ES2230908T3 - Procedimiento para la preparacion de celulas recombinantes. - Google Patents

Abstract

Procedimiento para la producción de una línea celular que se caracteriza por la expresión incrementada de una secuencia de aminoácidos, comprendiendo el procedimiento: a) la introducción en células huésped de un primer vector que comprende una primera secuencia seleccionable, unida operativamente a un segmento que codifica para la secuencia de aminoácidos, b) el cultivo de células huésped en condiciones que conducen a la selección del primer vector, c) el aislamiento de las células que expresan la secuencia de aminoácidos en un primer nivel de expresión (primeras células de elevada expresión), d) la introducción, en las células que se expresan en el primer nivel de expresión, de un segundo vector que codifica para la secuencia de aminoácidos, e) el sometimiento de las células a condiciones que conducen a la expresión de la secuencia de aminoácidos en un segundo nivel de expresión más elevado que el primer nivel de expresión; y f) el aislamiento de las células que expresan la secuenciade aminoácidos en el segundo nivel de expresión, para producir la línea celular (segundas células de elevada expresión), en donde el procedimiento comprende además la selección de al menos un marcador de superficie celular codificado por el vector.

Description

Procedimiento para la preparación de células recombinantes.

Campo de la invención

La presente invención está generalmente relacionada con procedimientos para preparar células recombinantes que expresan al menos una secuencia de aminoácidos. La invención tiene una variedad de aplicaciones de utilidad, incluyendo la utilización en la producción de células de mamífero recombinantes, las cuales son estables y expresan elevados niveles de una proteína deseada.

Antecedentes de la invención

Se han efectuado numerosos intentos para producir niveles elevados de un secuencia de aminoácidos deseada, mediante la introducción de un ácido nucleico extraño (heterólogo) en células huésped y expresando después ese ácido nucleico en el interior de las células. Las células eucariotas y, en especial las células de mamífero, han sido utilizadas con resultados mezclados. Por ejemplo, a pesar del esfuerzo realizado hacia la mejoría de los procedimientos para la preparación de células de mamífero recombinantes que producen elevados niveles de la secuencia de aminoácidos, la mayor parte de las células no expresan el ácido nucleico a niveles suficientes. Así pues, existe la necesidad de disponer en este campo de procedimientos para generar células de mamífero recombinantes que expresen el ácido nucleico introducido a niveles elevados.

En general, para incrementar la expresión de ácidos nucleicos heterólogos en células de mamífero se han utilizado dos procedimientos. Un planteamiento ha sido el de reforzar el número de copias del ácido nucleico a través de técnicas de selección celular, tales como la amplificación de la resistencia a fármacos. Otro enfoque ha sido el de incrementar la expresión del ácido nucleico en el interior de las células, por ejemplo, mediante la adición recombinante de uno o más elementos de control beneficioso para ese ácido nucleico. Ver, por regla general, Kaufman, R.J. y P.A. Sharp (1982) J. Mol. Biol. 159:601; Sambrook et al., Molecular Cloning (2d edition, 1989) y Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, (19890 John Wiley & Sons, New York).

En particular, se ha informado acerca de que la amplificación de la resistencia a fármacos conlleva la transformación celular con dos genes, uno de los cuales codifica para una secuencia de aminoácidos de interés, tal como una proteína heteróloga, y el otro, que codifica para un marcador genético seleccionable, tal como una dihidrofolato reductasa (DHFR). En aquellos casos en los cuales el marcador genético es DHFR, las células transformadas son cultivadas en presencia del fármaco de selección metotrexato (MXT). Los efectos normales citotóxicos del MXT son eliminados sustancialmente por medio de la expresión de la DHFR. Las células transformadas sobreviven debido a que han incrementado (amplificado) el número de copias de DHFR hasta alcanzar un nivel lo suficientemente elevado. La secuencia de ácidos nucleicos que codifica para la secuencia de aminoácidos resulta también amplificada, estimulando la expresión de la misma. Ver por ejemplo, Kaufman, R.J. y P.A. Sharp, supra.

No obstante, la amplificación de la resistencia a fármacos y las técnicas relacionadas presentan inconvenientes reconocidos. Por ejemplo, la generación de la mayor parte de líneas celulares recombinantes de mamíferos utilizando la técnica conlleva tiempo y puede requerir el transcurso de varios meses. Adicionalmente, se ha reconocido que cuando se amplifica el ácido nucleico heterólogo, los procedimientos de secuenciación de ácido nucleico habituales pueden resultar negativamente impactados. Además, puede resultar bastante difícil mantener el número suficiente de copias de ácido nucleico sin imponer una estricta, y a veces de larga duración, presión de selección. Una estrategia de selección celular dirigida a ampliar la presión de selección puede resultar cara y puede plantear cuestiones regulatorias, tales como cuando una proteína heteróloga está siendo producida para uso farmacéutico.

Además, la amplificación de la resistencia a fármacos puede no resultar capaz de reforzar la expresión de ácidos nucleicos heterólogos específicos hasta alcanzar niveles suficientes para aplicaciones tales como uso en investigación o comercial.

Entre los problemas adicionales que plantea la amplificación de la resistencia a fármacos se incluye la inestabilidad genética de las líneas celulares clonadas. Estos problemas resultan altamente significativos. Por ejemplo, el procedimiento genera a menudo células recombinantes que evolucionan a partir de acontecimientos de amplificación genética inestables, por ejemplo, la formación de cromosomas minúsculos dobles. Estas células pueden perder las características deseadas cuando se elimina el fármaco de selección. Ver Kaufman, R.J. et al., (1985) Mol. Cell. Biol. 5: 1570 y las referencias citadas en el mismo.

Adicionalmente, la práctica optimizada de la mayor parte de las técnicas de amplificación de resistencia a fármacos, ha requerido la utilización de células altamente especializadas y/o de condiciones de crecimiento celular. Por ejemplo, la mayor parte de los procedimientos utilizan células huésped que han sido manipuladas genéticamente de diversas formas. Las citadas células mutantes pueden no resultar adecuadas para algunas aplicaciones. Como ilustración de las dificultades, la amplificación de la resistencia a fármacos que involucra a la DHRF y al MXT no se producirá en condiciones óptimas en células que soportan un gen DHFR normal. La incapacitación de este gen normal puede representar un proceso lento y laborioso. Ver, Wigler et al. (1980) PNAS (USA) 3567; y Urlaub and Chasin (1980) PNAS (USA) 77:4216.

Se han descrito más inconvenientes particulares de los procedimientos de amplificación DHFR/MTX, en relación con la utilización de vectores específicos y condiciones de crecimiento. Ver, por ejemplo, Kaufman and Sharp, supra; Schimke, R. Cell (1984) 37:705. Ver también las patentes USA nºs. 5.686.263; 4.956.288 y 5.585.237, y las referencias citadas en las mismas.

Resultaría de utilidad disponer de procedimientos para la preparación de células recombinantes que sean flexibles y que puedan ser utilizados para producir líneas celulares recombinantes que sean generalmente estables. Sería particularmente deseable disponer de procedimientos para la producción de líneas celulares recombinantes de mamíferos que reduzcan o eviten la utilización de células, vectores y/o condiciones de crecimiento altamente especializadas. Sería también deseable adicionalmente disponer de líneas celulares de mamífero recombinantes obtenidas a través de procedimientos, que produzcan niveles elevados de aminoácidos y de secuencias de interés, tales como una proteína heteróloga.

Resumen de la invención

La presente invención está relacionada con procedimientos para la producción de células recombinantes y, en particular, con la obtención de líneas celulares recombinantes que resultan por línea general estables y que expresan elevados niveles de al menos una secuencia de aminoácidos. En un aspecto, la invención proporciona procedimientos para la producción de líneas celulares recombinantes que expresan elevados niveles de proteína heteróloga. Los procedimientos conllevan generalmente la introducción en células huésped de un vector que codifica para la secuencia de aminoácidos y el sometimiento de las células a condiciones que conducen al aislamiento de las líneas celulares recombinantes que producen elevados niveles de esa secuencia. Los procedimientos preferidos producen elevados niveles de secuencia de aminoácidos, a la vez que reducen, de forma significativa, la utilización de células huésped, vectores y/o condiciones de crecimiento altamente especializadas. Se proporcionan adicionalmente líneas celulares recombinantes de mamífero obtenidas a través de los procedimientos de esta invención.

La presente invención está más particularmente relacionada con procedimientos para la generación de líneas celulares recombinantes de mamífero, las cuales son genéticamente estables y expresan elevados niveles de al menos una secuencia de aminoácidos de interés. En una realización, la expresión de la secuencia de aminoácidos se ve sustancialmente reforzada mediante la introducción, en el interior de las células huésped, de un primer vector que codifica para la secuencia. El primer vector incluye por lo menos una secuencia seleccionable, habitualmente una primera secuencia seleccionable, operativamente unida a un segmento que codifica para la secuencia de aminoácidos. Adicionalmente, el primer vector puede codificar para más de una copia de la secuencia de aminoácidos, si así se desea. El primer vector puede ser introducido una vez en el interior de células huésped (única) o más de una vez (múltiples), según necesidades. Las células huésped son después cultivadas en condiciones que conducen a la expresión de la secuencia de aminoácidos, seguido el aislamiento de las líneas celulares recombinantes (primeras células de expresión elevada), que expresan la secuencia a un primer nivel de expresión elevado.

El procedimiento incluye la introducción, preferiblemente en el interior de las primeras células de elevada expresión, de un segundo vector que codifica para la secuencia de aminoácidos. El segundo vector puede ser igual o diferente del primer vector y puede codificar para más de una copia de la secuencia de aminoácidos, si ello resultase necesario. El segundo vector es introducido en el interior de las primeras células de elevada expresión una vez (única) o más de una vez (múltiples), según necesidades. Las células recombinantes que comprenden el segundo vector son después cultivadas en condiciones que conduce a la expresión de la secuencia de aminoácidos. Las células que expresan al aminoácidos en un segundo nivel de expresión (segundas células de expresión elevada), son aisladas seguidamente.

Tal como se ha comentado, se ha reconocido que las líneas celulares preparadas por medio de esquemas de selección de células anteriores y, especialmente, de técnicas de amplificación de resistencia a fármaco, han padecido inconvenientes. Entre los inconvenientes específicos se incluyen la inestabilidad genética y la necesidad de utilizar células, vectores y/o condiciones de crecimiento altamente especializadas. Los presentes procedimientos evitan significativamente estos inconvenientes proporcionando líneas celulares genéticamente estables que producen elevados niveles de la secuencia de aminoácidos. Además, los presentes procedimientos son por regla general más flexibles que los esquemas anteriores y son compatibles con un amplio espectro de vectores. Prácticamente cualquier célula transfectable puede ser utilizada con los presentes procedimientos, incluyendo las células de mamíferos más primarias, las secundarias o las cultivadas. De forma adecuada, los presentes procedimientos contemplan el crecimiento de un célula de mamífero transfectable específica, bajo una diversidad de condiciones de crecimiento selectivas o no selectivas, según necesidades.

Las líneas celulares obtenidas a través de los procedimientos de la invención son seleccionadas indirectamente a través de la selección de al menos un marcador de superficie celular codificado por un vector. La selección de dicho marcador de superficie celular de acuerdo con la invención facilita el eficaz aislamiento de las líneas celulares que expresan la secuencia de aminoácidos a niveles elevados. Tal y como se ha comentado, las líneas celulares resultantes son genéticamente estables y pueden ser obtenidas al tiempo de minimizar o eliminar la utilización de células, vectores y/o condiciones de crecimiento altamente especializadas.

En una particular realización del procedimiento, el segundo nivel de expresión elevado es sustancialmente más elevado que el primer nivel de expresión elevado, al menos entre aproximadamente 2 y 10 veces más elevado o un número de veces superior. Los procedimientos para la determinación de niveles de secuencias de aminoácidos, tales como proteínas, son conocidos en el campo e incluyen determinadas técnicas tales como la reactividad a anticuerpo.

En una realización más particular, el procedimiento incluye además la introducción, en el interior de las segundas células de expresión elevada, de un tercer vector que codifica para la secuencia de aminoácidos y el sometimiento de las células a condiciones que conducen a expresar la secuencia de aminoácidos a un tercer nivel de expresión, más elevado que el segundo nivel de expresión. Las células que expresan la secuencia de aminoácidos en el tercer nivel de expresión son después aisladas para producir la línea celular (terceras células de expresión elevada). El tercer vector codifica preferiblemente al menos para una secuencia de aminoácidos de interés y puede ser igual o diferente al primer o al segundo vector (o a ambos vectores). El tercer vector puede ser introducido una vez en el interior de las segundas células de elevada expresión (única) o más de una vez (múltiples), según necesidades. Las terceras células de elevada expresión mostrarán habitualmente una expresión incrementada de la secuencia de aminoácidos cuando se comparan con las primeras o segundas células de elevada expresión.

En otra realización particular, el procedimiento incluye además la introducción en el interior de las terceras células de elevada expresión al menos un vector que codifica para la secuencia de aminoácidos, preferiblemente uno de tales vectores, y el sometimiento de las células a condiciones que conducen a la expresión de la secuencia de aminoácidos a un nivel más elevado que el tercer nivel de expresión. El procedimiento incluye además la repetición de los pasos de introducción y de sometimiento al menos una vez, preferiblemente entre aproximadamente 2 y 10 veces o más, para aislar una línea celular que expresa la secuencia de aminoácidos a un nivel más elevado que el de las terceras células de expresión elevada. La elección de cuantas veces se repiten los pasos se apoyará en diversos parámetros, pero particularmente a través del nivel de expresión requerido.

En otra realización, el paso de cultivar las células huésped en condiciones que conducen a la selección del primer vector incluye, además, el cultivo de las células huésped en medios selectivos. Preferiblemente, esos medios selectivos incluyen al menos un fármaco y habitualmente un fármaco selectivo para la primera secuencia seleccionable. Se apreciará que estos vectores descritos en el presente documento que incluyen una secuencia de ácido nucleico seleccionable, por ejemplo, el primer y el cuarto vector, habitualmente codifican para una secuencia de aminoácidos que es seleccionable. En los ejemplos y discusión que siguen se describen fármacos ilustrativos para la selección de los vectores.

Resultará a menudo preferido que el segundo y el tercer vector (o ambos vectores) sean co-introducidos en el interior de células con al menos otro vector (identificado a veces en el presente documento como el "cuarto" o "quinto" vector), codificando dicho vector para al menos una secuencia seleccionable y particularmente para un marcador de superficie celular seleccionable, tal como una proteína de superficie celular. Se ha averiguado sorprendentemente que mediante la co-introducción del vector que codifica para el marcador de superficie celular seleccionable, resulta posible facilitar la producción de líneas celulares de mamíferos recombinantes altamente útiles que expresan niveles elevados de la secuencia de aminoácidos deseada. Por ejemplo, se ha averiguado que mediante la co-introducción del citado vector según la invención, resulta posible generar líneas celulares al tiempo de reducir o de eliminar totalmente la necesidad de utilizar células, vectores y/o condiciones de crecimiento altamente especializadas. Adicionalmente, la producción de células recombinantes genéticamente estables se ve favorecida por la práctica de estos procedimientos.

En otra realización del procedimiento, el paso de introducir el segundo vector en el interior de las primeras células de expresión elevada comprende además la introducción del cuarto vector en el interior de las células. Tal y como se ha discutido, el cuarto vector codifica para al menos una secuencia seleccionable (identificada en el presente documento como la "segunda" secuencia seleccionable), preferiblemente para un marcador de superficie celular seleccionable. El cuarto vector puede ser el mismo vector del procedimiento, si bien, en la mayoría de los casos, el cuarto vector será diferente de cualquiera o la totalidad de estos vectores. En otra realización, el cuarto vector comprende una segunda secuencia seleccionable operativamente unida a un segmento que codifica para la secuencia de aminoácidos de interés. En una realización más preferida, el procedimiento incluye además el cultivo de las células en medios selectivos que incluyen al menos un fármaco selectivo para la segunda secuencia seleccionable.

En realizaciones en las cuales el cuarto vector codifica para el marcador de la superficie celular, el procedimiento incluye, adicionalmente, preferiblemente, el aislamiento de las células que expresan ese marcador celular de superficie seleccionable, por medio de al menos uno de cromatografía, lavado celular, citometría de flujo, unión a anticuerpo, inmunoprecipitación o unión a anticuerpo. Habitualmente, una de estas técnicas será utilizada para aislar las células que expresan el marcador de superficie celular. Llevando a cabo el aislamiento, se obtuvieron líneas celulares que expresan niveles elevados de secuencia de aminoácidos codificadas por los vectores.

En otra realización del procedimiento, el paso de introducir el tercer vector en las segundas células de elevada expresión incluye, además, la introducción de un quinto vector en las células. En una realización particular, el quinto vector codifica al menos para una secuencia seleccionable (identificada en el presente documento como la "tercera" secuencia seleccionable). El quinto vector puede ser igual o diferente a cualquiera de los vectores descritos en el presente documento. En una realización más particular, el quinto vector incluye una tercera secuencia seleccionable la cual, si se desea, puede estar unida operativamente a un segmento que codifica para la secuencia de aminoácidos. Las células son después sometidas a condiciones que conducen a la expresión de la secuencia de aminoácidos en un tercer nivel de expresión, más elevado que el segundo nivel de expresión. Preferiblemente, el procedimiento comprende el cultivo de las células en medios selectivos que incluyen al menos un fármaco y, preferiblemente, un fármaco que es selectivo para la tercera secuencia seleccionable.

Un quinto vector adicionalmente preferido incluye una secuencia que codifica para un marcador de superficie celular seleccionable, el cual puede ser igual o diferente del marcador de superficie celular codificado por el cuarto vector. Si se desea, el marcador de superficie celular seleccionable puede estar unido operativamente a un segmento que codifica para la secuencia de aminoácidos. El procedimiento incluye, preferiblemente, el paso de aislar las células que expresan el marcador de superficie celular seleccionable codificado por el quinto vector y la utilización de al menos una de las técnicas de cromatografía, lavado celular, citometría de flujo, unión a anticuerpo, inmunoprecipitación, o unión a anticuerpo para aislar las células que expresan el marcador de la superficie celular expresado por el cuarto o quinto vector (o por ambos vectores), según necesidades. Llevando a cabo el aislamiento, se obtienen líneas celulares recombinantes que expresan elevados niveles de la secuencia de aminoácidos codificada por los vectores.

Las segundas células de elevada expresión más particulares según la invención expresan, por regla general, al menos aproximadamente 2 veces más de la secuencia de que las primeras células de elevada expresión, tal y como se determina a través de técnicas de cuantificación de proteína estándar, tales como la electroforesis en gel cuantitativa, la cromatografía y técnicas inmunológicas, tales como la inmunotransferencia Western, ELISA, y reactividad a anticuerpo. Más particularmente, las segundas células de expresión elevada expresan entre aproximadamente 3 y aproximadamente 40 veces la secuencia de aminoácidos cuando son comparadas con las primeras células de elevada expresión, tal como se determina mediante la reactividad a anticuerpo.

Las terceras células de elevada expresión de particular interés expresan generalmente al menos entre aproximadamente 2 veces más de la secuencia de que la segundas células de elevada expresión, tal y como se determina mediante técnicas de cuantificación de secuencia de proteínas estándar. Más particularmente, las terceras células de elevada expresión expresan entre aproximadamente 3 y aproximadamente 40 veces la secuencia de aminoácidos, en comparación con las segundas células de elevada expresión, tal y como se determina a través de reactividad a anticuerpo.

En una realización más específica de los procedimientos, cada uno de los primeros, segundos o terceros vectores codifica independientemente para un primer gen de resistencia a fármaco (identificado a veces en el presente documento como un marcador genético), un marcador de superficie celular seleccionable y un segundo gen de resistencia a fármaco, respectivamente. En esta realización, cada uno de los vectores se encuentra unido operativamente a un segmento que codifica para la secuencia de aminoácidos de interés. Adicionalmente, el cuarto y quinto vector pueden codificar, cada uno de ellos independientemente, para un tercer gen de resistencia a fármaco y para otro marcador de superficie celular, respectivamente. Los primeros, segundos y terceros genes de resistencia a fármacos pueden ser iguales o diferentes, según necesidades. Más adelante se describen, con mayor detalle, genes de resistencia a fármacos ilustrativos y marcadores de superficie celular seleccionables.

Como ilustración de la invención, se selecciona primeramente una célula huésped de mamífero adecuada, la cual no requiera vectores o condiciones de crecimiento altamente especializadas para expresar, de forma óptima, una proteína heteróloga. Las células huésped de mamífero preferidas no expresan la proteína heteróloga a niveles detectables. No obstante, en algunos casos, las células huésped de mamífero adecuadas pueden ya expresar la proteína en forma de proteína homóloga, por ejemplo, a niveles de fondo (a saber, basales).En este caso, la invención puede ser utilizada para estimular la expresión de la proteína homóloga hasta niveles más elevados que los niveles basales. Alternativamente, los presentes procedimientos pueden ser utilizados para estimular la expresión celular de una proteína heteróloga deseada o de una secuencia de polipéptidos. Más adelante se proporcionan células huésped de mamíferos específicas.

Después de la introducción del primer vector en las células huésped de mamífero, las primeras células de elevada expresión son aisladas en medios de crecimiento que resultan ser generalmente selectivos para el primer vector. Mediante la introducción del segundo vector que codifica para la secuencia de aminoácidos en las primeras células de elevada expresión se producen las segundas células de elevada expresión. En una realización, el primero y el segundo vector codifican para una copia de la proteína heteróloga y son sustancialmente iguales. La introducción del segundo vector va acompañada de la introducción de otro vector ("cuarto") que codifica para el marcador de superficie celular seleccionable. El aislamiento de las segundas células de elevada expresión se lleva a cabo en condiciones que conducen a la selección de ese marcador de superficie celular y puede incluir, opcionalmente, el crecimiento en medios selectivos, si así se desea. En esta realización, la selección del marcador de superficie celular selecciona también la elevada co-expresión de la secuencia de aminoácidos deseada, codificada por el primer y el segundo vector. La utilización de células huésped, vectores y medios de cultivo altamente especializados se ve significativamente reducida en este ejemplo.

La presente invención puede ser utilizada para preparar un amplio espectro de células recombinantes y, en particular, de líneas celulares de mamíferos que expresan elevados niveles de al menos la secuencia de aminoácidos deseada o una parte de esa secuencia de aminoácidos, tal como un fragmento de proteína funcional. Por ejemplo, los procedimientos de la invención pueden ser utilizados para expresar secuencias de aminoácidos de interés inmunológico, tales como la cadena de inmonuglobulina (pesada o ligera) o uno de sus fragmentos funcionales. Más adelante se discuten secuencias de aminoácidos de interés más específico.

La presente invención proporciona ventajas significativas en comparación con las técnicas de selección celular anteriores y, especialmente, con los procedimientos de amplificación de la resistencia a fármacos. Por ejemplo, tal como se ha discutido, la práctica de la mayoría de los procedimientos de amplificación de resistencia a fármacos requiere generalmente la utilización de líneas celulares, vectores y medios de cultivo altamente especializados. En la mayor parte de los casos, las células han sido manipuladas genéticamente para bloquear la resistencia a un fármaco y puede que no siempre muestren buenas características de crecimiento. Además, las citadas células pueden resultar difíciles de preparar y/o de mantener y pueden resultar particularmente inadecuadas para muchas estrategias específicas de selección celular. La presente invención soluciona estos inconvenientes proporcionando procedimientos para generar líneas celulares recombinantes que reducen o eliminan la utilización de estas líneas celulares altamente especializadas.

Además, los presentes procedimientos maximizan la estabilidad genética de las líneas celulares recombinantes resultantes, mediante la introducción de ácidos nucleicos heterólogos en el genoma de las células huésped. La creación de formaciones de cromosomas altamente inestables queda reducida y, a menudo, totalmente evitada.

Esta invención proporciona ventajas adicionales. Por ejemplo, los presentes procedimientos son sustancialmente más flexibles que los procedimientos anteriores para la generación de células de mamífero recombinantes y pueden ser utilizados con una diversidad de vectores de expresión de mamíferos. Por el contrario, la mayor parte de la técnicas de selección celular, tales como la amplificación de resistencia a fármacos, están diseñadas para ser utilizadas con vectores altamente especializados. Como ilustración del problema, se ha reconocido que los vectores para muchas de las técnicas de amplificación de resistencia a fármacos se han convertido en demasiado grandes y difíciles de manipular. Asimismo, muchos vectores óptimos para utilización con esquemas de selección celulares anteriores tienen una titularidad exclusiva y no pueden ser utilizados siempre que se necesitan. La presente invención soluciona este problema, por ejemplo, proporcionando compatibilidad con una amplia variedad de vectores de expresión de mamíferos.

Tal y como se ha discutido, al menos uno de los vectores descritos en el presente documento puede codificar para una parte de la secuencia de aminoácidos de interés. El primer vector (o cualquier otro de los vectores) puede codificar para la longitud completa de la proteína y al menos otro de los restantes vectores, por ejemplo el segundo, el tercero o el cuarto vector, puede codificar para una parte específica de la proteína. Los restantes vectores pueden ser utilizados, por ejemplo, para introducir partes adicionales de la secuencia proteínica o incluso la secuencia de proteína completa, si así se desea.

La capacidad de los presentes procedimientos para introducir partes de una secuencia de aminoácidos de interés proporciona ventajas. Por ejemplo, los procedimientos pueden ser utilizados para proporcionar una amplificación altamente controlada de una o varias partes de la secuencia de aminoácidos. Es decir, partes específicas de la secuencia de amionoácidos, que incluyen la secuencia completa, pueden ser amplificadas en células específicas (por ejemplo, las primeras o segundas células de elevada expresión) con anterioridad o coincidiendo con la amplificación de otra secuencia. Por consiguiente, la invención proporciona la expresión secuencial y coordinada de una o varias secuencias de interés.

Los procedimientos particulares de esta invención proporcionan ventajas adicionales. Por ejemplo, la práctica de los procedimientos para generar líneas celulares de mamífero recombinantes (denominadas a veces "líneas celulares de elevada producción" o expresión relacionada) puede ser alcanzada en significativamente menos tiempo que en otros procedimientos de selección celulares, incluyendo la mayor parte de los procedimientos de amplificación de fármaco. Además, los procedimientos producen líneas celulares de elevada producción, mediante la utilización de menos pasos celulares que en la mayoría de los procedimientos anteriores, reduciendo con ello el trabajo y el coste de los medios.

Los siguientes ejemplos no limitativos resultan ilustrativos de la invención.

Breve descripción de los dibujos

Las Figuras 1A y 1B son dibujos que muestran vectores ilustrativos para ser utilizados con la invención. El vector pJAlgG4TF (1A) codifica para un factor antitisular quimérico (TF) pesado y para cadenas de inmunoglobina ligeras. El vector pDRHK (1B) codifica para una molécula HLA-DR2/MBP de cadena única, fusionada a un dominio constante kappa de inmunoglobina humana.

La Figura 2 constituye una gráfica que muestra elevados niveles de producción de anticuerpos anti-TF quiméricos recombinantes en cultivos estáticos en matraz T25. Siguiendo tres transfecciones secuenciales, se aislaron líneas celulares recombinantes que producen elevados niveles de anticuerpo anti-TF. Las líneas celulares de elevada producción fueron denominadas H9G12, 3D2A9 y A11B5, respectivamente.

La Figura 3 es una gráfica que muestra el elevado nivel de producción de anti-TF quimérico recombinante en un biorreactor. Las líneas celulares recombinantes que producen elevados niveles del anticuerpo anti-TF fueron aisladas siguiendo tres transfecciones secuenciales. Las líneas celulares recombinantes de elevada producción fueron designadas como H9G12 y A11B5, para líneas aisladas después de la primera y tercera transfección.

La Figura 4 constituye una gráfica que muestra elevado nivel de producción de la producción de sc-DR2/MBP-Ck en cultivos estáticos en matraz T25. Las líneas celulares recombinantes que producen elevados niveles de la proteína de fusión sc-DR2/MBP-Ck fueron aisladas siguiendo tres transfecciones secuenciales. Las líneas celulares recombinantes de elevada producción fueron designadas como A5B4, DR2H4 y B9, respectivamente.

Descripción detallada de la invención

Tal y como se ha resumido anteriormente, la presente invención proporciona procedimientos para la preparación de un amplio espectro de células y de líneas celulares recombinantes en particular. Se proporcionan en particular procedimientos para la preparación de líneas celulares de mamífero recombinantes, que son genéticamente estables y producen elevados niveles de proteína heteróloga u homóloga de interés. Tal y como se ha comentado, la invención es flexible y puede ser utilizada para preparar líneas celulares de elevada utilidad, que producen elevados niveles de la proteína, al tiempo que evitan significativamente la utilización de células, vectores y/o condiciones de crecimiento altamente especializadas. Se proporcionan, adicionalmente, líneas celulares de mamífero recombinantes que producen elevados niveles de la proteína.

En general, se alcanza la práctica óptima de la presente invención mediante la utilización de manipulaciones reconocidas. Técnicas de aislamiento de DNA, de preparación y selección de vectores que expresan el DNA, de purificación y análisis de ácidos nucleicos, de procedimientos específicos para la preparación de vectores recombinantes de DNA, de rotura de DNA con enzimas de restricción, de unión a DNA, de introducción de DNA, incluyendo vectores de DNA en células huésped a través de medios estables o transitorios, de cultivo de células huésped en medios selectivos o no selectivos, de procedimientos ejemplarizados de células huésped para seleccionar y mantener células estables o transitorias que expresan el DNA, resultan por regla general conocidas en el campo. Ver generalmente Sambrook et al., supra; y Ausubel et al., supra.

La presente invención proporciona, en un aspecto, nuevos procedimientos para generar líneas celulares de mamífero recombinantes. Una línea celular de mamífero recombinante será a veces identificada como una línea celular de "elevada producción" o término relacionado. La frase "elevado nivel", "elevada producción" o similar, cuando se utiliza para referenciar la cantidad de secuencia de aminoácidos producida por la línea celular, significa que al menos aproximadamente 2 veces y preferiblemente entre aproximadamente 3 y aproximadamente 40 veces o un número más elevado (algunas secuencias heterólogas no se encuentran presentes en la línea celular parental) de la secuencia más elevada de la secuencia de aminoácidos es producida por la línea celular, en comparación con una célula parental o una línea celular parental.

Se conocen, en este campo, procedimientos para la determinación de la cantidad de una secuencia de aminoácidos particular, producida por una línea celular recombinante descrita en el presente documento e incluyen procedimientos cromatográficos tales como electroforesis en gel de proteína y técnicas inmunológicas, tales como la inmunotransferencia Western y ELISA. Los procedimientos de electroforesis en gel más particulares incluyen aquellos en los cuales una proteína o secuencia de péptido es detectada y cuantificada utilizando azul de Coumassie o teñido con plata. Un procedimiento de cuantificación de proteína preferido es el de la reactividad a anticuerpo.

A través del término "reactividad a anticuerpo" se quiere dar a entender la unión específica entre un anticuerpo designado y la secuencia de aminoácidos producida por la célula o por la línea celulares. El término hace adicionalmente referencia a la formación de un par de unión específico entre la secuencia de aminoácidos (a saber, un epítope sobre la misma) y el anticuerpo, pero el cual no se une de forma significativa a otras moléculas, tal como se determina, por ejemplo, mediante inmunotransferencia Western, ELISA; RIA, ensayo de desplazamiento de movilidad en gel, inmunoensayo de enzima, ensayos competitivos, ensayos de saturación o ensayos de unión adecuados a secuencias conocidos en el campo. Ver generalmente, Harlow y Lane en Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Publications, N.Y. (1988), para descripciones relacionadas con otros ensayos adecuados.

A través de la expresión "parental", tal y como es utilizada en relación con una célula o línea celular huésped se quiere dar a entender un antecesor de esa célula o línea celular utilizado para preparar una línea celular subsiguiente. Las células parentales ilustrativas son células huésped adecuadas para preparar las primeras células de elevada expresión. Las primeras células de elevada expresión constituyen, a su vez, un ejemplo de una línea parental utilizada para preparar las segundas células de elevada expresión. Se dará por entendido que una línea celular es una población clonal de células que proceden de una única célula antecesora, salvo que se indique lo contrario. Los procedimientos para la preparación de líneas celulares son generalmente conocidos en el campo y entre los mismos se incluyen técnicas de dilución en serie bien conocidas. Ver, por ejemplo, Ausubel et al., supra.

De acuerdo con un aspecto de la invención, las células huésped de mamífero que proporcionan una expresión reforzada de una secuencia específica de aminoácidos, tal como una proteína heteróloga, son obtenidas mediante la introducción en las células de un primer vector que incluye al menos una secuencia detectable y, preferiblemente, una secuencia detectable (primera secuencia detectable) unida operativamente al segmento que codifica para la proteína. Después del cultivo y aislamiento de las células que expresan la proteína en el primer nivel de expresión (primeras células de expresión elevada), un segundo vector que codifica para la proteína es introducido en las primeras células de elevada expresión. Resulta por regla general preferido que la introducción del segundo vector vaya acompañada de la introducción de otro vector (a saber, el cuarto vector), el cual codifica para al menos un marcador y, preferiblemente, para un marcador de superficie celular seleccionable. No obstante, en otras realizaciones, el segundo vector codifica tanto para la proteína como para al menos un marcador de superficie celular, preferiblemente uno de los citados marcadores. Las células son sometidas a condiciones que conducen a la expresión de la secuencia de aminoácidos en un segundo nivel de expresión, el cual es más alto que el primer nivel de expresión. Las condiciones preferidas seleccionan para al menos uno de los marcadores de la superficie celular y no utilizan células, vectores y condiciones de crecimiento altamente especializadas. Una línea celular que expresa la proteína en un segundo nivel de expresión es después aislada para producir las segundas células de elevada expresión.

A través el término "aislado", tal y como se refiere a células o líneas celulares específicas descritas en el presente documento, se quiere dar a entender células que han sido purificadas hasta al menos lograr una homogeneidad de entre aproximadamente el 80 y el 95% (peso/peso). Para la mayor parte de las aplicaciones resultan más preferidas células purificadas de pureza más elevada, por ejemplo, con una homogeneidad comprendida entre al menos aproximadamente el 98 y el 99%. Una vez purificadas las células pueden ser utilizadas para subsiguientes manipulaciones, tales como transfecciones celulares o establecimiento de líneas celulares que utilizan técnicas de dilución en serie reconocidas.

Tal y como se ha discutido, el primer y/o el segundo vector puede ser introducido en las células respectivas una vez (única) o más de una vez (múltiples), preferiblemente entre aproximadamente 2 y aproximadamente 20 veces y, más preferiblemente, entre aproximadamente 2 y aproximadamente 5 veces, según necesidades. La elección entre si introducir el primer y/o segundo vector en las respectivas células una o más veces dependerá de diversos parámetros, tales como el nivel de expresión reforzada deseada y la secuencia de aminoácidos de particular interés.

En una realización más particular, las condiciones utilizadas para seleccionar las segundas células de elevada expresión incluyen la selección de al menos un marcador de superficie celular y, preferiblemente, un marcador de superficie celular, siendo el citado marcador codificado por uno de los vectores co-introducidos en las primeras células de elevada expresión. Tal y como se ha discutido, esos vectores pueden ser el cuarto o el quinto vector. Se pone énfasis en el hecho de que esta realización de los presentes procedimientos constituye una mejora sustancial en relación con los sistemas de expresión anteriores, tales como las técnicas de amplificación de la resistencia a fármacos. Por ejemplo, mediante la co-introducción de los vectores en las células, la selección de las segundas células de elevada expresión puede ser llevada a cabo a través de la selección del marcador de superficie celular, de ahí muchos de los problemas ya comentados. También de modo significativo, la introducción secuencial del primer y del segundo vector según esta invención puede reforzar los niveles de expresión de la secuencia por encima de la suma de los niveles de la secuencia de aminoácidos.

Una "secuencia de aminoácidos" se refiere generalmente a cualquier polímero que consiste esencialmente en cualquiera de los 20, independientemente de su tamaño. Si bien el término se utiliza en el presente documento para referenciar proteínas, el término deberá entenderse como que comprende polipéptidos y péptidos, salvo que expresamente se indique lo contrario. La secuencia de aminoácidos puede codificar para una proteína de extensión completa (heteróloga u homologa, en relación con la célula que expresan) o para una parte de la misma, tal como un fragmento funcional. Más adelante se describen secuencias de aminoácidos específicas. Una secuencia de aminoácidos específicamente preferida es una cadena pesada de inmunoglobina, una cadena ligera o uno de sus fragmentos funcionales.

Por el término "fragmento funcional", tal y como se utiliza en relación con una secuencia de aminoácidos, se quiere dar a entender al menos un fragmento de una secuencia de aminoácidos que tiene al menos una de las actividades de la secuencia de aminoácidos completa. En lo referente a las secuencias de proteínas, entre estas actividades se incluyen la unión específica y la actividad enzimática. Los fragmentos funcionales preferidos presentan al menos aproximadamente el 70% y, más preferiblemente, entre aproximadamente el 80 y el 95%, de la actividad de la proteína de extensión completa, tal y como se determina a través de un ensayo adecuado.

Por el término "operativamente unido" se quiere dar a entender la unión de elementos polinucleótidos en una relación funcional. Un ácido nucleico se encuentra "operativamente unido" según la invención cuando el mismo es colocado en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. En particular, las secuencias operativamente unidas pueden residir sobre el mismo vector o sobre diferentes vectores dentro de la misma célula. Por ejemplo, un promotor o potenciador se encuentra operativamente unido a una secuencia de codificación específica si el mismo afecta a la transcripción de la citada secuencia de codificación. Es decir, para este ejemplo, operativamente unido significa que las secuencias de aminoácidos que se unen son continuas y, cuando resulte necesario unir dos regiones de codificación de proteínas, contiguas en el marco de lectura. No obstante, las secuencias operativamente unidas pueden residir sobre vectores diferentes en algunos casos. Como ilustración, una secuencia de vector que codifica para una subunidad de una proteína multi-subunidades, estaría operativamente unida a otra secuencia de vector que codifica para otra subunidad (socio de unión) de esa proteína.

Los procedimientos de la presente invención resultan operativos y altamente útiles con un amplio espectro de células huésped, en particular aquellos que están bien adaptados para el cultivo tisular. Habitualmente, las células huésped son eucariotas, preferiblemente células de mamífero que muestran buenas características de crecimiento en preparaciones de medios estándar. Sustancialmente, prácticamente la totalidad de células no microbianas, hayan sido transformadas o no previamente, y que pueden expresar una secuencia de aminoácidos deseada a elevados niveles, pueden ser utilizadas según la invención. En el estado de la técnica se conocen una diversidad de tales células y entre las mismas se incluyen CHO, CV-1, HeLa y otras células. Ver generalmente Sambrook et al, supra and Ausubel et al., supra; y la American Tissue Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia.

Tal y como resultará incluso más evidente a partir de los ejemplos y comentarios en los ejemplos que siguen, con la presente invención pueden utilizarse una diversidad de vectores y, especialmente, de vectores de expresión en mamíferos. En particular, los vectores incluirán secuencias regulatorias adecuadas para la auto-replicación y, preferiblemente, la selección en una célula huésped o línea celular deseada.

El término "vector" es definido más particularmente como una secuencia de ácido nucleico de interés, capaz de ser incorporada en una célula huésped y dar como resultado la expresión de una secuencia de ácido nucleico de interés. La citada secuencia de ácido nucleico de interés codicicará preferiblemente para la totalidad o para una parte sustancial de la secuencia de aminoácidos descrita anteriormente. Entre los vectores adecuados pueden incluirse, sin que ello represente ninguna limitación, secuencias de ácido nucleico lineales, plásmidos, cósmidos, fagémidos, episomas y DNA extracromosómico. Se incluyen, adicionalmente, DNA vírico y RNA vírico. Específicamente, el vector puede ser un DNA recombinante. También utilizado en el presente documento, el término "expresión" o "expresión genética", se refiere a la producción del producto proteína de una secuencia de ácido nucleico de interés, incluyendo la transcripción del DNA y la tranducción del RNA transcrito.

Entre los vectores más particulares para ser utilizados en la presente invención se incluye al menos una secuencia de ácido nucleico seleccionable, habitualmente una de tales secuencias. A los efectos de ilustración, las secuencias seleccionables son a menudo identificadas como un marcador genético seleccionable (o término relacionado), cuando la secuencia codifica para una secuencia intracelular; o un marcador de superficie celular (o término relacionado), cuando la secuencia codifica para una proteína de superficie celular.

Resultará evidente que una amplia variedad de secuencias seleccionables codificadas por vector son compatibles con la invención. Los vectores preferidos facilitan la selección de células o líneas celulares huésped o de otros vectores co-introducidos en la célula. Este objetivo puede ser conseguido a través de una diversidad de técnicas, incluyendo la supervivencia sustancial de las células después de la exposición a un agente citotóxico. Ver generalmente, Southern, P.J. et al. (1982) J. Mol. Appl. Gen. 1:327; Sambrook et al., supra y Ausubel et al. supra.

Por ejemplo, entre los marcadores genéticos seleccionables ilustrativos para su utilización con esta invención se incluye DHFR, el antibiótico aminoglucósido G418, la higromicina B (hmb) y el gen de la neomicinfosfodiesterasa II (neo), la puromicina y el gen de la adenosinadesaminasa para determinadas células eucariotas auxotróficas, por ejemplo, las células de ovario de cobayo chino (CHO). Se contempla que en algunas situaciones, la deseada secuencia de aminoácidos codificada por el vector puede ser de por si un marcador seleccionable suficiente o puede impactar positivamente la función del marcador seleccionable. En aquellos casos en los cuales la propia secuencia de aminoácidos codifica para el marcador seleccionable, no precisa incluirse en el vector ningún marcador seleccionable separado. Ver, por ejemplo, Southern, P.J. et al., (1981) J. Mol. Biol. 150:1; Sambrook et al; y Ausubel et al, supra y las referencias contenidas en el mismo para comentarios adicionales relacionados con marcadores genéticos.

Tal como se ha comentado, la secuencia de aminoácidos seleccionable puede codificar para un marcador de superficie celular adecuado y, particularmente, para una proteína de la superficie celular. Entre los ejemplos de marcadores de superficie celular ejemplarizados se incluyen un receptor de la superficie celular, glicoproteína, carbohidrato, proteína, lipoproteína, complejos de histocompatibilidad mayor (MHC/HLA), anticuerpo, antígeno o uno de sus fragmentos funcionales. Más particularmente, entre los marcadores de la superficie celular se incluyen glicoproteínas de interés inmunológico, tales como glicoproteínas CD (clase de diferenciación), localizadas habitualmente sobre las superficies de las células T. Entre los ejemplos se incluyen CD2, CD3, CD4, CD8 y LFA-1. La molécula CD-4 y, especialmente, un fragmento funcional de la misma constituye una glicoproteína de interés más particular. Ver también el CaptureTec™ System proporcionado por Vitrogen.

Tal y como se ha comentado anteriormente, en los ejemplos que siguen, las células que expresan un marcador de superficie celular específico pueden ser aisladas a través de una estrategia o de una combinación de diferentes estrategias. Por ejemplo, en un planteamiento, las células pueden ser aisladas a través de cromatografía, lavado celular, citometría de flujo, unión a anticuerpo o inmunoprecipitación. Un planteamiento preferido es la cromatografía que conlleva selección magnética, tal y como se comenta más adelante.

Por el término "fragmento funcional", según se usa el término para definir un marcador de superficie celular seleccionable, se quiere dar a entender una parte de ese marcador, por ejemplo, la glicoproteína CD4, la cual es capaz de unirse específicamente a otra molécula inmunológica tal como un anticuerpo, como un anticuerpo monoclonal. El término significa también que incluye la secuencia de ácido nucleico que codifica para el fragmento funcional.

En general, una vez se elige una secuencia seleccionable adecuada, la misma será unida operativamente a una o más secuencias regulatorias, a los efectos de que la secuencia de aminoácidos codificada esté posicionada en el vector, por ejemplo, adyacente a un promotor. De este modo, se facilita la expresión de la secuencia de aminoácidos deseada. Se contempla el hecho de que algunas secuencias de aminoácidos, tales como una proteína heteróloga u homóloga, tendrán su propia célula o promotor específico tisular. Nuevas secuencias regulatorias incluidas resultan adecuadas como secuencias de poliadenilación y líderes.

En ejemplos más particulares de la presente invención, la expresión de la secuencia de aminoácidos es o bien como mono- o di-cistron, según necesidades. Por ejemplo, la expresión es monocistrónica cuando el promotor está unido operativamente tanto a la secuencia de ácido nucleico seleccionable como a la secuencia de aminoácidos de interés, por ejemplo, promotor/secuencia de aminoácidos codificada/secuencia de ácido nucleico seleccionable; promotor/secuencia de ácido nucleico seleccionable/secuencia de aminoácidos codificada. Alternativamente, surge la expresión distrónica a partir de la expresión de la secuencia de aminoácidos a partir de promotores separados, por ejemplo, promotor/secuencia de aminoácidos codificados o secuencia de ácido nucleico seleccionable.

Tal y como se ha comentado, los presentes procedimientos son compatibles con una amplia variedad de vectores. Estos vectores codifican habitualmente para la secuencia de aminoácidos (o para varias de estas secuencias), para las cuales se desea una expresión reforzada. Un formato de vector preferido es identificado a veces como una cassette de expresión. En una realización, la cassette de expresión incluye generalmente un promotor funcional en la célula o una línea celular que alberga el vector, un operador, un punto de iniciación ribosómico, la secuencia de aminoácidos y una parte 3' suficiente que codifica para las señales de poliadenilación, para facilitar el procesado y, en algunos casos, la secreción de la secuencia de aminoácidos a partir de las células. La secuencia de poliadenilación procedente de SV40 constituye un ejemplo preferido de una secuencia terminadora. Si se desea, la cassette de expresión u otra parte adecuada del vector puede incluir una secuencia señal próxima a la terminación 5' de la secuencia de aminoácidos, para facilitar el procesado post-translacional de esa secuencia. Al menos un marcador genético adecuado o un vector de superficie celular puede ser posicionado en el vector, si se desea.

Un vector de DNA que comprende (i) un origen de replicación (Ori) funcional en E. Coli; (ii) un marcador genético seleccionable (gen de resistencia a antibióticos, por ejemplo, de resistencia a Amp, Tet, Neo o Kan); (iii) un promotor vírico potente, tal como el promotor citomegalovirus (CMV) y un elemento potenciador CMV opcional, (iv) una secuencia líder de región constante de cadena ligera de inmunoglobina (Ig-C_{L}), (v) la secuencia de aminoácidos de interés, (vi) un intrón Ig-C_{L}de longitud completa, unido a un exón Ig-C_{L}, (vii) una secuencia de poliadenilación de hormona del crecimiento, por ejemplo, la secuencia poli A de la hormona de crecimiento bovina (bgh) y (viii) DNA que codifica para un marcador eucariota seleccionable, tal como un promotor vírico potente (por ejemplo, el promotor de virus de simio 40 (SV40)), unido al gen de resistencia a antibiótico y fusionado con una secuencia de poliadenilación (por ejemplo, la secuencia poli A de SV40), constituyen ejemplos más específicos de un vector adecuado que incluye la cassette de expresión. Alternativamente, el vector DNA puede incluir la totalidad de (i)-(v) y de (vii)-(viii) indicadas anteriormente, sin el intrón de longitud completa Ig-C_{L} unido al exón Ig-C_{L} de (vi). La secuencia líder kappa de ratón constituye un ejemplo de secuencia líder de Ig-C_{L}. El gen C_{K} de longitud completa constituye un ejemplo de intrón y exón Ig-C_{L} de longitud completa

La secuencia de aminoácidos para la que se desea una expresión reforzada puede ser prácticamente cualquier secuencia de proteína o de polipéptido, incluyendo las proteínas heterólogas o homólogas (endógenas) producidas de forma natural por la célula huésped. En la mayoría de los casos, la secuencia de aminoácidos será una proteína eucariota, incluyendo, sin que ello suponga ninguna limitación, una subunidad o un fragmento funcional de una secuencia de aminoácidos más grande, tal como una proteína con multi-subunidades. Entre las secuencias de aminoácidos más específicas se incluyen enzimas, inmunoglobulinas, hormonas peptídicas, vacunas, receptores, incluyendo receptores de células T, moléculas MHC/HLA (clase I y clase II); o fragmentos de las mismas. Adicionalmente, entre las proteínas específicas se incluyen factores de crecimiento, factores de coagulación de la sangre, citoquinas, por ejemplo, actiivador de plasminógeno, facto tisular (TF), insulina, hormona de crecimiento de mamífero, eritropoyetina, IgE, uroquinasa, interleuquinas 1, 2 y 3; o fragmentos de las mismas. La invención es además compatible con otras secuencias de aminoácidos conocidas, parcialmente conocidas o desconocidas, entre las que se incluyen aquellas que codifican para secuencias genéticas nuevas.

Puede encontrarse una diversidad de secuencias de aminoácidos, por ejemplo, en Genbank (National Library of Medicine, 38A, 8N05, Rockville Pike, Bethesda, MD 20894). Genbank se encuentra también disponible en Internet en http://www.ncbi.nlm.nih.gov.

Los pesos moleculares de los vectores específicos comentados en el presente documento pueden ser determinados por medio de técnicas convencionales, tales como el dimensionamiento por electroforesis en gel de agarosa y variarán en función de, por ejemplo, el uso al que se pretendan destinar. No obstante, los vectores más adecuados y especialmente el vector adecuado DNA tendrá un peso molecular de al menos aproximadamente 5 kb y particularmente entre aproximadamente 5 kb y aproximadamente 35 kb o más elevado. El peso molecular de secuencias de aminoácidos particulares puede ser determinado por medio de técnicas de dimensionamiento de proteínas estándares, tales como la electroforesis en gel de poliacrilamida. Alternativamente, o adicionalmente, el peso molecular puede ser estimado mediante la determinación del peso molecular de la correspondiente secuencia de ácido nucleico, seguido de la traducción conceptual de esta secuencia. Para la mayor parte de las aplicaciones, el tamaño del ácido nucleico que codifica para la secuencia de aminoácidos será suficiente para codificar para una proteína o polipéptido de entre aproximadamente 500 y aproximadamente 300.000 daltons, siendo generalmente preferido entre aproximadamente 15 y aproximadamente 200.000 daltons.

Ver los siguientes ejemplos para vectores más específicos, que pueden ser utilizados con la invención, tales como pJAlgG4Tf.A8, pDRHK y pMACS. Ver también las Figuras 1A y 1B. En particular, el vector pDRHK ha sido depositado, de acuerdo con el tratado de Budapest, ante la ATCC, en la dirección indicada anteriormente. El vector DNA fue depositado ante la ATCC el 17 de septiembre de 1997 y se le asignó el número de acceso 209274. El vector pDRHK es un vector de expresión en mamíferos que incluye un promotor CMV, un péptido líder kappa IgC de ratón, una región de clonación, un intrón kappa de ratón y una secuencia de exón de dominio constante kappa humana.

Tal y como se ha comentado anteriormente, la presente invención caracteriza una serie de manipulaciones recombinantes, que conllevan la introducción secuencial y coordinada del vector para generar líneas celulares de mamífero recombinantes que expresan elevados niveles de una secuencia de aminoácidos. La introducción de los vectores puede ser lograda a través de una diversidad de vías, incluyendo la transferencia retrovírica, la infección vírica, la transfección mediada por calcio, por liposoma o por polibreno, la transferencia biolística u otra de las técnicas conocidas anteriormente. Entre los procedimientos de introducción más preferidos se incluyen aquellos que son adaptables para la transfección estable de células de mamíferos, tales como la electroporación. No obstante, para algunas aplicaciones, puede resultar de utilidad utilizar algunos procedimientos de introducción transitorios, siempre y cuando las líneas celulares recombinantes resultantes sean genéticamente estables.

Como ilustración más específica de la invención, una célula huésped de mamífero adecuada, tal como CHO, es transfectada una vez (única) o al menos dos veces (múltiple) con vectores adecuados que incluyen, cada uno de ellos, al menos un marcador seleccionable y que codifican para al menos una proteína heteróloga de interés. En una realización más específica, las células huésped son transfectadas con un vector que incluye una primera secuencia detectable (marcador genético), unida operativamente a un segmento unido operativamente a la proteína codificada. Para introducir el vector en las células huésped pueden utilizarse una diversidad de procedimientos de transfección, tales como la transfección mediada por fosfato cálcico estándar o técnicas de lipofección. La células huésped transfectadas son después sometidas a condiciones de crecimiento selectivas, a los efectos de que las primeras células de elevada expresión puedan ser aisladas. Se han descrito procedimientos para aislar células transfectadas en, por ejemplo, Sambrook et al., supra, Ausubel et al., supra; y en Wigler PNAS (USA) (1979) 76:1376.

Las primeras células de elevada expresión son aisladas y pueden ser caracterizadas, si así se desea, a través de una técnica o de una combinación de las técnicas estándar. Por ejemplo, en un planteamiento, las células CHO son transfectadas con un vector que codifica para un marcador genético de neomicina (proporcionando resistencia G418), unido operativamente a una secuencia de proteína, tal como una secuencia que codifica para inmunoglobina y, particularmente, una secuencia que codifica para un anticuerpo. Las células huésped transfectadas que expresan la secuencia de proteína son después clonadas a través de técnicas estándar (por ejemplo, limitando la dilución y el crecimiento), llevadas a cabo en placas de cultivo tisular de microvaloración. Tras someter las células a incubación, durante un período de tiempo comprendido entre aproximadamente unos pocos días y hasta unas pocas semanas, o un poco más, aparecerán las habituales colonias. Preferiblemente tan solo se utiliza una única colonia para manipulaciones adicionales. Los clones de elevada producción son seleccionados a través de cualquier procedimiento aceptable, tal como procedimientos inmunológicos estándar y, particularmente, un ensayo ELISA. Resultan preferidos los ensayos ELISA optimizados para detectar y cuantificar la producción de anticuerpos. Las células de elevada producción preferidas son aquellas que producen sustancialmente la cantidad más elevada de anticuerpo en el ensayo ELISA. Resultan más preferidas las primeras células de elevada producción que producen entre aproximadamente 0,5 y aproximadamente 20 microgramos de anticuerpo por mililitro de medio. Resultan específicamente preferidas las primeras células de elevada producción que producen entre aproximadamente 1 y aproximadamente 5 microgramos de anticuerpo por mililitro de medio.

Las primeras células altamente productoras son nuevamente manipuladas particularmente para incrementar las copias celulares de ácidos nucleicos que codifican para la secuencia de proteína. Un objetivo específico en este ejemplo es producir una línea celular productora de anticuerpo genéticamente estable. En una realización, la primeras células altamente productoras son nuevamente transfectadas, por ejemplo, mediante electroporación, con dos diferentes vectores: uno que codifica para la secuencia de proteína y el otro que codifica para un marcador de superficie celular adecuado, tal como una glicoproteína y, especialmente, CD4 o uno de sus fragmentos. Ver la Figura 1A. Un vector disponible comercialmente preferido que codifica para CD4 es pMACS (ver más adelante). En este ejemplo, los transfectantes son tratados con un anticuerpo específico o con un fragmento del mismo para unión con antígeno adecuado, capaz de unirse específicamente a la proteína de la superficie celular.

Por el término "generalmente estable" se quiere hacer referencia en el presente documento a un medio celular que está sustancialmente exento de reordenamientos genómicos que incluyen el ácido nucleico heterólogo. Entre los reordenamientos que se evitan particularmente se incluyen los cromosomas minúsculos dobles. Los presentes procedimientos introducen preferiblemente los ácido nucleicos heterólogos en el genoma de células huésped para maximizar la estabilidad genética.

La unión específica entre células que expresan la proteína de superficie celular a partir de uno de los vectores y la proteína codificada por el otro vector puede ser detectada de una diversidad de formas, incluyendo técnicas de inmunología estándar y, especialmente, cromatografía en columna relacionada con bolitas magnéticas. En este planteamiento, el anticuerpo objetivo frente a la proteína de la superficie celular está unido covalentemente a las bolitas magnéticas, permitiendo con ello que cualquiera de las células exprese la proteína de superficie celular que tiene que ser aislada, mediante la aplicación de un campo magnético a las células y a las bolitas magnéticas. Las células unidas son después extraídas de la columna y cultivadas en placas de cultivo tisular de microvaloración. Opcionalmente, las células pueden ser cultivadas en medios selectivos, tales como medios suplementados con G418.

Las segundas células altamente productoras pueden aislarse a través de diversas técnicas. Por ejemplo, en un planteamiento particular, las células son cultivadas en los pocillos durante un período de tiempo suficiente para permitir la producción de anticuerpo y la secreción en el medio de cultivo. Un anticuerpo anti-idiotípico adecuado frente a una porción Fc se utiliza para revestir los pocillos de placas de cultivo de microvaloración y se le añade después medio de cultivo. El medio, incluyendo elevados niveles el anticuerpo, puede ser detectado a través de técnicas estándar, tales como ensayos tipo sándwich convencionales utilizando un anticuerpo secundario adecuado marcado con, por ejemplo, peroxidasa de rábano silvestre (HRP). Las segundas células de elevada producción preferidas son aisladas mediante la identificación de elevadas tasas de producción de anticuerpo con el número de células en la placa. Los procedimientos para llevar a cabo este análisis se describen con mayor detalle más adelante e incluyen, específicamente, un formato de detección ELISA. Resultan preferidas las segundas células de elevada producción que generan entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 10 microgramos de anticuerpo o más por 10^{6} células, durante un período de tiempo de aproximadamente 24 horas. Un rango más preferido es el comprendido entre aproximadamente 1 y aproximadamente 5 microgramos de anticuerpo por 10^{6} células, a lo largo de aproximadamente un período de 24 horas.

Tal y como se ha comentado, resultan adicionalmente preferidas las segundas células de elevada producción que generan entre aproximadamente 3 y aproximadamente 40 veces o más de anticuerpo, cuando se comparan con las primeras células de elevada producción. La reactividad a anticuerpo constituye un procedimiento preferido para la realización de esta determinación.

Las segundas células de elevada expresión son transfectadas adicionalmente para proporcionar aislamiento de las líneas celulares que expresan la mayor parte de las proteínas, por ejemplo, las terceras células de elevada expresión. Por ejemplo, para incrementar la producción del anticuerpo en las segundas células de elevada expresión, los dos vectores utilizados para transfectar las primeras células de elevada expresión son utilizados de nuevo para co-transfectar las segundas células de elevada expresión. Un procedimiento de transfección preferido es la electroporación, si bien, si así se desease, podrían utilizarse otros procedimientos de transfección. Pueden aislarse células de elevada producción que permiten obtener niveles incrementados del anticuerpo, tal y como se ha comentado anteriormente, conllevando cromatografía en columna magnética de células que expresan CD4, seguido de aislamiento de las células de elevada producción. Opcionalmente, las células pueden ser cultivadas en medios no selectivos o selectivos, tales como medios suplementados con G418. Las células de elevada producción preferidas generan niveles máximos de anticuerpo, tal y como se determina a través de la identificación de tasas de elevada producción de anticuerpo con el número de células de la placa.

En este ejemplo, las líneas celulares seleccionadas son preferiblemente diluidas en serie y cultivadas a través de procedimientos convencionales en placas de cultivo tisulares de microvaloración. Transcurrido un período de tiempo comprendido entre aproximadamente unos pocos días y unas pocas semanas, se somete a comprobación la producción de anticuerpos a través de una técnica inmunológica adecuada, tal como ELISA. Los clones con elevados niveles de producción de anticuerpo son nuevamente amplificados. Resultan preferidos aquellos clones que tienen entre aproximadamente 1 y aproximadamente 100 microgramos de anticuerpo o más, por 10^{6} células, a lo largo de un período de 24 horas. Un intervalo más preferido es el comprendido entre aproximadamente 15 y aproximadamente 50 microgramos de anticuerpo por 10^{6} células, a lo largo de un período de 24 horas. Resultan adicionalmente preferidos los clones que muestran al menos aproximadamente 2 veces más y hasta 10 veces más de producción de anticuerpo que las segundas células de elevada producción.

Los clones seleccionados que satisfacen los criterios mencionados anteriormente son preferiblemente diluidos en serie según procedimientos estándar. Una vez transcurrido un período de tiempo comprendido entre unos pocos días y unas pocas semanas, o más, las colonias únicas son objeto de comprobación en relación con la producción de anticuerpos, a través de un procedimiento inmunológico adecuado, tal como ELISA. El clon de producción más elevada (la tercera célula de elevada expresión) es seleccionado para la preparación de cultivos estáticos, tal y como se describe más adelante con mayor detalle. Las terceras células de elevada expresión preferidas generan entre aproximadamente 20 y aproximadamente 200 microgramos por mililitro de cultivo. Más preferiblemente, las terceras células de elevada expresión generan entre aproximadamente 50 y 150 microgramos por mililitro de cultivo, resultando generalmente preferida la producción de aproximadamente 100 microgramos por mililitro.

Resultan adicionalmente preferidas las terceras células de elevada producción que generan entre aproximadamente 3 y aproximadamente 40 veces o más del anticuerpo, en comparación con las segundas células de elevada producción, tal y como se determina a través de la reactividad del anticuerpo.

Resultan adicionalmente preferidas las terceras células de elevada producción que generan entre aproximadamente 10 y aproximadamente 200 veces o más del anticuerpo, en comparación con las primeras células de elevada producción, tal y como se determina a través de la reactividad del anticuerpo.

El anticuerpo anti-TF codificado por el vector pJAlgG4TF.A8, mostrado en la Figura 1A, constituye un ejemplo de anticuerpo adecuado.

Las líneas celulares de elevada producción de generadas a través de losprocedimientos descritos en el presente documento presentan un número de aplicaciones altamente útiles, incluyendo el uso comercial, en investigación y ajustes médicos. Por ejemplo, se ha averiguado que las células de elevada producción generadas a través del procedimiento resultan especialmente adecuadas para producción a escala comercial de la secuencia de proteína. A título ilustrativo, los ejemplos mostrados más adelante describen la utilización de un biorreactor de fibra hueca para producir la secuencia de proteína a gran escala (a saber, cantidades del orden de miligramos por ml.).

En un ejemplo específico de la presente invención, pueden generarse líneas celulares de mamífero recombinantes que produzcan elevados niveles de complejos MHC y, particularmente, de MHC recombinante de cadena única y complejos heterodiméricos. Estos complejos han sido descritos, por ejemplo, en la patente US nº 5.869.270, depositada el 31 de enero de 1996 y en la solicitud PCT WO 96/04314, publicada el 15 de febrero de 1996. En el documento US 5.869.270 y en la solicitud PCT publicada WO 96/04314 se describen particularmente una diversidad de complejos de fusión MHC de cadena única, que comprenden un péptido presente unido covalentemente.

Por ejemplo, para generar líneas celulares de mamífero recombinantes que expresan un complejo MHC de cadena única deseado, se transfecta una vez una célula huésped de mamífero adecuada, tal como CHO, (única) o al menos dos veces (múltiple), con vectores adecuados. Cada uno de los vectores incluye al menos un marcador seleccionable, tal y como se ha definido anteriormente, y al menos un segmento que codifica para el complejo MHC de cadena única. En realizaciones preferidas, el complejo de cadena única es de clase II, si bien, en algunos casos, puede resultar preferido un complejo de cadena única de clase I. Las células huésped son transfectadas preferiblemente con un vector adecuado que codifica para el complejo de cadena única unido operativamente con el marcador seleccionable. Pueden utilizarse una diversidad de procedimientos de transfección, tales como la transfección mediada por fosfato cálcico estándar o técnicas de lipofección. Las células huésped transfectadas son después sometidas a condiciones de crecimiento selectivas, con vistas a que las primeras células de elevada expresión puedan ser aisladas. Procedimientos para aislar células transfectadas se han descrito en, por ejemplo, Sambrook et al., supra; Ausubel et al., supra, y en Wigler PNAS (USA) (1979) 76: 1376.

En un procedimiento más específico, el vector incluye un marcador genético seleccionable, tal como un gen de neomicina, operativamente unido al complejo MHC de cadena única. Las células huésped son preferiblemente transfectadas por medio de electroporación y las células huésped transfectadas que expresan la secuencia de proteína de fusión son clonadas por medio de la limitación de los procedimientos de dilución llevados a cabo en placas de cultivos tisulares de microvaloración. Una vez sometidas las células a incubación durante un período de tiempo comprendido entre un día y una pocas semanas o más, las células transfectadas son recogidas y diluidas en medios no selectivos o selectivos, tales como medios suplementados con G418. Los sobrenadantes son objeto de comprobación, tal y como se describe en los ejemplos que siguen. Los clones de elevada producción son seleccionados y expandidos. Los clones seleccionados son recogidos y cultivados durante un período de tiempo que oscila entre varios días y una pocas semanas o más, para aislar las primeras células de elevada producción. Resultan preferidas la primeras células de elevada producción que generan entre aproximadamente 1 y 100 nanogranmos de la proteína de fusión por ml. de medio. Resultan más preferidas las primeras células de elevada producción que generan entre aproximadamente 10 y 50 nanogramos por mililitro.

Las primeras células de elevada producción que generan proteína de fusión MHC de cadena única son nuevamente manipuladas, tal y como se indica seguidamente. Las primeras células de elevada producción son nuevamente co-transfectadas, por ejemplo, mediante electroporación, con dos vectores: uno que codifica para la proteína de fusión de cadena única y otro vector que codifica para una proteína de superficie celular, tal como una glicoproteína y especialmente CD4. Un vector preferido que codifica para CD4 es el vector pMACS (ver más adelante), disponible comercialmente. Los transfectantes son tratados subsiguientemente con un anticuerpo específico o con un fragmento de unión a antígeno adecuado de los mismos, capaz de unirse de formas específica a la proteína de la superficie celular. La unión específica puede ser detectada de una diversidad de formas, no obstante, la cromatografía en columna que conlleva bolitas magnéticas constituye un procedimiento preferido. Las células unidas son después extraídas de la columna y cultivadas en placas de cultivo tisular de microvaloración. Estas segundas células de elevada expresión pueden ser cultivadas en medios no selectivos o selectivos, tales como medios suplementados con G418.

Pueden prepararse cultivos estáticos de las segundas células de elevada producción, si así se desea. Resultan preferidas las segundas células de elevada producción que generan entre aproximadamente 50 y 500 nanogramos de proteína de fusión por mililitro. Resultan más preferidas las células de elevada producción que generan entre aproximadamente 100 y 200 nanogramos de la proteína de fusión por mililitro.

Para incrementar adicionalmente la producción de complejo MHC de cadena única, las segundas células de elevada producción pueden ser adicionalmente transfectadas. En un planteamiento, las segundas células de elevada producciónn son co-transfectadas con un mezcla de vector que codifica para la proteína de fusión MHC de cadena única y para otro vector que soporta una secuencia de ácido nucleico detectable que confiere resistencia al fármaco, tal como puromicina u otro fármaco adecuado. La co-transfección puede ser llevada a cabo a través de cualquier procedimiento adecuado, incluyendo la electroporación, si así se desea. Después de un período de tiempo de incubación, comprendido entre unos pocos días y unas pocas semanas o más, las células son recogidas y re-suspendidas en medios suplementados con puromicina. Una vez visualizadas las colonias resistentes, los medios de cultivo pueden ser objeto de comprobación, en lo que hace referencia a la producción de proteína de fusión, por ejemplo, a través de ELISA. Pueden prepararse cultivos estáticos a partir de clones que producen elevados niveles de la proteína. Las terceras células de elevada producción preferidas generan entre aproximadamente 500 y aproximadamente 5000 nanogramos por mililitro de la proteína de fusión. Resultan más preferidas las terceras células de elevada producción, las cuales generan entre aproximadamente 1000 y 2000 nanogramos por mililitro de la proteína.

Si se desea, las terceras células de elevada producción pueden ser nuevamente subclonadas para mejorar la expresión de la proteína recombinante. Un procedimiento preferido consiste en el clonado en dilución limitada. Resultan adicionalmente preferidos los clones de las terceras células de elevada producción que generan entre aproximadamente 100 y aproximadamente 1000 nanogramos de la proteína de fusión por mililitro, a lo largo de un período de 24 horas. Resultan particularmente preferidos los clones que producen entre aproximadamente 200 y 500 nanogramos de la proteína de fusión por mililitro, a lo largo de un período de 24 horas.

El vector pDRHK, mostrado en la Figura 1B, constituye un ejemplo de un vector que codifica para un complejo MHC de cadena única. Este vector codifica para un complejo MHC clase II de cadena única sc-DR2/MBP.

los presentes procedimientos pueden ser modificados para ser adaptados al uso que se pretende efectuar con los mismos. Por ejemplo, la invención abarca específicamente las siguientes realizaciones: 1) transfección con un vector de expresión que soporta un gen de resistencia a fármaco, 2) co-transfección con un vector de expresión y con un vector que expresa transitoriamente un marcador de superficie celular, y 3) co-transfección con un vector de expresión y un con vector que soporta un gen de resistencia a fármaco diferente. Los procedimientos de selección celular comentados en el presente documento pueden ser utilizados para implementar estas estrategias específicas. La invención puede ser también utilizada para re-transfectar células con vectores de expresión que codifican para proteínas recombinantes específicas de interés, tal como cuando un vector de expresión codifica para dos secuencias de polipéptido (cadenas de inmonuglobulina pesadas y ligeras). La expresión preferida conlleva la expresión coordinada de ambas cadenas de polipéptido. Estos procedimientos específicos y otros que se discuten en el presente documento encuentran una variedad de utilizaciones, incluida la de facilitar la selección y el cribado de las células.

La presente invención es ilustrada adicionalmente a través de los siguientes Ejemplos. Estos Ejemplos se proporcionan para contribuir a la comprensión de la invención y no tienen que ser construidos como limitadores de la misma.

Ejemplo I Retransfección de células CHO para elevado nivel de producción de anticuerpo de factor anti-tisular (TF) recombinante 1. Caracterización del vector

Se construyó un vector identificado como pJAlgG4TF.A8 (Figura 1A) para expresar factor anti-tisular (TF) quimérico pesado y cadenas de inmonoglobulina ligeras en células de mamífero. Se llevaron a cabo experimentos de transfección transitoria iniciales para comprobar la expresión de anticuerpo a partir del vector pJAlgG4TF.A8. Células COS fueron transfectadas transitoriamente utilizando el reactivo lipofectina Qiagen. Brevemente, 2,5x10^{5} células/pocillo fueron sembradas en una placa de 6 pocillos e incubadas durante un período de tiempo de 24 horas a 37ºC. Dos microgramos de pJAlgG4TF.A8 DNA fueron mezclados con 100 \mul de IMDM. Para preparar el complejo lípido, 10 \mul de lípidos fueron añadidos a la solución de DNA. La mezcla fue sometida a mezclado vorticial e incubada a temperatura ambiente durante un período de 5 minutos. Mientras el DNA formaba el complejo lipídico, las células fueron lavadas con PBS. La mezcla DNA-lípido fue mezclada con 600 \mul de SSM al 10% [medio CellGro IMDM (MediaTech) suplementado con suero bovino fetal al 10% (FBS)] y añadida a las células lavadas. Las células fueron sometidas a incubación con complejos lípidos por espacio de 3 horas a 37ºC y 10% de CO_{2}. Las células transfectadas fueron lavadas con PBS, alimentadas con 2 ml de SSM al 10% e incubadas por espacio de 72 horas a 37ºC y 10% de CO_{2}. El cultivo sobrenadante fue objeto de comprobación para determinar la producción de anticuerpo.

2. ELISA para comprobar la producción de anticuerpo

Para detectar la presencia del anticuerpo IgG4 humano, se desarrolló un sándwich ELISA HC/kappa específico para humanos. Brevemente, placas Maxisorp de 96 pocillos (NUNC) fueron revestidas con 100 \mul de IgG-Fc anti-humana de cabra (Fab), a una concentración de 1 \mug/ml, en tampón R5 (Tris-HCL 10 mM, pH 8,5) y sometidas a incubación a 4ºC durante el transcurso de una noche. Los pocillos fueron lavados con tampón R55 (Imidazol 2 mM, NaCl 7,5 mM; Tween-20 0,02%) una vez, cubiertas con una película de plástico y almacenadas a 4ºC hasta su utilización. Para ensayar la producción de anticuerpo, se extrajo el R55 y se añadieron 100 \mul de sobrenadante transfectante a los pocillos revestidos. Una vez transcurridos 30 minutos a 37ºC, los pocillos fueron lavados 6 veces con tampón R55 y se añadieron 100 \mul de una dilución 1:800 (en PBS que contenía FBS 10%) de un anticuerpo HRP de cadena Kappa anti-humano (Southern Biotech). Las placas fueron después incubadas a 37ºC y lavadas 6 veces con 400 \mul de tampón R55. Para detectar la presencia del anticuerpo sonda, se añadieron 100 \mul de sustrato 1x ABTS (Kirkegaard & Perry Labs) por espacio de 4 minutos, seguido de 100 \mul de tampón de apagamiento ABTS (Kirkegaard & Perry Labs). Se tomó la lectura de la absorbancia a 405 nm. La proteína IgG4 humana purificada se utilizó como control positivo. Los resultados del citado ensayo mostraron que el anticuerpo anti-TFIgG4 se obtuvo por medio de células COS transfectadas transitoriamente por el vector pJAlgG4TF.A8.

3. ELISA para comprobar la especificidad del anticuerpo

Se desarrolló un segundo sándwich ELISA para detectar, de forma específica, la unión de anticuerpo a factor tisular humano. Placas Maxisorp de 96 pocillos (NUNC) fueron revestidas a 4ºC durante el transcurso de una noche con 100 \mul de TF recombinante humano a razón de 500 ng/ml en tampón R65 (Bicarbonato sódico 100 mM, pH 8,2). Al día siguiente, las placas fueron lavadas una vez con tampón R55, cubiertas y almacenadas a 4ºC hasta su utilización. Para detectar la producción de anticuerpo anti-TF, se extrajo el R55 y se añadieron 100 \mul de sobrenadante transfectante a los pocillos revestidos. Una vez transcurridos 30 minutos a 37ºC, los pocillos fueron lavados 6 veces con tampón R55 y se añadieron 100 \mul de una dilución 1:1800 (en PBS que contenía FBS al 10%) de HRP de cadena Kappa anti-humano (Southern Biotech). Las placas fueron incubadas entonces a 37ºC y lavadas 6 veces con 400 pi de tampón R55. Para detectar la presencia del anticuerpo sonda, 100 \mul de 1xABTS fueron añadidos durante un período de 4 minutos, seguido de 100 \mul de tampón de apagamiento ABTS. Se tomo lectura de la absorbancia a 405 nm. Como control positivo se utilizó proteína anti-TF H36.D2 de ratón purificada. Los resultados obtenidos a partir del citado ensayo mostraron que el anticuerpo IgG4 anti-TF era producido por células COS transfectadas transitoriamente por el pJAlgG4TF.A8.

4. Transfección estable inicial de células CHO

Para generar una línea celular estable que expresara el anticuerpo anti-TF recombinante, células CHO.K1 fueron transfectadas con el vector pJAlgG4TF.A8. Brevemente, 100 \mug de pJAlgG4TF.A8 DNA fueron linearizados por medio de digestión con Pvul a 37ºC, durante un período de tiempo de aproximadamente 4 horas. Células CHO.K1 (ATCC CCL-61) se diluyeron hasta una concentración de 1,25x10^{7} células/ml. A una cubeta de electroporación de 0,4 cm se le añadió un volumen de 800 \mul de células y fueron incubadas sobre hielo por espacio de 10 minutos. Se añadieron veinticinco microgramos de pJAlg4TF.A8 DNA, se mezclaron con las células e incubaron por espacio de 10 minutos. Las células fueron entonces sometidas a electroporación a 960 \muF y 250 V. Una vez transcurrido un período de 10 minutos de incubación sobre hielo, la suspensión celular fue añadida a un matraz T25 con 10 ml de SSM al 10% y se sometió a incubación durante el transcurso de una noche a 37ºC, en 10% de CO_{2}. Veinticuatro horas más tarde, las células fueron recogidas por medio de incubación con tripsina-PBS, re-suspendidas en PBS y diluidas en medio suplementado con G418, a razón de 1:9; 1:27 y 1:81. Las células transfectadas fueron colocadas en placas, a razón de 100 \mul/pocillo en placas de 96 pocillos y se incubaron a 37ºC en 10% de CO_{2}.

El sobrenadante de cultivo procedente de las células transfectadas fue objeto de comprobación en relación con la producción de anticuerpo, tal y como se ha descrito anteriormente. Los clones positivos fueron seleccionados y expandidos. El clon H9, procedente de la fila H de la columna 9 de la placa de dilución 1:27 fue seleccionado como un productor de anticuerpo de elevado nivel.

Esta línea celular fue clonada por medio por medio de dilución limitada. Brevemente, el clon seleccionado fue diluido hasta alcanzar 1000 células/ml en PBS. Se prepararon una serie de diluciones 1:10 en SSM al 10%, hasta obtener 1 célula/ml. A partir de estas diluciones, 100 \mul/pocillo fueron colocados en placas de fondo plano de 96 pocillos. Estas placas fueron incubadas a 37ºC en 10% de CO_{2}. Transcurridos tres días de incubación, se añadieron a cada uno de los pocillos 100 \mul de SSM al 10%. Tres semanas más tarde, empezaron a distinguirse colonias únicas. Únicamente se sometieron a comprobación las colonias únicas en lo que hace referencia a la producción de anticuerpos por medio de ELISA. Los clones con elevados niveles de producción de anticuerpo fueron amplificados y seleccionados. El clon H9gl2 fue seleccionado como el productor más destacado y analizado para determinar la producción de anticuerpo en cultivo estático.

Los clones seleccionados fueron recogidos por medio de tratamiento con tripsina, resuspendidos a una concentración de 1 x 10^{5} células/ml de SSM al 10% y añadidos a un matraz de cultivo tisular T-25. Las células fueron incubadas a 37ºC en 10% de CO_{2} al 10%, durante un período de tiempo de 21 días o hasta que se produjo el 80% de la muerte celular. La suspensión celular fue centrifugada y el sobrenadante objeto de comprobación, determinar la producción de Ab a través de ensayo ELISA. La producción máxima de anticuerpo por parte del clon H9gl2 fue de 3,5 \mug/ml.

5. Re-transfección estable de la línea celular CHO-H9g12

Este procedimiento fue desarrollado para añadir más copias de los genes de interés al genoma de una línea celular estable productora de Ab. Para proceder con este procedimiento, el clon H9g12 fue co-transfectado con una mezcla del mega vector pJAlgG4TF.A8 TF anti-humano y pMACS. El vector pMACS permite la expresión transitoria de la proteína CD4 unida a una membrana. Para co-transfectar la línea celular H9gl2, 800 \mul de una suspensión de 1,25 x 10^{7} células/ml fueron añadidos a una cubeta de electroporación de 0,4 cm y se incubaron sobre hielo durante un período de tiempo de 10 minutos. Una relación molar 3:1 de pJAlgG4TF.A8 y pMACS DNA (40 \mul de pJAlgG4TF.A8 linearizado por Pvul a razón de 1 \mug/ml y 5 \mul de pMACS superenrrollado a razón de 1 \mug/ml) fueron añadidos a las células. Después de ser sometidas a incubación sobre hielo durante un período de tiempo de 10 minutos, las células fueron sometidas a electroporación a 960 \muF y 250 V. Las células fueron incubadas a 37ºC durante un período de tiempo de 10 minutos, diluidas hasta 10 ml de SSM al 10% en un matraz T25 e incubadas durante un período de tiempo de 72 horas a 37ºC en 10% de CO_{2}, para permitir la expresión transitoria de la proteína CD4. En ese momento, las células fueron tratadas con 5 ml de PBE (EDTA en solución de PBS) a temperatura ambiente, hasta que se desprendieron. Las células fueron lavadas una vez, resuspendidas en 380 \mul de PBE y marcadas con 80 \mul de anticuerpo específico para la molécula CD4 humana, expresada en la superficie celular. Esta anticuerpo estaba covalentemente unido a una bolita magnética. Después de sometido a incubación durante un período de tiempo comprendido entre 15 y 20 minutos, a 4ºC, las células marcadas con anticuerpo fueron aplicadas a una columna magnética. Se esperaba que las células transfectadas que expresaban CD4 sobre sus superficie se unieran a la columna magnética. Las células no transfectadas fueron lavadas a través de la columna con 1 ml de PBE. Las células unidas fueron después eluídas de la columna retirando la columna del campo magnético y haciendo pasar a través de la misma 1 ml de PBE. Las células que expresaban CD4 fueron diluidas en 199 ml de SSM al 10% suplementado con G418 (1,5 mg/ml) y colocadas en placas de fondo plano de 96 pocillos. Las placas fueron incubadas a 37ºC con un 10% de CO_{2}.

Para comprobar la producción de anticuerpo, placas de 96 pocillos Maxisorp (NUNC) fueron revestidas con 100 \mul de IgG-Fc anti-humana de cabra (Fab)(Pierce), a una concentración de 1 \mug/ml, tal y como se ha descrito anteriormente. El medio procedente de las células re-transfectadas fue modificado 24 horas antes de la comprobación. Se añadieron cinco mililitros de sobrenadante transfectante de 24 horas a 95 \mul de FBS-PBS al 10%. El sobrenadante diluido fue añadido a los pocillos revestidos y sometido a incubación durante un período de tiempo de 60 minutos, a 37ºC. Los pocillos fueron lavados 6 veces con tampón R55 y, para detectar el anticuerpo recombinante presente en el sobrenadante, tal como se ha descrito anteriormente, se utilizó un anticuerpo-HRP de cadena kappa anti-humano (Southern Biotech). La proteína IgG4 humana purificada (Biodesign) se utilizó como control positivo y se utilizó para establecer una curva estándar para la concentración de anticuerpo.

La selección clonal se logró mediante la comparación de las tasas de producción de anticuerpo en relación con el número de células. Brevemente, los clones de elevada producción fueron tratados con tripsina y contados. Utilizando la tasa de producción de anticuerpo calculada y el número de células, se determinaron los valores para \mug de anticuerpo/10^{6} células/24 horas. Los clones de producción más elevada fueron amplificados hasta 24 pocillos/placa y expandidos. El clon seleccionado fue denominado 3D2.

Para clonaje a dilución limitada, los clones seleccionados fueron diluidos en serie en SSM al 10%, sembrados en 96 pocillos de placas de fondo plano y sometidos a incubación, tal y como se ha descrito anteriormente. Transcurrido un período de tres semanas, se comprobaron las colonias únicas, con vistas a determinar la producción de anticuerpo, por medio de ELISA. Los clones con elevados niveles de producción de anticuerpo fueron amplificados y seleccionados. El clon 3D2A9 mostró 2,58 \mug de anticuerpo/10^{6} células/24 horas y fue seleccionado como el mejor clon. El análisis de la producción de anticuerpo en cultivo estático se inicio para este clon.

Se iniciaron cultivos estáticos del clon 3D2A9, por medio de la adición de una concentración de 2x10^{5} células/ml en 10 ml de medio SSM al 10%, a un matraz de cultivo tisular T-25. Los matraces fueron sometidos a incubación a 37ºC en 10% de CO_{2} durante un período de 21 días o hasta alcanzar el 80% de la muerte celular. La suspensión celular fue centrifugada y el sobrenadante objeto de comprobación, con vistas a determinar la producción de anticuerpo por medio de ELISA. La máxima producción de anticuerpo del clon 3D2A9 fue de 21 \mug/ml. Este nivel de producción era 7 veces más elevado que el del primer clon de transfección.

3. Tercera transfección estable

Para incrementar adicionalmente el nivel de producción de anticuerpo de las células transfectadas, el clon 3D2A9 fue co-transfectado de nuevo con una mezcla del mega vector pJAlgG4TF.A8 anti-humano TF y pMACS. Para co-transfectar esta línea celular, 800 \mul de una suspensión de 1,25x10^{7} células/ml fueron añadidos a una cubeta de electroporación de 0,4 cm y sometidos a incubación sobre hielo durante un período de 10 minutos. Se les añadió a las células una relación molar 3:1 del pJAlgG4TF.A8 y pMACS DNA (50 \mul de pJAlgG4TF.A8 linearizado con Pvul, a razón de 1 \mug/ml y 5 \mul de pMACS, a razón de 1 \mug/ml, superenrrollado). Una vez incubadas sobre hielo por espacio de 10 minutos, las células fueron sometidas a electroporación a 960 \muF y 250 V. Las células fueron incubadas a 37ºC durante un período de 10 minutos, añadidas a 10 ml de SSM al 10% en un matraz T25 e incubadas por espacio de 48 horas a 37ºC en 10% de CO_{2}, para permitir la expresión transitoria de la proteína CD4. En ese momento, las células transfectadas fueron marcadas con las bolitas magnéticas anti-CD4 y seleccionadas sobre la columna magnética, tal y como se ha descrito anteriormente. Las células que expresan CD4 fueron diluidas en 200 ml de SSM al 10%, suplementado con G418 (1,5 mg/ml). La suspensión celular fue colocada en placas de 96 pocillos de fondo plano. Las placas fueron incubadas a 37ºC en 10% CO_{2}, durante un período de tiempo aproximado de tres semanas.

Placas de 96 pocillos Maxisorp (NUNC) fueron revestidas con 100 \mul de IgG-Fc anti-humana de cabra (Fab), a una concentración de 1 \mug/ml (Pierce) en R5, tal y como se ha descrito anteriormente. Para someter a ensayo las tasas de producción de anticuerpo, los medios procedentes de células re-transfectadas fueron modificados 24 horas antes de la comprobación. Cinco microlitros del sobrenadante transfectante de 24 horas fueron añadidos a 95 \mul de FBS-PBS al 10%. El sobrenadante diluido fue añadido a los pocillos revestidos y sometido a incubación durante un período de 60 minutos, a 37ºC. Los pocillos fueron lavados 6 veces con tampón R55 y para detectar el anticuerpo presente en el sobrenadante, se utilizó un anticuerpo-HRP de cadena kappa anti-humano (Southern Biotech), tal y como se ha descrito anteriormente. Un anticuerpo quimérico anti-TF purificado sirvió como control positivo y se utilizó para establecer una curva estándar para determinar la concentración de anticuerpo. Los resultados obtenidos como consecuencia de esta comprobación permitieron la selección de clones de elevada producción de anticuerpo, los cuales fueron después amplificados a una placa de 12 pocillos. Estos clones fueron cultivados hasta el 80% del pocillo y se comprobaron los sobrenadantes. Una dilución 1:100 del sobrenadante de cultivo a las 24 horas fue objeto de comprobación por medio de ELISA. Las células fueron también contadas y se determinaron los valores de \mug/10^{6} células/ 24 horas de producción de anticuerpo. Los clones madre de producción más elevada de anticuerpo A9B11 y A9F12 fueron seleccionados en base a estos valores.

Los clones seleccionados fueron diluidos en serie en SSM al 10%, sembrados en 96 pocillos de placas de fondo plano y sometidos a incubación tal y como se ha descrito anteriormente. Transcurridas tres semanas, se comprobaron las colonias únicas, para determinar la producción de anticuerpo por medio de ELISA. Los clones con elevados niveles de producción de anticuerpo fueron amplificados y seleccionados. Se averiguó que los clones primarios A9F12C2 y A9AI IB5 tenían los clones con una tasa de producción de anticuerpo más elevada de entre 30 y 40 \mug/10^{6} células/24 horas. Los clones fueron expandidos para cultivos estáticos.

Se iniciaron cultivos estáticos del clon A9F12C2, mediante la adición de una concentración de 2x10^{5} células/ml en 10 ml de medio SSM al 10%, a un matraz de cultivo tisular T-25. Los matraces fueron incubados a 37ºC en 10% de CO_{2} durante un período de 21 días, o hasta alcanzar el 80% de la muerte celular. La suspensión celular fue centrifugada y el sobrenadante objeto de comprobación, con vistas a determinar la producción de Ab por medio de ELISA. La máxima producción de anticuerpo del clon A9F12C2 fue de 52 \mug/ml. Este nivel de producción era 2 veces más elevado que el del segundo clon de transfección.

El clon seleccionado fue diluido en serie en SSM al 10%, sembrado en 96 pocillos de placas de fondo plano y sometido a incubación, tal y como se ha descrito anteriormente. Transcurridas tres semanas, se comprobaron las colonias únicas para determinar la producción de anticuerpo por medio de ELISA. Se averiguó que el clon secundario A9F12C2E7 presentaba la tasa de producción de anticuerpo más elevada y fue expandido para cultivos estáticos. Estos cultivos estáticos fueron llevados a cabo tal y como se ha descrito anteriormente.

Para determinar la concentración de anticuerpo en los sobrenadantes de cultivo estático, 5 \mul del sobrenadante celular A9F12C2E7 fueron añadidos a 4,995 \mul de PBS al 10%. Este sobrenadante diluido fue objeto de ensayo en relación con el anticuerpo quimérico, por medio del anticuerpo ELISA, tal y como se ha descrito anteriormente. Como control positivo se utilizó anticuerpo quimérico anti-TF purificado. Los resultados obtenidos a partir de esta comprobación indicaron que el clon secundario A9F12C2E7 tenía un nivel de producción máximo de anticuerpo de 52,6 \mug/ml, en cultivo estático.

El clon seleccionado A9F12C12E7 fue diluido en serie en SSM al 10%, sembrado en 96 pocillos de placas de fondo plano y sometido a incubación, tal y como se ha descrito anteriormente. Transcurridas tres semanas, se comprobaron las colonias únicas, para determinar la producción de anticuerpo por medio de ELISA. El clon terciario A9F12C2E7B4 fue seleccionado como el productor más elevado y fue expandido para cultivo estático. Estos cultivos fueron iniciados tal y como se ha descrito anteriormente.

Para determinar la concentración de anticuerpo en los sobrenadantes de cultivo estático, 5 \mul del sobrenadante celular A9F12C2E7 fueron añadidos a 4,995 \mul de PBS al 10%. Este sobrenadante diluido fue objeto de ensayo en relación con el anticuerpo quimérico, por medio del anticuerpo ELISA, tal y como se ha descrito anteriormente. Como control positivo se utilizó el anticuerpo quimérico anti-TF purificado internamente. La máxima producción de anticuerpo para el clon A9F12C2E7B4 era de 102,3 \mul/ml (Figura 2). La línea celular fue amplificada y congelada. Se prepararon cincuenta viales a una concentración de 1x10^{6} células/ml, como banco inicial de células semilla y fueron almacenados en nitrógeno líquido. La designación otorgada a la línea celular era cH36 (químerico H36).

4. Inyección en biorreactor

Se instaló un biorreactor de fibra hueca, tal y como se indicaba en las instrucciones del fabricante. El clon seleccionado fue resuspendido a razón de 1x10^{8} células /ml en el volumen correcto de SSM al 30% y se inyectó en el biorreactor. El biorreactor fue entonces puesto en marcha, según lo especificado en las instrucciones del fabricante. La producción máxima fue comprobada a través de ELISA, tal y como se ha descrito anteriormente. El primer clon primario de transfección H9gl2 produjo 70 \mug de antibiótico/ml como máximo, en comparación con el tercer clon primario de transfección Al1B5, el cual producía 1,100 \mug de anticuerpo/ml (Figura 3).

Ejemplo 2 Generación de líneas celulares para la producción de la molécula de clase II MHC HLA-DR2 1. Caracterización del vector

Se construyó un vector identificado como pDRHK figura 1B), para la expresión en mamífero de la molécula HLA-DR2/MBP de cadena única soluble, fusionada con el dominio constante kappa de inmunoglobina humana. Se llevaron a cabo experimentos de transfección transitoria inicial, para comprobar la expresión de proteína a partir el vector pDRHK. Células COS fueron transfectadas transitoriamente utilizando el reactivo lipofectina Qiagen. Brevemente, 2,5x10^{5} células por pocillo fueron sembradas en una placa de 6 pocillos sometidas a incubación durante un período de 24 horas, a 37ºC. Dos microgramos de pDRHK DNA fueron mezclados con 100 \mul de IMDM. Para preparar el complejo lipídico, 10 \mul de lípidos fueron añadidos a la solución de DNA. La mezcla fue sometida a mezclado vorticial y sometida a incubación a temperatura ambiente por espacio de 5 minutos. Si bien el DNA estaba formando el complejo lipídico, las células fueron lavadas con PBS. La mezcla lípido-DNA fue mezclada con 600 \mul de SSM al 10% y añadida a las células lavadas. Las células fueron incubadas con complejos lipídicos durante un período de 3 horas a 37ºC y 10% de CO_{2}. Las células transfectadas fueron lavadas con PBS, alimentadas con 2 ml de SSM al 10% y sometidas a incubación por espacio de 72 horas a 37ºC y 10% de CO_{2}. El sobrenadante fue objeto de comprobación, en relación con la producción de DR2/MBP-CK recombinante.

2. ELISA para detectar la producción de sc-DR2/MBP-C_{K}

Para detectar la presencia del sc-DRZ/MBP-C6, se desarrolló un ELISA sándwich específico 6/HLA-DR humano. Brevemente, placas de 96 pocillos Maxisorp (NUNC) fueron revestidas con 100 \mul de IgG-kappa anti-humana de cabra, a una concentración de 1 \mug/ml, en PBS y se sometió a incubación a 4ºC durante el transcurso de una noche. Los pocillos fueron después lavados con tampón R55 una vez, cubiertos con una película de plástico y almacenados a 4ºC hasta su utilización. Para ensayar la producción de proteína recombinante, el R55 fue extraído y se añadieron 100 \mul de sobrenadante transfectante a los pocillos revestidos. Una vez transcurridos 60 minutos a 37ºC, los pocillos fueron lavados 6 veces con tampón R55 y 100 \mul de una dilución 1:1000 (en PBS que contenía 10% FBS) de un anticuerpo L243 anti HLA-DR, conjugado a HRP (Anergen, ATCC HB-55). Las placas fueron después sometidas a incubación a 37ºC y lavadas 6 veces con 400 \mul de tampón R55. Para detectar la presencia de anticuerpo sonda, 100 \mul de sustrato 1xABTS fueron añadidos, durante un período de 5 minutos, seguidos de 100 \mul de tampón de apagamiento ABTS. Se leyó la absorbancia a 405 nm. Los resultados obtenidos a partir del citado ensayo mostraron que la proteína de fusión scDR2/MBP-C_{K} era producida por células COS transfectadas transitoriamente por el vector pDRHK.

3. Transfección estable inicial

Para generar una línea celular estable que expresase la proteína de fusión sc-DR2/MBP-C_{K}, células CHO.K1 fueron transfectadas con el vector pDRHK. Brevemente, 100 \mug de pDRHK DNA fueron linearizados mediante digestión con Pvul a 37ºC, durante un período de tiempo aproximado de 4 horas. Las células CHO.K1 (ATCC CCL-61) fueron diluidas hasta alcanzar una concentración de 1,25x10^{7} células/mil. Se añadió un volumen de 800 \mul de células a una cubeta de electroporación y se sometieron las células a incubación sobre hielo, por espacio de 10 minutos. Se añadieron veinte microgramos de pDRHK DNA, se mezclaron con las células, y se sometieron a incubación durante un período de 10 minutos. Las células fueron después sometidas a electroporación, a 960 \muF y 250 V. Después de un período de incubación de 10 minutos sobre hielo, la suspensión celular fue añadida a un matraz T25 con 10 ml de SSM al 10% y sometida a incubación durante el transcurso de una noche, a 37ºC en 10% de CO_{2}. Veinticuatro horas más tarde, las células fueron recogidas por medio de incubación con tripsina-PBS, resuspendidas en PBS y diluidas en medio suplementado con G418, a razón de 1:9; 1:27 y 1:81. Las células transfectadas fueron colocadas en placas, a razón de 100 \mul/pocillo en 96 placas por pocillo y sometidas a incubación a 37ºC en 10% de CO_{2}.

El sobrenadante dimanante de las células que proceden de placas de 96 pocillos diferentes fue objeto de comprobación, tal y como se ha descrito anteriormente. El clon A5, procedente de la fila A columna 5 de la placa 1:27, fue seleccionado como un elevado productor. Esta línea celular fue subclonada por medio de limitación de la dilución, tal y como se ha descrito anteriormente. Una vez sometido a cribado, el clon A5B4 fue seleccionado como la línea celular de producción más elevada y se inició el cultivo estático.

Los clones seleccionados fueron recogidos por medio de tratamiento con tripsina, resuspendidos a una concentración de 1x10^{5} células/ml de medio SSM al 10% y añadidos a un matraz de cultivo tisular T-25. Las células fueron incubadas a 37ºC en 10% de CO_{2},durante un período de 21 días o hasta que se produjo el 80% de la muerte celular. La suspensión celular fue sometida a centrifugación y el sobrenadante objeto de comprobación para determinar la producción de DR2 recombinante a través de ensayo ELISA. La producción mediante fusión recombinante de sc-DR2/MBP-C6 por medio del clon A5B4 era de 20 ng/ml.

4. Re-transfección estable

Para proceder con este procedimiento, el clon A5B4 fue co-transfectado con una mezcla de pDRHK y pMACS. Un volumen de 800 \mul de una suspensión de 1,25x10^{7} células/ml fue añadido a una cubeta de electroporación de 0,4 cm y sometido a incubación sobre hielo, por espacio de 10 minutos. Una relación molar 3:1 de pDRHK y pMACS DNA (30 \mul de pDRHL linearizado con Pvul a una concentración de 1 \mug/ml y 5 \mul de pMACS superenrrollado a una concentración de 1 \mul/ml) fue añadida a las células. Una vez incubadas sobre hielo durante un período de 10 minutos, las células fueron sometidas a electroporación a 960 \muF y 250 V. Las células fueron incubadas a 37º por espacio de 10 minutos, diluidas a 10 ml de SSM al 10% en un matraz T25 y sometidas a incubación durante un período de 72 horas a 37ºC en 10% de CO_{2}, para permitir la expresión transitoria de la proteína CD4. En ese momento, las células fueron tratadas con 5 ml de PBE a temperatura ambiente, hasta que se desprendieron. Las células fueron lavadas una vez, resuspendidas en 380 \mul de PBE y marcadas con 80 \mul de un anticuerpo específico para la molécula CD4 humana expresada en la superficie celular. Este anticuerpo estaba unido covalentemente a una bolita magnética. Después de un período de incubación de entre 15 y 20 minutos a 4ºC, las células marcadas con anticuerpo fueron aplicadas a una columna magnética. Se esperaba que las células transfectadas que expresaban CD4 sobre sus superficies se unieran a la columna magnética. Las células no transfectadas fueron lavadas a través de la columna con 1 ml de PBE. Las células unidas fueron después eluidas de la columna retirando la misma del campo magnético y haciendo pasar 1 ml de PBE a su través. Las células que expresaban CD4 fueron diluidas en 199 ml de SSM al 10% suplementado con G418 (1,5 mg/ml) y colocadas en placas de 96 pocillos de fondo plano. Estas placas fueron incubadas a 37ºC en 10% de CO_{2}.

Transcurridas 3 semanas, el sobrenadante procedente de los diferentes 96 pocillos fue objeto de comprobación para determinar la proteína recombinante, tal y como se ha descrito anteriormente. Los clones positivos fueron seleccionados y expandidos. El clon DR2^{2} fue seleccionado como el productor más elevado. Esta línea celular fue congelada.

Un vial de clon DR2^{2} fue rápidamente descongelado hasta una viabilidad del 95%. Las células fueron diluidas en serie para clonado a dilución limitada, tal y como se ha descrito anteriormente. Transcurridas tres semanas de creecimiento, las colonias única fueron objeto de comprobación para determinar la producción de sc-DR2-C_{k}, por medio de ELISA. Los clones con los niveles más elevados de producción fueron amplificados y seleccionados. El clon DR2^{2}-H4 fue identificado como el mejor productor. Los cultivos estáticos fueron llevados a cabo tal y como se describe anteriormente y se averiguó que la producción de proteína recombinante procedente del clon DR2^{2}-H4 era de 100 ng/ml.

4. Tercera transfección estable

Para incrementar adicionalmente la producción de proteína, el clon primario DR2^{2}-H4 fue co-transfectado con una mezcla de pDRHK y pPUR (Clonetech), un vector que soporta un gen que confiere resistencia a la puromicina. Brevemente, 800 \mul de una suspensión de 1,25x10^{7} células/ml fueron añadidos a una cubeta de electroporación de 0,4 cm y sometidos a incubación sobre hielo durante un período de 10 minutos. Una relación molar 3:1 de pDRHK y pMACS DNA (25 \mul de pDRHL linearizado con Pvul, a una concentración de 1 \mug/ml y 5 \mul de pMACS superenrrollado, a una concentración de 1 \mul/ml) fue añadida a las células. Una vez incubadas sobre hielo durante un período de 10 minutos, las células fueron sometidas a electroporación a 960 \muF y 250 V. Las células fueron incubadas a 37º durante minutos, añadidas a 10 ml de SSM al 10% en un matraz T25 y sometidas a incubación durante un período de tiempo de 48 horas 37ºC en 10% de CO_{2}. Las células fueron entonces recogidas mediante tratamiento con tripsina, centrifugadas y resuspendidas en SSM al 10% conteniendo G418 (1,5 mg/ml) y Puromicina (20 \mug/ml). Las células fueron colocadas en placas de fondo plano de 96 pocillos, a 37ºC en 10% de CO_{2}. Cuando las colonias resultaron aparentes, los medios de cultivo fueron objeto de comprobación para determinar la proteína recombinante. Se averiguó que los clones A9 y B9 eran los productores más elevados y fueron objeto de comprobación en cultivos estáticos, tal y como se describe anteriormente. La producción de proteína recombinante por cultivo estático era de 1.800 ng/ml para A9 y de 2.108 para B9 (Figura 4).

Estas líneas celulares fueron subclonadas mediante clonaje a dilución limitada y comprobadas para determinar la producción de proteína recombinante. Los clones primarios A9D5, A9G4, A9C7, B9H3, B9G4 y B9H5 fueron identificados como teniendo tasas de producción de scDR2/MBP-C_{K} de 200 a 300 ng/ml en 24 horas. La producción de proteína recombinante a través de estos clones en cultivos estáticos fue llevada a cabo tal y como se describe anteriormente.

Claims (30)

1. Procedimiento para la producción de una línea celular que se caracteriza por la expresión incrementada de una secuencia de aminoácidos, comprendiendo el procedimiento:

a)

la introducción en células huésped de un primer vector que comprende una primera secuencia seleccionable, unida operativamente a un segmento que codifica para la secuencia de aminoácidos,

b)

el cultivo de células huésped en condiciones que conducen a la selección del primer vector,

c)

el aislamiento de las células que expresan la secuencia de aminoácidos en un primer nivel de expresión (primeras células de elevada expresión),

d)

la introducción, en las células que se expresan en el primer nivel de expresión, de un segundo vector que codifica para la secuencia de aminoácidos,

e)

el sometimiento de las células a condiciones que conducen a la expresión de la secuencia de aminoácidos en un segundo nivel de expresión más elevado que el primer nivel de expresión; y

f)

el aislamiento de las células que expresan la secuencia de aminoácidos en el segundo nivel de expresión, para producir la línea celular (segundas células de elevada expresión), en donde el procedimiento comprende además la selección de al menos un marcador de superficie celular codificado por el vector.

2. Procedimiento de la reivindicación 1, en el cual el procedimiento comprende, además:

g)

la introducción, en las células que se expresan en el segundo nivel de expresión, de un tercer vector que codifica para la secuencia de aminoácidos y el sometimiento de las células a condiciones que conducen a la expresión de la secuencia de aminoácidos en un tercer nivel de expresión más elevado que el segundo nivel de expresión; y

h)

el aislamiento de las células que expresan la secuencia de aminoácidos en el tercer nivel de expresión, para producir la línea celular (terceras células de elevada expresión).

3. Procedimiento de la reivindicación 2, en el cual el procedimiento comprende además la introducción en las terceras células de elevada expresión de un vector que codifica para la secuencia de aminoácidos y el sometimiento de las células a condiciones que conducen a la expresión de la secuencia de aminoácidos a un nivel más elevado que el del tercer nivel de expresión y la repetición de los pasos de introducción y de sometimiento, al menos una vez, para aislar una línea celular que exprese la secuencia de aminoácidos a un nivel más elevado que el de las terceras células de elevada expresión.

4. Procedimiento de la reivindicación 1, en el cual el paso b) del procedimiento comprende además el cultivo de las células en medios selectivos que comprenden al menos un fármaco selectivo para la primera secuencia seleccionable.

5. Procedimiento de la reivindicación 1, en el cual el paso d) del procedimiento comprende además la introducción en las células de un cuarto vector y el sometimiento de las células a condiciones que conducen a la expresión de la secuencia de aminoácidos en el segundo nivel de expresión.

6. Procedimiento de la reivindicación 5, en el cual el cuarto vector comprende además una segunda secuencia seleccionable.

7. Procedimiento de la reivindicación 6, en el cual el cuarto vector comprende además una segunda secuencia seleccionable, unida operativamente a un segmento que codifica para la secuencia de aminoácidos.

8. Procedimiento de la reivindicación 6, en el cual el procedimiento comprende además el cultivo de las células en medios selectivos que contienen al menos un fármaco selectivo para la segunda secuencia seleccionable.

9. Procedimiento de la reivindicación 5, en el cual el cuarto vector comprende además una secuencia que codifica para un marcador de superficie celular seleccionable.

10. Procedimiento de la reivindicación 9, en el cual el marcador de la superficie celular seleccionable está unido operativamente a un segmento que codifica para la secuencia de aminoácidos.

11. Procedimiento de la reivindicación 9, en el cual el procedimiento comprende además el aislamiento de células que expresan el marcador de la superficie celular, a través de al menos uno de entre cromatografía, lavado celular, citometría de flujo, inmunoprecipitación o unión a anticuerpo.

12. Procedimiento de la reivindicación 2, en el cual el paso g) del procedimiento comprende además la introducción en las células de un quinto vector y el sometimiento de las células a condiciones que conducen a la expresión de la secuencia de aminoácidos en el tercer nivel de expresión.

13. Procedimiento de la reivindicación 12, en el cual el quinto vector comprende además una tercera secuencia seleccionable.

14. Procedimiento de la reivindicación 13, en el cual la tercera secuencia seleccionable está unida operativamente a un segmento que codifica para la secuencia de aminoácidos.

15. Procedimiento de la reivindicación 13, en el cual el procedimiento comprende además el cultivo de las células en medios selectivos que comprenden al menos un fármaco selectivo para una tercera secuencia seleccionable.

16. Procedimiento de la reivindicación 12, en el cual el quinto vector comprende además una secuencia que codifica para un marcador de superficie celular seleccionable.

17. Procedimiento de la reivindicación 16, en el cual el marcador de superficie celular seleccionable está unido operativamente a un segmento que codifica para la secuencia de aminoácidos.

18. Procedimiento de la reivindicación 16, en el cual el procedimiento comprende además el aislamiento de las células que expresan el marcador de la superficie celular a través de al menos uno de entre cromatografía, lavado celular, citometría de flujo, unión a anticuerpo, inmunoprecipitación o unión a anticuerpo.

19. Procedimiento de la reivindicación 1, en el cual las segundas células de elevada expresión expresan de entre aproximadamente 3 a aproximadamente 40 veces más de la secuencia de aminoácidos, en relación con las primeras células de elevada expresión, tal como se determina a través de reactividad a anticuerpo.

20. Procedimiento de la reivindicación 2, en el cual las terceras células de elevada expresión expresan de entre aproximadamente 3 a aproximadamente 40 veces más de la secuencia de aminoácidos en relación con las segundas células de elevada expresión, tal y como se determina a través de reactividad a anticuerpo.

21. Procedimiento de la reivindicación 1, en el cual la secuencia de aminoácidos codifica para una cadena entre pesada y ligera de inmunoglobulina o para uno de sus fragmentos funcionales.

22. Procedimiento de la reivindicación 2, en el cual cada uno de los vectores codifica independientemente para un primer gen de resistencia a fármaco, un marcador de superficie celular o un segundo gen de resistencia a fármaco y, adicionalmente, en donde cada uno de los vectores está unido operativamente a la secuencia de aminoácidos.

23. Procedimiento de la reivindicación 1, en el cual el marcador de superficie celular seleccionable es un receptor de superficie celular, una glicoproteína, un carbohidrato, una proteína, una lipoproteína, un complejo de histocompatibilidad mayor (MHC/HLA), un anticuerpo, un antígeno, o un fragmento funcional del mismo.

24. Procedimiento de la reivindicación 23, en el cual el marcador de superficie celular seleccionable es una glicoproteína de tipo CD (clase de diferenciación).

25. Procedimiento de la reivindicación 4, en el cual el fármaco es un antibiótico aminoglicósido (G418), higromicina B(hmb), puromicina o neomicina.

26. Procedimiento de la reivindicación 1, en el cual al menos uno del primer y segundo vector es introducido en las células de entre aproximadamente 2 a aproximadamente 20 veces.

27. Procedimiento de la reivindicación 2, en el cual el tercer vector es introducido en las células de entre 2 a 10 veces.

28. Procedimiento de la reivindicación 1, en el cual el marcador de superficie celular es codificado al menos por uno de los primeros y segundos vectores.

29. Procedimiento de la reivindicación 2, en el cual el tercer vector comprende adicionalmente una secuencia que codifica para el marcador de superficie celular seleccionable.

30. Procedimiento de la reivindicación 1, en el cual la secuencia de aminoácidos codifica para una cadena pesada de inmunoglobina, una cadena ligera de inmunoglobina o un fragmento funcional del mismo.