NO341862B1 - Ny sekvens for forbedring av ekspresjon av nukleinsyre(r) - Google Patents

Abstract

Oppfinnelsen skaffer til veie et nytt anti-repressorelement, som er anvendelig for å forbedre ekspresjonen av nukleinsyrer i en vertscelle. Metoder som anvender det nye anti-repressorelementet for å produsere et protein av interesse er også fremskaffet. Oppfinnelsen skaffer også til veie nye konfigurasjoner av ekspresjons-kassetter som består av anti-repressorelementer.

Description

Oppfinnelsen relaterer seg til feltet molekylærbiologi og bioteknologi. Mer spesifikt handler den foreliggende oppfinnelsen om rekombinante nukleinsyremolekyler som angitt i krav 1 samt anvendelse derav ifølge krav 17 til å forbedre produksjonen av én eller flere nukleinsyrer som kan kode for proteiner i en vertscelle. Den angår også fremgangsmåter for fremstilling av slike proteiner som angitt i krav 10 og 18.

Proteiner kan produseres i forskjellige vertsceller og for en rekke anvendelser innen biologi og bioteknologi, f.eks. som biofarmasøytiske midler. Metodene for en slik produksjon er vel etablerte og omfatter generelt ekspresjon i en vertscelle av en nukleinsyre (også referert til som ”transgen”) som koder for det proteinet som er av interesse.

Et problem som er assosiert med ekspresjonen av transgenet, er at det er uforutsigbart, noe som stammer fra den høye sannsynligheten for at transgenet vil bli inaktivert grunnet gendempning (”gene silencing”) (McBurney et al., 2002). Derfor må mange vertscellekloner måtte testes for høy ekspresjon av transgenet. Videre blir, med en gang en slik klon er blitt etablert, ekspresjonen av transgenet ofte ustabilt, og demping av ekspresjonen av transgenet i løpet av en lengre dyrking av vertscellen er et vanlig observerbart fenomen. I vertebrate celler kan det skyldes dannelse av heterokromatin i transgenets locus, noe som hindrer transkripsjon av transgenet (Whitelaw et al, 2001). Transgen demping er stokastisk; dvs. at det kan opptre innen kort tid etter integrasjonen av transgenet i genomet, eller bare etter et visst antall celledelinger. Dette resulterer i heterogene cellepopulasjoner etter forlenget dyrking, under hvilken noen celler fortsetter å uttrykke høye nivåer av rekombinant protein, mens andre uttrykker små eller ikke målbare nivåer av proteinet (Martin & Whitelaw, 1996, McBurney et al., 2002). En cellelinje som blir benyttet for produksjon av heterologe proteiner, blir avledet fra en enkelt celle, likevel blir den oppskalert og til og med bibeholdt over lengre tid med celletettheter i overkant av 10 millioner celler per ml i dyrkningskammere på 1.000 liter eller mer. Disse store cellepopulasjonene(1014 - 1016 celler) er gjenstand for alvorlig forfall eller nedgang i produktivitet grunnet demping av transgenet (Migliaccio et al., 2000, Strutzenberger et al., 1999).

En mulighet for å overvinne dette problemet som er beskrevet ovenfor, er å anvende såkalte STAR-sekvenser i et ekspresjonssystem. En rekke slike STAR-sekvenser har blitt beskrevet i WO 03/004704. Disse sekvensene kan anvendes for å forbedre forutsigbarheten, utbyttet og/eller stabiliteten til produksjonen av proteinet, I det man benytter ekspresjonskonstrukter i flere typer av vertsceller (WO 03/004704; Kwaks et al, 2003).

Den internasjonale publikasjonen WO 03/106674 beskriver bruken av STAR-sekvenser for å uttrykke nukleinsyrer som koder for rekombinante proteiner i flere forskjellige cellelinjer.

Den internasjonale publikasjonen WO 03/106684 beskriver bruken av STAR-sekvenser for å uttrykke nukleinsyrer som koder for multimere proteiner, slike som antistoffer.

Den foreliggende oppfinnelsen tar mål av seg til å fremskaffe alternative midler og fremgangsmåter til å forbedre produksjonen av proteiner.

Oppsummering av oppfinnelsen

I en variant av oppfinnelsen skaffes det til veie et rekombinant nukleinsyremolekyl som består av en nukleinsyresekvens som oppviser anti-repressoraktivitet valgt ut fra gruppen som består av: a) SEQ. ID. NO. 66, b) fragmenter av SEQ. ID. NO. 66 hvori nevnte fragmenter oppviser anti-repressoraktivitet, c) sekvenser som er minst 70 % identiske i nukleotidsekvensen for a) eller b) hvori nevnte sekvens oppviser anti-repressoraktivitet; og d) hvori komplementet til en hvilken som helst av a) til c); der nevnte rekombinante nukleinsyremolekyl videre består av en ekspresjonskasett og nevnte ekspresjonskasett omfatter en heterolog promotor som er knyttet til en nukleinsyre av interesse, og hvori nevnte nukleinsyre av interesse fortrinnsvis koder for helle eller deler av et protein av interesse. I en foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen, der nevnte nukleotidsekvens oppviser antirepressoraktivitet, er sekvensen plassert oppstrøms for nevnte promotor i nevnte ekspresjonskasett, og særskilt foretrukne varianter av disse igjen der nevnte nukleotidsekvenser som oppviser anti-repressoraktivitet, og nevnte promotor er atskilt med mindre enn 2 kb. I visse varianter av den foreliggende oppfinnelsen er nevnte nukleinsyre, som koder for et protein av interesse, til stede i et mulicistronisk gen som videre koder for et selekterbart markørgen. I visse utgaver av oppfinnelsen omfatter nevnte molekyl minst en annen sekvens som oppviser antirepressoraktivitet, hvorav nevnte andre sekvens skal velges fra a) en hvilken som helst av SEQ. ID. NOs. 1-65, b) fragmenter av en hvilken som helst av SEQ. ID. NOs. 1-65, hvori nevnte fragmenter oppviser anti-repressoraktivitet, c) sekvenser som er minst 70 % identiske i nukleotidsekvens med a) eller b) hvori nevnte sekvenser oppviser anti-repressoraktivitet, og d) komplementet til en hvilken som helst av a) til c). Oppfinnelsen skaffer også til veie et rekombinant nukleinsyremolekyl som består av en ekspresjonskasett som omfatter: 5’- anti-repressorsekvens A - promotor – nukleinsyre som koder for hele eller deler av et protein av interesse – anti-repressorsekvens B – 3’ hvori anti-repressorsekvensene A og B kan være de samme eller også være forskjellige og blir selektert fra gruppen som består av (i) en hvilken som helst av SEQ. ID. NOs. 1-65, (ii) fragmenter av en hvilken som helst av SEQ. ID. NOs. 1-65, hvori nevnte fragmenter oppviser antirepressoraktivitet, (iii) sekvenser som er minst 70 % identiske i nukleotidsekvens med a) eller b) hvori nevnte sekvenser oppviser anti-repressoraktivitet, og (iv) komplementet til en hvilken som helst av (i) til (iii), karakterisert ved at nevnte ekspresjonskasett videre omfatter mellom nevnte anti-repressorsekvenser A og B, en sekvens som oppviser anti-repressoraktivitet valgt fra gruppen som består av:

a) SEQ. ID. NO. 66, b) fragmenter av SEQ. ID. NO. 66 hvori nevnte fragment oppviser anti-repressoraktivitet, c) sekvenser som er minst 70 % identiske i nukleotidsekvens med a) eller b) hvori nevnte sekvens oppviser anti-repressoraktivitet; og d) komplementet til en hvilken som helst av a) til c).

Oppfinnelsen fremskaffer videre en celle som omfatter eller inneholder et molekyl i overensstemmelse med oppfinnelsen. Fortrinnsvis er nevnte celle en mammalsk celle, og i visse varianter av oppfinnelsen er nevnte celle en CHO-celler.

Oppfinnelsen skaffer videre til veie en fremgangsmåte for å fremstille et protein av interesse, bestående av å dyrke en celle som omfatter eller inneholder et rekombinant nukleinsyremolekyl som koder for proteinet av interesse, som kan uttrykke nevnte nukleinsyremolekyl som koder for proteinet av interesse i nevnte celle, karakterisert ved at nevnte rekombinante nukleinsyremolekyl omfatter en nukleinsyresekvens som oppviser anti-repressoraktivitet selektert fra gruppen som består av:

a) SEQ. ID. NO. 66, b) fragmenter av SEQ. ID. NO. 66 hvori nevnte fragmenter oppviser anti-repressoraktivitet, c) sekvenser som er minst 70 % identiske i nukleotidsekvens med a) eller b) hvori nevnte sekvenser oppviser antirepressoraktivitet; og d) komplementet til en hvilken som helst av a) til c). I en foretrukket utgave av den foreliggende oppfinnelsen omfatter fremgangsmåten videre isolering av nevnte protein av interesse. I foretrukne varianter, befinner nevnte nukleotidsekvenser med anti-repressoraktivitet seg oppstrøms for en promotor som kontrollerer ekspresjonen av proteinet av interesse. I en derav foretrukket implementering er nevnte sekvens som oppviser anti-repressoraktivitet og nevnte promotor atskilt med mindre enn 2 kb. I visse utgaver av oppfinnelsen er nevnte nukleinsyre som koder for et protein av interesse, til stede i et multicistronisk gen som videre koder for et selekterbart markørgen. I visse varianter er nevnte celle en mammalsk celle, f.eks. en CHO-celler.

Oppfinnelsen skaffer også til veie anvendelsen av en nukleinsyresekvens som oppviser anti-repressoraktivitet selektert fra gruppen som består av: a) SEQ. ID. NO.

66, b) fragmenter av SEQ. ID. NO. 66 hvori nevnte fragment oppviser antirepressoraktivitet, c) sekvenser som er minst 70 % identisk i nukleotidsekvens med a) eller b) hvori nevnte sekvenser oppviser anti-repressoraktivitet; og d) komplementet til en hvilken som helst av a) til c), for å kunne øke ekspresjonen av en nukleinsyre av interesse.

I nok en variant av oppfinnelsen fremskaffes en fremgangsmåte for å generere en vertscelle som uttrykker to polypeptider av interesse, der metoden omfatter: a) å introdusere inn i en vertscelle ett eller flere nukleinsyremolekyler, der nukleinsyremolekylet eller molekylene til sammen består av: (i) en promotor som er funksjonelt knyttet sammen til en sekvens som koder for et første polypeptid av interesse og et første selektabelt markørgen, og (ii) en promotor funksjonelt koblet til en sekvens som koder for et andre polypeptid av interesse og et andre selektabelt markørgen, og (iii) der minst en sekvens oppviser anti-repressoraktivitet, valgt fra gruppen som består av (a) en hvilken som helst av SEQ. ID. NOs. 1-66, (b) fragmenter av en hvilken som helst av SEQ. ID. NOs. 1-66, hvorav nevnte fragmenter oppviser anti-repressoraktivitet, (c) sekvenser som er minst 70 % identiske med (a) eller (b) og oppviser anti-repressoraktivitet, og (d) komplementet av en hvilken som helst av (a)-(c); b) å selektere en vertscelle ved å velge ut hovedsakelig samtidig for ekspresjon av nevnte første og nevnte andre selektable markørgener. Oppfinnelsen skaffer også til veie en mulighet for å kunne uttrykke to polypeptider av interesse, hvor det anvendes en fremgangsmåte som består av: å dyrke en vertscelle som er oppnådd ved bruk av nærværende fremgangsmåte i samsvar med oppfinnelsen for å uttrykke nevnte første og andre polypeptid, og valgfritt isolere nevnte polypeptider. I en utgave av oppfinnelsen oppviser nevnte sekvens antirepressoraktivitet og er selektert fra gruppen som består av a) SEQ. ID. NO. 66, b) fragmenter av SEQ. ID. NO. 66 hvori nevnte fragment oppviser anti-repressoraktivitet, c) sekvenser som er minst 70 % identiske i nukleotidsekvens med a) eller b) hvori nevnte sekvenser oppviser anti-repressoraktivitet; og

d) komplementet til en hvilken som helst av a) til c). I visse implementeringer av oppfinnelsen er de nevnte to polypeptidene deler av et multimerisk protein.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Anti-repressorsekvenser

Sekvenser som oppviser anti-repressoraktivitet, som beskrevet i teksten, er sekvenser som er i stand til, i det minste delvis, å kunne motvirke den hemmende effekten av HP1- eller HPC2-proteinene når disse proteinene blir bundet til DNA. Sekvenser som oppviser anti-repressoraktivitet (av og til referert til som antirepressorsekvenser eller anti-repressorelementer i teksten) og som passer i denne oppfinnelsen, har blitt fremlagt i WO 03/004704, og ble her navngitt som ”STAR” sekvenser (hver gang en sekvens blir referert til som en STAR-sekvens i teksten, oppviser denne anti-repressoraktivitet i samsvar med oppfinnelsen). Som et eksempel er sekvenser med 65 anti-repressorelementer, navngitt STAR1-65 (se WO 03/004704) presentert i teksten som hhv. SEQ. ID. NOs. 1-65.

I overensstemmelse med oppfinnelsen er et funksjonelt fragment eller derivat av et gitt anti-repressorelement betraktet likeverdig med nevnte anti-repressorelement, når det fortsatt oppviser anti-repressoraktivitet. Tilstedeværelsen av en slik antirepressoraktivitet kan enkelt sjekkes av en person som har dyktiggjort seg i faget, f.eks. ved hjelp av analysen som er beskrevet nedenfor. Funksjonelle fragmenter eller derivater kan enkelt fremstilles av en person som er fortrolig med fagfeltet molekylærbiologi, ved å starte med en gitt anti-repressorsekvens og foreta delesjoner, addisjoner, substitusjoner, inversjoner og lignende (se f.eks. WO 03/004704). Et funksjonelt fragment eller derivat omfatter også ortologe varianter fra andre arter som kan fremskaffes ved å benytte kjente anti-repressorsekvenser ved hjelp av metoder som er kjent for en dyktig fagperson (se f.eks. WO 03/004704). Således omfatter den foreliggende oppfinnelsen fragmenter av anti-repressorsekvensene, hvori nevnte fragmenter fortsatt oppviser anti-repressoraktivitet. For fragmenter av en gitt sekvens, refererer prosent identitet seg til den delen av den opprinnelige referansesekvensen som er å finne i fragmentet. Oppfinnelsen favner også sekvenser som er minst 70 % identiske i nukleotidsekvens med nevnte sekvenser som oppviser anti-repressoraktivitet eller med funksjonelle fragmenter av disse som oppviser anti-repressoraktivitet, så lenge som disse sekvensene som er minst 70 % identiske fortsatt oppviser anti-repressoraktiviteten i overensstemmelse med den foreliggende oppfinnelsen. Fortrinnsvis er nevnte sekvenser minst 80 % identiske, mer foretrukket minst 90 % identiske og enda mer foretrukket minst 95% identiske med den opphavelige referansesekvensen eller funksjonelle fragmenter av denne.

Sekvenser som oppviser anti-repressoraktivitet i overensstemmelse med oppfinnelsen, kan oppnås ved hjelp av forskjellige metoder, inklusive kloning fra det humane genomet eller fra genomet til en annen organisme, eller ved f.eks. å amplifisere kjente anti-repressorsekvenser direkte fra slike genomer ved hjelp av kunnskap om sekvensene, f.eks. via PCR, eller de kan erverves delvis eller fullstendig via kjemisk syntese.

Sekvenser som oppviser anti-repressoraktivitet, samt funksjonelle fragmenter eller derivater av disse, er strukturelt definert i teksten gjennom sine sekvenser og i tillegg er de funksjonelt definert som sekvenser som oppviser anti-repressoraktivitet, som kan bestemmes med analysemetoden som er beskrevet nedenfor.

En hvilken som helst sekvens som oppviser anti-repressoraktivitet i samsvar med den foreliggende oppfinnelsen skulle i det minste være i stand til å overleve de følgende funksjonelle analysene (se WO 03/004704, eksempel 1). Humane U-2 OS-celler (ATCC HTB-96) blir stabilt transfektert med pTet-Off plasmidet (Clontech K1620-A) og med nukleinsyre som koder for et LexA-repressor fusjonsprotein som inneholder det LexA DNA-bindende domenet og den kodende regionen til enten HP1 eller HPC2 (Drosophila Polycomb gruppe proteiner som undertrykker genekspresjon når de binder seg til DNA; analysen fungerer med begge fusjonsproteinene) under kontroll av et Tet-Off-inneholdende transkripsjonsregulerende system (Gossen og Bujard, 1992). Disse cellene er referert til nedenfor som reportercellene for analysen av anti-repressoraktivitet. Et reporterplasmid som skaffer til veie motstand mot hygromycin, inneholder en polylinkersekvens som er posisjonert mellom fire LexA operatorseter og SV40-promotoren som kontrollerer zeocin resistensgenet. Sekvensen som skal testes for anti-repressoraktivitet, kan klones inn i nevnte polylinker. Konstruksjonen av et passende reporterplasmid, slik som pSelect, er beskrevet i eksempel 1, og Fig. 1 i WO 00/004704. Reporterplasmidet blir transfektert inn i reportercellene og cellene blir dyrket under seleksjon i hygromycin (25 µg/ml; seleksjon for tilstedeværelse av reporterplasmidet) og tetracyklin-mediert undertrykkelse (doxycyklin, 10 ng/ml; hemmer ekspresjon av LexA-repressor fusjonsproteinet). Etter 1 ukes vekst under disse forholdene blir doxycyklin-konsentrasjonen redusert til 1 ng/ml (eller lavere) for å indusere LexA-repressorgenet, og etter 2 dager blir zeocin tilsatt i en konsentrasjon på 250 µg/ml. Cellene blir så dyrket i 5 uker inntil kontrollkulturene (transfektert med tomme reporterplasmider, dvs. de mangler en klonet anti-repressorsekvens i polylinkeren) blir drept av zeocinet (i dette kontrollplasmidet blir SV40-promotoren undertrykket av LexA-repressor fusjonsproteinet som har bundet seg til det LexA-opererende setet, noe som resulterer i utilstrekkelig zeocinekspresjon i slike celler som overlever zeocinseleksjon). En sekvens som oppviser anti-repressoraktivitet i overensstemmelse med den foreliggende oppfinnelsen, hvis (når nevnte sekvens blir klonet inn i polylinkeren til reporterplasmidet) reportercellene overlever de 5 ukene med seleksjon i nærvær av zeocin. Celler fra slike kolonier kan fortsatt mangfoldiggjøres (vokse) i nye medier som inneholder zeocin etter de 5 ukene med zeocinseleksjon, mens celler som er blitt transfektert med reporterplasmid som mangler anti-repressorsekvenser, ikke kan vokse videre i nye medier som inneholder zeocin. En hvilken som helst sekvens som ikke er i stand til å overføre slik vekst etter 5 uker med seleksjon i nærvær av zeocin i denne analysen, kvalifiserer ikke som sekvens som oppviser anti-repressoraktivitet, eller funksjonelt fragment eller funksjonelt derivat av dette i samsvar med den foreliggende oppfinnelsen. Som et eksempel, overlever ikke kjente grensesekvenser slike som testet av Van der Vlag et al (2000), inklusive Drosophila scs (Kellum and Schedl, 1991), 5’-HS4 av kylling-derivert β-globin locus (Chung et al, 1993, 1997) eller Matrix Attachment Regions (MARs) (Phi-Van et al., 1990), denne analysen.

I tillegg er det foretrukket at anti-repressorsekvensen eller et funksjonelt fragment eller derivat av denne tilfører/overfører en større grad av reporteroveruttrykkende kloner når den grenser til et reportergen (f.eks. luciferase, GFP) som er integrert i genomet til U-2 OS- eller CHO-celler, sammenlignet med nevnte reportergen som ikke flankeres av anti-repressorsekvenser, eller tilgrenses av svakere represjonsblokkerende sekvenser, slike som Drosophila scs. Dette kan verifiseres ved f.eks. å benytte pSDH-vektoren eller lignende vektorer, som beskrevet i eksempel 1 og Fig. 2 i WO 03/004704.

Anti-repressorelementer i henhold til oppfinnelsen kan innebære minst én av tre konsekvenser for produksjon av et protein: (1) de kan øke forutsigbarheten i å identifisere vertscellelinjer som uttrykker et protein i en industrielt akseptabel målestokk; (2) de kan resultere i vertscellelinjer med forøket utbytte av proteiner; og/eller (3) de kan resultere i vertscellelinjer som oppviser en mer stabil produksjon av proteiner under langtidsdyrkning. Hver og en av disse egenskapene blir diskutert i mer detaljert form nedenfor:

(1) Økt forutsigbarhet: Integrasjon av transgene ekspresjonskasetter kan opptre i tilfeldige posisjoner gjennom hele vertscellegenomet. Imidlertid er en stor del av genomet ”taust” heterokromatin hva gjelder transkripsjon. Når ekspresjonskasetten inkluderer anti-repressorelementer som flankerer transgenet, har posisjonen til integrasjonen en redusert effekt på ekspresjonen. Anti-repressorelementer forstyrrer evnen til det tilstøtende heterokromatinet til å dempe transgenet. Som en konsekvens av dette blir andelen av transgen-inneholdende vertsceller med akseptable ekspresjonsnivåer forøket. I virkeligheten resulterer inkorporasjonen av antirepressorsekvenser i etableringen av opp til 10 ganger så mange kolonier, sammenlignet med det samme transgenet dersom det mangler anti-repressorsekvenser, når den samme mengde DNA blir transfektert.

(2) Utbytte: Nivåene på ekspresjonen av proteiner i primære populasjoner av rekombinante vertsceller direkte etter integrasjon av transgenet har blitt undersøkt. Nivået av ekspresjon mellom de forskjellige individene i populasjonen varierer. Når transgenet blir beskyttet ved hjelp av anti-repressorelementer, vil imidlertid variabiliteten bli redusert. Denne reduserte variabiliteten er høyst iøynefallende i det at færre kloner som gjenvinnes oppviser lave nivåer av ekspresjon. Videre besitter populasjoner med anti-repressorelementer vanligvis påfallende mye høyere ekspresjonsgrad. Disse individene som oppviser høyt utbytte viser seg fordelaktige for produksjon av proteiner, enten i forbindelse med høsting eller i forbindelse med forandring av fenotype av cellen eller en organisme som består av slike celler.

(3) Forøket stabilitet: anti-repressorelementer øker stabiliteten til transgener i rekombinante vertscellelinjer ved å sikre at transgenene ikke blir dempet hva angår transkripsjon under langvarig dyrkning. Sammenlignende undersøkelser viser at, under forhold der transgenene ikke blir beskyttet av anti-repressorelementer, blir transgenene gradvis dempet (5 - 25 passasjer med dyrkning): anti-repressorelement-beskyttede transgener fortsetter å bli uttrykt på høye nivåer. Dette er en fordel under industriell produksjon av proteinlignende molekyler, under hvilken celledyrkning fortsetter gjennom lange perioder, fra noen få uker til mange måneder. På samme måte kan stabil ekspresjon over lange perioder være fordelaktig i planter og dyr med endret fenotype som en konsekvens av rekombinant ekspresjon av anti-repressorbeskyttede transgener.

STAR67

Den foreliggende oppfinnelsen skaffer til veie en ny sekvens som oppviser antirepressoraktivitet, som ble kalt STAR67 (SEQ. ID. NO. 66). Denne anti-repressorsekvensen øker umiddelbart ekspresjonen sterkt bare når den blir plassert oppstrøms for en promotor som driver ekspresjon fra genet av interesse, noe som fremstår klart i eksemplene som er fremskaffet i teksten, mens inntil nå kjente potente anti-repressorsekvenser slike som STAR6 eller STAR7 viser seg å gi en mye mindre fordel i denne konfigurasjonen (de fungerer særskilt godt når de flankerer et transgen, f.eks. når de er til stede både oppstrøms og nedstrøms for transgenet). Følgelig skaffer STAR67 til veie et alternativ til allerede kjente antirepressorsekvenser, og når de blir plassert oppstrøms for en promotor viser de seg å kunne gi en større fordel når det sammenlignes med slike kjente anti-repressorsekvenser. STAR67 er ikke en enhancer-blokker, i kontrast til andre antirepressorsekvenser som er testet for denne egenskapen (Kwaks et al, 2003), og representerer dermed en annen forskjell mellom STAR67 og andre anti-repressorsekvenser som er forevist tidligere. Altså kan STAR67 operere på en a bidireksjonal måte, som vist i eksempel 7. I samsvar med den foreliggende oppfinnelsen sørger tilstedeværelsen av STAR67-sekvensen i en ekspresjonskasett for økt forutsigbarhet og/eller utbytte og/eller stabil ekspresjon. Der er demonstrert i teksten at STAR67 er funksjonell i kombinasjon med forskjellige promotorer og i forskjellige cellelinjer.

Ekspresjonskasett

Et nukleinsyremolekyl i overensstemmelse med den foreliggende oppfinnelsen, omfattende STAR67, kan anta ethvert format, f.eks. som DNA-fragment, om ønskelig til stede i en kloningsvektor slik som et plasmid, fortrinnsvis en ekspresjonsvektor, og kan benyttes f.eks. i kloningsformål ved å anvende standard rekombinant DNA-teknologi. I foretrukne varianter av oppfinnelsen består nukleinsyren av en ekspresjonskasett, noe som er nyttig for å kunne uttrykke sekvenser av interesse, f.eks. i vertsceller.

En “ekspresjonskasett”, som anvendt i teksten, er en nukleinsyresekvens som består av minst en promotor funksjonelt knyttet til en sekvens hvis ekspresjon er ønsket, der sekvensen hvis ekspresjon er ønsket fortrinnsvis er en åpen leseramme som koder for hele eller deler av et protein av interesse. Promotoren er fortrinnsvis en heterolog promotor med hensyn til nevnte nukleinsyre av interesse, hvorved en heterolog promotor er definert som en promotor som ikke er den naturlige promotoren til nevnte sekvens av interesse. Med andre ord har en eller annen form av menneskelig intervensjon, som f.eks. molekylær kloning, blitt anvendt på et eller annet tidspunkt for å lage en funksjonell kombinasjon av en heterolog promotor med en nukleinsyre av interesse, og det antas lett å forstå i denne sammenhengen at en heterolog promotor kan avledes fra den samme eller fra en annen organisme enn sekvensen av interesse. Fortrinnsvis inneholder en ekspresjonskasett transkripsjonelle terminerings- og polyadenyleringssekvenser. Andre regulatoriske sekvenser slike som enhancere kan også være inkludert. Ekspresjonsenhetene i samsvar med den foreliggende oppfinnelsen omfatter videre minst en antirepressorsekvens, slik som STAR67. Visse foretrukne utgaver av nevnte antirepressorsekvens, fortrinnsvis STAR67, blir plassert oppstrøms for nevnte promoter, fortrinnsvis på en slik måte at mindre enn 2kb befinner seg mellom 3’ enden av anti-repressorsekvensen og starten på promotorsekvensen. I foretrukne utgaver av oppfinnelsen er mindre enn 1 kb, mer foretrukket mindre enn 500 nukleotider (nt), enda mer foretrukket mindre enn rundt 200, 100, 50, eller 30 nt til stede mellom 3’ enden av anti-repressorsekvensen og starten på promotersekvensen. I visse foretrukne utgaver av den foreliggende oppfinnelsen blir anti-repressorsekvensen klonet direkte oppstrøms for promotoren, noe som resulterer i rundt 0-20 nt avstand mellom 3’ enden av anti-repressorsekvensen og starten på promotorsekvensen.

For å oppnå ekspresjon av nukleinsyresekvenser som koder for et rekombinant protein, er det velkjent for dem som er utdannet i feltet at sekvenser som er kapable til å drive slik ekspresjon kan være funksjonelt koblet til nukleinsyresekvenser som koder for proteinet, og som resulterer i rekombinante nukleinsyremolekyler som koder for et rekombinant protein i et uttrykkbart format. Generelt er promotor sekvensen plassert oppstrøms for sekvensen som koder for proteinet av interesse. Anvendelige vektorer er tilgjengelige innenfor fagfeltet, f.eks. pcDNA- og pEF-vektorseriene til Invitrogen, pMSCV og pTK-Hyg fra BD Sciences, pCMV-Script fra Stratagene, etc.

Der hvor sekvensen som koder for polypeptidet av interesse blir innsatt på riktig måte, med referanse til sekvenser som styrer transkripsjon og translasjon til det kodede polypeptidet, er den resulterende ekspresjons-kasetten anvendelig for å produsere proteinet av interesse, her referert til som ekspresjon. Sekvenser som driver ekspresjon kan omfatte promotorer, enhancere og lignende, samt kombinasjoner av dem. Disse skulle være i stand til å fungere i verscellen, for derved å drive ekspresjonen av nukleinsyresekvensene som er funksjonelt koblet til dem. En person som har dyktiggjort seg i faget er oppmerksom på at forskjellige promotorer kan anvendes for å oppnå ekspresjon av et gen av interesse i vertsceller. Promotorene kan være konstitutive eller regulerte og kan hentes fra forskjellige kilder, inklusive vira, prokaryote eller eukaryote kilder, eller fra kunstig utviklede kilder. Ekspresjon av nukleinsyrer av interesse kan avledes fra naturlige promotorer eller derivater av disse eller fra en fullstendig heterolog promotor (Kaufman, 2000). Noen velkjente og mye brukte promotorer for ekspresjon i eukaryote celler består av promotorer avledet fra vira, slike som adenovirus, f.eks. E1A-promotoren, promotorer avledet fra cytomegalovirus (CMV), slike som CMV ”immediate early” (IE)-promotoren (referert til i teksten som CMV-promotoren) (som kan skaffes fra f.eks. pcDNA, Invitrogen), promotorer avledet fra Simian Virus 40 (SV40) (Das et al, 1985), og lignende. Passende promotorer kan også avledes fra eukaryote celler, slike som metallothionein (MT)-promotorer, elongeringsfaktor 1 α (EF-1 α)-promotoren (Gill et al., 2001), ubiquitin C eller UB6-promotor (Gill et al., 2001; Schorpp et al, 1996), actin-promotor, en immunoglobulin-promotor, ”heat shock”-promotorer, og lignende. Noen foretrukne promotorer for å oppnå ekspresjon i eukaryote celler, som er passende promotorer i overensstemmelse med foreliggende oppfinnelse, er CMV-promotoren, en mammalsk EF1-alpha-promotor, en mammalsk ubiquitin-promotor, slik som en ubiquitin C-promotor, eller en SV40-promoter (f.eks. mulig å skaffe fra pIRES, kat.no. 631605, BD Sciences). Å teste for promotorfunksjon og styrken til en promotor er en rutinesak for en person som er utdannet i faget, og kan f.eks. generelt omfatte kloning av et testgen, slike som lacZ, luciferase, GFP, etc. bak promotorsekvensen, og analyse av ekspresjon av testgenet. Selvfølgelig kan promotorene endres ved hjelp av delesjon, addisjon eller mutasjon av sekvenser i dem og analyseres for funksjonalitet for å finne nye, svekkede aller forbedrede promotorsekvenser.

En ekspresjonskasett i samsvar med den foreliggende oppfinnelsen kan være monocistronisk, bicistronisk eller multicistronisk. Uttrykket “bicistronisk gen” er definert som et gen som er i stand til å fremskaffe et RNA-molekyl som koder for to proteiner/polypeptider. Termen “monocistronisk gen" er definert som et gen som er i stand til å skaffe til veie et RNA-molekyl som koder for ett protein/polypeptid. Uttrykket “multicistronisk gen” er definert som et gen som er kapabelt til å skaffe til veie et RNA molekyl som koder for to eller flere proteiner/polypeptider, og et bicistronisk gen er derfor omfattet av definisjonen av et multicistronisk gen. Et “gen”, som anvendt i teksten som beskriver den foreliggende oppfinnelsen, kan omfatte kromosomalt DNA, cDNA, kunstig DNA, kombinasjoner av disse og lignende, og kan også eksistere i form av andre nukleinsyrer, f.eks. RNA. I visse implementeringer av oppfinnelsen består den av en enhet som uttrykker protein av et multicistronisk gen. Enheter som består av flere cistroner kan bli transkribert som et enkelt mRNA. Translasjon av de andre og videre kodende regionene som befinner seg på det angjeldende RNA, kan oppnås på mange måter, inklusive bruk av reinitieringsseter for translasjon eller indre tilgangsseter på ribosomer, hvorav sistnevnte er å foretrekke. En fordel med bi- eller multi-cistroniske enheter kan innebære en enkel seleksjon av kloner som uttrykker et protein av interesse, ved å plassere nukleinsyren som koder for et selektabelt markørprotein nedstrøms for nukleinsyren som koder for et protein eller polypeptid av interesse.

For produksjonen av multimeriske proteiner kan man bruke to eller flere ekspresjonskasetter. Denne varianten av den foreliggende oppfinnelsen har vist seg å gi gode resultater ved f.eks. ekspresjon av tung og lett kjede fra antistoffer. I overensstemmelse med oppfinnelsen bør minst en av ekspresjonskasettene, men helst begge to bestå av en STAR-sekvens. I en annen implementering av oppfinnelsen er de forskjellige subenhetene eller delene av et multimerisk protein til stede på en enkeltstående ekspresjonskasett.

I stedet for eller i tillegg til tilstedeværelsen av en anti-repressorsekvens plassert oppstrøms for en promotor i en ekspresjonskasett er den blitt bevist å være høyst fordelaktig i å skaffe til veie en anti-repressorsekvens på begge sider av en ekspresjonskasett, slik at ekspresjonskasetten som består av transgenet er flankert av to anti-repressorsekvenser, som i visse implementeringer av oppfinnelsen er fullstendig lik hverandre. Selvfølgelig kan dette gjennomføres med STAR67, dvs. at man oppnår en ekspresjonskasett som er flankert av to STAR67-sekvenser. Alternative posisjoner for en enkeltstående STAR67-sekvens i en ekspresjonskasettt, f.eks. bak transgenet, fortrinnsvis bak transkripsjonsrelaterte stopp- og polyadenyleringssignaler, men det er også mulig med den 3’ enden av STAR67-sekvensen vendt mot transgenet.

En ekspresjonskasett i overensstemmelse med den foreliggende oppfinnelsen kan alternativt bestå av et markørgen for seleksjon. Benevnelsen ”seleksjonsmarkør” eller ”selektable markør” er typisk benyttet for å referere til et gen og/eller protein hvis tilstedeværelse kan detekteres direkte eller indirekte i en celle, det være seg f.eks. et gen og/eller et protein som inaktiverer et selekterende agens og beskytter vertscellen fra dette agensets dødelige eller veksthemmende effekter (f.eks. en gen som koder for resistens mot antibiotika og/eller et protein). En annen mulighet er at nevnte seleksjonsmarkør induserer fluorescens eller avlevering av en farge (f.eks. et grønt fluorescerende protein og derivater av dette, luciferase, lacZ, alkalisk fosfatase etc). I visse varianter av oppfinnelsen er den benyttede seleksjonsmarkøren zeocin, og for å selektere en andre ekspresjons-kasett blir puromycin anvendt. En person som har dyktiggjort seg i faget vil kjenne til at andre seleksjonsmarkører er tilgjengelige og kan anvendes, som f.eks. neomycin, blasticidin, puromycin, bleomycin, hygromycin, dhfr, etc.

Termen “seleksjon” er typisk definert som den prosessen der man anvender en seleksjonsmarkør/ selekterbar markør og et selekterende agens for å identifisere vertsceller med særskilte genetiske egenskaper (f.eks. at en vertscelle inneholder et transgen som er integrert i dets genom). Det burde være klart for en person som er spesialist i faget at utallige kombinasjoner av markører for seleksjon er mulig å benytte. Et eksempel på mulige antibiotika er nevnt ovenfor. Ett antibiotikum som er særdeles fordelaktig er zeocin, fordi zeocinresistensproteinet (zeocin-R) virker ved å binde medikamentet og gjøre det harmløst. Derfor er det enkelt å titrere mengden med medikament som dreper celler med lave nivåer av zeocin-R ekspresjon, mens det tillates at celler med høy ekspresjon overlever. Alle andre proteiner som bibringer antibiotikaresistens i vanlig bruk er enzymer, og således virker de katalytisk (ikke 1:1 i forhold til medikament). Når en totrinns seleksjon er utført, er det derfor fordelaktig å benytte et protein med antibiotikaresistens med denne 1:1 bindingsmodus som virkemekanisme. Følgelig er zeocin som antibiotikum en foretrukket seleksjonsmarkør. Av bekvemmelighetshensyn kan zeocin som antibiotikum kombineres i en totrinns selsksjonsmetode kombineres med f.eks. puromycin, blasticidin eller hygromycin, som eksempelvis kan være til stede i et monocistronisk gen.

Det er også mulig å kombinere et antibiotikum som seleksjonsmarkør med en seleksjonsmarkør som frembringer induksjon av fluorescens eller som skaffer til veie en fargedeponering. Forskjellige promotorer kan også anvendes så lenge som de er funksjonelle i den cellen som blir benyttet.

I visse implementeringer av oppfinnelsen er det fremskaffet en ekspresjonskasett med et (svakt) Internal Ribosome Binding Site (IRES) som et eksempel på et initieringssete for translasjon med en redusert effektivitet hva angår translasjon, f.eks. mellom den åpne leserammen til proteinet av interesse og seleksjonsmarkørens åpne leseramme. Translasjon av proteiner fra IRES-elementer er ofte mindre effektiv enn en cap-avhengig translasjon: mengden av protein fra IRES-avhengige åpne leserammer (ORFs) strekker seg fra mindre enn 20 % til 50 % av mengden fra første ORF (Mizuguchi et al., 2000). Videre kan mutasjoner av IRES-elementer svekke deres aktivitet, og senke ekspresjonen fra IRES-avhengige ORFs til under 10 % av første ORF (Lopez de Quinto & Martinez-Salas, 1998, Rees et al., 1996). Når den IRES-avhengige ORF koder for en selektabelt markørprotein, betyr dets lave relative nivå for translasjon at høye absolutte nivåer for transkripsjon må opptre for at den rekombinante vertscellen kan selekteres ut. Derfor vil selekterte rekombinante vertscelleisolater av ren nødvendighet uttrykke store mengder av det transgene mRNA. Siden det rekombinante proteinet blir translatert fra den capavhengige ORF, kan det produseres i store kvanta, noe som resulterer i store utbytter.

Konvensjonelle systemer for ekspresjon er DNA-molekyler i form av et rekombinant plasmid eller et rekombinant viralt genom. Plasmidet eller det virale genomet blir introdusert inn i (eukaryote verts-) celler og fortrinnsvis integrert inn i deres genomer ved hjelp av metoder som er kjent i fagfeltet. I foretrukne implementeringer, anvender den foreliggende oppfinnelsen også disse typene av DNA-molekyler for å avlevere sitt forbedrede transgene ekspresjonssystem. En foretrukket utgave av oppfinnelsen er bruken av plasmid-DNA for avlevering av ekspresjonssystemet. Et plasmid inneholder et antall komponenter: konvensjonelle komponenter, kjent i fagfeltet, er et origo for replikasjon og en selektabel markør for propagering av plasmide bakterieceller; en selektabel markør som fungerer i eukaryote celler for å identifisere og isolere vertsceller som bærer i seg et integrert transgent ekspresjonssystem; nukleinsyre som koder for et protein av interesse, hvis høynivåtranskripsjon blir frembrakt ved at en promotor som er funksjonell i eukaryote celler (f.eks. den såkalte humane cytomegalovirus ”major immediate early promoter/ enhancer”, pCMV (Boshart et al., 1985); og transkripsjonelle terminatorer (f.eks. SV40 polyadenyleringssetet (Kaufman & Sharp, 1982) for transgenet av interesse og den selektable markøren.

Vektoren som benyttes kan være en hvilken som helst vektor som passer for kloning av DNA og som kan anvendes for transkripsjon av en nukleinsyre av interesse. Når vertsceller blir benyttet, er det å foretrekke at vektoren er en integrerende vektor. Alternativt kan vektoren være en eposomalt replikerende vektor.

Noen ikke-begrensende, skjematiske representasjoner av mulige konfigurasjoner av ekspresjonskasetter er fremskaffet i Fig. 1. Denne viser konfigurasjonen av DNA elementene til ekspresjonskasetten i plasmidet både før og etter integrasjon inn i genomet. Konstrukt A inneholder en ekspresjonsenhet som favner en åpen leseramme som koder for et protein (Gene). Denne befinner seg oppstrøms for det svekkede EMCV IRES (Martinez-Salas et al 1999; Mizuguchi et al 2000; Rees et al 1996), og for den åpne leserammen som koder for det selektable markørproteinet som innebærer zeocinresistens (zeo). Genkasetten har SV40 transkripsjonell terminator i 3’ ende (t). Dette bicistroniske transgenet blir transkribert i store mengder fra CMV-promotoren. Konstrukt B er avledet fra konstrukt A, men STAR67 er nå klonet oppstrøms for CMV-promotoren. Konstrukt C er avledet fra konstrukt B, men nå er to anti-repressorelementer (i dette tilfellet STAR7) klonet inn for å flankere hele kassetten.

Kombinasjon av anti-repressorsekvenser i ekspresjonskassetten

Det fremkommer i teksten at kombinasjonen av et første anti-repressorelement oppstrøms for en promotor og flankerende ekspresjonskassetten med to andre antirepressorsekvenser frembringer uovertrufne resultater. I særdeleshet, når en SV40-promotor blir benyttet i CHO-celler, blir ekspresjonen allerede svært høy i fravær av anti-repressorsekvenser, men den blir betraktelig forøket når STAR67 blir plassert oppstrøms for nevnte promotor, og hele ekspresjonskassetten blir flankert av to anti-repressorelementer, slike som STAR6, STAR7, eller STAR 40.

Det er derfor hensikten med den foreliggende oppfinnelsen å skaffe til veie et rekombinant nukleinsyremolekyl som består av en ekspresjonskassett som omfatter (fra 5’ til 3’): anti-repressorsekvens A - promotor – nukleinsyre som koder for et protein av interesse – anti-repressorsekvens B, karakterisert ved at nevnte ekspresjonskassett videre består av en anti-repressorsekvens C mellom nevnte antirepressorsekvenser A og B. I en foretrukket utgave av oppfinnelsen er nevnte antirepressorsekvens C til stede oppstrøms for nevnte promotor, i en konfigurasjon som beskrevet ovenfor under tittellinjen ”ekspresjonskassett”. Ekspresjonskassetten mellom anti-repressorsekvensene A og B kan videre bestå av elementene som beskrevet ovenfor for ekspresjons-kassetter, f.eks. sekvenser som koder for terminering av transkripsjon, signal for polyadenylering, gen som skal tjene som seleksjonsmarkør, enhancer, etc., og som kan være enten monocistronisk, bicistronisk eller multicistronisk som beskrevet ovenfor.

To eller alle tre av de nevnte anti-repressorsekvensene A, B og C kan være like, eller alle tre kan være forskjellige. Anti-repressorsekvensene A og B kan være de samme eller være forskjellige fra anti-repressorsekvens C. I visse implementeringer er anti-repressorsekvensene A og B (essensielt) identiske med hverandre. I en variant av oppfinnelsen er anti-repressorsekvens C STAR67, eller et funksjonelt fragment av denne. Anti-repressorsekvensene A og B kan være en hvilken som helst anti-repressorsekvens, og i visse varianter av oppfinnelsen omfatter de en av SEQ. ID. NOs. 1-65, eller funksjonelle fragmenter av disse. I visse utgaver innholder ekspresjonskassetten et multicistronisk gen, og i foretrukne varianter av det nevnte foretrukne multicistroniske genet består disse av sekvenser som koder for et protein av interesse og et gen som tjener som en seleksjonsmarkør. Alternativt er seleksjonsmarkøren til stede under kontroll av en separat promotor.

I visse varianter av oppfinnelsen kan en fjerde anti-repressorsekvens D kan være til stede mellom STAR-sekvensene A og B. I en slik utgave av oppfinnelsen er nevnte anti-repressorsekvens D fortrinnsvis posisjonert nedstrøms for nukleinsyren som koder for et protein av interesse. Igjen kan denne anti-repressorsekvensen D være den samme som eller forskjellig fra de andre anti-repressorsekvensene i det rekombinante nukleinsyremolekylet, den kan være en hvilken som helst antirepressorsekvens, og i visse varianter av oppfinnelsen blir den valgt fra en hvilken som helst av SEQ. ID. NOs. 1-66, eller funksjonelle fragmenter av disse.

I det minst noen av anti-repressorsekvensene kan være retningsbestemte (WO 00/004704), kan anti-repressorsekvensene som flankerer ekspresjonskassetten (anti-repressorsekvenser A og B) med fordel bli plassert i motsatt retning med hensyn til hverandre, slik at 3’ enden av hver av disse anti-repressorsekvensene står med ansiktet innover mot ekspresjonskassetten (og mot hverandre). Således vender, i foretrukne implementeringer av den foreliggende oppfinnelsen, 5’ siden av et anti-repressorelement DNA/kromatinet på hvilket innflytelsen på transgenet skal minskes ved hjelp av nevnte anti-repressorelement. For en anti-repressorsekvens oppstrøms for en promotor i en ekspresjons-kassettsekvens vender 3’ enden mot promotoren. Sekvensene til anti-repressorelementene (SEQ. ID. NOs. 1-66) i listen med sekvenser er gitt i 5’ til 3’ retning dersom ikke annet er angitt.

Celler i overensstemmelse med oppfinnelsen

Nukleinsyremolekyler som omfatter STAR-sekvenser og/eller ekspresjonskassetter i overensstemmelse med den foreliggende oppfinnelsen kan anvendes for å forbedre ekspresjonen av nukleinsyrer, fortrinnsvis i vertsceller. Uttrykket "celle"/"vertscelle", respektive "cellelinje"/"vertscellelinje" er typisk definert som en celle og en homogen populasjon av denne som kan vedlikeholdes i cellekultur ved hjelp av metoder som er kjent i fagfeltet, og som oppviser evnen til å uttrykke heterologe eller homologe proteiner. En vertscelle i overensstemmelse med den foreliggende oppfinnelsen er fortrinnsvis en eukaryotisk celle, mer foretrukket en mammalsk celle, slike som en celle fra en gnager eller en human celle eller en fusjon mellom forskjellige celler. I visse ikke-begrensende varianter av oppfinnelsen er nevnte vertscelle en U-2 OS osteosarcoma celle, CHO (Chinese hamster ovary)-celle, HEK 293-celle, HuNS-1 myeloma-celle, WERI-Rb-1 retinoblastoma-celle, BHK-celle, Verocelle, ikke-sekreterende mus myeloma Sp2/0-Ag 14-celle, ikke-sekreterende mus myeloma NS0-celle, NCI-H295R binyrekjertel carcinomacelle eller en PER.C6®-celle.

I visse utgaver av oppfinnelsen er vertscellen en celle som i det minste uttrykker E1A, og fortrinnsvis også E1B fra et adenovirus. Som ikke-begrensende eksempler kan slike celler avledes fra f.eks. humane celler, som eksempelvis fra en nyre (eksempel: HEK 293-celler, se Graham et al, 1977), lunge (eksempel A549, se WO 98/39411) eller retina (eksempel: HER-celler markedsført under varemerket PER.C6®, se US patent 5,994,128), eller fra amniocytter (eksempel: N52.E6, beskrevet i US patent 6,558,948), og lignende fra andre celler. Metoder for å oppnå slike celler er beskrevet f.eks. i US patent 5,994,128 og US patent 6,558,948.

PER.C6® celler som oppfyller hensikten med den foreliggende patent-søknaden betyr celler fra en oppstrøms eller nedstrøms passasje eller nedstammende fra oppstrøms eller nedstrøms passasje av celler som er deponert under ECACC nr.

96022940. Det har tidligere blitt vist at slike celler er i stand til å uttrykke et protein i store kvanta (f.eks. WO 00/63403, og Jones et al, 2003).

Slike vertsceller som uttrykker det ønskede proteinet i overensstemmelse med den foreliggende oppfinnelsen kan oppnås ved å introdusere et nukleinsyremolekyl, fortrinnsvis i form av en ekspresjonskassett i samsvar med oppfinnelsen, inn i cellene. I en alternativ variant blir STAR67-sekvensen utpekt for integrasjon inn i en kromosomal region for å forbedre ekspresjonen av et gen av interesse, som allerede er integrert inn i genomet, f.eks. et naturlig forekommende gen, valgfritt under kontroll av en heterolog promotor som ble utpekt oppstrøms for nevnte gen for å regulere ekspresjonen av nevnte gen. Fortrinnsvis er vertscellen fra en stabil klon som kan være selektert og propagert i samsvar med prosedyrer som er kjent for en ekspert i feltet. En kultur av en slik klon er i stand til å produsere et rekombinant protein av interesse. Celler i overensstemmelse med oppfinnelsen er fortrinnsvis i stand til å vokse i suspensjonskultur i et serumfritt medium.

Et protein av interesse i samsvar med oppfinnelsen kan være et hvilket som helst protein, og det kan være et monomerisk eller et multimerisk protein. Et multimerisk protein består av minst to polypeptidkjeder. Ikke-begrensende eksempler på et protein av interesse i samsvar med oppfinnelsen er enzymer, hormoner, immunoglobulinkjeder, terapeutiske proteiner som anti-cancerproteiner, blodkoagulasjonsproteiner slike som Faktor VIII, multi-funksjonelle proteiner slike som erythropoietin, diagnostiske proteiner, eller proteiner eller fragmenter av disse som er anvendelige eller nyttige for vaksinasjon, hvorav alle er kjent for en person som har dyktiggjort seg innenfor fagfeltet.

I visse utgaver av oppfinnelsen koder ekspresjonskassetten i oppfinnelsen en tung eller lett kjede til et immunoglobulin eller en antigenbindende del, et derivat av og/eller en analog av disse. I en foretrukket utgave av oppfinnelsen er det skaffet til veie en ekspresjonsenhet, hvori nevnte protein av interesse er tung kjede fra et immunoglobulin. I nok en foretrukket variant er det fremskaffet en proteinuttrykkende enhet, hvori nevnte protein av interesse er en lett kjede fra et immunoglobulin. Når disse to proteinuttrykkende enhetene er til stede i samme (verts)celle, vil et multimerisk protein og mer spesifikt et antistoff bli satt sammen. Således er, i visse utgaver av oppfinnelsen, proteinet av interesse et immunoglobulin, slik som et antistoff, som er et multimerisk protein. Fortrinnsvis er et slikt antistoff et humant eller humanisert antistoff. I visse utgaver av disse er de et IgG, IgA, eller IgM antistoff. Et immunoglobulin kan være kodet for av tunge og lette kjeder på forskjellige ekspresjonskassetter, eller på en enkeltstående ekspresjonskassett, hvori genet som koder for hver individuelle kjede kan være under kontroll av en separat promotor i monocistroniske enheter for transkripsjon, eller alternativt, begge kjedene kan være kodet for av et multicistronisk gen.

Proteinet av interesse kan være fra en hvilken som helt kilde, og i visse implementeringer er det et mammalsk protein, et kunstig laget protein (f.eks. et fusjonsprotein eller mutert protein), og fortrinnsvis er det et humant protein.

Åpenbart kan anti-repressorsekvensene og konfigurasjonene til ekspresjonskassettene i den beskrevne oppfinnelsen også bli benyttet når det endelige målet ikke er produksjonen av et protein, men RNA i seg selv, f.eks. for å produsere større mengder av RNA fra en ekspresjonskassett, som kan bli benyttet i den hensikt å regulere andre gener (f.eks. RNAi, antisens-RNA), genterapi, in vitro proteinproduksjon etc.

Metoder for å produsere et protein av interesse

I en variant skaffer oppfinnelsen til veie en metode for å uttrykke en sekvens av interesse, fortrinnsvis en som koder for et protein av interesse, ved å sørge for tilgang til en vertscelle med et nukleinsyremolekyl eller en ekspresjonskassett i henhold til den foreliggende oppfinnelsen, dyrkning av cellen og ekspresjon av sekvensen av interesse.

Termen "ekspresjon" er typisk anvendt for å henvise til produksjon av et særskilt RNA-produkt eller et spesifikt protein i en celle. I tilfellet av RNA-produkter, henspeiler uttrykket på prosessen som innebærer transkripsjon. I tilfellet av et proteinprodukt henspeiler det på prosessene som er relatert til transkripsjon, translasjon og valgfritt post-translasjonell modifikasjon (f.eks. glykosylering, dannelse av disufidbindinger etc.). I tilfellet av sekreterte proteiner henspeiler det på prosesser som omfatter transkripsjon, translasjon og valgfritt post-translasjonell modifikasjon, etterfulgt av sekresjon.

Introduksjon av nukleinsyren som skal uttrykkes i en celle kan bli fullbyrdet ved hjelp av flerfoldige metoder, hvilke som sådan er kjent for en person som har dyktiggjort seg i faget, men som også er avhengige av det formatet som nukleinsyren er introdusert i. Nevnte metoder inkluderer, men er ikke begrenset til transfeksjon, infeksjon, injeksjon, transformasjon og lignende.

Dyrkningen av en celle blir utført for å gjøre det mulig for den å metabolisere og/ eller vokse og/eller dele seg og/eller produsere rekombinante proteiner av interesse. Dette kan oppnås ved hjelp av metoder som er godt kjent for en person som har dyktiggjort seg i faget, og inkluderer, men er ikke begrenset til, næringstilskudd til cellen. Metodene omfatter vekst i adherent tilstand til en flate, vekst i suspensjon, eller i kombinasjoner av disse vekstformene. Dyrkning kan f.eks. bli utført i skåler, spinnerflasker eller i bioreaktorer ved å benytte porsjonsvise, mating av porsjonsvise, kontinuerlige, eller perfunderte systemer, og lignende. I den hensikt å oppnå produksjon (kontinuerlig) i stor skala av rekombinante proteiner via cellekulturer, er det foretrukket innenfor fagfeltet å benytte celler som er i stand til å kunne dyrkes i suspensjon, og det er foretrukket å bruke celler som kan dyrkes i fravær av dyre- eller menneske-avledet serum eller dyre- eller menneske-avledete komponenter.

Betingelsene for voksende eller multipliserende celler (se f.eks. Tissue Culture, Academic Press, Kruse and Paterson, editors (1973)) og betingelsene for ekspresjon av det rekombinante produktet er kjent for en person som er ekspert i faget. Generelt er det slik at prinsipper, protokoller og praktiske teknikker for å maksimere produktiviteten til kulturer inneholdende mammalske celler kan letes frem i Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach (M. Butler, ed., IRL Press, 1991).

I en foretrukket implementering av oppfinnelsen blir det uttrykte proteinet samlet opp (isolert), enten fra cellene eller fra kultiveringsmediet eller begge. Det kan deretter bli videre renset opp ved avbenyttelse av kjente metoder, som f.eks. filtrering, kolonne-kromatografisk separasjon, etc., dvs. via metoder som generelt er kjent for en person utdannet i faget.

Nye seleksjonsmetoder

Den foreliggende oppfinnelsen bringer for dagen en ny metode for generering av vertsceller som uttrykker to polypeptider av interesse, hvor metoden gir et overraskende godt resultat i det at nesten ingen eller absolutt ingen kolonier fremstår når det ikke benyttes en anti-repressorsekvens, mens tilstedeværelsen av antirepressorsekvens leder til kloner som overlever seleksjonen, og disse klonene generelt uttrykker de to polypeptidene av interesse i store kvanta (eksempel 7, Fig. 11). Oppfinnelsen skaffer derfor til veie en metode for å generere en vertscelle som uttrykker to polypeptider av interesse, hvori metoden omfatter: a) introduksjon inn i en vertscelle ett eller flere nukleinsyremolekyler, der nukleinsyremolekylet eller -molekylene sammen omfatter: (i) en promotor som er funksjonelt knyttet til en sekvens som koder for et første polypeptid av interesse og et første selektabelt markørgen, og (ii) en promotor som er funksjonelt koblet til en sekvens som koder for et andre polypeptid av interesse og en andre selektable markør, og iii) minst en anti-repressorsekvens, valgt fra gruppen som består av (a) en hvilken som helst av SEQ. ID. NO. 1-66, (b) fragmenter av en hvilken som helst av SEQ. ID. NOs. 1-66, der nevnte fragmenter oppviser anti-repressoraktivitet, (c) sekvenser som er minst 70 % identiske med (a) eller (b) og som oppviser anti-repressoraktivitet, og (d) komplementet til en hvilken som helst av (a)-(c); b) seleksjon av en vertscelle ved essensielt simultant å selektere for ekspresjon av nevnte første og andre selektable markørgener. Den selekterte vertscellen kan bekvemmelighetvis anvendes for å uttrykke nevnte to polypeptider, ved å dyrke nevnte selekterte vertsceller. I en variant av oppfinnelsen blir to nukleinsyremolekyler, det ene inneholdende (i) og det andre inneholdende (ii), benyttet til introduksjon inn i vertscellen. I denne varianten av oppfinnelsen inneholder fortrinnsvis hvert nukleinsyremolekyl minst en av de nevnte anti-repressorsekvensene. I en annen variant inneholder et enkeltstående nukleinsyremolekyl der både (i) og (ii) blir benyttet, hvori førstnevnte kommer til å inneholde minst en av de nevnte anti-repressorsekvensene. En fordel ved å ha en kodende sekvens for begge polypeptider på et enkeltstående nukleinsyremolekyl er at bare en preparering av nukleinsyrer er påkrevd før nukleinsyren blir introdusert inn i cellene. Videre er i en slik utgave av oppfinnelsen en enkeltstående integrasjon tilstrekkelig for de kodende sekvensene til begge polypeptidene, for derved å eliminere muligheten for at nukleinsyren som koder for det første polypeptidet blir integrert på et annet sted eller med et forskjellig kopiantall enn den som koder for det andre polypeptidet. I foretrukne implementeringer av oppfinnelsen kan de nevnte to polypeptidene danne en del av et multimerisk protein, slik som et immunoglobulin. Metoden er derfor i særdeleshet egnet for ekspresjon av antistoffer. De to promotorene kan være like eller forskjellige, og kan være en hvilken som helst av promotorene som er beskrevet ovenfor. Når varianten der et enkeltstående nukleinsyremolekyl inneholder både (i) og (ii) blir benyttet, kan retningen på de to transkripsjonelle enhetene på det enkeltstående nukleinsyremolekylet f.eks. være den samme, eller motsatt og vendt mot hverandre, eller i motsatt retning hvor hvert av dem peker utover. I det sistnevnte tilfellet kan anti-repressorsekvensen bli plassert mellom de to promotorene (f.eks. se) Fig. 11B). En anvendelig antirepressorsekvens for dette aspektet av den foreliggende oppfinnelsen er SEQ. ID. NO. 66 (se eksempel 7), men de andre anti-repressorsekvensene kan fungere like godt. Dette kan med enkelthet testes av en person som har dyktiggjort seg i faget, ved å benytte den åpne redegjørelsen som angitt i teksten, og således er også avbenyttelsen av andre anti-repressorsekvenser i samsvar med herværende aspekt av oppfinnelsen favnet av definisjonsområdet for oppfinnelsen. Videre kan antirepressorsekvensene adderes for å flankere en eller begge de transkripsjonelle enhetene. Markørgenene må hver især være forskjellige, og kan f.eks. bli selektert fra markørgenene som er beskrevet ovenfor. I visse implementeringer av oppfinnelsen er en selektabel markør zeocin, og den andre selektable markøren er f.eks. puromycin. Imidlertid burde det være klart at andre kombinasjoner kan komme til anvendelse, og at de befinner seg innenfor definisjonsområdet for dette aspektet av oppfinnelsen. Ekspresjon av markørene skulle fortrinnsvis være avhengig av ekspresjonen av polypeptidet av interesse. Dette kan fastslås ved å knytte ekspresjonen av markørgenene til tilsvarende for polypeptidene av interesse ved f.eks. å benytte seg av multicistroniske gener, f.eks. med IRES-sekvenser, som diskutert ovenfor. “Essensielt samtidig” seleksjon betyr at minst i løpet av en del av tiden, fortrinnsvis minst en dag, mer foretrukket to dager og enda mer foretrukket minst 5 dager, vil begge seleksjonsagensene være til stede, noe som sørges for ved at begge seleksjonsagensene tilsettes til kulturmediet samtidig eller ved at man tilsetter et kulturmedium som inneholder begge seleksjonsagensene (se eksempel 7). Det burde være innlysende at å sette til det andre seleksjonsagenset til mediet etter bare noen få timer eller dager, hvori det første seleksjonsagenset allerede er til stede, vil resultere i en essensielt samtidig seleksjon innenfor betydningen av den foreliggende oppfinnelsen. Denne situasjonen er atskilt fra situasjonen hvor cellene først blir selektert med det første selekterende agenset, og med en gang kolonier er blitt dannet blir cellene overført til et nytt medium hvori det andre selekterende agenset er blitt tilsatt (etterfølgende seleksjon, se eksempel 5 og WO 03/106684). Ved å selektere for begge selektable markører essensielt samtidig, er det blitt avdekket, noe overraskende, at en hurtig og sterk seleksjon har fremstått, hvorved lav-produserende kloner er blitt eliminert, noe som har resultert i en sterkt forenklet arbeidsmengde hva angår det å finne en klon med ønsket ekspresjonskarakteristika. Dette er særskilt fordelaktig for den bioteknologiske industrien, hvor mange, vanligvis flere hundre eller til og med flere tusen kolonier må screenes før en ønsket klon som oppviser høy ekspresjon kan bli identifisert.

I tillegg skaffer systemet til veie muligheten for å teste deler av anti-repressorelementer for funksjonalitet, i det minste for STAR67, men også for andre antirepressorsekvenser når de fungerer under disse betingelsene. Denne enkle screeningen, som sørger for en nesten eller til og med komplett “svart og hvit” forskjell i mange tilfeller, vil derfor bidra til å identifisere funksjonelle deler eller derivater av anti-repressorsekvenser, og/eller hjelpe til med å karakterisere nye anti-repressorsekvenser. Denne screeningen kan til og med bli benyttet for å finne nye antirepressor- og/eller ekspresjons-økende sekvenser (siden denne typen av screening egentlig ikke innebærer selektering for anti-repressoraktivitet, men i bunn og grunn for ekspresjons-økende aktivitet, er det også mulig at sekvenser som oppviser sistnevnte egenskap, men ikke førstnevnte, vil bli funnet). Det er derfor et annet aspekt ved den foreliggende oppfinnelsen å fremskaffe en metode for å kunne identifisere anti-repressor- og/eller ekspresjons-økende sekvenser, eller et funksjonelt fragment eller derivat av disse, som omfatter: a) å introdusere inn i en vertscelle ett eller flere nukleinsyremolekyler, hvor nukleinsyremolekylet eller molekylene sammen utgjør: (i) en promotor funksjonelt koblet til et første selektabelt markørgen, og (ii) en promotor funksjonelt knyttet til et andre selektabelt markørgen, og (iii) minst en sekvens som skal testes for anti-repressor- og/eller ekspresjonsøkende aktivitet; b) å selektere en vertscelle ved å selektere essensielt simultant for ekspresjon av nevnte første og andre selektable markørgener. Vertscellen som overlever denne screeningen inneholder sannsynligvis et funksjonelt anti-repressorog/eller ekspresjons-økende element. Dette kan deretter enkelt analyseres videre, f.eks. ved å bestemme dets sekvens og/eller ved å underkaste det videre funksjonelle tester for anti-repressoraktivitet som beskrevet ovenfor. I en utgave av den foreliggende oppfinnelsen befinner både (i) og (ii) seg på ett nukleinsyremolekyl, f.eks. med divergerende promotorer (det første og andre selektable markørgenet vender utover), mellom hvilke sekvensen som skal testes kan klones for videre analyse. Fortrinnsvis blir nevnte selektable markørgener ikke uttrykt i store kvanta, f.eks. ved å benytte relativt svake promotorer som driver de selektable markørgenene, der relativt svake promotorer er kjent for og/eller kan identifiseres ved hjelp av rutineanalyser av en person som har dyktiggjort seg i faget, eller f.eks. ved å benytte en sterk promotor for transkripsjon og en IRES, fortrinnsvis en relativt svak IRES, som beskrevet ovenfor, for translasjon av markørgenet. Markørgenene kan også av bekvemmelighetshensyn bli plassert nedstrøms for nukleinsyresekvensene som koder for et polypeptid og knyttes til ekspresjonen av dette i et multicistronisk gen, f.eks. ved hjelp av en IRES (se eksempel 7, Fig. 11 for mulig konfigurasjon). Slike polypeptider kan igjen være polypeptider av interesse, slik at direkte nyttige kloner for ekspresjon av nevnte polypeptider av interesse kan oppnås, imidlertid kan de i den hensikt å screene også være markører hvis ekspresjon lett kan kvantifiseres, f.eks. GFP eller et derivat av denne, SEAP, lacZ, luciferase, etc. I en slik kombinasjon kan ekspresjonen av polypeptidene bli direkte kvantifisert for å plukke opp anti-repressor- og/eller ekspresjonsøkende elementer eller fragmenter av disse som frembringer tilstrekkelig antall av kolonier under den simultane seleksjonen, og som også skaffer til veie høye nivåer av transkripsjon. Når en ”tilfeldig” nukleinsyre (dvs. en nukleinsyre som ennå ikke er kjent hva angår dennes eventuelle antirepressor eller ekspresjonsfremmende aktivitet), f.eks. i form av genomfragmenter, blir benyttet som den sekvensen som skal testes for anti-repressor- og/eller ekspresjonsøkende aktivitet, kan ny anti-repressor- og/eller ekspresjonsfremmende sekvenser bli oppdaget/funnet. Når kjente anti-repressorsekvenser blir testet, kan denne analysen anvendes til å karakterisere dem videre. Når fragmenter av kjente anti-repressorsekvenser blir testet, vil analysen skaffe til veie funksjonelle fragmenter av slike kjente anti-repressorsekvenser.

I forbindelse med praktiseringen av den foreliggende oppfinnelsen vil man anvende, dersom ikke annet er angitt, konvensjonelle teknikker innen immunologi, molekylærbiologi, mikrobiologi, cellebiologi, og rekombinant DNA, som alle befinner seg innenfor ferdighetsområdet til en som er utdannet i faget. Se f.eks. Sambrook, Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, 1989; Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel FM, et al, eds, 1987; seriene Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); PCR2: A Practical Approach, MacPherson MJ, Hams BD, Taylor GR, eds, 1995; Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane, eds, 1988.

Oppfinnelsen er videre forklart i de følgende eksemplene. Eksemplene tjener utelukkende for å klargjøre oppfinnelsen.

Eksempler

Eksempel 1: Konstruksjon av STAR67-vektorer

En ny anti-repressorsekvens ble isolert ved hjelp en genetisk screening som beskrevet i WO 03/004704, og denne nye sekvensen ble gitt navnet STAR67 (SEQ. ID. NO. 66). Effekten av STAR67 på ekspresjon av transgener i mammalske cellelinjer ble testet. Her beskriver vi konstruksjonen av forskjellige konstrukter.

Materialer og Metoder

Tre plasmider ble konstruert (Fig. 1):

A) CMV-d2EGFP-ires-Zeo (CMV Kontroll),

B) STAR67-CMV-d2EGFP-ires-Zeo (CMV-STAR67),

C) STAR7-STAR67-CMV-d2EGFP-ires-Zeo-STAR7 (CMV-STAR67 7/7)

Dannelsen av konstrukt A er beskrevet nedenfor. Plasmid pd2EGFP (Clontech 6010-1) ble modifisert ved å sette inn en linker i BsiWI setet for å oppnå pd2EGFP-link. Linkeren, som ble dannet ved å la binde oligonukleotidene GTACGGATAT-CAGATCTTTAATTAAG (SEQ. ID. NO. 67) og GTACCTTAATTAAAGATCTGATAT (SEQ. ID. NO. 68), introduserte setene for PacI, BglII, og EcoRV restriksjonsendonukleasene. Disse utgjorde det multiple kloningssetet MCSII for innsetting av STAR-elementene. Deretter ble primerne gATCAgATCTggCgCgC-CATTTAAATCgTCTCgCgCgTTTCggTgATgACgg (SEQ. ID. NO. 69) og (AggCggATCCgAATgTATTTAgAAAAATAAACAAATAgggg (SEQ. ID. NO. 70) anvendt for å amplifisere en region på 0.37 kb fra pd2EGFP, som så ble satt inn i BglII setet til pIRES (Clontech 6028-1) for å oppnå pIRES-stuf. Dette introduserte setene for AscI og SwaI restriksjons-endonukleasene ved MCSI, og agerer som et “stuffer fragment” for å unngå potensiell interferens mellom STAR-elementer og tilstøtende promotorer. pIRES-stuf ble fordøyd med BglII og FspI for å frigi et DNA-fragment sammensatt av stufferfragmentet, CMV-promotoren, IRES-elementet (flankert av de multiple kloningssetene MCS A og MCS B), samt SV40 polyadenylerings-signalet. Dette fragmentet ble så ligert med vektor-ryggraden til pd2EGFP-link produsert via fordøyelse med BamHI og StuI, som ga pIRES-link.

Den åpne leserammen til genet som bibringer zeocin-resistens, ble satt inn i Bam-HI/NotI setet nedstrøms for pIRES på følgende måte: zeocin-resistensen ORF ble amplifisert ved hjelp av PCR med primerne gATCggATCCTTCgAAATggCCAAgTTgAC-CAgTgC (SEQ. ID. NO. 71) og AGGCGCGGCCGCAATTCTCAGTCCTGCTCCTC (SEQ. ID. NO. 72) fra plasmidet pCMV/zeo (Invitrogen, kat.no. V50120), fordøyd med BamHI og NotI, og ligert med BamHI/NotI-fordøyd pIRES-link som ga pIRES-linkzeo. d2EGFP-reporteren ORF ble introdusert inn i pIRES-link-zeo ved hjelp av amplifikasjon av pd2EGFP (Clontech 6010-1) med primerne gATCgAATTCTCgCgAAT-ggTgAgCAAgCAgATCCTgAAg (SEQ. ID NO. 73) og AggCgAATTCAccggTgTTTAAACT-TACACCCACTCgTgCAggCTgCCCAgg (SEQ. ID. NO. 74), og innsetting av den EcoRI-fordøyde d2EGFP-kasetten inn i EcoRI-setet i pIRES-link-zeo plasmidet. Dette skapte konstrukt A, CMV-d2EGFP-IRES-Zeo (CMV Kontroll).

STAR67 ble klonet oppstrøms for CMV-promotoren, i AscI-setet (omtrent 15 nt gjensto mellom STAR67 og promotoren). Dette skapte konstrukt B, STAR67-CMV-d2EGFP-ires-Zeo (CMV-STAR67).

STAR67 ble også testet i omgivelser beskrevet av en kassett som også inneholder STAR7 (SEQ. ID. NO. 7), klonet direksjonelt inn i 5’ SalI- og XbaI-setene og 3’ BglII og PacI-setene for å flankere hele kasetten med STAR7. Dette er konstrukt C (CMV-STAR67 7/7).

Eksempel 2: STAR67 øker ekspresjonsnivået fra CMV, EF1α og UB6-promotorene i stabilt transfekterte CHO-celler

Vi testet hvorvidt tilstedeværelsen av STAR67 direkte ved siden av CMV-, EF1 α- og UB6-promotorene influerer på ekspresjonsnivået av disse promotorene i CHO-celler. Konstruktene A og B (Fig. 1) beskrevet i Eksempel 1 er benyttet i denne anledningen, modifisert for de respektive promotorene:

1 CMV-d2EGFP-ires-Zeo (CMV Kontroll)

2 STAR67-CMV-d2EGFP-ires-Zeo (CMV-STAR67)

3 EF1 α-d2EGFP-ires-Zeo (EF1 α Kontroll)

4 STAR67-EF1 α-d2EGFP-ires-Zeo (EF1 α-STAR67)

5 UB6-d2EGFP-ires-Zeo (UB6 Kontroll)

6 STAR67-UB6-d2EGFP-ires-Zeo (UB6-STAR67).

Materialer og Metoder

UB6- og EF1 α-promotorene ble innsatt i stedet for CMV-promotorene i plasmidene som er beskrevet i Fig. 1. UB6-promotoren ble klonet som følger: En DNA 0.37 kb stuffer fra pd2EGFP-plasmidet ble amplifisert ved hjelp av PCR, som beskrevet i eksempel 1, ved å benytte primere identifisert som SEQ. ID. NOs. 69 og 70. Den resulterende DNA-stuffer ble klonet inn i BglII-setet til pUB6/V5-His [Invitrogen V250-20], noe som skapte pUB6-stuf. Fra pUB6-stuf ble et AscI-SacI-fragment klonet inn i CMV-d2EGFP-IRES-Zeo, fra hvilket CMV-promotoren ble fjernet.

EF1 α-promotoren ble amplifisert ved hjelp av PCR med pEF1 α/V5-His [Invitrogen V920-20] som templat, ved å benytte primerne GATCGGCGCGC-CATTTAAATCCGAAAAGTGCCACCTGACG (SEQ. ID. NO. 79) og

AGGCGGGACCCCCTCACGACACCTGAAATGGAAG (SEQ. ID. NO. 80). PCR-fragmentet ble klonet inn i AscI- og PpuMI-setene til CMV-d2EGFP-IRES-Zeo, fra hvilken CMV-promotoren ble fjernet.

Chinese Hamster Ovary cellelinjen CHO-K1 (ATCC CCL-61) ble dyrket i HAMS-F12 medium 10 % føtalt kalveserum inneholdende 2 mM glutamin, 100 U/ml penicillin, and 100 mikrogram/ml streptomycin ved 37°C/5% CO2. Celler ble transfektert med plasmidene ved å avbenytte SuperFect (QIAGEN) som beskrevet av fabrikanten. Kort beskrevet ble celler sådd ut i vekstbeholdere og latt gro over natten til 70-90 % konfluens. SuperFect-reagens ble kombinert med plasmid-DNA i en ratio på 6 mikroliter per mikrogram (f.eks. for en 10 cm Petriskål, 20 mikrogram DNA og 120 mikroliter SuperFect) og tilsatt til cellene. Etter inkubasjon over natten ble transfeksjonsblandingen erstattet med friskt medium, og de transfekterte cellene ble inkubert videre. Etter dyrkning over natten ble cellene trypsinert og sådd ut i nye vekstbeholdere med friskt medium. Etter en ny inkubasjon over natten ble zeocin tilsatt i en konsentrasjon på 50 μg/ml og cellene ble dyrket videre. Etter nye tre dager ble mediet erstattet med friskt medium som inneholdt zeocin (100 μg/ml) og deretter dyrket videre. Da individuelle kloner ble synlige (omtrent ti dager etter transfeksjon), ble mediet fjernet og erstattet med friskt medium uten zeocin. Individuelle kloner ble deretter isolert og overført til 24-brønners plater i medium uten zeocin. En dag etter isolering av koloniene ble zeocin tilsatt til mediet. Ekspresjon av d2EGFP reportergenet ble vurdert omtrent 3 uker etter transfeksjon. Ekspresjonsnivåene av d2EGFP i koloniene ble målt etter en periode på to uker. Etter de første to ukene etter transfeksjonen da de første d2EGFP-målingene ble utført, ble koloniene dyrket i medium uten zeocin eller andre antibiotika. Dette fortsatte gjennom hele den gjenstående delen av eksperimentet.

Resultater

Fig. 2 viser at transfeksjon av konstruktet som inneholder STAR67 klonet oppstrøms for CMV-promotoren resulterte i et antall av CHO-kolonier som uttrykker høyere nivåer av d2EGFP-protein, i forhold til den ”tomme” kontrollen uten STAR67; CMV Kontroll. Gjennomsnittet av d2EGFP-signalet i de 10 koloniene som ble transfektert med CMV Kontroll-plasmid var 34, når man målte 25 dager etter transfeksjon. 60 dager etter transfeksjon var det gjennomsnittlige d2EGFP-signalet i disse 10 koloniene redusert til 13, noe som indikerer at ekspresjonen ikke er stabil over tid. Til sammenligning var det gjennomsnittlige d2EGFP-signalet i de 10 koloniene som ble transfektert med STAR67-CMV-plasmidet 42 da man målte etter 25 dager og 32 ved måling 60 dager etter transfeksjon. Således bibrakte et STAR67-inneholdende CMV-konstrukt, 60 dager etter transfeksjon, en faktor på 2,5 høyere hva gjelder CMV-promotordrevet ekspresjonsnivå av reporterproteinet i stabilt transfekterte kloner. Av større viktighet ble, 25 dager etter transfeksjon, etter den første målingen, seleksjonspresset fjernet ved å dyrke klonene i et medium uten zeocin. På denne måten er koloniene som inneholder STAR67-konstruktet mer stabilt over tid i fravær av seleksjonstrykk enn kolonier som ikke inneholder STAR67-konstruktet.

Fig. 3 viser at transfeksjon av konstruktet som inneholder STAR67 klonet oppstrøms for EF1 α- promotoren resulterte i et antall CHO-kolonier som uttrykker signifikant høyere nivåer av d2EGFP-protein, i forhold til den “tomme” kontrollen uten STAR67; EF1 α Kontroll. Gjennomsnittet av d2EGFP-signalet i de 10 koloniene som ble transfektert med EF1 α Kontroll-plasmidet var 31, da man målte 25 dager etter transfeksjon. 60 dager etter transfeksjon var gjennomsnittet for d2EGFP-signalet i disse 10 koloniene 26. Til sammenligning var gjennomsnittet av d2EGFP-signalet i de 10 koloniene som ble transfektert med EF1 α-STAR67-plasmidet 60 da man målte 25 dager etter transfeksjon og 76 ved måling 60 dager etter transfeksjon. Således frembrakte, både 25 og 60 dager etter transfeksjon, et STAR67-inneholdende EF1 α-konstrukt en faktor 2,9 ganger høyere hva gjelder EF1 α promotordrevet ekspresjonsnivå av reporterproteinet i stabilt transfekterte kloner.

Fig. 4 viser at transfeksjon av et konstrukt som inneholder STAR67 klonet oppstrøms for UB6-promotoren resulterte i et antall av CHO-kolonier som uttrykker signifikant høyere nivåer av d2EGFP-protein, sett i forhold til den ”tomme” kontrollen uten STAR67, UB6 Kontroll. Gjennomsnittet av d2EGFP-signalet i de 10 koloniene som ble transfektert med UB6 Kontroll-plasmidet var, ved måling 25 dager etter transfeksjon. 60 dager etter transfeksjon var det gjennomsnittlige d2EGFP-signalet i disse 10 klonene 29, noe som indikerer at ekspresjonen ikke var stabil over tid. Til sammenligning var gjennomsnittet av d2EGFP-signalet i de 10 koloniene transfektert med UB6-STAR67-plasmidet 218 da man målte 25 dager og 224 ved måling 60 dager etter transfeksjon. På denne måten bidro, 25 dager etter transfeksjon, et STAR67-innholdende UB6-konstrukt med en faktor på 4,3 hva gjelder økning i UB6-promotor-drevet ekspresjon av reporterproteinet i stabilt transfekterte kloner. Etter 60 dager var denne faktoren 7,7, noe som ble tilskrevet labiliteten i ekspresjonen til kontrollkolonier og stabiliteten til UB6-STAR67-koloniene. Viktig å merke seg er at, 25 dager etter transfeksjon og første måling, ble seleksjonspresset fjernet ved å dyrke koloniene i medium uten zeocin. Således er kolonier som inneholder STAR67-konstruktet mer stabilt over tid i fravær av seleksjonstrykk enn kolonier som ikke inneholder et STAR67-konstrukt.

Som konklusjon hevdes det at STAR67 øker ekspresjonen fra tre forskjellige, ikkerelaterte promotorer.

Eksempel 3: STAR67 øker ekspresjonsnivået fra CMV-, EF1α- og UB6-promotorene i stabilt transfekterte celler PER.C6-celler

Vi testet hvorvidt tilstedeværelsen av STAR67 umiddelbart ved siden av CMV-, EF1 α- og UB6-promotorene influerer ekspresjonsnivået av disse promotorene i en annen celletype enn CHO-celler, nemlig humane PER.C6-celler. De samme konstruktene som i eksempel 1 ble benyttet.

Materialer og Metoder

Transfeksjon, dyrking og analyse av PER.C6-celler

PER.C6®-celler ble dyrket i DMEM-medium pyridoxin 9% føtalt kalveserum (ikke varme-inaktivert), 8,9 mM MgCl2100 U/ml penicillin, og 100 mikrogram/ml streptomycin ved 37 ºC/10 % CO2. Cellene ble transfektert med plasmidet ved å benytte Lipofectamine 2000 (Invitrogen) som beskrevet av tilvirkeren. Kort beskrevet ble celler sådd ut i 6-brønners plater og latt vokse over natten til 70-90 % konfluens. Lipofectamine-reagenset ble kombinert med plasmid-DNA i en ratio på 15 mikroliter per 3 mikrogram (eksempelvis for en 10 cm Petriskål, 20 mikrogram DNA og 120 mikroliter Lipofectamine) og tilsatt til cellene etter 30 minutters inkubasjon ved 250C. Etter en 6-timers inkubasjon ble blandingen erstattet med friskt medium, og de transfekterte cellene ble inkubert videre. Etter dyrkning over natt ble så cellene trypsinert og sådd ut (i 1:15, 1:30, 1:60, 1:120 fortynninger) i nye Petriskåler (90 mm) med friskt medium inneholdende zeocin tilsatt i en konsentrasjon på 100 μg/ml og cellene dyrket videre. Da kolonier ble synlige ble de individuelle klonene isolert ved hjelp av skraping og overført til 24-brønners plater i medium inneholdende zeocin. Etter å ha vokst til ~70 % konfluens ble cellene overført til 6-brønners plater. Stabile kolonier ble ekspandert over en periode på 2 uker i 6-brønners plater før d2EGFP-signalet ble bestemt med et XL-MCL Beckman Coulter ”flow”-cytometer. Det gjennomsnittlige d2EGFP-signalet ble akseptert som et mål for nivået av d2EGFP-ekspresjon. Kolonier ble målt en andre gang etter 2 uker. Deretter ble koloniene videre dyrket i fravær av zeocin.

Resultater

Fig. 5 viser at transfeksjon av konstruktet som inneholder STAR67 klonet oppstrøms for CMV-promotoren resulterer i et antall av PER.C6-kolonier som uttrykker signifikant høyere nivåer av d2EGFP-protein i forhold til den ”tomme” kontrollen som ikke inneholder STAR67, CMV Kontroll. Gjennomsnittet av d2EGFP-signalet i de 10 koloniene transfektert med CMV Kontroll-plasmidet var 37 da man målte 30 dager etter transfeksjon. 60 dager etter transfeksjon hadde gjennomsnittet av d2EGFP-signalet i disse 10 koloniene blitt redusert til 14, noe som indikerte at ekspresjonen ikke var stabil over tid. Til sammenligning var gjennomsnittet av d2EGFP-signalet i de 10 koloniene transfektert med STAR67-CMV-plasmidet 101 da man målte 30 dager og 45 da man målte 60 dager etter transfeksjon. Således bidro, 60 dager etter transfeksjon, et STAR67-inneholdende CMV konstrukt med en faktor på 3,2 i økning av CMV-promotordrevet ekspresjon av reporterproteinet i stabilt transfekterte kloner.

Fig. 6 viser at transfeksjon av konstruktet som inneholder STAR67 klonet oppstrøms for EF1 α-promotoren resulterer i et antall PER.C6-kolonier som uttrykker signifikant høyere nivåer av d2EGFP-protein, sammenlignet med den “tomme” kontrollen uten STAR67, EF1 α Kontroll. Det gjennomsnittlige d2EGFP-signalet i de 10 koloniene som ble transfektert med EF1 α Kontroll-plasmidet var 5, da man målte 30 dager etter transfeksjonen. 60 dager etter transfeksjonen var det gjennomsnittlige d2EGFP-signalet i disse 10 koloniene 6. Til sammenligning var det gjennomsnittlige d2EGFP-signalet i de 10 koloniene transfektert med EF1 α-STAR67-plasmidet 25 da man målte 30 dager etter og 20 da man målte 60 dager etter transfeksjon. Således bidro, både 30 og 60 dager etter transfeksjon, et STAR67-inneholdende EF1 α-konstrukt med en faktor på 4 i form av høyere EF1 α promotordrevet ekspresjonsnivå av reporterproteinet i stabilt transfekterte kloner.

Fig. 7 viser at transfeksjon av et konstrukt som inneholder STAR67 klonet oppstrøms for UB6-promotoren resulterer i et antall av PER.C6-kolonier som uttrykker et signifikant høyere nivå av d2EGFP-protein sammenlignet med den ”tomme” kontrollen uten STAR67, UB6 Kontroll. Gjennomsnittet av d2EGFP-signalet i de 10 koloniene som ble transfektert med UB6 Kontroll-plasmid var 4 da man målte 30 dager etter transfeksjon. 60 dager etter transfeksjon var gjennomsnittet av d2EGFP-signalet i disse 10 koloniene 2. Til sammenligning var det gjennomsnittlige d2EGFP-signalet i de 10 koloniene transfektert med UB6-STAR67-plasmidet 27 da man målte 30 dager og 18 da man målte 60 dager etter transfeksjon. Således bidro, både 30 og 60 dager etter transfeksjon, et STAR67-inneholdende UB6-konstrukt med en faktor på 7 til 9 ganger høyere verdi for et UB6-promotor-drevet ekspresjonsnivå av reporterproteinet i stabilt transfekterte kloner.

På denne måten resulterte plasseringen av STAR67 oppstrøms for promotoren i en signifikant høyere ekspresjon av proteinnivåene sammenlignet med STAR67-manglende konstrukter også i PER.C6-celler. Således fungerer STAR67 i forskjellige, ikke-relaterte celletyper.

Eksempel 4: Nye konfigurasjoner av STAR67 kombinert med andre antirepressorelementer for å øke aktiviteten av SV40-promotoren i CHO-celler

Vi testet hvorvidt tilstedeværelsen av STAR67 i umiddelbar tilknytning til SV40-promotoren influerer på nivået av ekspresjon for denne promotoren, enten alene eller i kombinasjon med et annet anti-repressorelement, i dette tilfellet STAR7. Konstruktene som ble benyttet i denne sammenhengen (se Fig. 8), er:

1 SV40-d2EGFP-ires-Zeo (SV40 Kontroll)

2 STAR67-SV40-d2EGFP-ires-Zeo (SV40-STAR67)

3 STAR7-SV40-d2EGFP-ires-Zeo-STAR7 (SV40-STAR7/7)

4 STAR7-STAR67-SV40-d2EGFP-ires-Zeo-STAR7 (SV40-STAR67 7/7)

Materialer og Metoder

SV40-promotoren ble amplifisert ved hjelp av PCR med pIRES som templat ved å benytte primerne TTGGTTGGGGCGCGCCGCAGCACCATGGCCTGAAATAAC-CTCTGAAAGAGG (SEQ. ID. NO. 81) og TTGGTTGGGAGCT-CAAGCTTTTTGCAAAAGCCTAGGCCTCCAAAAAAGCCTCCTC (SEQ. ID. NO. 82). PCR-fragmentet ble klonet inn i AscI- og SacI-setene til CMV-d2EGFP-IRES-Zeo, fra hvilket CMV-promotoren ble fjernet.

CHO-cellerne ble transfektert, koloniene isolert og propagert og analysert som i eksempel 2.

Resultater

Fig. 8 viser at transfeksjon av konstruktet som enten inneholder STAR67 klonet oppstrøms for SV40-promotoren (SV40-STAR67) eller STAR7 klonet til å flankere hele konstruktet (SV40-STAR 7/7) ikke resulterte i CHO-kolonier som uttrykker signifikant høyere nivåer av d2EGFP-protein, sammenlignet med den ”tomme” kontrollen uten anti-repressorelementer (SV40 Kontroll). Gjennomsnittet av d2EGFP-signalet i de 18 koloniene som ble transfektert med SV40 Kontroll-plasmidet var 86 da man målte 40 dager etter transfeksjon. Til sammenligning var det gjennomsnittlige d2EGFP-signalet i de 18 koloniene transfektert med SV40-STAR67-plasmidet 82 da man målte etter 40 dager og det gjennomsnittlige d2EGFP-signalet i de 18 koloniene transfektert med SV40-STAR 7/7-plasmidet var 91 etter 40 dager. På denne måten kunne man ikke observere noen signifikant effekt av disse anti-repressorelementene på SV40-promotoren i CHO-celler.

Det synes som om at ekspresjonsnivåene man får fra SV40-promotoren i disse cellene allerede er ganske høy, og mye høyere enn dem man kan observere relatert til CMV-promotoren, som ble ansett for å være en meget sterk promotor. Denne høye bakgrunns-ekspresjonen i fravær av et anti-repressorelement ved bruk av SV40-promotoren i CHO-celler, kan forklare hvorfor man ikke kunne observere noen signifikant effekt av STAR67 alene, eller av STAR7 som flankerte transgenet.

Imidlertid var den gjennomsnittlige verdien av d2EGFP-signalet i de 18 koloniene transfektert med SV40-STAR67 7/7-plasmidet 209 da man målte etter 40 dager, som er en faktor som innebærer en 2,4 ganger så høy gjennomsnittsverdi sammenlignet med kontrollkoloniene (middelverdi 86). Således resulterer dette, når STAR67 elementer blir benyttet i kombinasjon med et annet anti-repressorelement, i et antall av stabilt transfekterte CHO-kolonier som viser signifikant høyere d2EGFP-ekspresjonsnivåer.

Derfor viser det seg i denne nye konfigurasjonen STAR-sekvens A – STAR-sekvens C - promotor – nukleinsyre som koder for et protein av interesse – STAR-sekvens B – 3’, hvori det foreliggende eksemplet av STAR-sekvensene A og B er STAR 7 og STAR-sekvens C er STAR67) noe som viser at STAR-elementene fungerer enda bedre enn hittil beskrevne konfigurasjoner.

Vi har utført eksperimenter i hvilke de flankerende STAR7-elementene ble erstattet med flankerende STAR6 (SEQ. ID. NO. 6)-elementer eller med flankerende STAR4 (SEQ. ID. NO. 4)-elementer i kombinasjon med STAR67 oppstrøms for SV40-promotoren (SV40-STAR67 6/6 og SV40-STAR67 4/4, respektive, ved å benytte den samme nomenklaturen som ovenfor) og observert forbedret ekspresjon også med disse kombinasjonene. Dette beviser at de flankerende STAR7-elementene kan byttes ut med andre STAR-sekvenser og fortsatt gi sikre observasjoner av forbedring av nye konfigurasjoner av ekspresjons-kassetten inneholdende STAR-sekvensene.

Eksempel 5: En kombinasjon av STAR67 og STAR7 øker UB6-drevne nivåer av antistoffekspresjon i stabilt transfekterte CHO-celler

I eksempel 4 viste vi at kombinasjonen av STAR67 og STAR7 økte ekspresjonen av d2EGFP-proteinet i CHO-celler. Her testet vi hvorvidt kombinasjonen av STAR67 og STAR7 kunne anvendes for å produsere et antistoff. Vi valgte et antistoff mot EpCAM-molekylet (Huls et al, 1999) som testprotein og brukte UB6-promotoren.

Materialer og Metoder

Plasmider

Tungkjede cDNA (HC-EpCAM) ble klonet inn i et konstrukt som favnet UB6-promotoren. HC-EpCAM ble koblet til zeocin resistensgenet ved hjelp av en IRES-sekvens. Lettkjede cDNA (LC-EpCAM) ble også klonet inn i et konstrukt som favnet UB6-promotoren. LC-EpCAM ble koblet til puromycin resistensgenet ved hjelp av en IRES-sekvens. Sammen representerte disse to plasmidene UB6 (HC+LC) Kontroll (Fig. 9)

For å teste effekten av STAR67 og STAR7, ble STAR67 klonet inn i begge HC+LC-konstruktene, oppstrøms for UB6-promotorene. STAR7 ble klonet til å flankere hele kassetten, både ved 5’ enden og 3’ enden (Fig. 9). Disse to plasmidene representerer STAR7-STAR67-UB6 (HC+LC) STAR7.

Transfeksjon og dyrking av CHO-celler

The Chinese Hamster Ovary cellelinjen CHO-K1 (ATCC CCL-61) ble tranfekstert og dyrket som i eksempel 2 ved å benytte zeocin (100 µg/ml) and puromycin (2,5 µg/ml) for seleksjon. En dag etter transfeksjon ble zeocin tilsatt til dyrkningsmediet. Da de første koloniene ble synlige (omtrent 7 dager etter å ha tilsatt zeocin) ble dyrkningsmediet fjernet og erstattet med dyrknings-medium som inneholdt puromycin. Etter omtrent 7 dager ble kolonier isolert og overført til 24-brønners plater, i hvilke dyrkningsmediet utelukkende inneholdt zeocin.

Resultater

Fig. 9 viser at transfeksjon av antistoffkonstruktene som inneholder STAR67 klonet oppstrøms for UB6-promotoren og de to STAR7-elementene klonet til å flankere hele kasetten, resulterte i et antall av CHO-kolonier som uttrykker signifikant høyere nivåer av EpCAM-antistoffet (målt ved hjelp av ELISA ved å benytte et antihumant IgG antistoff) i forhold til den ”tomme” kontrollen uten STAR67 og STAR7, UB6 (HC+LC) Kontroll. Den gjennomsnittlige EpCAM-produksjonen i de 18 koloniene som ble transfektert med UB6 (HC+LC) Kontroll-plasmidet var 2,7 pg/celle/dag, da man målte 25 dager etter transfeksjon. Selekterende agenser som zeocin og puromycin ble fjernet etter 25 dager. 45 dager etter transfeksjonen var gjennomsnittet av EpCAM-produksjonen i disse 18 koloniene 2,7 pg/celle/dag. Til sammenligning var det gjennomsnittlige EpCAM produksjons-signalet i de 18 koloniene transfektert med STAR7-STAR67-UB6 (HC+LC)-STAR7 plasmidet 6,7 da man målte etter 25 dager og 7,7 pg/celle/dag da man målte 45 dager etter transfeksjon. Således bidro, både 30 og 45 dager etter transfeksjon, et STAR67/STAR7-inneholdende UB6-konstrukt med en faktor som indikerte en 2,5 til 2,9 gangers økning for UB6-promotordrevet EpCAM ekspresjonsnivå i stabilt transfekterte CHO-kloner.

Ved å plassere STAR67 oppstrøms for promotoren og de to STAR7-elementene for å flankere kassetten, oppnådde man en signifikant høyere ekspresjon av EpCAM-antistoff-nivåene i CHO-celler sammenlignet med de STAR67/STAR7-frie konstruktene.

Eksempel 6: STAR67 er ikke en enhancer-blokker, mens STAR6 og STAR7 er det

Alle hittil kjente STAR-elementer som ble testet for denne egenskapen, inklusive STAR6 og STAR7, er enhancer-blokkere (WO 03/004704, Kwaks et al., 2003). Enhancer-blokkernes aktivitet blir testet ved å plassere et STAR-element mellom en sterk enhancer og en promotor. Her testet vi hvorvidt også STAR67 er en enhancer-blokker.

Materialer og Metoder

d2EGFP-genet ble PCR-amplifisert ved å benytte primerne TTGGTTGGTCATGAAT-GGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTC (SEQ.ID.NO. 75) og ATTCTCTAGACTACACATT-GATCCTAGCAGAAGCAC (SEQ.ID.NO. 76) og klonet inn i plasmid pGL3-promotor (Promega) ved å anvende NcoI og XbaI restriksjonssetene for å erstatte Luciferasegenet for å danne plasmid pGL3-promotor-GFP. En linker dannet ved å sammenkoble oligoene CGATATCTTGGAGATCTACTAGTGGCGCGCCTTGGGCTAGCT (SEQ.ID.NO. 77) og GATCAGCTAGCCCAAGGCGCGCCACTAGTAGATCTCCAAGA-TATCGAGCT (SEQ.ID.NO. 78) ble klonet inn i SacI- og BglII-setene for å danne et multippelt kloningssete. Det opphavelige BglII-setet ble ødelagt ved å ligere inn linkeren, noe som skapte et nytt unikt BglII-sete inne i linkerens DNA. SV40-enhanceren ble kuttet ut fra plasmid pGL3-“basic” (Promega) ved å avbenytte BsaBI og BamHI og klonet inn i pGL3-linker-promotor-GFP ved å anvende EcoRV-og BglII-setene for å danne plasmid pGL3-enhancer-promotor-GFP. STAR40 elementet (SEQ. ID. NO. 40) ble plassert oppstrøms for SV40-enhanceren ved å avbenytte KpnI- og SacI-setene for å hindre virkningen av enhanceren på sekvenser beliggende oppstrøms. Til slutt ble anti-repressorelementene STAR6, STAR7 og STAR67 plassert mellom SV40-enhanceren og den SV40 minimale promotor ved å bruke SpeI og AscI restriksjonssetene.

Transfeksjon og dyrking av CHO-celler

Chinese Hamster Ovary cellelinjen CHO-K1 (ATCC CCL-61) ble transfektert som i eksempel 2. En dag etter transfeksjonen ble d2EGFP-nivåene målt på et Epics XL flowcytometer (Beckman Coulter).

Resultater

Fig. 10 viser at STAR67 ikke er en enhancer-blokker, mens STAR6 og STAR7 agerer som enhancer-blokkere i den samme analysen. STAR6, STAR7 og STAR67 ble klonet mellom SV40-enhanceren og en minimal SV40-promotor oppstrøms for d2EGFP-genet. Når intet STAR-element blir klonet mellom enhanceren og promotoren, opptrer en sterk aktivering av transkripsjon (tilfeldig satt lik 100 %). Når STAR6 eller STAR7 blir plassert mellom enhanceren og promotoren, faller transkripsjonen til bakgrunnsnivå, noe som indikerer at STAR6 og STAR7 er potente enhancer-blokkere. I kontrast til dette var de relative transkripsjons-nivåene, når STAR67 ble klonet mellom enhanceren og promotoren, fortsatt 80 % av kontrollen, noe som indikerer at STAR67 ikke er en god enhancer-blokker. Dette står i kontrast til STAR6 og STAR 7, så vel som andre anti-repressorelementer, som tidligere beskrevet (WO 03/004704, Kwaks et al, 2003).

Eksempel 7: STAR67 øker nivåene av UB6- og CMV-drevet antistoff-ekspresjon i stabilt transfekterte CHO-celler

I eksempel 5 viste vi at kombinasjonen av STAR67 og STAR7 øker ekspresjonsnivåene til EpCAM-antistoffet i CHO-celler i sammenheng med to distinkte plasmider, som inneholdt den tunge og lette kjeden. I dette eksemplet testet vi ut hvorvidt STAR67 kunne anvendes for å produsere EpCAM-antistoffet når både den tunge og lette kjeden ble plassert på ett plasmid. Vi benyttet oss av simultan seleksjon for hver selektabel markør.

Materialer og Metoder

Plasmider

Den tunge kjeden kodet for av cDNA (HC-EpCAM) er under kontroll av UB6-promotoren og koblet til zeocin-resistensgenet via en IRES-sekvens. Den lette kjeden kodet for av cDNA (LC-EpCAM) er under kontroll av CMV-promotoren og koblet til puromycin-resistensgenet via en IRES-sekvens. I grunnen er disse de konstruktene som er benyttet i eksempel 5. Disse to ekspresjonskassettene ble plassert i ett plasmid på en slik måte at transkripsjon av de to ekspresjonsenhetene hadde motsatt retning. I kontroll-plasmidet ble UB6 og CMV-promotorene atskilt ved hjelp av en “stuffer” (utfyller) på 500 bp (EpCAM Kontroll) (Fig. 10). I et annet plasmid ble STAR67 plassert mellom UB6 og CMV-promotoren (EpCAM STAR67) (Fig. 10).

Transfeksjon av og dyrkning av CHO-celler

Chinese Hamster Ovary cellelinjen CHO-K1 (ATCC CCL-61) ble transfektert og dyrket som i eksempel 2, ved å benytte zeocin (100 µg/ml) og puromycin (2,5 µg/ml) for seleksjon. I eksempel 5 ble konstant seleksjon for begge seleksjonsmarkørene benyttet. I kontrast til dette var her begge seleksjonsagensene til stede i vekstmediet samtidig. En dag etter transfeksjon ble zeocin og puromycin tilsatt til vekstmediet. Seleksjonsmediet var til stede inntil koloniene ble isolert (omtrent 14 dager etter transfeksjon). Etter at kolonier ble isolert og overført til 24-brønners plater ble cellene dyrket under tilstedeværelse av zeocin og puromycin.

Resultater

Fig. 11 viser at transfeksjon av antistoff-konstruktet som inneholder STAR67 klonet mellom UB6- og CMV-promotorene resulterte i et antall CHO-kolonier som uttrykte EpCAM-antistoffet (målt ved hjelp av ELISA ved å avbenytte et anti-humant IgG antistoff). Den gjennomsnittlige produksjonen av EpCAM i de 19 koloniene transfektert med EpCAM STAR67-plasmidet var 9,8 pg/celle/dag, da man målte 25 dager etter transfeksjon.

I kontrast til dette viste det seg at ingen kolonier overlevde transfeksjon med EpCAM Kontroll-plasmidet. Når seleksjon ble utført med enten zeocin eller med puromycin alene, overlevde EpCAM Kontroll-koloniene. Imidlertid tillot, når seleksjonspresset ble økt ved å plassere seleksjonstrykket på både den tunge og lette kjeden, disse betingelsene bare at de koloniene overlevde som hadde en STAR67 til stede i det transfekterte plasmidet.

Resultatet viser også at inkorporering av STAR67 har en fordelaktig effekt på de to promotorene, UB6- og CMV-promotorene, som er plassert oppstrøms og nedstrøms for ett STAR67-element. Dette indikerer at STAR67 kan operere på en måte som er bidireksjonell.

Forskjellen mellom EpCAM-kontroll og EpCAM STAR67-plasmidet er svart-hvit i den forstand at bare transfeksjon av EpCAM STAR67 resulterer i etableringen av kolonier, når seleksjonstrykket er høyt. Dette åpner for en mulighet til å anvende denne plasmid-konfigurasjonen for å identifisere for den regionen innen STAR67 som er ansvarlig for mediering av denne effekten. Mindre, overlappende deler av STAR67 ble plassert mellom UB6- and CMV-promotorene for å drive frem EpCAM-molekylet. Når en del av STAR67 er funksjonell, vil kolonier overleve når både zeocin og puromycin blir brukt simultant som seleksjonsagens. Når en del av STAR67 ikke er funksjonell, vil ingen kolonier overleve under identiske seleksjonsbetingelser.

Ved på denne måten å plassere STAR67 oppstrøms for promotoren, resulterte det i at man fikk signifikant høyere nivåer av EpCAM-antistoff ekspresjon i CHO-celler, i sammenligning med konstrukter som manglet slike anti-repressorelementer. Et lignende eksperiment ble utført med SV40-promotoren for å drive ekspresjon av den tunge og lette kjeden av anti-EpCAM-antistoffet. I andre eksperimenter ble STAR67 byttet ut med andre STAR-sekvenser. I videre eksperimenter ble orienteringen til de to ekspresjonsenhetene som koder for tung og lett kjede endret slik at begge vender i samme retning. I et annet eksperiment ble ekspresjonsenhetene for tung og lett kjede plassert på forskjellige nukleinsyremolekyler, respektive (som i eksempel 5), og de resulterende klonene ble simultant selektert for begge seleksjonsmarkører. I et annet eksperiment blir typen av vertscelle variert. Kombinasjoner av alle de forskjellige variasjonene ble også fremstilt.

BESKRIVELSE AV FIGURENE

Fig. 1. Skjematisk diagram av oppfinnelsen.

A) bicistronisk gen inneholdende (fra 5’ til 3’) et transgen (som eksempelvis koder for d2EGFP genet), en IRES, og en selektabel markør (zeo, som bibringer zeocinresistens) under kontroll av CMV-promotoren. Ekspresjonsenheten har SV40 transkripsjonell terminator ved sin 3’-ende (t). Navnet på konstruktet er CMV-d2EGFP-ires-Zeo (CMV Kontroll).

B) konstrukt som i A, men nå er STAR67 klonet oppstrøms for CMV-promotoren. Navnet på konstruktet er STAR67-CMV-d2EGFP-ires-Zeo (CMV-STAR67).

C) konstrukt som i B, men oppstrøms og nedstrøms STAR7-elementer er klonet til å flankere hele konstruktet. Navnet på konstruktet er STAR7-STAR67-CMV-d2EGFP-ires-Zeo-STAR7 (CMV-STAR67 7/7)

Fig. 2. STAR67 forbedrer CMV-drevet d2EGFP-ekspresjon i CHO-celler.

Gjennomsnittet av d2EGFP-signalet fra 10 uavhengige stabile kolonier er plottet for de indiserte konstruktene i CHO-celler. A) CMV Kontroll; B) STAR67-CMV. X(10): midlere d2EGFP-ekspresjonsnivåer fra de 10 koloniene. Se eksempel 2 for detaljer.

Fig. 3. STAR67 forbedrer EF1 α-drevet d2EGFP-ekspresjon i CHO-celler. Samme som Fig. 2, men nå med EF1α promotoren. A) EF1 α Kontroll; B) STAR67- EF1 α.

Fig. 4. STAR67 forbedrer UB6-drevet d2EGFP-ekspresjon i CHO-celler. Samme som Figurene 2 og 3, men nå med UB6-promotoren. A) UB6 Kontroll; B) STAR67-UB6.

Fig. 5. STAR67 forbedrer CMV-drevet d2EGFP-ekspresjon i PER. C6-celler. Samme som Fig. 2, men nå i PER.C6-celler. A) CMV Kontroll; B) STAR67-CMV.

Fig. 6. STAR67 forbedrer EF1 α-drevet d2EGFP-ekspresjon i PER.C6-celler. Samme som Fig. 3, men nå i PER.C6-celler. A) EF1 α Kontroll; B) STAR67- EF1 α.

Fig. 7. STAR67 forbedrer UB6-drevet d2EGFP-ekspresjon i PER.C6-celler. Samme som Fig. 4, men nå i PER.C6-celler. A) UB6 Kontroll; B) STAR67-UB6.

Fig. 8. STAR67 forbedrer SV40-drevet d2EGFP-ekspresjon i CHO-K1-celler i kombinasjon med et annet STAR-element. Samme som Fig. 2, men nå anvendes SV40-promotoren i CHO-celler, samt de indiserte konstruktene. Gjennomsnittet for d2EGFP-signaler er plottet for 18-20 uavhengige stabile kolonier 60 dager etter transfeksjon. A) SV40 Kontroll, SV40-STAR67, SV40-STAR7/7; B) SV40 Kontroll og SV40-STAR67 7/7. Se eksempel 4 for detaljer.

Fig. 9. STAR67 forbedrer UB6-drevet ekspresjon av EpCAM-antistoffet i CHO-K1-celler. Se eksempel 5 for detaljer. A) konstrukter uten STAR-elementer; B) konstrukter med STAR67 oppstrøms for promotor og flankerende STAR7-elementer. Anti-EpCAM-antistoffkonsentrasjonen er angitt som pg/celle/dag. X(18): midlere produksjonsnivå for de 18 koloniene.

Fig. 10. STAR67 er ikke en enhancer-blokker, mens STAR 6 og 7 er det. Se eksempel 6 for detaljer.

Fig. 11. STAR67 øker UB6- og CMV-drevet antistoff-ekspresjonsnivåer i stabilt transfekterte CHO-celler. Se eksempel 7 for detaljer. A) enkeltstående DNA-molekyl som inneholder anti-EpCAM tungkjeden (HC) og lettkjeden (LC), hver bak en promotor og hver knyttet til forskjellige gener som koder for selektable markører (simultan seleksjon ble benyttet for begge markører): konstrukt uten STAR-elementer. Ingen kolonier ble funnet; B) samme konstrukt med STAR67 mellom begge promotorene. Anti-EpCAM-antistoffkonsentrasjonen er angitt som pg/celle/ dag. X(19): gjennomsnittlig produksjonsnivå for de 19 koloniene.

Referanser

Boshart, M, Weber, F, Jahn, G, Dorsch-Hasler, K, Fleckenstein, B, and Schaffner, W. (1985) A very strong enhancer is located upstream of an immediate early gene of human cytomegalovirus Cell 41, 521-530.

Chung JH, Whiteley M, and Felsenfeld G. (1993) A 5’ element of the chicken betaglobin domain serves as an insulator in human erythroid cells and protects against position effect in Drosophila. Cell 74: 505-514.

Chung JH, Bell AC, Felsenfeld G. (1997). Characterization of the chicken beta-globin insulator. Proc Natl Acad Sci USA 94: 575-580.

Das, GC, Niyogi, SK, and Salzman, NP. (1985) SV40 promoters and their regulation Prog Nucleic Acid Res Mol Biol 32, 217-236.

Gill DR, Smyth SE, Goddard CA, Pringle IA, Higgins CF, Colledge WH, and Hyde SC. (2001) Increased persistence of lung gene expression using plasmids containing the ubiquitin C or elongation factor 1α promoter. Gene Therapy 8: 1539-1546.

Gossen M, and Bujard H. (1992) Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proc Natl Acad Sci USA 89: 5547-5551.

Graham FO, Smiley J, Russell W and Nairn R. (1977). Characteristics of a human cell line transformed by DNA from human adenovirus type 5. J. Gen. Virol. 36, 59-72.

Huls GA, Heijnen IAFM, Cuomo ME, Koningsberger JC, Wiegman L, Boel E, van der Vuurst-de Vries A-R, Loyson SAJ, Helfrich W, van Berge Henegouwen GP, van Meijer M, de Kruif J, Logtenberg T. (1999). A recombinant, fully human monoclonal antibody with antitumor activity constructed from phage-displayed antibody fragments. Nat Biotechnol. 17, 276-281.

Jones D, Kroos N, Anema R, Van Montfort B, Vooys A, Van Der Kraats S, Van Der Helm E, Smits S, Schouten J, Brouwer K, Lagerwerf F, Van Berkel P, Opstelten D-J, Logtenberg T, Bout A (2003) High-level expression of recombinant IgG in the human cell line PER.C6. Biotechnol. Prog. 19: 163-168.

Kaufman, RJ. (2000) Overview of vector design for mammalian gene expression Mol Biotechnol 16, 151-160.

Kaufman, RJ, and Sharp, PA. (1982) Construction of a modular dihydrofolate reductase cDNA gene: analysis of signals utilized for efficient expression Mol Cell Biol 2, 1304-1319.

Kellum R, and Schedl P. (1991) A position-effect assay for boundaries of higher order chromosomal domains. Cell 64: 941-950.

Kwaks TH, Barnett P, Hemrika W, Siersma T, Sewalt RG, Satijn DP, Brons JF, van Blokland R, Kwakman P, Kruckeberg AL, Kelder A, Otte AP. (2003) Identification of anti-repressorelements that confer high and stable protein production in mammalian cells. Nat Biotechnol 21, 553-558. Erratum in: Nat Biotechnol 21, 822 (2003).

Phi-Van L, Von Kreis JP, Ostertag W, and Strätling WH. (1990) The chicken lysozyme 5’ matrix attachment region increases transcription from a heterologous promoter in heterologous cells and dampens position effects on the expression of transfected genes. Mol. Cell. Biol. 10: 2302-2307.

Lopez de Quinto, S, and Martinez-Salas, E. (1998) Parameters influencing translational efficiency in aphthovirus IRES- based bicistronic expression vectors Gene 217, 51-56.

Martin, DI, and Whitelaw, E. (1996) The vagaries of variegating transgenes Bioessays 18, 919-923.

Martinez-Salas, E. (1999) Internal ribosome entry site biology and its use in expression vectors Curr Opin Biotechnol 10, 458-464.

McBurney, MW, Mai, T, Yang, X, and Jardine, K. (2002) Evidence for repeat-induced gene silencing in cultured Mammalian cells: inactivation of tandem repeats of transfected genes Exp Cell Res 274, 1-8.

Migliaccio, AR, Bengra, C, Ling, J, Pi, W, Li, C, Zeng, S, Keskintepe, M, Whitney, B, Sanchez, M, Migliaccio, G, and Tuan, D. (2000) Stable and unstable transgene integration sites in the human genome: extinction of the Green Fluorescent Protein transgene in K562 cells Gene 256, 197-214.

Mizuguchi, H, Xu, Z, Ishii-Watabe, A, Uchida, E, and Hayakawa, T. (2000) IRES-dependent second gene expression is significantly lower than cap- dependent first gene expression in a bicistronic vector Mol Ther 1, 376-382.

Rees, S, Coote, J, Stables, J, Goodson, S, Harris, S, and Lee, MG. (1996) Bicistronic vector for the creation of stable mammalian cell lines that predisposes all antibioticresistant cells to express recombinant protein Biotechniques 20, 102-104, 106, 108-110.

Schorpp, M, Jager, R, Schellander, K, Schenkel, J, Wagner, EF, Weiher, H, and Angel, P. (1996) The human ubiquitin C promoter directs high ubiquitous expression of transgenes in mice Nucleic Acids Res 24, 1787-8.

Strutzenberger, K, Borth, N, Kunert, R, Steinfellner, W, and Katinger, H. (1999) Changes during subclone development and ageing of human antibody- producing recombinant CHO cells J Biotechnol 69, 215-26.

Van der Vlag, J, den Blaauwen, JL, Sewalt, RG, van Driel, R, and Otte, AP. (2000) Transcriptional repression mediated by polycomb group proteins and other chroma tin-associated repressors is selectively blocked by insulators J Biol Chem 275, 697-704.

Whitelaw, E, Sutherland, H, Kearns, M, Morgan, H, Weaving, L, and Garrick, D. (2001) Epigenetic effects on transgene expression Methods Mol Biol 158, 351-68.