JP2023515504A - 組み換え産生されたポリペプチドの精製 - Google Patents

Abstract

本発明は、広義には、重グリコシル化組み換えタンパク質（例えば、ムチン、及びラブリシンなどのムチン様タンパク質）を産生するためのプロセスに関し、本プロセスは、１つ以上のバイオリアクターを含むシステム内の液体培地中で糖タンパク質を産生することが可能な哺乳動物細胞を培養して、糖タンパク質を濃縮及び精製並びに配合することを含み、本精製は、１つ以上のクロマトグラフィー工程、エンドヌクレアーゼ工程、及び少なくとも１工程のウイルス不活化を含む。特定の態様では、本発明は、精製された組み換えヒトラブリシンを含む医薬組成物、及びそれを必要とする対象を治療する方法に関する。

Description

関連出願の相互参照
本願は、参照によりその全体が全ての目的に関して本明細書に組み込まれる２０２０年２月２４日出願の米国特許出願第６２／９８０，６３０号明細書に対する利益及び優先権を主張する。

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的手段により提出されており、且つその全体が参照により本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０２１年１月２９日に作成された上記のＡＳＣＩＩコピーの名称はＰＡＴ０５８７７６－ＷＯ－ＰＣＴ＿ＳＬ．ｔｘｔであり、サイズは２４，７３８バイトである。

本発明は、重グリコシル化組み換えタンパク質の産生及び精製のプロセス、並びに精製された重グリコシル化組み換えタンパク質を含む組成物に関する。

プロテオグリカン４（ＰＲＧ４）遺伝子の生成物であるラブリシン又はＰＲＧ４は、滑膜細胞及び表層ゾーンの軟骨細胞によって高度に発現する（Ｒｈｅｅ ＤＫ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．２００５ Ｍａｒ；１１５（３）：６２２－３１）。ラブリシンは、関節軟骨の重要な境界潤滑剤として機能する糖タンパク質であり、通常は滑液から隔離されている（Ｓｗａｎｎ ＤＡ ｅｔ ａｌ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９８１ Ｊｕｎ １０；２５６（１１）：５９２１－５）。

ラブリシンは１２個のエクソンにわたる全長を有するＰＲＧ４遺伝子から発現されるが、複数の天然のトランケートバージョンが報告されている。ラブリシンの分子は長い屈曲性分子であり、約２００ｎｍの完全伸長「輪郭」長ｌｃ、及び数ナノメートルの直径を有する。その分子量は、およそＭｗ約２８０～３２０ｋＤａである。分子の中心部分は「ムチンドメイン」として知られ、高グリコシル化されている（Ｊａｙ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｊ．２００１，１８（１０），８０７－８１５）。このムチンドメイン内で、主に極性ガラクトース（全グリカンの約３３％）及び負に荷電したシアル酸（全グリカンの約６６％）によって終端している短グリカンオリゴマーは、スレオニン及びセリン残基にＯ－結合している（Ｊａｙ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｊ．２００１，１８（１０），８０７－８１５；Ｅｓｔｒｅｌｌａ，Ｒ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２０１０，４２９（２），３５９－３６７）。豊富な負荷電し且つ高次に水和された糖基によって、この中心ムチンドメインは、ラブリシンの潤滑、及び抗接着特性の両方を司るものと考えられている（Ａｎｉｎｗｅｎｅ，Ｇ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．，Ｐａｒｔ Ａ ２０１５，１０３ （２），４５１－４６２；Ｇｒｅｅｎｅ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ２０１５，５３（０），１２７－１３６）。ムチンドメインのいずれかの末端に隣接するのは、タンパク質の軽グリコシル化「末端ドメイン」であり、これらは細胞間及び細胞－細胞外マトリックス間の相互作用、例えば結合において特別な役割を果たすことが知られている２つの球状タンパク質であるソマトメジンＢ及びホメオペキシン（ｈｏｍｅｏｐｅｘｉｎ）に類似したサブドメインを含有する（Ｊａｙ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｊ．２００１，１８（１０），８０７－８１５；Ｅｓｔｒｅｌｌａ，Ｒ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２０１０，４２９（２），３５９－３６７）。これらの末端ドメインは、極めて「粘着性」であり、ほぼ全ての種類の表面に付着することができる。これらの末端ドメインはまた、互いに会合して分子の「ループ」を形成し、且つ、ラブリシンが容易に二量体、三量体、及び四量体、並びにより大きい緩やかにねじれた凝集体構造を形成することを可能にすることが示されている（Ｚａｐｐｏｎｅ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｇｍｕｉｒ ２００８，２４（４），１４９５－１５０８）。

ラブリシンへの大きな薬学的及び科学的関心が存在する。関節炎症状の悪化を遅延させるためにラブリシンを滑膜に注射投与することが提案されてきた。例えば、米国特許第８，０２６，３４６号明細書及び米国特許出願公開第２００９０１０４１４８号明細書を参照されたい。米国特許出願公開第２０１３０１１６１８６号明細書は、関節炎を発症するリスクのある無症候の関節にラブリシンを注射して、関節の潤滑を保存及び増進し、軟骨細胞を保存し、これらが生成する内因性ラブリシンの健全な発現を促進することを開示している。ラブリシンはまた、用途の中でもとりわけ、ドライアイ疾患用の局所治療として、及び間質性膀胱炎の治療としての使用も提案されている。

ヒトに適用する場合、全ての医薬物質は個別の基準を満たす必要がある。好ましくは、バイオ医薬品は非常に高い純度を有し、宿主細胞タンパク質及び核酸（例えばＤＮＡ）などの不純物の濃度が、所望の生成物に対して１００万分の１の範囲以下まで低減されている。規制上の仕様を満たすためには、製造プロセスの後に１つ以上の精製工程を行う必要がある。とりわけ、純度、処理量、及び収率は、適した精製プロセスを決定する上で重要な役割を果たす。商業的な医薬開発に好適な規模での組み換えラブリシンの製造及び精製におけるこれまでの試みは、不成功であったか、又は結果が低質であったかのいずれかである。組み換え発現されたラブリシン生成物、及びその多量体を混入物質から産生して精製し、同時に、凝集化及び断片化を回避し、高い収率を維持しながら、その潤滑及びその他の機能を保持することは難題である。ラブリシンの精製は、ラブリシンの重度グリコシル化、中心のムチンドメイン、及び極めて「粘着性の」末端ドメインにおける豊富な負荷電し且つ高次に水和された糖基、その高い分子量、並びに純度が増加すると錯体を形成し、凝集して不溶性微粒子を形成するその傾向のために、特に困難である。組み換えラブリシンの精製法は、米国特許出願公開第２０１６０３０４５７２号明細書に記載されている。しかしながら、不純物、特に宿主細胞タンパク質及びＤＮＡの除去を最適化し、且つ商業的開発に好適な改善された組み換えラブリシンの精製プロセスに対するニーズが依然として存在する。

特定の態様では、本発明の目的は、組み換え発現されたラブリシン糖タンパク質生成物、及びその多量体を混入物質から分離する精製プロセスを提供することであり、これは不純物からのラブリシンの効率的な精製を可能にし、同時にその生物学的機能を保持し、更に凝集を回避し、最終ラブリシンタンパク質生成物の高い収率を維持する。本明細書に記載される方法を用いて精製した、組み換えラブリシン及びその組成物、例えば組み換えラブリシンの薬学的に許容される組成物を提供することも本発明の目的である。

第１の態様では、本発明は、組み換え産生されたグリコシル化ポリペプチド、特に組み換え産生されたグリコシル化ラブリシン糖タンパク質（ｇｌｃｙｏｐｒｏｔｅｉｎ）を精製する方法に関し、方法は、３つのクロマトグラフィー工程を含む：（ａ）多モードカチオン交換クロマトグラフィー（ＭＣＣ）工程、（ｂ）多モードアニオン交換クロマトグラフィー（ＭＡＣ）工程、及び（ｃ）疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）工程。特定の実施形態では、本発明は、組み換え産生されたグリコシル化ポリペプチド、特に組み換え産生されたグリコシル化ラブリシンを精製する方法に関し、方法は、３つの連続的クロマトグラフィー工程：（ａ）多モードカチオン交換クロマトグラフィー（ＭＣＣ）からなる第１のクロマトグラフィー工程、（ｂ）多モードアニオン交換クロマトグラフィー（ＭＡＣ）からなる第２のクロマトグラフィー工程、及び（ｃ）疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）からなる第３のクロマトグラフィー工程を含む。

第２の態様では、本発明は、組み換え産生されたグリコシル化ポリペプチド、特に組み換え産生されたグリコシル化ラブリシン糖タンパク質を含む配合物中の混入物質（例えば、ポリヌクレオチド、及び／又は宿主細胞タンパク質混入）を低減させる方法に関し、方法は、（ｉ）３つのクロマトグラフィー工程：（ａ）多モードカチオン交換クロマトグラフィー（ＭＣＣ）工程、（ｂ）多モードアニオン交換クロマトグラフィー（ＭＡＣ）工程、及び（ｃ）疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）工程を含み、且つ（ｉｉ）回収された組み換え産生されたポリペプチドを含む配合物を調製する工程を更に含む。特定の実施形態では、本発明は、組み換え産生されたグリコシル化ポリペプチド、特に組み換え産生されたグリコシル化ラブリシン糖タンパク質を含む配合物中の混入物質（例えば、ポリヌクレオチド、及び／又は宿主細胞タンパク質混入）を低減させる方法に関し、方法は、（ｉ）３つの連続的クロマトグラフィー工程：（ａ）多モードカチオン交換クロマトグラフィー（ＭＣＣ）からなる第１のクロマトグラフィー工程、（ｂ）多モードアニオン交換クロマトグラフィー（ＭＡＣ）からなる第２のクロマトグラフィー工程、及び（ｃ）疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）からなる第３のクロマトグラフィー工程を含み、且つ（ｉｉ）回収された組み換え産生されたポリペプチドを含む配合物を調製する工程を更に含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組み換え産生されたグリコシル化ポリペプチドを含む配合物中の混入物質（例えば、ポリヌクレオチド、及び／又は宿主細胞タンパク質混入）を低減させる方法は、１つ以上の深層濾過工程を更に含む。いくつかの実施形態では、深層濾過工程は、ＨＩＣの前に実施される。いくつかの実施形態では、深層濾過はＨＩＣの後に実施される。いくつかの実施形態では、深層濾過はＨＩＣの前及びＨＩＣの後に実施される。いくつかの実施形態では、深層濾過は好適なフィルタ、例えばセルロース又はポリプロピレン繊維ベースのフィルタ、例えば正荷電三層Ｂ１ＨＣフィルタを用いて実施される。

特定の実施形態では、本発明は、組み換え産生されたグリコシル化ポリペプチド、特に組み換え産生されたグリコシル化ラブリシン糖タンパク質を含む医薬組成物を作製する方法に関し、方法は、（ｉ）３つの連続的クロマトグラフィー工程：（ａ）多モードカチオン交換クロマトグラフィー（ＭＣＣ）からなる第１のクロマトグラフィー工程、（ｂ）多モードアニオン交換クロマトグラフィー（ＭＡＣ）からなる第２のクロマトグラフィー工程、及び（ｃ）疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）からなる第３のクロマトグラフィー工程を含み、且つ（ｉｉ）回収された組み換え産生されたポリペプチドを含む医薬組成物を調製する工程を更に含む。いくつかの実施形態では、組み換え産生されたグリコシル化ポリペプチドを含む医薬組成物を作製する方法は、１つ以上の深層濾過工程を更に含む。いくつかの実施形態では、深層濾過工程は、ＨＩＣの前に実施される。いくつかの実施形態では、深層濾過はＨＩＣの後に実施される。いくつかの実施形態では、深層濾過はＨＩＣの前及びＨＩＣの後に実施される。いくつかの実施形態では、深層濾過は好適なフィルタ、例えばセルロース又はポリプロピレン繊維ベースのフィルタ、例えば正荷電三層Ｂ１ＨＣフィルタを用いて実施される。

更なる態様では、本発明は、本発明の方法によって精製される組み換え産生されたグリコシル化ポリペプチドに関する。特定の実施形態では、本発明は、本発明の方法によって精製されたラブリシンに関する。

いくつかの実施形態では、本発明は、本発明の方法によって産生されたグリコシル化ポリペプチドに関する。いくつかの実施形態では、本発明は、本発明の方法によって産生されたラブリシンに関する。

別の態様では、本発明は、本明細書に記載される方法によって得られる組み換えグリコシル化ポリペプチド、例えば組み換えヒトラブリシンに関する。いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載される方法によって得られる、プロテオグリカン４アイソフォームＡ（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００５７９８．３；配列番号：１）のアミノ酸２５～１４０４、プロテオグリカン４アイソフォームＣＲＡ＿ａ（ＮＣＢＩ参照配列：ＥＡＷ９１２０１．１；配列番号：２）のアミノ酸２５～１４０４、又は配列ＫＥＰＡＰＴＴ（配列番号３）のグリコシル化反復を含む組み換えポリペプチドの断片及びバリアントを含む組み換えグリコシル化ポリペプチドに関する。

別の態様では、本発明は、本発明の方法によって精製される組み換え産生されたグリコシル化ポリペプチド、例えばラブリシンを含む医薬組成物に関する。いくつかの実施形態では、本発明は、プロテオグリカン４アイソフォームＡ（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００５７９８．３；配列番号：１）又はアイソフォームＣＲＡ＿ａ（ＮＣＢＩ参照配列：ＥＡＷ９１２０１．１；配列番号２）のアミノ酸２５～１４０４を含むタンパク質を含む医薬組成物に関する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される医薬組成物は、組み換え産生されたグリコシル化ポリペプチド（ラブリシン）並びに医薬賦形剤又は緩衝剤（例えば、リン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、及びポリソルベート（例えばポリソルベート２０）を含む緩衝剤）を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される医薬組成物は、対象、例えば治療（例えば、眼表面障害、例えばドライアイ疾患の治療）を必要とする対象への投与に好適である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される医薬組成物は、局所投与に好適である。いくつかの実施形態では、治療を必要とする対象は霊長類である。いくつかの実施形態では、治療を必要とする対象はヒトである。

いくつかの実施形態では、本発明の方法によって精製される組み換え産生されたグリコシル化ポリペプチドを含む医薬組成物は、規定のレベル（複数可）のグリコシル化ポリペプチド、混入物質、及び／又は純度を有する。例えば、いくつかの実施形態では、本発明の方法によって精製された医薬組成物の純度は、逆相クロマトグラフィー（ＲＰＣ）によって決定して８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上、又は９９．９％以上である。いくつかの実施形態では、本発明の方法によって精製される組み換え産生されたグリコシル化ポリペプチドを含む医薬組成物は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって決定して、約１０％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２％以下、又は約１％以下、好ましくは１％未満の組み換え産生されたグリコシル化ポリペプチドの凝集体を含む。いくつかの実施形態では、本発明の方法によって精製される組み換え産生されたグリコシル化ポリペプチドを含む医薬組成物は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって決定して、約１０％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２％以下、又は約１％以下、好ましくは１％未満の組み換え産生されたグリコシル化ポリペプチドの断片を含む。

いくつかの実施形態では、本発明の方法によって精製される組み換え産生されたグリコシル化ポリペプチドを含む医薬組成物は、混入物質を１０百万分率（ｐｐｍ）～１０，０００ｐｐｍ、１０ｐｐｍ～１００ｐｐｍ、約１０ｐｐｍ以下、又は約５ｐｐｍ以下の濃度で含む。いくつかの実施形態では、本発明の方法によって精製される組み換え産生されたグリコシル化ポリペプチドを含む医薬組成物は、例えばＥＬＩＳＡによって測定して、≦１，０００ｎｇ／ｍｇ、≦９００ｎｇ／ｍｇ、≦８００ｎｇ／ｍｇ、≦７００ｎｇ／ｍｇ、≦６００ｎｇ／ｍｇ、≦５００ｎｇ／ｍｇ、≦４００ｎｇ／ｍｇ、≦３００ｎｇ／ｍｇ、≦２５０ｎｇ／ｍｇ、≦２００ｎｇ／ｍｇ、≦１５０ｎｇ／ｍｇ、又は≦１００ｎｇ／ｍｇの宿主細胞タンパク質含有量（例えば≦１，０００ｎｇの宿主細胞タンパク質／ｍｇ原薬）を含む。いくつかの実施形態では、本発明の方法によって精製される組み換え産生されたグリコシル化ポリペプチドを含む医薬組成物は、ｑＰＣＲによって測定して≦２００，０００ｐｇ／ｍｇ、≦１００，０００ｐｇ／ｍｇ、≦５０，０００ｐｇ／ｍｇ、≦１０，０００ｐｇ／ｍｇ、≦５，０００ｐｇ／ｍｇ、≦１，０００ｐｇ／ｍｇ、≦５００ｐｇ／ｍｇ、≦１００ｐｇ／ｍｇ、≦５０ｐｇ／ｍｇ、≦１０ｐｇ／ｍｇ、又は≦５ｐｇ／ｍｇの残留宿主細胞ＤＮＡ含有量（例えば≦１００，０００ｐｇの残留宿主細胞ＤＮＡ／ｍｇ原薬）を含む。いくつかの実施形態では、本発明の方法によって精製される組み換え産生されたグリコシル化ポリペプチドを含む医薬組成物は、細菌エンドトキシン試験法（ＢＥＴ）によって決定して、８エンドトキシン単位（ＥＵ）／ｍＬ未満、１ＥＵ／ｍＬ未満、０．１ＥＵ／ｍＬ未満、又は０．０１ＥＵ／ｍＬ未満の細菌エンドトキシン含有量を含む。いくつかの実施形態では、本発明の方法によって精製される組み換え産生されたグリコシル化ポリペプチドを含む医薬組成物は、１コロニー形成単位（ＣＦＵ）／ｍＬ未満、１ＣＦＵ／２ｍｌ未満、１ＣＦＵ／３ｍｌ未満、１ＣＦＵ／４ｍｌ未満、１ＣＦＵ／５ｍｌ未満、１ＣＦＵ／６ｍｌ未満、１ＣＦＵ／７ｍｌ未満、１ＣＦＵ／８ｍｌ未満、１ＣＦＵ／９ｍｌ未満、又は１ＣＦＵ／１０ｍｌ未満の総好気性微生物含有量（ＴＡＭＣ）を含む。いくつかの実施形態では、本発明の方法によって精製される組み換え産生されたグリコシル化ポリペプチドを含む医薬組成物は、１ＣＦＵ／ｍＬ未満、１ＣＦＵ／２ｍｌ未満、１ＣＦＵ／３ｍｌ未満、１ＣＦＵ／４ｍｌ未満、１ＣＦＵ／５ｍｌ未満、１ＣＦＵ／６ｍｌ未満、１ＣＦＵ／７ｍｌ未満、１ＣＦＵ／８ｍｌ未満、１ＣＦＵ／９ｍｌ未満、又は１ＣＦＵ／１０ｍｌ未満の総真菌数含有量（ｔｏｔａｌ ｙｅａｓｔ ａｎｄ ｍｏｌｄ ｃｏｎｔｅｎｔ、ＴＹＭＣ）を含む。

いくつかの実施形態では、本発明の方法によって精製される組み換え産生されたグリコシル化ポリペプチドを含む医薬組成物は、約５℃以下で約２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ヶ月、若しくはそれ以上、少なくとも２０～３０ヶ月、又は少なくとも２４ヶ月間安定する。いくつかの実施形態では、本発明の方法によって精製される組み換え産生されたグリコシル化ポリペプチドを含む医薬組成物は、１週間、２週間、３週間、４週間、１ヶ月、若しくはそれ以上、又は少なくとも１週間～１ヶ月、若しくは少なくとも１ヶ月間、２５℃で安定する。いくつかの実施形態では、ｒｈラブリシンの安定な組成物は、約０．１５ｍｇ／ｍｌ、約０．２０ｍｇ／ｍｌ、約０．２５ｍｇ／ｍｌ、約０．３０ｍｇ／ｍｌ、約０．３５ｍｇ／ｍｌ、約０．４０ｍｇ／ｍｌ、約０．４５ｍｇ／ｍｌ、約０．５０ｍｇ／ｍｌ、約０．５５ｍｇ／ｍｌ、約０．６０ｍｇ／ｍｌ、又は約０．１５ｍｇ／ｍｌ～約０．４５ｍｇ／ｍｌの初期濃度を有する。

本発明のいくつかの実施形態では、組み換え産生されたグリコシル化ポリペプチド（例えば、本発明の方法によって産生又は精製された組み換え産生されたグリコシル化ポリペプチド）を含む医薬組成物は、約０．１５ｍｇ／ｍｌ、約０．２０ｍｇ／ｍｌ、約０．２５ｍｇ／ｍｌ、約０．３０ｍｇ／ｍｌ、約０．３５ｍｇ／ｍｌ、約０．４０ｍｇ／ｍｌ、約０．４５ｍｇ／ｍｌ、約０．５０ｍｇ／ｍｌ、約０．５５ｍｇ／ｍｌ、約０．６０ｍｇ／ｍｌ、約１．０ｍｇ／ｍｌ、約１．１ｍｇ／ｍｌ、約１．２ｍｇ／ｍｌ、約１．３ｍｇ／ｍｌ、約１．４ｍｇ／ｍｌ、約１．５ｍｇ／ｍｌ、約１．６ｍｇ／ｍｌ、約１．７ｍｇ／ｍｌ、約１．８ｍｇ／ｍｌ、約１．９ｍｇ／ｍｌ、約２．０ｍｇ／ｍｌ、約２．１ｍｇ／ｍｌ、約２．２ｍｇ／ｍｌ、約２．３ｍｇ／ｍｌ、約２．４ｍｇ／ｍｌ、約２．５ｍｇ／ｍｌ、約２．６ｍｇ／ｍｌ、約２．７ｍｇ／ｍｌ、約２．８ｍｇ／ｍｌ、約２．９ｍｇ／ｍｌ、約３．０ｍｇ／ｍｌ、約４．０ｍｇ／ｍｌ、約５．０ｍｇ／ｍｌ、約１．０ｍｇ／ｍｌ～３．０ｍｇ／ｍｌ、約１．６ｍｇ／ｍｌ～２．４ｍｇ／ｍｌ、又は約０．１５ｍｇ／ｍｌ～約０．４５ｍｇ／ｍｌの濃度を有する。本発明のいくつかの実施形態では、高グリコシル化ポリペプチド（例えばラブリシン）を産生又は精製する方法は、高グリコシル化ポリペプチドの濃度を希釈する工程を含む。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法は、最終クロマトグラフィー工程の後に続いて高グリコシル化ポリペプチドの濃度を希釈する工程を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法は、高グリコシル化ポリペプチドの濃度を、約１．０ｍｇ／ｍｌ、約１．１ｍｇ／ｍｌ、約１．２ｍｇ／ｍｌ、約１．３ｍｇ／ｍｌ、約１．４ｍｇ／ｍｌ、約１．５ｍｇ／ｍｌ、約１．６ｍｇ／ｍｌ、約１．７ｍｇ／ｍｌ、約１．８ｍｇ／ｍｌ、約１．９ｍｇ／ｍｌ、約２．０ｍｇ／ｍｌ、約２．１ｍｇ／ｍｌ、約２．２ｍｇ／ｍｌ、約２．３ｍｇ／ｍｌ、約２．４ｍｇ／ｍｌ、約２．５ｍｇ／ｍｌ、約２．６ｍｇ／ｍｌ、約２．７ｍｇ／ｍｌ、約２．８ｍｇ／ｍｌ、約２．９ｍｇ／ｍｌ、約３．０ｍｇ／ｍｌ、約４．０ｍｇ／ｍｌ、約５．０ｍｇ／ｍｌ、約１．０ｍｇ／ｍｌ～３．０ｍｇ／ｍｌ、又は約１．６ｍｇ／ｍｌ～２．４ｍｇ／ｍｌの濃度から、約０．１５ｍｇ／ｍｌ、約０．２０ｍｇ／ｍｌ、約０．２５ｍｇ／ｍｌ、約０．３０ｍｇ／ｍｌ、約０．３５ｍｇ／ｍｌ、約０．４０ｍｇ／ｍｌ、約０．４５ｍｇ／ｍｌ、約０．５０ｍｇ／ｍｌ、約０．５５ｍｇ／ｍｌ、約０．６０ｍｇ／ｍｌ、又は約０．１５ｍｇ／ｍｌ～約０．４５ｍｇ／ｍｌの濃度へと希釈する工程を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法は、好適な緩衝剤（例えば、リン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、及びポリソルベート（例えばポリソルベート２０）を含む緩衝剤）中における高グリコシル化ポリペプチドの濃度を希釈する工程を含む。

いくつかの実施形態では、本発明の方法によって精製される組み換え産生されたグリコシル化ポリペプチドを含む医薬組成物は、リン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、及び／又はポリソルベート（例えばポリソルベート２０）を含む最終緩衝剤溶液中で配合される。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるｒｈラブリシン組成物は、１０ｍＭのリン酸ナトリウム、１４０ｍＭの塩化ナトリウム、及び０．０２％（ｗ／ｖ）のポリソルベート２０を含む最終緩衝剤溶液中で配合される。いくつかの実施形態では、最終緩衝剤溶液は、約６．８、６．９、７．０、７．１、若しくは７．２、約６．８～約７．２、約６．９～約７．１、又は約６．９～約７．０のｐＨを有する。

本開示の非限定的実施形態は、以下の実施形態のリストに記載される。

１．組み換え糖タンパク質（例えば組み換えラブリシン）を精製する方法であって、上記の糖タンパク質を含む細胞培養収穫物を、任意の順序で実施される、多モードカチオン交換クロマトグラフィー（ＭＣＣ）、多モードアニオン交換クロマトグラフィー（ＭＡＣ）、及び疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）に供する工程を含む、方法。

２．工程が、ａ）ＭＣＣ、ｂ）ＭＡＣ、及びｃ）ＨＩＣの順序で実施される、実施形態１に記載の方法。

３．工程ａ）の前に、細胞培養収穫物がＭｇＣｌ_２及びエンドヌクレアーゼと接触する、実施形態２に記載の方法。

４．エンドヌクレアーゼはＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）エンドヌクレアーゼである、実施形態３に記載の方法。

５．細胞培養収穫物は、ＭｇＣｌ_２及びエンドヌクレアーゼと接触する前に２～８℃に冷却される、実施形態３又は４に記載の方法。

６．多モードアニオン交換クロマトグラフィー（ＭＡＣ）工程の後、且つ疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）工程の前に、ウイルス不活化工程を更に含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。

７．ウイルス不活化工程は、工程ｂ）で得た溶液のｐＨを約３．５に調節することを含む、実施形態６に記載の方法。

８．溶液を少なくとも１時間インキュベートした後、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）工程の前にｐＨが約７．０に調節されている、実施形態７に記載の方法。

９．疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）工程の後にウイルス除去工程を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。

１０．ウイルス除去工程の後に限外濾過工程を更に含む、実施形態９に記載の方法。

１１．ウイルス除去工程の後にウイルス不活化工程を含む、実施形態９に記載の方法。

１２．ウイルス不活化工程はジメチル尿素溶液を添加することを含む、実施形態１１に記載の方法。

１３．ウイルス不活化工程の後に限外濾過工程を含む、実施形態１１又は１２に記載の方法。

１４．１つ以上の限外濾過及び／又はナノ濾過工程を更に含む、実施形態１又は２に記載の方法。

１５．１つ以上のウイルス不活化工程を更に含む、実施形態１又は２に記載の方法。

１６．１つ以上のウイルス除去工程を更に含む、実施形態１又は２に記載の方法。

１７．組み換えラブリシン糖タンパク質は、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸残基２５～１４０４を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。

１８．組み換えラブリシン糖タンパク質の重量の少なくとも３５％がグリコシド残基由来である、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。

１９．ラブリシン糖タンパク質のグリコシル化のうち少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％がコア１のグリコシル化である、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。

２０．先行実施形態のいずれか１つに記載の方法によって得られる組み換えラブリシン糖タンパク質を含む組成物又は配合物。

２１．実施形態２０に記載の組み換えラブリシン糖タンパク質、及び薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。

２２．実施形態２１に記載の組み換えラブリシン糖タンパク質を患者に投与する工程を含む、眼表面障害を治療するための方法。

２３．ａ）組み換えラブリシン糖タンパク質を産生するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞クローンを生成する工程と、ｂ）好適な条件下でＣＨＯ宿主細胞を栽培し、それにより組み換えラブリシン糖タンパク質を含有する細胞培養物を得る工程と、ｃ）実施形態１～１９のいずれか１つに記載の方法に従って、細胞培養物から組み換えラブリシン糖タンパク質を精製する工程と、を含む、組み換えラブリシン糖タンパク質を産生する方法。

２４．ａ）ラブリシンタンパク質をコードする核酸分子を含む哺乳動物宿主細胞を好適な条件下で栽培する工程と、ｂ）実施形態１～１９のいずれか１つに記載の方法に従って、細胞培養物から組み換えラブリシン糖タンパク質を精製する工程と、を含む、組み換えラブリシン糖タンパク質を産生する方法。

２５．哺乳動物宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣細胞である、実施形態２４に記載の方法。

２６．ＣＨＯ細胞はＣＨＯ－Ｍ細胞である、実施形態２５に記載の方法。

２７．ラブリシンは、１パーセント未満の二量体及びより高い分子量の関連物質、１０ｐｐｍ未満の一般的宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）、０．００６ｐｇ／ＩＵ未満のＦＳＨ ＤＮＡを含み、９７パーセント超の純度を有する、実施形態２０に記載の方法。

本発明の特定の好ましい実施形態が、ある種の好ましい実施形態及び特許請求の範囲の以下のより詳細な説明から明らかになるであろう。

本発明の精製プロセスのフロー図及び説明を示す。 本発明の特定の実施形態のフローチャートを示す。 本発明の特定の実施形態のフローチャートを示す。 初期原薬（ＤＳ）バッチ及び臨床原薬バッチのＳＥＣクロマトグラムのオーバーレイである。挿入図は、臨床原薬バッチで観察された小ピークを示す拡大表示である。 検出された凝集体に関する、初期原薬（ＤＳ）バッチ及び臨床原薬バッチのＳＥＣクロマトグラムのオーバーレイである。 初期原薬（ＤＳ）バッチ及び臨床原薬バッチのＲＰＣクロマトグラムのオーバーレイである。 ３重に測定した、初期原薬（ＤＳ）バッチ及び臨床原薬バッチに関する２３０ｎｍにおけるＳＶ－ＡＵＣ吸光度プロファイルを示す。 分子量マーカー溶液（ＭＷＭ溶液）の比較クロマトグラムである。 分子量マーカー溶液（ＭＷＭ溶液）の別の比較クロマトグラムである。 分解能の計算を示すクロマトグラムである。 ラブリシンピークの定量限界（ＬＯＱ）溶液のシグナル対ノイズ比の例示的なクロマトグラムである。 ラブリシンの例示的クロマトグラム（全景）である。 凝集体及び断片を含む主ピーク、並びに溶媒ピークを示す例示的クロマトグラムである。 テーリング計数を計算するための方法を示す例示的なクロマトグラムである。 参照溶液の例示的なクロマトグラムである。 参照溶液の例示的なクロマトグラムである。 ４０度及び高ｐＨで２週間ストレスを受けた原薬の例示的なクロマトグラムである。 ＭＷＭ溶液の例示的なクロマトグラムＩである。 ＭＷＭ溶液の例示的なクロマトグラムＩＩである。 分解能の計算を示すクロマトグラムである。 溶媒ピーク及びブランクを含む拡大クロマトグラフである。 積分手順を示すクロマトグラムである。 主二重ピークの拡大図及び説明である。 主ピークの拡大クロマトグラフである。 ストレスを受けた（４０度、２日間）ラブリシンの原薬バッチの例示的なクロマトグラムである。 ２つの原薬バッチ中で検出及び同定されたＯ－グリカンを示す表である。 ２つの原薬バッチのＮ－グリカンのＭＡＬＤＩ ＴＯＦスペクトルのオーバーレイである（鏡写し図）。 図２８：図２８Ａ及び２８Ｂは参照溶液クロマトグラムの例である。 （上記の通り。） 早期溶出ピーク（ＥＰ）、主ピーク（ＭＰ）、及び後期溶出ピーク（ＬＰ）を示すクロマトグラムである。

別段に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術的及び科学的用語は、本開示が関する技術分野の当業者により一般的に理解される意味と同じ意味を有する。

下記の定義及び説明は、以下の実施例において明示的に且つ疑いなく修正されている場合を除いて、或いは、その意味を適用すると、いかなる解釈も無意味又は本質的に無意味となる場合を除いて、あらゆる将来の解釈において優先されることが意図される。用語の解釈によってそれが無意味又は本質的に無意味になる場合は、定義をＷｅｂｓｔｅｒ’ｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ，３^ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、又は当業者に既知の辞書、例えばＯｘｆｏｒｄ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｅｄ．Ａｎｔｈｏｎｙ Ｓｍｉｔｈ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，２００４）から採用すべきである。

本明細書及び特許請求の範囲で使用される単数形の「ある（ａ）」、「ある（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」とは、文脈によりそうでないことが明らかに指示されない限りにおいて、複数の指示対象を含む。例えば、「細胞」という用語は、それらの混合物を含む、複数の細胞を含む。

範囲を含む全ての数字表示、例えばｐＨ、温度、時間、濃度、及び分子量は、指定される値から±２０パーセント、又は場合によっては±１０パーセント、若しくは場合によっては±５パーセント、若しくは場合によっては±１パーセント、若しくは場合によっては±０．１パーセント変動する近似値であり、こうした変動は本開示の方法を実施する上で適切なものである。常に明示的に言明されているわけではないが、全ての数値表示には、「約」という用語を前置することを理解されたい。

量、時間的期間などの計測可能な値に言及する場合の用語「約」は、指定される値から±２０パーセント、又は場合によっては±１０パーセント、若しくは場合によっては±５パーセント、若しくは場合によっては±１パーセント、若しくは場合によっては±０．１パーセントの変動を包含することが意図され、こうした変動は本開示の方法を実施する上で適切なものである。

また、常に明示的に言明されているわけではないが、本明細書で記載される試薬は、単に例示的なものであり、当該技術分野では、このような試薬の同等物が公知であることも理解されたい。

本明細書で使用するとき、用語「溶出液」とは、溶出によって得られる溶液を指す。したがって、洗浄緩衝剤で洗浄した後のクロマトグラフィー工程から得られた溶液は、溶出液である。

用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「タンパク質」は、本明細書において互換的に使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を指し、これとしては、コード及び非コードアミノ酸、化学的若しくは生化学的修飾又は誘導体化アミノ酸、並びに改変ペプチド骨格を有するポリペプチドを挙げることができる。この用語は、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、タンパク質分解的切断などの、ポリペプチドの翻訳時（例えばシグナルペプチド切断）及び翻訳後修飾を有するポリペプチドも含む。更に、本明細書で使用するとき、「ポリペプチド」とは、タンパク質が所望の活性を維持する限りにおいて、天然配列に対する欠失、付加、及び置換（当業者に既知であるように、一般的に保存的な性質である）などの修飾を含むタンパク質を指す。これらの修飾は、部位特異的突然変異誘発によるなどの意図的なものであってもよく、或いはタンパク質を産生する宿主の変異、又はＰＣＲ増幅若しくはその他の組み換えＤＮＡ法に起因する過誤によるなどの偶発的なものであってもよい。

本明細書で使用するとき、用語「グリコシル化」とは、アミノ酸と共有結合、すなわち連結したサッカリド（又は糖）と定義される。具体的には、サッカリドはアミノ酸の側鎖に連結する。用語「グリコシル化ペプチド」、「グリコシル化ポリペプチド」、及び「グリコシル化タンパク質」は、本明細書では互換的に用いられ、グリコシル化形態の翻訳後修飾を有するポリペプチドを指す。グリコシル化は当業者に周知されており、あらゆる種類のグリコシル化を含む。特定の実施形態では、本発明の方法は、Ｎ－グリコシル化よりも多くのＯ－グリコシル化を有するタンパク質を精製するのに特に有用である。特定の実施形態では、Ｏ－グリコシル化は、主にコア１サブタイプのＯ－グリカンである（例えば、コア２コア３又はコア４よりもコア１が多いＯ－グリカン）。その他の実施形態では、本発明の方法によって産生又は精製されるタンパク質のコア１グリコシル化は、総グリコシル化の少なくとも約８５％（例えば、少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はこれ以上）である。いくつかの実施形態では、コア１グリコシル化は、本発明の方法によって産生又は精製されるタンパク質のＯ－グリコシル化の約８５％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約８５％超、約８８％超、約８９％超、約９０％超、約９１％超、約９２％超、約９３％超、約９４％超、又は約９５％超を構成する。Ｏ－グリコシル化に関与するコア１及びその他のＯ－グリカンサブタイプは、例えば、Ｃｈａｐｔｅｒ ８，Ｏ－Ｇｌｙｃａｎｓ，Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ ｏｆ Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ Ｅｄ，１９９９，Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ ｏｆ Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａで説明されている。グリコシル化は、本明細書の実施例に記載されるとおりに判定することができる。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法によって産生又は精製されるグリコシル化タンパク質のＯ－グリコシル化は、シアル酸系及び単糖系Ｏ－グリカン種を含む。例えば、本明細書に記載される方法によって精製されたグリコシル化タンパク質のＯ－グリコシル化は、以下のコア１グリカン種を含み得る：ガラクトース－β－１，３－Ｎ－アセチルガラクトサミン（別名Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃ、ガラクトース－Ｎ－アセチル化ガラクトース、Ｇａｌ－ＧａｌＮＡｃ、又はコア１）、モノシアル化Ｇａｌ－ＧａｌＮＡｃ（別名アセチルノイラミン酸α２，３－ガラクトースβ１，３－Ｎ－アセチルガラクトサミン、Ｎｅｕ５Ａｃα２－３Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃ、又は２，３－ＮｅｕＡｃコア１）、ジシアル化Ｇａｌ－ＧａｌＮＡｃ（別名Ｎ－アセチルノイラミン酸α２，３－ガラクトースβ１，３－（Ｎ－アセチルノイラミン酸α２，６－）Ｎ－アセチルガラクトサミン、Ｎｅｕ５Ａｃα２－３（Ｎｅｕ５Ａｃα２－６）Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃ、又は２＊ＮｅｕＡｃコア１）、及びＮ－グリコリノイラミン酸（Ｎ－ｇｌｙｃｏｌｙｎｅｕｒａｍｉｎｉｃ ａｃｉｄ）（Ｎ－グリコリルノイラミン酸α２，３－ガラクトースβ１，３－Ｎ－アセチルガラクトサミン、Ｎｅｕ５Ｇｃα２－３Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃ、２，３－ＮｅｕＧｃコア１、又はＮＧＮＡ）。

例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法によって産生又は精製されるグリコシル化タンパク質のＯ－グリカン組成物は、約５％～約１０％、約６％～約１０％、約７％～約１０％、約７％～約１２％、又は約７％～約９％のＧａｌ－ＧａｌＮＡｃを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法によって産生又は精製されるグリコシル化タンパク質のＯ－グリカン組成物は、約７０％～約８０％、約７０％～約９０％、約７５％～約９５％、約７５％～約９０％、約７５％～約８５％、又は約７５％～約８０％の２，３－ＮｅｕＡｃコア１を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法によって産生又は精製されるグリコシル化タンパク質のＯ－グリカン組成物は、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約１％～約６％、約２％～約５％、約３％～約６％、約３％～約５％、又は約２％～約４％の２＊ＮｅｕＡｃコア１を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法によって産生又は精製されるグリコシル化タンパク質のＯ－グリカン組成物は、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約１％～約５％、約２％～約５％、約３％～約５％、約１％～約２％、又は約１％～約３％のＮＧＮＡを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法によって産生又は精製されるグリコシル化タンパク質のＯ－グリカン組成物は、約５％～約１０％のＧａｌ－ＧａｌＮＡｃ、約７５％～約８５％の２，３－ＮｅｕＡｃコア１、約１％～約５％の２＊ＮｅｕＡｃコア１、及び約１％～約２％のＮＧＮＡを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法によって産生又は精製されるグリコシル化タンパク質のＯ－グリカン組成物は、約７％のＧａｌ－ＧａｌＮＡｃ、約８０％の２，３－ＮｅｕＡｃコア１、約３％の２＊ＮｅｕＡｃコア１、及び約１％のＮＧＮＡを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法によって産生又は精製されるグリコシル化タンパク質のＯ－グリカン組成物は、約７％以上のＧａｌ－ＧａｌＮＡｃ、約８０％以上の２，３－ＮｅｕＡｃコア１、約３％以上の２＊ＮｅｕＡｃコア１、及び約１％以上のＮＧＮＡを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法によって産生又は精製されるグリコシル化タンパク質のＯ－グリカン組成物は、少なくとも約７％のＧａｌ－ＧａｌＮＡｃ、少なくとも約８０％の２，３－ＮｅｕＡｃコア１、少なくとも約３％の２＊ＮｅｕＡｃコア１、及び少なくとも約１％のＮＧＮＡを含む。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法によって産生又は精製されるグリコシル化タンパク質のＯ－グリカン組成物は、約９％のＧａｌ－ＧａｌＮＡｃ、約７６％の２，３－ＮｅｕＡｃコア１、約３％の２＊ＮｅｕＡｃコア１、及び約１％のＮＧＮＡを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法によって産生又は精製されるグリコシル化タンパク質のＯ－グリカン組成物は、約９％以上のＧａｌ－ＧａｌＮＡｃ、約７６％以上の２，３－ＮｅｕＡｃコア１、約３％以上の２＊ＮｅｕＡｃコア１、及び約１％以上のＮＧＮＡを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法によって産生又は精製されるグリコシル化タンパク質のＯ－グリカン組成物は、少なくとも約９％のＧａｌ－ＧａｌＮＡｃ、少なくとも約７６％の２，３－ＮｅｕＡｃコア１、少なくとも約３％の２＊ＮｅｕＡｃコア１、及び少なくとも約１％のＮＧＮＡを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法によって産生又は精製されるグリコシル化タンパク質のＯ－グリカン組成物は、少なくとも約７％のＧａｌ－ＧａｌＮＡｃ、少なくとも約７６％の２，３－ＮｅｕＡｃコア１、少なくとも約３％の２＊ＮｅｕＡｃコア１、及び少なくとも約１％のＮＧＮＡを含む。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法によって産生又は精製されるグリコシル化タンパク質のＯ－グリカン組成物は、約９％のＧａｌ－ＧａｌＮＡｃ、約７６％の２，３－ＮｅｕＡｃコア１、約３％の２＊ＮｅｕＡｃコア１、約１％のＮＧＮＡ、及び約１１％のＮＡＮＡ関連グリカン（例えば、モノシアル化（ＮＡＮＡ）Ｇａｌ－ＧａｌＮＡｃの酸化形態）を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法によって産生又は精製されるグリコシル化タンパク質のＯ－グリカン組成物は、約７％のＧａｌ－ＧａｌＮＡｃ、約８０％の２，３－ＮｅｕＡｃコア１、約３％の２＊ＮｅｕＡｃコア１、約１％のＮＧＮＡ、及び約８％のＮＡＮＡ関連グリカン（例えば、モノシアル化（ＮＡＮＡ）Ｇａｌ－ＧａｌＮＡｃの酸化形態）を含む。

いくつかの実施形態では、各Ｏ－グリカン（例えばＧａｌ－ＧａｌＮＡｃ、２，３－ＮｅｕＡｃコア１、２＊ＮｅｕＡｃコア１、又はＮＧＮＡ）のパーセンテージは、以下のＯ－グリカンの合計のパーセンテージとして計算される：Ｇａｌ－ＧａｌＮＡｃ、２，３－ＮｅｕＡｃコア１、２＊ＮｅｕＡｃコア１、及びＮＧＮＡ。いくつかの実施形態では、各Ｏ－グリカンのパーセンテージは、以下の合計のパーセンテージとして計算される：Ｇａｌ－ＧａｌＮＡｃ、２，３－ＮｅｕＡｃコア１、２＊ＮｅｕＡｃコア１、ＮＧＮＡ、及びＮＡＮＡ関連グリカン（例えば、２，３－ＮｅｕＡｃコア１の酸化形態）。

いくつかの実施形態では、本発明の方法によって産生又は精製された高グリコシル化タンパク質は、グリコシル化種の含有量によって特性決定される。グリコシル化種の含有量は任意の好適な方法、例えば、ＵＳＰ－ＮＦ＜１０６５＞「Ｉｏｎ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ」の一般法に基づくイオンクロマトグラフィー（分離機構：アニオン交換）／パルスアンペロメトリック検出を用いて決定することができる。イオンクロマトグラフィー（ＩＣ）による酸放出後に精製されたグリコシル化タンパク質のＮ－アセチルノイラミン酸（ＮＡＮＡ）及びＮ－グリコリルノイラミン酸（ＮＧＮＡ）を含むシアル酸グリカン種を定量化するために分析法を用いることができる。更に、分析法は、ＩＣによる酸放出の後に、単糖含有グリカン種、例えば単糖Ｄ－（＋）－ガラクトース（Ｇａｌ）及びＮ－アセチル－Ｄ－ガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）の定量化に用いることができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法によって産生又は精製されたグリコシル化タンパク質のシアル酸グリカン含有量は、グリコシル化タンパク質１ｍｇあたり約５０μｇ以上のＮＡＮＡと、グリコシル化タンパク質１ｍｇあたり約１０μｇ以下のＮＧＮＡとを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法によって産生又は精製されるグリコシル化タンパク質の単糖グリカン含量は、グリコシル化タンパク質１ｍｇあたり約１００μｇ以上のＧａｌと、グリコシル化タンパク質１ｍｇあたり約１００μｇ以上のＧａｌＮＡｃとを含む。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法によって産生又は精製されるグリコシル化タンパク質は、１つ以上のＮ－グリコシル化種、例えば１つ以上のマンノシル化グリカン、例えばマンノース－５グリカン（別名Ｍａｎ－５ Ｎ－連結オリゴサッカリド及びオリゴマンノース５グリカン；「Ｍａｎ－５」）、マンノース－６グリカン（別名Ｍａｎ－６ Ｎ－連結オリゴサッカリド及びオリゴマンノース６グリカン；「Ｍａｎ－６」）、及びマンノース－７グリカン（別名Ｍａｎ－７ Ｎ－連結オリゴサッカリド及びオリゴマンノース７グリカン；「Ｍａｎ－７」）を含む。Ｎ－グリカン種は、タンパク質のアスパラギン（Ａｓｎ）残基のアミド窒素に結合する。本明細書では、配列番号１若しくは２の組み換えラブリシンタンパク質（例えば、本明細書で説明される方法を用いて産生若しくは精製される配列番号１若しくは２の組み換えラブリシンタンパク質）、又は配列番号１若しくは配列番号２のアミノ酸残基２５～１４０４を含む組み換えラブリシンタンパク質であって、配列番号１又は２のアスパラギン１１３５がＮ－グリコシル化されている、組み換えラブリシンタンパク質が説明される。本明細書では、配列番号１若しくは２の、又は配列番号１若しくは配列番号２のアミノ酸残基２５～１４０４を含む、組み換えラブリシンタンパク質（例えば、本明細書で説明される方法を用いて産生又は精製される組み換えラブリシンタンパク質）であって、配列番号１又は２のアスパラギン１１３５がＮ－グリコシル化されている、組み換えラブリシンタンパク質を含む組成物も説明される。本明細書では、配列番号１若しくは２の組み換えラブリシンタンパク質、又は配列番号１若しくは配列番号２のアミノ酸残基２５～１４０４を含む組み換えラブリシンタンパク質であって、配列番号１又は２のアスパラギン１１３５がＮ－グリコシル化されている、組み換えラブリシンタンパク質を精製する方法も説明される。本明細書では、配列番号１若しくは２の組み換えラブリシン（例えば、本明細書で説明される方法を用いて精製される配列番号１若しくは２の組み換えラブリシン）、又は配列番号１若しくは配列番号２のアミノ酸残基２５～１４０４を含む組み換えラブリシンタンパク質を含む組成物を配合する方法も説明され、ここでは組み換えラブリシンがＮ－グリコシル化されている。

本明細書で説明されるいくつかの実施形態では、配列番号１又は２の組み換えラブリシンのアスパラギン１１３５のＮ－グリコシル化は、Ｍａｎ－５、Ｍａｎ－６、又はＭａｎ－７である。したがって、いくつかの実施形態では、配列番号１若しくは２の組み換えラブリシンタンパク質（例えば、本明細書で説明される方法を用いて産生又は精製される組み換えラブリシンタンパク質）、又は配列番号１若しくは配列番号２のアミノ酸残基２５～１４０４を含む組み換えラブリシンタンパク質は、配列番号１又は２の組み換えラブリシンのＮ－グリコシル化アスパラギン１１３５を含み、ここで、Ｎ－グリコシル化は、Ｍａｎ－５、Ｍａｎ－６、又はＭａｎ－７である。いくつかの実施形態では、組み換えラブリシン（例えば、本明細書で説明される方法を用いて産生又は精製される組み換えラブリシン）を含む組成物が本明細書で説明され、ここで、配列番号１又は２の組み換えラブリシンのアスパラギン１１３５のＮ－グリコシル化は、Ｍａｎ－５、Ｍａｎ－６、又はＭａｎ－７である。いくつかの実施形態では、配列番号１若しくは２の組み換えラブリシン（例えば、本明細書で説明される方法を用いて産生若しくは精製される配列番号１若しくは２の組み換えラブリシン）、又は配列番号１若しくは配列番号２のアミノ酸残基２５～１４０４を含む組み換えラブリシンタンパク質、を含む組成物は、配列番号１又は２の組み換えラブリシンのアスパラギン１１３５のＮ－グリコシル化を含み、ここで、Ｎ－グリコシル化は、Ｍａｎ－５、Ｍａｎ－６、Ｍａｎ－７、又はこれらの混合である（例えば、Ｍａｎ－５、Ｍａｎ－６、及びＭａｎ－７；Ｍａｎ－５及びＭａｎ－６；Ｍａｎ－５及びＭａｎ－７；Ｍａｎ－６及びＭａｎ－７；Ｍａｎ－５；Ｍａｎ－６；又はＭａｎ－７）。いくつかの実施形態では、本明細書で説明される組成物は、複数の組み換えラブリシンポリペプチドを含み、ここでは、組み換えラブリシンタンパク質の一部がＮ－グリコシル化されている。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書で説明される組成物は、同じポリペプチド配列を共有するが、別様にＮ－グリコシル化される、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸残基２５～１４０４を含む複数の組み換えラブリシンポリペプチドを含む（例えば、ポリペプチドの一部が、配列番号１又は２の組み換えラブリシンのＮ－グリコシル化アスパラギン１１３５を含み、アスパラギン１１３５のＮ－グリコシル化が、Ｍａｎ－５、Ｍａｎ－６、Ｍａｎ－７、又はこれらの混合である（例えば、Ｍａｎ－５、Ｍａｎ－６、及びＭａｎ－７；Ｍａｎ－５及びＭａｎ－６；Ｍａｎ－５及びＭａｎ－７；Ｍａｎ－６及びＭａｎ－７；Ｍａｎ－５；Ｍａｎ－６；又はＭａｎ－７））。

いくつかの実施形態では、本発明の方法によって精製された「グリコシル化」ポリペプチドは、重グリコシル化されている。本明細書で使用するとき、「重グリコシル化」ポリペプチドとは、例えば、沈降平衡（ＳＥ－ＡＵＣ）及び沈降速度（ＳＶ－ＡＵＣ）モードを用いる分析超遠心法（ＡＵＣ）によって判定して、少なくとも２５重量％の（例えば、少なくとも２５重量％、２６重量％、２７重量％、２８重量％、２９重量％、３０重量％、３１重量％、３２重量％、３３重量％、３４重量％、若しくは３５重量％、又はこれを超える）グリコシル化を含む。例えば、米国特許出願公開第２０１６０３０４５７２号明細書で説明される、哺乳動物宿主細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞）中で産生される組み換えラブリシンは、重グリコシル化ポリペプチドである。ムチン及びムチン様タンパク質はまた、高グリコシル化タンパク質とも考えられている（Ｄｅｂａｕｉｌｌｅｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：８８１－８９０；Ｇｅｎｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．５７：６０７－６３４；ｖａｎ Ｋｌｉｎｋｅｎ ｅｔ ａｌ．，．１９９８，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ８：６７－７５）。特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、ムチンタンパク質、及びラブリシンなどのムチン様タンパク質を含む、グリコシル化が少なくとも２５重量％、２６重量％、２７重量％、２８重量％、２９重量％、３０重量％、３５重量％、４０重量％、４５重量％、５０重量％、又はこれを超える（例えば、タンパク質の分子量の少なくとも３０％がグリコシド残基に由来する）グリコシル化タンパク質の精製に有用である。

核酸分子を説明するために本明細書で使用される用語「組み換え」とは、その起源又は操作のために、天然で関連するポリヌクレオチド配列の全部又は一部に関連しないゲノム、ｃＤＮＡ、ウイルス、半合成、及び／又は合成起源のポリヌクレオチドを意味する。用語「組み換えポリペプチド」又は「組み換え産生されたポリペプチド」とは、組み換えポリヌクレオチドからの発現によって産生されたポリペプチドを指す。宿主細胞又はウイルスに関して使用される用語「組み換え」とは、組み換えポリヌクレオチドが導入された宿主細胞又はウイルスを指す。また、組み換えとは、材料（例えば、細胞、核酸、タンパク質、又はベクター）に関連して、材料が、異種の材料（例えば、細胞、核酸、タンパク質、又はベクター）を導入することによって修飾されていることを指すためにも本明細書で使用される。

用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」、及び「核酸分子」は、本明細書では、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドのいずれかであるヌクレオチドの多量体型を含むように互換的に使用される。この用語は、分子の一次構造のみを指す。したがって、この用語は、三本鎖、二本鎖、及び一本鎖ＤＮＡ、並びに三本鎖、二本鎖、及び一本鎖ＲＮＡを含む。この用語はまた、メチル化による、且つ／又はキャッピングによるものなどの修飾、及びポリヌクレオチドの非修飾形態を有するこうした分子も含む。より具体的には、用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」、及び「核酸分子」は、ポリデオキシリボヌクレオチド（２－デオキシ－Ｄ－リボースを含む）、ポリリボヌクレオチド（Ｄ－リボースを含む）、プリン又はピリミジン塩基のＮ－又はＣ－グリコシドである任意の他の種類のポリヌクレオチド、及び非ヌクレオチド骨格を含む他のポリマー、ポリマー、並びに他の合成の配列特異的核酸ポリマー（ただし、ポリマーはＤＮＡ及びＲＮＡに見られるような塩基対形成及び塩基スタッキングを可能とする立体配置で核酸塩基を含有する）を含む。

本明細書で使用するとき、核酸配列、タンパク質、又はポリペプチドに関連して用いられる用語「異種」とは、これらの分子が、異種核酸配列、タンパク質、又はポリペプチドが誘導された細胞内で自然発生したものではないことを意味する。例えば、例えば、ヒト細胞ではない細胞に挿入されるヒトポリペプチドをコードする核酸配列は、その特定の文脈においては異種核酸配列である。異種核酸は、異なる生物又は動物種から誘導され得るが、こうした核酸は、異種となるために別個の生物種から誘導される必要がない。例えば、場合によっては、合成核酸配列又はこれからコードされるポリペプチドは、それが導入される細胞が以前に合成核酸を含有していなかったという点においてに、その細胞に対して異種であり得る。このため、例えば、合成核酸配列又はそれからコードされるポリペプチドのうち１つ以上の成分が元はヒト細胞から誘導された場合であっても、合成核酸配列又はそれからコードされるポリペプチドは、ヒト細胞に対して異種であると見なされ得る。

「相同」又は「同一性」という用語は、２つのポリマー分子間、例えば２つのＤＮＡ分子若しくは２つのＲＮＡ分子などの２つの核酸分子間又は２つのポリペプチド分子間におけるサブユニットの配列同一性を指す。２つの分子の両方におけるサブユニットの位置が同じモノマーのサブユニットで占められている場合、例えば２つのＤＮＡ分子のそれぞれにおける位置がアデニンで占められている場合、それらは、その位置において相同又は同一である。２つの配列間の相同性は、マッチした位置又は相同な位置の数の一次関数であり、例えば、２つの配列中の位置の半分（例えば、ポリマーの長さが１０個のサブユニットのうち５個の位置）が相同である場合、２つの配列は５０パーセント相同であり、位置の９０パーセント（例えば、１０個のうち９個）がマッチしているか又は相同である場合、２つの配列は９０パーセント相同である。

本明細書で使用するとき、「宿主細胞」とは、インビボ又はインビトロで真核細胞、又は単細胞体として培養された多細胞生物（例えば細胞株）由来の細胞を表し、この真核細胞は、核酸（例えば、本開示の組み換えポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクター）のレシピエントとして使用され得るか、又は使用されており、核酸により遺伝子操作されている原細胞の子孫を含む。単一細胞の子孫は、天然の、偶発的な、又は意図的な変異のために、モルホロジー又はゲノム若しくは全ＤＮＡ相補性が元の親と必ずしも完全に同一であるとは限らないと理解される。「組み換え宿主細胞」（「遺伝子操作された宿主細胞」とも称される）は、異種核酸、例えば発現ベクターが導入された宿主細胞である。例えば、遺伝子操作された真核宿主細胞は、細胞に安定的又は一時的に導入することができる異種核酸、例えば真核宿主細胞に対して異物である外因性核酸、又は真核宿主細胞中で通常は見出されない組み換え核酸を、好適な真核宿主細胞に導入することによって遺伝子操作される。いくつかの実施形態では、組み換えラブリシンは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの哺乳動物宿主細胞中で産生される。別の実施形態では、ＣＨＯ細胞は、その開示が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１６／３０４５７２号明細書に記載されるＣＨＯ－Ｍ細胞である（その開示が参照により本明細書に組み込まれる、Ｇｉｒｏｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ４（９）：７４７－５３（２００７）、並びに米国特許第７，１２９，０６２号明細書、及び同第８，２５２，９１７号明細書、並びに米国特許出願公開第２０１１／００６１１１７号明細書、同第２０１２／０２３１４４９号明細書、及び同第２０１３／０１４３２６４号明細書も参照されたい）。

用語「精製」、「単離」などは、望まれない物質、例えば混入物質、例えばポリヌクレオチド、宿主細胞タンパク質を含む溶液から、所望の物質、例えば組み換えタンパク質を除去すること、又は所望の物質を含有する溶液から望まれない物質を除去して、本質的に所望の物質のみを残することを指す。場合によっては、精製された物質は、その他の混入物質、例えばポリヌクレオチド、例えば宿主細胞タンパク質を本質的に含まないことができる。本明細書で使用するとき、精製する、とは、様々な得られる純度の範囲を指し得、ここで、例えば、精製された物質が溶液中の全物質の８０パーセント超、例えば８５パーセント超、９０パーセント超、９１パーセント超、９２パーセント超、９３パーセント超、９４パーセント超、９５パーセント超、９６パーセント超、９７パーセント超、９８パーセント超、９９パーセント超、９９．５パーセント超、９９．９パーセント超などを占める。当業者には理解されるように、一般に、物質の純度を決定するときには溶液自体の成分、例えば水若しくは緩衝剤、又は塩は考慮されない。

用語「混入物質」及び「不純物」は、精製されるタンパク質を含有する溶液又は製剤中に存在する望まれない物質、例えばポリヌクレオチド（例えばＤＮＡ及び／又はＲＮＡ）又はタンパク質（例えば宿主細胞タンパク質）を指す。混入物質としては、例えば、精製されるタンパク質を組み換え発現するために用いられる細胞由来の宿主細胞タンパク質、以前の親和性クロマトグラフィー工程中で試料内に浸出し得る、親和性クロマトグラフィー工程で用いられる吸収剤の一部であるタンパク質、及び標的タンパク質自体のミスフォールド変異体が挙げられる。特定の実施形態では、精製プロセス中に試料中に残る混入物質は、「残留（ｒｅｓｉｄｕａｌ）」と称される（例えば「残留ＤＮＡ」）。標的タンパク質の凝集体及び分解物も混入物質と見なされる。

本明細書で使用するとき、用語「分解物」としては、分解によって生じる組み換え標的タンパク質の断片（すなわち、ペプチド断片）が挙げられる。分解生成物は、当業者に周知の技術を用いて測定することができ、分析結果は、臨床、安全、及び安定性試験のための原薬及び製剤バッチ、並びに商業的製造プロセスを示すバッチのために提供することができる。

用語「宿主細胞タンパク質」（ＨＣＰ）としては、精製対象の標的タンパク質をコードするＤＮＡを含む宿主細胞によってコードされるタンパク質が挙げられる。宿主細胞タンパク質は、精製対象のタンパク質の混入物質であり得、そのレベルは精製によって低減され得る。宿主細胞タンパク質は、ゲル電気泳動法並びに染色及び／又はＥＬＩＳＡアッセイなどの、当業者に周知のアッセイを用いて検出することができる。宿主細胞タンパク質としては、例えば、組み換え標的タンパク質の発現中に産生されるチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）タンパク質（ＣＨＯＰ）が挙げられる。

ＨＣＰの対数除去能力は、下記の式で計算することができる。投入物及び溶出液中のＨＣＰ濃度は、多検体酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって百万分の一（ｐｐｍ）単位で決定することができる。
ＨＣＰｌｏｇ除去能力＝ｌｏｇ_１０（投入物中ＨＣＰ［ｐｍ］）－ｌｏｇ_１０（溶出液中ＨＣＰ［ｐｍ］）

特定の実施形態では、患者の安全のため、推奨されるＨＣＰの上限は、最終薬剤配合物中で１００ｐｐｍのＨＣＰ（又は１ｍｇの治療用タンパク質あたり＜１００ｎｇのＨＣＰ）である（Ｃｈａｍｐｉｏｎ，ｅｔ ａｌ．２００５，ＢｉｏＰｒｏｃｅｓｓ Ｉｎｔ，３：５２；Ｃｈｏｎ＆Ｚａｒｂｉｓ－Ｐａｐａｓｔｏｉｔｓｉｓ，２０１１，Ｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２８（５）：４５８－６３；Ｚｈｕ－Ｓｈｉｍｏｎｉ，ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｅｎｇ；１１１：２３６７－７９）。

残留ＤＮＡの望ましくない効果を防ぐために、ＦＤＡは、達成可能な分析感度限界を１用量あたり１０ｐｇのＤＮＡと決定した（Ｂｒｉｇｇｓ ａｎｄ Ｐａｎｆｉｌｉ，１９９１，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，６３：８５０－８５９）。

本願内で使用するとき、用語「緩衝化した（ｂｕｆｆｅｒｅｄ）」とは、緩衝剤物質によって酸又は塩基性物質の添加又は放出によるｐＨの変化が均一化される、溶液を表す。こうした効果をもたらす任意の緩衝剤物質が用いられ得る。好ましくは、例えば、リン酸若しくはその塩、酢酸若しくはその塩、クエン酸若しくはその塩、モルホリン若しくはその塩、２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸若しくはその塩、ヒスチジン若しくはその塩、グリシン若しくはその塩、又はトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）若しくはその塩などの、薬学的に許容される緩衝剤物質が用いられる。特に好ましいのは、リン酸若しくはその塩、又は酢酸若しくはその塩、又はクエン酸若しくはその塩、又はヒスチジン若しくはその塩である。任意選択的に、緩衝化液は、例えば、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、塩化カリウム、硫酸カリウム、クエン酸ナトリウム、又はクエン酸カリウムなどの追加の塩を含み得る。任意選択的に、緩衝化液は、追加成分、例えばポリソルベート、例えばポリソルベート２０を含み得る。

本明細書で使用するとき、タンパク質は、標的タンパク質の濃度が、出発溶液又は混合物（例えば、細胞培養収穫物）におけるよりも得られた生成物（例えば製剤）においてより高い場合、「回収されている」か、「分離されている」か、又は「除去されている」。特定の実施形態では、回収された標的タンパク質は、収率として表され得る。

本明細書で使用するとき、「収率」とは、精製工程前の、体積あたりの投入物含量と比較した溶出液中の体積あたりの残留含量のパーセンテージとして表される。「収率」とは、例えば、工程実施前に存在した量（例えば、溶出液と比較しての投入物中の量）と比較しての、精製工程後に存在する試料（例えば配合物又は組成物）中の標的タンパク質（例えば組み換えラブリシン）の量であり得る。投入物及び溶出液のタンパク質含量は、例えば、分析的サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって測定される。

本明細書で使用するとき、用語「薬学的に許容される担体」又は「薬学的に許容される賦形剤」とは、薬学的投与に適合する溶媒及びその他の物質を指す。こうした剤の使用は当該技術分野で周知されている。本明細書に記載される組成物は、補助的な、追加的な、又は強化された治療的機能を提供するその他の活性化合物も含有することができる。

本明細書で使用するとき、用語「医薬組成物」とは、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤と共に配合された、本明細書に開示される少なくとも１つの活性成分（例えば、組み換えヒトラブリシン）を含む組成物を指す。

タンパク質精製プロセス
本発明の目的は、組み換え発現されたグリコシル化ポリペプチド、例えばラブリシン及びその多量体を混入物質から精製するプロセスを提供することであり、この精製プロセスは、不純物から上記のグリコシル化ポリペプチド、例えばラブリシンを効率的に精製することを可能にし、同時に機能を保持し、凝集を回避し、最終生成物の高い収率を維持する。本発明者らは、商業的な医薬開発に好適な規模での、組み換え発現されたグリコシル化ポリペプチド、例えばラブリシンの精製に特に好適な精製法を見出した。

第１の態様では、本発明は、組み換え産生されたグリコシル化ポリペプチド、特に組み換え産生されたグリコシル化ラブリシンタンパク質を精製する方法に関し、方法は、３つのクロマトグラフィー工程を含む：（ａ）多モードカチオン交換クロマトグラフィー（ＭＣＣ）工程、（ｂ）多モードアニオン交換クロマトグラフィー（ＭＡＣ）工程、及び（ｃ）疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）工程。

いくつかの実施形態では、３つのクロマトグラフィー工程は、任意の順序で実施することができる。特定の実施形態では、本発明は、組み換え産生されたグリコシル化ポリペプチド、特に組み換え産生されたグリコシル化ラブリシンタンパク質を精製する方法に関し、方法は、３つの連続的クロマトグラフィー工程を含む：（ａ）多モードカチオン交換クロマトグラフィー（ＭＣＣ）からなる第１のクロマトグラフィー工程、（ｂ）多モードアニオン交換クロマトグラフィー（ＭＡＣ）からなる第２のクロマトグラフィー工程、及び（ｃ）疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）からなる第３のクロマトグラフィー工程。

本明細書で使用するとき、用語「連続的クロマトグラフィー工程」とは、提示された順番で実施されるが、最初の列挙される工程の前に、列挙される工程の間に、及び／又は最後の列挙される工程の後に、その他の工程を含み得る工程を指す。

第２の態様では、本発明は、組み換え産生されたグリコシル化ポリペプチド、特に組み換え産生されたグリコシル化ラブリシンを含む配合物中のポリヌクレオチド、及び／又は宿主細胞タンパク質の混入を低減させる方法に関し、方法は、
（ｉ）３つのクロマトグラフィー工程：（ａ）多モードカチオン交換クロマトグラフィー（ＭＣＣ）工程、（ｂ）多モードアニオン交換クロマトグラフィー（ＭＡＣ）工程、及び（ｃ）疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）工程を含み、且つ
（ｉｉ）回収された組み換え産生されたポリペプチドを含む配合物を調製する工程を更に含む。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組み換え産生されたグリコシル化ポリペプチドを含む配合物中のポリヌクレオチド、及び／又は宿主細胞タンパク質の混入を低減させる方法は、深層濾過工程を更に含む。いくつかの実施形態では、深層濾過工程は、ＨＩＣ工程の前に実施される。いくつかの実施形態では、深層濾過は好適なフィルタ、例えばセルロース又はポリプロピレン繊維ベースのフィルタ、例えば正荷電三層Ｂ１ＨＣフィルタを用いて実施される。

いくつかの実施形態では、３つのクロマトグラフィー工程は、任意の順序で実施することができる。特定の実施形態では、本発明は、組み換え産生されたグリコシル化ポリペプチド、特に組み換え産生されたグリコシル化ラブリシンを含む配合物中のポリヌクレオチド、及び／又は宿主細胞タンパク質の混入を低減させる方法に関し、方法は、
（ｉ）３つの連続的クロマトグラフィー工程：（ａ）多モードカチオン交換クロマトグラフィー（ＭＣＣ）からなる第１のクロマトグラフィー工程、（ｂ）多モードアニオン交換クロマトグラフィー（ＭＡＣ）からなる第２のクロマトグラフィー工程、及び（ｃ）疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）からなる第３のクロマトグラフィー工程を含み、且つ
（ｉｉ）回収された組み換え産生されたポリペプチドを含む配合物を調製する工程を更に含む。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組み換え産生されたグリコシル化ポリペプチドを含む配合物中のポリヌクレオチド、及び／又は宿主細胞タンパク質の混入を低減させる方法は、深層濾過工程を更に含む。いくつかの実施形態では、深層濾過工程は、ＨＩＣ工程の前に実施される。いくつかの実施形態では、深層濾過は好適なフィルタ、例えばセルロース又はポリプロピレン繊維ベースのフィルタ、例えば正荷電三層Ｂ１ＨＣフィルタを用いて実施される。

特定の実施形態では、本発明の方法は、本明細書に記載される１つ以上のウイルス不活化（ＶＩＮ）処理工程、及びウイルス除去工程を更に含む。様々なウイルス不活化法が当業者に既知であり、本発明の方法で用いることができ、これとしては、低温殺菌、末期乾燥加熱、蒸気加熱、溶媒／洗剤、及び酸性ｐＨが挙げられるがこれらに限定されない。ウイルス除去手順もまた周知されており、これとしては、沈降、クロマトグラフィー、及びナノ濾過が挙げられるがこれらに限定されない。ウイルス不活化及び除去は、プロセス中（例えば、ナノ濾過及び溶媒／洗剤処理、低温殺菌、水蒸気処理、並びに／又はｐＨ４でのインキュベーション）で、又は最終容器内の末期で行うことができる（例えば、末期低温殺菌、又は末期乾熱処理）。いくつかの実施形態では、ＶＩＮ工程は、本発明の精製法中に溶液をＮ，Ｎ－ジメチル尿素（ＤＭＵ）でインキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、ＶＩＮ工程は、本発明の精製法中に溶液を洗剤、例えばＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００でインキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、ＶＩＮ工程は、本発明の精製法中に、溶液を、３０分間、４０分間、５０分間、６０分間、７０分間、８０分間、９０分間、１００分間、１１０分間、又は１２０分間還元した２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００でインキュベートすることを含む。本明細書に記載される一実施形態では、ＶＩＮ工程は、本発明の精製法中に、溶液を、６０分間～７０分間還元した２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００でインキュベートすることを含む。

いくつかの実施形態では、開示される方法は、酸性ｐＨ溶液（例えば約ｐＨ３、約ｐＨ３．４、約ｐＨ３．５、約ｐＨ３．６、約ｐＨ４、約ｐＨ３．４～約ｐＨ３．６、又は約ｐＨ３～約ｐＨ４の溶液）中のウイルス不活化工程を含む。いくつかの実施形態では、酸性ｐＨ溶液中のウイルス不活化工程は、ｒｈラブリシン組成物のｐＨをｐＨ３．４～３．６に調節すること、例えば、０．５Ｍのリン酸溶液でｒｈラブリシン組成物のｐＨを調節することを含む。酸性ｐＨ溶液中のウイルス不活化工程は、ｒｈラブリシン組成物を１７～２５℃で６０～９０分間インキュベートすること、及び溶液、例えば１Ｍのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）溶液でｒｈラブリシン組成物のｐＨをｐＨ７．０に調節することを更に含み得る。酸性ｐＨ溶液中のウイルス不活化工程は、０．２μｍフィルタでｒｈラブリシン組成物を濾過することを更に含み得る。本明細書に記載される方法のいくつかの実施形態では、例えば酸性ｐＨ溶液中でインキュベートすることによるウイルス不活化工程は、多モードアニオン交換クロマトグラフィー（ＭＡＣ）工程の後、且つ疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）工程の前に実施される。

特定の実施形態では、本発明の方法は、ＭＡＣ工程の後で溶液中の全てのウイルスを不活化することを含み、ここでＭＡＣ工程から得られた溶液のｐＨは、約、例えば４．０以下、例えば約３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、又は４．０に調節され、少なくとも約６０分間インキュベートされ、続いて中性ｐＨ（例えば約７．０）に調節される。

別の実施形態では、本発明の方法は、ＨＩＣ工程の後に、ウイルス除去濾過（ＶＲＦ）及びウイルス不活化（ＶＩＮ）処理工程を更に含む。ＶＲＦ工程は、例えば、本明細書に記載されるナノフィルタを含む。いくつかの実施形態では、ＶＩＮ工程は、ＶＲＦ工程からの溶液を洗剤でインキュベートすることを含む。別の実施形態では、ＶＩＮ工程は、ＶＲＦ工程からの溶液をＮ，Ｎ－ジメチル尿素（ＤＭＵ）でインキュベートすることを含む。特定の実施形態では、ＤＭＵの濃度は約１Ｍ、２Ｍ、３Ｍ、４Ｍ、又は５Ｍである。好ましい実施形態では、ＤＭＵの濃度は３Ｍである。

一態様では、本発明は、以下の３つのクロマトグラフィー工程を含む方法によって得られる組み換えグリコシル化ポリペプチド、例えば組み換えヒトラブリシンに関する：
（ａ）多モードカチオン交換クロマトグラフィー（ＭＣＣ）工程；
（ｂ）多モードアニオン交換クロマトグラフィー（ＭＡＣ）工程；及び
（ｃ）疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）工程。

いくつかの実施形態では、方法は、組み換えグリコシル化ポリペプチドを含む配合物を調製する工程を更に含む。いくつかの実施形態では、方法は、深層濾過工程を更に含む。いくつかの実施形態では、深層濾過工程は、ＨＩＣ工程の前に実施される。いくつかの実施形態では、深層濾過は好適なフィルタ、例えばセルロース又はポリプロピレン繊維ベースのフィルタ、例えば正荷電三層Ｂ１ＨＣフィルタを用いて実施される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法によって得られる組み換えグリコシル化ポリペプチドは、プロテオグリカン４アイソフォームＡ（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００５７９８．３；配列番号：１）のアミノ酸２５～１４０４を含む組み換えヒトラブリシン、プロテオグリカン４アイソフォームＣＲＡ＿ａ（ＮＣＢＩ参照配列：ＥＡＷ９１２０１．１；配列番号：２）のアミノ酸２５～１４０４を含む組み換えヒトラブリシン、又は配列ＫＥＰＡＰＴＴ（配列番号３）のグリコシル化反復を含む組み換えポリペプチドの断片及びバリアントである。

本発明の方法は、高グリコシル化の組み換え産生されたポリペプチド（例えば少なくとも３０重量％のグリコシド残基を含む）の精製に特に好適である。本発明の方法は、負電荷担体を含む組み換え産生されたグリコシル化ポリペプチド、例えば、その中央ドメイン、特にムチンドメイン中に負電荷担体を含む組み換え産生されたグリコシル化ポリペプチドの精製に特に好適である。したがって、本発明の方法は、組み換え産生されたグリコシル化ラブリシンタンパク質の精製に特に好適である。

完全長（非トランケート型）ヒトラブリシン（プロテオグリカン４、アイソフォームＡ、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００５７９８．３）モノマー配列（配列番号１）は、コアタンパク質中に１４０４個のアミノ酸、又は約１５１ｋＤａを含む。バリアントラブリシン（プロテオグリカン４、アイソフォームＣＲＡ＿ａ、ＮＣＢＩ参照配列：ＥＡＷ９１２０１．１）モノマー配列（配列番号２）も１４０４個のアミノ酸を有する。本明細書で使用するとき、「ラブリシン」若しくは「ラブリシンタンパク質」又は「ＰＲＧ４」は、ラブリシンアイソフォームＡ及びラブリシンアイソフォームＣＲＡ＿ａを含み、配列ＫＥＰＡＰＴＴ（配列番号３）のグリコシル化反復を含み、完全長且つ天然のラブリシンと実質的に同じ活性を有する、それらの断片及びバリアントを更に含む。本明細書で使用するとき、「ｒｈラブリシン」とは組み換えヒトラブリシンを指し、組み換え産生された任意のヒトラブリシンを含む。本明細書で説明されるいくつかの実施形態では、「グリコシル化タンパク質」、「グリコシル化ポリペプチド」、「高グリコシル化タンパク質」、「高グリコシル化ポリペプチド」、「重グリコシル化タンパク質」、「重グリコシル化ポリペプチド」、「重グリコシル化組み換えタンパク質」、「重グリコシル化組み換えポリペプチド」、「組み換え産生されたグリコシル化タンパク質」、「組み換え産生されたグリコシル化ポリペプチド」、「組み換え産生されたグリコシル化糖タンパク質」、又は「高グリコシル化の組み換え産生されたポリペプチド」（本明細書に記載される方法を用いて産生又は精製された「グリコシル化タンパク質」、「グリコシル化ポリペプチド」、「高グリコシル化タンパク質」、「高グリコシル化ポリペプチド」、「重グリコシル化タンパク質」、「重グリコシル化ポリペプチド」、「重グリコシル化組み換えタンパク質」、「重グリコシル化組み換えポリペプチド」、「組み換え産生されたグリコシル化タンパク質」、「組み換え産生されたグリコシル化ポリペプチド」、「組み換え産生されたグリコシル化糖タンパク質」、又は「高グリコシル化の組み換え産生されたポリペプチド」を含む）は、配列ＫＥＰＡＰＴＴ（配列番号３）のグリコシル化反復を含み、完全長且つ天然のラブリシンと実質的に同じ活性を有するその断片（例えば、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸残基２５～１４０４）及びバリアントを含む、配列番号１、配列番号２、又はこれらの混合のラブリシンであり得る。

いくつかの実施形態では、本明細書で説明される方法を用いて産生又は精製されるグリコシル化組み換えヒトラブリシンは、約２８０ｋｇ／ｍｏｌ、約２９０ｋｇ／ｍｏｌ、約２９１ｋｇ／ｍｏｌ、約２９２ｋｇ／ｍｏｌ、約２９３ｋｇ／ｍｏｌ、約２９４ｋｇ／ｍｏｌ、約２９５ｋｇ／ｍｏｌ、約２９６ｋｇ／ｍｏｌ、約３００ｋｇ／ｍｏｌ、約３１０ｋｇ／ｍｏｌ、約３２０ｋｇ／ｍｏｌ、約３３０ｋｇ／ｍｏｌ、約３４０ｋｇ／ｍｏｌ、約３５０ｋｇ／ｍｏｌ、約３６０ｋｇ／ｍｏｌ、約２９１～約２９５ｋｇ／ｍｏｌ、約２９１ｋｇ／ｍｏｌ～約２９６ｋｇ／ｍｏｌ、約２８０ｋｇ／ｍｏｌ～約３６０ｋｇ／ｍｏｌ、約２９０ｋｇ／ｍｏｌ～約３４０ｋｇ／ｍｏｌ、約２９０ｋｇ／ｍｏｌ～約３５０ｋｇ／ｍｏｌ、約３００ｋｇ／ｍｏｌ～約３４５ｋｇ／ｍｏｌ、又は約２９０ｋｇ／ｍｏｌ～約３３０ｋｇ／ｍｏｌの分子量を特徴とする。したがって、いくつかの実施形態では、約２８０ｋｇ／ｍｏｌ、約２９０ｋｇ／ｍｏｌ、約２９１ｋｇ／ｍｏｌ、約２９２ｋｇ／ｍｏｌ、約２９３ｋｇ／ｍｏｌ、約２９４ｋｇ／ｍｏｌ、約２９５ｋｇ／ｍｏｌ、約２９６ｋｇ／ｍｏｌ、約３００ｋｇ／ｍｏｌ、約３１０ｋｇ／ｍｏｌ、約３２０ｋｇ／ｍｏｌ、約３３０ｋｇ／ｍｏｌ、約３４０ｋｇ／ｍｏｌ、約３５０ｋｇ／ｍｏｌ、約３６０ｋｇ／ｍｏｌ、約２９１～約２９５ｋｇ／ｍｏｌ、約２９１ｋｇ／ｍｏｌ～約２９６ｋｇ／ｍｏｌ、約２８０ｋｇ／ｍｏｌ～約３６０ｋｇ／ｍｏｌ、約２９０ｋｇ／ｍｏｌ～約３４０ｋｇ／ｍｏｌ、約２９０ｋｇ／ｍｏｌ～約３５０ｋｇ／ｍｏｌ、約３００ｋｇ／ｍｏｌ～約３４５ｋｇ／ｍｏｌ、又は約２９０ｋｇ／ｍｏｌ～約３３０ｋｇ／ｍｏｌの分子量を特徴とするグリコシル化組み換えヒトラブリシンを産生又は精製するために説明される方法が本明細書で説明される。

ラブリシンの機能及び活性は、当該技術分野で既知の任意の好適な方法、又は本明細書に記載される方法、例えば細胞接着アッセイ、例えばＡ３７５細胞接着アッセイを用いてアッセイすることができる。例えば、ラブリシンの機能は、細胞組織培養マイクロタイタープレートの表面に対するＡ３７５ヒト黒色腫細胞の接着を阻害するその能力に基づいて決定することができる。したがって、参照物質と比較した、組み換えラブリシン試料による用量依存的なＡ３７５細胞の接着の阻害を用いて、組み換えラブリシンの機能又は活性を決定することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法を用いて精製された組み換えラブリシンを含む組成物は、細胞接着アッセイ、例えばＡ３７５細胞接着アッセイによって決定して、参照物質（例えば、精製された組み換えラブリシンの参照試料）の活性と比較して５０％～１５０％（例えば５０％、７５％、１００％、１２５％、又は１５０％）の活性を示す。

本明細書に記載されるいくつかの実施形態では、組み換えヒトラブリシン（本明細書に記載される方法を用いて得られた又は精製された組み換えヒトラブリシンを含むがこれに限定されない）の活性は、レポーター細胞アッセイ、例えばＮＦ－κＢレポーター細胞アッセイを用いてアッセイされる。例えば、いくつかの実施形態では、組み換えヒトラブリシンの活性は、組み換えヒトラブリシンに応答した、レポーター細胞株、例えばＴＨＰ１－Ｌｕｃｉａ（商標）ＮＦ－κＢ細胞（カタログ番号：ｔｈｐ１－ｎｆｋｂ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ））中のＮＦ－κＢ活性の修飾を分析することによってアッセイされる。こうした実施形態では、ＮＦ－κＢ活性は、レポーター遺伝子、例えばルシフェラーゼレポーター遺伝子又は修飾ルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現レベルに基づいて監視され得る。いくつかの実施形態では、レポーター遺伝子の発現、例えばＮＦ－κＢに誘導されるレポーター遺伝子の発現のレベルは、好適な検出試薬、例えばＬｕｃｉａ（商標）を検出するためのＱＵＡＮＴＩ－Ｌｕｃ（商標）（カタログ番号：ｒｅｐ－ｑｌｃ１（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ））を用いて評価することができる。このため、一部の実施形態では、組み換えラブリシン試料に応答したＮＦ－κＢ活性の修飾を参照物質と比較して、組み換えラブリシンの機能又は活性を決定する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法を用いて精製された組み換えラブリシンを含む組成物は、レポーター細胞アッセイ、例えばＮＦ－κＢレポーター細胞アッセイによって決定して、参照物質（例えば、精製された組み換えラブリシンの参照試料）の活性と比較して５０％～１５０％（例えば５０％、７５％、１００％、１２５％、又は１５０％）の活性を示す。

ヒトラブリシンのシグナル配列は、配列番号１／配列番号２の残基１～２４である。したがって、ヒトラブリシンの成熟型は、配列番号１／配列番号２の残基２５～１４０４である。

いくつかの実施形態では、本発明の方法は、配列番号１又は２の配列に対して少なくとも８５％の配列同一性、具体的には、配列番号１又は２の配列に対して少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を有する、組み換え産生されたグリコシル化ポリペプチドの精製に好適である。特定の実施形態では、本発明の方法は、配列番号１又は２の配列を有する組み換え産生されたグリコシル化ポリペプチドの精製に好適である。

いくつかの実施形態では、本発明の方法は、配列番号１又は２のアミノ酸２５～１４０４と少なくとも８５％の配列同一性、具体的には、配列番号１又は２のアミノ酸２５～１４０４と少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の配列同一性を有する、組み換え産生されたグリコシル化ポリペプチドの精製に好適である。特定の実施形態では、本発明の方法は、配列番号１又は２の配列のアミノ酸２５～１４０４を有する組み換え産生されたグリコシル化ポリペプチドの精製に好適である。

本発明者らは、驚くべきことに、十分な純度（例えば、商業化のための規制要件を満たすのに十分な）及び高い収率（例えば、商業的に関連する要求を満たす）の組み換え産生されたグリコシル化ポリペプチド、特に組み換え産生されたグリコシル化ラブリシンは、具体的には以下を含む３つのクロマトグラフィー工程を含む方法によって得ることができることを見出した：（ａ）多モードカチオン交換クロマトグラフィー（ＭＣＣ）からなる第１のクロマトグラフィー工程、（ｂ）多モードアニオン交換クロマトグラフィー（ＭＡＣ）からなる第２のクロマトグラフィー工程、及び（ｃ）疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）からなる第３のクロマトグラフィー工程。

一般的なクロマトグラフィー法及びその使用は、当業者に既知である。例えば、Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｐａｒｔ Ａ：Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｈｅｆｔｍａｎｎ，Ｅ．（ｅｄ），Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９９２）；Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ ａｎｄ Ｅｌｅｃｔｒｏｍｉｇｒａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｄｅｙｌ，Ｚ．（ｅｄ．），Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＢＶ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，（１９９８）；Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ｔｏｄａｙ，Ｐｏｏｌｅ，Ｃ．Ｆ．，ａｎｄ Ｐｏｏｌｅ，Ｓ．Ｋ．，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９９１），Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（１９８２）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．（ｅｄ），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ）．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；又はＦｒｅｉｔａｇ，Ｒ．，Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃａｌ ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｏｆ（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｍｅｔｈ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２４（２００７）４２１－４５３（Ａｎｉｍａｌ ｃｅｌｌ ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２ｎ Ｅｄｉｔｉｏｎ）を参照されたい。

本願内で使用するとき、用語「イオン交換クロマトグラフィー」は、「イオン交換クロマトグラフィー材料」を用いるクロマトグラフィー法を表す。用語「イオン交換クロマトグラフィー材料」は、「カチオン交換クロマトグラフィー」においてカチオンが交換されるのか、又は「アニオン交換クロマトグラフィー」においてアニオンが交換されるのかに応じて、「カチオン交換クロマトグラフィー材料」又は「アニオン交換クロマトグラフィー材料」を包含する。

本願内で使用するとき、用語「イオン交換クロマトグラフィー材料」は、共有結合した荷電基をクロマトグラフィー官能基として担持する不動高分子量固相を表す。全体的な電荷中立性のために、共有結合していない対イオンがこれと会合している。「イオン交換クロマトグラフィー材料」は、その共有結合していない対イオンと、周囲溶液中の同様に荷電したイオンとを交換する能力を有する。好適には、カチオン交換リガンドは、－ＯＣＨ_２ＣＯＯ－、－ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＳＯ_３－、及び－ＣＨ_２ＳＯ_３－からなるリストから選択される官能基を含み得る。好適には、カチオン交換リガンドは、カルボキシメチル（ＣＭ）、スルホプロピル（ＳＰ）、及びメチルスルホネート（Ｓ）からなるリストから選択され得る。好適には、アニオン交換リガンドは、－ＣＨ_２ＣＨＯＨＣＨＨ_２Ｎ^＋Ｈ（ＣＨ_２ＣＨ_３）^２、－ＯＣＨ_２ＣＨ_２Ｎ^＋Ｈ（ＣＨ_２ＣＨ_３）_２－、－ＯＣＨ_２ＣＨ_２Ｎ^＋（Ｃ_２Ｈ_５）_２ＣＨ_２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ_３－、及び－ＣＨ_２Ｎ^＋（ＣＨ_３）_３－からなるリストから選択される官能基を含み得る。好適には、アニオン交換リガンドは、ジエチルアミノプロピル（ＡＮＸ）、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）、四級アミノエチル（ＱＡＥ）、四級アンモニウム（Ｑ）からなるリストから選択され得る。

荷電基の化学的性質に応じて、「イオン交換クロマトグラフィー材料」は、共有結合した荷電置換基の強度に応じて追加的に強又は弱イオン交換クロマトグラフィー材料と分類することができる。例えば、強カチオン交換クロマトグラフィー材料は、クロマトグラフィー官能基としてスルホン酸基を有し、弱カチオン交換クロマトグラフィー材料は、クロマトグラフィー官能基としてカルボン酸基を有する。

多モードカチオン交換クロマトグラフィー（ＭＣＣ）
本明細書で使用するとき、用語「多モード（又は混合モード）クロマトグラフィー」又は「ＭＭＣ」は、２つ以上の相互作用モード又は機序を介して溶質が固定相と相互作用するクロマトグラフィー法を指す。ＭＭＣは、従来の逆相（ＲＰ）、イオン交換（ＩＥＸ）、及び順相クロマトグラフィー（ＮＰ）に対する代替的又は補完的なツールとして用いられてきた。疎水性相互作用、親水性相互作用、及びイオン相互作用がそれぞれ主要な相互作用モードであるＲＰ、ＮＰ、及びＩＥＸクロマトグラフィーとは異なり、混合モードクロマトグラフィーは、これらの相互作用モードのうち２つ以上の組み合わせを用いる（Ｚｈａｎｇ Ｋ．ａｎｄ Ｌｕｉ Ｘ，２０１６，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｖｏｌｕｍｅ １２８，Ｐａｇｅｓ７３－８８）。

本発明の方法で用いられるクロマトグラフィー工程の１つは、多モードカチオン交換クロマトグラフィー（ＭＣＣ）である。

本明細書で使用するとき、「多モードカチオン交換クロマトグラフィー」又は「ＭＣＣ」は、カチオン交換、及び固定相と検体との間の相互作用の少なくとも１つ以上の形態を用いるクロマトグラフィー法を指す。

いくつかの実施形態では、本発明の方法で用いられるＭＣＣ樹脂は、水性環境中でイオン相互作用によって組み換え産生されたグリコシル化ポリペプチドと相互作用することが可能なカチオン交換リガンド、例えば多モードカチオン交換リガンドを含む。いくつかの実施形態では、本発明の方法で用いられるＭＣＣ樹脂は、カチオン交換リガンド、具体的には弱カチオン交換リガンド、典型的にはスルホン酸（－ＳＯ４－）基又はカルボキシル酸基（－ＣＯＯ－）を含む。好適には、多モードカチオン交換リガンドは、カルボキシル又はその他の負荷電基を含む。

いくつかの実施形態では、本発明の方法で用いられるＭＣＣ樹脂は、カチオン交換リガンド、具体的には弱カチオン交換リガンド、及びマトリックスを含む。マトリックスは、アガロース、セルロース、セラミックス、デキストラン、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリカ、合成ポリマー、有機ポリマーからなるリストから選択され得る。いくつかの実施形態では、本発明の方法で用いられるＭＣＣ樹脂は、カチオン交換リガンド、具体的には弱カチオン交換リガンド、及びアガロースマトリックスを含む。

いくつかの実施形態では、本発明の方法で用いられるＭＣＣ樹脂は、以下の市販の樹脂から選択される：Ｃａｐｔｏ ＭＭＣ（商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；アガロースマトリックスと組み合わせの多モード弱カチオン交換体）；Ｅｓｈｍｕｎｏ（登録商標）ＨＣＸ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ；Ｅｓｈｍｕｎｏ（登録商標）カチオン交換体親水性ポリビニルエーテルベースマトリックス）；Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＭＸ－Ｔｒｐ－６５０ Ｍ（ＴＯＳＯＨ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ；弱カルボキシルカチオン交換及びインドール疎水性官能基を有するトリプトファンリガンド）；Ｎｕｖｉａ ｃＰｒｉｍｅ（ＢｉｏＲａｄ）；ＣＨＴセラミックヒドロキシアパタイト（ＢｉｏＲａｄ）；及びＣＦＴセラミックフルオロアパタイト（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）。好ましい実施形態では、本発明の方法で用いられるＭＣＣ樹脂は、Ｃａｐｔｏ ＭＭＣ樹脂である。

好適には、いくつかの実施形態では、本発明の方法のＭＣＣ工程は、結合／溶出モードで実施される。本発明で使用される用語「結合／溶出モード」及びその文法的等価物は、目的の物質を含有する溶液が固定相、好ましくは固相と接触させられ、それにより目的の物質が固定相と結合するクロマトグラフィー法の動作モードを表す。結果として、目的の物質は固定相上に保持され、目的ではない物質は貫流又は上清で除去される。目的の物質は、その後の第２の工程で固定相から溶出し、それにより、溶出液で固定相から回収される。これは、必ずしも、目的ではない物質の１００パーセントが除去されることを表すものではないが、目的ではない物質の本質的に１００パーセント又は許容可能な部分が除去され、例えば、目的ではない物質の少なくとも５０パーセントが除去され、好ましくは目的ではない物質の少なくとも７５パーセントが除去され、好ましくは目的ではない物質の少なくとも９０パーセントが除去され、好ましくは目的ではない物質の９５パーセント超が除去される。

好適には、いくつかの実施形態では、ＭＣＣ工程は、（ｉ）組み換え産生されたグリコシル化ポリペプチド組成物を、ＭＣＣ樹脂を含むＭＣＣカラムと接触させる工程、具体的には、ＭＣＣ樹脂を含むＭＣＣカラム上に浄化された細胞培養物上清を投入する工程、（ｉｉ）ＭＣＣ樹脂、例えば組み換え産生されたグリコシル化ポリペプチドが結合しているＭＣＣ樹脂を、洗浄緩衝剤で洗浄する工程、及び（ｉｉｉ）組み換え産生されたグリコシル化ポリペプチドを含有する画分を溶出する工程、具体的には、ｐＨ８～１０、具体的にはｐＨ９で正荷電した少なくとも１つのアミノ酸を含む溶出緩衝剤によって、組み換え産生されたグリコシル化ポリペプチドを含有する画分を溶出する工程、並びに（ｉｖ）任意選択的に、精製又は富化形態の組み換え産生されたグリコシル化ポリペプチドを含有する画分を収集する工程を含む。

好適には、いくつかの実施形態では、ＭＣＣ工程は、（ｉ）組み換え産生されたグリコシル化ポリペプチド組成物を、ＭＣＣ樹脂を含むＭＣＣカラムと接触させる工程、具体的には、ＭＣＣ樹脂を含むＭＣＣカラム上に浄化された細胞培養物上清を投入する工程、及び（ｉｉ）ｐＨ８～１０、具体的にはｐＨ９で正荷電した少なくとも１つのアミノ酸を含む溶出緩衝剤によって、組み換え産生されたグリコシル化ポリペプチドを含有する画分を溶出する工程であって、溶出緩衝剤が高塩濃度溶液であり、具体的には塩濃度が５００ｍＭ超、例えば０．５Ｍ～２．５Ｍ、０．５Ｍ～２Ｍ、０．５Ｍ～１．５Ｍ、０．８Ｍ～１．２Ｍ、具体的には０．９Ｍ～１．１Ｍである、工程を含む。

いくつかの実施形態では、溶出緩衝剤は、酢酸ナトリウム及び／又は塩化ナトリウムを含む。いくつかの実施形態では、溶出緩衝剤は、１０ｍＭ～１００ｍＭの酢酸ナトリウム、具体的には２０ｍＭの酢酸ナトリウムを含む。いくつかの実施形態では、溶出緩衝剤は、０．５Ｍ～２Ｍの塩化ナトリウム、具体的には１Ｍの塩化ナトリウムを含む。特定の実施形態では、溶出緩衝剤は、酢酸ナトリウム及び塩化ナトリウムを含む。より特定の実施形態では、溶出緩衝剤は、１０ｍＭ～１００ｍＭの酢酸ナトリウム、具体的には２０ｍＭの酢酸ナトリウム、及び０．５Ｍ～２Ｍの塩化ナトリウム、具体的には１Ｍの塩化ナトリウムを含む。

好適には、溶出緩衝剤は、ｐＨ８～１０で正荷電したアミノ酸を含み、具体的には少なくとも５０ｍＭ、例えば５０ｍＭの濃度で、リジン、アルギニン、ヒスチジン、及びこれらの組み合わせなどのアミノ酸を含有するアミノ基の群から選択される。特定の実施形態では、溶出緩衝剤は、Ｌ－アルギニン、具体的には５０ｍＭのＬ－アルギニンを含む。

いくつかの実施形態では、溶出緩衝剤は、約１５ｍＭ～約２５ｍＭ Ｔｒｉｓ（例えば１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５ｍＭ）、具体的には２０ｍＭ Ｔｒｉｓを更に含む。

いくつかの実施形態では、溶出緩衝剤は、約８．５～約１０（例えば、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９．０、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、又は１０．０）のｐＨを有し、具体的には溶出緩衝剤はｐＨ９を有する。

特定の実施形態では、溶出緩衝剤は，ｐＨ９で２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２０ｍＭの酢酸ナトリウム、５０ｍＭのＬ－アルギニン、１ＭのＮａＣｌを含む。

いくつかの実施形態では、組み換え産生されたグリコシル化ポリペプチドが放出される前に、混入物質を洗い流し、組み換え産生されたグリコシル化ポリペプチドを保持するために洗浄緩衝剤がＭＣＣ樹脂に適用される。好適には、洗浄緩衝剤は２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ１０である。

いくつかの実施形態では、ＭＣＣカラムは、平衡緩衝剤で平衡化される。いくつかの実施形態では、組み換え産生されたグリコシル化ポリペプチド組成物をＭＣＣカラムと接触させる前に、例えば、ＭＣＣ樹脂上に浄化された細胞培養物上清を投入する前に、ＭＣＣカラムは平衡緩衝剤で平衡化される。いくつかの実施形態では、平衡緩衝剤は２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８を含む。

多モードアニオン交換クロマトグラフィー（ＭＡＣ）
本発明の方法で用いられるクロマトグラフィー工程の１つは、多モードアニオン交換クロマトグラフィー（ＭＡＣ）である。

本明細書で使用するとき、「多モードアニオン交換クロマトグラフィー」又は「ＭＡＣ」は、アニオン交換、及び固定相と検体との間の相互作用の少なくとも１つ以上の形態を用いるクロマトグラフィー法を指す。好適なＭＡＣ樹脂は、任意の多モードアニオン交換リガンド、例えばアミン又は他の正荷電基を含むリガンドを含み得る。

いくつかの実施形態では、本発明の方法で用いられるＭＡＣ樹脂は、マトリックスに結合したアニオン交換リガンド、例えば多モードアニオン交換リガンドを含み、ここでリガンドは、水性環境中でイオン相互作用によって組み換え産生されたグリコシル化ポリペプチド及び／又は混入物質と相互作用することが可能である。いくつかの実施形態では、多モードアニオン交換リガンドは、混入物質と相互作用する。

好適には、多モードアニオン交換リガンドは、アミン又はその他の正荷電基を含む。いくつかの実施形態では、ＭＡＣ樹脂は、アミンを含有するリガンドからなる。官能性アミンは、一級、二級、三級、及び四級アミン、ヒドラジン、例えば一置換ヒドラジン及び二置換ヒドラジン、ポリアミン、ポリイミン、ポリＱ（Ｑは四級アンモニウム基を指す）、アニリン、オクチルアミン、並びにヒドロキシルアミンからなる群から選択され得る。確率論的樹脂（Ｓｔｏｃｈａｓｔｉｃ ｒｅｓｉｎｓ）は、様々な濃度のフェニル基、ブチル基、ＰＥＧ、含フッ素リガンド、及び荷電基と組み合わせた１種類のアミン基に基づく。好適には、ＭＡＣ樹脂はオクチルアミンからなる。

いくつかの実施形態では、本発明の方法で用いられるＭＡＣ樹脂は、アニオン交換リガンド及びマトリックスを含む。マトリックスは、アガロース、セルロース、セラミックス、デキストラン、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、シリカ、合成ポリマー、有機ポリマーからなるリストから選択され得る。いくつかの実施形態では、本発明の方法で用いられるＭＡＣ樹脂は、アニオン交換リガンド及びアガロースマトリックスを含む。

いくつかの実施形態では、本発明の方法で用いられるＭＡＣ樹脂は、以下の市販の樹脂から選択される：ＭＥＰ Ｈｙｐｅｒｃｅｌ（商標）（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ：４－メルカプト－エチル－ピリジン（４－ＭＥＰ）及びセルロースマトリックス）；ＰＰＡ Ｈｙｐｅｒｃｅｌ（商標）（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；リガンド：フェニルプロピルアミン；静電気及び疎水性相互作用）；ＨＥＡ Ｈｙｐｅｒｃｅｌ（商標）（Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；リガンド：ヘキシルアミン；静電気及び疎水性相互作用）；ＣａｐｔｏＡｄｈｅｒｅ（商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；リガンド Ｎ－ベンジル－ｎ－メチルエタノールアミン及びアガロースマトリックス）；Ｃａｐｔｏ Ｃｏｒｅ７００（商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；リガンド オクチルアミン及びアガロースマトリックス）。

いくつかの実施形態では、ＭＡＣ樹脂は、リガンド活性化コア、例えばアミンリガンド、例えばオクチルアミンリガンド、及び不活性シェルからなる。不活性シェルはサイズ排除性質を有し、例えば、組み換え産生されたグリコシル化ポリペプチド、例えばラブリシンなどの大分子をシェルの細孔からコアが侵入することから排除する。したがって、組み換え産生されたグリコシル化ポリペプチド、例えばラブリシンは、より小さい不純物が内在化リガンドに結合する間にカラムの貫流中で回収される。好ましい実施形態では、ＭＡＣ樹脂はＣａｐｔｏ Ｃｏｒｅ ７００樹脂であり、これは７００ｋＤａの分子量カットオフを提供する。

好適には、いくつかの実施形態では、本発明の方法のＭＡＣ工程は、貫流モードで実施される。

本発明で使用される用語「貫流モード」及びその文法的等価物は、目的の物質を含有する溶液が固定相、好ましくは固相と接触させられ、それにより目的の物質がその固定相と結合しないクロマトグラフィー法の動作モードを表す。貫流モードでは、試料及び緩衝剤のｐＨを選択して、標的タンパク質又はクロマトグラフィー樹脂の電荷を修飾することができ、その結果、標的タンパク質は、不純物が樹脂に結合する間に貫流画分中で直接保持される。その結果、貫流又は上清のいずれかで目的の物質が得られる。これも溶液中に存在していた目的ではない物質は、固定相に結合し、溶液から除去される。これは、必ずしも、目的ではない物質の１００パーセントが溶液から除去されることを表すものではないが、目的ではない物質の本質的に１００パーセントが除去され、例えば、目的ではない物質の少なくとも５０パーセントが溶液から除去され、好ましくは目的ではない物質の少なくとも７５パーセントが溶液から除去され、好ましくは目的ではない物質の少なくとも９０パーセントが溶液から除去され、好ましくは目的ではない物質の９５パーセント超が溶液から除去される。

好適には、いくつかの実施形態では、本発明の方法のＭＡＣ工程は、（ｉ）組み換え産生されたグリコシル化ポリペプチド組成物を、ＭＡＣ樹脂を含むＭＡＣカラムと接触させる工程、具体的には、ＭＡＣ樹脂を含むＭＡＣカラム上にＭＣＣ工程の溶出液を投入する工程、（ｉｉ）ＭＡＣ樹脂を洗浄緩衝剤で洗浄する工程、及び（ｉｉｉ）精製又は富化形態の組み換え産生されたグリコシル化ポリペプチドを含む貫流を回収する工程を含む。

好適には、いくつかの実施形態では、本発明の方法のＭＡＣ工程は、組み換え産生されたグリコシル化ポリペプチド組成物を、ＭＡＣ樹脂を含むＭＡＣカラムと接触させる工程、具体的には、ＭＡＣ樹脂を含むＭＡＣカラム上にＭＣＣ工程の溶出液を投入する工程を含む。いくつかの実施形態では、組み換え産生されたグリコシル化ポリペプチド組成物、例えば、ＭＣＣ工程の溶出液は、ＭＡＣカラムに投入される前に、ｐＨを６～９（例えば、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９．０）、特にｐＨ７．０に調節される。

いくつかの実施形態では、ＭＡＣカラムは、平衡緩衝剤で平衡化される。いくつかの実施形態では、組み換え産生されたグリコシル化ポリペプチド組成物をＭＡＣカラムと接触させる前に、ＭＡＣカラムは平衡緩衝剤で平衡化される。好適には、平衡緩衝剤は、ｐＨ６～９（例えば６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９．０）で約４０～約６０ｍＭ Ｎａホスフェート、約３００～約１０００ｍＭ ＮａＣｌを含み、特にここで平衡緩衝剤はｐＨ７で５０ｍＭ Ｎａホスフェート、７５０ｍＭ ＮａＣｌを含む。

好適には、いくつかの実施形態では、本発明の方法のＭＡＣ工程は、（ｉ）組み換え産生されたグリコシル化ポリペプチド組成物を、ＭＡＣ樹脂を含むＭＡＣカラムと接触させる工程、具体的には、ＭＡＣ樹脂を含むＭＡＣカラム上にＭＣＣ工程の溶出液を投入する工程、（ｉｉ）ＭＡＣ樹脂を洗浄緩衝剤で洗浄する工程、及び（ｉｉｉ）精製又は富化形態の組み換え産生されたグリコシル化ポリペプチドを含む貫流を回収する工程を含む。好適には、洗浄緩衝剤は、ｐＨ６～９（例えば６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９．０）で約４０～約６０ｍＭ Ｎａホスフェート、約３００～約１０００ｍＭ ＮａＣｌを含み、特にここで洗浄緩衝剤はｐＨ７で５０ｍＭ Ｎａホスフェート、７５０ｍＭ ＮａＣｌを含む。

疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）。
本発明の方法で用いられるクロマトグラフィー工程の１つは、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）である。

用語「疎水性相互作用クロマトグラフィー」又は「ＨＩＣ」は、「疎水性相互作用クロマトグラフィー材料」が用いられるクロマトグラフィー法を指す。ＨＩＣは、生体分子を高塩濃度で弱疎水性表面に吸着させること、及び続いて下降する塩勾配で溶出することに基づく。この技法は、クロマトグラフィー保持体上で固定化疎水性リガンドに結合する生体分子の表面上に存在する疎水性領域を有効利用する。

「疎水性相互作用クロマトグラフィー材料」は、ブチル基、オクチル基、又はフェニル基などの疎水性基がクロマトグラフィー官能基として結合しているクロマトグラフィー材料である。ポリペプチドは、疎水性相互作用クロマトグラフィー材料の疎水性基と相互作用できる、それらの表面に露出したアミノ酸側鎖の疎水性に応じて分離される。ポリペプチドとクロマトグラフィー材料との相互作用は、温度、溶媒、及び溶媒のイオン強度により影響され得る。アミノ酸側鎖の運動が増加し、より低温ではポリペプチド内部に埋もれていた疎水性アミノ酸側鎖がアクセス可能になることから、温度増加は、例えばポリペプチドと疎水性相互作用クロマトグラフィー材料との相互作用を支持する。疎水性相互作用はまた、コスモトロピックな塩により促進され、カオトロピックな塩により減少する。「疎水性相互作用クロマトグラフィー材料」としては、例えば、フェニルセファロースＣＬ－４Ｂ、６ＦＦ、ＨＰ、フェニルスペロース（Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｕｐｅｒｏｓｅ）、オクチルセファロースＣＬ－４Ｂ、４ＦＦ、及びブチルセファロース４ＦＦ、ヘキシル、エーテル、ＰＰＧ（全てＡｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｅｕｒｏｐｅ ＧｍｂＨ（Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手可能）が挙げられ、これらはバルク材料へのグリシジル－エーテルカップリングにより得られる。

いくつかの実施形態では、ＨＩＣカラムは、フェニル膜吸着剤、具体的にはＳａｒｔｏｂｉｎｄフェニル膜吸着剤を含む。フェニル膜吸着剤は、従来の疎水性相互作用クロマトグラフィーで既知のものと同じ規則に従う。大孔径であるため、膜吸着剤は優れた流動性を示す。従来のビーズクロマトグラフィーと比較して、質量の輸送に拡散限界はほぼ存在しない。高濃度の塩を含む緩衝剤は、疎水性膜マトリックス上のタンパク質の吸着を促進する。タンパク質は、溶出緩衝剤中の塩濃度を低下させることによって溶出される。

いくつかの実施形態では、貫流モードでＨＩＣ工程が実施される。

いくつかの実施形態では、ＨＩＣ工程は、組み換え産生されたグリコシル化ポリペプチド組成物をＨＩＣカラムと接触させる、例えば、ＭＡＣ工程の貫流をＨＩＣカラム上に投入する工程を含む。

好適には、組み換え産生されたグリコシル化ポリペプチド組成物、例えばＭＡＣ工程の貫流は、組み換え産生されたグリコシル化ポリペプチド組成物、例えば貫流をＨＩＣカラム上に投入する前に高塩濃度に調節され、特に、ここで得られた塩濃度は５００ｍＭ超、例えば０．５Ｍ～約１Ｍ、０．５Ｍ～１．５Ｍ、０．５Ｍ～１．２Ｍ、０．８Ｍ～１Ｍ、特に約０．９Ｍである。いくつかの実施形態では、塩は硫酸アンモニウムである。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法は、組み換え産生されたグリコシル化ポリペプチド組成物を高塩濃度に調節した後で、且つ組み換え産生されたグリコシル化ポリペプチド組成物をＨＩＣカラムに投入する前に、深層濾過を実施することを更に含む。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法は、ＭＡＣ工程の後で組み換え産生されたグリコシル化ポリペプチド組成物を高塩濃度に調節し、続いて組み換え産生されたグリコシル化ポリペプチド組成物をＨＩＣカラムに投入する前に深層濾過を実施する工程を更に含む。いくつかの実施形態では、深層濾過は好適なフィルタ、例えばセルロース又はポリプロピレン繊維ベースのフィルタ、例えば正荷電三層Ｂ１ＨＣフィルタを用いて実施される。

いくつかの実施形態では、ＨＩＣカラムは、平衡緩衝剤で平衡化される。いくつかの実施形態では、組み換え産生されたグリコシル化ポリペプチド組成物をＨＩＣカラムと接触させる前に、ＨＩＣカラムは平衡緩衝剤で平衡化される。特定の実施形態では、ＨＩＣカラムは、ｐＨ６．５～７．５（例えば６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５）で１５～２５ｍＭ Ｎａホスフェート、５００～１５００ｍＭ 硫酸アンモニウムを含む平衡緩衝剤で平衡化され、特に、ここで平衡緩衝剤は、ｐＨ７で２０ｍＭ Ｎａホスフェート、１Ｍ 硫酸アンモニウムを含む。

好適には、いくつかの実施形態では、本発明の方法のＨＩＣ工程は、ＨＩＣカラムを洗浄緩衝剤で洗浄する工程を含む。好適には、いくつかの実施形態では、本発明の方法のＨＩＣ工程は、組み換え産生されたグリコシル化ポリペプチド組成物をＨＩＣカラムと接触させた、例えば第２のクロマトグラフィー工程の貫流プールをＨＩＣカラムに投入した後で、ＨＩＣカラムを洗浄緩衝剤で洗浄することを含む。いくつかの実施形態では、洗浄緩衝剤は、ｐＨ６．５～７．５（例えば６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５）で１５～２５ｍＭ Ｎａホスフェート、５００～１５００ｍＭ 硫酸アンモニウムを含み、特に、ここで平衡緩衝剤は、ｐＨ７で２０ｍＭ Ｎａホスフェート、１Ｍ 硫酸アンモニウムを含む。

エンドヌクレアーゼ
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、（例えば、第１のクロマトグラフィー工程の前に）細胞培養物又は溶出液中に存在する核酸分子（例えばＤＮＡ及び／又はＲＮＡ）を分解させるための追加の工程を含む。したがって、いくつかの実施形態では、本発明の方法は、細胞培養物又は溶出液を、エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）ヌクレアーゼ）及びＭｇＣｌ_２で処理することを含む。好適には、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）ヌクレアーゼは、グリコシル化ポリペプチドを産生する細胞培養物に添加される。或いは、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）ヌクレアーゼは、組み換え産生されたグリコシル化ポリペプチドを含む浄化された細胞培養物上清に添加される。いくつかの実施形態では、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）ヌクレアーゼは、０．２μｍフィルタを用いた濾過に供される。いくつかの実施形態では、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）ヌクレアーゼ処理の工程は、Ｍｇ^２＋を、特に１～２ｍＭ Ｍｇ^２＋の量まで、細胞培養物、又は浄化された細胞培養物上清に添加すること（例えば、１～２ｍＭ ＭｇＣｌ_２を添加すること、例えば０．２μｍフィルタを用いた濾過に供された１～２ｍＭ ＭｇＣｌ_２を添加すること）を含む。いくつかの実施形態では、細胞培養物又は浄化された細胞培養物上清をＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）ヌクレアーゼで処理する工程は、１ｍｌの細胞培養物上清あたり５Ｕ～５０ＵのＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）ヌクレアーゼを添加することを含む。より特定の実施形態では、細胞培養物又は浄化された細胞培養物上清をＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）ヌクレアーゼで処理する工程は、（ｉ）１ｍｌの細胞培養物上清あたり約５Ｕ～５０ＵのＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）ヌクレアーゼ（例えば、１．０ｋｇの浄化収穫物あたり約２００μｌのＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）（２５０Ｕ／μｌ））を添加すること、及び（ｉｉ）Ｍｇ^２＋を、特に約１ｍＭ Ｍｇ^２＋の量まで、細胞培養物又は浄化された細胞培養物上清に添加することを含む。本明細書に記載される一実施形態では、浄化された細胞培養物上清をＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）ヌクレアーゼで処理する工程は、（ｉ）１ｍｌの細胞培養物上清あたり１Ｕ～５Ｕ（例えば２Ｕ）のＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）ヌクレアーゼを添加すること、及び（ｉｉ）Ｍｇ^２＋を、特に約１ｍＭ Ｍｇ^２＋の量まで、浄化された細胞培養物上清に添加することを含む。更に、本明細書に記載される一実施形態では、細胞培養物をＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）ヌクレアーゼで処理する工程は、（ｉ）１ｍｌの細胞培養物あたり１Ｕ～５Ｕ（例えば２Ｕ）のＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）ヌクレアーゼを添加すること、及び（ｉｉ）Ｍｇ^２＋を、特に約１ｍＭ Ｍｇ^２＋の量まで、細胞培養物に添加することを含む。

いくつかの実施形態では、浄化された細胞培養物上清をＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）ヌクレアーゼで処理する工程は、（ｉ）１ｍｌの細胞培養物上清あたり２Ｕ、５Ｕ、１０Ｕ、１５Ｕ、２０Ｕ、３０Ｕ、４０Ｕ、５０Ｕ、５Ｕ～５０Ｕ、１Ｕ～５Ｕ、又は１Ｕ～５０ＵのＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）ヌクレアーゼを添加すること、及び（ｉｉ）ＭｇＣｌ_２を、特に約１ｍＭ ＭｇＣｌ_２の量まで、浄化された細胞培養物上清に添加することを含む。いくつかの実施形態では、浄化された細胞培養物上清をＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）ヌクレアーゼで処理する工程は、（ｉ）１ｍｌの細胞培養物上清あたり２ＵのＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）ヌクレアーゼを添加すること、及び（ｉｉ）ＭｇＣｌ_２を、特に約１ｍＭ ＭｇＣｌ_２の量まで、細胞培養物又は浄化された細胞培養物上清に添加することを含む。いくつかの実施形態では、細胞培養収穫物は、ＭｇＣｌ_２及びエンドヌクレアーゼと接触する前に２～８℃に冷却される。

いくつかの実施形態では、細胞培養物をＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）ヌクレアーゼで処理する工程は、１ｍｌの細胞培養物あたり２Ｕ、５Ｕ、１０Ｕ、１５Ｕ、２０Ｕ、３０Ｕ、４０Ｕ、５０Ｕ、５Ｕ～５０Ｕ、１Ｕ～５Ｕ、又は１Ｕ～５０ＵのＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）ヌクレアーゼ、及びＭｇＣｌ_２を細胞培養物に添加することを含む。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、１ｍｌの細胞培養物あたり２ＵのＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）ヌクレアーゼ、及びＭｇＣｌ_２を細胞培養物に添加することを含む。いくつかの実施形態では、細胞培養物は、ＭｇＣｌ_２及びエンドヌクレアーゼと接触する前に２～８℃に冷却される。

いくつかの実施形態では、細胞培養物をエンドヌクレアーゼで処理する工程は、細胞培養物をエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）ヌクレアーゼ）及びＭｇＣｌ_２で処理すること、例えば、細胞培養の９日目、１０日目、１１日目、１２日目、１３日目、１４日目、１５日目に（例えば、バイオリアクター中で細胞を培養する、例えば３０℃のバイオリアクター中で細胞を培養する９日目、１０日目、１１日目、１２日目、１３日目、１４日目、１５日目に）細胞培養物をエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）ヌクレアーゼ）及びＭｇＣｌ_２で処理することを含む。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、１ｍｌの細胞培養物あたり２Ｕ、５Ｕ、１０Ｕ、１５Ｕ、２０Ｕ、３０Ｕ、４０Ｕ、５０Ｕ、５Ｕ～５０Ｕ、１Ｕ～５Ｕ、又は１Ｕ～５０ＵのＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）ヌクレアーゼ、及びＭｇＣｌ_２を細胞培養物に添加することを含む。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、１ｍｌの細胞培養物あたり２ＵのＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）ヌクレアーゼ、及びＭｇＣｌ_２を細胞培養物に添加することを含む。

いくつかの実施形態では、本発明の方法は、（ａ）組み換え産生されたラブリシン糖タンパク質をコードする核酸を含む宿主細胞、特に真核細胞を栽培することと、（ｂ）組み換え産生されたラブリシン糖タンパク質を含む細胞培養物上清を浄化することと、（ｃ）上記の組み換え産生されたラブリシン糖タンパク質を本発明の方法で精製することと、を含む。

ウイルス不活化
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、クロマトグラフィー工程のうち１つ以上の間、又は第３のクロマトグラフィー工程の後で実施されるウイルス不活化及び／又はウイルス濾過工程を更に含む。

特定の実施形態では、本発明の方法は、本明細書に記載される１つ以上のウイルス不活化（ＶＩＮ）処理工程、及びウイルス除去工程を更に含む。様々なウイルス不活化法が当業者に既知であり、本発明の方法で用いることができ、これとしては、低温殺菌、末端乾燥加熱、蒸気加熱、溶媒／洗剤、及び酸性ｐＨが挙げられるがこれらに限定されない。ウイルス除去手順もまた周知されており、これとしては、沈降、クロマトグラフィー、及びナノ濾過が挙げられるがこれらに限定されない。ウイルス不活化及び除去は、プロセス中（例えば、ナノ濾過及び溶媒／洗剤処理、低温殺菌、水蒸気処理、並びに／又は約ｐＨ４．０でのインキュベーション）で、又は最終容器内の末期で行うことができる（例えば、末期低温殺菌、又は末期乾熱処理）。

いくつかの実施形態では、本発明の方法は、低ｐＨ、例えばｐＨ４．０以下、例えば約３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、又は４．０のｐＨによるウイルス不活化工程を含む。特定の実施形態では、ウイルス不活化工程は、第２のクロマトグラフィー工程と第３のクロマトグラフィー工程との間で（例えば、多モードアニオン交換クロマトグラフィー（ＭＡＣ）の後で、且つ疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）工程の前に）実施される。

いくつかの実施形態では、本発明の方法は、ウイルス不活化、例えば低ｐＨによるウイルス不活化工程に続いてウイルス除去工程を含む。いくつかの実施形態では、ウイルス除去工程は、ウイルス不活化工程の後で、且つ疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）工程の前に実施される。いくつかの実施形態では、ウイルス除去工程は、ウイルス不活化工程から得られた高グリコシル化タンパク質（例えば組み換えヒトラブリシン）を含む溶液（例えば濾液）を、塩化ナトリウム含有緩衝剤を用いた接線流濾過（ｔａｎｇｉａｌ ｆｌｏｗ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）に供することを含む。いくつかの実施形態では、溶液は、５０ｍＳ／ｃｍ超の導電率を特徴とする。いくつかの実施形態では、塩化ナトリウム含有緩衝剤は、ｐＨ６．５～ｐＨ７．５（例えば、ｐＨ６．５、ｐＨ６．６、ｐＨ６．７、ｐＨ６．８、ｐＨ６．９、ｐＨ７．０、ｐＨ７．１、ｐＨ７．２、ｐＨ７．３、ｐＨ７．４、又はｐＨ７．５）のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、１５ｍＳ／ｃｍ以下（例えば１５ｍＳ／ｃｍ、１０ｍＳ／ｃｍ、又は５ｍＳ／ｃｍ）の導電率が達成されるまで、接線流濾過が実施される。いくつかの実施形態では、接線流濾過に続いて、溶液をアニオン交換デプスフィルタ（ＡＥＸ）で濾過する。いくつかの実施形態では、ＡＥＸフィルタは、接線流濾過に使用する緩衝剤で洗浄する。いくつかの実施形態では、ＡＥＸフィルタからの濾液を硫酸アンモニウム溶液で処理して、０．４Ｍ～１．５Ｍ（例えば、０．４Ｍ、０．５Ｍ、０．６Ｍ、０．７Ｍ、０．８Ｍ、０．９Ｍ、１．０Ｍ、１．１Ｍ、１．２Ｍ、１．３Ｍ、１．４Ｍ、又は１．５Ｍ）の硫酸アンモニウム濃度を達成する。いくつかの実施形態では、硫酸アンモニウム溶液で処理されるＡＥＸフィルタからの濾液は、ＨＩＣ工程に供される。したがって、本明細書に記載される本発明のいくつかの実施形態では、高グリコシル化タンパク質（例えば組み換えヒトラブリシン）を精製する方法は、上記のウイルス除去工程を含む。本明細書に記載される本発明のいくつかの実施形態では、高グリコシル化タンパク質（例えば組み換えヒトラブリシン）を産生する方法は、上記のウイルス除去工程を含む。上記のウイルス除去工程を含む方法によって産生又は精製された高グリコシル化タンパク質（例えば、組み換えヒトラブリシン）も本明細書で説明される。上記のウイルス除去工程を含む方法によって産生又は精製された高グリコシル化タンパク質（例えば、組み換えヒトラブリシン）を含む組成物も本明細書で説明される。

いくつかの実施形態では、本発明の方法は、溶出液が洗剤又はＮ，Ｎ－ジメチル尿素（ＤＭＵ）と接触するウイルス不活化工程を含む。一態様では、溶出液は、Ｎ，Ｎ－ジメチル尿素（ＤＭＵ）、例えば、約３Ｍ Ｎ，Ｎ－ジメチル尿素（ＤＭＵ）の溶液と接触する。

いくつかの実施形態では、本発明の方法は、ウイルス濾過工程を含む。特定の実施形態では、ウイルス濾過は、第３のクロマトグラフィー工程の後（例えば、ＨＩＣ工程の後）で実施される。ウイルス濾過法及びフィルタは当業者に周知されており、これとしては、ウイルス粒子を捕捉するための精密濾過（例えば、孔径が約０．１～１０μｍの膜）及び限外濾過（例えば、孔径が約０．００１～０．１μｍの膜）の使用が挙げられるが、これらに限定されない。

いくつかの実施形態では、本発明の方法は、限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）により緩衝剤交換を実施する工程を更に含む。特定の実施形態では、ＵＦ／ＤＦによる緩衝剤交換の工程は、第３のクロマトグラフィー工程の後で（例えば、ＨＩＣ工程の後で）実施される。より特定の実施形態では、ＵＦ／ＤＦによる緩衝剤交換の工程は、ウイルス濾過工程後の第３のクロマトグラフィー工程の後で実施される。

純度パラメータ
いくつかの実施形態では、混入物質（例えばポリヌクレオチド及び／又は宿主細胞タンパク質）の含有量は、精製前、例えば第１のクロマトグラフィー工程前の含有量と比較して、３つのクロマトグラフィー工程を実施した後に得られるポリペプチド溶液中で減少する。いくつかの実施形態では、混入物質（例えばポリヌクレオチド及び／又は宿主細胞タンパク質）の含有量は、第１のクロマトグラフィー工程前の含有量と比較して、第３のクロマトグラフィー工程後に得られるポリペプチド溶液中で減少する。更なる実施形態では、混入物質（例えばポリヌクレオチド及び／又は宿主細胞タンパク質）の含有量は、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）ヌクレアーゼ処理工程前の含有量と比較して、第３のクロマトグラフィー工程後に得られるポリペプチド溶液中で減少する。いくつかの実施形態では、混入物質（例えばポリヌクレオチド及び／又は宿主細胞タンパク質）の含有量は、深層濾過工程、例えば、ＨＩＣ前に実施される深層濾過工程、例えばＭＡＣ工程の後で且つＨＩＣ工程の前に実施される深層濾過工程を実施した後に得られるポリペプチド溶液中で減少する。一般に、深層濾過は、濾過媒体（例えばセルロース）の厚さを利用して、懸濁粒子（例えば、懸濁した宿主細胞タンパク質粒子）を捕捉し、これらを担持流体（ｃａｒｒｙｉｎｇ ｆｌｕｉｄ）から分離する。

いくつかの実施形態では、本発明の方法の最終精製工程後に得られる最終ポリペプチド溶液の純度は、＞４０００ＩＵ／ｍｇ、好ましくは＞９０００ＩＵ／ｍｇ、より好ましくは＞１００００ＩＵ／ｍｇタンパク質であり、ＤＮＡ含有量は、＜１０００ｐｇ／１０００ＩＵ組み換え産生されたグリコシル化ポリペプチド、好ましくは＜１００ｐｇ／１０００ＩＵ組み換え産生されたグリコシル化ポリペプチド、より好ましくは＜１０ｐｇ／１０００ＩＵ組み換え産生されたグリコシル化ポリペプチドである。

いくつかの実施形態では、組み換え産生されたポリペプチドの、少なくとも３０％、例えば、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％ 少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％が、本発明の方法の後に回収される。いくつかの実施形態では、組み換え産生されたポリペプチドの、少なくとも４５％、例えば、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％が、第１のクロマトグラフィー工程前の量と比較して、第１のクロマトグラフィー工程後に回収される。いくつかの実施形態では、組み換え産生されたポリペプチドの少なくとも８０％、例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％が、第２のクロマトグラフィー工程前の量と比較して、第２のクロマトグラフィー工程後に回収される。いくつかの実施形態では、組み換え産生されたポリペプチドの少なくとも９０％、例えば、少なくとも９５％が、第３のクロマトグラフィー工程前の量と比較して、第３のクロマトグラフィー工程後に回収される。

ＳＥＣ、ＲＰＣ、及びｒＣＥ－ＳＤＳにより測定される純度基準
溶液（原薬又は製剤を含む）の純度は、下記によって測定可能な品質基準である：サイズ排除クロマトグラフ（ＳＥＣ）アッセイ、逆相クロマトグラフィー（ＲＰＣ）アッセイ、変性条件下還元キャピラリー電気泳動（ｒＣＥ－ＳＤＳ）アッセイ、又は本明細書に記載されるＳＥＣ、ＲＰＣ、及びｒＣＤ－ＳＤＳアッセイの任意の組み合わせ。溶液（例えば溶出液）の純度は、凝集体及び分解生成物を含むピーク全体に対する標的タンパク質のパーセンテージである。

例えば、いくつかの実施形態では、本発明の方法によって精製される組み換え産生されたグリコシル化ポリペプチドを含む溶液の純度は、逆相クロマトグラフィー（ＲＰＣ）を用いて決定することができる。ＲＰＣは、タンパク質精製を疎水性固定相及び極性移動相に頼るクロマトグラフィー技法である。本発明の方法によって精製される高グリコシル化ポリペプチドは、ＵＶ検出を用いたイオン対モードのＲＰＣによって、２つの主要なピーク群として分解することができる。２つの主要なピーク群のピーク面積対合計ピーク面積は、相対ピーク面積パーセンテージとして表される純度を定義する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法によって産生される組み換え産生されたグリコシル化ポリペプチドを含む溶液の純度は、ＲＰＣによって決定して８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上、又は９９．９％以上である。したがって、本明細書では、本明細書に記載される方法を用いて精製された組み換え産生されたグリコシル化ポリペプチド（例えば組み換えヒトラブリシン）を含む組成物（例えば医薬組成物）の純度を決定する方法も説明され、方法は、逆相クロマトグラフィー（ＲＰＣ）を実施する工程と、ＲＰＣによって決定した組成物の純度を計算する工程とを含む。いくつかの実施形態では、組成物の純度は、ＲＰＣによって決定したパーセント純度として計算される（例えば８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上、９９．９％以上、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約９９．５％、約９９．６％、約９９．７％、約９９．８％、又は約９９．９％）。

いくつかの実施形態では、本発明の方法によって精製される組み換え産生されたグリコシル化ポリペプチドを含む溶液の純度は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を用いて決定することができる。ＳＥＣは、分子をサイズに基づいて分離し、例えば精製タンパク質産物の凝集体及び断片を測定するのに用いることができるクロマトグラフィー技法である。精製タンパク質産物の凝集体は、ＳＥＣによって天然条件下でサイズに基づいてモノマーから分離され、ＵＶ検出によって検出され得る。凝集体の量は、各試料について得られた総面積のパーセンテージとして決定される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法によって産生された組み換え産生されたグリコシル化ポリペプチドの凝集体の合計（例えば、本明細書に記載される方法によって産生された組み換え産生されたグリコシル化ポリペプチドを含む組成物中の凝集体の合計）は、ＳＥＣによって決定して、約１０％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２％以下、又は約１％以下、好ましくは１％未満（例えば、ＳＥＣによって決定して、組み換え産生されたグリコシル化ポリペプチドの総量の約１０％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２％以下、又は約１％以下、好ましくは１％未満）である。したがって、本明細書に記載される方法を用いて精製された組み換え産生されたグリコシル化ポリペプチドを含む組成物（例えば医薬組成物）中における組み換え産生されたグリコシル化ポリペプチド（例えば組み換えヒトラブリシン）の凝集体の百分率を決定する方法も本明細書で説明され、方法は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を実施する工程と、ＳＥＣによって決定して凝集体の百分率を計算する工程と、を含む。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法によって産生された組み換え産生されたグリコシル化ポリペプチドの断片の合計（例えば、本明細書に記載される方法によって産生された組み換え産生されたグリコシル化ポリペプチドを含む組成物中の断片の合計）は、ＳＥＣによって決定して、約１５％以下、約１０％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２％以下、約１．５％以下、又は約１％以下、好ましくは１％未満（例えば、ＳＥＣによって決定して、組み換え産生されたグリコシル化ポリペプチドの総量の約１５％以下、約１０％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２％以下、約１．５％以下、又は約１％以下、好ましくは１％未満）である。したがって、本明細書に記載される方法を用いて精製された組み換え産生されたグリコシル化ポリペプチドを含む組成物（例えば医薬組成物）中における組み換え産生されたグリコシル化ポリペプチド（例えば組み換えヒトラブリシン）の断片の百分率を決定する方法も本明細書で説明され、方法は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を実施する工程と、ＳＥＣによって決定して断片の百分率を計算する工程と、を含む。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法によって産生された組み換え産生されたグリコシル化ポリペプチドの精製モノマーの合計は、ＳＥＣによって決定して、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上、又は９９．９％以上（例えば、ＳＥＣによって決定して、組み換え産生されたグリコシル化ポリペプチドの総量の７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、９９．５％以上、９９．６％以上、９９．７％以上、９９．８％以上、又は９９．９％以上）である。したがって、本明細書に記載される方法を用いて精製された組み換え産生されたグリコシル化ポリペプチドを含む組成物（例えば医薬組成物）中における組み換え産生されたグリコシル化ポリペプチド（例えば組み換えヒトラブリシン）の精製モノマーの百分率を決定する方法も本明細書で説明され、方法は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を実施する工程と、ＳＥＣによって決定して組み換え産生されたグリコシル化ポリペプチドのモノマーの百分率を計算する工程と、を含む。

試料の合計ピーク面積対既知の濃度の参照の合計ピーク面積に基づいてタンパク質の量を計算するために、ＵＶ検出を用いたサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を用いることもできる。いくつかの実施形態では、本発明の方法によって精製されたグリコシル化ポリペプチドを含む組成物のタンパク質濃度は、１．５０ｍｇ／ｍｌ～３．００ｍｇ／ｍｌである。いくつかの実施形態では、本発明の方法によって精製されたグリコシル化ポリペプチドを含む組成物のタンパク質濃度は、１．６０ｍｇ／ｍｌ～２．４０ｍｇ／ｍｌである。例えば、いくつかの実施形態では、本発明の方法によって精製されたグリコシル化ポリペプチドを含む組成物のタンパク質濃度は、１．５０ｍｇ／ｍｌ、１．６０ｍｇ／ｍｌ、１．７０ｍｇ／ｍｌ、１．８０ｍｇ／ｍｌ、１．９０ｍｇ／ｍｌ、２．００ｍｇ／ｍｌ、２．１０ｍｇ／ｍｌ、２．２０ｍｇ／ｍｌ、２．３０ｍｇ／ｍｌ、２．４０ｍｇ／ｍｌ、２．５０ｍｇ／ｍｌ、又は３．００ｍｇ／ｍｌである。したがって、本明細書に記載される方法を用いて精製された組み換え産生されたグリコシル化ポリペプチドを含む組成物（例えば医薬組成物）中における組み換え産生されたグリコシル化ポリペプチド（例えば組み換えヒトラブリシン）の濃度を決定する方法も本明細書で説明され、方法は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を実施する工程と、組成物中におけるグリコシル化ポリペプチドのタンパク質濃度を決定する工程と、を含む。いくつかの実施形態では、組成物中のグリコシル化ポリペプチドのタンパク質濃度は、ＳＥＣによって決定して、１．５０ｍｇ／ｍｌ、１．６０ｍｇ／ｍｌ、１．７０ｍｇ／ｍｌ、１．８０ｍｇ／ｍｌ、１．９０ｍｇ／ｍｌ、２．００ｍｇ／ｍｌ、２．１０ｍｇ／ｍｌ、２．２０ｍｇ／ｍｌ、２．３０ｍｇ／ｍｌ、２．４０ｍｇ／ｍｌ、２．５０ｍｇ／ｍｌ、３．００ｍｇ／ｍｌ、又は１．６０ｍｇ／ｍｌ～２．４０ｍｇ／ｍｌである。

本発明のいくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法は、変性条件下還元キャピラリー電気泳動（ｒＣＥ－ＳＤＳ）の実施を含む工程を含む。こうした実施形態では、ｒｈラブリシンポリペプチド及びその断片は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）で変性され、メルカプトエタノールで還元される。理論に束縛されるものではないが、ＳＤＳは、タンパク質の固有電荷をマスクし、単位質量あたりの一定の電荷を用いて複合体を形成するものと考えられる。これらの複合体は、そのサイズに従い、電場中での親水性ふるい分けポリマーを介したマイグレーションによって分離される。主ピーク及び変形は、相対的時間補正ピーク面積決定法によって定量化される。ｒＣＥ－ＳＤＳを用いてタンパク質断片を除去し、組成物の純度を向上させることができる。

いくつかの実施形態では、本発明の方法によって精製される組み換え産生されたグリコシル化ポリペプチドを含む溶液の純度は、変性条件下還元キャピラリー電気泳動（ｒＣＥ－ＳＤＳ）によって決定することができる。ｒＣＥ－ＳＤＳは、ポリペプチドがドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）で変性され、メルカプトエタノールで還元されるクロマトグラフィー技法である。理論に束縛されるものではないが、ＳＤＳは、ポリペプチドの固有電荷をマスクし、単位質量あたりの一定の電荷を用いて複合体を形成するものと考えられる。これらの複合体は、そのサイズに従い、電場中での親水性ふるい分けポリマーを介したマイグレーションによって分離される。主ピーク及び変形は、相対的時間補正ピーク面積決定法によって定量化される。ｒＣＥ－ＳＤＳは、組成物、例えば組み換え産生されたグリコシル化ポリペプチド、例えば組み換えヒトラブリシンを含む組成物中における純度（例えば、低分子量不純物、例えばタンパク質断片のパーセンテージ）を測定するために用いられ得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法によって産生又は精製された組み換え産生されたグリコシル化ポリペプチドの純度（例えば、本明細書に記載される方法によって産生された組み換え産生されたグリコシル化ポリペプチドを含む組成物中のタンパク質断片の合計）は、ｒＣＥ－ＳＤＳによって決定して、約１０％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２％以下、又は約１％以下、好ましくは１％未満（例えば、ｒＣＥ－ＳＤＳによって決定して、組み換え産生されたグリコシル化ポリペプチドの総量の約１０％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２％以下、又は約１％以下、好ましくは１％未満）である。したがって、本明細書に記載される方法を用いて精製された組み換え産生されたグリコシル化ポリペプチドを含む組成物（例えば医薬組成物）中における組み換え産生されたグリコシル化ポリペプチド（例えば組み換えヒトラブリシン）のタンパク質断片の百分率を決定する方法も本明細書で説明され、方法は、ｒＣＥ－ＳＤＳを実施する工程と、ｒＣＥ－ＳＤＳによって決定してタンパク質断片の百分率を計算する工程と、を含む。本明細書に記載される方法を用いて精製された組み換え産生されたグリコシル化ポリペプチドを含む組成物（例えば医薬組成物）中における組み換え産生されたグリコシル化ポリペプチド（例えば組み換えヒトラブリシン）の百分率純度を決定する方法も本明細書で説明され、方法は、ｒＣＥ－ＳＤＳを実施する工程と、ｒＣＥ－ＳＤＳによって決定して百分率純度を計算する工程と、を含む。

精製タンパク質
更なる態様では、本発明は、本発明の方法によって精製される組み換え産生されたグリコシル化ポリペプチドに関する。特定の実施形態では、本発明は、本発明の方法によって精製されたラブリシンに関する。いくつかの実施形態では、本発明は、本発明の方法によって精製される組み換え産生されたグリコシル化ポリペプチドに関し、ここで組み換え産生されたグリコシル化ポリペプチドは、配列番号１又は２に対して少なくとも８０％の配列同一性、例えば、配列番号１又は２のアミノ酸２５～１４０４に対して少なくとも８５％、具体的には少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する。特定の実施形態では、本発明は、本発明の方法によって精製される組み換え産生されたグリコシル化ポリペプチドに関し、ここで組み換え産生されたグリコシル化ポリペプチドは、配列番号１又は２のアミノ酸２５～１４０４を有する。

別の態様では、本発明は、本発明の方法によって精製される組み換え産生されたグリコシル化ポリペプチド、例えばラブリシンを含む医薬組成物に関する。いくつかの実施形態では、本発明は、本発明の方法によって精製された、実質的に純粋な組み換え産生されたグリコシル化ポリペプチド、例えばラブリシンを含む医薬組成物に関する。いくつかの実施形態では、本発明の方法によって精製される組み換え産生されたグリコシル化ポリペプチドは、配列番号１又は２に対して少なくとも８５％の配列同一性、具体的には、配列番号１又は２のアミノ酸２５～１４０４に対して少なくとも９０％、例えば少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する。特定の実施形態では、本発明の方法によって精製される組み換え産生されたグリコシル化ポリペプチドは、配列番号１又は２のアミノ酸２５～１４０４を含む。

本明細書で使用するとき、組み換え産生されたグリコシル化ポリペプチドに関する用語「実質的に純粋な」は、組み換え産生されたグリコシル化ポリペプチドが、１０重量％未満、好ましくは５重量％未満、より好ましくは３重量％未満、より好ましくは１重量％未満、最も好ましくは０．１重量％未満の任意の残留混入物質（例えばポリヌクレオチド、宿主タンパク質、標的タンパク質凝集体、及び／又はその調製から生じたプロセス不純物）を含むことを意味する。例えば、組み換え産生されたグリコシル化ポリペプチドは、現時点で既知であり且つ当該技術分野で一般的に受け入れられている手段により測定して９０重量％超の純度を有し、残りの１０重量％未満の物質が、混入物質（例えばポリヌクレオチド、宿主タンパク質、標的タンパク質凝集体、及び／又はプロセスに関連する不純物）を含むという点において実質的に純粋であるとみなされ得る。反応不純物及び／又は処理不純物の存在は、例えばクロマトグラフィー、質量分析法、又はｑＰＣＲなどの当該技術分野で既知の分析技法によって決定することができる。

精製の任意の段階における試料のタンパク質濃度は、任意の好適な方法によって決定することができる。こうした方法は、当該技術分野で周知されており、これらとしては以下が挙げられる：１）ローリーアッセイ、ブラッドフォードアッセイ、スミスアッセイ、及びコロイド金アッセイなどの比色法、２）タンパク質のＵＶ吸収特性を利用する方法（例えばＵＶ吸収を利用するクロマトグラフィー法）、並びに３）同じゲル上の既知の量のタンパク質標準との比較に依存する、ゲル上の染色タンパク質バンドに基づく視覚的推定。例えば、Ｓｔｏｓｃｈｅｋ（１９９０），Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ，ｉｎ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８２：５０－６８を参照されたい。

標的タンパク質、及び試料中に存在し得る混入タンパク質は、任意の適切な手段によって監視することができる。好ましくは、技法は、約２百万分率（ｐｐｍ）（精製されるタンパク質１ミリグラムあたりのナノグラムとして計算される）～５００ｐｐｍの範囲で混入物質が検出されるのに十分な感受性があるべきである。例えば、当該技術分野で周知の方法である酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いて、第２のタンパク質によるタンパク質混入を検出することができる。例えば、Ｒｅｅｎ（１９９４），Ｅｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ），ｉｎ Ｂａｓｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３２：４６１－４６６（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。一態様では、こうしたその他のタンパク質によるタンパク質混入は、本明細書に記載される方法の後に、好ましくは少なくとも約２倍、より好ましくは少なくとも約３倍、より好ましくは少なくとも約５倍、より好ましくは少なくとも約１０倍、より好ましくは少なくとも約２０倍、より好ましくは少なくとも約３０倍、より好ましくは少なくとも約４０倍、より好ましくは少なくとも約５０倍、より好ましくは少なくとも約６０倍、より好ましくは少なくとも約７０倍、より好ましくは少なくとも約８０倍、より好ましくは少なくとも約９０倍、最も好ましくは少なくとも約１００倍低下され得る。

別の態様では、本明細書に記載される方法の後で、他の混入タンパク質による標的タンパク質の混入は、約１０，０００ｐｐｍ以下、好ましくは約２５００ｐｐｍ以下、より好ましくは約４００ｐｐｍ以下、より好ましくは約３６０ｐｐｍ以下、より好ましくは約３２０ｐｐｍ以下、より好ましくは約２８０ｐｐｍ以下、より好ましくは約２４０ｐｐｍ以下、より好ましくは約２００ｐｐｍ以下、より好ましくは約１６０ｐｐｍ以下、より好ましくは約１４０ｐｐｍ以下、より好ましくは約１２０ｐｐｍ以下、より好ましくは約１００ｐｐｍ以下、より好ましくは約８０ｐｐｍ以下、より好ましくは約６０ｐｐｍ以下、より好ましくは約４０ｐｐｍ以下、より好ましくは約３０ｐｐｍ以下、より好ましくは約２０ｐｐｍ以下、より好ましくは約１０ｐｐｍ以下、最も好ましくは約５ｐｐｍ以下である。こうした混入は、検出不能レベル～約１０ｐｐｍ、又は約１０ｐｐｍ～約１０，０００ｐｐｍの範囲であり得る。いくつかの実施形態では、本明細書で説明される高グリコシル化タンパク質（例えば、組み換えヒトラブリシン、例えば、本明細書に記載される方法によって産生又は精製される組み換えヒトラブリシン）を含む組成物では、混入タンパク質（例えば宿主細胞タンパク質）のレベルは、１，０００ｎｇ／ｍｇ高グリコシル化タンパク質（ｎｇ／ｍｇ）未満、９００ｎｇ／ｍｇ未満、８００ｎｇ／ｍｇ未満、７００ｎｇ／ｍｇ未満、６００ｎｇ／ｍｇ未満、５００ｎｇ／ｍｇ未満、４００ｎｇ／ｍｇ未満、３００ｎｇ／ｍｇ未満、２００ｎｇ／ｍｇ未満、又は１００ｎｇ／ｍｇ未満である。

特定の実施形態では、本発明は、精製された組み換えラブリシンを含む組成物を提供し、ここでラブリシン凝集体の含有量は≦２％であり（例えば本明細書で説明されるＳＥ－ＨＰＬＣ（ＳＥＣ）、又は当業者に既知の任意の他のこうした方法によって決定して）、ラブリシン断片含有量は≦１０％であり（例えば本明細書で説明されるＳＥＣによって決定）、宿主細胞タンパク質含有量は、例えばＥＬＩＳＡによって測定して≦３００ｎｇ／ｍｇであり、残留ＤＮＡ含有量は、例えばｑＰＣＲによって測定して≦２００，０００ｐｇ／ｍｇである。

特定の実施形態では、本発明は、組み換えラブリシン（例えば、本明細書に記載される方法によって産生又は精製される組み換えラブリシン）を含む組成物を提供し、ここでラブリシン凝集体の含有量は≦２％であり（例えば本明細書で説明されるＳＥ－ＨＰＬＣ（ＳＥＣ）、又は当業者に既知の任意の他のこうした方法によって決定して）、ラブリシン断片含有量は≦１０％であり（例えば本明細書で説明されるＳＥＣによって決定）、宿主細胞タンパク質含有量は、例えばＥＬＩＳＡによって測定して≦３００ｎｇ／ｍｇであり、残留ＤＮＡ含有量は、例えばｑＰＣＲによって測定して≦２００，０００ｐｇ／ｍｇである。

本明細書に記載される方法を用いて産生される精製された組み換えラブリシンを含む組成物の宿主細胞タンパク質含有量は、任意の好適な方法、例えばＥＬＩＳＡを用いて決定可能である。いくつかの実施形態では、本発明は、精製された組み換えラブリシンを含む組成物を提供し、ここで宿主細胞タンパク質含有量は、ＥＬＩＳＡによって決定して、≦１，０００ｎｇ／ｍｇの組み換えラブリシン（ｎｇ／ｍｇ）、≦９００ｎｇ／ｍｇ、≦８００ｎｇ／ｍｇ、≦７００ｎｇ／ｍｇ、≦６００ｎｇ／ｍｇ、≦５００ｎｇ／ｍｇ、≦４００ｎｇ／ｍｇ、≦３００ｎｇ／ｍｇ、≦２５０ｎｇ／ｍｇ、≦２００ｎｇ／ｍｇ、≦１５０ｎｇ／ｍｇ、又は≦１００ｎｇ／ｍｇ（例えば≦１，０００ｎｇの宿主細胞タンパク質／ｍｇ原薬）である。いくつかの実施形態では、本発明は、組み換えラブリシン（例えば、本明細書に記載される方法によって産生又は精製される組み換えラブリシン）を含む組成物を提供し、ここで宿主細胞タンパク質含有量は、ＥＬＩＳＡによって決定して、≦１，０００ｎｇ／ｍｇ、≦９００ｎｇ／ｍｇ、≦８００ｎｇ／ｍｇ、≦７００ｎｇ／ｍｇ、≦６００ｎｇ／ｍｇ、≦５００ｎｇ／ｍｇ、≦４００ｎｇ／ｍｇ、≦３００ｎｇ／ｍｇ、≦２５０ｎｇ／ｍｇ、≦２００ｎｇ／ｍｇ、≦１５０ｎｇ／ｍｇ、又は≦１００ｎｇ／ｍｇ（例えば≦１，０００ｎｇの宿主細胞タンパク質／ｍｇ原薬）である。

残留宿主細胞ＤＮＡ（例えばＣＨＯ細胞ＤＮＡ）による精製された組み換えラブリシンを含む組成物の混入は、宿主細胞ゲノム全体に分散した反復配列の定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）増幅によって決定可能である。例えば、ＣＨＯ細胞ゲノムはＡｌｕ型反復の配列を含み、その中で、哺乳類ゲノムごとに約３００，０００コピーが存在する。これらの反復は、ＣＨＯ ＤＮＡの代理マーカーとしての役割を果たすことができる。増幅のためのフォワードプライマー及びリバースプライマーとしての役割を果たすオリゴヌクレオチドは、この反復配列の保存された１００塩基対コア領域を定義する。試料中の総残留ＤＮＡは、混入ＤＮＡによって生成された反応と、ゲノム参照標準、例えばＣＨＯ Ｋ１ＰＤ親細胞から単離されたＣＨＯゲノムＤＮＡ参照標準によって生成された反応とを比較することによって決定可能である。いくつかの実施形態では、本明細書で説明される本発明は、精製された組み換えラブリシンを含む組成物を提供し、ここで宿主細胞残留ＤＮＡ含有量は、ｑＰＣＲによって決定して、≦３００，０００ｐｇ／ｍｇ、≦２００，０００ｐｇ／ｍｇ、≦１００，０００ｐｇ／ｍｇ、≦５０，０００ｐｇ／ｍｇ、≦１０，０００ｐｇ／ｍｇ、≦５，０００ｐｇ／ｍｇ、≦１，０００ｐｇ／ｍｇ、≦５００ｐｇ／ｍｇ、≦１００ｐｇ／ｍｇ、≦５０ｐｇ／ｍｇ、≦１０ｐｇ／ｍｇ、又は≦５ｐｇ／ｍｇ（例えば≦３００，０００ｐｇの宿主細胞ＤＮＡ／ｍｇ原薬）である。いくつかの実施形態では、本明細書で説明される本発明は、組み換えラブリシン（例えば、本明細書に記載される方法によって産生又は精製される組み換えラブリシン）を含む組成物を提供し、ここで宿主細胞残留ＤＮＡ含有量は、ｑＰＣＲによって決定して、≦３００，０００ｐｇ／ｍｇ、≦２００，０００ｐｇ／ｍｇ、≦１００，０００ｐｇ／ｍｇ、≦５０，０００ｐｇ／ｍｇ、≦１０，０００ｐｇ／ｍｇ、≦５，０００ｐｇ／ｍｇ、≦１，０００ｐｇ／ｍｇ、≦５００ｐｇ／ｍｇ、≦１００ｐｇ／ｍｇ、≦５０ｐｇ／ｍｇ、≦１０ｐｇ／ｍｇ、又は≦５ｐｇ／ｍｇ（例えば≦３００，０００ｐｇの宿主細胞ＤＮＡ／ｍｇ原薬）である。

特定の実施形態では、本発明は、精製された組み換えラブリシンを含む組成物を提供し、ここで組成物の細菌エンドトキシン含有量は、細菌エンドトキシン試験（ＢＥＴ）、例えばカブトガニ血球抽出成分（ＬＡＬ）試験に基づいて決定される。細菌エンドトキシン含有量を決定するためのアッセイは、米国薬局方＜８５＞及び欧州薬局方２．６．１４に従って実施可能である。例えば、いくつかの実施形態では、本発明は、精製された組み換えラブリシンを含む組成物を提供し、ここで細菌エンドトキシン含有量は、ＢＥＴによって決定して、８エンドトキシン単位（ＥＵ）／ｍＬ未満、７ＥＵ／ｍＬ未満、６ＥＵ／ｍＬ未満、５ＥＵ／ｍＬ未満、４ＥＵ／ｍＬ未満、３ＥＵ／ｍＬ未満、２ＥＵ／ｍＬ未満、１ＥＵ／ｍＬ未満、０．９ＥＵ／ｍＬ未満、０．８ＥＵ／ｍＬ未満、０．７ＥＵ／ｍＬ未満、０．６ＥＵ／ｍＬ未満、０．５ＥＵ／ｍＬ未満、０．４ＥＵ／ｍＬ未満、０．３ＥＵ／ｍＬ未満、０．２ＥＵ／ｍＬ未満、０．１ＥＵ／ｍＬ未満、０．０９ＥＵ／ｍＬ未満、０．０８ＥＵ／ｍＬ未満、０．０７ＥＵ／ｍＬ未満、０．０６ＥＵ／ｍＬ未満、０．０５ＥＵ／ｍＬ未満、０．０４ＥＵ／ｍＬ未満、０．０３ＥＵ／ｍＬ未満、０．０２ＥＵ／ｍＬ未満、又は０．０１ＥＵ／ｍＬ未満である。いくつかの実施形態では、本発明は、組み換えラブリシン（例えば、本明細書に記載される方法によって産生又は精製される組み換えラブリシン）を含む組成物を提供し、ここで細菌エンドトキシン含有量は、ＢＥＴによって決定して、８エンドトキシン単位（ＥＵ）／ｍＬ未満、７ＥＵ／ｍＬ未満、６ＥＵ／ｍＬ未満、５ＥＵ／ｍＬ未満、４ＥＵ／ｍＬ未満、３ＥＵ／ｍＬ未満、２ＥＵ／ｍＬ未満、１ＥＵ／ｍＬ未満、０．９ＥＵ／ｍＬ未満、０．８ＥＵ／ｍＬ未満、０．７ＥＵ／ｍＬ未満、０．６ＥＵ／ｍＬ未満、０．５ＥＵ／ｍＬ未満、０．４ＥＵ／ｍＬ未満、０．３ＥＵ／ｍＬ未満、０．２ＥＵ／ｍＬ未満、０．１ＥＵ／ｍＬ未満、０．０９ＥＵ／ｍＬ未満、０．０８ＥＵ／ｍＬ未満、０．０７ＥＵ／ｍＬ未満、０．０６ＥＵ／ｍＬ未満、０．０５ＥＵ／ｍＬ未満、０．０４ＥＵ／ｍＬ未満、０．０３ＥＵ／ｍＬ未満、０．０２ＥＵ／ｍＬ未満、又は０．０１ＥＵ／ｍＬ未満である。

特定の実施形態では、本発明は、精製された組み換えラブリシンを含む組成物を提供し、ここで組成物の微生物含有量は、微生物計数試験（ＭＥＴ）、例えば、総好気性微生物数（ＴＡＭＣ）試験、又は総真菌数（ＴＹＭＣ）試験に基づいて決定される。ＭＥＴは、欧州薬局方第２．６．１２／２．６．１３章、米国薬局方第＜６１＞／＜６２＞章、及び日本薬局方第＜４．０５＞章Ｉ／ＩＩの微生物学的方法に従って実施可能である。例えば、いくつかの実施形態では、本発明は、精製された組み換えラブリシンを含む組成物を提供し、ここで総好気性微生物含有量は、ＴＡＭＣ試験によって決定して、１コロニー形成単位（ＣＦＵ）／ｍＬ未満、１ＣＦＵ／２ｍｌ未満、１ＣＦＵ／３ｍｌ未満、１ＣＦＵ／４ｍｌ未満、１ＣＦＵ／５ｍｌ未満、１ＣＦＵ／６ｍｌ未満、１ＣＦＵ／７ｍｌ未満、１ＣＦＵ／８ｍｌ未満、１ＣＦＵ／９ｍｌ未満、又は１ＣＦＵ／１０ｍｌ未満である。いくつかの実施形態では、本発明は、組み換えラブリシン（例えば、本明細書に記載される方法によって産生又は精製される組み換えラブリシン）を含む組成物を提供し、ここで総好気性微生物含有量は、ＴＡＭＣ試験によって決定して、１コロニー形成単位（ＣＦＵ）／ｍＬ未満、１ＣＦＵ／２ｍｌ未満、１ＣＦＵ／３ｍｌ未満、１ＣＦＵ／４ｍｌ未満、１ＣＦＵ／５ｍｌ未満、１ＣＦＵ／６ｍｌ未満、１ＣＦＵ／７ｍｌ未満、１ＣＦＵ／８ｍｌ未満、１ＣＦＵ／９ｍｌ未満、又は１ＣＦＵ／１０ｍｌ未満である。いくつかの実施形態では、本発明は、精製された組み換えラブリシンを含む組成物を提供し、ここで総真菌数含有量は、ＴＹＭＣ試験によって決定して、１ＣＦＵ／ｍＬ未満、１ＣＦＵ／２ｍｌ未満、１ＣＦＵ／３ｍｌ未満、１ＣＦＵ／４ｍｌ未満、１ＣＦＵ／５ｍｌ未満、１ＣＦＵ／６ｍｌ未満、１ＣＦＵ／７ｍｌ未満、１ＣＦＵ／８ｍｌ未満、１ＣＦＵ／９ｍｌ未満、又は１ＣＦＵ／１０ｍｌ未満である。いくつかの実施形態では、本発明は、組み換えラブリシン（例えば、本明細書に記載される方法によって産生又は精製される組み換えラブリシン）を含む組成物を提供し、ここで総真菌数含有量は、ＴＹＭＣ試験によって決定して、１ＣＦＵ／ｍＬ未満、１ＣＦＵ／２ｍｌ未満、１ＣＦＵ／３ｍｌ未満、１ＣＦＵ／４ｍｌ未満、１ＣＦＵ／５ｍｌ未満、１ＣＦＵ／６ｍｌ未満、１ＣＦＵ／７ｍｌ未満、１ＣＦＵ／８ｍｌ未満、１ＣＦＵ／９ｍｌ未満、又は１ＣＦＵ／１０ｍｌ未満である。

特定の実施形態では、本発明は、容積サイズが少なくとも約１，０００Ｌ、少なくとも約１，５００Ｌ、少なくとも約２，０００Ｌ、少なくとも約２，５００Ｌ、又は少なくとも約３，０００Ｌであるバイオリアクター中で産生される細胞培養物から原薬を精製する方法を提供する。したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、原薬を精製する方法を提供し、方法は、容積サイズが少なくとも約１，０００Ｌ、少なくとも約１，５００Ｌ、少なくとも約２，０００Ｌ、少なくとも約２，５００Ｌ、又は少なくとも約３，０００Ｌであるバイオリアクター中で細胞を培養することを含む。バイオリアクター中で細胞を培養した後、細胞は収穫され得る。こうした細胞収穫物は、例えば、深層濾過、及び続いて滅菌濾過により収穫される。続いて、本明細書で説明される本発明の方法によって細胞収穫物から原薬を精製する。特定の実施形態では、原薬は、重グリコシル化組み換えタンパク質、例えば組み換えラブリシン又はその他のムチン様タンパク質又はムチンタンパク質である。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法は、細胞が、後のバイオリアクターの容積のものよりも小さな容積（例えば、少なくとも約１，０００Ｌ，１，５００Ｌ、２，０００Ｌ、２，５００Ｌ、又は３，０００Ｌであるバイオリアクター容積）中で予備培養される１つ以上の工程を含む。例えば、いくつかの実施形態では、方法は、約１０Ｌ、約２０Ｌ、約３０Ｌ、約４０Ｌ、約５０Ｌ、約６０Ｌ、約７０Ｌ、約８０Ｌ、約９０Ｌ、約１００Ｌ、約１５０Ｌ、約２００Ｌ、約２５０Ｌ、約３００Ｌ、約３５０Ｌ、約４００Ｌ、約４５０Ｌ、約５００Ｌ、約５５０Ｌ、及び／又は約６００Ｌのバイオリアクター容積中で細胞を予備培養することを含む。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法は、約１０Ｌのバイオリアクター容積中で細胞を予備培養し、約９２Ｌのバイオリアクター容積中で細胞を予備培養し、その後、約１，０００Ｌのバイオリアクター容積中で細胞を予備培養する工程を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法は、約２０Ｌのバイオリアクター容積中で細胞を予備培養し、約１００Ｌのバイオリアクター容積中で細胞を予備培養し、約４００Ｌのバイオリアクター容積中で細胞を予備培養し、その後、約２，０００Ｌのバイオリアクター容積中で細胞を予備培養する工程を含む。

特定の実施形態では、本発明は、細胞培養物から少なくとも約１．５ｇ／Ｌ（例えば、約１．５ｇ／Ｌ、１．６ｇ／Ｌ、１．７ｇ／Ｌ、１．８ｇ／Ｌ、１．９ｇ／Ｌ、２．０ｇ／Ｌ、２．１ｇ／Ｌ、２．２ ｇ／Ｌ、２．３ｇ／Ｌ、２．４ｇ／Ｌ、２．５ｇ／Ｌ、２．６ｇ／Ｌ、２．７ｇ／Ｌ、２．８ｇ／Ｌ、２．９ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ、約１．５ｇ／Ｌ～約３．０ｇ／Ｌ、約１．５ｇ／Ｌ～約３．５ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ～約３．０ｇ／Ｌ、約１．５ｇ／Ｌ～約２．５ｇ／Ｌ、約１．６ｍｇ／ｍｌ～約２．４ｍｇ／ｍｌ、又は約２．０ｇ／Ｌ～約４．０ｇ／Ｌ）の原薬を精製する方法を提供する。特定の実施形態では、原薬は、重グリコシル化組み換えタンパク質、例えば組み換えラブリシン又はその他のムチン様タンパク質又はムチンタンパク質である。したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、細胞培養物容積の各単位からある量の重グリコシル化タンパク質を精製する方法（例えば、細胞培養物の各リットルから少なくとも約１．５ｇの重グリコシル化タンパク質を精製する方法）を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法を用いて細胞培養物から精製されるタンパク質の量は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって決定される。したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、ＳＥＣによって決定して、細胞培養物から少なくとも約１．５ｇ／Ｌ（例えば、約１．５ｇ／Ｌ、１．６ｇ／Ｌ、１．７ｇ／Ｌ、１．８ｇ／Ｌ、１．９ｇ／Ｌ、２．０ｇ／Ｌ、２．１ｇ／Ｌ、２．２ ｇ／Ｌ、２．３ｇ／Ｌ、２．４ｇ／Ｌ、２．５ｇ／Ｌ、２．６ｇ／Ｌ、２．７ｇ／Ｌ、２．８ｇ／Ｌ、２．９ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ、約１．５ｇ／Ｌ～約３．０ｇ／Ｌ、約１．５ｇ／Ｌ～約３．５ｇ／Ｌ、約２．０ｇ／Ｌ～約３．０ｇ／Ｌ、約１．６ｍｇ／ｍｌ～約２．４ｍｇ／ｍｌ、約１．５ｇ／Ｌ～約２．５ｇ／Ｌ、又は約２．０ｇ／Ｌ～約４．０ｇ／Ｌ）の原薬を精製する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、ＳＥＣによって決定して、細胞培養物から少なくとも約１．５ｇ／Ｌ（例えば、約１．５ｇ／Ｌ、１．６ｇ／Ｌ、１．７ｇ／Ｌ、１．８ｇ／Ｌ、１．９ｇ／Ｌ、２．０ｇ／Ｌ、２．１ｇ／Ｌ、２．２ ｇ／Ｌ、２．３ｇ／Ｌ、２．４ｇ／Ｌ、２．５ｇ／Ｌ、２．６ｇ／Ｌ、２．７ｇ／Ｌ、２．８ｇ／Ｌ、２．９ｇ／Ｌ、約３．０ｇ／Ｌ、約１．５ｇ／Ｌ～約３．０ｇ／Ｌ、約１．５ｇ／Ｌ～約３．５ｇ／Ｌ、約１．６ｍｇ／ｍｌ～約２．４ｍｇ／ｍｌ、約２．０ｇ／Ｌ～約３．０ｇ／Ｌ、約１．５ｇ／Ｌ～約２．５ｇ／Ｌ、又は約２．０ｇ／Ｌ～約４．０ｇ／Ｌ）の原薬を精製する方法を提供し、ここで細胞培養物の容積は、少なくとも約１，０００Ｌ、少なくとも約１，５００Ｌ、少なくとも約２，０００Ｌ、少なくとも約２，５００Ｌ、少なくとも約３，０００Ｌ、約１，０００Ｌ、約１，５００Ｌ、約２，０００Ｌ、約２，５００Ｌ、又は約３，０００Ｌである。

効力
いくつかの実施形態では、本明細書で説明される本発明は、特定の効力特性を備えるｒｈラブリシンを含む組成物を産生するのに有効な方法を提供する。本明細書で説明される組成物の効力は、例えば細胞接着アッセイ、例えばＡ３７５細胞接着アッセイで測定可能である。例えば、高グリコシル化タンパク質の効力は、細胞組織培養マイクロタイタープレートの表面に対するＡ３７５ヒト黒色腫細胞の接着を阻害するその能力に基づいて決定することができる。高グリコシル化タンパク質試料が、参照物質と比較してＡ３７５細胞の接着の用量依存的な阻害を示す場合、その正体を確認可能である。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法を用いて精製される高グリコシル化タンパク質を含む組成物は、Ａ３７５細胞接着アッセイによって決定して、参照物質の生物活性と比較して５０％～１５０％（例えば５０％、７５％、１００％、１２５％、又は１５０％）の効力を示す。一態様では、本明細書に記載される方法を用いて精製された組み換えラブリシンを含む組成物の効力を決定する方法が本明細書で開示され、効力を決定する方法は、Ａ３７５細胞接着アッセイを実施することと、組み換えラブリシンを含む組成物の活性を参照標準と比較して測定することと、を含む。いくつかの実施形態では、組み換えラブリシンを含む組成物は、Ａ３７５細胞接着アッセイによって決定して、参照物質（例えば、精製された組み換えラブリシンの参照試料）の活性と比較して５０％～１５０％（例えば５０％、７５％、１００％、１２５％、又は１５０％）の活性を示す。

いくつかの実施形態では、本明細書で説明される本発明は、特定の効力特性を備えるｒｈラブリシンを含む組成物を産生するのに有効な方法を提供する。本明細書で説明される組成物の効力は、例えばレポーター細胞アッセイ、例えばＮＦ－κＢレポーター細胞アッセイで測定可能である。例えば、高グリコシル化タンパク質の効力は、ＮＦ－κＢ媒介レポーター遺伝子（例えばルシフェラーゼ又はＬｕｃｉａ（商標））の発現を増加させるその能力に基づいて決定が可能である。高グリコシル化タンパク質試料が、参照物質と比較してＮＦ－κＢ媒介レポーター遺伝子発現の用量依存的増加を示す場合、その正体を確認可能である。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法を用いて産生又は精製される高グリコシル化タンパク質を含む組成物は、レポーター細胞アッセイ、例えばＮＦ－κＢレポーター細胞アッセイによって決定して、参照物質の生物活性と比較して５０％～１５０％（例えば、５０％、７５％、１００％、１２５％、又は１５０％）の効力を示す。一態様では、本明細書に記載される方法を用いて産生又は精製された組み換えラブリシンを含む組成物の効力を決定する方法が本明細書で開示され、効力を決定する方法は、ＮＦ－κＢレポーター細胞アッセイを実施することと、組み換えラブリシンを含む組成物の活性（例えばレポーター遺伝子発現によって決定した）を参照標準と比較して測定することと、を含む。いくつかの実施形態では、組み換えラブリシンを含む組成物は、ＮＦ－κＢレポーター細胞アッセイによって決定して、参照物質（例えば、精製された組み換えラブリシンの参照試料）の活性と比較して５０％～１５０％（例えば５０％、７５％、１００％、１２５％、又は１５０％）の活性を示す。

本明細書で説明される組成物の効力は、例えば、細胞表面タンパク質結合アッセイ、例えば、細胞表面受容体クラスター決定因子４４（ＣＤ４４）結合アッセイで測定可能である。例えば、高グリコシル化タンパク質の効力は、ＥＬＩＳＡ及び表面プラズモン共鳴によって測定した、ＣＤ４４への結合に関して競合するその能力に基づいて決定可能である（例えば、Ａｌ－Ｓｈａｒｉｆ ｅｔ ａｌ．，（２０１５）“Ｌｕｂｒｉｃｉｎ／Ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ ４ Ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｏ ＣＤ４４ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ：Ａ Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ Ｌｕｂｒｉｃｉｎ’ｓ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｓｙｎｏｖｉｏｃｙｔｅ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，”Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．６７（６）：１５０３－１３で説明される通り）。高グリコシル化タンパク質試料が、参照物質と比較してＣＤ４４への競合的結合を示す場合、その正体を確認可能である。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法を用いて精製される高グリコシル化タンパク質を含む組成物は、ＣＤ４４結合アッセイによって決定して、参照物質の生物活性と比較して５０％～１５０％（例えば５０％、７５％、１００％、１２５％、又は１５０％）の効力を示す。一態様では、本明細書に記載される方法を用いて精製された組み換えラブリシンを含む組成物の効力を決定する方法が本明細書で開示され、効力を決定する方法は、ＣＤ４４結合アッセイを実施することと、組み換えラブリシンを含む組成物の活性を参照標準と比較して測定することと、を含む。いくつかの実施形態では、組み換えラブリシンを含む組成物は、ＣＤ４４結合アッセイによって決定して、参照物質（例えば、精製された組み換えラブリシンの参照試料）の活性と比較して５０％～１５０％（例えば５０％、７５％、１００％、１２５％、又は１５０％）の活性を示す。

安定性
いくつかの実施形態では、本明細書で説明される本発明は、特定の安定性特性を備えるｒｈラブリシンを含む組成物を産生するのに有効な方法を提供する。具体的には、本明細書に記載される方法は、ｒｈラブリシン組成物を含む安定な組成物を産生するのに有効であり、ここで組成物のｒｈラブリシンのうち約１５％以下が、所与の温度で所与の期間にわたって断片化を経験する。本明細書で使用するとき、「安定なｒｈラブリシンの組成物」又は「安定であるｒｈラブリシンの組成物」は、初期組成物のｒｈラブリシンのうち１５％以下が所与の温度で所与の期間にわたって断片化を経験するｒｈラブリシンを含む組成物を指す。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法は、初期組成物のｒｈラブリシンのうち約５％、６％、７％、８％、９％、９．５％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、又は１５％以下が、所与の温度で所与の期間にわたって断片化を経験する、安定なｒｈラブリシンの組成物を産生するのに有効である。ｒｈラブリシンの断片化は当該技術分野で既知の方法、例えばサイズ排除クロマトグラフィーアッセイ、又は変性条件下還元キャピラリー電気泳動（ｒＣＥ－ＳＤＳ）を用いて測定可能である。

したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法は、約５℃以下で約１ヶ月、約２ヶ月、約３ヶ月、約４ヶ月、約５ヶ月、約６ヶ月、約７ヶ月、約８ヶ月、約９ヶ月、約１０ヶ月、約１１ヶ月、約１２ヶ月、約１３ヶ月、約１４ヶ月、約１５ヶ月、約１６ヶ月、約１７ヶ月、約１８ヶ月、約１９ヶ月、約２０ヶ月、約２１ヶ月、約２２ヶ月、約２３ヶ月、約２４ヶ月、約２５ヶ月、約２６ヶ月、約２７ヶ月、約２８ヶ月、約２９ヶ月、約３０ヶ月、約１２ヶ月～約２４ヶ月、約１４ヶ月～約２４ヶ月、約１６ヶ月～約２４ヶ月、約１８ヶ月～約２４ヶ月、約２０ヶ月～約２４ヶ月、又は約１８ヶ月～約２６ヶ月間安定なｒｈラブリシンの組成物を産生するのに有効である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法は、約２５℃以下で約１日、約３日、約５日、約１週間、約２週間、約３週間、約４週間、約１ヶ月、約２ヶ月、約３ヶ月、約４ヶ月、約５ヶ月、約６ヶ月、約１週間～１ヶ月、約２週間～１ヶ月、約３週間～１ヶ月、又は約１ヶ月～２ヶ月間安定なｒｈラブリシンの組成物を産生するのに有効である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法は、約４０℃以下で約１日、約３日、約５日、約１週間、約２週間、約３週間、約４週間、約１ヶ月、約１週間～１ヶ月、約２週間～１ヶ月、又は約３週間～１ヶ月間安定なｒｈラブリシンの組成物を産生するのに有効である。特定の実施形態では、本明細書に記載される方法は、５℃で２４ヶ月間安定なｒｈラブリシンの組成物を産生するのに有効である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法は、２５℃で１ヶ月間安定なｒｈラブリシンの組成物を産生するのに有効である。いくつかの実施形態では、ｒｈラブリシンの安定な組成物は、約０．１５ｍｇ／ｍｌ、約０．２０ｍｇ／ｍｌ、約０．２５ｍｇ／ｍｌ、約０．３０ｍｇ／ｍｌ、約０．３５ｍｇ／ｍｌ、約０．４０ｍｇ／ｍｌ、約０．４５ｍｇ／ｍｌ、約０．５０ｍｇ／ｍｌ、約０．５５ｍｇ／ｍｌ、約０．６０ｍｇ／ｍｌ、又は約０．１５ｍｇ／ｍｌ～約０．４５ｍｇ／ｍｌの初期濃度を有する。

更に、５℃以下で約１ヶ月、約２ヶ月、約３ヶ月、約４ヶ月、約５ヶ月、約６ヶ月、約７ヶ月、約８ヶ月、約９ヶ月、約１０ヶ月、約１１ヶ月、約１２ヶ月、約１３ヶ月、約１４ヶ月、約１５ヶ月、約１６ヶ月、約１７ヶ月、約１８ヶ月、約１９ヶ月、約２０ヶ月、約２１ヶ月、約２２ヶ月、約２３ヶ月、約２４ヶ月、約２５ヶ月、約２６ヶ月、約２７ヶ月、約２８ヶ月、約２９ヶ月、約３０ヶ月、約１２ヶ月～約２４ヶ月、約１４ヶ月～約２４ヶ月、約１６ヶ月～約２４ヶ月、約１８ヶ月～約２４ヶ月、約２０ヶ月～約２４ヶ月、又は約１８ヶ月～約２６ヶ月間安定な、本明細書に記載される方法を用いて産生されたｒｈラブリシンの安定な組成物が本明細書に記載される。約２５℃以下で約１日、約３日、約５日、約１週間、約２週間、約３週間、約４週間、約１ヶ月、約２ヶ月、約３ヶ月、約４ヶ月、約５ヶ月、約６ヶ月、約１週間～１ヶ月、約２週間～１ヶ月、約３週間～１ヶ月、又は約１ヶ月～２ヶ月間安定な、本明細書に記載される方法を用いて産生されたｒｈラブリシンの組成物も本明細書に記載される。約４０℃以下で約１日、約３日、約５日、約１週間、約２週間、約３週間、約４週間、約１ヶ月、約１週間～１ヶ月、約２週間～１ヶ月、又は約３週間～１ヶ月間安定な、本明細書に記載される方法を用いて産生されたｒｈラブリシンの組成物も本明細書に記載される。特定の実施形態では、５℃で２４ヶ月安定な、本明細書に記載される方法を用いて産生されたｒｈラブリシンの組成物が本明細書に記載される。いくつかの実施形態では、２５℃で１ヶ月安定な、本明細書に記載される方法を用いて産生されたｒｈラブリシンの組成物が本明細書に記載される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法を用いて産生されたｒｈラブリシンの安定な組成物は、約０．１５ｍｇ／ｍｌ、約０．２０ｍｇ／ｍｌ、約０．２５ｍｇ／ｍｌ、約０．３０ｍｇ／ｍｌ、約０．３５ｍｇ／ｍｌ、約０．４０ｍｇ／ｍｌ、約０．４５ｍｇ／ｍｌ、約０．５０ｍｇ／ｍｌ、約０．５５ｍｇ／ｍｌ、約０．６０ｍｇ／ｍｌ、又は約０．１５ｍｇ／ｍｌ～約０．４５ｍｇ／ｍｌの初期濃度を有する。

最終緩衝剤溶液
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるｒｈラブリシン組成物は、例えば全てのｒｈラブリシン精製工程が完了した後に、最終緩衝剤溶液中で配合される。こうした最終緩衝剤溶液は、対象、例えばヒト対象への投与に好適である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるｒｈラブリシン組成物は、リン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、及びポリソルベート（例えばポリソルベート２０）を含む最終緩衝剤溶液中で配合される。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるｒｈラブリシン組成物は、１０ｍＭのリン酸ナトリウム、１４０ｍＭの塩化ナトリウム、及び０．０２％（ｗ／ｖ）のポリソルベート２０を含む最終緩衝剤溶液中で配合される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるｒｈラブリシン組成物は、リン酸ナトリウム（例えば、５ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、５ｍＭ～１０ｍＭ、５ｍＭ～１５ｍＭ、１０ｍＭ～１５ｍＭ、又は１０～２０ｍＭのリン酸ナトリウム）、塩化ナトリウム（例えば、１００ｍＭ、１１０ｍＭ、１２０ｍＭ、１３０ｍＭ、１４０ｍＭ、１５０ｍＭ、１６０ｍＭ、１００ｍＭ～１２０ｍＭ、１２０ｍＭ～１４０ｍＭ、１３０ｍＭ～１５０ｍＭ、又は１４０ｍＭ～１５０ｍＭの塩化ナトリウム）、及び洗剤（例えば、０．０１％、０．０２％、０．０３％、０．０４％、０．０５％、０．１０％、０．０１％～０．１０％、０．０１％～０．０３％、０．０１％～０．０５％、０．０２％～０．０４％、又は０．０２％～０．０５％（ｗ／ｖ）の洗剤、例えばポリソルベート２０）を含む最終緩衝剤溶液中で配合される。いくつかの実施形態では、１０ｍＭのリン酸ナトリウム、１４０ｍＭの塩化ナトリウム、及び０．０２％（ｗ／ｖ）のポリソルベート２０を含む最終緩衝剤溶液中にｒｈラブリシン組成物を溶解する工程を含む方法が本明細書に記載される。

本明細書に記載されるいくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法を用いて精製され、リン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、及びポリソルベート（例えばポリソルベート２０）を含む最終緩衝剤溶液中で配合されたｒｈラブリシンを含むｒｈラブリシン組成物は、約５℃以下で約１ヶ月、約２ヶ月、約３ヶ月、約４ヶ月、約５ヶ月、約６ヶ月、約７ヶ月、約８ヶ月、約９ヶ月、約１０ヶ月、約１１ヶ月、約１２ヶ月、約１３ヶ月、約１４ヶ月、約１５ヶ月、約１６ヶ月、約１７ヶ月、約１８ヶ月、約１９ヶ月、約２０ヶ月、約２１ヶ月、約２２ヶ月、約２３ヶ月、約２４ヶ月、約２５ヶ月、約２６ヶ月、約２７ヶ月、約２８ヶ月、約２９ヶ月、約３０ヶ月、約１２ヶ月～約２４ヶ月、約１４ヶ月～約２４ヶ月、約１６ヶ月～約２４ヶ月、約１８ヶ月～約２４ヶ月、約２０ヶ月～約２４ヶ月、又は約１８ヶ月～約２６ヶ月間安定している。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法を用いて精製され、リン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、及びポリソルベート（例えばポリソルベート２０）を含む最終緩衝剤溶液中で配合されたｒｈラブリシンを含むｒｈラブリシン組成物は、約２５℃以下で約１日、約３日、約５日、約１週間、約２週間、約３週間、約４週間、約１ヶ月、約２ヶ月、約３ヶ月、約４ヶ月、約５ヶ月、約６ヶ月、約１週間～１ヶ月、約２週間～１ヶ月、約３週間～１ヶ月、又は約１ヶ月～２ヶ月間安定している。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法を用いて精製され、リン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、及びポリソルベート（例えばポリソルベート２０）を含む最終緩衝剤溶液中で配合されたｒｈラブリシンを含むｒｈラブリシン組成物は、約４０℃以下で約１日、約３日、約５日、約１週間、約２週間、約３週間、約４週間、約１ヶ月、約１週間～１ヶ月、約２週間～１ヶ月、又は約３週間～１ヶ月間安定している。特定の実施形態では、本明細書に記載される方法を用いて精製され、リン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、及びポリソルベート（例えばポリソルベート２０）を含む最終緩衝剤溶液中で配合されたｒｈラブリシンを含むｒｈラブリシン組成物は、５℃で２４ヶ月安定している。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法を用いて精製され、リン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、及びポリソルベート（例えばポリソルベート２０）を含む最終緩衝剤溶液中で配合されたｒｈラブリシンを含むｒｈラブリシン組成物は、２５℃で１ヶ月安定している。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるｒｈラブリシンの組成物は、約０．１５ｍｇ／ｍｌ、約０．２０ｍｇ／ｍｌ、約０．２５ｍｇ／ｍｌ、約０．３０ｍｇ／ｍｌ、約０．３５ｍｇ／ｍｌ、約０．４０ｍｇ／ｍｌ、約０．４５ｍｇ／ｍｌ、約０．５０ｍｇ／ｍｌ、約０．５５ｍｇ／ｍｌ、約０．６０ｍｇ／ｍｌ、又は約０．１５ｍｇ／ｍｌ～約０．４５ｍｇ／ｍｌの初期濃度を有する。

最終緩衝剤溶液又は高グリコシル化タンパク質を含む最終溶液のｐＨは、例えば米国薬局方＜７９１＞及び欧州薬局方２．２．３のプロトコルに従って測定可能である。いくつかの実施形態では、最終緩衝剤溶液は、約７．０のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、最終緩衝剤溶液は、約６．９のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、最終緩衝剤溶液は、約６．５～約７．５、約６．６～約７．４、約６．７～約７．３、約６．８～約７．２、約６．９～約７．１、又は約６．９～約７．０のｐＨを有する。例えば、いくつかの実施形態では、最終緩衝剤溶液は、約６．５、約６．６、約６．７、約６．８、約６．９、約７．０、約７．１、約７．２、約７．３、約７．４、又は約７．５のｐＨを有する。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるｒｈラブリシン組成物は、フリーズドライされる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるｒｈラブリシン組成物は、好適な温度、例えば－２０℃未満又は－６０℃未満（例えば－８０℃）でフリーズドライ及び貯蔵される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組み換え産生されたグリコシル化ポリペプチド、例えば組み換え産生されたグリコシル化ラブリシンタンパク質を精製する方法は、本明細書に記載される方法を用いて精製される組み換え産生されたグリコシル化ポリペプチド（例えば組み換え産生されたグリコシル化ラブリシンタンパク質）を含む組成物をフリーズドライする工程を含む。したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、組み換え産生されたグリコシル化ポリペプチド、特に組み換え産生されたグリコシル化ラブリシンを精製する方法に関し、方法は、３つの連続的クロマトグラフィー工程：（ａ）多モードカチオン交換クロマトグラフィー（ＭＣＣ）からなる第１のクロマトグラフィー工程、（ｂ）多モードアニオン交換クロマトグラフィー（ＭＡＣ）からなる第２のクロマトグラフィー工程、及び（ｃ）疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）からなる第３のクロマトグラフィー工程を含み、且つ（ｉｉ）組み換え産生されたグリコシル化ポリペプチドをフリーズドライする工程を更に含む。いくつかの実施形態では、方法は、深層濾過工程を更に含む。いくつかの実施形態では、深層濾過工程は、ＨＩＣ工程の前に実施される。いくつかの実施形態では、深層濾過は好適なフィルタ、例えばセルロース又はポリプロピレン繊維ベースのフィルタ、例えば正荷電三層Ｂ１ＨＣフィルタを用いて実施される。

本開示の更なる非限定的な実施形態が以下の実施形態に記載される（本明細書において考察され且つその他の方法で提供されるように、以下の実施形態はラブリシン以外の糖タンパク質（特に少なくとも約２５％以上のグリコシル化を有するタンパク質）にも当てはまる）。

１．組み換えラブリシン糖タンパク質を精製する方法であって、上記のラブリシン糖タンパク質を含む細胞培養収穫物を、任意の順序で実施される、多モードカチオン交換クロマトグラフィー（ＭＣＣ）、多モードアニオン交換クロマトグラフィー（ＭＡＣ）、及び疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）に供する工程を含む、方法。

２．工程が、ａ）ＭＣＣ、ｂ）ＭＡＣ、及びｃ）ＨＩＣの順序で実施される、実施形態１に記載の方法。

３．工程ａ）の前に、培養下の細胞をＭｇＣｌ_２及びエンドヌクレアーゼと接触させ、細胞を収穫して上記の細胞培養収穫物を得ることを更に含む、実施形態２に記載の方法。

４．上記の培養下の細胞は、約１，０００Ｌ、約１，５００Ｌ、約２，０００Ｌ、又は約２，５００Ｌの培養物容積中にある、実施形態３に記載の方法。

５．工程ａ）の前に、細胞培養収穫物をＭｇＣｌ_２及びエンドヌクレアーゼと接触させることを更に含む、実施形態２に記載の方法。

６．細胞培養収穫物は、約１，０００Ｌ、約１，５００Ｌ、約２，０００Ｌ、又は約２，５００Ｌの細胞培養物容積に由来する、実施形態５に記載の方法。

７．エンドヌクレアーゼはＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）エンドヌクレアーゼである、実施形態３又は５に記載の方法。

８．上記のＭｇＣｌ_２及びエンドヌクレアーゼと接触させることの前に、細胞培養収穫物を２～８℃に冷却することを更に含む、実施形態５に記載の方法。

９．多モードアニオン交換クロマトグラフィー（ＭＡＣ）工程の後、且つ疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）工程の前に、ウイルス不活化工程を更に含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。

１０．ウイルス不活化工程は、工程ｂ）で得た溶液のｐＨを約３．４～３．６に調節することを含む、実施形態９に記載の方法。

１１．溶液を少なくとも１時間インキュベートした後、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）工程の前にｐＨを約７．０に調節する、実施形態１０に記載の方法。

１２．疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）工程の前に深層濾過工程を更に含む、実施形態９～１１のいずれか１つに記載の方法。

１３．深層濾過工程は、ウイルス不活化工程の後に続く、実施形態１２に記載の方法。

１４．疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）工程の後にウイルス除去工程を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。

１５．ウイルス除去工程がナノ濾過を含む、実施形態１４に記載の方法。

１６．ウイルス除去工程の後に限外濾過工程を更に含む、実施形態１４又は１５に記載の方法。

１７．ウイルス除去工程の後に第２のウイルス不活化工程を含む、実施形態１４～１６のいずれか１つに記載の方法。

１８．第２のウイルス不活化工程はジメチル尿素溶液を添加することを含む、実施形態１７に記載の方法。

１９．第２のウイルス不活化工程の後に限外濾過工程を含む、実施形態１７又は１８に記載の方法。

２０．１つ以上の限外濾過及び／又はナノ濾過工程を更に含む、実施形態１又は２に記載の方法。

２１．１つ以上のウイルス不活化工程を更に含む、実施形態１又は２に記載の方法。

２２．１つ以上のウイルス除去工程を更に含む、実施形態１又は２に記載の方法。

２３．組み換えラブリシン糖タンパク質は、配列番号１又は２のアミノ酸残基２５～１４０４のアミノ酸配列を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。

２４．組み換えラブリシン糖タンパク質の分子量のうち少なくとも３０％がグリコシド残基由来である、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。

２５．ラブリシン糖タンパク質のＯ－グリコシル化のうち少なくとも９０％がコア１のグリコシル化である、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。

２６．ラブリシン糖タンパク質はＯ－グリカン種を含み、Ｏ－グリカン種は、約７％以上のＧａｌ－ＧａｌＮＡｃ、約８０％以上の２，３－ＮｅｕＡｃコア１、約３％以上の２＊ＮｅｕＡｃコア１、及び約１％以上の２，３－ＮｅｕＧｃコア１を含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。

２７．ラブリシン糖タンパク質は、ラブリシン糖タンパク質１ｍｇあたり約５０μｇ以上のＮＡＮＡを含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。

２８．ラブリシン糖タンパク質は、ラブリシン糖タンパク質１ｍｇあたり約１０μｇ以下のＮＧＮＡを含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。

２９．ラブリシン糖タンパク質は、ラブリシン糖タンパク質１ｍｇあたり約１００μｇ以上のＧａｌを含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。

３０．ラブリシン糖タンパク質は、ラブリシン糖タンパク質１ｍｇあたり約１００μｇ以上のＧａｌＮＡｃを含む、先行実施形態のいずれか１つに記載の方法。

３１．先行実施形態のいずれか１つに記載の方法によって得られる組み換えラブリシン糖タンパク質。

３２．実施形態３１に記載の組み換えラブリシン糖タンパク質、及び薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。

３３．医薬組成物の純度は、逆相クロマトグラフィー（ＲＰＣ）によって決定して９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上である、実施形態３２に記載の医薬組成物。

３４．１％未満の組み換えラブリシン糖タンパク質の凝集体を含む、実施形態３２又は３３に記載の医薬組成物。

３５．１％未満の組み換えラブリシン糖タンパク質の断片を含む、実施形態３２～３４のいずれか１つに記載の医薬組成物。

３６．≦１，０００ｎｇの宿主細胞タンパク質／ｍｇの組み換えラブリシン糖タンパク質（ｎｇ／ｍｇ）、≦９００ｎｇ／ｍｇ、≦８００ｎｇ／ｍｇ、≦７００ｎｇ／ｍｇ、≦６００ｎｇ／ｍｇ、≦５００ｎｇ／ｍｇ、≦４００ｎｇ／ｍｇ、≦３００ｎｇ／ｍｇ、≦２５０ｎｇ／ｍｇ、≦２００ｎｇ／ｍｇ、≦１５０ｎｇ／ｍｇ、又は≦１００ｎｇ／ｍｇを含む、実施形態３２～３５のいずれか１つに記載の医薬組成物。

３７．≦１０，０００ｐｇの宿主細胞ＤＮＡ／ｍｇの組み換えラブリシン糖タンパク質（ｐｇ／ｍｇ）、≦５，０００ｐｇ／ｍｇ、≦１，０００ｐｇ／ｍｇ、≦５００ｐｇ／ｍｇ、≦１００ｐｇ／ｍｇ、≦５０ｐｇ／ｍｇ、≦１０ｐｇ／ｍｇ、又は≦５ｐｇ／ｍｇを含む、実施形態３２～３６のいずれか１つに記載の医薬組成物。

３８．細菌エンドトキシン試験法（ＢＥＴ）によって決定して、８エンドトキシン単位（ＥＵ）／ｍＬ未満、１ＥＵ／ｍＬ未満、０．１ＥＵ／ｍＬ未満、又は０．０１ＥＵ／ｍＬ未満を含む、実施形態３２～３７のいずれか１つに記載の医薬組成物。

３９．１コロニー形成単位（ＣＦＵ）／ｍＬ未満、１ＣＦＵ／２ｍｌ未満、１ＣＦＵ／３ｍｌ未満、１ＣＦＵ／４ｍｌ未満、１ＣＦＵ／５ｍｌ未満、１ＣＦＵ／６ｍｌ未満、１ＣＦＵ／７ｍｌ未満、１ＣＦＵ／８ｍｌ未満、１ＣＦＵ／９ｍｌ未満、又は１ＣＦＵ／１０ｍｌ未満の総好気性微生物数（ＴＡＭＣ）を有する、実施形態３２～３８のいずれか１つに記載の医薬組成物。

４０．１コロニー形成単位（ＣＦＵ）／ｍＬ未満、１ＣＦＵ／２ｍｌ未満、１ＣＦＵ／３ｍｌ未満、１ＣＦＵ／４ｍｌ未満、１ＣＦＵ／５ｍｌ未満、１ＣＦＵ／６ｍｌ未満、１ＣＦＵ／７ｍｌ未満、１ＣＦＵ／８ｍｌ未満、１ＣＦＵ／９ｍｌ未満、又は１ＣＦＵ／１０ｍｌ未満の総真菌数（ＴＹＭＣ）を有する、実施形態３２～３９のいずれか１つに記載の医薬組成物。

４１．組成物は、５℃で少なくとも２４ヶ月間安定している、実施形態３２～４０のいずれか１つに記載の医薬組成物。

４２．組成物は、２５℃で少なくとも１ヶ月間安定している、実施形態３２～４１のいずれか一項に記載の医薬組成物。

４３．組成物は、約０．１５ｍｇの組み換えラブリシン糖タンパク質／ｍｌ（ｍｇ／ｍｌ）、約０．２０ｍｇ／ｍｌ、約０．２５ｍｇ／ｍｌ、約０．３０ｍｇ／ｍｌ、約０．３５ｍｇ／ｍｌ、約０．４０ｍｇ／ｍｌ、約０．４５ｍｇ／ｍｌ、約０．５０ｍｇ／ｍｌ、約０．５５ｍｇ／ｍｌ、約０．６０ｍｇ／ｍｌ、約０．７０ｍｇ／ｍｌ、約０．８ｍｇ／ｍｌ、約０．９ｍｇ／ｍｌ、約１．０ｍｇ／ｍｌ、約１．５ｍｇ／ｍｌ、約１．６ｍｇ／ｍｌ、約１．７ｍｇ／ｍｌ、約１．８ｍｇ／ｍｌ、約１．９ｍｇ／ｍｌ、約２．０ｍｇ／ｍｌ、約２．１ｍｇ／ｍｌ、約２．２ｍｇ／ｍｌ．，約２．３ｍｇ／ｍｌ、約２．４ｍｇ／ｍｌ、約２．５ｍｇ／ｍｌ、約２．６ｍｇ／ｍｌ、約２．７ｍｇ／ｍｌ、約２．８ｍｇ／ｍｌ、約２．９ｍｇ／ｍｌ、約３．０ｍｇ／ｍｌ、約３．５ｍｇ／ｍｌ、約４．０ｍｇ／ｍｌ、約０．１５ｍｇ／ｍｌ～約３．０ｍｇ／ｍｌ、約０．４５ｍｇ／ｍｌ～約３．０ｍｇ／ｍｌ、約０．１５ｍｇ／ｍｌ～約０．４５ｍｇ／ｍｌ、約１．５ｍｇ／ｍｌ～約３．０ｍｇ／ｍｌ、約１．５ｍｇ／ｍｌ～約３．５ｍｇ／ｍｌ、約２．０ｍｇ／ｍｌ～約３．０ｍｇ／ｍｌ、約１．５ｍｇ／ｍｌ～約２．５ｍｇ／ｍｌ、又は約２．０ｍｇ／ｍｌ～約４．０ｍｇ／ｍｌの初期濃度を有する、実施形態３２～４２のいずれか１つに記載の医薬組成物。

４４．実施形態３２～４３のいずれか１つに記載の医薬組成物を患者に投与する工程を含む、眼表面障害を治療するための方法。

４５．眼表面障害はドライアイ疾患である、実施形態４４に記載の方法。

４６．
ａ）組み換えラブリシン糖タンパク質を産生するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞クローンを生成する工程と、
ｂ）好適な条件下でＣＨＯ宿主細胞を栽培し、それにより組み換えラブリシン糖タンパク質を含有する細胞培養物を得る工程と、
ｃ）実施形態１～３０のいずれか１つに記載の方法に従って、細胞培養物から組み換えラブリシン糖タンパク質を精製する工程と、を含む、組み換えラブリシン糖タンパク質を産生する方法。

４７．
ａ）ラブリシン糖タンパク質をコードする核酸分子を含む哺乳動物宿主細胞を好適な条件下で栽培する工程と、
ｂ）実施形態１～３０のいずれか１つに記載の方法に従って、細胞培養物から組み換えラブリシン糖タンパク質を精製する工程と、を含む、組み換えラブリシン糖タンパク質を産生する方法。

４８．哺乳動物宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、実施形態４７に記載の方法。

４９．ＣＨＯ細胞はＣＨＯ－Ｍ細胞である、実施形態４８に記載の方法。

５０．精製された組み換えヒトラブリシン糖タンパク質を産生するプロセスであって、
ｉ）組み換えヒトラブリシン（ｒｈラブリシン）を液体培地内に産生することが可能な哺乳動物細胞を培養する工程と、
ｉｉ）多モードカチオン交換クロマトグラフィー（ＭＣＣ）、多モードアニオン交換クロマトグラフィー（ＭＡＣ）、及び／又は疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）のうち１つ以上の工程を含む精製プロセスによってｒｈラブリシンを濃縮、精製、及び配合する工程と、を含み、
産生されるｒｈラブリシンが、（ａ）配列番号１又は２のアミノ酸配列のアミノ酸２５～１４０４と、（ｂ）完全長且つ天然のラブリシンと実質的に同じ活性を有する、配列番号１の配列のアミノ酸２５～１４０４と少なくとも７５パーセント同一なアミノ酸配列を有するｒｈラブリシンの機能的に同等の変異体と、（ｃ）配列番号３のグリコシル化反復を含む機能的に同等のラブリシン断片と、からなる群から選択される、プロセス。

５１．エンドヌクレアーゼを液体培地に添加し、その後液体培地を多モードカチオン交換クロマトグラフィー（ＭＣＣ）に適用することを含む、実施形態５０に記載のプロセス。

５２．ＭＣＣ、ＭＡＣ、及びＨＩＣ工程が連続的である、実施形態５０又は５１に記載のプロセス。

５３．ＭＣＣクロマトグラフィー工程後のｒｈラブリシンの回収率が約４５～７５％である、実施形態５０～５２のいずれか１つに記載のプロセス。

５４．ＭＡＣクロマトグラフィー工程後のｒｈラブリシンの回収率が約８０～９０％である、実施形態５２に記載のプロセス。

５５．ＨＩＣクロマトグラフィー工程後のｒｈラブリシンの回収率が約９３～１００％である、実施形態５２に記載のプロセス。

５６．少なくとも１つのウイルス不活化工程を含む、実施形態５０～５５のいずれか１つに記載のプロセス。

５７．少なくとも１つのウイルス不活化工程が、クロマトグラフィー工程からの溶出液のｐＨを約３．４～３．６のｐＨに調節することを含む、実施形態５６に記載のプロセス。

５８．少なくとも１つのウイルス不活化工程が、クロマトグラフィー工程からの溶出液をジメチル尿素と共にインキュベートすることを含む、実施形態５６に記載のプロセス。

５９．２つのウイルス不活化工程を含む、実施形態５０～５８のいずれか１つに記載のプロセス。

６０．少なくとも１つのウイルス不活化工程が、クロマトグラフィー工程からの溶出液のｐＨをｐＨ３．５に調節することを含み、第２のウイルス不活化工程が、別個のクロマトグラフィー工程からの溶出液をジメチル尿素と共にインキュベートすることを含む、実施形態５６に記載のプロセス。

６１．第１のウイルス不活化工程の前のクロマトグラフィー工程がＭＡＣである、実施形態６０に記載のプロセス。

６２．第２のウイルス不活化工程の前のクロマトグラフィー工程がＨＩＣである、実施形態６０又は６１に記載のプロセス。

６３．疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）工程の前に深層濾過工程を含む、実施形態５０～５８のいずれか１つに記載のプロセス。

６４．深層濾過工程は、少なくとも１つのウイルス不活化工程の後に続く、実施形態６３に記載のプロセス。

６５．ＨＩＣ工程からの溶液をナノ濾過に供することを含む、実施形態５０～６４のいずれか１つに記載のプロセス。

６６．ナノ濾過がウイルス不活化の前に行われる、実施形態６５に記載のプロセス。

６７．クロマトグラフィー工程からの溶液を限外濾過及びコンパウンディングに供することを含む、実施形態５０～６４のいずれか１つに記載のプロセス。

６８．第１のウイルス不活化工程後のｒｈラブリシンの回収率が約９０～９９％である、実施形態５６～６７のいずれか１つに記載のプロセス。

６９．第２のウイルス不活化工程後のｒｈラブリシンの回収率が約９５～９９％である、実施形態５６～６８のいずれか１つに記載のプロセス。

７０．限外濾過及びコンパウンディング工程後のｒｈラブリシンの回収率が約９２～９５％である、実施形態６７～６９のいずれか１つに記載のプロセス。

７１．工程ｉ）が、哺乳動物細胞をエンドヌクレアーゼで処理することを更に含む、実施形態５０～７０のいずれか１つに記載のプロセス。

７２．工程ｉｉ）が、
ＩＩ）ｒｈラブリシンを含有する上清を平衡化したクロマトグラフィーカラムに導入し、ｒｈラブリシンを含有する１つ以上の画分を溶液内に溶出する工程と、
ＩＩＩ）工程ＩＩからのｒｈラブリシン含有溶液を１回又は２回以上の連続工程でポリッシュする工程であって、各工程が、調製物を平衡化したクロマトグラフィーカラム上に投入することと、ｒｈラブリシンを含有する１つ以上の画分を溶出することと、を含む、工程と、
ＩＶ）工程ＩＩＩからのｒｈラブリシン含有溶液をウイルス不活化に供する工程と、
Ｖ）工程ＩＶからのｒｈラブリシン含有溶液を１回又は２回以上の連続工程でポリッシュする工程であって、各工程が、調製物を平衡化したクロマトグラフィーカラム上に投入することと、ｒｈラブリシンを含有する１つ以上の画分を溶出することと、を含む、工程と、
ＶＩ）工程Ｖからの画分をウイルス低減フィルタに通す工程、及び／又は上記の画分中のウイルスをウイルス不活化薬で不活化する工程と、
ＶＩＩ）好適な配合物緩衝剤中のｒｈラブリシンの調製物を得るために、工程ＶＩからの画分を配合する工程と、を含む、実施形態５０～７０のいずれか１つに記載のプロセス。

７３．ｒｈラブリシン含有上清をエンドヌクレアーゼで処理する一次工程Ｉを更に含む、実施形態７２に記載のプロセス。

７４．精製プロセスの工程ＩＩで用いられるクロマトグラフィーカラムがカチオン交換カラムである、実施形態７２又は７３のいずれか１つに記載のプロセス。

７５．上記のアニオン交換カラムが多モードカチオン交換クロマトグラフィー（ＭＣＣ）カラムである、実施形態７４に記載のプロセス。

７６．精製プロセスの工程ＩＩＩで用いられるクロマトグラフィーカラムがアニオン交換カラムである、実施形態７２～７５のいずれか１つに記載のプロセス。

７７．クロマトグラフィーカラムが多モードアニオン交換クロマトグラフィー（ＭＡＣ）カラムである、実施形態７６に記載のプロセス。

７８．精製プロセスの工程Ｖで用いられるクロマトグラフィーカラムが疎水性相互作用カラムである、実施形態７２～７７のいずれか１つに記載のプロセス。

７９．精製プロセスの工程ＶＩで実施される試料の濾過が、試料を洗剤に接触させることと置き換えられるか、又はそれと組み合わせられる、実施形態７２～７８のいずれか１つに記載のプロセス。

８０．精製プロセスの工程ＶＩで実施される試料の濾過が、試料をジメチル尿素に接触させることと置き換えられるか、又はそれと組み合わせられる、実施形態７２～７８のいずれか１つに記載のプロセス。

８１．ウイルス不活化薬が洗剤又はジメチル尿素である、実施形態７２～８０のいずれか１つに記載のプロセス。

８２．ｒｈラブリシンの配合調製物を好適な容器に充填し、試料をフリーズドライする工程ＶＩＩＩ）を更に含む、実施形態７２～８１のいずれか１つに記載のプロセス。

８３．工程ＶＩからの画分を限外濾過／透析濾過に供する工程を更に含む、実施形態７２～８１のいずれか１つに記載のプロセス。

８４．ｒｈラブリシンの配合調製物を好適な容器に充填し、試料をフリーズドライする工程ＶＩＩＩ）を更に含む、実施形態８３に記載のプロセス。

８５．ｒｈラブリシンの分子量のうち少なくとも３０％がグリコシド残基由来である、実施形態５０～８４のいずれか１つに記載のプロセス。

８６．ｒｈラブリシンのＯ－グリコシル化のうち少なくとも９０％がコア１のグリコシル化である、実施形態５０～８５のいずれか１つに記載のプロセス。

８７．ｒｈラブリシンはＯ－グリカン種を含み、Ｏ－グリカン種は、約７％以上のＧａｌ－ＧａｌＮＡｃ、約８０％以上の２，３－ＮｅｕＡｃコア１、約３％以上の２＊ＮｅｕＡｃコア１、及び約１％以上の２，３－ＮｅｕＧｃコア１を含む、実施形態５０～８６のいずれか１つに記載のプロセス。

８８．ｒｈラブリシンは、ラブリシン糖タンパク質１ｍｇあたり約５０μｇ以上のＮＡＮＡを含む、実施形態５０～８７のいずれか１つに記載のプロセス。

８９．ｒｈラブリシンは、ラブリシン糖タンパク質１ｍｇあたり約５約１０μｇ以下のＮＧＮＡを含む、実施形態５０～８８のいずれか１つに記載のプロセス。

９０．ｒｈラブリシンは、ラブリシン糖タンパク質１ｍｇあたり約１００μｇ以上のＧａｌを含む、実施形態５０～８９のいずれか１つに記載のプロセス。

９１．ｒｈラブリシンは、ラブリシン糖タンパク質１ｍｇあたり約１００μｇ以上のＧａｌＮＡｃを含む、実施形態５０～９０のいずれか１つに記載のプロセス。

９２．上記のｒｈラブリシンは、薬学的に許容される担体と組み合わせられる、実施形態５０～８４のいずれか１つに記載のプロセス。

９３．実施形態５０～９２のいずれか１つのプロセスに従って精製されたｒｈラブリシンを含む組成物。

９４．組成物の純度は、逆相クロマトグラフィー（ＲＰＣ）によって決定して９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上である、実施形態９３に記載の組成物。

９５．１％未満のｒｈラブリシンの凝集体を含む、実施形態９３又は９４に記載の組成物。

９６．１％未満のｒｈラブリシンの断片を含む、実施形態９３～９５のいずれか１つに記載の組成物。

９７．≦１，０００ｎｇの宿主細胞タンパク質／ｍｇのｒｈラブリシン（ｎｇ／ｍｇ）、≦９００ｎｇ／ｍｇ、≦８００ｎｇ／ｍｇ、≦７００ｎｇ／ｍｇ、≦６００ｎｇ／ｍｇ、≦５００ｎｇ／ｍｇ、≦４００ｎｇ／ｍｇ、≦３００ｎｇ／ｍｇ、≦２５０ｎｇ／ｍｇ、≦２００ｎｇ／ｍｇ、≦１５０ｎｇ／ｍｇ、又は≦１００ｎｇ／ｍｇを含む、実施形態９３～９６のいずれか１つに記載の組成物。

９８．≦１０，０００ｐｇの宿主細胞ＤＮＡ／ｍｇのｒｈラブリシン（ｐｇ／ｍｇ）、≦５，０００ｐｇ／ｍｇ、≦１，０００ｐｇ／ｍｇ、≦５００ｐｇ／ｍｇ、≦１００ｐｇ／ｍｇ、≦５０ｐｇ／ｍｇ、≦１０ｐｇ／ｍｇ、又は≦５ｐｇ／ｍｇを含む、実施形態９３～９７のいずれか１つに記載の組成物。

９９．細菌エンドトキシン試験法（ＢＥＴ）によって決定して、８エンドトキシン単位（ＥＵ）／ｍＬ未満、１ＥＵ／ｍＬ未満、０．１ＥＵ／ｍＬ未満、又は０．０１ＥＵ／ｍＬ未満を含む、実施形態９３～９８のいずれか１つに記載の組成物。

１００．１コロニー形成単位（ＣＦＵ）／ｍＬ未満、１ＣＦＵ／２ｍｌ未満、１ＣＦＵ／３ｍｌ未満、１ＣＦＵ／４ｍｌ未満、１ＣＦＵ／５ｍｌ未満、１ＣＦＵ／６ｍｌ未満、１ＣＦＵ／７ｍｌ未満、１ＣＦＵ／８ｍｌ未満、１ＣＦＵ／９ｍｌ未満、又は１ＣＦＵ／１０ｍｌ未満の総好気性微生物数（ＴＡＭＣ）を有する、実施形態９３～９９のいずれか１つに記載の組成物。

１０１．１コロニー形成単位（ＣＦＵ）／ｍＬ未満、１ＣＦＵ／２ｍｌ未満、１ＣＦＵ／３ｍｌ未満、１ＣＦＵ／４ｍｌ未満、１ＣＦＵ／５ｍｌ未満、１ＣＦＵ／６ｍｌ未満、１ＣＦＵ／７ｍｌ未満、１ＣＦＵ／８ｍｌ未満、１ＣＦＵ／９ｍｌ未満、又は１ＣＦＵ／１０ｍｌ未満の総真菌数（ＴＹＭＣ）を有する、実施形態９３～１００のいずれか１つに記載の組成物。

１０２．組成物は、５℃で少なくとも２４ヶ月間安定している、実施形態９３～１０１のいずれか１つに記載の組成物。

１０３．組成物は、２５℃で少なくとも１ヶ月間安定している、実施形態９３～１０２のいずれか１つに記載の組成物。

１０４．組成物は、約０．１５ｍｇの組み換えラブリシン糖タンパク質／ｍｌ（ｍｇ／ｍｌ）、約０．２０ｍｇ／ｍｌ、約０．２５ｍｇ／ｍｌ、約０．３０ｍｇ／ｍｌ、約０．３５ｍｇ／ｍｌ、約０．４０ｍｇ／ｍｌ、約０．４５ｍｇ／ｍｌ、約０．５０ｍｇ／ｍｌ、約０．５５ｍｇ／ｍｌ、約０．６０ｍｇ／ｍｌ、約０．７０ｍｇ／ｍｌ、約０．８ｍｇ／ｍｌ、約０．９ｍｇ／ｍｌ、約１．０ｍｇ／ｍｌ、約１．５ｍｇ／ｍｌ、約１．６ｍｇ／ｍｌ、約１．７ｍｇ／ｍｌ、約１．８ｍｇ／ｍｌ、約１．９ｍｇ／ｍｌ、約２．０ｍｇ／ｍｌ、約２．１ｍｇ／ｍｌ、約２．２ｍｇ／ｍｌ．，約２．３ｍｇ／ｍｌ、約２．４ｍｇ／ｍｌ、約２．５ｍｇ／ｍｌ、約２．６ｍｇ／ｍｌ、約２．７ｍｇ／ｍｌ、約２．８ｍｇ／ｍｌ、約２．９ｍｇ／ｍｌ、約３．０ｍｇ／ｍｌ、約３．５ｍｇ／ｍｌ、約４．０ｍｇ／ｍｌ、約０．１５ｍｇ／ｍｌ～約３．０ｍｇ／ｍｌ、約０．４５ｍｇ／ｍｌ～約３．０ｍｇ／ｍｌ、約０．１５ｍｇ／ｍｌ～約０．４５ｍｇ／ｍｌ、約１．５ｍｇ／ｍｌ～約３．０ｍｇ／ｍｌ、約１．５ｍｇ／ｍｌ～約３．５ｍｇ／ｍｌ、約２．０ｍｇ／ｍｌ～約３．０ｍｇ／ｍｌ、約１．５ｍｇ／ｍｌ～約２．５ｍｇ／ｍｌ、又は約２．０ｍｇ／ｍｌ～約４．０ｍｇ／ｍｌの初期濃度を有する、実施形態９３～１０３のいずれか１つに記載の組成物。

１０５．組み換えラブリシン糖タンパク質及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物であって、
組成物の純度は、逆相クロマトグラフィー（ＲＰＣ）によって決定して９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上であり、
組成物は１％未満の組み換えラブリシン糖タンパク質の凝集体を含み、
組成物は１％未満の組み換えラブリシン糖タンパク質の断片を含み、
組成物は、≦１，０００ｎｇの宿主細胞タンパク質／ｍｇの組み換えラブリシン糖タンパク質（ｎｇ／ｍｇ）、≦９００ｎｇ／ｍｇ、≦８００ｎｇ／ｍｇ、≦７００ｎｇ／ｍｇ、≦６００ｎｇ／ｍｇ、≦５００ｎｇ／ｍｇ、≦４００ｎｇ／ｍｇ、≦３００ｎｇ／ｍｇ、≦２５０ｎｇ／ｍｇ、≦２００ｎｇ／ｍｇ、≦１５０ｎｇ／ｍｇ、又は≦１００ｎｇ／ｍｇを含み、
組成物は、≦１０，０００ｐｇの宿主細胞ＤＮＡ／ｍｇの組み換えラブリシン糖タンパク質（ｐｇ／ｍｇ）、≦５，０００ｐｇ／ｍｇ、≦１，０００ｐｇ／ｍｇ、≦５００ｐｇ／ｍｇ、≦１００ｐｇ／ｍｇ、≦５０ｐｇ／ｍｇ、≦１０ｐｇ／ｍｇ、又は≦５ｐｇ／ｍｇを含み、
組成物は、細菌エンドトキシン試験法（ＢＥＴ）によって決定して、８エンドトキシン単位（ＥＵ）／ｍＬ未満、１ＥＵ／ｍＬ未満、０．１ＥＵ／ｍＬ未満、又は０．０１ＥＵ／ｍＬ未満を含み、
組成物は、１コロニー形成単位（ＣＦＵ）／ｍＬ未満、１ＣＦＵ／２ｍｌ未満、１ＣＦＵ／３ｍｌ未満、１ＣＦＵ／４ｍｌ未満、１ＣＦＵ／５ｍｌ未満、１ＣＦＵ／６ｍｌ未満、１ＣＦＵ／７ｍｌ未満、１ＣＦＵ／８ｍｌ未満、１ＣＦＵ／９ｍｌ未満、又は１ＣＦＵ／１０ｍｌ未満の総好気性微生物数（ＴＡＭＣ）を有し、且つ／或いは
組成物は、１コロニー形成単位（ＣＦＵ）／ｍＬ未満、１ＣＦＵ／２ｍｌ未満、１ＣＦＵ／３ｍｌ未満、１ＣＦＵ／４ｍｌ未満、１ＣＦＵ／５ｍｌ未満、１ＣＦＵ／６ｍｌ未満、１ＣＦＵ／７ｍｌ未満、１ＣＦＵ／８ｍｌ未満、１ＣＦＵ／９ｍｌ未満、又は１ＣＦＵ／１０ｍｌ未満の総真菌数（ＴＹＭＣ）を有する、医薬組成物。

１０６．組成物は、５℃で少なくとも２４ヶ月間安定している、実施形態１０５に記載の医薬組成物。

１０７．組成物は、２５℃で少なくとも１ヶ月間安定している、実施形態１０５に記載の医薬組成物。

１０８．組成物は、約０．１５ｍｇの組み換えラブリシン糖タンパク質／ｍｌ（ｍｇ／ｍｌ）、約０．２０ｍｇ／ｍｌ、約０．２５ｍｇ／ｍｌ、約０．３０ｍｇ／ｍｌ、約０．３５ｍｇ／ｍｌ、約０．４０ｍｇ／ｍｌ、約０．４５ｍｇ／ｍｌ、約０．５０ｍｇ／ｍｌ、約０．５５ｍｇ／ｍｌ、約０．６０ｍｇ／ｍｌ、約０．７０ｍｇ／ｍｌ、約０．８ｍｇ／ｍｌ、約０．９ｍｇ／ｍｌ、約１．０ｍｇ／ｍｌ、約１．５ｍｇ／ｍｌ、約１．６ｍｇ／ｍｌ、約１．７ｍｇ／ｍｌ、約１．８ｍｇ／ｍｌ、約１．９ｍｇ／ｍｌ、約２．０ｍｇ／ｍｌ、約２．１ｍｇ／ｍｌ、約２．２ｍｇ／ｍｌ．， 約２．３ｍｇ／ｍｌ、約２．４ｍｇ／ｍｌ、約２．５ｍｇ／ｍｌ、約２．６ｍｇ／ｍｌ、約２．７ｍｇ／ｍｌ、約２．８ｍｇ／ｍｌ、約２．９ｍｇ／ｍｌ、約３．０ｍｇ／ｍｌ、約３．５ｍｇ／ｍｌ、約４．０ｍｇ／ｍｌ、約０．１５ｍｇ／ｍｌ～約３．０ｍｇ／ｍｌ、約０．４５ｍｇ／ｍｌ～約３．０ｍｇ／ｍｌ、約０．１５ｍｇ／ｍｌ～約０．４５ｍｇ／ｍｌ、約１．５ｍｇ／ｍｌ～約３．０ｍｇ／ｍｌ、約１．５ｍｇ／ｍｌ～約３．５ｍｇ／ｍｌ、約２．０ｍｇ／ｍｌ～約３．０ｍｇ／ｍｌ、約１．５ｍｇ／ｍｌ～約２．５ｍｇ／ｍｌ、又は約２．０ｍｇ／ｍｌ～約４．０ｍｇ／ｍｌの初期濃度を有する、実施形態１０５～１０７のいずれか１つに記載の医薬組成物。

１０９．組み換えラブリシン糖タンパク質の分子量のうち少なくとも３０％がグリコシド残基由来である、実施形態１０５～１０８のいずれか１つに記載の医薬組成物。

１１０．組み換えラブリシン糖タンパク質のＯ－グリコシル化のうち少なくとも９０％がコア１のグリコシル化である、実施形態１０５～１０９のいずれか１つに記載の医薬組成物。

１１１．組み換えラブリシン糖タンパク質はＯ－グリカン種を含み、Ｏ－グリカン種は、約７％以上のＧａｌ－ＧａｌＮＡｃ、約８０％以上の２，３－ＮｅｕＡｃコア１、約３％以上の２＊ＮｅｕＡｃコア１、及び約１％以上の２，３－ＮｅｕＧｃコア１を含む、実施形態１０５～１１０のいずれか１つに記載の医薬組成物。

１１２．組み換えラブリシン糖タンパク質は、ラブリシン糖タンパク質１ｍｇあたり約５０μｇ以上のＮＡＮＡを含む、実施形態１０５～１１１のいずれか１つに記載の医薬組成物。

１１３．組み換えラブリシン糖タンパク質は、ラブリシン糖タンパク質１ｍｇあたり約１０μｇ以下のＮＧＮＡを含む、実施形態１０５～１１２のいずれか１つに記載の医薬組成物。

１１４．組み換えラブリシン糖タンパク質は、ラブリシン糖タンパク質１ｍｇあたり約１００μｇ以上のＧａｌを含む、実施形態１０５～１１３のいずれか１つに記載の医薬組成物。

１１５．組み換えラブリシン糖タンパク質は、ラブリシン糖タンパク質１ｍｇあたり約１００μｇ以上のＧａｌＮＡｃを含む、実施形態１０５～１１４のいずれか１つに記載の医薬組成物。

１１６．組み換えラブリシン糖タンパク質は、（ａ）配列番号１若しくは２のアミノ酸配列のアミノ酸２５～１４０４、（ｂ）完全長且つ天然のラブリシンと実質的に同じ活性を有する、配列番号１の配列のアミノ酸２５～１４０４と少なくとも７５パーセント同一なアミノ酸配列を有する組み換えラブリシン糖タンパク質の機能的に同等の変異体、及び（ｃ）配列番号３のグリコシル化反復を含む機能的に同等のラブリシン断片、又はこれらの混合物からなる群から選択される、実施形態１０５～１１５のいずれか１つに記載の医薬組成物。

１１７．組み換えラブリシン糖タンパク質は、実施形態１～２０のいずれか１つに記載の方法に従って精製される、実施形態１０５～１１６のいずれか１つに記載の医薬組成物。

１１８．組み換えラブリシン糖タンパク質は、実施形態４６～４９のいずれか１つに記載の方法に従って産生される、実施形態１０５～１１６のいずれか１つに記載の医薬組成物。

１１９．組み換えラブリシン糖タンパク質は、実施形態５０～８４又は９２のいずれか１つに記載のプロセスに従って産生される、実施形態１０５～１１６のいずれか１つに記載の医薬組成物。

１２０．実施形態１０５～１１９のいずれか１つに記載の医薬組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、眼表面疾患を治療する方法。

１２１．疾患はドライアイ疾患である、実施形態１２０に記載の方法。

１２２．組み換えラブリシン糖タンパク質を産生する方法であって、上記のラブリシン糖タンパク質を含む細胞培養収穫物を、任意の順序で実施される、多モードカチオン交換クロマトグラフィー（ＭＣＣ）、多モードアニオン交換クロマトグラフィー（ＭＡＣ）、及び疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）に供する工程を含む、方法。

１２３．工程が、ａ）ＭＣＣ、ｂ）ＭＡＣ、及びｃ）ＨＩＣの順序で実施される、実施形態１２２に記載の方法。

１２４．工程ａ）の前に、培養下の細胞をＭｇＣｌ_２及びエンドヌクレアーゼと接触させ、細胞を収穫して上記の細胞培養収穫物を得ることを更に含む、実施形態１２３に記載の方法。

１２５．上記の培養下の細胞は、約１，０００Ｌ、約１，５００Ｌ、約２，０００Ｌ、又は約２，５００Ｌの培養物容積中にある、実施形態１２４に記載の方法。

１２６．工程ａ）の前に、細胞培養収穫物がＭｇＣｌ_２及びエンドヌクレアーゼと接触する、実施形態１２３に記載の方法。

１２７．細胞培養収穫物は、約１，０００Ｌ、約１，５００Ｌ、約２，０００Ｌ、又は約２，５００Ｌの細胞培養物容積に由来する、実施形態１２６に記載の方法。

１２８．エンドヌクレアーゼはＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）エンドヌクレアーゼである、実施形態１２４又は１２６に記載の方法。

１２９．細胞培養収穫物は、ＭｇＣｌ_２及びエンドヌクレアーゼと接触する前に２～８℃に冷却される、実施形態１２６に記載の方法。

１３０．多モードアニオン交換クロマトグラフィー（ＭＡＣ）工程の後、且つ疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）工程の前に、ウイルス不活化工程を更に含む、実施形態１２２～１２９のいずれか１つに記載の方法。

１３１．ウイルス不活化工程は、工程ｂ）で得た溶液のｐＨを約３．４～３．６に調節することを含む、実施形態１３０に記載の方法。

１３２．溶液を少なくとも１時間インキュベートした後、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）工程の前にｐＨが約７．０に調節されている、実施形態１３１に記載の方法。

１３３．疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）工程の前に深層濾過工程を更に含む、実施形態１３０～１３２のいずれか１つに記載の方法。

１３４．深層濾過工程は、ウイルス不活化工程の後に続く、実施形態１３３に記載の方法。

１３５．疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）工程の後にウイルス除去工程を含む、実施形態１２２～１３４のいずれか１つに記載の方法。

１３６．ウイルス除去工程がナノ濾過を含む、実施形態１３５に記載の方法。

１３７．ウイルス除去工程の後に限外濾過工程を更に含む、実施形態１３５又は１３６に記載の方法。

１３８．ウイルス除去工程の後に第２のウイルス不活化工程を含む、実施形態１３５～１３７のいずれか１つに記載の方法。

１３９．第２のウイルス不活化工程はジメチル尿素溶液を添加することを含む、実施形態１３８に記載の方法。

１４０．第２のウイルス不活化工程の後に限外濾過工程を含む、実施形態１３８又は１３９に記載の方法。

１４１．１つ以上の限外濾過及び／又はナノ濾過工程を更に含む、実施形態１２２又は１２３に記載の方法。

１４２．１つ以上のウイルス不活化工程を更に含む、実施形態１２２又は１２３に記載の方法。

１４３．１つ以上のウイルス除去工程を更に含む、実施形態１２２又は１２３に記載の方法。

１４４．組み換えラブリシン糖タンパク質は、配列番号１又は２のアミノ酸残基２５～１４０４のアミノ酸配列を含む、実施形態１２２～１４３のいずれか１つに記載の方法。

１４５．組み換えラブリシン糖タンパク質の分子量のうち少なくとも３０％がグリコシド残基由来である、実施形態１２２～１４４のいずれか１つに記載の方法。

１４６．ラブリシン糖タンパク質のＯ－グリコシル化のうち少なくとも９０％がコア１のグリコシル化である、実施形態１２２～１４５のいずれか１つに記載の方法。

１４７．ラブリシン糖タンパク質はＯ－グリカン種を含み、Ｏ－グリカン種は、約７％以上のＧａｌ－ＧａｌＮＡｃ、約８０％以上の２，３－ＮｅｕＡｃコア１、約３％以上の２＊ＮｅｕＡｃコア１、及び約１％以上の２，３－ＮｅｕＧｃコア１を含む、実施形態１２２～１４６のいずれか１つに記載の方法。

１４８．ラブリシン糖タンパク質は、ラブリシン糖タンパク質１ｍｇあたり約５０μｇ以上のＮＡＮＡを含む、実施形態１２２～１４７のいずれか１つに記載の方法。

１４９．ラブリシン糖タンパク質は、ラブリシン糖タンパク質１ｍｇあたり約１０μｇ以下のＮＧＮＡを含む、実施形態１２２～１４８のいずれか１つに記載の方法。

１５０．ラブリシン糖タンパク質は、ラブリシン糖タンパク質１ｍｇあたり約１００μｇ以上のＧａｌを含む、実施形態１２２～１４９のいずれか１つに記載の方法。

１５１．ラブリシン糖タンパク質は、ラブリシン糖タンパク質１ｍｇあたり約１００μｇ以上のＧａｌＮＡｃを含む、実施形態１２２～１５０のいずれか１つに記載の方法。

１５２．実施形態１２２～１５１のいずれか１つに記載の方法によって得られる組み換えラブリシン糖タンパク質。

１５３．実施形態１５２に記載の組み換えラブリシン糖タンパク質、及び薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。

１５４．医薬組成物の純度は、逆相クロマトグラフィー（ＲＰＣ）によって決定して９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上である、実施形態１５３に記載の医薬組成物。

１５５．１％未満の組み換えラブリシン糖タンパク質の凝集体を含む、実施形態１５３又は１５４に記載の医薬組成物。

１５６．１％未満の組み換えラブリシン糖タンパク質の断片を含む、実施形態１５３～１５５のいずれか１つに記載の医薬組成物。

１５７．≦１，０００ｎｇの宿主細胞タンパク質／ｍｇの組み換えラブリシン糖タンパク質（ｎｇ／ｍｇ）、≦９００ｎｇ／ｍｇ、≦８００ｎｇ／ｍｇ、≦７００ｎｇ／ｍｇ、≦６００ｎｇ／ｍｇ、≦５００ｎｇ／ｍｇ、≦４００ｎｇ／ｍｇ、≦３００ｎｇ／ｍｇ、≦２５０ｎｇ／ｍｇ、≦２００ｎｇ／ｍｇ、≦１５０ｎｇ／ｍｇ、又は≦１００ｎｇ／ｍｇを含む、実施形態１５３～１５６のいずれか１つに記載の医薬組成物。

１５８．≦１０，０００ｐｇの宿主細胞ＤＮＡ／ｍｇの組み換えラブリシン糖タンパク質（ｐｇ／ｍｇ）、≦５，０００ｐｇ／ｍｇ、≦１，０００ｐｇ／ｍｇ、≦５００ｐｇ／ｍｇ、≦１００ｐｇ／ｍｇ、≦５０ｐｇ／ｍｇ、≦１０ｐｇ／ｍｇ、又は≦５ｐｇ／ｍｇを含む、実施形態１５３～１５７のいずれか１つに記載の医薬組成物。

１５９．細菌エンドトキシン試験法（ＢＥＴ）によって決定して、８エンドトキシン単位（ＥＵ）／ｍＬ未満、１ＥＵ／ｍＬ未満、０．１ＥＵ／ｍＬ未満、又は０．０１ＥＵ／ｍＬ未満を含む、実施形態１５３～１５８のいずれか１つに記載の医薬組成物。

１６０．１コロニー形成単位（ＣＦＵ）／ｍＬ未満、１ＣＦＵ／２ｍｌ未満、１ＣＦＵ／３ｍｌ未満、１ＣＦＵ／４ｍｌ未満、１ＣＦＵ／５ｍｌ未満、１ＣＦＵ／６ｍｌ未満、１ＣＦＵ／７ｍｌ未満、１ＣＦＵ／８ｍｌ未満、１ＣＦＵ／９ｍｌ未満、又は１ＣＦＵ／１０ｍｌ未満の総好気性微生物数（ＴＡＭＣ）を有する、実施形態１５３～１５９のいずれか１つに記載の医薬組成物。

１６１．１コロニー形成単位（ＣＦＵ）／ｍＬ未満、１ＣＦＵ／２ｍｌ未満、１ＣＦＵ／３ｍｌ未満、１ＣＦＵ／４ｍｌ未満、１ＣＦＵ／５ｍｌ未満、１ＣＦＵ／６ｍｌ未満、１ＣＦＵ／７ｍｌ未満、１ＣＦＵ／８ｍｌ未満、１ＣＦＵ／９ｍｌ未満、又は１ＣＦＵ／１０ｍｌ未満の総真菌数（ＴＹＭＣ）を有する、実施形態１５３～１６０のいずれか１つに記載の医薬組成物。

１６２．組成物は、５℃で少なくとも２４ヶ月間安定している、実施形態１５３～１６１のいずれか１つに記載の医薬組成物。

１６３．組成物は、２５℃で少なくとも１ヶ月間安定している、実施形態１５３～１６２のいずれか１つに記載の医薬組成物。

１６４．組成物は、約０．１５ｍｇの組み換えラブリシン糖タンパク質／ｍｌ（ｍｇ／ｍｌ）、約０．２０ｍｇ／ｍｌ、約０．２５ｍｇ／ｍｌ、約０．３０ｍｇ／ｍｌ、約０．３５ｍｇ／ｍｌ、約０．４０ｍｇ／ｍｌ、約０．４５ｍｇ／ｍｌ、約０．５０ｍｇ／ｍｌ、約０．５５ｍｇ／ｍｌ、約０．６０ｍｇ／ｍｌ、約０．７０ｍｇ／ｍｌ、約０．８ｍｇ／ｍｌ、約０．９ｍｇ／ｍｌ、約１．０ｍｇ／ｍｌ、約１．５ｍｇ／ｍｌ、約１．６ｍｇ／ｍｌ、約１．７ｍｇ／ｍｌ、約１．８ｍｇ／ｍｌ、約１．９ｍｇ／ｍｌ、約２．０ｍｇ／ｍｌ、約２．１ｍｇ／ｍｌ、約２．２ｍｇ／ｍｌ．， 約２．３ｍｇ／ｍｌ、約２．４ｍｇ／ｍｌ、約２．５ｍｇ／ｍｌ、約２．６ｍｇ／ｍｌ、約２．７ｍｇ／ｍｌ、約２．８ｍｇ／ｍｌ、約２．９ｍｇ／ｍｌ、約３．０ｍｇ／ｍｌ、約３．５ｍｇ／ｍｌ、約４．０ｍｇ／ｍｌ、約０．１５ｍｇ／ｍｌ～約３．０ｍｇ／ｍｌ、約０．４５ｍｇ／ｍｌ～約３．０ｍｇ／ｍｌ、約０．１５ｍｇ／ｍｌ～約０．４５ｍｇ／ｍｌ、約１．５ｍｇ／ｍｌ～約３．０ｍｇ／ｍｌ、約１．５ｍｇ／ｍｌ～約３．５ｍｇ／ｍｌ、約２．０ｍｇ／ｍｌ～約３．０ｍｇ／ｍｌ、約１．５ｍｇ／ｍｌ～約２．５ｍｇ／ｍｌ、又は約２．０ｍｇ／ｍｌ～約４．０ｍｇ／ｍｌの初期濃度を有する、実施形態１５３～１６３のいずれか１つに記載の医薬組成物。

１６５．実施形態１５３～１６４のいずれか１つに記載の医薬組成物を患者に投与する工程を含む、眼表面障害を治療するための方法。

１６６．眼表面障害はドライアイ疾患である、実施形態１６５に記載の方法。

１６７．眼表面障害を治療するための、実施形態３２～４３、９３～１１９、又は１５３～１６４のいずれか１つに記載の医薬組成物。

１６８．眼表面障害の治療で使用するための、実施形態３２～４３、９３～１１９、又は１５３～１６４のいずれか１つに記載の医薬組成物。

１６９．眼表面障害を治療するための薬剤を製造するための、実施形態３２～４３、９３～１１９、又は１５３～１６４のいずれか１つに記載の医薬組成物の使用。

特許請求の範囲が、特許権保護が求められる本発明を規定するため、本開示における「本発明」に対する参照は、本明細書で開示されるいくつかの発明の実施形態を反映することを意図しており、特許請求される主題を必ずしも限定するものと解釈するべきではない。

以下の実施例は上記の本発明を例示するものであるが、なんら本発明の範囲を限定することを意図するものではない。関連する技術分野の当業者にそのようなものとして知られる他の試験モデルも、特許請求される本発明の有益な効果を決定し得る。

実施例１：
組み換えラブリシンの精製プロセス
ラブリシンの例示的な精製プロセスを、下記の図１及び２、並びに表２に記載する。一般的に、プロセスは、３つのクロマトグラフィー工程と、ウイルス不活化（すなわち低ｐＨインキュベーション）、及び除去、ナノ濾過、並びに以下の実施例に記載される実施形態における、Ｎ，Ｎ－ジメチル尿素（ＤＭＵ）を用いたウイルス不活化のための追加の工程を含む。最後に、生成物は濃縮及び透析濾過されて最終緩衝剤となる。

精製のための出発物質を、チャイニーズハムスター卵巣細胞株（国際公開第２０１５／０６１４８８号パンフレットに記載されるＣＨＯ－Ｍ細胞）中で産生した組み換えヒトラブリシン糖タンパク質（ｇｌｙｏｐｒｏｔｅｉｎ）を含む細胞培養収穫物から調製した。

工程１：Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ処理及び多モードカチオン交換クロマトグラフィー（ＭＣＣ）
細胞を、インライン深層濾過を用いて、又は単に深層濾過によって、続いて０．２μｍの濾過で除去した。冷却した（２～８℃）浄化細胞培養物上清に、Ｍｇ^２＋及びＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）エンドヌクレアーゼ（Ｍｅｒｃｋ ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）をスパイクして、５０’０００Ｕ／Ｌ_{浄化収穫物}の標的濃度にし、４℃で１６時間インキュベートした。１．０ｋｇの浄化収穫物あたり、約１．０７ｇの１Ｍ ＭｇＣｌ_２溶液（密度１．０７０ｇ／ｍｌ）を用いた。

Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）処理の後、浄化収穫物を、Ｃａｐｔｏ ＭＭＣ樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ－Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ ＰＡ）を用いてベッド高さが２０ｃｍになるまで充填した多モードカチオン交換クロマトグラフィー（ＭＣＣ）カラムに適用した。４分以上の滞留時間を適用した。存在する生成物の量に応じて、複数のカチオン交換クロマトグラフィーサイクルを実施した。各サイクルは、約６ｇ／Ｌカラム体積の最大投入量を許容する。

投入する前に、カラムを１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８でプライミングし、続いて平衡緩衝剤（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８）で平衡化した。無細胞収穫物を投入した後、カラムを最初に洗浄緩衝剤（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ１０）で、次に平衡緩衝剤で洗浄した。生成物を、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２０ｍＭの酢酸ナトリウム、５０ｍＭのＬ－アルギニン、１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ９を含む緩衝剤で溶出した。

工程２：多モードアニオン交換クロマトグラフィー（ＭＡＣ）
前工程からの濾過生成物含有溶液を、貫流モードの多モードアニオン交換クロマトグラフィー（ＭＡＣ）によるクロマトグラフィーポリッシングに供した。溶液を、ベッド高さが２０ｃｍになるまで充填したＣａｐｔｏ Ｃｏｒｅ７００カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ ＰＡ）に適用した。６分以上の滞留時間を適用した。存在する生成物の量に応じて、複数の多モードアニオン交換クロマトグラフィーサイクルを実施した。各サイクルは、約１８ｇ／Ｌカラム体積の最大投入量を許容した。投入物を、０．５Ｍリン酸溶液でｐＨ７．０に調節した。５０ｍＭリン酸ナトリウム、７５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７を含有する緩衝剤で、平衡化及び投入後洗浄を実施した。生成物をパーコレート中に回収した（貫流）。

工程３：ウイルス不活化（ＶＩＮ）
部分的に精製したラブリシン溶液を、続いて０．５Ｍリン酸溶液でｐＨをｐＨ３．４～３．６に調節することによってウイルス不活化に供した。１７～２５℃で６０～９０分間インキュベーションした後、１Ｍ トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）溶液でｐＨをｐＨ７．０に調節した。最後に、溶液を０．２μｍフィルタで濾過した。

工程４：疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）
第２のクロマトグラフィーポリッシング工程を、続いて貫流モードの疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を用いて実施した。

前工程からの濾過生成物含有溶液に、３Ｍ硫酸アンモニウムをスパイクして、０．７２Ｍ硫酸アンモニウム濃度の標的濃度にした。濾過した後、スパイクした溶液をＳａｒｔｏｂｉｎｄ Ｐｈｅｎｙｌ膜吸着剤に適用した。０．２分以上の滞留時間を適用した。存在する生成物の量に応じて、複数の膜吸着剤サイクルを実施した。各サイクルは、約３０ｇ／Ｌカラム体積の最大投入量を許容した。

２０ｍＭのリン酸ナトリウム、１Ｍの硫酸アンモニウム、ｐＨ７を含有する緩衝剤で、平衡化及び投入後洗浄を実施した。生成物をパーコレート中に回収した（貫流）。

工程５：ナノ濾過（ＶＲＦ）
０．１μｍフィルタで予備濾過した後、Ｐｌａｎｏｖａ ２０Ｎウイルス低減フィルタを０．８バールの作動圧力差で使用してラブリシン含有溶液をナノ濾過に供した。１ｍ^２あたり６０ｇの生成物の最大投入量を適用した。供給圧力を一定に保ち、流束は経時的に減少した。製造プロセスでは、８０％の最大流束減衰を許容した。

工程６：３Ｍ ＤＭＵを用いたウイルス不活化（ＶＩＮ ＤＭＵ）
溶液を、続いて３Ｍ Ｎ，Ｎ－ジメチル尿素（ＤＭＵ）を用いたウイルス不活化工程に供した。ウイルス除去濾過工程からの溶液を、６Ｍ ＤＭＵ溶液と１：１（ｖ／ｖ）の比率で混合し、混合物を室温で最大３６０分間インキュベートした（攪拌せず）。溶液を、続いて０．４５／０．２μｍのＳａｒｔｏｐｏｒｅ２マイクロフィルタ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ ＡＧ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で濾過した。

工程７：限外濾過及びコンパウンディング（ＵＦＴ）
溶液を、続いて、濃縮工程及び透析濾過工程からなる限外濾過／透析濾過に供し、緩衝剤は原薬標的組成を達成するように設計した。この工程は、３０ｋＤａカットオフ膜を使用した。限外濾過／透析濾過プロセスの後にポリソルベート２０を添加した。最終ＤＳ溶液を０．２μｍフィルタで濾過した。

表３はプロセスの精製結果を示す。表中、ＨＭＷ及びＬＭＷ％は、下記のＳＥＣアッセイを用いて決定した。ＨＣＰ含有量は、ＣＨＯ－ＥＬＩＳＡによって測定した。ＤＮＡ含有量はｑＰＣＲを用いて測定した。

表４－１～４－７は、プロセスの様々な工程の典型的なプロセス出力を示す。

最終ラブリシン原薬溶液は、ラブリシンタンパク質に加えて、約１０ｍＭのリン酸ナトリウム、１４０ｍＭの塩化ナトリウム、及び０．０２％（ｗ／ｖ）のポリソルベート２０を含有する。

実施例２：
組み換えラブリシンの精製プロセス
ラブリシンの更なる精製プロセスが図３に記載される。一般に、このプロセスは、実施例１に記載されたプロセスと同様であるが、Ｎ，Ｎ－ジメチル尿素（ＤＭＵ）を用いたウイルス不活化の工程を含まない。

精製のための出発物質を、チャイニーズハムスター卵巣細胞株（国際公開第２０１５／０６１４８８号パンフレットに記載されるＣＨＯ－Ｍ細胞）中で産生した組み換えヒトラブリシン糖タンパク質を含む細胞培養収穫物から調製した。細胞を、最初にＷａｖｅバイオリアクター内の約２０Ｌの細胞培養物溶液中で培養し、続いてＷＡＶＥバイオリアクター内で、約１００Ｌから４００Ｌへと細胞培養物容積が増加する２予備段階で更に培養した。最終的に、細胞を２，０００Ｌのバイオリアクター内で培養した。

精製プロセスの様々な段階における残留宿主細胞タンパク質を下記の表５－１に示す。

精製プロセスの様々な段階における残留宿主細胞ＤＮＡを下記の表５－２に示す。

精製プロセスの様々な段階における残留Ｂｅｎｚｏｎａｓｅを下記の表５－３に示す。

表５－４は、本プロセスを用いて作製された原薬バッチの様々な試験要件、及び試験結果を示す。

サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）による純度／断片
最終組成物に含まれる組み換えラブリシン分解生成物（断片化生成物）を、専用のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）法によって分析した。試料の分離をサイズに基づいて実施し、２１０ｎｍにおけるＵＶ吸光度を記録した。初期原薬（ＤＳ）バッチ及び臨床原薬バッチのオーバーレイクロマトグラムを図４に示す。ピークは、約０．４ピーク面積パーセンテージ（ＬＯＱ未満）のものであり、これは初期バッチでのみ検出された。両方のバッチの断片の合計はＬＯＱ未満（＜１．０％）であった。ＳＥＣプロファイルは、２つのバッチで全体的に類似しており、これは、両方のバッチがＳＥＣ分析によれば純度及び断片に関して同等であったことを示す。

サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）による凝集体
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）法により、分解生成物を凝集体に関して分析した。試料の分離をサイズに基づいて実施し、２１０ｎｍにおけるＵＶ吸光度を記録した。初期原薬バッチ及び臨床原薬バッチプロファイルのオーバーレイクロマトグラムを図５に示す。各バッチの凝集体の合計は定量限界未満であった（ＬＯＱ；＜１．０％）。ＳＥＣプロファイルは、２つのバッチで類似しており、これは、初期ＤＳバッチ及び臨床ＤＳバッチは、ＳＥＣによれば凝集体に関して同等であったことを示す。

逆相クロマトグラフィー（ＲＰＣ）による純度
疎水性に基づく逆相クロマトグラフィー（ＲＰＣ）による純度を評価し、２１５ｎｍにおけるＵＶ吸光度を記録した。初期原薬バッチ及び臨床原薬（ＤＳ）バッチのオーバーレイクロマトグラムを図６に示す。プロファイル及び純度は、２つのバッチで類似しており、これは、初期ＤＳバッチ及び臨床ＤＳバッチは、ＲＰＣによれば同等であったことを示す。早期溶出ピーク不均一であり、１つのピーク群として積分された。Ｎ及びＣ末端切断ラブリシンを含むためのペプチドマッピングにより早期ピークの正体を示した。早期溶出ピークのピーク面積パーセンテージは、２つのバッチで類似していた（約２３％）。主ピークも不均一であり、２つの主要な密接に関連したピークを含んだ。主ピークは、おそらく非断片化ラブリシンを含む。２つのピークの外観は、分析超遠心法によって観察された精製タンパク質の異なる分子又は構造配座を示し得る。

分析超遠心法による分子量の決定
初期原薬（ＤＳ）バッチ及び臨床ＤＳバッチを、それぞれ沈降平衡（ＳＥ－ＡＵＣ）及び沈降速度（ＳＶ－ＡＵＣ）モードを用いる分析超遠心法（ＡＵＣ）により天然条件下で測定した。ＳＥ－ＡＵＣは分子量を測定し、一方でＳＶ－ＡＵＣは、例えば配座及びサイズ分布としての分子特性を測定する。試料を、１２ｍｍの６チャネルセンターピース（ＳＥ－ＡＵＣ）及び１２ｍｍの２チャネルセンターピース（ＳＶ－ＡＵＣ）に導入し、設定条件に従い２０℃の温度で分析した。図７は、３重に測定した各ＤＳバッチの２３０ｎｍにおけるＳＶ－ＡＵＣ吸光度プロファイルを示す。どちらのＤＳバッチも、約４．５Ｓ及び６Ｓ前後の最大値を有する２つの主要ピークを含む類似するプロファイルを示した。２つのバンドは、類似する分子量の異なる構造配座：より細長い形態（４．５Ｓ）及び比較的よりコンパクトな形態（６Ｓ）に対応すると思われる。ピーク面積は各ＤＳバッチで類似していた。

初期ＤＳバッチのＳＥ－ＡＵＣにより測定された分子量は、２９４，９３８．７ｇ／ｍｏｌであった。臨床ＤＳバッチのＳＥ－ＡＵＣにより測定された分子量は、２９１，９３１．９ｇ／ｍｏｌであった。２つのバッチの分子量は類似しており、予期される範囲内にあった。２つのバッチ間で観察された分子量のわずかな差異は、本方法の誤差範囲内にあった。

アミノ酸組成物に基づく組み換えヒトラブリシンの理論分子量は、１４８，３０８Ｄａであった。ＤＳバッチあたり１４５ｋＤａ前後の追加測定された質量は、主にシアル化Ｏ－グリカンからなると思われる。バッチ中に凝集体種は検出されなかった。したがって、初期ＤＳバッチ及び臨床ＤＳバッチは、類似するＡＵＣプロファイル及び分子量を示した。

実施例３：
本明細書で提供される方法を用いて精製された溶液を分析するために以下のアッセイを使用し、又はこれを使用してもよい。

分析的アッセイ：サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）による正体及び凝集体
上記のプロセスからの試料中のラブリシンの凝集体は、ＵＶ検出を用いたサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を使用して、天然条件下でサイズに基づいてモノマーから分離される。凝集体の量／含有量は、決定された各試料について得られた総面積のパーセンテージとして決定される。試料の正体は、正体が既知の参照標準と比較して評価される。正体又は凝集体の決定は、単独でも組み合わせでも実施され得る。

この方法は、一般に「試料」と称される原薬及び製剤に適用可能である。

以下の試験溶液を使用した。

移動相 ５０ｍＭリン酸ナトリウム／４００ｍＭ過塩素酸ナトリウム、ｐＨ７．０
希釈剤（試料希釈剤） １０ｍＭリン酸ナトリウム／１４０ｍＭ塩化ナトリウム／０．０２％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０（ＰＳ２０）、ｐＨ７．０
ＢＳＡ／サイログロブリン／ＮａＣｌ（飽和溶液） 例えば、約８０ｍＬの水に、１００±１０ｍｇのＢＳＡ、１００±１０ｍｇのサイログロブリン、及び１００±１０ｍｇのＮａＣｌを溶解する。１００ｍＬの最終容積になるまで水を充填する。０．４５μｍ（又はそれ未満）のメンブレンフィルタで濾過する。
分子量マーカー溶液（ＭＷＭ溶液） Ｉ．１５０ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ６．５を調製する
ＩＩ．約７０ｍＬの１５０ｍＭ リン酸カリウム、ｐＨ６．５に、５０±１ｍｇのサイログロブリン（６６９ｋＤａ）、２０±１ｍｇのＩｇＧ（１５０ｋＤａ）、２５±１ｍｇのホロ－トランスフェリン（８０ｋＤａ）、２５±１ｍｇのオボアルブミン（４５ｋＤａ）、２０±１ｍｇの炭酸脱水酵素（２９ｋＤａ）、２０±１ｍｇのアプロチニン（６．５ｋＤａ）、及び１６±１ｍｇのヒスチジン（２０９．６Ｄａ）を溶解する。溶液を穏やかに約１５分間攪拌する。メスフラスコ内に１００ｍＬの最終容積になるまで１５０ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ６．５を充填し、０．２２μｍのメンブレンフィルタで濾過する。

ラブリシン試料溶液を約０．１５ｍｇ／ｍＬまで希釈する（例えば、１５μＬの試料、参照を８５μＬの希釈剤で１ｍｇ／ｍＬ前後に希釈する）。試料希釈剤は、１０ｍＭリン酸ナトリウム／１４０ｍＭ塩化ナトリウム／０．０２％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０（ＰＳ２０）、ｐＨ７．０である。ラブリシン参照溶液を２段階で希釈し、１．５μｇ／ｍＬの最終ラブリシン濃度（ＬＯＱ溶液）を得る。最初に、３０μＬの参照溶液を、９７０μＬの試料希釈剤で０．１５ｍｇ／ｍＬに希釈する。これを溶液Ａと名付けた（約４．５μｇ／ｍＬのラブリシン）。次に、１００μＬの溶液Ａを２００μＬの試料希釈剤で希釈した。これをＬＯＱ溶液と名付けた（１．５μｇ／ｍＬ）。

分子量マーカー溶液（ＭＷＭ溶液）を以下のように調製した。１）１５０ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ６．５を調製し、２）約７０ｍＬの１５０ｍＭ リン酸カリウム、ｐＨ６．５に、５０±１ｍｇのサイログロブリン（６６９ｋＤａ）、２０±１ｍｇのＩｇＧ（１５０ｋＤａ），２５±１ｍｇのホロ－トランスフェリン（８０ｋＤａ）、２５±１ｍｇのオボアルブミン（４５ｋＤａ）、２０±１ｍｇの炭酸脱水酵素（２９ｋＤａ）、２０±１ｍｇのアプロチニン（６．５ｋＤａ）、及び１６±１ｍｇのヒスチジン（２０９．６Ｄａ）を溶解する。溶液を穏やかに約１５分間攪拌し、続いてメスフラスコ内に１００ｍＬの最終容積になるまで１５０ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ６．５を充填し、０．２２μｍのメンブレンフィルタで濾過する。

以下のクロマトグラフィー条件を使用する。
流量 ０．３ｍＬ／分
カラム温度 ３０℃
Ｃｈｒｏｍｅｌｅｏｎ（商標）設定：デルタ：３℃
オートサンプラー温度 ５℃
Ｃｈｒｏｍｅｌｅｏｎ（商標）設定：下限４℃／上限８℃
検出 ２１０ｎｍ
Ｃｈｒｏｍｅｌｅｏｎ（商標）設定：工程：１．０ｓ／平均：オン
データサンプリングレート 該当なし
注入量 ２０μＬ（ＭＷＭ溶液 ２μＬ）
実行時間 ５０分間

順番を以下の通り実行する。

上記のアプローチは、最大１５個の試料に使用することができる。１５個を超える試料の場合、以下の注射の順番を使用してよい。

３０個を超える試料が分析される場合、それに応じて試料Ｎ（３０、４５など）の後に参照溶液の反復注射を開始する。試料注射の前後で以下に示すＳＳＴ基準が満たされている限り、試料注射の結果は有効である（ブラケティングアプローチ）。

３０個を超える試料が分析される場合、それに応じて試料Ｎ（３０、４５など）の後に参照溶液の反復注射を開始する。試料注射の前後でＳＳＴ基準が満たされている限り、試料注射の結果は有効である（ブラケティングアプローチ）。

結果を以下の通り評価する：
原則として、凝集体ピークから溶媒ピークまで１本のベースラインを引く。例示的なクロマトグラム図１２及び図１３、並びにストレスを受けた試料図１７を参照されたい。

ピーク積分及び番号付け
２つ以上の凝集体が存在する場合、ピークを分離する谷の最小値における直交分割によって、互いから、及び主ピークから（モノマー）、ピークを分離する。主ピーク及び凝集体ピークがショルダーによってのみ分解される場合、分割がショルダーの変曲点に設定され得る。（１つの単位として積分される）主ピークと断片との間に分割が設定されるべきではない。

参照、ＬＯＱ、及び試料溶液の積分のために、溶媒ピーク、及び存在する場合はブランクからのピークを積分してはならない。

凝集体ピークは、主ピークに対するその溶出時間に基づいて特定される。主の前に溶出するピークは、凝集生成物（例えば、ＡＰｘと名付けられる）に割り当てられる。

凝集体の計算
全ての積分された凝集体ピーク及び主ピーク＋断片のピーク面積（ｍＡＵ＊ｍｉｎ）を決定する（主ピーク及び断片は１つの単位として積分される）。

各試料に関して、各凝集体ピークの面積パーセンテージ（％Ｐ）を計算する。凝集体の相対的ピーク面積の合計（％）を計算する。＜１．０％（ＬＯＱ）のピークは、合計凝集体の計算に含まれない。

凝集体ピークの％Ｐは、以下の式に従って計算される。

ａ_ｒｓ：試料溶液クロマトグラムにおける生成物特異的凝集体ピークのピーク面積（ｍＡＵ＊ｍｉｎ）
ａ_ｔ：試料溶液クロマトグラムの合計ピーク面積（ｍＡＵ＊ｍｉｎ）、すなわち全ての積分されたピーク（凝集体＋モノマー／断片）の総面積。

溶出時間の差
主ピーク及び凝集体ピーク（ＬＯＱを上回る）のΔ（デルタ）時間差として定義される溶出時間差、すなわち、時間主ピーク（分）－時間凝集体ピーク（分）。

正体
試料の正体は、試料の主ピークの溶出時間を、正体が既知の参照標準の溶出時間（順番の最初及び最後のみ）の平均と比較することによって評価する。同定試験は、単独でも、凝集体の決定と組み合わせても実施されてよい。

プラセボの正体は、参照の予期溶出時間におけるＬＯＱを超える試料ピークが出現しないことによって評価される。
計算：差＝［（Ｔｓ－Ｔｒ）／Ｔｒ］＊１００
Ｔｓ＝試料の溶出時間
Ｔｒ＝参照の溶出時間（平均）

報告
凝集体量：合計凝集体生成物のピーク面積パーセンテージ（％Ｐ）及び各凝集体ピークの％Ｐを報告する。

小数点第１位まで四捨五入した（Ｘ．Ｘ分）各凝集体ピーク対主ピークのΔ（デルタ）時間差を情報のために報告する。

正体：溶出時間の差を報告する（パーセンテージ単位で）。

実施例４：
本明細書で提供される方法を用いて精製された溶液を分析するために以下のアッセイを使用し、又はこれを使用してもよい。

分析的純度アッセイ：サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）による断片
ラブリシンの断片は、ＵＶ検出を用いたサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を使用して、天然条件下でサイズに基づいてモノマーから分離される。断片の純度（モノマー）及び量を、各試料に関して得られた合計試料面積のパーセンテージとして決定する。アッセイを、試料の合計ピーク面積対既知の濃度の参照の合計ピーク面積に基づいて決定する。アッセイ又は純度は、必要に応じて単独で実施してよい。

この方法は、一般に「試料」と称される原薬及び製剤に適用可能である。

以下のクロマトグラフィー条件を使用する。

以下の試験溶液を使用した。

純度及びアッセイのために以下のとおりに順番を実行する。

試料が１５個を超える場合、以下の順番を用いる。

システム適合性試験（ＳＳＴ）の要件

評価
より低分子量の予想断片（特にストレス下条件における試料の）が、溶媒ピーク近くまで溶出したが完全には分解され得なかったため、下記のベースライン設定が確立される。以下の手順により、こうした断片はより正確に説明及び計算される。その立ち下がり側（ｔｒａｉｌｉｎｇ ｓｉｄｅ）で主ピークと「非対称である」ピークが、実際の試料含有量のために、及びそれに次いで、例えば試料の吸着に関連してテーリングするピークのために、最先にある。

Ｉ：１本のベースラインを、主ピーク（暫定的な凝集体ピークを含む）の開始点から溶媒ピークを横断して越えるように引き、全体にわたる真っ直ぐなベースラインを投影する。ベースラインの終点を、開始点と同水準／同じレベル、又はおおよそ類似するレベルに設定する。溶媒ピークを横断して越えるベースラインは、「外挿された（ｅｘｔｒａｐｏｌａｔｅｄ）」と称される。図２２を参照されたい。

ＩＩ：上記のベースラインを投影した後で、図２２の「Ａ」で示されるように、溶媒ピークにドロップラインを設定する。ドロップラインを設定した後、外挿されたベースライン並びに溶媒ピーク及びその先を、面積の計算に含まれないように（すなわち、面積の計算から除外されるように）除去する。外挿ベースラインを除去した後の最終結果は、図２１を参照されたい。

ピーク積分及び番号付け
２つ以上の断片ピークが存在する場合、ピークを分離する谷の最小値における直交分割によって、互いから、及び主ピークから（モノマー）、ピークを分離する。断片ピークが主ピークと密接に関連し、ショルダーによってのみ分解される場合、分割がショルダーの変曲点に設定され得る。主ピークと凝集体ピークとの間には１つの分割のみが設定されるべきである。凝集体は報告されないが、合計面積の計算のために積分され、純度決定のために主ピークから分離される。或いは、モノマーピークと凝集体ピークとの間に分割を設定しない。代わりに、凝集体及びモノマーピークを、「主ピーク」と称される単一のピークとして見なす。

参照、ＬＯＱ、及び試料溶液の積分のために、存在する場合、ブランクからのピークを積分してはならない。

断片ピークは、主ピークに対するその溶出時間に基づいて特定される。主ピーク／モノマーの後に溶出するピークは、断片／分解生成物に割り当てられる（ＤＰｘと名付けられる）。

純度の計算
全ての積分されたピーク（主＋断片＋凝集体）のピーク面積（ｍＡＵ＊ｍｉｎ）を決定する（凝集体は１つの単位として積分され、存在する場合、個々の凝集体ピーク間に分割は存在しない）。

或いは、主ピークのピーク面積（ｍＡＵ＊ｍｉｎ）を決定する（凝集体及びモノマーピークは１つの単位として積分され、これらのピーク間に分割は存在しない）。アッセイ評価と並行して純度が評価される場合（３回の注射）、３回の注射の平均が純度の計算に用いられる。

各試料に関して、各断片ピーク及び主ピークの面積パーセンテージ（％Ｐ）を計算する。断片の相対的ピーク面積の合計（％）を計算する。
＜１．０％（ＬＯＱ）のピークは、合計断片の計算に含まれない。
各ピークの％Ｐは、以下の式に従って計算される。

ａ_ｒｓ：試料溶液クロマトグラムにおける特異的ピークのピーク面積（ｍＡＵ＊ｍｉｎ）
ａ_ｔ：試料溶液クロマトグラムの合計ピーク面積（ｍＡＵ＊ｍｉｎ）。全ての積分されたピーク（凝集体ピークを含む）が含まれる。

溶出時間の差
測定された試料の主ピーク対参照標準の主ピークのΔ（デルタ）時間差として定義される溶出時間（順番中の最初及び最後の参照の平均溶出時間）の差、すなわち、時間主ピーク参照（平均、分）－時間主ピーク試料（分）。

アッセイの計算
原薬
全参照溶液注射の平均合計ピーク面積（ｎ＝６；Ａ_ｒ）（順番中の試料の前後の、又は上記で例示したように１５個を超える試料の場合はそれに加えてその間の）を、注射された各試料の平均合計ピーク面積（Ａ_ｓ）と比較する。或いは、１５個を超える試料を注射する場合、ブラケットアプローチを適用する。各ブラケットに対し、参照の合計ピーク面積の平均（ｎ＝６）（第１のブラケットに対してＡ_ｒ１、及び第２のブラケットに対してＡ_ｒ２）を用いてアッセイを計算する。

試料の濃度（ｍｇ／ｍＬ）を以下の式に従って計算する。

Ａ_ｒ：全参照溶液注射の平均合計ピーク面積（ｎ＝６）
Ａ_ｓ：注射された各試料の平均合計ピーク面積（ｎ＝３）
Ｃｓ：未希釈試料の濃度（ｍｇ／ｍＬ）
Ｃｒ：未希釈参照の濃度（ｍｇ／ｍＬ）
Ｄｓ：試料希釈係数（希釈係数がない場合、Ｄｓ＝１）
Ｄｒ：参照希釈係数（希釈係数がない場合、Ｄｒ＝１）

製剤
全参照溶液注射の平均合計ピーク面積（ｎ＝６；Ａ_ｒ）（順番中の試料の前後の、又は上記で例示したように１５個を超える試料の場合はそれに加えてその間の）を、注射された各試料の平均合計ピーク面積（Ａ_ｓ）と比較する。或いは、１５個を超える試料を注射する場合、ブラケットアプローチを適用する。各ブラケットに対し、参照の合計ピーク面積の平均（ｎ＝６）（第１のブラケットに対してＡ_ｒ１、及び第２のブラケットに対してＡ_ｒ２）を用いてアッセイを計算する。

以下の式に従い申告含有量のパーセンテージ（％）を計算する：

Ａ_ｒ：全参照溶液注射の平均合計ピーク面積（ｎ＝６）
Ａ_ｓ：注射された各試料の平均合計ピーク面積（ｎ＝３）
ＣＬ：活性薬剤成分（ラブリシン）の製剤の理論濃度（ｍｇ／ｍＬ）
Ｃｒ：未希釈参照の濃度（ｍｇ／ｍＬ）
Ｄｓ：試料希釈係数（希釈係数がない場合、Ｄｓ＝１）
Ｄｒ：参照希釈係数（希釈係数がない場合、Ｄｒ＝１）

報告
純度：モノマーのピーク面積パーセンテージ（％Ｐ）（主ピーク）、及び断片／分解生成物（ＤＰ）の合計（％）を報告する。

或いは、純度を、主ピークのピーク面積パーセンテージ（％Ｐ）（単一単位としての凝集体及びモノマーピーク）及び断片／分解生成物（ＤＰ）の合計（％）として報告する。

≧１．０％の各断片／ＤＰピークの％Ｐ（ＬＯＱ）を、その対応する相対溶出時間（モノマーに対する）と共に情報のために報告する。

小数点第２位まで四捨五入した（Ｘ．ＸＸ分）各試料主ピーク対参照主ピーク（平均値）のΔ（デルタ）時間差を情報のために報告する。

アッセイ：
原薬：試料あたりの結果をｍｇ／ｍＬ単位で報告する（例えば、小数点第２位を含めて）。
製剤：結果を、申告含有量のパーセンテージ（％）として報告する（例えば、小数点第１位を含めて）。

実施例５：
本明細書で提供される方法を用いて精製された溶液を分析するために以下のアッセイを使用し、又はこれを使用してもよい。

分析的アッセイ：逆相クロマトグラフィー（ＲＰＣ）によるアッセイ及び純度
ラブリシンを、ＲＰＣによってそれぞれ早期ピーク及び主ピークと称される２つの主要なピーク群として分解する。２つの主要なピーク群のピーク面積対合計ピーク面積は、相対ピーク面積パーセンテージとして表される純度を定義する。

アッセイは、試料の平均合計ピーク面積対参照溶液のブラケティング注射の平均合計ピーク面積の相対的比較によって定義される。

この方法は、一般に「試料」と称されるラブリシンの原薬（ＤＳ）及び製剤（ＤＰ）に適用可能である。

次の溶液を使用する。

以下のクロマトグラフィーカラム、条件、及び勾配を使用してよい。
カラム Ｐｏｒｏｓｈｅｌｌ３００ ＳＢ－Ｃ８ ５μｍ；２．１ｍｍ×７５ｍｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ ＃６６０７５０－９０６）又は等価物

条件

溶媒勾配

試験手順

注射の順番
順番を以下の通り実行する。参照は順番の最初及び最後に注射する。所与の例は、最大で１０個の試料に対してのものである。１０個を超える試料が注射される場合、ブランクは各１０回目の試料注射の後で実行すべきである。

システム適合性試験（ＳＳＴ）
ＳＳＴは、各試験系列の前に実施する。全てのＳＳＴ要件が受け入れられた場合にのみ、試料の評価を開始する。

ＳＳＴ要件

評価
早期溶出ピーク（ＥＰ）、主ピーク、及び暫定的な後期溶出ピーク（ＬＰ）を包含するおよそ１～４分の範囲内で、ブランク溶液に対するオーバーレイ中でベースラインを第１の溶出ピークから最後の溶出ピークまで引く。

或いは、ベースラインを図２８Ａ及び図２８Ｂと同様に引く。第１の溶出ピーク（ＥＰ）、又はピークの群、及び主ピークは別個のベースラインを含む。早期溶出ピーク（ＥＰ＝、主ピーク及び暫定的な後期溶出ピーク（ＬＰ）を包含するおよそ１～４分の範囲内で、ベースラインをブランク溶液に相関して引く。

ピーク積分及び番号付け
主要なピークは、ピークを分離する谷の最小値における直交分割によって、或いは変曲点において、分離することができる（例えば図２４及び図２５を参照されたい）。存在する場合、溶媒／注射ピーク、又はブランク溶液に由来するピークを積分してはならない。

ピークは、主ピークに対するその保持時間に基づいて特定される。主ピークの前に溶出するピークは、早期溶出ピーク（ＥＰと名付ける）に割り当てられ、主ピークの後に溶出するピークは後期溶出ピーク（ＬＰと名付ける）に割り当てられる。現行の参照標準中のＥＰは、１つの主要であるが不均一なピークを構成する。ＥＰピークは１つの単位として積分される（図２４及び図２３を参照されたい）。主要ＥＰの前に、又は主要ＥＰと主ピークとの間に溶出する追加のＥＰが検出された場合、これらのピークは主要ＥＰとは別に、ピークを分離する谷の最小値における直交分割によって、又は分離した個別のベースラインを用いて、積分されるべきである（図２９のストレスを受けた試料の例を参照されたい）。同様の積分原理が、ピーク又はピークの群として積分されるべきＬＰにも、谷又は変曲点のいずれかによって主ピークから分解された場合は適用される（いくつかのＬＰの群が積分される図２９を参照されたい）。

参照標準の主ピークは、二重ピーク（２つの不完全に分解された主要ピーク）として分解される場合が多い。主要な二重ピークは、ここでも谷によって分解されないが、少なくとも変曲点によって分解される場合、分割及び積分されるべきである（ドロップラインによって；主１及び主２をもたらす）（図２４を参照されたい）。或いは、主要な二重ピークは、２つの単一ピークとして積分されてもよい。

純度の計算
アッセイ及び純度が同じ試料に対して実施される場合は、第１の試料の複製は純度を評価するためにのみ使用する。

全ての積分されたピークのピーク面積（ｍＡＵ＊ｍｉｎ）を決定する。

ＥＰ及び主ピーク（存在する場合、二重ピークの合計）のパーセンテージである％Ｐは、以下の式に従って計算する。

ａ_ｒｓ：クロマトグラムにおけるそれぞれＥＰ及び主のピーク面積（ｍＡＵ＊ｍｉｎ）
ａ_ｔ：試料溶液クロマトグラムの合計ピーク面積（ｍＡＵ＊ｍｉｎ）、すなわち全ての積分されたピーク（ＥＰ、主、及びＬＰ）の総面積。

或いは、ＥＰ、主ピークの合計、及びＬＰのパーセンテージである％Ｐは、以下の式に従って計算する。

ａ_ｒｓ：クロマトグラムにおけるそれぞれＥＰ、主の合計、及びＬＰのピーク面積（ｍＡＵ＊ｍｉｎ）
ａ_ｔ：試料溶液クロマトグラムの合計ピーク面積（ｍＡＵ＊ｍｉｎ）、すなわち全ての積分されたピーク（ＥＰ、主、及びＬＰ）の総面積。

アッセイの計算
原薬
全ての参照溶液注射の平均合計ピーク面積（ｎ＝６（Ａ_ｒ））を比較する（順番中の試料の前及び後で注射された各試料の平均合計ピーク面積（Ａ_ｓ）と）。１２個を超える試料を注射する場合（三重の４つの試料に対応する）、ブラケットアプローチを適用する。各ブラケットに対し、参照の合計ピーク面積の平均（ｎ＝６）（第１のブラケットに対してＡ_ｒ１、及び第２のブラケットに対してＡ_ｒ２）を用いてアッセイを計算する。

試料の濃度（ｍｇ／ｍＬ）を以下の式に従って計算する。

Ａ_ｒ：全参照溶液注射の平均合計ピーク面積（ｎ＝６）
Ａ_ｓ：注射された各試料の平均合計ピーク面積（ｎ＝３）
Ｃｓ：未希釈試料の濃度（ｍｇ／ｍＬ）
Ｃｒ：未希釈参照の濃度（ｍｇ／ｍＬ）
Ｄｓ：試料希釈係数（希釈係数がない場合、Ｄｓ＝１）
Ｄｒ：参照希釈係数（希釈係数がない場合、Ｄｒ＝１）

製剤
全ての参照溶液注射の平均合計ピーク面積（ｎ＝６（Ａ_ｒ））を比較する（順番中の試料の前及び後で注射された各試料の平均合計ピーク面積（Ａ_ｓ）と）。１２個を超える試料を注射する場合（三重の４つの試料に対応する）、ブラケットアプローチを適用する。各ブラケットに対し、参照の合計ピーク面積の平均（ｎ＝６）（第１のブラケットに対してＡ_ｒ１、及び第２のブラケットに対してＡ_ｒ２）を用いてアッセイを計算する。

以下の式に従い申告含有量のパーセンテージ（％）を計算する：

Ａ_ｒ：全参照溶液注射の平均合計ピーク面積（ｎ＝６）
Ａ_ｓ：注射された各試料の平均合計ピーク面積（ｎ＝３）
ＣＬ：活性薬剤成分（ＥＣＦ８４３）の製剤の理論濃度（ｍｇ／ｍＬ）
Ｃｒ：未希釈参照の濃度（ｍｇ／ｍＬ）
Ｄｓ：試料希釈係数（希釈係数がない場合、Ｄｓ＝１）
Ｄｒ：参照希釈係数（希釈係数がない場合、Ｄｒ＝１）

保持時間の差
測定された試料の主ピーク対参照標準の主ピークのΔ（デルタ）時間差として定義される保持時間（順番中の最初及び最後の参照の平均保持時間）の差、すなわち、時間主ピーク試料（分）－時間主ピーク参照（平均、分）。

報告
純度：主要なＥＰピーク及び主ピーク（存在する場合、主二重ピーク１及び２の合計）の合計パーセンテージ（％Ｐ）を報告する

主要ＥＰ及び主（主ピーク１及び２の合計）を含む、≧１．０％（ＬＯＱ）の各ピークの％Ｐを情報のために報告する。

主ピーク１及び２（存在する場合、二重ピーク）を構成する２つのピークのパーセンテージ（％）を情報のために報告する。

小数点第２位まで四捨五入した（Ｘ．ＸＸ分）各試料主ピーク対参照主ピーク（平均値）のΔ（デルタ）時間差を情報のために報告する。

或いは、以下の報告基準を用いる。
純度：純度（％）は、以下の合計として定義する：ＥＰ（％）及び主ピークの合計（％）。全ての早期溶出ピーク（１つの単位として積分される主要な不均一ピーク（ＥＰ）、及び追加の早期溶出ピーク（ＥＰ１、ＥＰ２など））が純度（％）に考慮されることに留意されたい。

純度（％）、ＥＰ（％）、個々の主ピーク（％）、及び主ピークの合計（％）を報告する。

≧１．０％（ＬＯＱ）の各ピークの％Ｐを情報のために報告する。

アッセイ：
原薬の場合：試料あたりの結果をｍｇ／ｍＬ単位で報告する。
製剤の場合：結果を申告含有量のパーセンテージ（％）として報告する。

実施例６：
グリコシル化アッセイ－Ｏ－グリカン及びＮ－グリカンの量の決定
上記の実施例２に記載された方法を用いて精製された臨床ＤＳバッチを含む原薬（ＤＳ）バッチのＯ－グリカンを、原薬バッチを最初にジスルフィド還元／アルキル化、続いてトリプシン消化に供した後で、化学的に放出し（還元的β脱離）、誘導体化した（パーメチル化）。Ｏ－グリカンを、エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ－ＭＳ）と組み合わせた逆相クロマトグラフィーによってプロファイルし、ＭＳ又はタンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）を介して検出／特定を実施した。

両方のバッチで検出された主要なＯ－グリカン種としては、以下が挙げられる：モノシアル化（ＮＡＮＡ）Ｇａｌ－ＧａｌＮＡｃ（コア１構造体；初期ＤＳバッチ、７６％；臨床ＤＳバッチ、８０％）、Ｇａｌ－ＧａｌＮＡｃ（初期ＤＳバッチ、９％；臨床ＤＳバッチ、７％）、ＮＡＮＡ＊＊関連グリカン（初期ＤＳバッチ、１１％；臨床ＤＳバッチ、８％）、ジシアル化（２＊ＮＡＮＡ）Ｇａｌ－ＧａｌＮＡｃ（初期ＤＳバッチ、３％；臨床ＤＳバッチ、３％）、及びＮＧＮＡ（Ｎ－グリコリノイラミン酸）Ｇａｌ－ＧａｌＮＡｃ（初期ＤＳバッチ、１％；臨床ＤＳバッチ、１％）。Ｏ－グリカンの組成及び相対存在量は、初期ＤＳバッチと臨床ＤＳバッチとの間で同等であった（図２６を参照されたい：初期ＤＳバッチ＝バッチ１；臨床ＤＳバッチ＝バッチ２）。少量のＮ－グリコリノイラミン酸（ＮＧＮＡ；１％以下前後）が両方のバッチで検出された。ＮＡＮＡ関連グリカンも検出され、これはモノシアル化（ＮＡＮＡ）Ｇａｌ－ＧａｌＮＡｃの酸化形であり得る。ＮＡＮＡ関連グリカンは、試料調製のアーチファクトであり得る。

原薬（ＤＳ）バッチのＮ－グリカンは、最初にジスルフィド結合還元／アルキル化、続いてトリプシン消化に供された後で、酵素的に放出され（ＰＮＧａｓｅＦ）、還元され（水素化ホウ素ナトリウム）、及び誘導体化された（パーメチル化）。Ｎ－グリカンは、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析によって測定及び特定した。検出及び特定された主要なＮ－グリカンは、両方のバッチに類似するレベルで存在した高マンノース（Ｍａｎ－５、Ｍａｎ－６、及びＭａｎ－７）に対応した。Ｍａｎ－６は最も一般的なＮ－グリカンであり、Ｍａｎ－５及びＭａｎ－７がそれに続く。

本明細書に記載される方法を用いて作製された臨床ＤＳバッチを含む２つのバッチのＯ－グリカン及びＮ－グリカンの種類／アイソフォーム及び相対存在量は、同等であった（図２６及び図２７を参照されたい）。

参照による組込み
本明細書で引用される特許文書及び科学論文の各々の全開示が、全ての目的のために参照により組み込まれる。

均等物
本発明及びその実施形態は、詳細に記載された。しかしながら、本発明の範囲は、本明細書に記載されるいずれかのプロセス、製造、物質の組成、化合物、手段、方法、及び／又は工程の特定の実施形態に限定されることが意図されない。本発明の趣旨及び／又は本質的な特徴から逸脱することなく、様々な変更形態、置換、及び変形形態が本開示の材料に施され得る。したがって、当業者は、本明細書に記載される実施形態と同じ機能を実質的に実施するか又は同じ結果を実質的に達成する、後の修正、置換、及び／又は変形が、本発明のこうした関連する実施形態に従って利用され得ることを本開示から容易に理解するであろう。したがって、以下の特許請求の範囲は、本明細書に開示されるプロセス、製造、物質の組成、化合物、手段、方法、及び／又は工程に対する変更形態、置換、及び変形形態をそれらの範囲内に包含することが意図される。特許請求の範囲は、その趣旨が述べられていない限り、記載された順又は要素に限定して解釈すべきではない。形態及び詳細の様々の変更が添付の特許請求の範囲から逸脱することなく施され得ることを理解すべきである。

Claims (45)

1. 組み換えラブリシン糖タンパク質を精製する方法であって、前記ラブリシン糖タンパク質を含む細胞培養収穫物を、任意の順序で実施される、多モードカチオン交換クロマトグラフィー（ＭＣＣ）、多モードアニオン交換クロマトグラフィー（ＭＡＣ）、及び疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）に供する工程を含む、方法。
2. 前記工程が、ａ）ＭＣＣ、ｂ）ＭＡＣ、及びｃ）ＨＩＣの順序で実施される、請求項１に記載の方法。
3. 工程ａ）の前に、培養下の細胞をＭｇＣｌ_２及びエンドヌクレアーゼと接触させ、前記細胞を収穫して前記細胞培養収穫物を得る、請求項２に記載の方法。
4. 前記培養下の細胞は、約１，０００Ｌ、約１，５００Ｌ、約２，０００Ｌ、又は約２，５００Ｌの培養物容積中にある、請求項２に記載の方法。
5. 工程ａ）の前に、前記細胞培養収穫物がＭｇＣｌ_２及びエンドヌクレアーゼと接触する、請求項２に記載の方法。
6. 前記細胞培養収穫物は、約１，０００Ｌ、約１，５００Ｌ、約２，０００Ｌ、又は約２，５００Ｌの細胞培養物容積に由来する、請求項４に記載の方法。
7. 前記エンドヌクレアーゼはＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）エンドヌクレアーゼである、請求項２又は４に記載の方法。
8. 前記細胞培養収穫物は、ＭｇＣｌ_２及び前記エンドヌクレアーゼと接触する前に２～８℃に冷却される、請求項４に記載の方法。
9. 前記多モードアニオン交換クロマトグラフィー（ＭＡＣ）工程の後、且つ前記疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）工程の前に、ウイルス不活化工程を更に含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記ウイルス不活化工程は、工程ｂ）で得た溶液のｐＨを約３．４～３．６に調節することを含む、請求項８に記載の方法。
11. 前記溶液を少なくとも１時間インキュベートした後、前記疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）工程の前に前記ｐＨが約７．０に調節されている、請求項１０に記載の方法。
12. 前記疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）工程の前に深層濾過工程を含む、請求項８～１０のいずれか一項に記載の方法。
13. 前記深層濾過工程は、前記ウイルス不活化工程の後に続く、請求項１２に記載の方法。
14. 前記疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）工程の後にウイルス除去工程を含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
15. 前記ウイルス除去工程がナノ濾過を含む、請求項１４に記載の方法。
16. 前記ウイルス除去工程の後に限外濾過工程を更に含む、請求項１４又は１４に記載の方法。
17. 前記ウイルス除去工程の後に第２のウイルス不活化工程を含む、請求項１４～１６のいずれか一項に記載の方法。
18. 前記第２のウイルス不活化工程はジメチル尿素溶液を添加することを含む、請求項１６に記載の方法。
19. 前記第２のウイルス不活化工程の後に限外濾過工程を含む、請求項１６又は１８に記載の方法。
20. １つ以上の限外濾過及び／又はナノ濾過工程を更に含む、請求項１又は２に記載の方法。
21. １つ以上のウイルス不活化工程を更に含む、請求項１又は２に記載の方法。
22. １つ以上のウイルス除去工程を更に含む、請求項１又は２に記載の方法。
23. 前記組み換えラブリシン糖タンパク質は、配列番号１又は２のアミノ酸残基２５～１４０４のアミノ酸配列を含む、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。
24. 前記組み換えラブリシン糖タンパク質の分子量のうち少なくとも３０％がグリコシド残基由来である、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。
25. 前記ラブリシン糖タンパク質のＯ－グリコシル化のうち少なくとも９０％がコア１のグリコシル化である、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。
26. 前記ラブリシン糖タンパク質はＯ－グリカン種を含み、前記Ｏ－グリカン種は、約７％以上のＧａｌ－ＧａｌＮＡｃ、約８０％以上の２，３－ＮｅｕＡｃコア１、約３％以上の２＊ＮｅｕＡｃコア１、及び約１％以上の２，３－ＮｅｕＧｃコア１を含む、請求項１～２５のいずれか一項に記載の方法。
27. 前記ラブリシン糖タンパク質は、前記ラブリシン糖タンパク質１ｍｇあたり約５０μｇ以上のＮＡＮＡを含む、請求項１～２６のいずれか一項に記載の方法。
28. 前記ラブリシン糖タンパク質は、前記ラブリシン糖タンパク質１ｍｇあたり約１０μｇ以下のＮＧＮＡを含む、請求項１～２７のいずれか一項に記載の方法。
29. 前記ラブリシン糖タンパク質は、前記ラブリシン糖タンパク質１ｍｇあたり約１００μｇ以上のＧａｌを含む、請求項１～２８のいずれか一項に記載の方法。
30. 前記ラブリシン糖タンパク質は、前記ラブリシン糖タンパク質１ｍｇあたり約１００μｇ以上のＧａｌＮＡｃを含む、請求項１～２９のいずれか一項に記載の方法。
31. 請求項１～３０のいずれか一項に記載の方法によって得られる組み換えラブリシン糖タンパク質。
32. 請求項３０に記載の組み換えラブリシン糖タンパク質、及び薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
33. 前記医薬組成物の純度は、逆相クロマトグラフィー（ＲＰＣ）によって決定され９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上である、請求項３２に記載の医薬組成物。
34. １％未満の前記組み換えラブリシン糖タンパク質の凝集体を含む、請求項３２又は３２に記載の医薬組成物。
35. １％未満の前記組み換えラブリシン糖タンパク質の断片を含む、請求項３２～３４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
36. ≦１，０００ｎｇの宿主細胞タンパク質／ｍｇの組み換えラブリシン糖タンパク質（ｎｇ／ｍｇ）、≦９００ｎｇ／ｍｇ、≦８００ｎｇ／ｍｇ、≦７００ｎｇ／ｍｇ、≦６００ｎｇ／ｍｇ、≦５００ｎｇ／ｍｇ、≦４００ｎｇ／ｍｇ、≦３００ｎｇ／ｍｇ、≦２５０ｎｇ／ｍｇ、≦２００ｎｇ／ｍｇ、≦１５０ｎｇ／ｍｇ、又は≦１００ｎｇ／ｍｇを含む、請求項３２～３４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
37. ≦１０，０００ｐｇの宿主細胞ＤＮＡ／ｍｇの組み換えラブリシン糖タンパク質（ｐｇ／ｍｇ）、≦５，０００ｐｇ／ｍｇ、≦１，０００ｐｇ／ｍｇ、≦５００ｐｇ／ｍｇ、≦１００ｐｇ／ｍｇ、≦５０ｐｇ／ｍｇ、≦１０ｐｇ／ｍｇ、又は≦５ｐｇ／ｍｇを含む、請求項３２～３６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
38. 細菌エンドトキシン試験法（ＢＥＴ）によって決定され、８エンドトキシン単位（ＥＵ）／ｍＬ未満、１ＥＵ／ｍＬ未満、０．１ＥＵ／ｍＬ未満、又は０．０１ＥＵ／ｍＬ未満を含む、請求項３２～３６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
39. １コロニー形成単位（ＣＦＵ）／ｍＬ未満、１ＣＦＵ／２ｍｌ未満、１ＣＦＵ／３ｍｌ未満、１ＣＦＵ／４ｍｌ未満、１ＣＦＵ／５ｍｌ未満、１ＣＦＵ／６ｍｌ未満、１ＣＦＵ／７ｍｌ未満、１ＣＦＵ／８ｍｌ未満、１ＣＦＵ／９ｍｌ未満、又は１ＣＦＵ／１０ｍｌ未満の総好気性微生物数（ＴＡＭＣ）を有する、請求項３２～３８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
40. １コロニー形成単位（ＣＦＵ）／ｍＬ未満、１ＣＦＵ／２ｍｌ未満、１ＣＦＵ／３ｍｌ未満、１ＣＦＵ／４ｍｌ未満、１ＣＦＵ／５ｍｌ未満、１ＣＦＵ／６ｍｌ未満、１ＣＦＵ／７ｍｌ未満、１ＣＦＵ／８ｍｌ未満、１ＣＦＵ／９ｍｌ未満、又は１ＣＦＵ／１０ｍｌ未満の総真菌数（ＴＹＭＣ）を有する、請求項３２～３８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
41. 前記組成物は、５℃で少なくとも２４ヶ月間安定している、請求項３２～４０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
42. 前記組成物は、２５℃で少なくとも１ヶ月間安定している、請求項３２～４０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
43. 前記組成物は、約０．１５ｍｇの組み換えラブリシン糖タンパク質／ｍｌ（ｍｇ／ｍｌ）、約０．２０ｍｇ／ｍｌ、約０．２５ｍｇ／ｍｌ、約０．３０ｍｇ／ｍｌ、約０．３５ｍｇ／ｍｌ、約０．４０ｍｇ／ｍｌ、約０．４５ｍｇ／ｍｌ、約０．５０ｍｇ／ｍｌ、約０．５５ｍｇ／ｍｌ、約０．６０ｍｇ／ｍｌ、約０．７０ｍｇ／ｍｌ、約０．８ｍｇ／ｍｌ、約０．９ｍｇ／ｍｌ、約１．０ｍｇ／ｍｌ、約１．５ｍｇ／ｍｌ、約１．６ｍｇ／ｍｌ、約１．７ｍｇ／ｍｌ、約１．８ｍｇ／ｍｌ、約１．９ｍｇ／ｍｌ、約２．０ｍｇ／ｍｌ、約２．１ｍｇ／ｍｌ、約２．２ｍｇ／ｍｌ、約２．３ｍｇ／ｍｌ、約２．４ｍｇ／ｍｌ、約２．５ｍｇ／ｍｌ、約２．６ｍｇ／ｍｌ、約２．７ｍｇ／ｍｌ、約２．８ｍｇ／ｍｌ、約２．９ｍｇ／ｍｌ、約３．０ｍｇ／ｍｌ、約３．５ｍｇ／ｍｌ、約４．０ｍｇ／ｍｌ、約０．１５ｍｇ／ｍｌ～約３．０ｍｇ／ｍｌ、約０．４５ｍｇ／ｍｌ～約３．０ｍｇ／ｍｌ、約０．１５ｍｇ／ｍｌ～約０．４５ｍｇ／ｍｌ、約１．５ｍｇ／ｍｌ～約３．０ｍｇ／ｍｌ、約１．５ｍｇ／ｍｌ～約３．５ｍｇ／ｍｌ、約２．０ｍｇ／ｍｌ～約３．０ｍｇ／ｍｌ、約１．５ｍｇ／ｍｌ～約２．５ｍｇ／ｍｌ、又は約２．０ｍｇ／ｍｌ～約４．０ｍｇ／ｍｌの初期濃度を有する、請求項３２～４２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
44. 請求項３２～４２のいずれか一項に記載の医薬組成物を患者に投与する工程を含む、眼表面障害を治療するための方法。
45. 前記眼表面障害はドライアイ疾患である、請求項４４に記載の方法。

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