KR20140001229A - 숙주 세포에서 재조합 단백질의 발현을 증강시키기 위한 재조합 발현 벡터 요소(ｒＥＶＥ) - Google Patents

숙주 세포에서 재조합 단백질의 발현을 증강시키기 위한 재조합 발현 벡터 요소(ｒＥＶＥ) Download PDF

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제랄드 알. 카슨
홍 가오
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Abstract

재조합 단백질의 발현 수준을 증강시키는 재조합 발현 벡터 요소(rEVE)를 포함하는 조성물 및 방법이 기재되어 있다. 재조합 단백질의 발현을 저하시키거나, 실질적으로 억제하거나 또는 필수적으로 사일런싱하는 다른 조성물 및 방법이 또한 기재되어 있다.

Description

숙주 세포에서 재조합 단백질의 발현을 증강시키기 위한 재조합 발현 벡터 요소(ｒＥＶＥ){Recombinant expression vector elements(rEVEs) for enhancing expression of recombinant proteins in host cells}
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2007년 3월 30일 출원된 미국 임시출원 제60/921,141호에 대한 우선권을 주장한다.
본 발명은 재조합 단백질의 발현 수준을 증강시키는 재조합 발현 벡터 요소(rEVE)에 관한 것이다.
재조합 단백질 발현용 핵산 벡터 분자를 여러가지 및 다양한 진핵 또는 원핵 숙주 세포에서 사용하는 다양한 시스템이 사용가능하다. 어떠한 벡터/숙주 세포 쌍을 사용할 지에 대한 결정은 통상적으로 가장 높은 수율의 목적하는 재조합 유전자 산물을 이의 의도된 용도에 가장 적합한 형태로 제공하는 시스템에 따라 달라진다. 예를 들어, 해독후 변형, 예를 들어 글리코실화가 목적하는 재조합 단백질의 요건(예, 항원성, 활성, 입체형태 등)에 결정적인 경우, 원핵 세포는 해독후 글리코실화 활성이 특징적으로 결여되어 있으므로 진핵 숙주 세포 시스템이 바람직할 것이다. 또한, 벡터/숙주 세포 쌍이 발현된 유전자 산물을 목적하는 형태로 생성시킬 뿐만 아니라 목적하는 발현된 유전자 산물의 분자가 이들을 생성하는 세포로부터 용이하게 분리될 수 있는 것이 중요하다.
사람 치료법용으로 의도된 재조합 단백질의 개발과 관련된 비용 증가로 인하여, 특히 진핵 숙주 세포를 사용한 시스템에서 이러한 재조합 단백질의 발현 수준을 증강시키는 계속된 노력이 남아있다. 다양한 시스- 및 트랜스-작용성 조절 요소는 발현 효율 및/또는 목적하는 재조합 유전자 산물의 총 수율을 향상시킬 수 있는 뉴클레오타이드 서열(DNA 또는 RNA)을 갖는 것을 특징으로 하였다. 이러한 조절 요소에는 고 효율의 프로모터, 전사 인핸서 서열(예를 들어 Dillon and Grosveld, Trends Genet., 9: 134 (1993) 참조), 유전자좌 조절 영역(LCR; 예를 들어 Grosveld et al., Cell, 51: 975 (1987) 참조), 매트릭스 또는 골격 부착 영역(MAR, SAR; 예를 들어 미국 특허 제7,129,062호; Bode et al., Int. Rev. Cytol, 162A: 389-454 (1995); Bode et al., Crit. Rev. Eukaryotic Gene Expression, 6: 115-138 (1996) 참조); 인슐레이터(insulator) 요소(예를 들어 Kellum et al., Cell, 64: 941 (1991) 참조); 및 내부 리보솜 진입 부위(IRES; 예를 들어 McBratney et al., Curr. Opin. Cell Biol., 5: 961 (1993) 참조)가 포함되지만 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 요소들의 몇몇의 핵산 서열은 발현에 영향을 미칠 수 있는 특이적 서열을 함유하는 것으로 후속적으로 발견되었다.
다양한 형태의 숙주 세포에서 재조합 단백질의 발현에 영향을 미칠 수 있는 다양한 서열 및 기타 인자들의 이해에 대한 진보가 있음에도 불구하고, 특히 이러한 재조합 단백질이 치료적 또는 다른 특성화된 적용으로 의도되는 경우 재조합 단백질의 수율을 향상시킬 필요가 여전히 남아있다.
발명의 개요
본 발명은 재조합 단백질의 발현을 증강시키는 뉴클레오타이드 염기 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자(폴리뉴클레오타이드 분자)를 제공한다. 이러한 핵산 분자를 본원에서 재조합 발현 벡터 요소(rEVE)라고 나타낸다. 발현 벡터 상의 rEVE의 존재는 rEVE의 부재시 발현 수준과 비교하여 발현 벡터 상에 존재하는 하나 이상의 기능성 유전자에 의해 암호화된 하나 이상의 재조합 단백질의 발현 수준을 증강시킨다. 재조합 단백질의 발현 수준의 이러한 rEVE-매개된 증강은, rEVE가 목적하는 재조합 단백질(들)을 암호화하는 유전자의 5', 3', 또는 5'와 3' 둘다(예, 플랭킹)에 위치하거나 간에 가능하다. 발현 벡터 상에 존재하는 rEVE는, 개별적으로 상응하는 유전자 상에 암호화되거나 발현 벡터 상에 존재하는 단일 폴리시스트로닉(polycistronic) 유전자 상에 암호화되거나 간에 하나 이상의 재조합 단백질의 발현을 증강시킬 수 있다. rEVE는 안정한 발현 시스템과 일시적 발현 시스템 둘다를 사용하여 재조합 단백질의 발현 수준을 증강시키는데 사용될 수 있다.
하나의 양태에서, 본 발명은 서열번호 1의 염기 서열("ARM1"), 서열번호 2의 염기 서열("ARM2") 및 상기 서열들의 임의의 발현-증강 부분으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 뉴클레오타이드 염기 서열을 포함하는 분리된 rEVE 폴리뉴클레오타이드 분자를 제공하고, 이때, rEVE 폴리뉴클레오타이드가 목적하는 재조합 단백질을 암호화하는 재조합 유전자와 동일한 발현 벡터상에 존재하는 경우 재조합 단백질의 발현 수준은 rEVE의 부재시 발현 수준과 비교하여 증강될 것이다.
본 발명의 바람직한 rEVE 분자는 서열번호 1의 뉴클레오타이드 염기 서열을 갖는 2329 염기쌍(bp) rEVE 핵산 분자 및 서열번호 2의 뉴클레오타이드 염기 서열을 갖는 2422bp rEVE 핵산 분자를 포함한다.
서열번호 2의 서열의 3' 말단 영역은 단백질 발현의 rEVE-매개된 증강에 결정적인 서열을 함유한다. 이러한 바람직한 서열번호 2의 3' 말단 영역 서열은 서열번호 2의 염기 462-2422의 서열 및 서열번호 2의 염기 1087-2422의 서열을 포함한다.
본원에 기재된 하나 이상의 뉴클레오타이드 염기 서열을 포함하는 분리된 rEVE 핵산 분자는 선형 핵산 분자, 플라스미드, 진핵 바이러스 분자, 원핵 바이러스(박테리오파아지) 분자, 인공 염색체 및 재조합 염색체를 포함하지만 이에 제한되는 것은 아닌 임의의 다양한 형태를 가질 수 있다.
바람직한 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 하나 이상의 rEVE를 포함하는 발현 벡터를 제공한다. 이러한 rEVE-함유 발현 벡터는 rEVE가 결핍된 동일한 발현 벡터를 함유하는 숙주 세포에서의 발현 수준과 비교하여 발현 벡터 상에 암호화된 하나 이상의 재조합 단백질의 적합한 숙주 세포에서 증강된(향상된) 발현 수준을 제공한다. 본 발명에 유용한 발현 벡터는 적합한 (상동) 숙주 세포에서 하나 이상의 재조합 단백질을 암호화하고 발현하도록 조작될 수 있는 임의의 핵산 벡터 분자를 포함한다. 이러한 발현 벡터에는 진핵 플라스미드 벡터, 진핵 바이러스 벡터, 원핵 플라스미드, 박테리오파아지 벡터, 셔틀 벡터(예, 진핵 및 원핵 세포에서 복제할 수 있는 벡터), 미니-염색체 및 다양한 인공 염색체가 포함되지만 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는, 발현 벡터는 플라스미드 발현 벡터, 보다 바람직하게는, 진핵 숙주 세포 게놈 내로 안정하게 통합되는 플라스미드 발현 벡터 및 더욱 보다 바람직하게는 비-상동 재조합에 의해 숙주 세포 게놈 내로 안정하게 통합되는 플라스미드 발현 벡터이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 rEVE를 포함하는 발현 벡터 및 숙주 세포에서 하나 이상의 재조합 단백질의 발현을 지시하는 재조합 유전자를 함유하는 숙주 세포를 제공한다. 숙주 세포는 진핵 또는 원핵 숙주 세포일 수 있다. 본 발명에 사용하기에 바람직한 진핵 숙주 세포에는 포유동물 숙주 세포, 식물 숙주 세포, 진균 숙주 세포, 진핵 조류 숙주 세포, 원생동물 숙주 세포, 곤충 숙주 세포 및 어류 숙주 세포가 포함되지만 이에 제한되는 것은 아니다. 보다 바람직하게는, 본 발명에 유용한 숙주 세포는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, COS 세포, Vero 세포, SP2/0 세포, NS/0 골수종 세포, 사람 배아 신장(HEK 293) 세포, 어린 햄스터 신장(BHK) 세포, HeLa 세포, 사람 B 세포, CV-1/EBNA 세포, L 세포, 3T3 세포, HEPG2 세포, PerC6 세포 및 MDCK 세포를 포함하지만 이에 제한되는 것은 아닌 포유동물 숙주 세포이다. 특히 바람직하게는, 숙주 세포 내로 삽입된 발현 벡터 상의 재조합 유전자의 카피수를 증폭시키는 표준 메토트렉세이트 처리 프로토콜을 사용하여 처리될 수 있는 CHO 세포이다. 본 발명에 숙주 세포로서 작용할 수 있는 진균 세포에는 자낭균류 세포, 예를 들어 아스퍼질러스(Aspergillus), 뉴로스포라(Neurospora) 및 효모 세포, 특히 사카로마이세스(Saccharomyces), 피치아(Pichia), 한세눌라(Hansenula), 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces), 야로위아(Yarrowia) 및 캔디다(Candida)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 효모 속이 포함되지만 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에 따른 재조합 단백질의 발현에서 숙주 세포로서 작용할 수 있는 바람직한 효모 종에는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe) 및 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica)가 포함되지만 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에 따른 재조합 단백질을 발현시키는데 사용될 수 있는 원핵 숙주 세포에는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica)의 혈청형, 시겔라(Shigella) 종, 울리넬라 석시노게네스(Wollinella succinogenes), 프로테우스 불가리스(Proteus vulgaris), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis), 에드와르드시엘라 타르다(Edwardsiella tarda), 시트로박터 프레운디이(Citrobacter freundii), 파스테우렐라(Pasteurella) 종, 헤모필루스(Haemophilus) 종, 슈도모나스(Pseudomonas) 종, 바실러스(Bacillus) 종, 스타필로코쿠스(Staphyloccocus) 종 및 스트렙토코쿠스(Streptococcus) 종이 포함되지만 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에 따른 재조합 단백질의 발현에서 숙주 세포로서 사용될 수 있는 세포에는 원생동물 세포, 예를 들어 트리파노소마티드 숙주 레이쉬마니아 타렌톨래(Leishmania tarentolae) 및 선충류 케노하디티스 엘레간스(Caenorhaditis elegans)의 세포가 포함된다.
본원에 기재된 rEVE 폴리뉴클레오타이드, 본원에 기재된 하나 이상의 rEVE를 포함하는 벡터 및 본원에 기재된 하나 이상의 rEVE를 포함하는 이러한 벡터를 포함하는 숙주 세포가 목적하는 재조합 단백질의 발현과 관련된 다양한 방법에서 사용될 수 있다.
하나의 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 rEVE 및 숙주 세포에서 목적하는 재조합 단백질의 합성을 암호화하고 지시하는 재조합 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 숙주 세포내로 삽입하는 단계 및 재조합 단백질의 발현을 촉진시키는 조건하에서 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함하여 숙주 세포에서 목적하는 재조합 단백질의 발현을 증강시키는 방법을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 메토트렉세이트("MTX")의 부재하에, 즉, 메토트렉세이트의 존재로 제공된 재조합 단백질의 향상된 발현을 위한 선택적 압력의 부재하에, 재조합 단백질을 향상된 수준으로 (일시적인 것과는 대조적으로) 안정하게 발현하는 메토트렉세이트-내성 숙주 세포를 생성시키는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 목적하는 재조합 단백질을 암호화하는 재조합 유전자, 본원에 기재된 rEVE 및 디하이드로폴레이트 리덕타제("DHFR")를 암호화하는 유전자를 포함하는 발현 벡터를 숙주 세포내로 삽입하는 단계; 목적하는 재조합 단백질을 발현하는 메토트렉세이트-내성 숙주 세포를 선택하기 위해 메토트렉세이트의 존재하에 숙주 세포를 증식시키는 단계; 및 메토트렉세이트-내성 숙주 세포를 분리하는 단계를 포함하고, 이때, 메토트렉세이트-내성 숙주 세포는 메토트렉세이트-민감성 숙주 세포보다 더 높은 수준으로 목적하는 재조합 단백질을 발현하고, 이때, 메토트렉세이트-내성 숙주 세포는 메토트렉세이트의 존재하에 또는 부재하에 증식시키는 경우 향상된 수준의 목적하는 재조합 단백질을 안정하게 발현한다. 특히 바람직한 양태에서, 이러한 방법에 사용된 rEVE는 서열번호 2의 서열 또는 목적하는 재조합 단백질을 암호화하는 유전자로서 동일한 발현 벡터 상에 존재하는 경우 숙주 세포에서 재조합 단백질의 발현 수준을 증강시키는 이의 발현-증강 부분을 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 목적하는 재조합 단백질을 암호화하는 유전자, 본원에 기재된 rEVE 및 DHFR 유전자를 포함하는 발현 벡터를 숙주 세포내로 삽입하는 단계를 포함하여 재조합 단백질 발현을 증폭시키기 위한 DHFR-메토트렉세이트 공정에서 메토트렉세이트의 존재에 증강되거나 향상된 적응을 갖는 숙주 세포의 집단을 생성시키는 방법을 제공하고, 이때, 발현 벡터를 함유하는 숙주 세포의 집단은 rEVE 서열이 결핍된 발현 벡터를 함유한 숙주 세포의 집단과 비교하여 메토트렉세이트의 존재하에 더 우수하게 적응하고, 즉, 더 높은 생존율 및/또는 더 높은 증식률을 갖는다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 목적하는 재조합 단백질을 암호화하는 재조합 유전자, 본원에 기재된 rEVE 및 DHFR 유전자를 포함하는 발현 벡터를 숙주 세포내로 삽입하는 단계; 목적하는 재조합 단백질을 발현하는 메토트렉세이트-내성 숙주 세포를 선택하기 위해 메토트렉세이트의 존재하에 숙주 세포를 증식시키는 단계; 및 메토트렉세이트-내성 숙주 세포를 분리하는 단계를 포함하고, 이때, 분리된 메토트렉세이트-내성 숙주 세포는 rEVE가 결핍된 동일한 발현 벡터를 함유하는 메토트렉세이트-내성 숙주 세포보다 더 높은 수준으로 메토트렉세이트의 존재하에 목적하는 재조합 단백질을 발현하는, DHFR-메토트렉세이트 공정을 사용하여 수득한 숙주 세포에서 재조합 단백질의 발현의 증폭(향상)을 증강시키는 방법을 제공한다.
메토트렉세이트는 본원에 기재된 방법에서 편리하게는 20nM 내지 500nM의 범위로 사용될 수 있지만, 더 낮고 더 높은 농도, 예를 들어 5nM 내지 10μM이 또한 목적하는 재조합 단백질의 증폭된 발현을 선택하기 위해 이러한 방법에서 성공적으로 사용될 수도 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 발현 벡터로부터 재조합 단백질의 발현을 저하시키거나, 실질적으로 억제하거나, 필수적으로 사일런싱하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 서열을 포함하는 rEVE를 사용하여 제공된 것보다 특정 재조합 유전자 산물의 더 낮은 수준의 발현을 제공하는 rEVE의 하나 이상의 단편을 포함하는 발현 벡터를 사용한다. 이러한 단편은 서열번호 2의 염기 1-1086 또는 서열번호 2의 염기 1-461의 뉴클레오타이드 염기 서열을 포함하는 서열번호 2의 특정 절두된 변이체를 갖는다. 서열번호 2의 염기 1-461로 이루어진 절두된 ARM2 서열을 갖는 핵산 분자는 숙주 세포에서 벡터 분자로부터 재조합 단백질의 발현을 억제하거나 실질적으로 사일런싱하는데 특히 유용하다. 이러한 발견은, 또한 서열번호 2의 뉴클레오타이드 염기 462-2422의 서열 및 서열번호 2의 뉴클레오타이드 염기 1087-2422의 서열이 재조합 단백질 발현의 최대 rEVE-매개된 증강에 가장 바람직하다는 것을 나타내는 것이다.
본원에 기재된 하나 이상의 rEVE 분자에 의해 발현이 증강될 수 있는 재조합 단백질은, 기능성 유전자(들)이 적합한 숙주 세포에서 발현을 위해 핵산 벡터 분자내로 조작될 수 있는 임의의 단백질(펩타이드, 폴리펩타이드 및 올리고머 단백질 포함)일 수 있다. 이러한 단백질에는 가용성 단백질, 막 단백질, 구조 단백질(즉, 세포, 조직 또는 기관에 구조 또는 지지를 제공하는 단백질), 리보솜 단백질, 효소, 효소원, 항체 분자, 세포 표면 수용체 단백질, 전사 조절 단백질, 해독 조절 단백질, 염색질 단백질(예, 히스톤), 호르몬, 세포 주기 조절 단백질, G 단백질, 신경활성 펩타이드, 면역조절 단백질(예, 인터루킨, 사이토카인), 혈액 성분 단백질, 이온 게이트 단백질, 열 충격 단백질, 디하이드로폴레이트 리덕타제, 항생제 내성 단백질, 이의 기능성 단편, 이의 에피토프-함유 단편 및 이의 조합물이 포함되지만 이에 제한되는 것은 아니다.
본원에 기재된 rEVE 서열 또는 이의 부분을 함유하는 핵산 분자는 또한 핵산 하이브리드화에 의해 다른 핵산 분자에서 rEVE 서열의 존재를 확인하기 위한 핵산 프로브로서 또는 예를 들어 본원에 기재된 rEVE 서열을 조작하거나, 확인하거나, 생성시키거나 또는 증폭시키기 위해 사용될 수 있는 다양한 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 공정에서 사용하기 위한 프라이머 공급원으로서 사용될 수 있다.
rEVE 서열, 예를 들어 ARM1(서열번호 1)에 있어서 및 ARM2(서열번호 2)에 있어서의 서열은 하나 이상의 매트릭스 부착 영역(MAR) 서열을 포함할 수 있다. MAR 서열은 rEVE 서열의 5' 및/또는 3' 말단 영역에서의 클러스터를 포함하여 rEVE 서열내 클러스터로 존재할 수 있다. 본원에 기재된 rEVE 폴리뉴클레오타이드는 MAR 서열의 유용한 공급원이다. 따라서, 본 발명은 본원에 기재된 rEVE 또는 하나 이상의 MAR 서열을 함유하는 본원에 기재된 rEVE의 부분을 핵산 분자내로 삽입함을 포함하여 핵산 분자에서 MAR 서열을 증가시키기에 유용한 조성물 및 방법을 제공한다.
또한 본원에 기재된 뉴클레오타이드 염기 서열은 이의 상보적 서열을 제공하는 역할을 한다. 또한 본원에 기재된 DNA 분자 및 뉴클레오타이드 염기 서열은 상응하는 RNA 분자 및 티민(T)이 우라실(U)로 대체된 염기 서열, 및 이의 상보적인 핵산 서열을 제공한다.
도 1은 중국 햄스터 난소(CHO) 세포의 안정한 형질감염체에서 활성 사람 항-TNF-α IgG1 분자("아달리무맙")를 형성하는 면역글로불린 중쇄 및 카파 경쇄를 발현시키는데 사용된 플라스미드 발현 벡터 pA205의 도식을 나타낸다. 약어: "인핸서"는 사이토메갈로바이러스(CMV)의 즉시 초기 유전자 인핸서를 나타내고; "아데노 프로모터"는 아데노바이러스의 주요 후기 프로모터를 나타내며; "아달리무맙 중쇄"는 아달리무맙의 IgG1 중쇄에 대한 암호화 영역을 나타내고; "SV40 폴리 A"는 원숭이 바이러스 40 폴리아데닐화 부위를 나타내며; "가스트린 터미네이터"는 사람 가스트린 유전자의 전사 종결 시그날을 나타내고; "SV40 프로모터"는 원숭이 바이러스 40 프로모터이며; "DHFR"은 마우스 디하이드로폴레이트 리덕타제 유전자를 나타내고; "TK 폴리 A"는 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제 유전자의 폴리아데닐화 부위를 나타내며; "아달리무맙 경쇄"는 아달리무맙의 카파 경쇄에 대한 암호화 영역을 나타내고; "ORI"는 에스케리키아 콜라이에서 작용하는 플라스미드 ColE1 원핵 복제 오리진을 나타내며; "P(BLA)"는 β-락타마제 유전자의 원핵 프로모터를 나타내고(암피실린 내성 유전자), 작은 화살표는 전사 방향을 나타내며; "APr"("암피실린 내성")은 β-락타마제에서 암호화 영역을 나타낸다. 화살표는 전사의 방향을 나타낸다(5'에서 3'으로).
도 2는, 서열번호 1의 뉴클레오타이드 염기 서열을 갖는 ARM1("A1") 핵산이 아데노바이러스 주요 후기 프로모터 및 아달리무맙 IgG1 중쇄 암호화 영역의 상류에서 발현 벡터 pA205(도 1)내로 삽입되고, 서열번호 2의 뉴클레오타이드 염기 서열을 갖는 ARM2("A2") 핵산이 아달리무맙 카파 경쇄 암호화 영역의 하류에 삽입되는 플라스미드 발현 벡터 pA205Genomic의 도식이다. 다른 약어는 상기 도 1의 기재를 참조한다.
도 3은, 서열번호 1의 서열을 갖는 ARM1("A1") 핵산이 아데노 프로모터 및 아달리무맙 IgG1 중쇄 암호화 영역의 상류에서 발현 벡터 pA205(도 1)내로 삽입되는 플라스미드 발현 벡터 pA205A1의 도식이다. 다른 약어는 상기 도 1의 기재를 참조한다.
도 4는, 서열번호 2의 뉴클레오타이드 염기 서열을 갖는 ARM2("A2") 핵산이 아달리무맙 카파 경쇄 암호화 영역의 하류에서 삽입되는 플라스미드 발현 벡터 pA205A2의 도식이다. 다른 약어는 상기 도 1의 기재를 참조한다.
도 5는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포의 안정한 형질감염체에서 활성 사람 항-EL-셀렉틴 IgG1 분자를 형성하는 면역글로불린 중쇄 및 카파 경쇄를 발현시키는데 사용된 플라스미드 발현 벡터 pCHOEL246GGhum의 도식이다. "항-EL-셀렉틴 중쇄"는 사람 항-EL-셀렉틴 IgG1 항체의 중쇄에 대한 암호화 영역을 나타내고; "항-EL-셀렉틴 경쇄"는 사람 항-EL-셀렉틴 IgG1 항체의 카파 경쇄에 대한 암호화 영역을 나타낸다. 다른 약어는 상기 도 1의 기재를 참조한다.
도 6은, 서열번호 1의 뉴클레오타이드 염기 서열을 갖는 ARM1("A1") 핵산이 항-EL-셀렉틴 IgG1 중쇄 암호화 영역의 상류에서 발현 벡터 pCHOEL246GGhum(도 5)내로 삽입되고, 서열번호 2의 뉴클레오타이드 염기 서열을 갖는 ARM2("A2") 핵산이 항-EL-셀렉틴 카파 경쇄 암호화 영역의 하류에 삽입되는 플라스미드 발현 벡터 pA-Gen-EL-셀렉틴의 도식이다. 다른 약어는 상기 도 1의 기재를 참조한다.
도 7은 CHO 세포의 안정한 형질감염체에서 증강된 녹색 형광 단백질(eGFP)을 발현시키는데 사용된 플라스미드 발현 벡터 pA205-eGFP의 도식이다. eGFP 암호화 영역("EGFP")은 아데노바이러스 주요 후기 프로모터("아데노 프로모터")로부터 하류에서 경쇄 암호화 영역, 인접 프로모터 및 인접 인핸서와 중쇄 암호화 영역이 결실된 pA205(도 1)내로 삽입된다. 다른 약어는 상기 도 1의 기재를 참조한다.
도 8은, 서열번호 1의 뉴클레오타이드 염기 서열을 갖는 ARM1("A1") 핵산이eGFP 암호화 영역("EGFP")의 상류에서 발현 벡터 pA205-eGFP(도 7)내로 삽입되고, 서열번호 2의 뉴클레오타이드 염기 서열을 갖는 ARM2("A2") 핵산이 eGFP 암호화 서열의 하류에 삽입되는 플라스미드 발현 벡터 pA205G-eGFP의 도식이다. 다른 약어는 상기 도 1의 기재를 참조한다.
도 9는, ARM2(서열번호 2)가 제한 엔도뉴클레아제 SpeI로 ARM2 핵산을 분해한 결과로서 서열번호 2의 염기 1-1086의 뉴클레오타이드 염기 서열을 갖는 절두된 ARM2 변이체 "A2(bp 1-1086)"로 대체된 것을 제외하고는 도 4에 제시된 발현 벡터 pA205A2와 필수적으로 동일한 플라스미드 발현 벡터 pA205A2-Spe-trunc의 도식이다. 다른 약어는 상기 도 1의 기재를 참조한다.
도 10은, ARM2(서열번호 2)가 제한 엔도뉴클레아제 Swa1로 ARM2 핵산을 분해한 결과로서 서열번호 2의 염기 1-461의 뉴클레오타이드 염기 서열을 갖는 절두된 ARM2 변이체 "A2(bp 1-461)"로 대체된 것을 제외하고는 도 4에 제시된 발현 벡터 pA205A2와 필수적으로 동일한 플라스미드 발현 벡터 pA205A2-Swa-trunc의 도식이다. 다른 약어는 상기 도 1의 기재를 참조한다.
본 발명은, 서열번호 1:
Figure pat00001
의 뉴클레오타이드 서열 또는 서열번호 2:
Figure pat00002
의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 하나 이상의 분리된 핵산 분자(폴리뉴클레오타이드 분자)가 발현 벡터 분자 상에 존재하는 하나 이상의 유전자로부터 하나 이상의 재조합 단백질의 발현을 증강시키기 위해 발현 벡터 분자내로 조작될 수 있다는 발견을 근거로 한다.
서열번호 1 또는 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자를 재조합 발현 벡터 요소(rEVE)라고 본원에 나타낸다. 또한 본 발명의 rEVE에는 서열번호 1("ARM1") 또는 서열번호 2("ARM2")에 제시된 서열의 발현-증강 부분을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 분자를 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다. 서열번호 2의 염기 462-2422 및 서열번호 2의 염기 1087-2422의 서열을 갖는 것과 같은 ARM2 서열번호 2의 3' 말단 영역으로부터의 서열은 목적하는 재조합 단백질의 증강된 발현을 제공하는데 특히 유용하다. 본원에 기재된 rEVE는 다른 조절 서열, 조절자 및 숙주 세포에서 재조합 단백질의 생성을 증가시킬 수 있는 최근 공정과 조합하여 사용될 수 있다.
본 발명을 보다 명확하게 기재하기 위해서, 다음의 용어가 정의된다:
본원에 사용되고 이해된 용어 "항체" 또는 "항체 분자"는 2개의 중쇄(H) 및 2개의 경쇄(L)인 4개의 폴리펩타이드 쇄로 이루어진 임의의 면역글로불린(Ig) 분자 또는 Ig 분자의 필수적 에피토프 결합 특성을 갖는 이의 임의의 기능성 단편, 돌연변이체, 변이체 또는 유도체를 광범위하게 나타낸다. 이러한 돌연변이체, 변이체 또는 유도체 항체는 당해 기술분야에 공지되어 있고, 하기 논의된 비-제한적 양태가 포함된다.
전장 항체에서, 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역(VH) 및 중쇄 불변 영역으로 이루어진다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인 CH1, CH2 및 CH3으로 이루어진다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역(VL) 및 경쇄 불변 영역으로 이루어진다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인(CL)으로 이루어진다. VH 및 VL 영역은 상보성 결정 영역(CDR)으로 명명된 과변이 영역으로 추가로 세분될 수 있고, 골격 영역(FR)으로서 나타내어진 보다 보존된 영역으로 산재되어 있을 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 다음의 순서로 아미노 말단에서부터 카복시 말단까지 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 이루어진다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 면역글로불린 분자는 임의의 종류(예, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 부류(예, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 아부류일 수 있다.
용어 "항체" 및 "항체 분자"는 또한 항원과 특이적으로 결합하는 능력을 갖는 항체의 하나 이상의 단편을 포함한다. 항체의 항원-결합 기능은 전장 항체의 단편에 의해 이루어질 수 있는 것으로 제시되었다. 이러한 항체 양태는 또한 2개 이상의 상이한 항원과 특이적으로 결합하는 이특이적, 이중 특이적 또는 다중-특이적 형식일 수 있다. 용어 "항체"내에 포함된 결합 단편의 예에는 Fab 단편, 즉, VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 (하나의 결합 부위) 단편; F(ab')2 단편, 즉, 힌지 영역에서 디설파이드 브릿지에 의해 결합된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 (2개의 결합 부위) 단편; VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; 항체의 단일 암(arm)의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; 단일 가변 도메인을 포함하는 단일 도메인 항체(dAb)(참조: Ward et al., Nature, 341: 544-546 (1989); Winter et al., PCT 공개번호 WO 90/05144 A1호, 본원에 참조로 인용됨); 이중 가변 도메인(DVD) 항체(참조: 예를 들어 PCT 공개번호 WO 2007/024715호); 및 분리된 상보성 결정 영역(CDR)이 포함된다. 추가로, Fv 단편의 2개의 도메인인 VL 및 VH가 개별적 유전자에 의해 암호화되지만, 이들은, VL 및 VH 영역 쌍이 1가 분자(단일쇄 Fv(scFv)로서 공지됨, 예를 들어 Bird et al. Science, 242: 423-426 (1988); Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 5879-5883 (1988) 참조)를 형성하는, 단일 단백질 쇄로서 이들이 제조될 수 있도록 하는 합성 링커에 의한 재조합 방법을 사용하여 결합될 수 있다. 이러한 단일쇄 항체는 용어 "항체" 및 "항체 분자"에 포함된다. 디아바디(diabody)가 또한 용어 "항체" 및 "항체 분자"에 포함된다. 디아바디는, VH 및 VL 도메인이 단일 폴리펩타이드 쇄 상에 발현되지만, 너무 짧은 링커를 사용하여 동일한 쇄 상의 2개의 도메인 사이에 짝을 이루게 할 수 없으며, 이로써 도메인이 또 다른 쇄의 상보적 도메인과 짝을 이루게 하여 2개의 항원 결합 부위를 생성시킬 수 있는 2가의 이중특이성 항체이다[참조: 예를 들어 Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993); Poljak et al., Structure, 2: 1121-1123 (1994)]. 용어 "항체" 및 "항체 분자"는 또한 2중 가변 도메인 면역글로불린 분자, 예를 들어 DVD-IGTM(Abbott Laboratories사) 2중 가변 도메인 면역글로불린 분자를 포함한다[참조: 예를 들어 PCT 공개번호 WO 2007/024715호].
본원에 사용된 "벡터"는 숙주 세포에서 외래 폴리뉴클레오타이드에 대한 유전자 전이, 발현 또는 복제의 비히클로서 작용할 수 있는 임의의 유전자 요소를 나타낸다. 예를 들어, 벡터는 인공 염색체 또는 플라스미드일 수 있고, 숙주 세포 게놈내로 안정하게 통합될 수 있거나, 독립적인 유전자 요소(예, 에피솜, 플라스미드)로서 존재할 수 있다. 벡터는 단일 폴리뉴클레오타이드 또는 2개 이상의 개별적 폴리뉴클레오타이드로서 존재할 수 있다. 벡터는 숙주 세포에서 존재하는 경우 단일 카피 벡터 또는 다중 카피 벡터일 수 있다. 본 발명에 사용하기에 바람직한 벡터는, 벡터 분자가 적합한 (상동) 숙주 세포에 존재하는 경우 하나 이상의 단백질의 발현을 지시하기 위해 발현 벡터 분자에 존재하는 발현 조절 요소에 적합한 위치 및 부근에서 하나 이상이 기능성 유전자가 벡터 분자내로 삽입될 수 있는 발현 벡터 분자이다.
발현 벡터에는 진핵 플라스미드 벡터, 진핵 바이러스 벡터, 원핵 플라스미드, 박테리오파아지 벡터, 셔틀 벡터(예, 진핵 및 원핵 세포에서 복제할 수 있는 벡터), 미니-염색체 및 다양한 인공 염색체(예, 세균 인공 염색체(BAC), 효모 인공 염색체(YAC))가 포함되지만 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는, 본 발명에 사용된 발현 벡터는 플라스미드이고, 보다 바람직하게는 숙주 세포 게놈내로 안정하게 통합되는 플라스미드 발현 벡터이며, 더욱 보다 바람직하게는 비-상동 재조합에 의해 숙주 세포 게놈내로 안정하게 통합되는 플라스미드 발현 벡터이다. "셔틀 벡터" (또는 이-기능성 벡터)는 하나 이상의 유기체 종에서 복제할 수 있는 임의의 벡터를 나타낸다. 예를 들어, 에스케리키아 콜라이(이.콜라이)와 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)(에스.세레비지애) 둘다에서 복제할 수 있는 셔틀 벡터는 이.콜라이 플라스미드로부터의 서열과 효모 2μ 플라스미드로부터의 서열을 결합함으로써 작제될 수 있다.
발현 시스템은 발현 벡터 상에 암호화된 재조합 단백질(들)을 발현시킬 적합한 (상동) 숙주 세포 및 발현 벡터를 포함한다. 발현 시스템은 안정한 발현 시스템 또는 일시적 발현 시스템일 수 있다. 안정한 발현 시스템에서, 발현 벡터는 숙주 세포 게놈 내로 안정하게 통합되거나, 적합한 조건하에서 배양되는 경우 숙주 세포가 재조합 단백질(들)을 연속적으로 발현할 수 있도록 딸세포 둘다 상에 연속적으로 복제되고 정확하게 계대된다. 일시적 발현 시스템에서, 발현 벡터 분자는 딸세포 둘다에 존재하지 않고, 증식하는 세포 배양물에서 결국 사라지거나 감소하여 배양물로부터 재조합 단백질(들)의 발현은 결국 멈춰지거나 너무 낮아 대부분의 생성 목적에 유용하지 않다. 하기 실시예에 사용된 발현 벡터는 목적하는 이들의 암호화된 유전자 산물(들)의 안정한 발현을 수득하기 위해 이.콜라이 세포내로 (예를 들어 형질전환에 의해) 삽입되는 경우 상대적으로 우수한 카피수로 복제될 수 있고, 또한 중국 햄스터 난소(CHO) 세포 내로 (예를 들어, 형질감염에 의해) 삽입되어 안정하게 유지될 수 있거나[참조: Kaufman et al., Molec. Cell. Biol., 5:1750-1759 (1980)], HEK 293 세포에서 일시적으로 유지될 수 있는[참조: Durocher et al., Nucleic Acids Res., 30: E9], 셔틀 벡터의 형태이다. 따라서, 본원에 기재된 rEVE 폴리뉴클레오타이드 분자는 안정한 및 일시적인 발현 시스템 둘다에서 목적하는 재조합 단백질(들)의 발현을 증강시키기 위해 사용될 수 있다.
본 발명에 사용될 수 있는 예시적 진핵 벡터에는 바이러스 및 비-바이러스 벡터가 포함되지만 이에 제한되는 것은 아니다. 바이러스 벡터에는 레트로바이러스 벡터(렌티바이러스 벡터 포함); 복제 적합자, 복제 결손자 및 이의 실제가 없는 형태를 포함한 아데노바이러스 벡터; 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터; 원숭이 바이러스 40(SV-40) 벡터; 소 유두종 바이러스 벡터; 엡스타인-바 바이러스 벡터; 헤르페스 바이러스 벡터, 백신 바이러스 벡터; 몰로니 설치류 백혈병 바이러스 벡터; 하비 설치류 육종 바이러스 벡터, 설치류 포유동물 종양 바이러스 벡터 및 라우스 육종 바이러스 벡터가 포함되지만 이에 제한되는 것은 아니다. 배큘로바이러스 벡터는 익히 공지되어 있고, 곤충 세포에서 발현에 적합하다.
진핵 또는 원핵 세포에서 발현에 적합한 다양한 벡터는 당해 기술분야에 익히 공지되어 있고, 다수는 시판중이다. 시판중인 공급원에는 Stratagene사(La Jolla, California), Invitrogen사(Carlsbad, California), Promega사(Madison, Wisconsin) 및 Sigma-Aldrich사(St. Louis, Missouri)가 포함되지만 이에 제한되는 것은 아니다. 다수의 벡터 서열은 GenBank를 통해 입수가능하고, 벡터에 관련된 부가의 정보는 Riken BioSource Center를 통해 인터넷상에서 입수가능하다.
벡터 분자는 통상적으로 하나 이상의 복제 오리진을 포함하고, 또한 벡터가 숙주 세포내로 삽입되는 경우 확인하거나 선택할 수 있는 "마커" 또는 "선택성 마커"에 대한 유전자를 포함할 수 있다. 이러한 유용한 마커는 비제한적으로 항생제에 대한 내성을 부여하고, 이러한 기능이 결여된 세포 상에 선택적 증식 이점을 주는 기능을 제공하거나, 벡터(예, 발색 시스템)를 보유한 세포를 용이하게 확인하는 수단을 제공할 수 있다. 이러한 마커는 당해 기술분야에 익히 공지되어 있고, 벡터 분자에 사용하기에 적합한 선택성 마커(들)의 선택은 사용될 숙주 세포 및 벡터를 함유한 숙주 세포의 바람직한 특성에 따라 달라질 것이다.
용어 "기능성 유전자 작제물", "기능성 유전자" 및 "유전자"는, 프로모터 서열과 작동가능하게 결합되는 하나 이상의 단백질에 대한 암호화 서열 및 가능하게는 메신저 RNA(mRAN)내로 암호화 서열의 적합한 전사를 지시하는 다른 전사 조절 서열을 함유하고, 또한 의도한 숙주 세포에서 목적하는 단백질내로 mRNA의 적합한 해독을 지시하는 것이 필요하거나 바람직할 수 있는 임의의 다수의 해독 조절 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 나타낸다. 해독 개시 코돈(예, ATG) 및 리보솜 결합 부위는, 원핵 및 진핵 세포에서 해독이 발생하기 위해 통상적으로 mRNA에서 필요하다. 또한 숙주 세포에 따라 사용될 수 있는 기타 해독 조절 서열에는 RNA 스플라이스 부위 및 폴리아데닐화 부위가 포함되지만 이에 제한되는 것은 아니다.
본원에서 용어 "재조합"은 변경되거나 조작된 핵산, 천연 발생하는 환경으로부터 분리된 핵산, 외인성 핵산으로 형질감염되거나 그렇지 않으면 외인성 핵산을 함유하도록 조작된 숙주 세포 또는 분리된 DNA의 조작 및 숙주 세포의 형질감염을 통해 비-천연적으로 발현된 단백질을 나타내는데 사용된다. "재조합"은 특히 유전자 조작 기술을 사용하여 시험관내 작제되었던 DNA 분자를 포함하는 용어이고, 분자, 작제물, 벡터, 세포, 단백질, 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 기재하는 형용사로서 용어 "재조합"의 사용은 특히 천연으로 발생하는 이러한 분자, 작제물, 벡터, 세포, 단백질, 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 제외한다. 특히, 본 발명의 목적에 있어서 "재조합 단백질"은 단백질의 발현 이전에 숙주 세포에서 천연으로 발생하지 않았던 하나 이상의 유전적 요소를 혼입시킴으로써 조작된 숙주 세포에 의해 발현된 단백질이다. 예를 들어 단백질의 암호화 서열을 포함한 발현 벡터로 형질감염시킴으로써 단백질을 발현할 수 있는 숙주 세포 내로 인공적으로 혼입되었던 단백질 암호화 서열이 숙주 세포에 의해 일단 발현된 "재조합 단백질"이다.
"숙주 세포"는, 벡터 분자가 삽입될 수 있는 임의의 세포, 즉, 임의의 진핵 또는 원핵 세포를 나타낸다. 본 발명에 따르면, 바람직한 숙주 세포는 동물 세포(예, 포유동물, 조류 및 어류 숙주 세포), 식물 세포(진핵 조류 세포 포함), 진균 세포, 세균 세포 및 원생동물 세포를 포함하지만 이에 제한되는 것은 아닌 진핵 또는 원핵 세포이다. 본 발명에 유용한 숙주 세포는 임의의 유전적 작제물일 수 있지만, 반수체 또는 배수체 세포가 바람직하다. 본 발명에 유용한 바람직한 포유동물 숙주 세포에는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, COS 세포, Vero 세포, SP2/0 세포, NS/0 골수종 세포, 사람 배아 신장(HEK 293) 세포, 어린 햄스터 신장(BHK) 세포, HeLa 세포, 사람 B 세포, CV-1/EBNA 세포, L 세포, 3T3 세포, HEPG2 세포, PerC6 세포 및 MDCK 세포가 포함되지만 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직한 곤충 세포는 Sf9이다. 본 발명에서 숙주 세포로서 작용할 수 있는 진균 세포에는 자낭균류 세포, 예를 들어 아스퍼질러스, 뉴로스포라 및 효모 세포, 특히 사카로마이세스, 피치아, 한세눌라, 스키조사카로마이세스, 클루이베로마이세스, 야로위아 및 캔디다 속의 효모가 포함되지만 이에 제한되는 것은 아니다. 재조합 단백질의 발현에 있어서 숙주 세포로서 작용할 수 있는 특히 바람직한 효모 진균 종류는 사카로마이세스 세레비지애, 한세눌라 폴리모르파, 클루이베로마이세스 락티스, 피치아 파스토리스, 스키조사카로마이세스 폼베 및 야로위아 리폴리티카이다. 본 발명에서 숙주 세포로서 작용할 수 있는 바람직한 원핵 세포에는 에스케리키아 콜라이, 살모넬라 엔테리카의 혈청형, 시겔라 종, 울리넬라 석시노게네스, 프로테우스 불가리스, 프로테우스 미라빌리스, 에드와르드시엘라 타르다, 시트로박터 프레운디이, 파스테우렐라 종, 헤모필루스 종, 슈도모나스 종, 바실러스 종, 스타필로코쿠스 종 및 스트렙토코쿠스 종이 포함되지만 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에 따른 재조합 단백질의 발현에 유용한 숙주 세포일 수 있는 기타 세포에는 원생동물, 예를 들어 트리파노소마티드 숙주 레이쉬마니아 타렌톨래 및 선충류 케노하디티스 엘레간스의 세포가 포함된다. 다양한 발현 벡터가 상기 언급된 세포에서 사용가능하다.
형질전환, 형질감염, 세포 또는 원형질체 융합, 화학적 처리 사용(예, 원형질체의 폴리에틸렌 글리콜 처리, 칼슘 처리, Invitrogen사(Carlsbad, California)로부터 입수가능한 LIPOFECTIN® 및 LIPOFECTAMINE® 형질감염 시약과 같은 형질감염 제제), 다양한 형태의 리포솜 사용, 기계적 장치 사용(예, 핵산 피복된 미세비드), 전하량의 사용(예, 전기천공) 및 이의 조합을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아닌, 벡터 분자를 세포내로 삽입하는 다양한 수단 및 프로토콜이 있다. 본원에 기재된 특정 벡터 분자를 목적하는 숙주 세포내로 삽입하는데 사용하는 특정 프로토콜 및/또는 수단의 결정은 당해 기술분야 숙련가의 기술내에 있다.
하나의 벡터 또는 다른 핵산 분자로부터 또 다른 것으로 "핵산 서열 정보를 전달하는" 방법이 본 발명에 제한되는 것은 아니고, 당해 기술분야에 공지된 임의의 다양한 유전자 조작 또는 재조합 핵산 기술이 포함된다. 특히 바람직한 전달 기술에는 제한 분해 및 연결 기술, 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 프로토콜(특이적 또는 무작위 서열 프라이머 사용), 상동 재조합 기술(상동의 폴리뉴클레오타이드 영역 사용) 및 비-상동 재조합(예, 무작위 삽입) 기술이 포함되지만 이에 제한되는 것은 아니다. 특이적 서열을 함유하는 핵산 분자는 또한 예를 들어 자동화 핵산 합성기를 사용하여 합성될 수 있고, 이어서 수득한 핵산 산물은 상기 언급된 임의의 합성법으로 또 다른 핵산 분자 내로 혼입될 수 있다.
유전자 조작 기술의 사용은 숙련가에 의해 목적하는 특정 세포 상태 및 세포의 필요조건에 의해 결정된 다양한 상술된 조건하에서 증식하는 재조합 숙주 세포(예, 형질감염체, 형질전환체)를 증식시키는 것을 필요로 한다. 예를 들면, 숙주 세포는 특정 영양 조건, 또는 물리적(예, 온도) 및/또는 화학적(예, 항생제) 조건에 대한 특정 내성 또는 민감성을 (이의 유전적 소인에 의해 결정된 바와 같이) 함유할 수 있다. 또한, 특이적 배양 조건은 목적하는 유전자의 발현을 조절하거나(예를 들어 유도성 프로모터를 사용), 특정 세포 상태를 개시하기 위해(예, 효모 세포 짝짓기 또는 포자형성) 필요할 수 있다. 이러한 조건을 만족시키는 이들 다양한 조건 및 요건은 당해 기술분야 숙련가에게 이해되고 인식된다.
표준 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR)-메토트렉세이트(MTX) 증폭 공정을 사용하여 숙주 세포에서 재조합 단백질 발현을 증폭시킨다(향상시킨다)는 문맥에서, 용어 "안정성" 및 "안정한 발현"은 메토트렉세이트의 부재하에, 즉, 증폭 공정에 사용된 메토트렉세이트의 존재하에 제공된 향상된 발현을 위한 선택적 압력의 부재하에 증식시키는 경우 증폭된 (향상된) 수준으로 연속적으로 재조합 단백질을 발현하는 세포의 배양의 능력을 나타낸다. 따라서, 일단 분리되는 경우, 안정한 형질감염체 숙주 세포는 메토트렉세이트의 존재 또는 부재하에 목적하는 재조합 단백질을 발현할 수 있다.
표준 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR)-메토트렉세이트(MTX) 증식 공정을 사용하여 숙주 세포에서 재조합 단백질 발현을 증식시킨다는 문맥에서, 메토트렉세이트의 존재에 대한 "증강된 적응" 또는 "향상된 적응"은, rEVE가 결핍된 발현 벡터를 함유하는 숙주 세포 배양물의 메토트렉세이트의 존재하의 생존율 및/또는 증식률과 비교하여 본원에 기재된 rEVE를 포함하는 발현 벡터를 함유하는 숙주 세포 배양물의 메토트렉세이트의 존재하의 생존율 및/또는 증식률이 더 높음을 나타낸다. 숙주 세포 집단의 "생존율"은 선택적 압력(예, 메토트렉세이트)의 존재하에 증식하고 재생성하는 숙주 세포 집단의 능력을 나타낸다.
"서열 상동성"은 당해 기술분야에 숙련가에게 익숙한 개념이다. 2개의 아미노산 서열 또는 2개의 핵산의 상동성(%)을 측정하기 위해, 서열들을 최적 비교 목적으로 정렬시킨다(예, 제2 비교 아미노산 또는 핵산 서열과의 최적 정렬을 위해, 갭을 제1 아미노산 또는 핵산 서열의 서열내로 도입할 수 있다). 이어서, 상응하는 아미노산 위치 또는 뉴클레오타이드 위치에서 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드를 비교한다. 제1 서열에서 위치가 제2 서열에서 상응하는 위치와 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드로 채워진 경우, 이때 분자는 그 위치에서 상동성이다(즉, 본원에 사용된 바와 같이 아미노산 또는 핵산 "상동성"은 아미노산 또는 핵산 "동일성"과 일치한다). 핵산 서열 상동성은 2개의 서열 사이에 동일성 정도로 측정될 수 있다. 상동성은 당해 기술분야에 공지된 컴퓨터 프로그램, 예를 들어 GCG 프로그램 패키지에서 제공된 GAP 소프트웨어를 사용하여 측정될 수 있다. 문헌[참조: Needleman and Wunsch, J. Mol Biol., 48: 443-453 (1970)]을 참조한다.
하나 이상의 지정된 성분 또는 단계를 "포함하는"과 같이 본원에 사용된 조성물 또는 방법은, 지정된 성분 또는 단계가 필수적이지만, 다른 성분 또는 단계가 조성물 또는 방법의 범위내에 부가될 수 있다는 제한이 없는 의미를 갖는다. 장황하지 않게는, 하나 이상의 지정된 성분 또는 단계를 "포함하는" (또는 "포함한다")과 같이 기재된 임의의 조성물 또는 방법은 또한 동일한 지정된 성분 또는 단계로 "필수적으로 이루어진" (또는 "~로 필수적으로 이루어진다") 상응하는 더 제한적인 조성물 또는 방법을 기재하는 것으로 이해되고, 이는 조성물 또는 방법이 지정된 필수 성분 또는 단계를 포함하고, 또한 조성물 또는 방법의 기본적이고 신규한 특성(들)에 물질적으로 영향을 미치지 않는 부가의 성분 또는 단계를 포함할 수 있음을 의미한다. 또한, 하나 이상의 지정된 성분 또는 단계를 "포함하는" 또는 "~로 필수적으로 이루어진"과 같이 본원에 기재된 임의의 조성물 또는 방법은 또한 임의의 다른 지정되지 않은 성분 또는 단계를 제외한 지정된 성분 또는 단계로 "~로 이루어진" (또는 "~로 이루어진다") 상응하는 보다 제한적이고 한정된 조성물 또는 방법을 기재하는 것으로 이해된다. 본원에 기재된 임의의 조성물 또는 방법에서, 임의의 지정된 성분 또는 단계의 공지되거나 기재된 등가물이 그 성분 또는 단계에 대체될 수 있다.
"~로 이루어진 그룹으로부터 선택된" 성분 또는 단계는 또한 임의의 2개 이상의 열거된 성분 또는 단계의 조합을 포함하여, 후속된 열거에서 하나 이상의 성분 또는 단계를 나타내는 것으로 이해된다.
달리 제시되지 않는 한, 다른 용어의 의미는 문맥에서 확실하거나, 당해 기술분야 숙련가에게 이해되고 사용된 것과 동일하게 이해될 것이다.
당해 기술분야 숙련가는, 또한 본원에 기재된 핵산 서열(뉴클레오타이드 염기 서열)이 DNA, RNA 및 이의 상보적 서열을 제공함을 이해한다.
본 발명의 재조합 발현 벡터 요소(rEVE)는 먼저 발현 벡터 상에 존재하는 유전자로부터 예외적으로 높은 수준의 항-IL-12 항체 분자를 발현하였던 형질감염된 DUXB11 CHO 세포주의 세포에 존재하는 발현 벡터의 통합 부위의 둘중의 한쪽 위치의 게놈 DNA 플랭킹의 영역으로부터 분리되었다. DUXB11 CHO 게놈 DNA의 이들 플랭킹 영역의 클로닝 및 서열분석으로 서열번호 1 및 서열번호 2의 서열이 밝혀졌다. 서열번호 1의 2329 염기 서열을 또한 "ARM1"로 본원에 나타내고, 서열번호 2의 2422 염기 서열을 "ARM2"로 나타낸다. 플랭킹 ARM1 DNA 서열은 통합된 발현 벡터의 중쇄 유전자의 전사 방향의 상류에 위치하는 것으로 나타났고, 플랭킹 ARM2 DNA 서열은 통합된 발현 벡터의 경쇄 유전자의 전사 위치의 하류에 위치하는 것으로 나타났다(하기 실시예 단락 참조).
ARM1- 및 ARM2-함유 DNA 분자는, 이들의 존재가 발현 벡터를 함유하는 숙주 세포에서 다양한 재조합 단백질의 발현 수준에 영향을 미칠 수 있는지 여부를 측정하기 위해 단독으로 및 조합으로 발현 벡터내에 삽입되었다. ARM1- 및 ARM2-함유 DNA 둘다 이들 서열의 부재하에 수득된 생성 수준과 비교하여 숙주 세포에서 재조합 단백질의 증강된 발현 수준을 제공한다(하기 실시예 참조). 따라서, ARM1- 및 ARM2-함유 핵산 분자는 재조합 발현 벡터 요소(rEVE)의 예이다. 통상적으로, ARM1 폴리뉴클레오타이드를 사용하여 수득된 증강된 수준의 생성은 ARM2 폴리뉴클레오타이드를 사용하여 수득한 것보다 또는 ARM1과 ARM2 폴리뉴클레오타이드 조합을 사용하여 수득한 것보다 다소 더 낮다.
ARM1 및 ARM2 둘중의 하나 또는 둘다를 본 발명에 따른 목적하는 재조합 단백질의 생성을 위해 발현 벡터의 작제에 사용한 모든 예에서, 단백질의 발현 수준은 ARM1 및/또는 ARM2 발현 인핸서 요소를 사용하여 더 높았다. 어떠한 ARM 인핸서도 갖지 않은 조절 발현 시스템보다 2배 이상, 3배 이상, 4배 이상, 5배 이상, 6배 이상, 9배 이상, 10배 이상, 13배 이상, 16배 이상 및 18배 이상의 재조합 단백질 산물에 대한 증가된 비교 발현 수준이 직접적으로 관찰되었다(하기 실시예 참조). 또한, ARM1 또는 ARM2, 또는 ARM1과 ARM2 둘다를 함유하는 발현 벡터를 사용하여 수득된 높은 수준의 발현은 형질감염된 숙주 세포에서 시간에 따라 안정하게 유지된다.
ARM1 및 ARM2 서열은 매트릭스/골격 부착 영역에 대해 서열에서 상대적으로 풍부한 영역을 함유한다(MAR/SAR; 문헌 Michalowski et al., Biochemistry, 38: 12795-12804 (1999); Tikhonov et al., The Plant Cell, 12: 2490-264 (2000) 미국 특허 제7,129,062호; Bode et al., Int. Rev. Cytol, 162A: 389-454 (1995); Bode et al., Crit. Rev. Eukaryotic Gene Expression, 6: 115-138 (1996) 참조). ARM1의 경우, MAR 서열 모티프가 특히 서열의 3' 말단 영역에 집중된 반면, ARM2의 경우, MAR 모티프의 클러스터는 서열의 중간 영역에 MAR 모티프가 거의 위치하지 않으면서 서열의 5' 및 3' 말단 영역 둘다에 나타난다. 결실 분석은, ARM2 핵산의 대략 1260 염기쌍 3' 말단 영역이 ARM2 증강된 단백질 발현 활성에 결정적인 서열을 함유하는 것으로 제시하고 있다(하기 실시예 6 참조).
본 발명의 rEVE 분자는 ARM1 및 ARM2 서열의 발현 증강 부분 또는 단편을 포함하는 이들 핵산 분자를 포함한다. ARM1 및 ARM2 서열의 이러한 발현 증강 부분은, 목적하는 재조합 단백질을 암호화하는 유전자와 동일한 발현 벡터 상에 존재하는 경우 ARM1 또는 ARM2 서열의 이러한 부분 또는 단편의 부재하에 수득된 발현 수준과 비교하여 발현 벡터를 함유하는 숙주 세포에서 재조합 단백질의 발현의 수준을 증강시키는 것이다.
본원에 기재된 rEVE는 단독으로 또는 숙주 세포에서 목적하는 재조합 단백질(들)의 생성 수준을 향상시키는 임의의 다른 조절 요소 또는 발현 증강 시스템과 조합하여 사용될 수 있다. 이러한 다른 서열 및 시스템에는, 목적하는 재조합 단백질(들)을 암호화하는 유전자(들)의 전사를 조절하거나 최적화하는 조절된 프로모터의 사용, 숙주 세포로부터 재조합 단백질(들)의 분비를 지시하는 시그날 서열의 사용 및 유전자 증폭 방법, 예를 들어 디하이드로폴레이트 리덕타제 (DHFR)-메토트렉세이트(MTX) 증폭 프로토콜 또는 글루타민 신타제 프로토콜의 사용이 포함될 수 있지만 이에 제한되는 것은 아니다. DHFR-MTX 증폭 공정에서, DHFR에 대한 유전자를 포함하는 발현 벡터를 함유하는 숙주 세포는 증가하는 농도의 메토트렉세이트에 대한 내성을 위해 선택된다[참조: 예를 들어, Kaufman, RJ., In Genetic Engineering: Principles and methods (ed. J.K. Setlow), volume 9, page 155 (Plenum Publishing, New York, 1987)]. 통상적으로, 메토트렉세이트 증가에 대한 내성 수준과 같이, 이러한 증폭된 유전자(들)로부터의 재조합 단백질 발현 수준에서의 상응하는 증폭(향상)과 함께 재조합 유전자(들)의 카피수의 동반하는 증폭이 있다.
서열번호 1 및 서열번호 2의 핵산 서열은 DUXB11 CHO 세포주로부터 수득된 DNA 분자로부터 확인되었다. 임의의 다양한 방법이 서열번호 1, 서열번호 2, 또는 이들 서열 둘중 하나 부분의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 분자를 생성시키기 위해 사용될 수 있다. 이러한 방법에는, DUXB11 CHO 세포의 게놈 DNA로부터 이러한 서열을 포함하는 하나 이상의 rEVE DNA 분자를 클로닝, 이러한 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 생성시키는 고체-상 핵산 합성 프로토콜, 재조합 핵산 기술, 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 프로토콜, 자동화 핵산 합성기 및 이의 조합이 포함되지만 이에 제한되는 것은 아니다. 본원에 기재된 rEVE 폴리뉴클레오타이드 분자는 또한 맞춤 설계된 핵산 분자의 시판중인 공급사로부터 구입할 수 있다. rEVE를 생성하거나 합성하는 방법은 제한적이지 않고, 기술분야 숙련가는, 어떠한 방법 또는 방법의 조합이 본원에 기재된 특정 rEVE를 생성하기에 가장 적합한지 결정할 수 있다.
본원에 기재된 rEVE는 숙주 세포에서 발현 벡터로부터 임의의 다양한 단백질(펩타이드, 폴리펩타이드 및 올리고머 단백질 포함)의 발현을 증강시키는 발현 벡터내로 삽입될 수 있다. 만일 뉴클레오타이드 암호화 서열(들)이 핵산(DNA 또는 RNA) 분자 상에 공지되거나 이용가능한 경우, 목적하는 단백질에 대한 암호화 서열(들) 또는 전체 기능성 유전자가 당해 기술분야에 이용가능한 임의의 다양한 방법을 사용하여 발현 벡터 내로 삽입될 수 있다. 암호화 서열은, 발현이 바람직한 숙주 세포의 형태에서 작용할 프로모터와 작동가능하게 결합한다. 부가적 전사 및 해독 서열이 또한 숙주 세포에서 목적하는 단백질(들)의 적합한 발현을 위해 벡터내로 조작될 수 있다.
적합한 숙주 세포에서 발현 벡터로부터의 임의의 광대한 단백질(펩타이드, 폴리펩타이드, 올리고머 단백질 포함)의 발현은, 가용성 단백질, 막 단백질, 구조 단백질(즉, 구조를 제공하거나 세포, 조직 또는 기관을 지지하는 단백질), 리보솜 단백질, 효소, 효소원, 다양한 항체 분자(TNF-α에 대한 항체, 예를 들어 아달리무맙; 셀렉틴에 대한 항체; 면역조절 단백질에 대한 항체, 예를 들어 IL-13에 대한 항체; 이중 가변 도메인 면역글로불린 분자, 예를 들어 DVD-IGTM 이중 가변 도메인 면역글로불린 분자; 세포 표면 수용체에 대한 항체를 포함하지만 이에 제한되는 것은 아님), 세포 표면 수용체 단백질, 전사 조절 단백질, 해독 조절 단백질, 염색질 단백질, 호르몬, 세포 주기 조절 단백질, G 단백질, 신경활성 펩타이드, 면역조절 단백질(예, 인터루킨, 사이토카인, 림포카인), 혈액 성분 단백질, 이온 게이트 단백질, 열 충격 단백질, 디하이드로폴레이트 리덕타제, 항생제 내성 단백질, 임의의 전술된 단백질의 기능성 단편, 임의의 전술된 단백질의 에피토프-함유 단편 및 이의 조합을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아닌 본원에 기재된 하나 이상의 rEVE로 증강될 수 있다.
목적하는 재조합 단백질은 본원에 기재된 발현 벡터 분자 상에 존재하고 재조합 단백질을 암호화하는 유전자 또는 유전자들을 전사하고 해독함으로써 생성될 수 있다. 본원에 기재된 것을 포함한 발현 벡터 상의 유전자 또는 유전자들의 이러한 전사 및 해독은 무세포 전사/해독 시스템을 사용하거나 발현 벡터 분자 상에 존재하는 유전자 또는 유전자들로부터 목적하는 재조합 단백질을 생성하는데 필요한 적합한 세포 전사 및 해독 기구를 갖고 발현 벡터 분자를 함유하는 적합한 숙주 세포를 사용하여 수행될 수 있다.
또한 골격 부착 영역(SAR)으로 나타내는 매트릭스 부착 영역(MAR)은 진핵 핵에서 골격 또는 매트릭스를 형성하는 것으로 보이는 핵 단백질의 제제와 결합하는 염색체 DNA의 단편으로서 원래 확인되었다. MAR은 핵 매트릭스와 결합하는 염색질의 루프에 존재하고, 염색질의 개별적 구조적 단위를 정의하거나 한정하는 것으로 여겨진다. MAR은 몇몇 인핸서 서열과 관련이 있고/있거나 전사, 유전자도입 발현, 유전자도입 재배열, 재조합, 복제 및 형질감염의 안정화를 포함한 염색질내 발생할 수 있는 다수의 공정과도 연관이 있었다[참조: 예를 들어 Michalowski et al., Biochemistry, 38: 12795-12804 (1999); Zhong et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96(21): 11970-11975 (1999); Tikhonov et al., The Plant Cell, 12: 249-264 (2000); Zhou et al., Gene, 277: 139-144 (2001); Sumer et al., Genome Research, 13: 1737-1743 (2003); 미국 특허 제7,129,062호; Bode et al., Int. Rev. Cytol, 162A: 389-454 (1995); Bode et al., Crit. Rev. Eukaryotic Gene Expression, 6: 115-138 (1996)]. ARM1(서열번호 1) 및 ARM2(서열번호 2)는 다수의 MAR 요소를 보유하고, 이는 3' 및/또는 5' 말단 영역에서 클러스터로 주로 위치하는 것으로 보인다. ARM1은 3' 말단 영역에 MAR 요소의 클러스터를 함유한다. ARM2의 경우, MAR 요소는 5' 및 3' 말단 영역 둘다에 위치한 MAR 모티프 클러스터를 가지면서 이러한 rEVE 서열의 길이를 통해 발견될 수 있다. 명확하게는, ARM1 및 ARM2 서열을 함유하는 벡터 및 다른 핵산 분자는 MAR 요소 및 MAR 요소의 클러스터의 편리한 공급원이다. 따라서, ARM1, ARM2 및 MAR-함유 이의 부분은 재조합하거나 그렇지 않으면 핵산 서열 정보를 핵산 분자에 전달하기 위해서 당해 기술분야에 이용가능한 임의의 다양한 방법을 사용하여 목적하는 핵산 분자에서 다수의 MAR 요소를 증가시키기 위해 사용될 수 있다.
본원에 기재된 rEVE의 서열 또는 이의 부분을 포함하는 핵산 분자는 또한 다른 핵산 분자에서 rEVE 서열을 조작, 확인, 생성 또는 종폭시키기 위해 당해 기술분야에 공지된 다양한 공정에서 사용될 수 있다. 이러한 공정에는 당해 기술분야에 공지된 임의의 다양한 핵산 하이브리드화 방법에서 프로브로서 또는 당해 기술분야에 공지된 임의의 다양한 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 공정에서 프라이머로서 rEVE 또는 이의 부분의 사용이 포함될 수 있지만 이에 제한되는 것은 아니다.
본원에 기재된 rEVE 폴리뉴클레오타이드 분자는 목적하는 재조합 단백질을 생성시키는 방법에서 사용될 수 있다. 바람직하게는, 목적하는 재조합 단백질을 생성시키는 방법은 본원에 기재된 하나 이상의 rEVE 폴리뉴클레오타이드 분자 및 목적하는 재조합 단백질을 암호화하는 하나 이상의 재조합 유전자를 포함하고, 재조합 발현 벡터 상에 존재하는 하나 이상의 재조합 유전자를 전사하고 해독하여 목적하는 재조합 단백질을 생성하는 본원에 기재된 재조합 발현 벡터를 포함한다. 발현 벡터로부터의 하나 이상의 재조합 유전자의 전사 및 해독은 바람직하게는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포에서 수행되고, 목적하는 재조합 단백질의 발현을 촉진시키는 조건하에서 배양된다. rEVE 폴리뉴클레오타이드 분자는 일시적으로 발현되거나(예, 형질감염된 COS 또는 HEK 293 숙주 세포에서) 또는 안정하게 발현되거나(예, 형질감염된 CHO 숙주 세포에서) 숙주 세포에서 발현 벡터로부터 목적하는 하나 이상의 재조합 단백질의 발현 수준을 증강시키기 위해 사용될 수 있다. 본원에 기재된 rEVE를 함유하는 발현 벡터로부터의 하나 이상의 재조합 유전자의 전사 및 해독은 또한 당해 기술분야에 이용가능한 시험관내 무세포 전사/해독 시스템을 사용하여 수행될 수 있다.
본원에 기재된 rEVE 폴리뉴클레오타이드 분자는, 발현 수준이 DHFR-메토트렉세이트 증폭 공정을 사용하여 증폭(향상)된 경우, 향상된 수준의 재조합 단백질을 (일시적인 것과 반대되는) 안정하게 발현하는 숙주 세포를 제조하는데 사용될 수 있다. 이러한 숙주 세포는 메토트렉세이트의 존재하에 증식된 경우 뿐만 아니라 메토트렉세이트의 부재하에 증식된 경우에도, 즉, 메토트렉세이트의 존재하에 제공된 향상된 발현을 위한 선택적 압력의 부재하에 증식된 경우에도 향상된 수준의 재조합 단백질을 계속 발현하는 메토트렉세이트-내성(MTX-내성) 세포이다. 바람직한 양태에서, 메토트렉세이트-내성 숙주 세포를 생성시키는 이러한 방법은:
목적하는 재조합 단백질을 암호화하는 재조합 유전자,
rEVE 또는 발현을 증강시키는 이의 부분 및
디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 유전자
를 포함하는 발현 벡터를 숙주 세포내로 삽입하는 단계,
목적하는 재조합 단백질을 발현하는 메토트렉세이트-내성 숙주 세포를 선택하기 위해 메토트렉세이트의 존재하에 숙주 세포를 증식시키는 단계, 및
메토트렉세이트-내성 숙주 세포를 분리하는 단계를 포함하고, 이때, 분리된 메토트렉세이트-내성 숙주 세포는 메토트렉세이트-민감성 숙주 세포에서보다 더 높은 수준으로 목적하는 재조합 단백질을 발현하고, 메토트렉세이트-내성 숙주 세포는 메토트렉세이트의 존재 또는 부재하에 증식되는 경우 향상된 수준의 재조합 단백질을 안정하게 발현한다. 바람직하게는, rEVE는 서열번호 1, 서열번호 2 또는 발현을 증강시키는 이의 부분을 포함한다. 보다 바람직하게는, rEVE는 서열번호 2를 포함한다.
본원에 기재된 rEVE 폴리뉴클레오타이드 분자는 또한 재조합 단백질을 발현하는 숙주 세포 집단의 메토트렉세이트의 존재하에서 증식의 적응 능력을 향상시키기 위한 방법에 사용될 수 있다. 바람직한 양태에서, 이러한 방법은:
목적하는 단백질을 암호화하는 재조합 유전자,
서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 1의 부분, 서열번호 2의 부분 및 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터 요소(rEVE) 폴리뉴클레오타이드 분자, 및
디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 유전자
를 포함하는 발현 벡터를 숙주 세포내로 삽입하는 단계를 포함하고, 이때, 발현 벡터를 함유하는 숙주 세포의 집단은 상기 rEVE 폴리뉴클레오타이드 분자가 결핍된 발현 벡터를 함유하는 숙주 세포의 집단과 비교하여 메토트렉세이트의 존재하에 증식되는 경우 더 높은 생존력 및/또는 더 높은 증식률을 갖는다.
본원에 기재된 rEVE 폴리뉴클레오타이드 분자는 또한 DHFR-메토트렉세이트 증폭 공정을 사용하여 숙주 세포에서 재조합 단백질 발현의 증폭(향상)을 증강시키기 위해 사용될 수 있다. 바람직한 양태에서, 이러한 방법은:
목적하는 재조합 단백질을 암호화하는 재조합 유전자,
서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 1의 부분, 서열번호 2의 부분 및 이의 조합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열을 포함하는 rEVE 폴리뉴클레오타이드 분자, 및
디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 유전자
를 포함하는 발현 벡터를 숙주 세포내로 삽입하는 단계,
목적하는 재조합 단백질을 발현하는 메토트렉세이트-내성 숙주 세포 선택을 위해 메토트렉세이트의 존재하에 숙주 세포를 증식시키는 단계, 및
메토트렉세이트-내성 숙주 세포를 분리하는 단계를 포함하고, 이때, 분리된 메토트렉세이트-내성 숙주 세포는, 상기 rEVE 폴리뉴클레오타이드 분자가 결여된 발현 벡터를 함유하는 메토트렉세이트-내성 숙주 세포에서보다 더 높은 수준으로 메토트렉세이트의 존재하에 목적하는 재조합 단백질을 발현한다.
목적하는 재조합 단백질(들)의 증폭된 발현을 위해 메토트렉세이트 선택을 사용한 본원에 기재된 방법에서, 메토트렉세이트는 20nM 내지 500nM의 범위로 사용될 수 있다. 그러나, 유리하게는 당해 기술분야 숙련가는, 더 낮고 더 높은 메토트렉세이트의 농도, 예를 들어 5nM 내지 10μM이 또한 발현을 증폭시키기 위해 메토트렉세이트 선택에서 성공적으로 사용될 수 있음을 인지한다[참조: 예를 들어 Kaufman, R.J., Methods in Enzymology. Vol. 185: 537-566 (1990)].
본 발명은 또한 발현 벡터로부터 재조합 단백질의 발현을 저하, 실질적으로 억제 또는 필수적으로 사일런싱하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은, 전장 rEVE 서열을 사용하여 제공된 것보다 더 낮은 수준의 특정 재조합 유전자 산물의 발현을 제공하는 본원에 기재된 rEVE 서열의 하나 이상의 단편을 포함하는 발현 벡터를 사용할 수 있다. 이러한 발현-저하 또는 발현-억제 rEVE-유도된 서열은 서열번호 2의 염기 1-1086 또는 서열번호 2의 염기 1-461의 염기 서열을 갖는 ARM2 서열의 절두된 변이체를 포함한다. 명확하게는, 이들 2개의 변이체로부터 결실된 3' 말단 서열 영역의 존재는 재조합 단백질의 rEVE-매개된 증강된 발현에 상당히 바람직하다. 서열번호 2의 염기 1-461의 ARM2 절두된 서열을 갖는 핵산 분자는 숙주 세포에서 발현 벡터 분자로부터 재조합 단백질의 발현을 억제하거나 실질적으로 사일런싱하는데 특히 유용하다. 이러한 방법은, 재조합 단백질의 발현이 숙주 세포에 독성일 수 있는 것과 관계가 있는 경우나, 어느 정도 수준의 발현이 목적하는 단백질의 정제 또는 분리에 대한 문제점, 예를 들어 단백질 응집이 존재할 수 있는 경우를 포함하지만 이에 제한되는 것은 아닌 다수의 상황에서 사용을 찾을 수 있다.
따라서, 서열번호 2의 염기 462-2422 서열 및 서열번호 2의 염기 1087-2422의 서열이 재조합 단백질 발현의 최대 ARM2 rEVE-매개된 증강을 위해 가장 바람직하다. 따라서, 재조합 단백질의 발현을 증강시키는데 특히 유용한 rEVE 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 2의 염기 462-2422의 서열 및/또는 서열번호 2의 염기 1087-2422의 서열을 포함한다.
본 발명의 부가의 양태 및 특성은 하기 비-제한적 실시예로부터 명확해질 것이다.
실시예
실시예 1. ARM1 및 ARM2 재조합 발현 벡터 요소(rEVE)의 클로닝 및 서열 분석.
안정하게 통합된 발현 벡터를 함유하는 생산 DUX B11 CHO 세포주를, 숙주 CHO 세포를 형질감염시키는데 사용한 발현 벡터 상에 암호화된 재조합 항-IL-12 항체의 예외적으로 높은 수준의 발현에 대한 가능한 근거를 결정하기 위해 연구하였다. 연구에서, 통합된 발현 벡터를 플랭킹하는 게놈 DNA의 영역을 클로닝하고 서열분석하였다. 간략히 설명하면, 숙주 세포로부터의 게놈 DNA를 XbaI로 분해하고, 대략 5kb의 평균 크기의 단편을 문헌[참조: Reynaud et al. J. Mol. Biol., 140: 481-504 (1980)]에 기재된 BioGel A-50 칼럼을 기본적으로 사용하여 정제하였다. 정제된 게놈 단편의 라이브러리를 람다(λ) DASH® 클로닝 벡터(Stratagene사, La Jolla, California)내로 단편을 클로닝함으로써 제조하였다. 라이브러리를 증폭시키고 GIGAPACK® 패키징 추출물(Stratagene사)을 사용하여 패키징하며, 제조사의 프로토콜에 따라서 XL1-블루 MRA 또는 XL1-블루 MRA(P2) 에스케리키아 콜라이 세포내로 형질도입시켰다. 이어서, 라이브러리를 Stratagene사 프로토콜에 따라서 항-IL-12 항체의 중쇄 가변 영역(VH)의 암호화 서열을 위해 프로브를 사용하여 스크리닝하였다. λDASH 클론#21에서 14.5kb Xbal 단편은 플랭킹 게놈 서열과 함께 항체 발현 벡터를 위한 삽입 부위를 함유하였다. 이들 플랭킹 게놈 영역을 ARM1 및 ARM2로 명명하였다. ARM1 및 ARM2 영역의 서열은 각각 서열번호 1 및 서열번호 2의 서열인 것으로 측정되었다. CHO 세포 게놈에서 항체 발현 벡터의 삽입 부위에 있어서, ARM1은 삽입 부위의 상류 및 항체 중쇄에 있어서 벡터 유전자의 전사 방향의 5'에 위치하며, ARM2는 삽입 부위의 하류 및 항체 경쇄에 있어서 벡터 유전자의 전사 방향의 3'에 위치한다.
CHO 발현된 서열 태그(EST) 데이터 염기에 대한 서열번호 1 및 서열번호 2의 BLAST 분석은 어떠한 관련 암호화 서열을 밝히는데 실패하였고, 이는, ARM1 및 ARM2 rEVE 서열이 어떠한 CHO 암호화 서열도 함유하지 않음을 제시하는 것이다. rEVE 서열의 BLAST 분석은 또한 마우스 게놈 서열에 대해 수행되었다. 어떠한 마우스 게놈 서열도, ARM1 서열과 상동인 것으로 확인되지 않았다. 그러나, ARM2 서열은 어떠한 공지된 암호화 서열을 함유하지 않는 마우스 염색체 14 상에 고도로 보존적인 영역과 관련 있는 것으로 보인다.
벡터 NTI 서열 분석 프로그램(Invitrogen사)을 사용하여, ARM1(서열번호 1) 및 ARM2(서열번호 2)의 서열을 또한 매트릭스 부착 영역(MAR) 요소에 대한 다양한 대표적인(즉, 모두는 아님) 뉴클레오타이드 서열 모티프의 샘플링의 존재에 대해 또한 스크리닝하였다[참조: 예를 들어 Michalowski et al., Biochemistry, 38: 12795-12804 (1999)]. 컴퓨터 프로그램에 의해 스크리닝된 구체적 MAR DNA 서열 모티프는 표 1에 제시되어 있다(상보적 쇄 서열은 열거되지 않음).
대표적인 매트릭스 부착 영역(MAR) 요소에 대한 뉴클레오타이드 서열 모티프
MAR 요소 스크리닝된 MAR 서열 모티프*
A-Box
Figure pat00003
(서열번호 3) (2개의 미스매치 허용됨)
T-Box
Figure pat00004
(서열번호 4) (1개의 미스매치 허용됨)
MRS
Figure pat00005
(서열번호 5) (2개의 미스매치가 허용되지만, 3' 말단이 G임) 또는
Figure pat00006
(서열번호 5의 염기 1 내지 7) (MRS의 제1 부분, 미스매치 없음) +
Figure pat00007
(서열번호 5의 염기 10-21) (MRS의 제2 부분, 1개의 미스매치가 허용되지만, 3' 말단이 G임), 여기서 제1 및 제2 MRS 부분은 최대 4개의 개재 염기 (N1 -4) 또는 최대 3개의 오버래핑 염기가 존재함
ARS
Figure pat00008
(서열번호 6) (1개의 미스매치 허용됨)
BUR
Figure pat00009
(서열번호 7) (1개의 미스매치 허용됨)
Curved
Figure pat00010
(서열번호 8) 또는
Figure pat00011
(서열번호 9)
90%AT W20 (서열번호 10) (2개의 미스매치 허용됨)
Kinked
Figure pat00012
(서열번호 11) 또는
Figure pat00013
(서열번호 12) 또는
Figure pat00014
(서열번호 13) 또는
Figure pat00015
(서열번호 14) (미스매치 허용되지 않음)
토포이소머라제 II
결합 부위
Figure pat00016
(서열번호 15) (2개의 미스매치가 허용되지만, 위치 4 내지 9에서는 허용되지 않음, 즉 WAYATT (서열번호 15의 염기 4 내지 9)가 보존됨)
TG-Rich
Figure pat00017
(서열번호 16)
DNA 풀림(Unwinding) 모티프
Figure pat00018
(서열번호 17) 또는
Figure pat00019
(서열번호 18)
* 상보적 쇄 서열은 열거되지 않음; 약어: Y = T 또는 C; W = A 또는 T; N = A, T, G 또는 C; R = G 또는 A
표 2에 제시된 바와 같이, 41개 이상의 MAR 요소 서열이 ARM1 DNA 서열(서열번호 1) 또는 이의 상보적 쇄 서열에서 확인되었고, 114개 이상 MAR 요소 서열이 ARM2 DNA 서열(서열번호 2) 또는 이의 상보적 쇄 서열에서 확인되었다.
Figure pat00020
Figure pat00021
*ARM1 서열(서열번호 1) 또는 ARM2 서열(서열번호 2); "상보적" = 상보적 쇄 서열; "클러스터" = 구체화된 서열에서 지시된 MAR 요소의 하나 초과의 카피
표 2의 ARM1 및 ARM2의 (상보적 쇄 분석 포함한) MAR 서열 분석의 결과는, 다양한 MAR이 ARM1(서열번호 1)의 3' 말단 부분 및 ARM2(서열번호 2)의 5' 부분 및 3' 부분 둘다에 주로 클러스터됨을 제시한다. ARM1은 ARM2 보다 더 적은 이들 MAR 부위를 갖는다. 그러나, ARM1에서 다수의 MAR 서열은 서열의 3' 영역인 반면, ARM2의 5' 및 3' 영역 둘다 MAR 서열로 차지된다.
실시예 2. 재조합 단백질 발현 수준에 미치는 ARM1 및 ARM2 rEVE 영향의 연구를 위한 일반적 프로토콜
발현 연구를 위한 세포
DUXB11 CHO 세포주는 디하이드로폴레이트 리덕타제의 발현이 결핍된(DHFR-) CHO 세포주이다[참조: Urlaub, G. and Chasin, L. A., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 77: 4216-4220 (1980)]. 이러한 세포주의 DHFR- 표현형은 이들 세포내로 형질감염되었던 발현 벡터의 카피수를 종폭시키기 위한 표준 디하이드로폴레이트 리덕타제-메토트렉세이트 시스템(DHFR-MTX) 프로토콜의 사용을 허용한다[참조: 예를 들어 Kaufman, R.J., In Genetic Engineering: Principles and Methods (ed. J.K. Setlow), volume 9, page 155 (Plenum Publishing, New York, 1987)].
ARM1 및 ARM2 rEVE 서열을 함유하는 발현 벡터
도 1은 플라스미드 발현 벡터 pA205의 도식을 제공한다. 도 2는, ARM1 서열이 아달리무맙의 중쇄에 대한 유전자의 상류에 위치하고, ARM2 서열이 아달리무맙의 경쇄에 대한 유전자의 하류에 위치하도록 아달리무맙에 대한 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자가 ARM1 및 ARM2에 의해 플랭킹된 플라스미드 발현 벡터 pA205Genomic의 도식을 제공한다. 도 3은, ARM1 서열이 아달리무맙의 중쇄에 대한 유전자의 상류에 위치하는 플라스미드 발현 벡터 pA205A1의 도식을 제공한다. 도 4는, ARM2 서열이 아달리무맙의 경쇄에 대한 유전자의 하류에 위치하는 플라스미드 발현 벡터 pA205A2의 도식을 제공한다.
도 5는 사람 항-EL-셀렉틴 항체의 중쇄 및 경쇄에 대한 유전자를 함유하는 플라스미드 발현 벡터 pCHOEL246GGhum의 도식을 제공한다. 도 6은, ARM1 서열이 항체 중쇄에 대한 유전자의 상류에 위치하고, ARM2 서열이 항체 경쇄에 대한 유전자의 하류에 위치하도록 항-EL-셀렉틴 항체에 대한 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 유전자가 ARM1 및 ARM2 서열에 의해 플랭킹된 플라스미드 발현 벡터 pA-Gen-EL-셀렉틴의 도식을 제공한다.
도 7은 증강된 녹색 형광 단백질(eGFP)에 대한 유전자를 함유하는 플라스미드 발현 벡터 pA205-eGFP의 도식을 제공한다. 도 8은, ARM1 서열이 eGFP에 대한 유전자의 상류에 위치하고, ARM2 서열이 eGFP 유전자의 하류에 위치하도록 증강된 녹색 형광 단백질을 암호화하는 유전자가 ARM1 및 ARM2 서열에 의해 플랭킹된 플라스미드 발현 벡터 pA205G-eGFP의 도식을 제공한다.
도 9는, ARM2 서열이 절두된 ARM2 변이체 "A2(bp 1-1086)"로 대체된 것을 제외하고는 도 4에 제시된 발현 벡터 pA205A2와 필수적으로 동일하고, 제한 엔도뉴클레아제 SpeI로 ARM2 DNA를 분해한 결과로 서열번호 2의 염기 1-1086의 핵산 염기 서열을 갖는 플라스미드 발현 벡터 pA205A2-Spe-trunc의 도식을 제공한다. 도 10은, ARM2 서열이 절두된 ARM2 변이체 "A2(bp 1-461)"로 대체된 것을 제외하고는 도 4에 제시된 발현 벡터 pA205A2와 필수적으로 동일하고, 제한 엔도뉴클레아제 Swa1로 ARM2 DNA를 분해한 결과로 서열번호 2의 염기 1-461의 핵산 염기 서열을 갖는 플라스미드 발현 벡터 pA205A2-Swa-trunc의 도식을 제공한다.
배양 배지
αMEM은 최소 필수 배지인 α 배지(GIBCO®, Invitrogen사, Carlsbad, California)이다.
세포의 증식 및 형질감염
형질감염 당 3개의 10cm 조직 배양 플레이트에 5% 투석된 FBS 및 H/T(GIBCO)로 보충된 10ml의 αMEM 중의 각각의 1x106 B3.2 모 DUXB11 CHO 세포를 접종하였다. 이들 세포는 하기 제시된 수개의 변형과 함께 문헌[참조: Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F.V., Brent, R., Moore, D.M., Kingston, R.E., Seidman, J.G., Smith, J.A., and K. Struhl eds, (Wiley Interscience, New York, 1990)]에 기재된 인산칼슘 형질감염 프로토콜에 따라서 18시간 후 형질감염되었다. 증식 배지를 흡입에 의해 배양 플레이트로부터 제거하고, 9ml의 Ham's F12 배지(Invitrogen사)를 각각의 플레이트에 부가하였다. 플레이트를 형질감염 전 2시간 동안 37℃에서 항온처리하였다.
인산칼슘 형질감염 프로토콜
75μg의 DNA를 50ml의 원뿔 튜브내 1.35ml 물 중에 용해시켰다. 150μl의 2.5M CaCl2를 부가하고, 이러한 DNA-칼슘 혼합물을 50ml의 원뿔 튜브내 1.5ml의 2X HeBES(HEPES 완충된 염수)에 적가하였다. HeBES를 파스퇴르 피펫을 사용하여 DNA-칼슘 혼합물을 부가하면서 피펫터로 버블링하였다. 혼합물을 5초 동안 볼텍스로 혼합하고, 실온에서 20분 동안 항온처리하였다. 1ml의 DNA-칼슘 혼합물을 상기 기재된 F12 배지 중에 형질감염을 위해 증식되고 제조된 부착 세포의 각각의 배양 접시 위에 고르게 뿌린 후, 배양물을 4시간 동안 37℃에서 항온처리하였다. 항온처리 후, 플레이트를 흡인시키고, F12 배지 내 2ml의 10% 디메틸설폭시드(DMSO)를 각각의 플레이트에 부가하였다(DMSO 쇼크 처리). DMSO 쇼크를 1분 동안 계속한 후, DMSO를 각각의 플레이트에 5ml의 PBS(인산염 완충화된 염수)를 부가함으로써 희석시켰다. 플레이트를 흡인시키고, PBS 중에 2회 이상 세척하였다. 10ml의 αMEM/5% FBS/HT를 부가하고, 플레이트를 37℃에서 밤새 항온처리하였다.
형질감염된 세포의 96-웰 플레이트내로의 접종 및 메토트렉세이트 ( MTX ) 증폭
다음날, 세포를 다음과 같이 96-웰 플레이트에 접종하였다: 모든 10cm의 플레이트로부터 세포를 트립신 분해에 의해 수거하고, αMEM/5%FBS 중에 2000세포/ml의 밀도로 재현탁시켰다. 96-웰 플레이트는 10ml/플레이트, 100μl/웰로 접종되었다. 배지를 1주 후, 2주 후 및 다시 5일 후 96-웰 플레이트 상에 교환하였다. 사용된 배지 αMEM/5%FBS는 DHFR을 발현하는 세포에 대해 선택적이었다.
마지막 배지 교환 2일 후, 배양 상청액을 1:40으로 희석하고, 아달리무맙 또는 항-EL-셀렉틴 항체의 발현을 검출하기 위해 사람 IgG 감마 쇄에 특이적인 ELISA를 사용하여 시험하였다. 가장 높은 ELISA 시그날을 제공한 클론을 96-웰 플레이트로부터 2.0ml/웰의 αMEM/5%FBS 중의 12-웰 플레이트 내로 옮겼다. (대략 2-5일 후) 융합된 경우, 이들을 다시 분석하고, 클론을 증폭을 위해 동일한 배지 + 20nM MTX내로 나누었다. 세포를 12웰 조직 배양 플레이트에서 αMEM/5%FBS 및 20nM MTX 중에 초기에 선택하였다. 초기 선택 후, 이들 세포를 18일 평균 기간에 걸쳐 20nM MTX를 함유하는 증식 배지 중에 최소 2회 이상 계대시켰다. 이어서, 세포주를 100nM MTX에 증폭시켰다. 이러한 배양 기간 동안, 배양물의 아달리무맙(사람 항-TNF-α 항체) 또는 항-EL-셀렉틴 생성률은 증가하였다. 100nM MTX 수준에서 선택 후, 세포주를 평균 18일 기간에 걸쳐 100nM MTX를 함유하는 증식 배지 중에 최소 2회 이상 계대시켰다. 징조가 나타난 경우, 세포주를 추가로 500nM MTX에 증폭시켰다. 500nM MTX 수준에서 선택 후, 세포주를 평균 18일 기간에 걸쳐 500nM MTX를 함유하는 증식 배지 중에 최소 2회 이상 계대시켰다.
ARM1 핵산 서열(서열번호 1), ARM2 핵산 서열(서열번호 2) 또는 ARM1과 ARM2 서열의 조합을 포함하는 발현 벡터를 함유하는 형질감염된 CHO 세포의 배양물은, 이들 rEVE 서열이 결핍된 동일한 발현 벡터로 형질감염된 CHO 세포와 비교하여 더 우수하게 적응하고, 즉, 메토트렉세이트의 존재하에 보다 높은 생존율 및/또는 더 높은 증식률을 갖는다.
실시예 3. 형질감염된 CHO 세포에서 항-TNF-α의 발현 수준에 미치는 ARM1 및 ARM2 서열의 효과.
본 연구에서, 안정적으로 형질감염된 CHO 세포에서 사람 항-TNF-α 항체(아달리무맙)의 발현에 미치는 ARM1 및 ARM2 서열의 효과를 연구하였다. 아달리무맙의 발현 수준을 발현 벡터 pA205(ARM 서열 없음), pA205Genomic(ARM1과 ARM2 둘다 함유), pA205A1(ARM1 함유) 또는 pA205A2(ARM2 함유)로 안정하게 형질감염된 CHO 세포에서 비교하였다. 표 3은 제시된 증폭 수준(메토트렉세이트, "MTX"의 농도)에서 각각의 벡터 형질감염으로부터의 최고 3개의 생성 클론의 부착 배양물에서 아달리무맙의 평균 생성 수준을 나타낸다.
Figure pat00022
표 3의 데이터는, ARM1 및 ARM2 서열이 단독으로 또는 조합하여, ARM 서열이 결핍된 벡터(pA205)로 형질감염된 세포에서 보여지는 것과 비교하여 아달리무맙의 발현 수준을 증강시켰음을 제시하고 있다. 전반적으로, ARM2 단독(p205 A2)은 모든 다른 형질감염체와 비교하여 가장 높은 증강된 발현 수준을 제공한 반면, ARM1 단독(p205A1)은 가장 낮은 증강된 발현 수준을 제공하였다. 데이터는, ARM1 서열(서열번호 1) 또는 ARM2 서열(서열번호 2)을 갖는 분리된 핵산 분자가 대표적인 재조합 발현 벡터 요소(rEVE)이고, 이는 발현 벡터내로 삽입되는 경우, 발현 벡터에 의해 암호화되고 발현 벡터로부터 발현된 재조합 단백질의 발현을 증강시킬 수 있음을 보여준다.
상기 언급된 벡터 형질감염의 개별적 클론에 의한 아달리무맙의 발현 수준을 또한 메토트렉세이트 증폭의 부재하에 현탁 배양물에서 1주 후 및 4주 후 비교하였다. 결과를 표 4에 제시하고 있다.
Figure pat00023
표 4의 데이터는, ARM2를 ARM1 없이 pA205내로 혼입한 것(pA205A2)은 시간에 따라 증강된 아달리무맙 발현 수준의 안정성을 증가시킴을 보여준다. 특히, ARM1과 ARM2 둘다 존재(pA205Genomic) 또는 ARM1 단독(pA205A1)의 경우, 아달리무맙의 증강된 발현 수준은 배양물에서 초기에 관찰되었지만, 그 수준은 대략 수 주에 걸쳐 훨씬 더 낮은 수준으로 빠르게 떨어질 수 있었다(표 4 참조). 대조적으로, ARM2 단독(pA205A2)의 존재하에 아달리무맙을 발현하는 세포 배양물에서, 아달리무맙의 증강된 발현 수준은 4주 기간의 과정에 걸쳐 4개의 배양물 중 3개에서 안정하게 유지되었다. 따라서, ARM2는 형질감염된 CHO 세포의 현탁 배양물에서 아달리무맙의 발현 수준에서 상당한 향상을 안정하게 유지할 수 있다.
실시예 4. 형질감염된 CHO 세포에서 항-EL-셀렉틴 항체의 발현 수준에 미치는 ARM1 및 ARM2 서열의 효과.
본 연구에서, 안정하게 형질감염된 CHO 세포에서 항-EL-셀렉틴 항체(E- 및 L-셀렉틴과 결합함)의 발현에 미치는 ARM1 및 ARM2 서열의 효과를 연구하였다. 항-셀렉틴 항체의 발현 수준을 발현 벡터 pCHOEL246GGhum(ARM 서열 없음) 또는 발현 벡터 pA-Gen-EL-셀렉틴(ARM1과 ARM2 둘다 함유)으로 안정하게 형질감염된 CHO 세포에서 비교하였다. 표 5는 제시된 증폭 수준(메토트렉세이트, "MTX"의 농도)에서 각각의 벡터 형질감염으로부터 클론을 생성하는 최고 3개의 부착 배양물에서 항-셀렉틴 항체의 평균 생성 수준을 나타내는 것이다.
Figure pat00024
표 5의 데이터는, ARM1 및 ARM2 서열(pAGen-EL-셀렉틴)이 안정하게 형질감염된 CHO 세포의 메토트렉세이트-증폭된 배양물에서 항-EL-셀렉틴 항체의 발현 수준을 향상시키는데 효과적이었음을 보여준다.
실시예 5. 형질감염된 CHO 세포에서 증강된 녹색 형광 단백질(eGFP)의 발현 수준에 미치는 ARM1 및 ARM2 서열의 효과.
증강된 녹색 형광 단백질(eGFP)을 암호화하는 유전자를 함유하는 작제물을, 세포를 안정한 형질감염체에 대한 선택성 마커, 즉 하이그로마이신 내성을 제공하기 위해 pcDNA3.1-하이그로로 동시-형질감염시킨 것을 제외하고는 상기 기재된 것과 같이 CHO 세포내로 형질감염시켰다. 발현 벡터 peGFP는 CMV 프로모터의 전사 조절하에 eGFP의 발현에 대한 포지티브 조절을 제공한다. 플라스미드 pA205-eGFP는 ARM1 또는 ARM2 서열없이 pA205 발현 벡터 상에 eGFP 유전자를 함유한다(도 7). 플라스미드 pA205Gen-eGFP(도 8)는 eGFP를 암호화하는 유전자를 플랭킹하는 ARM1과 ARM2 둘다를 함유한다. 이들 플라스미드 둘다에 어떠한 DHFR 선택 유전자도 없다. 따라서, 어떠한 DHFR-메토트렉세이트 증폭 단계도 선택되지 않았다. 형질감염체를 2주 동안 400μg/ml의 농도로 하이그로마이신을 사용하여 선택하였고, 필요한 경우 나눈 후, 발현 수준을 측정하기 위해 FACS로 분류하였다. 세포를 원래 각각의 유형의 벡터에 대한 풀내로 분류하고, 발현하는 세포를 2주 더 증식시킨 후, 다시 분류하였다.
Figure pat00025
표 6의 데이터는, ARM1 및 ARM2 서열이 ARM 서열이 결핍된 것을 제외하고는 동일한 eGFP 발현 벡터(pA205-eGFP)로 형질감염된 세포에서 발현 수준과 비교하여 형질감염된 CHO 세포에서 eGFP의 발현 수준을 상당히 증강시키는데 효과적이었다.
실시예 6: 형질감염된 CHO 세포에서 아달리무맙의 발현 수준에 미치는 ARM2의 결실 돌연변이체의 효과.
ARM2 서열(서열번호 2)의 3' 말단 영역을 pA205A2 벡터에서 SpeI 절단 부위(서열번호 2의 염기 1086) 또는 SwaI 절단 부위(서열번호 2의 염기 461)에 대해 절두하여 각각 pA205A2-Spe-trunc(서열번호 2의 염기 1-1086 서열 함유) 및 pA205A2-Swa-trunc(서열번호 2의 염기 1-461의 서열 함유)을 생성시켰다. 수득한 플라스미드를 상기 기재된 CHO 세포 내로 형질감염시켰고, 20nM MTX로 증폭시켰다. 표 7은 각각의 증폭 수준에서 각각의 형질감염으로부터 클론을 생성하는 최고 3개의 부착 배양물에서 평균 발현 수준을 나타내는 것이다.
Figure pat00026
표 7의 데이터는, ARM2 DNA의 5' 말단 1086 염기 쌍을 함유하는 발현 벡터 pA205A2-Spe-trunc로 형질감염된 CHO 세포가 pA205A2 벡터로 형질감염된 CHO 세포와 비교하여 더 낮은 증강된 발현 수준으로 아달리무맙을 생성하였음을 보여준다. 놀랍게도, ARM2 DNA의 5' 말단 461 염기 쌍을 함유하는 발현 벡터 pA205A2-Swa-trunc로 형질감염된 세포는 어떠한 ARM 서열도 함유하지 않는 pA205로 형질감염된 세포보다 훨씬 더 낮은 발현 수준으로 아달리무맙을 생성하였다. 표 7의 데이터는, ARM2 DNA의 3' 말단으로부터 결실된 영역이 숙주 세포에서 재조합 단백질의 증강된 발현에 특히 중요함을 나타낸다. 또한, 상대적으로 적은 존재, 즉, ARM2 DNA의 5' 말단 단편의 461 염기 쌍은 단독으로 실제로 형질감염된 숙주 세포에서 재조합 유전자 산물의 발현을 감소시키는 것으로 보여지고, 재조합 유전자 산물의 발현을 실질적으로 낮추거나 사일런싱하는데 특히 유용할 수 있다. 이러한 적용은, 유전자 산물의 발현이 예를 들어 특정 배양 조건하에서 숙주 세포에서 독성이거나 그렇지 않으면 바람직하지 않을 경우 바람직할 수 있다.
실시예 7. 상기 연구로부터 개별적 형질감염체의 발현 수준.
하기 제시된 표는 상기 연구에서 생성된 개별적 형질감염된 클론에 의해 생성된 재조합 단백질의 발현 수준을 제공한다.
Figure pat00027
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Figure pat00037
Figure pat00038
실시예 8. 항-IL-13 항체의 발현 증강.
본 연구는 rEVE 결핍 발현으로 형질감염된 세포와 비교하여 배양물내 안정하게 형질감염된 포유동물 세포에서 사람화된 항-IL-13 항체 발현의 rEVE-매개된 증강을 나타낸다.
사람 IgGγ1 동형을 갖는 사람화된 항-IL-13 모노클로날 항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 DNA 분자를(본원에 참조로 인용된 미국 제11/899,819호 참조) 표준 방법을 사용하여 DHFR-MTX 증폭성 발현 플라스미드인 발현 벡터 플라스미드 pBJ 내로 삽입시키고 발현 플라스미드 pBJ-13C5.5(모 발현 플라스미드)를 수득하였다. 이어서, ARM2 서열(서열번호 2)을 포함하는 rEVE 폴리뉴클레오타이드를 플라스미드 pBJ-13C5.5에 삽입하여 rEVE-함유 발현 플라스미드 pA2-13C5.5(ARM2 rEVE 발현 플라스미드)를 수득하였다.
CHO 세포를 상기 실시예에 기재된 일반적 형질감염 프로토콜에 따라서 모 발현 플라스미드 pBJ-13C5.5 또는 ARM2-함유 rEVE 발현 플라스미드 pA2-13C5.5로 형질감염시켜 안정한 형질감염체 CHO 세포를 수득하였다. 형질감염 24시간 후, 각각의 형질감염으로부터의 세포를 48개의 96웰 배양 플레이트(200세포/웰) 내로 접종하였다. 각각의 웰의 배양 배지를 사람 IgG의 발현에 대해 ELISA로 스크리닝하였다. 광학 밀도는 모 발현 플라스미드로 형질감염된 세포에서 보다 ARM2 rEVE 발현 플라스미드로 형질감염된 세포의 배양물(웰)에서 경미하게 더 높았다. 모 플라스미드 pBJ-13C5.5로 형질감염된 세포의 경우 플레이트마다 평균 68개 콜로니인 것과 비교하여 ARM2 rEVE 플라스미드 pA2-13C5.5로 형질감염된 세포의 경우 배양 플레이트마다 평균 74개 콜로니(웰)가 선택 공정에서 생존하였다. 이어서, 각각의 형질감염으로부터 15개의 안정하게 형질감염된 콜로니를 DHFR-메토트렉세이트(MTX) 증폭시켰다.
증폭 전, ARM2 rEVE 플라스미드 형질감염체 콜로니로부터 수득된 항-IL-13 항체의 평균 발현 수준은 모 플라스미드 형질감염체 클론으로부터의 평균 발현 수준보다 2배 더 높았다. 이어서, 항체 발현을 2개의 프로토콜 중 하나로 증폭시켰다. 상기 실시예 2에 기재된 DHFR-MTX 증폭에 대한 기본적 프로토콜을 사용하여, 클론을 먼저 20nM MTX의 농도에서 선택한 후, 100nM MTX에서 추가로 선택하였다. 또 다른 증폭 프로토콜에서, 클론을 중간 MTX 농도에서 선택하지 않으면서 100nM MTX에서 직접 선택하였다. 하기 표 16은, 제시된 증폭 수준(메토트렉세이트, "MTX"의 농도)을 함유하는 배지에서 2회 계대 후 각각의 형질감염으로부터 상위 3개의 생성 클론의 배양물에서 항-IL-13 항체의 평균 생성 수준을 나타내는 것이다.
Figure pat00039
표 16의 데이터는, ARM2 rEVE는 ARM2 rEVE DNA 결핍 모 발현 플라스미드를 함유하는 형질감염체로부터 수득한 발현 수준과 비교하여 대략 3배 내지 5배까지 사람화된 항-IL-13 항체의 발현 수준을 증강시킨 것으로 명확하게 제시하고 있다. 또한, ARM2 rEVE 발현 플라스미드 형질감염체의 하나의 서브클론은 100nM MTX의 증폭 수준에서 증식되는 경우 사람화된 항-IL-13 항체를 높은 95㎍/ml의 수준으로 및 21.74pg/세포/1일의 비생산성(specific productivity)으로 발현하였다.
ARM2 rEVE 발현 플라스미드로 형질감염된 클론에 의해 증폭된 항-IL-13 항체의 발현 수준은 MTX 선택하에 증식되는 경우 3주 이상 동안 용이하게 유지되었다.
실시예 9. 일시적 발현 시스템에서 아달리무맙의 발현에 미치는 ARM1 및 ARM2 rEVE 폴리뉴클레오타이드 분자의 효과.
본 연구는, rEVE 폴리뉴클레오타이드 분자가 일시적 발현 시스템에서 재조합 단백질의 발현 수준을 증강시킬지 여부를 측정하기 위해 계획되었다.
HEK 293 세포를 발현 플라스미드 벡터 pA205, pA205Genomic, pA205A1, pA205A2, pA205A2-Spec-trunc 및 pA205A2-Swa-trunc로 형질감염시켰다. Freestyle 293 발현 배지(GIBCO®, Invitrogen사, Carlsbad, CA)에서 배양시킨 HEK293 세포를 공개된 조건에 따라서 폴리에틸렌이민과 복합체를 이룬 플라스미드 DNA로 형질감염시켰다[참조: Durocher et al., Nucleic Acids Res., 30: E9]. 벡터 통합에 대한 어떠한 선택도 수행되지 않았다. 세포를 형질감염 후 7일 동안 배양하고, 배양 상청액의 분취량을 상기 기재된 아달리무맙 농도에 대해 시험하였다. 3개의 형질감염의 결과를 표 17에 제시하고 있다. 발현 수준은 제3 형질감염의 경우 3회 측정하였다.
Figure pat00040
표 17의 결과는, ARM1 및 ARM2 서열이 발현 플라스미드 벡터(pA205A1, pA205A2) 상에 또는 조합(pA205Genomic)으로 개별적으로 존재하는 경우 HEK 293 세포에서 아달리무맙의 발현 수준을 증강시킬 수 있음을 제시하고 있다. ARM1은 이러한 HEK 293 일시적 발현 시스템에서 ARM2보다 아달리무맙의 더 우수한 발현 증강 수준을 제공하였다. 대조적으로, ARM2는 CHO 안정 발현 시스템에서 ARM1보다 아달리무맙의 더 우수한 발현 증강 수준을 제공하였다(상기 실시예 3 참조). CHO 안정한 발현 시스템에서 보여지는 바와 같이(상기 실시예 6), ARM2의 증강 효과는, 또한 pA205 조절(ARM 서열 없음) 플라스미드 발현 벡터로 형질감염된 세포에서 보여진 것보다 낮게 발현을 저하시키는 것을 포함하여, SpeI- 또는 SwaI-절두된 ARM2 서열을 함유하는 발현 플라스미드 벡터로 형질감염된 HEK 293 세포에서 명확하게 감소되었다.
상기 본문에 인용된 모든 특허, 특허원 및 공개문헌은 본원에 참조로 인용된다.
본원에 기재된 본 발명의 다른 변화 및 양태가 당해 기술분야 숙련가에게 명백할 것이고, 본 발명의 모든 이러한 변화 및 대안적 양태는 상기 기재 및 하기 청구항 내에 포함되는 것으로 의도된다.
<110> Abbott Laboratories <120> Recombinant expression vector elements (rEVEs) for enhancing expression of recombinant proteins in host cells <130> ABT-107.1 PCT <150> US 60/921,141 <151> 2007-03-30 <160> 18 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 2329 <212> DNA <213> Cricetulus griseus <400> 1 aattgaattc gttcccttta gtgagggtta attccgcggc cgcgtcgaca gctctagagg 60 gagtgccagg ataggctcca aagctacaca gagaatccct gtttcaaaaa accaaaaaaa 120 aaaaaataaa aaataaaaaa taaaaagtag ggtacagatc taaatagaca attctcaata 180 gaggaatcta aaatgcctga aagacaaata agaaagtgtt caacatcctt agccatcagg 240 gaaatgcaaa tcaaaacaac tctgagatac tatcttactc ctgtcataat ggccaaattc 300 aaaaacacta atgacagttc atgttggaga gaatgtggag aaagaggagc acttctccac 360 tgctggtggg agtgccaact tggacagcca ctttggaaat cagtatggct actcctcaag 420 aaaatggaaa tcagtttacc acaagatcca gcaattccac tcaggcatat acccaaaaga 480 accgcattca tacaagcaat atctgttcaa cgatgttcat agcagctcta tttgtaacag 540 ccagaaactg gaagcagcct agttgcacct caaccaaaga aatggataga gaaaatatgg 600 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<220> <223> MAR element <220> <221> misc_feature <222> (3)..(5) <223> n is a, t, g, or c <220> <221> misc_feature <222> (8)..(10) <223> n is a, t, g, or c <400> 12 tannncannn tg 12 <210> 13 <211> 12 <212> DNA <213> unknown <220> <223> MAR element <220> <221> misc_feature <222> (3)..(5) <223> n is a, t, g, or c <220> <221> misc_feature <222> (8)..(10) <223> n is a, t, g, or c <400> 13 tgnnntannn ca 12 <210> 14 <211> 12 <212> DNA <213> unknown <220> <223> MAR element <220> <221> misc_feature <222> (3)..(5) <223> n is a, t, g, or c <220> <221> misc_feature <222> (8)..(10) <223> n is a, t, g, or c <400> 14 cannntannn tg 12 <210> 15 <211> 15 <212> DNA <213> unknown <220> <223> MAR element <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> n is a, t, g, or c <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> w is a or t <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> y is t or c <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> n is a, t, g, or c <220> <221> misc_feature <222> (13)..(14) <223> n is a, t, g, or c <220> <221> misc_feature <222> (15)..(15) <223> r is g or a <400> 15 gtnwayattn atnnr 15 <210> 16 <211> 7 <212> DNA <213> unknown <220> <223> MAR element <400> 16 caaaaca 7 <210> 17 <211> 6 <212> DNA <213> unknown <220> <223> MAR element <400> 17 aatatt 6 <210> 18 <211> 8 <212> DNA <213> unknown <220> <223> MAR sequence motifs <400> 18 aatatatt 8

Claims (10)

  1. 서열번호 1의 뉴클레오타이드 염기 서열, 서열번호 2의 뉴클레오타이드 염기 서열, 임의의 상기 서열의 발현-증강 부분, 임의의 상기 서열에 대한 상보적 서열, 및 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 염기 서열을 포함하는 재조합 발현 벡터 요소(rEVE)를 포함하는, 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
  2. 제1항에 있어서, 서열번호 2의 염기 462-2422의 서열 및 서열번호 2의 염기 1087-2422의 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 서열번호 2의 서열의 발현-증강 부분을 포함하는, 분리된 폴리뉴클레오타이드 분자.
  3. 제1항에 따른 폴리뉴클레오타이드 분자를 포함하는 재조합 벡터.
  4. 제3항에 있어서, 재조합 발현 벡터인 재조합 벡터.
  5. 제4항에 있어서, 하나 이상의 재조합 단백질을 암호화하는 하나 이상의 기능성 재조합 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터.
  6. 제5항에 따른 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  7. 제6항에 있어서, 진핵 숙주 세포 또는 원핵 숙주 세포인 숙주 세포.
  8. 제6항에 따른 숙주 세포를 하나 이상의 재조합 단백질을 발현시키는 조건 하에서 배양하는 단계를 포함하여, 목적하는 재조합 단백질을 생산하는 방법.
  9. 제1 핵산 분자에 존재하는 매트릭스 부착 영역(MAR) 서열의 수를 증가시키는 방법으로서,
    상기 제1 핵산 분자 내로 제2 핵산 분자를 삽입하는 단계를 포함하고,
    이때, 상기 제2 핵산 분자는 서열번호 1, 하나 이상의 MAR 서열을 포함하는 서열번호 1의 부분, 서열번호 2, 하나 이상의 MAR 서열을 포함하는 서열번호 2의 부분 및 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 방법.
  10. 하나 이상의 재조합 단백질을 암호화하는 하나 이상의 재조합 유전자를 포함하는 발현 벡터 내로 서열번호 2의 염기 1-461의 뉴클레오타이드 염기 서열을 포함하는 핵산 분자를 삽입하는 단계를 포함하여,
    발현 벡터로부터 재조합 단백질의 발현을 저하시키거나 실질적으로 억제시키거나 또는 필수적으로 사일런싱시키는 방법.
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