조건 하에서 안정적이어야 하고 미생물, 예컨대, 박테리아 및 진균의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다.
담체는, 일부 실시형태에서, 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글라이콜, 및 액체 폴리에틸렌 글라이콜 등), 이들의 적합한 혼합물, 및 식물성 오일을 포함하는 용매 또는 분산매질일 수 있다. 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅제의 사용에 의해, 분산의 경우 필요한 입자 크기의 유지에 의해, 그리고 계면활성제의 사용에 의해 적절한 유동성이 유지된다. 미생물 작용의 방지는, 어떤 경우에는, 다양한 항박테리아제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로뷰탄올, 페놀, 솔빈산, 티메로살 등의 혼입에 의해 야기된다. 많은 경우에, 등장화제, 예를 들어, 당 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사제 조성물의 흡수 연장은 조성물에 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴의 첨가에 의해 야기된다.
멸균 주사제 용액은 상기 열거된 다양한 성분과 함께 적절한 용매에 필요한 양으로 IRC를 혼입함으로써 제조되며, 필요에 따라 이어서 여과 멸균될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 기분 분산 매질과 상기 열거된 것에서 필요한 다른 성분을 포함하는 멸균 비히클로 다양한 멸균된 활성 성분을 혼입함으로써 제조된다. 멸균 주사제 용액의 제조에 있어서 멸균 파우더의 경우에, 바람직한 제조 방법은 진공 건조 및 동결 건조 기법이며, 상기 기법으로 활성 성분의 분말과, 이전에 이의 멸균 여과된 용액 유래의 임의의 추가적인 원하는 성분이 산출된다.
본 개시내용의 상이한 양상은 IRC를 포함하는 유효량의 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 본 개시내용의 일부 실시형태에서, CD8+ T 세포 에피토프를 포함하는 표적 펩타이드를 포함하는 IRC가 환자에게 투여되어 종양을 치료하거나 이와 같은 종양의 재발을 예방한다. 이와 같은 조성물은 일반적으로 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 수성 매질에 용해되거나 분산될 것이다.
구체적인 사용을 위한 IRC의 설계
다양한 실시형태에서, (1) 대상체에서 기존 면역력을 측정하는 단계, 및 (2) 필요로 하는 대상체의 투여를 위해 적절한 IRC를 선택하는 단계를 포함하는, IRC를 이를 필요로 하는 대상체에게 제공하는 방법이 제공된다. 대상체에게 투여하기에 적절한 IRC는 환자 T 세포 프로파일에 따라 달라질 것이다. 적절한 IRC는 총 CD8+ 세포의 기준선의 적어도 2배인 T 세포 반응을 유발할 수 있는 것일 것이다. 다양한 실시형태에서, 적절한 IRC는 총 CD8+ 또는 총 CD8+ CD69+ T 세포의 기준선의 2배인 T 세포 반응을 유발할 수 있는 것일 것이다. 목표는 대상체의 백신접종 이력 또는 병원체에 대한 이전 노출을 기반으로 적절한 IRC를 선택하는 것이다. IRC가 적절한지를 결정하는 것은, 예를 들어, (1) 대상체 인터뷰; (2) 대상체의 의료 기록의 검토; 및/또는 (3) 대상체의 T 세포 프로파일의 평가를 통해 달성된다.
다양한 실시형태에서, 하나 초과의 펩타이드가 종양에 대한 면역 반응을 유발하는 데 적합하다. 다양한 실시형태에서, 펩타이드 또는 두 펩타이드의 혼합물을 보유하는 IRC가 적절할 것이다. 다양한 실시형태에서, 하나 초과의 펩타이드가 발현되고 캡시드 백본에 결합된다. 다양한 실시형태에서, 단일 융합 단백질은 하나 초과의 펩타이드을 포함할 것이다. 다양한 실시형태에서, 상이한 펩타이드를 포함하는 다수의 펩타이드가 캡시드 백본에 접합될 것이다. 다양한 실시형태에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 바와 같은 IRC의 집단 및 약제학적으로 허용 가능한 부형제를 포함한다. 다양한 실시형태에서, 대상체에게 투여되는 IRC는 동일하다. 다양한 실시형태에서, 상이한 펩타이드(들)를 보유하는 IRC가 대상체에게 투여된다.
이전 백신접종을 기반으로 한 선택. 본 명세서에 기재된 방법 및 용도의 다양한 실시형태에서, 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하기 위해 적절한 IRC를 선택하는 방법이 또한 고려된다. 다양한 실시형태에서, 이는 대상체가 주어진 병원체, 예컨대, 기생충, 박테리아, 또는 바이러스, 예컨대, 홍역 또는 소아마비에 대해 능동적으로 백신접종을 받았는지 여부를 확인하는 단계, 및 그 다음, 본 명세서에 개시된 바와 같은 IRC를 선택하고 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 펩타이드의 CD8+ T 세포 에피토프는 대상체가 면역화된 병원체에서 유래된다. 다양한 실시형태에서, 대상체의 백신접종 이력은 대상체의 의료 기록을 검토함으로써 얻어진다. 다양한 실시형태에서 대상체의 백신접종 이력은 대상체를 인터뷰함으로써 얻어진다.
이전 감염을 기반으로 한 선택. 다양한 실시형태에서, 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하기 위한 적절한 IRC를 선택하는 방법은 대상체가 주어진 병원체, 예컨대, 기생충, 박테리아, 또는 바이러스, 예컨대, 홍역 또는 소아마비로 이전에 감염되었고 감염을 해결했는지 여부를 확인하는 단계를 포함한다. 다양한 실시형태에서, 그 다음 대상체에게 대상체가 이전에 감염된 상기 병원체를 포함하는 펩타이드를 포함하는 IRC가 투여된다.
대상체의 의료 기록을 검토하거나 대상체를 인터뷰함으로써 대상체가 특정 병원체에 감염되었는지 확인할 수 있다. 특정 MHC 클래스 I 분자에 결합하는 CD8+ T 세포 에피토프의 비제한적인 예는 표 1에 제시되어 있다. 방법은 또한 어떤 경우에는 대상체의 세포가 어떤 MHC 클래스 I 결정자(들)를 발현하는지를 결정하는 단계 및 그 다음 본 명세서에 기재된 IRC를 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 펩타이드의 CD8+ T 세포 에피토프는 백신 중 병원체의 항원 성분 또는 대상체의 MHC 클래스 I 결정자(들)와 복합체를 형성하는 대상체를 이전에 감염시킨 병원체의 항원 성분의 CD8+ T 세포 에피토프이다.
T 세포 반응 측정. 다양한 실시형태에서, 당업계에 알려진 다양한 기법을 사용하여 적절한 IRC를 선택하기 위해 대상체의 T 세포 프로파일을 또한 평가한다. 그 다음 이 프로파일을 사용하여 대상체에게 투여하기에 적절한 IRC의 선택을 유도한다. 이러한 기법은, 예를 들어, Ag-특이적 CD8+ T 세포를 단리시키기 위한 유세포분석, 및/또는 세포독성 검정을 사용하여 인터페론-γ 수준을 측정하는 것을 포함한다. 인터페론-γ(T 세포 활성화의 마커)를 측정하기 위해, 단리된 T 세포의 세포내 염색. 대안적으로, 인터페론-γ에 대한 효소-결합 면역흡착 스팟(ELISPOT) 검정을 수행할 수 있다. 이 기법은 환자의 T 세포 프로파일의 고속대량 평가를 가능하게 한다. 이 방법은 잠재적으로 100,000 내지 300,000개 세포 중 1개를 검출할 수 있다. 간단히 말해서, 특정 사이토카인에 대한 단클론성 항체를 폴리비닐리덴 다이플루오라이드(PVDF)-백킹 마이크로플레이트 상에 사전 코팅한다. CD8+ T 세포를 수지상 세포 및 개별 펩타이드와 함께 웰에 피펫팅하고 마이크로플레이트를 24 내지 48시간 범위의 기간 동안 가습한 37℃ CO2 인큐베이터에 넣는다. 인큐베이션 동안, 고정된 항체는 세포로부터 분비된 사이토카인에 결합한다. 세척한 후 선택된 분석물에 특이적인 검출 항체를 웰에 첨가한다. 세척한 다음, 스트렙타비딘에 접합된 효소를 첨가하고 기질을 첨가한다. 이용된 기질에 따라 착색된 침전물이 형성되고 사이토카인 분비 부위에 반점으로 나타나며, 이때 각각의 개별 반점은 단일 생성 세포를 나타낸다.
다양한 실시형태에서, (1) 대상체로부터 PBMC를 수집하는 단계(백신접종 전 샘플), (2) 항-IFN-γ 항체로 코팅함으로써 효소-결합 면역 흡착 스팟(ELISPot) 플레이트를 준비하는 단계(하룻밤 인큐베이션함), (3) T 세포 반응을 유발할 것으로 예상되는, 관심 펩타이드 풀 중 하나, 즉, 펩타이드와 함께 PBMC를 인큐베이션하는 단계(1 내지 2일 동안 인큐베이션함), (4) 플레이트를 세척하고, 바이오틴화 2차 항체를 첨가하는 단계(몇 시간 동안 인큐베이션함), (5) 플레이트를 세척하고, 아비딘 접합 호스래디쉬 퍼옥시다제를 첨가한 다음 인큐베이션하는 단계, (6) 플레이트를 세척하고, 아미노에틸 카바졸(AEC)을 몇 분 동안 첨가하는 단계, (7) (물을 첨가함으로써) 반응을 정지시키는 단계, 및 (8) ELISPot 판독기 상에서 시각화하는 단계를 포함하는, 환자 T 세포 프로파일을 평가함으로써, 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하기에 적절한 IRC를 결정하는 방법이 제공된다. 개시된 방법은 최대 100,000 내지 300,000개 세포 중 1개를 검출한다. 항원-특이적 T 세포의 빈도의 2배 증가는 신호로 간주되어야 한다.
다양한 실시형태에서 T 세포 증식은 3H(삼중수소)-티미딘에 의해 측정된다. 이러한 방법은 민감하며 고속대량 분석에 사용될 수 있다. 이러한 기법은, 예를 들어, 카복시플루오레세인 석신이미딜 에스터(CFSE) 및 Ki64 세포내 염색을 포함한다.
향성을 기반으로 한 펩타이드의 선택. 일부 바이러스는 특정 유형의 조직에 대해 향성을 표시한다는 것이 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, 뇌 조직에 대해 향성을 표시하는 바이러스는 제한없이 JC 바이러스, 홍역, LCM 바이러스, 아르보바이러스 및 공수병을 포함하고; 눈 조직에 대해 향성을 표시하는 바이러스는 제한없이 단순 헤르페스 바이러스, 아데노바이러스, 및 거대세포바이러스를 포함하며; 코 조직에 대해 향성을 표시하는 바이러스는 제한없이 리노바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, 및 호흡기 세포융합 바이러스를 포함하고; 구강 조직, 예를 들어, 구강 점막, 잇몸, 침샘, 인두에 대해 향성을 표시하는 바이러스는 제한없이 단순 헤르페스 바이러스 I형 및 II형, 유행성이하선염 바이러스, 엡스타인 바 바이러스, 및 거대세포바이러스를 포함하며; 폐 조직에 대해 향성을 표시하는 바이러스는 제한없이 인플루엔자 바이러스 A형 및 B형, 파라인플루엔자 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 아데노바이러스, 및 SARS 코로나바이러스를 포함하고; 신경 조직, 예를 들어, 척수에 대해 향성을 표시하는 바이러스는 제한없이 소아마비바이러스 및 HTLV-1을 포함하며; 심장 조직에 대해 향성을 표시하는 바이러스는 제한없이 콕사키 B 바이러스를 포함하고; 간 조직에 대해 향성을 표시하는 바이러스는 제한없이 A형, B형, 및 C형 간염 바이러스를 포함하며; 위장 조직, 예를 들어, 위, 및 대장과 소장에 대해 향성을 표시하는 바이러스는 제한없이 아데노바이러스, 로타바이러스, 노로바이러스, 아스트로바이러스, 및 코로나바이러스를 포함하고; 췌장 조직에 대해 향성을 표시하는 바이러스는 제한없이 콕사키 B 바이러스를 포함하며; 피부 조직에 대해 향성을 표시하는 바이러스는 제한없이 수두대상포진 바이러스, 단순 헤르페스 바이러스 6, 천연두 바이러스, 물사마귀, 유두종 바이러스, 파보바이러스 B19, 풍진, 홍역 및 콕사키 A 바이러스를 포함하고; 생식기 조직에 대해 향성을 표시하는 바이러스는 제한없이 단순 헤르페스 2형, 유두종바이러스, 인간 면역결핍 바이러스(HIV)를 포함한다.
다양한 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 IRC를 대상체에게 투여함으로써 암 치료를 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하기 위한 방법이 제공되며, 여기서 펩타이드는 암의 원천인 조직("원천 조직")에 대해 향성을 가지는 병원체의 CD8+ 에피토프이다. 다양한 실시형태에서, 적절한 IRC는 먼저 종양 세포의 원천 조직을 결정한 다음에, (1) 환자가 펩타이드에 대해 기존 CD8+ T 세포를 이미 가지고 있고, (2) 종양의 원천 조직에 대해 향성을 갖는 펩타이드를 선택함으로써 선택된다. 그 다음 선택된 접합된 IRC(들)는 이를 필요로 하는 대상체에게 투여된다.
다양한 실시형태에서, 대상체가 폐 세포를 감염시키는 병원체, 예컨대, 인플루엔자 바이러스, 예컨대, 인플루엔자 바이러스 A형 또는 B형에 대해 능동적으로 백신접종을 받았는지 여부를 결정하는 단계, 그 다음, 유효량의 본 명세서에 기재된 IRC 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 폐암을 치료하기 위한 방법이 제공되되, 여기서 펩타이드의 CD8+ T 세포 에피토프는 백신에 포함된 병원체의 항원 결정기의 것이고 T 세포 에피토프는 대상체의 MHC 분자 클래스 I과 복합체를 형성한다. 폐암을 치료하기 위한 본 명세서에 기재된 방법 및 용도는, 일부 실시형태에서, 대상체가 폐 세포를 감염시키는 병원체, 예를 들어, 인플루엔자 바이러스, 예를 들어, 인플루엔자 바이러스 A형 또는 B형에 감염되었는지 여부를 결정하는 단계, 그 다음, 유효량의 본 명세서에 기재된 IRC 조성물을 투여하는 단계를 포함하되, 펩타이드의 CD8+ T 세포 에피토프는 병원체의 것이고 T 세포 에피토프는 대상체의 MHC 클래스 I 분자와 복합체를 형성한다.
또한 본 명세서에 기재된 IRC 조성물을 투여함으로써, 통상적으로 두경부암으로 지칭되는 암 그룹의 일부인 구강암을 치료하기 위한 방법이 제공되되, 여기서 펩타이드의 CD8+ 에피토프는 구강 조직에 대해 향성을 갖는 병원체, 예를 들어, 유행성이하선염 바이러스, 엡스타인 바 바이러스, 거대세포바이러스, 또는 단순 헤르페스 바이러스 1형의 것이다. 상기 방법은 이를 필요로 하는 대상체가, 예를 들어, 유행성이하선염 바이러스, 엡스타인 바 바이러스, 거대세포바이러스, 또는 단순 헤르페스 바이러스 1형에 대해 능동적으로 백신접종을 받았거나, 이로 감염되었는지 여부를 결정하는 단계, 및 대상체가 이전에 백신접종을 받았거나 감염된 적이 있다면, 본 명세서에 기재된 IRC 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 펩타이드의 CD8+ 에피토프는 유행성이하선염 바이러스 또는 홍역 바이러스 또는 대상체가 받은 백신의 항원 성분, 또는 대상체를 이전에 감염시킨 병원체, 즉 유행성이하선염, 홍역, 엡스타인 바 바이러스, 거대세포바이러스, 또는 단순 헤르페스 바이러스 1형의 것이다.
병용 요법
다양한 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 IRC 조성물은 다른 암 치료제와 공동 투여된다. 또한, 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 IRC는 다른 암 치료 요법, 예컨대, 방사선요법, 화학요법, 수술, 및/또는 면역요법과 함께 투여된다. 본 명세서에 기재된 방법 및 용도의 일부 양상에서, 본 명세서에 기재된 IRC 조성물은 관문 저해제와 함께 투여된다. 다양한 실시형태에서, 캡시드 백본은 면역 효현제와 함께 투여된다. 다양한 실시형태에서, IRC는 치료용 백신을 이용한 치료와 함께 투여된다. 다양한 실시형태에서, IRC는 접합된 항원 수용체 발현 T 세포(CAR-T 세포)를 이용한 치료와 함께 투여된다. 다양한 실시형태에서, IRC는 또 다른 면역-항암 제품을 이용한 치료와 함께 투여된다. 본 개시내용의 IRC 및 다른 요법 또는 치료제는 동일하거나 상이한 투여 경로에 의해 동시에 또는 순차적으로 투여된다. 본 개시내용의 방법에서 사용하기 위한 치료제(들)의 정체 및 양의 결정은 당업계에 알려진 표준 기법을 사용하여 통상의 숙련된 의사에 의해 용이하게 이루어질 수 있다.
위에서 인용된 모든 참고문헌 및 본 명세서에 인용된 모든 참고문헌은 모든 목적을 위해 그들의 전문이 참조에 의해 본 명세서에 원용된다.
본 명세서에 기재된 방법, 용도 및 조성물이 위에서 상세하게 예시되고 설명되었지만, 이러한 예시 및 설명은 설명적이거나 예시적인 것으로 간주되어야 하며 제한적이지 않다. 다음 청구범위의 범주 및 사상 내에서 당업자에 의해 변경 및 수정이 이루어질 수 있음이 이해될 것이다. 특히, 본 개시내용은 상기 및 하기에 기재된 상이한 실시예로부터의 특징의 임의의 조합을 갖는 추가의 실시형태를 포함한다.
본 개시내용은 본 개시내용 및 이의 많은 이점에 대한 더 나은 이해를 제공하는 다음의 예시적인 비제한적 예를 통해 추가로 설명된다. 하기 실시예는 본 발명의 바람직한 실시형태를 입증하기 위해 포함된다. 하기 실시예에 개시된 기술은 본 발명의 실시에서 잘 기능하기 위해 본 개시내용에서 사용된 기술을 나타내며, 따라서 그의 실시를 위한 바람직한 방식을 구성하는 것으로 간주될 수 있음이 당업자에 의해 이해되어야 한다. 그러나, 당업자라면, 본 개시내용에 비추어, 개시된 구체적인 실시형태에서 많은 변경이 이루어질 수 있고 여전히 본 개시내용의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 같거나 유사한 결과를 얻을 수 있음을 인식해야 한다.
실시예
실시예 1
절단된 마우스 유두종바이러스(MPV1) L1 단백질의 제조
1138개의 염기쌍의 절단된 마우스 유두종바이러스 L1 DNA 서열을 이. 콜라이 발현을 위하여 최적화시키고 합성하고(서열번호 135 및 136, 두 변종의 코돈 최적화)(GeneScript Biotech, 뉴저지주 피스캐터웨이 소재), 이어서 T7 발현 벡터 Pet-24a(+)에 클로닝하였다(MilliporeSigma, 매사추세츠주 벌링턴 소재). 서열은 3개의 특정 영역에서 3개의 결실 돌연변이, 즉, 아미노-말단에서 하나의 결실(10개의 아미노산이 제거됨), 카복시-말단에서 하나의 결실(34개의 아미노산이 결실됨) 및 카복시-말단 영역에 가까운 나선 4(H4) 영역에서의 제3 결실(MPV L1 서열의 아미노산 411 내지 436의 결실)을 함유하는 것을 제외하고, 야생형 마우스(무스 무스쿨루스) 유두종바이러스 L1 단백질 서열에 기반하였다. 이 돌연변이 MPV L1 단백질은 이하에서 "MPV.10.34.d"라 지칭된다(도 1B 참조).
야생형 마우스(무스 무스쿨루스) L1 야생형 단백질 서열은 도 1A에 묘사되어 있고, 다음 단백질 서열(서열번호 132, NCBI 참조 서열: YP_003778198.1, DNA: 9434943)을 갖는다:
마찬가지로, MPV1 L1 단백질에 대한 야생형 핵산 서열(서열번호 133)은 다음과 같다:
이와 대조적으로, 다음 연구를 위하여 선택된 돌연변이 MPV 서열은 도 1B에 묘사되어 있고 다음 아미노산 서열(서열번호 134)을 갖는다:
야생형 서열과 삼중 절단 MPV.10.34.d 서열의 정렬이 도 2에 도시되어 있다. 또한, MPV.10.34.d의 핵산 서열(하기)은 발현을 위하여 최적화시켰다. 서열은 숙주 내에서 발현 효율을 최대화하기 위한 발현 수준뿐만 아니라 표적 숙주 내에서 코돈 사용을 위하여 최적화시켰다. 본 명세서에서 사용되는 MPV.10.34.d에 대한 2가지 대안적인 적합화된 핵산 서열이 하기에 제공된다:(서열번호 135)
및 (서열번호 136):
돌연변이 MPV.10.34.d의 재조합체 발현 및 정제를 위한 일반적인 프로토콜은 도 3에 개략으로 묘사되어 있다.
MPV.10.34.d 핵산 서열은 야생형 마우스 유두종바이러스 서열로부터 하기 프라이머 서열(서열번호 137)을 이용한 부위-돌연변이유발(Genscript Biotech, 뉴저지주 피스캐터웨이 소재)을 통해 생성되었다:
이어서, MPV.10.34.d 핵산 서열을 표준 프로토콜에 따라서 제한 엔도뉴클레아제 NdeI 및 BamH1을 사용하여 발현 벡터 pet24a(+)(MilliporeSigma, 매사추세츠주 벌링턴 소재)의 멀티클로닝 부위에 클로닝시켰다. MIu1 및 BamH1을 사용하는 제한 엔도뉴클레아제 효소 소화와 T7 정방향 및 역방향 프라이머 둘 다를 사용하는 Sanger 시퀀싱에 의해 다중 클로닝 부위 및 작제물 서열로의 정확한 클로닝을 확인하였다.
발현은 MPV.10.34.d를 함유하는 pet24a(+) 플라스미드를 T7 발현 적격 에세리키아 콜라이(Escherichia coli) 2566 세포(New England Biolabs, 미국 매사추세츠주 입스위치 소재)로 형질전환시키고, 고체 배지 상에서 콜로니 선택함으로써 달성하였다. 단일 콜로니를 L유레아 broth(LB) 배지에서 표준 프로토콜에 따라 성장시켰다. 간략하게 말하면, including 50μg/mL 카나마이신(Quality Biological, 미국 메릴랜드주 게이더스버그 소재)을 포함하는 5 mL 멸균 LB에 고체 배지로부터 선택된 단일 콜로니를 파종하고, 37℃에서 하룻밤 진탕시키면서 성장시켰다. 이어서, 종자 배양액을 1:25로 희석시키고 OD600이 약 0.6 내지 0.8에 도달할 때까지 37℃에서 계속 성장시켰다. 이어서 약 1mM 최종 농도의 아이소프로필 β-d-1-티오갈락토피라노사이드(IPTG, Invitrogen, 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재)를 배양물에 첨가하여 플라스미드로부터 발현을 유도하였다. 추가 4시간 동안 이러한 조건 하에서 유도를 계속한 후 세포 펠릿을 4℃에서 15분 동안 4000 x g에서 원심분리에 의해 수집한다. 상청액을 버리고 세포 펠릿을 즉시 사용하지 않는 한 -20℃에서 보관하였다.
MPV.10.34.d는 봉입체(IB)로서 발현되었다. IB MPV.10.34.d를 회수하기 위하여, 펠릿을 먼저 해동(냉동된 경우)시키고, 이어서 1 L 펠릿 용해 완충제(50mM Tris, pH 8.0, 500mM NaCl, 1mM EDTA, 1mM 프로테아제 저해제 페닐메틸설포닐 플루오라이드(PMSF))당 20 mL에 재현탁시켰다. 이어서, 재현탁된 물질을 고압 균질화기(Avestin Emulsiflex C3™, ATA Scientific, 호주 타렌 포인트 소재)를 통해 균질화시키고, 세포를 균질화기에 통과시키고, 약 15,000 내지 20,000 PSI에서 4회 용해시켰다. 이어서, 용해된 박테리아 세포를 25,000 x g에서 4℃에서 20분 동안 원심분리시켰다. 이어서, 상청액을 버리고 봉입체 펠릿을 -20℃에서 보관하였다.
다음에, 펠릿(1 L 펠릿당 50 mL)을 6M 유레아 완충제(8M 유레아, 50mM Tris, pH 8.0, 500mM NaCl, 1mM EDTA, 1mM PMSF 및 1mM DTT)에 재현탁시킴으로써 IB를 가용화시켰다. 재현탁된 내용물을 약 15,000 내지 20,000 PSI에서 고압 균질화기(Avestin Emulsiflex C3™, ATA Scientific, 호주 타렌 포인트 소재)를 통해 3 내지 3회 더욱 통과시켰다. 가용화된 샘플을 25,000 x g에서 4℃에서 20분 동안 원심분리시켰다. 샘플의 전체 부피를 담을 수 있을 정도로 충분히 큰 용기에 상청액을 수집하였다. 펠릿을 버렸다. 상청액을 4℃ 또는 -20℃에서 보관하였다.
가용화 후, 단계-구배 방식으로 변성제(6M 유레아)의 제거에 의해 MPV.10.34.d를 리폴딩시켰다. 가용화된 샘플을 투석 튜브(snakeskin dialysis tubing, 10,000 Da 분자량 컷오프, 35 mm(ThermoFisher Scientific, 미국 매사추세츠 월섬 소재))에 삽입하였다. 일반적으로, 약 100 내지 약 150mL의 가용화된 샘플 용액을 단일 투석 튜브에 분배시켰다. 샘플을 먼저 냉장실에서 약 4℃에서 교반 플레이트 상에서 3±1시간 동안 4M 유레아 완충제(50mM Tris, pH 8.0, 500mM NaCl, 1mM EDTA, 1mM PMSF, 1mM DTT 및 0.05% Tween®-80)에 대해서 투석(샘플 대 완충제 비 1:12.5)하였다. 이어서, 샘플을 냉장실에서 교반 플레이트 상에서 3±1시간 동안 신선한 1M 유레아 완충제(50mM Tris, pH 8.0, 500mM NaCl, 1mM EDTA, 1mM PMSF, 1mM DTT 및 0.05% Tween-80)에 대해서 재차 투석하였다. 그 후에, 샘플을 냉장실에서 약 4℃에서 교반 플레이트 상에서 하룻밤(약 16 to 18시간) 0M 유레아 완충제(50mM Tris, pH 8.0, 500mM NaCl, 1mM EDTA, 1mM PMSF, 1mM DTT 및 0.05% Tween-80)에 대해서 투석하였다. 투석된/리폴딩된 샘플 용액을 50 mL 코니컬 튜브에 분주하고 -20℃ 냉동고에 보관하였다.
후속의 의약 용도를 위하여 95% 초과의 순도의 MPV.10.34.d를 얻기 위하여, 샘플을 양이온 교환 크로마토그래피(CEX)를 사용하는 포획 단계와 소수성 상호작용 칼럼(HIC)을 사용하는 폴리싱 단계를 포함하는 2-단계 크로마토그래피 정제에 적용하였다. 포획 단계를 위하여, 리폴딩된 MPV.10.34.d 샘플을 -20으로부터 꺼내어 얼음 위에서 해동시켰다. 다음에, 샘플을 포획 완충제 A(25mM NaPO4, 25mM NaCl, pH 6.0)로 투석하였다. 투석 후, 샘플을 4℃에서 4000 x g, 약 10분 동안 원심분리하고 나서, 0.22μm 폴리에터설폰(PES) 막을 통해 여과시켰다. 이어서, 리폴딩된 MPV.10.34.d 단백질을 CEX(Fractogel® EMD S03-M, EMD Millipore, 미국 매사추세츠주 벌링턴 소재)에 의해 포획하고, 이어서 30% 25mM NaPO4, 1.5 M NaCl, pH 6.0로 단계 용출시켰다. 이것은 적어도 80%의 순도의 정제된 리폴딩된 MPV.10.34.d를 생성하였다.
오염물을 더욱 제거하여 MPV.10.34.d의 순도를 95% 초과로 증가시키기 위하여, CEX 용출물을 고염 완충제로 희석시켜, 25mM NaPO4, 3 M NaCl, pH 6.0의 로딩 조건을 달성하고, HIC 수지(butyl-S-Sepharose® Fast Flow, GE Healthcare Life Sciences/Fisher Scientific, 미국 매사추세츠 월섬 소재)에 적용하였다. 결합된 리폴딩된 MPV.10.34.d 생성물을 30% 25mM NaPO4, 25mM NaCl, pH 6.0으로 사전 용출 세척하고, 이어서 70% 25mM NaPO4, 25mM NaCl, pH 6.0의 단일 단계 구배로 용출시켰다. 95% 초과의 순도의 MPV.10.34.d를 -20℃ 냉동고 속에서 용출 완충제에 보관하였다.
95% 초과의 순도의 MPV.10.34.d는 SDS-PAGE에 이어서 쿠마시 블루 겔 및 은 염색을 통해 확인하였다. 쿠마시 염색을 위하여, 겔을 물에서 인큐베이션하여 SDS-PAGE 시행 완충액을 제거한 후에, SimplyBlue SafeStain(Novex, 캘리포니아주 칼스배드 소재)에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 겔을 물에서 탈색하였다. (도 4A에서의 겔 사진 참조). 제조업체의 지침에 따라서 Pierce Silver stain kit(ThermoFisher Scientific, 일리노이주 록퍼드 소재)를 사용하여 은 염색을 수행하였다. (도 4B 참조). 순도를 추정하기 위하여, 겔의 이미지를 Bio-Rad 이미지 Lab 6.01 소프트웨어를 사용하여 촬영하였다. 이어서, 겔 이미지를 그 소프트웨어에 업로드하고, 관심 밴드("레인 프로파일")를 포함하는 전체 수직 레인을 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 관심 단백질의 밴드의 특정 총 밀도를 그 밴드 주위에 상자 및 프리핸드 형상(freehand shape)을 그려서 계산하였다. 그 후에, 전체 레인의 총 밀도를 동일한 방식으로 측정하였다. 측정값을 얻은 후, 각 경우에 겔 상에서 적합하게 일치하는 영역의 배경 밀도를 차감하였다. 이어서, 단백질 밴드의 배경-보정 밀도/전체 레인의 배경-보정 밀도에 100을 곱해서 순도 퍼센트를 얻었다.
이 분석으로부터 그리고 도 4A 및 도 4B 둘 다에 나타낸 바와 같이, 위에서 기재된 주요 공정 단계는 대략 50 kDA MPV.10.34.d 단백질의 증분식 정제를 제공하였다. 50 kDA 밴드의 위와 아래의 비-특이적 단백질은 각각의 정제 단계에 걸쳐서 상당히 저감되었으며, 여기서 레인 1은 세포 수거 후 샘플, 세척 및 균질화였고; 레인 2는 IB 가용화 후 샘플이었고, 레인 3은 리폴딩 후 샘플이었고, 레인 4는 CEX 샘플을 통한 포획 후 크로마토그래피였고, 레인 5는 HIC를 사용한 폴리싱 단계 후 샘플이었다.
실시예 2
MPV.10.34.d 구조 및 크기의 결정
DLS(동적 광 산란) 및 TEM은 리폴딩 시 MPV.10.34.d가 약 20 nm 내지 30 nm 직경인 캡시드 백본을 예기치 않게 형성하는 것을 드러내었다. (도 5 참조). 리폴딩된 MPV.10.34.d 샘플을 분석하기 위하여, 정제된 샘플을 먼저 DLS로 분석하여 MPV.10.34.d의 리폴딩이 발생했는지의 여부를 결정하였다.
60μl의 샘플을 40μL 내용매성 마이크로 큐벳(ZEN0040, Malvern Panalytical, 매사추세츠 월섬 소재)에 넣고, 후속하여 세포를 Zetasizer Nano ZS 동적 광 산란 기기(Malvern Panalytical, 매사추세츠 월섬 소재)에 넣었다. 이것은 단백질 크기, 단백질의 전기영동 이동성, 콜로이드 및 나노입자의 제타 전위, 및 선택적으로 단백질 이동성 측정, 및 단백질 및 중합체 용액의 미세유변학의 측정을 위한 연구-등급 동적 광 산란 시스템이었다. Zetasizer Nano ZS의 고성능은 또한 거대분자의 분자량과 제2 비리얼 계수 A2 및 DLS 상호작용 파라미터인 kD의 측정을 가능하게 한다. 이 시스템은 SEC 또는 FFF용 크기 검출기로서 작동하는 흐름 구성에서도 사용될 수 있다. 일단 기계에 들어가면, 샘플은 동반 소프트웨어(Zetasizer Nano Software, Malvern Panalytical)로 처리되었다. 프로그램은 총 5회 실행하여 샘플을 판독하여 두 개의 플롯을 생성하도록 설정되었다.
생성된 두 개의 플롯은 캡시드 백본 크기와 구조, 강도(도 6A) 및 부피(도 6B)를 결정하였다. 강도 분포는 다양한 크기의 빈(bin)에서 입자에 의해 산란되는 광의 양을 제공한다. 부피 분포는 다양한 크기의 빈에 있는 입자의 총 부피를 나타낸다. 즉, 강도 플롯(도 6A)은 샘플 내의 숙주 세포 오염물을 포함하는 MPV.10.34.d 입자의 전체 집단 크기에 대한 평가를 제공하는 반면, 부피 플롯(도 6B)은 다른 오염물, 즉, 숙주 박테리아 세포 단백질에 관하여 리폴딩된 단백질의 상대적 비율을 결정한다.
도 6A 및 도 6B의 그래프에서 각 개별 플롯 라인은 개별 샘플(A 및 B 각각에 대해 5개 샘플)을 나타내는 점에 유의한다. 부피 곡선이 약 10 내지 15nm(X-축) 사이이면 셸이 5 MPV.10.34.d 단위로 구성된 캡소머인 것으로 결정되었다. 60 MPV.10.34.d로 구성된 T=1 이십면체 캡시드 백본의 경우, 부피 곡선 플롯은 약 20 내지 30nm였다. 360 MPV.10.34.d로 구성된 T=7 이십면체 캡시드 백본의 경우, 부피 곡선 플롯은 약 50 내지 60nm였다. 강도 그래프(도 6A)로부터 쉽게 알 수 있듯이, 두 개의 피크가 있는데 하나는 약 20 내지 30nm에서 더 낮고 다른 하나는 대략 100nm 초과에서 더 낮은 반면, 부피 그래프(도 6B)는 약 20nm 내지 30 nm의 단일 크기를 나타낸다. 강도 수치의 두 피크는, 이 단계에서 샘플이 정제를 거치지 않았기 때문에 MPV.10.34.d를 캡시드 백본으로 리폴딩한 후에 발생한 캡시드 백본의 뚜렷한 집단의 존재에 기인한 것으로 가정되었다. 그러나, 강도 플롯에 표시된 두 개의 피크 중 더 큰 피크는 샘플의 작은 부분만을 구성하고, 대부분의 샘플은 더 작은 피크에 속한다. 따라서 DLS 결과는 대부분의 MPV.10.34.d가 약 20nm 내지 30nm 크기인 구조임을 나타낸다.
DLS에서, 강도 자기 상관이라 불리는 통계 기법을 사용하여 산란 강도 변동률로부터 용액 내 서브미크론 입자의 움직임(확산)에 관한 정보를 추출한다. 평균 입자 크기 및 분포는 스톡스 아인슈타인 방정식(Stokes Einstein equation)을 사용하여 확산 계수 분포로부터 계산된다. 산란 강도의 크기는 대략 입자 크기의 6승에 따라 달라지기 때문에, DLS는 캡시드 백본의 혼합물에 있는 소량의 응집체의 존재에 매우 민감하며, 이는 도 6A에 나타낸 강도 플롯에 반영된 것으로 여겨진다.
TEM 분석은 또한 리폴딩된 단백질의 구조와 크기를 더욱 시각적으로 확인하기 위해 사용되었다. 샘플(10μL)을 2분 동안 부상시켜 글로우 방전(EMS GloQube) 탄소 코팅된 400 메시 구리 그리드(EMS)에 흡착시켰다. 그리드(grid)를 신속하게 블로팅하고 나서, TBS 3방울(각각 1분)로 헹구었다. 그리드는 틸로스가 포함된 1% 우라닐 아세테이트(1% UAT, 이중 여과, 0.22μm 필터)의 연속 2방울로 음성으로 염색되었고, 블롯팅된 다음 신속하게 흡인되어 샘플을 덮고 있는 얼룩의 얇은 층을 얻었다. 그리드는 AMT XR80 CCD(8 메가픽셀)를 사용하여 80kV에서 작동하는 Phillips CM-120 TEM에서 이미지화되었다.
TEM 결과는 MPV.10.34.d가 오각형/캡소머 "타워"가 있는 현저하게 홈이 파인 외관을 가진 캡시드 백본을 형성한 것을 나타내었다(도 5 참조). 측정 결과, 이러한 캡시드 백본은 크기가 대략 30nm인 것으로 나타났다(TEM 현미경 사진 상에서 500nm 스케일과 비교, 도 5).
이러한 결과는 L1의 나선 4 H4 영역에서 잔기의 결실이 T=1 기하학적 캡시드 백본 형성을 초래하지 않는 것으로 보고되었기 때문에 예상치 못한 것이었다. 또한, HPV11 및 HPV16 L1 단백질에서 동일한 결실로 인해 T=7의 캡소머가 생성되는 것으로 나타났다. (문헌[Chen et al., Mol. Cell, 5:557-567, 2000, WO 2000054730, Bishop et al., Virol. J., 4:3, 2007, 및 et al., J. Virol., 83(15):7690-7705, 2009] 참조). 요약하면, 이들 지견은 MPV.10.34.d 작제물이 60개 단량체 또는 12개 캡소머로 구성된 T=1 격자 기하 형태의 이십면체 캡시드 백본을 형성한다는 결론을 뒷받침한다.
실시예 3
MPV.10.34.d 캡시드 백본 조립체는 환원제를 필요로 한다
HPV 입자는 직경이 50 내지 60nm인 T=7 기하학적 입자를 형성한다. 진핵 또는 원핵 숙주 세포 시스템에서 이러한 캡시드 백본의 제조 및 생산은 고도로 정제된 캡시드 백본을 수득하기기 위하여 적합한 숙주 세포 시스템에서의 발현에 이어서 일련의 정제 단계를 포함한다. 이어서 이러한 캡시드 백본은 분해 및 재조립(DARA) 단계를 거친다. 간단히 말해서, 이것은 캡시드 백본을 캡소머/오량체(5개의 L1 모노머로 만들어짐)로 분해시키기 위해 DTT 또는 유사한 환원제를 첨가하고 이어서 더욱 대칭이고 안정적인 것으로 문서화된 T=7 캡시드 백본으로 다시 조립하기 위해 환원제를 제거하는 것을 포함한다.
MPV.10.34.d가 어떻게 T=1 캡시드 백본으로 리폴딩되는지를 더욱 기술하기 위하여, 실시예 1에서의 리폴딩 단계를 반복하였다. 간단히 말해서, IB의 가용화 후, MPV.10.34.d는 단계-구배 방식으로 변성제(6M 유레아)의 제거를 통해 리폴딩에 적용되었다. 가용화된 샘플을 투석 튜브(snakeskin dialysis tubing, 10,000 Da 분자량 컷오프 35mm(ThermoFisher Scientific, 미국 매사추세츠 월섬 소재))에 삽입하였다. 일반적으로, 약 100 mL 내지 약 150mL의 가용화된 샘플 용액을 4개 투석 튜브에 분배하였다. 이어서 샘플을 냉장실에서 약 4℃에서 교반 플레이트 상에서 3±1시간 동안 일반적인 완충제 레시피인 50mM Tris, pH 8.0, 500mM NaCl 및 0.05% Tween-80을 가진 4M 유레아 완충제에 대해서 투석하였다. 이어서 샘플을 냉장실에서 교반 플레이트 상에서 3±1시간 동안 신선한 1M 유레아 완충제에 대해서 재차 투석하였다. 그 후에, 샘플을 냉장실에서 약 4℃에서 교반 플레이트 상에서 하룻밤(약 16 내지 18시간) 0M 유레아 완충제에 대해서 투석하였다.
이 실험에서 4가지 완충제 조건 간의 주된 차이점은 (i) 1mM EDTA, 1mM PMSF 및 1mM DTT; (ii) 1mM EDTA, (iii) 1mM DTT 및 (iv) ETDA, PMSF 또는 DTT 무첨가의 존재였다. 모두 4가지 조건하에서 투석된/리폴딩된 샘플 용액을 50 mL 코니칼 튜브에 분취하고, -20℃ 냉동고에 보관하기 전에 실시예 2에 기재된 바와 같이 DLS를 통해서 분석하였다. 부피 플롯을 사용하여 도 7에 도시된 바와 같이(그리고 실시예 2에서 설명된 바와 같이), 화살표로 표기된 바와 같은 응집체가 샘플 (ii) 및 샘플 (iv)에서 관찰되었다. (각각 도 7C 및 도 7D 참조). 샘플 (i) 또는 샘플 (iii)에서의 DLS 부피 플롯 상에 응집체가 거의 또는 전혀 관찰되지 않았다. (각각 도 7A 및 도 7B 참조).
MPV.10.34.d가 T=1 캡시드 백본으로 성공적으로 리폴딩되었는지의 여부를 더욱 확인하기 위하여, 모든 샘플을 포획 완충제 A(25mM NaPO4, 25mM NaCl, pH 6.0)로 하룻밤 4℃에서 투석하였다. 투석 후, 샘플을 4℃에서 4000 x g에서 10분 동안 원심분리시키고, 이어서 0.22μM PES 막을 통해서 여과시켰다. 이어서 T=1 캡시드 백본 플랫폼을 CEX(EMD Fractogel S03 (M), EMD Millipore, 독일 다름슈타트 소재)에 의해 포획하고, 이어서 30% 25mM NaPO4, 1.5M NaCl, pH 6.0으로 단계 용출시켰다. 결과는 도 8에 나타나 있다. 도 8은 DTT/ETDA/PMSF(도 8A) 또는 DTT 단독(도 8B)으로 리폴딩된 샘플에서 정확하게 리폴딩된 T=1 캡시드 백본의 성공적인 포획 및 용출을 나타낸다. 대조적으로, 도 8에서 화살표로 구분된 바와 같이 ETDA 단독(도 8C) 또는 첨가제 없음(도 8D)을 포함하는 리폴딩 조건하에서 정확하게 리폴딩된 T=1 캡시드 백본의 포획 및 용출은 거의 내지 전혀 없었다.
종합하면, 데이터는 T=1 캡시드 백본을 생산하는 과정이 환원 조건을 선호하는 것을 나타낸다. 이것은 성공적인 캡시드 백본 조립을 위하여 임의의 환원제의 궁극적인 제거를 필요로 하는 HPV T=7 캡시드 백본을 생산하는 공지된 공정과는 대조된다.
실시예 4
가용성 MPV.10.34.d의 제조
1mM IPTG의 존재 하에 37℃에서 4시간 동안 MPV.10.34.d의 박테리아 발현은 고도로 정제된 20nm 내지 30nm T=1 캡시드 백본 구조를 얻기 위해 실시예 1에 기재된 바와 같은 일련의 공정 단계에서 처리되어야 하는 IB의 발현 및 형성을 초래한다. 가용성 MPV.10.34d가 이. 콜라이에서 세포 내로 발현될 수 있는지의 여부와 IB와는 반대로 T=1 캡시드 백본으로 조립될 수 있는지의 여부를 조사하기 위해, 유도 온도와 IPTG 농도를 낮추어 발현을 늦춤으로써 IB의 형성을 방지하는 전략을 채택하였다.
실시예 1로부터, 유도 온도를 100μM 및 1mM의 IPTG의 농도에서 37℃에서 16℃로 낮추었다. 간단히 말해서, MPV.10.34d DNA로 형질전환된 새롭게 채택된 이. 콜라이 C2566 콜로니를 50μg/mL의 카나마이신(이후 LB+KAN) 종균 배양물이 포함된 LB에 접종하고, 37℃ 및 250 rpm에서 하룻밤 성장시켰다. 다음날 종균 배양물을 사용하여 신선한 250mL LB+KAN 배양물을 1:25 희석으로 접종하고 37℃, 250rpm에서 약 1.5 내지 2시간 동안 배양하여, 배양물이 약 0.5 내지 0.7의 OD600에 도달하도록 하였다. 이 시점에서, 배양물을 1mM 및 다른 테스트된 IPTG 농도(들)로 유도하고 16℃ 유도 온도에서 하룻밤 진탕시켰다. 다음 날, 유도 후 샘플(각각 1mL)을 1500 x g에서 10분 동안 펠릿화하였다. 상청액을 제거하고 나머지 벌크 샘플을 4℃에서 4000 x g에서 10분 동안 펠릿화하였다. 이 샘플을 분석할 때까지 -20℃에서 보관하였다.
가용성 재료를 결정하기 위하여, 세포를 균질화기(15,000 내지 20,000psi, 3주기)를 사용하여 용해시켰다. 미유도 재료, 유도된 재료, 용해 후 가용성 재료 및 용해 후 불용성 재료의 샘플을 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯으로 분석하였다. 결과는 유도 온도를 16°C로 낮추면 감지할 수 없는 수준의 단백질이 생성되었음을 나타낸다(데이터 미제시).
MPV.10.34.d의 발현은 16℃에서 낮거나 감지할 수 없었기 때문에, 더 높은 온도인 25℃에서 유도를 시도하였다. 25℃의 유도 온도에서, MPV.10.34d는 성공적으로 발현되었다. 대부분의 MPV.10.34.d가 IB의 형태로 발현되었다(데이터는 미제시). 30℃에서의 세 번째 시도는 위에 기재된 유도 조건하에 시도하였다. 이 온도에서 가용성 발현이 엄청나게 개선된 것이 발견되었다. MPV.10.34.d가 가용성 형태로 발현된 약 50%로 성공적으로 전환될 수 있도록 25℃와 30℃ 사이에 중요한 전이가 있는 것으로 나타났다. 대조적으로, IPTG의 농도는 전환된 MPV.10.34.d의 양에 미미한 영향을 미치는 것으로 나타났다.
이러한 가용성 MPV.10.34.d를 정제하기 위하여, 단일 단계 용출 크로마토그래피 정제가 개발되었고, 후속하여 이용되었다. 간단히 말해서, MPV.10.34d를 함유하는 가용성 용해물을 50mM NaPO4, 50mM NaCl, pH 7.0에서 제조하였다. 1 mL 사전 패킹된 Fractogel SO3 (M) 칼럼을 50mM NaPO4, 50mM NaCl, pH 7.0로 평형화시키고, 500μL의 MPV.10.34d 용해물을 칼럼에 주입하였다. MPV.10.34d의 용출에 대한 전도도 창을 확인하기 위하여, 5, 10, 15, 20, 25 및 100% B 단계(B = 50mM NaPO4, 1.5M NaCl, pH 7.0; 이는 0.075M, 0.15M, 0.225M, 0.3M, 0.375M, 및 1.5M의 이론적 NaCl 농도로 전환됨)를 포함하는 일련의 단계 구배 용출을 수행하였다. MPV.10.34d의 용출을 기반으로 하여, 단일 단계 방법이 개발되었고, 최대 5 mL의 주입 부피를 가진 5 mL 사전 패킹된 Fractogel SO3 (M) 칼럼으로 확장되었다. 이 단일 단계 방법은 15%B를 사용하였으며, 여기서 B는 50mM NaPO4, 500mM NaCl, pH 7.0이었다. (1.5M NaCl의 작은 백분율 변화에 의존하면, 마찬가지로 사전-칼럼 혼합 부피로 인해 1 mL 칼럼을 사용할 때 전도도 불규칙성이 초래되기 때문에, NaCl의 농도가 낮을수록 전도도의 보다 일관적인 제어가 가능하다).
이러한 노력을 기반으로 하여, CEX-포획된 MPV.10.34d의 밀리그램 규모의 양을 생성하기 위해 단일 단계 구배 용출 방법이 개발되었다. 그 후에, 용출 재료를 수집하고, 실시예 2에 기재된 바와 같이 분석하였다. 결과는 용출된 MPV.10.34d로부터의 DLS(도 9A 및 도 9B) 및 TEM 데이터(도 9C)가 20 내지 30nm 직경의 T=1 캡시드 백본을 산출한 것을 나타내었다.
실시예 5
가용성 및 IB MPV.10.34.D는 T=1 캡시드 백본을 형성한다
MPV.A4 항체는 T=1 또는 T=7 캡시드 백본 구조의 형태로 MPV L1에 특이적으로 결합하는 입체형태적 항체이다. 이 항체는 변성 또는 단량체성 MPV L1에 결합하지 않는다. (Hafenstein et al., 2020, "Atomic Resolution CRYOEM structure of Mouse Papillomavirus," International Papillomavirus Conference, July 20-24, 2020). 실시예 1 또는 실시예 4의 단계를 거친 MPV.10.34.d가 T=1 캡시드 백본을 산출하는지를 결정하기 위하여, MPV.A4 단클론성 항체를 사용하여 이들 샘플에 대해서 ELISA를 수행하였다.
동일한 농도(출발 농도 1000ng/웰)의 실시예 1 및 실시예 4로부터의 샘플을 ELISA에 적용하였다. 가용성 및 리폴딩된 MPV.10.34.d가 둘 다 ELISA 플레이트(Nunc Maxisorp, ThermoFisher Scientific, 미국 매사추세츠 월섬 소재)에 동등하게 결합되었는지 확인하기 위하여, 두 샘플을 먼저 50mM NaPO4, 450mM NaCl에 pH 6 또는 pH 7에서 완충제 교환하였다. 이로 인해 두 샘플 모두에 대해서 두 가지 다른 pH 조건이 생성되었다. 이것을 기반으로 해서, 총 4개의 샘플 조건을 2배 연속 희석시켜 MPV.A4 단클론 항체로 ELISA를 수행하였다.
간단히 말해서, 두 pH 조건(pH 6 또는 pH 7에서 50mM NaPO4, 450mM NaCl)하에 각 샘플에 대해서 8가지 상이한 양의 단백질(7.8ng 내지 1μg)을 먼저 ELISA 플레이트에 첨가하고, 이 플레이트를 4℃에서 보관하였다. 2일 후, 각 플레이트를 차단 완충제(4% 분유, 0.2% Tween-20)를 사용하여 1:1000 희석된 MPV.A4 mAb와 함께 오비탈 쉐이커(300 rpm) 상에서 실온에서 1시간 동안 인큐베이션함으로써 ELISA를 수행하고, 플레이트를 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 실온에서 총 3회 세척(세척당 샘플당 200μL)으로 세척 완충제(0.35 M NaCl, 1.5mM KH2PO4, 6.5mM Na2HPO4, 0.05% Tween-20)를 사용하여 세척 단계를 이용하였다. 세척 단계 후, 염소 항-마우스 IgG-HRP 항체(Millipore Sigma, 미국 미주리주 세인트루이스 소재)를 차단 완충제(4% 분유, 0.2% Tween-20)에 1:7000 희석하여 82.9 ng/mL의 최종 농도로 첨가하고, 플레이트를 오비탈 쉐이커(300 rpm) 상에서 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 플레이트를 세척하고, 퍼옥시다제 기질(3, 3', 5, 5' 테트라메틸 벤지딘, SeraCare Life Sciences, Inc., 미국 매사추세츠주 밀퍼드 소재)로 30분 동안 인큐베이션하고 나서, 정지 용액(0.36N H2SO4)(J.T. Baker/Avantor, 미국 펜실베이니아주 앨런타운 소재)의 20분 동안 첨가 및 인큐베이션하였다. 샘플 플레이트의 흡광도를 플레이트 판독기(BioTek, 미국 버몬트주 위누스키 소재)로 450nm 및 620nm에서 판독하였다.
결과(도 10)는 pH 7(흑색 원)에서 완충제를 사용하여 포획한 투석되지 않은 가용성 MPV10.34.d 캡시드 백본뿐만 아니라, pH 7(흑색 정사각형) 및 pH 6(흑색 삼각형)에서 완충제에 대해서 툭석된 가용성 형태가 MPV.A4 단클론성 항체에 의해 인식된 것을 나타내었다.
요약하면, IB로부터 리폴딩된 MPV.10.34.d 캡시드 백본(실시예 1) 및 가용성 MPV.10.34.d 캡시드 백본(실시예 4)은 둘 다 MPV.A4 입체형태적 단클론성 항체에 의해 인식된다.
실시예 6
IRC 형성: MPV.10.34.d 캡시드 백본 접합
MPV.10.34.d 캡시드 백본이 대상체에서 암세포를 공격하기 위해 기존의 면역계를 동원하는 데 효과적이도록 해당 캡시드 백본을 기능화하기 위하여, MPV.10.34.d 캡시드 백본을 오브알부민 펩타이드 SIINFEKL(OVA, 서열번호 95), HPV16 E7 단백질(서열번호 96) 및 CMV 펩타이드 pp65(서열번호 129)을 포함하는 다양한 펩타이드 에피토프에 접합시켜 IRC를 형성하였다.
펩타이드의 설계: 펩타이드는 프로테아제 인식 부위가 상류에 선행하는 약 8 내지 10개 아미노산의 일반적 길이를 갖는 에피토프이다. (도 11 참조). 하기 실험은, 에피토프 펩타이드의 상류에 위치하도록 설계된 퓨린 프로테아제 절단 서열 R X R/K R(서열번호 89)인 예시적인 프로테아제 인식 부위를 포함한다. 또한, 에피토프 펩타이드는 말레이미드를 함유하도록 N-말단에서 화학적으로 변형된다. 설프히드릴 반응성 시약인 말레이미드를 펩타이드 항원의 N-말단에 혼입하면, MPV.10.34.d 캡시드 백본 상에서 환원된 설프하이드릴기, 즉, 시스테인에 대한 프로테아제/펩타이드의 접합을 가능하게 한다. 이 반응의 최종 생산은 접합된 MPV.10.34.d 캡시드 백본이다.
약 95% 초과의 순도의 정제된 MPV.10.34.d 캡시드 백본을 접합시키기 위하여, MPV.10.34.d를 접합 반응 완충제(50mM NaPO4, pH 6.5, 500mM NaCl, 2mM EDTA 및 0.05% Tween® 80)에서 더욱 투석하고, 완충제를 3회(2℃ 내지 8℃에서, 3±1시간, 3±1시간 및 하룻밤 16±3시간) 교환하였다. 다음 날, MPV.10.34.d를 적어도 0.6μg/μL의 최종 농도로 조정하였다. 이어서 MPV.10.34.d를 10:1의 TCEP:MPV.10.34.d 비로 실온(21℃)에서 진탕 없이 경미한 환원제인 트리스(2-카복시에틸)포스핀(TCEP)으로 1시간 동안 처리하였다. 그 후에, 펩타이드를 MPV.10.34.d의 양의 X10의 몰비로 반응에 첨가하였다. 이 반응물을 실온(21℃), 200 rpm에서, 1시간 동안 진탕시켰다. 접합 후, 과량의 유리 펩타이드를 제거하기 위하여, 반응으로부터의 내용물을 매회 10분 동안 1000rcf에서 10회의 Amicon 스핀 여과(분자 컷오프 100kDa)에 적용하였다. 이 정제 단계 후에, 샘플을 Coomassie Brilliant Blue R-250 염료(Bio-Rad, 미국 캘리포니아주 허큘리스 소재)로 염색된 SDS-PAGE에 의해 분석하여 접합 퍼센트(4 - 20% CRITERION™ TGX Stain-Free™ Precast Gels, 10 Well Comb, 30μL, 1.0 mm, Bio-Rad, 미국 캘리포니아주 허큘리스 소재)를 결정하였다. 도 12에 도시된 바와 같이, 약 50 kDa에서의 상부 밴드는 IRC에 대응하는 것으로 결정되었다. (도 12, 레인 4 참조). 하부 밴드는 에피토프 펩타이드를 결여하는 MPV.10.34.d를 나타낸다. 이들 밴드 동질성은 접합된 대조군을 통해서 추가로 확인되었다. (도 12, 레인 3 참조).
중요하게는, MPV.10.34.d의 접합은 밀도측정법에 의해 결정된 바와 같이 약 50%의 접합 효율을 산출하였다. (도 12, 레인 4 참조). 접합 퍼센트는 밀도측정법에 의해 계산되었다. 제조사-권장 소프트웨어를 사용하여 겔 이미지를 컴퓨터로 스캔하였다. 그 후에, 각 밴드 주위에 상자 또는 프리핸드 형상을 그려서 상부 밴드와 하부 밴드의 총 밀도를 계산하였다. 이들 영역의 총 밀도는 각 밴드에서 총 단백질량에 대응한다. 다음에, 상부 레인만 같은 방식으로 측정하였다. 각 젤에서 적합하게 일치하는 영역의 배경 밀도를 수집하고, 밴드 신호로부터 차감한다. 이어서, 상부 단백질 밴드의 배경-보정된 밀도를 관심 영역의 전체 배경-보정된 밀도로 나눈 다음 100을 곱해서 접합 퍼센트를 얻었다.
실시예 7
MPV.10.34.d 및 HPV16 캡시드 백본의 접합 효율
실시예 6에 기재된 바와 같은 동일한 접합 반응 단계를 사용하는 HPV L1 입자의 접합은 전에 기술되었다. (예를 들어, WO 2018/237115 및 WO 2020/139978 참조). 접합 실험은 실시예 6에 기재된 방식으로 HPV16 캡시드 백본 및 MPV.10.34.d 캡시드 백본에서 수행되었다. 캡시드 백본에 접합된 펩타이드 에피토프는 CMV pp65 항원으로부터 유도된 HLA-A2 수퍼타입으로부터의 HLA-A*0201 제한된 에피토프 NLVPMVATV(NLV, 서열번호 138)였다.
도 13에 나타낸 바와 같이, 10:1(TCEP:L1) 및 10:1(펩타이드:L1) 비의 동일한 접합 반응 조건하에서, MPV.10.34.d 캡시드 백본은 HPV16(약 20%, 도 13, 레인 3)에 비해서 더 높은 접합 백분율(50%, 도 13, 레인 5)을 나타냈다. 접합 퍼센트는 위에서 기재된 바와 같이 밀도측정법에 의해 결정되었다. 대조군 샘플은 비접합 HPV16(도 13, 레인 2) 및 비접합 MPV.10.34.d(도 13, 레인 4)를 포함하였다.
펩타이드 접합 퍼센트는 적어도 2개의 인자에 따라 좌우되는 것으로 여겨진다: (1) 환원제 대 L1 단백질의 비 및 (2) 접합 반응에 첨가된 유리 펩타이드의 양. 도 13에 나타낸 결과에 대해서, 10:1의 환원제 대 L1 비 및 10:1의 펩타이드 대 L1 비는 MPV.10.34.d 캡시드 백본에 대해서 적어도 50% 접합(도 13, 레인 5) 및 WT HPV16 T=7 캡시드 백본에 대해서 적어도 20%(도 13, 레인 3)를 초래하는 것으로 결정되었다.
환원제 농도의 영향을 더욱 평가하기 위하여, 10:1의 환원제 대 L1 단백질(도 14, 레인 3 및 레인 10, 각각 HPV16 IRC 또는 MPV.10.34.d IRC에 대해서), 100-배 비(도 14, 레인 4 및 레인 11, 각각 HPV16 IRC 또는 MPV.10.34.d IRC에 대해서), 및 1000-배 비(도 14, 레인 5 및 레인 12, 각각 HPV16 IRC 또는 MPV.10.34.d IRC에 대해서)로 접합 반응을 수행하였다. 놀랍게도, 100:1 및 1000:1의 환원제 대 L1 비는, 표준 10:1의 환원제 대 L1 단백질 비와 비교하여, 더 낮은 접합 퍼센트를 산출하였고, 어떤 경우에는 심지어 검출할 수 없는 접합을 생성하였다. 임의의 특정 이론에 의해 얽매이길 원치 않지만, 과량의 환원제가 펩타이드와 반응하여 L1 표면 티올에 대한 펩타이드의 접합과 대략 동일한 속도로 -일렌 부산물을 형성하는 것이 가능하다. 이러한 현상은 L1에 접합할 수 있는 펩타이드를 고갈시킬 수 있었다.
IRC의 상대적 안정성도 평가되었다. 접합 후, IRC 샘플을 Amicon 10 kDa 필터 스핀 칼럼으로 여과시켜 과량의 유리 펩타이드를 제거하였다. 여과 후, 샘플의 단백질 농도를 점검하여 여과 중에 단백질이 손실되지 않았는지 확인하였다. (HPV16 IRC 또는 MPV.10.34.d IRC에 대해서 각각 도 14, 레인 6 내지 8 및 레인 13 내지 15 참조). 이어서, 샘플을 실시예 2에 기재된 바와 같이 TEM으로 분석하였다. 도 15A 및 도 15B는 각각 150,000X 및 200,000X 배율에서의 예시적인 TEM 현미경 사진이며, 이는 Amicon 정제 후 HPV16 IRC의 파괴를 나타낸다. 대조적으로, MPV.10.34.d IRC는 각각 180,000X 및 200,000X 배율에서 도 15C 및 도 15D에 도시된 바와 같이, 어떠한 파괴도 나타내지 않았다.
임의의 특정 이론에 의해 얽매이길 원치 않지만, MPV.10.34.d IRC의 추가 안정성이 아마도 이황화 결합 대신에 함께 유지되는 T=7 입자와 비교하여 소수성 결합에 의해 함께 유지되는 캡시드 백본 자체의 고유한 구조적 안정성에 기인될 수 있는 것이 가정된다. 실제로, 접합 반응 동안의 환원 단계는 사실상 필요한 티올기의 환원을 통해 이황화 결합에 의해 함께 유지되는 T=7 구조를 불안정화시킬 수 있다. 결과적으로, MPV.10.34.d 캡시드 백본은 TCEP 대 L1의 최대 100:1 또는 1000:1 비로 처리된 후 비교적 더 안정적일 수 있다.
이들 지견의 결과로서, MPV.10.34.d 캡시드 백본이 대상체에서 암을 치료할 목적으로 대상체에서 기존의 면역계 성분을 동원하기 위한 안정적인 접합 플랫폼으로서 잘 작용할 것이라는 결론을 내렸다.
1:100 초과의 환원제 비에서 MPV.10.34.d 캡시드 백본의 접합에 대한 개선(SDS-PAGE 겔 상에서의 밀도측정법에 의해 나타낸 바와 같은 50%)은 없었지만, 1:10보다 높지만 1:100보다 낮은 환원제 비가 접합 효율을 증가시키는지의 여부를 결정하기 위하여 이러한 범위를 조사하였다. 따라서, 접합 반응은 1:100 미만, 구체적으로 5:1, 10:1 및 25:1의 비에서의 다양한 양의 환원제로 앞서 기재된 바와 같이 반복하였다. 펩타이드 대 MPV.10.34.d 비(5:1, 10:1 및 25:1)도 평가하였다.
도 16에서 알 수 있는 바와 같이, 환원제: L1 단백질 비가 5:1(레인 1, 4 및 7)인 경우 5:1, 10:1 및 25:1 펩타이드:L1 비를 사용하는 MPV.10.34.d 캡시드 백본에 대한 용량-의존적 펩타이드 접합이 관찰되었다. 10:1(레인 2, 5 및 8) 및 20:1(레인 3, 6 및 9)에서의 환원제:L1 단백질 비로 펩타이드 용량 의존성은 보이지 않았다. 레인 6은, 10:1의 환원제 대 L1 비 및 10:1의 펩타이드 대 L1 비가 사용된 참조점이고, 대략 50% 수준의 펩타이드 접합이 밀도측정법에 의해 결정된 바와 같이 일상적으로 관찰되는 조건이다. "CEX-FB035"로 표기된 레인은 MPV.10.34.d 캡시드 백본만을 함유하는 대조군이다.
펩타이드 대 L1의 10:1 비와 함께 환원제 대 L1의 5:1 비가 50%를 넘는 접합 효율을 수득한 것으로 결정되었다. (도 16, 레인 4 및 7 참조). 환원제 대 L1 단백질 비가 1:1, 2.5:1 및 5:1인 접합 조건도 테스트되었다. 이들 비에서 얻어진 결과는 도 17에 보고되어 있다. 환원제의 양을 5:1에서 1:1로 낮추는 것은, 반응에 포함된 펩타이드의 양에 관계없이, 접합 효율을 개선시키지 않는 것으로 결정되었다. 도 17에서, 레인 R은 10:1의 펩타이드 대 L1 비뿐만 아니라 10:1의 환원제 대 L1 비가 포함된 참조점 샘플이며, 이는 전형적으로 약 50% 수준의 펩타이드 접합을 수득한다. "CEX-FB035"로 표기된 레인은 MPV.10.34.d 캡시드 백본만을 함유하는 대조군이다. 요약하면, 5:1의 환원제 대 L1 비 및 10:1의 펩타이드 대 L1 비가 50%를 넘는 접합률을 달성하는 것으로 결정되었다.
실시예 8
HSPG를 통한 종양 세포에 대한 IRC의 결합
IRC가 종양 세포에 결합하는지의 여부를 평가하기 위하여, 시험관 내 세포 결합 검정을 수행하였다. 구체적으로, 두 MPV.10.34.d 캡시드 백본(비접합)뿐만 아니라 상이한 접합된 IRC(인간 CMV pp65, 뮤린 E7 및 뮤린 OVA 펩타이드)도 조사하였다.
간단히 말해서, 2×105개 MC38 세포(뮤린 결장 선암종, # ENH204-FP Kerafast, Inc., 매사추세츠주 보스톤 소재) 또는 pgsA-745 세포(헤파린 설페이트 프로테오글리칸(HSPG) 발현이 녹아웃된 자일로실트랜스퍼라제(UDP-D-자일로스:세린-1,3-D-자일로실트랜스퍼라제, ATCC CRL-2242)가 결핍된 중국 햄스터 난소 세포 돌연변이체)를 하룻밤 파종하였다. 다음 날, 세포를 인간 CMV pp65, 뮤린 HPV16 E7 및 뮤린 OVA 펩타이드뿐만 아니라 MPV.10.34.d 캡시드 백본으로 37℃에서 1시간 동안 처리하였다. 이어서, 세포를 2 내지 3mL의 형광 활성화 세포 분류(FACS) 완충제(PBS 중 1% 소 혈청 알부민)로 2회 세척하고, 이어서 1mL의 토끼 항-musPsV 혈청 항체로 4℃에서 30분 동안 염색하였다. 그 후, 샘플을 3 mL의 FACS 완충제로 한 번 세척하고, 0.5mL의 당나귀 항-토끼 IgG-PE 항체(Biolegend, 캘리포니아주 샌디에이고 소재)로 어두운 곳에서 4℃에서 30분 동안 염색하였다. 마지막으로, 샘플을 3 mL의 FACS 완충제로 한 번 더 세척하고, 이어서 CytoFLEX 유세포분석기(Beckman Coulter Life Sciences, 미국 캘리포니아주 브레아 소재)에 의해 분석하기 전에 250mL의 FACS 완충제에 재현탁시켰다.
도 18A 및 도 18B에 나타낸 바와 같이, MPV.10.34.d - CMV pp65 IRC(실선), MPV.10.34.d - E7 IRC(두꺼운 실선), MPV.10.34.d - OVA IRC(두꺼운 대시선) 및 MPV.10.34.d 캡시드 백본(대시선)의 모든 작제물은 피크가 우측으로 이동하는 것에 의한 증거로서 종양 세포에 대한 특이성을 나타냈다. 이들 실험에서의 양성 대조군은 MPV 캡시드 백본(야생형, 점선)이었다. 음성 대조군은 IRC 또는 L1(긴 대시선)을 포함하지 않았다.
이들 실험은 MPV.10.34.d 캡시드 백본의 결합이 HSPG 발현을 결여하는 세포주(pgsA-745 세포, 도 17B에서 피크의 이동 없음으로 표시됨)에서 관찰되지 않았기 때문에 IRC이 HSPG-특이적 결합을 나타내었음을 더욱 보여준다. 요약하면, 이러한 결과는, 종양 세포에 대한 MPV.10.34.d 캡시드 백본의 결합 특이성이 HSPG 특이적이고, 중요하게는, MPV.10.34.d 캡시드 백본에 대한 에피토프 펩타이드의 접합이 감소되지 않거나 또는 다르게는 시험관내에서 종양 세포에 대한 MPV.10.34.d IRC의 결합에 부정적으로 영향을 미치지 않는 것을 나타낸다.
실시예 9
MPV.10.34.d IRC에 의한 종양 세포에의 펩타이드의 로딩
MPV.10.34.d IRC는, 펩타이드가 종양 미세환경에 진입 시 IRC로부터 절단됨으로써, 종양 세포 표면 근방에서 펩타이드를 방출하도록 설계된다. 절단 사건은, 일부 실시형태에서, 종양 세포 상에 또는 그 근처에 대상체의 시스템의 다른 곳보다 상대적으로 높은 농도로, 일부 실시형태에서, 존재하는 종양-특이적 프로테아제, 즉, 프로테아제와 접촉 시 발생한다. 이어서, 이 절단 사건은 종양 세포의 표면에서 발현되는 MHC 분자에 의해 펩타이드의 로딩 또는 결합을 초래하도록 설계된다. 다음 실험은 이 작동 모드와 설계된 IRC가 예상된 방식으로 작동하는지의 여부를 테스트하도록 설계된다.
이 목적을 위하여, 종양 세포의 표면에 발현되는 MHC 클래스 I 분자 상에 IRC로부터의 펩타이드 로딩을 직접 검출하는 MHC 클래스 I 분자 로딩 검정이 개발되었다. 이 검정은 OVA 펩타이드(SIINFEKL, 서열번호 95) - 유리 펩타이드가 아니라 MHC 클래스 I 동종항원 H-2Kb 분자 복합체, 빈 MHC 클래스 1 분자, 또는 IRC에 접합된 펩타이드를 특이적으로 인식하는 항체의 사용을 수반한다. (문헌[Zhang et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 89:8403-84-7, 1992] 참조).
이 실험에서, 실시예 6으로부터의 OVA 접합된 MPV.10.34.d IRC는 접합된 펩타이드의 농도를 기준으로 등가 몰농도에서 OVA 접합된 HPV16 IRC와 나란히 조사되었다. 간단히 말해서, 0.1 내지 0.2×106개 MC38 종양 세포(C57BL6 뮤린 결장 선암종-유도 세포, # ENH204-FP, Kerafast, Inc., 매사추세츠주 보스톤 소재)를 IRC와 함께 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 단지 유리 펩타이드를 포함하는 양성 대조군 및 펩타이드 또는 IRC를 포함하지 않는 음성 대조군도 테스트되었다. 이어서, 세포를 2 내지 3 mL의 FACS 완충제로 2회 세척하고, 이어서 OVA(SIINFEKL, 서열번호 95) 단클론성 항체와 결합된 PE-접합된-마우스 항-마우스 MHC I(Biolegend, 캘리포니아주 샌디에이고 소재)로 4℃에서 30분 동안 염색하였다. 그 후, 샘플을 3 mL의 FACS 완충제로 한 번 세척하고, 이어서 세포를 CytoFLEX 유세포분석기(Beckman Coulter Life Sciences, 미국 캘리포니아주 브레아 소재)로 분석하기 전에 250μL의 FACS 완충제에 재현탁시켰다.
이들 검정의 결과는 도 19에 제공된다. 이 결과는 OVA-접합된 MPV.10.34.d IRC(1.4μg/mL, 두꺼운 실선) 및 OVA-접합된 HPV16 IRC(2.5μg/mL, 실선)가 MC38 뮤린 종양 세포의 표면 상에 에피토프의 로딩을 입증하고, OVA-접합된 MPV.10.34.d IRC가 OVA-접합된 HPV16 IRC를 능가하는 것을 나타낸다. (도 18, 음성 대조군 - 긴 대시선, 양성 대조군 - 얇은-대시선 참조). 이들 결과는, 소량의 MPV.10.34.d IRC가 동일하거나 더 양호한 더 많은 양의 HPV16 IRC의 "로딩" 가능성을 달성하였기 때문에, MPV.10.34.d IRC가 HPV16 IRC보다 우수하다는 것을 시사한다.
OVA는 뮤린 MHC에 사용되는 모델 항원이므로, 이 실험은 OVA 펩타이드를 CMV pp65 펩타이드로 대체하여 반복하였다. CMV pp65로부터의 HLA-A*0201 제한된 에피토프 NLVPMVATV(NLV, 서열번호 138)가 이 연구에 사용되었고, pp65-접합된 MPV.10.34.d IRC는 실시예 6에 기재된 바와 같이 제조하였다. MHC 클래스 I - NLV 복합체를 인식하는 상업적으로 입수 가능한 단클론성 항체가 없었기 때문에, 이 HLA-A2 복합체를 인식하는 가용성 T-세포 수용체 항체(2S16)를 사용하였다. (문헌[Wagner et al., J. Biol. Chem., 295(15):5790-5804, 2019] 참조). 세포주인 HCT116(인간 결장직장 암종 세포주, HCT 116, ATCC, CCL-247) 및 MCF7(인간 유방암 세포주, MCF7, ATCC, HTB-22)가 이 연구에 사용된 것을 제외하고 위에서와 마찬가지 방식으로 IRC 작제물을 분석하였다. 이들 세포주는 HLA-A*0201 제한된 것이고, 따라서 CMV pp65 펩타이드로부터의 HLA-A*0201 제한된 에피토프 NLVPMVATV(NLV, 서열번호 138)를 제시할 수 있다.
OVA MHC 클래스 I 로딩 결과와 일관되게, 인간 종양 세포 상에 NLV 펩타이드의 로딩이 관찰되었다. 결과는 도 19A(HCT116 세포) 및 도 19B(MCF7 세포)에 제시되어 있다. 도 20A 및 도 20B에서, 관련 없는 B형 간염 펩타이드가 음성 대조군(가는 대시선, 10μg/mL)으로서 사용되었고, 비접합 MPV.10.34.d 캡시드 백본이 추가의 음성 대조군(가는 실선, 100μg/mL)으로서 사용되었고, CMV 접합된 MPV.10.34.d IRC는 두꺼운 실선(100μg/mL, 약 1.7μg/mL의 hCMV 펩타이드 접합됨)으로 표시된다, HCMV 무함유 펩타이드는 두꺼운 대시선(1μg/mL)으로 표시된다.
도 19 및 도 20은 표시된 세포주를 사용한 시험관내 MPV.10.34.d IRC의 인큐베이션이 펩타이드의 방출 및 종양 세포 표면 MHC 클래스 1 분자에 대한 결합을 유도하는 것을 나타낸다. IRC의 메커니즘이 먼저 종양 세포에 대한 MPV.10.34.d IRC 결합에 이어 퓨린 절단을 수반한다는 것을 추가로 입증하기 위하여, 종양 세포 결합 또는 퓨린 절단을 저해하는 경쟁적 저해 실험을 수행하여 이중 어느 하나의 단계의 제거가 종양 세포에 펩타이드 로딩의 부재를 초래하는 것을 나타내었다. 이들 연구는 OVA-접합된 MPV.10.34.d IRC로 수행되었고 위에서 기재된 결합 검정과 동일한 조건 하에서 수행되었다.
종양 결합을 차단하기 위하여, 1 mg/mL, 5 mg/mL, 또는 10 mg/mL의 가용성 헤파린(Sigma Aldrich, 미주리주 세인트루이스 소재)을 FACs 튜브에서 2×105개 MC38 세포의 존재 하에 2.5μg/mL의 OVA-접합된 MPV.10.34.d IRC와 37℃, 5% CO2에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 샘플이 있는 세포의 최종 부피는 200μL였다. 가용성 헤파린을 함유하지 않는 양성 대조군 샘플뿐만 아니라 IRC 또는 헤파린을 함유하지 않는 음성 대조군도 포함하였다. 이어서, 세포를 2 내지 3 mL의 FACS 완충제로 2회 세척하고, 이어서 OVA 펩타이드 단클론성 항체(이 단클론성 항체는 MHC-I Kb와 복합하여 OVA 펩타이드, SIINFEKL, 서열번호 95를 특이적으로 검출할 수 있음)에 결합된 PE-접합된-마우스 항-마우스 MHC I로 4℃에서 30분 동안 염색하였다. 그 후, 샘플을 3 mL의 FACS 완충제로 한 번 세척하고, 이어서 세포를 CytoFLEX 유세포분석기(Beckman Coulter Life Sciences, 미국 캘리포니아주 브레아 소재)에 의해 분석하기 전에 250μL의 FACS 완충제에 재현탁시켰다. 도 21A, 도 21B 및 도 21C에 나타낸 바와 같이, 음성 대조군에서는 OVA 펩타이드 로딩이 관찰되지 않았다(도 21A, 도 21B 및 도 21C에서의 가는 흑색선). 10 mg/ml(대시선, 도 21A), 5 mg/ml(대시선, 도 20B), 또는 1 mg/ml(대시선, 도 21C) 가용성 헤파린을 포함하는 샘플에서는 OVA 펩타이드 로딩이 관찰되지 않았다(이들 곡선은 음성 대조군 데이터와 중첩됨). 헤파린이 없는 OVA-접합된 MPV.10.34.d IRC를 함유하는 샘플에서만 OVA 펩타이드의 로딩이 검출되었다(우측으로 두꺼운 흑색선, 도 21A, 도 21B 및 도 21C). 이러한 결과는 OVA-접합된 MPV.10.34.d IRC가 HSPG-특이적인 것을 나타낸다.
IRC로부터 종양 세포로의 펩타이드 로딩이 MPV.10.34.d IRC로부터의 에피토프 펩타이드의 프로테아제 절단에 의존한다는 것을 보여주기 위해, 실시예 10의 실험을 퓨린 저해제인 퓨린 저해제 I - Calbiochem, 데카노일-RVKR-CMKa, 펩티딜 클로로메틸케톤(Millipore-Sigma, 미주리주 세인트루이스 소재)의 존재하에 반복하였다. 이 퓨린 저해제는 퓨린의 촉매 부위에 비가역적으로 결합하여 모든 퓨린 프로테아제 활성을 차단한다.
간단히 말해서, 2×105개의 MC38 세포(뮤린 결장 선암종, # ENH204-FP, Kerafast, Inc., 매사추세츠주 보스톤 소재)를 FACs 튜브에 파종하고, 이어서 200μL의 총 최종 샘플 부피로 DMSO에 용해된 0.5μM, 5μM, 또는 50μM 퓨린 저해제와 인큐베이션하였다. 저해제를 함유하지 않는 대조군 샘플은 동일한 당량의 DMSO를 사용하여 동일한 방식으로 제조하였다. 샘플을 조직 배양 인큐베이터에서 37℃, 5% CO2에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 2.5μg/mL의 OVA-접합된 MPV.10.34.d IRC를 모든 샘플에 첨가하고, 샘플을 조직 배양 인큐베이터에서 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션하였다. 이어서, 샘플을 2 내지 3 mL의 FACS 완충제로 2회 세척하고, 이어서 OVA(SIINFEKL, 서열번호 95) 단클론성 항체(Biolegend, Cat# 141604, 캘리포니아주 샌디에이고 소재)에 결합된 PE-접합된-마우스 항-마우스 MHC I로 30분 동안 4℃에서 염색하였다. 그 후, 샘플을 3 mL의 FACS 완충제로 한 번 세척하고, 이어서 세포를 CytoFLEX 유세포분석기(Beckman Coulter Life Sciences, 미국 캘리포니아주 브레아 소재)에 의해 분석하기 전에 250μL의 FACS 완충제에 재현탁시켰다.
도 22A, 도 22B 및 도 22C에서 알 수 있는 바와 같이, OVA-접합된 MPV.10.34.d IRC는 저해제가 첨가되지 않은 샘플(가는 흑색 선, 도 22A, 도 22B 및 도 22C), 및 퓨린 저해제 없이 DMSO만으로 처리된 샘플(흑색 대시선, 도 22A, 도 22B 및 도 22C)에서 종양 세포 상에 OVA 펩타이드를 로딩하였다. 대조적으로, 음성 대조군(도 22A, 도 22B 및 도 22C에서의 가는 회색 선, 대조군 곡선은 실험 데이터와 중첩됨)뿐만 아니라, 50μM(어두운 가는 선으로 가리키는 화살표 도 22A), 5μM(어두운 가는 선으로 가리키는 화살표, 도 22B), 및 0.5μM(어두운 가는 선으로 가리키는 화살표, 도 22C)의 퓨린 저해제로 처리된 샘플에서는 OVA 펩타이드 로딩이 관찰되지 않았다. 따라서, IRC로부터의 에피토프 펩타이드의 퓨린 절단의 저해는 표적 암세포의 MHC 분자에 OVA가 결합하는 것을 방지함으로써, IRC의 작용 메커니즘을 확인하게 해준다. 이 메커니즘은 도 18 내지 22에 나타낸 결과에 의해 더욱 확인되고, 이와 일치한다.
실시예 10
MPV.10.34.d IRC를 사용한 시험관내 세포독성 사멸 검정
시험관내 MPV.10.34.d IRC가 뮤린 및 인간 MHC 클래스 I 분자 상에 펩타이드 에피토프를 침착시킬 수 있었고 이 메커니즘이 퓨린 활성에 의존한다는 점이 실시예 9에 나타나 있으므로, 이들 암세포를 표지화하는 것이 표적 종양 세포에 대해서 세포 면역계 성분의 활성화 및 재지향을 촉발시키는지의 여부를 결정하기 위하여 추가의 실험을 설계하였다. 활성화 및 재지향 시에, 목표는 종양 세포에 세포독성 신호의 전달 및 종양 세포 사멸이다. 이를 위해, MPV.10.34.d IRC의 존재 또는 부재 하에 종양 세포 및 바이러스 항원-특이적 CD8+ T 세포의 공동 배양을 수반하는 3가지 상이한 시험관내 세포독성 T-세포-의존성 종양 세포 사멸 검정을 설계하였다. (1) 뮤린 OVA-특이적 전임상 CD8+ T 세포, (2) 뮤린 HPV16 E7-특이적 CD8+ T 세포 및 (3) 인간 HLA-A*0201-제한된 CMV-특이적 T 세포(Astarte Biologicals, cat#1049-4367JY19)를 포함하는 3가지 CD8 T-세포를 테스트하였다. ((3)에 대해서 실시예 12 참조).
루시퍼라제 유전자를 과발현하는 뮤린 B16(흑색종/피부)(B16-F10(ATCC® CRL-6475™)) 및 뮤린 ID8(난소) 종양 세포(Hung et al., Gene Ther., 14(12):921-020, 2007)(B16-luc 및 ID8-luc)를 배양액에서 성장시켰다. 정상적인 상황에서, 뮤린 종양 세포주 B16 및 ID8은, 이들 세포주가 뮤린 OVA(SIINFIKEL, 서열번호 95) 항원을 발현하지 않으므로, 뮤린 OVA-특이적 CD8+ T 세포에 의해 사멸되지 않았다.
대략 0.01×106개 B16-루시퍼라제 돌연변이체(B16-luc) 또는 0.005×106개 ID8-루시퍼라제 돌연변이체(ID8-luc) 종양 세포를 96-웰 검정 플레이트 상에 웰당 100μL에 하룻밤 파종하였다. 이어서, 세포를 100μL의 2.5μg/mL의 MPV.10.34.d 캡시드 백본, OVA-접합된 MPV.10.34.d IRC, OVA-접합된 HPV16 IRC, 및 1μg/mL의 유리 OVA 펩타이드(SIINFIKEL, 서열번호 95)를 함유하는 양성 대조군으로 웰당 200μL의 최종 부피로 37℃에서 1시간 동안 처리하였다. 어떠한 항원도 공급받지 않은 세포를 음성 대조군(Ag 없음)으로서 포함하였다. 이어서, 세포를 200μL의 Roswell Park Memorial Institute(RPMI) 배지로 2회 세척하고, 10:1(B16-luc) 또는 20:1(ID8-luc)의 효과기(CD8+T-세포) 대 표적 세포(종양 세포) 비("E:T 비")로 OVA-특이적 CD8+ T-세포(Jackson, stock no. 003831)와 세포 인큐베이터에서 37℃, 5% CO2에서 웰당 200μL의 최종 부피로 16시간 동안 공동 인큐베이션하였다. 10:1의 E:T 비는 매1개의 종양 세포에 대해서, 10개의 CD8+ OT-1 T 세포를 종양 세포와 공동 인큐베이션하는 것을 의미한다. 이어서, 이러한 공동 인큐베이션된 세포를 200μL의 PBS로 세척하고, 35μL의 1X 세포 용해 완충제(Promega, 미국 위스콘신주 매디슨 소재)로 15 내지 20분 동안 용해시키고 나서 50μL의 루시퍼라제 검정 기질을 첨가하고, Promega GloMax Explorer Microplate Reader(Promega, 미국 위스콘신주 매디슨 소재) 상에서 검출하였다.
T 세포와 공동-인큐베이션 후 살아 있는 종양 세포의 수는 용해된 세포로부터 방출된 루시퍼라제의 농도의 정량화에 의해 측정하였다. 이는 표적 세포가 루시퍼라제를 과발현하는 조건에서 인큐베이션되었기 때문에 세포 생존력에 대한 대리 마커로서 작용한다. 감소된 루시퍼라제 활성은 더 많은 세포 사멸을 나타내어 더 큰 면역 재지향, 따라서 더 큰 세포 독성을 시사한다.
도 23A 및 도 23B에 나타낸 바와 같이, OVA-접합된 MPV.10.34.d IRC, OVA-접합된 HPV16 IRC, 및 펩타이드 양성 대조군은 B16-luc(도 23A) 및 ID8-luc(도 23B) 종양 사멸 검정 둘 다에서 음성 대조군 샘플보다 훨씬 더 높은 종양 세포 세포독성(>70%)을 나타내었다. 동일한 농도(2.5μg/mL)에서, OVA-접합된 MPV.10.34.d IRC는 또한 OVA-접합된 HPV16 IRC와 유사한 종양 세포에 대한 높은 세포독성을 나타내었다.
상기 실험과 마찬가지로, OVA 펩타이드를 E7 펩타이드(RAHYNIVTF, 서열번호 96)로 대체한 것을 제외하고 마찬가지 방식으로 제2 실험을 수행하였다. 상기 동일한 프로토콜을 사용하여 이 실험에서 상기 동일한 종양 세포 및 샘플을 조사하였다.
도 24A 및 도 24B에 나타낸 바와 같이, E7-접합된 MPV.10.34.d IRC, E7-접합된 HPV16 IRC 및 양성 대조군은 B16-luc(도 24A) 및 ID8-luc(도 24B) 종양 사멸 검정 둘 다에서 음성 대조군보다 훨씬 더 높은 종양 세포 세포독성(>70%)을 나타냈다. 동일한 농도(2.5μg/mL)에서, OVA-접합된 MPV.10.34.d IRC는 또한 OVA-접합된 HPV16 IRC와 유사한 종양 세포에 대한 높은 세포독성을 나타내었다.
실시예 11
인간 검정에서의 MPV.10.34.d IRC 유효성
상기 실험의 시험관내 기능성 테스트 결과가 유망했지만, 이 분석에서 다음으로 원하는 단계는 인간-기반 검정에서 유사한 실험을 수행하는 것이었다. 이를 위해, MPV.10.34.d IRC에 노출된 종양 세포에 대한 모의 인간 세포 면역계 구성 요소의 반응은 시험관내에서 조사되었다. 인간 CMV(HCMV)는, 인간 CMV가 널리 퍼져 있고(인간 인구의 50 내지 90% 감염) 건강한 개인에서 대부분 무증상이기 때문에 이 연구를 위해 선택되었다. (문헌[Longmate et al., Immunogenetics, 52(3-4):165-73, 2001; Pardieck et al., F1000Res, 7, 2018; 및 van den Berg et al., Med. Microbiol. Immunol., 208(3-4):365-373, 2019] 참조). 중요하게는, HCMV는 질환을 예방하기 위해 수명이 긴 세포 면역을 필요로 하는 평생 지속되는 감염을 확립한다. 따라서, 나이든 사람의 바이러스 감염을 강력하게 통제하기 위해 수년에 걸쳐 개발된 복잡한 적응 세포-매개 항바이러스 면역력이 암 치료를 위해 용도 변경되어 활용될 수 있다는 가설을 세우는 것이 합리적이다.
이들 실험에서, CMV 펩타이드에 대한 CD8+ T 세포 반응은 HCT116, OVCAR3 및 MCF7을 포함한 세 가지 상이한 인간 종양 세포주에서 테스트되었다. 이들 세 가지 인간 종양 세포주는 모두 HLA-A*0201 양성이다.
시험관내 세포독성 검정. 인간 결장암세포인 HTC112, 인간 유방암세포인 MCF7 및 인간 난소암세포인 OVCAR3(모두 ATCC로부터 입수, 미국 버지니아주 머내서스 소재)를 96 웰 플레이트당 100μL당 웰당 0.01 내지 0.2×106개로 하룻밤 파종하였다. 다음 날(약 20 내지 22시간 후), 각 세포주를 다음 조건하에서 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다: (1) 최종 농도 1μg/mL의 CMV 펩타이드(양성 대조군), (2) 최종 농도 2.5μg/mL의 MPV.10.34.d(음성 대조군), (3) 최종 농도 2.5μg/mL의 CMV-접합된 MPV.10.34.d IRC, (4) 최종 농도 2.5μg/mL의 CMV-접합된 HPV16 IRC 및 (5) 항원 없음(음성 대조군). 1시간 후, 세포를 200μL의 배지로 3회 격렬하게 세척하여 비특이적 결합을 제거하였다. 인간 환자 공여자 CMV T 세포(ASTARTE Biologics, 미국 워싱턴주 시애틀 소재)를 E:T(효과기 세포:표적 세포) 비 10:1로 첨가하고, 조직 배양 인큐베이터에서 37C, 5% CO2에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 공동 배양 후 각 샘플의 총 최종 부피는 200μL였다. 세포 생존력은 공동배양 후 측정하였다. 세포 생존력은 CELLTITER-GLO®(Promega, 미국 위스콘신주 매디슨 소재)로 측정하였다. 이 검정은 세포 생존력의 마커인 ATP를 검출하고 결합하는 루시퍼라제 발현 화학 프로브를 제공한다. 종양 세포로부터 생성된 ATP의 양은 제조업체의 프로토콜에 따라 정량화하였다. 이러한 검정에서, 감소된 루시퍼라제 활성은 세포 사멸을 나타내며 더 큰 면역 재지향 및 더 큰 세포독성을 시사한다.
결과는 도 25에 제공된다. CMV-접합된 MPV.10.34.d IRC(25A, 도 25B 및 도 25C에서 "VERI-101")는 불멸화된 HLA.A2 양성 인간 결장암세포(HCT116), 인간 난소암세포(OVCAR3), 및 인간 유방암세포(MCF7)를 사멸하기 위하여 인간 건강한 공여자 CMV pp65-특이적 CD8+ T-세포(Astarte Biologics, Inc., 미국 워싱턴주 보셀 소재)를 재지향시킴에 있어서 CMV-접합된 HPV16 IRC(도 25A, 도 25B 및 도 25C에서 "CMV AIR-VLP")만큼 동등하게 효과적이었다. 대조군 샘플(도 25A, 도 25B 및 도 25C에서 "Ag 없음" 또는 "VERI-000")은 배경 종양 사멸을 나타내지 않았다. 종합하면, 이러한 데이터는 MPV.10.34.d IRC가 시험관 내에서 종양 세포에 대한 마우스 및 인간 면역 반응을 재지향시키는 것을 입증한다.
실시예 12
MPV.10.34.d IRC 결합 및 펩타이드 절단의 순차적 메커니즘
실시예 9는 PV.10.34.d IRC 결합이 펩타이드의 퓨린-의존성 절단 및 표적 종양 세포 상에 로딩되기 전에 일어나야 함을 입증한다. 별도의 검정에서 결합 및 로딩을 검출하기 위하여 상이한 농도의 OVA-접합 MPV.10.34.d IRC를 사용한 용량-반응 곡선이 생성되었다. 이들 검정은 실시예 7 및 8에 기재된 바와 같이 수행하였다. 두 검정으로부터의 기하학적 MFI에 기초하여, 상관관계 분석을 수행하였다.
도 26에 나타낸 결과는 종양 세포에 대한 OVA-접합된 MPV.10.34.d IRC 결합의 수와 종양 세포상의 OVA 펩타이드/Kb 복합체의 수준 간에 고도로 통계학적으로 유의한 상관관계가 있음을 나타낸다(스피어맨(Spearman) r=0.92, P=0.0003; 피어슨(Pearson) r=0.98, p<0.001). 이 통계학적 분석은 우선 종양 세포를 결합 또는 접촉시키고 나서, IRC로의 펩타이드의 퓨린-의존적 절단 및 펩타이드의 MHC 로딩을 수행하는 OVA-접합된 MPV.10.34.d IRC의 순차적 단계를 위한 요건을 더욱 입증한다.
실시예 13
MPV.10.34.d IRC 결합 및 종양 세포사의 순차적 메커니즘
실시예 9는 OVA-접합된 MPV.10.34.d IRC 결합의 저해가 IRC로부터의 펩타이드의 퓨린-의존성 절단 및 종양 세포 표면 상으로의 OVA 펩타이드 로딩의 저해를 초래하는 것을 나타낸다. 이 결합 단계의 저해가 또한 CD8+ T-세포의 재지향 및 종양 세포사를 저해한다는 것을 더욱 나타내기 위하여, 실시예 10에서와 같이 수행된 세포독성 연구를 HSPG 결합의 경쟁자인 가용성 헤파린의 존재 및 부재 하에 수행하였다.
소정 범위의 OVA-접합된 MPV.10.34.d IRC 농도(0.156μg/mL 내지 0.625μg/mL)뿐만 아니라 E:T 비(1:4.5, 1:9 및 1:18)를 실시예 10에 기재된 검정에서의 10 mg/mL의 가용성 헤파린의 존재 및 부재 하에 조사하였다. 가용성 헤파린의 이러한 농도는 OVA-접합된 MPV.10.34.d IRC 결합의 완전한 저해뿐만 아니라 종양 세포 상으로의 펩타이드 로딩의 저해를 유발하는 것으로 이전에 나타났다. 이들 검정에서, 루시퍼라제를 과발현하는 15,000개의 TC-1 세포를 먼저 세포 배양 인큐베이터에서 37℃, 5% CO2에서 평저(flat-bottom) 96-웰 플레이트에 하룻밤 파종하였다. 다음 날, 세포를 PBS로 3회 세척하고 나서 세포 배양 인큐베이터에서 37℃, 5% CO2에서 2% BSA가 포함된 AIM-V 배지(혈청 무함유)와 1.5시간 동안 인큐베이션하였다. 동시에, OVA-접합된 MPV.10.34.d IRC를 동일한 AIM-V 배지 + 2% BSA에 0.625, 0.3125, 0.156μg/mL로 희석시켰다. (도 27A, 도 27B 및 도 27C 참조). 각 샘플을 10 mg/mL의 가용성 헤파린과 함께(두꺼운 대시선) 또는 이것 없이(실선) 2℃ 내지 8℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. MPV.10.34.d 캡시드 백본(가는 대시선, "ViP" 단독)은 음성 대조군으로서 포함되었다. 1시간 후, 샘플을 TC-1 세포에 첨가하고, 세포 배양 인큐베이터에서 37℃, 5% CO2에서 추가로 30분 동안 공동 인큐베이션하였다. 그 후, 처리된 샘플을 AIM-V 배지로 바로 3회 세척하고 나서 18:1, 9:1, 또는 4.5:1의 효과기 대 표적(E:T) 비로 OT-1 T-세포와 인큐베이션하였다. 이 이어서 이 공동 배양물을 37℃, 5% CO2에서 추가로 3시간 동안 인큐베이션하였다. 3시간 후, 표적 세포를 제조사의 프로토콜에 따라서 Promega 루시퍼라제 검정 시스템(Promega, 미국 위스콘신주 매디슨 소재)을 사용해서 세포독성에 대해서 분석하였다. 이 검정에서 세포 생존력의 대용 마커로서 사용되는 루시퍼라제 신호의 손실의 검출에 의해 세포독성을 결정하였다. 모든 연구는 3회 수행되었다.
결과는 도 27에 도시되어 있다. 가용성 헤파린의 존재는 테스트된 모든 농도 및 E:T 비 조건 하에 OVA-접합된 MPV.10.34.d IRC-매개 세포독성을 나타내지 않았다. 이러한 결과는 MPV.10.34.d IRC 작용 메커니즘의 순차적 특성을 더욱 입증한다.
OVA-접합된 MPV.10.34.d IRC의 결합 및 세포독성 활성에 대해서 상관관계 분석을 행하였다. 간단히 말해서, 별도의 검정에서 결합 및 세포독성을 검출하기 위하여 상이한 농도의 OVA-접합된 MPV.10.34.d IRC를 사용하는 용량-반응 곡선이 생성되었다. 세포독성 검정은 다음과 같이 변경하여 실시예 10에 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다: 6.25×10-5μg/mL 내지 2.5μg/mL 범위의 OVA-접합된 MPV.10.34.d IRC를 3가지 상이한 E:T 비(18:1, 9:1 및 4.5:1)에서 테스트하였다.
테스트된 모든 3가지 E:T 비 조건 하에, OVA-접합 MPV.10.34.d IRC 농도가 0.04㎍/mL 미만 그리고 그 초과인 경우 용량 의존적 사멸이 관찰된 반면, 0.156μg/mL 내지 2.5μg/mL의 OVA-접합 MPV.10.34.d IRC의 농도는 최대 수준의 세포 독성을 유발한다. 결합 검정은 다음과 같이 변경하여 실시예 7에 기재된 프로토콜에 따라 수행하였다: 6.24×10-4 내지 2.5μg/mL의 농도 범위의 OVA-접합된 MPV.10.34.d IRC를 조사하였다.
결과는 용량-의존적 결합이 관찰되었고 결합 검출 한계가 2.5×10-4μg/mL에 도달했음을 나타낸다. 두 검정은 2회 반복하였다(적어도 3회 반복). 기하 평균 형광 강도(MFI)의 평균값은 두 실험으로부터 보고되었고 도 28에 요약되어 있다.
두 검정으로부터의 MFI에 기초하여(도 28), 스피어맨 상관관계 분석을 사용하여 그래픽 및 상관관계 분석을 수행하였다(도 29). 간단히 말해서, 두 서로 다른 날에 수행된 두 독립적 OVA-접합된 MPV.10.34.d IRC 세포독성 검정의 백분율의 평균과, 두 서로 다른 날로부터의 OVA-접합된 MPV.10.34.d IRC 결합 실험의 MFI의 평균을 계산하고(도 28), 플롯하였다(도 29). 이들 결과에 대해 수행한 스피어맨 상관관계 분석은 모두 3가지 E:T 비에서 이들 두 가지 변수 사이에 유의한 관계 (r=0.83-0.9)를 드러낸다. 이러한 결과는 종양 세포에 대한 OVA-접합된 MPV.10.34.d IRC 결합과 그에 따른 세포독성의 수준 사이에 고도로 통계학적으로 유의한 상관관계(E:T 비에 따라 0.83 내지 0.9 사이의 r값)가 있음을 나타낸다.
실시예 14
GARDASIL®9-생성 항체는 MPV.10.34.d IRC 효과를 저해하지 않는다
GARDASIL®9의 백신접종은 HPV 감염을 예방할 수 있는 HPV L1 캡시드-특이적 항체가 장기간(10년 초과) 지속되어, 그 후에, HPV-연관 자궁경부암을 예방할 수 있다. Although GARDASIL®9는 9가지 유형의 HPV에 대해서만 효과적인 것으로 보고되었지만, 다른 유형의 유두종바이러스 캡시드에 대한 일부 교차-중화가 예상될 수 있다. MPV.10.34.d IRC는 뮤린 유두종바이러스 캡시드로부터 유도되므로, GARDASIL®9 백신접종으로부터 유도된 백신 혈청이 MPV.10.34.d IRC 종양 세포 사멸을 저해할 수 있는지 여부를 결정하는 것이 바람직하였다.
GARDASIL®9 혈청은 다음과 같이 생성되었다: 뉴질랜드 백색 토끼(n = 10)에게 인간 용량의 GARDASIL®9(용량당 270μg의 VLP)의 근육내 백신접종을 3회 투여하였다. 토끼는 0, 1 및 2개월에 백신접종하였다. 최종 백신 접종 후 2주 후에, 토끼를 채혈하여 GARDASIL®9 혈청을 얻었다. 각 토끼로부터의 혈청 100μL 분취량을 혼주시켰다. 대조군으로서 GARDASIL®9 혈청은 또한 HPV 유형 6, 11, 16, 18, 31, 45, 52 및 58에 대한 중화 활성에 대해 테스트되었으며 결과는 중화 활성을 나타내지 않았습니다(데이터는 표시되지 않음).
OVA-접합된 MPV.10.34.d IRC를 실시예 11 및 13에 기재된 프로토콜을 이용해서 GARDASIL®9 혈청으로 테스트하였다. 간단히 말해서, 루시퍼라제를 과발현하는 15,000개의 TC-1 세포를 세포 배양 인큐베이터에서 37℃, 5% CO2에서 평저 96-웰 플레이트에 하룻밤 파종하였다. 다음 날, 세포를 PBS로 3회 세척하고 나서 세포 배양 인큐베이터에서 37℃, 5% CO2에서 AIM-V 배지(혈청 무함유)+ 2% BSA와 1.5시간 동안 인큐베이션하였다. 동시에, OVA-접합된 MPV.10.34.d IRC를 동일한 AIM-V 배지 + 2% BSA에 0.625μg/mL, 0.3125μg/mL 및 0.156μg/mL로 희석시키고, 각 샘플을 GARDASIL®9 혈청의 1:200 희석액(두꺼운-대시선)과 또는 것 없이(실선) 2℃ 내지 8℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. MPV.10.34.d 단독(가는 대시선)이 또한 음성 대조군으로서 포함되었다. (도 30A, 도 30B 및 도 30C 참조). 1시간 후, 샘플을 TC-1 세포에 첨가하고, 세포 배양 인큐베이터에서 37℃, 5% CO2에서 30분 동안 공동 인큐베이션하였다. 그 후, 처리된 세포를 AIM-V 배지로 바로 3회 세척하고 나서 OT-1 T-세포와 18:1, 9:1, 또는 4.5:1의 효과기 대 표적(E:T) 비로 인큐베이션하였다. 이어서, 이 공동 배양물을 37℃, 5% CO2에서 3시간 동안 인큐베이션하였다. 3시간 후, 표적 세포를 제조사의 프로토콜에 따라서 Promega 루시퍼라제 검정 시스템(Promega, 미국 위스콘신주 매디슨 소재)을 사용해서 세포독성에 대해서 분석하였다. 세포 생존력의 대리 마커로 사용되는 루시퍼라제 신호의 손실의 정량화에 의해 세포독성을 결정하였다. 모든 연구는 3회 수행하였다.
GARDASIL®9 혈청의 존재하에서 세포 독성의 저해가 관찰되지 않았다. 도 30의 결과는 MPV.10.34.d IRC가 기존 HPV 백신-생성 항체를 보유하고 있을 수 있는 대상체에게 부정적인 영향을 미치지 않을 것임을 시사한다.
실시예 15
항-MPV.10.34.d IRC 항체는 종양 세포 세포독성을 저해하지 않는다
MPV.10.34.d IRC 서열이 MPV L1 캡시드에 기반하므로, 야생형 MPV 또는 MPV.10.34.d IRC에 대해서 생성된 항체가 종양에 대한 MPV.10.34.d IRC의 작용 메커니즘에 영향을 미치지는지 테스트하는 것이 바람직하였다.
야생형 MPV에 대한 항체는 다음과 같이 생성되었다: 뉴질랜드 백색 토끼(n = 3)에게 용량당 50μg의 야생형 마우스 유두종 바이러스 입자의 3회 근육내 백신접종을 투여하였다. 토끼는 0, 1 및 2개월에 백신접종하였다. 최종 백신접종 2주 후, 항-MPV 혈청을 얻기 위해 토끼를 채혈하였다. MPV.10.34.d IRC에 대한 항체는 다음과 같이 얻었다: 미경험 6 내지 8주령 C57/BL6 마우스(n=10)에게 150μg의 E7-접합 MPV.10.34.d의 2회 용량을 48시간의 기간에 걸쳐서 전신 주사하였다. 48시간 후, 마우스를 채혈하여 항-MPV.10.34.d IRC 혈청을 얻었다.
MPV.10.34.d 캡시드 백본 및 MPV.10.34.d IRC 둘 다에 대한 항-MPV.10.34.d IRC 혈청 및 항-MPV 혈청의 특이성을 ELISA에 의해 조사하였다. 검정은 실시예 5에 기재된 바와 같이 수행되었지만 차이점은 다음과 같다: 혈청 샘플을 1:100 희석 배율 및 2-배 연속 희석으로 테스트하였다. 염소 항-마우스 IgG-HRP 2차 항체를 ELISA(1:7000)에 사용하였다. MPV.10.34.d 캡시드 백본(도 31A) 및 MPV.10.34.d IRC(도 31B) 둘 다에 대한 항-MPV.10.34.d IRC 혈청(도 31) 및 항-MPV 혈청(데이터 미제시)의 결합이 관찰되었다.
MPV.10.34.d IRC에 대한 항체 혈청의 결합이 후속 종양 세포독성에 영향을 미치는지의 여부를 결정하기 위하여, 결합 및 세포독성 검정을 어느 하나의 혈청의 존재 또는 부재에서 OVA-접합된 MPV.10.34.d IRC로 수행하였다. 항-MPV 혈청(도 32A, 도 32B 및 도 32C) 또는 항-MPV.10.34.d IRC 혈청(도 32D, 도 32E 및 도 32F)의 존재 하에 실시예 14에서와 같이 세포독성 검정을 수행하였다. 결과는, OVA-접합된 MPV.10.34.d IRC가 항-MPV 혈청(도 32A, 도 32B 및 도 32C) 또는 항-MPV.10.34.d IRC 혈청(도 32D, 도 32E 및 도 32F)과 함께 테스트된 모든 농도 및 E:T 비율에 대해 사전 인큐베이션한 경우에 세포독성에 차이가 없음을 나타낸다.
MPV.10.34.d IRC 또는 MPV에 대한 항체가 ELISA를 통해 MPV.10.34.d 캡시드 백본 및 MPV.10.34.d IRC 둘 다에 대한 결합에 대한 특이성을 나타냄에도 불구하고 세포독성을 저해하는 이들 항체의 불능성을 이들 혈청의 존재하에 결합 검정을 수행함으로써 더욱 연구하였다.
샘플을 상이한 OVA-접합된 MPV.10.34.d IRC 농도(0.0025μg/mL 내지 2.5μg/mL)로 사전 인큐베이션하였다. 이들 샘플을 실시예 5에 기재된 동일한 결합 검정으로 테스트하였다. 간단히 말해서, 루시퍼라제를 과발현하는 20,000개의 TC-1 세포를 FACs 튜브에 파종하고, 필요할 때까지 세포 배양 인큐베이터에서 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션하였다. 동시에, OVA-접합된 MPV.10.34.d IRC를 동일한 AIM-V 배지 + 2% BSA에 0.0025 내지 2.5μg/mL의 농도 범위로 희석시키고, 각 샘플을 항-MPV 혈청(A) 또는 항-MPV.10.34.d IRC 혈청(B)의 1:200 희석액과 함께 2℃ 내지 8℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 1시간 후, 샘플을 FAC 튜브에 파종된 TC-1에 첨가하고 세포 배양 인큐베이터에서 37℃, 5% CO2에서 1시간 동안 공동 인큐베이션하였다. 이어서 샘플을 FACS 완충제(DBPS, pH 7, 0.1% BSA)로 2회 세척하였다. 이어서, 샘플을 AF647-접합된 당나귀 항-토끼 Ig 항체 또는 PE-접합된 염소 항-마우스 IgG 항체로 어두운 곳에서 30분 동안 염색하였다. 이어서, 샘플을 FACS 완충제(DBPS, pH 7, 0.1% BSA)로 세척하였다. 그 후, 샘플을 250μL의 FACS 완충제에 재현탁시키고, MPV 혈청(도 33A) 또는 항-MPV.10.34.d IRC 혈청(도 33B)으로 전처리된 상이한 농도의 OVA-접합된 MPV.10.34.d IRC에서 유세포 분석에 의해 결합을 검출하였다. 모든 연구는 3회 수행되었다.
이들 테스트의 결과는 항-MPV 토끼 IgG 혈청(도 33A) 또는 항-MPV.10.34.d IRC 마우스 IgG 혈청(도 33B)과 함께 샘플의 인큐베이션이 여전히 표적 종양 세포에 결합할 수 있음을 드러낸다. 요약하면, 실시예 15로부터의 결과(도 31, 도 32 및 도 33)는 생체내 유도된 MPV.10.34.d IRC에 특이적인 항체가 MPV.10.34.d IRC에 특이적으로 결합함을 종합적으로 나타낸다. 그러나, 이들 항체는 MPV.10.34.d IRC가 종양 세포에 결합하는 것을 차단하지 않고(도 33), 따라서, MPV.10.34.d IRC의 전체 세포독성 메커니즘도 저해하지 않는다(도 32). 대조적으로, 이들 동일한 항체는 슈도-바이러스 중화 검정에서 볼 수 있는 바와 같이 MPV 감염을 저해할 수 있었다(데이터 미제시). MPV 감염은 세포 내재화를 필요로 하므로, 한 가지 가능한 설명은 이러한 항-MPV.10.34.d IRC 혈청 항체가 MPV.10.34.d IRC의 세포 내재화를 차단하지만 MPV.10.34.d IRC의 표적 세포 결합을 저해하지 않는다는 것이다. MPV.10.34.d IRC의 메커니즘은 세포외이기 때문에, 이들 항체에 의해 영향을 받지 않는 이유일 수 있다.
실시예 16
MHC 클래스 1 세포내 경로 성분이 결핍된 세포에 대한 펩타이드 로딩
실시예 9는 IRC로부터의 펩타이드를 종양 세포 표면에 로딩하는 것을 입증한다. IRC로부터의 방출된 펩타이드가 종양 세포에 의해 결합되고 나서 탐식되어 MHC 클래스 1 항원 제시 경로를 통해 처리되는지의 여부를 결정하는 것이 바람직하였다. 이러한 가능성을 테스트하기 위하여, 세포내 MHC 클래스 1 처리 단백질에서 유전적으로 결핍(TAP-결핍)된 세포주(RMA-S 세포)로 펩타이드 로딩 검정을 수행하였다. 이러한 맥락에서 종양 세포 표면에 대한 펩타이드 로딩이 여전히 발생한다면 그것은 세포외 메커니즘을 통해야만 한다.
OVA-접합된 MPV.10.34.d IRC 농도 범위(0.625μg/mL 내지 10μg/mL)를, RMA-S 세포에 펩타이드를 로딩하는 능력에 대해서 테스트하였다. 이러한 결합 검정은 앞서 기재된 바와 같이 수행하였다. 간단히 말해서, 2×106개 세포/mL의 RMA-S 세포를 단일 세포 현탁액에 재현탁시키고, 100μL(0.2×106개의 RMA-S 세포)를 FACS 튜브에 분주하였다. 다양한 양의 OVA-접합된 MPV.10.34.d IRC(0.625μg/mL 내지 10μg/mL)를 샘플에 첨가하고, 이어서 이 샘플을 37℃, 5% CO2에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 세포를 2mL의 FACS 완충제(PBS, pH7.0, 1% BSA)로 2회 세척하였다. 세포를 1μL의 PE-접합된 항-SIINFEKL(서열번호 95)/Kb 항체로 염색하였다. 세포를 2mL의 FACS 완충제(PBS, pH7.0, 1% BSA)에서 2회 세척하였다. 이어서, 샘플을 약 250μL의 FACS 완충제에 재현탁시키고, MFI를 통해서 펩타이드 결합을 분석하였다.
데이터는 더 높은 농도의 OVA-접합된 MPV.10.34.d IRC가 첨가됨에 따라서 이들 세포에서 증가하는 수준의 OVA 펩타이드-MHC 복합체를 드러낸다. 이러한 데이터는 MPV.10.34.d IRC 표지가 세포외 메커니즘에 의해 종양 세포를 표적화하는 것을 확립하는 것으로 보인다.
SEQUENCE LISTING <110> VERIMMUNE INC. <120> VIRUS-INSPIRED COMPOSITIONS AND METHODS OF REDIRECTING PREEXISTING IMMUNE RESPONSES USING THE SAME FOR TREATMENT OF CANCER <130> 8005/US <140> PCT/US2021/055676 <141> 2021-10-19 <150> US 63/093,525 <151> 2020-10-19 <150> US 63/220,485 <151> 2021-07-10 <160> 140 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 473 <212> PRT <213> Human papillomavirus type 16 <220> <221> SITE <222> (1)..(473) <223> minor capsid protein L2 <400> 1 Met Arg His Lys Arg Ser Ala Lys Arg Thr Lys Arg Ala Ser Ala Thr 1 5 10 15 Gln Leu Tyr Lys Thr Cys Lys Gln Ala Gly Thr Cys Pro Pro Asp Ile 20 25 30 Ile Pro Lys Val Glu Gly Lys Thr Ile Ala Asp Gln Ile Leu Gln Tyr 35 40 45 Gly Ser Met Gly Val Phe Phe Gly Gly Leu Gly Ile Gly Thr Gly Ser 50 55 60 Gly Thr Gly Gly Arg Thr Gly Tyr Ile Pro Leu Gly Thr Arg Pro Pro 65 70 75 80 Thr Ala Thr Asp Thr Leu Ala Pro Val Arg Pro Pro Leu Thr Val Asp 85 90 95 Pro Val Gly Pro Ser Asp Pro Ser Ile Val Ser Leu Val Glu Glu Thr 100 105 110 Ser Phe Ile 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<220> <221> SITE <222> (1)..(9) <223> tumor cell surface cell count of CMV <400> 129 Asn Leu Ala Pro Met Val Ala Thr Val 1 5 <210> 130 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: peptide <400> 130 Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Cys 1 5 <210> 131 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: peptide <400> 131 Cys Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Cys 1 5 10 <210> 132 <211> 439 <212> PRT <213> Mus musculus papillomavirus type 1 <220> <221> SITE <222> (1)..(439) <223> wild type mouse (Mus musculus) L1 wild type protein sequence <400> 132 Met Ala Met Trp Thr Pro Gln Thr Gly Lys Leu Tyr Leu Pro Pro Thr 1 5 10 15 Thr Pro Val Ala Lys Val Gln Ser Thr Asp Glu Tyr Val Tyr Pro Thr 20 25 30 Ser Leu Phe Cys His Ala His Thr Asp Arg Leu Leu Thr Val Gly His 35 40 45 Pro Phe Phe Ser Val Ile Asp Asn Asp Lys Val Thr Val Pro Lys Val 50 55 60 Ser Gly Asn Gln Tyr Arg Val Phe Arg Leu Lys Phe Pro Asp Pro Asn 65 70 75 80 Lys Phe Ala Leu Pro Gln Lys Asp Phe Tyr Asp 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ccacctacaa ctccagtggc aaaagtgcag agcacagacg aatatgtgta ccctacgtct 180 ctcttctgtc atgcacacac ggaccgtttg ctaacagtgg gccacccttt tttttctgtc 240 attgacaatg acaaggtcac tgtgcctaaa gtgtctggca accaatatag ggttttcaga 300 cttaaattcc cagatccaaa taaatttgca ttgccccaaa aggatttcta tgatcctgag 360 aaagaacggt tagtgtggag gttaaggggt ctggaaattg gaagaggtgg cccattaggg 420 attggcacta ccgggcaccc cctttttaac aagcttggag acacggaaaa tccaaataaa 480 tatcagcaag gctctaagga taataggcag aacacttcca tggaccccaa acaaacacag 540 ctgtttattg ttggctgtga accccctaca ggggaacact gggatgtagc taagccctgt 600 ggagctctgg agaagggtga ctgccctcct atccaacttg taaatagtgt aattgaggat 660 ggggatatgt gtgacattgg ctttgggaat atgaacttca aagagctgca gcaggatagg 720 agtggtgtgc ctcttgatat tgtatctacc cggtgcaaat ggcccgactt tctgaaaatg 780 accaatgagg catatgggga taagatgttc ttctttggaa ggagagagca agtgtatgca 840 agacactttt tcaccaggaa tggctctgtg ggggagccca taccaaactc tgtgagtccc 900 agtgactttt actacgcacc cgacagcaca caggaccaga agacactcgc accctccgtg 960 tactttggaa ctcctagtgg gtcacttgtg tcgagtgatg gtcagctgtt taacaggcca 1020 ttttggcttc aaagggctca gggaaacaat aatggtgtgt gctggcacaa tgagctcttt 1080 gttactgttg tcgacaacac aaggaataca aactttacta tctcccagca aaccaacaca 1140 ccaaacccag atacatatga ctctactaat tttaaaaact atttaagaca tgtggaacaa 1200 tttgagctgt cccttattgc tcaactgtgt aaggttccac ttgacccggg tgtgcttgcc 1260 catataaaca ctatgaaccc aaccatcttg gagaactgga acttgggttt tgtacctccc 1320 ccacagcagt ccatctctga tgactatagg tatataacat catcggcaac tcgctgtcca 1380 gatcagaatc cgcccaagga aagagaggat ccttacaagg gtcttatatt ttgggaagtt 1440 gatcttactg agaggttttc tcaggacctt gatcagtttg ctctgggacg aaagtttctg 1500 tatcaagctg gtatacgtac tgctgttacg ggccgcgggg tcaaaagggc agcgtctaca 1560 acctctgcgt cttctagacg agttgtaaaa cggaagaggg gaagcaaata a 1611 <210> 134 <211> 441 <212> PRT <213> Mus musculus papillomavirus type 1 <220> <221> SITE <222> (1)..(441) <223> mutant MPV sequence <400> 134 Met Leu Tyr Leu Pro Pro Thr Thr Pro Val Ala Lys Val Gln Ser Thr 1 5 10 15 Asp Glu Tyr Val Tyr Pro 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tttcacccgt aacggtagcg tgggcgagcc gatcccgaac 780 agcgttagcc cgagcgactt ctactatgcg ccggacagca cccaggatca aaaaaccctg 840 gcgccgagcg tgtactttgg taccccgagc ggcagcctgg ttagcagcga tggtcaactg 900 tttaaccgtc cgttctggct gcagcgtgcg cagggtaaca acaacggcgt gtgctggcac 960 aacgaactgt ttgttaccgt ggttgacaac acccgtaaca ccaacttcac catcagccag 1020 caaaccaaca ccccgaaccc ggacacctac gatagcacca actttaaaaa ctatctgcgt 1080 cacgtggagc agttcgaact gagcctgatt gcgcaactgt gcaaagtgcc gctggacccg 1140 ggtgtgctgg cgcacatcaa caccatgaac ccgaccattc tggagaactg gaacctgggt 1200 ttcgttccgc cgaaagagcg tgaagacccg tacaagggcc tgatcttctg ggaagtggat 1260 ctgaccgaac gtttcagcca ggacctggat caatttgcgc tgggccgtaa attcctgtat 1320 cagtaa 1326 <210> 136 <211> 1427 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: optimized nucleic acid sequence for MPV.10.34.d <400> 136 gaattggcgg aaggccgtca aggccacgtg tcttgtccgc ggtacccata tgctgtatct 60 gcctccaact acaccggttg caaaagttca gagcaccgat gaatatgttt atccgaccag 120 cctgttttgt catgcacata ccgatcgtct gctgaccgtt ggtcatccgt tttttagcgt 180 tattgataac gataaagtga ccgttccgaa agttagcggt aatcagtatc gtgtttttcg 240 cctgaaattt ccggatccga acaaatttgc actgccgcag aaagattttt acgacccgga 300 aaaagaacgt ctggtttggc gtctgcgtgg tctggaaatt ggtcgtggtg gtccgttagg 360 tattggcacc accggtcatc cgctgtttaa caaactgggt gataccgaaa atccgaataa 420 ataccagcag ggcagcaaag ataatcgtca gaataccagt atggatccga aacagaccca 480 gctgtttatt gttggttgtg aaccgcctac cggtgaacat tgggatgttg caaaaccgtg 540 tggtgcactg gaaaaaggtg attgtccgcc tattcagctg gttaatagcg tgattgaaga 600 tggtgatatg tgcgatattg gctttggcaa catgaacttt aaagaactgc agcaggatcg 660 tagcggtgtt ccgctggata ttgttagcac ccgttgtaaa tggcctgatt ttctgaaaat 720 gaccaatgaa gcctatggcg acaaaatgtt ttttttcggt cgtcgtgaac aggtttatgc 780 ccgtcacttt tttacccgta atggtagcgt tggtgaaccg attccgaata gcgttagccc 840 gagcgatttc tattatgcac cggatagcac ccaggatcag aaaaccctgg caccgagcgt 900 ttattttggc accccgagcg gtagcctggt tagcagtgat ggtcagctgt tcaatcgtcc 960 gttttggctg cagcgtgcac agggtaataa caatggtgtt tgttggcata acgaactgtt 1020 tgttaccgtt gttgataata cccgcaatac caactttacc attagccagc agaccaatac 1080 accgaatccg gatacctatg atagcaccaa cttcaaaaac tatctgcgtc atgtggaaca 1140 gtttgaactg agcctgattg cccagctgtg taaagtgccg ctggatccgg gtgttctggc 1200 acatattaac accatgaatc cgaccattct ggaaaattgg aatctgggtt ttgttccgcc 1260 taaagaacgt gaagatccgt ataaaggtct gattttttgg gaagttgatc tgaccgaacg 1320 ttttagccag gatctggatc agtttgcact gggtcgcaaa tttctgtatc agtaactcga 1380 ggagctcgga gcacaagact ggcctcatgg gccttccgct cactgcc 1427 <210> 137 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: primer <400> 137 aagcttgtcg acggagctcg aattcggatc cttattactg atacaggaat ttacggccca 60 gc 62 <210> 138 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: NLV <400> 138 Asn Leu Val Pro Met Val Ala Thr Val 1 5 <210> 139 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: murine OVA <400> 139 Ser Ile Ile Asn Phe Ile Lys Glu Leu 1 5 <210> 140 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: free OVA peptide <400> 140 Ser Ile Ile Asn Phe Ile Lys Glu Leu 1 5

Claims (27)

  1. 조성물로서,
    복수의 바이러스 단백질로서, 상기 복수의 바이러스 단백질의 각각은 유두종바이러스과(Papillomaviridae) L1 단백질의 돌연변이된 아미노산 서열을 포함하는, 상기 복수의 바이러스 단백질;
    유두종바이러스과 항원성 펩타이드 이외의 하나 이상의 병원체로부터의 하나 이상의 에피토프를 각각 포함하는 하나 이상의 펩타이드
    를 포함하되; 상기 유두종바이러스과 L1 단백질의 상기 돌연변이된 아미노산 서열은 야생형 L1 단백질 서열에 대해서 적어도 다음의 돌연변이: (a) 아미노-말단으로부터 적어도 5개의 아미노산 잔기의 결실 및 (b) 나선 4 영역으로부터 적어도 10개의 아미노산 잔기의 결실을 포함하고,
    상기 하나 이상의 펩타이드는 상기 복수의 바이러스 단백질에 부착되고, 그리고
    상기 복수의 바이러스 단백질은 종양 세포에서 발현되는 프로테오글리칸에 결합하는 삼각화 수(triangulation number) T가 1인 이십면체 또는 십이면체를 형성하도록 자발적으로 조립되는, 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 복수의 돌연변이 유두종바이러스과 L1 단백질 각각의 상기 아미노산 서열은 (c) 카복시-말단으로부터 적어도 30개의 아미노산 잔기의 결실을 더 포함하는, 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 펩타이드는 상기 복수의 돌연변이 유두종바이러스과 L1 단백질에 접합되는, 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 하나 이상의 펩타이드는 상기 돌연변이 유두종바이러스과 L1 단백질의 시스테인, 라이신 또는 아르기닌 잔기를 통해서 상기 돌연변이 유두종바이러스과 L1 단백질에 접합되는, 조성물.
  5. 제3항에 있어서, 상기 하나 이상의 펩타이드는 상기 돌연변이 유두종바이러스과 L1 단백질과 상기 펩타이드이의 잔기 사이의 다이설파이드, 말레이미드, 또는 아마이드 결합을 통해서 상기 돌연변이 유두종바이러스과 L1 단백질에 접합되는, 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 복수의 돌연변이 유두종바이러스과 L1 단백질의 적어도 25%가 상기 하나 이상의 펩타이드 중 적어도 하나에 접합되는, 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 복수의 돌연변이 유두종바이러스과 L1 단백질의 적어도 25 내지 85% (w/w)가 상기 하나 이상의 펩타이드 중 적어도 하나에 접합되는, 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 펩타이드의 각각은 하나 이상의 프로테아제 절단 서열을 더 포함하는, 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 하나 이상의 프로테아제 절단 서열은 퓨린 절단 서열, 기질 금속프로테아제 절단 서열, 또는 디스인테그린 및 메탈로프로테아제(ADAM) 절단 서열을 포함하는, 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 에피토프는 바이러스, 박테리아, 기생충 또는 진균 에피토프인, 조성물.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 바이러스 에피토프는 코로나바이러스, 백시니아, 수두 대상포진, 대상포진, 풍진, 간염, 인플루엔자, 홍역, 유행성이하선염, 폴리오바이러스, 천연두, 공수병, 뎅기열, 에볼라, 웨스트 나일, 황열, 또는 지카 에피토프 중 하나 이상이거나;
    상기 박테리아 에피토프는 보르데텔라 페르투시스(Bordetella pertussis), 클로스트리듐 테타니(Clostridium tetani), 클라미디아 트라코마티스(chlamydia trachomatis), 코리네박테륨 디프테리아(Corynebacterium diphtheriae), 헤모필루스 인플루엔자(Hemophilus influenza), 나이세리아 메닌기티스(Neisseria meningitidis), 스트렙토코커스(Streptococcus), 비브리오 콜레라(Vibrio cholera), 마이코박테륨 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 칼메트-게랑 간균, 살모넬라(Salmonella), 에세리키아 콜라이(Escherichia coli), 레지오넬라 뉴모필라(Legionella pneumophila), 리케치아(Rickettsia), 트레포네마 팔리듐 팔리듐(Treponema pallidum pallidum), 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis), 클로스트리듐 보툴리늄(Clostridium botulinum), 또는 예르시니아(Yersinia) 에피토프 중 하나 이상이거나; 또는
    상기 기생충 에피토프는 엔트아메바 히스토리티카(Entamoeba histolytica), 톡소플라스마 곤디이(Toxoplasma gondii), 트리키넬라(Trichinella), 트리코모나스(Trichomonas), 트리파노소마(Trypanosoma) 또는 플라스모듐(Plasmodium) 에피토프 중 하나 이상인, 조성물.
  12. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 에피토프 중 적어도 하나는 소아 백신 항원성 에피토프인, 조성물.
  13. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 펩타이드는 유두종바이러스과 항원성 펩타이드 이외의 하나 이상의 병원체로부터의 적어도 2개의 에피토프를 각각 포함하는, 조성물.
  14. 제1항에 있어서, 종양 세포에서 발현되는 상기 프로테오글리칸은 헤파린 설페이트 프로테오글리칸(HSPG), 퍼레칸(perlecan), 히알렉탄 베르시칸(hyalectan versican), 글리피칸-3, 소형 류신-풍부 프로테오글리칸(SLRP) 및/또는 바이글리칸인, 조성물.
  15. 제1항에 있어서, 상기 복수의 돌연변이 유두종바이러스과 L1 단백질은 T=7 캡시드 백본을 형성하지 않는, 조성물.
  16. 제1항에 있어서, 상기 복수의 돌연변이 유두종바이러스과 L1 단백질은 마우스 돌연변이 유두종바이러스과 L1 단백질인, 조성물.
  17. 제1항에 있어서, 상기 복수의 돌연변이 유두종바이러스과 L1 단백질 각각의 아미노산 서열은 서열번호 134이고, 핵산 서열인 서열번호 135 또는 136에 의해 암호화되는, 조성물.
  18. 필요로 하는 대상체에서 암을 치료하고, 암의 발생을 감소시키고, 암의 진행 및/또는 전이를 저해하는 방법으로서, 상기 대상체에게 약제학적 유효량의 조성물을 투여하는 단계를 포함하되, 상기 조성물은,
    복수의 바이러스 단백질로서, 상기 복수의 바이러스 단백질의 각각은 유두종바이러스과 L1 단백질의 돌연변이된 아미노산 서열을 포함하는, 상기 복수의 바이러스 단백질;
    유두종바이러스과 항원성 펩타이드 이외의 하나 이상의 병원체로부터의 하나 이상의 에피토프를 각각 포함하는 하나 이상의 펩타이드
    를 포함하되; 상기 유두종바이러스과 L1 단백질의 상기 돌연변이된 아미노산 서열은 야생형 L1 단백질 서열에 대해서 적어도 다음의 돌연변이: (a) 아미노-말단으로부터 적어도 5개의 아미노산 잔기의 결실 및 (b) 나선 4 영역으로부터 적어도 10개의 아미노산 잔기의 결실을 포함하고,
    상기 하나 이상의 펩타이드는 상기 복수의 바이러스 단백질에 부착되고, 그리고
    상기 복수의 바이러스 단백질은 종양 세포에서 발현되는 프로테오글리칸에 결합하는 삼각화 수 T가 1인 이십면체 또는 십이면체를 형성하도록 자발적으로 조립되는, 방법.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 대상체로부터 종양 조직 샘플을 얻는 단계; 및
    상기 종양 조직 샘플에서의 하나 이상의 종양 세포에 의해 발현되는 하나 이상의 MHC 분자의 서열을 상기 종양 조직에서 식별하는 단계
    를 더 포함하는, 방법.
  20. 제18항에 있어서, 상기 대상체는 병원체에 대해서 이전에 감염되었거나 백신접종을 받았고, 상기 하나 이상의 에피토프는 상기 병원체의 항원성 에피토프인, 방법.
  21. 제18항에 있어서, 상기 하나 이상의 에피토프는 상기 대상체로부터 얻어진 종양 조직 샘플에서 종양 세포에 의해 발현되는 하나 이상의 MHC 분자와 복합체화 가능한, 방법.
  22. 제1항의 조성물을 제조하는 방법으로서,
    (a) 원핵 세포를 L1 단백질을 암호화하는 발현 벡터로 형절전환시키는 단계;
    (b) 형질전환된 원핵 세포를 상기 L1 단백질의 발현을 촉진시키는 조건하에 배양하는 단계;
    (c) 상기 형질전환된 원핵 세포를 용해시켜 발현된 L1 단백질을 방출시키는 단계;
    (d) 상기 발현된 L1 단백질로부터 세포 파편을 분리시키고 상기 L1 단백질을 봉입체로서 회수하는 단계;
    (e) 선택적으로 L1 단백질 봉입체를 세척하는 단계;
    (f) 상기 L1 단백질 봉입체를 가용화시키는 단계;
    (g) 상기 L1 단백질을 리폴딩시키는 단계; 및
    (h) 리폴딩된 L1 단백질을 리폴딩 완충제에서 인큐베이션시킴으로써 삼각화 수 T가 1인 이십면체 또는 십이면체 캡시드를 형성시키는 단계
    를 포함하는, 조성물을 제조하는 방법.
  23. 제22항에 있어서,
    (i) 하나 이상의 펩타이드의 존재 중 환원 조건하에 조립된 L1 단백질을 인큐베이션함으로써 접합 완충제에서 상기 하나 이상의 펩타이드를 상기 조립된 L1 단백질에 접합시키는 단계를 더 포함하는, 조성물을 제조하는 방법.
  24. 제22항에 있어서, 상기 리폴딩 완충제는 변성제, 환원제, 250 내지 500mM의 염, 비이온성 계면활성제, 금속 킬레이트제 및 pH 7.5 내지 8.5의 완충제를 포함하는, 조성물을 제조하는 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 염은 250mM 내지 500 mM로 존재하는, 조성물을 제조하는 방법.
  26. 제24항에 있어서, 상기 하나 이상의 펩타이드 대 상기 L1 단백질의 몰비는 적어도 1:5인, 조성물을 제조하는 방법.
  27. 제22항에 있어서, 삼각화 수 T가 1인 상기 이십면체 또는 십이면체 캡시드를 형성할 때 상기 리폴딩 완충제로부터 변성제를 제거하지만 환원제를 유지시키는 단계를 더 포함하는, 조성물을 제조하는 방법.
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