ES2330201T3 - Regiones de union a la matriz y metodos para el uso de las mismas. - Google Patents
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Abstract
Un método para transformar in vitro o ex vivo una célula eucariota para incorporar un gene deseado o la porción de este mediante la técnica de co-transfección con vectores desenlazados, el método comprendiendo la co-transfección de la célula con: un primer vector que comprende un primer promotor y un primer gen heterólogo que codifica el gene deseado o la porción de este bajo el control transcripcional del primer promotor, y un primer elemento de la cromatina; y, un segundo vector desenlazado que comprende un segundo elemento de la cromatina, donde el elemento de la cromatina impide a la cromatina vecina afectar la expresión transgénica.
Description
Regiones de unión a la matriz y métodos para el
uso de las mismas.
La presente invención generalmente se refiere a
las regiones de unión a la matriz (MAR) y a los métodos para el uso
de las MAR. En particular, la invención se refiere a los usos de
tales métodos para el desarrollo de líneas estables de célula
eucariota.
\vskip1.000000\baselineskip
Las líneas de células eucariotas pueden ser
genéticamente modificadas para expresar una o más proteínas
deseadas. La selección actual y los procedimientos de tamizaje para
identificar una línea de célula clonal con las características de
expresión requeridas para la producción o expresión regulada son
tediosas y consumen tiempo. Por ejemplo, en células de ovario de
hámster chino (CHO), el acercamiento clásico para alcanzar la máxima
expresión involucra el uso de líneas de células mutantes y un
incremento gradual en la presión de selección durante varios meses
para un marcador de selección co-transfectado como
el dihidrofolato reductasa (Kaufman y Sharp, 1982; Schimke y otros,
1982). Mientras nuevos acercamientos al problema incluyen la
identificación de sitios raros en un cromosoma con elevada
actividad transcripcional, combinado con la integración dirigida y
el mejoramiento de la selección y de los procedimientos de tamizaje
(Fussenegger y otros, 1999), estos son no obstante todos procesos
de trabajo
intensivo.
intensivo.
\vskip1.000000\baselineskip
En un aspecto, la presente invención proporciona
un método para la transformación de células eucariotas usando la
transfección de dos o más vectores desenlazados de ácido nucleico,
el primer vector tiene un promotor, un gen heterólogo que codifica
para una proteína deseada y un primer elemento de la cromatina; y el
segundo vector tiene un segundo elemento de la cromatina. En
realizaciones alternativas, el primer elemento de la cromatina
puede estar localizado 5' (aguas arriba) o 3' (aguas abajo) del
promotor y del gen heterólogo. En otras realizaciones, el segundo
vector incluye dos o más elementos de la cromatina (por
ejemplo, un tercero, cuarto, quinto o sexto elemento de la
cromatina). En realizaciones preferidas de la presente invención, al
menos uno del primer, segundo, tercero, cuarto, quinto y sexto
elementos de la cromatina pueden ser elementos MAR (por
ejemplo, un elemento MAR de lisozima de pollo). En otra
realización preferida, la célula eucariota es
co-transfectada con un tercer vector. Este tercer
vector puede incluir al menos uno de los genes (por ejemplo,
genes estructurales, reguladores o de selección) y/o al menos un
elemento de la cromatina (por ejemplo, un elemento MAR). En
ciertas realizaciones preferidas de la presente invención, las
proporciones molares de los vectores primero, segundo y
posiblemente tercero son
moduladas.
moduladas.
En otro aspecto, la invención proporciona una o
más células eucariotas que incluyen dos o más vectores de ácidos
nucleicos, el primer vector tiene un promotor, un gen heterólogo que
codifica para una proteína deseada y un elemento MAR, y el segundo
vector tiene al menos un elemento MAR. En algunas realizaciones, las
unas o más células eucariotas son células tratadas con
butirato.
En un aspecto adicional, la invención
proporciona kits, que incluyen en uno o más recipientes, una o más
células eucariotas que incluyen dos o más vectores de ácidos
nucleicos, el primer vector tiene un promotor, un gen heterólogo
que codifica para una proteína deseada y un elemento MAR, y el
segundo vector tiene al menos un elemento MAR. En una realización,
el kit adicionalmente comprende butirato.
A menos que se defina lo contrario, todos los
términos técnicos y científicos usados en este documento tienen el
mismo significado que lo entendido comúnmente por un experto
ordinario en el arte para el que esta invención se aplica. Aunque
métodos y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos
en este documento pueden ser usados en la práctica o probando la
presente invención, métodos y materiales apropiados son descritos a
continuación. En caso de conflicto, la presente especificación,
incluyendo las definiciones, controlará. Además, los materiales,
métodos y ejemplos son solamente ilustrativos y no se pretende sean
limitativos.
Otras características y ventajas de la invención
serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y de
las reivindicaciones.
\vskip1.000000\baselineskip
La Figura 1 demuestra el efecto de los elementos
de la cromatina sobre la expresión estable transgénica. Los
elementos de la cromatina fueron clonados en uno o ambos lados de la
unidad de expresión de la luciferasa (línea y flecha negra) del
plásmido control pGL3. Los constructos resultantes, que se muestran
esquemáticamente en el panel a mano izquierda, fueron digeridos con
PvuI y co-transfectados con pSV2neo. La actividad de
la luciferasa de las mezclas de clones de CHO, normalizada con
relación al contenido de proteína y expresada con relación al
control pGL3, es mostrada en el panel a mano derecha. Las barras de
error se corresponden al error estándar, basado en al menos tres
transfecciones independientes. Los elementos de la cromatina
examinados incluyen aquellos elementos de la cromatina
potencialmente capaces de superar efectos de posición, que incluyen
elementos de separación (BE; cajas negras), regiones de unión a la
matriz (MAR; cajas blancas), y regiones de control del locus (LCR;
cajas sombreadas). La flecha que representa la orientación de la MAR
lys apunta de BamHI a XbaI, mientras que la flecha para LCR LAP
apunta en la dirección del gen LAP y su dirección de
transcripción.
La Figura 2 es un diagrama que indica la
expresión estable del reportero usando MAR de lisozima de pollo.
Los constructos con uno o dos MAR clonados en el control pGL3 (pMZ50
y pMZ52 respectivamente), así como los plásmidos
Control-pGL3 y
pUC-B-1-X1 en las
proporciones molares indicadas fueron
co-transfectados con pSV2neo en células CHO. La
figura muestra la actividad de la luciferasa de mezclas de clones,
normalizada con relación al contenido de proteína, y expresada con
relación al Control-pGL3. Las barras de error se
corresponden al error estándar, basado en al menos tres
transfecciones independientes.
La Figura 3 demuestra la expresión génica en
clones estables de CHO. La Figura 3A muestra la expresión de la
luciferasa para clones obtenidos con Control-pGL3,
pMZ50, o pMZ52, que corresponden a los plásmidos que portan,
ninguna, una, o dos MAR de lisozimas de pollo. La actividad
luciferasa, normalizada con relación al contenido de proteína, es
mostrada por 15 clones para cada constructo, ordenado desde el nivel
de expresión inferior hasta el superior. La Figura 3B muestra la
expresión del anticuerpo IgG1 anti-Reshus D para
clones obtenidos mediante la co-transfección de
vectores de expresión de cadenas ligeras y pesadas, pMZ57 y pMZ36
respectivamente, con las proporciones molares indicadas del plásmido
pUC18 control o
pUC-B-I-XI que porta
MAR. La concentración del sobrenadante de anticuerpo es mostrado
por clones ordenados desde el nivel de expresión inferior hasta el
superior. La Figura 3C demuestra el análisis molecular de los clones
de expresión del anticuerpo anti-Reshus D. El panel
superior muestra un diagrama esquemático del vector
pUC-B-I-XI, con caja
sombreada correspondiente a la secuencia MAR. Las tallas de
fragmentos obtenidos bajo digestión son indicadas en la parte
superior del mapa. El panel inferior muestra los resultados de un
análisis de transferencia de Southern de cuatro clones celulares
estables con el MAR a partir del panel B (marcado #1-#4). El ADN
genómico fue digerido con EcoRI y probado con la secuencia completa
de la MAR. La masa molecular de los fragmentos es dada en pares de
kilobase sobre la
izquierda.
izquierda.
La Figura 4 muestra la expresión génica regulada
en clones estables C2C12. La Figura 4A representa el tamizaje de
clones estables C2C12 elegidos aleatoriamente con el constructo de
supresión. La actividad de la luciferasa, normalizada con relación
a la actividad de la \beta-galactosidasa, es
mostrada por 24 clones. Las columnas blancas se corresponden con la
expresión en ausencia de doxiciclina (no dox); las columnas negras
se corresponden con la expresión inducida por la adición de
doxiciclina (dox), con la inducción de plegamiento indicada en la
parte superior de la columna negra. La Figura 4B muestra la
expresión en los clones escogidos por FACS con el sistema de
expresión establemente regulado e integrado. La actividad de la
\beta-galactosidasa, normalizada con relación al
contenido de proteína, es mostrada por 10 clones. Las columnas
blancas se corresponden con la expresión en ausencia de doxiciclina
(no dox); las columnas negras se corresponden con la expresión
inducida por la adición de doxiciclina (dox), con la inducción de
plegamiento indicada en la parte superior de la columna negra.
La Figura 5 demuestra el efecto de la MAR sobre
la productividad de IgG en las células CHO. La inducción de
plegamiento del promotor SV40 (panel A) y el promotor CMV
(panel B) conducen la expresión de IgG recombinante con
combinaciones diferentes de la MAR. Los resultados están expresados
por medio de la productividad específica de las mezclas de células
establemente transfectadas a partir de dos experimentos hechos en
triplicado. La productividad específica de los clones simples de
células con 1 MAR en cis + 4 MAR en trans oscilan hasta 38
pg/célula/día y 40 pg/célula/día con el promotor SV40 y CMV,
respectivamente. Las transfecciones son como las generalmente
descritas en el arte (ver por ejemplo,
Zahn-Zabal y otros, 2001 J. Biotechnol. 87:29, e
infra) usando plásmidos pMZ36, pMZ37, pMZ57 y pMZ59. El
plásmido usado para la expresión de IgG que contiene un elemento
MAR en cis (1 MAR en cis) fue construido como es descrito en el
Ejemplo 1.
La Figura 6 demuestra el efecto de los elementos
MAR y butirato de sodio sobre la secreción de IgG en las células
CHO transcientemente tranfectadas indicando la cinética de la
acumulación de IgG (\mug) por 1.3 ml de sobrenadante de medio de
cultivo en una simple cavidad de una placa de 24 cavidades (el
promedio de cavidades triplicadas es mostrado). En el panel de la
izquierda, las células fueron transfectadas con 1.69 \mug de
control (primeras dos hileras de columnas) o con una cantidad
equimolar (2.28 \mug) de plásmidos que contienen MAR (filas 3 y
4) por tres cavidades. La proporción entre los plásmidos que
codifican para cadenas pesadas y ligeras fue de 2:1. La cantidad
total de ADN plasmídico fue ajustada a 2.5 \mug con pGL3 (Promega,
Inc). Las filas 2 y 4 resultaron de las células tratadas por la
adición de 10 mM de butirato de sodio en el medio de cultivo. Las
células en el panel derecho fueron transfectadas con 2.47 \mug de
control (primeras dos filas de columnas) o con una cantidad
equimolar (3.27 \mug) de plásmidos que contienen MAR (filas 3 y
4) por tres cavidades, respectivamente. La proporción entre los
plásmidos que codifican para cadenas pesadas y ligeras fue de 2:1.
Las filas 2 y 4 resultaron de las células tratadas por la adición de
10 mM de butirato de sodio en el medio de cultivo.
La Figura 7 demuestra el efecto de los
fragmentos MAR sobre un gen reportero de luciferasa en células CHO
establemente transfectadas. La Figura 7A muestra un mapa para los
constructos génicos del fragmento MAR unidos a la luciferasa. El
constructo pML muestra la secuencia natural MAR, arbitrariamente
segmentada en partes A, B, C, D, E, F, G y K, el promotor temprano
SV40, como indicado por la caja marcada con SV40, y el transgen
reportero de la luciferasa. El constructo pLM tiene el transgen de
la luciferasa colocado entre el promotor SV40 y la secuencia
natural MAR. Otros constructos mostrados en el Ejemplo 7 incluyen
partes multimerizadas del elemento MAR como indicado para pML. La
secuencia de ADN de los segmentos MAR se proporciona en el Ejemplo
7. La Figura 7B muestra los resultados de las mediciones de
luciferasa realizadas con extractos de células que incluyen un
constructo reportero carente de la secuencia MAR (pGL3) o derivados
que contienen en cis una copia de las secuencias naturales de la
MAR (pML, pLM), o que contienen elementos MAR multimerizados como
indicado en la parte (A). Los análisis fueron realizados con
poblaciones seleccionadas G-418 (mezclas
policlonales de células CHO establemente transfectadas), como en el
arte. Los resultados representan datos a partir de dos conjuntos de
experimentos
independientes.
independientes.
\vskip1.000000\baselineskip
Hasta la fecha, el desarrollo de líneas de
células estables ha sido obstaculizado por los efectos negativos de
la cromatina circundante en la expresión de las secuencias
aleatoriamente integradas a vectores. Los elementos de la
cromatina, como los elementos de separación, las regiones de unión a
la matriz, y las regiones de control del locus, son conocidos que
ejercen un efecto sobre la expresión génica solamente cuando se
integran en el genoma. Mientras el uso de elementos de la cromatina
en la próxima generación de vectores de terapia génica está
actualmente siendo considerado para mejorar la expresión de
transgenes terapéuticos (Neff y otros, 1997), pocos estudios han
direccionado sistemáticamente el potencial de tales elementos para
modificar o mejorar la expresión de los constructos génicos. Para
explotar las propiedades favorables de los elementos de la cromatina
en el desarrollo de líneas estables de células, deben ser
establecidas sus utilidades. Los elementos usados para este fin
deben mejorar la frecuencia de obtención de clones de elevado nivel
de expresión, independientemente del sitio de integración
cromosómica y del número de copias integradas. Este efecto no debe
ser específico para un tipo de célula en particular, sino más bien
debe ser observada en todas las líneas celulares comúnmente usadas
en la biotecnología y la terapia celular o génica. Además, el
elemento debe actuar independientemente del promotor,
posibilitándole que sea usado con diversos
constructos.
constructos.
Las composiciones y los métodos de acuerdo a la
presente invención poseen nuevas capacidades y habilidades en la
transfección de células eucariotas. La presente invención posibilita
la transfección de ácidos nucleicos, como genes que codifican
proteínas recombinantes, dentro las células eucariotas,
particularmente células mamíferas.
Las composiciones y métodos de acuerdo a la
presente invención son particularmente apropiadas para la generación
de líneas de células que expresen uno o más genes que codifican
para proteínas recombinantes.
La variabilidad en los niveles de expresión de
un gen heterólogo transfectado dentro de una célula eucariota se
cree reflejar la influencia de la estructura de la cromatina y/o la
presencia de elementos de regulación en el sitio de integración del
gen heterólogo en el genoma huésped, un fenómeno designado como el
"efecto de posición". Un acercamiento sencillo y rápido para
superar efectos de posición es hacer uso de elementos de la
cromatina que impiden a la cromatina vecina afectar la expresión
transgénica. Este acercamiento mejora la probabilidad de
aislamiento de un clon que exhiba la expresión regulada deseada.
Este acercamiento es útil, por ejemplo, para la terapia
génica ex vivo, o para elevar niveles de expresión durante la
producción de una proteína recombinante, reduciendo de ese modo el
tiempo que se pierde en el tamizaje de clones. Además, la expresión
transgénica independiente de la posición tiene potencial significado
en la construcción de sistemas de expresión génica regulada, debido
a que la expresión de una terapia génica (junto con sus componentes
controladores) sería independiente de la estructura de la cromatina
en el sitio de integración. Los elementos de la cromatina que son
potencialmente capaces de superar los efectos de posición, y por lo
tanto son de interés para el desarrollo de líneas estables de
células, que incluyan elementos de separación (BE), regiones de
unión a la matriz (MARs), regiones de control del locus (LCR), y
elementos universales de apertura de la cromatina (UCOE).
Los elementos de separación ("BE"), o
elementos de aislamiento, definen las separaciones en la cromatina
en muchos casos (Bell y Felsenfeld, 1999; Udvardy, 1999) y pueden
desempeñar un papel en la definición de un dominio transcripcional
in vivo. Los BE carecen de actividad promotora/potenciadora
intrínseca, pero más bien se cree que protegen los genes de la
influencia transcripcional de elementos de regulación en la
cromatina circundante. El ensayo en bloque potenciador es
comúnmente usado para identificar los elementos de aislamiento. En
este ensayo, el elemento de la cromatina es colocado entre un
potenciador y un promotor y la transcripción potenciadora activada
es medida. Los elementos de separación se han mostrados siendo
capaces de proteger genes reporteros establemente transfectados
contra los efectos de posición en Drosophila, levadura y en
células de mamíferos (Bi y Broach, 1999; Cuvier y otros, 1998;
Walters y otros, 1999). También se ha demostrado que incrementan la
proporción de ratones transgénicos con expresión transgénica
inducible (Wang y otros, 1997).
Las Regiones de unión a la Matriz ("MAR";
también conocidas como Regiones de Unión a Andamios o Regiones de
unión a Matriz/Andamio ("S/MAR")) son secuencias de ADN que
unen andamios nucleares aislados o matrices nucleares in
vitro con elevada afinidad (Hart y Laemmli, 1998). Como tal,
ellos pueden definir separaciones de dominios independientes de la
cromatina, tal que los elementos que abarcan la
regulación-cis solamente controlan la expresión de los genes
dentro del dominio. Sin embargo, su habilidad para proteger
completamente un locus cromosomal a partir de elementos de la
cromatina cercana, y de ese modo conferir expresión génica
independiente de la posición, no ha sido observada en células
establemente transfectadas (Poljak y otros, 1994). Por otra parte,
las secuencias MAR han sido mostradas por interactuar con
potenciadores para incrementar la accesibilidad local de la
cromatina (Jennwein y otros, 1997). Específicamente, los elementos
MAR pueden potenciar la expresión de genes heterólogos en las
líneas de cultivo de células (Kalos y Fournier, 1995; Klehr y otros,
1991; Phi-Van y otros, 1990; Poljak., 1994),
ratones transgénicos (Castilla y otros, 1998) y plantas (Allen y
otros, 1996). La utilidad de las secuencias MAR para desarrollar
vectores mejorados para terapia génica es también reconocida
(Agarwal y otros,
1998).
1998).
Las Regiones de Control del Locus ("LCR")
son elementos de regulación-cis requeridos para la activación
inicial de la cromatina de un locus y posterior transcripción
génica en sus localizaciones nativas (revisado en Grosvel, 1999).
La función de activación de los LCR también permite la expresión de
un transgen acoplado en el tejido adecuado en ratones transgénicos,
independiente del sitio de integración en el genoma hospedero.
Mientras los LCR generalmente confieren niveles de expresión
tejido-específicos en los genes enlazados, una
expresión eficiente en casi todos los tejidos en ratones
transgénicos se ha reportado para un LCR truncado receptor de
célula T humana (Ortiz y otros, 1997) y un LCR LAP de rata (Talbot y
otros, 1994). El más extensivamente caracterizado LCR es aquel del
locus globina. Su uso en vectores para la terapia génica de la
enfermedad siclémica celular y \beta-talasemias
está actualmente siendo evaluado (Pawliuk y otros, 1998).
Los elementos ubicuos de apertura de la
cromatina ("UCOE" también conocido como elementos de apertura
de la cromatina que actúan ubicuamente) se han reportado
recientemente (Ver WO00/05393).
El elemento MAR 5' de lisozima de pollo es
capaz de mejorar significativamente la expresión estable transgénica
en células CHO, una línea celular comúnmente usada en la producción
de proteína recombinante. El elemento MAR 5' de lisozima de pollo
es también capaz de mejorar significativamente las transfecciones
transcientes, particularmente cuando las células transfectadas son
contactadas con butirato. Este elemento MAR de pollo se ha mostrado
previamente por potenciar la transcripción desde un promotor
heterólogo en células heterólogas (Phi-Van y otros,
1990), y conferir una regulación hormonal independiente de la
posición y del desarrollo de la expresión del gen de la proteína de
acidez sérica en ratones transgénicos (McKnight y otros, 1992).
Sobre todo, la co-transfección
de un plásmido que porta el elemento MAR 5' de lisozima de pollo con
un o más vectores de expresión resulta en una expresión estable
transgénica incrementada. Este acercamiento sencillo evita la
necesidad de elementos MAR clonados en constructos de expresión.
Además, la talla de los elementos MAR ya no es una limitación. La
co-transfección con los elementos MAR se muestra por
incrementar el nivel de expresión promedio de clones estables, así
como incrementar la probabilidad para obtener clones que expresen
niveles superiores a aquellos solamente obtenidos bajo la
transfección de los plásmidos de expresión.
Sin el deseo de estar atado por la teoría, es
posible que la distancia y secuencia entre los elementos MAR y la
unidad de expresión sean una consideración importante. El efecto de
las MAR se ha detectado para un gen proximal, y no para uno
localizado más distante (Bode y otros, 1995). El efecto de la
co-transfección de las MAR no ha encontrado por ser
saturado (Ver Fig. 2), una limitación potencial de esta técnica es
la cantidad de ADN que puede ser transfectada por célula. Un
experto en el arte sería capaz de determinar la cantidad máxima de
ADN para transfectar para un tipo de célula dada.
Como es usado en este documento, las siguientes
definiciones son provistas para facilicitar la comprensión de este
caso. Hasta el punto en que las definiciones varían de los
significados que se conocen dentro del arte, las definiciones a
continuación son las que controlan.
"Cromatina" es el material de ácido
nucleico que tiene los cromosomas de una célula eucariota, y se
refiere a ADN, ARN y proteínas asociadas.
Un "elemento de la cromatina" significa una
secuencia de ácido nucleico en un cromosoma.
"Cis" se refiere a la posición de dos o más
elementos (como elementos de la cromatina) en la misma molécula de
ácido nucleico (como el mismo vector o cromosoma).
"Trans" se refiere a la posición de dos o
más elementos (como elementos de la cromatina) en dos o más
moléculas diferentes de ácido nucleico (como en dos vectores o dos
cromosomas).
"Activación cis" se refiere a la activación
de un gen por un activador (como un potenciador) localizado en la
misma molécula de ácido nucleico (como el mismo vector o
cromosoma).
"Aguas abajo" se refiere a la dirección que
va hacia el extremo 3' de una secuencia nucleótida.
Un "potenciador" es una secuencia
nucleótida que actúa potenciando la transcripción de genes
independiente de la identidad del gen, la posición de la secuencia
con relación al gen, o la orientación de la secuencia. Los vectores
de la presente invención opcionalmente incluyen potenciadores.
\newpage
Un "gen" es una secuencia (ADN) de
desoxirribonucleico que codifica para una proteína madura dada. Como
usado en este documento, el término "gen" no incluirá regiones
de flanqueo no traducidas como señales de inicio de transcripción
de ARN, sitios de adición de poliadenilación, promotores o
potenciadores.
Un "gen de selección" es un gen que
confiere un fenotipo en las células cuando expresan el gen como una
proteína detectable. Ejemplos de genes de selección incluyen, pero
no son limitativos a, genes de resistencia a antibióticos y genes
que codifican enzimas que producen o modifican compuestos
intermedios del metabolismo celular o compuestos adicionados
exógenamente a la célula (por ejemplo, drogas).
Un "agente de selección" es una condición,
agente o sustancia que posibilita la detección de la expresión de
un gen de selección.
"Fenotipo" se refiere a las propiedades
distinguibles de una célula cuando es expresada por el genotipo
celular.
Un "producto génico" es un gen que codifica
un producto proteico que tiene características deseables como
utilidad diagnostica y terapéutica. Un producto génico incluye,
por ejemplo genes estructurales y genes de regula-
ción.
ción.
Un "gen estructural" se refiere a un gen
que codifica una proteína estructural. Los ejemplos de genes
estructurales incluyen pero no son limitativos a, proteínas del
citoesqueleto, proteínas de la matriz extracelular, enzimas,
proteínas nucleares de poro y proteínas nucleares de andamio,
canales iónicos y transportadores, proteínas contráctiles y
chaperonas. Los genes estructurales preferidos codifican para
anticuerpos o fragmentos de anticuerpo.
Un "gen de regulación" se refiere a un gen
que codifica una proteína de regulación. Ejemplos de proteínas de
regulación incluyen, pero no son limitativos a, factores de
transcripción, hormonas, factores de crecimiento, citoquinas,
moléculas señalizadoras de transducción, oncogenes,
proto-oncogenes, receptores de transmembranas, y
quinasas proteica.
"Genotipo" se refiere a la información
genética contenida dentro de la célula a diferencia de su expresión,
que es distinguida como el fenotipo celular.
"Ligamiento" es el proceso para formar un
enlace fosfodiester entre los extremos 5' y 3' de dos cadenas de
ADN. Esto puede ser logrado por diversas técnicas enzimáticas bien
conocidas, que incluyen, pero no limitadas a, ligamiento de extremo
romo por T4 ADN ligasa.
"Orientación" se refiere al arreglo de
nucleótidos en una secuencia de ADN dada. Por ejemplo, la
orientación invertida de una secuencia de ADN es una en la que el
arreglo de 5' a 3' de la secuencia está contrario con relación a
otra secuencia cuando es comparado con el punto de referencia en el
ADN del cual la secuencia fue obtenida. Tales puntos de referencia
pueden incluir la dirección de transcripción de otras secuencias de
ADN específicas en la fuente de ADN y/o el origen de replicación de
vectores replicables que contienen la secuencia.
"Transcripción" significa la síntesis de
ARN a partir del ADN molde.
"Traducción" se refiere a la síntesis de un
polipéptido a partir del ARN mensajero.
El término "vector" como es usado en este
documento se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de
transportar otro ácido nucleico para lo cual ha sido enlazado.
"Célula eucariota" se refiere a cualquier
célula mamífera o no mamífera de un organismo eucariota. A manera
de ejemplo no limitativo, cualquier célula eucariota que sea capaz
de ser mantenida bajo condiciones de cultivo celular y
posteriormente transfectada sería incluida en esta invención. Los
tipos de células especialmente preferidos incluyen, por
ejemplo, células de médula, células embrionarias de médula,
células de ovario de hámster chino (CHO), COS, BHK21, NIH3T3, HeLa,
C2C12, células de cáncer, y células primarias diferenciadas e
indiferenciadas. Otras células huésped apropiadas son conocidas por
aquellos expertos en el arte.
"Transformación" como usado en este
documento se refiere a la modificación de una célula eucariota por
la adición de un ácido nucleico. Por ejemplo, la transformación de
una célula incluiría la transfección de la célula con un ácido
nucleico, como un vector de ADN.
"Transfección" es la introducción de un
ácido nucleico dentro de una célula eucariota receptora, como por
electroporación o por medios químicos. La transfección puede ser
detectada en algunos casos por una alteración en el fenotipo
celular. En algunos casos, las células transfectadas son denominadas
transfectantes y las células pre-transfección son
referidas como células parentales.
"Promotor" como es usado en este documento
se refiere a una secuencia de ácido nucleico que regula la expresión
de un gen.
\newpage
"Co-transfección" significa
el proceso de transfectar una célula eucariota con más de un gen
exógeno foráneo a la célula, uno del que puede conferir un fenotipo
seleccionable en la célula.
La transfección eucariótica de vectores de ácido
nucleico es, en general, un proceso bien conocido, y puede ser
lograda por una variedad de métodos estándares. Un tipo de vector es
un "plásmido", que se refiere a un lazo de ADN de doble cadena
circular dentro del cual segmentos de un ADN adicional pueden ser
ligados. Otro tipo de vector es un vector viral, donde segmentos de
ADN adicional pueden ser ligados dentro del genoma viral. Ciertos
vectores son capaces de replicación autónoma en una célula huésped
dentro de la cual ellos son introducidos (por ejemplo,
vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriana
y vectores episomales de mamíferos). Otros vectores (por
ejemplo, vectores no-episomales de mamíferos)
son integrados dentro del genoma de una célula huésped bajo la
introducción dentro de la célula huésped, y de ese modo son
replicados junto con el genoma huésped. Además, ciertos vectores
son capaces de dirigir la expresión de los genes a los que ellos
están operativamente enlazados. Tales vectores son referidos en este
documento como "vectores de expresión". En general, los
vectores de expresión de utilidad en técnicas de ADN recombinante
están frecuentemente en forma de plásmido. Como usado en este
documento, "plásmido" y "vector" son usados de forma
intercambiable, como el plásmido es la forma de vector más
comúnmente usada. Sin embargo, en la invención se propone incluir
tales otras formas de vectores de expresión, incluyendo, pero no
limitativo a, vectores virales (por ejemplo retrovirus deficiente
de replicación, adenovirus y virus adeno-asociados),
que cumplen funciones equivalentes.
Los vectores de expresión recombinante de la
invención contienen un ácido nucleico de la invención en una forma
apropiada para la expresión del ácido nucleico en una célula
huésped. Específicamente, esto significa que los vectores de
expresión recombinante incluyen una o más secuencias de regulación,
seleccionadas sobre la base de las células huésped siendo usadas
para la expresión, que es operativamente enlazado a la secuencia de
ácido nucleico a ser expresada. Dentro de un vector de expresión
recombinante, el término "operativamente enlazado" se pretende
que signifique que la secuencia nucleótida de interés se enlace a
la(s) secuencia(s) de regulación en una forma que
permita la expresión de la secuencia nucleótida (por ejemplo, en un
sistema de transcripción/traducción in vitro o en una célula
huésped cuando el vector es introducido dentro de la célula
huésped). Tales secuencias de regulación están descritas, por
ejemplo, en Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN
ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, California (1990). Las
secuencias de regulación incluyen aquellas de expresión
constitutiva directa de una secuencia nucleótida en muchos tipos de
célula huésped y aquellas de expresión directa de la secuencia
nucleótida sólo en ciertas células huésped (por ejemplo,
secuencias de regulación tejido-específico). Será
apreciado por aquellos expertos en el arte que el diseño del vector
de expresión puede depender de factores como la selección de la
célula huésped a ser transfectada, el nivel de expresión de la
proteína deseada,
etc.
etc.
El(los) vector(es) de expresión
recombinante(s) usado(s) en este documento
puede(n) ser diseñado(s) para la expresión de las
proteínas deseadas en células eucariotas. Las células huésped
apropiadas son discutidas además en Goeddel, GENE EXPRESSION
TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego,
California (1990).
El(los) vector(es) de expresión
usado(s) en este documento puede(n) ser un vector de
expresión de levadura. Ejemplos de vectores para expresión en la
levadura Saccharomyces cerivisae incluyen pYepSec1 (Baldari,
y otros, 1987. EMBO J. 6: 229-234), pMFa
(Kurjan y Herskowitz, 1982. Cell 30:
933-943), pJRY88 (Schultz y otros, 1987.
Gene 54:113-123) pYES2 (Invitrogen
Corporation, San Diego, California) y picZ (Invitrogen Corporation,
San Diego, California).
Como alternativa, el(los)
vector(es) de expresión usado(s) en este documento
puede(n) ser un vector de expresión de baculovirus. Los
vectores de baculovirus disponibles para expresión de proteínas en
células de insectos cultivadas (por ejemplo, células SF9) incluyen
la serie pAc (Smith, y otros, 1983. Mol.Cell. Biol.
3: 2156-2165) y la serie pVL Lucklow y Summers,
1989. Virology 170:31-39).
Un ácido nucleico de la invención puede también
ser expresado en células de mamíferos usando un vector de expresión
de mamíferos. Ejemplos de vectores de expresión de mamíferos
incluyen pCDM8 (Seed, 1987. Nature 329: 840) y pMT2PC
(Kaufman, y otros, 1987. EMBO J.
6:187-195).
Cuando son usados en células de mamíferos, las
funciones de control de los vectores de expresión son frecuentemente
proporcionadas por elementos de regulación viral. Por ejemplo, los
promotores comúnmente usados son derivados de polioma, adenovirus
2, citomegalovirus, y virus 40 de simio. Para otros sistemas de
expresión apropiados para ambas células procariotas y eucariotas
ver, por ejemplo, los Capítulo 16 y 17 del Sambrook, y
otros, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL. 2da edición,
Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press,
Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989.
Un vector de expresión recombinante de mamífero
es capaz de dirigir la expresión de un ácido nucleico
preferentemente en un tipo de célula particular (por
ejemplo, los elementos de regulación
tejido-específico son usados para expresar el ácido
nucleico). Los elementos de regulación
tejido-específico son conocidos en el arte.
Ejemplos no limitativos de promotores
tejido-específico apropiados incluyen el promotor de
albúmina (hígado-específico; Pinkert y
otros, 1987. Genes Dev. 1:268-277)
promotores linfoide-específicos (Calame y Eaton,
1988. Adv. Immunol. 43: 235-275) en
particular promotores de receptores de células T (Winoto y
Baltimore, 1989. EMBO J. 8: 729-733) e
inmunoglobulinas (Banerji, y otros, 1983. Cell
33:729-740; Queen y Baltimore, 1983. Cell
33:741-748), promotores
neurona-específicos (por ejemplo, el promotor
del neurofilamento; Byme y Ruddle, 1989. Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 86:5473-5477) promotores
páncreas-específico (Edlund, y otros, 1985.
Science 230:912-916), y promotores glándula
mamaria-específico (por ejemplo, promotor
del suero de la leche; Patente U.S. No.4,873,316 y Solicitud Europea
Publicación No. 264,166).
Promotores desarrolladamente regulados son
también abarcados. Los ejemplos de tales promotores incluyen, por
ejemplo, promotores murinos hox (Kessel y Grus, 1990.
Science 249:374-379) y promotor de
\alpha-feto proteína (Campes y Tilghman, 1989.
Genes Dev. 3:537-546).
Los promotores de expresión génica regulables
son bien conocidos en el arte, e incluyen, a manera de ejemplo no
limitativo, cualquier promotor que module la expresión de un gen que
codifique una proteína deseada por unión de una molécula exógena,
como el sistema CRE/LOX, el sistema TET, el sistema de luz
NFkappaB/UV, el sistema Leu3p/isopropilmalato, y el sistema
GLVPc/GAL4 (ver, por ejemplo Sauer, 1998, Methods
14(4):381-92; Lewandoski, 2001, Nat. Rev.
Genet 2(10):743-55;
Legrand-Poels y otros, 1998, J. Photochem.
Photobiol. B. 45:1-8; Guo y otros, 1996,
FEBS Lett. 390(2): 191-5; Wang y
otros, PNAS USA, 1999, 96(15):
8483-8).
Además, los términos "célula huésped" y
"célula huésped recombinante" son usados de forma
intercambiable en este documento para indicar una célula eucariota
dentro de la que uno o más vectores de la invención se han
introducido. Se entiende que tales términos se refieren no sólo a la
célula sujeto particular sino también a la progenie o progenie
potencial de una célula. Debido a ciertas modificaciones que pueden
ocurrir en generaciones sucesivas por alguna mutación o influencias
ambientales, tal progenie puede, de hecho, no ser idéntica a la
célula madre, pero están también incluidas dentro del alcance del
término como usado en este documento.
Como se nota, el término "transfección" se
refiere a una variedad de técnicas reconocidas en el arte para la
introducción del ácido nucleico foráneo (por ejemplo ADN)
dentro de una célula huésped, que incluye la
co-precipitación de fosfato de potasio o cloruro de
calcio, la transfección mediada por DEAE-dextrana,
lipofección, o electroporación. Métodos apropiados para la
transformación o transfección de células huésped pueden ser
encontrados en Sambrook, y otros (MOLECULAR CLONING: A LABORATORY
MANUAL. 2da edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring
Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1989) y
otros manuales de
laboratorio.
laboratorio.
Para la transfección estable de células de
mamíferos, es conocido que, dependiendo del vector de expresión y
la técnica de transfección usada, sólo una pequeña fracción de
células puede integrar el ADN foráneo dentro de su genoma. Para
identificar y seleccionar esos integrantes exitosos, un gen que
codifica un marcador selectivo (por ejemplo, resistencia a
antibióticos) es generalmente introducido dentro de las células
huésped junto con el gen de interés. Diversos marcadores selectivos
incluyen aquellos que confieren la resistencia a drogas, como G418,
higromicina y metotrexato. El ácido nucleico que codifica un
marcador selectivo puede ser introducido dentro de una célula
huésped en el mismo vector que codifica una proteína estructural o
de regulación, o puede ser introducido en un vector separado. Las
células establemente transfectadas con el ácido nucleico introducido
pueden ser identificadas por selección de droga (por
ejemplo, las células que tienen incorporado el gen marcador
selectivo sobrevivirán, mientras otras células mueren).
La presente invención involucra las
composiciones y métodos que pueden modular la eficiencia de la
transfección de célula eucariota usando elementos de la cromatina
(por ejemplo, elementos MAR, BE y LCR). De acuerdo con la
invención, los elementos MAR pueden ser usados en métodos de
transfección de célula eucariota. Por ejemplo, un elemento MAR
apropiado para el uso en la presente invención incluye al elemento
MAR de lisozima de pollo, que es mostrado en la SEQ ID NO:1 (Ver
Tabla 1A) o un fragmento de este. Útiles también son las secuencias
nucleótidas enumeradas en los números de acceso del GenBank X52989
(SEQ ID NO:2), X84223 (SEQ ID NO:3), X98408 (SEQ ID NO:4), y
AJ277960 (SEQ ID NO:5) (Ver Tablas 1B-1E) o
fragmentos de estos. Elementos MAR adicionales siendo usados de
acuerdo con la invención pueden ser identificados, aislados, y
clonados usando una variedad de técnicas bien conocidas por
aquellos de experiencia ordinaria en el arte.
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La invención proporciona un método de
transformación de una o más células eucariotas mediante
co-transfección de dos o más vectores de ácido
nucleico dentro de la célula. Las secuencias de ácido nucleico de
SEQ ID Nos 1-5 son útiles como elementos MAR de la
presente invención. En diversas realizaciones el primer y segundo
vector son integrados dentro del ADN cromosomal de la célula
huésped. Aquellos expertos en el arte reconocerán que cualquier
significado de transfección puede ser usado de acuerdo con los
métodos divulgados en este documento. En algunas realizaciones, el
primer vector contiene un elemento de la cromatina simple (por
ejemplo, un elemento MAR). En algunas otras realizaciones, la
invención proporciona un método de transformación de una o más
células eucariotas por co-transfección de tres o
más vectores de ácido nucleico dentro de la célula. Adicionalmente
vectores transfectados pueden incluir, por ejemplo, genes que
codifican para proteínas estructurales o de regulación, o genes
de
selección.
selección.
En algunas realizaciones, elementos
potenciadores son opcionalmente incluidos en una o más de los
vectores de la invención.
La proporción de los vectores primero y segundo
puede ser adaptada como sea requerido para el uso de tipos de
célula específica, y es experimentación de rutina para uno de
experiencia ordinaria en el arte. Un rango de proporciones molares
ejemplificante no limitativo del primer vector al segundo vector
está entre alrededor de 1:2 y alrededor de 1:10. Sin embargo, otras
proporciones son también previstas por esta invención, que incluyen
2:1, 1:1, 1:20, 1:50, 1:100, y 1:1000 o más.
La presente invención también prevé el uso de
butirato para modular (por ejemplo incrementar) la expresión
transgénica (ver, por ejemplo, Ejemplo 6, infra). El
butirato también puede ser adicionado a la célula antes de,
concomitante con, o a continuación de la adición de los vectores de
ácido nucleico. Un experto en el arte determinaría fácilmente el
tiempo y la concentración de butirato más ventajosa para la línea
celular que está siendo transfectada. Por ejemplo, el butirato
puede ser adicionado en una concentración de alrededor de 0.1 mM
hasta alrededor de 1 M. Preferiblemente, en una cantidad de
alrededor de 1-500 mM, 1-250 mM,
1-100 mM, 1-75 mM,
1-50 mM, 1-25 mM,
1-20 mM, 1-15 mM,
1-14 mM, 1-13 mM,
1-12 mM, 1-11 mM o
1-10 mM. Aquellos expertos en el arte reconocerán
que el efecto(s) específico de butirato depende del tipo de
célula usada en la co-transfección, y que la
adición de butirato puede o no afectar la proliferación o
diferenciación de las células transfectadas. El butirato puede ser
adicionado en la forma de butirato de sodio o cualquier otro
compuesto conocido por aquellos expertos en el
arte.
arte.
La invención además abarca la
co-transfección de la célula eucariota con uno o más
vectores de ácido nucleico desenlazados además del primer vector
que contiene un gen que codifica una proteína deseada siendo
expresada por la célula y al menos un elemento de la cromatina la
expresión de este gen es controlada por un promotor, y el segundo
vector que contiene al menos un elemento de la cromatina (por
ejemplo, un elemento MAR de lisozima de pollo). El vector o
vectores adicionales pueden codificar para genes de selección o
productos génicos o ambos. En tales realizaciones donde tres
vectores desenlazados son co-transfectados, la
proporción de los vectores primero, segundo y tercero puede ser
adaptada como sea requerido para el uso de tipos de células
específicas. La determinación de la proporción de estos vectores es
una materia de experimentación de rutina para uno de experiencia
ordinaria en el arte. Por ejemplo, un rango de proporción molar no
limitativo de los vectores primero, segundo y tercero esta entre
alrededor de 1:1.75:5.5 y alrededor de 1:1.75:11. Otras proporciones
incluyen 1:2:20, 1:2:50, 1:2:100 o 1:2:1000 o más, están también
previstos en esta invención.
La invención también abarca una célula eucariota
que se ha co-transfectado, que contiene dos o más
vectores, un primer vector que tiene un primer promotor, un primer
gen que codifica un gen deseado o una parte de este y un elemento
MAR, y un segundo vector que incluye al menos un elemento MAR. La
invención además abarca una célula eucariota que se ha
co-transfectado, que contiene tres o mas vectores,
un primer vector que tiene un primer promotor y un primer gen que
codifica para un gen deseado o una parte de este y al menos un
elemento de la cromatina un segundo vector que incluye al menos un
elemento MAR, y un tercer vector que incluye un segundo promotor y
un segundo gen que codifica un gen deseado o una parte de este. En
algunas realizaciones de la invención, el segundo gen codifica para
un gen de selección o un gen que codifica un producto génico
detectable (por ejemplo, una proteína de fluorescencia como proteína
fluorescente verde o una proteína luminiscente como la luciferasa).
Como una realización de la invención, los vectores primero y/o
segundo son integrados dentro del ADN cromosomal de la célula
eucariota. La célula eucariota co-transfectada puede
ser una célula tratada con
butirato.
butirato.
La presente invención proporciona conjuntos para
la transfección de células eucariotas. En una realización, la
invención proporciona kits, que contienen en uno o más recipientes,
una o más células eucariotas que contienen dos o mas vectores de
ácido nucleico, el primer vector tiene un promotor, un gen
heterólogo que codifica para una proteína deseada y un elemento
MAR, y un segundo vector que tiene uno o más elementos MAR. En una
realización, el kit adicionalmente comprende butirato. Los vectores
de los kits son proporcionados en proporciones que un experto en el
arte sería capaz de usar en una línea celular bajo estudio con
experimentación mínima.
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La invención será además descrita en los
ejemplos siguientes, los que no limitan el alcance de la invención
descrito en las reivindicaciones.
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Ejemplo
1
Construcción de plásmido. Los vectores de
expresión de luciferasa usados para probar los elementos de la
cromatina son todos basados en Control-pGL3
(Promega). Este plásmido contiene un promotor SV40 frente a un ADNc
modificado de luciferasa de luciérnaga, seguido por la señal
poli(A) tardía de SV40 y el potenciador SV40. Los elementos
de Drosophila melanogaster provienen de los plásmidos p7,
p83, y p1314 (Poljak y otros, 1994). El fragmento SalI de 1.8 kb de
BE scs (estructura de la cromatina especial) proviene de p83, así
como (el locus 87A BamHI-XhoI de 960 pb de SAR
choque térmico (hsp SAR). El fragmento BamHI de 500 pb de BE scs es
derivado de p7, mientras que el EcoRI-HinfI de 657
pb histona SAR (his SAR) proviene de p1314.
Las combinaciones de estos elementos fueron
primero clonadas dentro de sitios BamHI-SalI del
Control-pGL3. El scs de BE y hsp SAR fueron
clonados como fragmentos BamHI-EcoRI y
EcoRI-SalI respectivamente, dando pMZ61. Del mismo
modo, el fragmento BamHI-EcoRI scs de BE y el
fragmento EcoRI-SalI de his SAR fueron insertados
para dar pMZ62, y el BamHI-EcoRI his SAR y el
EcoRI-SalI BE scs fueron introducidos para producir
pMZ63. Elementos de la cromatina fueron luego clonados en sitios
aguas arriba del casete de expresión de la luciferasa. El
constructo pMZ67-1 fue obtenido por clonación de los
fragmentos KpnI-BamHI de SAR hsp y BamHI de BE scs
dentro de los sitios KpnI BglII de pMZ61, mientras
pMZ70-1 resultó de la clonación de los mismos
fragmentos dentro de pMZ62. El vector pMZ71 fue construido por
introducción de los fragmentos KpnI-EcoRI de SAR his
y EcoRI-BamHI de BE scs en los sitios KpnI BglII de
pMZ61, mientras pMZ68 resultó de la clonación de los mismos
fragmentos en pMZ62. Por último, pMZ69 fue obtenida por clonación
de los fragmentos XbaI-EcoRI de BE scs y
EcoRI-BamHI de SAR his en los sitios NheI BglII de
pMZ63. El fragmento BamHI-XbaI de la MAR de lisozima
(lys MAR) de pollo de 2.95 kb (Phi-Van y Stratling,
1988) es de
pUC-B-1-X1 (Wolf
Strätling). Este fue primero clonado dentro de los sitios BamHI
SalI del Control-pGL3, dando pMZ50. El constructo
pMZ52 fue obtenido por inserción de un segundo MAR como un
fragmento KpnI-XbaI dentro de los sitios KpnI NbeI
de pMZ50. La subregión de 6 kb LCR del receptor \alpha de células
T de ratón (Ortiz y otros, 1997) originado a partir de
p3'LCR-72 (Astar Winoto). Este fue clonado dentro
de los sitios SalI y BamHI sustituido del
control-pGL3 como un fragmento EcoRI sustituido,
dando pMZ74. El fragmento NheI de 2kb a partir de S1 LIP (Ueli
Schibler) supuestamente abarca el LCR LAP de ratón (Talbot y otros,
1994). Este fue clonado en ambas direcciones como un fragmento NotI
sustituido en KpnI dentro de los sitios KpnI SmaI del
control-pGL3 para dar pMZ44 y pMZ45.
Los vectores de expresión de inmunoglobulina,
pMZ57 y pMZ36, son idénticos a aquellos descritos en otra parte
(Miescher y otros), excepto que el promotor/potenciador MIE de
citomegalovirus humano conduce la expresión de las cadenas ligeras
y pesadas. Los plásmidos para el sistema de expresión regulado,
pEF1-TetRNLS-TR450W,
pPGK-TetRNLS-TR450W,
pSV-TetRNLS-KoxW,
pVG-GTTI-Luc+,
p5xGTTI-GVP y
p5xGTTI-mEpoires\betaGeo se han descrito
previamente (Imbof y otros, 2000). Todos los plásmidos fueron
construidos usando técnicas estándares.
Cultivo de células CHO y transfección. La
línea celular CHO DG44 (Urlaud y otros, 1983) fue cultivada en
DMEM:F12 (Gibco-BRL) suplementado con HT
(Gibco-BRL) y FBS al 2 ó 10%
(Gibco-BRL). Mezclas de células CHO estables que
expresan luciferasa fueron obtenidas por transfección con
polietilenimina (PEI) (Boussif y otros, 1995). Las células fueron
cultivadas en placas de 6 cavidades a 500-750 000
células/cavidad y se dejó unirse toda la noche. Cantidades
equimolares de constructos de prueba
PvuI-linealizados, correspondientes a
2-3 \mug de Control-pGL3, fueron
co-transfectados con pSV2neo (CLONTECH Laboratories,
Inc.) en una proporción molar de 10:1, con mezclas de transfección
llevadas a un total de 10 \mug con pUC19 o pBluescript. El ADN
plásmido fue diluido en NaCl 150 mM, y un volumen igual de solución
de NaCl 150 mM que contiene 35 \mul de PEI25 10 mM (Fluka) fue
adicionado. Seguido los 15 minutos de incubación a temperatura
ambiente, la mezcla de transfección fue adicionada a las células.
El medio fue sustituido o suplementado con medio fresco después de 4
horas. Después de 48 horas, las células fueron lavadas con PBS,
tripsinizadas y recubiertas en medio suplementado con 700 \mug/ml
de geneticina (sulfato G-418,
Gibco-BRL). Cambios de medio posteriores fueron
llevados a cabo después de 13 y 15 días de selección. Los clones
individuales que expresan luciferasa fueron seleccionados después
de 12-14 días de selección, y mantenidos en medio
selectivo previo al análisis.
Los clones de CHO estables que expresan
anticuerpos IgG1 anti-Reshus D humanos fueron
obtenidos por co-transfección de la cadena ligera
del vector pMZ57, la cadena pesada del vector pMZ36 y cualquier
plásmido pUC-B-1-X1
que porte MAR, o pUC18 como control. Un total de 2.5 \mug de ADN
por cavidad, con una proporción molar de 1:1.75:5.5 ó 1:1.75:11 de
pMZ57:pMZ36:pUC-B-1-X1
fue usado, correspondiendo a una proporción molar de 2:1 y 4:1 de la
MAR: plásmidos de anticuerpo respectivamente. Las células fueron
cultivadas en placa de 12 cavidades a 140 000 células/cavidad, 18
horas previo a la transfección usando un método de precipitación
optimizado con fosfato de calcio (Jordan y otros, 1996). Un choque
de glicerol (glicerol 10% en PBS 1X) fue aplicado 3 horas después
de la transfección, y las células fueron mantenidas durante 2 días
bajo condiciones no selectivas en medio suplementado con FCS 8%. La
selección en medio (GHT)-MEM (Sigma), suplementado
con L-Prolina 100 \muM, suero bovino fetal 5%
(Gibco-BRL) dializado y tamponado con HEPES 10 mM,
fue llevado a cabo bajo el recubrimiento de las células en placas
de 10 cm. Las colonias surgidas después de 10-14
días, y los clones estables fueron transferidos a placas de 24
cavidades. Después de 8 días, los sobrenadantes de cultivo fueron
diluidos dos y diez veces, y la concentración de anticuerpo
determinada por ELISA.
Cultivo de células C2C12 y transfección.
La línea celular C2C12 fue cultivada en DMEM
(Gibco-BRL) suplementado con FBS al 10%. Clones de
C2C12 estables que expresan el supresor fueron obtenidas por
co-transfección usando Lipofectin^{TM}
(Gibco-BRL) de TK-Hyg, uno de los
supresores de la expresión de plásmidos
pEF1-TetRNLS-TR450W,
pPGK-TetRNLS-TR450W,
pSV-TetRNLS-KoxW, y el plásmido MAR
pUC-B-1-X1, en una
proporción molar de 1:4. Los clones fueron escogidos después de la
selección durante 9 días con 200 \mug/ml de higromicina B
(Gibco-BRL). La transfección transciende con
pVG-GTTI-Luc+, y pCMV\betagal
(McGregory y Caskey, 1989) como un estándar interno para la
eficiencia de la transfección, fue realizado en triplicado
esencialmente como descrito previamente (Imhof y otros, 2000). El
medio con o sin 100 ng/ml de hidrocloruro de doxiciclina (Sigma),
fue cambiado cada 24 horas, y las células fueron centrifugadas 48
horas pos-transfección. La mezcla de clones con el
represor pEF1-TetRNLS-TR450W fue
co-transfectada con el plásmido de expresión
activadora p5xGTTI-GVP, el plásmido reportero
p5xGTTI-mEpoires\betaGeo y el plásmido MAR
pUC-B1-X-1. Después
de la selección con 500 \mug/ml de geneticina, el análisis de la
mezcla de clones por citometría de flujo usando fluoresceína
di-\beta-D galactopiranosida
(Molecular Probes) fue realizado de acuerdo al fabricante. Las
células con una expresión intermedia de
\beta-galactosidasa fueron clasificadas, y esos
clones fueron expandidos en medio sin doxiciclina. Esos clones
fueron tamizados para inducción en presencia de 100 ng/ml de
hidrocloruro de doxiciclina, y aquellas que expresaban
\beta-galactosidasa fueron elegidas. Después del
cultivo en medio sin hidrocloruro de doxiciclina, los clones fueron
ensayados en presencia y ausencia de doxiciclina.
Ensayos de lisados celulares y reportero.
Extractos de células fueron preparados como sigue para mediciones
de luciferasa y proteína. Las células fueron lavadas con PBS e
incubadas con 100 \mul de tampón lisis
(Tris-fosfato 25 mM, pH 7.8, DTT 2 mM, CDTA 2 mM,
glicerol 10%, tritón X-100 0.5%) durante 20 minutos
a temperatura ambiente. Mediciones de luciferasa fueron llevadas a
cabo con 20 \mul de extracto en placas blancas de 96 cavidades.
El ensayo tipo constante de irradiación fue realizado en un
luminómetro de 96V EG&G Berthold para Microplaca, usando los
reactivos descritos en el protocolo Reactivo para Ensayo de
Luciferasa (Promega). Para cada cavidad, 100 \mul de solución de
sustrato fue adicionado por inyección. Después de un retardo de 2
segundos la emisión de luz fue medida durante 2 segundos. La
determinación colorimétrica de la actividad de la
\beta-galactosidasa fue realizada como fue
previamente descrito (Imhof y otros, 2000). La determinación
colorimétrica del contenido de proteína fue realizado por adición
de una mezcla de 155 \mul de agua y 40 \mul de reactivo color
concentrado para ensayo de proteína (BioRad) para 5 \mul de
extracto de célula en placas de 96 cavidades y medida la
absorbancia a 595 nm (Spectramax 340, Molecular Devices). Todos los
valores de absorbancia estaban dentro del rango lineal de una curva
estándar establecida con BSA. Los valores de luciferasa fueron
normalizados con relación al contenido de proteína para los clones
de CHO. Para los clones C2C12, los valores de luciferesa fueron
normalizados con relación a la actividad de
\beta-galactosidasa, y los valores de
\beta-galactosidasa con el contenido de proteína.
La inmunoglobulina humana secretada dentro del medio fue medida
mediante un ELISA sandwich, con un anticuerpo de cadena ligera
kappa anti-humano en carnero no conjugado y una
IgG\gamma anti-humana en carnero conjugada con
fosfatasa alcalina como anticuerpos de captura y detección
respectivamente (BioSource).
Análisis de Southern y rescate de
plásmido. El ADN genómico para el análisis de Southern fue
aislado con Nuclespin C+T (Macherey & Nagel, Alemania) de
acuerdo con las instrucciones del fabricante. Alícuotas (4 \mug)
fueron digeridas hasta la terminación con EcoRI, separadas mediante
electroforesis en gel de agarosa, y transferidas sobre membrana
Hybond N+ (Amersham, Inglaterra). La sonda MAR extendida fue aislada
a partir de
pUC-B-1-X1 como un
fragmento BamHI-XbaI. La radiomarcación fue
realizada con HighPrime (Roche, Suiza).
Para los experimentos de rescate de plásmido, el
ADN episomal fue aislado mediante la transfección de los vectores
de IgG1 y MAR, a partir de células CHO DG44 no transfectadas, y a
partir de células transcientemente transfectadas con
pUC-B-1-X1 una
semana antes del aislamiento del ADN. Las células fueron contadas,
lisadas en condiciones alcalinas y los plásmidos purificados con el
conjunto Nucleospin (Macherey & Nagel, Alemania). Las células
de E. coli competentes (Electro ax DH10B, Gibco) fueron
electroporadas con el extracto de plásmido a partir de
aproximadamente 10^{5} células con una Unidad Pulsadora de Gen
BioRad de acuerdo con las instrucciones de los proveedores de
células. Los tansformantes fueron elegidos sobre placas LB que
contienen 100 \mug/ml de ampicilina.
Construcción de vectores de expresión MAR
cis. Los vectores IgG-kappa y gamma SV40 MAR
cis fueron creados por clonación del fragmento
BamHI-Xba de la MAR a partir de
pUC-B1-X1 en los plásmidos pMZ59 y
pMZ37, respectivamente, linealizados con EcoRI y BamHI. El sitio
XbaI del fragmento MAR y el sitio EcoRI de pMZ59 y pMZ37 fueron
primero enromados con Pfu. Para sintetizar los vectores IgG kappa y
gamma CMV MAR cis, pMZ57 y pMZ36 fueron primero digeridos con AvaI
y KpnI, respectivamente, enromados con T4ADN polimerasa y luego
cortados con BamHI. El fragmento MAR BamHI sustituido por XbaI
descrito anteriormente fue clonado en los últimos vectores.
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Ejemplo
2
El uso de componentes estructurales de la
cromatina para superar el silenciamiento de los genes establemente
integrados por el ambiente cromosómico circundante probará ser
particularmente útil en la biotecnología. Desafortunadamente, los
elementos de la cromatina completamente caracterizados en eucariotas
superiores son raros. Además, muchos de estos no se han probado con
un promotor heterólogo en células heterólogas. Los elementos que
contrarrestan el efecto de la estructura de la cromatina vecina en
la expresión transgénica estable son esperados para alcanzar la
expresión transgénica promedio en mezclas de clones estables, donde
los efectos de diferentes sitios de integración y el número de
copias resulta promediado.
Los elementos de la cromatina simple o las
combinaciones de elementos de la cromatina fueron clonados en uno,
o ambos lados, de la unidad de expresión de la luciferasa del
Control-pGL3 como descrito en la Figura 1. Varias
combinaciones de elementos SAR y BE de Drosophila
melanogaster fueron probados flanqueando el casete de expresión
del reportero. Estos elementos han sido previamente mostrados para
estimular la expresión génica estable del reportero en células HeLa
y L (Poljak y otros, 1994). El elemento 5' MAR de lisozima de pollo
(lys MAR), o "elemento A" fue clonado flanqueando el casete de
expresión de la luciferasa, en una configuración previamente
mostrada para conferir una expresión elevada en células promacrófago
de pollo y fibroblastos de rata (Phi-Van y otros,
1990; Stief y otros, 1989). El LCR \alpha del receptor de células
T de ratón (TCR\alpha LCR) y el LCR de la proteína de hígado de
rata activada (LAP LCR) ambas se han mostrado para dirigir la
expresión de elevado nivel en múltiples tejidos en ratones
transgénicos (Ortiz y otros, 1997; Talbot y otros, 1994). La
posición y orientación de los dos LCR con relación al promotor
transgénico fue como en su locus original.
Los elementos de la cromatina tuvieron poco o
ningún efecto en los niveles de expresión transitorios donde la
estructura de la cromatina no entra en juego. Mezclas de células CHO
establemente transfectadas fueron analizadas para la expresión
transgénica (Figura 1). Un incremento modesto de 2 a 4 veces en los
niveles de expresión fue observado para todas las combinaciones
probadas de los elementos SAR y BE de Drosophila, así como para los
dos LCR probados. El único elemento probado que mostró un incremento
importante en la expresión de reportero fue el 5' MAR de lisozima
de pollo, que dio un incremento de 20 veces en la expresión de la
luciferasa cuando fue comparado con el constructo
Control-pGL3. De acuerdo con resultados previos en
células de pollo (Stief y otros, 1989), la orientación de los dos
elementos MAR flanqueando el casete de expresión del reportero no
tuvo efecto sobre la expresión transgénica. Después de este tamizaje
inicial de los elementos de la cromatina en células CHO, la
atención fue focalizada en el uso de la MAR de lisozima de pollo por
su utilidad en el desarrollo de línea de células estables.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Una estrategia alternativa para la clonación del
elemento MAR dentro del vector de expresión del reportero es
aquella de co-transfectar un plásmido que contiene
un elemento MAR con el vector de expresión transgénico. La
observación de que la transfección con múltiples plásmidos parece
resultar en la co-integración de múltiples copias
de plásmido en el mismo sitio cromosómico (Wurn y otros, 1992)
sugiere que el elemento MAR no necesita estar físicamente enlazado
con el casete de expresión transgénica a la vez de la transfección.
Sin embargo, la organización de los varios plásmidos integrados, y
como estos se pueden recombinar para generar el ADN integrado no es
conocido. Un incremento significativo en el nivel de expresión
transgénica estable es observado cuando los elementos MAR flanquean
ambos lados del casete de expresión génica del reportero, sugiriendo
que es requerido un orden preciso de los elementos genéticos.
Aunque la orientación de la MAR no afecta la expresión estable, un
arreglo con espacio definido puede ser requerido. No obstante, se
determinó si la co-transfección de la MAR y el
plásmido que porta el casete de expresión del reportero pueden
también resultar en la mejoría de la expresión transgénica
estable.
El reportero Control-pGL3 fue
co-transfectado con cantidades incrementadas del
plásmido pUC-B-1-X1
que porta el MAR de lisozima de pollo. La Figura 2 muestra la
actividad de luciferasa en mezclas de clones de CHO, incluyendo los
resultados para los constructos pMZ50 y pMZ52 con uno o dos MAR
adyacentes a la unidad de transcripción de la luciferasa
respectivamente. La comparación de la expresión estable con pMZ50 y
pMZ52 muestra que dos MAR flanqueando tienen un efecto mayor que un
MAR sencillo, cuando está presente en el propio plásmido de
expresión. Por otra parte, el incremento de la proporción del
plásmido MAR hasta el constructo del reportero a partir de una
proporción molar de 1:1 hasta 4:1 también resulta en una expresión
estable incrementada. La co-transfección del
constructo del reportero con dos MAR rinde la misma expresión
estable que la del constructo pMZ50 con un MAR. Aunque la
co-transfección con MARs no resulta en niveles de
expresión estables para la luciferasa comparado con aquellos
obtenidos con el constructo pMZ52 con dos MARs flanqueando, esto
puede también proporcionar una alternativa que significa mejorar la
expresión transgénica estable.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Mientras la expresión incrementada en mezclas de
clones estables es indicativo de un efecto positivo absoluto de la
MAR de lisozima de pollo sobre la expresión transgénica, este no
proporciona la información en cuanto a la probabilidad de aislar un
clon productor máximo. Para direccionar este tema, colonias
individuales fueron aisladas y el nivel de expresión del transgen
fue medido.
Células CHO fueron transfectadas con vectores de
expresión de la luciferesas que contienen ninguno, uno o dos MAR, y
quince colonias fueron aisladas aleatoriamente y analizadas para
cada constructo. El nivel de expresión estable de la luciferasa de
colonias individuales, ordenado de menor a mayor, es mostrado en la
Figura 3A. Consistente con los resultados obtenidos con las mezclas
de clones estables, el nivel de expresión promedio de los clones
analizados incrementa con el número de las MAR presentes en el
constructo. Más importante aún, las MAR tienen sobre la expresión
del constructo un incremento claro de la prevalencia de clones
productores máximos. Además, el nivel de expresión de los clones
más productores es superior para los constructos que portan las
MAR. De ese modo menos clones necesitan ser elegidos y analizados
para identificar un clon de elevado nivel de producción cuando las
MAR están presentes en el plásmido de expresión.
Una situación más compleja ocurre con la
producción estable de una proteína compuesta de múltiples
subunidades expresadas a partir de plásmidos separados. En lugar de
la clonación del elemento MAR dentro de cada vector separado, fue
examinado si una co-transfección sencilla de las MAR
puede también resultar en la mejoría de los niveles de expresión
estables. Para hacer eso, los vectores de expresión para la cadena
ligera y pesada del anticuerpo anti-Reshus D humano
médicamente relevante (Miescher y col. en prensa) fueron usados. Los
vectores de expresión de cadena ligera y pesada que contienen
intrones, fueron transfectados junto con el plásmido
pUC-B-1-X1 que porta
MAR o su columna pUC como un control. Las colonias CHO individuales
estables fueron elegidas y analizadas para la expresión de
anticuerpo (Figura 3B). Pocas colonias blancas expresaron anticuerpo
en el control con pUC18, la proporción de colonias que expresan
cantidades detectables de anticuerpo anti-Reshus D
incrementa con el incremento de cantidades de las MAR.
Como es observado con los constructos de
luciferasa que portan MAR, el nivel de expresión de anticuerpo de
los clones más productores es marcadamente superior para las
colonias de las MAR que para los controles. De ese modo el MAR de
lisozima de pollo incrementa tanto la proporción de clones
productores máximos como sus niveles de expresión. Esto es
verdadero cuando la MAR está presente en la expresión del
constructo, así como cuando la MAR es
co-transfectada con uno o más constructos de
expresión. Prácticamente, esto significa que las estrategias de
clonación complejas pueden ser desviadas mediante
co-transfección con el elemento MAR, que resulta en
las mismas ventajas para el desarrollo de línea de célula estable.
Más importante aún, estas ventajas son también observadas bajo la
co-transfección del plásmido que porta un elemento
MAR con varios vectores de expresión.
Para confirmar que el elemento MAR se ha
integrado dentro del genoma de la célula huésped, cuatro clones que
expresan anticuerpos seleccionados aleatoriamente fueron analizados
mediante transferencia de Southern (Figura 3C). Dos fragmentos, un
fragmento de la MAR de 1.8 kb y un fragmento de tamaño variable que
corresponde al restante de la MAR, están presentes en todos los
clones y ausentes en la línea celular CHO DG44 madre. Ambos
vectores de cadena ligera y pesada también están integrados. Un
elemento MAR recientemente se ha mostrado capaz de la replicación
episomal de vectores transfectados que contienen ori SV40 en células
CHO (Picchaczck y otros, 1999). Ninguna banda de 3.8 kb
correspondiente a
pUC-B-1-X1 replicado
episomalmente en células CHO es detectado en las transferencias de
Southern. Los experimentos de rescate de plásmido fueron llevados a
cabo para determinar si el plásmido está presente episomalmente a
bajos números de copias. Las transfecciones transitorias del
control CHO con una copia del plásmido
pUC-B-1-X1 que porta
el MAR por célula produjeron más de 200 colonias. A diferencia de,
los cuatro clones y DG44 produjeron un escenario de hasta 4 colonias
que contienen ADN sin parentesco con los plásmidos transfectados.
Juntos, estos experimentos proporcionan evidencia de que la MAR
transfectada no es episomalmente replicable sino que está integrada
dentro del cromosoma de los clones
estables.
estables.
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Ejemplo
5
Los sistemas de expresión génica regulada más
recientemente usados están basados en múltiples componentes. En
tales sistemas, la expresión estable de elementos de regulación
individuales es crítica para el control de la expresión del
transgen. Hasta la fecha, los elementos de la cromatina raramente se
han empleado en tales sistemas y su uso esencialmente se ha
limitado a la inserción de tales elementos de manera que flanqueen
el constructo transgénico (Wang y otros, 1997; Wells y otros,
1999). Fue examinado si un sistema de expresión estable regulado
puede ser obtenido mediante co-transfección de la
MAR con los componentes de un sistema de expresión regulado (Imhof
y otros, 2000). Este sistema de cambio basado en tetraciclina
involucra un supresor quimérico y proteínas activadoras que actúan
para controlar la transcripción transgénica.
En un primer paso, el vector de expresión
supresor de la proteína es establemente transfectado. Inicialmente,
la transfección del vector sólo produjo clones en los que la
expresión transgénica no sería regulada. Estos clones exhiben una
expresión supresora de la proteína inestable, especialmente después
de eliminar la presión selectiva. Los tres vectores de expresión
supresora de proteína con el plásmido 5' MAR de lisozima de pollo
fueron luego transfectados separadamente. Los resultados de un
tamizaje de 24 clones, obtenidos mediante lipofección, por su
capacidad para inducir expresión de luciferasa bajo la adición de
doxiciclina es mostrado en la Figura 4A. La mayoría de los clones
(21 de los 24) mostraron expresión transgénica regulada, con varios
exhibiendo más de 400 veces la inducción de la expresión del
reportero en presencia de doxiciclina. Además, la expresión génica
regulada fue obtenida independiente del método de transfección y del
promotor que conduce la expresión de proteína
supresora.
supresora.
En un segundo paso, los constructos activador y
reportero son transfectados establemente dentro de clones que
expresan el supresor. Una mezcla de clones que expresan establemente
la proteína supresor, y de los cuales los clones del 1 al 8 en la
Figura 4A fueron aislados, fue usado para este fin. Los constructos
activador y reportero fueron co-transfectados
establemente con el plásmido 5' MAR de lisozima de pollo, y los
clones de células individuales que expresan un nivel intermedio de
\beta-galactosidasa fueron aislados mediante
selección FACS. Estos fueron tamizados para la inducción en la
presencia de doxiciclina, y los diez clones resultantes probados
para la regulación de la expresión de
\beta-galactosidasa en ausencia y presencia de
doxiciclina después de 3 días (Figura 4B). Cinco de esos clones
mostraron expresión regulada de
\beta-galactosidasa, con una inducción que
alcanza desde 17 hasta 45 veces en la presencia de doxiciclina. La
expresión regulada del segundo transgen, eritropoyetina de ratón,
es también observado (Imhof y otros, 2000). Por lo tanto las líneas
celulares que muestran expresión regulada fueron obtenidas mediante
co-transfección de la MAR de lisozima de pollo con
los elementos del sistema de expresión.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
6
Un incremento dramático en la expresión
transgénica ocurre cuando el MAR 5' de lisozima de pollo es
combinado con la adición de butirato de sodio al medio de cultivo
de células. Sin el deseo de estar atado por la teoría, este efecto
puede resultar de un incremento en la eficiencia de transfección del
ADN, alteraciones en la proliferación y/o diferenciación de la
célula, y/o otros mecanismos celulares. El butirato se ha usado en
transfecciones transitorias o estables (Gorman y otros, 1983 Nucl.
Acids res. 11:7631; Reeves y otros, 1985, Nucl. Acids Res.
13:3599).
13:3599).
Vectores: Plásmidos que codifican cadenas
kappa y gamma de IgG anti-Reshus, pMZ59 y pMZ37, son
como previamente se describió para pMZ58 y pMZ36, respectivamente,
excepto que estos contienen el promotor temprano SV40 en lugar del
promotor CMV (ver Ejemplo 1). pMZ126 y pMZ127 son derivados de pMZ59
y pMZ37, pero contienen además un elemento MAR en cis aguas arriba
a partir del promotor SV40. pMZ126 y pMZ127 fueron construidos como
sigue: pUCB1X1 fue digerido con XbaI, de extremo en romo con ADN
polimerasa Pfu, digerido con BamHI y subclonado direccionalmente en
pMZ59 y pMZ37, respectivamente, que había sido primeramente dividido
con EcoRI, de extremo en romo con ADN polimerasa Pfu, y digerido
con BamHI.
Cultivo de célula y transfección: Las
células CHO fueron crecidas como es descrito en el Ejemplo 1. Para
la transfección, las células fueron tratadas como es descrito
previamente con las siguiente modificación: 24 horas después de la
adición de 1 ml de DMEM suplementado con FBS 10% (Gibco, Life
Technologies) a cada cavidad, 26 \mul de butirato de sodio 500 mM
pH 6,9 en PBS fue adicionado a la mitad de las cavidades como
indicado en la leyenda de la figura. Alícuotas de 2 \mul fueron
tomadas a intervalos de 24 horas y transferidas en 248 \mul de
solución de bloqueo en una placa de 96 cavidades. El titulo de IgG
fue determinado como se describió previamente mediante un ELISA
sándwich-doble.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
7
Los elementos MAR de la invención incluyen
fragmentos de elementos MAR, como fragmentos de la SEQ ID NO:1. La
Figura 7 demuestra que cuatro copias del fragmento F de la MAR
(pF4L) exponen una expresión similar a aquellas obtenidas con las
secuencias MAR naturales, más largas. Otros fragmentos exponen baja
(K,B) o ninguna (G) expresión. Cuando dos fragmentos distintos de
elementos MAR son combinados, en PK4F4L o en pB4K4L, una expresión
superior a la del elemento MAR extendido (SEQ ID NO:1) es obtenida.
De ese modo, las combinaciones particulares de los fragmentos del
elemento MAR son preferidas para modular la expresión transgénica,
en dependencia de si es deseado un tamaño pequeño o una expresión
máxima.
\vskip1.000000\baselineskip
Varios fragmentos MAR (a saber B, K, F y G)
fueron amplificados mediante la reacción en cadena de la polimerasa
usando pUC-B1-X1 como molde con
conjuntos cebadores específicos que introdujeron un sitio BglII y un
BamHI en el terminal 5'y 3', respectivamente. Después de liberar
los últimos sitios de restricción, los fragmentos fueron
auto-ligados en presencia de BgLII y BamHI. Las
repeticiones de dímero y tetrámero en orientación dirigida fueron
clonadas entre los sitios BglII-BamHI del
Control-pGL3 (Promega). Para construir los plásmidos
basados en pLuc, los varios tetrámeros fueron cortados como
fragmentos BglII-BamHI y subclonados dentro del
plásmido Control-pGL3 en el sitio BglII. Para
pF4G4L, pK4G4L y pB4G4L, los fragmentos F4, K4 y B4 fueron clonados
dentro del sitio BglII del plásmido pG4L, respectivamente. Los
plásmidos pK4F4L y pB4F4L fueron construidos mediante la clonación
de K4 y B4 en pF4L y pB4K4L fue generado mediante clonación de B4
dentro del sitio BglII de
pK4L.
pK4L.
\vskip1.000000\baselineskip
Células CHO DG44 fueron crecidas como es
descrito (ver supra) Los derivados-pLuc y
Control-pGL3 anteriores fueron transfectados en
paralelo para crear las líneas celulares receptoras para los
estudios de expresión de los vectores con fragmentos MAR y vectores
controles. Para la transfección, las células fueron cultivadas en
placas de 24 cavidades a 1.3 E5 célula/cavidad y se dejaron unir
durante 16 horas. Después de lavadas con PBS, las células fueron
transfectadas en triplicado con mezclas en un volumen final de 81
\mul de OptiMEM (Gibco, Life Sciences). Típicamente, las mezclas
contenían 0.327 pmol de plásmidos derivados de la MAR y
Control-pGL3 y 23,4 fmol de pSVneo. En un tubo de
poliestireno, 77 \mul de OptiMEM fueron combinados con 4 \mul de
LipofectAMIN2000 (Gibco, Life Science) por triplicado e incubado
durante 5 minutos. Seguidamente, el ADN y la mezcla de
LipofectAMIN2000 fueron combinados en un tubo de poliestireno.
Después de 15 minutos a temperatura ambiente, las mezclas fueron
suplementadas con 1 ml de OptiMEM por triplicado y 300 \mul de
estas mezclas fueron alicuotadas dentro de cada cavidad. Las
células fueron expuestas a las mezclas de transfección durante 3
horas. Después de eso, 1 ml de DMEM suplementado con FBS al 10%
(Gibco, Life Sciences) fue adicionado a cada cavidad. Las células
fueron pasadas 40 horas pos-transfección y los
triplicados mezclados dentro de T-75 que contiene
14 ml de medio suplementado con 750 \mug de G-418.
El medio fue sustituido cada 4 días. Las células fueron pasadas dos
semanas pos-
transfección.
transfección.
\vskip1.000000\baselineskip
Triplicados de 250 \mul de muestras de
suspensión de células fueron recogidas mediante centrifugación,
lavadas con PBS, e incubadas con 100 \mul de tampón lisis durante
20 minutos a temperatura ambiente. 20 \mul de extractos fueron
transferidos a 96 cavidades de fondo plano para la medición
posterior de la luciferasa. 5 \mul de extractos fueron usados
para la determinación de proteína mediante Bradford.
Unidades ligeras relativas fueron calculadas
mediante la normalización de la luciferasa por medición de Bradford.
Los puntos de datos representan el promedio de los triplicados de
dos experimentos de transfección indepen-
dientes.
dientes.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
Debe ser entendido que, aunque la invención se
ha descrito en conjunto con la descripción detallada de la misma,
la descripción anterior es propuesta para ilustrar y no limitar el
alcance de la invención que es definida por el alcance de las
reivindicaciones adjuntadas.
Claims (20)
-
\global\parskip0.920000\baselineskip
1. Un método para transformar in vitro o ex vivo una célula eucariota para incorporar un gene deseado o la porción de este mediante la técnica de co-transfección con vectores desenlazados, el método comprendiendo la co-transfección de la célula con:un primer vector que comprende un primer promotor y un primer gen heterólogo que codifica el gene deseado o la porción de este bajo el control transcripcional del primer promotor, y un primer elemento de la cromatina; y,un segundo vector desenlazado que comprende un segundo elemento de la cromatina, donde el elemento de la cromatina impide a la cromatina vecina afectar la expresión transgénica. - 2. El método de la reivindicación 1, donde dicho primer elemento de la cromatina es un elemento MAR (Región de Unión a la Matriz).
- 3. El método de la reivindicación 2, donde dicho elemento MAR es un elemento MAR de lisozima de pollo.
- 4. El método de la reivindicación 1, donde dicho primer elemento de la cromatina es seleccionado a partir de un grupo que consiste en la SEQ ID NO:1-5 o un fragmento de esta.
- 5. El método de la reivindicación 1, donde el segundo elemento de la cromatina es el mismo que el primer elemento de la cromatina.
- 6. El método de la reivindicación 1, donde dicho gen deseado es seleccionado a partir del grupo que consiste en un gen estructural y un gen de regulación.
- 7. El método de la reivindicación 1, donde el gen deseado codifica un polipéptido seleccionado a partir del grupo que consiste en un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, una cadena ligera de anticuerpo y una cadena pesada de anticuerpo.
- 8. El método de la reivindicación 1, donde el gen deseado codifica para un anticuerpo IgG anti-Rhesus D humano.
- 9. El método de la reivindicación 1, donde el método además comprende la introducción dentro de dicha célula eucariota de un tercer vector, donde dicho tercer vector opcionalmente comprende un segundo promotor y un segundo gen heterólogo.
- 10. El método de la reivindicación 1, donde la célula es transfectada con el primer vector y el segundo vector en una proporción molar de entre alrededor de 1:2 hasta alrededor de 1:10.
- 11. El método de la reivindicación 1, donde el método además comprende la introducción dentro de dicha célula eucariota de un tercer vector, donde dichos vectores primero, segundo y tercero son introducidos en una proporción molar de entre alrededor de 1:1.75:5.5 hasta alrededor de 1:1.75:11.
- 12. El método de la reivindicación 1, donde el primer vector además comprende un elemento de expresión génica regulable que permite la regulación de la expresión del producto génico deseado mediante la administración de una molécula exógena.
- 13. El método de la reivindicación 12, donde el elemento de expresión génica regulable es el elemento Tet-regulable.
- 14. El método de la reivindicación 1, además comprende el contacto de dicha célula con butirato.
- 15. El método de la reivindicación 14, donde la concentración de dicho butirato es aproximadamente 10 mM.
- 16. El método de la reivindicación 1, donde dicho primer elemento de la cromatina es localizado 5' hacia dicho promotor y dicho primer gen heterólogo.
- 17. El método de la reivindicación 1, donde dicho primer elemento de la cromatina es localizado 3' hacia dicho promotor y dicho primer gen heterólogo.
- 18. Una célula eucariota in vitro o ex vivo que contiene dos o más vectores, un primer vector que tiene un primer promotor, un primer gen que codifica el gen deseado o una parte de este y un elemento MAR (Región de Unión a la Matriz), y un segundo vector que comprende al menos un elemento MAR.
- 19. Un kit, que comprende en uno o más recipientes, una o más células eucariotas que incluyen dos o más vectores de ácido nucleico, el primer vector tiene un promotor, un gen heterólogo que codifica para una proteína deseada y un elemento MAR, y un segundo vector que tiene uno o más elementos MAR (Región de Unión a la Matriz).
- 20. El kit de la reivindicación 19, que comprende además butirato.
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