ES2296201T3 - Secuencia novedosa para mejorar la expresion de acido nucleico. - Google Patents

Abstract

Una molécula de ácido nucleico recombinante, que comprende una secuencia de ácido nucleico tiene una actividad anti-represora seleccionada del grupo que consiste de: a) SEQ. ID. NO. 66, b) fragmentos de SEQ. ID. NO. 66 en donde el fragmento tiene actividad anti-represora, c) secuencias que son al menos 70% idénticas en secuencia de nucleótidos al a) o b) en donde dichas secuencias tienen actividad anti-represora; y d) el complemento de uno cualesquiera de a) hasta c); dicha molécula de ácido nucleico recombinante comprende además un casete de expresión, dicho casete de expresión comprende un promotor heterólogo ligado a un ácido nucleico de interés, y en donde dicho ácido nucleico de interés codifica preferiblemente todo o parte de una proteína de interés.

Description

Secuencia novedosa para mejorar la expresión del ácido nucleico.

La invención se relaciona al campo de biología molecular y biotecnología. Más específicamente la presente invención se relaciona a medios y métodos para mejorar la producción de uno o más ácidos nucleicos que pueden codificar proteínas en una célula hospedadora.

Las proteínas se pueden producir en varias células hospedadoras para un amplio rango de aplicaciones en biología y biotecnología, por ejemplo como biofarmacéuticos. Los métodos para la producción están bien establecidos y generalmente implican la expresión en una célula hospedadora de un ácido nucleico (también referido como "transgen") que codifica la proteína de interés. Un problema asociado con la expresión de transgenes es que es impredecible, prevenir de la alta probabilidad de que el transgen se vuelva inactivo debido a silenciamiento del gen (McBurney y colaboradores, 2002), y por lo tanto muchos clones de células hospedadoras deben ser probados para expresión alta del transgen. Además, una vez que el clon se ha establecido, la expresión del transgen a menudo no es estable y el silenciamiento de la expresión del transgen durante el cultivo de células hospedadoras prolongado es un fenómeno observado comúnmente. En células de vertebrados esto puede ser provocado por formación de heterocromatina en la ubicación del cromosoma del transgen, lo cual previene la transcripción del transgen (Whitelaw y colaboradores, 2001). El silenciamiento del transgen es estocástico; esto puede ocurrir brevemente después de integración del transgen en el genoma, o solamente después de un número de divisiones de la célula. Esto resulta en poblaciones de células heterogéneas después de cultivo prolongado, en el cual algunas células continúan para expresar niveles altos de proteína recombinante mientras otras expresan bajos o indetectables niveles de la proteína (Martin & Whitelaw, 1996, McBurney y colaboradores, 2002). Una línea de células que se usa para producción de proteína heteróloga se deriva de una célula sencilla, todavía a menudo se escala, y se mantiene por períodos prolongados, a densidades de células en exceso de diez millones de células por ml en cultivos de 1,000 litros o más. Estas poblaciones de células grandes (10^{14} - 10^{16} células)
están propensas a serias declinaciones en la productividad debido al silenciado del transgen (Migliaccio y colaboradores, 2000, Strutzenberger y colaboradores, 1999).

Una posibilidad para superar los problemas descritos anteriormente es emplear las secuencias llamadas STAR en el sistema de expresión. Una variedad de las secuencias STAR se han descrito en WO 03/004704. Estas secuencias se pueden usar para mejorar la predicción, rendimiento y/o estabilidad de la producción de proteína que usa constructor de expresión en varios tipos de células hospedadoras (WO 03/004704; Kwaks y colaboradores, 2003).

La publicación internacional WO 03/106674 describe el uso de secuencias STAR para expresión de ácido nucleico que codifica proteínas recombinantes en varias líneas de células.

La publicación internacional WO 03/106674 describe el uso de secuencias STAR para expresión de ácido nucleico que codifica proteínas multiméricas, tales como anticuerpos.

La presente invención propone el proporcionar medios y métodos alternativos para mejorar la producción de proteína.

Resumen de la invención

La invención proporciona moléculas de ácido nucleico recombinantes, células, métodos y su uso según las reivindicaciones.

Descripción detallada de la invención Secuencias Anti-represoras

Las secuencias que tienen actividad anti-represora como se usa en la presente son secuencias que son capaces de por lo menos en parte de contrarrestar el efecto represivo de las proteínas HP1 o HPC2 cuando estas proteínas se atan a ADN. Las secuencias que tienen actividad anti-represora (algunas veces también son referidas como secuencias anti-represoras o elementos anti-represores en la presente) apropiadas para la presente invención, se han descrito en WO 03/004704, incorporada en la presente por referencia, y se forman secuencias "STAR" ahí (cuando una secuencia es referida como una secuencia STAR en la presente, esta secuencia tiene actividad anti-represora de acuerdo con la invención). Como un ejemplo sin limitación, las secuencias de 65 elementos anti-represores, llamadas STAR1-65 (ver WO 03/004704) se presentan en la presente como SEQ. ID. Nos. 1-65, respectivamente.

De acuerdo con la invención, un fragmento funcional o derivado de un elemento anti-represor dado se considera equivalente para el elemento anti-represor, cuando este todavía tiene actividad anti-represora. La presencia de la actividad anti-represora puede ser verificada fácilmente por la persona experta en la técnica, por ejemplo por el ensayo descrito a continuación. Los fragmentos funcionales o derivados se pueden obtener fácilmente por una persona experta en la técnica de biología molecular, mediante inicio con una secuencia anti-represora dada, y haciendo eliminaciones, adiciones, sustituciones, inversiones y lo similar (ver, por ejemplo, WO 03/004704). Un fragmento funcional o derivado también comprende ortólogos de otras especies, los cuales se pueden encontrar usando las secuencias anti-represoras conocidas por métodos conocidas por la persona experta en la técnica (ver, por ejemplo, WO 03/004704). De ahí, la presente invención abarca fragmentos de las secuencias anti-represoras, en donde los fragmentos todavía tienen actividad anti-represora. Para fragmentos de una secuencia dada, el por ciento de identidad se refiere a aquella porción de la secuencia nativa de referencia que se encuentra en el fragmento. La invención también abarca secuencias que son por lo menos 70% idénticas en secuencia de nucleótidos a las secuencias que tienen actividad anti-represora o a fragmentos funcionales de estas que tienen actividad anti-represora, mientras que estas secuencias que son por lo menos 70% idénticas todavía tienen la actividad anti-represora de acuerdo con la invención. Preferiblemente, las secuencias son por lo menos 80% idénticas, más preferiblemente por lo menos 90% idénticas y todavía más preferiblemente por lo menos 95% idénticas a la secuencia nativa de referencia o fragmento funcional de esta.

Las secuencias que tienen actividad anti-represora de acuerdo con la invención se pueden obtener por varios métodos, que incluyen pero no se limitan a la clonación del genoma humano o de los genomas de otros organismos, o por ejemplo, por ampliación de secuencias anti-represoras conocidas directamente de un genoma por el uso del conocimiento de las secuencias, por ejemplo, por PCR, o pueden ser sintetizadas químicamente en parte o totalmente.

Las secuencias que tienen actividad anti-represora, y fragmentos funcionales o derivados de estas, se definen estructuralmente en la presente por su secuencia y además se definen funcionalmente como secuencias que tienen actividad anti-represora, la cual se puede determinar con el ensayo descrito a continuación.

Cualquier secuencia que tiene actividad anti-represora de acuerdo con la presente invención debe ser capaz por lo menos de sobrevivir el siguiente ensayo funcional (ver WO 03/004704, ejemplo 1, incorporado en la presente por referencia). Las células Humanas U-2 OS (ATCC HTB-96) son transfectadas de forma estable con el plásmido pTet-Off (Clontech K1620-A) y con ácido nucleico que codifica una proteína de fusión LexA-represor que contiene el dominio de enlace al ADN LexA y la región de codificación de cualquiera de HP1 o HPC2 (proteínas del grupo Drosophila Polycomb que reprimen la expresión del gen cuando se hace en extensiones laterales al ADN; el ensayo trabaja con cualquier proteína de fusión) bajo control del sistema regulador transcripcional Tet-Off (Gossen & Bujard, 1992). Estas células son referidas a continuación como las células reporteras para el ensayo de actividad anti-represora. Un plásmido reportero, el cual proporciona resistencia a la higromicina, contiene una secuencia poliligadora posicionada entre cuatro sitios operadores LexA y el promotor SV40 que controla el gen de resistencia a la zeocina. La secuencia a ser evaluada para actividad anti-represora puede ser clonada en el poliligador. La construcción de un plásmido reportero apropiado, tal como pSelect, se describe en el ejemplo 1 y la Fig. 1 de WO 00/004704. El plásmido reportero se transfecta en las células reporteras, y las células se cultivan bajo selección de higromicina (25 \mug/ml; selección para presencia del plásmido reportero) y represión de tetraciclina (doxiciclina, 10 ng/ml; que previene la expresión de la proteína de fusión de represor de LexA). Después de 1 semana de crecimiento bajo estas condiciones, la concentración de doxiciclina se reduce a 0.1 ng/ml (o menor) para inducir el gen represor de LexA, y después de 2 días la zeocina se agrega a 250 \mug/ml. Las células se cultivan por 5 semanas, hasta que los cultivos de control (transfectados con plásmido de reportero vacío, esto es que carece de una secuencia anti-represora clonada en el poliligador) son exterminados por la zeocina (en este plásmido de control el promotor SV40 se representa por la proteína de fusión de represor de LexA que se hace en extensiones laterales a los sitios de operación LexA, que resulta en expresión de zeocina insuficiente en las células para sobrevivir a la selección de zeocina). Una secuencia tiene actividad anti-represora de acuerdo con la presente invención si, cuando la secuencia se clona en el poliligador del plásmido reportero, las células reporteras sobreviven la selección de 5 semanas bajo zeocina. Las células de las colonias todavía se pueden propagar en medio nuevo que contiene zeocina después de la selección de zeocina de 5 semanas, considerando que las células transfectadas con plásmidos reporteros que carecen de secuencias anti-represoras no se pueden propagar en medio nuevo que contiene zeocina. Cualquier secuencia no capaz de conferir el crecimiento después de 5 semanas en zeocina en este ensayo, no califica como una secuencia que tiene actividad anti-represora, o fragmento funcional o derivado funcional de este de acuerdo con la presente invención. Como un ejemplo, las secuencias límite conocidas tales como aquellas evaluadas por Van der Valg y colaboradores, (2000), que incluyen Drosophila scs (Kellum y Schedl, 1991), 5'-HS4 de la ubicación cromosomal \beta-globina de pollo (Chung y colaboradores, 1993, 1997) o Regiones de Enlace a la Matriz (MARs, por sus siglas en inglés) (Phi-Van y colaboradores, 1990), no sobrevive este ensayo.

Además, se prefiere que la secuencia anti-represora o fragmento funcional o derivado de estos confiere una proporción mayor de los clones que sobreexpresan el reportero cuando flanquean un gen reportero (por ejemplo, luciferasa, GFP) el cual está integrado en el genoma de células U-2 OS o CHO, comparado a cuando el gen reportero no está flanqueado por secuencias anti-represoras, o flanqueado por secuencias que bloquean represión más débil tal como Drosophila scs. Esto se puede verificar usando por ejemplo el vector pSDH, o vectores similares, como se describen en el ejemplo 1 y Fig. 2 de WO 03/004704.

Los elementos anti-represores de la invención pueden tener por lo menos una de tres secuencias para producción de proteínas: (1) incrementan la predicción de identificación de las líneas de células hospedadoras que expresan una proteína en niveles industrialmente aceptables; (2) resultan en líneas de células hospedadoras con rendimientos de proteína aumentados; y/o (3) resultan en líneas de células hospedadoras que exhiben producción de proteína más estable durante el cultivo prolongado. Cada uno de estos atributos se discute en más detalle a continuación:

(1) predicción aumentada: la integración de casetes de expresión de transgen puede ocurrir en posiciones aleatorias en todo el genoma de la célula hospedadora. Sin embargo, la mayoría del genoma es heterocromatina transcripcionalmente silencioso. Cuando los casetes de expresión incluyen elementos anti-represores que flanquean el transgen, la posición de integración tiene un efecto reducido en expresión. Los elementos anti-represores dañan la capacidad de heterocromatina adyacente para silenciar el transgen. Consecuentemente, la proporción de células hospederos que contienen transgen con niveles de expresión aceptables se incrementa. Verdaderamente, la incorporación de resultados de secuencias anti-represoras en el establecimiento de hasta 10 veces más colonias, comparado con las mismas secuencias anti-represoras que carecen de transgen, cuando la misma cantidad de ADN es transfectada.

(2) Rendimiento: Han sido medidos los niveles de expresión de proteína en poblaciones primarias de células hospedadoras recombinantes, directamente después de la integración del transgen. El nivel de expresión de individuos en las diferentes poblaciones varía. Sin embargo, cuando los transgenes se protegen por elementos anti-represores, la variabilidad se reduce. Esta variabilidad reducida es la más visible en aquellos clones menores que son recuperados que tienen niveles menores de expresión. Además, las poblaciones con elementos anti-represores comúnmente tienen individuos con expresión sorprendentemente alta. Estos individuos de rendimiento alto son favorables para la producción de proteínas, ya sea para propósitos de cosecha o para propósitos de cambio del fenotipo de la célula o un organismo que comprende las células.

(3) Estabilidad incrementada: Los elementos anti-represores aumentan la estabilidad de transgenes en líneas de células hospedadoras recombinantes mediante asegurar que los transgenes no son silenciados transcripcionalmente durante cultivo prolongado. Las pruebas comparativas muestran que, bajo condiciones en las cuales los transgenes que no están protegidos por elementos anti-represores son silenciados progresivamente (5-25 pasos en cultivo), los transgenes protegidos con elemento anti-represor continúan para ser expresados en niveles altos. Esto es una ventaja en la producción industrial de moléculas proteinaceas, en la cual el cultivo de células continúa por períodos prolongados, de unas pocas semanas hasta muchos meses. Similarmente, la estabilidad de expresión en períodos prolongados puede ser ventajosa en plantas o animales con fenotipos alterados como una consecuencia de expresión recombinante de transgenes protegidos anti-represores.

STAR67

La presente invención proporciona una secuencia novedosa que tiene actividad anti-represora, la cual fue STAR67 acuñada (SEQ. ID. No. 66). Esta secuencia anti-represora todavía aumenta fuertemente la expresión cuando esta se coloca solamente secuencia arriba de un promotor que conduce la expresión de un gen de interés, como es evidente de los ejemplos propuestos en la presente, considerando que hasta ahora las secuencias anti-represoras potentes conocidas tales como STAR6 o STAR7 aparentan proporcionar mucha menos ventaja en esta configuración (funcionan especialmente bien cuando flanquean un transgen, esto es cuando están presentes en ambas corrientes la 5' y la 3' del transgen). De ahí, STAR67 proporciona una alternativa para conocer todavía secuencias anti-represoras, y cuando se colocan secuencia arriba de un promotor aparenta tener beneficio aumentado cuando se compara a aquellas secuencias anti-represoras conocidas. La STAR67 no es un bloqueador mejorado, en contraste con otras secuencias anti-represoras evaluadas para esta propiedad (Kwaks y colaboradores, 2003), que proporcionan otra diferencia entre STAR67 y otras secuencias anti-represoras descritas anteriormente. También, la STAR67 puede operar de una manera bidireccional, como se muestra en el ejemplo 7. De acuerdo con la invención, la presencia de la secuencia STAR67 en un casete de expresión proporciona predicción mejorada y/o rendimiento y/o estabilidad de expresión. Se demuestra en la presente que STAR67 es funcional en combinación con varios promotores, y en diferentes líneas de células.

Casete de expresión

Una molécula de ácido nucleico de acuerdo con la invención, que comprende STAR67, puede estar en cualquier formato, por ejemplo, como fragmento de ADN, opcionalmente presente en un vector de clonación tal como un plásmido, preferiblemente un vector de expresión, y se puede usar por ejemplo para propósitos de clonación que usa tecnología de ADN recombinante estándar. En modalidades preferidas de la invención, el ácido nucleico comprende un casete de expresión, el cual es útil para expresar secuencias de interés, por ejemplo, en células hospedadoras.

Un "casete de expresión" como se usa en la presente es una secuencia de ácido nucleico que comprende por lo menos un promotor ligado funcionalmente a una secuencia de la cual la expresión es deseada, cuya secuencia de la cual la expresión es deseada preferiblemente es una estructura de lectura abierta que codifica toda o parte de una proteína de interés. El promotor preferiblemente es un promotor heterólogo con respecto al ácido nucleico de interés, por lo cual un promotor heterólogo se define como un promotor el cual no es el promotor natural de la secuencia de interés. En otras palabras, alguna forma de intervención humana, por ejemplo, clonación molécula, se ha usado en cualquier momento para hacer la combinación funcional de un promotor heterólogo con un ácido nucleico de interés, y se entiende fácilmente en este contexto que un promotor heterólogo se puede derivar del mismo o de un organismo diferente como la secuencia de interés. Preferiblemente, un casete de expresión además contiene secuencias de terminación de transcripción y poliadenilación. Otras secuencias reguladoras tales como mejoradores también pueden ser incluidas. Las unidades de expresión de acuerdo con la invención además comprenden por lo menos una secuencia anti-represora, tal como STAR67. En ciertas modalidades preferidas la secuencia anti-represora, preferiblemente STAR67, se coloca secuencia arriba del promotor, preferiblemente de tal manera que menos de 2 kb están presentes entre la terminación 3' de la secuencia anti-represora y el inicio de la secuencia promotora. En modalidades preferidas, menos de 1 kb, más preferiblemente menos que 500 nucleótidos (nt), todavía más preferiblemente menos que alrededor de 200, 100, 50, ó 30 nt están presentes entre la terminación 3' de la secuencia anti-represora y el inicio de la secuencia promotora. En ciertas modalidades preferidas, la secuencia anti-represora se clona directamente secuencia arriba del promotor, que resulta solamente en alrededor de 0-20 nt entre la terminación 3' de la secuencia anti-represora y el inicio de la secuencia promotora.

Para obtener la expresión de las secuencias de ácido nucleico que codifican proteína recombinante, es bien sabido por aquellos expertos en la técnica que las secuencias capaces de conducir la expresión, pueden ser ligadas funcionalmente a las secuencias de ácido nucleico que codifican la proteína, resultando en moléculas de ácido nucleico recombinante que codifican una proteína recombinante en el formato de expresión. En general, la secuencia del promotor está colocada secuencia arriba de las secuencias que codifican la proteína de interés. Los vectores de expresión útiles están disponibles en la técnica, por ejemplo, las series de vectores pcADN y pEF de Invitrogen, pMSCV y pTK-Hyg de BD Sciences, pCMV-Script de Stratagene, etc.

Cuando la secuencia que codifica el polipéptido de interés se inserta apropiadamente con referencia a secuencias que gobiernan la transcripción y traslación del polipéptido codificado, el casete de expresión que resulta es útil para producir la proteína de interés, referida como expresión. Las secuencias que conducen la expresión puede incluir promotores, mejoradores y similares, y combinaciones de estos. Estas deben ser capaces de funcionar en las células hospedadoras, que conduce de esa manera la expresión de las secuencias de ácido nucleico que están ligadas funcionalmente a ellas. La persona experta en la técnica está consciente de que varios promotores se pueden usar para obtener la expresión de un gen de interés en las células hospedadoras. Los promotores pueden ser constitutivos o regulados y se pueden obtener de varias fuentes, que incluyen virus, fuentes procarióticas o eucarióticas, o diseñados artificialmente. La expresión de los ácidos nucleicos de interés puede ser del promotor natural o derivados de este o de un promotor completamente heterólogo (Kaufman, 2000). Algunos promotores bien conocidos y muy usados para expresión de células eucarióticas comprenden promotores derivados de virus, tales como adenovirus, por ejemplo, el promotor E1A, promotores derivados de citomegalovirus (CMV), tales como el promotor tempranamente inmediato CMV (IE) (referido en la presente como el promotor CMV) (obtenible por ejemplo de pcADN, Invitrogen), promotores derivados de Simian Virus 40 (SV40) (Das y colaboradores, 1985), y similares. Los promotores apropiados pueden ser también derivados de células eucarióticas, tales como promotores metalotioneina (MT), factor de elongación 1\alpha (EF-1\alpha) (Gill y colaboradores, 2001), promotor C o UB6 de ubiquitina (Gill y colaboradores, 2001; Schorpp y colaboradores, 1997), promotor de actina, un promotor de inmunoglobulina, promotores de choque de calor, y similares. Algunos promotores preferidos para obtener la expresión en células eucarióticas, tal como promotores apropiados en la presente invención, son el promotor CMV, un promotor EF1-alfa de mamífero, un promotor ubiquitina de mamífero tal como un promotor de ubiquitina C, o un promotor SV40 (por ejemplo, obtenible de pIRES, cat. No. 631605, BD Sciences). La evaluación para la función del promotor y tensión de un promotor es una materia de rutina para una persona experta en la técnica, y en general puede por ejemplo, abarcar la clonación de un gen de prueba tal como lacZ, luciferasa, GFP, etc., junto con la secuencia promotora, y la prueba para expresión del gen de prueba. Por supuesto, los promotores pueden ser alterados por eliminación, adición, mutación de secuencias ahí dentro, y ser evaluados para funcionalidad, para encontrar secuencias promotoras nuevas, atenuadas o mejoradas.

Un casete de expresión de acuerdo con la invención puede ser monocistrónico, bicistrónico o multicistrónico. El término "gen bicistrónico", se define como un gen capaz de proporcionar una molécula de ARN que codifica dos proteínas/polipéptidos. El término "gen monocistrónico" se define como un gen capaz de proporcionar una molécula de ARN que codifica una proteína/polipéptido. El término "multicistrónico" se define como un gen capaz de proporcionar una molécula de ARN que codifica dos o más proteínas/polipéptidos, y un gen bicistrónico por lo tanto está abarcado dentro de la definición de un gen multicistrónico. Un "gen" como se usa en la presente invención puede comprender ADN cromosomal, cADN, ADN artificial, combinaciones de estos, y similares, y también puede estar en la forma de otro ácido nucleico, por ejemplo, ARN. En ciertas modalidades, una unidad de expresión de proteína comprende un gen multicistrónico. Las unidades que comprenden varios cistrones se pueden transcribir como un ARNm único. La traslación de la segunda y más regiones de codificación presentes en ese ARN se puede lograr en varias formas, que incluyen el uso de sitios de reiniciación de traslación o sitios de entrada de ribosoma interna, de los cuales el último es el preferido. Una ventaja de las unidades bi- o multi-cistrónicas puede ser una selección fácil de clones que expresan una proteína de interés, mediante la colocación del ácido nucleico que codifica una proteína marcadora seleccionable en secuencia abajo de ácido nucleico que codifica una proteína o polipéptido de interés.

Para la producción de proteínas multiméricas, dos o más casetes de expresión se pueden usar. Esta modalidad ha demostrado dar buenos resultados, por ejemplo, para la expresión de la cadena pesada y ligera de anticuerpos. De acuerdo con la invención, por lo menos uno de los casetes de expresión, pero preferiblemente cada uno de ellos, debe comprender una secuencia STAR. En otra modalidad, las subunidades diferentes o partes de una proteína multimérica están presentes en un casete de expresión sencillo.

En lugar de o además de la presencia de una secuencia anti-represora colocada secuencia arriba de un promotor en un casete de expresión, ha demostrado ser altamente benéfico para proporcionar una secuencia anti-represora en ambos lados de un casete de expresión, de tal manera que el casete de expresión que comprende el transgen está flanqueado por dos secuencias anti-represoras, las cuales en ciertas modalidades son esencialmente idénticas una a la otra. Por supuesto, también se puede hacer con STAR67, para obtener un casete de expresión flanqueado por dos secuencias STAR67. También son posibles las posiciones alternativas de una secuencia STAR67 sencilla en un casete de expresión, por ejemplo, detrás del transgen, preferiblemente detrás de la terminación transcripcional y de la señal de poliadenilación, con la terminación 3' de la secuencia STAR67 enfrente del transgen.

Un casete de expresión de acuerdo con la invención opcionalmente puede comprender un gen marcador de selección. El término "marcador de selección o marcador seleccionable" comúnmente se usa para referirse a un gen y/o proteína cuya presencia puede ser detectable directa o indirectamente en una célula, por ejemplo, un gen y/o una proteína que inactiva un agente de selección y protege la célula hospedadora de los efectos inhibidores de crecimiento o letales del agente (por ejemplo, un gen y/o proteína de resistencia antibiótica). Otra posibilidad es que el marcador de selección induce fluorescencia o un depósito de color (por ejemplo, proteína fluorescente verde y derivados, luciferasa, lacZ fosfatasa alcalina, etc.). En ciertas modalidades, un marcador de selección usado para la invención es zeocina, y para selección se usa un segundo casete de expresión puromicina. La persona experta en la técnica conocerá que otros marcadores de selección están disponibles y se pueden usar, por ejemplo, neomicina, blasticidina, puromicina, bleomicina, higromicina, dhfr, etc. El término "selección" comúnmente se define como el proceso de uso de un marcador de selección/marcador seleccionable y un agente de selección para identificar células hospedadoras con propiedades genéticas específicas (por ejemplo, que las células hospedadoras contienen un transgen integrado en su genoma). Está claro para una persona experta en la técnica que combinaciones numerosas de marcadores de selección son posibles. Un ejemplo de un antibiótico posible se proporciona anteriormente. El antibiótico que es particularmente ventajoso es zeocina, debido a que la proteína de resistencia de zeocina (zeocina-R) actúa por enlazamiento del fármaco y lo vuelve a producir inocuo. Por lo tanto es fácil titular la cantidad de fármaco que extermina células con niveles bajos de expresión de zeocina-R, mientras que permite a los expresores altos sobrevivir. Todas las otras proteínas de resistencia antibiótica en uso común son enzimas, y así actúan catalíticamente (no 1:1 con el fármaco). Cuando una selección de dos etapas se realiza, es por lo tanto ventajoso usar una proteína de resistencia antibiótica con ese modo de enlace 1:1 de acción. Por lo tanto, el antibiótico zeocina es un marcador de selección preferido. Por conveniencia el antibiótico zeocina puede en un método de selección de dos etapas combinarse con, por ejemplo, puromicina, blasticidina o higromicina, el cual puede por ejemplo estar presente en un gen monocistrónico.

También es posible combinar un marcador de selección antibiótico con un marcador de selección el cual proporciona la inducción de fluorescencia o el cual proporciona un depósito de color. Diferentes promotores se pueden usar mientras que sean funcionales en las células usadas.

En ciertas modalidades un casete de expresión se proporciona con un Sitio de Enlace de Ribosoma Interno (débil) (IRES, por sus siglas en inglés) como un ejemplo de un sitio de iniciación de traducción de proteína con una eficiencia de traducción reducida, por ejemplo, entre la estructura de lectura abierta de la proteína de interés y la estructura de lectura abierta del marcador de selección. La traducción de proteínas de los elementos IRES es menos eficiente que la traducción dependiente de la capa: la cantidad de proteína de rangos de estructuras de lectura abiertas dependientes de IRES (ORF) de menos que 20% hasta 50% de la cantidad del primer ORF (Mizuguchi y colaboradores, 2000). Además, la mutación de elementos IRES puede atenuar su actividad, y disminuir la expresión de los ORF dependientes de IRES a menos de 10% del primer ORF (López de Quinto & Martínez-Salas, 1998, Rees y colaboradores, 1996). Cuando el ORF dependiente de IRES codifica una proteína de marcador seleccionable, su nivel relativo bajo de traducción significa que los niveles absolutos altos de transcripción deben ocurrir con el propósito de que la célula hospedadora recombinante sea seleccionada. Por lo tanto, los aislados de células hospedadoras recombinantes seleccionables expresarán, por necesidad, cantidades altas del mARN de transgen. Puesto que la proteína recombinante se traduce del ORF dependiente de la capa, se puede producir en abundancia lo que resulta en rendimientos de producto altos.

Los sistemas de expresión convencionales son moléculas de ADN en la forma de un plásmido recombinante o un genoma viral recombinante. El plásmido o el genoma viral se introducen en células (hospedadoras eucarióticas) y preferiblemente se integra en sus genomas por métodos conocidos en la técnica. En modalidades preferidas, la presente invención también usa estos tipos de moléculas de ADN para suministrar su sistema de expresión de transgen mejorado. Una modalidad preferida de la invención es el uso de ADN de plásmido para suministro del sistema de expresión. Un plásmido contiene un número de componentes: componentes convencionales, conocidos en la técnica, son un origen de replicación y un marcador seleccionable para propagación del plásmido en células bacteriales; un marcador seleccionable que funciona en células eucarióticas para identificar y aislar células hospedadoras que portan un sistema de expresión de transgen integrado; ácido nucleico que codifica la proteína de interés, cuya transcripción de nivel alto se lleva por un portador que es funcional en células eucarióticas (por ejemplo, el promotor/mejorador inmediatamente temprano principal de citomegalovirus humano, pCMV (Boshart y colaboradores, 1985); y terminadores transcripcionales (por ejemplo, el sitio de poliadenilación SV40 (Kaufman & Sharp, 1982) para el transgen de interés y el marcador seleccionable. El vector usado puede ser cualquier vector que es apropiado para ADN de clonación y que se puede usar para transcripción de un ácido nucleico de interés. Cuando las células hospedadoras se usan se prefiere que el vector es un vector de integración. Alternativamente, el vector puede ser un vector de replicación episomalmente.

Algunas representaciones esquemáticas sin limitación de configuraciones posibles de casetes de expresión se proporcionan en la Fig. 1. Esto es la configuración de los elementos de ADN de los casetes de expresión en el plásmido además después de integración en el genoma. El constructo A contiene una unidad de expresión que abarca una estructura de lectura abierta que codifica una proteína (Gene). Está en secuencia arriba del EMCV IRES atenuado (Martínez-Salas y colaboradores, 1999; Mizuguchi y colaboradores, 2000; Rees y colaboradores, 1996), y de la estructura de lectura abierta que codifica la proteína marcadora seleccionable de resistencia de zeocina (zeo). El casete de gen tiene el terminador transcripcional SV40 en sus terminales 3' (t). Este transgen bicistrónico se transcribe en niveles altos del promotor CMV. El constructo B se deriva del constructo A, pero STAR67 se clona ahora en secuencia arriba del promotor CMV. El constructo C se deriva del contracto B, pero ahora dos elementos anti-represores (en este caso STAR7) se clonan para flanquear el casete completo.

Combinación de secuencias anti-represoras en casete de expresión

Se muestra en la presente que la combinación de un primer elemento anti-represor en secuencia arriba de un promotor y que flanquea el casete de expresión por otras dos secuencias anti-represoras proporciona resultados superiores. En particular, cuando un promotor SV40 se usa en células CHO, la expresión es todavía muy alta en la ausencia de secuencias anti-represoras, pero es considerablemente mejorada cuando STAR67 se coloca en secuencia arriba del promotor, y el casete de expresión completo se flanquea por dos elementos anti-represores, tal como STAR6, STAR7, o STAR 40.

Por lo tanto es un objetivo de la presente invención proporcionar una molécula de ácido nucleico recombinante que comprende un casete de expresión que comprende (desde 5' hasta 3'): secuencia anti-represora A - promotor - ácido
nucleico que codifica una proteína de interés - secuencia anti-represora B, caracterizada en que el casete de expresión además comprende una secuencia anti-represora C entre las secuencias anti-represoras A y B. En una modalidad preferida, la secuencia anti-represora C está presente en secuencia abajo del promotor, en una configuración como se describe anteriormente bajo el encabezado "casete de expresión". El casete de expresión entre las secuencias anti-represoras A y B además pueden comprender los elementos como se describen anteriormente por los casetes de expresión, por ejemplo, secuencia terminador de transcripción, señal de poliadenilación, gen marcador de selección, mejorador, etc. y puede ser monocistrónico, bicistrónico o multicistrónico como se describe anteriormente. Dos o las tres secuencias anti-represoras A, B y C pueden ser las mismas, o las tres pueden ser diferentes. Las secuencias anti-represoras A y B pueden ser las mismas o diferentes de la secuencia anti-represora C. En ciertas modalidades, las secuencias anti-represoras A y B son (esencialmente) idénticas una a la otra. En una modalidad, la secuencia anti-represora C es STAR67, o un fragmento funcional o derivado de este. Las secuencias anti-represoras A y B pueden ser cualquier secuencia anti-represora, y en ciertas modalidades comprende una de SEQ. ID. Nos. 1-65, o fragmentos funcionales o derivados de esta. En ciertas modalidades, el casete de expresión contiene un gen multicistrónico, y en modalidades preferidas de esta el gen multicistrónico comprende una secuencia que codifica una proteína de interés y un gen marcador de selección. Alternativamente, un gen marcador de selección está presente bajo control de un promotor separado.

En ciertas modalidades, una cuarta secuencia anti-represora D puede estar presente entre las secuencias A y B STAR. En una modalidad tal, la secuencia anti-represora D está preferentemente posicionada secuencia arriba del ácido nucleico que codifica la proteína de interés. Nuevamente, esta secuencia anti-represora D puede ser la misma o diferente de las otras secuencias anti-represoras en la molécula de ácido nucleico recombinante, puede ser cualquier secuencia anti-represora, y en ciertas modalidades se selecciona de cualquiera de SEQ. ID. NOs. 1-66, o fragmentos funcionales o derivados de estas.

Como por lo menos algunas secuencias anti-represoras puede ser direccional (WO 00/004704), las secuencias anti-represoras que flanquean el casete de expresión (secuencias anti-represoras A y B) se pueden colocar beneficiosamente en dirección opuesta con respecto a la otra, tal que la terminación 3' de cada una de estas secuencias anti-represoras se enfrenta hacia dentro al casete de expresión (y a cada otro). De ahí, en modalidades preferidas, el lado 5' de un elemento anti-represor enfrenta el ADN/cromatina del cual la influencia en el transgen está para ser disminuido por el elemento anti-represor. Para una secuencia anti-represora en secuencia arriba de un promotor en un casete de expresión, la terminación de 3' enfrenta el promotor. Las secuencias de los elementos anti-represoras (SEQ. ID. Nos. 1-66) en la lista de secuencia se dan en dirección 5' hasta 3', a menos que se indique de otra manera.

Células de acuerdo con la invención

Las moléculas de ácido nucleico que comprenden secuencias STAR y/o casetes de expresión de acuerdo con la presente invención se pueden usar para mejorar la expresión del ácido nucleico, preferiblemente en células hospedadoras. Los términos "célula"/"célula hospedadora" y "línea de célula"/"línea de célula hospedadora" se definen comúnmente respectivamente como una célula y poblaciones homogéneas de esta que se pueden mantener en cultivo de célula por métodos conocidos en la técnica, y que tienen la capacidad de expresar proteínas heterólogas u homólogas. Una célula hospedadora de acuerdo con la presente invención preferiblemente es una célula eucariótica, más preferiblemente una célula mamífera, tal como una célula de roedor o una célula de humano o fusión entre células diferentes. En ciertas modalidades sin limitación, la célula hospedadora es un osteosarcoma U-2 OS, CHO (ovario de hámster chino), HEK 293, mieloma HuNS-1, retinoblastoma WERI-Rb-1, BHK, Vero, mieloma de ratón no secretor Sp2/0-Ag 14, mieloma de ratón sin secreción NS0, carcinoma de glándula adrenal NCI-H295R o una célula PER.C6®. En ciertas modalidades de la invención, una célula hospedadora es una célula que expresa por lo menos E1A, y preferiblemente también E1B, de un adenovirus. Como ejemplos sin limitación, una célula tal se puede derivar de, por ejemplo, células humanas, por ejemplo, de riñón (ejemplo: células HEK 293, ver Graham y colaboradores, 1977), pulmón (por ejemplo, A549, ver por ejemplo, WO 98/39411) o retina (ejemplo: células HER marcada bajo la marca comercial PER.C6®, ver la Patente de EUA No. 5,994,128), o de amniocitos (por ejemplo, N52.E6, descritos en la Patente de EUA No. 6,558,948), y similarmente de otras células. Los métodos para obtener las células se describen por ejemplo, en la Patente de EUA No. 5,994,128 y la Patente de EUA No. 6,558,948. Las células PER.C6® para el propósito de la solicitud presente significan células de un paso en secuencia abajo o secuencia arriba o un descendente de un paso en secuencia abajo o secuencia arriba de células como se depositan bajo ECACC no. 96022940. Previamente se ha mostrado que las células son capaces de expresión de proteínas en niveles altos (por ejemplo, WO 00/63403), y Jones y colaboradores,
2003).

Las células hospedadoras que expresan la proteína deseada de acuerdo con la invención se pueden obtener por introducción de una molécula de ácido nucleico, preferiblemente en la forma de un casete de expresión de acuerdo con la invención, dentro de las células. En una modalidad alternativa, la secuencia STAR67 se direcciona para integración en una región cromosomal para mejorar la expresión de un gen de interés que ya está integrado dentro del genoma, por ejemplo, un gen que ocurre naturalmente, opcionalmente bajo control de un promotor heterólogo que fue dirigido en secuencia abajo del gen para regular la expresión del gen. Preferiblemente las células hospedadoras son de un clon estable que se puede seleccionar y propagar de acuerdo con procedimientos estándar conocidos para la persona experta en la técnica. Un cultivo de tal clon es capaz de producir proteína recombinante de interés. Las células de acuerdo con la invención preferiblemente son capaces de crecer en cultivo de suspensión en medio libre de suero.

Una proteína de interés de acuerdo con la invención puede ser cualquier proteína, y puede ser una proteína monomérica o una proteína multimérica. Una proteína multimérica comprende por lo menos dos cadenas de polipéptido. Ejemplos sin limitación de una proteína de interés de acuerdo con la invención son enzimas, hormonas, cadenas de inmunoglobulina, proteínas terapéuticas similares a proteínas anticáncer, proteínas de coagulación de sangre tales como Factor VIII, proteínas multifuncionales, tales como eritropoyetina, proteínas de diagnóstico, o proteínas o fragmentos de estas útiles para propósitos de vacunación, todas conocidas para la persona experta en la técnica.

En ciertas modalidades, un casete de expresión de la invención codifica una cadena pesada o ligera de inmunoglobulina o un antígeno que enlaza parte, derivado y/o análogo de éstas. En una modalidad preferida una unidad de expresión de proteína de acuerdo con la invención se proporciona, en donde la proteína de interés es una cadena pesada de inmunoglobulina. En todavía otra modalidad preferida una unidad de expresión de proteína de acuerdo con la invención se proporciona, caracterizada porque la proteína de interés es una cadena ligera de inmunoglobulina. Cuando estas dos unidades de expresión de proteína están presentes dentro de la misma célula (hospedadora) una proteína multimérica y más específicamente un anticuerpo se ensambla. De ahí, en ciertas modalidades, la proteína de interés es una inmunoglobulina, tal como un anticuerpo, la cual es una proteína multimérica. Preferiblemente, un anticuerpo tal es un anticuerpo humano o humanizado. En ciertas modalidades por lo tanto, es un anticuerpo IgG, IgA, o IgM. Una inmunoglobulina puede ser codificada por las cadenas pesadas y ligeras en diferentes casetes de expresión, o en un casete de expresión simple, en donde el gen que codifica cada cadena individual puede cada una estar bajo control de un promotor separado en unidades de transcripción monocistrónicas, o alternativamente ambas cadenas pueden ser codificadas en un gen multicistrónico.

La proteína de interés puede ser de cualquier fuente, y en ciertas modalidades es una proteína mamífera, una proteína artificial (por ejemplo, una proteína de fusión o proteína mutada), y preferiblemente es una proteína humana.

Obviamente, las secuencias y configuraciones anti-represoras del casete de expresión de la presente invención también se puede usar cuando el último objetivo no es la producción de una proteína, pero el mismo ARN, por ejemplo para la producción de cantidades aumentadas de ARN de un casete de expresión, el cual se puede usar para propósitos de regulación de otros genes (por ejemplo, ARNi, ARN antisentido), terapia de gen, producción de proteína in vitro, etc.

Método para la producción de proteína de interés

En un aspecto, la invención proporciona un método para expresar una secuencia de interés, preferiblemente que codifica una proteína de interés, mediante proporcionar una célula hospedadora con una molécula de ácido nucleico o casete de expresión de acuerdo con la invención, que cultiva la célula y que expresa la secuencia de interés.

El término "expresión" se usa comúnmente para referirse a la producción de un producto o productos de ARN específicos, o una proteína o proteínas específicas, en una célula. En el caso de productos de ARN, se refiere al proceso de trascripción. En el caso de productos de proteína, se refiere a los procesos de transcripción, traducción y opcionalmente modificaciones post-transcripcionales (por ejemplo, glicosilación, formación de enlace de bisulfuro, etc.). En el caso de proteínas secretadas, se refiere a los procesos de trascripción, traducción, y opcionalmente modificación post-transcripcional, seguida por secreción.

La introducción del ácido nucleico que se expresa en una célula, se puede hacer por uno de varios métodos, los cuales son conocidos para la persona experta en la técnica, también dependiente del formato del ácido nucleico para ser introducido. Los métodos incluyen pero no se limitan a transfección, infección, inyección, transformación, y lo similar.

El cultivo de una célula se hace para hacer posible metabolizar, y/o crecer y/o dividir y/o producir proteínas recombinantes de interés. Esto se puede lograr por métodos bien conocidos para personas expertas en la técnica, e incluye pero no se limita a proporcionar nutrientes para la célula. Los métodos comprenden crecimiento que adhieren a superficies, crecimiento en suspensión, o combinaciones de estos. El cultivo se puede hacer por ejemplo, en platos, botellas de rodillo o en birreactores, que usan lotes, lotes de alimentación, sistemas continuos tales como sistemas de perfusión, y lo similar. Con el propósito de lograr producción a gran escala (continua) de proteínas recombinantes a través de cultivo de célula se prefiere en la técnica tener células capaces de crecer en suspensión, y se prefiere tener células capaces de ser cultivadas en la ausencia de suero derivado de animal o humano o componentes de suero derivado de animal o humano.

Las condiciones para crecimiento o multiplicación de células (ver por ejemplo, Tissue Culture, Academic Press, Kruse y Paterson, editores (1973)) y las condiciones para expresión del producto recombinante se conocen para la persona experta en la técnica. En general, los principios, protocolos, y técnicas parciales para maximizar la productividad de los cultivos de célula mamífera se pueden encontrar en Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach (M. Butler, ed., IRL Press, 1991). En una modalidad preferida, la proteína expresada se recolecta (aísla), ya sea de las células o del medio de cultivo o de ambos. Entonces se puede purificar además usando métodos conocidos, por ejemplo, filtración, cromatografía de columna, etc., por métodos generalmente conocidos para la persona experta en la técnica.

Método de selección novedoso

La presente invención describe un método novedoso para la generación de células hospedadoras que expresan dos polipéptidos de interés cuyo método da un resultado sorprendentemente bueno, en que casi nada o ninguna colonia aparece sin el uso de una secuencia anti-represora, mientras que la presencia de una secuencia anti-represora conduce a los clones que sobreviven a la selección, y estos clones en general expresan dos polipéptidos de interés en niveles elevados (ejemplo 7, Fig. 11). La invención por lo tanto proporciona un método para la generación de una célula hospedadora que expresa dos polipéptidos de interés, el método comprende: a) introducir en una célula hospedadora una o más moléculas de ácido nucleico, la molécula o moléculas de ácido nucleico juntas comprenden: (i) un promotor ligado funcionalmente a una secuencia que codifica un primer polipéptido de interés y un primer gen de marcador de selección y (ii) un promotor ligado funcionalmente a una secuencia que codifica un segundo polipéptido de interés y un segundo marcador de selección y (iii) al menos una secuencia anti-represora, elegida del grupo que consiste de (a) cualquiera de SEQ. ID. NO. 1-66, (b) fragmentos de cualquiera de SEQ. ID. NOs. 1-66, los fragmentos tienen actividad anti-represora, (c) secuencias que son al menos 70% idénticas a (a) o (b) y que tienen actividad anti-represora y (d) el complemento de cualquiera de (a)-(c); b) seleccionar una célula hospedadora al seleccionar esencialmente de forma simultanea la expresión del primero y segundo genes marcadores de selección. Las células hospedadoras seleccionadas se pueden usar convenientemente para la expresión de los dos polipéptidos al cultivar las células hospedadoras seleccionadas. En una modalidad, dos moléculas de ácidos nucleicos, una que contiene (i) y la otra que contiene (ii), se usan para la introducción en la célula hospedadora. En esta modalidad, cada molécula de ácido nucleico contiene preferiblemente al menos una secuencia anti-represora. En otra modalidad, una molécula de ácido nucleico sencilla que contiene a (i) y (ii) se usa, la cual debe al menos contener una secuencia anti-represora. Una ventaja de tener las secuencias codificadoras para ambos polipéptidos en una molécula sencilla de ácido nucleico es que solamente una preparación de ácido nucleico se requiere antes de que se introduzca el ácido nucleico en las células. Adicionalmente, en tal modalidad, es suficiente un evento de integración sencillo para las secuencias codificadoras de ambos polipéptidos con lo cual se elimina la posibilidad de que el ácido nucleico que codifica al primer polipéptido se integre en una ubicación diferente o con un número de copias diferentes que el que codifica al segundo polipéptido. En modalidades preferidas, los dos polipéptidos pueden formar parte de una proteína multimérica, tal como una inmunoglobulina. Por lo tanto el método es particularmente adecuado para la expresión de anticuerpos. Los dos promotores pueden ser iguales o diferentes y pueden ser cualesquiera promotores como se describe supra. Cuando la modalidad en una molécula sencilla de ácido nucleico que contiene ambos (i) y (ii) se usa, la dirección de las dos unidades de transcripción en la molécula sencilla de ácido nucleico pueden ser por ejemplo, ser ambos mismos, o en direcciones opuestas de cara uno con el otro, o en direcciones opuestas cada uno seleccionando afuera. En el último caso, se puede colocar la secuencia anti-represora entre los dos promotores (ver por ejemplo, Fig. 11B). Además, se pueden agregar secuencias anti-represoras al flanco de una o ambas unidades de transcripción. Los genes marcadores deben ser cada uno diferente y se pueden seleccionar por ejemplo de los genes marcadores como se describen supra. En ciertas modalidades, un marcador de selección es zeocina, y el otro marcador de selección es, por ejemplo, puromicina. Sin embargo, estará claro que otras combinaciones se pueden usar y están dentro del alcance de este aspecto de esta invención. La expresión de los marcadores debe ser preferiblemente dependiente de la expresión de los polipéptido de interés. Esto se puede establecer al ligar la expresión de los genes marcadores con aquella de los polipéptidos de interés, por ejemplo, al usar genes multicistrónicos, por ejemplo, con secuencias IRES, como se discute supra. La selección "esencialmente simultanea" significa que al menos parte del tiempo preferiblemente al menos un día, más preferiblemente al menos dos días, todavía más preferiblemente al menos 5 días, ambos agentes de selección están presentes lo cual se puede generar al tener ambos agentes de selección agregados al medio de cultivo al mismo tiempo o agregando al medio de cultivo que comprende ambos agentes de selección (por ejemplo, ejemplo 7). Estará claro que al agregar el segundo agente de selección solamente después de unas cuantas horas o días al medio en donde ya esta presente el primer agente de selección, resultará todavía en una selección, esencialmente simultanea dentro del significado de la invención. Esta situación se distingue de la situación en donde las células se selecciona primero con el primer agente de selección y una vez que se forman las colonias las células se seleccionan en un modo medio por el cual el segundo agente de selección y no el primer agente de selección sean agregado (selección consecutiva, por ejemplo, ejemplo 5 y WO 03/106684). Al seleccionar ambos marcadores de selección esencialmente de manera simultánea, se describe en la presente sorprendentemente que se suministra una selección rápida y fuerte por lo cual muchos clones de baja producción se eliminan, lo que resulta en una carga fuertemente disminuida para encontrar un clon con características deseables de expresión. Esto es particularmente ventajoso para la industria biotecnológica, en donde muchos usualmente cientos o incluso miles de colonias sean seleccionadas antes de que se identifique un clon deseado que tenga altos niveles de expresión.

La práctica de esta invención empleara a menos de que se indique de otra manera técnicas convencionales de inmunología, biología molecular, microbiología, biología celular y ADN recombinante, las cuales están dentro de la experiencia en la técnica. Ver por ejemplo, Sambrook, Fritsch y Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, 1989; Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel FM, y colaboradores, eds, 1987; the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); PCR2: A Practical Approach, MacPherson MJ, Hams BD, Taylor GR, eds, 1995; Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow y Lane, eds, 1988.

La invención se explica además en los siguientes ejemplos. Los ejemplos no limitan la invención de ninguna manera. Estos sirven meramente para clarificar la invención.

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Ejemplos Ejemplo 1 Construcción de los vectores STAR67

Una secuencia anti-represora novedosa se aísla usando una selección genética como se describe en WO 03/004704, y esta secuencia novedosa se acuño como STAR67 (SEQ. ID. NO. 66). Los efectos de STAR67 en la expresión de los transgenes en las líneas celulares de mamíferos se probaron. Aquí se describe la construcción de los diversos constructos.

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Materiales y métodos

Tres plásmidos se crearon (Fig. 1):

A)

CMV-d2EGFP-ires-Zeo (CMV Control),

B)

STAR67-CMV-d2EGFP-ires-Zeo (CMV-STAR67),

C)

STAR7-STAR67-CMV-d2EGFP-ires-Zeo-STAR7 (CMV-STAR67 7/7)

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La construcción del constructo A se describe a continuación. El plásmido pd2EGFP (Clontech 6010-1) se modificó por inserción de una ligadura en el sitio BsiWI para producir la ligadura pd2EGFP. La ligadura hecha al combinar los oligonucleótidos GTACGGATATCAGATCTTTAATTAAG (SEQ. ID. NO. 67) y GTACCTTAATTAAA
GATCTGATAT (SEQ. ID. NO. 68), introdujo los sitios para las endonucleasas de restricción PacI, BglII, y EcoRV. Se creó el sitio de clonación múltiple MCSII para la inserción de los elementos STAR. Luego los cebadores GATCA
GATCTGGCGCGCCATTTAAATCGTCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGG (SEQ. ID. NO. 69) y AGGCGGATCC
GAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGG (SEQ. ID. NO. 70) se usaron para amplificar una región de 0.37 kb desde pd2EGFP, la cual se insertó dentro del sitio BglII de pIRES (Clontech 6028-1) para producir el pIRES-stuf. Estos introducen sitios para las endonucleasas de restricción AscI y SwaI en MCSI, y actúan como un "fragmento de relleno)" para evitar la interferencia potencial con los elementos STAR y los promotores adyacentes. pIRES-stuf se digirió con BglII y FspI para liberar el fragmento de ADN compuesto del fragmento más firme, el promotor CMV, el elemento IRES (flanqueado por sitio de clonación múltiples MCS A y MCS B), y la señal de poliadenilación SV40. Este fragmento se ligó con la columna del vector de la ligadura pd2EGFP producida por digestión con BamHI y StuI, para producir la ligadura pIRES.

La estructura de lectura abierta del gen resistente a la zeocina se insertó en los sitios BamHI/NotI en secuencia abajo de pIRES como sigue: El ORF resistente a la zeocina se amplificó por PCR con los cebadores GATCGGATCCTTC
GAAATGGCCAAGTTGACCAGTGC (SEQ. ID. NO. 71) y AGGCGCGGCCGCAATTCTCAGTCCTGCTCCTC (SEQ. ID. NO. 72) a partir del plásmido pCMV/zeo (Invitrogen, cat.no. V50120), digerido con BamHI y NotI, y ligado con la ligadura BamHI/NotI digerida por pIRES para producir el pIRES-link-zeo. LA ORF reportera de d2EGFP se introdujo en pIRES-link-zeo por amplificación de pd2EGFP (Clontech 6010-1) con los cebadores GATC
GAATTCTCGCGAATGGTGAGCAAGCAGATCCTGAAG (SEQ. ID. NO. 73) y AGGCGAATTCACCGGTGTT
TAAACTTACACCCACTCGTGCAGGCTGCCCAGG (SEQ. ID. NO. 74), y la inserción del casete EcoRI digerido con d2EGFP en el sitio EcoRI en el plásmido pIRES-link-zeo. Esto creó el constructo A, CMV-d2EGFP-IRES-Zeo (CMV Control).

STAR67 se clonó secuencia arriba del promotor CMV, en el sitio AscI (alrededor de 15 nucleótidos permanecen entre STAR67 y el promotor). Esto creo el constructo B, STAR67-CMV-d2EGFP-ires-Zeo (CMV-STAR67).

STAR67 también se probó en el contexto de un casete que contiene también el STAR7 (SEQ. ID. NO. 7), se clonó direccionalmente en los sitio 5' SalI y XbaI y los sitios 3' BglII y PacI para flanquear el casete completo con STAR7. Este es el constructo C (CMV-STAR67 7/7).

Ejemplo 2 STAR67 mejora el nivel de expresión de los promotores CMV, EF1\alpha y UB6 en células CHO transfectadas de forma estable

Se probó si la presencia de STAR67 adyacente a los promotores CMV, EF1\alpha y UB6 tiene influencia en el nivel de expresión de estos promotores en las células CHO. Los constructos A y B (Fig. 1) descritos en el Ejemplo 1 se usan para este propósito modificados por los promotores respectivos:

1

CMV-d2EGFP-ires-Zeo (CMV Control)

2

STAR67-CMV-d2EGFP-ires-Zeo (CMV-STAR67)

3

EF1\alpha-d2EGFP-ires-Zeo (EF1\alpha Control)

4

STAR67-EF1\alpha-d2EGFP-ires-Zeo (EF1\alpha-STAR67)

5

UB6-d2EGFP-ires-Zeo (UB6 Control)

6

STAR67-UB6-d2EGFP-ires-Zeo (UB6-STAR67).

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Materiales y métodos

Los promotores UB6 y EF1\alpha se intercambiaron por el promotor CMV en los plásmidos descritos en la figura 1. El promotor UB6 se clonó como sigue. Un ADN de relleno 0.37 kb a partir del plásmido pd2EGFP se amplificó por PCR, como se describe por el ejemplo 1, usando los cebadores ejemplificados por SEQ. ID. NOs. 69 y 70. El ADN de relleno, resultante se clonó en el sitio BglII de pUB6/V5-His [Invitrogen V250-20], creando pUB6-stuf. A partir de pUB6-stuf se clonó un fragmento de AscI-SacI dentro del CMV-d2EGFP-IRES-Zeo, a partir del cual se removió el promotor CMV.

El promotor EF1\alpha se amplificó por PCR con pEF1\alpha/V5-His [Invitrogen V920-20] como plantilla, usando los cebadores GATCGGCGCGCCATTTAAATCCGAAAAGTGCCACCTGACG (SEQ. ID. NO. 79) y AGGCGGGACCCCC
TCACGACACCTGAAATGGAAG (SEQ. ID. NO. 80). El fragmento PCR se clonó en los sitios AscI y PpuMI del CMV-d2EGFP-IRES-Zeo, a partir del cual se removió el promotor CMV.

La línea celular de ovario de hámster chino CHO-K1 (ATCC CCL-61) se cultivo en un medio HAMS-F12 + 10% de suero de ternera fetal que contiene 2 mM glutamina, 100 U/ml penicilina y 100 microgramos/ml estreptomicina a 37ºC/5% de CO_{2}. Las células se transfectaron con los plásmidos usando SuperFect (QIAGEN) como se describe por el fabricante. Brevemente, se sembraron las células en recipientes de cultivo y se hicieron crecer durante la noche hasta 70-90% de confluencia. Se combinó el reactivo SuperFect con el ADN del plásmido a una relación de 6 microlitros por microgramo (por ejemplo, para una caja petri de 10 cm, 20 microgramos de ADN y 120 microlitros de SuperFect) y se agregó a las células. Después de la incubación durante la noche, se reemplazó la mezcla de transfección con medio fresco y se incubaron las células transfectadas además. Después de un cultivo durante la noche, se trataron con tripsina las células y se sembraron en vasos de cultivo frescos con medio fresco. Después de otra incubación durante la noche, se agregó zeocina a una concentración de 50 \mug/ml y se cultivaron además las células. Después de otros tres días, se reemplazó el medio fresco que contiene zeocina (100 \mug/ml) y se cultivaron además. Cuando se hicieron visibles las colonias individuales (aproximadamente 10 días después de la transfección) se removió el medio y se reemplazó con medio fresco sin zeocina. Se aislaron los clones individuales y se transfirieron a placas de 24 pozos en medio sin zeocina. Un día después del aislamiento de las colonias se agregó zeocina al medio. La expresión del gen reportero d2EGFP se evaluó aproximadamente 3 semanas después de la transfección. Los niveles de expresión d2EGFP en las colonias se midieron después de periodos de dos semanas. Después de las dos semanas iniciales posteriores a la transfección cuando se efectuaron las primeras mediciones de d2EGFP, las colonias se cultivaron en medio sin zeocina u otros antibióticos. Esto continuó por el resto del experimento.

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Resultados

La figura 2 muestra que la transfección del constructo que contiene el STAR67 clonado secuencia arriba del promotor CMV resultó en diversas colonias de CHO que expresan niveles significativamente superiores de la proteína d2EGFP en comparación con el control "vacío" sin STAR67, control CMV. El promedio de la señal de d2EGFP en las 10 colonias transfectadas con el plásmido de control CMV fue de 34, cuando se miden 25 días después de la transfección. 60 días después de la transfección el promedio de la señal de d2EGFP en estas 10 colonias se redujo a 13 lo que indica que la expresión no es estable con el tiempo. En comparación, el promedio de la señal d2EGFP en las 10 colonias transfectadas con el plásmido STAR67-CMV fue de 42 cuando se mide después de 25 días y de 32 medidas 60 días después de la transfección. Así 60 días después de la transfección, un constructo de CMV que abarca STAR67 transmite un factor de 2.5 superior al promotor CMV que impulsa el nivel de expresión de la proteína reportera en los clones transfectados de manera estable. De manera importante, 25 días después de la transfección después de la primera medición, se retiró la presión de selección al cultivar las colonias en medio sin zeocina. Así, las colonias que contienen el constructo STAR67 son más estables con el tiempo en la ausencia de la presión de selección que las colonias que no contienen un constructo de STAR67.

La figura 3 muestra que la transfección del constructo que contiene STAR67 clonado secuencia arriba del promotor EF1\alpha resulto en diversas colonias de CHO que expresan niveles significativamente superiores de la proteína d2EGFP en comparación con el control "vacío" sin STAR67, control EF1\alpha. El promedio de la señal d2EGFP en las 10 colonias transfectadas con el plásmido de control EF1\alpha fue de 31, cuando se mide 25 días después de la transfección. 60 días después de la transfección el promedio de la señal d2EGFP en estas 10 colonias fue de 26. En comparación, el promedio de la señal d2EGFP en las 10 colonias transfectadas con el plásmido EF1\alpha-STAR67 fue de 60 cuando se mide después de 25 días y 76 cuando se mide 60 días después de la transfección. Así, ambos después de 25 y 60 días después de la transfección, un constructo STAR67 que abarca EF1\alpha transmitió un factor de 2.9 superior al nivel de expresión impulsado por el promotor EF1\alpha de la proteína reportera en clones transfectados de manera estable.

La figura 4 muestra que la transfección del constructo que contiene el STAR67 clonado cadena arriba del promotor UB6 resulta en diversas colonias de CHO que expresan niveles significativamente superiores de la proteína d2EGFP, en comparación con el control "vacío" sin STAR67, control UB6. El promedio de la señal d2EGFP en las 10 colonias transfectadas con el plásmido de control UB6 fue de 51 cuando se mide 25 días después de la transfección. 60 días después de la transfección el promedio de la señal d2EGFP en estas 10 colonias fue de 29, lo que indica que la expresión no estuvo estable con el tiempo. En comparación, el promedio de la señal d2EGFP en las 10 colonias transfectadas con el plásmido UB6-STAR67 fue de 218 cuando se mide después de 25 días y 224 medida 60 días después de la transfección. Así, 25 días después de la transfección un constructo de UB6 que abarca STAR67 transmitió un factor de 4.3 mayor que el nivel de expresión impulsado por el promotor UB6 de la proteína reportera en clones transfectados de manera estable. Después de 60 días, este factor fue de 7.7, debido a la inestabilidad de la expresión en las colonias de control y la estabilidad en las colonias de UB6-STAR67. De manera importante, 25 días después de la transfección, después de la primera medición, se removió la presión de selección al cultivar las colonias en un medio sin zeocina. Así, las colonias que contienen el constructo de STAR67 son más estables con el tiempo en la ausencia de la presión de selección que las colonias que no contienen un constructo de STAR67.

En conclusión, STAR67 incrementa la expresión de tres diferentes promotores, no relacionados.

Ejemplo 3 STAR67 mejora el nivel de expresión a partir de CMV, EF1\alpha y los promotores UB6 en células PER.C6 transfectadas de manera estable

Se probó si la presencia de STAR67 adyacente de los promotores CMV, EF1\alpha y UB6 tiene influencia en el nivel de expresión de estos promotores en otro tipo celular que las células CHO, en particular las células PER.C6 humanas. Se usaron los mismos constructos como en el ejemplo 1.

Materiales y métodos Transfección, cultivo y análisis de células PER.C6

Las células PER.C6® se cultivaron en medio DMEM + piridoxina + suero de ternera fetal al 9% (no inactivado con calor), 8.9 mM MgCl_{2} 100 U/ml penicilina y 100 microgramos/ml estreptomicina a 37ºC/10% CO_{2}. Las células se transfectaron con los plásmidos usando Lipofectamina 2000 (Invitrogen) como se describe por el fabricante. Brevemente, se sembraron las células a los 6 pozos y crecieron durante la noche hasta 70-90% de confluencia. Se combinó el reactivo de lipofectamina con el ADN del plásmido a una relación de 15 microlitros por 3 microgramos (por ejemplo, para una caja petri de 10 cm, 20 microgramos de ADN y 120 microlitros de Lipofectamina) y se agregó después de 30 minutos de incubación a 25ºC a las células. Después de una incubación por 6 horas, se reemplazó la mezcla de transfección con medio fresco y se incubaron además las células transfectadas. Después de un cultivo durante la noche, se trataron con tripsina las células y se sembraron (diluciones de 1:15, 1:30, 1:60, 1:120) en cajas de petri frescas (90 mm) con medio fresco con zeocina agregado a una concentración de 100 \mug/ml y las células se cultivaron además. Cuando se hicieron visibles las colonias, se aislaron los clones individuales al raspar y transferir a placas de 24 pozos en medio con zeocina. Cuando se hicieron crecer hasta una confluencia de \sim70%, se transfirieron las células a placas de 6 pozos. Se expandieron las colonias estables durante 2 semanas en placas de 6 pozos antes de que se determinara la señal d2EGFP en un citómetro de flujo XL-MCL Beckman Coulter. La media de la señal d2EGFP se tomó como medida para el nivel de expresión de d2EGFP. Se midieron las colonias por una segunda vez después de 2 semanas. Posteriormente se cultivaron además las colonias en ausencia de zeocina.

Resultados

La figura 5 muestra que la transfección del constructo que contiene STAR67 clonado cadena arriba del promotor CMV resulta en diversas colonias PER.C6 que expresan significativamente niveles superiores de la proteína d2EGFP, en comparación con el control "vacío" sin STAR67, control CMV. El promedio de la señal d2EGFP en las 10 colonias transfectadas con el plásmido de control CMV fue de 37, cuando se mide 30 días después de la transfección. 60 días después de la transfección el promedio de la señal d2EGFP en estas 10 colonias se redujo a 14, lo que indica que la expresión no estuvo estable durante el tiempo. En comparación, el promedio de la señal d2EGFP en las 10 colonias transfectadas con el plásmido STAR67-CMV fue de 101 cuando se mide después de 30 días y 45 cuando se mide 60 días después de la transfección. Así 60 días después de la transfección, un constructo CMV que abarca STAR67 transmitió un factor de 3.2 superior al nivel de expresión impulsado por el promotor CMV de la proteína reportera en clones transfectados de manera estable.

La figura 6 muestra que la transfección del constructo que contiene STAR67 clonado cadena arriba del promotor EF1\alpha resulto en un número de colonia PER.C6 que expresan niveles significativamente superiores que la proteína d2EGFP cuando se comparan con el control "vacío" sin STAR67, control EF1\alpha. El promedio de la señal d2EGFP en las 10 colonias transfectadas con el plásmido de control EF1\alpha fue de 5, cuando se mide 30 días después de la transfección. 60 días después de la transfección el promedio de la señal d2EGFP en estas 10 colonias fue de 6. En comparación, el promedio de la señal d2EGFP en las 10 colonias transfectadas con el plásmido EF1\alpha-STAR67 fue de 25 cuando se mide después de 30 días y 20 cuando se mide 60 días después de la transfección. Así, tanto después de 30 y de 60 días después de la transfección, un constructo de EF1\alpha que abarca STAR67 transmitió un factor 4 veces mayor que el nivel de expresión impulsado por el promotor EF1\alpha de la proteína reportera en clones transfectados de manera estable.

La figura 7 muestra que la transfección del constructo que contiene STAR67 clonado cadena arriba del promotor UB6 resulto en un número de colonias PER.C6 que expresan niveles significativamente superiores de la proteína d2EGFP, en comparación con el control "vacío" sin STAR67, control UB6. El promedio de la señal d2EGFP en las 10 colonias transfectadas con el plásmido de control UB6 fue de 4, cuando se mide 30 días después de la transfección. 60 días después de la transfección, el promedio de la señal d2EGFP en estas 10 colonias fue de 2. En comparación, el promedio de la señal d2EGFP en las 10 colonias transfectadas con el plásmido US6-STAR67 fue de 27 cuando se mide después de 30 días y de 18 cuando se mide 60 días después de la transfección. Así, tanto después de 30 y 60 días después de la transfección, un constructo UB6 que abarca STAR67 transmitió un factor de 7 a 9 veces mayor que el nivel de expresión impulsado por el promotor UB6 de la proteína reportera en clones transfectados de manera estable.

Así, al colocar STAR67 cadena arriba del promotor resultó en niveles de expresión de proteína significativamente mayores en comparación con los constructos de menos de STAR67, también en las células PER.C6. Así, STAR67 funciona en tipos de célula no relacionados diferentes.

Ejemplo 4 Configuración novedosa de STAR67 combinada con otros elementos anti-represores para potenciar al promotor SV40 en las células CHO

Se probó si la presencia de STAR67 adyacente del promotor SV40 tiene influencia en el nivel de expresión de este promotor ya sea solo o en combinación con otro elemento anti-represor en este ejemplo STAR7. Los constructos que se usaron para este propósito (ver Fig. 8), son:

1

SV40-d2EGFP-ires-Zeo (control SV40)

2

STAR67-SV40-d2EGFP-ires-Zeo (SV40-STAR67)

3

STAR7-SV40-d2EGFP-ires-Zeo-STAR7 (SV40-STAR7/7)

4

STAR7-STAR67-SV40-d2EGFP-ires-Zeo-STAR7 (SV40-STAR67 7/7)

Materiales y Métodos

El promotor SV40 se amplificó por PCR con pIRES como plantilla usando los cebadores TTGGTTGGGGCGCGC
CGCAGCACCATGGCCTGAAATAACCTCTGAAAGAGG (SEQ. ID. NO. 81) y TTGGTTGGGAGCTCAAGCTTT
TTGCAAAAGCCTAGGCCTCCAAAAAAGCCTCCTC (SEQ. ID. NO. 82). El fragmento PCR se clonó en los sitios AscI y SacI de CMV-d2EGFP-IRES-Zeo, a partir de los cuales se removió el promotor CMV. Las células CHO se transfectaron, se aislaron las colonias y se propagaron y se analizaron como en el ejemplo 2.

Resultados

La figura 8 muestra que la transfección del constructo que contiene ya sea STAR67 clonado cadena arriba del promotor SV40 (SV40-STAR67) o STAR7 clonado en el flanco del constructo completo (SV40-STAR 7/7) no resultó en colonias de CHO que expresen niveles significativamente mayores que la proteína d2EGFP, en comparación con el control "vacío" sin los elementos anti-represores (control SV40). El promedio de la señal d2EGFP en las 18 colonias transfectadas con el plásmido de control SV40 fue de 86, cuando se mide 40 días después de la transfección. En comparación, el promedio de la señal d2EGFP en las 18 colonias transfectadas con el plásmido SV40-STAR67 fue de 82 cuando se mide después de 40 días y el promedio de la señal d2EGFP en las 18 colonias transfectadas con el plásmido SV40-STAR 7/7 fue de 91 cuando se mide después de 40 días. Así, no se observó ningún efecto importante de estos elementos anti-represores sobre el promotor SV40 en las células CHO.

Parece que los niveles de expresión del promotor SV40 en estas células ya son bastante altos e incluso mucho mayores que aquellos observados con el promotor CMV, el cual se consideró que era un promotor muy fuerte. Esta alta expresión del respaldo en ausencia de un elemento anti-represor usando el promotor SV40 en las células CHO, puede expresar por que no se observo ningún efecto importante del STAR6 solo o del STAR7 que flanquea al transgen.

Sin embargo, el promedio de la señal d2EGFP en las 18 colonias transfectadas con el plásmido SV40-STAR67 7/7 fue de 209 cuando se mide después de 40 días de colonias, el cual es un factor de 2.4 mayor que el promedio de las 18 colonias de (86). Así, cuando el elemento STAR67 se usa en combinación con otro elemento anti-represor, esto resulta en diversas colonias CHO transfectadas de manera estable que muestran niveles de expresión d2EGFP significativamente mayores.

Por lo tanto en esta configuración novedosa (5'-STAR secuencia A - STAR secuencia C - promotor - ácido nucleico que codifica una proteína de interés - STAR secuencia B - 3', en donde en el ejemplo actual las secuencias STAR A y B son la secuencia STAR 7 y STAR C es STAR67) los elementos STAR parecen funcionar incluso mejor que en las configuraciones hasta ahora descritas.

Se han hecho experimentos en los cuales los elementos de flanqueo STAR7 se reemplazaron por el STAR6 de elementos de flanqueo (SEQ. ID. NO. 6) o elementos de flanqueo STAR4 (SEQ. ID. No. 4), en combinación con el STAR67 cadena arriba del promotor SV (SV40-STAR67 6/6 y SV40-STAR67 4/4, respectivamente, al usar la misma nomenclatura como anteriormente) y se observó la expresión mejorada también con estas combinaciones. Esto prueba que los elementos de flanqueo STAR7 se pueden intercambiar por otras secuencias STAR, y todavía la mejora de la configuración novedosa del casete de expresión con las secuencias STAR se observa.

Ejemplo 5 Una combinación de STAR67 y STAR7 mejora los niveles de expresión de anticuerpos impulsados por UB6 en células CHO transfectadas de manera estable

En el ejemplo 4, se mostró que la combinación de STAR67 y STAR7 potenció los niveles de expresión de la proteína d2EGFP en células CHO. Aquí se probó si la combinación de STAR67 y STAR7 se puede usar para la producción de un anticuerpo. Se escogió un anticuerpo contra la molécula EpCAM (Huls y colaboradores, 1999) como proteína de prueba y se usó el promotor UB6.

Materiales y métodos Plásmidos

El ADNc de cadena pesada (HC-EpCAM) se clonó en un constructo que abarca el promotor UB6. EL HC-EpCAM se acopló al gen de resistencia a la zeocina por una secuencia IRES. El ADNc de cadena ligera (LC-EpCAM) también se clonó en un constructo que abarca el promotor UB6. El LC-EpCAM se acopló al gen de resistencia de puromicina por una secuencia IRES. Juntos estos dos plásmidos representan el control UB6 (HC+LC) (Fig. 9).

Para probar los efectos de STAR67 y STAR7, STAR67 se clonó en ambos constructos HC+LC, cadena arriba de los promotores UB6. STAR7 se clonó para flanquear los casetes completos, ambos en los extremos 5' y 3' (Fig. 9). Estos dos plásmidos representan STAR-STAR67-UB6 (HC+LC) STAR7.

Transfección y cultivo de las células CHO

La línea celular de ovario de hámster chino CHO-K1 (ATCC CCL-61) se transfectó y se cultivó como en el ejemplo 2, usando zeocina (100 \mug/ml) y puromicina (2.5 \mug/ml) para la selección. Un día después de la transfección, la zeocina se agregó al medio de cultivo. Cuando se volvieron visibles las primeras colonias (aproximadamente 7 días después de la adición de zeocina) se retiro el medio de cultivo y se reemplazó con medio de cultivo que contenía puromicina. Después de aproximadamente 7 días, se aislaron las colonias y se transfirieron a placas de 24 pozos, en medio de cultivo que contenían solamente zeocina.

Resultados

La figura 9 muestra que la transfección de los constructos de anticuerpos que contienen STAR67 clonado cadena arriba del promotor UB6 y los dos elementos STAR7 clonados para flanquear los casetes completos resultaron en diversas colonias CHO que expresan niveles significativamente superiores del anticuerpo EpCAM (medida por ELISA usando un anticuerpo IgG anti-humano) en comparación con el control "vacío" sin STAR67 y STAR7, UB6 (HC+LC). El promedio de la producción EpCAM en las 18 colonias transfectadas con el plásmido de control UB6 (HC+LC) fue de 2.7 pg/célula/día, cuando se mide 25 días después de la transfección. Los agentes de selección de zeocina y puromicina se removieron después de 25 días. 45 días después de la transfección el promedio de la producción de EpCAM en estas 18 colonias fue de 2.7 pg/célula/día. En comparación, el promedio de la señal de producción de EpCAM en las 18 colonias transfectadas con el plásmido STAR7-STAR67-UB6 (HC+LC)-STAR7 fue de 6.7 cuando se miden después de 25 días y 7.7 pg/célula/día, cuando se mide 45 días después de la transfección. Así, tanto después de 30 y 45 días después de la transfección, un constructo UB6 que abarca STAR67/STAR7 transportó un factor de 2.5 hasta 2.9 veces superior al promotor UB6 que impulsa el nivel de expresión EpCAM en clones CHO transfectados de manera estable.

Así, la colocación de STAR67 de cadena arriba del promotor y dos elementos STAR7 para flanquear los casetes resultó en niveles de expresión de anticuerpos EpCAM significativamente mayores en las células CHO, en comparación con los constructos menos STAR67/STAR7.

Ejemplo 6 STAR67 no es un bloqueador intensificador, mientras que STAR6 y STAR7 lo son

Todos los elementos hasta aquí conocidos de STAR que se probaron para esa propiedad incluyendo STAR6 y STAR7, son bloqueadores intensificadores (WO 03/004704, Kwaks y colaboradores, 2003). Se prueba la actividad del bloqueador intensificador al colocar un elemento STAR entre un intensificador fuerte y un promotor. Aquí se probó si también STAR67 es un bloqueador intensificador.

Materiales y Métodos

El gen d2EGFP se amplifica por PCR usando cebadores TTGGTTGGTCATGAATGGTGAGCAAGGGCGAG
GAGCTGTTC (SEQ.ID.NO. 75) y ATTCTCTAGACTACACATTGATCCTAGCAGAAGCAC (SEQ.ID.NO. 76) y se clonan en un promotor pGL3 plásmido (Promega) usando los sitios de restricción NcoI y XbaI para reemplazar el gen Luciferasa para crear el promotor GFP del plásmido pGL3. Un ligador (creado al combinar en sus pares base el oligo CGATATCTTGGAGATCTACTAGTGGCGCGCCTTGGGCTAGCT (SEQ.ID.NO. 77) y GATCAGCTAGCC
CAAGGCGCGCCACTAGTAGATCTCCAAGATATCGAGCT(SEQ.ID.NO. 78), se clonó en los sitios SacI y BglII para crear sitios de clonación múltiples. El sitio BglII original se destruyó durante la ligación del ligador, creando un sitio BglII único nuevo dentro del ligador de ADN. El potenciador SV40 se cortó del plásmido pGL3 básico (Promega) usando BsaBI y BamHI y se clona en el promotor GFP de ligador pGL3 usando los sitios EcoRV y BglII que crean el plásmido pGL3-potenciador-promotor-GFP. El elemento STAR40 (SEQ. ID. NO. 40) se colocó cadena arriba del potenciador SV40 usando sitios KpnI y SacI para prevenir la acción del potenciador en secuencias cadena arriba. Finalmente, los elementos anti-represores STAR6, STAR7 y STAR67 se colocaron entre el potenciador SV40 y el promotor mínimo SV40 usando los sitios de restricción SpeI y AscI.

Transfección y cultivo de células CHO

La línea de célula de ovario de hámster chino CHO-K1 (ATCC CCL-61) se transfecta como en el ejemplo 2. Un día después de la transfección, los niveles de d2EGFP se miden en un flujocitómetro Epics XL (Beckman Coulter).

Resultados

La Fig. 10 muestra que STAR67 no es bloqueador potenciador, mientras que STAR6 y STAR7 actúan como bloqueadores potenciadores en el mismo ensayo. El STAR6, STAR7 y STAR67 se clonaron entre el potenciador SV40 y un promotor SV40 mínimo cadena arriba del gen d2EGFP. Cuando no se clona el elemento STAR entre el potenciador y el promotor se presenta la activación transcripcional fuerte (arbitrariamente colocado al 100%). Cuando STAR6 o STAR7 se coloca entre el potenciador y el promotor, la transcripción cae hasta niveles de respaldo, lo que indica que STAR6 y STAR7 son bloqueadores potenciadores potentes. En contraste, cuando STAR67 se clonó entre el potenciador y el promotor con relación a los niveles de transcripción todavía fueron del 80% del control, lo que indica que STAR67 no es un buen bloqueador potenciador, esto está en contraste con STAR6 y STAR 7, así como otros elementos anti-represores, como se describe previamente (WO 03/004704, Kwaks y colaboradores, 2003).

Ejemplo 7 STAR67 aumenta los niveles de expresión del anticuerpo conducido por UB6 y CMV en células CHO establemente transfectadas

En el ejemplo 5 se muestra que la combinación de STAR67 y STAR7 aumenta los niveles de expresión del anticuerpo EpCAM en células CHO, en el contexto de dos distintos plásmidos, que contienen las cadenas pesada y ligera. En este ejemplo se prueba que STAR67 podrá usarse para la producción del anticuerpo EpCAM cuando ambas cadenas pesada y ligera se colocan en un plásmido. Se usa una selección simultánea para cada marcador seleccionable.

Materiales y Métodos Plásmidos

El ADNc de cadena pesada (HC-EpCAM) está bajo el control del promotor UB6 y se acopla al gen de resistencia Zeocina por una secuencia IRES. El ADNc de cadena ligera (LC-EpCAM) está bajo el control del promotor CMV y se acopla al gen de resistencia a la puromicina por una secuencia IRES. Básicamente estos son los constructos usados en el ejemplo 5. Estos dos casetes de expresión se colocaron en un plásmido, de tal manera que la transcripción de las dos unidades de expresión tiene direcciones opuestas. En el plásmido de control los promotores UB6 y CMV se separaron por ADN de relleno de 500 bp (EpCAM Control) (Fig. 10). En otro plásmido, el STAR67 se colocó entre el promotor UB6 y CMV (EpCAM STAR67) (Fig. 10).

Transfección y cultivo de células CHO

La línea de células de ovarios de hámster chino CHO-K1 (ATCC CCL-61) se transfectó y cultivo como en el ejemplo 2, usando zeocina (100 \mug/ml) y puromicina (2.5 \mug/ml) para selección. En el ejemplo 5, se usó la selección consecutiva para ambos marcadores. En contraste, ambos agentes de selección se presentaron en el medio de cultivo simultáneamente. Un día después de la transfección, la zeocina y puromicina se agregaron al medio de cultivo. El medio de selección se presentó hasta que las colonias se aislaron (aproximadamente 14 días después de la transfección). Después de que las colonias se aislaron y se transfectaron a placas de 24 pozos, las células se cultivaron en presencia de zeocina y puromicina.

Resultados

La Fig. 11 muestra que la transfección del constructo de anticuerpo que contiene el STAR67 clonado entre los promotores UB6 y CMV que resulta en un número de colonias CHO que expresan el anticuerpo EpCAM (medido por ELISA usando un anticuerpo IgG antihumano). El promedio de la producción EpCAM en las 19 colonias transfectadas con el plásmido EpCAM STAR67 fue 9.8 pg/célula/día, cuando se mide 25 días después de la transfección.

En contraste, sorprendentemente no sobrevivieron colonias de la transfección con el plásmido de control EpCAM. Cuando la selección se realizó ya sea con zeocina o puromicina solamente, las colonias de control EpCAM sobrevivieron. Sin embargo, cuando la presión de selección se incrementó al colocar la presión de selección tanto en la cadena pesada como ligera, estas condiciones permiten que sólo las colonias que sobreviven tengan el STAR67 presente en el plásmido transfectado.

Los resultados también muestran que la incorporación de STAR67 tienen un efecto benéfico en dos promotores, los promotores UB6 y CMV, que se colocan cadena arriba y cadena debajo de un elemento STAR67. Esto indica que STAR67 puede operar en una manera bi-direccional.

La diferencia entre el plásmido EpCAM de control y EpCAM STAR67 es el negro-blanco en el sentido de que sólo la transfección de EpCAM STAR67 resulta en el establecimiento de colonias, cuando la presión de selección es alta. Esto abre una oportunidad para usar esta configuración de plásmido para identificar la región en STAR67 que es responsable de mediar este efecto. Las porciones traslapadas, más pequeñas de STAR67 se colocan entre los promotores UB6 y CMV, conduciendo la molécula EpCAM. Cuando una porción de STAR67 es funcional, las colonias sobrevivirán cuando se usan simultáneamente tanto zeocina como puromicina como agente de selección. Cuando una porción de STAR67 no es funcional, no sobrevivirán colonias bajo condiciones de selección idénticas.

Por lo tanto, cuando se coloca STAR67 cadena arriba del promotor resulta en niveles de expresión de anticuerpo EpCAM significativamente mayores en células CHO, en comparación con constructos que carecen de tales elementos anti-represores. Un experimento similar se realizó con el promotor SV40 para conducir la expresión de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo anti-EpCAM. En otros experimentos, STAR67 se intercambia por otras secuencias STAR. En experimentos adicionales, la orientación de las dos unidades de expresión que codifican las cadenas pesada y ligera se cambian de tal manera que ambas están en la misma dirección. En otro experimento, las unidades de expresión para las cadenas pesada y ligera se colocan en moléculas de ácido nucleico diferentes respectivamente (como en el ejemplo 5), y los clones resultantes se seleccionan simultáneamente para ambos marcadores seleccionables. En otro experimento, el tipo de célula hospedadora varía. Las combinaciones de estas variaciones se hacen.

Descripción de las figuras

Fig. 1. Diagrama esquemático de la invención.

A) gen bicistrónico que contiene (desde 5' hasta 3') un transgen (que codifica por ejemplo el gen d2EGFP), un IRES, y un marcador seleccionable (zeo, que confiere resistencia a la zeocina) bajo control del promotor CMV. La unidad de expresión tiene el terminador SV40 transcripcional en su extremo 3' (t). El nombre del constructo es CMV-d2EGFP-ires-Zeo (CMV Control).

B) constructo como en A, pero ahora STAR 67 SE clona cadena arriba del promotor CMV. El nombre del constructo es STAR67-CMV-d2EGFP-ires-Zeo (CMV-STAR67).

C) constructo como en B, pero elementos STAR7 de cadena arriba y cadena abajo se clonan para flanquear el constructo completo. El nombre del constructo es STAR7-STAR67-CMV-d2EGFP-ires-Zeo-STAR7 (CMV-STAR67 7/7).

Fig. 2. STAR67 mejora la expresión d2EGFP que conduce CMV en células CHO. La media de la señal d2EGFP para 10 colonias estables independientes se agrupa para los constructos indicados en células CHO. A) CMV Control; B) STAR67-CMV.X(10): niveles de expresión d2EGFP promedio de las 10 colonias. Ver el ejemplo 2 para detalles.

Fig. 3. STAR67 mejora la expresión d2EGFP conducida por EF1\alpha en células CHO. Igual que en la Fig. 2, pero ahora con el promotor EF1\alpha. A) EF1\alpha Control; B) STAR67- EF1\alpha.

Fig. 4. STAR67 mejora la expresión d2EGFP conducida por UB6 en células CHO. Igual que en las Figs. 2 y 3, pero ahora con promotor UB6. A) UB6 Control; B) STAR67-UB6.

Fig. 5. STAR67 mejora la expresión d2EGFP conducida en CMV en células PER.C6. Igual que en la Fig. 2, pero ahora en células PER.C6. A) CMV Control; B) STAR67-CMV.

Fig. 6. STAR67 mejora la expresión d2EGFP conducida por EF1\alpha en células PER.C6. Igual que en la Fig. 3, pero ahora en células PER.C6. A) EF1\alpha Control; B) STAR67-EF1\alpha.

Fig. 7. STAR67 mejora la expresión d2EGFP conducida en UB6 en células PER.C6. Igual que en la Fig. 4, pero ahora en células PER.C6. A) UB6 Control; B) STAR67-UB6.

Fig. 8. STAR67 mejora la expresión d2EGFP conducida en SV40 en células CHO-K1 en combinación con otro elemento STAR. Igual como en la Fig. 2, pero ahora usando el promotor SV40 en células CHO, y los constructos indicados. La media de la señal d2EGFP se agrupa por 18-20 colonias estables independientes 60 días después de la transfección. A) SV40 Control, SV40-STAR67, SV40-STAR7/7; B) SV40 Control y SV40-STAR67 7/7. Ver el ejemplo 4 para detalles.

Fig. 9. STAR67 mejora los niveles de expresión conducidos por UB6 del anticuerpo EpCAM en células CHO-K1. Ver ejemplo 5 para detalles. A) constructos sin elementos STAR; B) constructos con STAR67 cadena arriba del promotor y elementos STAR7 de flanqueo. La concentración de anticuerpo anti-EpCAM se presenta como pg/célula/día. X(18): nivel de producción promedio de las 18 colonias.

Fig. 10. STAR67 no es bloqueador potenciador, mientras que STAR 6 y 7 lo son. Ver ejemplo 6 para detalles.

Fig. 11. STAR67 aumenta los niveles de expresión de anticuerpo conducidos por UB6 y CMV en células CHO establemente transfectadas. Ver ejemplo 7 para detalles. A) molécula de ADN sencilla que contiene la cadena pesada anti-EpCAM (HC) y cadena ligera (LC), cada uno siendo un promotor, y cada uno ligado a un gen marcador seleccionable diferente (la selección simultánea se usó para ambos marcadores): constructo sin elementos STAR. No se encontraron colonias; B) mismo constructo con STAR67 entre los dos promotores. La concentración de anticuerpo anti-EpCAM se presenta como pg/célula/día.X(19): nivel de producción promedio de las 19 colonias.

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\hskip1cm van Blokland, Rik

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<120> Secuencia novedosa para mejorar la expresión de ácido nucleótido

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<130> 0111 WO 00 ORD

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<150> PCT/EP2004/051405

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<151> 2004-07-08

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<160> 82

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<170> PatentIn versión 3.2

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<210> 1

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<211> 749

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> características diversas

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

\vskip1.000000\baselineskip

1

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\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 883

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> características diversas

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

\vskip1.000000\baselineskip

2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2126

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> características diversas

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR3

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

\vskip1.000000\baselineskip

3

4

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1625

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> características diversas

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR4

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

\vskip1.000000\baselineskip

5

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1571

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> características diversas

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR5

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

\vskip1.000000\baselineskip

6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1173

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> características diversas

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR6

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

\vskip1.000000\baselineskip

7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2101

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> características diversas

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR7

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

\vskip1.000000\baselineskip

8

9

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1821

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> características diversas

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR8

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

10

11

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1929

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> características diversas

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR9

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

12

13

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1167

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> características diversas

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> características diversas

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (452)..(1143)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n es a, c, g, o t en diversas posiciones

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip1.000000\baselineskip

14

15

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1377

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> características diversas

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

16

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1051

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> características diversas

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR12

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

18

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1291

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> características diversas

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR13

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

20

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 711

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> características diversas

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR14

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1876

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> características diversas

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

23

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1282

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> características diversas

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR16

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 793

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> características diversas

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

26

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 492

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> características diversas

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1840

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> características diversas

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR19

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

29

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 780

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> características diversas

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 607

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> características diversas

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

31

32

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1380

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> características diversas

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

33

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1246

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> características diversas

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR23

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 939

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> características diversas

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR24

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1067

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> características diversas

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

37

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 540

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> características diversas

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1520

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> características diversas

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR27

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 961

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> características diversas

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR28

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2233

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> características diversas

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

43

44

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1851

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> características diversas

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

45

46

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1701

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> características diversas

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> características diversas

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (159)..(1696)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n es a, c, g, o t en diversas posiciones

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

47

48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 771

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> características diversas

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

49

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1368

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> características diversas

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR33

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 755

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> características diversas

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR34

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\vskip1.000000\baselineskip

51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1193

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> características diversas

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> características diversas

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (312)..(1191)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n es a, c, g, o t en diversas posiciones

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\vskip1.000000\baselineskip

52

53

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1712

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> características diversas

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\vskip1.000000\baselineskip

54

55

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1321

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> características diversas

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\vskip1.000000\baselineskip

56

57

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1445

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> características diversas

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> características diversas

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (348)..(949)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n es a, c, g, o t en diversas posiciones

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\vskip1.000000\baselineskip

58

59

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2331

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> características diversas

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\vskip1.000000\baselineskip

60

61

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1071

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> características diversas

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR40

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

\vskip1.000000\baselineskip

62

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1135

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> características diversas

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

\vskip1.000000\baselineskip

63

64

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 735

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> características diversas

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

\vskip1.000000\baselineskip

65

66

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1227

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> características diversas

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

\vskip1.000000\baselineskip

67

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1586

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> características diversas

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR44

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

\vskip1.000000\baselineskip

68

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1981

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> características diversas

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR45

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

69

70

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1859

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> características diversas

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR46

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46

71

72

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1082

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> características diversas

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 47

\vskip1.000000\baselineskip

73

74

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1242

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> características diversas

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR48

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 48

\vskip1.000000\baselineskip

75

76

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1015

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> características diversas

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR49

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 49

\vskip1.000000\baselineskip

77

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2355

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> características diversas

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR50

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 50

\vskip1.000000\baselineskip

78

79

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2289

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> características diversas

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 51

\vskip1.000000\baselineskip

80

81

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1184

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> características diversas

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR52

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 52

\vskip1.000000\baselineskip

82

83

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1431

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> características diversas

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR53

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 53

\vskip1.000000\baselineskip

84

85

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 975

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> características diversas

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR54

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 54

\vskip1.000000\baselineskip

86

87

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 55

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 501

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> características diversas

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR55

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 55

\vskip1.000000\baselineskip

88

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 56

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 741

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> características diversas

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR56

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 56

\vskip1.000000\baselineskip

89

90

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1365

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> características diversas

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR57

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 57

\vskip1.000000\baselineskip

91

92

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 58

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1401

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> características diversas

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR58

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 58

\vskip1.000000\baselineskip

93

94

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 59

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 866

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> características diversas

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR59

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 59

95

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2067

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> características diversas

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR60

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> características diversas

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (92)..(1777)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n es a, c, g, o t en diversas posiciones

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 60

\vskip1.000000\baselineskip

96

97

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 61

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1470

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> características diversas

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR61

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> características diversas

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (130)..(976)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> n es a, c, g, o t en diversas posiciones

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 61

\vskip1.000000\baselineskip

98

99

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 62

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1011

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> características diversas

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR62

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 62

\vskip1.000000\baselineskip

100

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 63

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1410

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> características diversas

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR63

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 63

\vskip1.000000\baselineskip

101

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 64

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1414

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> características diversas

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR64

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 64

\vskip1.000000\baselineskip

102

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 65

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1310

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> características diversas

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR65

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 65

\vskip1.000000\baselineskip

103

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 66

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1917

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> características diversas

\vskip0.400000\baselineskip

<223> secuencia de STAR67

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 66

\vskip1.000000\baselineskip

104

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 67

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligo para hacer ligador que contiene MCII de pdEGFP-ligado

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 67

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtacggatat cagatcttta attaag

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 68

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligo para hacer ligador que contiene MCII de pdEGFP-ligado

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 68

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtaccttaat taaagatctg atat

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 69

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador para amplificación de 0.37 kb del pd2EGFP

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 69

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatcagatct ggcgcgccat ttaaatcgtc tcgcgcgttt cggtgatgac gg

\hfill

52

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 70

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador para amplificación de 0.37 kb del pd2EGFP

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 70

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aggcggatcc gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg g

\hfill

41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 71

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador para amplificar el gen ORF resistente a la zeocina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 71

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatcggatcc ttcgaaatgg ccaagttgac cagtgc

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 72

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador para amplificar el gen ORF resistente a la zeocina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 72

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aggcgcggcc gcaattctca gtcctgctcc tc

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 73

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador para amplificar d2EGFP ORF

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 73

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatcgaattc tcgcgaatgg tgagcaagca gatcctgaag

\hfill

40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 74

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador para amplificar d2EGFP ORF

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 74

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aggcgaattc accggtgttt aaacttacac ccactcgtgc aggctgccca gg

\hfill

52

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 75

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador para amplificar gen d2EGFP

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 75

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttggttggtc atgaatggtg agcaagggcg aggagctgtt c

\hfill

41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 76

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador para amplificar gen d2EGFP

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 76

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

attctctaga ctacacattg atcctagcag aagcac

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 77

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligo para preparar ligador para crear MCS en pGL3-promotor-GFP

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 77

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cgatatcttg gagatctact agtggcgcgc cttgggctag ct

\hfill

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 78

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligo para preparar ligador para crear MCS en pGL3-promotor-GFP

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 78

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatcagctag cccaaggcgc gccactagta gatctccaag atatcgagct

\hfill

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 79

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador para amplificación de promotor EF-1alfa

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 79

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gatcggcgcg ccatttaaat ccgaaaagtg ccacctgacg

\hfill

40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 80

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador para amplificación de promotor EF-1alfa

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 80

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aggcgggacc ccctcacgac acctgaaatg gaag

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 81

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador para amplificación de promotor SV40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 81

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttggttgggg cgcgccgcag caccatggcc tgaaataacc tctgaaagag g

\hfill

51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 82

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 55

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador para amplificación de promotor SV40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 82

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttggttggga gctcaagctt tttgcaaaag cctaggcctc caaaaaagcc tcctc

\hfill

55

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

Cambios en las secuencias:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencias 67 y 68:

\vskip0.400000\baselineskip

<223> oligo para hacer ligador que contiene MCSII de pd2EGFP-ligado

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencias 71 y 72:

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador para amplificar el ORF del gen de resistencia a la zeocina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

Secuencias 73 y 74:

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador para amplificar el ORF de d2EGFP

Claims (20)

1. Una molécula de ácido nucleico recombinante, que comprende una secuencia de ácido nucleico tiene una actividad anti-represora seleccionada del grupo que consiste de:

a) SEQ. ID. NO. 66,

b) fragmentos de SEQ. ID. NO. 66 en donde el fragmento tiene actividad anti-represora,

c) secuencias que son al menos 70% idénticas en secuencia de nucleótidos al a) o b) en donde dichas secuencias tienen actividad anti-represora; y

d) el complemento de uno cualesquiera de a) hasta c);

dicha molécula de ácido nucleico recombinante comprende además un casete de expresión, dicho casete de expresión comprende un promotor heterólogo ligado a un ácido nucleico de interés, y en donde dicho ácido nucleico de interés codifica preferiblemente todo o parte de una proteína de interés.

2. Una molécula de conformidad con la reivindicación 1, en la que dicha secuencia de ácido nucleico que tiene una actividad anti-represora se sitúa cadena arriba del promotor en dicho casete de expresión.

3. Una molécula de conformidad con la reivindicación 2, en la que dicha secuencia que tiene una actividad anti-represora y dicho promotor se separan por menos de 2 kb.

4. Una molécula de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que dicho ácido nucleico que codifica una proteína de interés está presente en un gen multicistrónico que codifica además un gen marcador seleccionable.

5. Una molécula de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende además al menos otra secuencia que tiene una actividad anti-represora, eligiéndose dicha al menos otra secuencia de

a) cualesquiera de las SEQ. ID. NOs. 1-65,

b) fragmentos de cualesquiera de las SEQ. ID. NOs. 1-65, en donde dichos fragmentos tienen actividad anti-represora, y

c) secuencias que son al menos 70% idénticas en secuencia de nucleótidos al a) o b) en donde las secuencias tienen actividad anti-represora, y

d) el complemento de uno cualesquiera de a) hasta c).

6. Una molécula de ácido nucleico recombinante, que comprende un casete de expresión que comprende:

5'-secuencia anti-represora A - promotor - ácido nucleico que codifica todo o parte de una proteína de interés - secuencia anti-represora B - 3' en donde las secuencias anti-represoras A y B pueden ser la misma o diferente y se eligen del grupo que consiste en

(i) cualesquiera de las SEQ. ID. NOs. 1-65,

(ii) fragmentos de cualesquiera de las SEQ. ID. NOs. 1-65, en donde dichos fragmentos tienen actividad anti-represora,

(iii) secuencias que son al menos 70% idénticas en secuencia de nucleótidos al a) o b) en donde dichas secuencias tienen actividad anti-represora, y

(iv) el complemento de uno cualesquiera de (i) hasta (iii), caracterizado en que dicho casete de expresión comprende además entre las secuencias anti-represoras A y B una secuencia que tiene una actividad anti-represora elegida del grupo que consiste en

a) SEQ. ID. NO. 66,

b) fragmentos de SEQ. ID. NO. 66 en donde dicho fragmento tiene actividad anti-represora,

c) secuencias que son al menos 70% idénticas en secuencia de nucleótidos al a) o b) en donde dichas secuencias tienen actividad anti-represora; y

d) el complemento de uno cualesquiera de a) hasta c).

7. Una célula, que comprende la molécula de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1-6.

8. La célula de conformidad con la reivindicación 7, que es una célula de mamífero.

9. La célula de conformidad con la reivindicación 8, que es una célula CHO.

10. Un método para producir una proteína de interés, que comprende cultivar una célula que comprende una molécula de ácido nucleico recombinante que codifica la proteína de interés para expresar dicho ácido nucleico que codifica la proteína de interés en la célula, caracterizado porque dicha molécula de ácido nucleico recombinante comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene una actividad anti-represora seleccionada del grupo que consiste en:

a) SEQ. ID. NO. 66,

b) fragmentos de SEQ. ID. NO. 66 en donde dicho fragmento tiene actividad anti-represora,

c) secuencias que son al menos 70% idénticas en secuencia de nucleótidos al a) o b) en donde dichas secuencias tienen actividad anti-represora; y

d) el complemento de uno cualesquiera de a) hasta c).

11. Un método de conformidad con la reivindicación 10, que comprende además aislar dicha proteína de interés.

12. Un método de conformidad con la reivindicación 10 u 11, en donde dicha secuencia de ácido nucleico que tiene una actividad anti-represora se sitúa cadena arriba del promotor que controla la expresión de la proteína de interés.

13. Un método de conformidad con la reivindicación 12, en el que dicha secuencia que tiene una actividad anti-represora y dicho promotor se separan por menos de 2 kb.

14. Un método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 10 hasta 13, en el que dicho ácido nucleico que codifica una proteína de interés está presente en un gen multicistrónico que codifica además un gen marcador seleccionable.

15. Un método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 10 hasta 14, en el que dicha célula es una célula de mamífero.

16. Un método de conformidad con la reivindicación 15, en el que dicha célula es una célula CHO.

17. Uso de una secuencia de ácido nucleico que tiene actividad anti-represora seleccionada del grupo que consiste en:

a) SEQ. ID. NO. 66,

b) fragmentos de SEQ. ID. NO. 66 en donde dicho fragmento tiene actividad anti-represora,

c) secuencias que son al menos 70% idénticas en secuencia de nucleótidos al a) o b) en donde dichas secuencias tienen actividad anti-represora; y

d) el complemento de uno cualesquiera de a) hasta c), para incrementar la expresión de un ácido nucleico de interés.

18. Un método para generar una célula hospedadora que expresa dos polipéptidos de interés, comprendiendo el método:

a) introducir en una célula hospedadora una o más moléculas de ácido nucleico, la molécula de ácido nucleico o moléculas en conjunto comprenden:

(i) un promotor ligado funcionalmente a una secuencia que codifica un primer polipéptido de interés y un primer gen marcador seleccionable, y

(ii) un promotor ligado funcionalmente a una secuencia que codifica un segundo polipéptido de interés y un segundo gen marcador seleccionable, y

(iii) al menos una secuencia que tiene una actividad anti-represora, elegida del grupo que consiste en

(a) SEQ. ID. NO. 66,

(b) fragmentos de la SEQ. ID. NO.66, los fragmentos tienen una actividad anti-represora,

(c) secuencias que son al menos 70% idénticas al (a) o (b) y que tienen actividad anti-represora, y

(d) el complemento de cualesquiera de (a) - (c);

b) seleccionar una célula hospedadora al seleccionar esencialmente de manera simultánea para la expresión del primero y segundo genes marcadores seleccionables.

19. Un método para expresar dos polipéptidos de interés, comprendiendo el método: cultivar una célula hospedadora obtenida por el método de conformidad con la reivindicación 18 para expresar el primero y segundo polipéptidos, y opcionalmente aislar dichos polipéptidos.

20. El método de conformidad con la reivindicación 18 ó 19, en el que dichos dos polipéptidos son parte de una proteína multimérica.