KR20220145361A

KR20220145361A - 재조합적으로 생성된 폴리펩타이드의 정제

Info

Publication number: KR20220145361A
Application number: KR1020227032367A
Authority: KR
Inventors: 이사벨 자포이; 헤르베 뫼벨; 안-조피 블뤼멜; 안데르스 클라스 팔름; 헨리 슈토슈
Original assignee: 노파르티스 아게
Priority date: 2020-02-24
Filing date: 2021-02-22
Publication date: 2022-10-28
Also published as: CA3172363A1; EP4110798A1; MX2022010334A; WO2021171165A1; TW202146430A; US20230127949A1; AR121396A1; CN115175925A; BR112022016481A2; AU2021227771A1; JP2023515504A

Abstract

본 발명은 일반적으로, 과다하게 글리코실화된 재조합 단백질(예를 들어, 뮤신 및 뮤신-유사 단백질, 예컨대 루브리신)의 제조 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 하나 이상의 생물반응기를 포함하는 시스템에서 액체 배지 중의 당단백질을 생성할 수 있는 포유동물 세포를 배양하는 단계, 당단백질을 농축 및 정제 및 제형화하는 단계를 포함하는 방법을 포함하고, 정제는 크로마토그래피, 엔도뉴클레아제 단계, 및 적어도 하나의 바이러스 불활성화 단계 중 하나 이상의 단계들을 포함한다. 특정 양태에서, 본 발명은 정제된 재조합 인간 루브리신을 포함하는 약제학적 조성물, 및 이를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법에 관한 것이다.

Description

재조합적으로 생성된 폴리펩타이드의 정제

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 2020년 2월 24일자로 출원된 미국 특허 출원 번호 62/980,630호의 이익과 우선권을 주장하며, 그 전체가 모든 목적을 위해 본원에 참고로 포함된다.

서열 목록

본 출원에는 ASCII 형식으로 전자 제출되었고 그 전체가 본원에 참조로 포함되는 서열 목록이 포함된다. 2021년 1월 29일자로 작성된 상기 ASCII 카피는 파일명이 PAT058776-WO-PCT_SL.txt이고, 크기가 24,738바이트이다.

기술분야

본 발명은 과다하게 글리코실화된 재조합 단백질의 생산 및 정제 방법, 및 정제된 과다하게 글리코실화된 재조합 단백질을 포함하는 조성물에 관한 것이다.

루브리신 또는, 프로테오글리칸 4(PRG4) 유전자의 산물인, PRG4는 활막 세포와 표재부 연골세포에서 고도로 발현된다(문헌[Rhee DK et al., J Clin Invest. 2005 Mar; 115(3):622-31]). 루브리신은 관절 연골을 위한 임계 경계 윤활제로 기능하고 활액으로부터 정상적으로 단리되는 당단백질이다(문헌[Swann DA et al, J Biol Chem. 1981 Jun 10; 256(11):5921-5]).

루브리신은 12개의 엑손에 걸쳐 있는 전체 길이로 PRG4 유전자에서 발현되지만, 자연적으로 발생하는 절단된 버전이 여러개 보고되어 있다. 루브리신 분자는 lc

200 nm의 완전히 확장된 "등고선" 길이 및 수 나노미터의 직경을 갖는 길고 유연한 분자이다. 그의 분자량은 대략 Mw

280-320 kDa이다. "뮤신 도메인"으로 알려진 분자의 중앙 부분은 고도로 글리코실화되어 있다(문헌[Jay, G.et al., Glycoconjugate J. 2001, 18 (10), 807815]). 이 뮤신 도메인 내에서, 주로 극성 갈락토스(총 글리칸의 ∼33%) 및 음으로 하전된 시알산(총 글리칸의 ∼66%)로 종결되는 짧은 글리칸 올리고머는 트레오닌 및 세린 잔기에 O-연결되어 있다(문헌[Jay, G.et al.,Glycoconjugate J. 2001, 18 (10), 807815]; 문헌[Estrella, R. P. et al., Biochem. J. 2010, 429 (2), 359367]). 풍부한 음으로 하전되고 고도로 수화된 당 그룹에 의해, 이 중앙 뮤신 도메인은 루브리신의 윤활과 항부착 특성들 모두의 원인인 것으로 믿어진다(문헌[Aninwene, G. E. et al., J. Biomed. Mater. Res., Part A 2015, 103 (2), 451462]; 문헌[Greene, G. et al., Biomaterials 2015, 53 (0), 127136]). 뮤신 도메인의 양쪽 끝은 세포-세포 및 세포-세포외 기질 상호작용, 예를 들어, 결합에서 특별한 역할을 하는 것으로 알려진, 2개의 구형 단백질인 소마토메딘-B 및 호메오펙신과 유사한 하위-도메인을 함유하는 단백질의 약하게 글리코실화된 "말단 도메인"이다(문헌[Jay, G.et al.,Glycoconjugate J. 2001, 18 (10), 807815]; 문헌[Estrella, R. P. et al., Biochem. J. 2010, 429 (2), 359367]). 이러한 말단 도메인은 극도로 "끈적"이며, 거의 모든 유형의 표면에 부착할 수 있다. 이러한 말단 도메인은 또한 서로 결합하여 분자 "루프"를 형성하는 것으로 나타났으며, 또한 루브리신이 이량체, 삼량체 및 사량체 및 더 크고 느슨하게 꼬인 응집체 구조를 쉽게 형성할 수 있도록 한다(문헌[Zappone, B. et al.,Langmuir 2008, 24 (4), 14951508]).

루브리신에 대한 많은 약제학적 및 과학적 관심이 있다. 루브리신은 관절염 증상의 악화를 늦추기 위해 활막에 주사함에 의한 투여를 위해 제안되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 제8,026,346호 및 미국 출원 공개 번호 US 20090104148호를 참조한다. 미국 출원 공개 번호 US 20130116186호에는 관절 윤활을 보존 및 강화하고, 연골 세포를 보존하고, 그들이 생산하는 내인성 루브리신의 건강한 발현을 촉진하기 위해 관절염이 발병할 위험이 있는 무증상 관절에 루브리신을 주사하는 것이 개시되어 있다. 루브리신은 또한 다른 용도들 중에서도 안구건조증의 국소 치료제 및 간질성 방광염 치료제로 제안되어 있다.

인간에 적용하기 위해, 모든 약제학적 물질이 명확한 기준을 충족시켜야 한다. 바람직하게는, 바이오의약품은 순도가 매우 높고, 숙주 세포 단백질 및 핵산(예를 들어, DNA)과 같은 불순물의 농도가 원하는 제품에 비해 백만분율(parts per million) 범위 이하로 감소된다. 규정 사양을 충족하기 위해서는, 하나 이상의 정제 단계가 제조 공정을 따라야 한다. 무엇보다도, 순도, 처리량 및 수율은 적당한 정제 공정을 결정하는 데 중요한 역할을 한다. 상업적 약제 개발에 적합한 규모로 재조합 루브리신을 제조 및 정제하기 위한 이전의 시도들은 성공적이지 못했거나 열등한 결과를 도출했다. 응집 및 단편화를 방지하고 높은 수율을 유지하면서, 그의 윤활 및 기타 기능을 유지하면서, 재조합적으로 발현된 루브리신 생성물 및 이의 다량체 복합체를 오염물질로부터 생산 및 정제하는 것은 어려운 일이다. 루브리신의 정제는 루브리신의 심한 글리코실화, 중앙 뮤신 도메인의 풍부한 음전하 및 고도로 수화된 당 그룹, 극도로 "끈끈한" 말단 도메인, 그의 고분자량, 및 복합체를 형성하고 응집하여, 순도가 증가함에 따라 불용성 미립자를 형성하는 경향으로 인해 특히 어렵다. 재조합 루브리신의 정제 방법은 미국 공개 출원 번호 US20160304572에 기재되어 있다. 그러나, 불순물, 특히, 숙주 세포 단백질 및 DNA의 제거를 최적화하고, 상업적 이용에 적합한 재조합 루브리신의 개선된 정제 방법에 대한 필요성이 여전히 존재한다.

특정 양태에서, 본 발명의 목적은 재조합적으로 발현된 루브리신 당단백질 생성물 및 이의 다량체 복합체를 오염물로부터 분리하는 정제 방법으로서, 그 생물학적 기능을 유지하고 응집을 추가로 방지하고, 고수율의 최종 루브리신 단백질 생성물을 유지하면서, 불순물로부터 루브리신의 효율적인 정제를 가능하게 하는 방법을 제공하는 것이다. 또한 본 발명의 목적은 본원에 기재된 방법들을 사용하여 정제된 재조합 루브리신 및 그 조성물, 예를 들어, 재조합 루브리신의 약제학적으로 허용가능한 조성물을 제공하는 것이다.

제1 양태에서, 본 발명은 재조합적으로 생성된 글리코실화된 폴리펩타이드, 특히 재조합적으로 생성된 글리코실화 루브리신 당단백질을 정제하는 방법으로서, 하기 3개의 크로마토그래피 단계들을 포함하는 방법에 관한 것이다: (a) 다중모드 양이온 교환 크로마토그래피(MCC) 단계; (b) 다중모드 음이온 교환 크로마토그래피(MAC) 단계; 및 (c) 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 단계. 특정 실시형태에서, 본 발명은 재조합적으로 생성된 글리코실화된 폴리펩타이드, 특히 재조합적으로 생성된 글리코실화 루브리신을 정제하는 방법으로서, 하기 3개의 연속 크로마토그래피 단계들을 포함하는 방법에 관한 것이다: (a) 다중모드 양이온 교환 크로마토그래피(MCC)로 이루어진 제1 크로마토그래피 단계; (b) 다중모드 음이온 교환 크로마토그래피(MAC)로 이루어진 제2 크로마토그래피 단계; 및 (c) 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)로 이루어진 제3 크로마토그래피 단계.

제2 양태에서, 본 발명은 재조합적으로 생성된 글리코실화된 폴리펩타이드, 특히 재조합적으로 생성된 글리코실화 루브리신 당단백질을 포함하는 제형에서 오염물(예를 들어, 폴리뉴클레오타이드 및/또는 숙주 세포 단백질 오염)을 감소시키는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은: (i) 3개의 크로마토그래피 단계들을 포함하고: (a) 다중모드 양이온 교환 크로마토그래피(MCC) 단계; (b) 다중모드 음이온 교환 크로마토그래피(MAC) 단계; 및 (c) 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 단계; 및 (ii) 회수된 재조합적으로 생성된 폴리펩타이드를 포함하는 제형을 제조하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 재조합적으로 생성된 글리코실화된 폴리펩타이드, 특히 재조합적으로 생성된 글리코실화 루브리신 당단백질을 포함하는 제형에서 오염물(예를 들어, 폴리뉴클레오타이드 및/또는 숙주 세포 단백질 오염)을 감소시키는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은: (i) 3개의 연속 크로마토그래피 단계들을 포함하고: (a) 다중모드 양이온 교환 크로마토그래피(MCC)로 이루어진 제1 크로마토그래피 단계; (b) 다중모드 음이온 교환 크로마토그래피(MAC)로 이루어진 제2 크로마토그래피 단계; 및 (c) 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)로 이루어진 제3 크로마토그래피 단계; 및 (ii) 회수된 재조합적으로 생성된 폴리펩타이드를 포함하는 제형을 제조하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 재조합적으로 생성된 글리코실화된 폴리펩타이드를 포함하는 제형에서 오염물(예를 들어, 폴리뉴클레오타이드 및/또는 숙주 세포 단백질 오염)을 감소시키는 방법은 하나 이상의 심층 여과 단계들을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 심층 여과 단계는 HIC 전에 수행된다. 일부 실시형태에서, 심층 여과는 HIC 후에 수행된다. 일부 실시형태에서, 심층 여과는 HIC 전 및 HIC 후에 수행된다. 일부 실시형태에서, 심층 여과는 적합한 필터, 예를 들어, 셀룰로오스 또는 폴리프로필렌 섬유-기반 필터, 예를 들어, 양으로 하전된 삼중층 B1HC 필터를 사용하여 수행된다.

특정 실시형태에서, 본 발명은 재조합적으로 생성된 글리코실화된 폴리펩타이드, 특히, 재조합적으로 생성된 글리코실화 루브리신 당단백질을 포함하는 약제학적 조성물의 제조 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은: (i) 3개의 연속 크로마토그래피 단계들을 포함하고: (a) 다중모드 양이온 교환 크로마토그래피(MCC)로 이루어진 제1 크로마토그래피 단계; (b) 다중모드 음이온 교환 크로마토그래피(MAC)로 이루어진 제2 크로마토그래피 단계; 및 (c) 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)로 이루어진 제3 크로마토그래피 단계; 및 (ii) 회수된 재조합적으로 생성된 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물을 제조하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 재조합적으로 생성된 글리코실화된 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물의 제조 방법은 하나 이상의 심층 여과 단계들을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 심층 여과 단계는 HIC 전에 수행된다. 일부 실시형태에서, 심층 여과는 HIC 후에 수행된다. 일부 실시형태에서, 심층 여과는 HIC 전 및 HIC 후에 수행된다. 일부 실시형태에서, 심층 여과는 적합한 필터, 예를 들어, 셀룰로오스 또는 폴리프로필렌 섬유-기반 필터, 예를 들어, 양으로 하전된 삼중층 B1HC 필터를 사용하여 수행된다.

추가 양태에서, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 정제된 재조합적으로 생성된 글리코실화된 폴리펩타이드에 관한 것이다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 정제된 루브리신에 관한 것이다.

일부 실시형태에서, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 생성된 글리코실화된 폴리펩타이드에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 생성된 루브리신에 관한 것이다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 방법에 의해 수득된 재조합 글리코실화된 폴리펩타이드, 예를 들어, 재조합 인간 루브리신에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 본원에 기재된 방법에 의해 수득된, 프로테오글리칸 4 이소형 A(NCBI 참조 서열: NP_005798.3; 서열번호 1)의 아미노산 25-1404, 프로테오글리칸 4 이소형 CRA_a(NCBI 참조 서열: EAW91201.1; 서열번호 2)의 아미노산 25-1404, 또는 서열 KEPAPTT(서열번호 3)의 글리코실화 반복부를 포함하는 재조합 폴리펩타이드의 단편 및 변이체를 포함하는 재조합 글리코실화된 폴리펩타이드에 관한 것이다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 정제된 재조합적으로 생성된 글리코실화된 폴리펩타이드, 예를 들어, 루브리신을 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 프로테오글리칸 4 이소형 A(NCBI 참조 서열: NP_005798.3; 서열번호 1) 또는 이소형 CRA_a(NCBI 참조 서열: EAW91201.1; 서열번호 2)의 아미노산 25-1404를 포함하는 단백질을 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 약제학적 조성물은 재조합적으로 생성된 글리코실화된 폴리펩타이드(루브리신) 및 약제학적 부형제 또는 완충제(예를 들어, 인산나트륨, 염화나트륨, 및 폴리소르베이트(예를 들어 폴리소르베이트 20)를 포함하는 완충제)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 약제학적 조성물은 대상체, 예를 들어, 치료(예를 들어, 안구 표면 장애, 예를 들어, 안구 건조증 치료)를 필요로 하는 대상체에 투여하기에 적합하다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 약제학적 조성물은 국소 투여에 적합하다. 일부 실시형태에서, 치료를 필요로 하는 대상체는 영장류이다. 일부 실시형태에서, 치료를 필요로 하는 대상체는 인간이다.

일부 실시형태에서, 본 발명의 방법에 의해 정제된 재조합적으로 생성된 글리코실화된 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물은 글리코실화된 폴리펩타이드, 오염물, 및/또는 순도의 특정 수준 또는 특정 수준들을 갖는다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법에 의해 정제된 약제학적 조성물의 순도는 역상 크로마토그래피(RPC)에 의해 측정 시, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상, 99.6% 이상, 99.7% 이상, 99.8% 이상, 또는 99.9% 이상이다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법에 의해 정제된 재조합적으로 생성된 글리코실화된 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물은 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의해 측정 시, 재조합적으로 생성된 글리코실화된 폴리펩타이드의 응집체의 약 10% 이하, 약 5% 이하, 약 4% 이하, 약 3% 이하, 약 2% 이하, 또는 약 1% 이하, 바람직하게는 1% 미만을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법에 의해 정제된 재조합적으로 생성된 글리코실화된 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물은 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의해 측정 시, 재조합적으로 생성된 글리코실화된 폴리펩타이드의 단편의 약 10% 이하, 약 5% 이하, 약 4% 이하, 약 3% 이하, 약 2% 이하, 또는 약 1% 이하, 바람직하게는 1% 미만을 포함한다.

일부 실시형태에서, 본 발명의 방법에 의해 정제된 재조합적으로 생성된 글리코실화된 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물은 10 백만분율(ppm) 내지 10,000 ppm, 10 ppm 내지 100 ppm, 약 10 ppm 이하, 또는 약 5 ppm 이하의 농도로 오염물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법에 의해 정제된 재조합적으로 생성된 글리코실화된 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물은 예를 들어, ELISA에 의해 측정 시, ≤ 1,000 ng/mg, ≤ 900 ng/mg, ≤ 800 ng/mg, ≤ 700 ng/mg, ≤ 600 ng/mg, ≤ 500 ng/mg, ≤ 400 ng/mg, ≤ 300 ng/mg, ≤ 250 ng/mg, ≤ 200 ng/mg, ≤ 150 ng/mg, 또는 ≤ 100 ng/mg 숙주 세포 단백질 함량(예를 들어, ≤ 1,000 ng 숙주 세포 단백질/mg 원료의약품)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법에 의해 정제된 재조합적으로 생성된 글리코실화된 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물은 qPCR에 의해 측정 시, ≤ 200,000 pg/mg, ≤ 100,000 pg/mg, ≤ 50,000 pg/mg, ≤ 10,000 pg/mg, ≤ 5,000 pg/mg, ≤ 1,000 pg/mg, ≤ 500 pg/mg, ≤ 100 pg/mg, ≤ 50 pg/mg, ≤ 10 pg/mg, 또는 ≤ 5 pg/mg 잔류 숙주 세포 DNA 함량(예를 들어, ≤ 100,000 pg 잔류 숙주 세포 DNA/mg 원료의약품)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법에 의해 정제된 재조합적으로 생성된 글리코실화된 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물은 박테리아 내독소 테스트(BET)에 의해 측정 시, 8 내독소 단위(EU)/mL 미만, 1 EU/mL 미만, 0.1 EU/mL 미만, 또는 0.01 EU/mL 미만의 박테리아 내독소 함량을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법에 의해 정제된 재조합적으로 생성된 글리코실화된 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물은 1 콜로니 형성 단위(CFU)/mL 미만, 1 CFU/2 ml 미만, 1 CFU/3 ml 미만, 1 CFU/4 ml 미만, 1 CFU/5 ml 미만, 1 CFU/6 ml 미만, 1 CFU/7 ml 미만, 1 CFU/8 ml 미만, 1 CFU/9 ml 미만, 또는 1 CFU/10 ml 미만의 총 호기성 미생물 함량(TAMC)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법에 의해 정제된 재조합적으로 생성된 글리코실화된 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물은 1 CFU/mL 미만, 1 CFU/2 ml 미만, 1 CFU/3 ml 미만, 1 CFU/4 ml 미만, 1 CFU/5 ml 미만, 1 CFU/6 ml 미만, 1 CFU/7 ml 미만, 1 CFU/8 ml 미만, 1 CFU/9 ml 미만, 또는 1 CFU/10 ml 미만의 총 효모 및 곰팡이 함량(TYMC)을 포함한다.

일부 실시형태에서, 본 발명의 방법에 의해 정제된 재조합적으로 생성된 글리코실화된 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물은 약 5℃ 이하에서 약 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30개월 이상, 적어도 20 내지 30개월 동안, 또는 적어도 24개월 동안 안정하다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법에 의해 정제된 재조합적으로 생성된 글리코실화된 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물은 25℃에서 1주, 2주, 3주, 4주, 1개월 이상, 또는 적어도 1주 내지 1개월 동안, 또는 적어도 1개월 동안 안정하다. 일부 실시형태에서, rh루브리신의 안정한 조성물은 약 0.15 mg/ml, 약 0.20 mg/ml, 약 0.25 mg/ml, 약 0.30 mg/ml, 약 0.35 mg/ml, 약 0.40 mg/ml, 약 0.45 mg/ml, 약 0.50 mg/ml, 약 0.55 mg/ml, 약 0.60 mg/ml, 또는 약 0.15 mg/ml 내지 약 0.45 mg/ml의 초기 농도를 갖는다.

본 발명의 일부 실시형태에서, 재조합적으로 생성된 글리코실화된 폴리펩타이드(예를 들어, 본 발명의 방법에 의해 생성되거나 정제된 재조합적으로 생성된 글리코실화된 폴리펩타이드)를 포함하는 약제학적 조성물은 약 0.15 mg/ml, 약 0.20 mg/ml, 약 0.25 mg/ml, 약 0.30 mg/ml, 약 0.35 mg/ml, 약 0.40 mg/ml, 약 0.45 mg/ml, 약 0.50 mg/ml, 약 0.55 mg/ml, 약 0.60 mg/ml, 약 1.0 mg/ml, 약 1.1 mg/ml, 약 1.2 mg/ml, 약 1.3 mg/ml, 약 1.4 mg/ml, 약 1.5 mg/ml, 약 1.6 mg/ml, 약 1.7 mg/ml, 약 1.8 mg/ml, 약 1.9 mg/ml, 약 2.0 mg/ml, 약 2.1 mg/ml, 약 2.2 mg/ml, 약 2.3 mg/ml, 약 2.4 mg/ml, 약 2.5 mg/ml, 약 2.6 mg/ml, 약 2.7 mg/ml, 약 2.8 mg/ml, 약 2.9 mg/ml, 약 3.0 mg/ml, 약 4.0 mg/ml, 약 5.0 mg/ml, 약 1.0 mg/ml 내지 3.0 mg/ml, 약 1.6 mg/ml 내지 2.4 mg/ml, 또는 약 0.15 mg/ml 내지 약 0.45 mg/ml의 농도를 갖는다. 본 발명의 일부 실시형태에서, 고도로 글리코실화된 폴리펩타이드(예를 들어, 루브리신)를 생성하거나 정제하는 방법은 고도로 글리코실화된 폴리펩타이드의 농도를 희석시키는 단계를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 최종 크로마토그래피 단계 후에 고도로 글리코실화된 폴리펩타이드의 농도를 희석시키는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 고도로 글리코실화된 폴리펩타이드의 농도를 약 1.0 mg/ml, 약 1.1 mg/ml, 약 1.2 mg/ml, 약 1.3 mg/ml, 약 1.4 mg/ml, 약 1.5 mg/ml, 약 1.6 mg/ml, 약 1.7 mg/ml, 약 1.8 mg/ml, 약 1.9 mg/ml, 약 2.0 mg/ml, 약 2.1 mg/ml, 약 2.2 mg/ml, 약 2.3 mg/ml, 약 2.4 mg/ml, 약 2.5 mg/ml, 약 2.6 mg/ml, 약 2.7 mg/ml, 약 2.8 mg/ml, 약 2.9 mg/ml, 약 3.0 mg/ml, 약 4.0 mg/ml, 약 5.0 mg/ml, 약 1.0 mg/ml 내지 3.0 mg/ml, 또는 약 1.6 mg/ml 내지 2.4 mg/ml의 농도로부터, 약 0.15 mg/ml, 약 0.20 mg/ml, 약 0.25 mg/ml, 약 0.30 mg/ml, 약 0.35 mg/ml, 약 0.40 mg/ml, 약 0.45 mg/ml, 약 0.50 mg/ml, 약 0.55 mg/ml, 약 0.60 mg/ml, 또는 약 0.15 mg/ml 내지 약 0.45 mg/ml의 농도까지 희석시키는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 고도로 글리코실화된 폴리펩타이드의 농도를 적합한 완충제(예를 들어, 인산나트륨, 염화나트륨, 및 폴리소르베이트(예를 들어 폴리소르베이트 20)를 포함하는 완충제)에서 희석하는 단계를 포함한다.

일부 실시형태에서, 본 발명의 방법에 의해 정제된 재조합적으로 생성된 글리코실화된 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물은 인산나트륨, 염화나트륨, 및/또는 폴리소르베이트(예를 들어 폴리소르베이트 20)를 포함하는 최종 완충제 용액에서 제형화된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 rh루브리신 조성물은 10 mM 인산나트륨, 140 mM 염화나트륨, 및 0.02% (w/v) 폴리소르베이트 20을 포함하는 최종 완충제 용액에서 제형화된다. 일부 실시형태에서, 최종 완충제 용액은 약 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 또는 7.2, 약 6.8 내지 약 7.2, 약 6.9 내지 약 7.1, 또는 약 6.9 내지 약 7.0의 pH를 갖는다.

본 개시내용의 비제한적 실시형태는 하기 실시형태 목록에서 설명된다:

1. 재조합 당단백질(예를 들어, 재조합 루브리신)을 정제하는 방법으로서, 상기 당단백질을 함유하는 세포 배양 수확물을: 임의의 순서로 수행되는, 다중모드 양이온 교환 크로마토그래피(MCC), 다중모드 음이온 교환 크로마토그래피(MAC), 및 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)에 적용시키는 단계들을 포함하는, 방법.

2. 실시형태 1에 있어서, 상기 단계들이 하기 순서로 수행되는, 방법: a) MCC, b) MAC, 및 c) HIC.

3. 실시형태 2에 있어서, 단계 a) 전에 세포 배양 수확물이 MgCl₂및 엔도뉴클레아제와 접촉되는, 방법.

4. 실시형태 3에 있어서, 상기 엔도뉴클레아제는 Benzonase® 엔도뉴클레아제인, 방법.

5. 실시형태 3 또는 4에 있어서, 상기 세포 배양 수확물은 MgCl₂및 엔도뉴클레아제와 접촉되기 전에 2~8℃까지 냉각되는, 방법.

6. 실시형태 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 다중모드 음이온 교환 크로마토그래피(MAC) 단계 후 및 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 단계 전에 바이러스 불활성화 단계를 추가로 포함하는, 방법.

7. 실시형태 6에 있어서, 상기 바이러스 불활성화 단계는 단계 b)에서 수득된 용액의 pH를 약 3.5로 조정하는 단계를 포함하는, 방법.

8. 실시형태 7에 있어서, 상기 용액을 적어도 1시간 동안 인큐베이션한 후, 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 단계 전에 pH가 약 7.0으로 조정되는, 방법.

9. 실시형태 1 내지 8 중 어느 하나에 있어서, 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 단계 후 바이러스 제거 단계를 포함하는, 방법.

10. 실시형태 9에 있어서, 바이러스 제거 단계 후 한외여과 단계를 추가로 포함하는, 방법.

11. 실시형태 9에 있어서, 바이러스 제거 단계 후 바이러스 불활성화 단계를 포함하는, 방법.

12. 실시형태 11에 있어서, 상기 바이러스 불활성화 단계는 디메틸우레아 용액을 첨가하는 단계를 포함하는, 방법.

13. 실시형태 11 또는 12에 있어서, 바이러스 불활성화 단계 후 한외여과 단계를 포함하는, 방법.

14. 실시형태 1 또는 2에 있어서, 하나 이상의 한외여과 및/또는 나노여과 단계들을 추가로 포함하는, 방법.

15. 실시형태 1 또는 2에 있어서, 하나 이상의 바이러스 불활성화 단계들을 추가로 포함하는, 방법.

16. 실시형태 1 또는 2에 있어서, 하나 이상의 바이러스 제거 단계들을 추가로 포함하는, 방법.

17. 실시형태 1 내지 16 중 어느 하나에 있어서, 상기 재조합 루브리신 당단백질은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 잔기 25-1404를 포함하는, 방법.

18. 실시형태 1 내지 17 중 어느 하나에 있어서, 재조합 루브리신 당단백질의 적어도 35중량%가 글리코시드 잔기로부터 유래되는, 방법.

19. 실시형태 1 내지 18 중 어느 하나에 있어서, 루브리신 당단백질의 글리코실화의 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%가 코어 1 글리코실화인, 방법.

20. 실시형태 1 내지 19 중 어느 하나에 따른 방법에 의해 수득된 재조합 루브리신 당단백질을 포함하는 조성물 또는 제형.

21. 실시형태 20에 따른 재조합 루브리신 당단백질 및 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.

22. 실시형태 21에 따른 재조합 루브리신 당단백질을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 안구 표면 장애의 치료 방법.

23. a) 재조합 루브리신 당단백질을 생성하는 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포 클론을 생성하는 단계, b) 적합한 조건하에 CHO 숙주 세포를 배양하여, 재조합 루브리신 당단백질을 함유하는 세포 배양물을 얻는 단계, 및 c) 실시형태 1 내지 19 중 어느 하나의 방법에 따라 세포 배양물로부터 상기 재조합 루브리신 당단백질을 정제하는 단계를 포함하는, 재조합 루브리신 당단백질의 생성 방법.

24. a) 루브리신 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 포유동물 숙주 세포를 적합한 조건 하에 배양하는 단계 및 b) 실시형태 1 내지 19 중 어느 하나의 방법에 따라 세포 배양물로부터 상기 재조합 루브리신 당단백질을 정제하는 단계를 포함하는, 재조합 루브리신 당단백질의 생성 방법.

25. 실시형태 24에 있어서, 상기 포유동물 숙주 세포가 차이니즈 햄스터 난소 세포인, 방법.

26. 실시형태 25에 있어서, CHO 세포는 CHO-M 세포인, 방법.

27. 실시형태 20에 있어서, 상기 루브리신은 1% 미만의 고분자량의 이량체 및 관련 물질, 10 ppm 미만의 일반 숙주 세포 단백질(HCP), 0.006 pg/IU 미만의 FSH DNA를 포함하고, 97% 초과의 순도를 갖는, 방법.

본 발명의 특정 바람직한 실시형태는, 특정 바람직한 실시형태에 대한 하기의 보다 상세한 설명 및 청구범위로부터 명백해질 것이다.

도 1은 본 발명의 정제 공정의 흐름도 및 설명을 도시한다.
도 2는 본 발명의 특정 실시형태의 흐름도를 도시한다.
도 3은 본 발명의 특정 실시형태의 흐름도를 도시한다.
도 4는 초기 원료의약품(DS) 배치 및 임상 원료의약품 배치에 대한 SEC 크로마토그램의 오버레이이다. 삽입물은 임상 원료의약품 배치에 대해 관찰된 작은 피크를 표시하는 확대도이다.
도 5는 검출된 응집체에 대한, 초기 원료의약품(DS) 배치 및 임상 원료의약품 배치에 대한 SEC 크로마토그램의 오버레이이다.
도 6은 초기 원료의약품(DS) 배치 및 임상 원료의약품 배치에 대한 RPC 크로마토그램의 오버레이이다.
도 7은 삼중으로 측정된, 초기 원료의약품(DS) 배치 및 임상 원료의약품 배치에 대한 230 nm에서의 SV-AUC 흡광도 프로파일을 도시한다.
도 8은 분자량 마커 용액(MWM 용액)의 비교 크로마토그램이다.
도 9은 분자량 마커 용액(MWM 용액)의 또 다른 비교 크로마토그램이다.
도 10은 해상도 계산을 입증하는 크로마토그램이다.
도 11은 루브리신 피크에 대한 정량 한계(LOQ) 용액 신호 대 잡음 비의 예시적인 크로마토그램이다.
도 12는 루브리신의 예시적인 크로마토그램(전체도)이다.
도 13은 응집체 및 단편에 의한 주요 피크 및 용매 피크를 나타내는 예시적인 크로마토그램이다.
도 14는 테일링 팩터를 계산하는 방법을 예시하는 예시적인 크로마토그램이다.
도 15는 참조 용액의 예시적인 크로마토그램이다.
도 16 15는 참조 용액의 예시적인 크로마토그램이다.
도 17은 40도 및 높은 pH에서 2주 동안 스트레스받은 원료의약품의 예시적인 크로마토그램이다.
도 18은 MWM 용액의 예시적인 크로마토그램 I이다.
도 19는 MWM 용액의 예시적인 크로마토그램 II이다.
도 20은 해상도 계산을 입증하는 크로마토그램이다.
도 21은 용매 피크 및 블랭크가 있는 클로즈업 크로마토그래프(close up chromatograph)이다.
도 22는 통합 절차를 보여주는 크로마토그램이다.
도 23은 주요 이중-피크의 클로즈업 및 설명이다.
도 24는 주요 피크의 클로즈업 크로마토그래프이다.
도 25는 루브리신의 스트레스 원료의약품 배치(40도, 2일)의 예시적인 크로마토그램이다.
도 26은 2개의 원료의약품 배치에서 검출 및 확인된 O-글리칸을 보여주는 표이다.
도 27은 2개의 원료의약품 배치의 N-글리칸의 MALDI TOF 스펙트럼(거울도)의 오버레이이다.
도 28a 및 28b는 참조 용액 크로마토그램의 예이다.
도 29는 초기-용리 피크(EP), 주요 피크(MP), 및 후기-용리 피크(LP)를 나타내는 크로마토그램이다.

달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 개시내용이 속하는 분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다.

다음의 정의 및 설명은, 다음의 실시예에서 명확하게 그리고 분명하게 변형되지 않는 한, 또는 의미의 적용이 임의의 구성을 무의미하게 또는 본질적으로 무의미하게 만들지 않는 한, 임의의 장래의 구성에서 우선시되도록 의미되고 의도된다. 용어의 구성을 무의미하게 또는 본질적으로 무의미하게 만들 경우에, 정의는 문헌[Webster's Dictionary, 3^rd Edition] 또는 당업자에게 공지되어 있는 사전, 예컨대 문헌[Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology (Ed. Anthony Smith, Oxford University Press, Oxford, 2004)]으로부터 취하여야 한다.

명세서 및 청구범위에서 사용되는 바와 같이, 단수 형태는 문맥상 명확히 달리 나타내지 않는 한 복수의 언급 대상을 포함한다. 예를 들어, 용어 "세포"는 이의 혼합물을 비롯하여 복수의 세포를 포함한다.

범위를 포함한 모든 수치 표기, 예를 들어, pH, 온도, 시간, 농도, 및 분자량은 명시된 값의 20% 또는 어떤 경우에는 10%, 또는 어떤 경우에는 5%, 또는 어떤 경우에는 1%, 또는 어떤 경우에는 0.1%만큼 변하는((+) 또는 (-)) 근사치이며, 그러한 변동은 개시된 방법을 수행하는 데 적합하기 때문이다. 항상 명시적으로 언급되는 것은 아니지만, 모든 수치 표기 앞에 용어 "약"이 선행됨이 이해되어야 한다.

측정가능한 값, 예컨대 양, 기간 등을 지칭할 때, 용어 "약"은, 명시된 값으로부터 (+) 또는 (-) 20%, 또는 어떤 경우에는 (+) 또는 (-) 10%, 또는 어떤 경우에는 (+) 또는 (-) 5%, 또는 어떤 경우에는 (+) 또는 (-) 1%, 또는 어떤 경우에는 (+) 또는 (-) 0.1%의 편차를 포괄하는 의미이며, 이러한 편차는 개시된 방법의 수행에 적절하다.

또한 항상 명시적으로 언급되는 것은 아니지만, 본원에 기술된 시약은 단순히 예이며 이의 균등물이 당업계에 알려져 있음이 이해되어야 한다.

본원에 사용된 바와 같이 용어 "용리액"은 용리에 의해 얻어진 용액을 지칭한다. 따라서, 세척 완충액으로 세척한 후 크로마토그래피 단계에서 얻은 용액이 용리액이다.

용어 "펩타이드", "폴리펩타이드" 및 "단백질"은 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 암호화된 아미노산 및 암호화되지 않은 아미노산, 화학적 또는 생화학적으로 변형되거나 유도된 아미노산, 및 변형된 펩타이드 백본을 갖는 폴리펩타이드를 포함할 수 있는 임의 길이의 아미노산의 중합체 형태를 지칭한다. 용어는 또한 폴리펩타이드의 동시-번역(예를 들어, 신호 펩타이드 절단) 및 번역후 변형, 예컨대, 예를 들어, 이황화-결합 형성, 글리코실화, 아세틸화, 인산화, 단백질분해 절단 등을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다. 또한, 본원에 사용된 바와 같이, "폴리펩타이드"는 단백질이 원하는 활성을 유지하는 한, 천연 서열에 대한 결실, 부가 및 치환(일반적으로 당업자에게 공지된 바와 같이 자연적으로 보존적임)과 같은 변형을 포함하는 단백질을 지칭한다. 이러한 변형은 부위-지정 돌연변이유발을 통해 의도적일 수 있거나, 또는 단백질을 생성하는 숙주의 돌연변이 또는 PCR 증폭 또는 기타 재조합 DNA 방법으로 인한 오류와 같이 우발적일 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "글리코실화"는 아미노산에 공유 결합된, 즉 연결된, 당류(또는 당)로 정의된다. 구체적으로, 당류는 아미노산의 측쇄에 연결되어 있다. 용어 "글리코실화 펩타이드", "글리코실화된 폴리펩타이드", 및 "글리코실화된 단백질"은 본원에서 상호교환가능하게 사용되며, 글리코실화 형태의 번역후 변형을 갖는 폴리펩타이드를 지칭한다. 글리코실화는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 모든 유형의 글리코실화를 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 방법은 N-글리코실화보다 더 많은 O-글리코실화를 갖는 단백질을 정제하는 데 특히 유용하다. 특정 실시형태에서, O-글리코실화는 주로 코어 1 서브타입 O-글리칸(예를 들어, 코어 2 또는 코어 3 또는 코어 4 O-글리칸보다 코어 1이 많음)이다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 방법에 의해 생성되거나 정제된 단백질의 코어 1 글리코실화는 총 글리코실화의 적어도 약 85%(예를 들어, 적어도 약 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 이상)이다. 일부 실시형태에서, 코어 1 글리코실화는 본 발명의 방법에 의해 생성되거나 정제된 단백질의 O-글리코실화의 약 85%, 약 88%, 약 89%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 85% 초과, 약 88% 초과, 약 89% 초과, 약 90% 초과, 약 91% 초과, 약 92% 초과, 약 93% 초과, 약 94% 초과, 또는 약 95% 초과를 포함한다. O-글리코실화와 관련된 코어 1 및 다른 O-글리칸 서브타입은 예를 들어 문헌[Chapter 8, O-Glycans, Essentials of Glycobiology, 3^rd Ed, 1999, Consortium of Glycobiology Editors, La Jolla, California]에 기재되어 있다. 글리코실화는 본원의 실시예에 기재된 바와 같이 측정될 수 있다.

일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법에 의해 생성되거나 정제된 글리코실화된 단백질의 O-글리코실화는 시알산-기반 및 단당류-기반 O-글리칸 종을 포함한다. 예를 들어, 본원에 기재된 방법에 의해 정제된 글리코실화된 단백질의 O-글리코실화는 하기 코어 1 글리칸 종을 포함할 수 있다: 갈락토스-β-1,3-N-아세틸갈락토사민(Galβ1-3GalNAc, 갈락토스-N-아세틸화 갈락토스, Gal-GalNAc, 또는 코어 1로도 알려져 있음), 모노시알화 Gal-GalNAc(N-아세틸뉴라민산 α 2,3-갈락토스 베타 1,3-N-아세틸갈락토사민, Neu5Acα2-3Galβ1-3GalNAc, 또는 2,3-NeuAc 코어 1로도 알려져 있음), 디시알화 Gal-GalNAc(N-아세틸뉴라민산 α 2,3-갈락토스 β 1,3-(N-아세틸뉴라민산 알파 2,6-)N-아세틸갈락토사민, Neu5Acα2-3(Neu5Acα2-6)Galβ1-3GalNAc, 또는 2*NeuAc 코어 1로도 알려져 있음), 및 N-글리콜리뉴라민산(N-글리콜일뉴라민산 α 2,3-갈락토스 β 1,3-N-아세틸갈락토사민, Neu5Gcα2-3Galβ1-3GalNAc, 2,3-NeuGc 코어 1, 또는 NGNA).

예를 들어, 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법에 의해 생성되거나 정제된 글리코실화된 단백질의 O-글리칸 조성물은 약 5% 내지 약 10%, 약 6% 내지 약 10%, 약 7% 내지 약 10%, 약 7% 내지 약 12%, 또는 약 7% 내지 약 9% Gal-GalNAc를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법에 의해 생성되거나 정제된 글리코실화된 단백질의 O-글리칸 조성물은 약 70% 내지 약 80%, 약 70% 내지 약 90%, 약 75% 내지 약 95%, 약 75% 내지 약 90%, 약 75% 내지 약 85%, 또는 약 75% 내지 약 80% 2,3-NeuAc 코어 1을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법에 의해 생성되거나 정제된 글리코실화된 단백질의 O-글리칸 조성물은 약 1%, 약 2%, 약 3%, 약 4%, 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 1% 내지 약 6%, 약 2% 내지 약 5%, 약 3% 내지 약 6%, 약 3% 내지 약 5%, 또는 약 2% 내지 약 4% 2*NeuAc 코어 1을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법에 의해 생성되거나 정제된 글리코실화된 단백질의 O-글리칸 조성물은 약 1%, 약 2%, 약 3%, 약 4%, 약 5%, 약 1% 내지 약 5%, 약 2% 내지 약 5%, 약 3% 내지 약 5%, 약 1% 내지 약 2%, 또는 약 1% 내지 약 3% NGNA를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법에 의해 생성되거나 정제된 글리코실화된 단백질의 O-글리칸 조성물은 약 5% 내지 약 10% Gal-GalNAc, 약 75% 내지 약 85% 2,3-NeuAc 코어 1, 약 1% 내지 약 5% 2*NeuAc 코어 1, 및 약 1% 내지 약 2% NGNA를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법에 의해 생성되거나 정제된 글리코실화된 단백질의 O-글리칸 조성물은 약 7% Gal-GalNAc, 약 80% 2,3-NeuAc 코어 1, 약 3% 2*NeuAc 코어 1, 및 약 1% NGNA를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법에 의해 생성되거나 정제된 글리코실화된 단백질의 O-글리칸 조성물은 약 7% 이상의 Gal-GalNAc, 약 80% 이상의 2,3-NeuAc 코어 1, 약 3% 이상의 2*NeuAc 코어 1, 및 약 1% 이상의 NGNA를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법에 의해 생성되거나 정제된 글리코실화된 단백질의 O-글리칸 조성물은 적어도 7% Gal-GalNAc, 적어도 80% 2,3-NeuAc 코어 1, 적어도 3% 2*NeuAc 코어 1, 및 적어도 1% NGNA를 포함한다.

일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법에 의해 생성되거나 정제된 글리코실화된 단백질의 O-글리칸 조성물은 약 9% Gal-GalNAc, 약 76% 2,3-NeuAc 코어 1, 약 3% 2*NeuAc 코어 1, 및 약 1% NGNA를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법에 의해 생성되거나 정제된 글리코실화된 단백질의 O-글리칸 조성물은 약 9% 이상의 Gal-GalNAc, 약 76% 이상의 2,3-NeuAc 코어 1, 약 3% 이상의 2*NeuAc 코어 1, 및 약 1% 이상의 NGNA를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법에 의해 생성되거나 정제된 글리코실화된 단백질의 O-글리칸 조성물은 적어도 9% Gal-GalNAc, 적어도 76% 2,3-NeuAc 코어 1, 적어도 3% 2*NeuAc 코어 1, 및 적어도 1% NGNA를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법에 의해 생성되거나 정제된 글리코실화된 단백질의 O-글리칸 조성물은 적어도 7% Gal-GalNAc, 적어도 76% 2,3-NeuAc 코어 1, 적어도 3% 2*NeuAc 코어 1, 및 적어도 1% NGNA를 포함한다.

일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법에 의해 생성되거나 정제된 글리코실화된 단백질의 O-글리칸 조성물은 약 9% Gal-GalNAc, 약 76% 2,3-NeuAc 코어 1, 약 3% 2*NeuAc 코어 1, 약 1% NGNA, 및 약 11%의 NANA 관련 글리칸(예를 들어, 모노시알화(NANA) Gal-GalNAc의 산화된 형태)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법에 의해 생성되거나 정제된 글리코실화된 단백질의 O-글리칸 조성물은 약 7% Gal-GalNAc, 약 80% 2,3-NeuAc 코어 1, 약 3% 2*NeuAc 코어 1, 약 1% NGNA, 및 약 8%의 NANA 관련 글리칸(예를 들어, 모노시알화(NANA) Gal-GalNAc의 산화된 형태)을 포함한다.

일부 실시형태에서, 각 O-글리칸(예를 들어, Gal-GalNAc, 2,3-NeuAc 코어 1, 2*NeuAc 코어 1, 또는 NGNA)의 백분율은 하기 O-글리칸의 합계의 백분율로 계산된다: Gal-GalNAc, 2,3-NeuAc 코어 1, 2*NeuAc 코어 1, 및 NGNA. 일부 실시형태에서, 각 O-글리칸의 백분율은 하기의 합계의 백분율로 계산된다: Gal-GalNAc, 2,3-NeuAc 코어 1, 2*NeuAc 코어 1, NGNA, 및 NANA-관련 글리칸(예를 들어, 2,3-NeuAc 코어 1의 산화된 형태).

일부 실시형태에서, 본 발명의 방법에 의해 생성되거나 정제된 고도로 글리코실화된 단백질은 글리코실화 종의 함량을 특징으로 한다. 글리코실화 종 함량은 USP-NF <1065>, "Ion Chromatography"의 일반적인 방법을 기반으로 하는, 이온 크로마토그래피(분리 메커니즘: 음이온 교환)/펄스 전류측정 검출과 같은 임의의 적합한 방법을 사용하여 측정될 수 있다. 분석 방법은 이온 크로마토그래피(IC)에 의한 산성 방출 후 정제된 글리코실화된 단백질의 N-아세틸뉴라민산(NANA) 및 N-글리콜일뉴라민산 (NGNA)을 포함하는, 시알산 글리칸 종의 정량화에 사용될 수 있다. 또한, 분석 방법은 IC에 의한 산성 방출 후 단당류-함유 글리칸 종, 예를 들어, 단당류 D-(+)-갈락토스(Gal) 및 N-아세틸-D-갈락토사민(GalNAc)의 정량화에 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법에 의해 생성되거나 정제된 글리코실화된 단백질의 시알산 글리칸 함량은 글리코실화된 단백질의 mg 당 약 50 μg 이상 NANA 및 글리코실화된 단백질의 mg 당 약 10 μg 이하 NGNA를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법에 의해 생성되거나 정제된 글리코실화된 단백질의 단당류 글리칸 함량은 글리코실화된 단백질의 mg 당 약 100 μg 이상 Gal 및 글리코실화된 단백질의 mg 당 약 100 μg 이상 GalNAc를 포함한다.

일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법에 의해 생성되거나 정제된 글리코실화된 단백질은 하나 이상의 N-글리코실화 종, 예를 들어, 하나 이상의 만노실화된 글리칸, 예를 들어, 만노스-5 글리칸(Man-5 N-연결된 올리고당 및 올리고만노스 5 글리칸; "Man-5"로도 알려져 있음), 만노스-6 글리칸(Man-6 N-연결된 올리고당 및 올리고만노스 6 글리칸; "Man-6"으로도 알려져 있음), 및 만노스-7 글리칸(Man-7 N-연결된 올리고당 및 올리고만노스 7 글리칸; "Man-7"로도 알려져 있음)을 포함한다. N-글리칸 종은 단백질의 아스파라긴(Asn) 잔기의 아미드 질소에 결합된다. 서열번호 1 또는 2의 재조합 루브리신 단백질(예를 들어, 본원에 기재된 방법을 사용하여 생성되거나 정제된 서열번호 1 또는 2의 재조합 루브리신 단백질) 또는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 잔기 25-1404를 포함하는 재조합 루브리신 단백질이 본원에 기재되어 있으며, 여기서 서열번호 1 또는 2의 아스파라긴 1135는 N-글리코실화된다. 또한, 서열번호 1 또는 2의 재조합 루브리신 단백질(예를 들어, 본원에 기재된 방법을 사용하여 생성되거나 정제된 재조합 루브리신 단백질)을 포함하거나, 또는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 잔기 25-1404를 포함하는 조성물이 본원에 기재되어 있으며, 여기서 서열번호 1 또는 2의 아스파라긴 1135는 N-글리코실화된다. 또한, 서열번호 1 또는 2의 재조합 루브리신 단백질 또는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 잔기 25-1404를 포함하는 재조합 루브리신 단백질을 정제하는 방법이 본원에 기재되어 있으며, 여기서 서열번호 1 또는 2의 아스파라긴 1135는 N-글리코실화된다. 또한, 서열번호 1 또는 2의 재조합 루브리신(예를 들어, 본원에 기재된 방법을 사용하여 정제된 서열번호 1 또는 2의 재조합 루브리신) 또는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 잔기 25-1404를 포함하는 재조합 루브리신 단백질을 포함하는 조성물을 제형화하는 방법이 본원에 기재되어 있으며, 여기서 재조합 루브리신은 N-글리코실화된다.

본원에 기재된 일부 실시형태에서, 서열번호 1 또는 2의 재조합 루브리신의 아스파라긴 1135의 N-글리코실화는 Man-5, Man-6, 또는 Man-7이다. 따라서, 일부 실시형태에서, 서열번호 1 또는 2의 재조합 루브리신 단백질(예를 들어, 본원에 기재된 방법을 사용하여 생성되거나 정제된 재조합 루브리신 단백질) 또는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 잔기 25-1404를 포함하는 재조합 루브리신 단백질은 서열번호 1 또는 2의 재조합 루브리신의 N-글리코실화 아스파라긴 1135를 포함하며, N-글리코실화는 Man-5, Man-6, 또는 Man-7이다. 일부 실시형태에서, 재조합 루브리신(예를 들어, 본원에 기재된 방법을 사용하여 생성되거나 정제된 재조합 루브리신)을 포함하는 조성물이 본원에 기재되어 있으며, 여기서 서열번호 1 또는 2의 재조합 루브리신의 아스파라긴 1135의 N-글리코실화는 Man-5, Man-6, 또는 Man-7이다. 일부 실시형태에서, 서열번호 1 또는 2의 재조합 루브리신(예를 들어, 본원에 기재된 방법을 사용하여 생성되거나 정제된 서열번호 1 또는 2의 재조합 루브리신) 또는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 잔기 25-1404를 포함하는 재조합 루브리신 단백질을 포함하는 조성물은 서열번호 1 또는 2의 재조합 루브리신의 아스파라긴 1135의 N-글리코실화를 포함하며, 여기서 N-글리코실화는 Man-5, Man-6, Man-7, 또는 그의 혼합물(예를 들어: Man-5, Man-6, 및 Man-7; Man-5 및 Man-6; Man-5 및 Man-7; Man-6 및 Man-7; Man-5; Man-6; 또는 Man-7)이다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 조성물은 복수의 재조합 루브리신 폴리펩타이드를 포함하고, 여기서 재조합 루브리신 단백질의 일부는 N-글리코실화된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 조성물은 동일한 폴리펩타이드 서열을 공유하지만, 차등적으로 N-글리코실화(예를 들어, 폴리펩타이드의 일부는 서열번호 1 또는 2의 재조합 루브리신의 N-글리코실화 아스파라긴 1135를 포함하고, 아스파라긴 1135의 N-글리코실화는 Man-5, Man-6, Man-7, 또는 그의 혼합물(예를 들어: Man-5, Man-6, 및 Man-7; Man-5 및 Man-6; Man-5 및 Man-7; Man-6 및 Man-7; Man-5; Man-6; 또는 Man-7)임)인, 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 잔기 25-1404를 포함하는 복수의 재조합 루브리신 폴리펩타이드를 포함한다.

일부 실시형태에서, 본 발명의 방법에 의해 정제된 "글리코실화" 폴리펩타이드는 과다하게 글리코실화된다. 본원에 사용된 바와 같이, 예를 들어 침강 평형(SE-AUC) 및 침강 속도(SV-AUC) 모드를 사용하여 분석용 초원심분리(AUC)에 의해 측정 시, "과다하게 글리코실화된" 폴리펩타이드는 적어도 25중량% 글리코실화(예를 들어, 적어도 25중량%, 26중량%, 27중량%, 28중량%, 29중량%, 30중량%, 31중량%, 32중량%, 33중량%, 34중량%, 또는 35중량% 이상)를 포함한다. 예를 들어, 미국 특허 출원 번호 US20160304572에 기재된 바와 같이 포유동물 숙주 세포(예를 들어, 차이니즈 햄스터 난소 세포)에서 생성된 재조합 루브리신은 과다하게 글리코실화된 폴리펩타이드이다. 뮤신 및 뮤신-유사 단백질도 또한 고도로 글리코실화된 단백질로 간주된다(문헌[Debauilleul et al., 1998, J. Biol. Chem. 273:881-890]; 문헌[Gendler et al., 1995, Annu. Rev. Physiol. 57:607-634]; 문헌[van Klinken et al.,. 1998, Glycobiology 8:67-75]). 특정 실시형태에서, 본원에 제공된 방법들은 뮤신 단백질 및 뮤신-유사 단백질 예컨대 루브리신을 포함하여, 적어도 25중량%, 26중량%, 27중량%, 28중량%, 29중량%, 30중량%, 35중량%, 40중량%, 45중량%, 50중량% 이상의 글리코실화(예를 들어, 단백질 분자량의 적어도 30%는 글리코시드 잔기로부터 유래됨)를 갖는 글리코실화된 단백질을 정제하는 데 유용하다.

본원에 사용된 바와 같이, 핵산 분자를 설명하기 위한, 용어 "재조합"은 게놈, cDNA, 바이러스, 반합성, 및/또는 합성 기원의 폴리뉴클레오타이드를 의미하며, 이는 그의 기원 또는 조작으로 인해, 자연적으로 결합된 폴리뉴클레오타이드 서열들 모두 또는 일부와 연관되지 않는다. 용어 "재조합 폴리펩타이드" 또는 "재조합적으로 생성된 폴리펩타이드"는 재조합 폴리뉴클레오타이드로부터의 발현에 의해 생성된 폴리펩타이드를 지칭한다. 숙주 세포 또는 바이러스와 관련하여 사용되는, 용어 "재조합"은 재조합 폴리뉴클레오타이드가 도입된 숙주 세포 또는 바이러스를 지칭한다. 재조합은 물질(예를 들어, 세포, 핵산, 단백질, 또는 벡터)과 관련하여, 이종 물질(예를 들어, 세포, 핵산, 단백질, 또는 벡터)의 도입에 의해 물질이 변형된 것을 지칭하기 위해 본원에서 사용된다.

용어 "폴리뉴클레오타이드", "올리고뉴클레오타이드", "핵산" 및 "핵산 분자"는 리보뉴클레오타이드 또는 데옥시리보뉴클레오타이드 중 하나인 뉴클레오타이드의 중합체 형태를 포함하기 위해, 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 이 용어는 분자의 기본 구조만을 지칭한다. 따라서, 용어에는 삼중-, 이중- 및 단일-가닥 DNA, 뿐만 아니라 삼중-, 이중- 및 단일-가닥 RNA가 포함된다. 용어에는 또한 메틸화 및/또는 캡핑과 같은 변형을 갖는 상기 분자들, 및 변형되지 않은 형태의 폴리뉴클레오타이드가 포함된다. 보다 구체적으로, 용어들 "폴리뉴클레오타이드", "올리고뉴클레오타이드", "핵산" 및 "핵산 분자"는 폴리데옥시리보뉴클레오타이드(2-데옥시-D-리보스 함유), 폴리리보뉴클레오타이드(D-리보스 함유), 퓨린 또는 피리미딘 염기의 N- 또는 C-글리코사이드인, 폴리뉴클레오타이드의 임의의 다른 형태, 및, 비-뉴클레오티드성 백본을 함유하는 기타 중합체, DNA 및 RNA에서 발견되는 바와 같이 단, 중합체가 염기 페어링 및 염기 스태킹을 허용하는 배열로 핵염기를 함유하는 경우, 중합체 및 기타 합성 서열-특이적 핵산 중합체를 포함한다.

본원에 사용된 바와 같이, 핵산 서열, 단백질 또는 폴리펩타이드와 관련하여 사용된 용어 "이종"은 이들 분자들이 이종 핵산 서열, 단백질 또는 폴리펩타이드가 유래된 세포에서 자연적으로 발생하지 않는다는 것을 의미한다. 예를 들어, 인간 세포가 아닌 세포에 삽입되는 인간 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 그 특정 맥락에서 이종 핵산 서열이다. 이종성 핵산이 상이한 유기체 또는 동물 종으로부터 유래될 수 있는 반면, 이러한 핵산은 이종성이기 위해 별도의 유기체 종으로부터 유래될 필요는 없다. 예를 들어, 어떤 경우에는, 세포가 이전에 합성 핵산을 함유하지 않았다는 점에서 합성 핵산 서열 또는 이로부터 암호화된 폴리펩타이드는 그것이 도입된 세포에 이종성일 수 있다. 이와 같이, 합성 핵산 서열 또는 이로부터 암호화된 폴리펩타이드는 예를 들어, 합성 핵산 서열 또는 이로부터 암호화된 폴리펩타이드의 하나 이상의 성분이 원래 인간 세포로부터 유래된 경우에도 인간 세포에 대해 이종성인 것으로 간주될 수 있다.

용어 "상동성" 또는 "동일성"은 2개의 중합체 분자 사이, 예를 들어 2개의 핵산 분자, 예컨대 2개의 DNA 분자 또는 2개의 RNA 분자 사이, 또는 2개의 폴리펩타이드 분자 사이의 서브유닛 서열 동일성을 지칭한다. 두 분자 모두에서 서브유닛 위치가 동일한 단량체 서브유닛에 의해 점유될 때, 예를 들어 2개의 DNA 분자 각각에서 하나의 위치가 아데닌에 의해 점유되는 경우, 이들은 그 위치에서 상동성이거나 동일하다. 두 서열 사이의 상동성은 매칭되거나 상동성인 위치의 수의 직접적인 함수이다; 예를 들어, 두 서열에서의 위치의 절반(예를 들어, 길이가 10개 서브유닛인 중합체에서 5개의 위치)이 상동성일 경우, 두 서열은 50% 상동성이고; 위치의 90%(예를 들어, 10개 중 9개)가 매칭되거나 상동성일 경우, 두 서열은 90% 상동성이다.

본원에 사용된 바와 같이, "숙주 세포"는 생체내 또는 시험관내 진핵 세포 또는 단세포 개체로서 배양된 다세포 유기체(예를 들어, 세포주)로부터의 세포를 나타내며, 진핵 세포는 핵산(예를 들어, 본 개시내용의 재조합 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 벡터)에 대한 수용체로서 사용될 수 있거나 사용되어 왔으며, 핵산에 의해 유전적으로 변형된 원래 세포의 자손을 포함한다. 단일 세포의 자손은 자연적, 우발적, 또는 의도적 돌연변이로 인해 형태나 게놈 또는 전체 DNA 보체가 원래 모세포와 반드시 완전히 동일하지 않을 수 있음을 이해한다. "재조합 숙주 세포"("유전적으로 변형된 숙주 세포"로도 지칭됨)는 이종 핵산, 예를 들어, 발현 벡터가 도입된 숙주 세포이다. 예를 들어, 유전적으로 변형된 진핵 숙주 세포는 적합한 진핵 숙주 세포내로 이종 핵산, 예를 들어, 진핵 숙주 세포에 대해 외래인 외인성 핵산을 도입함으로써 유전적으로 변형되거나, 또는 진핵 숙주 세포에서 정상적으로 발견되지 않는 재조합 핵산은 세포 내로 안정적으로 또는 일시적으로 도입될 수 있다. 일부 실시형태에서, 재조합 루브리신은 포유동물 숙주 세포, 예컨대 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포에서 생성된다. 또 다른 실시형태에서, CHO 세포는 미국 특허 출원 공개 번호 2016/304572에 기재된 바와 같은, CHO-M 세포이며, 이의 개시내용은 본원에 참고로 포함된다(또한 문헌[Girod et al., Nat. Methods 4(9):747-53 (2007)], 및 미국 특허 제7,129,062호 및 제8,252,917호 및 미국 특허 출원 공개 번호 2011/0061117; 2012/0231449; 및 2013/0143264 참조, 이의 개시내용은 본원에 참고로 포함됨).

용어 "정제하는", "단리하는", 등은 원하지 않는 물질, 예를 들어 오염물, 예를 들어, 폴리뉴클레오타이드, 숙주 세포 단백질을 함유하는 용액으로부터 원하는 물질, 예를 들어, 재조합 단백질을 제거하거나, 또는 원하는 물질을 함유하는 용액으로부터 원하지 않는 물질을 제거하여, 본질적으로 원하는 물질만 남게 하는 것을 지칭한다. 어떤 경우에는, 정제된 물질은 다른 오염물, 예를 들어, 폴리뉴클레오타이드, 예를 들어, 숙주 세포 단백질이 본질적으로 없을 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 정제는 다양한 결과의 순도를 의미할 수 있으며, 예를 들어, 여기서 정제된 물질은 용액내 모든 물질의 80% 초과, 85% 초과, 90% 초과, 91% 초과, 92% 초과, 93% 초과, 94% 초과, 95% 초과, 96% 초과, 97% 초과, 98% 초과, 99% 초과, 99.5% 초과, 99.9% 초과, 등을 구성한다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 일반적으로, 용액 자체의 성분, 예를 들어, 물 또는 완충제, 또는 염은 물질의 순도를 결정할 때 고려되지 않는다.

용어 "오염물" 및 "불순물"은 정제된 단백질을 함유한 용액 또는 의약품에 존재하는, 원하지 않는 물질, 예를 들어, 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, DNA 및/또는 RNA) 또는 단백질(예를 들어, 숙주 세포 단백질)을 지칭한다. 오염물에는 예를 들어, 정제되는 단백질을 재조합적으로 발현하는 데 사용되는 세포로부터의 숙주 세포 단백질, 이전 친화성 크로마토그래피 단계 동안 샘플로 침출될 수 있는 친화성 크로마토그래피 단계에서 사용되는 흡수제의 일부인 단백질, 및 표적 단백질 자체의 잘못-접힌 변이체가 포함된다. 특정 실시형태에서, 정제 과정 동안 샘플에 남아 있는 오염물을 "잔여물"(예를 들어, "잔류 DNA")이라고 한다. 표적 단백질의 응집체 및 분해물도 오염물로 간주된다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "분해물"은 분해에 의해 유발된 재조합 표적 단백질의 단편(즉, 펩타이드 단편)을 포함한다. 분해 산물은 당업자에게 잘 알려진 기술을 사용하여 측정될 수 있으며, 임상, 안전성 및 안정성 테스트를 위한 원료의약품 및 의약품 배치뿐만 아니라 상업적 제조 공정을 나타내는 배치에 대한 분석 결과가 제공될 수 있다.

용어 "숙주 세포 단백질"(HCP)은 정제될 표적 단백질을 암호화하는 DNA를 포함하는 숙주 세포에 의해 암호화되는 단백질을 포함한다. 숙주 세포 단백질은 정제될 단백질의 오염물일 수 있으며, 그 수준은 정제에 의해 감소될 수 있다. 숙주 세포 단백질은 겔 전기영동 및 염색 및/또는 ELISA 분석 등과 같은 당업자에게 잘 알려진 분석을 사용하여 검출될 수 있다. 숙주 세포 단백질은 예를 들어, 재조합 표적 단백질의 발현 동안 생성된 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 단백질(CHOP)을 포함한다.

HCP의 대수 제거 능력은 아래 식으로 계산될 수 있다. 로드 및 용리액의 HCP 농도는 다중분석물 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA)에 의해 백만분율(ppm) 단위로 측정될 수 있다.

특정 실시형태에서, 환자 안전을 위해 HCP에 대한 권장 상한선은 최종 약물 제형에서 100 ppm HCP(또는 치료 단백질 mg 당 100 ng 미만 HCP)이다(문헌[Champion, et al. 2005, BioProcess Int, 3:52]; 문헌[Chon & Zarbis-Papastoitsis, 2011, N Biotechnol. 28(5):458-63]; 문헌[Zhu-Shimoni, et al., 2014, Biotechnol Bioeng; 111:2367-79]).

잔류 DNA의 원치 않는 영향을 방지하기 위해, FDA는 1회 투여량당 10 pg의 DNA를 민감도의 달성 가능한 분석 한계로 결정하였다(문헌[Briggs and Panfili, 1991, Anal. Chem., 63:850-859]).

본 출원에서 사용된 바와 같이 용어 "완충된"은 산성 또는 염기성 물질의 첨가 또는 방출로 인한 pH 변화가 완충제 물질에 의해 평준화되는 용액을 의미한다. 이러한 효과를 유발하는 모든 완충제 물질이 사용될 수 있다. 바람직하게는, 예를 들어 인산 또는 그의 염, 아세트산 또는 그의 염, 시트르산 또는 그의 염, 모르폴린 또는 그의 염, 2-(N-모르폴리노) 에탄술폰산 또는 그의 염, 히스티딘 또는 그의 염, 글리신 또는 그의 염, 또는 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄(TRIS) 또는 그의 염과 같은 약제학적으로 허용가능한 완충제 물질이 사용된다. 인산 또는 그의 염, 또는 아세트산 또는 그의 염, 또는 시트르산 또는 그의 염, 또는 히스티딘 또는 그의 염이 특히 바람직하다. 선택적으로, 완충 용액은 예를 들어 염화나트륨, 황산나트륨, 염화칼륨, 황산칼륨, 시트르산나트륨 또는 시트르산칼륨과 같은 추가 염을 포함할 수 있다. 선택적으로, 완충 용액은 추가의 성분, 예를 들어, 폴리소르베이트, 예를 들어, 폴리소르베이트 20을 포함할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, 단백질은 표적 단백질의 농도가 출발 용액 또는 혼합물(예를 들어, 세포 배양 수확물)에서보다 생성된 생성물 (예를 들어, 약품)에서 더 높을 때 "회수" 또는 "분리" 또는 "제거"된다. 특정 실시형태에서, 회수된 표적 단백질은 수율로서 표현될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, "수율"은 정제 단계(들) 전의 부피당 부하 함량과 비교하여 용리액의 부피당 잔류 함량의 백분율로 나타낸다. "수율"은 예를 들어, 정제 단계가 수행되기 전에 존재했던 양과 비교하여 정제 단계 후에 존재하는 샘플(예를 들어, 제형 또는 조성물) 내의 표적 단백질(예를 들어, 재조합 루브리신)의 양(예를 들어, 용리액과 비교한 부하의 양)일 수 있다. 부하 및 용리액의 단백질 함량은 예를 들어, 분석적 크기-배제 크로마토그래피(SEC)에 의해 측정된다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "약제학적으로 허용가능한 담체" 또는 "약제학적으로 허용가능한 부형제"는 약제학적 투여에 적합한 용매 및 기타 물질을 지칭한다. 이러한 제제의 사용은 당업계에 잘 알려져 있다. 본원에 기재된 조성물은 또한 보충적, 추가적 또는 강화된 치료 기능을 제공하는 다른 활성 화합물을 함유할 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이 용어 "약제학적 조성물"은 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 부형제와 함께 제형화된 본원에 개시된 바와 같은 적어도 하나의 활성 성분(예를 들어, 재조합 인간 루브리신)을 포함하는 조성물을 지칭한다.

단백질 정제 공정

본 발명의 목적은 오염물로부터의 재조합적으로 발현된 글리코실화된 폴리펩타이드, 예를 들어, 루브리신 및 이의 다량체 복합체의 정제 방법을 제공하는 것이며, 여기서 정제 방법은 기능을 유지하고 응집을 피하고 최종 생성물의 높은 수율을 유지하면서, 불순물로부터의, 상기 글리코실화된 폴리펩타이드, 예를 들어, 루브리신의 효율적인 정제를 가능하게 한다. 본 발명자들은 이제 상업적 제약 이용에 적합한 규모로 재조합적으로 발현된 글리코실화된 폴리펩타이드, 예를 들어, 루브리신의 정제에 특히 적합한 정제 방법을 발견하였다.

제1 양태에서, 본 발명은 재조합적으로 생성된 글리코실화된 폴리펩타이드, 특히 재조합적으로 생성된 글리코실화 루브리신 단백질을 정제하는 방법으로서, 하기 3개의 크로마토그래피 단계들을 포함하는 방법에 관한 것이다: (a) 다중모드 양이온 교환 크로마토그래피(MCC) 단계; (b) 다중모드 음이온 교환 크로마토그래피(MAC) 단계; 및 (c) 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 단계.

일부 실시형태에서, 3개의 크로마토그래피 단계들은 임의의 순서로 수행될 수 있다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 재조합적으로 생성된 글리코실화된 폴리펩타이드, 특히 재조합적으로 생성된 글리코실화 루브리신 단백질을 정제하는 방법으로서, 하기 3개의 연속 크로마토그래피 단계들을 포함하는 방법에 관한 것이다: (a) 다중모드 양이온 교환 크로마토그래피(MCC)로 이루어진 제1 크로마토그래피 단계; (b) 다중모드 음이온 교환 크로마토그래피(MAC)로 이루어진 제2 크로마토그래피 단계; 및 (c) 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)로 이루어진 제3 크로마토그래피 단계.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "연속적인 크로마토그래피 단계들"은 제시된 순서대로 수행되는 단계를 지칭하지만, 제1 인용된 단계 전, 인용된 단계들 사이, 및/또는 마지막 인용된 단계 후에 다른 단계들을 포함할 수 있다.

제2 양태에서, 본 발명은 재조합적으로 생성된 글리코실화된 폴리펩타이드, 특히 재조합적으로 생성된 글리코실화 루브리신을 포함하는 제형에서 폴리뉴클레오타이드 및/또는 숙주 세포 단백질 오염을 감소시키는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은:

(i) 3개의 크로마토그래피 단계들을 포함하고: (a) 다중모드 양이온 교환 크로마토그래피(MCC) 단계; (b) 다중모드 음이온 교환 크로마토그래피(MAC) 단계; 및 (c) 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 단계; 및

(ii) 회수된 재조합적으로 생성된 폴리펩타이드를 포함하는 제형을 제조하는 단계를 추가로 포함한다.

일부 실시형태에서, 본원에 기재된 재조합적으로 생성된 글리코실화된 폴리펩타이드를 포함하는 제형에서 폴리뉴클레오타이드 및/또는 숙주 세포 단백질 오염을 감소시키는 방법은 심층 여과 단계들을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 심층 여과 단계는 HIC 단계 전에 수행된다. 일부 실시형태에서, 심층 여과는 적합한 필터, 예를 들어, 셀룰로오스 또는 폴리프로필렌 섬유-기반 필터, 예를 들어, 양으로 하전된 삼중층 B1HC 필터를 사용하여 수행된다.

일부 실시형태에서, 3개의 크로마토그래피 단계들은 임의의 순서로 수행될 수 있다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 재조합적으로 생성된 글리코실화된 폴리펩타이드, 특히 재조합적으로 생성된 글리코실화 루브리신을 포함하는 제형에서 폴리뉴클레오타이드 및/또는 숙주 세포 단백질 오염을 감소시키는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은:

(i) 3개의 연속 크로마토그래피 단계들을 포함하고: (a) 다중모드 양이온 교환 크로마토그래피(MCC)로 이루어진 제1 크로마토그래피 단계; (b) 다중모드 음이온 교환 크로마토그래피(MAC)로 이루어진 제2 크로마토그래피 단계; 및 (c) 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)로 이루어진 제3 크로마토그래피 단계; 및

특정 실시형태에서, 본 발명의 방법은 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 바이러스 불활성화(VIN) 처리 단계 및 바이러스 제거 단계들을 추가로 포함한다. 바이러스 불활성화의 다양한 방법은 당업자에게 공지되어 있으며, 저온살균, 최종 건열, 증기 열, 용매/세제, 및 산성 pH를 포함하지만 이에 제한되지 않는 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 침전, 크로마토그래피 및 나노여과를 포함하지만 이에 제한되지 않는 바이러스 제거 절차는 또한 잘 알려져 있다. 바이러스 불활성화 및 제거는 공정 중(예를 들어, 나노여과 및 용매/세제 처리, 저온살균, 증기-처리, 및/또는 pH 4에서의 인큐베이션) 또는 최종 용기에서의 최종 처리(예를 들어, 최종 저온살균 또는 최종 건열 처리)에서 수행될 수 있다. 일부 실시형태에서, VIN 단계는 본 발명의 정제 방법 동안의 용액을 N,N-디메틸우레아(DMU)와 함께 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, VIN 단계는 본 발명의 정제 단계 동안의 용액을 세제, 예를 들어, Triton X-100과 함께 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, VIN 단계는 본 발명의 정제 단계 동안의 용액을 30분, 40분, 50분, 60분, 70분, 80분, 90분, 100분, 110분, 또는 120분 동안 환원된 2% Triton X-100과 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 본원에 기재된 실시형태에서, VIN 단계는 본 발명의 정제 단계 동안의 용액을 60분 내지 70분 동안 환원된 2% Triton X-100과 인큐베이션하는 것을 포함한다.

일부 실시형태에서, 개시된 방법은 산성 pH 용액(예를 들어, 약 pH 3, 약 pH 3.4, 약 pH 3.5, 약 pH 3.6, 약 pH 4, 약 pH 3.4 내지 약 pH 3.6, 또는 약 pH 3 내지 약 pH 4의 용액)에서의 바이러스 불활성화 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 산성 pH 용액에서의 바이러스 불활성화 단계는 rh루브리신 조성물의 pH를 pH 3.4~3.6으로 조정하는 단계, 예를 들어, rh루브리신 조성물의 pH를 0.5 M 인산 용액으로 조정하는 단계를 포함한다. 산성 pH 용액에서의 바이러스 불활성화 단계는 rh루브리신 조성물을 17~25℃에서 60~90분 동안 인큐베이션하는 단계, 및 용액, 예를 들어, 1 M 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄(Tris) 용액으로 rh루브리신 조성물의 pH를 pH 7.0으로 조정하는 단계를 추가로 포함한다. 산성 pH 용액에서의 바이러스 불활성화 단계는 0.2 μm 필터를 통해 rh루브리신 조성물을 여과하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 본원에 기재된 방법의 일부 실시형태에서, 예를 들어, 산성 pH 용액에서의 인큐베이션에 의한 바이러스 불활성화 단계는 다중모드 음이온 교환 크로마토그래피(MAC) 단계 후 및 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 단계 전에 수행된다.

특정 실시형태에서, 본 발명의 방법은 MAC 단계 후의 용액에서 임의의 바이러스를 불활성화시키는 단계를 포함하며, 여기서 MAC 단계로부터 수득된 용액의 pH는 예를 들어, 약 4.0 이하, 예컨대 약 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 또는 4.0로 조정되며, 적어도 약 60분 동안 인큐베이션된 다음, 중성 pH(예를 들어, 약 7.0)으로 조정된다.

또 다른 실시형태에서, 본 발명의 방법은 HIC 단계 후 바이러스 제거 여과(VRF) 및 바이러스 불활성화(VIN) 처리 단계들을 추가로 포함한다. VRF 단계는 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 나노필터를 포함한다. 일부 실시형태에서, VIN 단계는 VRF 단계로부터의 용액을 세제와 함께 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, VIN 단계는 VRF 단계로부터의 용액을 N,N-디메틸우레아(DMU)와 함께 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 특정 실시형태에서, DMU의 농도는 약 1 M, 2 M, 3 M, 4 M, 또는 5 M이다. 바람직한 실시형태에서, DMU의 농도는 3 M이다.

일 양태에서, 본 발명은 3개의 크로마토그래피 단계들을 포함하는 방법에 의해 수득된 재조합 글리코실화된 폴리펩타이드, 예를 들어, 재조합 인간 루브리신에 관한 것이다:

(a) 다중모드 양이온 교환 크로마토그래피(MCC) 단계;

(b) 다중모드 음이온 교환 크로마토그래피(MAC) 단계; 및

(c) 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 단계.

일부 실시형태에서, 상기 방법은 재조합 글리코실화된 폴리펩타이드를 포함하는 제형을 제조하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 심층 여과 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 심층 여과 단계는 HIC 단계 전에 수행된다. 일부 실시형태에서, 심층 여과는 적합한 필터, 예를 들어, 셀룰로오스 또는 폴리프로필렌 섬유-기반 필터, 예를 들어, 양으로 하전된 삼중층 B1HC 필터를 사용하여 수행된다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법에 의해 수득된 재조합 글리코실화된 폴리펩타이드는 프로테오글리칸 4 이소형 A(NCBI 참조 서열: NP_005798.3; 서열번호 1)의 아미노산 25-1404를 포함하는 재조합 인간 루브리신, 프로테오글리칸 4 이소형 CRA_a(NCBI 참조 서열: EAW91201.1; 서열번호 2)의 아미노산 25-1404를 포함하는 재조합 인간 루브리신, 또는 서열 KEPAPTT(서열번호 3)의 글리코실화 반복부를 포함하는 재조합 폴리펩타이드의 단편 및 변이체이다.

본 발명의 방법은 고도로 글리코실화된(예를 들어, 적어도 30중량% 글리코시드 잔기를 포함하는) 재조합적으로 생성된 폴리펩타이드의 정제에 특히 적합하다. 본 발명의 방법은 음전하 담체를 포함하는 재조합적으로 생성된 글리코실화된 폴리펩타이드, 예를 들어 그의 중심 도메인에, 특히 뮤신 도메인에 음전하 담체를 포함하는 재조합적으로 생성된 글리코실화된 폴리펩타이드의 정제에 특히 적합하다. 따라서, 본 발명의 방법은 재조합적으로 생성된 글리코실화 루브리신 단백질의 정제에 특히 적합하다.

전장(절단되지 않은) 인간 루브리신(프로테오글리칸 4, 이소형 A, NCBI 참조 서열: NP_005798.3) 단량체 서열(서열번호 1)은 코어 단백질에서 1404개의 아미노산, 또는 대략 151 kDa를 포함한다. 변이체 루브리신(프로테오글리칸 4, 이소형 CRA_a, NCBI 참조 서열: EAW91201.1) 단량체 서열(서열번호 2)은 또한 1404개의 아미노산을 갖는다. 본원에 사용된 바와 같이, "루브리신" 또는 "루브리신 단백질" 또는 "PRG4"는 루브리신 이소형 A 및 루브리신 이소형 CRA_a를 포함하고, 서열 KEPAPTT(서열번호 3)의 글리코실화 반복부를 포함하고 전장 및 자연 발생 루브리신과 실질적으로 동일한 활성을 갖는 그의 단편 및 변이체를 추가로 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이 "rh루브리신"은 재조합 인간 루브리신을 지칭하며, 재조합적으로 생성된 임의의 인간 루브리신을 포함한다. 본원에 기재된 일부 실시형태에서, "글리코실화 단백질," "글리코실화된 폴리펩타이드," "고도로 글리코실화된 단백질," "고도로 글리코실화된 폴리펩타이드," "과다하게 글리코실화된 단백질," "과다하게 글리코실화된 폴리펩타이드," "과다하게 글리코실화된 재조합 단백질," "과다하게 글리코실화된 재조합 폴리펩타이드," "재조합적으로 생성된 글리코실화 단백질," "재조합적으로 생성된 글리코실화된 폴리펩타이드," "재조합적으로 생성된 글리코실화 당단백질," 또는 "재조합적으로 생성된, 고도로 글리코실화된 폴리펩타이드,"(본원에 기재된 방법을 사용하여 생성되거나 정제된, "글리코실화 단백질," "글리코실화된 폴리펩타이드," "고도로 글리코실화된 단백질," "고도로 글리코실화된 폴리펩타이드," "과다하게 글리코실화된 단백질," "과다하게 글리코실화된 폴리펩타이드," "과다하게 글리코실화된 재조합 단백질," "과다하게 글리코실화된 재조합 폴리펩타이드," "재조합적으로 생성된 글리코실화 단백질," "재조합적으로 생성된 글리코실화된 폴리펩타이드," "재조합적으로 생성된 글리코실화 당단백질," 또는 "재조합적으로 생성된, 고도로 글리코실화된 폴리펩타이드" 포함)는 서열 KEPAPTT(서열번호 3)의 글리코실화 반복부를 포함하고, 전장 및 자연 발생 루브리신과 실질적으로 동일한 활성을 갖는 그의 단편(예를 들어, 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 잔기 25-1404) 및 변이체를 포함하는, 서열번호 1, 서열번호 2, 또는 그의 혼합물의 루브리신일 수 있다.

일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법을 사용하여 생성되거나 정제된 글리코실화 재조합 인간 루브리신은 약 280 kg/mol, 약 290 kg/mol, 약 291 kg/mol, 약 292 kg/mol, 약 293 kg/mol, 약 294 kg/mol, 약 295 kg/mol, 약 296 kg/mol, 약 300 kg/mol, 약 310 kg/mol, 약 320 kg/mol, 약 330 kg/mol, 약 340 kg/mol, 약 350 kg/mol, 약 360 kg/mol, 약 291 내지 약 295 kg/mol, 약 291 kg/mol 내지 약 296 kg/mol, 약 280 kg/mol 내지 약 360 kg/mol, 약 290 kg/mol 내지 약 340 kg/mol, 약 290 kg/mol 내지 약 350 kg/mol, 약 300 kg/mol 내지 약 345 kg/mol, 또는 약 290 kg/mol 내지 약 330 kg/mol의 분자량을 특징으로 한다. 따라서, 일부 실시형태에서, 약 280 kg/mol, 약 290 kg/mol, 약 291 kg/mol, 약 292 kg/mol, 약 293 kg/mol, 약 294 kg/mol, 약 295 kg/mol, 약 296 kg/mol, 약 300 kg/mol, 약 310 kg/mol, 약 320 kg/mol, 약 330 kg/mol, 약 340 kg/mol, 약 350 kg/mol, 약 360 kg/mol, 약 291 내지 약 295 kg/mol, 약 291 kg/mol 내지 약 296 kg/mol, 약 280 kg/mol 내지 약 360 kg/mol, 약 290 kg/mol 내지 약 340 kg/mol, 약 290 kg/mol 내지 약 350 kg/mol, 약 300 kg/mol 내지 약 345 kg/mol, 또는 약 290 kg/mol 내지 약 330 kg/mol의 분자량을 특징으로 하는 글리코실화 재조합 인간 루브리신을 생성하거나 정제하는 방법이 본원에 기재되어 있다.

루브리신 기능 및 활성은 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법 또는 본원에 기재된 방법, 예를 들어, 세포 부착 분석, 예를 들어, A375 세포 부착 분석을 사용하여 분석될 수 있다. 예를 들어, 루브리신 기능은 A375 인간 흑색종 세포가 세포-조직 배양 미세역가 플레이트의 표면에 부착되는 것을 억제하는 능력을 기반으로 결정될 수 있다. 따라서, 참조 물질과 비교한, 재조합 루브리신 샘플에 의한 용량-의존적 방식의 A375 세포의 부착 억제는 재조합 루브리신 기능 또는 활성을 결정하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법을 사용하여 정제된 재조합 루브리신을 포함하는 조성물은 세포 접착 분석, 예를 들어, A375 세포 접착 분석에 의해 결정 시, 참조 물질(예를 들어, 정제된 재조합 루브리신의 참조 샘플)의 활성에 비해, 50% 내지 150%(예를 들어, 50%, 75%, 100%, 125%, 또는 150%)의 활성을 나타낸다.

본원에 기재된 일부 실시형태에서, 재조합 인간 루브리신 활성(본원에 기재된 방법을 사용하여 수득되거나 정제된 재조합 인간 루브리신을 포함하지만, 이에 제한되지는 않음)은 리포터 세포 분석, 예를 들어, NF-κB 리포터 세포 분석을 사용하여 분석된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 재조합 인간 루브리신 활성은 리포터 세포주, 예를 들어, THP1-Lucia^TM NF-κB 세포(Cat. No. thp1-nfkb, InvivoGen, San Diego, CA)에서 재조합 인간 루브리신에 대한 반응에 있어서 NF-κB 활성의 변형을 분석함으로써 분석된다. 이러한 실시형태에서, NF-κB 활성은 리포터 유전자, 예를 들어, 루시페라제 리포터 유전자 또는 변형된 루시페라제 리포터 유전자의 발현 수준에 기초하여 모니터링될 수 있다. 일부 실시형태에서, 리포터 유전자 발현, 예를 들어, NF-κB-유도된 리포터 유전자 발현의 수준은 Lucia™의 검출을 위해 적합한 검출 시약, 예를 들어, QUANTI-Luc™(Cat. No. rep-qlc1, InvivoGen, San Diego, Ca)을 사용하여 평가될 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서 재조합 루브리신 샘플에 대한 반응에 있어서 NF-κB 활성의 변형이 참조 물질과 비교되어, 재조합 루브리신 기능 또는 활성을 결정한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법을 사용하여 정제된 재조합 루브리신을 포함하는 조성물은 리포터 세포 분석, 예를 들어, NF-κB 리포터 세포 분석에 의해 결정 시, 참조 물질(예를 들어, 정제된 재조합 루브리신의 참조 샘플)의 활성에 비해, 50% 내지 150%(예를 들어, 50%, 75%, 100%, 125%, 또는 150%)의 활성을 나타낸다.

인간 루브리신의 신호 서열은 서열번호 1/서열번호 2의 잔기 1-24이다. 따라서, 인간 루브리신의 성숙 형태는 서열번호 1/서열번호 2의 잔기 25-1404이다.

[표 1]

일부 실시형태에서, 본 발명의 방법은 서열번호 1 또는 2의 서열에 대한 적어도 85% 서열 동일성, 특히 서열번호 1 또는 2의 서열에 대한 적어도 90%, 예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 재조합적으로 생성된 글리코실화된 폴리펩타이드를 정제하는 데 적합하다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 방법은 서열번호 1 또는 2의 서열을 갖는 재조합적으로 생성된 글리코실화된 폴리펩타이드를 정제하는 데 적합하다.

일부 실시형태에서, 본 발명의 방법은 서열번호 1 또는 2의 아미노산 25-1404에 대한 적어도 85% 서열 동일성, 특히 서열번호 1 또는 2의 아미노산 25-1404에 대한 적어도 90%, 예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 서열 동일성을 갖는 재조합적으로 생성된 글리코실화된 폴리펩타이드를 정제하는 데 적합하다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 방법은 서열번호 1 또는 2의 서열 아미노산 25-1404를 갖는 재조합적으로 생성된 글리코실화된 폴리펩타이드를 정제하는 데 적합하다.

본 발명자들은 놀랍게도, 충분한 순도(예를 들어, 상업화에 대한 규제 요건을 충족시키기에 충분함) 및 고수율(예를 들어, 상업적으로 관련된 요구를 충족시키기에 충분함)의, 재조합적으로 생성된 글리코실화된 폴리펩타이드, 특히 재조합적으로 생성된 글리코실화 루브리신이 3개의 크로마토그래피 단계들을 포함하는, 특히 하기를 포함하는 방법에 의해 수득될 수 있는 것을 밝혀냈다: (a) 다중모드 양이온 교환 크로마토그래피(MCC)로 이루어진 제1 크로마토그래피 단계; (b) 다중모드 음이온 교환 크로마토그래피(MAC)로 이루어진 제2 크로마토그래피 단계; 및 (c) 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)로 이루어진 제3 크로마토그래피 단계.

일반적인 크로마토그래피 방법 및 그의 용도는 당업자에게 알려져 있다. 예를 들어, 문헌[Chromatography, 5th edition, Part A: Fundamentals and Techniques, Heftmann, E. (ed), Elsevier Science Publishing Company, New York, (1992)]; 문헌[Advanced Chromatographic and Electromigration Methods in Biosciences, Deyl, Z. (ed.), Elsevier Science BV, Amsterdam, The Netherlands, (1998)]; 문헌[Chromatography Today, Poole, C. F., and Poole, S. K., Elsevier Science Publishing Company, New York, (1991), Scopes, Protein Purification: Principles and Practice (1982)]; 문헌[Sambrook, J., et al. (ed), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F. M., et al. (eds)., John Wiley and Sons, Inc., New York]; 또는 문헌[Freitag, R., Chromatographical processes in the downstream processing of (recombinant) proteins, Meth. Biotechnol. 24 (2007) 421-453 (Animal cell biotechnology 2n Edition)]을 참조한다.

본 출원에서 사용된 용어 "이온 교환 크로마토그래피"는 "이온 교환 크로마토그래피 물질"을 사용하는 크로마토그래피 방법을 나타낸다. 용어 "이온 교환 크로마토그래피 물질"은 "양이온 교환 크로마토그래피"에서 양이온이 교환되는지의 여부에 따라 "양이온 교환 크로마토그래피 물질"을, 또는 "음이온 교환 크로마토그래피"에서 음이온이 교환되는지 여부에 따라 "음이온 교환 크로마토그래피 물질"을 포함한다.

본 출원내에서 사용된 용어 "이온 교환 크로마토그래피 물질"은 크로마토그래피 작용기로서 공유 결합된 하전 기를 운반하는 부동 고분자량 고체상을 나타낸다. 전체 전하 중성을 위해 공유 결합되지 않은 반대 이온이 이와 결합된다. "이온 교환 크로마토그래피 물질"은 공유 결합되지 않은 반대 이온을 주변 용액의 유사하게 하전된 이온과 교환하는 능력을 갖는다. 적합하게는, 양이온 교환 리간드는 -OCH₂COO-, -CH₂CH₂CH₂SO₃-, 및 -CH₂SO₃-로 이루어진 목록으로부터 선택된 작용기를 포함할 수 있다. 적합하게는, 양이온 교환 리간드는 카르복시메틸(CM), 설포프로필(SP), 및 메틸 설포네이트(S)로 이루어진 목록에서 선택될 수 있다. 적합하게는, 음이온 교환 리간드는 -CH₂CHOHCHH₂N⁺H(CH₂CH₃)², -OCH₂CH₂N⁺H(CH₂CH₃)₂-, -OCH₂CH₂N⁺(C₂H₅)₂CH₂CH(OH)CH₃-, 및 -CH₂N⁺(CH₃)₃-로 이루어진 목록으로부터 선택되는 작용기를 포함할 수 있다. 적합하게는, 음이온 교환 리간드는 디에틸아미노프로필(ANX), 디에틸아미노에틸(DEAE), 4차 아미노에틸(QAE), 4차 암모늄(Q)으로 이루어진 목록에서 선택될 수 있다.

하전된 기의 화학적 성질에 따라, "이온 교환 크로마토그래피 물질"은 공유 결합된 하전 치환기의 강도에 따라 강하거나 약한 이온 교환 크로마토그래피 물질로 추가로 분류될 수 있다. 예를 들어, 강한 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 크로마토그래피 작용기로 설폰산 기를 갖고, 약한 양이온 교환 크로마토그래피 물질은 크로마토그래피 작용기로 카르복실산기를 갖는다.

다중모드 양이온 교환 크로마토그래피 (MCC)

본원에 사용된 바와 같이 용어 "다중모드(또는 혼합 모드) 크로마토그래피" 또는 "MMC"는 하나 이상의 상호작용 모드 또는 메커니즘을 통해 용질이 정지 상과 상호작용하는 크로마토그래피 방법을 지칭한다. MMC는 전형적인 역상(RP), 이온 교환(IEX) 및 순상 크로마토그래피(NP)에 대한 대안 또는 보완 도구로 사용되었다. 소수성 상호작용, 친수성 상호작용 및 이온 상호작용이 각각 지배적인 상호작용 모드인, RP, NP 및 IEX 크로마토그래피와 달리, 혼합-모드 크로마토그래피는 이러한 상호작용 모드들 중 둘 이상의 조합을 사용한다(문헌[Zhang K. and Lui X, 2016, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, Volume 128, Pages 73-88]).

본 발명의 방법에 사용되는 크로마토그래피 단계 중 하나는 다중모드 양이온 교환 크로마토그래피(MCC)이다.

본원에 사용된 바와 같이 "다중모드 양이온 교환 크로마토그래피" 또는 "MCC"는 양이온 교환 및 정지 상과 분석물 사이의 적어도 하나 더 많은 상호작용 형태를 이용하는 크로마토그래피 방법을 지칭한다.

일부 실시형태에서, 본 발명의 방법에 사용되는 MCC 수지는 이온 상호작용에 의해 수성 환경에서 재조합적으로 생성된 글리코실화된 폴리펩타이드와 상호작용할 수 있는 양이온 교환 리간드, 예를 들어, 다중모드 양이온 교환 리간드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법에 사용되는 MCC 수지는 양이온 교환 리간드, 특히 약한 양이온 교환 리간드, 전형적으로 설폰산(-SO4-) 기 또는 카르복실산 기(-COO-)를 포함한다. 적합하게는, 다중모드 양이온 교환 리간드는 카르복실 또는 다른 음으로 하전된 기를 포함한다.

일부 실시형태에서, 본 발명의 방법에 사용되는 MCC 수지는 양이온 교환 리간드, 특히 약한 양이온 교환 리간드, 및 매트릭스를 포함한다. 매트릭스는 아가로스, 셀룰로오스, 세라믹스, 덱스트란, 폴리스티렌, 폴리아크릴아미드, 실리카, 합성 고분자, 유기 중합체로 이루어진 목록으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법에 사용되는 MCC 수지는 양이온 교환 리간드, 특히 약한 양이온 교환 리간드, 및 아가로스 매트릭스를 포함한다.

일부 실시형태에서, 본 발명의 방법에 사용되는 MCC 수지는 하기 상업적으로 입수가능한 수지로부터 선택된다: Capto MMC™(GE Healthcare; 아가로스 매트릭스와 조합된 다중 모드 약한 양이온 교환기); Eshmuno®HCX(Merck Millipore; Eshmuno® 양이온 교환기 친수성 폴리비닐 에테르 염기 매트릭스); Toyopearl MX-Trp-650 M(TOSOH Bioscience; 약한 카르복실 양이온 교환 및 인돌 소수성 작용기를 갖는 트립토판 리간드); Nuvia cPrime(BioRad); CHT 세라믹 수산화인회석(BioRad); 및 CFT 세라믹 플루오로아파타이트(Bio-Rad). 바람직한 실시형태에서, 본 발명의 방법에 사용되는 MCC 수지는 Capto MMC 수지이다.

적합하게는, 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법의 MCC 단계는 결합 및 용리 모드로 수행된다. 본 발명에서 사용되는 용어 "결합 및 용리 모드" 및 그의 문법적 등가물은 관심 물질을 함유하는 용액이 정지 상, 바람직하게는 고체 상과 접촉하게 되는 크로마토그래피 방법의 작동 모드를 나타내며, 이에 의해 관심 물질이 정지 상에 결합한다. 결과적으로 관심 물질은 정지 상에 유지되는 반면, 관심 없는 물질은 통과 또는 상청액으로 제거된다. 관심 물질은 이후 두번째 단계에서 정지 상으로부터 용리되고, 이에 의해 용리 용액으로 정지 상으로부터 회수된다. 이것은 관심 없는 물질의 100%가 제거된다는 것을 반드시 의미하지는 않지만, 관심 없는 물질의 본질적으로 100% 또는 허용 가능한 부분이 제거됨을, 예를 들어, 관심 없는 물질의 적어도 50%가 제거됨을, 바람직하게는 관심 없는 물질의 적어도 75%가 제거됨을, 바람직하게는 관심 없는 물질의 적어도 90%가 제거됨을, 바람직하게는 관심 없는 물질의 95% 초과가 제거됨을 의미한다.

적합하게는, 일부 실시형태에서, MCC 단계는 (i) 재조합적으로 생성된 글리코실화된 폴리펩타이드 조성물을 MCC 수지를 포함하는 MCC 컬럼과 접촉시키는 단계, 특히 정화된 세포 배양 상청액을 MCC 수지를 포함하는 MCC 컬럼에 로딩하는 단계, (ii) MCC 수지, 예를 들어, 그에 결합된 재조합적으로 생성된 글리코실화된 폴리펩타이드를 갖는 MCC 수지를 세척 완충액으로 세척하는 단계, 및 (iii) 재조합적으로 생성된 글리코실화된 폴리펩타이드 함유 분획을 용리하는 단계, 특히 pH 8 내지 10, 특히 pH 9에서 양으로 하전된 적어도 하나의 아미노산을 포함하는 용리 완충제로 재조합적으로 생성된 글리코실화된 폴리펩타이드 함유 분획을 용리하는 단계; 및 (iv) 선택적으로, 정제되거나 농축된 형태의 재조합적으로 생성된 글리코실화된 폴리펩타이드 함유 분획을 수집하는 단계를 포함한다.

적합하게는, 일부 실시형태에서, MCC 단계는 (i) 재조합적으로 생성된 글리코실화된 폴리펩타이드 조성물을 MCC 수지를 포함하는 MCC 컬럼과 접촉시키는 단계, 특히 정화된 세포 배양 상청액을 MCC 수지를 포함하는 MCC 컬럼에 로딩하는 단계, 및 (ii) pH 8 내지 10, 특히 pH 9에서 양으로 하전된 적어도 하나의 아미노산을 포함하는 용리 완충제로 재조합적으로 생성된 글리코실화된 폴리펩타이드 함유 분획을 용리하는 단계를 포함하며, 여기서 용리 완충제는 고염 용액이며, 특히 염 농도는 500 mM 초과, 예를 들어, 0.5 M 내지 2.5 M, 0.5 M 내지 2 M, 0.5 M 내지 1.5 M, 0.8 M 내지 1.2 M, 특히 0.9 M 내지 1.1 M이다.

일부 실시형태에서, 용리 완충제는 아세트산나트륨 및/또는 염화나트륨을 포함한다. 일부 실시형태에서, 용리 완충제는 10 mM 내지 100 mM 아세트산나트륨, 특히 20 mM 아세트산나트륨을 포함한다. 일부 실시형태에서, 용리 완충제는 0.5 M 내지 2 M 염화나트륨, 특히 1 M 염화나트륨을 포함한다. 특정 실시형태에서, 용리 완충제는 아세트산나트륨 및 염화나트륨을 포함한다. 보다 구체적인 실시형태에서, 용리 완충제는 10 mM 내지 100 mM 아세트산나트륨, 특히 20 mM 아세트산나트륨, 및 0.5 M 내지 2 M 염화나트륨, 특히 1 M 염화나트륨을 포함한다.

적합하게는, 용리 완충제는 pH 8 내지 10에서 양으로 하전되고 라이신; 아르기닌, 히스티딘 및 이들의 조합과 같은 아미노산을 함유하는 아미노기의 군으로부터 선택되는 아미노산을, 특히 적어도 50 mM, 예를 들어, 50 mM의 농도로 포함한다. 특정 실시형태에서, 용리 완충제는 L-아르기닌, 특히 50 mM L-아르기닌을 포함한다.

일부 실시형태에서, 용리 완충제는 약 15 mM 내지 약 25 mM Tris(예를 들어, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 또는 25 mM), 특히 20 mM Tris를 추가로 포함한다.

일부 실시형태에서, 용리 완충제는 약 8.5 내지 약 10(예를 들어, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9.0, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9, 또는 10.0)의 pH를 갖고, 특히 상기 용리 완충제는 pH 9를 갖는다.

특정 실시형태에서, 용리 완충제는 pH 9에서 20 mM Tris, 20 mM 아세트산나트륨, 50 mM L-아르기닌, 1 M NaCl을 포함한다.

일부 실시형태에서, 세척 완충제가 MCC 수지에 적용되어, 재조합적으로 생성된 글리코실화된 폴리펩타이드가 방출되기 전에, 오염물을 세척하고, 재조합적으로 생성된 글리코실화된 폴리펩타이드를 보유한다. 적합하게는, 세척 완충제는 20 mM Tris, pH 10이다.

일부 실시형태에서, MCC 컬럼은 평형화 완충제로 평형화된다. 일부 실시형태에서, MCC 컬럼은 재조합적으로 생성된 글리코실화된 폴리펩타이드 조성물을 MCC 컬럼과 접촉하기 전에, 예를 들어, 정화된 세포 배양 상청액을 MCC 수지 상에 로딩하기 전에, 평형화 완충제로 평형화된다. 일부 실시형태에서, 평형화 완충제는 20 mM Tris, pH 8을 포함한다.

다중모드 음이온 교환 크로마토그래피(MAC)

본 발명의 방법에 사용되는 크로마토그래피 단계 중 하나는 다중모드 음이온 교환 크로마토그래피(MAC)이다.

본원에 사용된 바와 같이 "다중모드 음이온 교환 크로마토그래피" 또는 "MAC"는 음이온 교환 및 정지 상과 분석물 사이의 적어도 하나 더 많은 상호작용 형태를 이용하는 크로마토그래피 방법을 지칭한다. 적합한 MAC 수지는 아민 또는 다른 양으로 하전된 기를 포함하는 리간드와 같은 임의의 다중-모드 음이온 교환 리간드를 포함할 수 있다.

일부 실시형태에서, 본 발명의 방법에 사용되는 MAC 수지는 매트릭스에 결합된 음이온 교환 리간드, 예를 들어, 다중모드 음이온 교환 리간드를 포함하며, 여기서 리간드는 이온 상호작용에 의한 수성 환경에서 재조합적으로 생성된 글리코실화된 폴리펩타이드 및/또는 오염물과 상호작용할 수 있다. 일부 실시형태에서, 다중모드 음이온 교환 리간드는 오염물과 상호작용한다.

적합하게는, 다중모드 음이온 교환 리간드는 아민 또는 다른 양으로 하전된 기를 포함한다. 일부 실시형태에서, MAC 수지는 아민을 포함하는 리간드로 구성된다. 작용성 아민은 1차, 2차, 3차 및 4차 아민; 하이드라진, 예컨대 일치환된 하이드라진 및 이치환된 하이드라진; 폴리-아민; 폴리-이민; 폴리-Q(여기서 Q는 4차 암모늄 기를 지칭함); 아닐린; 옥틸아민 및 하이드록실아민으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 확률적 수지는 페닐 기, 부틸 기, PEG, 불소 함유 리간드 및 하전된 기의 다른 수준과 결합된 한 유형의 아민 기를 기반으로 한다. 적합하게는, MAC 수지는 옥틸아민으로 구성된다.

일부 실시형태에서, 본 발명의 방법에 사용되는 MAC 수지는 음이온 교환 리간드 및 매트릭스를 포함한다. 매트릭스는 아가로스, 셀룰로오스, 세라믹스, 덱스트란, 폴리스티렌, 폴리아크릴아미드, 실리카, 합성 고분자, 유기 중합체로 이루어진 목록으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법에 사용되는 MAC 수지는 음이온 교환 리간드 및 아가로스 매트릭스를 포함한다.

일부 실시형태에서, 본 발명의 방법에 사용되는 MAC 수지는 하기 상업적으로 입수가능한 수지 MEP Hypercel™(Pall Corporation: 4-메르캅토-에틸-피리딘(4-MEP) 및 셀룰로오스 매트릭스); PPA Hypercel™(Pall Corporation; 리간드: 페닐프로필아민; 정전기 및 소수성 상호작용); HEA Hypercel™(Pall Corporation; 리간드: 헥실아민; 정전기 및 소수성 상호작용); CaptoAdhere™(GE Healthcare; 리간드 N-벤질-n-메틸 에탄올아민 및 아가로스 매트릭스); Capto 코어 700™(GE Healthcare; 리간드 옥틸아민 및 아가로스 매트릭스)로부터 선택된다.

일부 실시형태에서, MAC 수지는 리간드-활성화 코어, 예를 들어, 아민 리간드, 예를 들어, 옥틸아민 리간드, 및 비활성 쉘로 구성된다. 비활성 쉘은 크기 배제 특성을 가지며, 예를 들어, 재조합적으로 생성된 글리코실화된 폴리펩타이드, 예를 들어, 루브리신과 같은 큰 분자가, 쉘의 공극을 통해 코어로 들어가는 것을 배제한다. 따라서, 재조합적으로 생성된 글리코실화된 폴리펩타이드, 예를 들어, 루브리신은 컬럼 통과-흐름에 수집되는 반면, 더 작은 불순물이 내재화된 리간드에 결합한다. 바람직한 실시형태에서, MAC 수지는 Capto 코어 700 수지이며, 이는 700 kDa 분자량 컷-오프를 제공한다.

적합하게는, 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법의 MAC 단계는 통과-흐름 모드로 수행된다.

본 발명내에서 사용되는 용어 "통과-흐름 모드" 및 그의 문법적 등가물은 관심 물질을 함유하는 용액이 정지 상, 바람직하게는 고체 상과 접촉하게 되는 크로마토그래피 방법의 작동 모드를 나타내며, 이에 의해 관심 물질이 정지 상에 결합하지 않는다. 통과-흐름 모드에서, 샘플 및 완충제의 pH는 표적 단백질 또는 크로마토그래피 수지의 전하를 변형시키도록 선택될 수 있어서, 표적 단백질이 통과-흐름 분획에서 직접 유지되는 반면, 불순물이 수지에 결합된다. 결과적으로, 관심 물질은 통과-흐름 또는 상청액에서 수득된다. 용액에도 존재하는, 관심 없는 물질은 정지 상에 결합하고 용액에서 제거된다. 이것은 관심 없는 물질의 100%가 용액에서 제거된다는 것을 반드시 의미하지는 않지만, 관심 없는 물질의 본질적으로 100%가 제거됨을, 예를 들어, 관심 없는 물질의 적어도 50%가 용액에서 제거됨을, 바람직하게는 관심 없는 물질의 적어도 75% 가 용액에서 제거됨을, 바람직하게는 관심 없는 물질의 적어도 90%가 용액에서 제거됨을, 바람직하게는 관심 없는 물질의 95% 이상이 용액에서 제거됨을 의미한다.

적합하게는, 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법의 MAC 단계는 (i) 재조합적으로 생성된 글리코실화된 폴리펩타이드 조성물을 MAC 수지를 포함하는 MAC 컬럼과 접촉시키는 단계, 특히 MCC 단계의 용리액을 MAC 수지를 포함하는 MAC 컬럼 상에 로딩하는 단계, (ii) MAC 수지를 세척 완충제로 세척하는 단계, 및 (iii) 정제되거나 농축된 형태의 재조합적으로 생성된 글리코실화된 폴리펩타이드를 포함하는 통과-흐름을 수집하는 단계를 포함한다.

적합하게는, 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법의 MAC 단계는 재조합적으로 생성된 글리코실화된 폴리펩타이드 조성물을 MAC 수지를 포함하는 MAC 컬럼과 접촉시키는 단계, 특히 MCC 단계의 용리액을 MAC 수지를 포함하는 MAC 컬럼 상에 로딩하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 재조합적으로 생성된 글리코실화된 폴리펩타이드 조성물, 예를 들어, MCC 단계의 용리액은 MAC 컬럼 상에 로딩되기 전에 6~9(예를 들어, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9.0), 특히 pH 7.0으로 pH-조정된다.

일부 실시형태에서, MAC 컬럼은 평형화 완충제로 평형화된다. 일부 실시형태에서, MAC 컬럼은 재조합적으로 생성된 글리코실화된 폴리펩타이드 조성물을 MAC 컬럼과 접촉시키기 전에 평형화 완충제로 평형화된다. 적합하게는, 평형화 완충제는 pH 6 내지 9(예를 들어, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9.0)의 약 40 내지 약 60 mM Na 포스페이트, 약 300 내지 약 1000 mM NaCl을 포함하며, 특히 평형화 완충제는 pH 7의 50 mM Na 포스페이트, 750 mM NaCl을 포함한다.

적합하게는, 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법의 MAC 단계는 (i) 재조합적으로 생성된 글리코실화된 폴리펩타이드 조성물을 MAC 수지를 포함하는 MAC 컬럼과 접촉시키는 단계, 특히 MCC 단계의 용리액을 MAC 수지를 포함하는 MAC 컬럼 상에 로딩하는 단계, (ii) MAC 수지를 세척 완충제로 세척하는 단계, 및 (iii) 정제되거나 농축된 형태의 재조합적으로 생성된 글리코실화된 폴리펩타이드를 포함하는 통과-흐름을 수집하는 단계를 포함한다. 적합하게는, 세척 완충제는 pH 6~9(예를 들어, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9.0)의 약 40 내지 약 60 mM Na 포스페이트, 약 300 내지 약 1000 mM NaCl을 포함하며, 특히 세척 완충제는 pH 7의 50 mM Na 포스페이트, 750 mM NaCl을 포함한다.

소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC).

본 발명의 방법에 사용되는 크로마토그래피 단계 중 하나는 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)이다.

용어 "소수성 상호작용 크로마토그래피" 또는 "HIC"는 "소수성 상호작용 크로마토그래피 물질"이 사용된 크로마토그래피 방법을 지칭한다. HIC는 고염 농도에서 약한 소수성 표면에 생체분자를 흡착시킨 다음, 염분 구배를 낮추면서 용리하는 것을 기반으로 한다. 이 기술은 크로마토그래피 지지체 상의 고정된 소수성 리간드에 결합하는 생체 분자의 표면에 존재하는 소수성 영역을 이용한다.

"소수성 상호작용 크로마토그래피 물질"은 부틸-, 옥틸- 또는 페닐-기와 같은 소수성 기가 크로마토그래피 작용기로서 결합된 크로마토그래피 물질이다. 폴리펩타이드는 소수성 상호작용 크로마토그래피 물질의 소수성 기들과 상호작용할 수 있는, 표면 노출된 아미노산 측쇄의 소수성에 따라 분리된다. 폴리펩타이드와 크로마토그래피 물질 사이의 상호작용은 온도, 용매, 및 용매의 이온 강도에 의해 영향을 받을 수 있다. 온도 증가는, 예를 들어, 아미노산 측쇄의 움직임이 증가하고 더 낮은 온도에서 폴리펩타이드 내부에 묻힌 소수성 아미노산 측쇄에 접근할 수 있게 됨에 따라 폴리펩타이드와 소수성 상호작용 크로마토그래피 물질 사이의 상호작용을 뒷받침한다. 소수성 상호작용은 또한 코스모트로픽 염에 의해 촉진되고 카오트로픽 염에 의해 감소된다. "소수성 상호작용 크로마토그래피 물질"은 예를 들어, 페닐세파로스 CL-4B, 6 FF, HP, 페닐 수페로스, 옥틸세파로스 CL-4B,4 FF, 및 부틸세파로스 4 FF, 헥실, 에테르, PPG (모두 Amersham Pharmacia Biotech Europe GmbH에서 입수가능함, 독일)를 포함하며, 이들은 벌크 물질에 대한 글리시딜-에테르 결합을 통해 수득된다.

일부 실시형태에서, HIC 컬럼은 페닐 막 흡착기, 특히 Sartobind 페닐 막 흡착기를 포함한다. 페닐 막 흡착기는 기존의 소수성 상호작용 크로마토그래피에서 알려진 것과 동일한 규칙을 따른다. 큰 공극 크기로 인해, 막 흡착기는 우수한 흐름 특성들을 나타낸다. 기존의 비드 크로마토그래피와 비교하여 물질 전달의 확산 제한이 거의 없다. 염 농도가 높은 완충제는 소수성 막 매트릭스에서 단백질의 흡착을 촉진한다. 단백질은 용리 완충제의 염 농도를 감소시켜 용리된다.

일부 실시형태에서, HIC 단계는 통과-흐름 모드로 수행된다.

일부 실시형태에서, HIC 단계는 재조합적으로 생성된 글리코실화된 폴리펩타이드 조성물을 HIC 컬럼과 접촉시키는 단계, 예를 들어, MAC 단계의 통과-흐름을 HIC 컬럼에 로딩하는 단계를 포함한다.

적합하게는, 재조합적으로 생성된 글리코실화된 폴리펩타이드 조성물, 예를 들어 MAC 단계의 통과-흐름은 재조합적으로 생성된 글리코실화된 폴리펩타이드 조성물을 로딩하기 전에, 예를 들어 통과-흐름을 HIC 컬럼 상에 로딩하기 전에 고염 농도로 조정되며, 특히 생성된 염 농도는 500 mM 초과, 예를 들어, 0.5 M 내지 약 1 M, 0.5 M 내지 1.5 M, 0.5 M 내지 1.2 M, 0.8 M 내지 1 M, 특히 약 0.9 M이다. 일부 실시형태에서, 염은 황산암모늄이다.

일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 재조합적으로 생성된 글리코실화된 폴리펩타이드 조성물을 고염 농도로 조정한 후, 그리고 재조합적으로 생성된 글리코실화된 폴리펩타이드 조성물을 HIC 컬럼 상에 로딩하기 전에 심층 여과를 수행하는 단계를 추가로 포함한다. 따라서, 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 MAC 단계 후 재조합적으로 생성된 글리코실화된 폴리펩타이드 조성물을 고염 농도로 조정하는 단계 및 그 후 재조합적으로 생성된 글리코실화된 폴리펩타이드 조성물을 HIC 컬럼 상에 로딩하기 전에 심층 여과를 수행하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 심층 여과는 적합한 필터, 예를 들어, 셀룰로오스 또는 폴리프로필렌 섬유-기반 필터, 예를 들어, 양으로 하전된 삼중층 B1HC 필터를 사용하여 수행된다.

일부 실시형태에서, HIC 컬럼은 평형화 완충제로 평형화된다. 일부 실시형태에서, HIC 컬럼은 재조합적으로 생성된 글리코실화된 폴리펩타이드 조성물을 HIC 컬럼과 접촉시키기 전에 평형화 완충제로 평형화된다. 특정 실시형태에서, HIC 컬럼은 pH 6.5-7.5(예를 들어, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5)의, 15-25 mM Na 포스페이트, 500-1500 mM 황산암모늄을 포함하는 평형화 완충제로 평형화되며, 특히 상기 평형화 완충제는 pH 7의 20 mM Na 포스페이트, 1 M 황산암모늄을 포함한다.

적합하게는, 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법의 HIC 단계는 HIC 컬럼을 세척 완충제로 세척하는 단계를 포함한다. 적합하게는, 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법의 HIC 단계는 재조합적으로 생성된 글리코실화된 폴리펩타이드 조성물을 HIC 컬럼과 접촉시킨 후, 예를 들어, 통과-흐름 풀을 두번째 크로마토그래피 단계에 로딩한 후 HIC 컬럼을 세척 완충제로 세척하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세척 완충제는 pH 6.5-7.5(예를 들어, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5)의, 15-25 mM Na 포스페이트, 500-1500 mM 황산암모늄을 포함하며, 특히 상기 세척 완충제는 pH 7의 20 mM Na 포스페이트, 1 M 황산암모늄을 포함한다.

엔도뉴클레아제

일부 실시형태에서, 본 발명의 방법은 세포 배양물 또는 용리액에 존재하는 핵산 분자(예를 들어, DNA 및/또는 RNA)를 분해하기 위한 추가 단계(들)(예를 들어, 제1 크로마토그래피 단계 이전)를 포함한다. 따라서, 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법은 세포 배양물 또는 용리액을 엔도뉴클레아제(예를 들어, Benzonase® 뉴클레아제) 및 MgCl₂로 처리하는 단계를 포함한다. 적합하게는, Benzonase® 뉴클레아제는 세포 배양물에 첨가되어, 글리코실화된 폴리펩타이드를 생산한다. 대안적으로, Benzonase® 뉴클레아제는 재조합적으로 생성된 글리코실화된 폴리펩타이드를 포함하는 정화된 세포 배양 상청액에 첨가된다. 일부 실시형태에서, Benzonase® 뉴클레아제는 0.2 μm 필터로 여과된다. 일부 실시형태에서, Benzonase® 뉴클레아제 처리 단계는 Mg²⁺를 세포 배양물에 또는 정화된 세포 배양 상청액에, 특히 1-2 mM Mg²⁺의 양으로 첨가하는 단계(예를 들어, 1-2 mM MgCl₂ 첨가, 예를 들어, 0.2 μm 필터로 여과한 1-2 mM MgCl₂ 첨가)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 배양물 또는 정화된 세포 배양 상청액을 Benzonase® 뉴클레아제로 처리하는 단계는 세포 배양 상청액의 1 ml 당 5 U 내지 50 U의 Benzonase® 뉴클레아제를 첨가하는 단계를 포함한다. 더욱 구체적인 실시형태에서, 세포 배양물 또는 정화된 세포 배양 상청액을 Benzonase® 뉴클레아제로 처리하는 단계는 (i) 세포 배양 상청액의 1 ml 당 약 5 U 내지 50 U의 Benzonase® 뉴클레아제(예를 들어, 정화된 수확물의 1.0 kg 당 약 200 μl의 Benzonase®(250 U/μl))를 첨가하는 단계, 및 (ii) 세포 배양물 또는 정화된 세포 배양 상청액에, 특히 약 1 mM Mg²⁺의 양으로 Mg²⁺를 첨가하는 단계를 포함한다. 본원에 기재된 실시형태에서, 정화된 세포 배양 상청액을 Benzonase® 뉴클레아제로 처리하는 단계는 (i) 세포 배양 상청액의 1 ml 당 1 U 내지 5 U(예를 들어, 2 U)의 Benzonase® 뉴클레아제를 첨가하는 단계, 및 (ii) 정화된 세포 배양 상청액에, 특히 약 1 mM Mg²⁺의 양으로 Mg²⁺를 첨가하는 단계를 포함한다. 또한, 본원에 기재된 실시형태에서, 세포 배양물을 Benzonase® 뉴클레아제로 처리하는 단계는 (i) 세포 배양물의 1 ml 당 1 U 내지 5 U(예를 들어, 2 U)의 Benzonase® 뉴클레아제를 첨가하는 단계, 및 (ii) 세포 배양물에, 특히 약 1 mM Mg²⁺의 양으로 Mg²⁺를 첨가하는 단계를 포함한다.

일부 실시형태에서, 정화된 세포 배양 상청액을 Benzonase® 뉴클레아제로 처리하는 단계는 (i) 세포 배양 상청액의 1 ml 당 2 U, 5 U, 10 U, 15 U, 20 U, 30 U, 40 U, 50 U, 5 U 내지 50 U, 1 U 내지 5 U, 또는 1 U 내지 50 U의 Benzonase® 뉴클레아제를 첨가하는 단계, 및 (ii) 정화된 세포 배양 상청액에, 특히 약 1 mM MgCl₂의 양으로 MgCl₂를 첨가하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 정화된 세포 배양 상청액을 Benzonase® 뉴클레아제로 처리하는 단계는 (i) 세포 배양 상청액의 1 ml 당 2 U의 Benzonase® 뉴클레아제를 첨가하는 단계, 및 (ii) 세포 배양물 또는 정화된 세포 배양 상청액에, 특히 약 1 mM MgCl₂의 양으로 MgCl₂를 첨가하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 배양 수확물은 MgCl₂및 엔도뉴클레아제와 접촉되기 전에 2~8℃까지 냉각된다.

일부 실시형태에서, 세포 배양물을 Benzonase® 뉴클레아제로 처리하는 단계는 세포 배양물의 1 ml 당 2 U, 5 U, 10 U, 15 U, 20 U, 30 U, 40 U, 50 U, 5 U 내지 50 U, 1 U 내지 5 U, 또는 1 U 내지 50 U의 Benzonase® 뉴클레아제 및 MgCl₂를 세포 배양물에 첨가하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법은 세포 배양물의 1 ml 당 2 U의 Benzonase® 뉴클레아제 및 MgCl₂를 세포 배양물에 첨가하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포 배양물은 MgCl₂및 엔도뉴클레아제와 접촉되기 전에 2~8℃까지 냉각된다.

일부 실시형태에서, 세포 배양물을 엔도뉴클레아제로 처리하는 단계는 세포 배양물을 엔도뉴클레아제(예를 들어, Benzonase® 뉴클레아제) 및 MgCl₂로 처리하는 단계, 예를 들어, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일의 세포 배양 시에(예를 들어, 생물반응기에서 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일 세포 배양 시에, 예를 들어, 30℃의 생물반응기에서 세포 배양 시에), 세포 배양물을 엔도뉴클레아제(예를 들어, Benzonase® 뉴클레아제) 및 MgCl₂로 처리하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법은 세포 배양물의 1 ml 당 2 U, 5 U, 10 U, 15 U, 20 U, 30 U, 40 U, 50 U, 5 U 내지 50 U, 1 U 내지 5 U, 또는 1 U 내지 50 U의 Benzonase® 뉴클레아제 및 MgCl₂를 세포 배양물에 첨가하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법은 세포 배양물의 1 ml 당 2 U의 Benzonase® 뉴클레아제 및 MgCl₂를 세포 배양물에 첨가하는 단계를 포함한다.

일부 실시형태에서, 본 발명의 방법은 하기 단계를 포함한다: (a) 재조합적으로 생성된 루브리신 당단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는, 숙주 세포, 특히 진핵 세포를 배양하는 단계; (b) 재조합적으로 생성된 루브리신 당단백질을 포함하는 세포 배양 상청액을 정화하는 단계; 및 (c) 상기 재조합적으로 생성된 루브리신 당단백질을 본 발명에 따른 방법으로 정제하는 단계.

바이러스 불활성화

일부 실시형태에서, 본 발명의 방법은 크로마토그래피 단계들 중 하나 이상 사이에서, 또는 제3 크로마토그래피 단계 후에 수행되는, 바이러스 불활성화 및/또는 바이러스 여과 단계를 추가로 포함한다

특정 실시형태에서, 본 발명의 방법은 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 바이러스 불활성화(VIN) 처리 단계 및 바이러스 제거 단계들을 추가로 포함한다. 저온살균, 최종 건열, 증기 열, 용매/세제, 및 산성 pH를 포함하지만 이에 제한되지 않는, 바이러스 불활성화의 다양한 방법은 당업자에게 공지되어 있으며, 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 침전, 크로마토그래피 및 나노여과를 포함하지만 이에 제한되지 않는 바이러스 제거 절차는 또한 잘 알려져 있다. 바이러스 불활성화 및 제거는 공정 중(예를 들어, 나노여과 및 용매/세제 처리, 저온살균, 증기-처리, 및/또는 약 pH 4.0에서의 인큐베이션) 또는 최종 용기에서의 최종 처리(예를 들어, 최종 저온살균 또는 최종 건열 처리)에서 수행될 수 있다.

일부 실시형태에서, 본 발명의 방법은 약 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 또는 4.0의 pH와 같은 낮은 pH, 예를 들어 pH 4.0 이하에 의한 바이러스 불활성화 단계를 포함한다. 특정 실시형태에서, 바이러스 불활성화 단계는 제2 및 제3 크로마토그래피 단계들 사이(예를 들어, 다중모드 음이온 교환 크로마토그래피(MAC) 단계 후 및 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 단계 전)에 수행된다.

일부 실시형태에서, 본 발명의 방법은 바이러스 불활성화 단계, 예를 들어, 낮은 pH에 의한 바이러스 불활성화 단계 후 바이러스 제거 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 바이러스 제거 단계는 바이러스 불활성화 단계 후 및 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 단계 전에 수행된다. 일부 실시형태에서, 바이러스 제거 단계는 염화나트륨 함유 완충제를 사용하여, 바이러스 불활성화 단계로부터 수득된 고도로 글리코실화된 단백질(예를 들어, 재조합 인간 루브리신)을 포함하는 용액(예를 들어, 여과액)을 접선 유동 여과에 적용하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 용액은 50 mS/cm 초과의 전도도를 특징으로 한다. 일부 실시형태에서, 염화나트륨 함유 완충제는 pH 6.5 내지 pH 7.5(예를 들어, pH 6.5, pH 6.6, pH 6.7, pH 6.8, pH 6.9, pH 7.0, pH 7.1, pH 7.2, pH 7.3, pH 7.4, 또는 pH 7.5)의 pH를 갖는다. 일부 실시형태에서, 접선 유동 여과는 15 mS/cm 이하(예를 들어, 15 mS/cm, 10 mS/cm, 또는 5 mS/cm)의 전도도가 달성될 때까지 수행된다. 일부 실시형태에서, 접선 유동 여과 후, 용액은 음이온 교환 심층 필터(AEX) 상에서 여과된다. 일부 실시형태에서, AEX 필터는 접선 유동 여과에 사용되는 완충제로 세척된다. 일부 실시형태에서, AEX 필터로부터의 여과액은 황산암모늄 용액으로 처리되어, 0.4 M 내지 1.5 M(예를 들어, 0.4 M, 0.5 M, 0.6 M, 0.7 M, 0.8 M, 0.9 M, 1.0 M, 1.1 M, 1.2 M, 1.3 M, 1.4 M, 또는 1.5 M)의 황산암모늄 농도를 달성한다. 일부 실시형태에서, 황산암모늄 용액으로 처리된 AEX 필터로부터의 여과액에 HIC 단계가 적용된다. 따라서, 본원에 기재된 발명의 일부 실시형태에서, 고도로 글리코실화된 단백질(예를 들어, 재조합 인간 루브리신)을 정제하는 방법은 상기 기재된 바와 같은 바이러스 제거 단계를 포함한다. 본원에 기재된 발명의 일부 실시형태에서, 고도로 글리코실화된 단백질(예를 들어, 재조합 인간 루브리신)을 생성하는 방법은 상기 기재된 바와 같은 바이러스 제거 단계를 포함한다. 또한, 본원에는 상기 기재된 바와 같은 바이러스 제거 단계를 포함하는 방법에 의해 생성되거나 정제된 고도로 글리코실화된 단백질(예를 들어, 재조합 인간 루브리신)이 기재되어 있다. 또한, 본원에는 상기 기재된 바와 같은 바이러스 제거 단계를 포함하는 방법에 의해 생성되거나 정제된 고도로 글리코실화된 단백질(예를 들어, 재조합 인간 루브리신)을 포함하는 조성물이 기재되어 있다.

일부 실시형태에서, 본 발명의 방법은 바이러스 불활성화 단계를 포함하며, 여기서 용리액이 세제 또는 N,N-디메틸우레아(DMU)와 접촉된다. 일 양태에서, 용리액은 N,N-디메틸우레아(DMU), 예를 들어, 약 3 M N,N-디메틸우레아(DMU)의 용액과 접촉된다.

일부 실시형태에서, 본 발명의 방법은 바이러스 여과 단계를 포함한다. 특정 실시형태에서, 바이러스 여과는 제3 크로마토그래피 단계 후(예를 들어, HIC 단계 후)에 수행된다. 바이러스 여과 방법 및 필터는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 바이러스 입자 포획을 위한 미세여과(예를 들어, 약 0.1 내지 10 μm의 공극 크기를 갖는 막) 및 한외여과(예를 들어, 약 0.001 내지 0.1 μm의 공극 크기를 갖는 막)의 용도를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.

일부 실시형태에서, 본 발명의 방법은 한외여과/정용여과(UF/DF)에 의한 완충제 교환을 수행하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 실시형태에서, UF/DF에 의한 완충제 교환 단계는 제3 크로마토그래피 단계 후(예를 들어, HIC 단계 후)에 수행된다. 보다 구체적인 실시형태에서, UF/DF에 의한 완충제 교환 단계는 바이러스 여과 단계 후 제3 크로마토그래피 단계 후에 수행된다.

순도 매개변수

일부 실시형태에서, 오염물(예를 들어, 폴리뉴클레오타이드 및/또는 숙주 세포 단백질)의 함량은 정제 전, 예를 들어, 제1 크로마토그래피 단계 이전의 함량과 비교하여, 3가지 크로마토그래피 단계들의 수행 후에 수득된 폴리펩타이드 용액에서 감소된다. 일부 실시형태에서, 오염물(예를 들어, 폴리뉴클레오타이드 및/또는 숙주 세포 단백질)의 함량은 제1 크로마토그래피 단계 전 함량과 비교하여, 제3 크로마토그래피 단계 후에 수득된 폴리펩타이드 용액에서 감소된다. 추가 실시형태에서, 오염물(예를 들어, 폴리뉴클레오타이드 및/또는 숙주 세포 단백질)의 함량은 Benzonase® 뉴클레아제 처리 단계 전 함량과 비교하여, 제3 크로마토그래피 단계 후에 수득된 폴리펩타이드 용액에서 감소된다. 일부 실시형태에서, 오염물(예를 들어, 폴리뉴클레오타이드 및/또는 숙주 세포 단백질)의 함량은 심층 여과 단계, 예를 들어, HIC 전에 수행된 심층 여과 단계, 예를 들어, MAC 단계 후 및 HIC 단계 전에 수행된 심층 여과 단계를 수행한 후 수득된 폴리펩타이드 용액에서 감소된다. 일반적으로, 심층 여과는 현탁된 입자들(예를 들어, 현탁된 숙주 세포 단백질 입자들)을 포획하고 운반 유체로부터 이들을 분리하기 위해 여과 매질(예를 들어, 셀룰로오스)의 두께를 활용한다.

일부 실시형태에서, 본 발명의 방법의 마지막 정제 단계 후 수득된 최종 폴리펩타이드 용액의 순도는 > 4000 IU/mg, 바람직하게는 >9000 IU/mg 및 더욱 바람직하게는 > 10 000 IU/mg 단백질이고, DNA 함량은 < 1000 pg/1000 IU 재조합적으로 생성된 글리코실화된 폴리펩타이드, 바람직하게는 < 100 pg/ 1000 IU 재조합적으로 생성된 글리코실화된 폴리펩타이드 및 더욱 바람직하게는 < 10 pg/1000 IU 재조합적으로 생성된 글리코실화된 폴리펩타이드이다.

일부 실시형태에서, 재조합적으로 생성된 폴리펩타이드의 적어도 30%, 예를 들어, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%가 본 발명의 방법 후에 회수된다. 일부 실시형태에서, 제1 크로마토그래피 단계 전의 양과 비교하여, 재조합적으로 생성된 폴리펩타이드의 적어도 45%, 예를 들어, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%가 제1 크로마토그래피 단계 후에 회수된다. 일부 실시형태에서, 제2 크로마토그래피 단계 전의 양과 비교하여, 재조합적으로 생성된 폴리펩타이드의 적어도 80%, 예를 들어, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%가 제2 크로마토그래피 단계 후에 회수된다. 일부 실시형태에서, 제3 크로마토그래피 단계 전의 양과 비교하여, 재조합적으로 생성된 폴리펩타이드의 적어도 90%, 예를 들어, 적어도 95%가 제3 크로마토그래피 단계 후에 회수된다.

SEC, RPC, 및 rCE-SDS에 의해 측정된 순도 기준

용액(원료의약품 또는 의약품 포함)의 순도는 하기에 의해 측정될 수 있는 품질 기준이다: 크기-배제 크로마토그래피(SEC) 분석; 역상 크로마토그래피(RPC) 분석; 변성 조건 하에서 환원 모세관 전기영동(rCE-SDS) 분석; 또는 본원에 기재된 SEC, RPC, 및 rCD-SDS 분석의 임의의 조합. 용액(예를 들어, 용리액)의 순도는 응집체 및 분해 산물을 포함한 전체 피크에 대한 표적 단백질의 백분율이다.

예를 들어, 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법에 의해 정제된 재조합적으로 생성된 글리코실화된 폴리펩타이드를 포함하는 용액의 순도는 역상 크로마토그래피(RPC)를 사용하여 결정될 수 있다. RPC는 단백질 정제를 위한 소수성 정지 상 및 극성 이동 상에 의존하는 크로마토그래피 기술이다. 본 발명의 방법에 의해 정제된 고도로 글리코실화된 폴리펩타이드는 UV-검출과 함께 이온쌍 모드에서 RPC에 의해 2개의 주요 피크 그룹으로 분해될 수 있다. 2개의 주요 피크 그룹의 피크 면적 대 총 피크 면적은 상대적인 피크 면적 백분율로 표현되는 순도를 정의한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법에 의해 생성된 재조합적으로 생성된 글리코실화된 폴리펩타이드를 포함하는 용액의 순도는 RPC에 의해 결정 시, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상, 99.6% 이상, 99.7% 이상, 99.8% 이상, 또는 99.9% 이상이다. 따라서, 본원에 기재된 방법을 사용하여 정제된 재조합적으로 생성된 글리코실화된 폴리펩타이드(예를 들어, 재조합 인간 루브리신)를 포함하는 조성물(예를 들어, 약제학적 조성물)의 순도를 결정하는 방법이 또한 본원에 기재되어 있으며, 여기서 상기 방법은 역상 크로마토그래피(RPC)를 수행하는 단계 및 RPC에 의해 결정된 바와 같은, 조성물의 순도를 계산하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물의 순도는 RPC에 의해 결정된 바와 같은, % 순도로 계산된다(예를 들어, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상, 99.6% 이상, 99.7% 이상, 99.8% 이상, 99.9% 이상, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 약 99.5%, 약 99.6%, 약 99.7%, 약 99.8%, 또는 약 99.9%).

일부 실시형태에서, 본 발명의 방법에 의해 정제된 재조합적으로 생성된 글리코실화된 폴리펩타이드를 포함하는 용액의 순도는 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 사용하여 결정될 수 있다. SEC는 크기에 따라 분자를 분리하는 크로마토그래피 기술로, 예를 들어, 정제된 단백질 생성물의 응집체 및 단편을 측정하는 데 사용될 수 있다. 정제된 단백질 생성물의 응집체는 SEC에 의해 기본 조건에서 크기를 기준으로 단량체로부터 분리되고 UV 검출로 검출될 수 있다. 응집체의 양은 각 샘플에 대해 얻은 총 면적의 백분율로 결정된다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법에 의해 생성된 재조합적으로 생성된 글리코실화된 폴리펩타이드의 응집체의 합(예를 들어, 본원에 기재된 방법에 의해 생성된 재조합적으로 생성된 글리코실화된 폴리펩타이드를 포함하는 조성물에서의 응집체의 합)은 SEC에 의해 결정 시 약 10% 이하, 약 5% 이하, 약 4% 이하, 약 3% 이하, 약 2% 이하, 또는 약 1% 이하, 바람직하게는 1% 미만(예를 들어, SEC에 의해 결정 시, 재조합적으로 생성된 글리코실화된 폴리펩타이드의 총량의 약 10% 이하, 약 5% 이하, 약 4% 이하, 약 3% 이하, 약 2% 이하, 또는 약 1% 이하, 바람직하게는 1% 미만)이다. 따라서, 또한 본원에는 본원에 기재된 방법을 사용하여 정제된 재조합적으로 생성된 글리코실화된 폴리펩타이드를 포함하는 조성물(예를 들어, 약제학적 조성물)에서 재조합적으로 생성된 글리코실화된 폴리펩타이드(예를 들어, 재조합 인간 루브리신)의 응집체의 퍼센트를 결정하는 방법이 기재되어 있으며, 상기 방법은 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 수행하는 단계 및 SEC에 의해 결정된 바와 같은 응집체의 퍼센트를 계산하는 단계를 포함한다.

일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법에 의해 생성된 재조합적으로 생성된 글리코실화된 폴리펩타이드의 단편의 합(예를 들어, 본원에 기재된 방법에 의해 생성된 재조합적으로 생성된 글리코실화된 폴리펩타이드를 포함하는 조성물에서의 단편의 합)은 SEC에 의해 결정 시, 약 15% 이하, 약 10% 이하, 약 5% 이하, 약 4% 이하, 약 3% 이하, 약 2% 이하, 약 1.5% 이하, 또는 약 1% 이하, 바람직하게는 1% 미만(예를 들어, SEC에 의해 결정 시, 재조합적으로 생성된 글리코실화된 폴리펩타이드의 총량의 약 15% 이하, 약 10% 이하, 약 5% 이하, 약 4% 이하, 약 3% 이하, 약 2% 이하, 약 1.5% 이하, 또는 약 1% 이하, 바람직하게는 1% 미만)이다. 따라서, 또한 본원에는 본원에 기재된 방법을 사용하여 정제된 재조합적으로 생성된 글리코실화된 폴리펩타이드를 포함하는 조성물(예를 들어, 약제학적 조성물)에서 재조합적으로 생성된 글리코실화된 폴리펩타이드(예를 들어, 재조합 인간 루브리신)의 단편의 퍼센트를 결정하는 방법이 기재되어 있으며, 상기 방법은 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 수행하는 단계 및 SEC에 의해 결정된 바와 같은 단편의 퍼센트를 계산하는 단계를 포함한다.

일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법에 의해 생성된 재조합적으로 생성된 글리코실화된 폴리펩타이드의 정제된 단량체의 합은 SEC에 의해 결정 시, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상, 99.6% 이상, 99.7% 이상, 99.8% 이상, 또는 99.9% 이상(예를 들어, SEC에 의해 결정 시, 재조합적으로 생성된 글리코실화된 폴리펩타이드의 총량의 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상, 99.6% 이상, 99.7% 이상, 99.8% 이상, 또는 99.9% 이상)이다. 따라서, 또한 본원에는 본원에 기재된 방법을 사용하여 정제된 재조합적으로 생성된 글리코실화된 폴리펩타이드를 포함하는 조성물(예를 들어, 약제학적 조성물)에서 재조합적으로 생성된 글리코실화된 폴리펩타이드(예를 들어, 재조합 인간 루브리신)의 정제된 단량체의 퍼센트를 결정하는 방법이 기재되어 있으며, 상기 방법은 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 수행하는 단계 및 SEC에 의해 결정된 바와 같은 재조합적으로 생성된 글리코실화된 폴리펩타이드의 단량체의 퍼센트를 계산하는 단계를 포함한다.

UV 검출 기능이 있는 크기 배제 크로마토그래피(SEC)가 또한 사용되어, 알려진 농도의, 총 샘플 피크 면적 대 참조의 총 피크 면적을 기반으로 단백질 양을 계산할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법에 의해 정제된 글리코실화된 폴리펩타이드를 포함하는 조성물의 단백질 농도는 1.50 mg/ml 내지 3.00 mg/ml이다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법에 의해 정제된 글리코실화된 폴리펩타이드를 포함하는 조성물의 단백질 농도는 1.60 mg/ml 내지 2.40 mg/ml이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법에 의해 정제된 글리코실화된 폴리펩타이드를 포함하는 조성물의 단백질 농도는 1.50 mg/ml, 1.60 mg/ml, 1.70 mg/ml, 1.80 mg/ml, 1.90 mg/ml, 2.00 mg/ml, 2.10 mg/ml, 2.20 mg/ml, 2.30 mg/ml, 2.40 mg/ml, 2.50 mg/ml, 또는 3.00 mg/ml이다. 따라서, 또한 본원에는 본원에 기재된 방법을 사용하여 정제된 재조합적으로 생성된 글리코실화된 폴리펩타이드를 포함하는 조성물(예를 들어, 약제학적 조성물)에서 재조합적으로 생성된 글리코실화된 폴리펩타이드(예를 들어, 재조합 인간 루브리신)의 농도를 결정하는 방법이 기재되어 있으며, 상기 방법은 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 수행하는 단계 및 조성물내 글리코실화된 폴리펩타이드의 단백질 농도를 결정하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물내 글리코실화된 폴리펩타이드의 단백질 농도는 SEC에 의해 결정 시, 1.50 mg/ml, 1.60 mg/ml, 1.70 mg/ml, 1.80 mg/ml, 1.90 mg/ml, 2.00 mg/ml, 2.10 mg/ml, 2.20 mg/ml, 2.30 mg/ml, 2.40 mg/ml, 2.50 mg/ml, 3.00 mg/ml, 또는 1.60 mg/ml 내지 2.40 mg/ml이다.

본 발명의 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 변성 조건 하에 환원 모세관 전기영동(rCE-SDS)을 수행하는 것을 포함하는 단계를 포함한다. 이러한 실시형태에서, rh루브리신 폴리펩타이드 및 그의 단편은 나트륨 도데실 설페이트(SDS)로 변성되고, 메르캅토에탄올로 환원된다. 이론에 얽매이지 않으면서, SDS는 단백질의 고유 전하를 가리고, 단위 질량 당 일정한 전하를 갖는 복합체를 형성한다고 믿어진다. 이러한 복합체는 전기장에서 친수성 체질 중합체를 통한 이동에 의해 그들의 크기에 따라 분리된다. 주요 피크 및 변이체는 상대 시간-보정 피크 면적 결정에 의해 정량화된다. rCE-SDS는 단백질 단편을 제거하고 조성물의 순도를 높이는 데 사용될 수 있다.

일부 실시형태에서, 본 발명의 방법에 의해 정제된 재조합적으로 생성된 글리코실화된 폴리펩타이드를 포함하는 용액의 순도는 변성 조건 하에 환원 모세관 전기영동(rCE-SDS)에 의해 결정될 수 있다. rCE-SDS는 폴리펩타이드가 나트륨 도데실 설페이트(SDS)로 변성되고 메르캅토에탄올로 환원되는 크로마토그래피 기술이다. 이론에 얽매이지 않으면서, SDS는 폴리펩타이드의 고유 전하를 가리고, 단위 질량 당 일정한 전하를 갖는 복합체를 형성한다고 믿어진다. 이러한 복합체는 전기장에서 친수성 체질 중합체를 통한 이동에 의해 그들의 크기에 따라 분리된다. 주요 피크 및 변이체는 상대 시간-보정 피크 면적 결정에 의해 정량화된다. rCE-SDS는 조성물, 예를 들어, 재조합적으로 생성된 글리코실화된 폴리펩타이드, 예를 들어 재조합 인간 루브리신을 포함하는 조성물의 순도(예를 들어, 저분자량 불순물, 예를 들어, 단백질 단편의 백분율)를 측정하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법에 의해 생성되거나 정제된 재조합적으로 생성된 글리코실화된 폴리펩타이드의 순도(예를 들어, 본원에 기재된 방법에 의해 생성된 재조합적으로 생성된 글리코실화된 폴리펩타이드를 포함하는 조성물에서의 단백질 단편의 합)는 rCE-SDS에 의해 결정 시 약 10% 이하, 약 5% 이하, 약 4% 이하, 약 3% 이하, 약 2% 이하, 또는 약 1% 이하, 바람직하게는 1% 미만(예를 들어, rCE-SDS에 의해 결정 시, 재조합적으로 생성된 글리코실화된 폴리펩타이드의 총량의 약 10% 이하, 약 5% 이하, 약 4% 이하, 약 3% 이하, 약 2% 이하, 또는 약 1% 이하, 바람직하게는 1% 미만)이다. 따라서, 또한 본원에는 본원에 기재된 방법을 사용하여 정제된 재조합적으로 생성된 글리코실화된 폴리펩타이드를 포함하는 조성물(예를 들어, 약제학적 조성물)에서 재조합적으로 생성된 글리코실화된 폴리펩타이드(예를 들어, 재조합 인간 루브리신)의 단백질 단편의 퍼센트를 결정하는 방법이 기재되어 있으며, 상기 방법은 rCE-SDS를 수행하는 단계 및 rCE-SDS에 의해 결정 시 단백질 단편의 퍼센트를 계산하는 단계를 포함한다. 또한 본원에는 본원에 기재된 방법을 사용하여 정제된 재조합적으로 생성된 글리코실화된 폴리펩타이드를 포함하는 조성물(예를 들어, 약제학적 조성물)에서 재조합적으로 생성된 글리코실화된 폴리펩타이드(예를 들어, 재조합 인간 루브리신)의 퍼센트 순도를 결정하는 방법이 기재되어 있으며, 상기 방법은 rCE-SDS를 수행하는 단계 및 rCE-SDS에 의해 결정된 바와 같은 퍼센트 순도를 계산하는 단계를 포함한다.

정제된 단백질

추가 양태에서, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 정제된 재조합적으로 생성된 글리코실화된 폴리펩타이드에 관한 것이다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 정제된 루브리신에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 정제된 재조합적으로 생성된 글리코실화된 폴리펩타이드에 관한 것으로, 여기서 재조합적으로 생성된 글리코실화된 폴리펩타이드는 서열번호 1 또는 2에 대해 적어도 80% 서열 동일성, 예를 들어, 서열번호 1 또는 2의 아미노산 25-1404에 대해 적어도 85%, 특히 적어도 90%, 예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 정제된 재조합적으로 생성된 글리코실화된 폴리펩타이드에 관한 것으로, 여기서 재조합적으로 생성된 글리코실화된 폴리펩타이드는 서열번호 1 또는 2의 아미노산 25-1404를 갖는다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 정제된 재조합적으로 생성된 글리코실화된 폴리펩타이드, 예를 들어, 루브리신을 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 정제된 실질적으로 순수한 재조합적으로 생성된 글리코실화된 폴리펩타이드, 예를 들어, 루브리신을 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 방법에 의해 정제된 재조합적으로 생성된 글리코실화된 폴리펩타이드는 서열번호 1 또는 2에 대해 적어도 85% 서열 동일성, 특히 서열번호 1 또는 2의 아미노산 25-1404에 대해 적어도 90%, 예를 들어, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 방법에 의해 정제된 재조합적으로 생성된 글리코실화된 폴리펩타이드는 서열번호 1 또는 2의 아미노산 25-1404를 포함한다.

본원에 사용된 바와 같이, 재조합적으로 생성된 글리코실화된 폴리펩타이드와 관련하여 용어 "실질적으로 순수한"은 재조합적으로 생성된 글리코실화된 폴리펩타이드가 10중량% 미만, 바람직하게는 5중량% 미만, 보다 바람직하게는 3중량% 미만, 보다 바람직하게는 1중량% 미만, 가장 바람직하게는 0.1중량% 미만의 임의의 잔류 오염물(예를 들어, 폴리뉴클레오타이드, 숙주 단백질, 표적 단백질 응집체, 및/또는 이의 제조 과정에서 발생하는 공정 불순물)을 포함함을 의미한다. 예를 들어, 재조합적으로 생성된 글리코실화된 폴리펩타이드는, 현재 당업계에 공지되어 있고 일반적으로 허용되는 방법에 의해 측정 시 90 중량% 초과의 순도를 갖는다는 점에서 실질적으로 순수한 것으로 간주될 수 있고, 나머지 10 중량% 미만의 물질은 오염물(예를 들어, 폴리뉴클레오타이드, 숙주 단백질, 표적 단백질 응집체, 및/또는 이의 제조 관련 불순물)을 포함한다. 반응 불순물 및/또는 가공 불순물의 존재는 예를 들어, 크로마토그래피, 질량 분석법 또는 qPCR과 같은 당업계에 공지된 분석 기술에 의해 결정될 수 있다.

임의의 정제 단계에서 샘플의 단백질 농도는 임의의 적합한 방법으로 결정될 수 있다. 이러한 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 하기를 포함한다: 1) Lowry 분석법, Bradford 분석법, Smith 분석법, 및 콜로이달 골드 분석법과 같은 비색법; 2) 단백질의 UV 흡수 특성을 이용하는 방법(예를 들어, UV 흡수를 이용하는 크로마토그래피 방법); 및 3) 동일한 겔에 대한 알려진 양의 표준과의 비교에 의존하는 겔의 염색된 단백질 밴드에 기반한 시각적 추정. 예를 들어 문헌[Stoschek (1990), Quantitation of Protein Purification, Methods in Enzymol. 182: 50-68]을 참조한다.

샘플에 존재할 수 있는 오염 단백질뿐만 아니라 표적 단백질은 임의의 적당한 수단으로 모니터링될 수 있다. 바람직하게는, 이 기술은 약 2 백만분율(ppm)(정제되는 단백질의 밀리그램당 나노그램으로 계산됨) 내지 500 ppm의 범위로 오염물을 감지하기에 충분히 민감해야 한다. 예를 들어, 당업계에 잘 알려진 방법인 효소-결합 면역흡착 분석법(ELISA)을 사용하여 제2 단백질에 의한 단백질 오염을 검출할 수 있다. 예를 들어 문헌[Reen (1994), Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA), in Basic Protein and Peptide Protocols, Methods Mol. Biol. 32: 461-466]을 참조하며, 이는 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. 일 양태에서, 이러한 기타 단백질에 의한 단백질 오염은 본원에 기재된 방법 후에, 바람직하게는 적어도 약 2배, 보다 바람직하게는 적어도 약 3배, 보다 바람직하게는 적어도 약 5배, 보다 바람직하게는 적어도 약 10배, 보다 바람직하게는 적어도 약 20배, 보다 바람직하게는 적어도 약 30배, 보다 바람직하게는 적어도 약 40배, 보다 바람직하게는 적어도 약 50배, 보다 바람직하게는 적어도 약 60배, 보다 바람직하게는 적어도 약 70배, 보다 바람직하게는 적어도 약 80배, 보다 바람직하게는 적어도 약 90배, 및 가장 바람직하게는 적어도 약 100배 감소될 수 있다.

또 다른 양태에서, 본원에 기재된 방법 이후에 기타 오염 단백질에 의한 표적 단백질의 오염은 약 10,000 ppm 이하, 바람직하게는 약 2500 ppm 이하, 보다 바람직하게는 약 400 ppm 이하, 보다 바람직하게는 약 360 ppm 이하, 보다 바람직하게는 약 320 ppm 이하, 보다 바람직하게는 약 280 ppm 이하, 보다 바람직하게는 약 240 ppm 이하, 보다 바람직하게는 약 200 ppm 이하, 보다 바람직하게는 약 160 ppm 이하, 보다 바람직하게는 약 140 ppm 이하, 보다 바람직하게는 약 120 ppm 이하, 보다 바람직하게는 약 100 ppm 이하, 보다 바람직하게는 약 80 ppm 이하, 보다 바람직하게는 약 60 ppm 이하, 보다 바람직하게는 약 40 ppm 이하, 보다 바람직하게는 약 30 ppm 이하, 보다 바람직하게는 약 20 ppm 이하, 보다 바람직하게는 약 10 ppm 이하, 및 가장 바람직하게는 약 5 ppm 이하이다. 이러한 오염은 검출 불가능한 수준 내지 약 10 ppm 또는 약 10 ppm 내지 약 10,000 ppm의 범위일 수 있다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 고도로 글리코실화된 단백질(예를 들어, 재조합 인간 루브리신, 예를 들어, 본원에 기재된 방법에 의해 생성되거나 정제된 재조합 인간 루브리신)을 포함하는 조성물에서, 오염 단백질(예를 들어, 숙주 세포 단백질)의 수준은 1,000 ng/mg 고도로 글리코실화된 단백질(ng/mg) 미만, 900 ng/mg 미만, 800 ng/mg 미만, 700 ng/mg 미만, 600 ng/mg 미만, 500 ng/mg 미만, 400 ng/mg 미만, 300 ng/mg 미만, 200 ng/mg 미만, 또는 100 ng/mg 미만이다.

특정 실시형태에서, 본 발명은 정제된 재조합 루브리신을 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서 루브리신 응집체 함량은 2% 이하(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 SE-HPLC(SEC) 또는 당업자에게 공지된 임의의 다른 상기 방법으로 측정 시)이고, 루브리신 단편 함량은 10% 이하(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 SEC로 측정 시)이고, 숙주 세포 단백질 함량은 예를 들어 ELISA로 측정 시 300 ng/mg 이하이고, 잔류 DNA 함량은 예를 들어 qPCR로 측정 시 200,000 pg/mg 이하이다.

특정 실시형태에서, 본 발명은 재조합 루브리신(예를 들어, 본원에 기재된 방법에 의해 생성되거나 정제된 재조합 루브리신)을 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서 루브리신 응집체 함량은 2% 이하(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 SE-HPLC(SEC) 또는 당업자에게 공지된 임의의 다른 상기 방법으로 측정 시)이고, 루브리신 단편 함량은 10% 이하(예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 SEC로 측정 시)이고, 숙주 세포 단백질 함량은 예를 들어 ELISA로 측정 시 300 ng/mg 이하이고, 잔류 DNA 함량은 예를 들어 qPCR로 측정 시 200,000 pg/mg 이하이다.

본원에 기재된 방법을 사용하여 생성된 정제된 재조합 루브리신을 포함하는 조성물의 숙주 세포 단백질 함량은 임의의 적합한 방법, 예를 들어, ELISA를 사용하여 결정될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 정제된 재조합 루브리신을 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서 숙주 세포 단백질 함량은 ELISA에 의해 측정 시, 재조합 루브리신(ng/mg)의 ≤ 1,000 ng/mg, ≤ 900 ng/mg, ≤ 800 ng/mg, ≤ 700 ng/mg, ≤ 600 ng/mg, ≤ 500 ng/mg, ≤ 400 ng/mg, ≤ 300 ng/mg, ≤ 250 ng/mg, ≤ 200 ng/mg, ≤ 150 ng/mg, 또는 ≤ 100 ng/mg(예를 들어, ≤ 1,000 ng 숙주 세포 단백질/mg 원료의약품)이다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 재조합 루브리신(예를 들어, 본원에 기재된 방법에 의해 생성되거나 정제된 재조합 루브리신)을 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서 숙주 세포 단백질 함량은 ELISA에 의해 측정 시, ≤ 1,000 ng/mg, ≤ 900 ng/mg, ≤ 800 ng/mg, ≤ 700 ng/mg, ≤ 600 ng/mg, ≤ 500 ng/mg, ≤ 400 ng/mg, ≤ 300 ng/mg, ≤ 250 ng/mg, ≤ 200 ng/mg, ≤ 150 ng/mg, 또는 ≤ 100 ng/mg(예를 들어, ≤ 1,000 ng 숙주 세포 단백질/mg 원료의약품)이다.

정제된 재조합 루브리신을 포함하는 조성물의 잔류 숙주 세포 DNA(예를 들어, CHO 세포 DNA)에 의한 오염은 숙주 세포 게놈 전체에 분산된 반복 서열의 정량적 중합효소 연쇄 반응(qPCR) 증폭에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, CHO 세포 게놈은 포유동물 게놈당 약 300,000개 사본이 존재하는 Alu형 반복의 서열을 포함한다. 이러한 반복은 CHO DNA의 대리 마커 역할을 할 수 있다. 증폭을 위한 정방향 및 역방향 프라이머 역할을 하는 올리고뉴클레오타이드는 이 반복 서열의 보존된 100개 염기쌍 코어 영역을 정의한다. 샘플의 총 잔류 DNA는 오염 DNA에 의해 생성된 반응을 게놈 참조 표준, 예를 들어 CHO K1PD 모 세포로부터 단리된 CHO 게놈 DNA 참조 표준에 의해 생성된 반응과 비교하여 결정할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 발명은 정제된 재조합 루브리신을 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서 숙주 세포 잔류 DNA 함량은 qPCR에 의해 측정 시, ≤ 300,000 pg/mg, ≤ 200,000 pg/mg, ≤ 100,000 pg/mg, ≤ 50,000 pg/mg, ≤ 10,000 pg/mg, ≤ 5,000 pg/mg, ≤ 1,000 pg/mg, ≤ 500 pg/mg, ≤ 100 pg/mg, ≤ 50 pg/mg, ≤ 10 pg/mg, 또는 ≤ 5 pg/mg(예를 들어, ≤ 300,000 pg 숙주 세포 DNA/mg 원료의약품)이다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 발명은 재조합 루브리신(예를 들어, 본원에 기재된 방법에 의해 생성되거나 정제된 재조합 루브리신)을 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서 숙주 세포 잔류 DNA 함량은 qPCR에 의해 측정 시, ≤ 300,000 pg/mg, ≤ 200,000 pg/mg, ≤ 100,000 pg/mg, ≤ 50,000 pg/mg, ≤ 10,000 pg/mg, ≤ 5,000 pg/mg, ≤ 1,000 pg/mg, ≤ 500 pg/mg, ≤ 100 pg/mg, ≤ 50 pg/mg, ≤ 10 pg/mg, 또는 ≤ 5 pg/mg(예를 들어, ≤ 300,000 pg 숙주 세포 DNA/mg 원료의약품)이다.

특정 실시형태에서, 본 발명은 정제된 재조합 루브리신을 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서 조성물의 박테리아 내독소 함량은 박테리아 내독소 테스트(BET), 예를 들어, 리물루스 아메바세포 용해물(LAL) 테스트에 기반하여 결정된다. 박테리아 내독소 함량을 결정하기 위한 분석법은 USP <85> 및 Ph. Eur. 2.6.14에 따라 수행될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 본 발명은 정제된 재조합 루브리신을 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서 박테리아 내독소 함량은 BET에 의해 측정 시, 8 내독소 단위(EU)/mL 미만, 7 EU/mL 미만, 6 EU/mL 미만, 5 EU/mL 미만, 4 EU/mL 미만, 3 EU/mL 미만, 2 EU/mL 미만, 1 EU/mL 미만, 0.9 EU/mL 미만, 0.8 EU/mL 미만, 0.7 EU/mL 미만, 0.6 EU/mL 미만, 0.5 EU/mL 미만, 0.4 EU/mL 미만, 0.3 EU/mL 미만, 0.2 EU/mL 미만, 0.1 EU/mL 미만, 0.09 EU/mL 미만, 0.08 EU/mL 미만, 0.07 EU/mL 미만, 0.06 EU/mL 미만, 0.05 EU/mL 미만, 0.04 EU/mL 미만, 0.03 EU/mL 미만, 0.02 EU/mL, 또는 0.01 EU/mL 미만이다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 재조합 루브리신(예를 들어, 본원에 기재된 방법에 의해 생성되거나 정제된 재조합 루브리신)을 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서 박테리아 내독소 함량은 BET에 의해 측정 시, 8 내독소 단위(EU)/mL 미만, 7 EU/mL 미만, 6 EU/mL 미만, 5 EU/mL 미만, 4 EU/mL 미만, 3 EU/mL 미만, 2 EU/mL 미만, 1 EU/mL 미만, 0.9 EU/mL 미만, 0.8 EU/mL 미만, 0.7 EU/mL 미만, 0.6 EU/mL 미만, 0.5 EU/mL 미만, 0.4 EU/mL 미만, 0.3 EU/mL 미만, 0.2 EU/mL 미만, 0.1 EU/mL 미만, 0.09 EU/mL 미만, 0.08 EU/mL 미만, 0.07 EU/mL 미만, 0.06 EU/mL 미만, 0.05 EU/mL 미만, 0.04 EU/mL 미만, 0.03 EU/mL 미만, 0.02 EU/mL 미만, 또는 0.01 EU/mL 미만이다.

특정 실시형태에서, 본 발명은 정제된 재조합 루브리신을 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서 조성물의 미생물 함량은 미생물 계수 테스트(MET), 예를 들어, 총 호기성 미생물 계수(TAMC) 테스트 또는 총 조합된 효모/곰팡이 계수(TYMC) 테스트에 기초하여 결정된다. MET는 Ph. Eur. chapters 2.6.12 / 2.6.13, USP chapters <61> / <62> and JP chapters <4.05> I / II의 미생물학적 방법에 따라 수행될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 본 발명은 정제된 재조합 루브리신을 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서 총 호기성 미생물 함량은 TAMC 테스트로 측정 시, 1 콜로니 형성 단위(CFU)/mL 미만, 1 CFU/2 mL 미만, 1 CFU/3 mL 미만, 1 CFU/4 mL 미만, 1 CFU/5 mL 미만, 1 CFU/6 mL 미만, 1 CFU/7 mL 미만, 1 CFU/8 mL 미만, 1 CFU/9 ml 미만, 또는 1 CFU/10 ml 미만이다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 재조합 루브리신(예를 들어, 본원에 기재된 방법에 의해 생성하거나 정제된 재조합 루브리신)을 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서 총 호기성 미생물 함량은 TAMC 테스트로 측정 시, 1 콜로니 형성 단위(CFU)/mL 미만, 1 CFU/2 mL 미만, 1 CFU/3 mL 미만, 1 CFU/4 mL 미만, 1 CFU/5 mL 미만, 1 CFU/6 mL 미만, 1 CFU/7 mL 미만, 1 CFU/8 mL 미만, 1 CFU/9 ml 미만, 또는 1 CFU/10 ml 미만이다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 정제된 재조합 루브리신을 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서 총 효모 및 곰팡이 함량은 TYMC 테스트로 측정 시, 1 CFU/mL 미만, 1 CFU/2 mL 미만, 1 CFU/3 mL 미만, 1 CFU/4 mL 미만, 1 CFU/5 mL 미만, 1 CFU/6 mL 미만, 1 CFU/7 mL 미만, 1 CFU/8 mL 미만, 1 CFU/9 ml 미만, 또는 1 CFU/10 ml 미만이다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 재조합 루브리신(예를 들어, 본원에 기재된 방법에 의해 생성되거나 정제된 재조합 루브리신)을 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서 총 효모 및 곰팡이 함량은 TYMC 테스트로 측정 시, 1 CFU/mL 미만, 1 CFU/2 mL 미만, 1 CFU/3 mL 미만, 1 CFU/4 mL 미만, 1 CFU/5 mL 미만, 1 CFU/6 mL 미만, 1 CFU/7 mL 미만, 1 CFU/8 mL 미만, 1 CFU/9 ml 미만, 또는 1 CFU/10 ml 미만이다.

특정 실시형태에서, 본 발명은 부피 크기가 적어도 약 1,000 L, 적어도 약 1,500 L, 적어도 약 2,000 L, 적어도 약 2,500 L, 또는 적어도 약 3,000 L인 생물반응기에서 생성된 세포 배양물로부터 원료의약품을 정제하는 방법을 제공한다. 따라서, 일부 실시형태에서 본 발명은 원료의약품을 정제하는 방법을 제공하며, 여기서 상기 방법은 부피 크기가 적어도 약 1,000 L, 적어도 약 1,500 L, 적어도 약 2,000 L, 적어도 약 2,500 L, 또는 적어도 약 3,000 L인 생물반응기에서 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 생물반응기에서 세포를 배양한 후, 세포가 수확될 수 있다. 이러한 세포 수확물은 예를 들어, 심층 여과 후 멸균 여과에 의해 수확된다. 그런 다음, 원료의약품은 본원에 기재된 바와 같이 본 발명의 방법에 의해 세포 수확물로부터 정제된다. 특정 실시형태에서, 원료의약품은 재조합 루브리신 또는 다른 뮤신-유사 단백질 또는 뮤신 단백질과 같은 과다하게 글리코실화된 재조합 단백질이다.

일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 하나 이상의 단계들을 포함하며, 여기서 세포는 이후 생물반응기 부피(예를 들어, 적어도 약 1,000 L, 1,500 L, 2,000 L, 2,500 L, 또는 3,000 L인, 생물반응기 부피)의 부피보다 작은 부피에서 사전-배양된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서 상기 방법은 약 10 L, 약 20 L, 약 30 L, 약 40 L, 약 50 L, 약 60 L, 약 70 L, 약 80 L, 약 90 L, 약 100 L, 약 150 L, 약 200 L, 약 250 L, 약 300 L, 약 350 L, 약 400 L, 약 450 L, 약 500 L, 약 550 L, 및/또는 약 600 L의 생물반응기 부피에서 세포를 사전-배양하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 약 1,000 L의 생물반응기 부피에서 세포를 배양하기 전에, 약 10 L의 생물반응기 부피에서 세포를 사전-배양하는 단계 및 약 92 L의 생물반응기 부피에서 세포를 사전-배양하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 약 2,000 L의 생물반응기 부피에서 세포를 배양하기 전에, 약 20 L의 생물반응기 부피에서 세포를 사전-배양하는 단계, 약 100 L의 생물반응기 부피에서 세포를 사전-배양하는 단계, 및 약 400 L의 생물반응기 부피에서 세포를 사전-배양하는 단계를 포함한다.

특정 실시형태에서, 본 발명은 세포 배양물로부터 적어도 약 1.5 g/L의 원료의약품(예를 들어, 약 1.5 g/L, 1.6 g/L, 1.7 g/L, 1.8 g/L, 1.9 g/L, 2.0 g/L, 2.1 g/L, 2.2 g/L, 2.3 g/L, 2.4 g/L, 2.5 g/L, 2.6 g/L, 2.7 g/L, 2.8 g/L, 2.9 g/L, 약 3.0 g/L, 약 1.5 g/L 내지 약 3.0 g/L, 약 1.5 g/L 내지 약 3.5 g/L, 약 2.0 g/L 내지 약 3.0 g/L, 약 1.5 g/L 내지 약 2.5 g/L, 약 1.6 mg/ml 내지 약 2.4 mg/ml, 또는 약 2.0 g/L 내지 약 4.0 g/L)을 정제하는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 원료의약품은 재조합 루브리신 또는 다른 뮤신-유사 단백질 또는 뮤신 단백질과 같은 과다하게 글리코실화된 재조합 단백질이다. 따라서, 일부 실시형태에서 본 발명은 세포 배양물 부피의 각 단위로부터 소정량의 과다하게 글리코실화된 단백질을 정제하는 방법(예를 들어, 세포 배양물의 각 리터로부터 적어도 약 1.5 g의 과다하게 글리코실화된 단백질을 정제하는 방법)을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법을 사용하여 세포 배양물로부터 정제된 단백질의 양은 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의해 결정된다. 따라서, 일부 실시형태에서, 본 발명은 세포 배양물로부터 SEC에 의해 결정 시, 적어도 약 1.5 g/L(예를 들어, 약 1.5 g/L, 1.6 g/L, 1.7 g/L, 1.8 g/L, 1.9 g/L, 2.0 g/L, 2.1 g/L, 2.2 g/L, 2.3 g/L, 2.4 g/L, 2.5 g/L, 2.6 g/L, 2.7 g/L, 2.8 g/L, 2.9 g/L, 약 3.0 g/L, 약 1.5 g/L 내지 약 3.0 g/L, 약 1.5 g/L 내지 약 3.5 g/L, 약 2.0 g/L 내지 약 3.0 g/L, 약 1.6 mg/ml 내지 약 2.4 mg/ml, 약 1.5 g/L 내지 약 2.5 g/L, 또는 약 2.0 g/L 내지 약 4.0 g/L)의 원료의약품을 정제하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 발명은 세포 배양물로부터 SEC에 의해 결정 시, 적어도 약 1.5 g/L(예를 들어, 약 1.5 g/L, 1.6 g/L, 1.7 g/L, 1.8 g/L, 1.9 g/L, 2.0 g/L, 2.1 g/L, 2.2 g/L, 2.3 g/L, 2.4 g/L, 2.5 g/L, 2.6 g/L, 2.7 g/L, 2.8 g/L, 2.9 g/L, 약 3.0 g/L, 약 1.5 g/L 내지 약 3.0 g/L, 약 1.5 g/L 내지 약 3.5 g/L, 약 1.6 mg/ml 내지 약 2.4 mg/ml, 약 2.0 g/L 내지 약 3.0 g/L, 약 1.5 g/L 내지 약 2.5 g/L, 또는 약 2.0 g/L 내지 약 4.0 g/L)의 원료의약품을 정제하는 방법을 제공하며, 여기서 세포 배양물 부피는 적어도 약 1,000 L, 적어도 약 1,500 L, 적어도 약 2,000 L, 적어도 약 2,500 L, 적어도 약 3,000 L, 약 1,000 L, 약 1,500 L, 약 2,000 L, 약 2,500 L, 또는 약 3,000 L이다.

효능

일부 실시형태에서, 본원에 기재된 본 발명은 특정 효능 특성을 갖는 rh루브리신을 포함하는 조성물을 생성하는 데 효과적인 방법을 제공한다. 본원에 기재된 조성물의 효능은 예를 들어, 세포 접착 분석, 예를 들어, A375 세포 접착 분석으로 측정될 수 있다. 예를 들어, 고도로 글리코실화된 단백질의 효능은 A375 인간 흑색종 세포가 세포-조직 배양 미세역가 플레이트의 표면에 부착되는 것을 억제하는 능력을 기반으로 결정될 수 있다. 고도로 글리코실화된 단백질 샘플이 참조 물질과 비교하여 A375 세포의 부착을 용량-의존적으로 억제하는 것을 보여주는 경우, 그의 동일성이 확인될 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법을 사용하여 정제된 고도로 글리코실화된 단백질을 포함하는 조성물은 A375 세포 접착 분석으로 측정 시, 참조 물질의 생물학적 활성에 비해 50% 내지 150%(예를 들어, 50%, 75%, 100%, 125%, 또는 150%)의 효능을 나타낸다. 일 양태에서, 본원에 기재된 방법을 사용하여 정제된 재조합 루브리신을 포함하는 조성물의 효능을 결정하는 방법이 본원에 개시되어 있으며, 상기 효능을 결정하는 방법은 A375 세포 접착 분석을 수행하는 단계 및 참조 표준에 비해 재조합 루브리신을 포함하는 조성물의 활성을 측정하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 재조합 루브리신을 포함하는 조성물은 A375 세포 접착 분석으로 측정 시, 참조 물질(예를 들어, 정제된 재조합 루브리신의 참조 샘플)의 활성에 비해, 50% 내지 150%(예를 들어, 50%, 75%, 100%, 125%, 또는 150%)의 활성을 나타낸다.

일부 실시형태에서, 본원에 기재된 본 발명은 특정 효능 특성을 갖는 rh루브리신을 포함하는 조성물을 생성하는 데 효과적인 방법을 제공한다. 본원에 기재된 조성물의 효능은 예를 들어, 리포터 세포 분석, 예를 들어, NF-κB 리포터 세포 분석으로 측정될 수 있다. 예를 들어, 고도로 글리코실화된 단백질의 효능은 NF-κB-매개 리포터 유전자(예를 들어, 루시페라제 또는 Lucia^TM) 발현을 증가시키는 그의 능력을 기반으로 결정될 수 있다. 고도로 글리코실화된 단백질 샘플이 참조 물질과 비교하여 NF-κB-매개 리포터 유전자 발현의 용량-의존적 증가를 나타내면, 그의 동일성이 확인될 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법을 사용하여 생성되거나 정제된 고도로 글리코실화된 단백질을 포함하는 조성물은 리포터 세포 분석, 예를 들어, NF-κB 리포터 세포 분석으로 측정 시, 참조 물질의 생물학적 활성에 비해, 50% 내지 150%(예를 들어, 50%, 75%, 100%, 125%, 또는 150%)의 효능을 나타낸다. 일 양태에서, 본원에 기재된 방법을 사용하여 생성되거나 정제된 재조합 루브리신을 포함하는 조성물의 효능을 결정하는 방법이 본원에 개시되어 있으며, 상기 효능을 결정하는 방법은 NF-κB 리포터 세포 분석을 수행하는 단계 및 참조 표준에 비해, 재조합 루브리신을 포함하는 조성물의 활성(예를 들어, 리포터 유전자 발현으로 측정 시)을 측정하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 재조합 루브리신을 포함하는 조성물은 NF-κB 리포터 세포 분석으로 측정 시, 참조 물질(예를 들어, 정제된 재조합 루브리신의 참조 샘플)의 활성에 비해, 50% 내지 150%(예를 들어, 50%, 75%, 100%, 125%, 또는 150%)의 활성을 나타낸다.

본원에 기재된 조성물의 효능은 예를 들어, 세포 표면 단백질 결합 분석, 예를 들어, 세포 표면 수용체 클러스터 결정인자 44(CD44) 결합 분석으로 측정될 수 있다. 예를 들어, 고도로 글리코실화된 단백질의 효능은 ELISA 및 표면 플라즈몬 공명으로 측정 시, CD44에 대한 결합에 대해 경쟁하는 그의 능력을 기반으로 결정될 수 있다(예를 들어, 문헌[Al-Sharif et al., (2015) "Lubricin/Proteoglycan 4 Binding to CD44 Receptor: A Mechanism of Lubricin's suppression of Pro-inflammatory Cytokine Induced Synoviocyte Proliferation," Arthritis Rheumatol. 67(6):1503-13]에 기재된 바와 같음). 고도로 글리코실화된 단백질 샘플이 참조 물질과 비교하여 CD44에 대한 경쟁적 결합을 보여주는 경우, 그의 동일성이 확인될 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법을 사용하여 정제된 고도로 글리코실화된 단백질을 포함하는 조성물은 CD44 결합 분석으로 측정 시, 참조 물질의 생물학적 활성에 비해 50% 내지 150%(예를 들어, 50%, 75%, 100%, 125%, 또는 150%)의 효능을 나타낸다. 일 양태에서, 본원에 기재된 방법을 사용하여 정제된 재조합 루브리신을 포함하는 조성물의 효능을 결정하는 방법이 본원에 개시되어 있으며, 상기 효능을 결정하는 방법은 CD44 결합 분석을 수행하는 단계 및 참조 표준에 비해 재조합 루브리신을 포함하는 조성물의 활성을 측정하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 재조합 루브리신을 포함하는 조성물은 CD44 결합 분석으로 측정 시, 참조 물질(예를 들어, 정제된 재조합 루브리신의 참조 샘플)의 활성에 비해, 50% 내지 150%(예를 들어, 50%, 75%, 100%, 125%, 또는 150%)의 활성을 나타낸다.

안정성

일부 실시형태에서, 본원에 기재된 본 발명은 특정한 안정성 특성을 갖는 rh루브리신을 포함하는 조성물을 생성하는 데 효과적인 방법을 제공한다. 특히, 본원에 기재된 방법은 rh루브리신 조성물을 포함하는 안정한 조성물을 생성하는 데 효과적이며, 여기서 조성물의 rh루브리신의 약 15% 이하가 주어진 온도에서 주어진 기간에 걸쳐 단편화를 겪는다. 본원에 사용된 바와 같이, "안정한 rh루브리신 조성물" 또는 "안정한 rh루브리신의 조성물"은 초기 조성물의 rh루브리신의 15% 이하가 주어진 온도에서 주어진 기간에 걸쳐 단편화를 겪는, rh루브리신을 포함하는 조성물을 지칭한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 안정한 rh루브리신 조성물을 생성하는 데 효과적이며, 여기서 초기 조성물의 rh루브리신의 약 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 9.5%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 또는 15% 이하가 주어진 온도에서 주어진 기간에 걸쳐 단편화를 겪는다. rh루브리신의 단편화는 당업계에 공지된 방법, 예를 들어, 크기 배제 크로마토그래피 분석법 또는 변성 조건 하에 환원 모세관 전기영동(rCE-SDS)을 사용하여 측정될 수 있다.

따라서, 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 약 5℃ 이하에서 약 1개월, 약 2개월, 약 3개월, 약 4개월, 약 5개월, 약 6개월, 약 7개월, 약 8개월, 약 9개월, 약 10개월, 약 11개월, 약 12개월, 약 13개월, 약 14개월, 약 15개월, 약 16개월, 약 17개월, 약 18개월, 약 19개월, 약 20개월, 약 21개월, 약 22개월, 약 23개월, 약 24개월, 약 25개월, 약 26개월, 약 27개월, 약 28개월, 약 29개월, 약 30개월, 약 12개월 내지 약 24개월, 약 14개월 내지 약 24개월, 약 16개월 내지 약 24개월, 약 18개월 내지 약 24개월, 약 20개월 내지 약 24개월, 또는 약 18개월 내지 약 26개월 동안 안정한 rh루브리신의 조성물을 생성하는 데 효과적이다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 약 25℃ 이하에서 약 1일, 약 3일, 약 5일, 약 1주, 약 2주, 약 3주, 약 4주, 약 1개월, 약 2개월, 약 3개월, 약 4개월, 약 5개월, 약 6개월, 약 1주 내지 1개월, 약 2주 내지 1개월, 약 3주 내지 1개월, 또는 약 1개월 내지 2개월 동안 안정한 rh루브리신의 조성물을 생성하는 데 효과적이다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 약 40℃ 이하에서 약 1일, 약 3일, 약 5일, 약 1주, 약 2주, 약 3주, 약 4주, 약 1개월, 약 1주 내지 1개월, 약 2주 내지 1개월, 또는 약 3주 내지 1개월 동안 안정한 rh루브리신의 조성물을 생성하는 데 효과적이다. 특정 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 5℃에서 24개월 동안 안정한 rh루브리신의 조성물을 생성하는 데 효과적이다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 25℃에서 1개월 동안 안정한 rh루브리신의 조성물을 생성하는 데 효과적이다. 일부 실시형태에서, rh루브리신의 안정한 조성물은 약 0.15 mg/ml, 약 0.20 mg/ml, 약 0.25 mg/ml, 약 0.30 mg/ml, 약 0.35 mg/ml, 약 0.40 mg/ml, 약 0.45 mg/ml, 약 0.50 mg/ml, 약 0.55 mg/ml, 약 0.60 mg/ml, 또는 약 0.15 mg/ml 내지 약 0.45 mg/ml의 초기 농도를 갖는다.

추가로, 본원에는 약 5℃ 이하에서 약 1개월, 약 2개월, 약 3개월, 약 4개월, 약 5개월, 약 6개월, 약 7개월, 약 8개월, 약 9개월, 약 10개월, 약 11개월, 약 12개월, 약 13개월, 약 14개월, 약 15개월, 약 16개월, 약 17개월, 약 18개월, 약 19개월, 약 20개월, 약 21개월, 약 22개월, 약 23개월, 약 24개월, 약 25개월, 약 26개월, 약 27개월, 약 28개월, 약 29개월, 약 30개월, 약 12개월 내지 약 24개월, 약 14개월 내지 약 24개월, 약 16개월 내지 약 24개월, 약 18개월 내지 약 24개월, 약 20개월 내지 약 24개월, 또는 약 18개월 내지 약 26개월 동안 안정한, 본원에 기재된 방법을 사용하여 생성된 안정한 rh루브리신 조성물이 기재되어 있다. 또한, 본원에는 약 25℃ 이하에서 약 1일, 약 3일, 약 5일, 약 1주, 약 2주, 약 3주, 약 4주, 약 1개월, 약 2개월, 약 3개월, 약 4개월, 약 5개월, 약 6개월, 약 1주 내지 1개월, 약 2주 내지 1개월, 약 3주 내지 1개월, 또는 약 1개월 내지 2개월 동안 안정한, 본원에 기재된 방법을 사용하여 생성된 rh루브리신 조성물이 기재되어 있다. 또한, 본원에는 약 40℃ 이하에서 약 1일, 약 3일, 약 5일, 약 1주, 약 2주, 약 3주, 약 4주, 약 1개월, 약 1주 내지 1개월, 약 2주 내지 1개월, 또는 약 3주 내지 1개월 동안 안정한, 본원에 기재된 방법을 사용하여 생성된 rh루브리신 조성물이 기재되어 있다. 특정 실시형태에서, 본원에는 5℃에서 24개월 동안 안정한, 본원에 기재된 방법을 사용하여 생성된 rh루브리신 조성물이 기재되어 있다. 일부 실시형태에서, 본원에는 25℃에서 1개월 동안 안정한, 본원에 기재된 방법을 사용하여 생성된 rh루브리신 조성물이 기재되어 있다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법을 사용하여 생성된 rh루브리신의 안정한 조성물은 약 0.15 mg/ml, 약 0.20 mg/ml, 약 0.25 mg/ml, 약 0.30 mg/ml, 약 0.35 mg/ml, 약 0.40 mg/ml, 약 0.45 mg/ml, 약 0.50 mg/ml, 약 0.55 mg/ml, 약 0.60 mg/ml, 또는 약 0.15 mg/ml 내지 약 0.45 mg/ml의 초기 농도를 갖는다.

최종 완충제 용액

일부 실시형태에서, 본원에 기재된 rh루브리신 조성물은 예를 들어, 모든 rh루브리신 정제 단계들의 완료 후, 최종 완충제 용액에서 제형화된다. 이러한 최종 완충제 용액은 대상체, 예를 들어, 인간 대상체에 투여하기에 적합하다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 rh루브리신 조성물은 인산나트륨, 염화나트륨, 및 폴리소르베이트(예를 들어 폴리소르베이트 20)를 포함하는 최종 완충제 용액에서 제형화된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 rh루브리신 조성물은 10 mM 인산나트륨, 140 mM 염화나트륨, 및 0.02% (w/v) 폴리소르베이트 20을 포함하는 최종 완충제 용액에서 제형화된다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 rh루브리신 조성물은 인산나트륨(예를 들어, 5 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 5 mM 내지 10 mM, 5 mM 내지 15 mM, 10 mM 내지 15 mM, 또는 10-20 mM 인산나트륨), 염화나트륨(예를 들어, 100 mM, 110 mM, 120 mM, 130 mM, 140 mM, 150 mM, 160 mM, 100 mM 내지 120 mM, 120 mM 내지 140 mM, 130 mM 내지 150 mM, 또는 140 mM 내지 150 mM 염화나트륨), 및 세제(예를 들어, 0.01%, 0.02%, 0.03%, 0.04%, 0.05%, 0.10%, 0.01% 내지 0.10%, 0.01% 내지 0.03%, 0.01% 내지 0.05%, 0.02% 내지 0.04%, 또는 0.02% 내지 0.05% (w/v) 세제, 예를 들어, 폴리소르베이트 20)를 포함하는 최종 완충제 용액에서 제형화된다. 일부 실시형태에서, 본원에는 10 mM 인산나트륨, 140 mM 염화나트륨, 및 0.02% (w/v) 폴리소르베이트 20을 포함하는 최종 완충제 용액에 rh루브리신 조성물을 용해시키는 단계를 포함하는 방법이 기재되어 있다.

본원에 기재된 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법을 사용하여 정제되고, 인산나트륨, 염화나트륨, 및 폴리소르베이트(예를 들어 폴리소르베이트 20)를 포함하는 최종 완충제 용액에서 제형화된 rh루브리신을 포함하는, rh루브리신 조성물은 약 5℃ 이하에서 약 1개월, 약 2개월, 약 3개월, 약 4개월, 약 5개월, 약 6개월, 약 7개월, 약 8개월, 약 9개월, 약 10개월, 약 11개월, 약 12개월, 약 13개월, 약 14개월, 약 15개월, 약 16개월, 약 17개월, 약 18개월, 약 19개월, 약 20개월, 약 21개월, 약 22개월, 약 23개월, 약 24개월, 약 25개월, 약 26개월, 약 27개월, 약 28개월, 약 29개월, 약 30개월, 약 12개월 내지 약 24개월, 약 14개월 내지 약 24개월, 약 16개월 내지 약 24개월, 약 18개월 내지 약 24개월, 약 20개월 내지 약 24개월, 또는 약 18개월 내지 약 26개월 동안 안정하다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법을 사용하여 정제되고, 인산나트륨, 염화나트륨, 및 폴리소르베이트(예를 들어 폴리소르베이트 20)를 포함하는 최종 완충제 용액에서 제형화된 rh루브리신을 포함하는, rh루브리신 조성물은 약 25℃ 이하에서 약 1일, 약 3일, 약 5일, 약 1주, 약 2주, 약 3주, 약 4주, 약 1개월, 약 2개월, 약 3개월, 약 4개월, 약 5개월, 약 6개월, 약 1주 내지 1개월, 약 2주 내지 1개월, 약 3주 내지 1개월, 또는 약 1개월 내지 2개월 동안 안정하다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법을 사용하여 정제되고, 인산나트륨, 염화나트륨, 및 폴리소르베이트(예를 들어 폴리소르베이트 20)를 포함하는 최종 완충제 용액에서 제형화된 rh루브리신을 포함하는, rh루브리신 조성물은 약 40℃ 이하에서 약 1일, 약 3일, 약 5일, 약 1주, 약 2주, 약 3주, 약 4주, 약 1개월, 약 1주 내지 1개월, 약 2주 내지 1개월, 또는 약 3주 내지 1개월 동안 안정하다. 특정 실시형태에서, 본원에 기재된 방법을 사용하여 정제되고, 인산나트륨, 염화나트륨, 및 폴리소르베이트(예를 들어 폴리소르베이트 20)를 포함하는 최종 완충제 용액에서 제형화된 rh루브리신을 포함하는, rh루브리신 조성물은 5℃에서 24개월 동안 안정하다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법을 사용하여 정제되고, 인산나트륨, 염화나트륨, 및 폴리소르베이트(예를 들어 폴리소르베이트 20)를 포함하는 최종 완충제 용액에서 제형화된 rh루브리신을 포함하는, rh루브리신 조성물은 25℃에서 1개월 동안 안정하다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 rh루브리신 조성물은 약 0.15 mg/ml, 약 0.20 mg/ml, 약 0.25 mg/ml, 약 0.30 mg/ml, 약 0.35 mg/ml, 약 0.40 mg/ml, 약 0.45 mg/ml, 약 0.50 mg/ml, 약 0.55 mg/ml, 약 0.60 mg/ml, 또는 약 0.15 mg/ml 내지 약 0.45 mg/ml의 초기 농도를 갖는다.

고도로 글리코실화된 단백질을 포함하는 최종 완충제 용액 또는 최종 용액의 pH는 프로토콜, 예를 들어, USP <791> 및 Ph. Eur. 2.2.3에 따라 측정될 수 있다. 일부 실시형태에서, 최종 완충제 용액은 약 7.0의 pH를 갖는다. 일부 실시형태에서, 최종 완충제 용액은 약 6.9의 pH를 갖는다. 일부 실시형태에서, 최종 완충제 용액은 약 6.5 내지 약 7.5, 약 6.6 내지 약 7.4, 약 6.7 내지 약 7.3, 약 6.8 내지 약 7.2, 약 6.9 내지 약 7.1, 또는 약 6.9 내지 약 7.0의 pH를 갖는다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 최종 완충제 용액은 약 6.5, 약 6.6, 약 6.7, 약 6.8, 약 6.9, 약 7.0, 약 7.1, 약 7.2, 약 7.3, 약 7.4, 또는 약 7.5의 pH를 갖는다.

일부 실시형태에서, 본원에 기재된 rh루브리신 조성물은 동결 건조된다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 rh루브리신 조성물은 동결 건조되고 적절한 온도, 예를 들어, -20℃ 미만 또는 -60℃ 미만(예를 들어, -80℃)에서 저장된다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 재조합적으로 생성된 글리코실화된 폴리펩타이드, 예를 들어, 재조합적으로 생성된 글리코실화 루브리신 단백질을 정제하는 방법은 본원에 기재된 방법을 사용하여 정제된 재조합적으로 생성된 글리코실화된 폴리펩타이드(예를 들어, 재조합적으로 생성된 글리코실화 루브리신 단백질)를 포함하는 조성물을 동결-건조시키는 단계를 포함한다. 따라서, 일부 실시형태에서, 본 발명은 재조합적으로 생성된 글리코실화된 폴리펩타이드, 특히 재조합적으로 생성된 글리코실화 루브리신을 정제하는 방법으로서, 하기 3개의 연속 크로마토그래피 단계들을 포함하는 방법에 관한 것이며: (a) 다중모드 양이온 교환 크로마토그래피(MCC)로 이루어진 제1 크로마토그래피 단계; (b) 다중모드 음이온 교환 크로마토그래피(MAC)로 이루어진 제2 크로마토그래피 단계; 및 (c) 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)로 이루어진 제3 크로마토그래피 단계; 및 (ii) 재조합적으로 생성된 글리코실화된 폴리펩타이드를 동결-건조시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 심층 여과 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 심층 여과 단계는 HIC 단계 전에 수행된다. 일부 실시형태에서, 심층 여과는 적합한 필터, 예를 들어, 셀룰로오스 또는 폴리프로필렌 섬유-기반 필터, 예를 들어, 양으로 하전된 삼중층 B1HC 필터를 사용하여 수행된다.

본 개시내용의 추가의 비제한적인 실시형태는 하기 실시형태에 기재되어 있다(하기 실시형태는 또한 본원에서 논의되고 달리 제공된 바와 같이 루브리신 이외의 당단백질(특히, 적어도 약 25% 이상 글리코실화를 갖는 단백질)에도 적용가능함):

1. 재조합 루브리신 당단백질을 정제하는 방법으로서, 상기 루브리신 당단백질을 함유하는 세포 배양 수확물을, 임의의 순서로 수행되는, 다중모드 양이온 교환 크로마토그래피(MCC), 다중모드 음이온 교환 크로마토그래피(MAC), 및 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)에 적용시키는 단계들을 포함하는, 방법.

3. 실시형태 2에 있어서, 단계 a) 전에, 배양물내 세포를 MgCl₂ 및 엔도뉴클레아제와 접촉시키는 단계 및 세포를 수확하여 상기 세포 배양 수확물을 수득하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.

4. 실시형태 3에 있어서, 상기 배양물내 세포는 약 1,000 L, 약 1,500 L, 약 2,000 L, 또는 약 2,500 L의 배양물 부피로 있는, 방법.

5. 실시형태 2에 있어서, 단계 a) 전에 세포 배양 수확물을 MgCl₂ 및 엔도뉴클레아제와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.

6. 실시형태 5에 있어서, 상기 세포 배양 수확물은 약 1,000 L, 약 1,500 L, 약 2,000 L, 또는 약 2,500 L의 세포 배양물 부피로부터 유래되는, 방법.

7. 실시형태 3 또는 5에 있어서, 상기 엔도뉴클레아제는 Benzonase® 엔도뉴클레아제인, 방법.

8. 실시형태 5에 있어서, MgCl₂ 및 엔도뉴클레아제와의 상기 접촉 전에 세포 배양 수확물을 2~8℃까지 냉각시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.

9. 실시형태 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서, 다중모드 음이온 교환 크로마토그래피(MAC) 단계 후 및 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 단계 전에 바이러스 불활성화 단계를 추가로 포함하는, 방법.

10. 실시형태 9에 있어서, 상기 바이러스 불활성화 단계는 단계 b)에서 수득된 용액의 pH를 약 3.4 - 3.6로 조정하는 단계를 포함하는, 방법.

11. 실시형태 10에 있어서, 상기 용액을 적어도 1시간 동안 인큐베이션한 후, 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 단계 전에 pH를 약 7.0으로 조정하는, 방법.

12. 실시형태 9 내지 11 중 어느 하나에 있어서, 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 단계 전에 심층 여과 단계를 추가로 포함하는, 방법.

13. 실시형태 12에 있어서, 상기 심층 여과 단계가 바이러스 불활성화 단계에 후속하는, 방법.

14. 실시형태 1 내지 13 중 어느 하나에 있어서, 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 단계 후 바이러스 제거 단계를 포함하는, 방법.

15. 실시형태 14에 있어서, 상기 바이러스 제거 단계는 나노여과를 포함하는, 방법.

16. 실시형태 14 또는 15에 있어서, 바이러스 제거 단계 후 한외여과 단계를 추가로 포함하는, 방법.

17. 실시형태 14 내지 16 중 어느 하나에 있어서, 바이러스 제거 단계 후 제2 바이러스 불활성화 단계를 포함하는, 방법.

18. 실시형태 17에 있어서, 상기 제2 바이러스 불활성화 단계는 디메틸우레아 용액을 첨가하는 단계를 포함하는, 방법.

19. 실시형태 17 또는 18에 있어서, 제2 바이러스 불활성화 단계 후 한외여과 단계를 포함하는, 방법.

20. 실시형태 1 또는 2에 있어서, 하나 이상의 한외여과 및/또는 나노여과 단계들을 추가로 포함하는, 방법.

21. 실시형태 1 또는 2에 있어서, 하나 이상의 바이러스 불활성화 단계들을 추가로 포함하는, 방법.

22. 실시형태 1 또는 2에 있어서, 하나 이상의 바이러스 제거 단계들을 추가로 포함하는, 방법.

23. 실시형태 1 내지 22 중 어느 하나에 있어서, 상기 재조합 루브리신 당단백질은 서열번호 1 또는 2의 아미노산 잔기 25-1404의 아미노산 서열을 포함하는, 방법.

24. 실시형태 1 내지 23 중 어느 하나에 있어서, 재조합 루브리신 당단백질의 분자량의 적어도 30%가 글리코시드 잔기로부터 유래되는, 방법.

25. 실시형태 1 내지 24 중 어느 하나에 있어서, 루브리신 당단백질의 O-글리코실화의 적어도 90%가 코어 1 글리코실화인, 방법.

26. 실시형태 1 내지 25 중 어느 하나에 있어서, 루브리신 당단백질은 O-글리칸 종을 포함하며, 여기서 O-글리칸 종은 약 7% 이상 Gal-GalNAc, 약 80% 이상 2,3-NeuAc 코어 1, 약 3% 이상 2*NeuAc 코어 1, 및 약 1% 이상 2,3-NeuGc 코어 1을 포함하는, 방법.

27. 실시형태 1 내지 26 중 어느 하나에 있어서, 루브리신 당단백질이 루브리신 당단백질의 mg 당 약 50 μg 이상 NANA를 포함하는, 방법.

28. 실시형태 1 내지 27 중 어느 하나에 있어서, 루브리신 당단백질이 루브리신 당단백질의 mg 당 약 10 μg 이하 NGNA를 포함하는, 방법.

29. 실시형태 1 내지 28 중 어느 하나에 있어서, 루브리신 당단백질이 루브리신 당단백질의 mg 당 약 100 μg 이상 Gal를 포함하는, 방법.

30. 실시형태 1 내지 29 중 어느 하나에 있어서, 루브리신 당단백질이 루브리신 당단백질의 mg 당 약 100 μg 이상 GalNAc를 포함하는, 방법.

31. 실시형태 1 내지 30 중 어느 하나에 따른 방법에 의해 수득된 재조합 루브리신 당단백질.

32. 실시형태 31에 따른 재조합 루브리신 당단백질 및 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.

33. 실시형태 32에 있어서, 역상 크로마토그래피(RPC)에 의해 측정 시, 약제학적 조성물의 순도가 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상인, 약제학적 조성물.

34. 실시형태 32 또는 33에 있어서, 재조합 루브리신 당단백질의 응집체를 1% 미만으로 포함하는, 약제학적 조성물.

35. 실시형태 32 내지 34 중 어느 하나에 있어서, 재조합 루브리신 당단백질의 단편을 1% 미만으로 포함하는, 약제학적 조성물.

36. 실시형태 32 내지 35 중 어느 하나에 있어서, ≤ 1,000 ng 숙주 세포 단백질/mg 재조합 루브리신 당단백질(ng/mg), ≤ 900 ng/mg, ≤ 800 ng/mg, ≤ 700 ng/mg, ≤ 600 ng/mg, ≤ 500 ng/mg, ≤ 400 ng/mg, ≤ 300 ng/mg, ≤ 250 ng/mg, ≤ 200 ng/mg, ≤ 150 ng/mg, 또는 ≤ 100 ng/mg을 포함하는, 약제학적 조성물.

37. 실시형태 32 내지 36 중 어느 하나에 있어서, ≤ 10,000 pg 숙주 세포 DNA/mg 재조합 루브리신 당단백질(pg/mg), ≤ 5,000 pg/mg, ≤ 1,000 pg/mg, ≤ 500 pg/mg, ≤ 100 pg/mg, ≤ 50 pg/mg, ≤ 10 pg/mg, 또는 ≤ 5 pg/mg을 포함하는, 약제학적 조성물.

38. 실시형태 32 내지 37 중 어느 하나에 있어서, 박테리아 내독소 테스트(BET)에 의해 측정 시, 8 내독소 단위(EU)/mL 미만, 1 EU/mL 미만, 0.1 EU/mL 미만, 또는 0.01 EU/mL 미만을 포함하는, 약제학적 조성물.

39. 실시형태 32 내지 38 중 어느 하나에 있어서, 1 콜로니 형성 단위(CFU)/mL 미만, 1 CFU/2 mL 미만, 1 CFU/3 mL 미만, 1 CFU/4 mL 미만, 1 CFU/5 mL 미만, 1 CFU/6 mL 미만, 1 CFU/7 mL 미만, 1 CFU/8 mL 미만, 1 CFU/9 ml 미만, 또는 1 CFU/10 ml 미만의 총 호기성 미생물 계수(TAMC)를 갖는, 약제학적 조성물.

40. 실시형태 32 내지 39 중 어느 하나에 있어서, 1 콜로니 형성 단위(CFU)/mL 미만, 1 CFU/2 mL 미만, 1 CFU/3 ml 미만, 1 CFU/4 ml 미만, 1 CFU/5 ml 미만, 1 CFU/6 ml 미만, 1 CFU/7 ml 미만, 1 CFU/8 ml 미만, 1 CFU/9 ml 미만, 또는 1 CFU/10 ml 미만의 총 조합된 효모/곰팡이 계수(TYMC)를 갖는, 약제학적 조성물.

41. 실시형태 32 내지 40 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물이 5℃에서 적어도 24개월 동안 안정한, 약제학적 조성물.

42. 실시형태 32 내지 41 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물이 25℃에서 적어도 1개월 동안 안정한, 약제학적 조성물.

43. 실시형태 32 내지 42 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물이 약 0.15 mg 재조합 루브리신 당단백질/ml(mg/ml), 약 0.20 mg/ml, 약 0.25 mg/ml, 약 0.30 mg/ml, 약 0.35 mg/ml, 약 0.40 mg/ml, 약 0.45 mg/ml, 약 0.50 mg/ml, 약 0.55 mg/ml, 약 0.60 mg/ml, 약 0.70 mg/ml, 약 0.8 mg/ml, 약 0.9 mg/ml, 약 1.0 mg/ml, 약 1.5 mg/ml, 약 1.6 mg/ml, 약 1.7 mg/ml, 약 1.8 mg/ml, 약 1.9 mg/ml, 약 2.0 mg/ml, 약 2.1 mg/ml, 약 2.2 mg/ml, 약 2.3 mg/ml, 약 2.4 mg/ml, 약 2.5 mg/ml, 약 2.6 mg/ml, 약 2.7 mg/ml, 약 2.8 mg/ml, 약 2.9 mg/ml, 약 3.0 mg/ml, 약 3.5 mg/ml, 약 4.0 mg/ml, 약 0.15 mg/ml 내지 약 3.0 mg/ml, 약 0.45 mg/ml 내지 약 3.0 mg/ml, 약 0.15 mg/ml 내지 약 0.45 mg/ml, 약 1.5 mg/ml 내지 약 3.0 mg/ml, 약 1.5 mg/ml 내지 약 3.5 mg/ml, 약 2.0 mg/ml 내지 약 3.0 mg/ml, 약 1.5 mg/ml 내지 약 2.5 mg/ml, 또는 약 2.0 mg/ml 내지 약 4.0 mg/ml의 초기 농도를 갖는, 약제학적 조성물.

44. 실시형태 32 내지 43 중 어느 하나의 약제학적 조성물을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 안구 표면 장애의 치료 방법.

45. 실시형태 44에 있어서, 상기 안구 표면 장애가 안구 건조증인, 방법.

46. 하기 단계를 포함하는 재조합 루브리신 당단백질의 생성 방법:

a) 재조합 루브리신 당단백질을 생산하는 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포 클론을 생성시키는 단계,

b) 적합한 조건하에서 CHO 숙주 세포를 배양하여 재조합 루브리신 당단백질을 함유하는 세포 배양물을 얻는 단계, 및

c) 실시형태 1 내지 30 중 어느 하나의 방법에 따라 세포 배양물로부터 재조합 루브리신 당단백질을 정제하는 단계.

47. 하기 단계를 포함하는 재조합 루브리신 당단백질의 생성 방법:

a) 루브리신 당단백질을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 포유동물 숙주 세포를 적합한 조건 하에 배양하는 단계; 및

b) 실시형태 1 내지 30 중 어느 하나의 방법에 따라 세포 배양물로부터 재조합 루브리신 당단백질을 정제하는 단계.

48. 실시형태 47에 있어서, 상기 포유동물 숙주 세포가 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포인, 방법.

49. 실시형태 48에 있어서, CHO 세포는 CHO-M 세포인, 방법.

50. 하기 단계를 포함하는, 정제된 재조합 인간 루브리신 당단백질의 생산 방법으로서,

i) 재조합 인간 루브리신(rh루브리신)을 생산할 수 있는 포유동물 세포를 액체 배지 내로 배양시키는 단계; 및

ii) 하기 하나 이상의 단계들을 포함하는 정제 공정에 의해 rh루브리신을 농축, 정제 및 제형화하는 단계: 다중모드 양이온 교환 크로마토그래피(MCC), 다중모드 음이온 교환 크로마토그래피(MAC), 및/또는 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC),

여기서, 생성된 rh루브리신이 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법: (a) 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열의 아미노산 25-1404; (b) 전장 및 자연 발생 루브리신과 실질적으로 동일한 활성을 갖는, 서열번호 1의 서열의 아미노산 25-1404에 대해 적어도 75% 동일한 아미노산 서열을 갖는 rh루브리신의 기능적으로 동등한 변이체; 및 (c) 서열번호 3의 글리코실화된 반복부를 포함하는 기능적으로 동일한 루브리신 단편.

51. 실시형태 50에 있어서, 액체 배지를 다중모드 양이온 교환 크로마토그래피(MCC)에 적용하기 전에 액체 배지에 엔도뉴클레아제를 첨가하는 단계를 포함하는, 방법.

52. 실시형태 50 또는 51에 있어서, 상기 MCC, MAC, 및 HIC 단계들이 연속적인, 방법.

53. 실시형태 50 내지 52 중 어느 하나에 있어서, MCC 크로마토그래피 단계 후 rh루브리신의 회수율이 약 45~75%인, 방법.

54. 실시형태 52에 있어서, MAC 크로마토그래피 단계 후 rh루브리신의 회수율이 약 80~90%인, 방법.

55. 실시형태 52에 있어서, HIC 크로마토그래피 단계 후 rh루브리신의 회수율이 약 93~100%인, 방법.

56. 실시형태 50 내지 55 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 바이러스 불활성화 단계를 포함하는, 방법.

57. 실시형태 56에 있어서, 적어도 하나의 바이러스 불활성화 단계가 크로마토그래피 단계로부터의 용리액의 pH를 약 3.4~3.6의 pH로 조정하는 단계를 포함하는, 방법.

58. 실시형태 56에 있어서, 적어도 하나의 바이러스 불활성화 단계가 크로마토그래피 단계로부터의 용리액을 디메틸우레아와 함께 인큐베이션하는 단계를 포함하는, 방법.

59. 실시형태 50 내지 58 중 어느 하나에 있어서, 2개의 바이러스 불활성화 단계를 포함하는, 방법.

60. 실시형태 56에 있어서, 적어도 하나의 바이러스 불활성화 단계가 크로마토그래피 단계로부터의 용리액의 pH를 pH 3.5로 조정하는 단계를 포함하고, 제2 바이러스 불활성화 단계가 별도의 크로마토그래피 단계로부터의 용리액을 디메틸우레아와 함께 인큐베이션하는 단계를 포함하는, 방법.

61. 실시형태 60에 있어서, 제1 바이러스 불활성화 단계 이전의 크로마토그래피 단계가 MAC인, 방법.

62. 실시형태 60 또는 61에 있어서, 제2 바이러스 불활성화 단계 이전의 크로마토그래피 단계가 HIC인, 방법.

63. 실시형태 50 내지 58 중 어느 하나에 있어서, 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 단계 전에 심층 여과 단계를 포함하는, 방법.

64. 실시형태 63에 있어서, 상기 심층 여과 단계가 적어도 하나의 바이러스 불활성화 단계에 후속하는, 방법.

65. 실시형태 50 내지 64 중 어느 하나에 있어서, HIC 단계로부터의 액체 용액을 나노여과하는 단계를 포함하는, 방법.

66. 실시형태 65에 있어서, 상기 나노여과가 바이러스 불활성화 전에 일어나는, 방법.

67. 실시형태 50 내지 64 중 어느 하나에 있어서, 크로마토그래피 단계로부터의 액체 용액을 한외여과 및 컴파운딩하는 단계를 포함하는, 방법.

68. 실시형태 56 내지 67 중 어느 하나에 있어서, 제1 바이러스 불활성화 단계 후 rh루브리신의 회수율이 약 90~99%인, 방법.

69. 실시형태 56 내지 68 중 어느 하나에 있어서, 제2 바이러스 불활성화 단계 후 rh루브리신의 회수율이 약 95~99%인, 방법.

70. 실시형태 67 내지 69 중 어느 하나에 있어서, 한외여과 및 컴파운딩 단계 후 rh루브리신의 회수율이 약 92~95%인, 방법.

71. 실시형태 50 내지 70 중 어느 하나에 있어서, 단계 i)가 포유동물 세포를 엔도뉴클레아제로 처리하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.

72. 실시형태 50 내지 70 중 어느 하나에 있어서, 단계 ii)가 하기 단계들을 추가로 포함하는, 방법:

II) rh루브리신을 함유하는 상청액을 평형 크로마토그래피 컬럼에 도입하고, rh루브리신을 함유하는 하나 이상의 분획(들)을 용액 내로 용리하는 단계;

III) 하나 또는 둘 이상의 연속 단계들에서 단계 II로부터의 rh루브리신 함유 용액을 연마하는 단계로서, 각 단계는 제제를 평형 크로마토그래피 컬럼(들) 상에 로딩하고 rh루브리신을 함유하는 하나 이상의 분획(들)을 용리하는 것을 포함하는, 단계;

IV) 단계 III으로부터의 rh루브리신 함유 용액을 바이러스 불활성화시키는 단계;

V) 하나 또는 둘 이상의 연속 단계들에서 단계 IV로부터의 rh루브리신 함유 용액을 연마하는 단계로서, 각 단계는 제제를 평형 크로마토그래피 컬럼(들) 상에 로딩하고 rh루브리신을 함유하는 하나 이상의 분획(들)을 용리하는 것을 포함하는, 단계;

VI) 바이러스 감소 필터를 통해 단계 V로부터의 분획(들)을 통과시키고/시키거나 상기 분획(들)의 바이러스를 바이러스 불활성화제로 불활성화시키는 단계; 및

VII) 적합한 제형 완충제에서 rh루브리신의 제제를 수득하기 위해, 단계 VI으로부터의 분획(들)을 제형화하는 단계.

73. 실시형태 72에 있어서, rh루브리신을 함유하는 상청액을 엔도뉴클레아제로 처리하는 초기 단계 I을 추가로 포함하는, 방법.

74. 실시형태 72 또는 73에 있어서, 정제 방법의 단계 II에서 사용되는 크로마토그래피 칼럼이 양이온 교환 칼럼인, 방법.

75. 실시형태 74에 있어서, 상기 음이온 교환 컬럼이 다중모드 양이온 교환 크로마토그래피(MCC) 컬럼인, 방법.

76. 실시형태 72 내지 75 중 어느 하나에 있어서, 정제 방법의 단계 III에서 사용되는 크로마토그래피 칼럼이 음이온 교환 칼럼인, 방법.

77. 실시형태 76에 있어서, 상기 크로마토그래피 컬럼이 다중모드 음이온-교환 크로마토그래피(MAC) 컬럼인, 방법.

78. 실시형태 72 내지 77 중 어느 하나에 있어서, 정제 방법의 단계 V에서 사용되는 크로마토그래피 칼럼이 소수성 상호작용 컬럼인, 방법.

79. 실시형태 72 내지 78 중 어느 하나에 있어서, 정제 방법의 단계 VI에서 수행되는 바와 같은 샘플의 여과는 샘플을 세제와 접촉시키는 것으로 대체되거나 접촉시키는 것과 조합되는, 방법.

80. 실시형태 72 내지 78 중 어느 하나에 있어서, 정제 방법의 단계 VI에서 수행되는 바와 같은 샘플의 여과는 샘플을 디메틸우레아와 접촉시키는 것으로 대체되거나 접촉시키는 것과 조합되는, 방법.

81. 실시형태 72 내지 80 중 어느 하나에 있어서, 상기 바이러스 불활성화제는 세제 또는 디메틸우레아인, 방법.

82. 실시형태 72 내지 81 중 어느 하나에 있어서, rh루브리신의 제형화된 제제를 적합한 용기에 채우고 샘플을 동결 건조하는 단계 VIII)을 추가로 포함하는, 방법.

83. 실시형태 72 내지 81 중 어느 하나에 있어서, 단계 VI으로부터의 분획(들)을 한외여과/정용여과로 처리하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.

84. 실시형태 83에 있어서, rh루브리신의 제형화된 제제를 적합한 용기에 채우고 샘플을 동결 건조하는 단계 VIII)을 추가로 포함하는, 방법.

85. 실시형태 50 내지 84 중 어느 하나에 있어서, rh루브리신의 분자량의 적어도 30%가 글리코시드 잔기로부터 유래하는, 방법.

86. 실시형태 50 내지 85 중 어느 하나에 있어서, rh루브리신의 O-글리코실화의 적어도 90%가 코어 1 글리코실화인, 방법.

87. 실시형태 50 내지 86 중 어느 하나에 있어서, rh루브리신은 O-글리칸 종을 포함하며, 여기서 O-글리칸 종은 약 7% 이상 Gal-GalNAc, 약 80% 이상 2,3-NeuAc 코어 1, 약 3% 이상 2*NeuAc 코어 1, 및 약 1% 이상 2,3-NeuGc 코어 1을 포함하는, 방법.

88. 실시형태 50 내지 87 중 어느 하나에 있어서, rh루브리신은 루브리신 당단백질의 mg 당 약 50 μg 이상 NANA를 포함하는, 방법.

89. 실시형태 50 내지 88 중 어느 하나에 있어서, rh루브리신은 루브리신 당단백질의 mg 당 약 10 μg 이하 NGNA를 포함하는, 방법.

90. 실시형태 50 내지 89 중 어느 하나에 있어서, rh루브리신은 루브리신 당단백질의 mg 당 약 100 μg 이상 Gal를 포함하는, 방법.

91. 실시형태 50 내지 90 중 어느 하나에 있어서, rh루브리신은 루브리신 당단백질의 mg 당 약 100 μg 이상 GalNAc를 포함하는, 방법.

92. 실시형태 50 내지 84 중 어느 하나에 있어서, 상기 rh루브리신은 약제학적으로 허용가능한 담체와 조합되는, 방법.

93. 실시형태 50 내지 92 중 어느 하나의 방법에 따라 정제된 rh루브리신을 포함하는 조성물.

94. 실시형태 93에 있어서, 역상 크로마토그래피(RPC)에 의해 측정 시, 조성물의 순도가 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상인, 조성물.

95. 실시형태 93 또는 94에 있어서, rh루브리신의 응집체를 1% 미만으로 포함하는, 조성물.

96. 실시형태 93 내지 95 중 어느 하나에 있어서, rh루브리신의 단편의 1% 미만을 포함하는, 조성물.

97. 실시형태 93 내지 96 중 어느 하나에 있어서, ≤ 1,000 ng 숙주 세포 단백질/mg rh루브리신(ng/mg), ≤ 900 ng/mg, ≤ 800 ng/mg, ≤ 700 ng/mg, ≤ 600 ng/mg, ≤ 500 ng/mg, ≤ 400 ng/mg, ≤ 300 ng/mg, ≤ 250 ng/mg, ≤ 200 ng/mg, ≤ 150 ng/mg, 또는 ≤ 100 ng/mg을 포함하는, 조성물.

98. 실시형태 93 내지 97 중 어느 하나에 있어서, ≤ 10,000 pg 숙주 세포 DNA/mg rh루브리신(pg/mg), ≤ 5,000 pg/mg, ≤ 1,000 pg/mg, ≤ 500 pg/mg, ≤ 100 pg/mg, ≤ 50 pg/mg, ≤ 10 pg/mg, 또는 ≤ 5 pg/mg을 포함하는, 조성물.

99. 실시형태 93 내지 98 중 어느 하나에 있어서, 박테리아 내독소 테스트(BET)에 의해 측정 시, 8 내독소 단위(EU)/mL 미만, 1 EU/mL 미만, 0.1 EU/mL 미만, 또는 0.01 EU/mL 미만을 포함하는, 조성물.

100. 실시형태 93 내지 99 중 어느 하나에 있어서, 1 콜로니 형성 단위(CFU)/mL 미만, 1 CFU/2 mL 미만, 1 CFU/3 mL 미만, 1 CFU/4 mL 미만, 1 CFU/5 mL 미만, 1 CFU/6 mL 미만, 1 CFU/7 mL 미만, 1 CFU/8 mL 미만, 1 CFU/9 ml 미만, 또는 1 CFU/10 ml 미만의 총 호기성 미생물 계수(TAMC)를 갖는, 조성물.

101. 실시형태 93 내지 100 중 어느 하나에 있어서, 1 콜로니 형성 단위(CFU)/mL 미만, 1 CFU/2 mL 미만, 1 CFU/3 ml 미만, 1 CFU/4 ml 미만, 1 CFU/5 ml 미만, 1 CFU/6 ml 미만, 1 CFU/7 ml 미만, 1 CFU/8 ml 미만, 1 CFU/9 ml 미만, 또는 1 CFU/10 ml 미만의 총 조합된 효모/곰팡이 계수(TYMC)를 갖는, 조성물.

102. 실시형태 93 내지 101 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물이 5℃에서 적어도 24개월 동안 안정한, 조성물.

103. 실시형태 93 내지 102 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물이 25℃에서 적어도 1개월 동안 안정한, 조성물.

104. 실시형태 93 내지 103 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물이 약 0.15 mg 재조합 루브리신 당단백질/ml(mg/ml), 약 0.20 mg/ml, 약 0.25 mg/ml, 약 0.30 mg/ml, 약 0.35 mg/ml, 약 0.40 mg/ml, 약 0.45 mg/ml, 약 0.50 mg/ml, 약 0.55 mg/ml, 약 0.60 mg/ml, 약 0.70 mg/ml, 약 0.8 mg/ml, 약 0.9 mg/ml, 약 1.0 mg/ml, 약 1.5 mg/ml, 약 1.6 mg/ml, 약 1.7 mg/ml, 약 1.8 mg/ml, 약 1.9 mg/ml, 약 2.0 mg/ml, 약 2.1 mg/ml, 약 2.2 mg/ml, 약 2.3 mg/ml, 약 2.4 mg/ml, 약 2.5 mg/ml, 약 2.6 mg/ml, 약 2.7 mg/ml, 약 2.8 mg/ml, 약 2.9 mg/ml, 약 3.0 mg/ml, 약 3.5 mg/ml, 약 4.0 mg/ml, 약 0.15 mg/ml 내지 약 3.0 mg/ml, 약 0.45 mg/ml 내지 약 3.0 mg/ml, 약 0.15 mg/ml 내지 약 0.45 mg/ml, 약 1.5 mg/ml 내지 약 3.0 mg/ml, 약 1.5 mg/ml 내지 약 3.5 mg/ml, 약 2.0 mg/ml 내지 약 3.0 mg/ml, 약 1.5 mg/ml 내지 약 2.5 mg/ml, 또는 약 2.0 mg/ml 내지 약 4.0 mg/ml의 초기 농도를 갖는, 조성물.

105. 재조합 루브리신 당단백질 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물로서,

역상 크로마토그래피(RPC)에 의해 측정 시, 조성물의 순도가 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상이고,

상기 조성물이 재조합 루브리신 당단백질의 응집체를 1% 미만으로 포함하고,

상기 조성물이 재조합 루브리신 당단백질의 단편을 1% 미만으로 포함하고,

상기 조성물이 ≤ 1,000 ng 숙주 세포 단백질/mg 재조합 루브리신 당단백질(ng/mg), ≤ 900 ng/mg, ≤ 800 ng/mg, ≤ 700 ng/mg, ≤ 600 ng/mg, ≤ 500 ng/mg, ≤ 400 ng/mg, ≤ 300 ng/mg, ≤ 250 ng/mg, ≤ 200 ng/mg, ≤ 150 ng/mg, 또는 ≤ 100 ng/mg을 포함하고,

상기 조성물이 ≤ 10,000 pg 숙주 세포 DNA/mg 재조합 루브리신 당단백질(pg/mg), ≤ 5,000 pg/mg, ≤ 1,000 pg/mg, ≤ 500 pg/mg, ≤ 100 pg/mg, ≤ 50 pg/mg, ≤ 10 pg/mg, 또는 ≤ 5 pg/mg을 포함하고,

상기 조성물이 박테리아 내독소 테스트(BET)에 의해 측정 시, 8 내독소 단위(EU)/mL 미만, 1 EU/mL 미만, 0.1 EU/mL 미만, 또는 0.01 EU/mL 미만을 포함하고,

상기 조성물이 1 콜로니 형성 단위(CFU)/mL 미만, 1 CFU/2 mL 미만, 1 CFU/3 mL 미만, 1 CFU/4 mL 미만, 1 CFU/5 mL 미만, 1 CFU/6 mL 미만, 1 CFU/7 mL 미만, 1 CFU/8 mL 미만, 1 CFU/9 ml 미만, 또는 1 CFU/10 ml 미만의 총 호기성 미생물 계수(TAMC)를 갖고/갖거나,

상기 조성물이 1 콜로니 형성 단위(CFU)/mL 미만, 1 CFU/2 mL 미만, 1 CFU/3 mL 미만, 1 CFU/4 mL 미만, 1 CFU/5 mL 미만, 1 CFU/6 mL 미만, 1 CFU/7 mL 미만, 1 CFU/8 mL 미만, 1 CFU/9 ml 미만, 또는 1 CFU/10 ml 미만의 총 조합된 효모/곰팡이 계수(TYMC)를 갖는, 약제학적 조성물.

106. 실시형태 105에 있어서, 상기 조성물이 5℃에서 적어도 24개월 동안 안정한, 약제학적 조성물.

107. 실시형태 105에 있어서, 상기 조성물이 25℃에서 적어도 1개월 동안 안정한, 약제학적 조성물.

108. 실시형태 105 내지 107 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물이 약 0.15 mg 재조합 루브리신 당단백질/ml(mg/ml), 약 0.20 mg/ml, 약 0.25 mg/ml, 약 0.30 mg/ml, 약 0.35 mg/ml, 약 0.40 mg/ml, 약 0.45 mg/ml, 약 0.50 mg/ml, 약 0.55 mg/ml, 약 0.60 mg/ml, 약 0.70 mg/ml, 약 0.8 mg/ml, 약 0.9 mg/ml, 약 1.0 mg/ml, 약 1.5 mg/ml, 약 1.6 mg/ml, 약 1.7 mg/ml, 약 1.8 mg/ml, 약 1.9 mg/ml, 약 2.0 mg/ml, 약 2.1 mg/ml, 약 2.2 mg/ml, 약 2.3 mg/ml, 약 2.4 mg/ml, 약 2.5 mg/ml, 약 2.6 mg/ml, 약 2.7 mg/ml, 약 2.8 mg/ml, 약 2.9 mg/ml, 약 3.0 mg/ml, 약 3.5 mg/ml, 약 4.0 mg/ml, 약 0.15 mg/ml 내지 약 3.0 mg/ml, 약 0.45 mg/ml 내지 약 3.0 mg/ml, 약 0.15 mg/ml 내지 약 0.45 mg/ml, 약 1.5 mg/ml 내지 약 3.0 mg/ml, 약 1.5 mg/ml 내지 약 3.5 mg/ml, 약 2.0 mg/ml 내지 약 3.0 mg/ml, 약 1.5 mg/ml 내지 약 2.5 mg/ml, 또는 약 2.0 mg/ml 내지 약 4.0 mg/ml의 초기 농도를 갖는, 약제학적 조성물.

109. 실시형태 105 내지 108 중 어느 하나에 있어서, 재조합 루브리신 당단백질의 분자량의 적어도 30%가 글리코시드 잔기로부터 유래되는, 약제학적 조성물.

110. 실시형태 105 내지 109 중 어느 하나에 있어서, 재조합 루브리신 당단백질의 O-글리코실화의 적어도 90%가 코어 1 글리코실화인, 약제학적 조성물.

111. 실시형태 105 내지 110 중 어느 하나에 있어서, 재조합 루브리신 당단백질은 O-글리칸 종을 포함하며, 여기서 O-글리칸 종은 약 7% 이상 Gal-GalNAc, 약 80% 이상 2,3-NeuAc 코어 1, 약 3% 이상 2*NeuAc 코어 1, 및 약 1% 이상 2,3-NeuGc 코어 1을 포함하는, 약제학적 조성물.

112. 실시형태 105 내지 111 중 어느 하나에 있어서, 재조합 루브리신 당단백질이 루브리신 당단백질의 mg 당 약 50 μg 이상 NANA를 포함하는, 약제학적 조성물.

113. 실시형태 105 내지 112 중 어느 하나에 있어서, 재조합 루브리신 당단백질이 루브리신 당단백질의 mg 당 약 10 μg 이하 NGNA를 포함하는, 약제학적 조성물.

114. 실시형태 105 내지 113 중 어느 하나에 있어서, 재조합 루브리신 당단백질이 루브리신 당단백질의 mg 당 약 100 μg 이상 Gal를 포함하는, 약제학적 조성물.

115. 실시형태 105 내지 114 중 어느 하나에 있어서, 재조합 루브리신 당단백질이 루브리신 당단백질의 mg 당 약 100 μg 이상 GalNAc를 포함하는, 약제학적 조성물.

116. 실시형태 105 내지 115 중 어느 하나에 있어서, 재조합 루브리신 당단백질이 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는, 약제학적 조성물: (a) 서열번호 1 또는 2의 아미노산 서열의 아미노산 25-1404; (b) 전장 및 자연 발생 루브리신과 실질적으로 동일한 활성을 갖는, 서열번호 1의 서열의 아미노산 25-1404에 대해 적어도 75% 동일한 아미노산 서열을 갖는 재조합 루브리신 당단백질의 기능적으로 동등한 변이체; 및 (c) 서열번호 3의 글리코실화된 반복부를 포함하는 기능적으로 동일한 루브리신 단편, 또는 이의 혼합물.

117. 실시형태 105 내지 116 중 어느 하나에 있어서, 재조합 루브리신 당단백질이 실시형태 1 내지 20 중 어느 하나의 방법에 따라 정제되는, 약제학적 조성물.

118. 실시형태 105 내지 116 중 어느 하나에 있어서, 재조합 루브리신 당단백질이 실시형태 46 내지 49 중 어느 하나의 방법에 따라 생성되는, 약제학적 조성물.

119. 실시형태 105 내지 116 중 어느 하나에 있어서, 재조합 루브리신 당단백질이 실시형태 50 내지 84 또는 92 중 어느 하나의 방법에 따라 생성되는, 약제학적 조성물.

120. 실시형태 105 내지 119 중 어느 하나의 약제학적 조성물을 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 안구 표면 질환의 치료 방법.

121. 실시형태 120에 있어서, 상기 질환이 안구 건조증인, 방법.

122. 재조합 루브리신 당단백질을 생성하는 방법으로서, 상기 루브리신 당단백질을 함유하는 세포 배양 수확물을: 임의의 순서로 수행되는, 다중모드 양이온 교환 크로마토그래피(MCC), 다중모드 음이온 교환 크로마토그래피(MAC), 및 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)에 적용시키는 단계들을 포함하는, 방법.

123. 실시형태 122에 있어서, 상기 단계들이 하기 순서로 수행되는, 방법: a) MCC, b) MAC, 및 c) HIC.

124. 실시형태 123에 있어서, 단계 a) 전에, 배양물내 세포를 MgCl₂ 및 엔도뉴클레아제와 접촉시키고, 세포를 수확하여 상기 세포 배양 수확물을 수득하는, 방법.

125. 실시형태 124에 있어서, 상기 배양물내 세포는 약 1,000 L, 약 1,500 L, 약 2,000 L, 또는 약 2,500 L의 배양물 부피로 있는, 방법.

126. 실시형태 123에 있어서, 단계 a) 전에 세포 배양 수확물이 MgCl₂및 엔도뉴클레아제와 접촉되는, 방법.

127. 실시형태 126에 있어서, 상기 세포 배양 수확물은 약 1,000 L, 약 1,500 L, 약 2,000 L, 또는 약 2,500 L의 세포 배양물 부피로부터 유래되는, 방법.

128. 실시형태 124 또는 126에 있어서, 상기 엔도뉴클레아제는 Benzonase® 엔도뉴클레아제인, 방법.

129. 실시형태 126에 있어서, 상기 세포 배양 수확물은 MgCl₂및 엔도뉴클레아제와 접촉되기 전에 2~8℃까지 냉각되는, 방법.

130. 실시형태 122 내지 129 중 어느 하나에 있어서, 다중모드 음이온 교환 크로마토그래피(MAC) 단계 후 및 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 단계 전에 바이러스 불활성화 단계를 추가로 포함하는, 방법.

131. 실시형태 130에 있어서, 상기 바이러스 불활성화 단계는 단계 b)에서 수득된 용액의 pH를 약 3.4 - 3.6로 조정하는 단계를 포함하는, 방법.

132. 실시형태 131에 있어서, 상기 용액을 적어도 1시간 동안 인큐베이션한 후, 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 단계 전에 pH가 약 7.0으로 조정되는, 방법.

133. 실시형태 130 내지 132 중 어느 하나에 있어서, 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 단계 전에 심층 여과 단계를 추가로 포함하는, 방법.

134. 실시형태 133에 있어서, 상기 심층 여과 단계가 바이러스 불활성화 단계에 후속하는, 방법.

135. 실시형태 122 내지 134 중 어느 하나에 있어서, 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 단계 후 바이러스 제거 단계를 포함하는, 방법.

136. 실시형태 135에 있어서, 상기 바이러스 제거 단계는 나노여과를 포함하는, 방법.

137. 실시형태 135 또는 136에 있어서, 바이러스 제거 단계 후 한외여과 단계를 추가로 포함하는, 방법.

138. 실시형태 135 내지 137 중 어느 하나에 있어서, 바이러스 제거 단계 후 제2 바이러스 불활성화 단계를 포함하는, 방법.

139. 실시형태 138에 있어서, 상기 제2 바이러스 불활성화 단계는 디메틸우레아 용액을 첨가하는 단계를 포함하는, 방법.

140. 실시형태 138 또는 139에 있어서, 제2 바이러스 불활성화 단계 후 한외여과 단계를 포함하는, 방법.

141. 실시형태 122 또는 123에 있어서, 하나 이상의 한외여과 및/또는 나노여과 단계들을 추가로 포함하는, 방법.

142. 실시형태 122 또는 123에 있어서, 하나 이상의 바이러스 불활성화 단계들을 추가로 포함하는, 방법.

143. 실시형태 122 또는 123에 있어서, 하나 이상의 바이러스 제거 단계들을 추가로 포함하는, 방법.

144. 실시형태 122 내지 143 중 어느 하나에 있어서, 상기 재조합 루브리신 당단백질은 서열번호 1 또는 2의 아미노산 잔기 25-1404의 아미노산 서열을 포함하는, 방법.

145. 실시형태 122 내지 144 중 어느 하나에 있어서, 재조합 루브리신 당단백질의 분자량의 적어도 30%가 글리코시드 잔기로부터 유래되는, 방법.

146. 실시형태 122 내지 145 중 어느 하나에 있어서, 루브리신 당단백질의 O-글리코실화의 적어도 90%가 코어 1 글리코실화인, 방법.

147. 실시형태 122 내지 146 중 어느 하나에 있어서, 루브리신 당단백질은 O-글리칸 종을 포함하며, 여기서 O-글리칸 종은 약 7% 이상 Gal-GalNAc, 약 80% 이상 2,3-NeuAc 코어 1, 약 3% 이상 2*NeuAc 코어 1, 및 약 1% 이상 2,3-NeuGc 코어 1을 포함하는, 방법.

148. 실시형태 122 내지 147 중 어느 하나에 있어서, 루브리신 당단백질이 루브리신 당단백질의 mg 당 약 50 μg 이상 NANA를 포함하는, 방법.

149. 실시형태 122 내지 148 중 어느 하나에 있어서, 루브리신 당단백질이 루브리신 당단백질의 mg 당 약 10 μg 이하 NGNA를 포함하는, 방법.

150. 실시형태 122 내지 149 중 어느 하나에 있어서, 루브리신 당단백질이 루브리신 당단백질의 mg 당 약 100 μg 이상 Gal를 포함하는, 방법.

151. 실시형태 122 내지 150 중 어느 하나에 있어서, 루브리신 당단백질이 루브리신 당단백질의 mg 당 약 100 μg 이상 GalNAc를 포함하는, 방법.

152. 실시형태 122 내지 151 중 어느 하나에 따른 방법에 의해 수득된 재조합 루브리신 당단백질.

153. 실시형태 152에 따른 재조합 루브리신 당단백질 및 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.

154. 실시형태 153에 있어서, 역상 크로마토그래피(RPC)에 의해 측정 시, 약제학적 조성물의 순도가 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상인, 약제학적 조성물.

155. 실시형태 153 또는 154에 있어서, 재조합 루브리신 당단백질의 응집체를 1% 미만으로 포함하는, 약제학적 조성물.

156. 실시형태 153 내지 155 중 어느 하나에 있어서, 재조합 루브리신 당단백질의 단편을 1% 미만으로 포함하는, 약제학적 조성물.

157. 실시형태 153 내지 156 중 어느 하나에 있어서, ≤ 1,000 ng 숙주 세포 단백질/mg 재조합 루브리신 당단백질(ng/mg), ≤ 900 ng/mg, ≤ 800 ng/mg, ≤ 700 ng/mg, ≤ 600 ng/mg, ≤ 500 ng/mg, ≤ 400 ng/mg, ≤ 300 ng/mg, ≤ 250 ng/mg, ≤ 200 ng/mg, ≤ 150 ng/mg, 또는 ≤ 100 ng/mg을 포함하는, 약제학적 조성물.

158. 실시형태 153 내지 157 중 어느 하나에 있어서, ≤ 10,000 pg 숙주 세포 DNA/mg 재조합 루브리신 당단백질(pg/mg), ≤ 5,000 pg/mg, ≤ 1,000 pg/mg, ≤ 500 pg/mg, ≤ 100 pg/mg, ≤ 50 pg/mg, ≤ 10 pg/mg, 또는 ≤ 5 pg/mg을 포함하는, 약제학적 조성물.

159. 실시형태 153 내지 158 중 어느 하나에 있어서, 박테리아 내독소 테스트(BET)에 의해 측정 시, 8 내독소 단위(EU)/mL 미만, 1 EU/mL 미만, 0.1 EU/mL 미만, 또는 0.01 EU/mL 미만을 포함하는, 약제학적 조성물.

160. 실시형태 153 내지 159 중 어느 하나에 있어서, 1 콜로니 형성 단위(CFU)/mL 미만, 1 CFU/2 mL 미만, 1 CFU/3 mL 미만, 1 CFU/4 mL 미만, 1 CFU/5 mL 미만, 1 CFU/6 mL 미만, 1 CFU/7 mL 미만, 1 CFU/8 mL 미만, 1 CFU/9 ml 미만, 또는 1 CFU/10 ml 미만의 총 호기성 미생물 계수(TAMC)를 갖는, 약제학적 조성물.

161. 실시형태 153 내지 160 중 어느 하나에 있어서, 1 콜로니 형성 단위(CFU)/mL 미만, 1 CFU/2 mL 미만, 1 CFU/3 ml 미만, 1 CFU/4 ml 미만, 1 CFU/5 ml 미만, 1 CFU/6 ml 미만, 1 CFU/7 ml 미만, 1 CFU/8 ml 미만, 1 CFU/9 ml 미만, 또는 1 CFU/10 ml 미만의 총 조합된 효모/곰팡이 계수(TYMC)를 갖는, 약제학적 조성물.

162. 실시형태 153 내지 161 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물이 5℃에서 적어도 24개월 동안 안정한, 약제학적 조성물.

163. 실시형태 153 내지 162 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물이 25℃에서 적어도 1개월 동안 안정한, 약제학적 조성물.

164. 실시형태 153 내지 163 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물이 약 0.15 mg 재조합 루브리신 당단백질/ml(mg/ml), 약 0.20 mg/ml, 약 0.25 mg/ml, 약 0.30 mg/ml, 약 0.35 mg/ml, 약 0.40 mg/ml, 약 0.45 mg/ml, 약 0.50 mg/ml, 약 0.55 mg/ml, 약 0.60 mg/ml, 약 0.70 mg/ml, 약 0.8 mg/ml, 약 0.9 mg/ml, 약 1.0 mg/ml, 약 1.5 mg/ml, 약 1.6 mg/ml, 약 1.7 mg/ml, 약 1.8 mg/ml, 약 1.9 mg/ml, 약 2.0 mg/ml, 약 2.1 mg/ml, 약 2.2 mg/ml, 약 2.3 mg/ml, 약 2.4 mg/ml, 약 2.5 mg/ml, 약 2.6 mg/ml, 약 2.7 mg/ml, 약 2.8 mg/ml, 약 2.9 mg/ml, 약 3.0 mg/ml, 약 3.5 mg/ml, 약 4.0 mg/ml, 약 0.15 mg/ml 내지 약 3.0 mg/ml, 약 0.45 mg/ml 내지 약 3.0 mg/ml, 약 0.15 mg/ml 내지 약 0.45 mg/ml, 약 1.5 mg/ml 내지 약 3.0 mg/ml, 약 1.5 mg/ml 내지 약 3.5 mg/ml, 약 2.0 mg/ml 내지 약 3.0 mg/ml, 약 1.5 mg/ml 내지 약 2.5 mg/ml, 또는 약 2.0 mg/ml 내지 약 4.0 mg/ml의 초기 농도를 갖는, 약제학적 조성물.

165. 실시형태 153 내지 164 중 어느 하나의 약제학적 조성물을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 안구 표면 장애의 치료 방법.

166. 실시형태 165에 있어서, 상기 안구 표면 장애가 안구 건조증인, 방법.

167. 안구 표면 장애를 치료하기 위한, 실시형태 32 내지 43, 93 내지 119, 또는 153 내지 164 중 어느 하나에 따른 약제학적 조성물.

168. 안구 표면 장애 치료에 사용하기 위한, 실시형태 32 내지 43, 93 내지 119, 또는 153 내지 164 중 어느 하나에 따른 약제학적 조성물.

169. 안구 표면 장애의 치료용 약제의 제조를 위한, 실시형태 32 내지 43, 93 내지 119, 또는 153 내지 164 중 어느 하나에 따른 약제학적 조성물의 용도.

본 개시내용에서 "발명"에 대한 참조는 본 명세서에 개시된 여러 발명의 실시형태를 반영하기 위한 것이며, 특허 보호가 필요한 발명(들)을 설명하는 청구범위에서처럼 청구된 주제를 반드시 제한하는 것으로 간주되어서는 안된다.

하기 실시예는 상기 기술된 본 발명을 예시하지만, 본 발명의 범주를 어떠한 방식으로도 제한하려는 것이 아니다. 관련 기술 분야의 기술자에게 이와 같이 알려진 다른 시험 모델은 또한 청구된 발명의 유익한 효과를 결정할 수 있다.

실시예

실시예 1:

재조합 루브리신의 정제 방법

루브리신의 예시적인 정제 방법은 도 1 및 2 및 하기 표 2에 기재되어 있다. 일반적으로, 상기 방법은 3개의 크로마토그래피 단계들 및 바이러스 불활성화(즉, 낮은 pH 인큐베이션) 및 제거, 나노여과, 및, 하기 실시예에 기재된 실시형태에서, N,N-디메틸우레아(DMU)에 의한 바이러스 불활성화에 중심을 둔 추가 단계들을 포함한다. 최종적으로 생성물을 농축하고, 최종 완충액으로 정용여과한다.

[표 2]

정제를 위한 출발 물질은 차이니즈 햄스터 난소 세포주(WO 2015/061488에 기재된 바와 같은 CHO-M 세포)에서 생성된 재조합 인간 루브리신 당단백질을 함유하는 세포 배양 수확물로부터 제조하였다.

단계 1: 벤조나아제 처리 및 다중모드 양이온 교환 크로마토그래피(MCC)

세포는 인라인 심층 여과 또는 심층 여과에 의해서만 제거된 후, 0.2 μm 여과에 의해 제거하였다. 냉각된(2~8℃) 정화된 세포-배양 상청액에 Mg²⁺ 및 Benzonase® 엔도뉴클레아제(Merck MilliporeSigma, Burlington, MA)를 50'000 U/L_{정화된 수확물}의 표적 농도로 스파이킹하고, 4℃에서 16시간 동안 인큐베이션하였다. 정화된 수확물의 1.0 kg 당 대략 1.07 g의 1 M MgCl₂ 용액(밀도 1.070 g/ml)을 사용하였다.

Benzonase® 처리 후, 정화된 수확물을 Capto MMC 수지(GE Healthcare Bio-Sciences, Pittsburgh Pa)를 사용하여 20 cm의 베드 높이로 다중모드 양이온 교환 크로마토그래피(MCC) 컬럼에 적용하였다. 4분 이상의 체류 시간이 적용되었다. 존재하는 생성물의 양에 따라, 다중 양이온 교환 크로마토그래피 사이클을 수행하였다. 각 주기는 대략 6 g/L 컬럼 부피의 최대 로딩을 허용한다.

로딩 전에 컬럼을 100 mM Tris, pH 8로 프라이밍한 다음, 평형화 완충제(20 mM Tris, pH 8)로 평형화하였다. 무세포 수확물의 로딩 후, 컬럼을 먼저 세척 완충제(20 mM Tris, pH 10)로 세척한 다음, 평형화 완충제로 세척하였다. 생성물을 20 mM Tris, 20 mM 아세트산나트륨, 50 mM L-아르기닌, 1 M NaCl, pH 9를 함유하는 완충제로 용리시켰다.

단계 2: 다중모드 음이온 교환 크로마토그래피(MAC)

이전 단계로부터의 여과된 생성물-함유 용액을 유동 모드의 다중모드 음이온-교환 크로마토그래피(MAC)에 의한 크로마토그래피 연마에 적용하였다. 용액을 베드 높이 20 cm로 패킹된 Capto 코어 700 컬럼(GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh PA)에 적용하였다. 6분 이상의 체류 시간이 적용되었다. 존재하는 생성물의 양에 따라, 다중 다중모드 음이온 교환 크로마토그래피 사이클을 수행하였다. 각 주기는 대략 18 g/L 컬럼 부피의 최대 로딩을 허용하였다. 로드를 0.5 M 인산 용액으로 pH 7.0으로 조정하였다. 평형화 및 로딩 후 세척은 50 mM 인산나트륨, 750 mM NaCl, pH 7을 함유하는 완충제로 수행하였다. 생성물을 퍼콜레이트(유동식)에 수집하였다.

단계 3: 바이러스 불활성화(VIN)

그 후, 0.5 M 인산 용액으로 pH를 pH 3.4 - 3.6으로 조정함으로써 부분적으로 정제된 루브리신 용액을 바이러스 불활성화에 적용하였다 17~25℃에서 60~90분 동안 인큐베이션한 후, 1 M 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄(Tris) 용액으로 pH를 pH 7.0으로 조정하였다. 마지막으로, 용액을 0.2 μm 필터를 통해 여과하였다.

단계 4: 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)

두 번째 크로마토그래피 연마 단계는 통과 모드에서 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)를 사용하여 수행하였다.

이전 단계로부터의 여과된 생성물-함유 용액에 3 M 황산암모늄을 0.72 M 황산암모늄 농도의 표적 농도로 스파이킹하였다. 여과한 후 스파이크 용액을 Sartobind 페닐 막 흡착기에 적용하였다. 0.2분 이상의 체류 시간이 적용되었다. 존재하는 생성물의 양에 따라, 다중 막 흡착기 사이클을 수행하였다. 각 주기는 대략 30 g/L 컬럼 부피의 최대 로딩을 허용하였다.

평형화 및 로딩 후 세척은 20 mM 인산나트륨, 1 M 황산암모늄, pH 7을 함유하는 완충제로 수행하였다. 생성물을 퍼콜레이트(통과흐름)에 수집하였다.

단계 5: 나노여과(VRF)

0.1 μm 필터를 통한 사전 여과 후, 루브리신-함유 용액을 0.8 bar의 작동 압력차에서 Planova 20N 바이러스 감소 필터를 사용하여 나노여과하였다. m2 당 최대 60 g의 생성물 로드가 적용되었다. 공급 압력은 일정하게 유지되었고 플럭스는 시간이 지남에 따라 감소하였다. 제조 공정에서 80%의 최대 플럭스 감쇠가 허용되었다.

단계 6: 3 M DMU로의 바이러스 불활성화(VIN DMU)

그런 다음, 용액을 3 M N,N-디메틸우레아(DMU)로 바이러스 불활성화 단계에 적용하였다. 바이러스 제거 여과 단계로부터의 용액을 6 M DMU 용액과 1:1(v/v)의 비율로 혼합하고, 혼합물을 실온에서 최대 360분 동안 (교반 없이) 인큐베이션하였다. 그런 다음 용액을 0.45/0.2 μm Sartopore 2 마이크로필터(Sartorius AG, Germany)로 여과하였다.

단계 7: 한외여과 및 컴파운딩(UFT)

그런 다음, 용액을 한외여과/정용여과에 적용하였고, 이는 원료의약품 표적 조성물을 달성하도록 설계된 완충제를 사용한 농축 단계 및 정용여과 단계로 이루어졌다. 단계는 30 kDa 컷-오프 막을 사용하였다. 한외여과/정용여과 공정 후에 폴리소르베이트 20을 첨가하였다. 최종 DS 용액을 0.2 μm 필터를 통해 여과하였다.

표 3은 공정의 정제 결과를 보여준다. 표에서, HMW 및 LMW %는 하기 기재된 바와 같이 SEC 분석을 사용하여 결정하였다. HCP 함량은 CHO-ELISA로 측정하였다. DNA 함량은 qPCR을 사용하여 측정하였다.

[표 3]

표 4-1 내지 4-7은 공정의 다양한 단계들에 대한 전형적인 공정 출력을 보여준다.

[표 4-1]

[표 4-2]

[표 4-3]

[표 4-4]

[표 4-5]

[표 4-6]

[표 4-7]

[표 4-8]

최종 루브리신 원료의약품 용액은 루브리신 단백질에 더해, 대략 10 mM 인산나트륨, 140 mM 염화나트륨, 및 0.02% (w/v) 폴리소르베이트 20을 함유한다.

실시예 2:

재조합 루브리신의 정제 공정

루브리신의 추가 정제 공정은 도 3에 설명되어 있다. 일반적으로, 공정은 실시예 1에 기술된 공정과 유사하지만, N,N-디메틸우레아(DMU)를 사용한 바이러스 불활성화 단계는 포함하지 않는다.

정제를 위한 출발 물질은 차이니즈 햄스터 난소 세포주(WO 2015/061488에 기재된 바와 같은 CHO-M 세포)에서 생성된 재조합 인간 루브리신 당단백질을 함유하는 세포 배양 수확물로부터 제조하였다. 세포를 먼저 대략 20 L의 세포 배양물 부피의 Wave 생물반응기에서 배양한 다음, 대략 100 L에서 400 L로 세포 배양물 부피를 증가시키면서 2개의 전-단계에서 WAVE 생물반응기에서 추가로 배양하였다. 마지막으로, 세포를 2,000 L 생물반응기에서 배양하였다.

정제 공정의 다양한 단계에서 잔류 숙주 세포 단백질이 하기 표 5-1에 개시되어 있다:

[표 5-1]

정제 공정의 다양한 단계에서 잔류 숙주 세포 DNA가 하기 표 5-2에 개시되어 있다:

[표 5-2]

정제 공정의 다양한 단계에서 잔류 벤조나아제가 하기 표 5-3에 개시되어 있다:

[표 5-3]

표 5-4는 공정을 사용하여 제조된 원료의약품 배치에 대한 다양한 테스트 요건과 테스트 결과를 보여준다.

[표 5-4]

크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의한 순도/ 단편

최종 조성물 내에 포함된 재조합 루브리신 분해 생성물(단편화 생성물)은 전용 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 방법으로 분석하였다. 크기에 따라 샘플 분리를 수행하고, 210 nm에서 UV 흡광도를 기록하였다. 초기 원료의약품(DS) 배치 및 임상 원료의약품 배치의 오버레이 크로마토그램이 도 4에 도시되어 있다. 피크는 대략 0.4 피크 면적 백분율(LOQ 미만)이며, 초기 배치에서만 검출되었다. 두 배치에 대한 단편의 합계는 LOQ 미만(<1.0%)이었다. SEC 프로파일은 두 배치에 대해 전반적으로 유사하여 두 배치가 순도 및 단편에 대한 SEC 분석에 의해 유사함을 나타낸다.

크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의한 응집체

응집체에 대한 분해 생성물은 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 방법으로 분석하였다. 크기에 따라 샘플 분리를 수행하고, 210 nm에서 UV 흡광도를 기록하였다. 초기 원료의약품 배치 및 임상 원료의약품 배치 프로파일의 오버레이 크로마토그램이 도 5에 도시되어 있다. 각 배치에 대한 응집체의 합계는 정량화 한계 미만(LOQ; <1.0%)이었다. SEC 프로파일은 두 배치에 대해 유사했으며, 이는 초기 DS 배치와 임상 DS 배치가 응집체에 대한 SEC에 의해 유사함을 나타낸다.

역상 크로마토그래피(RPC)에 의한 순도

소수성을 기준으로 역상 크로마토그래피(RPC)에 의한 순도를 평가하고 215 nm에서 UV 흡광도를 기록하였다. 초기 원료의약품 배치 및 임상 원료의약품(DS) 배치의 오버레이 크로마토그램이 도 6에 도시되어 있다. 프로파일과 순도가 두 배치에 대해 유사했으며, 이는 초기 DS 배치와 임상 DS 배치가 RPC에 의해 유사함을 나타낸다. 초기 용리 피크는 이종성이며, 하나의 피크 그룹으로 통합되었다. 초기 피크의 동일성은 N- 및 C-말단 절단된 루브리신을 포함하는 것으로 펩타이드 매핑으로 입증되었다. 초기 용리 피크의 피크 면적 백분율은 2개의 배치에 대해 유사했다(대략 23%). 주요 피크도 또한 이종성이었으며, 2개의 주요 및 밀접하게 연관된 피크를 포함했다. 주요 피크는 단편화되지 않은 루브리신을 포함할 가능성이 높다. 2개의 피크의 모양은 분석적 초원심분리에 의해 관찰된 바와 같은, 정제된 단백질의 상이한 분자 또는 구조적 형태를 나타낼 수 있다.

분석용 초원심분리에 의한 분자량 측정

초기 원료의약품(DS) 배치 및 임상 DS 배치는 각각 침강 평형(SE-AUC) 및 침강 속도(SV-AUC) 모드를 사용하여 분석용 초원심분리(AUC)에 의해 기본 조건하에 측정하였다. SE-AUC는 분자량을 측정하는 반면, SV-AUC는 형태 및 크기 분포와 같은 분자 특성을 측정한다. 샘플을 12 mm 6-채널 센터피스(SE-AUC)와 12 mm 2-채널 센터피스(SV-AUC)에 넣고, 20℃의 온도에서 설정된 조건에 따라 분석하였다. 도 7은 삼중으로 측정된 각 DS 배치의 230 nm에서 SV-AUC 흡광도 프로파일을 나타낸다. 두 DS 배치 모두 대략 4.5S 및 6S 부근에서 최대값을 갖는 2개의 주요 피크를 포함하는 유사한 프로파일을 입증하였다. 두 밴드는 비슷한 분자량의 서로 다른 구조적 형태에 해당할 가능성이 있다: 더 신장된 형태(4.5S) 및 비교적 더 컴팩트한 형태(6S). 피크 면적은 각 DS 배치에 대해 유사했다.

초기 DS 배치의 SE-AUC에 의해 측정된 분자량은 294,938.7 g/mol이었다. 임상 DS 배치의 SE-AUC에 의해 측정된 분자량은 291,931,9 g/mol이었다. 두 배치의 분자량은 유사했고, 예상 범위 내에 있었다. 두 배치 사이에서 관찰된 분자량의 작은 차이는 방법의 오차 범위 내에 있었다.

아미노산 조성을 기반으로 한 재조합 인간 루브리신의 이론적인 분자 질량은 148,308 Da이다. DS 배치당 약 145 kDa의 추가 측정된 질량은 주로 시알화된 O-글리칸으로 구성될 가능성이 있다. 배치에서 응집체 종은 검출되지 않았다. 따라서, 초기 DS 배치 및 임상 DS 배치는 유사한 AUC 프로파일 및 분자량을 나타내었다.

실시예 3:

하기 분석이 사용되었으며, 본원에 제공된 방법들을 사용하여 정제된 용액을 분석하는 데 사용될 수 있다.

분석용 분석법: 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의한 동일성 및 응집체

위에서 설명한 공정으로부터의 샘플내 루브리신 응집체는 UV 검출 기능이 있는 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 사용하여 천연 조건에서 크기를 기준으로 단량체에서 분리된다. 응집체의 양/함량은 결정된 각 샘플에 대해 얻은 총 면적의 백분율로 결정된다. 샘플의 동일성은 알려진 동일성의 참조 표준과 관련하여 평가된다. 동일성 또는 응집체 결정은 단독으로 또는 조합하여 수행할 수 있다.

이 방법은 일반적으로 ‘샘플'이라고 칭하는 원료의약품 및 의약품에 적용할 수 있다.

하기 테스트 용액을 사용한다:

루브리신 샘플 용액을 대략 0.15 mg/mL(예를 들어 15 μL의 샘플 희석, 85 μL 희석제로 약 1 mg/mL 참조)로 희석한다. 샘플 희석제는 10 mM 인산나트륨 / 140 mM 염화나트륨 / 0.02% (w/v) 폴리소르베이트 20 (PS20), pH 7.0이다. 루브리신 참조 용액은 1.5 μg/mL의 최종 루브리신 농도(LOQ 용액)를 얻기 위해 두 단계들로 희석된다. 먼저, 30 μL의 참조 용액을 970 μL 샘플 희석제로 0.15 mg/mL로 희석한다. 이것은 용액 A(대략 4.5 μg/mL 루브리신)라고 명명한다. 둘째, 100 μL의 용액 A를 200 μL 샘플 희석제로 희석하였다. 이것은 LOQ 용액(1.5 μg/mL)이라고 명명한다.

분자량 마커 용액(MWM 용액)은 하기와 같이 제조한다: 1) 150 mM 인산칼륨, pH 6.5를 제조하고; 2) 대략 70 mL 150 mM 인산칼륨, pH 6.5에 50 ±1 mg의 티로글로불린(669 kDa), 20 ± 1 mg의 IgG(150 kDa), 25 ±1 mg의 홀로-트랜스페린(80 kDa), 25 ±1 mg의 오브알부민(45 kDa), 20 ±1 mg의 탄산 탈수효소(29 kDa), 20 ±1 mg의 아프로티닌(6.5 kDa) 및 16 ±1 mg의 히스티딘(209.6 Da)을 용해한다. 용액을 대략 15분 동안 부드럽게 교반한 다음, 부피 플라스크에 150 mM 인산칼륨, pH 6.5로 100 mL의 최종 부피를 채우고, 0.22 μm 막 필터를 통해 여과한다.

하기 크로마토그래피 조건들을 사용한다:

순서는 하기와 같이 실행한다:

위의 접근 방식은 최대 15개 샘플에 사용할 수 있다. 15개 초과의 샘플에 대해, 하기와 같은 주입 순서를 사용할 수 있다:

30개 초과의 샘플을 분석해야 하는 경우 샘플 N(30, 45 등) 이후에 그에 따라 참조 용액의 반복 주입을 진행한다. 샘플 주입에 대한 결과는 아래에 표시된 SST 기준이 샘플 주입 전후에 충족되는 한 유효하다(브라케팅 접근방법(bracketing approach)).

30개 초과의 샘플을 분석해야 하는 경우 샘플 N(30, 45 등) 이후에 그에 따라 참조 용액의 반복 주입을 진행한다. 샘플 주입에 대한 결과는 SST 기준이 샘플 주입 전후에 충족되는 한 유효하다(브라케팅 접근방법(bracketing approach)).

결과는 다음과 같이 평가된다:

일반적으로, 응집체 피크(들)에서 용매 피크까지 하나의 기준선을 그리며, 예시적인 크로마토그램 도 12 및 도 13, 및 스트레스 샘플 도 17을 참조한다.

피크 통합 및 넘버링

하나 초과의 응집체가 존재하는 경우, 피크를 분리하는 계곡의 최소값에서 직교 분할에 의해, 피크를 서로, 그리고 주요 피크(단량체)로부터 분리한다. 주요 피크와 응집체 피크가 숄더에 의해서만 분리되는 경우, 숄더의 변곡점에서 분할이 설정될 수 있다. 주요 피크와 단편(하나의 단위로 통합) 사이에 분할이 설정되어서는 안된다.

참조, LOQ 및 샘플 용액의 통합을 위해, 존재하는 경우 용매 피크 및 블랭크로부터의 피크를 통합하지 않는다.

응집체 피크는 주요 피크에 대한 용리 시간에 따라 식별된다. 주요 피크 전 용리 피크는 응집 생성물(예를 들어 APx라고 명명됨)에 할당된다.

응집체 계산

모든 통합된 응집체 피크 및 주요 피크 + 단편의 피크 면적(mAU*min)을 계산한다(주요 피크와 단편은 하나의 단위로 통합됨).

각 샘플에 대해 각 응집체 피크의 면적 백분율(% P)을 계산한다. 응집체의 상대 피크 면적의 합(%)을 계산한다. 피크 < 1.0%(LOQ)는 총합 응집체의 계산에 포함되지 않는다.

응집체 피크의 % P는 하기 식에 따라 계산한다:

a_rs: 샘플 용액 크로마토그램에서 생성물-특이적 응집체 피크의 피크 면적(mAU*min)

a_t: 샘플 용액 크로마토그램의 총 피크 면적(mAU*min), 즉 모든 통합 피크(응집체 + 단량체 / 단편)의 합계 면적.

용리 시간차

주요 피크 및 응집체 피크(들)의 Δ (델타) 시간 차로 정의된 용리 시간차(LOQ 초과), 즉 시간 주요 피크 (분) - 시간 응집체 피크 (분).

동일성

샘플의 동일성은 알려진 동일성의 참조 표준의 용리 시간의 평균(순서의 첫 번째 및 마지막에만 해당)과 비교하여 샘플의 주요 피크의 용리 시간을 비교하여 평가된다. 동일성 시험은 단독으로 수행되거나, 응집체 결정과 조합하여 수행될 수 있다.

위약의 동일성은 참조의 예상 용리 시간에 LOQ를 초과하는 샘플 피크의 부재에 의해 평가된다.

계산치: 차이 = [(Ts - Tr)/Tr]*100

Ts = 샘플의 용리 시간

Tr = 참조의 용리 시간(평균)

보고

응집체 양: 총합 응집체 생성물의 피크 면적 백분율(% P) 및 각 응집체 피크의 %P를 보고한다.

정보를 위해 각 응집체 피크 대 주요 피크의 Δ(델타) 시간 차이를 소수점 첫째 자리까지 반올림하여 보고한다, X.X min.

동일성: 용리 시간의 차이(백분율)를 보고한다.

실시예 4:

분석용 순도 분석법: 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의한 단편

루브리신의 단편은 UV 검출 기능이 있는 크기 배제 크로마토그래피(SEC)를 사용하여 천연 조건에서 크기를 기준으로 단량체에서 분리된다. 단편의 순도(단량체) 및 양은 각 샘플에 대해 얻은 총 샘플 면적의 백분율로 결정된다. 분석법은 총 샘플 피크 면적 대 알려진 농도의 참조의 총 피크 면적을 기반으로 결정된다. 분석법 또는 순도는 필요한 경우 독립-실행형으로 수행될 수 있다.

하기 크로마토그래피 조건들을 사용한다:

하기 테스트 용액을 사용한다:

순서는 순도 및 분석법의 경우 하기와 같이 실행된다:

15개 초과의 샘플에 대해, 하기와 같은 순서를 사용한다.

30개 초과의 샘플을 분석해야 하는 경우 샘플 N(30, 45 등) 이후에 그에 따라 블랭크 및 참조 용액의 반복 주입을 진행한다. 샘플 주입에 대한 결과는 SST 기준이 샘플 주입 전후에 충족되는 한 유효하다(브라케팅(bracketing).

시스템 적합성 테스트(SST) 요건들

평가

추정되는 저분자량 단편(특히 스트레스 조건에서 샘플의 경우)이 용매 피크 근처에서 용리되었지만, 완전히 분해될 수 없었기 때문에 아래에 설명된 기준선 설정이 설정되었다. 아래 절차에 따라 이러한 단편이 더 정확하게 고려되고 계산된다. 후미 측에서 주요 피크의 피크 "비대칭"은, 일차적으로는 실제 샘플 함량에 기인한 것이며, 예를 들어 샘플 흡착과 관련된 피크 테일링에는 덜 기인한다.

I: 전체 직선 기준선을 투영하기 위해 주요 피크 (추정 응집체 피크 포함)의 개시로부터 용매 피크를 가로질러 그리고 넘어서 하나의 기준선을 그린다. 기준선의 끝점은 시작점과 동등한 수준 또는 거의 유사한 수준으로 설정된다. 용매 피크를 가로질러 뻗어 나가는 기준선을 "외삽"이라고 한다. 도 22를 참조한다.

II: 위의 기준선 투영 후 드롭-라인은 도 22에서 "A"로 표시된 대로 용매 피크에서 설정된다. 드롭-라인 설정 후 외삽된 기준선 및 용매 피크 그 이상은 면적 계산에 포함되지 않도록 제거된다(즉, 배제됨). 외삽 기준선을 제거한 후의 최종 결과는 도 21을 참조한다.

피크 통합 및 넘버링

하나 이상의 단편 피크가 존재하는 경우, 피크를 분리하는 계곡의 최소값에서 직교 분할에 의해, 피크를 서로, 그리고 주요 피크(단량체)로부터 분리한다. 단편 피크가 주요 피크와 밀접하게 연관되어 있고 주요 피크와 응집체 피크가 숄더에 의해서만 분리되는 경우, 숄더의 변곡점에서 분할이 설정될 수 있다. 주요 피크와 응집체 피크 사이에 하나의 분할만 설정되어야 한다. 응집체는 보고되지 않지만 총 면적 계산을 위해 통합되고 순도 측정을 위해 주요 피크에서 분리된다. 대안적으로, 단량체 피크와 응집체 피크 사이에 분할이 설정되지 않는다. 응집체 및 단량체 피크는 대신 "주요 피크"라고 하는, 하나의 단일 피크로 간주된다.

참조, LOQ 및 샘플 용액의 통합을 위해, 존재하는 경우 블랭크로부터의 피크를 통합하지 않는다.

단편 피크는 주요 피크에 대한 용리 시간에 따라 식별된다. 주요 피크 / 단량체 이후에 용리되는 피크는 단편 / 분해 생성물(DPx로 명명됨)에 할당된다.

순도 계산

모든 통합 피크(주요 + 단편 + 응집체)의 피크 면적(mAU*min)을 결정한다(응집체는 하나의 단위로 통합되며 개별 응집체 피크가 있는 경우 개별 응집체 피크간 분할되지 않음).

대안적으로, 주요 피크의 피크 면적(mAU*min)을 결정한다(응집체 및 단량체 피크는 이러한 피크 사이에 분할이 없는 하나의 단위로 통합됨). 순도를 분석 평가(3회 주입)와 병행하여 평가하는 경우 순도 계산을 위해 3회 주입의 평균을 취한다.

각 샘플에 대해 각 단편 피크 및 주요 피크의 면적 백분율(% P)을 계산한다. 단편들의 상대 피크 면적의 합(%)을 계산한다

피크 < 1.0%(LOQ)는 총합 단편의 계산에 포함되지 않는다

각 피크의 % P는 하기 식에 따라 계산한다:

a_rs: 샘플 용액 크로마토그램에서 특이적 피크의 피크 면적(mAU*min)

a_t: 샘플 용액 크로마토그램의 총 피크 면적 (mAU*min). 모든 통합 피크(응집체 피크 포함)가 포함된다.

용리 시간차

측정된 샘플의 주요 피크 대 참조 표준의 주요 피크(순서의 첫 번째 및 마지막 기준의 평균 용리 시간)의 Δ(델타) 시간차, 즉, 시간 주요 피크 참조(평균, 분) - 시간 주요 피크 샘플(분)의 주요 피크로 정의된 용리 시간차.

분석 계산

원료의약품

모든 참조 용액 주입의 평균 총 피크 면적(n=6; A_r)(순서의 샘플 전후, 또는 위에 예시된 바와 같이 샘플이 15개 초과인 경우 중간에 추가)을 주입된 각 샘플의 평균 총 피크 면적(A_s)과 비교한다. 대안적으로, 15개 초과의 샘플 주입에 대해, 브라켓 접근방식이 적용된다. 각 브라켓의 경우, 참조(n=6)의 총 피크 면적의 평균(첫 번째 브라켓의 경우 A_r1 및 두번째 브라켓의 경우 A_r2)을 사용하여 분석을 계산한다.

하기 식에 따라 샘플 농도(mg/mL)를 계산한다:

A_r: 모든 참조 용액 주입(n=6)의 평균 총 피크 면적

A_s: 주입된 각 샘플(n=3)의 평균 총 피크 면적

Cs: 희석되지 않은 샘플의 농도(mg/mL)

Cr: 희석되지 않은 참조의 농도(mg/mL)

Ds: 샘플 희석 계수(희석 계수가 없으면 Ds =1)

Dr: 참조 희석 계수(희석 계수가 없으면 Dr =1)

의약품

하기 식에 따라 공식 함량의 백분율(%)을 계산한다:

A_r: 모든 참조 용액 주입(n=6)의 평균 총 피크 면적

A_s: 주입된 각 샘플(n=3)의 평균 총 피크 면적

CL: 활성 약제학적 성분(루브리신)의 의약품의 이론적 농도(mg/mL)

Cr: 희석되지 않은 참조의 농도(mg/mL)

Ds: 샘플 희석 계수(희석 계수가 없으면 Ds =1)

Dr: 참조 희석 계수(희석 계수가 없으면 Dr =1)

보고

순도: 단량체(주요 피크)의 피크 면적 백분율(% P) 및 단편 / 분해 생성물(DP)의 합계(%)를 보고한다.

대안적으로, 순도는 주요 피크(단일 단위로서의 응집체 및 단량체 피크)의 피크 면적 백분율(% P) 및 단편 / 분해 생성물(DP)의 합계(%)로 보고된다.

각 단편의 % P / DP 피크 ≥ 1.0%(LOQ)를 해당 상대 용리 시간(단량체에 상대적)과 함께 정보를 위해 보고한다.

정보를 위해 각 샘플 주요 피크 대 참조 주요 피크(평균 값)에 대한 Δ(델타) 시간 차이를 소수점 둘째 자리까지, X.XX min로 반올림하여 보고한다.

분석:

원료의약품: 샘플 당 결과를 mg/mL 단위로 보고한다(예를 들어, 소수점 둘째 자리).

의약품: 선언된 내용의 백분율(%)로 결과를 보고한다(예를 들어, 소수점 첫째 자리).

실시예 5:

분석용 분석법: 역상 크로마토그래피(RPC)에 의한 분석 및 순도

루브리신은 RPC에 의해 각각 초기 피크 및 주요 피크로 칭해지는 두 개의 주된 피크 그룹으로 분해된다. 2개의 주요 피크 그룹의 피크 면적 대 총 피크 면적은 상대적인 피크 면적 백분율로 표현되는 순도를 정의한다.

분석은 샘플의 평균 총 피크 면적과 참조 용액의 브라케팅 주입의 평균 총 피크 면적의 상대적 비교에 의해 정의된다.

이 방법은 일반적으로 "샘플"로 칭해지는 루브리신 원료의약품(DS) 및 의약품(DP)에 적용할 수 있다.

하기 용액을 사용한다:

하기 크로마토그래피 컬럼, 조건들 및 구배를 사용할 수 있다.

테스트 과정

테스트 용액

주입 순서

하기와 같이 순서를 실행한다. 참조는 순서의 시작과 끝에 주입된다. 주어진 예는 최대 10개의 샘플에 대한 것이다. 10개 초과의 샘플을 주입하는 경우, 각 10번째 샘플 주입 후에 블랭크를 실행해야 한다.

시스템 적합성 테스트(SST)

SST는 각 테스트 시리즈 전에 수행된다. 모든 SST 요건들이 수락된 경우에만 샘플 평가를 진행한다.

SST 요건들

평가

초기-용리 피크(EP), 주요 피크 및 잠정 후기-용리 피크(LP)를 포함하는 대략 1~4분 범위에서 블랭크 용액에 오버레이의 첫 번째 용리 피크에서 마지막 용리 피크까지의 기준선을 그린다.

대안적으로, 도 28a 및 도 28b와 유사한 기준선을 그린다. 첫 번째 용리 피크(EP) 또는 피크 그룹과 주요 피크에는 별도의 기준선이 포함된다. 초기-용리 피크(EP), 주요 피크 및 잠정 후기-용리 피크(LP)를 포함하는 대략 1~4분 범위에서 블랭크 용액에 관해 기준선을 그린다.

피크 통합 및 넘버링

주요 피크는 이들을 분리하는 골짜기의 최소값 또는 변곡점에서 직교 분할에 의해 분리될 수 있다(예를 들어 도 24 및 도 25 참조). 용매 / 주입 피크 또는 블랭크 용액으로부터 유래하는 피크가 있는 경우, 통합하지 않는다.

피크는 주요 피크에 대한 그들의 체류 시간에 따라 식별된다. 주요 피크 이전에 용리되는 피크는 조기 용리 피크(EP라고 함)에 할당되고 주요 피크 이후에 용리되는 피크는 후기 용리 피크(LP라고 함)에 할당된다. 현재 참조 표준의 EP는 하나의 주요하지만 이종성의 피크를 구성한다. EP 피크는 하나의 단위로 통합되며, 도 24 및 도 23을 참고한다. 추가 EP가 주요 EP보다 먼저 용리되거나 주요 EP와 주요 피크 사이에서의 용리가 검출되는 경우, 해당 피크는 이들을 분리하는 최소 골짜기에서 직교 분할에 의해, 또는 분리된 및 독립 기준선으로, 주요 EP와 별도로 통합된다(도 29에서 스트레스를 받은 샘플의 예 참조). 골짜기나 변곡점에 의해 주요 피크에서 분리되는 경우, 피크 또는 피크 그룹으로 통합되어야 하는 LP에도 유사한 통합 원칙이 적용된다(여러 그룹의 LP가 통합된 도 29 참조).

참조 표준물의 주요 피크는 종종 이중-피크, 불완전하게 해결된 2개의 주요 피크로 분리된다. 주요 이중-피크는 골짜기에 의해 분리되지 않고 최소한 변곡점에 의해 분리되는 경우에도 (드롭라인에 의해, 주요 1 및 주요 2 생성)분할 및 통합되어야 하며, 도 24를 참조한다. 대안적으로, 주요 이중-피크는 2개의 단일 피크로 통합될 수 있다.

순도 계산

동일한 샘플에 대해 분석법 및 순도가 수행될 때, 첫번째 샘플 복제만을 사용하여 순도를 평가한다.

모든 통합 피크의 피크 면적(mAU*min)을 결정한다.

EP 및 주요 피크(존재하는 경우 이중 피크의 합)의 백분율, % P는 하기 식에 따라 계산한다:

a_rs: 크로마토그램에서, 각각 EP 및 주요의 피크 면적(mAU*min)

a_t: 샘플 용액 크로마토그램의 총 피크 면적(mAU*min) 즉, 모든 통합 피크(EP, 주요 및 Lp)의 합계 면적.

대안적으로, EP의 백분율, % P, 주요 피크 및 LP의 합은 하기 식에 따라 계산한다:

a_rs: 크로마토그램에서, 각각 EP의 피크 면적, 주요 및 LP의 합(mAU*min)

분석 계산

원료의약품

모든 참조 용액 주입 n=6의 평균 총 피크 면적(A_r)을 비교한다(순서의 샘플 전후를, 주입된 각 샘플의 평균 총 피크 면적(A_s)과 비교). (삼중으로 4개 샘플에 해당하는) 12개 초과의 샘플 주입의 경우, 브라켓 접근방법이 적용된다. 각 브라켓의 경우, 참조(n=6)의 총 피크 면적의 평균(첫 번째 브라켓의 경우 A_r1 및 두번째 브라켓의 경우 A_r2)을 사용하여 분석을 계산한다.

하기 식에 따라 샘플 농도(mg/mL)를 계산한다:

A_r: 모든 참조 용액 주입(n=6)의 평균 총 피크 면적

A_s: 주입된 각 샘플(n=3)의 평균 총 피크 면적

Cs: 희석되지 않은 샘플의 농도(mg/mL)

Cr: 희석되지 않은 참조의 농도(mg/mL)

Ds: 샘플 희석 계수(희석 계수가 없으면 Ds =1)

Dr: 참조 희석 계수(희석 계수가 없으면 Dr =1)

의약품

모든 참조 용액 주입 n=6의 평균 총 피크 면적(A_r)을 비교한다(순서의 샘플 전후를, 주입된 각 샘플의 평균 총 피크 면적(A_s)과 비교). (삼중으로 4개 샘플에 해당하는) 12개 이상의 샘플 주입의 경우, 브라켓 접근방법이 적용된다. 각 브라켓의 경우, 참조(n=6)의 총 피크 면적의 평균(첫 번째 브라켓의 경우 A_r1 및 두번째 브라켓의 경우 A_r2)을 사용하여 분석을 계산한다.

하기 식에 따라 공식 함량의 백분율(%)을 계산한다:

A_r: 모든 참조 용액 주입(n=6)의 평균 총 피크 면적

A_s: 주입된 각 샘플(n=3)의 평균 총 피크 면적

CL: 활성 약제학적 성분(ECF843)의 의약품의 이론적 농도(mg/mL)

Cr: 희석되지 않은 참조의 농도(mg/mL)

Ds: 샘플 희석 계수(희석 계수가 없으면 Ds =1)

Dr: 참조 희석 계수(희석 계수가 없으면 Dr =1)

용리 시간차

측정된 샘플의 주요 피크 대 참조 표준의 주요 피크(순서의 첫 번째 및 마지막 기준의 평균 용리 시간)의 Δ(델타) 시간차, 즉, 시간 주요 피크 샘플(분) - 시간 주요 피크 참조(평균, 분)로 정의된 용리 시간차.

보고

순도: 주요 EP 피크와 주요 피크의 합계 백분율(%P)(존재하는 경우, 주요 이중-피크 1 및 2의 합계) 보고

주요 EP 및 주요(주요 피크 1 및 2의 합)를 포함하는, 각 피크의 % P ≥1.0% (LOQ)를 정보를 위해 보고.

주요 피크 1 및 2(존재하는 경우, 이중-피크)를 구성하는 두 피크들의 백분율(%)을 정보를 위해 보고.

대안적으로, 하기 보고 기준을 사용한다.

순도: 순도(%)는 하기의 합계로 정의된다: EP(%) 및 주요 피크의 합계(%). 모든 조기-용리 피크(하나의 단위(EP)로 통합된 주요 이종성 피크, 및 추가의 조기-용리 피크(EP1, EP2, 등))가 순도(%)에 대해 고려됨을 주의한다.

순도(%), EP(%), 개별 주요 피크(%) 및 주요 피크의 합계(%)를 보고한다.

각 피크의 %P ≥ 1.0%(LOQ)를 정보를 위해 보고한다.

분석:

원료의약품용: mg/mL 단위로 샘플당 결과를 보고한다.

의약품용: 공지된 함량의 백분율(%)로 결과를 보고한다.

실시예 6:

글리코실화 분석 - O-글리칸 및 N-글리칸의 양 결정

위의 실시예 2에 기술된 방법을 사용하여 정제된 임상 DS 배치를 포함하는 원료의약품(DS) 배치의 O-글리칸은 원료의약품 배치가 먼저 이황화 환원 / 알킬화 및 트립신 소화된 후 화학적으로 방출(환원성 베타-제거)되고, 유도체화(과메틸화)되었다. O-글리칸은 전자분무 이온화 질량 분석법(ESI-MS)과 결합된 역상 크로마토그래피에 의해 프로파일링되었고, 검출 / 식별은 MS 또는 탠덤 질량 분석법(MS/MS)을 통해 수행되었다.

두 DS 배치 모두에서 검출된 주요 O-글리칸 종은 하기를 포함하였다: 모노시알화(NANA) Gal-GalNAc(코어 1 구조; 초기 DS 배치, 76%; 임상 DS 배치, 80%), Gal-GalNAc(초기 DS 배치, 9%; 임상 DS 배치, 7%), NANA** 관련 글리칸(초기 DS 배치, 11 %; 임상 DS 배치, 8%), 디시알화(2*NANA) Gal-GalNAc(초기 DS 배치, 3%; 임상 DS 배치,3%) 및 NGNA(N글리콜리뉴라민) Gal-GalNAc (초기 DS 배치, 1%; 임상 DS 배치, 1%). O-글리칸의 조성 및 상대적 존재비는 초기 및 임상 DS 배치 간에 유사했다(도 26 참조: 초기 DS 배치 = 배치 1; 임상 DS 배치 = 배치 2). 소량의 N-글리콜리뉴라민(NGNA; 약 1% 이하)이 두 배치에서 모두 검출되었다. NANA 관련 글리칸도 검출되었으며, 모노시알화(NANA) Gal-GalNAc의 산화된 형태일 수 있다. NANA 관련 글리칸은 샘플 제제의 인공물일 수 있다.

원료의약품(DS) 배치의 N-글리칸은 먼저 이황화 환원 / 알킬화 및 트립신 소화된 후 화학적으로 방출(PNGaseF)되고, 환원(수소화 붕소나트륨)되고, 유도체화(과메틸화)되었다. N-글리칸은 MALDI-TOF 질량 분석에 의해 측정 및 확인되었다. 검출 및 식별된 주요 N-글리칸은 두 배치 모두에서 유사한 수준으로 존재하는 고-만노스(Man-5, Man-6 및 Man-7)에 해당한다. Man-6이 가장 우세한 N-글리칸이었고, 그 이후로 Man-5, 및 Man-7이 우세했다.

본원에 기술된 방법을 사용하여 제조된 임상 DS 배치를 포함하여 두 배치의 O-글리칸 및 N-글리칸의 유형/이소형 및 상대적 존재비는 비슷했다(도 26 및 도 27 참조).

참조로 포함

본원에 인용된 각각의 특허 문서 및 과학 논문의 전체 개시 내용은 모든 목적을 위해 참고로 포함된다.

균등물

본 발명 및 이의 실시형태가 상세히 설명되었다. 그러나, 본 발명의 범주는 본 명세서에 기재된 임의의 공정, 제조, 물질 조성, 화합물, 수단, 방법 및/또는 단계의 특정 실시형태로 제한되는 것으로 의도되지 않는다. 본 발명의 정신 및/또는 본질적인 특징을 벗어나지 않으면서, 다양한 변경, 대체 및 변형이, 개시된 물질에 적용될 수 있다. 따라서, 당업자는 본 명세서에서 기재된 실시형태와 실질적으로 동일한 기능을 수행하거나, 실질적으로 동일한 결과를 달성하는 이후의 변경, 대체 및/또는 변형이 본 발명의 그러한 관련 실시형태에 따라 이용될 수 있음을 본 개시내용으로부터 용이하게 인지할 것이다. 따라서, 이하의 청구범위는 본 명세서에 개시된 공정, 제조, 물질 조성, 화합물, 수단, 방법 및/또는 단계의 변경, 대체 및 변형을 그의 범위 내에 포함하는 것으로 의도된다. 청구범위는 해당 효과에 대해 언급되지 않는 한, 설명된 순서 또는 요소에 제한되는 것으로 이해해서는 안 된다. 첨부된 청구범위의 범주를 벗어나지 않으면서 형태 및 세부사항의 다양한 변경이 이루어질 수 있음을 이해하여야 한다.

SEQUENCE LISTING <110> NOVARTIS AG <120> PURIFICATION OF RECOMBINANTLY PRODUCED POLYPEPTIDES <130> PAT058776-WO-PCT <140> <141> <150> 62/980,630 <151> 2020-02-24 <160> 3 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1404 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala Trp Lys Thr Leu Pro Ile Tyr Leu Leu Leu Leu Leu Ser Val 1 5 10 15 Phe Val Ile Gln Gln Val Ser Ser Gln Asp Leu Ser Ser Cys Ala Gly 20 25 30 Arg Cys Gly Glu Gly Tyr Ser Arg Asp Ala Thr Cys Asn Cys Asp Tyr 35 40 45 Asn Cys Gln His Tyr Met Glu Cys Cys Pro Asp Phe Lys Arg Val Cys 50 55 60 Thr Ala Glu Leu Ser Cys Lys Gly Arg Cys Phe Glu Ser Phe Glu Arg 65 70 75 80 Gly Arg Glu Cys Asp Cys Asp Ala Gln Cys Lys Lys Tyr Asp Lys Cys 85 90 95 Cys Pro Asp Tyr Glu Ser Phe Cys Ala Glu Val His Asn Pro Thr Ser 100 105 110 Pro Pro Ser Ser Lys Lys Ala Pro Pro Pro Ser Gly Ala Ser Gln Thr 115 120 125 Ile Lys Ser Thr Thr Lys Arg Ser Pro Lys Pro Pro Asn Lys Lys Lys 130 135 140 Thr Lys Lys Val Ile Glu Ser Glu Glu Ile Thr Glu Glu His Ser Val 145 150 155 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Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro 580 585 590 Ala Pro Thr Thr Thr Lys Lys Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro 595 600 605 Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Thr Ala Pro Thr Thr Pro Lys Lys Leu 610 615 620 Thr Pro Thr Thr Pro Glu Lys Leu Ala Pro Thr Thr Pro Glu Lys Pro 625 630 635 640 Ala Pro Thr Thr Pro Glu Glu Leu Ala Pro Thr Thr Pro Glu Glu Pro 645 650 655 Thr Pro Thr Thr Pro Glu Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Ala Ala 660 665 670 Ala Pro Asn Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro 675 680 685 Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Thr 690 695 700 Ala Pro Thr Thr Pro Lys Gly Thr Ala Pro Thr Thr Leu Lys Glu Pro 705 710 715 720 Ala Pro Thr Thr Pro Lys Lys Pro Ala Pro Lys Glu Leu Ala Pro Thr 725 730 735 Thr Thr Lys Glu Pro Thr Ser Thr Thr Ser Asp Lys Pro Ala Pro Thr 740 745 750 Thr Pro Lys Gly Thr Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr 755 760 765 Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Gly Thr Ala Pro Thr 770 775 780 Thr Leu Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Lys Pro Ala Pro Lys 785 790 795 800 Glu Leu Ala Pro Thr Thr Thr Lys Gly Pro Thr Ser Thr Thr Ser Asp 805 810 815 Lys Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Thr Ala Pro Thr Thr Pro Lys 820 825 830 Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Lys Pro Ala Pro Thr Thr Pro Glu 835 840 845 Thr Pro Pro Pro Thr Thr Ser Glu Val Ser Thr Pro Thr Thr Thr Lys 850 855 860 Glu Pro Thr Thr Ile His Lys Ser Pro Asp Glu Ser Thr Pro Glu Leu 865 870 875 880 Ser Ala Glu Pro Thr Pro Lys Ala Leu Glu Asn Ser Pro Lys Glu Pro 885 890 895 Gly Val Pro Thr Thr Lys Thr Pro Ala Ala Thr Lys Pro Glu Met Thr 900 905 910 Thr Thr Ala Lys Asp Lys Thr Thr Glu Arg Asp Leu Arg Thr Thr Pro 915 920 925 Glu Thr Thr Thr Ala Ala Pro Lys Met Thr Lys Glu Thr Ala Thr Thr 930 935 940 Thr Glu Lys Thr Thr Glu Ser Lys Ile Thr Ala Thr Thr Thr Gln Val 945 950 955 960 Thr Ser Thr Thr Thr Gln Asp Thr Thr Pro Phe Lys Ile Thr Thr Leu 965 970 975 Lys Thr Thr Thr Leu Ala Pro Lys Val Thr Thr Thr Lys Lys Thr Ile 980 985 990 Thr Thr Thr Glu Ile Met Asn Lys Pro Glu Glu Thr Ala Lys Pro Lys 995 1000 1005 Asp Arg Ala Thr Asn Ser Lys Ala Thr Thr Pro Lys Pro Gln Lys 1010 1015 1020 Pro Thr Lys Ala Pro Lys Lys Pro Thr Ser Thr Lys Lys Pro Lys 1025 1030 1035 Thr Met Pro Arg Val Arg Lys Pro Lys Thr Thr Pro Thr Pro Arg 1040 1045 1050 Lys Met Thr Ser Thr Met Pro Glu Leu Asn Pro Thr Ser Arg Ile 1055 1060 1065 Ala Glu Ala Met Leu Gln Thr Thr Thr Arg Pro Asn Gln Thr Pro 1070 1075 1080 Asn Ser Lys Leu Val Glu Val Asn Pro Lys Ser Glu Asp Ala Gly 1085 1090 1095 Gly Ala Glu Gly Glu Thr Pro His Met Leu Leu Arg Pro His Val 1100 1105 1110 Phe Met Pro Glu Val Thr Pro Asp Met Asp Tyr Leu Pro Arg Val 1115 1120 1125 Pro Asn Gln Gly Ile Ile Ile Asn Pro Met Leu Ser Asp Glu Thr 1130 1135 1140 Asn Ile Cys Asn Gly Lys Pro Val Asp Gly Leu Thr Thr Leu Arg 1145 1150 1155 Asn Gly Thr Leu Val Ala Phe Arg Gly His Tyr Phe Trp Met Leu 1160 1165 1170 Ser Pro Phe Ser Pro Pro Ser Pro Ala Arg Arg Ile Thr Glu Val 1175 1180 1185 Trp Gly Ile Pro Ser Pro Ile Asp Thr Val Phe Thr Arg Cys Asn 1190 1195 1200 Cys Glu Gly Lys Thr Phe Phe Phe Lys Asp Ser Gln Tyr Trp Arg 1205 1210 1215 Phe Thr Asn Asp Ile Lys Asp Ala Gly Tyr Pro Lys Pro Ile Phe 1220 1225 1230 Lys Gly Phe Gly Gly Leu Thr Gly Gln Ile Val Ala Ala Leu Ser 1235 1240 1245 Thr Ala Lys Tyr Lys Asn Trp Pro Glu Ser Val Tyr Phe Phe Lys 1250 1255 1260 Arg Gly Gly Ser Ile Gln Gln Tyr Ile Tyr Lys Gln Glu Pro Val 1265 1270 1275 Gln Lys Cys Pro Gly Arg Arg Pro Ala Leu Asn Tyr Pro Val Tyr 1280 1285 1290 Gly Glu Thr Thr Gln Val Arg Arg Arg Arg Phe Glu Arg Ala Ile 1295 1300 1305 Gly Pro Ser Gln Thr His Thr Ile Arg Ile Gln Tyr Ser Pro Ala 1310 1315 1320 Arg Leu Ala Tyr Gln Asp Lys Gly Val Leu His Asn Glu Val Lys 1325 1330 1335 Val Ser Ile Leu Trp Arg Gly Leu Pro Asn Val Val Thr Ser Ala 1340 1345 1350 Ile Ser Leu Pro Asn Ile Arg Lys Pro Asp Gly Tyr Asp Tyr Tyr 1355 1360 1365 Ala Phe Ser Lys Asp Gln Tyr Tyr Asn Ile Asp Val Pro Ser Arg 1370 1375 1380 Thr Ala Arg Ala Ile Thr Thr Arg Ser Gly Gln Thr 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Arg 180 185 190 Glu Leu Gln Lys Lys Leu Lys Val Lys Asp Asn Lys Lys Asn Arg Thr 195 200 205 Lys Lys Lys Pro Thr Pro Lys Pro Pro Val Val Asp Glu Ala Gly Ser 210 215 220 Gly Leu Asp Asn Gly Asp Phe Lys Val Thr Thr Pro Asp Thr Ser Thr 225 230 235 240 Thr Gln His Asn Lys Val Ser Thr Ser Pro Lys Ile Thr Thr Ala Lys 245 250 255 Pro Ile Asn Pro Arg Pro Ser Leu Pro Pro Asn Ser Asp Thr Ser Lys 260 265 270 Glu Thr Ser Leu Thr Val Asn Lys Glu Thr Thr Val Glu Thr Lys Glu 275 280 285 Thr Thr Thr Thr Asn Lys Gln Thr Ser Thr Asp Gly Lys Glu Lys Thr 290 295 300 Thr Ser Ala Lys Glu Thr Gln Ser Ile Glu Lys Thr Ser Ala Lys Asp 305 310 315 320 Leu Ala Pro Thr Ser Lys Val Leu Ala Lys Pro Thr Pro Lys Ala Glu 325 330 335 Thr Thr Thr Lys Gly Pro Ala Leu Thr Thr Pro Lys Glu Pro Thr Pro 340 345 350 Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Ser Thr Thr Pro Lys Glu Pro Thr Pro 355 360 365 Thr Thr Ile Lys Ser Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr 370 375 380 Thr Thr Lys Ser Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr 385 390 395 400 Thr Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr 405 410 415 Thr Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys Ser Ala Pro Thr Thr Pro 420 425 430 Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Lys Pro Ala Pro Thr Thr Pro 435 440 445 Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Thr Pro Thr Thr Pro 450 455 460 Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys 465 470 475 480 Glu Pro Ala Pro Thr Ala Pro Lys Lys Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys 485 490 495 Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys 500 505 510 Glu Pro Ser Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys 515 520 525 Ser Ala Pro Thr Thr Thr Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys Ser 530 535 540 Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ser Pro Thr Thr Thr Lys Glu Pro 545 550 555 560 Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Lys Pro 565 570 575 Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro 580 585 590 Ala Pro Thr Thr Thr Lys Lys Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro 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1015 1020 Pro Thr Lys Ala Pro Lys Lys Pro Thr Ser Thr Lys Lys Pro Lys 1025 1030 1035 Thr Met Pro Arg Val Arg Lys Pro Lys Thr Thr Pro Thr Pro Arg 1040 1045 1050 Lys Met Thr Ser Thr Met Pro Glu Leu Asn Pro Thr Ser Arg Ile 1055 1060 1065 Ala Glu Ala Met Leu Gln Thr Thr Thr Arg Pro Asn Gln Thr Pro 1070 1075 1080 Asn Ser Lys Leu Val Glu Val Asn Pro Lys Ser Glu Asp Ala Gly 1085 1090 1095 Gly Ala Glu Gly Glu Thr Pro His Met Leu Leu Arg Pro His Val 1100 1105 1110 Phe Met Pro Glu Val Thr Pro Asp Met Asp Tyr Leu Pro Arg Val 1115 1120 1125 Pro Asn Gln Gly Ile Ile Ile Asn Pro Met Leu Ser Asp Glu Thr 1130 1135 1140 Asn Ile Cys Asn Gly Lys Pro Val Asp Gly Leu Thr Thr Leu Arg 1145 1150 1155 Asn Gly Thr Leu Val Ala Phe Arg Gly His Tyr Phe Trp Met Leu 1160 1165 1170 Ser Pro Phe Ser Pro Pro Ser Pro Ala Arg Arg Ile Thr Glu Val 1175 1180 1185 Trp Gly Ile Pro Ser Pro Ile Asp Thr Val Phe Thr Arg Cys Asn 1190 1195 1200 Cys Glu Gly Lys Thr Phe Phe Phe Lys Asp Ser Gln Tyr Trp Arg 1205 1210 1215 Phe Thr Asn Asp 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Claims

재조합 루브리신 당단백질을 정제하는 방법으로서, 상기 루브리신 당단백질을 함유하는 세포 배양 수확물을, 임의의 순서로 수행되는, 다중모드 양이온 교환 크로마토그래피(MCC), 다중모드 음이온 교환 크로마토그래피(MAC), 및 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)에 적용시키는 단계들을 포함하는, 방법.
제1항에 있어서,
상기 단계들이 하기 순서로 수행되는, 방법:
a) MCC, b) MAC, 및 c) HIC.
제2항에 있어서,
단계 a) 전에, 배양물내 세포를 MgCl₂ 및 엔도뉴클레아제와 접촉시키고, 세포를 수확하여 상기 세포 배양 수확물을 수득하는, 방법.
제2항에 있어서,
상기 배양물내 세포는 약 1,000 L, 약 1,500 L, 약 2,000 L, 또는 약 2,500 L의 배양물 부피로 있는, 방법.
제2항에 있어서,
단계 a) 전에, 세포 배양 수확물이 MgCl₂및 엔도뉴클레아제와 접촉되는, 방법.
제4항에 있어서,
상기 세포 배양 수확물은 약 1,000 L, 약 1,500 L, 약 2,000 L, 또는 약 2,500 L의 세포 배양물 부피로부터 유래되는, 방법.
제2항 또는 제4항에 있어서,
상기 엔도뉴클레아제는 Benzonase® 엔도뉴클레아제인, 방법.
제4항에 있어서,
상기 세포 배양 수확물은 MgCl₂및 엔도뉴클레아제와 접촉되기 전에 2~8℃까지 냉각되는, 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
다중모드 음이온 교환 크로마토그래피(MAC) 단계 후 및 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 단계 전에 바이러스 불활성화 단계를 추가로 포함하는, 방법.
제8항에 있어서,
상기 바이러스 불활성화 단계는 단계 b)에서 수득된 용액의 pH를 약 3.4 - 3.6으로 조정하는 단계를 포함하는, 방법.
제10항에 있어서,
상기 용액을 적어도 1시간 동안 인큐베이션한 후, 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 단계 전에 pH가 약 7.0으로 조정되는, 방법.
제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 단계 전에 심층 여과 단계를 포함하는, 방법.
제12항에 있어서,
상기 심층 여과 단계가 바이러스 불활성화 단계에 후속하는, 방법.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 단계 후 바이러스 제거 단계를 포함하는, 방법.
제14항에 있어서,
상기 바이러스 제거 단계는 나노여과를 포함하는, 방법.
제14항 또는 제14항에 있어서,
바이러스 제거 단계 후 한외여과 단계를 추가로 포함하는, 방법.
제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
바이러스 제거 단계 후 제2 바이러스 불활성화 단계를 포함하는, 방법.
제16항에 있어서,
상기 제2 바이러스 불활성화 단계는 디메틸우레아 용액을 첨가하는 단계를 포함하는, 방법.
제16항 또는 제18항에 있어서,
제2 바이러스 불활성화 단계 후 한외여과 단계를 포함하는, 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서,
하나 이상의 한외여과 및/또는 나노여과 단계들을 추가로 포함하는, 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서,
하나 이상의 바이러스 불활성화 단계들을 추가로 포함하는, 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서,
하나 이상의 바이러스 제거 단계들을 추가로 포함하는, 방법.
제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 재조합 루브리신 당단백질은 서열번호 1 또는 2의 아미노산 잔기 25-1404의 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
재조합 루브리신 당단백질의 분자량의 적어도 30%가 글리코시드 잔기로부터 유래되는, 방법.
제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
루브리신 당단백질의 O-글리코실화의 적어도 90%가 코어 1 글리코실화인, 방법.
제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
루브리신 당단백질은 O-글리칸 종을 포함하며, 여기서 O-글리칸 종은 약 7% 이상 Gal-GalNAc, 약 80% 이상 2,3-NeuAc 코어 1, 약 3% 이상 2*NeuAc 코어 1, 및 약 1% 이상 2,3-NeuGc 코어 1을 포함하는, 방법.
제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
루브리신 당단백질이 루브리신 당단백질의 mg 당 약 50 μg 이상 NANA를 포함하는, 방법.
제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
루브리신 당단백질이 루브리신 당단백질의 mg 당 약 10 μg 이하 NGNA를 포함하는, 방법.
제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서,
루브리신 당단백질이 루브리신 당단백질의 mg 당 약 100 μg 이상 Gal를 포함하는, 방법.
제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서,
루브리신 당단백질이 루브리신 당단백질의 mg 당 약 100 μg 이상 GalNAc를 포함하는, 방법.
제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득된 재조합 루브리신 당단백질.
제30항에 따른 재조합 루브리신 당단백질 및 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약제학적 조성물.
제32항에 있어서,
역상 크로마토그래피(RPC)에 의해 측정 시, 약제학적 조성물의 순도가 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상인, 약제학적 조성물.
제32항 또는 제32항에 있어서,
재조합 루브리신 당단백질의 응집체를 1% 미만으로 포함하는, 약제학적 조성물.
제32항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서,
재조합 루브리신 당단백질의 단편을 1% 미만으로 포함하는, 약제학적 조성물.
제32항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서,
≤ 1,000 ng 숙주 세포 단백질/mg 재조합 루브리신 당단백질(ng/mg), ≤ 900 ng/mg, ≤ 800 ng/mg, ≤ 700 ng/mg, ≤ 600 ng/mg, ≤ 500 ng/mg, ≤ 400 ng/mg, ≤ 300 ng/mg, ≤ 250 ng/mg, ≤ 200 ng/mg, ≤ 150 ng/mg, 또는 ≤ 100 ng/mg을 포함하는, 약제학적 조성물.
제32항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서,
≤ 10,000 pg 숙주 세포 DNA/mg 재조합 루브리신 당단백질(pg/mg), ≤ 5,000 pg/mg, ≤ 1,000 pg/mg, ≤ 500 pg/mg, ≤ 100 pg/mg, ≤ 50 pg/mg, ≤ 10 pg/mg, 또는 ≤ 5 pg/mg을 포함하는, 약제학적 조성물.
제32항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서,
박테리아 내독소 테스트(BET)에 의해 측정 시, 8 내독소 단위(EU)/mL 미만, 1 EU/mL 미만, 0.1 EU/mL 미만, 또는 0.01 EU/mL 미만을 포함하는, 약제학적 조성물.
제32항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서,
1 콜로니 형성 단위(CFU)/mL 미만, 1 CFU/2 mL 미만, 1 CFU/3 mL 미만, 1 CFU/4 mL 미만, 1 CFU/5 mL 미만, 1 CFU/6 mL 미만, 1 CFU/7 mL 미만, 1 CFU/8 mL 미만, 1 CFU/9 ml 미만, 또는 1 CFU/10 ml 미만의 총 호기성 미생물 계수(TAMC)를 갖는, 약제학적 조성물.
제32항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서,
1 콜로니 형성 단위(CFU)/mL 미만, 1 CFU/2 mL 미만, 1 CFU/3 ml 미만, 1 CFU/4 ml 미만, 1 CFU/5 ml 미만, 1 CFU/6 ml 미만, 1 CFU/7 ml 미만, 1 CFU/8 ml 미만, 1 CFU/9 ml 미만, 또는 1 CFU/10 ml 미만의 총 조합된 효모/곰팡이 계수(TYMC)를 갖는, 약제학적 조성물.
제32항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물이 5℃에서 적어도 24개월 동안 안정한, 약제학적 조성물.
제32항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물이 25℃에서 적어도 1개월 동안 안정한, 약제학적 조성물.
제32항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물이 약 0.15 mg 재조합 루브리신 당단백질/ml(mg/ml), 약 0.20 mg/ml, 약 0.25 mg/ml, 약 0.30 mg/ml, 약 0.35 mg/ml, 약 0.40 mg/ml, 약 0.45 mg/ml, 약 0.50 mg/ml, 약 0.55 mg/ml, 약 0.60 mg/ml, 약 0.70 mg/ml, 약 0.8 mg/ml, 약 0.9 mg/ml, 약 1.0 mg/ml, 약 1.5 mg/ml, 약 1.6 mg/ml, 약 1.7 mg/ml, 약 1.8 mg/ml, 약 1.9 mg/ml, 약 2.0 mg/ml, 약 2.1 mg/ml, 약 2.2 mg/ml, 약 2.3 mg/ml, 약 2.4 mg/ml, 약 2.5 mg/ml, 약 2.6 mg/ml, 약 2.7 mg/ml, 약 2.8 mg/ml, 약 2.9 mg/ml, 약 3.0 mg/ml, 약 3.5 mg/ml, 약 4.0 mg/ml, 약 0.15 mg/ml 내지 약 3.0 mg/ml, 약 0.45 mg/ml 내지 약 3.0 mg/ml, 약 0.15 mg/ml 내지 약 0.45 mg/ml, 약 1.5 mg/ml 내지 약 3.0 mg/ml, 약 1.5 mg/ml 내지 약 3.5 mg/ml, 약 2.0 mg/ml 내지 약 3.0 mg/ml, 약 1.5 mg/ml 내지 약 2.5 mg/ml, 또는 약 2.0 mg/ml 내지 약 4.0 mg/ml의 초기 농도를 갖는, 약제학적 조성물.
제32항 내지 제42항 중 어느 한 항의 약제학적 조성물을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 안구 표면 장애의 치료 방법.
제44항에 있어서,
상기 안구 표면 장애가 안구 건조증인, 방법.