KR101188013B1

KR101188013B1 - 핵산 발현의 개선을 위한 신규한 서열

Info

Publication number: KR101188013B1
Application number: KR1020067027165A
Authority: KR
Inventors: 아리이 피터 오떼; 테오도루스 헨드리쿠스 야코부스 콱스; 리차르드 게오르그 안토니우스 베르나르두스 세발트; 헨리쿠스 요하네스 마리아 반 블록란트
Original assignee: 크로마제닉스 비.브이.
Priority date: 2004-07-08
Filing date: 2005-07-07
Publication date: 2012-10-08
Also published as: JP4805262B2; US7825232B2; NO341862B1; DE602005003369T2; CN1981057A; JP2008505626A; CA2573022A1; DE602005003369D1; ES2296201T3; WO2006005718A3; EA011747B1; IL180531A0; CN1981057B; US20070212755A1; MXPA06014553A; ZA200610470B; WO2006005718A2; PT1763586E; AU2005261699A1; AU2005261699B2

Abstract

본 발명은 신규한 항-억제자 요소를 제공하고, 이것은 숙주세포에서 핵산의 발현을 개선하는데 유용하다. 관심대상 단백질을 생산하기 위한 신규한 항-억제자 요소를 사용하는 방법이 또한 제공된다. 본 발명은 또한 항-억제자 서열을 포함하는 발현 카세트의 새로운 배열을 제공한다.

항-억제자 요소, 핵산 발현, 재조합 핵산분자

Description

핵산 발현의 개선을 위한 신규한 서열{Novel sequence for improving expression of nucleic acid}

본 발명은 생물학 및 생명공학 분야에 관한 것이다. 더 상세하게는 본 발명은 숙주 세포에서 단백질을 암호화할 수 있는 하나 이상의 핵산의 생성을 개선시키기 위한 수단 및 방법에 관한 것이다.

단백질은 생물학 및 생명공학, 예를 들면 생물약제학에서의 광범위한 적용을 위해 다양한 숙주 세포에서 생성될 수 있다. 그러한 생성을 위한 방법들이 잘 확립되어 있고, 일반적으로 관심대상 단백질을 암호화하는 핵산(또한 '트란스유전자'이라고 불림)의 숙주 세포에서 발현을 수반한다.

트란스유전자의 발현과 연관된 한가지 문제는 트란스유전자가 유전자 침묵으로 인해 불활성화될 가능성이 높기 때문에 발현이 예측불가능하다는 것이고, 따라서 많은 숙주 세포 클론을 트란스유전자의 고발현에 관하여 시험하여야 한다는 것이다. 게다가, 일단 그러한 클론이 확립되면, 트란스유전자의 발현은 종종 안정적이지 않고, 연장된 숙주 세포 배양 중에 트란스유전자 발현의 침묵은 일반적으로 관찰되는 현상이다. 척추 세포에서 그것은 트란스유전자 유전자자리에서의 이질염색질 형성에 의해 야기될 수 있고, 이것은 트란스유전자의 전사를 막는다(Whitelaw et al., 2001). 트란스유전자 침묵은 확률적이다; 그것은 트란스유전자가 게놈에 통합된 직후, 또는 다수의 세포 분열 후에만 일어날 수 있다. 이것은 연장된 배양 후에 이종성 세포 개체군을 초래하고, 여기서 일부 세포들은, 다른 것들이 낮거나 검출불가능한 수준의 단백질을 발현하는 반면, 고수준의 재조합 단백질 발현을 계속한다(Martin & Whitelaw, 1996, McBurney et al., 2002). 이종성 단백질 생산에 사용되는 세포계는 단일 세포에서 유도되지만, 1,000리터 이상의 배양기에서, 세포 밀도가 천만개/ml를 넘는 규모로 커지고, 장기간 동안 그것을 유지한다. 이들 큰 세포 개체군 (10¹⁴~10¹⁶ 세포)은 트란스유전자 침묵으로 인해 생산성이 심각하게 감소되기 쉽다(Migliaccio et al., 2000, Strutzenberger et al., 1999).

상기 문제를 극복하기 위한 하나의 가능성은 발현 시스템에 소위 STAR 서열을 적용하는 것이다. 다양한 이와 같은 STAR 서열들이 WO 03/004704에 기술되었다. 이들 서열은, 여러 종류의 숙주 세포에서 발현 구조물을 사용하여 단백질 생성의 예측가능성, 수율 및/또는 안정성을 개선하는데 사용될 수 있다(WO 03/004704; Kwaks et al, 2003).

국제 공개 WO 03/106674는 여러 세포계에서 재조합 단백질을 암호화하는 핵산을 발현하기 위한 STAR 서열의 사용을 기술한다.

국제 공개 WO 03/106684는 항체와 같은, 다중 결합의 단백질을 코딩하는 핵산을 발현하기 위한 STAR 서열의 사용을 기술한다.

발명의 요약

한 면에서, 본 발명은 a) SEQ. ID. NO. 66, b) SEQ. ID. NO. 66의 단편, 여기서 상기 단편은 항-억제자 활성을 갖는다, c) 뉴클레오티드 서열에서 a) 또는 b)와 적어도 70%가 동일한 서열, 여기서 상기 서열은 항-억제자 활성을 갖는다; 및 d) a) 내지 c) 중의 어느 하나에 대한 상보체로 이루어진 군으로부터 선택된 항-억제자 활성을 갖는 핵산서열을 포함하는 재조합 핵산분자를 제공하고; 상기 재조합 핵산 분자는 추가로 발현 카세트를 포함하고, 상기 발현 카세트는 관심대상 핵산에 연결된 이종성 프로모터를 포함하고, 여기서 상기 관심대상 핵산은 바람직하기는 관심대상 단백질의 모두 또는 일부를 암호화한다. 바람직한 구현예에서, 항-억제자 활성을 갖는 상기 핵산 서열은 상기 발현 카세트에서 상기 프로모터의 업스트림에 위치되고, 특히 그것의 바람직한 구현예에서, 항-억제자 활성을 갖는 상기 서열 및 상기 프로모터는 2 kb 미만으로 떨어져 있다. 특정 구현예에서, 관심대상 단백질을 암호화하는 상기 핵산은 추가로 선택적 마커 유전자를 암호화하는 다중시스트론 유전자에 존재한다. 특정 구현예에서, 상기 분자는 추가로, 항-억제자 활성을 갖는 적어도 하나의 다른 서열을 포함하고, 상기 적어도 하나 이상의 다른 서열은 a) SEQ. ID. NOs. 1~65, b) SEQ. ID. NOs. 1~65중의 어느 하나의 단편, 여기서 상기 단편은 항-억제자 활성을 갖는다, c) 뉴클레오티드 서열에서 a) 또는 b)와 적어도 70%가 동일한 서열, 및 d) a) 내지 c) 중의 어느 하나에 대한 상보체로부터 선택된다.

본 발명은 또한 5'-항-억제자 서열 A - 프로모터 - 관심대상 단백질 전체 또는 일부를 암호화하는 핵산 - 항-억제자 서열 B - 3'를 포함하는 발현 카세트를 포함하는 재조합 핵산 분자를 제공하고, 여기서 항-억제자 서열 A 및 B는 동일하거나 다르고, (ⅰ) SEQ. ID. NOs. 1~65 중의 어느 하나, (ⅱ) SEQ. ID. NOs. 1~65중의 어느 하나의 단편, 여기서 상기 단편은 항-억제자 활성을 갖는다, (ⅲ) 뉴클레오티드 서열에서 a) 또는 b)와 적어도 70%가 동일한 서열, 여기서 상기 서열은 항-억제자 활성을 갖는다, 및 (ⅳ) (ⅰ) 내지 (ⅲ) 중의 어느 하나에 대한 상보체로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 발현 카세트는 추가로 상기 항-억제자 서열 A와 B 사이에, a) SEQ. ID. NO. 66, b) SEQ. ID. NO. 66의 단편, 여기서 상기 단편은 항-억제자 활성을 갖는다, c) 뉴클레오티드 서열에서 a) 또는 b)와 적어도 70%가 동일한 서열, 여기서 상기 서열은 항-억제자 활성을 갖는다; 및 d) a) 내지 c) 중의 어느 하나에 대한 상보체로 이루어진 군으로부터 선택된 항-억제자 활성을 갖는 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명은 추가로 본 발명에 따른 분자를 포함하는 세포를 제공한다. 바람직하기는 상기 세포는 포유류 세포이고, 특정 구현예에서 상기 세포는 CHO 세포이다.

본 발명은 추가로 관심대상 단백질을 생성하는 방법을 제공하고, 상기 방법은, 상기 세포에서 관심대상의 단백질을 암호화하는 상기 핵산을 발현하도록 관심대상의 단백질을 암호화하는 재조합 핵산 분자를 포함하는 세포를 배양하는 것을 포함하고, 상기 재조합 핵산 분자는 a) SEQ. ID. NO. 66, b) SEQ. ID. NO. 66의 단편, 여기서 상기 단편은 항-억제자 활성을 갖는다, c) 뉴클레오티드 서열에서 a) 또는 b)와 적어도 70%가 동일한 서열, 여기서 상기 서열은 항-억제자 활성을 갖는다; 및 d) a) 내지 c) 중의 어느 하나에 대한 상보체로 이루어진 군으로부터 선택된 항-억제자 활성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다. 바람직한 구현예에서, 상기 방법은 추가로 관심대상의 단백질을 단리하는 것을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 항-억제자 활성을 갖는 상기 핵산 서열은 관심대상의 단백질의 발현을 조절하는 프로모터의 업스트림에 위치된다. 그것의 바람직한 구현예에서, 항-억제자 활성을 갖는 상기 서열 및 상기 프로모터는 2 kb 미만으로 떨어져 있다. 어떤 구현예에서, 관심대상의 단백질을 암호화하는 상기 핵산은 선택적 마커 유전자를 추가로 암호화하는 다중시스트론성 유전자에 존재한다. 특정 구현예에서, 상기 세포는 포유류 세포, 예를 들면 CHO 세포이다.

본 발명은 또한 관심대상의 핵산의 발현을 증가시키기 위해, a) SEQ. ID. NO. 66, b) SEQ. ID. NO. 66의 단편, 여기서 상기 단편은 항-억제자 활성을 갖는다, c) 뉴클레오티드 서열에서 a) 또는 b)와 적어도 70%가 동일한 서열, 여기서 상기 서열은 항-억제자 활성을 갖는다; 및 d) a) 내지 c) 중의 어느 하나에 대한 상보체로 이루어진 군으로부터 선택된 항-억제자 활성을 갖는 핵산 서열의 용도를 제공한다.

또 하나의 면에서, 본 발명은 관심대상의 두개의 폴리펩티드를 발현하는 숙주 세포를 생산하기 위한 방법을 제공하고, 상기 방법은 a) 숙주 세포에 하나 이상의 핵산 분자를 도입하고, 핵산 분자 또는 분자들은 함께: (ⅰ) 관심대상의 첫번째 폴리펩티드 및 첫번째 선택적 마커 유전자를 암호화하는 서열에 기능적으로 연결된 프로모터, 및 (ⅱ) 관심대상의 두번째 폴리펩티드 및 두번째 선택적 마커 유전자를 암호화하는 서열에 기능적으로 연결된 프로모터, 및 (ⅲ) (a) SEQ. ID. NOs. 1~66의 어느 하나, (b) SEQ. ID. NOs. 1~66의 어느 하나의 단편, 여기서 상기 단편은 항-억제자 활성을 갖는다, (c) (a) 또는 (b)와 적어도 70%가 동일하고 항-억제자 활성을 갖는 서열; 및 (d) (a) ~ (c) 중의 어느 하나의 상보체로 이루어진 군으로부터 선택되는, 항-억제 활성을 갖는 적어도 하나의 서열을 포함하고; b) 상기 첫번째 및 두번째 선택적 마커 유전자의 발현을 위해 필수적으로 동시에 선택함으로써 숙주 세포를 선택하는 것을 포함한다.

본 발명은 또한 관심대상의 두 폴리펩티드를 발현하는 방법을 제공하고, 상기 방법은, 상기 첫번째 및 두번째 폴리펩티드를 발현하기 위한 본 발명의 이 면에 따른 방법에 의해 얻어진 숙주 세포를 배양하고, 그리고 임의로 상기 폴리펩티드를 단리하는 것을 포함한다. 한 구현예에서, 상기 항-억제자 활성을 갖는 서열은, a) SEQ. ID. NO. 66, b) SEQ. ID. NO. 66의 단편, 여기서 상기 단편은 항-억제자 활성을 갖는다, c) 뉴클레오티드 서열에서 a) 또는 b)와 적어도 70%가 동일한 서열, 여기서 상기 서열은 항-억제자 활성을 갖는다; 및 d) a) 내지 c) 중의 어느 하나에 대한 상보체로 이루어진 군으로부터 선택된다.

발명의 상세한 설명

항-억제자 서열

여기서 사용되는 것과 같은 항-억제자 활성을 갖는 서열은 HP1 또는 HPC2 단백질의 억제 효과를, 이들 단백질이 DNA에 구속될 때, 적어도 부분적으로 방해할 수 있는 서열이다. 본 발명에 적절한 항-억제자 활성을 갖는 서열(또한 본 명세서에서 때때로 항-억제자 서열 또는 항-억제자 요소로 일컬어짐)은 참고 문헌으로서 여기에 병합된, WO 03/004704에 개시되었고, 거기서 경화된 "STAR" 서열이다(서열이 STAR 서열으로 일컬어지는 경우는 언제나, 이 서열은 본 발명에 따른 항-억제자 활성을 갖는다). 비-제한적 실시예로서, STAR1-65(WO 03/004704 참조)라 명명된 65 항-억제자 요소의 서열은 본 명세서에서 각각, SEQ. ID. NOs. 1~65로 표시된다.

본 발명에 따라, 주어진 항-억제자 요소의 기능적 단편 또는 유도체는 그것이 여전히 항-억제자 활성을 가지면, 상기 항-억제자 요소와 동등하다고 간주된다. 그러한 항-억제자 활성의 존재는 예를 들면, 하기 분석에 의해 당업자에 의해 쉽게 확인될 수 있다. 기능적 단편 또는 유도체는, 주어진 항-억제자 서열로 시작하고, 그리고 결실, 첨가, 치환, 역위를 만드는 것으로, 분자 생물학 분야의 당업자에 의해 쉽게 얻어질 수 있다(WO 03/004704 참조). 기능성 단편 또는 유도체는 또한 다른 종으로부터의 오쏘로그(orthologs)를 포함할 수 있고, 이것은 당업자에 의해 알려진 방법에 의해 공지의 항-억제자 서열을 사용하여 발견될 수 있다(예를 들면, WO 03/004704 참조). 그리하여, 본 발명은 항-억제자 서열의 단편을 포함하고, 상기 단편은 여전히 항-억제자 활성을 갖는다. 주어진 서열의 단편의 경우, 퍼센트 동정은 단편에서 발견되는 참조 천연 서열의 일부를 말한다. 본 발명은 또한 항-억제자 활성을 갖는 상기 서열과 또는 항-억제자 활성을 갖는 그들의 기능적 단편과 핵산서열에서 적어도 70% 동일한 서열이 여전히 본 발명에 따른 항-억제자 활성을 갖는 한, 이들 적어도 70% 동일한 서열을 포함한다. 바람직하기는, 상기 서열은 참조 천연 서열 또는 그것의 기능적 단편과 적어도 80% 동일하고, 더 바람직하기는 적어도 90% 동일하고, 훨씬 더 바람직하기는 적어도 95% 동일하다.

본 발명에 따른 항-억제자 활성을 갖는 서열은, 인간 게놈 또는 또 하나의 유기체의 게놈으로부터의 클로닝하는 것을 포함하는, 그러나 그것으로 제한되는 것은 아닌 다양한 방법에 의해, 또는 예를 들면 서열에 대한 지식을 사용하여, 예를 들면 PCR에 의해, 그러한 게놈으로부터 직접 공지의 항-억제자 서열을 증폭시킴으로써 얻어지거나, 또는 부분적으로 또는 전체적으로 화학적으로 합성될 수 있다.

항-억제자 활성을 갖는 서열, 및 그것의 기능적 단편 또는 유도체는 그들의 서열에 의해 여기서 구조적으로 정의되고 이에 더하여 항-억제자 활성을 갖는 서열로서 기능적으로 정의되고, 이것은 하기와 같은 분석으로 측정될 수 있다.

본 발명에 따른 항-억제자 활성을 갖는 어느 서열은 적어도 하기의 기능성 분석을 견딜 수 있어야 한다(여기에 참조로서 병합된, WO 03/004704, 실시예 1 참조). 인간 U-2 OS 세포(ATCC HTB-96)는 Tet-Off 전사 조절 시스템(Gossen and Bujard, 1992)하에서, pTet-Off 플라즈미드(Clontech K1620-A)으로, 그리고 LexA DNA 결합 도메인 및 HP1 또는 HPC2의 코딩 영역을 함유하는 LexA-억제자 융합 단백질(DNA에 구속될 때 유전자 발현을 억제하는 Drosophila Polycomb 기 단백질)을 암호화하는 핵산으로 안정하게 트란스펙션된다. 이들 세포들은 하기에 항-억제자 활성 분석을 위한 리포터 세포로서 언급된다. 하이그로마이신 내성을 제공하는 리포터 플라즈미드는 네 개의 LexA 작동자 부위와 제오신 내성 유전자를 조절하는 SV40 프로모터 사이에 위치된 폴리링커 서열을 함유한다. 항-억제자 활성에 대해 시험될 서열은 상기 폴리링커에서 클론될 수 있다. pSelect와 같은 적절한 리포터 플라즈미드의 구성은 WO 00/004704의 실시예 1 및 도 1에 기술된다. 리포터 플라즈미드는 리포터 세포로 트란스펙션되고, 세포들은 하이그로마이신 선택(25 ㎍/㎖; 리포터 플라즈미드의 존재를 위한 선택) 및 테트라사이클린 억제(독시사이클린, 10 ng/㎖; LexA-억제 융합 단백질의 발현을 막는다) 하에 배양된다. 이들 조건 하의 성장 1주 후에, 독시사이클린 농도는 LexA-억제자 유전자를 유발하도록 0.1 ng/㎖로 감소되고, 2일 후에 제오신이 250 ng/㎖에 첨가된다. 세포는 대조구 배양물(빈 리포터 플라즈미드로 트란스펙션됨, 즉, 폴리링커에 클론된 항-억제자 서열이 부족)이 제오신에 의해 죽을 때까지 5주 동안 배양된다(이 대조구 플라즈미드에서, SV40 프로모터는 LexA 작동 부위에 구속된 LexA-억제자 융합 단백질에 의해 억제되고, 이와 같은 세포에서 제오신 선택을 견디기에 불충분한 제오신 발현을 초래한다). 서열은, 상기 서열이 리포터 플라즈미드의 폴리링커에 클론될 때, 리포터 세포가 제오신 하에 5주 선택을 견딘다면, 본 발명에 따른 항-억제자 활성을 갖는다. 항-억제자 서열이 부족한 리포터 플라즈미드로 트란스펙션된 세포는 제오신을 함유한 새로운 배지 상에 증식될 수 없는 반면에, 그러한 콜로니로부터의 세포는 5주 제오신 선택 후에 여전히 제오신 함유 새로운 배지 상에서 증식될 수 있다. 이 분석에서 제오신에 대한 5주 후에 그러한 성장을 수여할 수 없는 모든 서열은 본 발명에 따른 항-억제자 활성, 또는 기능적 단편 또는 그것의 기능성 유도체를 갖는 서열로서 평가되지 않는다. 예로서, Drosophila scs(Kellum and Schedl, 1991), 치킨 β-글로블린 유전자자리의 5'-HS4(Chung et al, 1993, 1997) 또는 매트릭스 부착 영역(MARs)(Phi-Van et al., 1990)을 포함하여, Van der Vlag et al(2000)에 의해 시험된 것들과 같은 공지의 경계 서열들은 이 분석에서 살아남지 못했다.

게다가, 항-억제자 서열 또는 그것의 기능적 단편 또는 유도체는, 리포터 유전자가 항-억제자 서열의 측면에 위치되지 않거나, Drosophila scs와 같은 더 약한 억제 차단 서열의 측면에 위치할 때와 비교하여, U-2 OS 또는 CHO 세포의 게놈으로 통합되는 리포터 유전자(예를 들면, 루시페라제, GFP)의 측면에 위치할 때, 더 높은 비율의 리포터 과-발현(over-expressing) 클론을 수여한다. 이것은 예를 들면, WO 03/004704의 실시예 1 및 도 2에 기술된 것과 같이, pSDH 벡터, 또는 유사한 벡터를 사용하여 입증될 수 있다.

본 발명의 항-억제자 요소들은 단백질 생성을 위해 중요한 세 가지 중 적어도 하나를 가질 수 있다: (1) 그들은 산업적으로 허용가능한 수준으로 단백질을 발현시키는 숙주 세포계를 동정하는 예측가능성을 증가시킨다; (2) 그들은 숙주세포계의 단백질 수율을 증가되도록 한다. 및/또는 (3) 그들은 숙주세포계가 연장된 재배동안 더 안정한 단백질 생성을 나타내도록 한다. 이들 속성의 각각은 하기에 더 상세하게 논의된다:

(1) 증가된 예측가능성: 트란스유전자 발현 카세트의 통합은 숙주세포 게놈 전체에 걸쳐 임의의 위치에서 일어날 수 있다. 그러나, 대부분의 게놈은 전사적으로 가동되지 않는(silent) 이질염색질(heterochromatin)이다. 발현 카세트가 트란스유전자의 측면에 위치되는 항-억제자 요소들을 포함할 때, 통합 상황은 발현에 대하여 감소 효과를 갖는다. 항-억제자 요소들은 트란스유전자를 가동되지 않도록 하는 인접 이질염색질의 능력을 감소시킨다. 결과적으로, 허용가능한 발현 수준을 갖는 트란스유전자-함유 숙주세포의 비율은 증가한다. 참으로, 항-억제자 서열의 결합은, 동일한 양의 DNA가 트란스펙션될 때, 항-억제자 서열이 부족한 동일 트란스유전자와 비교하여, 최대 10배 더 많은 콜로니의 확립을 가져온다.

(2)수득량: 재조합 숙주세포의 일차 개체군에서 단백질 발현의 수준을 트란스유전자 통합 직후 조사하였다. 개체군에서 개개의 발현수준은 변한다. 그러나, 트란스유전자가 항-억제자 요소에 의해 보호되면, 가변성은 감소된다. 이 감소된 가변성은 낮은 발현 수준을 갖는 클론은 거의 회복되지 않는다는 점에서 가장 돋보인다. 더우기, 일반적으로 항-억제자 요소를 갖는 개체군은 두드러지게 높은 발현을 갖는 개체를 갖는다. 이들 고-수득 개체들은 수확을 위한, 또는 세포 또는 이와 같은 세포를 포함하는 기관의 페노타입을 변화시키기 위한 단백질의 생산에 유리하다.

(3)증가된 안정성: 항-억제자 요소들은, 연장된 배양 동안 트란스유전자가 전사적으로 가동되지 않는 것을 확실히 함으로써, 재조합 숙주세포계에서 트란스유전자의 안정성을 증가시킨다. 비교시험은 항-억제자 요소에 의해 보호되지 않는 트란스유전자가 점진적으로 작동하지 않는 조건하에서(배양 중 5~25 계대), 항-억제자 요소-보호된 트란스유전자가 고수준으로 계속 발현된다는 것을 나타낸다. 이것은 단백질성 분자의 산업적 생산중의 이점으로, 생산 중 세포 배양은 수주에서 수개월로 연장된 기간동안 계속된다. 유사하기는, 연장된 기간에 걸친 발현의 안정성은 항-억제자 보호된 트란스유전자의 재조합 발현의 결과와 마찬가지로, 변형된 페노타입을 갖는 식물 또는 동물에서 유리할 것이다.

STAR67

본 발명은 항-억제자 활성을 갖는 신규한 서열을 제공하고, 이것은 경화된(coined) STAR67(SEQ. ID. NO. 66)이었다. 이 항-억제자 서열은, 여기서 제공된 실시예로부터 증명되는 바와 같이, 관심대상 유전자의 발현을 구동하는 프로모터의 업스트림에만 존재할 때 이미 강하게 발현을 증가시키고, 반면 STAR6 또는 STAR7과 같은 지금까지 알려진 강력한 항-억제자 서열들은 이 배열에서 훨씬 덜 이점을 제공하는 것으로 나타난다(이들은 트란스유전자의 측면에 위치될 때, 즉, 트란스유전자의 업스트림과 다운스트림 모두에 존재할 때 특히 잘 작동한다).

따라서, STAR67은 이미 알려진 항-억제자 서열에 대한 대체물을 제공하고, 프로모터의 업스트림에 위치할 때 공지의 항-억제자 서열과 비교하여 증가된 이점을 갖는 것으로 보인다. STAR67은 이 특성에 관하여 시험된 다른 항-억제자들(Kwaks et al, 2003)과 반대로 인핸서-차단제가 아니고, STAR67과 앞에서 기재된 다른 항-억제자 서열 간에 또 다른 차이를 제공한다. 또한, STAR67은 실시예 7에 나타낸 바와 같이, 이-방향성 방식으로 작용할 것이다. 본 발명에 따르면, 발현 카세트에서 STAR67 서열의 존재는 개선된 예측가능성 및/또는 수득률 및/또는 발현의 안정성을 제공한다. 여기서 STAR67이 여러 프로모터와 결합하여, 다양한 세포계에서 작용한다는 것이 논증된다.

발현 카세트

STAR67을 포함하는 본 발명에 따른 핵산분자는 예를 들면, 플라즈미드와 같은 클로닝 벡터, 바람직하기는 발현벡터에 임의로 존재하는 DNA 단편과 같은 어느 포맷일 수도 있고, 예를 들면, 표준 재조합 DNA 기술을 사용하는 클로닝 목적을 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 핵산은 발현 카세트를 포함하고, 이것은 예를 들면, 숙주세포에서 관심대상 서열을 발현하는데 유용하다.

본 명세서에서 사용하는 '발현 카세트'는 발현이 요구되어지는 서열에 기능적으로 연결된 적어도 하나의 프로모터를 포함하는 핵산서열로, 발현이 요구되는 서열은 바람직하기는 관심대상 단백질의 전부 또는 일부를 암호화하는 개방형 해독틀이다. 프로모터는 바람직하기는 상기 관심대상 핵산에 대하여 이종성 프로모터이고, 그것에 의해 이종성 프로모터는 상기 관심대상 핵산의 천연 프로모터가 아닌 프로모터로서 정의된다. 다른 말로는, 인간 개입의 몇몇 형태, 예를 들면 분자 클로닝은 이종성 프로모터와 관심대상 핵산의 기능적 결합을 이루기 위한 어느 시점에 사용되고, 문맥에서 이것은 이종성 프로모터가 관심대상 서열과 같거나 또는 다른 기관으로부터 유래될 수 있다는 것임을 쉽게 이해할 수 있다. 바람직하기는, 발현 카세트는 추가로 전사 말단 및 폴리아데닐화 서열을 함유한다. 인핸서와 같은 다른 조절 서열이 포함될 수 있다. 본 발명에 따른 발현 유니트는 STAR67와 같은, 적어도 하나의 항-억제자 서열을 추가로 포함한다. 특정 바람직한 구현예에서, 상기 항-억제자 서열, 바람직하기는 STAR67는 상기 프로모터의 업스트림에 놓이고, 바람직하기는 2kb 미만이 항-억제자 서열의 3'말단과 프로모터 서열의 시작 사이에 존재한다. 바람직한 구현예에서, 1kb 미만, 더욱 바람직하기는 500 뉴클레오티드(nt) 미만, 더욱 바람직하기는 약 200, 100, 50 또는 30 nt 미만은 항-억제자 서열의 3'말단과 프로모터 서열의 시작 사이에 존재한다. 특정 바람직한 구현예에서, 항-억제자 서열은 프로모터의 업스트림에 직접 클론되어, 항-억제자 서열과 프로모터 서열의 시작 사이는 겨우 약 0~20nt가 된다.

재조합 단백질을 암호화하는 핵산서열의 발현을 얻기 위해, 당업자에게는 이와 같은 발현을 구동할 수 있는 서열이 단백질을 암호화하는 핵산 서열에 기능적으로 연결될 수 있고, 발현가능 포맷의 재조합 단백질을 암호화하는 재조합 핵산분자를 가져온다는 것이 잘 알려져 있다. 일반적으로, 프로모터 서열은 관심대상 단백질을 암호화하는 서열의 업스트림에 위치한다. 유용한 발현 벡터들은 선행기술에서 이용가능하고, 예를 들면 인비트로겐(Invitrogen)의 pcDNA 및 pEF 벡터 시리즈, BD Science의 pMSCV 및 pTK-Hyg, Stratagene의 pCMV-Script 등이다.

관심대상 폴리펩티드를 암호화하는 서열이 암호화된 폴리펩티드의 전사 및 번역을 관리하는 서열에 관하여 삽입되어지는 경우, 생성된 발현 카세트는 발현으로 불리는, 관심대상 단백질의 생산에 유용하다. 발현을 구동하는 서열은 프로모터, 인핸서 등 및 그들의 결합물을 포함할 수 있다. 이들은 숙주세포에서 작용하고, 그것에 의해 그들에 기능적으로 연결된 핵산 서열의 발현을 구동할 수 있어야 한다. 본 분야의 당업자는 숙주세포에서 관심대상 유전자의 발현을 얻기 위해 여러가지 프로모터를 사용할 수 있다는 것을 알고 있다. 프로모터는 본질적이거나 또는 조절될 수 있고, 바이러스, 원핵생물, 또는 진핵생물 근원 또는 인공적으로 고안된 것을 포함하는, 여러 근원으로부터 얻어질 수 있다. 관심대상 핵산의 발현은 천연 프로모터 또는 그것의 유도체로부터 또는 완전히 이종성 프로모터로부터 일 수 있다(Kaufman, 2000). 몇몇 잘 알려지고 진핵세포에서 발현을 위해 많이 사용되는 프로모터들은 아데노바이러스와 같은 바이러스로부터 유래된 프로모터, 예를 들면 E1A 프로모터, CMV 급성 초기(immediate early:IE) 프로모터(이후 CMV 프로모터로 불린다)와 같은 사이토메칼로바이러스(CMV)로부터 유래된 프로모터(예를 들면, pcDNA, Invitrogen으로부터 얻을 수 있다), Simian 바이러스 40(SV40)(Das et al, 1985)로부터 유래된 프로모터 등을 포함한다. 적절한 프로모터는 메탈로티오네인(MT) 프로모터, 신장 인자 1α(EF-1α) 프로모터(Gill et al., 2001), 유비퀴틴 C 또는 UB6 프로모터(Gill et al., 2001; Schorpp et al., 1996), 액틴 프로모터, 면역글로불린 프로모터, 열쇼크 프로모터 등과 같이, 진핵세포로부터 유래될 수 있다. 진핵세포에서 발현을 얻기 위한 몇몇 바람직한 프로모터들은 본 발명에서 바람직한 프로모터이고, CMV- 프로모터, 포유동물 EF-1-알파 프로모터, 유비퀴틴 C 프로모터와 같은 포유동물 유비퀴틴 프로모터 또는 SV40 프로모터(예를 들면, pIRES cat.no.631605, BD Sciences로부터 얻을 수 있다)이다. 프로모터 기능 및 프로모터의 강도를 시험하는 것은 당업자에게는 일상적인 문제이고 일반적으로 예를 들면, 프로모터 서열 뒤에 lacZ, 루시퍼라제, GFP 등과 같은 시험 유전자를 클로닝하는 것 및 시험 유전자에 대한 발현을 시험하는 것을 포함한다. 물론, 프로모터는 신규의, 감독된 또는 개선된 프로모터 서열을 찾기 위해, 그 안의 서열의 결실, 첨가, 돌연변이에 의해 변경되고, 기능성에 대해 시험될 수 있다

본 발명에 따른 발현 카세트는 단일시스트론성, 이-시스트론성 또는 다중시스트론성일 수 있다. "이-시스트론성 유전자"라는 용어는 2개의 단백질/폴리펩티드를 암호화하는 RNA 분자를 제공할 수 있는 유전자로 정의된다. "단일 시스트론성 유전자"라는 용어는 하나의 단백질/폴리펩티드를 암호화한 RNA 분자를 제공할 수 있는 유전자로 정의된다. "다중시스트론성 유전자"라는 용어는 2개 이상의 단백질/폴리펩티드를 암호화하는 RNA 분자를 제공할 수 있는 유전자로 정의되고, 그러므로 이-시스트론성 유전자는 다중시스트론성 유전자의 정의에 포함된다. 본 발명에서 사용되는 "유전자"는 염색체 DNA, cDNA, 인공 DNA, 그들의 결합물 등을 포함할 수 있고, 또한 다른 핵산, 예를 들면 RNA의 형태일 수 있다. 특정 구현예에서, 단백질 발현 유니트는 다중시스트론성 유전자를 포함한다. 여러 개의 시스트론을 포함하는 유니트는 단일 mRNA로 전사될 수 있다. 그 RNA에 존재하는 제2 및 추가의 코딩 영역의 번역은, 번역 재개시부위 또는 내부 리보솜 엔트리 부위의 사용을 포함하여, 여러 방법으로 달성될 수 있고, 후자가 바람직하다. 이- 또는 다중-시스트론성 유니트의 이점은, 선택적 마커 단백질을 암호화하는 핵산을 관심대상 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산의 다운스트림에 위치시킴에 의해, 관심대상 단백질을 발현하는 클론의 선택이 용이한 것이다.

다중결합 단백질의 생산을 위해, 2개 이상의 발현 카세트가 사용될 수 있다. 이 구현예는, 예를 들면 항체의 중사슬 또는 경사슬의 발현에 양호한 결과를 제공하는 것이 증명되었다. 본 발명에 따라, 적어도 하나의 발현 카세트, 그러나 바람직하기는 그들 각각은 STAR 서열을 포함하여야 한다. 또 다른 구현예에서, 다중결합 단백질의 다양한 서브유니트 또는 일부는 단일 발현 카세트에 존재한다.

발현 카세트에서 프로모터의 업스트림에 위치한 항-억제자 서열의 존재 대신 또는 그에 더하여, 발현 카세트의 양쪽 측면에 항-억제자 서열을 제공하는 것이 매우 유리하다는 것이 증명되었고, 트란스유전자를 포함하는 발현 카세트는 2개의 항-억제자 서열이 측면에 놓이고, 이것은 특정 구현예에서 본질적으로 서로 동일하다. 물론, 이것은 2개의 STAR67 서열이 측면에 위치된 발현 카세트를 얻기 위해, STAR67로 실시될 수도 있다. 발현 카세트에서 단일 STAR67 서열의 선택적 위치, 예를 들면 트란스유전자 뒤, 바람직하기는 전사 말단과 트란스유전자를 향하여 STAR67 서열의 3'말단을 갖는 폴리아데닐화 시그널 뒤 등이 또한 가능하다.

본 발명에 따른 발현 카세트는 임의로 선택 마커 유전자를 포함할 수 있다. "선택 마커 또는 선택적 마커"라는 용어는 전형적으로 그의 존재가 세포 중에서 직접 또는 간접적으로 검출될 수 있는 유전자 및/또는 단백질, 예를 들면, 선택 시약을 불활성화시키고 약제의 치사 또는 성장-억제 효과로부터 숙주세포를 보호하는 유전자 및/또는 단백질(예를 들면, 항생물질 내성 유전자 및/또는 단백질)을 말한다. 또 다른 가능성은 상기 선택 마커가 형광 또는 색 침착(예를 들면, 녹색형광 단백질 및 유도체, 루시페라제, lacZ, 알칼리성 포스파타제 등)을 유도하는 것이다. 특정 구현예에서, 본 발명에 사용되는 선택 마커는 제오신이고, 제2 발현 카세트를 선택하기 위해 퓨로마이신이 사용된다. 당업자는 다른 선택 마커, 예를 들면 네오마이신, 블라스티시딘, 퓨로마이신, 브레오마이신, 하이그로마이신, dhfr 등이 이용가능하고 사용될 수 있다는 것을 알 것이다.

용어 "선택"은 통상적으로 선택 마커/선택적 마커 및 선택 약제를 특이적 유전적 특성(예를 들면, 숙주세포는 그것의 게놈에 통합된 트란스유전자를 함유한다)을 갖는 숙주세포를 동정하는데 사용하는 공정으로 정의된다. 본 발명의 당업자에게 있어서, 수많은 선택 마커들의 조합이 가능하다는 것은 명백하다. 가능한 항생물질의 예가 앞에서 제공된다. 특히 유리한 항생물질은 제오신으로, 제오신-내성 단백질(제오신-R)은 약물과 결합하여 작용하고 그것을 무해하게 하기 때문이다. 그러므로, 고-발현자가 생존하도록 허용하면서, 낮은 수준의 제오신-R 발현을 갖는 세포를 죽이는 약물의 양을 적정하는 것이 용이하다. 통상적으로 사용되는 모든 다른 항생물질-내성 단백질은 효소이고, 그러므로 (약물과 1:1이 아니라) 촉매적으로 작용한다. 그러므로, 두 단계 선택이 실시될 때 항생물질 내성 단백질과 작용의 1:1 결합 모드로 이것을 사용하는 것이 유리하다. 그러므로, 항생물질 제오신은 바람직한 선택 마커이다. 편리함을 위해, 제오신 항생물질은 두-단계 선택법에서 예를 들면, 퓨로마이신, 블라스티시딘 또는 하이그로마이신과 결합될 수 있고, 이것은 예를 들면 단일시스트론성 유전자로 존재할 수 있다.

또한, 항생물질 선택 마커를, 형광 유도를 제공하는 또는 색 침착을 제공하는 선택 마커와 결합시키는 것이 가능하다. 다양한 프로모터들이, 그들이 사용되는세포에서 작용성인 한, 사용될 수 있다.

특정 구현예에서, 발현 카세트는, 예를 들면 관심대상 단백질의 개방형 해독틀과 선택마커 개방형 해독틀 사이에 감소된 번역 효율을 갖는 단백질 번역 개시 부위의 예로서 (약한) 내부 리보솜 결합부위(IRES)를 제공한다. IRES 요소로부터 단백질의 번역은 캡-의존성 번역보다 덜 효율적이다: IRES-의존 개방형 해독틀(ORFs)로부터의 단백질 양은 첫번째 ORF로부터의 단백질 양의 20% 미만 ~ 50%의 범위이다(Mizuguchi et al., 2000). 더우기, IRES 요소의 돌연변이는 그것의 활성을 감쇠시키고 IRES-의존 ORFs으로부터의 발현을 첫번째 ORF의 10% 미만으로 낮춘다(Lopez de Quinto & Martinez-Salas, 1998, Rees et al., 1996). IRES-의존 ORF가 선택적 마커 단백질을 암호화될 때, 그것의 번역의 낮은 단계는 전사의 높은 절대 수준이 선택되어질 재조합 숙주세포를 위해 적절히 발생되어야 한다는 것을 의미한다. 그러므로, 선택된 재조합 숙주세포 분리물은 필요에 따라 많은 양의 트란스유전자 mRNA를 발현할 것이다. 재조합 단백질은 캡-의존 ORF로부터 번역되기 때문에, 높은 생산 수득률로 풍부히 생산될 수 있다.

통상의 발현 시스템은 재조합 플라즈미드 또는 재조합 바이러스성 게놈의 형태의 DNA 분자이다. 플라즈미드 또는 바이러스성 게놈은 (진핵 숙주)세포에 도입되고 바람직하기는 공지의 방법으로 그들의 게놈으로 통합된다. 바람직한 구현예에서, 본 발명은 또한 그것의 개선된 트란스유전자 발현 시스템을 전달하기 위해 이러한 형태의 DNA 분자를 사용한다. 본 발명의 바람직한 구현예는 발현 시스템의 전달을 위해 플라즈미드 DNA를 사용하는 것이다. 플라즈미드는 많은 성분들을 함유한다: 본 분야에 알려진 통상의 성분들은, 세균성 세포에서 플라즈미드의 증식을 위한 복제의 기원 및 선택적 마커; 통합된 트란스유전자 발현 시스템을 수행하는 숙주세포를 동정하고 분리하기 위해 진핵 세포에서 작용하는 선택적 마커; 관심대상 단백질을 암호화하는 핵산, 그것의 고수준 전사는 진핵세포에서 작용성인 프로모터에 의해 일어난다(예를 들면, 인간 사이토메갈로바이러스 주요 급성초기 프로모터/인핸서, pCMV(Boshart et al., 1985)); 관심대상 트란스유전자와 선택적 마커를 위한 전사적 터미네이터(예를 들면, SV40 폴리아데닐화 부위(Kaufman & Sharp, 1982))이다. 사용된 벡터는 DNA를 암호화하는데 적당한 어느 벡터일 수 있고 관심대상 핵산의 전사에 대해 사용될 수 있다. 숙주세포가 사용될 때, 벡터는 통합 벡터인 것이 바람직하다. 선택적으로, 벡터는 에피솜적으로 복제된 벡터일 수 있다.

발현 카세트의 가능한 배열의 몇몇 비-제한적이고 대략적인 표현을 도 1에 나타내었다. 이것은 플라즈미드에서 및 게놈으로의 통합 후의 발현 카세트의 DNA 요소의 배열이다. 구조물 A는 단백질(게놈)을 암호화하는 개방형 해독틀을 에워싸는 발현 유니트를 함유한다. 이것은 감독된 EMCV IRES(Martinez-Salas et al 1999; Mizuguchi et al 2000; Rees et al 1996), 및 제오신 내성 선택적 마커 단백질(zeo)를 암호화하는 개방형 해독틀의 업스트림이다. 유전자 카세트는 그들의 3' 말단에서 SV40 전사적 터미네이터(t)를 갖는다. 이-시스트론성 트란스유전자는 CMV 프로모터로부터 고수준으로 전사된다. 구조물 B는 구조물 A로부터 유도되지만, STAR67이 CMV 프로모터의 업스트림에 클론된다. 구조물 C는 구조물 B로부터 유도되지만, 두 개의 항-억제자 요소(이 경우, STAR7)가 전체 카세트의 측면에 클론된다.

발현 카세트에서 항-억제자 서열의 결합

프로모터의 제1 항-억제자 요소 업스트림과 두 개의 다른 항-억제자 서열에 의한 발현 카세트의 측면 배치의 결합은 뛰어난 결과를 제공한다는 것을 나타내었다. 특히, SV40 프로모터가 CHO 세포에 사용될 때, 발현은 항-억제자 서열의 부재하에서 이미 매우 높지만, 상기 프로모터의 상부에 STAR67이 위치하면 상당히 강화되고 전체 발현 카세트는 STAR6, STAR7 또는 STAR 40과 같은 두 개의 항-억제자 요소가 측면에 놓인다.

그러므로, 본 발명의 목적은, (5'에서 3'로) 항-억제자 서열 A-프로모터 - 관심대상 단백질을 암호화하는 핵산 - 항-억제자 서열 B를 포함하는 발현 카세트를 포함하고, 상기 발현 카세트는 추가로 상기 항-억제자 서열 A와 B 사이에 항-억제자 서열 C를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 핵산 분자를 제공하는 것이다. 바람직한 구현예에서, 상기 항-억제자 서열 C는 '발현 카세트'라는 표제 아래, 상기와 같은 배열로 상기 프로모터의 업스트림에 존재한다. 항-억제자 서열 A와 B 사이의 발현 카세트는 발현카세트에 대하여 상기된 바와 같은 요소들, 예를 들면, 전사 터미네이터 서열, 폴리아데닐화 시그널, 선택 마커 유전자, 인핸서 등을 추가로 포함할 수 있고, 상기와 같이 단일시스트론성, 이-시스트론성 또는 다중시스트론성일 수 있다.

3개의 항-억제자 서열 A, B 및 C 중 두 개 또는 모두는 동일할 수 있고, 또는 3개 모두 다를 수 있다. 항-억제자 서열 A 및 B는 항-억제자 서열 C와 같거나 또는 다를 수 있다. 특정 구현예에서, 항-억제자 서열 A와 B는 (본질적으로) 서로 동일하다. 한 구현예에서, 항-억제자 서열 C는 STAR67이거나, 그것의 기능적 단편 또는 유도체이다. 항-억제자 서열 A 및 B는 어느 항-억제자 서열일 수 있고, 어느 특정 구현예에서 SEQ ID. NO. 1~65 또는 그것의 기능적 단편 또는 유도체 중 하나를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 발현 카세트는 다중시스트론성 유전자를 함유하고, 그것의 바람직한 구현예에서 상기 다중시스트론성 유전자는 관심대상 단백질을 암호화하는 서열과 선택 마커 유전자를 포함한다. 선택적으로, 선택 마커 유전자는 개별적인 프로모터의 조절하에 존재한다.

특정 구현예에서, 제4의 항-억제자 서열 D가 STAR 서열 A와 B 사이에 존재할 수 있다. 이와 같은 구현예에서, 상기 항-억제자 서열 D는 바람직하기는 관심대상 단백질을 암호화하는 핵산의 다운스트림에 위치된다. 또한, 이 항-억제자 서열 D는 재조합 핵산 분자에서 다른 항-억제자 서열과 같거나 또는 다를 수 있고, 이것은 어느 항-억제자일 수 있고, 특정 구현예에서 SEQ. ID. NO. 1~66 중 어느 하나 또는 그들의 단편 또는 유도체일 수 있다.

적어도 몇몇의 항-억제자 서열은 방향성일 수 있고(WO 00/004704), 발현카세트의 측면에 위치하는 항-억제자 서열(항-억제자 서열 A 및 B)은 유리하기는 서로의 반대 방향에 위치되어, 이들 항-억제자 서열의 각각의 3' 말단이 발현 카세트(및 서로에 대하여) 내부로 향할 수 있다. 그러므로, 바람직한 구현예에서, 항-억제자 요소는 트란스유전자에 대한 효과가 상기 항-억제자 요소에 의해 사라지는 DNA/염색질을 향한다. 발현 카세트에서 프로모터의 항-억제자 서열 업스트림의 경우, 3' 말단은 프로모터를 향한다. 서열 리스트에서 항-억제자 요소(SEQ ID NOs. 1-66)의 서열은 다른 언급이 없는 한, 5'에서 3'의 방향으로 제공된다.

본 발명에 따른 세포

본 발명에 따른 STAR 서열 및/또는 발현 벡터를 포함하는 핵산 분자는 바람직하기는 숙주세포에서 핵산의 발현을 개선하기 위해 사용될 수 있다. 용어 "세포"/"숙주세포" 및 "세포계/"숙주세포계"는 각각 통상적으로 세포 및 본 분야의 방법에 의해 세포 배양물에 유지될 수 있고, 이종성 또는 동종성 단백질을 발현할 수 있는 그들의 동질성 집단을 정의한다. 본 발명에 따른 숙주세포는 진핵세포, 더욱 바람직하기는 설치류세포 또는 인간세포와 같은 포유동물 세포 또는 다른 세포들 간의 융합물이다. 특정의 비-제한적인 구현예에서, 상기 숙주세포는 U-2 OS 오스테오사르코마, CHO(차이니즈 햄스터 난소), HEK 293, HuNS-1 골수종, WERI-Rb-1 망막아세포종, BHK, Vero, 비-분비성 마우스 골수종 Sp2/0-Ag 14, 비-분비성 마우스 골수종 NS0, NCI-H295R 아드레날 분비기관 암 또는 PER.C6^® 세포이다.

본 발명의 특정 구현예에서, 숙주세포는 적어도 아데노바이러스의 E1A, 바람직하기는 또한 E1B를 발현시키는 세포이다. 비-제한적인 예로서, 이와 같은 세포는 예를 들면 인간세포, 예를 들면 신장(예: HEK 293 세포, Graham et al, 1997 참조), 폐(예: A549, 예를 들면, WO 98/39411 참조) 또는 망막(예:상품명 PER.C6^®로 시판되는 HER 세포, 미국특허 5,994,128 참조), 또는 양막세포(예를 들면, N52.E6, 미국특허 6,558,948), 및 다른 세포로부터 유래될 수 있다. 이와 같은 세포를 얻기 위한 방법은 예를 들면, 미국특허 5,994,128 및 미국 특허 6,558,948에 기재되어 있다. 본 출원의 목적을 위한 PER.C6® 세포는 ECACC no. 96022940으로 기탁된 세포의 업스트림 또는 다운스트림 계대접종 또는 업스트림 또는 다운스트림 계대접종의 자손으로부터의 세포를 의미한다. 이와 같은 세포는 고수준으로 단백질의 발현이 가능하다는 것이 앞에서 기재되어 있다(예를 들면, WO 00/63404, 및 Jones et al, 2003).

본 발명에 따른 원하는 단백질을 발현하는 숙주세포는 바람직하기는 본 발명에 따른 발현 카세트의 형태의 핵산 분자를 세포에 도입함으로써 얻어질 수 있다. 선택적인 구현예에서, STAR67 서열은 게놈, 예를 들면 임의로 상기 유전자의 발현을 조절하기 위해 상기 유전자의 업스트림을 표적으로 하는 이종성 프로모터의 조절하에, 천연적으로 생산된 유전자인 관심대상 유전자의 발현을 개선하기 위한 염색체 영역으로의 통합을 위해 표적된다.

바람직하기는 숙주세포는 본 분야의 당업자에게 알려진 표준 방법에 따라 선택되고 증식될 수 있는 안정한 클론으로 만들어진다. 이와 같은 클론의 배양은 관심대상 재조합 단백질을 생산할 수 있다. 본 발명에 따른 세포는 무혈청 배지에서 현탁 배양물 중에 성장할 수 있다.

본 발명에 따른 관심대상 단백질은 어느 단백질일 수 있고, 모노머성 단백질 또는 다중결합 단백질일 수 있다. 다중결합 단백질은 적어도 2개의 폴리펩티드 사슬을 포함한다. 본 발명에 따른 관심대상 단백질의 비-제한적인 예는 효소, 호르몬, 면역글로불린 사슬, 항암 단백질과 같은 치료적 단백질, Factor Ⅷ과 같은 혈액 응집 단백질, 에리트로포이에틴과 같은 다기능성 단백질, 진단용 단백질 또는 백신화 목적에 유용한 단백질들 또는 그들의 단편이고, 모두 본 분야의 당업자에게 알려져 있다.

특정 구현예에서, 본 발명의 발현 카세트는 면역글로불린 중사슬 또는 경사슬 또는 그들의 항원결합부, 유도체 및/또는 동종체를 암호화한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 단백질 발현 유니트가 제공되고, 여기서 상기 관심대상 단백질은 면역글로불린 중사슬이다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 단백질 발현 유니트가 제공되고, 여기서 상기 관심대상 단백질은 면역글로불린 경사슬이다. 이들 2개의 단백질 발현 유니트가 동일한 (숙주)세포 내에 존재하면, 다중결합 단백질과 더욱 구체적으로는 항체가 조립된다. 따라서, 특정 구현예에서, 관심대상 단백질은 항체와 같은 면역글로불린이고, 이것은 다중결합 단백질이다. 바람직하기는, 이와 같은 항체는 인간 또는 인간화 항체이다. 그것의 특정 구현예에서, 이것은 IgG, IgA 또는 IgM 항체이다. 면역글로불린은 다른 발현 카세트에서, 또는 단일 발현 카세트에서 중사슬 및 경사슬에 의해 암호화될 수 있고, 여기서 각 개별 사슬을 암호화하는 유전자는 단일시스트론성 전자 유니트에서 개별적인 프로모터의 조절하에 있거나 또는 선택적으로는 두 사슬은 다중시스트론성 유전자 상에서 암호화될 수 있다.

관심대상 단백질은 어느 기원일 수 있고, 특정 구현예에서 포유동물 단백질, 인공 단백질(예를 들면, 융합 단백질 또는 돌연변이 단백질)이고, 그리고 바람직하기는 인간 단백질이다.

당연히, 본 발명의 항-억제자 서열 및 발현 카세트의 배열은 궁극적 목적이 단백질의 생산이 아니라, 예를 들면 발현 카세트로부터 RNA의 증가된 양을 생산하기 위한 RNA 자체의 생산일 때에도 사용될 수 있고, 이것은 다른 유전자 조절(예를 들면, RNAi, 안티센스 RNA), 유전자 치료법, 인비트로 단백질 생산 등의 목적을 위해 사용될 수 있다.

관심대상 단백질의 생산방법

한 면에서, 본 발명은 숙주세포에 본 발명에 따른 핵산분자 또는 발현 카세트를 제공하고, 세포를 배양하고 그리고 관심대상 서열을 발현함에 의한, 관심대상 서열을 발현하고, 바람직하기는 관심대상 단백질을 암호화하는 방법을 제공한다.

"발현"이라는 용어는 통상적으로 특정 RNA 산물 또는 산물들, 또는 특정 단백질 또는 단백질들을 세포에서 생산하는 것을 말한다. RNA 산물의 경우, 이것은 전사과정을 말한다. 단백질 산물의 경우, 이것은 전사, 번역 및 임의로 후-번역 변형(예를 들면, 글리코실화, 이황화결합 형성 등)의 공정을 말한다. 분비된 단백질의 경우, 이것은 전사, 번역, 및 임의로 후-번역 변형, 이어서 분비의 과정을 말한다.

세포 내에서 발현되어질 핵산의 도입은 여러 방법 중 하나로 실시될 수 있고, 이것은 본 분야의 당업자에게 알려진 것으로, 또한 도입되어질 핵산의 포맷에 의존한다. 상기 방법은 트란스펙션, 감염, 주입, 형질전환 등을 포함하지만, 그것으로 제한되는 것은 아니다.

세포를 배양하는 것은 세포가 신진대사, 및/또는 성장 및/또는 분할 및/또는 관심대상 재조합 단백질의 생산을 위해 실시된다. 이것은 당업자에게 공지된 방법으로 수행될 수 있고, 세포에 영양을 제공하는 것을 포함하지만, 이것으로 제한되는 것은 아니다. 방법은 표면에 부착된 성장, 현탁물 중 성장, 또는 그들의 조합을 포함한다. 배양은 예를 들면, 접시, 롤러병 또는 생물반응기에서, 배치, 공급-배치(fed-batch), 관류 시스템과 같은 연속 시스템 등을 사용하여 행한다. 세포 배양을 통한 재조합 단백질의 대량생산을 얻기 위해, 현탁액 중에 성장할 수 있는 세포를 갖는 것이 바람직하고, 동물- 또는 인간-유래 혈청 또는 동물- 또는 인간-유래 혈청 성분이 없이 배양될 수 있는 것이 바람직하다.

세포를 성장 또는 증식하기 위한 조건(Tissue Culture, Academic Press, Kruse and Paterson, editors(1973)) 및 재조합 산물의 발현을 위한 조건은 본 분야에 잘 알려져 있다. 일반적으로, 포유동물 세포 배양물의 생산성을 최대로 하기위한 원리, 프로토콜, 실질적 기술은 Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach(M. Butler, ed., IRL Press, 1991)에서 찾을 수 있다.

바람직한 구현예에서, 발현된 단백질은 세포로부터 또는 배양 매질로부터 또는 모두로부터 수집(분리)된다. 그리고 나서, 공지의 방법, 예를 들면, 여과, 칼럼 크로마토그래피 등 당업자에게 일반적으로 알려진 방법을 이용하여 추가로 정제된다.

새로운 선택법

본 발명은 관심대상의 2개의 폴리펩티드를 발현하는 숙주세포를 생산하기 위한 신규한 방법을 개시하고, 이 방법은 놀라운 결과를 제공하는데, 항-억제자 서열의 사용없이 콜로니가 나타나지 않거나 또는 거의 나타나지 않고, 반면, 항-억제자 서열의 존재는 클론이 선택에서 살아남도록 하고, 일반적으로 이들 클론은 관심대상 폴리펩티드를 고수준으로 발현시킨다(실시예 7, 도 11). 그러므로 본 발명은 관심대상의 두 폴리펩티드를 발현하는 숙주세포를 생성하는 방법을 제공하고, 상기 방법은: a)숙주세포에 하나 이상의 핵산 분자를 도입하고, 여기서 핵산 분자 또는 분자들은 함께:(ⅰ)관심대상인 제1 폴리펩티드 및 제1 선택적 마커 유전자를 암호화하는 서열에 기능적으로 연결된 폴리머, 및 (ⅱ) 관심대상 제2 폴리펩티드 및 제2 선택적 마커 유전자를 암호화하는 서열에 기능적으로 연결된 프로모터, 및 (ⅲ) (a) SEQ ID NO 1~65의 어느 하나, (b) SEQ ID NO.1~66의 어느 하나의 단편, (c) (a) 및 (b)와 적어도 70%가 동일하고 항-억제자 활성을 갖는 서열, 및 (d)(a)~(c) 중 어느 하나의 상보체로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 항-억제자 서열을 포함하고; b)상기 제1 및 제2 선택적 마커 유전자의 발현을 위해 필수적으로 동시에 선택함에 의해 숙주세포를 선택하는 것을 포함한다. 선택된 숙주세포는 상기 선택된 숙주세포를 배양함에 의해, 상기 2개의 폴리펩티드의 발현을 위해 편리하게 사용될 수 있다. 한 구현예에서, 하나는 (ⅰ)을 함유하고 다른 하나는 (ⅱ)를 함유하는 2개의 핵산분자가 숙주 세포에 도입되도록 사용된다. 이 구현예에서, 각 핵산 분자는 바람직하기는 적어도 하나의 항-억제자 서열을 함유한다. 다른 구현예에서, (ⅰ)과 (ⅱ)를 모두 함유하는 단일 핵산 분자가 사용되고, 이것은 그리고나서 적어도 하나의 상기 항-억제자 서열을 함유해야 한다. 단일 핵산 분자에 2개의 폴리펩티드를 위한 암호화 서열을 갖는 이점은 핵산 분자가 세포에 도입되기 전에 오직 하나의 핵산 분자가 요구된다는 것이다. 더우기, 이와 같은 구현예에서, 단일 통합 사상은 두 폴리펩티드의 코딩 서열에 충분하고, 그것에 의해 제1 폴리펩티드를 암호화하는 핵산이 다른 위치에 통합되거나 또는 제2 폴리펩티드를 암호화하는 것과 다른 사본 수로 병합되는 가능성을 제거한다. 바람직한 구현예에서, 상기 2개의 폴리펩티드는 면역글로불린과 같은 다중결합 단백질의 일부를 형성할 수 있다. 그러므로 이 방법은 특히 항체의 발현에 적당하다. 두 개의 프로모터는 동일하거나 또는 다르고, 위에 기재된 바와 같은 어느 프로모터일 수 있다. 단일 핵산 분자가 (ⅰ)과 (ⅱ) 모두를 함유하는 구현예가 사용될 때, 단일 핵산 분자에서 두 전자 유니트의 방향은, 예를 들면 둘 다 같거나, 반대로 서로 마주보는 방향이거나 또는 반대로 서로 바깥을 향하는 방향일 것이다. 후자의 경우, 항-억제자 서열은 두 프로모터 사이에 놓일 것이다(도 11B 참조). 본 발명의 이 면에서 적절한 항-억제자 서열은 SEQ ID NO. 66이고(실시예 7 참조), 다른 항-억제자 서열은 마찬가지로 작용할 것이다. 이것은 당업자에 의해 본 명세서의 개시를 사용하여 쉽게 시험될 수 있고, 그러므로 본 발명의 이 면에 따른 다른 항-억제자 서열의 사용은 본 발명의 범위에 속한다. 더우기, 항-억제자 서열은 전사 유니트의 한 측면 또는 양 측면에 첨가될 수 있다. 마커 유전자는 서로 달라야 하고, 예를 들면, 위에서 기재된 바와 같은 마커 유전자로부터 선택될 수 있다. 특정 구현예에서, 하나의 선택적 마커는 제오신이고, 다른 선택적 마커는 예를 들면 퓨로마이신이다. 그러나, 다른 조합이 사용될 수 있고 이들이 본 발명의 범위 내라는 것은 분명하다. 마커의 발현은 바람직하기는 관심대상 폴리펩티드의 발현에 의존해야 한다. 이것은 마커 유전자의 발현이 상기와 같이, 예를 들면 IRES 서열을 갖는 다중시스트론성 유전자의 것에 결합됨에 의해 확립될 수 있다. "필수적으로 동시" 선택은 적어도 얼마동안, 바람직하기는 적어도 1일, 더욱 바람직하기는 적어도 2일, 더욱 바람직하기는 적어도 5일에 두 개의 선택 시약이 존재한다는 것을 의미하고, 이것은 두 개의 선택 시약이 동시에 배지에 첨가되거나 또는 두 개의 선택 약제를 포함하는 배지에 첨가됨에 의해 이루어진다(실시예 7). 제1 선택 약제가 이미 존재할 때 수시간 또는 수일 후 배지에 제2 선택 약제를 첨가하는 것은 여전히 본 발명의 본질적으로 동시 선택의 의미에 속한다. 이 상황은 세포가 처음 제1 선택 약제로 선택되고, 그리고 일단 콜로니가 형성되면 세포가 새로운 매질에서 제2 약제에 대해 선택되고 제1 약제는 첨가되지 않는 상황과 구별된다(연속 선택, 예를 들면, 실시예 5 및 WO 03/106684). 두 선택 마커를 본질적으로 동시에 선택함에 의해, 빠르고 강한 선택이 제공된다는 것이 놀랍게도 나타났고, 그것에 의해, 많은 저-생산 콜로니들이 제거되고, 바람직한 발현 특성을 갖는 콜로니를 발견하기 위한 작업하중을 크게 감소시킨다. 이것은 특히 고발현 수준을 갖는 원하는 클론이 동정되기 전에, 많은, 통상적으로 수백 또는 수천 개의 콜로니를 스크린하여야 하는 생물공학 분야에서 유리하다.

이에 더하여, 시스템은 항-억제자 요소, 적어도 STAR67, 그러나 또한 그들이 이 세팅에서 작용성에 대해 기능할 때 다른 항-억제자 서열의 일부를 시험할 수 있는 가능성을 제공한다. 많은 경우에 거의 또는 심지어 완전한 흑백 차이를 제공하는 이 용이한 스크린은, 그러므로, 항-억제자 서열에서 기능부 또는 유도체를 동정하고 및/또는 신규 항-억제자 서열을 특징화하는데 기여할 것이다. 스크린은 신규의 항-억제자 및/또는 발현-강화 서열을 찾는데 사용될 수도 있다(이런 타입의 스크린은 항-억제자 활성에 대해 그러나 오히려 발현-강화 활성에 대해 완전하게 스크린하지 않으므로, 후자를 갖지만 전자의 활성은 갖지 않는 서열이 발견되지 않을 가능성이 있다). 그러므로, 본 발명의 다른 면은 항-억제자 및/또는 발현-강화 서열, 또는 그것의 기능적 단편 또는 유도체를 동정하는 방법을 제공하는 것으로, 상기 방법은: a) 숙주세포에 하나 이상의 핵산 분자를 도입하고, 상기 핵산 분자 또는 분자들은 함께:(ⅰ)제1 선택 마커 유전자에 기능적으로 연결된 프로모터 및 (ⅱ)제2 선택 마커에 기능적으로 연결된 프로모터, 및 (ⅲ) 항-억제자 및/또는 발현-강화 활성에 대해 시험되어질 적어도 하나의 서열을 포함하고; b) 상기 제1 및 제2 선택적 마커 유전자의 발현을 위해 본질적으로 동시에 선택됨에 의해 숙주세포를 선택하는 것을 포함한다. 이 스크린을 살아남은 숙주세포는 기능적 항-억제자 및/또는 발현-강화 요소를 함유하는 것으로 보인다. 이것은 그리고 나서, 예를 들면, 그것의 서열을 결정하고 및/또는 상기와 같은 항-억제자 활성에 대한 다른 기능적 시험에 의해 쉽게 더욱 분석된다. 한 구현예에서, (ⅰ)과 (ⅱ) 모두는, 예를 들면, 그 사이에 시험되어질 서열이 분석을 위해 클론될 수 있는 갈라진 프로모터(외부를 향하는 제1 및 제2 선택 마커 유전자)를 갖는 하나의 핵산 분자 상에 있다. 바람직하기는 상기 선택성 마커 유전자들은, 예를 들면, 선택적 마커 유전자를 직접 구동하는 비교적 약한 프로모터를 사용함에 의해, 또는 예를 들면, 전사용 강한 프로모터 및 마커 유전자 번역용 IRES, 바람직하기는 비교적 약한 IRES를 사용함에 의해, 고도로 발현되지 않고, 여기서 비교적 약한 프로모터는 당업자에게 알려져 있고 및/또는 당업자에게 알려진 일반적인 방법으로 동정될 수 있다. 마커 유전자는 또한 편리하기는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열의 다운스트림에 놓일 수 있고, 예를 들면 IRES에 의해 다중시스트론성 유전자에서 그것의 발현에 연결될 수 있다(실시예 7, 가능한 배열은 도 11 참조). 이와 같은 폴리펩티드는 또한 관심대상 폴리펩티드일 수 있으므로, 관심있는 폴리펩티드의 발현을 위한 유용한 클론이 직접적으로 얻어지고, 그러나 또한 스크린 목적을 위해 발현이 쉽게 정량화되는 마커, 예를 들면 GFP 또는 그것의 유도체, SEAP, lacZ, 루시퍼라제 등일 수 있다. 이와 같은 조합에서, 폴리펩티드의 발현은, 동시 선택동안 충분한 클로니를 제공하고 또한 높은 전사 수준을 제공하는 항-억제자 및/또는 발현-강하 요소 또는 그것의 단편을 선택할 수 있도록 직접 정량화될 수 있다. '임의의' 핵산(즉 항-억제자 또는 발현-강화 활성을 갖는다는 것이 아직 알려지지 않은 핵산)이, 예를 들면 게놈 단편의 형태로 항-억제자 및/또는 발현-강화 활성에 대해 평가되어질 서열로 사용될 때, 신규한 항-억제자 및/또는 발현-강화 서열이 발견될 수 있다. 공지의 항-억제자 서열이 시험될 때, 이 분석은 그들을 추가로 특성화하기 위해 사용될 수 있다. 공지의 항-억제자 서열의 단편이 시험될 때, 분석은 이와 같은 공지의 항-억제자 서열의 기능적 단편이 제공될 것이다.

본 발명의 실시는 다른 언급이 없는 한 면역, 분자생물학, 미생물학, 세포생물학 및 재조합 DNA의 통상의 기술을 적용할 것이고, 이것은 본 분야의 기술 범위에 속한다. 예를 들면, Sambrook, Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, 1989; Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel FM, et al, eds, 1987; the series Methods in Enzymology(Academic Press, Inc.); PCR2: A Practical Approach, MacPherson MJ, Hams BD, Taylor GR, eds, 1995; Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane, eds, 1988 참조.

본 발명은 다음 실시예에서 더욱 설명된다. 실시예는 본 발명을 어떠한 방법으로도 제한하지 않는다. 그들은 단지 본 발명을 명확히 할 뿐이다.

도 1은 본 발명의 개략도이다.

A) CMV 프로모터의 조절하에, (예를 들면, d2EGFP 유전자를 암호화하는)트란스유전자, IRES, 및 선택적 마커(zeo, 제오신 내성을 제공)를 (5'에서 3'로) 함유하는 이-시스트론성 유전자. 발현 유니트는 그것의 3' 말단(t)에 SV40 전사터미네이터를 갖는다. 구조물의 이름은 CMV-d2EGFP-ires-Zeo (CMV 대조)이다.

B) A에서와 같은 구조물이나, STAR67이 CMV 프로모터의 업스트림에 클론된다. 구조물의 이름은 STAR67-CMV-d2EGFP-ires-Zeo (CMV-STAR67)이다.

C) B에서와 같은 구조물이나, STAR7 상부 및 하부 요소들이 전체 구조물의 측면에 클론된다. 구조물의 이름은 STAR7-STAR67-CMV-d2EGFP-ires-Zeo-STAR7 (CMV-STAR67 7/7)이다.

도 2. STAR67은 CHO 세포에서 CMV 구동 d2EGFP 발현을 개선한다.

10개의 독립적인 안정한 콜로니들에 대한 d2EGFP 시그널의 평균을 CHO 세포에서 표시된 구조물들에 대하여 플롯한다. A)CMV 대조; B)STAR67-CMV. X(10):10 콜로니의 평균 d2EGFP 발현 수준. 더욱 상세한 것은 실시예 2 참조.

도 3. STAR67은 CHO 세포에서 EF1α 구동 d2EGFP 발현을 개선한다. 도 2와 같으나, EF1α 프로모터를 갖는다. A) EF1α 대조; B) STAR67-EF1α.

도 4. STAR67은 CHO 세포에서 UB6 구동 d2EGFP 발현을 개선한다. 도 2 및 도3과 같으나, UB6 프로모터를 갖는다. A) UB6 대조; B) STAR67-UB6.

도 5. STAR67은 PER.C6 세포에서 CMV 구동 d2EGFP 발현을 개선한다. 도 2와 같으나, PER.C6 세포를 갖는다. A) CMV 대조; B) STAR67-CMV.

도 6. STAR67은 PER.C6 세포에서 EF1α 구동 d2EGFP 발현을 개선한다. 도 2 와 같으나, PER.C6 세포를 갖는다. A) EF1α 대조; B) STAR67-EF1α.

도 7. STAR67은 REP.C6 세포에서 UB6 구동 d2EGFP 발현을 개선한다. 도 2 및 도3과 같으나, REP.C6 세포를 갖는다. A) UB6 대조; B) STAR67-UB6.

도 8. STAR67은 또 다른 STAR 요소와 결합하여 CHO-K1 세포에서 SV40 구동 d2EGFP 발현을 개선한다. 도 2와 유사하지만, CHO 세포에서 SV40 프로모터, 및 표시된 구조물을 사용한다. d2EGFP 시그널의 평균을 트란스펙션 60일 후 18~20개의 독립적인 안정한 콜로니들에 대해 플롯한다. A) SV40 대조, SV40-STAR67, SV40-STAR7/7; B) SV40 대조 및 SV40-STAR67 7/7. 더욱 상세한 것은 실시예 4 참조.

도 9. STAR67은 CHO-K1 세포에서 UB6 구동 EpCAM 항체의 발현 수준을 개선한다. 더욱 상세한 것은 실시예 5 참조. A) STAR 요소가 없는 구조물; B)프로모터의 STAR67 업스트림과 측면의 STAR7 요소들을 갖는 구조물. 항-EpCAM 항체 농도는 pg/세포/일로 나타낸다. X(18):18개 콜로니들의 평균 생산 수준.

도 10. STAR67은 인핸서 차단제가 아니고, 반면 STAR6와 7은 인핸서 차단제이다. 더욱 상세한 것은 실시예 6 참조.

도 11. STAR67은 안정하게 트란스펙션된 CHO 세포에서 UB6 및 CMV-구동 항체 발현 수준을 강화한다. 더욱 상세한 것은 실시예 7 참조. A) 각각 프로모터 뒤에 있고, 다른 선택적 마커 유전자에 연결된, 항-EpCAM 중사슬(HC) 및 경사슬(LC)을 함유하는 단일 DNA 분자(두 마커에 대해 동시 선택이 사용되었다): STAR 요소가 없는 구조물. 콜로니가 발견되지 않았다; B) 두 프로모터 사이에 STAR67을 갖는 동일한 구조물. 항-EpCAM 항체 농도는 pg/세포/일로 나타낸다. X(19):19개의 콜로니 의 평균 생산 수준.

실시예 1: STAR67 벡터의 구조

신규한 항-억제자 서열은 WO 03/004704에 기재된 바에 따라 유전성 스크린을 사용하여 단리하였고, 이 신규한 서열은 경화된 STAR67이었다(SEQ. ID.NO. 66). 포유동물 세포계에서 트란스유전자의 발현에 대한 STAR67의 효과를 시험하였다. 본 발명자들은 여러가지 구조물의 구조를 기재한다.

재료 및 방법

3개의 플라즈미드를 생성하였다(도 1):

A) CMV-d2EGFP-ires-Zeo(CMV 대조)

B) STAR67-CMV-d2EGFP-ires-Zeo (CMV-STAR67)

C) STAR7-STAR67-CMV-d2EGFP-ires-Zeo-STAR7(CMV-STAR67 7/7)

구조물 A의 구조가 아래에 기재된다. 플라즈미드 pd2EGFP(Clontech 6010-1)를 BsiWI 부위에서 링커의 삽입에 의해 변형시켜 pd2EGFP-링크를 생산하였다. 올리고뉴클레오티드 GTACGGATATCAGATCTTTAATTAAG (SEQ. ID. NO. 67) 및 GTACCTTAATTAAAGATCTGATAT (SEQ. ID. NO. 68)을 어닐링함에 의해 재조된 링커를PacI, BglⅡ, 및 EcoRV 제한 엔도뉴클레아제의 부위에 도입하였다. 이것은 STAR 요소의 삽입을 위한 다중 클로닝 부위 MCSⅡ를 생성하였다. 그리고 나서 프라이머 GATCAGATCTGGCGCGCCATTTAAATCGTCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGG (SEQ. ID. NO. 69) 및 AGGCGGATCCGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGG(SEQ. ID. NO. 70)를 사용하여 pd2EGFP 로부터 0.37 kb의 영역을 증폭하였고, 이것을 pIRES(Clontech 6028-1)의 BglⅡ에 삽입하여 pIRES-stuf를 수득하였다. 이것은 MSCI에서 AscI 및 SwaI 제한 엔도뉴클레아제의 부위에 도입되었고, STAR 요소들과 주변 프로모터 사이의 잠재적 간섭을 막기위한 "스터퍼(stuffer) 단편"으로 작용한다. pIRES-stuf를 BglⅡ와 FspI로 소화시켜 스터퍼 단편, CMV 프로모터, (다중 클로닝 부위 MCS A 및 MCS B가 측면에 배치된)IRES 요소, 및 SV40 폴리아데닐화 시그널로 구성된 DNA 단편을 유리시켰다. 이 단편을 BamHI 및 StuI 로 소화시켜 생성한 pd2EGFP-링크의 벡터 백본으로 결찰하여 pIRES-링크를 수득하였다.

제오신-내성 유전자의 개방형해독틀을 다음과 같은 pIRES의 BamHI/NotI 부위 다운스트림에 삽입하였다: 제오신-내성 ORF를 플라즈미드 pCMV/zeo(Invitrogenm cat no.V50120)으로부터 프라이머 GATCGGATCCTTCGAAATGGCCAAGTTGACCAGTGC (SEQ. ID. NO. 71) 및 AGGCGCGGCCGCAATTCTCAGTCCTGCTCCTC (SEQ. ID. NO. 72)로 PCR 증폭하고, BamHI와 NotI로 소화시키고, 그리고 BamHI/NotI-소화된 pIRES-링크로 결찰하여 pIRES-링크-Zeo를 수득하였다. d2EGFP 리포터 ORF를, 프라이머 GATCGAATTCTCGCGAATGGTGAGCAAGCAGATCCTGAAG(SEQ. ID. NO. 73) 및 AGGCGAATTCACCGGTGTTTAAACTTACACCCACTCGTGCAGGCTGCCCAGG (SEQ. ID. NO. 74)로 pd2EGFP(Clontech 6010-1)의 증폭 및 pIRES-링크-zeo 프라이머의 EcoRI 부위로의 EcoRI-소화된 d2EGFP 카세트의 삽입에 의해 pIRES-링크-zeo에 도입하였다. 이것은 구조물 A, CMV-d2EGFP-IRES-Zeo(CMV 대조)를 생성하였다.

STAR67을 AscI 부위(STAR67과 프로모터 사이에 남아있는 약 15nt)에, CMV 프 로모터의 업스트림을 클론하였다. 이것은 구조물 B, STAR67-CMV-d2EGFP-ires-Zeo (CMV-STAR67)를 생성하였다.

STAR67을 STAR7(SEQ. ID. NO 7)을 함유하는 카세트와 관련하여 시험하고, STAR7를 갖는 전체 카세트의 측면에 위치되도록 5' SalI 및 XbaI 부위와 3' BalⅡ 및 PacI 부위에 방향이 있게 복제하였다.

실시예 2: STAR67 은 안정하게 트란스펙션된 CHO 세포에서 CMV , EF1 α 및 UB6 프로모터의 발현 수준을 강화한다.

본 발명자들은 CMV, EF1α 및 UB6 프로모터 주변의 STAR67의 존재가 CHO 세포에서 이들 프로모터의 발현수준에 영향을 주는가를 시험하였다. 실시예 1에 기재된 구조물 A 및 B (도1)를 이 목적을 위해 사용하고 각각의 프로모터에 대하여 변형한다:

1 CMV-d2EGFP-ires-Zeo (CMV 대조)

2 STAR67-CMV-d2EGFP-ires-Zeo (CMV-STAR67)

3 EF1α-d2EGFP-ires-Zeo (EF1α 대조)

4 STAR67-EF1α-d2EGFP-ires-Zeo (EF1α-STAR67)

5 UB6-d2EGFP-ires-Zeo (UB6 대조)

4 STAR67-UB6-d2EGFP-ires-Zeo (UB6-STAR67).

재료 및 방법

도 1에 기재된 플라즈미드에서 CMV 프로모터를 UB6와 EF1α 프로모터로 교환하였다. UB6 프로모터는 다음과 같이 복제되었다. pd2EGFP 플라즈미드에서 DNA 0.37kb 스터퍼를 실시예 1의 기재에 따라 SEQ에 의해 동정된 프라이머를 사용하여 PCR로 증폭하였다. 생성된 DNA 스터퍼는 pUB6/V5-His[Invitrogen V250-20]의 BglⅡ 부위에서 클론되었고 pUB6-stuf를 생성하였다. pUB6-stuf로부터 AscI-Saci 단편을 CMV-d2EGFP-IRES-Zeo로 클론하였고, 그것으로부터 CMV 프로모터를 제거하였다.

EF1α 프로모터를 주형으로서 pEF1α/V5-His[Invitrogen V920-20]으로, 프라이머 GATCGGCGCGCCATTTAAATCCGAAAAGTGCCACCTGACG(SEQ. ID. NO. 79) 및 AGGCGGGACCCCCTCACGACACCTGAAATGGAAG (SEQ ID. NO. 80)을 사용하여 PCR에 의해 증폭하였다. PCR 단편을 CMV-d2EGFP-IRES-Zeo의 AscI 및 PpuMI 부위에서 클론하였고, 그것으로부터 CMV 프로모터를 제거하였다.

차이니즈 햄스터 난소세포계 CHO-K1(ATCC CCL-61)을 37℃/5% CO₂에서 글루타민 2mM, 페니실린 100 U/㎖, 및 스트렙토마이신 100 ㎍/㎖을 함유하는 HAMS-F12 매질 + 10% 송아지 태아 혈청에서 배양하였다. 세포를 제조자 지침에 따라 SuperFect(QIAGEN)을 사용하여 플라즈미드로 트란스펙션하였다. 간단히 말하면, 세포들을 배양 용기에 시드하고 70~90% 일치까지 밤샘 성장시켰다. SuperFect 시약을 플라즈미드 DNA와 6 ㎕/㎍의 비율로 결합시키고(예를 들면, 10cm 페트리 디쉬의 경우, DNA 20㎍와 SuperFect 120 ㎕) 세포에 첨가하였다. 밤샘 인큐베이션 후 트란스펙션 혼합물을 새로운 배지로 바꾸고, 트란스펙션된 세포를 추가로 인큐베이션하였다. 밤샘 재배 후, 세포를 트립신화하고 새로운 매질을 갖는 새로운 재배 용기에 시드하였다. 또 다른 밤샘 인큐베이션 후, 제오신을 50㎍/㎖의 농도까지 첨가하고 세포를 더욱 재배하였다. 다시 3일 후, 매질을 제오신(100㎍/㎖)을 함유하는 새로운 매질로 바꾸고 추가로 재배하였다. 개별의 콜로니들을 볼 수 있게 되었을 때(트란스펙션 후 약 10일) 매질을 제거하고 제오신이 없는 새로운 매질로 바꾸었다. 개개의 콜로니들을 단리하고 제오신이 없는 매질 중의 24-웰 플레이트로 트란스펙션하였다. 콜로니를 단리하고 하루 후, 제오신을 매질에 첨가하였다. d2EGFP 리포터 유전자의 발현을 트란스펙션 약 3일 후 평가하였다. 콜로니에서 d2EGFP 발현 수준을 2주 후 측정하였다. 프란스펙션 하고 처음 2주 후 첫번째 d2EGFP 측정을 수행하였을 때, 콜로니들을 제오신 또는 다른 항체 없이 매질에서 재배하였다. 이것을 나머지 실험에서도 계속하였다.

결과

도 2는 STAR67 클론된 CMV 프로모터의 업스트림을 함유하는 구조물의 트란스펙션이, STAR67, CMV 대조가 없는 "공(empty)" 대조와 비교하여, 상당히 더 높은 d2EGFP 단백질 수준을 나타내는 다수의 CHO 콜로니를 가져온다는 것을 나타낸다. CMV 대조 플라즈미드로 트란스펙션된 10 콜로니들에서 d2EGFP 시그널의 평균은 트란스펙션 25일 후에 측정하였을 때 34이었다. 트란스펙션 60일 후 이들 10 콜로니들에서 d2EGFP 시그널의 평균은 13으로 감소되었고, 발현이 시간에 걸쳐 안정하지 않다는 것을 나타낸다. 비교하여, STAR67-CMV 플라즈미드로 트란스펙션된 10개의 콜로니들에서의 d2EGFP 시그널의 평균은 트라스펙션 후 25일에 측정하였을 때는 42였고, 60일에 측정하였을 때는 32였다. 따라서 트란스펙션 60일 후, STAR67-포함 CMV 구조물은 안정하게 트란스펙션된 클론에서 리포터 단백질의 발현 수준을 구동 하는 CMV 프로모터에 2.5 더 높은 인자를 가져왔다. 중요하기는, 트란스펙션 25일 후, 처음 측정 이후에 선택압력은 제오신이 없는 매질에서 콜로니들의 재배에 의해 제거되었다. 따라서, STAR67 구조물을 함유하는 콜로니들은 STAR67 구조물을 함유하지 않는 콜로니보다 선택 압력의 부재시에 시간에 걸쳐 더욱 안정하다.

도 3은 STAR67 클론된 EF1α-프로모터의 업스트림을 함유하는 구조물의 트란스펙션이, STAR67, EF1α 대조가 없는 "공" 대조와 비교하여, 상당히 더 높은 d2EGFP 단백질 수준을 발현하는 다수의 CHO 콜로니를 가져온다는 것을 나타낸다. EF1α 대조 플라즈미드로 트란스펙션된 10 콜로니들에서 d2EGFP 시그널의 평균은 트란스펙션 25일 후에 측정하였을 때 31이었다. 트란스펙션 60일 후 이들 10 콜로니들에서 d2EGFP 시그널의 평균은 26이었다. 비교하여, EF1α-STAR67 플라즈미드로 트란스펙션된 10개의 콜로니들에서의 d2EGFP 시그널의 평균은 트란스펙션 후 25일에 측정하였을 때는 60이었고, 60일에 측정하였을 때는 76이었다. 따라서, 트란스펙션 후 25일과 60일 모두에서, STAR67-포함 EF1α 구조물은 안정하게 트란스펙션된 콜로니에서 2.9 인자 더 높은 EF1α 프로모터 구동된 리포터 단백질의 발현 수준을 제공한다.

도 4는 STAR67 클론된 UB6 프로모터의 업스트림을 함유하는 구조물의 트란스펙션이, STAR67, UB6 대조가 없는 "공" 대조와 비교하여, 상당히 더 높은 d2EGFP 단백질 수준을 발현하는 다수의 CHO 콜로니를 가져온다는 것을 나타낸다. UB6 대조 플라즈미드로 트란스펙션된 10 콜로니들에서 d2EGFP 시그널의 평균은 트란스펙션 25일 후에 측정하였을 때 51이었다. 트란스펙션 60일 후 이들 10 콜로니들에서 d2EGFP 시그널의 평균은 29였고, 발현이 시간에 걸쳐 안정하지 않다는 것을 나타낸다. 비교하여, UB6-STAR67 플라즈미드로 트란스펙션된 10개의 콜로니들에서의 d2EGFP 시그널의 평균은 트란스펙션 후 25일에 측정하였을 때는 218이었고, 60일에 측정하였을 때는 224였다. 따라서, 트란스펙션 후 25일에, STAR67-포함 UB6 구조물은 안정하게 트란스펙션된 콜로니에서 4.3 인자 더 높은 UB6 프로모터 구동된 리포터 단백질의 발현 수준을 제공한다. 60일 후 이 인자는 7.7이었고, 대조 콜로니에서의 발현의 불안정성과 UB6-STAR67 콜로니에서의 안정성에 기인한다. 중요하기는, 트란스펙션 후 25일에, 첫번째 측정 후, 선택 압력을 제오신 없는 매질에서 콜로니들을 재배함으로써 제거하였다. 따라서, STAR67 구조물을 함유하는 콜로니들은 STAR67 구조물을 함유하지 않는 콜로니들보다 선택 압력의 부재시 시간에 걸쳐 더 안정하다.

결론으로, STAR67은 3개의 다른, 관련없는 프로모터에서 발현을 증가시킨다.

실시예 3: STAR67 은 안정하게 트란스펙션된 PER . C6 세포에서 CMV , EF1 α 및UB6 프로모터의 발현수준을 강화한다.

본 발명자들은 CMV, EF1α 및 UB6 프로모터의 주변의 STAR67의 존재가 CHO 세포 이외의 다른 세포, 즉 인간 PER.C6 세포에 이들 프로모터의 발현 수준에 영향을 미치는가를 시험하였다. 실시예 1과 동일한 구조물이 사용되었다.

재료 및 방법

PER . C6 세포의 트란스펙션 , 배양 및 분석

PER.C6®세포를 DMEM 매질 + 피리독신 + 9% 송아지 태아 혈청 (비-가열 불 활성화된), MgCl₂ 8.9mM, 페니실린 100U/㎖ 및 스트렙토마이신 100㎍/㎖에서, 37℃/10% CO₂에서 배양하였다. 세포들을 제조자 지침에 따라 리포펙타민 2000(Invitrogen)을 사용하여 플라즈미드로 트란스펙션 하였다. 즉, 세포를 6-웰에 시드하고 70~90% 일치까지 밤샘 성장시켰다. 리포펙타민 시약을 플라즈미드 DNA와 15㎖/3㎍의 비율로(예를 들면, 10cm페트리 디쉬의 경우, DNA 20㎍ 및 리포펙타민 120 ㎕) 결합시키고 30분 인큐베이션 후 25℃에서 세포에 첨가하였다. 6시간 배양 후, 트란스펙션 혼합물을 새로운 매질로 바꾸고, 트란스펙션된 세포를 더욱 인큐베이션하였다. 밤샘 배양 후, 세포를 트립신화하고 100㎍/㎖의 농도로 첨가된 제오신을 갖는 새로운 페트리 디쉬(90mm)에 시드하고(1:15, 1:30, 1:60, 1:120 희석) 세포를 더욱 재배하였다. 콜로니들을 볼 수 있게 되었을 때, 개개의 클론들을 스크래핑에 의해 단리하고 제오신을 갖는 매질에서 24-웰 플레이트로 옮겼다. ~70% 일치까지 성장했을 때, 세포를 6-웰 플레이트로 옮겼다. 안정한 콜로니들을 XL-MCL Beckman Coulter 유동세포분석기로 d2EGFP 시그널을 측정하기 전에 6-웰 플레이트로 옮겼다. d2EGFP 시그널의 평균을 d2EGFP 발현의 수준에 대한 측정으로 취하였다. 2주 후 콜로니들을 2회 측정하였다. 그리고나서 콜로니들을 제오신 없이 추가로 배양하였다.

결과

도 5는 STAR67 클론된 CMV 프로모터의 업스트림을 함유하는 구조물의 트란스펙션이 STAR67, CMV 대조없이 "빈" 대조와 비교하여, 상당히 더 높은 d2EGFP 단 백질 수준을 발현하는 다수의 PER.C6 콜로니를 가져온다는 것을 나타낸다. CMV 대조 플라즈미드로 트란스펙트된 10 콜로니에서 d2EGFP 시그널의 평균은 트란스펙션 30일 후에 측정하였을 때 37이었다. 트란스펙션 60일 후에, 이들 10 콜로니들에서의 d2EGFP 시그널의 평균은 14로 감소하였고, 발현이 시간에 따라 안정하지 않다는 것을 나타낸다. 비교하여, STAR67-CMV 플라즈미드로 트란스펙션된 10 콜로니에서 d2EGFP 시그널의 평균은 트란스펙션 30일 후에는 측정하였을 때 101이었고, 60일 후에 측정하였을 때 45였다. 따라서, 트란스펙션 60일 후에 측정하였을 때, STAR67-포함 CMV 구조물은 안정하게 트란스펙션된 콜로니에서 리포터 단백질의 발현 수준이 구동된 CMV 프로모터보다 3.2 더 높은 인자를 가져왔다.

도 6은 EF1α-프로모터의 업스트림에 클론된 STAR67을 함유하는 구조물의 트란스펙션이, STAR67, EF1α 대조가 없는 "빈" 대조와 비교하여, 상당히 높은 수준의 d2EGFP 단백질을 발현하는 다수의 PER.C6 콜로니를 가져온다는 것을 나타낸다. EF1α 대조 플라즈미드로 트란스펙션된 10 콜로니에서 d2EGFP 시그널의 평균은 트란스펙션 30일 후 5였다. 트란스펙션 60일 후 이들 10 콜로니에서 d2EGFP의 평균 시그널은 6이었다. 비교하여, EF1α-STAR67 플라즈미드로 트란스펙션된 10 콜로니에서 d2EGFP 시그널의 평균은 트란스펙션 30일 후 측정하였을 때 25였고, 60일 후 측정하였을 때 20이었다. 따라서, 트란스펙션 30일 후 및 60일 후에 측정하였을 때, STAR67-포함 EF1α 구조물은 안정하게 트란스펙션된 콜로니에서 리포터 단백질의 발현 수준이 구동된 CMV 프로모터보다 4 더 높은 인자를 가져왔다.

도 7은 UB6 프로모터의 업스트림에 클론된 STAR67을 함유하는 구조물의 트란 스펙션이, STAR67, UB6 대조가 없는 "빈" 대조와 비교하여, 상당히 높은 수준의 d2EGFP 단백질을 발현하는 다수의 PER.C6 콜로니를 가져온다는 것을 나타낸다. UB6 대조 플라즈미드로 트란스펙션된 10 콜로니에서 d2EGFP 시그널의 평균은 30일 후 4였다. 트란스펙션 60일 후 이들 10 콜로니에서 d2EGFP의 평균 시그널은 2였다. 비교하여, UB6-STAR67 플라즈미드로 트란스펙션된 10 콜로니에서 d2EGFP 시그널의 평균은 트란스펙션 30일 후 측정하였을 때 27이었고, 60일 후 측정하였을 때 18이었다. 따라서, 트란스펙션 30일 후 및 60일 후에 측정하였을 때, STAR67-포함 UB6 구조물은 안정하게 트란스펙션된 콜로니에서 리포터 단백질의 발현 수준이 구동된 CMV 프로모터보다 7~9배 더 높은 인자를 가져왔다.

따라서 프로모터의 업스트림에 STAR67를 위치시키는 것은 PER.C6 세포에서도, STAR67-less 구조물을 갖는 것과 비교하여 상당히 더 높은 단백질 발현 수준을 가져왔다. 따라서, STAR67은 관련없는 세포 형태에서 다르게 작용한다.

실시예 4: CHO 세포에서 SV40 프로모터를 강화하기 위해 다른 항-억제자 요소와 결합된 STAR67 의 새로운 배열

본 발명자들은 SV40 프로모터 주변의 STAR67의 존재가 샘플 STAR7에서, 단독으로 또는 다른 항-억제자 요소와 결합하여, 이 프로모터의 발현 수준에 영향을 미치는가 여부를 시험하였다. 이 목적을 위해 사용된 구조물들은 다음과 같다(도 8 참조):

1 SV40-d2EGFP-ires-Zeo (SV40 대조)

2 STAR67-SV40-d2EGFP-ires-Zeo (SV40-STAR67)

3 STAR7-SV40-d2EGFP-ires-Zeo-STAR7 (SV40-STAR7/7)

4 STAR7-STAR67-SV40-d2EGFP-ires-Zeo-STAR7 (SV40-STAR67 7/7)

재료 및 방법

SV40 프로모터를 프라이머로서

TTGGTTGGGGCGCGCCGCAGCACCATGGCCTGAAATAACCTCTGAAAGAGG (SEQ. ID. NO. 81) 및 TTGGTTGGGAGCTCAAGCTTTTTGCAAAAGCCTAGGCCTCCAAAAAAGCCTCCTC (SEQ. ID. NO. 82)를 사용하는 주형으로서 pIRES로 PCR에 의해 증폭하였다. PCR 단편을 CMV-d2EGFP-IRES-Zeo의 AscI 및 SacI 부위에서 클론하고, 그것으로부터 CMV 프로모터를 제거하였다.

CHO 세포들을 트란스펙션하고, 클로니들을 분리하고 실시예 2에서와 같이 증폭시키고 분석하였다.

결과

도 8은 SV40 프로모터의 업스트림에 클론된 STAR67 (SV40-STAR67) 또는 전체 구조물의 측면에 클론된 STAR(SV40-STAR 7/7)을 함유하는 구조물의 트란스펙션이 항-억제자 요소를 갖지 않는 "빈"대조(SV40 대조)와 비교하여, 상당히 높은 수준의 d2EGFP 단백질을 발현하는 CHO 콜로니를 가져오지 않는다는 것을 나타낸다. 트란스펙션 40일 후에 측정하였을 때, SV40 대조 플라즈미드로 트란스펙션된 18 콜로니에서 d2EGFP 시그널의 평균은 86이었다. 비교하여, SV40-STAR67 플라즈미드로 트란스펙션된 18 콜로니에서 d2EGFP 시그널의 평균은 40일 후에 측정하였을 때 82였고, SV40-STAR 7/7 플라즈미드로 트란스펙션된 18 콜로니에서 d2EGFP 시그널의 평균은 40일 후에 측정하였을 때 91이었다. 따라서, CHO 세포에서 SV40 프로모터에 대한 이들 항-억제자 요소들의 중요한 효과는 관찰되지 않았다.

이들 세포에서 SV40 프로모터에서 발현 수준은 이미 상당히 높고, SMV 프로모터에서 관찰된 것보다도 훨씬 높고, 이것은 매우 강력한 프로모터라고 생각된다. CHO 세포에서 SV40 프로모토를 사용한 항-억제자 요소의 부재하에 이러한 높은 기준 발현은, STAR67 단독 또는 트란스유전자의 측면에 위치하는 STAR의 상당한 효과가 발견되지 않는 이유를 설명할 수 있다.

그러나, SV40-STAR67 7/7 플라즈미드로 트란스펙션된 18 콜로니에서 d2EGFP 시그널의 평균은 40일 후에 측정하였을 때 209였고, 이것은 18 대조 콜로니의 평균(86)보다 2.4 인자로 높다. 따라서, STAR67 요소가 다른 항-억제자 요소와 결합하여 사용될 때, 상당히 높은 d2EGFP 발현 수준을 나타내는 안정적으로 트란스펙션된 많은 CHO 콜로니들을 가져온다.

그러므로, 이 신규한 배열(5'- STAR 서열 - STAR 서열 C - 프로모터 - 관심대상 단백질을 암호화하는 핵산 - STAR 서열 B - 3', 본 샘플에서, STAR 서열 A와 B는 STAR7이고 STAR 서열 C는 STAR67이다)에서, STAR 요소는 여기 기재된 배열에서보다 더 나은 기능을 나타낸다.

본 발명자들은 SV40 프로모터의 STAR67 업스트림과 결합하여, 측면의 STAR7 요소들을 측면 STAR6(SEQ ID.NO.6) 요소 또는 측면 STAR 4(SEQ.ID.NO.4) 요소로 대체하는 실험(상기와 동일한 명명법을 사용하여, 각각 SV40-STAR 67 6/6 및 SV40-STAR67 4/4)을 실시하였고, 이들 결합에 의해 증가된 발현을 관찰하였다. 이것은 측면의 STAR7 요소들이 다른 STAR 서열과 교환될 수 있고, STAR 서열을 갖는 발현 카세트의 신규한 배열의 개선이 여전히 관찰된다는 것을 증명한다.

실시예 5: STAR67 과 STAR7 의 결합물은 안정하게 트란스펙션된 CHO 세포에서 UB6-구동 항체 발현 수준을 강화한다.

실시예 4에서, 본 발명자들은 STAR67과 STAR7의 결합물이 안정하게 트란스펙션된 CHO 세포에서 UB6-구동 항체 발현 수준을 강화한다는 것을 나타낸다. 여기서 본 발명자들은 STAR67과 STAR7의 결합물이 항체의 생성을 위해 사용될 수 있는지 여부를 시험하였다. 본 발명자들은 시험 단백질로서 EpCAM 분자에 대한 항체(Huls, et al, 1999)를 선택하고 및 UB6 프로모터를 사용하였다.

재료 및 방법

플라즈미드

중사슬 cDNA(HC-EpCAM)을 UB6 프로모터를 포함하는 구조물에 클론시켰다. HC-EpCAM을 IRES 서열에 의해 제오신 내성 유전자에 결합시켰다. 또한 경사슬 cDNA(LC-EpCAM)를 UB6 프로모터를 함유하는 구조물에서 클론시켰다. LC-EpCAM을 IRES 서열에 의한 퓨로마이신 내성 유전자에 결합시켰다. 이들 두 플라즈미드는 함께 UB6(HC+LC) 대조를 나타낸다(도 9).

STAR67 및 STAR7의 효과를 시험하기 위해, STAR67을 HC+LC 구조물, UB6 프로모터의 업스트림에 클론시켰다. STAR7을 전체 카세트의 측면, 5' 및 3' 말단에 클론시켰다(도 9). 이들 두 플라즈미드는 STAR7-STAR67-UB6 (HC+LC) STAR7을 나타낸다.

CHO 세포의 트란스펙션과 배양

차이니즈 햄스터 난소 세포계 CHO-K1(ATCC CCL-61)을, 선택을 위해 제오신(100㎍/㎖) 및 퓨로마이신(2.5㎍/㎖)을 사용하여 실시예 2에서와 같이 트란스펙션하고 배양하였다. 트란스펙션 하루 후, 제오신을 배양 매질에 첨가하였다. 첫번째 클로니들이 보이게 된 후(제오신 첨가 후 약 7일), 배양 매질을 제거하고 퓨로마이신을 함유하는 배양 매질로 교환하였다. 약 7일 후, 콜로니들을 분리하고 제오신 만을 함유하는 배양 매질에 24웰 플레이트로 옮겼다.

결과

도 9는 UB6 프로모터의 업스트림에 클론된 STAR67 및 전체 카세트의 측면에 클론된 STAR67을 함유하는 항체 구조물의 트란스펙션이, STAR67과 STAR7이 없는 "빈"대조, UB6 (HC+LC) 대조와 비교하여, 상당히 높은 수준의 EpCAM 항체를 발현하는 CHO 콜로니를 많이 가져오지 않는다는 것을 나타낸다. 트란스펙션 25일 후에 측정하였을 때, UB6 (HC+LC) 대조 플라즈미드로 트란스펙션된 18 콜로니에서 EpCAM 생산의 평균은 2.7 pg/세포/일이었다. 선택 약제 제오신과 퓨로마이신을 25일 후 제거하였다. 트란스펙션 후 45일에, 이들 18 콜로니의 EpCAM 생산의 평균은 2.7pg/세포/일이었다. 비교하여, STAR7-STAR67-UB6 (HC+LC)-STAR7 플라즈미드로 트란스펙션된 18 콜로니에서 EpCAM 생산 시그널의 평균은 25일 후에 측정하였을 때 6.7이었고, 45일 후에 측정하였을 때 7.7 pg/세포/일이었다. 따라서, 트란스펙션 후 30일 과 45일 모두에서, STAR67/STAR7-포함 UB6 구조물은 안정하게 트란스펙션된 CHO 클론에서 EpCAM 발현 수준을 구동하는 UB6 프로모터보다 2.5 ~ 2.9 인자로 높다.

따라서, STAR67을 카세트의 측면에 위치하도록 프로모터와 2개의 STAR7 요소의 업스트림에 위치시키는 것은 STAR67/STAR7-less 구조물과 비교하여, CHO 세포에서 상당히 더 높은 EpCAM 항체 발현을 가져왔다.

실시예 6: STAR6 및 STAR7 은 인핸서 차단제인 반면, STAR67 은 인핸서 차단제가 아니다.

STAR6 및 STAR7을 포함하여 특성에 관하여 시험된 지금까지 알려진 모든 STAR 요소들은 인핸서 차단제이다(WO 03/004704, Kwaks et al, 2003). 인핸서 차단제 활성은 강한 인핸서와 프로모터 사이에 STAR 요소를 놓음으로써 시험하였다. 여기서 본 발명자들은 또한 STAR67이 인핸서 차단제인가를 시험하였다.

재료 및 방법

d2EGFP 유전자를 프라이머 TTGGTTGGTCATGAATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTC (SEQ. ID. NO. 75) 및 ATTCTCTAGACTACACATTGATCCTAGCAGAAGCAC (SEQ. ID. NO. 76)을 사용하여 PCR-증폭하였고 플라즈미드 pGL3-프로모터-GFP를 생성하기 위해 루시퍼라제 유전자를 대체하도록 NcoI 및 XbaI 제한 부위를 사용하여 플라즈미드 pGL3-프로모터(Promega)에 클론하였다.(올리고 CGATATCTTGGAGATCTACTAGTGGCGCGCCTTGGGCTAGCT (SEQ. ID. NO. 77) 및 GATCAGCTAGCCCAAGGCGCGCCACTAGTAGATCTCCAAGATATCGAGCT (SEQ ID. NO. 78)을 어닐링하여 생성된) 링커를 SacI 및 BglⅡ 부위에 클론하여 다중 클로닝 부위를 생성하였다. 원래의 BglⅡ 부위를 링커의 결찰 후 파괴하고, 링커 DNA 내에 새로운 유일한 BglⅡ 부위를 생성하였다. SV40-인핸서를 BsaBI와 BamHI를 사용하여 플라즈미드 pGL3-basic(Promega)로부터 절단하고 플라즈미드 pGL3-인핸서- 프로모터-GFP를 생성하는 EcoRV 및 BglⅡ 부위를 이용하여 pGL3-링커-프로모터-GRP으로 클론하였다. STAR40 요소(SEQ. ID. NO. 40)를 업스트림 서열상에서의 인핸서의 작용을 막기 위해 KpnI 및 SacI 부위를 사용하여 SV40 인핸서의 업스트림에 놓았다. 마지막으로, 항-억제자 요소 STAR6, STAR7 및 STAR67을 SpeI 및 AscI 제한 부위를 사용하여 SV40 인핸서와 SV40 최소 프로모터 사이에 놓았다.

CHO 세포의 트란스펙션과 배양

차이니즈 햄스터 난소 세포계 CHO-K1 (ATCC CCL-61)을 실시예 2와 같이 트란스펙션하였다. 트란스펙션 하루 후, d2EGFP 수준을 Epics XL 유동세포분석기로 측정하였다(Beckman Coulter)

결과

도 10은 STAR67은 인핸서 차단제가 아니고, 반면 STAR6과 STAR7은 동일한 조사에서 인핸서 차단제로 작용한다는 것을 보여준다. STAR6, STAR7 및 STAR67은 SV40 인핸서와 d2EGFP 유전자의 최소 SV40-프로모터 업스트림 사이에 클론되었다. STAR 요소가 인핸서와 프로모터 사이에 클론되지 않았을 때 강한 전사 활성이 발생한다(임의로 100%에 맞춤). STAR6 또는 STAR7이 인핸서와 프로모터 사이에 위치하였을 때, 전사는 기준 수준으로 떨어졌고, 이것은 STAR6와 STAR7이 잠재적인 인핸서 차단제라는 것을 나타낸다. 반대로, STAR67이 인핸서와 프로모터 사이에 클론되었을 때 상대적 전사 수준은 여전히 대조의 80%였고, 이것은 상기와 같이(WO 03/004704, Kwaks et al, 2003) 다른 항-억제자 요소와 마찬가지로, STAR6 및 STAR7과 대조적으로 STAR67이 양호한 인핸서 차단제가 아니라는 것을 나타낸다.

실시예 7: STAR67 은 안정하게 트란스펙션된 CHO 세포에서 UB6 및 CMV -구동 항체 발현 수준을 강화한다.

실시예 5에서 본 발명자들은 STAR67과 STAR7의 결합물이 중사슬과 경사슬을 함유하는 두 개의 구별되는 플라즈마와 관련하여, CHO 세포에서 EpCAM 항체의 발현수준을 강화시킨다는 것을 나타내었다. 이 실험에서, 본 발명자들은 중사슬과 경사슬 모두가 하나의 플라즈미드에 놓일 때 SRAT67이 EpCAM 항체의 생산에 사용될 수 있는지를 시험하였다. 본 발명자들은 각각의 선택적 마커에 대해 동시 선택을 사용하였다.

재료 및 방법

플라즈미드

중사슬 cDNA(HC-EpCAM)는 UB6 프로모터의 조절하에 있고 IRES 서열에 의해 제오신 내성 유전자에 결합되었다. 경사슬 cDNA(LC-EpCAM)는 CMV 프로모터의 조절하에 있고 IRES 서열에 의해 퓨로마이신 내성 유전자에 결합되어 있다. 기본적으로, 이들은 실시예 5에 사용된 구조물이다. 이들 2개의 발현 카세트는 하나의 플라즈미드 상에 놓이고, 이와 같은 방법으로 두개의 발현 유니트의 전사는 반대 방향을 갖는다. 대조 플라즈미드에서, UB6와 CMV 프로모터는 500 bp의 스터퍼에 의해 분리되었다(EpCAM 대조)(도 10). 또 다른 플라즈미드에서 STAR67은 UB6와 CMV 프로모터 사이에 놓였다(EpCAM STAR67) (도 10).

CHO 세포의 트란스펙션 및 배양

차이니즈 햄스터 난소 세포계 CHO-K1(ATCC CCL-61)을, 실시예 2에서와 같이, 선택을 위해 제오신(100㎍/㎖)과 퓨리신(2.5㎍/㎖)을 사용하여 트란스펙션하고 배양하였다. 실시예 5에서, 두 선택 마커에 대해 연속 선택이 사용되었다. 반대로, 여기서는 두 선택 약제가 동시에 배양 매질에 존재하였다. 트란스펙션 하루 후, 제오신과 퓨로마이신을 배양 매질에 첨가하였다. 선택 매질은 콜로니가 단리될 때까지 존재하였다(약 트란스펙션 후 14일). 콜로니들을 단리하고 24-웰 플레이트로 옮긴 후, 세포들을 제오신과 퓨로마이신의 존재하에 배양하였다.

결과

도 11은 UB6와 CMV 프로모터 사이에 클론된 STAR67을 함유하는 항체 구조물의 트란스펙션이 (항 인간 IgG 항체를 사용한 ELISA에 의해 측정된) EpCAM 항체를 발현하는 다수의 CHO 콜로니를 가져온다는 것을 나타낸다. EpCAM STAR67 플라즈미드로 트란스펙션된 19 콜로니들에서 EpCAM 생산의 평균은 트란스펙션 후 25일에 측정하였을 때 9.8pg/세포/일이었다.

반대로, 놀랍게도 EpCAM 대조 플라즈미드로 트란스펙션된 콜로니의 생존은 없었다. 선택이 제오신 또는 퓨로마이신 단독으로 실시되었을 때, EpCAM 대조 콜로니들이 생존하였다. 그러나, 선택 압력이 중사슬과 경사슬 모두에 놓임으로써 선택압력이 증가하면, 이들 조건은 오직 트란스펙션된 플라즈마에 SAR67 존재를 갖는 콜로니들만이 생존하도록 한다.

결과는 또한 STAR67의 병합이 두개의 프로모터, UB6와 CMV 프로모터에 유익한 결과를 갖는다는 것을 나타내고, 이들은 하나의 STAR67 요소의 업스트림과 다운스트림에 놓인다. 이것은 STAR67이 이-방향성 방식으로 작용할 수 있다는 것을 나 타낸다.

EpCAM 대조와 EpCAM STAR67 플라즈미드 사이의 차이는, 선택 압력이 높을 때, EpCAM STAR67의 트란스펙션 만이 콜로니의 확립을 가져온다는 의미에서 명확하다. 이것은 STAR67에서 이 효과를 중재하는 책임이 있는 영역을 동정하기 위해 이 플라즈미드 배열을 사용하는 기회를 제공한다. 유사하기는, STAR67의 오버래핑 부분이 UB6와 CMV 프로모터 사이에 놓이고, EpCAM 분자를 구동한다. STAR67의 일부가 기능적일 때, 콜로니들은 제오신과 퓨로마이신 모두가 선택 약제로서 동시에 사용될 때 생존할 것이다. STAR67의 일부가 비기능적일 때, 동일한 선택 조건에서 생존하는 콜로니는 없을 것이다.

따라서, 프로모터의 업스트림에 STAR67을 놓는 것은 항-억제자 요소가 부족한 구조물과 비교하여, CHO 세포에서 상당히 더 높은 EpCAM 항체 발현 수준을 가져왔다.

유사한 실험이 항-EpCAM 항체의 중사슬과 경사슬의 발현을 구동하도록 SV40 프로모터로 실시된다. 다른 실험에서, STAR67은 다른 STAR 서열로 교환된다. 추가의 실험에서, 중사슬과 경사슬을 암호화하는 두개의 발현 유니트의 오리엔테이션은 두개가 동일한 방향이 되도록 변화된다. 또 다른 실험에서, 중사슬과 경사슬용 발현 유니트는 각각 다른 핵산 분자상에 놓이고(실시예 5), 생성된 클론은 동시에 두 선택적 마커에 대해 선택된다. 또 다른 실험에서, 숙주세포 타입은 바뀐다. 이들 변수의 조합이 이루어진다.

참고문헌

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cggcctctat 780 ccgggtgtca ctccaggtag gcttctcaac gctctcggct caaagaagga caatcacagg 840 tccaagccca aagcccacac ctcttccttt tgttataccc acagaagtta gagaaaacgc 900 cacactttga gacaaattaa gagtccttta tttaagccgg cggccaaaga gatggctaac 960 gctcaaaatt ctctgggccc cgaggaaggg gcttgactaa cttctatacc ttggtttagg 1020 aaggggaggg gaactcaaat gcggtaattc tacagaagta aaaacatgca ggaatcaaaa 1080 gaagcaaatg gttatagaga gataaacagt tttaaaaggc aaatggttac aaaaggcaac 1140 ggtaccaggt gcggggctct aaatccttca tgacacttag atataggtgc tatgctggac 1200 acgaactcaa ggctttatgt tgttatctct tcgagaaaaa tcctgggaac ttcatgcact 1260 gtttgtgcca gtatcttatc agttgattgg gctcccttga aatgctgagt atctgcttac 1320 acaggtcaac tccttgcgga agggggttgg gtaaggagcc cttcgtgtct cgtaaattaa 1380 ggggtcgatt ggagtttgtc cagcattccc agctacagag agccttattt acatgagaag 1440 caaggctagg tgattaaaga gaccaacagg gaagattcaa agtagcgact tagagtaaaa 1500 acaaggttag gcatttcact ttcccagaga acgcgcaaac attcaatggg agagaggtcc 1560 cgagtcgtca aagtcccaga tgtggcgagc ccccgggagg aaaaaccgtg tcttccttag 1620 gatgcccgga acaagagcta ggcttccgga gctaggcagc catctatgtc cgtgagccgg 1680 cgggagggag accgccggga ggcgaagtgg ggcggggcca tccttctttc tgctctgctg 1740 ctgccgggga gctcctggct ggcgtccaag cggcaggagg ccgccgtcct gcagggcgcc 1800 gtagagtttg cggtgcagag t 1821 <210> 9 <211> 1929 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> sequence of STAR9 <400> 9 cacttcctgg gagtggagca gaggctctgc gtggagcatc catgtgcagt actcttaggt 60 acggaaggga ttgggctaaa ccatggatgg gagctgggaa gggaagggac caacttcagg 120 ccccactggg acactggagc tgccaccctt tagagccctc ctaaccctac accagaggct 180 gagggggacc tcagacatca cacacatgct ttcccatgtt ttcagaaatc tggaaacgta 240 gaacttcagg ggtgagagtg cctagatatt gaatacaagg ctagattggg cttctgtaat 300 atcccaaagg accctccagc tttttcacca gcacctaatg cccatcagat accaaagaca 360 cagcttagga gaggttcacc ctgaagctga ggaggaggca gccggattag agttgactga 420 gcaaggatga ctgccttctc cacctgacga tttcagctgc tgcccttttc ttttcctggg 480 aatgcctgtc gccatggcct tctgtgtcca caggagagtt tgacccagat actcatggac 540 caggcaaagg tgctgttcct cccagcccag ggcccaccat gaagcatgcc tgggagcctg 600 gtaaggaccc agccactcct gggctgttga cattggcttc tcttgcccag cattgtagcc 660 acgccactgc attgtactgt gagataagtc aaggtgggct caccaggacc tgcactaaat 720 tgtgaaattc agctccaaag aactttggaa attacccatg catttaagca aaatgaatga 780 tacctgagca aaccctttca cattggcaca agttacaatc ctgtctcatc ctcttgatta 840 caaattccat ccaggcaaga gctgtatcac cctgaggtct ccccattcat gttttggtca 900 ataatattta gtttcctttt gaaaatagat ttttgtgtta ctccattatg atgggcagag 960 gccagatgct tatattctat ttaaatgact atgtttttct atctgtaact gggtttgtgt 1020 tcaggtggta aatgcttttt ttttgcagtc agaagattcc tggaaggcga ccagaaatta 1080 gctggccgct gtcagacctg aagttacttc taaagggcct ttagaaatga attctttttt 1140 atgccttctc tgaattctga gaagtaggct tgacttcccc taagtgtgga gttgggagtc 1200 aactcttctg aaaagaaagt ttcagagcat tttccaaagc catggtcagc tgtgggaagg 1260 gaagacgatg gatagtacag ttgccggaaa acactgatgg aggcggatgc tccagctcag 1320 ccaaagacct ttgttctgcc caccccagaa atgccccttc ctcaatcgca gaaacgttgc 1380 cccatggctc ctgatactca gaatgcagcc tctgaccagg accatctgca tcctccagga 1440 gctcgtaaga aatgcagcat cgtgggacct gctggcacct ggtgaaccca aacctgcagg 1500 gctcctgggt gtgcttgggg cggctgcagg ggaagaggga gtcagcagcc tcctcctgac 1560 cttcccgggg gctgcttttc tgaggggcca gaatgcaccg gttgaccttg ttgcatcact 1620 ggcccatgac tggctgcttt ggtcaggtgt aaaaaggtgt ttccagaggg tctgctcctc 1680 tcactatcgg accaggtttc catggagagc tcagcctccc agcaaggata gagaacttca 1740 aatggctcaa agaactgaga ggccacacat gtgtgacctg aatagtctct gctgcaaaac 1800 aaagggtttc ttaatgtaaa acgttctctt cctcacagag gggttcccag ctgctagtgg 1860 gcatgttgca ggcatttcct gggctgcatc aggttgtcat aagccagagg atcatttttg 1920 ggggctcat 1929 <210> 10 <211> 1167 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> sequence of STAR10 <220> <221> misc_feature <222> (452)..(1143) <223> n is a, c, g, or t on various positions <400> 10 aggtcaggag ttcaagacca gcctggccaa catggtgaaa ccctgtccct acaaaaaata 60 caaaaattag ccgggcgtgg tggggggcgc ctataatccc agctactcag gatgctgaga 120 caggagaatt gtttgaaccc gggaggtgga ggttgcagtg aactgagatc gcgccactgc 180 actccagcct ggtgacagag agagactccg tctcaacaac agacaaacaa acaaacaaac 240 aacaacaaaa atgtttactg acagctttat tgagataaaa ttcacatgcc ataaaggtca 300 ccttctacag tatacaattc agtggattta gtatgttcac aaagttgtac gttgttcacc 360 atctactcca gaacatttac atcaccccta aaagaagctc tttagcagtc acttctcatt 420 ctccccagcc cctgccaacc acgaatctac tntctgtctc tattctgaat atttcatata 480 aaggagtcct atcatatggg ccttttacgt ctaccttctt tcacttagca tcatgttttt 540 aagattcatc cacagtgtag cacgtgtcag ttaattcatt tcatcttatg gctggataat 600 gctctattgt atgcatatcc ctcactttgc ttatccattc atcaactgat tgacatttgg 660 gttatttcta ctttttgact attatgagta atgctgctat gaacattcct gtaccaatcg 720 ttacgtggac atatgctttc aattctcctg agtatgtaac tagggttgga gttgctgggt 780 catatgttaa ctcagtgttt catttttttg aagaactacc aaatggtttt ccaaagtgga 840 tgcaacactt tacattccca ccagcaagat atgaaggttc caatgtctct acatttttgc 900 caacacttgt gattttcttt tatttattta tttatttatt tatttttgag atggagtctc 960 actctgtcac ccaggctgga gtgcagtggc 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acatttgacg tttatttctt 600 gttcacctga cagttcagtg ttacctaaat ttacatgaag acccagaggc ccacgctcct 660 tcattttggg ctccaccgac ctccaaggtt tcagggccct ctgccccgcc ttctgcaccc 720 acaggggaag agagtggagg atgcacacgc ccaggcctgg aagtgacgca tgtggcttcc 780 ccgtccacag acttcaccca cagtccattg gccttcttaa gtcatggact cctgctgagc 840 tgccagggtg catgggaaat ccatgtgact gtgtgccctg gaggaagggg agcgtttcgg 900 tgagcacaca ggagtctttg ccactagacg ctgatgagga ttccccacag gcgatgaagc 960 atggagactc atcttgtaac aaacagatga gttgttgaca tctcttaagt ttactttgtg 1020 tgcagttttt attcagatag gaaaggctgt taaaatctta acacctaact ggaagaaggg 1080 ttttagagaa gtgtggtttt cagtaagcca gttctttcca caatccaaga aacgaaataa 1140 atttccagca tggagcagtt ggcaggtaag gtttttgttg tggtctcgcc caggcttgag 1200 tgtaaccggt gtggtcatag ctcactacat tctcaaactc ctggccttaa gtcatcctcc 1260 tgcctcagcc tcccaaaggc aagtaaggtt aagaataggg gaaaggtgaa gtttcacagc 1320 ttttctagaa ttctttttat tcaagggact ctcagatcat caaacccacc cagaatc 1377 <210> 12 <211> 1051 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> sequence of STAR12 <400> 12 atcctgcttc tgggaagaga gtggcctccc ttgtgcaggt gactttggca ggaccagcag 60 aaacccaggt ttcctgtcag gaggaagtgc tcagcttatc tctgtgaagg gtcgtgataa 120 ggcacgagga ggcaggggct tgccaggatg ttgcctttct gtgccatatg ggacatctca 180 gcttacgttg ttaagaaata tttggcaaga agatgcacac agaatttctg taacgaatag 240 gatggagttt taagggttac tacgaaaaaa agaaaactac tggagaagag ggaagccaaa 300 caccaccaag tttgaaatcg attttattgg acgaatgtct cactttaaat ttaaatggag 360 tccaacttcc ttttctcacc cagacgtcga gaaggtggca ttcaaaatgt ttacacttgt 420 ttcatctgcc tttttgctaa gtcctggtcc cctacctcct ttccctcact tcacatttgt 480 cgtttcatcg cacacatatg ctcatcttta tatttacata tatataattt ttatatatgg 540 cttgtgaaat atgccagacg agggatgaaa tagtcctgaa aacagctgga aaattatgca 600 acagtgggga gattgggcac atgtacattc tgtactgcaa agttgcacaa cagaccaagt 660 ttgttataag tgaggctggg tggtttttat tttttctcta ggacaacagc ttgcctggtg 720 gagtaggcct cctgcagaag gcattttctt aggagcctca acttccccaa gaagaggaga 780 gggcgagact ggagttgtgc tggcagcaca gagacaaggg 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<400> 14 ccctggacca gggtccgtgg tcttggtggg cactggcttc ttcttgctgg gtgttttcct 60 gtgggtctct ggcaaggcac tttttgtggc gctgcttgtg ctgtgtgcgg gaggggcagg 120 tgctctttcc tcttggagct ggaccctctg gggcgggtcc ccgtcggcct ccttgtgtgt 180 tttctgcacc tggtacagct ggatggcctc ctcaatgccg tcgtcgctgc tggagtcgga 240 cgcctcgggc gcctgtacgg cgctcgtgac tcgctttccc ctccttgcgg tgctggcgtt 300 ccttttaatc ccacttttat tctgtactgc ttctgaaggg cggtgggggt tgctggcttt 360 gtgctgccct ccttctcctg cgtggtcgtg gtcgtgacct tggacctgag gcttctgggc 420 tgcacgtttg tctttgctaa ccgggggagg tctgcagaag gcgaactcct tctggacgcc 480 catcaggccc tgccggtgca ccacctttgt agccggctct tggtgggatt tcgagagtga 540 cttcgccgaa ttttcatgtg tgtctggttt cttctccact gacccatcac atttttgggt 600 ctcatgctgt cttttctcat tcagaaactg ttctatttct gccctgatgc tctgctcaaa 660 ggagtctgct ctgctcatgc tgactgggga ggcagagccc tggtccttgc t 711 <210> 15 <211> 1876 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> sequence of STAR15 <400> 15 gagtccaaga tcaaggtgcc agcatcttgt gagggccttc 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cacagcctgt gtcatagagg gttggaggag atgactttaa ctgcctgtgg ttaggatccc 1800 tttcccccag gaatgtctgg gagcccactg ccgggtttgc tgtccgtctc gtttggactc 1860 agttctgcat gtactg 1876 <210> 16 <211> 1282 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> sequence of STAR16 <400> 16 cgcccacctc ggctttccaa agtgctggga ttacaggcat gagtcactgc gcccatcctg 60 attccaagtc tttagataat aacttaactt tttcgaccaa ttgccaatca ggcaatcttt 120 gaatctgcct atgacctagg acatccctct ccctacaagt tgccccgcgt ttccagacca 180 aaccaatgta catcttacat gtattgattg aagttttaca tctccctaaa acatataaaa 240 ccaagctata gtctgaccac ctcaggcacg tgttctcagg acctccctgg ggctatggca 300 tgggtcctgg tcctcagatt tggctcagaa taaatctctt caaatatttt ccagaatttt 360 actcttttca tcaccattac ctatcaccca taagtcagag ttttccacaa ccccttcctc 420 agattcagta atttgctaga atggccacca aactcaggaa agtattttac ttacaattac 480 caatttatta tgaagaactc aaatcaggaa tagccaaatg gaagaggcat agggaaaggt 540 atggaggaag gggcacaaag cttccatgcc ctgtgtgcac accaccctct cagcatcttc 600 atgtgttcac caactcagaa 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ctacctaccg 660 tctatttatc tatcatctat ctacttattt atctatctat ttatgcatgt gtaccaaccg 720 aaagttttag taaatgcaca aactgcgata taatgaaaat ggaaattttc aaaagaagag 780 aaatcacctg ccacctgact accttaacaa atgagtggtt ttcatctctc cttccaggcc 840 tgtcattttt acagtgcttt agtcataaaa caggtcctct attctattgt tttatgtcac 900 atgaaattgt accataagca ttttccatga tgtgactcca ctgtttcatt ttccattttt 960 ttccagaatg aagataacct cattgttttt ttcctgattg taaaaatgct ctgtgctctt 1020 tttttttttt tttaacaatg caggcagtac caaaaagtat gaagaagaat gtaatagttc 1080 ccatttccca tctcactctt taaggccagc attttggtga acatccatcc gaacaaatct 1140 ccacgcgttt atcaatttgt tgacttactc cttcttttat gtaaatatga acatgattta 1200 actgccagtc catttggaac cttaaagtga aggtttttta ttgttggggt ttgctatggt 1260 ctgaatatgt gtgtcccccc aaaatttatg ttgaatccta acgcccaatg cgattaggag 1320 gtggggccat taggaggtga ttaagtcatg aagtcatcag ccctaatgaa tgggatttgt 1380 ggccttgaaa agggacccca gagagctgcc ttgccccttc tgccatgtaa ggacacagtg 1440 aggagctagg aagggggcct cagcagagac caaatgtgat ggtgcctcga tattggactt 1500 cccagcctcc agaatgtgag aaatgaattt ctgttgttta taagtcaccc agtctatagt 1560 attttgttct agcagcccaa acagactaag tcagggttgt tgttttagga agtggggaat 1620 ggggccatgc atgggtgtac gccagaacaa aggaagccag caagtcctga aagatactgg 1680 aaaagggaat agtgggcacg tgcagtgtgt tagtttcctg aggctgctat aacaaagcac 1740 cacaggttgg gtggcttaaa taacagaaat tcattctccc atcattctgg ggaccagacg 1800 tctgaaatca agactcctat gccatgctcc ttctgaaggc tccaggggag g 1851 <210> 31 <211> 1701 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> sequence of STAR31 <220> <221> misc_feature <222> (159)..(1696) <223> n is a, c, g, or t on various positions <400> 31 cacccgcctt ggccccccag agtgctggga ttacaagtgt aaaccaccat tcctggctag 60 atttaatttt ttaaaaaata aagagaagta ggaatagttc attttaggga gagcccctta 120 actgggacag gggcaggaca ggggtgaggc ttcccttant tcaagctcac ctcaaaccca 180 cccaggactg tgtgtcacat tctccaataa aggaaaggtt gctgcccccg cctgtgagtg 240 ctgcagtgga gggtagaggg ccgtgggcag agtgcttcat ggactgctca tcaagaaagg 300 cttcatgaca atcggcccag ctgctgtcat cccacattct acttccagct aggagaaggc 360 ggcttgccca cagtcaccca gccggcaagt gtcacccctg ggttggaccc agagctatga 420 tcctgcccag gggtccagct gagaatcagg cccacgttct aggcagaggg gctcacctac 480 tgggactcca gtagctgtag tgcatggagg catcatggct gcagcagcct ggacctggtc 540 tcacactggc tgtccctgtg ggcaggccat cctcaatgcc aggtcaggcc caagcatgta 600 tcccagacaa tgacaatggg gtggaatcct ctcttgtccc agaagccact cctcactgtt 660 ctacctgagg aaggcagggg catggtggaa tcctgaagcc tgctgtgagg gtctccagcg 720 aacttgcaca tggtcagccc tgccttctcc tccctgaact agattgagcg agagcaagaa 780 ggacattgaa ccagcaccca aagaattttg gggaacggcc tctcatccag gtcaggctca 840 cctccttttt aaaatttaat taattaatta attaattttt ttttagagac agagtcttac 900 tgtgtggccc aggctgtagt gcagtggcac aatcatagtt cactgcagcc tcaaactccc 960 cacctcagcc tctggattag ctgagactac aggtgcacca ccaccacacc cagctaatat 1020 ttttattttt gtagagagag ggtttcacca tcttgcccag gctggtctca aactcctggg 1080 ctcaagtgat cccgcccagg tctgaaagcc cccaggctgg cctcagactg tggggttttc 1140 catgcagcca cccgagggcg cccccaagcc 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cagctttcgt ctaatcttga 240 gcagctagtt agcaaatatg agaatacagt tgttcccaga taatgcttta tgtctgacca 300 tcttaaactg gcgctgtttt tcaaaaactt aaaaacaaaa tccatgactc ttttaattat 360 aaaagtgata catgtctact tgggaggctg aggtggtggg aggatggctt gagtttgagg 420 ctgcagtatg ctactatcat gcctataaat agccgctgca ttccagcttg ggcaacatac 480 ccaggcccta tctcaaaaaa ataaaaagta atacatctac attgaagaaa attaatttta 540 ttgggttttt ttgcattttt attatacaca gcacacacag cacatatgaa aaaatgggta 600 tgaactcagg cattcaactg gaagaacagt actaaatcaa tgtccatgta gtcagcgtga 660 ctgaggttgg tttgtttttt cttttttctt ctcttctctt ctcttttctt tttttttgag 720 acggagcttt gctctttttg cccaggcttg attgcaatgg cgtgatctca g 771 <210> 33 <211> 1368 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> sequence of STAR33 <400> 33 gcttttatcc tccattcaca gctagcctgg cccccagagt acccaattct ccctaaaaaa 60 cggtcatgct gtatagatgt gtgtggcttg gtagtgctaa agtggccaca tacagagctc 120 tgacaccaaa cctcaggacc atgttcatgc cttctcactg agttctggct tgttcgtgac 180 acattatgac attatgatta tgatgacttg tgagagcctc agtcttctat agcactttta 240 gaatgcttta taaaaaccat ggggatgtca ttatattcta acctgttagc acttctgttc 300 gtattaccca tcacatccca acatcaattc tcatatatgc aggtacctct tgtcacgcgc 360 gtccatgtaa ggagaccaca aaacaggctt tgtttgagca acaaggtttt tatttcacct 420 gggtgcaggt gggctgagtc tgaaaagaga gtcagtgaag ggagacaggg gtgggtccac 480 tttataagat ttgggtaggt agtggaaaat tacaatcaaa gggggttgtt ctctggctgg 540 ccagggtggg ggtcacaagg tgctcagtgg gagagccttt gagccaggat gagccagaag 600 gaatttcaca aggtaatgtc atcagttaag gcagggactg gccattttca cttcttttgt 660 ggtggaatgt catcagttaa ggcaggaacc ggccattttc acttcttttg tgattcttca 720 cttgcttcag gccatctgga cgtataggtg caggtcacag tcacagggga taagatggca 780 atggcatagc ttgggctcag aggcctgaca cctctgagaa actaaagatt ataaaaatga 840 tggtcgcttc tattgcaaat ctgtgtttat tgtcaagagg cacttatttg tcaattaaga 900 acccagtggt agaatcgaat gtccgaatgt aaaacaaaat acaaaacctc tgtgtgtgtg 960 tgtgtgtgag tgtgtgtgta tgtgtgtgtg tgtgtattag agaggaaaag cctgtatttg 1020 gaggtgtgat tcttagattc taggttcttt cctgcccacc ccatatgcac ccaccccaca 1080 aaagaacaaa caacaaatcc caggacatct tagcgcaaca tttcagtttg catattttac 1140 atatttactt ttcttacata ttaaaaaact gaaaatttta tgaacacgct aagttagatt 1200 ttaaattaag tttgttttta cactgaaaat aatttaatat ttgtgaagaa tactaataca 1260 ttggtatatt tcattttctt aaaattctga acccctcttc ccttatttcc ttttgacccg 1320 attggtgtat tggtcatgtg actcatggat ttgccttaag gcaggagg 1368 <210> 34 <211> 755 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> sequence of STAR34 <400> 34 actgggcacc ctcctaggca ggggaatgtg agaactgccg ctgctctggg gctgggcgcc 60 atgtcacagc aggagggagg acggtgttac accacgtggg aaggactcag ggtggtcagc 120 cacaaagctg ctggtgatga ccaggggctt gtgtcttcac tctgcagccc taacacccag 180 gctgggttcg ctaggctcca tcctgggggt gcagaccctg agagtgatgc cagtgggagc 240 ctcccgcccc tccccttcct cgaaggccca ggggtcaaac agtgtagact cagaggcctg 300 agggcacatg tttatttagc agacaaggtg gggctccatc agcggggtgg cctggggagc 360 agctgcatgg gtggcactgt ggggagggtc tcccagctcc ctcaatggtg ttcgggctgg 420 tgcggcagct ggcggcaccc tggacagagg tggatatgag ggtgatgggt ggggaaatgg 480 gaggcacccg agatggggac agcagaataa agacagcagc agtgctgggg ggcaggggga 540 tgagcaaagg caggcccaag acccccagcc cactgcaccc tggcctccca caagccccct 600 cgcagccgcc cagccacact cactgtgcac tcagccgtcg atacactggt ctgttaggga 660 gaaagtccgt cagaacaggc agctgtgtgt gtgtgtgcgt gtatgagtgt gtgtgtgtga 720 tccctgactg ccaggtcctc tgcactgccc ctggg 755 <210> 35 <211> 1193 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> sequence of STAR35 <220> <221> misc_feature <222> (312)..(1191) <223> n is a, c, g, or t on various positions <400> 35 cgacttggtg atgcgggctc ttttttggtt ccatatgaac tttaaagtag tcttttccaa 60 ttctgtgaag aaagtcattg gtaggttgat ggggatggca ttgaatctgt aaattacctt 120 gggcagtatg gccattttca caatgttgat tcttcctatc catgatgatg gaatgttctt 180 ccattagttt gtatcctctt ttatttcctt gagcagtggt ttgtagttct ccttgaagag 240 gtccttcaca tcccttgtaa gttggattcc taggtatttt attctctttg aagcaaattg 300 tgaatgggag tncactcacg atttggctct ctgtttgtct gctgggtgta taaanaatgt 360 ngtgatnttn gtacattgat ttngtatccn tgagacttng ctgaatttgc ttnatcngct 420 tnngggaacc ttttgggctg aaacnatggg attttctaaa tatacaatca tgtcgtctgc 480 aaacagggaa caatttgact tcctcttttc ctaattgaat acactttatc tccttctcct 540 gcctaattgc cctgggcaaa acttccaaca ctatgntngn aataggagnt ggtgagagag 600 ggcatccctg ttcttgttgc cagnttttca aagggaatgc ttccagtttt ggcccattca 660 gtatgatatg ggctgtgggt ngtgtcataa atagctctta tnattttgaa atgtgtccca 720 tcaataccta atttattgaa agtttttagc atgaangcat ngttgaattt ggtcaaaggc 780 tttttctgca tctatggaaa taatcatgtg gtttttgtct ttggctcntg tttatatgct 840 ggatnacatt tattgatttg tgtatatnga acccagcctn ncatcccagg gatgaagccc 900 acttgatcca agcttggcgc gcngnctagc tcgaggcagg caaaagtatg caaagcatgc 960 atctcaatta gtcagcaccc atagtccgcc cctacctccg cccatccgcc cctaactcng 1020 nccgttcgcc cattctcgcc catggctgac taatnttttt annatccaag cggngccgcc 1080 ctgcttganc attcagagtn nagagnnttg gaggccnagc cttgcaaaac tccggacngn 1140 ttctnnggat tgaccccnnt taaatatttg gttttttgtn ttttcanngg nga 1193 <210> 36 <211> 1712 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> sequence of STAR36 <400> 36 gatcccatcc ttagcctcat cgatacctcc tgctcacctg tcagtgcctc tggagtgtgt 60 gtctagccca ggcccatccc ctggaactca ggggactcag gactagtggg catgtacact 120 tggcctcagg ggactcagga ttagtgagcc ccacatgtac acttggcctc agtggactca 180 ggactagtga gccccacatg tacacttggc ctcaggggac tcaggattag tgagccccca 240 catgtacact tggcctcagg ggactcagga ttagtgagcc ccacatgtac acttggcctc 300 aggggactca ggactagtga gccccacatg tacacttggc ctcaggggac tcagaactag 360 tgagccccac atgtacactt ggcttcaggg gactcaggat tagtgagccc cacatgtaca 420 cttggacacg tgaaccacat cgatgtgctg cagagctcag ccctctgcag atgaaatgtg 480 gtcatggcat tccttcacag tggcacccct cgttccctcc ccacctcatc tcccattctt 540 gtctgtcttc agcacctgcc atgtccagcc ggcagattcc accgcagcat cttctgcagc 600 acccccgacc acacacctcc ccagcgcctg cttggccctc cagcccagct cccgcctttc 660 ttccttgggg aagctccctg gacagacacc ccctcctccc agccatggct ttttcctgct 720 ctgccccacg cgggaccctg ccctggatgt gctacaatag acacatcaga tacagtcctt 780 cctcagcagc cggcagaccc agggtggact gctcggggcc tgcctgtgag gtcacacagg 840 tgtcgttaac ttgccatctc agcaactagt gaatatgggc agatgctacc ttccttccgg 900 ttccctggtg agaggtactg gtggatgtcc tgtgttgccg gccacctttt gtccctggat 960 gccatttatt tttttccaca aatatttccc aggtctcttc tgtgtgcaag gtattagggc 1020 tgcagcgggg gccaggccac agatctctgt cctgagaaga cttggattct agtgcaggag 1080 actgaagtgt atcacaccaa tcagtgtaaa ttgttaactg ccacaaggag aaaggccagg 1140 aaggagtggg gcatggtggt gttctagtgt tacaagaaga agccagggag ggcttcctgg 1200 atgaagtggc atctgacctg ggatctggag gaggagaaaa atgtcccaaa agagcagaga 1260 gcccacccta ggctctgcac caggaggcaa cttgctgggc ttatggaatt cagagggcaa 1320 gtgataagca gaaagtcctt gggggccaca attaggattt ctgtcttcta aagggcctct 1380 gccctctgct gtgtgacctt gggcaagtta cttcacctct agtgctttgg ttgcctcatc 1440 tgtaaagtgg tgaggataat gctatcacac tggttgagaa ttgaagtaat tattgctgca 1500 aagggcttat aagggtgtct aatactagta ctagtaggta cttcatgtgt cttgacaatt 1560 ttaatcatta ttattttgtc atcaccgtca ctcttccagg ggactaatgt ccctgctgtt 1620 ctgtccaaat taaacattgt ttatccctgt gggcatctgg cgaggtggct aggaaagcct 1680 ggagctgttt cctgttgacg tgccagacta gt 1712 <210> 37 <211> 1321 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> sequence of STAR37 <400> 37 aggatcacat ttaaggaagt gtgtggggtc cctggatgac accagcaccc agtgcggctc 60 tgtctggcaa ccgctcccaa ggtggcagga gtgggtgtcc cctgtgtgtc agtgggcagc 120 tcctgctgag cctacagctc actggggagc ctgacagcgg ggccatgtgc ctgacactcc 180 tctctgcttg tggacctggc aaggcaggga gcagaaaaca gagccacttg aaggctttct 240 gtctgcgtct gtgtgcagtg tggatttagt tgtgcttttt tcttgctggg agagcacagc 300 caccatttac aagcagtgtc accctcatgg gtggcgagga cagaacagga gcctctgctc 360 tctgtaccta tctgggcccg gtgggctccc ttgtcctggc ttccatctct gtctcagcga 420 ccattcagcc ctgcgcagga acacatgttg cttagaaaag ccaaattcag cccttgtctc 480 tgcctcctct ggtctcatga tgtgcatctg ttaccttgaa actggaaacc agtctatcaa 540 tgtctgtgcc aattttttat tccctcccca acctccttcc ccatacgact ttttatttat 600 gtaggatgtg tgctgtctaa tgatgggatg accacatttt tccatgttct aaaagtgctc 660 ctctcccgca gggtcccagg gctggtggtt gctttgggtc tacagctacg tcttacccgc 720 ctcctgcctc aacagcctgt gtggtggcaa agccggtgtg gggctgggga acgcagcgtt 780 ctccaggagg gggacccggc tctccttctg cagtgcaggc gaaggcctag atgccagtgt 840 gacctcccac aaggcgtggc ttccagactc cccggctgga agtgatgctt ttttgcctcc 900 ggccctgggt ttgaagcagc ctggctttct cttggtaagt ggctggtgtc ttagcagctg 960 caatctgagc tcagccacct acacaccacc gtggccgaca ctttcattaa aaagtttcct 1020 gagacgactt gcgtgcatgt tgacttcatg atcagcgccg ctgggaagaa cccctgagcc 1080 ggtggggtgg ggctggaagc agcaggtgca gtgatggggc tgggtgccca ggaggcctca 1140 gtgctcaatc aggccaaggt ggccaagccc aggctgcagg gaaggccggc ctgggggttg 1200 tgggtgagca caggcaggca ccagctgggc agtgttagga tgctggagca gcatccgtaa 1260 ccccactgag tggggtagtc tggttggggc agggaccgct gttgctttgg cagagagaga 1320 t 1321 <210> 38 <211> 1445 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> sequence of STAR38 <220> <221> misc_feature <222> (348)..(949) <223> n is a, c, g, or t on various positions <400> 38 gatctatggg agtagcttcc ttagtgagct ttcccttcaa atactttgca accaggtaga 60 gaattttgga gtgaaggttt tgttcttcgt ttcttcacaa tatggatatg catcttcttt 120 tgaaaatgtt aaagtaaatt acctctcttt tcagatactg tcttcatgcg aacttggtat 180 cctgtttcca tcccagcctt ctataaccca gtaacatctt ttttgaaacc agtgggtgag 240 aaagacacct ggtcaggaac gcggaccaca ggacaactca ggctcaccca cggcatcaga 300 ctaaaggcaa acaaggactc tgtataaagt accggtggca tgtgtatnag tggagatgca 360 gcctgtgctc tgcagacagg gagtcacaca gacacttttc tataatttct taagtgcttt 420 gaatgttcaa gtagaaagtc taacattaaa tttgattgaa caattgtata ttcatggaat 480 attttggaac ggaataccaa aaaatggcaa tagtggttct ttctggatgg aagacaaact 540 tttcttgttt aaaataaatt ttattttata tatttgaggt tgaccacatg accttaagga 600 tacatataga cagtaaactg gttactacag tgaagcaaat taacatatct accatcgtac 660 atagttacat ttttttgtgt gacaggaaca gctaaaatct acgtatttaa caaaaatcct 720 aaagacaata catttttatt aactatagcc ctcatgatgt acattagatc gtgtggttgt 780 ttcttccgtc cccgccacgc cttcctcctg ggatggggat tcattcccta gcaggtgtcg 840 gagaactggc gcccttgcag ggtaggtgcc ccggagcctg aggcgggnac tttaanatca 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tccatattgt gttaaatgac aggattccct gcctttttaa 240 ggctgaatag tatttcattg taatatatat acatacacac acacatatac acacacatat 300 atatacatat atacatatat gtacatagat acatatatat gtacatatat acacacacat 360 atacacacat atatacacat atatacatat acatatatac acatatatgt acatatatat 420 aacttttttt catttatcca ttcacttaat acatatgatg gagggcttta tatatgccag 480 gctctgtgat gaatgctgga aattcaatag tgagaaagac tcagtctctg cctccaaaga 540 gcatcatggg ctaggtgctg caacgaggaa ttgccaactg ttgtcatgag agcacagaga 600 agggactcaa ccagccttga agaatcaggg gaggcttcta agctaatggt gtgtgcctgg 660 ggatcacatt gtttcaagca gcagtaacag gatgtgctca ggtccagatg tgagagagag 720 agagagcata tgtcttcaag aaactaacag tagctcccta tagctgaagc aggagtacaa 780 aatagtgagt ttaagtgatg aggcaagaga tatgaagaag cttgaccatg cagctacacc 840 gggcagcatg ccctctgaga catctcatgg aagccggaaa tgggagtgcc ttgataccaa 900 gccagagaaa ttataatact aagtagatag actgagcagc actcctcctg ggaagaatga 960 gacaagccct gaatttggag gtaagttgtg gattggtgat tagaggagag gtaacaggca 1020 ccaaagcaag aaatagtatt gatgcaaagc 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aatgcacttc tccacgatga ctaggctttt 1920 cactcatagg cgtctggctc cctagaactg aaaacatatg ttcacaagaa gacttgcaaa 1980 tatatattct cccacgtcag gagatatttg ctatgcattt aactgacata agattagtgc 2040 tagagtttat aatgaggttc ttcaaatcta aaagaaaatg caaagcatat aatagtaagg 2100 ggtgcaggcc aggcgcagtg gctcactctg taatcccagc actttgggag gccgaggtgg 2160 gcggatcaca aggtcaggag ttcgagacca acctggccaa catagtgaaa ccctgtctct 2220 actaaaaata caaaaactag ccaggtgcgg tgtcatgcac ctgtagtccc agctactcgg 2280 gaggccgagg caggagaatc acttgaacct gggaggtgga ggttgcagtg a 2331 <210> 40 <211> 1071 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> sequence of STAR40 <400> 40 gctgtgattc aaactgtcag cgagataagg cagcagatca agaaagcact ccgggctcca 60 gaaggagcct tccaggccag ctttgagcat aagctgctga tgagcagtga gtgtcttgag 120 tagtgttcag ggcagcatgt taccattcat gcttgacttc tagccagtgt gacgagaggc 180 tggagtcagg tctctagaga gttgagcagc tccagcctta gatctcccag tcttatgcgg 240 tgtgcccatt cgctttgtgt ctgcagtccc ctggccacac ccagtaacag ttctgggatc 300 tatgggagta gcttccttag tgagctttcc cttcaaatac tttgcaacca ggtagagaat 360 tttggagtga aggttttgtt cttcgtttct tcacaatatg gatatgcatc ttcttttgaa 420 aatgttaaag taaattacct ctcttttcag atactgtctt catgcgaact tggtatcctg 480 tttccatccc agccttctat aacccagtaa catctttttt gaaaccagtg ggtgagaaag 540 acacctggtc aggaacgcgg accacaggac aactcaggct cacccacggc atcagactaa 600 aggcaaacaa ggactctgta taaagtaccg gtggcatgtg tattagtgga gatgcagcct 660 gtgctctgca gacagggagt cacacagaca cttttctata atttcttaag tgctttgaat 720 gttcaagtag aaagtctaac attaaatttg attgaacaat tgtatattca tggaatattt 780 tggaacggaa taccaaaaaa tggcaatagt ggttctttct ggatggaaga caaacttttc 840 ttgtttaaaa taaattttat tttatatatt tgaggttgac cacatgacct taaggataca 900 tatagacagt aaactggtta ctacagtgaa gcaaattaac atatctacca tcgtacatag 960 ttacattttt ttgtgtgaca ggaacagcta aaatctacgt atttaacaaa aatcctaaag 1020 acaatacatt tttattaact atagccctca tgatgtacat tagatctcta a 1071 <210> 41 <211> 1135 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> sequence of STAR41 <400> 41 cgtgtgcagt ccacggagag tgtgttctcc tcatcctcgt tccggtggtt gtggcgggaa 60 acgtggcgct gcaggacacc aacatcagtc acgtatttca ttctggaaaa aaaagtagca 120 caagcctcgg ctggttccct ccagctctta ccaggcagcc taagcctagg ctccattccc 180 gctcaaggcc ttcctcaggg gcctgctcac cacaggagct gttcccatgc agggactaag 240 gacatgcagc ctgcatagaa accaagcacc caggaaaaca tgattggatg gagcgggggg 300 gtgtggtctc tagccttgtc cacctccggt cctcatgggt ctcacacctc ctgagaatgg 360 gcaccgcaga ggccacagcc catacagcca agatgacaga ctccgtaagt gacagggatc 420 cacagcagag tgggtgaaat gttccctata aactttacaa aattaatgag ggcaggggga 480 ggggagaaat gaaaatgaac ccagctcgca gcacatcagc atcagtcact aggtcggcgt 540 gctctctgac tgcttcctcg tagctgcttg gtgtctcatt gcctcagaag catgtagacc 600 ctgtcacaag attgtagttc ccctaactgc tccgtagatc acaacttgaa ccttaggaaa 660 tgctgttttc cctttgagat attcctttgg gtcctgtata ctgatggagc tactgactga 720 gctgctccga aggaccccac gaggagctga ctaaaccaag agtgcagttt gtacaccctg 780 atgattacat cccccttgcc ccaccaatca actctcccaa ttttccagcc cctcaccctc 840 cagtcccctt aaaagcccca 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ggacacggtg gcgtatgcct gtaatcccag ctactcggga agctgaggca ggagaactgc 540 ttgaacccag gaggcggagg ttgtggtgag tcgagattgc gccattgcac tccagcctgg 600 gcaacaagag cgaaattcca tctcaaaaaa aagaaaaaag tatgactgta tttagagtag 660 tatgtggatt tgaaaaatta ataagtgttg ccaacttacc ttagggttta taccatttat 720 gagggtgtcg gtttc 735 <210> 43 <211> 1227 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> sequence of STAR43 <400> 43 caaatagatc tacacaaaac aagataatgt ctgcccattt ttccaaagat aatgtggtga 60 agtgggtaga gagaaatgca tccattctcc ccacccaacc tctgctaaat tgtccatgtc 120 acagtactga gaccaggggg cttattccca gcgggcagaa tgtgcaccaa gcacctcttg 180 tctcaatttg cagtctaggc cctgctattt gatggtgtga aggcttgcac ctggcatgga 240 aggtccgttt tgtacttctt gctttagcag ttcaaagagc agggagagct gcgagggcct 300 ctgcagcttc agatggatgt ggtcagcttg ttggaggcgc cttctgtggt ccattatctc 360 cagcccccct gcggtgttgc tgtttgcttg gcttgtctgg ctctccatgc cttgttggct 420 ccaaaatgtc atcatgctgc accccaggaa gaatgtgcag gcccatctct tttatgtgct 480 ttgggctatt ttgattcccc gttgggtata ttccctaggt aagacccaga agacacagga 540 ggtagttgct ttgggagagt ttggacctat gggtatgagg taatagacac agtatcttct 600 ctttcatttg gtgagactgt tagctctggc cgcggactga attccacaca gctcacttgg 660 gaaaacttta ttccaaaaca tagtcacatt gaacattgtg gagaatgagg gacagagaag 720 aggccctaga tttgtacatc tgggtgttat gtctataaat agaatgcttt ggtggtcaac 780 tagacttgtt catgttgaca tttagtcttg ccttttcggt ggtgatttaa aaattatgta 840 tatcttgttt ggaatatagt ggagctatgg tgtggcattt tcatctggct ttttgtttag 900 ctcagcccgt cctgttatgg gcagccttga agctcagtag ctaatgaaga ggtatcctca 960 ctccctccag agagcggtcc cctcacggct cattgagagt ttgtcagcac cttgaaatga 1020 gtttaaactt gtttattttt aaaacattct tggttatgaa tgtgcctata ttgaattact 1080 gaacaacctt atggttgtga agaattgatt tggtgctaag gtgtataaat ttcaggacca 1140 gtgtctctga agagttcatt tagcatgaag tcagcctgtg gcaggttggg tggagccagg 1200 gaacaatgga gaagctttca tgggtgg 1227 <210> 44 <211> 1586 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> sequence of STAR44 <400> 44 cacctgcctc agcctcccaa agtgctgaga ttcaaagaaa ttttcatgga gaggggacag 60 atggagtcaa ttcttgtggg gtgaacatga gtaccacagt tagactgagg ttgggaaaga 120 ttttccagac aattggaaga gcatgtgaaa gacacagatt ttgagaaatg ttaagtctag 180 ggaactgcaa ggcttttggc acaagaaagc cactgtagac tatagaggca ggatgcctag 240 attcaaatcc caactgctac acttctaagc tttgtaattt tggcaagttt ttaccctcta 300 ttttcttatc tataaaatat agattttata tatatagata tagatatata gatagataat 360 aattgtgcat gcctaataaa gttgtcaaag attaaatgtt atatgtgaag tattttgtac 420 ggtgatagga acccaggaag ggctctatga atattatgta ttattattat tctaaagtag 480 ctggaataca atgttcaaag gagatagtgg caggagataa gtttgaattg aaagattgag 540 gccagaacat aaagtgcctc ctatattata ttttacataa ttggaacatc attgaaaaat 600 ttaagtatta tttatgtgtg tatgtgtgtt ttatataatt aattctagtt catcatttta 660 aaatatcttt ctgatgtcac tgtgaacaac agatgagaag aagtgaatcc tgagttaagg 720 agaccagctc tctgattact gccataatcc agggagggta ccataaggat ttcaactgga 780 agtgaatcca tcatgatgga gaggaaggac agggctgaaa aatacttagg aagtagtatc 840 agtaggactg gttaagagag agcagaggca ggctacaggg gttggaggtg tcaatcacag 900 agatagggaa aatgggagga gaagcaggct ttgaaaaagt ggcttgtctt gtaaaattat 960 gtgctgttaa aacagtacaa gaaattaata tattcaatcc caaaatacag ggacaattct 1020 ttttgaaaga gttacccaga tagtcttcct tgaagttttc agttaaagaa atttcttgtt 1080 aacaaataat gtagtcatag aagaaaacac ttaaaacttt attgaataaa gctaataaat 1140 catttaatat aatttatagg aaattgttac ataacacaca cattcaatac tttttgctaa 1200 agtataaatt aatggaagga gagcacgcac acagaggttg aattatgttt atgactttat 1260 tagtcaagaa tacaaaattg agtagctaca tcaagcagaa gcacatgctt tacaatccag 1320 cacagaatcc cttgacatcc aaactcccga aacagacatg taaatacaga tgacattgtc 1380 agaacaaaat agggtctcac ccgacctata atgttctttt cttgatataa atatgcacat 1440 gaattgcata cggtcatatg gttccaatta ccattatttc ctctgggctt agctatccat 1500 ctaaggggaa tttacaccaa cactgtactt ctacttgcaa gaatatatga aagcatagtt 1560 aacttctggc ttaggacccc aactca 1586 <210> 45 <211> 1981 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> sequence of STAR45 <400> 45 atggatcata gggtaaataa atttataatt tcttgagaaa gcttcgtact gttttccaag 60 atggctgtac taatttccat tcctaccaac agtgtacagg gtttcttttt ctccacatcc 120 tcaccaacac ttatcttcca tcttttttta taatagccct agtaaaatgt gtgaggtgat 180 atctcattgt ggcattgatt tgcacttctc tgataattag gaatgtttat gattttttca 240 tgtacctggt tggccttttg tatgatgtag gaaatgtcta ttctgattct ttgcttattt 300 tttaataagc atagtttttt tcttattttt gagtaggttg agttgcttat atattattat 360 atgagcccct tacctgatgt atggtttaaa aatattatcc catttgtggg ttctcttaat 420 tctatcattg cttcttttcc tgtggaaaag ttttaagttt tatgcagtct catttgtgtg 480 ttttgctttt gttgcctttt ggaataatct acagaaaatc atagctcagg ccaatgtcat 540 acagtctcct tctatatttc cttgtagtag ttttacattt aaactttaat tttgatttga 600 tgcttgtata aagagcaaaa taaaagtcaa attttattct tctgtatgtg gatagtcagt 660 tttgtctaca ccatttattg aaaataattt tctttcttca ctgtgtattt ttagttattt 720 tatcaaaaaa tcaattgacc acagacacac ggatttattt acaggttcta tatccctttg 780 tactgtttta catgtctgtt tttatgccat tgctatgctg ttttaattcc tatagctttg 840 taatagagtt tggagtcagg tagtctgatg cctccagctt tgttcttttt gttcaagatt 900 gctttggttg gtccaggtct tttgtggttc catacaaatt ttagcagtaa tttttctatt 960 tctgtgaaga atgacattgg aatttgatag tggttgcatt taatctgtag attgctttgg 1020 gtagcattga cacttttaca atactaattt ttgaatccat caatgaagga tgtttctcca 1080 tttatttatg ccattttaat ttttttcatc aatgtgctat agttttcagt atgtaaatct 1140 tttatggttt tgattaaatt tactcctgtc ttttatatat ttatatatct gttttgattc 1200 tattataaat tgaattgcct ttatttttca ggtaatagtt tgtcattagt taatagaaac 1260 aataatgata tttgtatgtt gattttgtaa ctattaactt tattgaattt cttcatcagc 1320 tataaccatt tattttggtg gaatctttaa gattttctct atcttaagat tatattttca 1380 aaaaacagaa acaatcttac ctcttccttc cctatgtgga tttcttttac gtctttgtct 1440 tgtgtaactg ttctggctag gcaattacac ataatgtttt catcatttat aattttacat 1500 cacatccatc tattgtggca cattgattgc tacttttcaa gttgtaaacc tggacattta 1560 tcactactct tcctccaata caggagtcca tggcgtggtg tgggccctac tgtgccacag 1620 tccagggcac ggctgggctg aggttctctt gtgcaagagt ccgtggctct gcggagcaag 1680 agttctccag tgccttagtc cagggttagg caggggtggg gctccttcag tagcttagtc 1740 cagtgcgccg 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<213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> sequence of STAR48 <400> 48 atcatgtatt tgttttctga attaattctt agatacatta atgttttatg ttaccatgaa 60 tgtgatatta taatataata tttttaattg gttgctactg tttataagaa tttcattttc 120 tgtttacttt gccttcatat ctgaaaacct tgctgatttg attagtgcat ccacaaattt 180 tcttggattt tctatgggta attacaaatc tccacacaat gaggttgcag tgagccaaga 240 tcacaccact gtactccagc ctgggcgaca gagtgagaca ccatctcaca aaaacacata 300 aacaaacaaa cagaaactcc acacaatgac aacgtatgtg ctttcttttt ttcttcctct 360 ttctataata tttctttgtc ctatcttaac tgaactggcc agaaacccca ggacaatgat 420 aaatacgagc agtgtcaaca gacatctcat tccctttcct agcttttata aaaataacga 480 ttatgcttca acattacata tggtggtgtc gatggttttg ttatagataa gcttatcagg 540 ttaagaaatt tgtctgcgtt tcctagtttg gtataaagat tttaatataa atgaatgttg 600 tattttatca tcttattttt ttcctacatc tgctaaggta atcctgtgtt ttcccctttt 660 caatctccta atgtggtgaa tgacattaaa ataccttcta ttgttaaaat attcttgcaa 720 cgctgtatag aaccaatgcc tttattctgt attgctgatg gatttttgaa aaatatgtag 780 gtggacttag 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tttttttttt tttttttttt atgggagcca 1020 tgttaatggg tgtaaggtga tatttcatta tagttttgat ttgcatttcc ctaatgatta 1080 gtgatgttaa gcatctcttc atgtgcctat tggccatttg tatatcttct ttaaaaatat 1140 atatatactc attcctttgc ccatttttga attatgttta ttttttgtta ttgagtttca 1200 atacttttct atataaccta ggtattaatc ctttatcaga cttaagattt gcaaatattc 1260 tctttcattc cacaggttgc taattctctc tgttggtaat atcttttgat gctgttgtgt 1320 ccagaattga ttcattcctg tgggttcttg gtctcactga cttcaagaat aaagctgcgg 1380 accctagtgg tgagtgttac acttcttata gatggtgttt ccggagtttg ttccttcaga 1440 tgtgtccaga gtttcttcct tccaatgggt tcatggtctt gctgacttca ggaatgaagc 1500 cgcagacctt cgcagtgagg tttacagctc ttaaaggtgg cgtgtccaga gttgtttgtt 1560 ccccctggtg ggttcgtggt cttgctgact tcaggaatga agccgcagac cctcgcagtg 1620 agtgttacag ctcataaagg tagtgcggac acagagtgag ctgcagcaag atttactgtg 1680 aagagcaaaa gaacaaagct tccacagcat agaaggacac cccagcgggt tcctgctgct 1740 ggctcaggtg gccagttatt attcccttat ttgccctgcc cacatcctgc tgattggtcc 1800 attttacaga gtactgattg gtccatttta 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cagttatttc tctggcgtaa gcaataccag 120 gaaggaagtc ttactgctgt cgccgccgga gaacaggttg ttcctgcctc tgaacttgct 180 gccgccatga agcagattaa agaactccag cgcctgctcg gcaagaaaac gatggaaaat 240 gaactcctca aagaagccgt tgaatatgga cgggcaaaaa agtggatagc gcacgcgccc 300 ttattgcccg gggatgggga gtaagcttag tcagccgttg tctccgggtg tcgcgtgcgc 360 agttgcacgt cattctcaga cgaaccgatg actggatgga tggccgccgc agtcgtcaca 420 ctgatgatac ggatgtgctt ctccgtatac accatgttat cggagagctg ccaacgtatg 480 gttatcgtcg ggtatgggcg ctgcttcgca gacaggcaga acttgatggt atgcctgcga 540 tcaatgccaa acgtgtttac cggatcatgc gccagaatgc gctgttgctt gagcgaaaac 600 ctgctgtacc gccatcgaaa cgggcacata caggcagagt ggccgtgaaa gaaagcaatc 660 agcgatggtg ctctgacggg ttcgagttct gctgtgataa cggagagaga ctgcgtgtca 720 cgttcgcgct ggactgctgt g 741 <210> 57 <211> 1365 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> sequence of STAR57 <400> 57 tccttctgta aataggcaaa atgtatttta gtttccacca cacatgttct tttctgtagg 60 gcttgtatgt tggaaatttt atccaattat tcaattaaca ctataccaac 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ggagaaggca ctgatgggct gtgttccatt 720 taggaaggat ggacggttgt gagacgggta agtcagaacg ggctgcccac ctcggccgag 780 agggccccgt ggtgggttgg caccatctgg gcctggagag ctgctcagga ggctctctag 840 ggctgggtga ccaggnctgg ggtacagtag ccatgggagc aggtgcttac ctggggctgt 900 ccctgagcag gggctgcatt gggtgctctg tgagcacaca cttctctatt cacctgagtc 960 ccnctgagtg atgagnacac ccttgttttg cagatgaatc tgagcatgga gatgttaagt 1020 ggcttgcctg agccacacag cagatggatg gtgtagctgg gacctgaggg caggcagtcc 1080 cagcccgagg acttcccaag gttgtggcaa actctgacag catgacccca gggaacaccc 1140 atctcagctc tggtcagaca ctgcggagtt gtgttgtaac ccacacagct ggagacagcc 1200 accctagccc cacccttatc ctctcccaaa ggaacctgcc ctttcccttc attttcctct 1260 tactgcattg agggaccaca cagtgtggca gaaggaacat gggttcagga cccagatgga 1320 cttgcttcac agtgcagccc tcctgtcctc ttgcagagtg cgtcttccac tgtgaagttg 1380 ggacagtcac accaactcaa tactgctggg cccgtcacac ggtgggcagg caacggatgg 1440 cagtcactgg ctgtgggtct gcagaggtgg 1470 <210> 62 <211> 1011 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature 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<212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> sequence of STAR64 <400> 64 tggatcagat ttgttttata ccctcccttc tactgctctg agagttgtac atcacagtct 60 actgtatctg tttcccatta ttataatttt tttgcactgt gcttgcctga agggagcctc 120 aagttcatga gtctccctac cctcctccca aatgagacat ggacctttga atgctttcct 180 gggaccacca ccccaccttt catgctgctg ttatccagga ttttagttca acagtgtttt 240 aaccccccaa atgagtcatt tttattgttt cgtatagtga atgtgtattt gggtttgctt 300 atatggtgac ctgtttattt gctcctcatt gtacctcatg ctctgctctt tccttctaga 360 ttcagtctct ttcctaatga ggtgtctcgc agcaattctt tacaagacag ccaagatagg 420 ccagctctca gagcacttgt tgtctgaaaa agtcttgtct tatttaattt ctttttctta 480 gagatggggt ctcattatgt tacccacact ggtctcaaac ttctggctta aagcggtcct 540 cccaccttgg cctcccaaag tgctaggatt acaggcgtga gcgacctcgt ccagcctgtc 600 tgagaaagcg tttgttttgc ccttgctctc agatgacagt ttggggatag aattctaggt 660 ggacggtttt tttccttcag ccctttgaag agtctgtatt ttcattatct ccctgcatta 720 gatgttcttt tgcaagtaac gtgtcttttc tctctgggta ttcttaaggt tttctctttg 780 cctttggtga gctgcagtgg atttgctttt ttcaagaggt caagagaaag gaaagtgtga 840 ggtttctgtt ttttactgac aatttgtttg ttgatttgtt ttcccaccca gaggttcctt 900 gccactttgc caggctggaa ggcagacttc ttctggtgtc ctgttcacag acggggcagc 960 ctgcggaagg ccctgccaca tgcagggcct cggtcctcat tcccttgcat gtggacccgg 1020 gcgtgactcc tgttcaggct ggcacttccc agagctgagc cccagcctga ccttcctccc 1080 atactgtctt cacaccccct cctttcttct gatacctgga ggttttcctt tctttcctgt 1140 cacctccact tggattttaa atcctctgtc tgtggaattg tattcggcac aggaagatgc 1200 ttgcaagggc caggctcatc agccctgtcc ctgctgctgg aagcagcaca gcagagcctc 1260 atgctcaggc tgagatggag cagaggcctg cagacgagca cccagctcag ctggggttgg 1320 cgccgatggt ggagggtcct cgaaagctct ggggacgatg gcagagctat tggcagggga 1380 gccgcagggt cttttgagcc cttaaaagat ctct 1414 <210> 65 <211> 1310 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> sequence of STAR65 <400> 65 gtgaatgttg atggatcaaa tatctttctg tgttgtttat caaagttaaa ataaatgtgg 60 tcatttaaag gacaaaagat gaggggttgg agtctgttca agcaaagggt atattaggag 120 aaaagcagaa ttctctccct gtgaagggac agtgactcct attttccacc tcatttttac 180 taactctcct aactatctgc ttaggtagag atatatccat gtacatttat aaaccacagt 240 gaatcatttg attttggaat aaagatagta taaaatgtgt cccagtgttg atatacatca 300 tacattaaat atgtctggca gtgttctaat tttacagttg tccaaagata atgttagggc 360 atactggcta tggatgaagc tccaatgttc agattgcaaa gaaacttaga attttactaa 420 tgaaaccaaa tacatcccaa gaaatttttc agaagaaaaa aagagaaact agtagcaaag 480 taaagaatca ccacaatatc atcagatttt ttttatatgt agaatattta ttcagttctt 540 ttttcaagta caccttgtct tcattcattg tactttattt tttgtgaagg tttaaattta 600 tttcttctat gtgtttagtg atatttaaaa tttttattta atcaagttta tcagaaagtt 660 ctgttagaaa atatgacgag gctttaattc cgccatctat attttccgct attatataaa 720 gataattgtt ttctcttttt aaaacaactt gaattgggat tttatatcat aattttttaa 780 tgtctttttt tattatactt taagttctgg gatacatgtg cagaacgtgc aggtgtgtta 840 catagatata cacgtgccat ggtggtttgc tgcacccact aacctgttat cgacattagg 900 tatttctcct aatgctatca ccccctattt ccccaccccc cgagaggccc cagtgtgtga 960 tgttctcctc cctgtgtcca tgtgttctca ttgttcatct cccacttatg gtatctacca 1020 taaccttgaa attgtcttat gcattcactt gtttggttgt tatatagcct ccatcaggac 1080 agggatattt gctgctgctt cttttttttt tctttttgag acagtcttgc tccgtcatcc 1140 aggctggagt gcttctcggc tcaatgcaac ctccacctcc caggtttaag cgattctcca 1200 acttcagcct cccaaatggc tgggactgca ggcatgcacc actacacctg gctaattttt 1260 gtatttgtaa tagagacaat gtttcaccat gttggccagg ctggtctcga 1310 <210> 66 <211> 1917 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <223> sequence of STAR67 <400> 66 aggatcctaa aattttgtga ccctagagca agtactaact atgaaagtga aatagagaat 60 gaaggaatta tttaattaag tccagcaaaa cccaaccaaa tcatctgtaa aatatatttg 120 ttttcaacat ccaggtattt tctgtgtaaa aggttgagtt gtatgctgac ttattgggaa 180 aaataattga gttttcccct tcactttgcc agtgagagga aatcagtact gtaattgtta 240 aaggttaccc atacctacct ctactaccgt ctagcatagg taaagtaatg tacactgtga 300 agtttcctgc ttgactgtaa tgttttcagt ttcatcccat tgattcaaca gctatttatt 360 cagcacttac tacaaccatg ctggaaaccc aagagtaaat aggctgtgtt actcaacagg 420 actgaggtac agccgaactg tcaggcaagg ttgctgtcct ttggacttgc ctgctttctc 480 tctatgtagg aagaagaaat ggacataccg tccaggaaat agatatatgt tacatttcct 540 tattccataa ttaatattaa taaccctgga cagaaactac caagtttcta gacccttata 600 gtaccacctt accctttctg gatgaatcct tcacatgttg atacatttta tccaaatgaa 660 aattttggta ctgtaggtat aacagacaaa gagagaacag aaaactagag atgaagtttg 720 ggaaaaggtc aagaaagtaa ataatgcttc tagaagacac aaaaagaaaa atgaaatggt 780 aatgttggga aagttttaat acattttgcc ctaaggaaaa aaactacttg ttgaaattct 840 acttaagact ggaccttttc tctaaaaatt gtgcttgatg tgaattaaag caacacaggg 900 aaatttatgg gctccttcta agttctaccc aactcaccgc aaaactgttc ctagtaggtg 960 tggtatactc tttcagattc tttgtgtgta tgtatatgtg tgtgtgtgtg tgtgtttgta 1020 tgtgtacagt ctatatacat atgtgtacct acatgtgtgt atatataaat atatatttac 1080 ctggatgaaa tagcatatta tagaatattc ttttttcttt aaatatatat gtgcatacat 1140 atgtatatgc acatatatac ataaatgtag atatagctag gtaggcattc atgtgaaaca 1200 aagaagccta ttacttttta atggttgcat gatattccat cataggagta tagtacaact 1260 tatgtaacac acatttggct tgttgtaaaa ttttggtatt aataaaatag cacatatcat 1320 gcaaagacac ccttgcatag gtctattcat tctttgattt ttaccttagg acaaaattta 1380 aaagtagaat ttctgggtca agcagtatgc tcatttaaaa tgtcattgca tatttccaaa 1440 ttgtcctcca gaaaagtagt aacagtaaca attgatggac tgcgtgtttt ctaaaacttg 1500 catttttttc cttattggtg aggtttggca ttttccatat gtttattggc attttaattt 1560 tttttggttc atgtctttta ttcccttcct gcaaatttgt ggtgtgtctc aactttattt 1620 atactctcat tttcataatt ttctaaagga atttgacttt aaaaaaataa gacagccaat 1680 gctttggttt aatttcattg ctgctttttg aagtgactgc tgtgttttta tatactttta 1740 tattttgttg ttttagcaaa ttcttctata ttataattgt gtatgctgga acaaaaagtt 1800 atatttctta atctagataa aatatttcaa gatgttgtaa ttacagtccc ctctaaaatc 1860 atataaatag acgcatagct gtgtgatttg taattagtta tgtccattga tagatcc 1917 <210> 67 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> oligo for making linker containing MCSII of pd2EGFP-link <400> 67 gtacggatat cagatcttta attaag 26 <210> 68 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> oligo for making linker containing MCSII of pd2EGFP-link <400> 68 gtaccttaat taaagatctg atat 24 <210> 69 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer for amplification of 0.37 kb from pd2EGFP <400> 69 gatcagatct ggcgcgccat ttaaatcgtc tcgcgcgttt cggtgatgac gg 52 <210> 70 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer for amplification of 0.37 kb from pd2EGFP <400> 70 aggcggatcc gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg g 41 <210> 71 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer for amplifying zeocin resistance gene ORF <400> 71 gatcggatcc ttcgaaatgg ccaagttgac cagtgc 36 <210> 72 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer for amplifying zeocin resistance gene ORF <400> 72 aggcgcggcc gcaattctca gtcctgctcc tc 32 <210> 73 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer for amplifying d2EGFP ORF <400> 73 gatcgaattc tcgcgaatgg tgagcaagca gatcctgaag 40 <210> 74 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer for amplifying d2EGFP ORF <400> 74 aggcgaattc accggtgttt aaacttacac ccactcgtgc aggctgccca gg 52 <210> 75 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer for amplifying d2EGFP gene <400> 75 ttggttggtc atgaatggtg agcaagggcg aggagctgtt c 41 <210> 76 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer for amplifying d2EGFP gene <400> 76 attctctaga ctacacattg atcctagcag aagcac 36 <210> 77 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> oligo for preparing linker for creating MCS in pGL3-promoter-GFP <400> 77 cgatatcttg gagatctact agtggcgcgc cttgggctag ct 42 <210> 78 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> oligo for preparing linker for creating MCS in pGL3-promoter-GFP <400> 78 gatcagctag cccaaggcgc gccactagta gatctccaag atatcgagct 50 <210> 79 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer for amplification of EF-1alfa promoter <400> 79 gatcggcgcg ccatttaaat ccgaaaagtg ccacctgacg 40 <210> 80 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer for amplification of EF-1alfa promoter <400> 80 aggcgggacc ccctcacgac acctgaaatg gaag 34 <210> 81 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer for amplification of SV40 promoter <400> 81 ttggttgggg cgcgccgcag caccatggcc tgaaataacc tctgaaagag g 51 <210> 82 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer for amplification of SV40 promoter <400> 82 ttggttggga gctcaagctt tttgcaaaag cctaggcctc caaaaaagcc tcctc 55

Claims

재조합 핵산분자로,

SEQ. ID. NO. 66의 항-억제자 활성을 갖는 핵산 서열을 포함하고,

상기 재조합 핵산 분자는 추가로 발현 카세트를 포함하고, 상기 발현 카세트는 관심대상 핵산에 연결된 이종성 프로모터를 포함하고, 상기 관심대상 핵산은 관심대상 단백질의 전부 또는 일부를 암호화하는 것인 재조합 핵산분자.
제1항에 있어서, 상기 항-억제자 활성을 갖는 핵산 서열은 상기 발현 카세트에서 상기 프로모터의 업스트림에 위치하는 것인 재조합 핵산분자.
제2항에 있어서, 상기 항-억제자 활성을 갖는 서열 및 상기 프로모터는 2kb 미만으로 떨어져 있는 것인 재조합 핵산분자.
제1항에 있어서, 관심대상 단백질을 암호화하는 핵산은 선택적 마커 유전자를 추가로 암호화하는 다중시스트론성 유전자에 존재하는 것인 재조합 핵산분자.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 추가로 항-억제자 활성을 갖는 하나 이상의 다른 서열을 포함하고, 상기 하나 이상의 다른 서열은

SEQ ID. NO. 1~65 중 어느 것 중에서 선택되는 것인 재조합 핵산분자.
재조합 핵산분자로,

5'-항-억제자 서열 A ━ 프로모터 ━ 관심대상 단백질 전부 또는 일부를 암호화하는 핵산 ━ 항-억제자 서열 B-3'를 포함하는 발현카세트를 포함하고,

여기서 항-억제자 서열 A와 B는 동일하거나 또는 다르고, SEQ. ID. NO 1~65 중 어느 것으로 이루어진 군으로부터 선택되고,

상기 발현 카세트는 추가로 상기 항-억제자 서열 A와 B 사이에 SEQ.ID. NO. 66의 항-억제자 활성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 핵산분자.
제4항 또는 제6항에 따른 분자를 포함하는 세포.
제7항에 있어서, 포유동물 세포인 세포.
제8항에 있어서, CHO 세포인 세포.
관심대상 단백질의 제조방법으로,

관심대상 단백질을 암호화하는 재조합 핵산분자를 포함하는 세포를 배양하여 상기 세포에서 상기 관심대상 단백질을 발현하는 것을 포함하고,

상기 재조합 핵산 분자는 SEQ.ID. NO. 66의 항-억제자 활성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제10항에 있어서, 추가로 상기 관심대상 단백질을 단리하는 것을 포함하는 방법.
제10항에 있어서, 상기 항-억제자 활성을 갖는 핵산 서열은 관심대상 단백질의 발현을 조절하는 프로모터의 업스트림에 위치하는 것인 방법.
제12항에 있어서, 상기 항-억제자 활성을 갖는 서열과 상기 프로모터는 2kb 미만으로 떨어져 있는 것인 방법.
제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 관심대상 단백질을 암호화하는 핵산은 선택적 마커 유전자를 추가로 암호화하는 다중시스트론성 유전자에 존재하는 것인 방법.
제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 포유동물 세포인 방법.
제15항에 있어서, 상기 세포는 CHO 세포인 방법.
관심대상 핵산의 발현을 증가시키기 위한, SEQ.ID. NO. 66의 항-억제자 활성을 갖는 핵산 서열.
관심대상의 두 개의 폴리펩티드를 발현하는 숙주세포의 생산방법으로, 상기 방법은:

a) 하나 이상의 핵산분자를 숙주세포에 도입하는 단계, 여기서 상기 핵산분자 또는 핵산분자들은 함께:

(ⅰ) 제1의 관심대상 폴리펩티드와 제1 선택적 마커 유전자를 암호화하는 서열에 기능적으로 연결된 프로모터, 및

(ⅱ) 제2의 관심대상 폴리펩티드 및 제2 선택적 마커 유전자를 암호화하는 서열에 기능적으로 연결된 프로모터, 및

(ⅲ) 하나 이상의 SEQ. ID. NO. 66의 항-억제자 활성을 갖는 핵산 서열을 포함하고; 그리고

b) 상기 제1 및 제2 선택적 마커 유전자의 발현을 필수적으로 동시에 선택함에 의해 숙주세포를 선택하는 단계를 포함하는 방법.
관심대상의 두 개의 폴리펩티드를 발현하는 방법으로, 상기 방법은:

제1 및 제2 폴리펩티드를 발현시키기 위해 제18항에 따른 방법으로 얻은 숙주세포를 배양하고, 그리고 임의로 상기 폴리펩티드를 단리하는 것을 포함하는 방법.
제18항 또는 제19항에 있어서, 상기 두 개의 폴리펩티드는 다중결합 단백질의 일부인 방법.
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