CN104136461B - Cd27l抗原结合蛋白 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及CD27L抗原结合蛋白、此类抗体、编码所述CD271抗原结合蛋白的多核苷酸、抗体药物缀合物组合物以及诊断和治疗与CD27L表达相关的疾病的方法。

Description

CD27L抗原结合蛋白
相关申请
本申请要求2011年9月22日提交的美国临时申请No.61/538,024的权益，其内容据此通过引用方式整体并入。
本申请连同序列表以电子格式提交。序列表以标题为A-1437-US-NP(US Non-Prov)_ST25.txt的文件提供，它在2012年9月17日生成，大小为94.3KB。序列表的电子格式中信息通过引用方式整体并入本文。
发明领域
本发明的领域涉及包含能够结合CD27L的抗体的抗原结合蛋白的组合物、以及相关的方法。
背景
CD27L(CD70，TNFSF7)是II型内在膜蛋白，它在正常组织上的表达高度限制在活化的T和B细胞的亚组、树状细胞和在胸腺上皮中细胞的少量亚组。通过CD27L与它的受体CD27结合来介导CD27L的生物功能，其包括增强或者调节免疫应答，所述CD27主要表达在淋巴样细胞上。CD27L/CD27相互作用调节B-细胞增殖和分化以及T-细胞共同刺激/活化。在CD27缺陷的小鼠中CD27L/CD27相互作用的破坏没有导致缺少免疫攻击(immune challenge)的任何表型(Grewal，Expert Opin.Ther.Targets.12，341-351(2008))。
除了在正常组织上它非常有限的表达，CD27L在一些B细胞非霍奇金氏淋巴瘤(B-NHL)肿瘤亚型中、在前-B细胞急性淋巴细胞性白血病(ALL)中和在B细胞型-慢性淋巴细胞性白血病(B-CLL)中表达相对较高水平。在肾细胞癌(RCC)中也观察到CD27L的异常表达，但在正常肾脏或者其它正常组织中未观察到。因此，CD27L近似表现出与“肿瘤特异性抗原”的那些性质一致的性质(Grewal，Expert Opin.Ther.Targets.12，341-351(2008))。
每年，在美国约49,000名患者患上RCC，他们中超过40,000多人被诊断为ccRCC(American Cancer Society：Cancer Facts and Figures final(2008)。尽管在最近4年已经证实RCC的一些较新治疗方法，但是具有转移性RCC的患者的5年存活率依然维持在10-20％的较低水平下(National Caner Institute.SEER cancer statistics fact sheet：cancer of the kidney and renal pelvis--2008年存取)，因而仍然存在显著未得到满足的医疗需求。预期表达CD27L的每年新诊断出ccRCC患者(美国)的预计数量为约36,000。目前预估有64,000名具有活动性疾病的ccRCC患者。
在报道异常表达CD27L的B细胞恶性肿瘤中，弥散性大细胞B细胞淋巴瘤(DLBCL)的B-NHL亚组和滤泡性淋巴瘤(FL)显示如使用经验证的抗体在冷冻的切片上通过IHC所证实的最高表达的发生率，其范围为FL的33％至DLBCL的71％(Lens等人，Brit.J.Hematol.106，491-503(1999)。如在冷冻的肿瘤切片上通过IHC或者在循环肿瘤细胞上通过流式细胞计量术评估，50-89％的B-CLL肿瘤也表达CD27L(Ranheim等人，Blood85，3556-3565(1965)；Trentin等人，Cancer Res.57，4940-4947(1997))。
在美国目前具有活性B-NHL的127,000名患者中，约50％这些患者表现出DLBCL(中间等级)亚型(Morton等人，Blood107，265-276(2002))。尽管有用于DLBCL患者的护理治疗标准的利妥昔单抗(Rituxan)以及环磷酰胺、阿霉素、长春新碱、强的松(CHOP)，但是几乎50％会复发。因此，在该疾病中，仍然也有未满足的医疗需求。
概述
本发明提供抗-CD27L抗原结合蛋白，例如，抗体及其功能片段。抗-CD27L抗原结合蛋白特别用于治疗与异常细胞增殖(例如，癌症)和/或炎症相关的疾病和疾患的方法中。
在第一方面中，CD27L抗原结合蛋白包含：a)与SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69或者SEQ ID NO：70表示的氨基酸序列具有至少90％同一性、至少95％同一性或者相同的轻链可变结构域；b)与SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23或者SEQ ID NO：24表示的氨基酸序列具有至少90％同一性、至少95％同一性或者相同的重链可变结构域；或者c)a)的轻链可变结构域和b)的重链可变结构域。
第一方面的优选抗原结合蛋白包括包含与SEQ ID NO：63表示的氨基酸序列具有至少90％、至少95％同一性或者相同的轻链可变结构域和与SEQ ID NO：17表示的氨基酸序列具有至少90％、至少95％同一性或者相同的重链可变结构域的那些；包含与SEQ ID NO：64表示的氨基酸序列具有至少90％、至少95％同一性或者相同的轻链可变结构域和与SEQID NO：18表示的氨基酸序列具有至少90％、至少95％同一性或者相同的重链可变结构域的那些；包含与SEQ ID NO：65表示的氨基酸序列具有至少90％、至少95％同一性或者相同的轻链可变结构域和与SEQ ID NO：19表示的氨基酸序列具有至少90％、至少95％同一性或者相同的重链可变结构域的那些；包含与SEQ ID NO：66表示的氨基酸序列具有至少90％、至少95％同一性或者相同的轻链可变结构域和与SEQ ID NO：20表示的氨基酸序列具有至少90％、至少95％同一性或者相同的重链可变结构域的那些；包含与SEQ ID NO：67表示的氨基酸序列具有至少90％、至少95％同一性或者相同的轻链可变结构域和与SEQ ID NO：21表示的氨基酸序列具有至少90％、至少95％同一性或者相同的重链可变结构域的那些；包含与SEQ ID NO：68表示的氨基酸序列具有至少90％、至少95％同一性或者相同的轻链可变结构域和与SEQ ID NO：22表示的氨基酸序列具有至少90％、至少95％同一性或者相同的重链可变结构域的那些；包含与SEQ ID NO：69表示的氨基酸序列具有至少90％、至少95％同一性或者相同的轻链可变结构域和与SEQ ID NO：23表示的氨基酸序列具有至少90％、至少95％同一性或者相同的重链可变结构域的那些；以及包含与SEQ ID NO：70表示的氨基酸序列具有至少90％、至少95％同一性或者相同的轻链可变结构域和与SEQ ID NO：24表示的氨基酸序列具有至少90％、至少95％同一性或者相同的重链可变结构域的那些。
在第二方面中，CD27L抗原结合蛋白包含：a)与SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69或者SEQ ID NO：70表示的氨基酸序列具有不超过十个或不超过五个氨基酸添加、缺失或置换的轻链可变结构域；b)与SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQID NO：22、SEQ ID NO：23或者SEQ ID NO：24表示的氨基酸序列具有不超过十个或不超过五个氨基酸添加、缺失或置换的重链可变结构域；或者c)a)的轻链可变结构域和b)的重链可变结构域。
第二方面的优选抗原结合蛋白包括包含与SEQ ID NO：63表示的氨基酸序列具有不超过十个或不超过五个氨基酸添加、缺失或置换的轻链可变结构域和与SEQ ID NO：17表示的氨基酸序列具有不超过十个或不超过五个氨基酸添加、缺失或置换的重链可变结构域的那些；包含与SEQ ID NO：64表示的氨基酸序列具有不超过十个或不超过五个氨基酸添加、缺失或置换的轻链可变结构域和与SEQ ID NO：18表示的氨基酸序列具有不超过十个或不超过五个氨基酸添加、缺失或置换的重链可变结构域的那些；包含与SEQ ID NO：65表示的氨基酸序列具有不超过十个或不超过五个氨基酸添加、缺失或置换的轻链可变结构域和与SEQ ID NO：19表示的氨基酸序列具有不超过十个或不超过五个氨基酸添加、缺失或置换的重链可变结构域的那些；包含与SEQ ID NO：66表示的氨基酸序列具有不超过十个或不超过五个氨基酸添加、缺失或置换的轻链可变结构域和与SEQ ID NO：20表示的氨基酸序列具有不超过十个或不超过五个氨基酸添加、缺失或置换的重链可变结构域的那些；包含与SEQID NO：67表示的氨基酸序列具有不超过十个或不超过五个氨基酸添加、缺失或置换的轻链可变结构域和与SEQ ID NO：21表示的氨基酸序列具有不超过十个或不超过五个氨基酸添加、缺失或置换的重链可变结构域的那些；包含与SEQ ID NO：68表示的氨基酸序列具有不超过十个或不超过五个氨基酸添加、缺失或置换的轻链可变结构域和与SEQ ID NO：22表示的氨基酸序列具有不超过十个或不超过五个氨基酸添加、缺失或置换的重链可变结构域的那些；包含与SEQ ID NO：69表示的氨基酸序列具有不超过十个或不超过五个氨基酸添加、缺失或置换的轻链可变结构域和与SEQ ID NO：23表示的氨基酸序列具有不超过十个或不超过五个氨基酸添加、缺失或置换的重链可变结构域的那些；以及包含与SEQ ID NO：70表示的氨基酸序列具有不超过十个或不超过五个氨基酸添加、缺失或置换的轻链可变结构域和与SEQ ID NO：24表示的氨基酸序列具有不超过十个或不超过五个氨基酸添加、缺失或置换的重链可变结构域的那些。
在第三方面中，CD27L抗原结合蛋白包含轻链可变结构域和重链可变结构域，该轻链可变结构域包含：a)与SEQ ID NO：71表示的LCDR1序列具有不超过三个氨基酸添加、缺失或置换的LCDR1；与SEQ ID NO：79表示的LCDR2序列具有不超过三个氨基酸添加、缺失或置换的LCDR2；以及与SEQ ID NO：87表示的LCDR3序列具有不超过三个氨基酸添加、缺失或置换的LCDR3；b)与SEQ ID NO：72表示的LCDR1序列具有不超过三个氨基酸添加、缺失或置换的LCDR1；与SEQ ID NO：80表示的LCDR2序列具有不超过三个氨基酸添加、缺失或置换的LCDR2；以及与SEQ ID NO：88表示的LCDR3序列具有不超过三个氨基酸添加、缺失或置换的LCDR3；c)与SEQ ID NO：73表示的LCDR1序列具有不超过三个氨基酸添加、缺失或置换的LCDR1；与SEQ ID NO：81表示的LCDR2序列具有不超过三个氨基酸添加、缺失或置换的LCDR2；以及与SEQ ID NO：89表示的LCDR3序列具有不超过三个氨基酸添加、缺失或置换的LCDR3；d)与SEQ ID NO：74表示的LCDR1序列具有不超过三个氨基酸添加、缺失或置换的LCDR1；与SEQ ID NO：82表示的LCDR2序列具有不超过三个氨基酸添加、缺失或置换的LCDR2；以及与SEQ ID NO：90表示的LCDR3序列具有不超过三个氨基酸添加、缺失或置换的LCDR3；e)与SEQ ID NO：75表示的LCDR1序列具有不超过三个氨基酸添加、缺失或置换的LCDR1；与SEQ ID NO：83表示的LCDR2序列具有不超过三个氨基酸添加、缺失或置换的LCDR2；以及与SEQ ID NO：91表示的LCDR3序列具有不超过三个氨基酸添加、缺失或置换的LCDR3；f)与SEQ ID NO：76表示的LCDR1序列具有不超过三个氨基酸添加、缺失或置换的LCDR1；与SEQ ID NO：84表示的LCDR2序列具有不超过三个氨基酸添加、缺失或置换的LCDR2；以及与SEQ ID NO：92表示的LCDR3序列具有不超过三个氨基酸添加、缺失或置换的LCDR3；g)与SEQ ID NO：77表示的LCDR1序列具有不超过三个氨基酸添加、缺失或置换的LCDR1；与SEQ ID NO：85表示的LCDR2序列具有不超过三个氨基酸添加、缺失或置换的LCDR2；以及与SEQ ID NO：93表示的LCDR3序列具有不超过三个氨基酸添加、缺失或置换的LCDR3；或者h)与SEQ ID NO：78表示的LCDR1序列具有不超过三个氨基酸添加、缺失或置换的LCDR1；与SEQ ID NO：86表示的LCDR2序列具有不超过三个氨基酸添加、缺失或置换的LCDR2；以及与SEQ ID NO：94表示的LCDR3序列具有不超过三个氨基酸添加、缺失或置换的LCDR3；和所述重链可变结构域包含：i)与SEQ ID NO：25表示的HCDR1序列具有不超过三个氨基酸添加、缺失或置换的HCDR1；与SEQ ID NO：33表示的HCDR2序列具有不超过三个氨基酸添加、缺失或置换的HCDR2；以及与SEQ ID NO：41表示的HCDR3序列具有不超过三个氨基酸添加、缺失或置换的HCDR3；j)与SEQ ID NO：26表示的HCDR1序列具有不超过三个氨基酸添加、缺失或置换的HCDR1；与SEQ ID NO：34序列表示的HCDR2序列具有不超过三个氨基酸添加、缺失或置换的HCDR2；以及与SEQ ID NO：42表示的HCDR3序列具有不超过三个氨基酸添加、缺失或置换的HCDR3；k)与SEQ ID NO：27表示的HCDR1序列具有不超过三个氨基酸添加、缺失或置换的HCDR1；与SEQ ID NO：35表示的HCDR2序列具有不超过三个氨基酸添加、缺失或置换的HCDR2；以及与SEQ ID NO：43表示的HCDR3序列具有不超过三个氨基酸添加、缺失或置换的HCDR3；1)与SEQ ID NO：28表示的HCDR1序列具有不超过三个氨基酸添加、缺失或置换的HCDR1；与SEQ ID NO：36表示的HCDR2序列具有不超过三个氨基酸添加、缺失或置换的HCDR2；以及与SEQ ID NO：44表示的HCDR3序列具有不超过三个氨基酸添加、缺失或置换的HCDR3；m)与SEQ ID NO：29表示的HCDR1序列具有不超过三个氨基酸添加、缺失或置换的HCDR1；与SEQ ID NO：37表示的HCDR2序列具有不超过三个氨基酸添加、缺失或置换的HCDR2；以及与SEQ ID NO：45表示的HCDR3序列具有不超过三个氨基酸添加、缺失或置换的HCDR3；n)与SEQ ID NO：30表示的HCDR1序列具有不超过三个氨基酸添加、缺失或置换的HCDR1；与SEQ ID NO：38表示的HCDR2序列具有不超过三个氨基酸添加、缺失或置换的HCDR2；以及与SEQ ID NO：46表示的HCDR3序列具有不超过三个氨基酸添加、缺失或置换的HCDR3；o)与SEQ ID NO：31表示的HCDR1序列具有不超过三个氨基酸添加、缺失或置换的HCDR1；与SEQ ID NO：39表示的HCDR2序列具有不超过三个氨基酸添加、缺失或置换的HCDR2；以及与SEQ ID NO：47表示的HCDR3序列具有不超过三个氨基酸添加、缺失或置换的HCDR3；或者p)与SEQ ID NO：32表示的HCDR1序列具有不超过三个氨基酸添加、缺失或置换的HCDR1；与SEQ ID NO：40表示的HCDR2序列具有不超过三个氨基酸添加、缺失或置换的HCDR2；以及与SEQ ID NO：48表示的HCDR3序列具有不超过三个氨基酸添加、缺失或置换的HCDR3。
第三方面的优选CD27L抗原结合蛋白包括包含a)的轻链可变结构域和i)的重链可变结构域的那些；包含b)的轻链可变结构域和j)的重链可变结构域的那些；包含c)的轻链可变结构域和k)的重链可变结构域的那些；包含d)的轻链可变结构域和1)的重链可变结构域的那些；包含e)的轻链可变结构域和m)的重链可变结构域的那些；包含f)的轻链可变结构域和n)的重链可变结构域的那些；包含g)的轻链可变结构域和o)的重链可变结构域的那些；以及包含h)的轻链可变结构域和p)的重链可变结构域的那些。
在本发明的第四方面中，第一、第二或第三方面的CD27L抗原结合蛋白以小于或等于2x10-11M的亲和力结合人CD27L。
在本发明的第五方面中，第一、第二、第三或第四方面的CD27L抗原结合蛋白抑制CD27L与CD27的结合。
在本发明的第六方面中，第一、第二、第三、第四或第五方面的CD27L抗原结合蛋白为抗体，例如人抗体。优选的抗体包括包含具有SEQ ID：56表示的氨基酸序列的轻链和具有SEQ ID NO：10表示的氨基酸序列的重链的那些抗体；包含具有SEQ ID：57表示的氨基酸序列的轻链和具有SEQ ID NO：11表示的氨基酸序列的重链的那些；包含具有SEQ ID：58表示的氨基酸序列的轻链和具有SEQ ID NO：12表示的氨基酸序列的重链的那些；包含具有SEQID：59表示的氨基酸序列的轻链和具有SEQ ID NO：13表示的氨基酸序列的重链的那些；包含具有SEQ ID：60表示的氨基酸序列的轻链和具有SEQ ID NO：14表示的氨基酸序列的重链的那些；包含具有SEQ ID：61表示的氨基酸序列的轻链和具有SEQ ID NO：15表示的氨基酸序列的重链的那些；以及包含具有SEQ ID：62表示的氨基酸序列的轻链和具有SEQ ID NO：16表示的氨基酸序列的重链的那些。
在第七方面中，第一、第二、第三、第四、第五或第六方面的CD27L抗原结合蛋白与药物或化疗剂缀合。在优选的实施方案中，使用接头，使药物或化疗剂与抗原结合蛋白(例如抗体)缀合。优选的接头包括不可裂解的接头，例如MCC。优选的化疗剂为DM1。因此，在特别优选的实施方案中，第七方面提供通过MCC接头与DM1缀合的第一、第二、第三、第四、第五或第六方面的CD27L抗原结合蛋白，该MCC接头附接一个或多个赖氨酸残基。
使DM1与CD27L抗原结合蛋白(例如抗体)缀合的方法产生包含与DM1-缀合的抗体群的组合物，每个抗体具有一定范围的DM1分子。可以测定组合物的平均数。在优选的实施方案中，每个CD27L抗原结合蛋白(例如抗体)的DM1分子的平均数介于1和10之间、介于3和7之间或者介于4和6之间。在优选的实施方案中，本发明的第一、第二、第三、第四、第五、第六或第七方面的CD27L抗原结合蛋白的组合物具有约4.0、约4.1、约4.2、约4.3、约4.4、约4.5、约4.6、约4.7、约4.8、约4.9、约5.0、约5.1、约5.2、约5.3、约5.4、约5.5、约5.6、约5.7、约5.8、约5.9或约6.0的每个CD27L抗原结合蛋白的DM1分子的平均数。这些组合物可含有治疗有效量的CD27L抗原结合蛋白以及可被冻干。
在第八方面中，本发明提供编码CD27L抗原结合蛋白的一种或多种多肽组分的分离的核酸，例如，抗体轻链或抗体重链。在优选的实施方案中，核酸编码多肽，该多肽包含：
a)与SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69或者SEQ ID NO：70表示的氨基酸序列具有至少95％同一性的轻链可变结构域；
b)与SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23或者SEQ ID NO：24表示的氨基酸序列具有至少95％同一性的重链可变结构域；
c)与SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69或者SEQ ID NO：70表示的氨基酸序列具有不超过五个氨基酸添加、缺失或置换的轻链可变结构域；
d)与SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23或者SEQ ID NO：24表示的氨基酸序列具有不超过五个氨基酸添加、缺失或置换的重链可变结构域；
e)轻链可变结构域，其包含：
i)与SEQ ID NO：71表示的LCDR1序列具有不超过三个氨基酸添加、缺失或置换的LCDR1；与SEQ ID NO：79表示的LCDR2序列具有不超过三个氨基酸添加、缺失或置换的LCDR2；以及与SEQ ID NO：87表示的LCDR3序列具有不超过三个氨基酸添加、缺失或置换的LCDR3；
ii)与SEQ ID NO：72表示的LCDR1序列具有不超过三个氨基酸添加、缺失或置换的LCDR1；与SEQ ID NO：80表示的LCDR2序列具有不超过三个氨基酸添加、缺失或置换的LCDR2；以及与SEQ ID NO：88表示的LCDR3序列具有不超过三个氨基酸添加、缺失或置换的LCDR3；
iii)与SEQ ID NO：73表示的LCDR1序列具有不超过三个氨基酸添加、缺失或置换的LCDR1；与SEQ ID NO：81表示的LCDR2序列具有不超过三个氨基酸添加、缺失或置换的LCDR2；以及与SEQ ID NO：89表示的LCDR3序列具有不超过三个氨基酸添加、缺失或置换的LCDR3；
iv)与SEQ ID NO：74表示的LCDR1序列具有不超过三个氨基酸添加、缺失或置换的LCDR1；与SEQ ID NO：82表示的LCDR2序列具有不超过三个氨基酸添加、缺失或置换的LCDR2；以及与SEQ ID NO：90表示的LCDR3序列具有不超过三个氨基酸添加、缺失或置换的LCDR3；
v)与SEQ ID NO：75表示的LCDR1序列具有不超过三个氨基酸添加、缺失或置换的LCDR1；与SEQ ID NO：83表示的LCDR2序列具有不超过三个氨基酸添加、缺失或置换的LCDR2；以及与SEQ ID NO：91表示的LCDR3序列具有不超过三个氨基酸添加、缺失或置换的LCDR3；
vi)与SEQ ID NO：76表示的LCDR1序列具有不超过三个氨基酸添加、缺失或置换的LCDR1；与SEQ ID NO：84表示的LCDR2序列具有不超过三个氨基酸添加、缺失或置换的LCDR2；以及与SEQ ID NO：92表示的LCDR3序列具有不超过三个氨基酸添加、缺失或置换的LCDR3；
vii)与SEQ ID NO：77表示的LCDR1序列具有不超过三个氨基酸添加、缺失或置换的LCDR1；与SEQ ID NO：85表示的LCDR2序列具有不超过三个氨基酸添加、缺失或置换的LCDR2；以及与SEQ ID NO：93表示的LCDR3序列具有不超过三个氨基酸添加、缺失或置换的LCDR3；或者
viii)与SEQ ID NO：78表示的LCDR1序列具有不超过三个氨基酸添加、缺失或置换的LCDR1；与SEQ ID NO：86表示的LCDR2序列具有不超过三个氨基酸添加、缺失或置换的LCDR2；以及与SEQ ID NO：94表示的LCDR3序列具有不超过三个氨基酸添加、缺失或置换的LCDR3；或者
f)重链可变结构域，其包含：
i)与SEQ ID NO：25表示的HCDR1序列具有不超过三个氨基酸添加、缺失或置换的HCDR1；与SEQ ID NO：33表示的HCDR2序列具有不超过三个氨基酸添加、缺失或置换的HCDR2；以及与SEQ ID NO：41表示的HCDR3序列具有不超过三个氨基酸添加、缺失或置换的HCDR3；
ii)与SEQ ID NO：26表示的HCDR1序列具有不超过三个氨基酸添加、缺失或置换的HCDR1；与SEQ ID NO：34序列表示的HCDR2序列具有不超过三个氨基酸添加、缺失或置换的HCDR2；以及与SEQ ID NO：42表示的HCDR3序列具有不超过三个氨基酸添加、缺失或置换的HCDR3；
iii)与SEQ ID NO：27表示的HCDR1序列具有不超过三个氨基酸添加、缺失或置换的HCDR1；与SEQ ID NO：35表示的HCDR2序列具有不超过三个氨基酸添加、缺失或置换的HCDR2；以及与SEQ ID NO：43表示的HCDR3序列具有不超过三个氨基酸添加、缺失或置换的HCDR3；
iv)与SEQ ID NO：28表示的HCDR1序列具有不超过三个氨基酸添加、缺失或置换的HCDR1；与SEQ ID NO：36表示的HCDR2序列具有不超过三个氨基酸添加、缺失或置换的HCDR2；以及与SEQ ID NO：44表示的HCDR3序列具有不超过三个氨基酸添加、缺失或置换的HCDR3；
v)与SEQ ID NO：29表示的HCDR1序列具有不超过三个氨基酸添加、缺失或置换的HCDR1；与SEQ ID NO：37表示的HCDR2序列具有不超过三个氨基酸添加、缺失或置换的HCDR2；以及与SEQ ID NO：45表示的HCDR3序列具有不超过三个氨基酸添加、缺失或置换的HCDR3；
vi)与SEQ ID NO：30表示的HCDR1序列具有不超过三个氨基酸添加、缺失或置换的HCDR1；与SEQ ID NO：38表示的HCDR2序列具有不超过三个氨基酸添加、缺失或置换的HCDR2；以及与SEQ ID NO：46表示的HCDR3序列具有不超过三个氨基酸添加、缺失或置换的HCDR3；
vii)与SEQ ID NO：31表示的HCDR1序列具有不超过三个氨基酸添加、缺失或置换的HCDR1；与SEQ ID NO：39表示的HCDR2序列具有不超过三个氨基酸添加、缺失或置换的HCDR2；以及与SEQ ID NO：47表示的HCDR3序列具有不超过三个氨基酸添加、缺失或置换的HCDR3；或者
viii)与SEQ ID NO：32表示的HCDR1序列具有不超过三个氨基酸添加、缺失或置换的HCDR1；与SEQ ID NO：40表示的HCDR2序列具有不超过三个氨基酸添加、缺失或置换的HCDR2；以及与SEQ ID NO：48表示的HCDR3序列具有不超过三个氨基酸添加、缺失或置换的HCDR3。
在第八方面的某些实施方案中，多肽编码抗体轻链并且与SEQ ID NO：49、SEQ IDNO：50、SEQ ID NO：51、SEQ ID NO：52、SEQ ID NO：53、SEQ ID NO：54或者SEQ ID NO：55表示的核苷酸序列具有至少80％、至少90％、至少95％或者100％同一性。在第八方面的其它实施方案中，多肽编码抗体重链并且与SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8或者SEQ ID NO：9表示的核苷酸序列具有至少80％、至少90％、至少95％或者100％同一性。
在第九方面中，本发明提供包含一种或多种第八方面的分离的核酸的表达载体。在某些实施方案中，表达载体编码抗体轻链、抗体重链或者抗体轻链和重链两者。
在第十方面中，本发明提供重组宿主细胞，该重组宿主细胞包含可操作连接启动子的一种或多种第八方面的分离的核酸；该重组宿主细胞包括包含一种或多种本发明的第九方面的表达载体的重组宿主细胞。在优选的实施方案中，重组宿主细胞分泌结合CD27L的抗体。优选的宿主细胞为哺乳动物宿主细胞，包括CHO细胞系。
在第十一方面，本发明提供通过使接头和药物(例如，化疗剂)与第一、第二、第三、第四、第五或第六方面的CD27L抗原结合蛋白的任一种缀合制备第七方面的CD27L抗体药物缀合物的方法。接头和药物可首先连接，然后与CD27L抗原结合蛋白缀合；或者接头可首先与CD27L抗原结合蛋白缀合，然后连接药物。在优选的实施方案中，接头为MCC和药物为DM1。在特别优选的实施方案中，CD27L抗原结合蛋白为包含如SEQ ID NO：63表示的轻链可变结构域氨基酸序列和如SEQ ID NO：17表示的重链可变结构域氨基酸序列的抗体(例如，Ab1)；包含如SEQ ID NO：64表示的轻链可变结构域氨基酸序列和如SEQ ID NO：18表示的重链可变结构域氨基酸序列的抗体(例如，Ab2)；包含如SEQ ID NO：65表示的轻链可变结构域氨基酸序列和如SEQ ID NO：19表示的重链可变结构域氨基酸序列的抗体(例如，Ab3)；包含如SEQ ID NO：66表示的轻链可变结构域氨基酸序列和如SEQ ID NO：20表示的重链可变结构域氨基酸序列的抗体(例如，Ab4)；包含如SEQ ID NO：67表示的轻链可变结构域氨基酸序列和如SEQ ID NO：21表示的重链可变结构域氨基酸序列的抗体(例如，Ab5)；包含如SEQ IDNO：68表示的轻链可变结构域氨基酸序列和如SEQ ID NO：22表示的重链可变结构域氨基酸序列的抗体(例如，Ab6)；包含如SEQ ID NO：69表示的轻链可变结构域氨基酸序列和如SEQID NO：23表示的重链可变结构域氨基酸序列的抗体(例如，Ab7)；或者包含如SEQ ID NO：70表示的轻链可变结构域氨基酸序列和如SEQ ID NO：24表示的重链可变结构域氨基酸序列的抗体(例如，Ab8)，该抗体通过MCC来与DM1缀合，即通过在抗体内的一个或多个赖氨酸残基与MCC或MCC-DM1化学反应。
在第十二方面中，本发明提供治疗癌症的方法，它包括向患者施用治疗有效量的组合物，该组合物包含治疗有效量的第一、第二、第三、第四、第五或第六方面的CD27L抗原结合蛋白。在优选的实施方案中，CD27L抗原结合蛋白为包含如SEQ ID NO：63表示的轻链可变结构域氨基酸序列和如SEQ ID NO：17表示的重链可变结构域氨基酸序列的抗体(例如，Ab1)；包含如SEQ ID NO：64表示的轻链可变结构域氨基酸序列和如SEQ ID NO：18表示的重链可变结构域氨基酸序列的抗体(例如，Ab2)；包含如SEQ ID NO：65表示的轻链可变结构域氨基酸序列和如SEQ ID NO：19表示的重链可变结构域氨基酸序列的抗体(例如，Ab3)；包含如SEQ ID NO：66表示的轻链可变结构域氨基酸序列和如SEQ ID NO：20表示的重链可变结构域氨基酸序列的抗体(例如，Ab4)；包含如SEQ ID NO：67表示的轻链可变结构域氨基酸序列和如SEQ ID NO：21表示的重链可变结构域氨基酸序列的抗体(例如，Ab5)；包含如SEQ IDNO：68表示的轻链可变结构域氨基酸序列和如SEQ ID NO：22表示的重链可变结构域氨基酸序列的抗体(例如，Ab6)；包含如SEQ ID NO：69表示的轻链可变结构域氨基酸序列和如SEQID NO：23表示的重链可变结构域氨基酸序列的抗体(例如，Ab7)；或者如SEQ ID NO：70表示的轻链可变结构域氨基酸序列和如SEQ ID NO：24表示的重链可变结构域氨基酸序列的抗体(例如，Ab8)。在特别优选的实施方案中，CD27L抗原结合蛋白通过接头(MCC)与化疗剂(例如，DM1)缀合。在第十二方面的其它优选实施方案中，抗体包含增强的效应子功能。
在一些实施方案中，向具有肾细胞癌(RCC)、透明细胞RCC、头颈癌、成胶质细胞瘤、乳腺癌、脑肿瘤、鼻咽癌、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、伯基特氏淋巴瘤、间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)、多发性骨髓瘤、皮肤T-细胞淋巴瘤、结节性小卵裂细胞淋巴瘤(nodular small cleaved-cell lymphomas)、淋巴细胞性淋巴瘤、外周T-细胞淋巴瘤、伦南德氏淋巴瘤(Lennert′s lymphomas)、免疫母细胞性淋巴瘤、T-细胞白血病/淋巴瘤(ATLL)、成人T-细胞白血病(T-ALL)、中心母细胞/中心细胞(cb/cc)滤泡性淋巴瘤癌(entroblastic/centrocytic(cb/cc)follicular lymphomacance)、B系弥漫性大细胞淋巴瘤(diffuse large cell lymphoma of B lineage)、血管免疫母细胞性淋巴结病(AILD)样T细胞淋巴瘤(angioimmunoblastic lymphadenopathy(AILD)-like T cell lymphoma)、HIV相关体腔型淋巴瘤(HIV associated body cavitybased lymphoma)、胚胎癌、未分化鼻咽癌(undifferentiated carcinoma of the rhino-pharynx)、卡斯尔曼氏病(Castleman′s disease)、卡波西氏肉瘤(Kaposi′s Sarcoma)、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症(Waldenstrom′s macroglobulinemia)或者其它B细胞淋巴瘤的患者施用CD27L抗原结合蛋白。
在某些实施方案中，在施用CD27L抗原结合蛋白之前将来自患者的样品用于测试CD27L表达。通过测试在样品中编码CD27L的RNA的存在或CD27L蛋白的存在可测定CD27L表达。样品可以为血液样品或者活组织检查。
在第十三方面中，本发明提供治疗自身免疫或炎性疾患的方法，所述方法包括向需要其的患者施用治疗有效量的第一、第二、第三、第四、第五或第六方面的任一种的CD27L抗原结合蛋白。在优选的实施方案中，CD27L抗原结合蛋白为包含如SEQ ID NO：63表示的轻链可变结构域氨基酸序列和如SEQ ID NO：17表示的重链可变结构域氨基酸序列的抗体(例如，Ab1)；包含如SEQ ID NO：64表示的轻链可变结构域氨基酸序列和如SEQ ID NO：18表示的重链可变结构域氨基酸序列的抗体(例如，Ab2)；包含如SEQ ID NO：65表示的轻链可变结构域氨基酸序列和如SEQ ID NO：19表示的重链可变结构域氨基酸序列的抗体(例如，Ab3)；包含如SEQ ID NO：66表示的轻链可变结构域氨基酸序列和如SEQ ID NO：20表示的重链可变结构域氨基酸序列的抗体(例如，Ab4)；包含如SEQ ID NO：67表示的轻链可变结构域氨基酸序列和如SEQ ID NO：21表示的重链可变结构域氨基酸序列的抗体(例如，Ab5)；包含如SEQ ID NO：68表示的轻链可变结构域氨基酸序列和如SEQ ID NO：22表示的重链可变结构域氨基酸序列的抗体(例如，Ab6)；包含如SEQ ID NO：69表示的轻链可变结构域氨基酸序列和如SEQ ID NO：23表示的重链可变结构域氨基酸序列的抗体(例如，Ab7)；或者包含如SEQID NO：70表示的轻链可变结构域氨基酸序列和如SEQ ID NO：24表示的重链可变结构域氨基酸序列的抗体(例如，Ab8)。在优选的实施方案中，CD27L抗原结合蛋白抑制CD27与CD27L的结合。在特别优选的实施方案中，自身免疫或炎性疾患为全身性红斑狼疮(SLE)、胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)、炎性肠道疾病(IBD)、多发性硬化(MS)、牛皮癣、自身免疫性甲状腺炎、类风湿性关节炎(RA)或者肾小球性肾炎。在其它实施方案中，该治疗抑制或预防在患者中移植排斥或移植物抗宿主病。
附图简述
图1.CD27L抗原结合蛋白的示例性实施方案的功能和物理特征的概况。
图2.随着时间的推移(A)Ab4(A4)和Ab8(A8)以及它们的缀合对应物向786-0细胞内的内化水平和速率的测量。
图3.在增加抗链霉抗生素蛋白-MCC-DM1、Ab4-MCC-DM1和Ab8-MCC-DM1浓度下培养786-0细胞4天。使用CELL-TITER-GLO试剂测定对细胞生长的作用，其使用荧光示值读数(luminescent read-out)测定细胞数目。
图4.在786-0异种移植物模型中Ab4-MCC-DM1和Ab8-MCC-DM1的剂量反应。在第24天的静脉内剂量在指示剂量下通过箭头表示。
图5.在Caki-1异种移植物模型中Ab4-MCC-DM1和Ab8-MCC-DM1的剂量反应。通过箭头表示静脉内给药方案。
图6.在Raji异种移植物模型中Ab4-MCC-DM1的剂量反应。通过箭头表示静脉内给药方案。
图7.在786-0异种移植物模型中Ab4-MCC-DM1的不同剂量反应。
图8.针对Raji肿瘤细胞的Ab4-MCC-DM1抗体依赖细胞细胞毒性(ADCC)分析。
图9.针对Raji和786-0肿瘤细胞的Ab4-MCC-DM1抗体依赖细胞吞噬作用(ADCP)分析。
图10.通过掩蔽型(masked)IHC得出“阳性”的主要冷冻肿瘤样品的CD27L表达的比较。结果表明：在ccRCC患者样品中，总体CD27L蛋白表达最高，随后为DLBCL(弥漫性大B细胞淋巴瘤)；B-CLL和FL样品。
图11.CD27L mRNA和蛋白表达分析的结果。结果表明：在RCC、B-NHL和CLL中CD27L表达很普遍。
图12示出在本文中实施例2中描述的Ab-MCC-DM1ADC的结构。
具体实施方案的详细描述
本文所使用的章节标题仅用于组织目的，不应当解释为限制描述的主题。在该说明书的主体内引用的所有参考文献通过引用方式明确地整体并入。
标准技术可用于重组DNA、寡核苷酸合成、组织培养和转化、蛋白纯化等。根据制造商的说明书或者如本领域通常所完成或者如本文所述可进行酶反应和纯化技术。根据本领域众所周知的常见方法和如在说明书整篇中引用和讨论的各种一般和更加具体引用中所述，通常可进行以下程序和技术。参见例如，Sambrook等人，2001，Molecular Cloning：ALaboratory Manuel，第3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，cold SpringHarbor，N.Y.，其通过引用方式并入本文中用于任何目的。除非提供具体定义，则与本文所述的分析化学、有机化学以及医疗和药物化学相关的所用术语以及实验室程序和技术为众所周知和本领域常用的那些。标准技术可用于化学合成、化学分析、药物制备、配制以及患者的递送和治疗。
CD27L
抗原结合蛋白结合CD27L，它也称为CD70和TNFSF7。CD27L首先在美国专利No.5,573,924中描述。本文提供的示例性人CD27L氨基酸序列为SEQ ID NO：1，其对应NCBI参考序列NP_001423.1(GI：4507605)。在某些实施方案中，抗原结合蛋白阻断CD27L与它的受体CD27的相互作用。提供的示例性CD27氨基酸序列为SEQ ID NO：2，其对应Swiss-Prot：P26842.2(GI：269849546)。成熟CD27氨基酸序列对应SEQ ID NO：2的氨基酸20-260。
CD27L抗原结合蛋白
本发明提供特异性结合CD27L的抗原结合蛋白。抗原结合蛋白的实施方案包括特异性结合CD27L的肽和/或多肽。这些肽或多肽可任选包括一种或多种端口-翻译修饰(port-translational modification)。抗原结合蛋白的实施方案包括特异性结合CD27L的如本文各自定义的抗体及其片段。这些包括特异性结合人CD27L的抗体，包括抑制CD27L结合和/或活化CD27的那些抗体。
本发明的抗原结合蛋白特异性结合CD27L。如本文所使用的“特异性结合”是指抗原结合蛋白比其它蛋白优先结合CD27L。在一些实施方案中，“特异性结合”是指相比其它蛋白，CD27L抗原结合蛋白具有对CD27L的更高亲和力。特异性结合CD27L的CD27L抗原结合蛋白可具有对人CD27L的以下结合亲和力：小于或等于1x10-7M、小于或等于2x10-7M、小于或等于3x10-7M、小于或等于4x10-7M、小于或等于5x10-7M、小于或等于6x10-7M、小于或等于7x10- 7M、小于或等于8x10-7M、小于或等于9x10-7M、小于或等于1x10-8M、小于或等于2x10-8M、小于或等于3x10-8M、小于或等于4x10-8M、小于或等于5x10-8M、小于或等于6x10-8M、小于或等于7x10-8M、小于或等于8x10-8M、小于或等于9x10-8M、小于或等于1x10-9M、小于或等于2x10-9M、小于或等于3x10-9M、小于或等于4x10-9M、小于或等于5x10-9M、小于或等于6x10-9M、小于或等于7x10-9M、小于或等于8x10-9M、小于或等于9x10-9M、小于或等于1x10-10M、小于或等于2x10-10M、小于或等于3x10-10M、小于或等于4x10-10M、小于或等于5x10-10M、小于或等于6x10-10M、小于或等于7x10-10M、小于或等于8x10-10M、小于或等于9x10-10M、小于或等于1x10-11M、小于或等于2x10-11M、小于或等于3x10-11M、小于或等于4x10-11M、小于或等于5x10-11M、小于或等于6x10-11M、小于或等于7x10-11M、小于或等于8x10-11M、小于或等于9x10-11M、小于或等于1x10-12M、小于或等于2x10-12M、小于或等于3x10-12M、小于或等于4x10-12M、小于或等于5x10-12M、小于或等于6x10-12M、小于或等于7x10-12M、小于或等于8x10-12M或者小于或等于9x10- 12M。测定抗原结合蛋白的结合亲和力的方法是本领域众所周知的。实施例1提供示例性方法。
应理解，当提及本文CD27L-结合抗体的各个实施方案时，它也涵盖其CD27L-结合片段。CD27L-结合片段包含保留特异性结合CD27L能力的本文所述的任何抗体片段或者结构域。CD27L-结合片段可以在本文所述的任何支架中。
在某些治疗实施方案中，CD27L抗原结合蛋白抑制CD27L与CD27的结合和/或抑制与CD27L和CD27的结合相关的一种或多种生物活性，例如，CD27-介导的信号传导。这些抗原结合蛋白被称为“中和”。在某些实施方案中，中和CD27L抗原结合蛋白特异性结合CD27L和抑制介于10％至100％之间来自任意处的CD27L与CD27的结合，例如抑制了至少约20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％或更多。例如，通过测定抗原结合蛋白阻断CD27-Fc与MP-1细胞的结合能力可测试CD27L抗原结合蛋白的中和能力(Slack等人，Int.Immunol.(1995)7(7)：1087-1092))。
抗原结合蛋白的实施方案包含具有一个或多个互补性决定区(CDR)的如本文各自定义的支架结构。实施方案还包括包含支架结构的抗原结合蛋白，该支架结构具有一个或多个抗体可变结构域(重或轻)。实施方案包括抗体，该抗体包含选自Ab1轻链可变结构域(LCv)、Ab2LCv、Ab3LCv、Ab4LCv、Ab5LCv、Ab6LCv、Ab7LCv和Ab8LCv(分别为SEQ ID NO：63-70)组成的组的轻链可变结构域和/或选自Ab1重链可变结构域(HCv)、Ab2HCv、Ab3HCv、Ab4HCv、Ab5HCv、Ab6HCv、Ab7HCv和Ab8HCv(分别为SEQ ID NO：17-24)组成的组的重链可变结构域、及其片段、衍生物、突变蛋白和变体。
包含Ab1LCv的示例性轻链为包含SEQ ID NO：56表示的氨基酸序列的轻链。
包含Ab2LCv的示例性轻链为包含SEQ ID NO：57表示的氨基酸序列的轻链。
包含Ab4LCv的示例性轻链为包含SEQ ID NO：58表示的氨基酸序列的轻链。
包含Ab5LCv的示例性轻链为包含SEQ ID NO：59表示的氨基酸序列的轻链。
包含Ab6LCv的示例性轻链为包含SEQ ID NO：60表示的氨基酸序列的轻链。
包含Ab7LCv的示例性轻链为包含SEQ ID NO：61表示的氨基酸序列的轻链。
包含Ab8LCv的示例性轻链为包含SEQ ID NO：62表示的氨基酸序列的轻链。
包含Ab1HCv的示例性重链为包含SEQ ID NO：10表示的氨基酸序列的重链。
包含Ab2HCv的示例性重链为包含SEQ ID NO：11表示的氨基酸序列的重链。
包含Ab4HCv的示例性重链为包含SEQ ID NO：12表示的氨基酸序列的重链。
包含Ab5HCv的示例性重链为包含SEQ ID NO：13表示的氨基酸序列的重链。
包含Ab6HCv的示例性重链为包含SEQ ID NO：14表示的氨基酸序列的重链。
包含Ab7HCv的示例性重链为包含SEQ ID NO：15表示的氨基酸序列的重链。
包含Ab8HCv的示例性重链为包含SEQ ID NO：16表示的氨基酸序列的重链。
设想的支架另外的例子包括：纤连蛋白、新制癌菌素CBM4-2、脂质运载蛋白、T-细胞受体、蛋白-A结构域(蛋白Z)、Im9、TPR蛋白、锌指结构域、pVIII、禽胰多肽、GCN4、WW结构域Src同源结构域3、PDZ结构域、TEM-1β-内酰胺酶、硫氧还蛋白、葡萄球菌核酸酶、PHD-指结构域、CL-2、BPTI、APPI、HPSTI、大肠杆菌素(ecotin)、LACI-D1、LDTI、MTI-II、蝎毒素、昆虫抵抗素-A肽、EETI-II、Min-23、CBD、PBP、细胞色素b-562、Ld1受体结构域、γ-晶体蛋白、遍在蛋白、运铁蛋白和/或C-型凝素样结构域。非抗体支架和它们作为治疗方法的用途在Gebauer和Skerra，Curr.Opin.Chem.Biol.，13：245-255(2009)以及Binz等人，Nat.Biotech.，23(10)：1257-1268(2005)中综述，其通过引用方式整体并入本文。
本发明的一些方面包括包含以下可变结构域的抗体：Ab1LCv/Ab1HCv(SEQ ID NO：63/SEQ ID NO：17)、Ab2LCv/Ab2HCv(SEQ ID NO：64/SEQ ID NO：18)、Ab3LCv/Ab3HCv(SEQID NO：65/SEQ ID NO：19)、Ab4LCv/Ab4HCv(SEQ ID NO：66/SEQ ID NO：20)、Ab5LCv/Ab5HCv(SEQ ID NO：67/SEQ ID NO：21)、Ab6LCv/Ab6HCv(SEQ ID NO：68/SEQ ID NO：22)、Ab7LCv/Ab7HCv(SEQ ID NO：69/SEQ ID NO：23)、Ab8LCv/Ab8HCv(SEQ ID NO：70/SEQ ID NO：24)、及其组合、及其片段、衍生物、突变蛋白和变体。
本发明的示例性抗体包括Ab1(SEQ ID NO：56/SEQ ID NO：10)、Ab2(SEQ ID NO：57/SEQ ID NO：11)、Ab4(SEQ ID NO：58/SEQ ID NO：12)、Ab5(SEQ ID NO：59/SEQ ID NO：13)、Ab6(SEQ ID NO：60/SEQ ID NO：14)、Ab7(SEQ ID NO：61/SEQ ID NO：15)、Ab8(SEQ IDNO：62/SEQ ID NO：16)。
通常，抗体轻和重链的各可变结构域包含三种CDR。重链可变结构域包含重链CDR1(HCDR1)、重链CDR2(HCDR2)和重链CDR3(HCDR3)。轻链可变结构域包含轻链CDR1(LCDR1)、轻链CDR2(LCDR2)和轻链CDR3(LCDR3)。在某些实施方案中，抗原结合蛋白包含在本文所述的优选可变结构域内含有的一种或多种CDR。
这些CDR的例子包括但不限于：
Ab1LCv：LCDR1(SEQ ID NO：71)、LCDR2(SEQ ID NO：79)和LCDR3(SEQ ID NO：87)的CDR；
Ab2LCv：LCDR1(SEQ ID NO：72)、LCDR2(SEQ ID NO：80)和LCDR3(SEQ ID NO：88)的CDR；
Ab3LCv：LCDR1(SEQ ID NO：73)、LCDR2(SEQ ID NO：81)和LCDR3(SEQ ID NO：89)的CDR；
Ab4LCv：LCDR1(SEQ ID NO：74)、LCDR2(SEQ ID NO：82)和LCDR3(SEQ ID NO：90)的CDR；
Ab5LCv：LCDR1(SEQ ID NO：75)、LCDR2(SEQ ID NO：83)和LCDR3(SEQ ID NO：91)的CDR；
Ab6LCv：LCDR1(SEQ ID NO：76)、LCDR2(SEQ ID NO：84)和LCDR3(SEQ ID NO：92)的CDR；
Ab7LCv：LCDR1(SEQ ID NO：77)、LCDR2(SEQ ID NO：85)和LCDR3(SEQ ID NO：93)的CDR；
Ab8LCv：LCDR1(SEQ ID NO：78)、LCDR2(SEQ ID NO：86)和LCDR3(SEQ ID NO：94)的CDR；
Ab1HCv：HCDR1(SEQ ID NO：25)、HCDR2(SEQ ID NO：33)和HCDR3(SEQ ID NO：41)的CDR；
Ab2HCv：HCDR1(SEQ ID NO：26)、HCDR2(SEQ ID NO：34)和HCDR3(SEQ ID NO：42)的CDR；
Ab3HCv：HCDR1(SEQ ID NO：27)、HCDR2(SEQ ID NO：35)和HCDR3(SEQ ID NO：43)的CDR；
Ab4HCv：HCDR1(SEQ ID NO：28)、HCDR2(SEQ ID NO：36)和HCDR3(SEQ ID NO：44)的CDR；
Ab5HCv：HCDR1(SEQ ID NO：29)、HCDR2(SEQ ID NO：37)和HCDR3(SEQ ID NO：45)的CDR；
Ab6HCv：HCDR1(SEQ ID NO：30)、HCDR2(SEQ ID NO：38)和HCDR3(SEQ ID NO：46)的CDR；
Ab7HCv：HCDR1(SEQ ID NO：31)、HCDR2(SEQ ID NO：39)和HCDR3(SEQ ID NO：47)的CDR；以及
Ab8HCv：HCDR1(SEQ ID NO：32)、HCDR2(SEQ ID NO：40)和HCDR3(SEQ ID NO：48)的CDR。
在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含：A)包含具有选自SEQ ID NO：71、72、73、74、75、76、77和78组成的组的氨基酸序列的LCDR1；具有选自SEQ ID NO：79、80、81、82、83、84、85和86组成的组的氨基酸序列的LCDR2；和/或具有选自SEQ ID NO：87、88、89、90、91、92、93和94组成的组的氨基酸序列的LCDR3的多肽(例如，轻链)；和/或B)包含具有选自SEQID NO：25、26、27、28、29、30、31和32组成的组的氨基酸序列的HCDR1；具有选自SEQ ID NO：33、34、35、36、37、38、39和40组成的组的氨基酸序列的HCDR2和/或具有选自SEQ ID NO：41、42、43、44、45、46、47和48组成的组的氨基酸序列的HCDR3的多肽(例如，重链)。
在进一步的实施方案中，抗原结合蛋白包含：A)包含Ab1LCv、Ab2LCv、Ab3LCv、Ab4LCv、Ab5LCv、Ab6LCv、Ab7LCv和Ab8LCv中任一种的LCDR1、LCDR2和LCDR3的轻链氨基酸序列；和B)包含Ab1HCv、Ab2HCv、Ab3HCv、Ab4HCv、Ab5HCv、Ab6HCv、Ab7HCv和Ab8HCv中任一种的HCDR1、HCDR2和HCDR3的重链氨基酸序列。
在某些实施方案中，CDR包括与本文所示的示例性CDR不超过一个、不超过两个、不超过三个、不超过四个、不超过五个或者不超过六个氨基酸添加、缺失或者置换。
本发明的一些方面包括包含轻链可变结构域的抗体，该轻链可变结构域选自SEQID NO：63、64、65、66、67、68、69和70组成的组。本发明的一些方面包括包含重链可变结构域的抗体，该重链可变结构域选自SEQ ID NO：17、18、19、20、21、22、23和24组成的组。而且，本发明的一些方面包括包含A)选自SEQ ID NO：63、64、65、66、67、68、69和70组成的组的轻链可变结构域和B)选自SEQ ID NO：17、18、19、20、21、22、23和24组成的组的重链可变结构域的抗体。
本发明的抗体可包含本领域已知的任何恒定区。轻链恒定区可以为例如κ-或λ-型轻链恒定区，例如，人κ-或λ-型轻链恒定区。重链恒定区可以为例如，α-、δ-、ε-、γ或μ-型重链恒定区，例如，人α-、δ-、ε-、γ-或μ-型重链恒定区。在一个实施方案中，轻或重链恒定区为天然存在的恒定区的片段、衍生物、变体或突变蛋白。
本发明的一些方面包括包含轻链可变区的抗体，该轻链可变区选自具有不超过一个、不超过两个、不超过三个、不超过四个、不超过五个、不超过六个、不超过七个、不超过八个、不超过九个或不超过十个氨基酸添加、缺失或者置换的SEQ ID NO：63、64、65、66、67、68、69和70组成的组。本发明的一些方面包括包含重链可变区的抗体，该重链可变区选自具有不超过一个、不超过两个、不超过三个、不超过四个、不超过五个、不超过六个、不超过七个、不超过八个、不超过九个或不超过十个氨基酸添加、缺失或者置换的SEQ ID NO：17、18、19、20、21、22、23和24组成的组。而且，本发明的一些方面包括抗体，其包含：A)包含具有不超过一个、不超过两个、不超过三个、不超过四个、不超过五个、不超过六个、不超过七个、不超过八个、不超过九个或不超过十个氨基酸添加、缺失或者置换的选自SEQ ID NO：63、64、65、66、67、68、69和70组成的组的轻链可变区；和B)具有不超过一个、不超过两个、不超过三个、不超过四个、不超过五个、不超过六个、不超过七个、不超过八个、不超过九个或不超过十个氨基酸添加、缺失或者置换的选自SEQ ID NO：17、18、19、20、21、22、23和24组成的组的重链可变区。例如，在某些示例性实施方案中，抗体包含：1)SEQ ID NO：66表示的轻链可变结构域的变体，其中在位置51处苯丙氨酸突变为亮氨酸和/或在位置105处脯氨酸突变为甘氨酸或谷氨酰胺；2)SEQ ID NO：20表示的重链可变结构域的变体，其中在位置1处谷氨酰胺突变为谷氨酸和/或在位置16处精氨酸突变为甘氨酸；或者SEQ ID NO：66表示的轻链可变结构域的变体，其中在位置51处苯丙氨酸突变为亮氨酸和/或在位置105处脯氨酸突变为甘氨酸或谷氨酰胺；以及SEQ ID NO：20表示的重链可变结构域的变体，其中在位置1处谷氨酰胺突变为谷氨酸和/或在位置16处精氨酸突变为甘氨酸。
在一种变型中，抗原结合蛋白包含与选自SEQ ID NO：63、64、65、66、67、68、69和70组成的组的轻链氨基酸序列具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。在另一变型中，抗原结合蛋白包含与选自SEQ ID NO：17、18、19、20、21、22、23和24组成的组的重链氨基酸序列具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。在又进一步的实施方案中，抗原结合蛋白包含：A)与选自SEQ ID NO：63、64、65、66、67、68、69和70组成的组的轻链氨基酸序列具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列；和B)与选自SEQ ID NO：17、18、19、20、21、22、23和24组成的组的重链氨基酸序列具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。
在某些实施方案中，抗原结合蛋白包含轻链和/或重链CDR3。在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含选自SEQ ID NO：87、88、89、90、91、92、93、94、41、42、43、44、45、46、47和48表示的序列的组的氨基酸序列。在某些实施方案中，氨基酸序列包括与SEQ ID NO：87、88、89、90、91、92、93、94、41、42、43、44、45、46、47和48表示的示例性序列的不超过一个、不超过两个、不超过三个、不超过四个、不超过五个或不超过六个氨基酸添加、缺失或者置换。因此，本发明的实施方案包括抗原结合蛋白，其包含与选自SEQ ID NO：87、88、89、90、91、92、93、94、41、42、43、44、45、46、47和48表示的序列的组的氨基酸序列具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。
在某些实施方案中，抗原结合蛋白包含轻链和/或重链CDR2。在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含选自SEQ ID NO：79、80、81、82、83、84、85、86、33、34、35、36、37、38、39和40表示的序列的组的氨基酸序列。在某些实施方案中，氨基酸序列包括与SEQ ID NO：79、80、81、82、83、84、85、86、33、34、35、36、37、38、39和40表示的示例性序列的不超过一个、不超过两个、不超过三个、不超过四个、不超过五个、或不超过六个氨基酸添加、缺失或者置换。因此，本发明的实施方案包括抗原结合蛋白，其包含与选自SEQ ID NO：79、80、81、82、83、84、85、86、33、34、35、36、37、38、39和40表示的序列的组的氨基酸序列具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。
在某些实施方案中，抗原结合蛋白包含轻链和/或重链CDR1。在一些实施方案中，抗原结合蛋白包含选自SEQ ID NO：71、72、73、74、75、76、77、78、25、26、27、28、29、30、31和32表示的序列的组的氨基酸序列。在某些实施方案中，氨基酸序列包括与SEQ ID NO：71、72、73、74、75、76、77、78、25、26、27、28、29、30、31和32表示的示例性序列的不超过一个、不超过两个、不超过三个、不超过四个、不超过五个、或不超过六个氨基酸添加、缺失或者置换。因此，本发明的实施方案包括抗原结合蛋白，其包含与选自SEQ ID NO：71、72、73、74、75、76、77、78、25、26、27、28、29、30、31和32表示的序列的组的氨基酸序列具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。
本发明的抗原结合蛋白包含常见抗体的支架，其分别包括人和单克隆抗体、双特异性抗体、双体、微抗体、结构域抗体、合成抗体(有时本文称为“抗体模拟物”)、嵌合抗体、抗体融合物(有时称为“抗体缀合物”)以及它们各自的片段。可将上述CDR(包括CDR的各种组合)移植至以下任意支架内。
如本文所使用，术语“抗体”是指如本文分别所述包含特异性结合抗原的一条或多条多肽链的各种形式的单体或多聚体蛋白。在某些实施方案中，通过重组DNA技术来产生抗体。在另外的实施方案中，通过天然存在的抗体的酶或化学裂解来产生抗体。在另一方面中，抗体选自以下组成的组：a)人抗体；b)人源化抗体；c)嵌合抗体；d)单克隆抗体；e)多克隆抗体；f)重组抗体；g)抗原结合片段；h)单链抗体；i)双链抗体；j)三链抗体；k)四链抗体；1)Fab片段；m)F(ab’)2片段；n)IgA抗体；o)IgD抗体；p)IgE抗体；q)IgG1抗体；r)IgG2抗体；s)IgG3抗体；t)IgG4抗体；以及u)IgM抗体。
可变区包含嵌入构架区(称为构架区FR1、FR2、FR3和FR4)内的至少三个重或轻链CDR。Kabat等人，1991，Sequences of Proteins of Immunological Interest，PublicHealth Service N.I.H.，Bethesda，MD。常见抗体结构单元通常包含四聚体。各四聚体通常由两个相同的多肽链对构成，各对具有一个“轻”和一个“重”链。各链的氨基末端部分包括主要负责抗原识别的约100至110或更多个氨基酸的可变区。各链的羧基末端部分定义主要负责效应子功能的恒定区。人轻链分为κ或λ轻链。重链分为μ、δ、γ、α、或ε，并分别定义抗体的同种型为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。IgG具有多个亚类，其包括但不限于IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。IgM具有包括但不限于IgM1和IgM2的亚类。本发明的实施方案包括并入如本文所述的抗原结合蛋白的可变结构域或CDR的抗体的所有这些类别和亚类。
一些天然存在的抗体(例如在骆驼和羊驼中发现的那些)为由两条重链组成的二聚体，它没有包括轻链。本发明涵盖可结合CD27L的两条重链的二聚抗体、或其片段。
重和轻链的可变区通常具有与通过三个高可变区连接的相对保守构架区(FR)相同的基本结构，即，互补性决定区或CDR。CDR主要负责抗原识别和结合。来自每对两条链的CDR通过构架区对齐，使能够结合特异性表位。由N-末端至C-末端，轻和重链均包含结构域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。氨基酸与各结构域的对齐是依据Kabat的定义。
CDR构成抗原结合的主要表面接触点。CDR3或者轻链以及特别是重链的CDR3可构成在轻和重链可变区内抗原结合的最重要决定簇。在一些抗体中，重链CDR3表现出构成在抗原和抗体之间接触的主要区域。仅改变CDR3的体外选择方案可用于改变抗体的结合性质或者测定何种残基有助于抗原的结合。
天然存在的抗体通常包括信号序列，其引导抗体进入蛋白分泌的细胞途径并且其通常不存在于成熟的抗体中。编码本发明的抗体的多核苷酸可编码如下所述的天然存在的信号序列或异源性信号序列。
在一个实施方案中，抗原结合蛋白是包含一至六种本文所述的示例性CDR的抗体。本发明的抗体可具有包括IgM、IgG(包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgD、IgA或IgE抗体的任意类型。在具体的实施方案中，抗原结合蛋白为IgG型抗体，例如，IgG1抗体。
在一些实施方案中，例如当抗原结合蛋白为具有完整重和轻链的抗体时，CDR全部来源于相同种类，例如人。可选择地，例如在抗原结合蛋白含有少于六种来自以上示出序列的CDR的实施方案中，另外的CDR可以来自其它种类或者可以为与在示例性序列中示出那些不同的人CDR。例如，任选选自可替代种类或不同人抗体序列、或其组合的HCDR1、HCDR2、LCDR1和LCDR2可用于来自本文所识别合适序列的HCDR3和LCDR3区。例如，本发明的CDR可替代市售相关嵌合或人源化抗体的CDR区。
具体实施方案利用作为人组分的抗原结合蛋白的支架组分。然而，在一些实施方案中，支架组分可以为不同种类的混合物。如此，如果抗原结合蛋白为抗体，这些抗体可以为嵌合抗体和/或人源化抗体。通常，“嵌合抗体”和“人源化抗体”是指结合超过一个种类的区的抗体。例如，“嵌合抗体”通常包含来自小鼠(在一些情况下，或大鼠)的可变区和来自人的恒定区。
“人源化抗体”通常是指具有交换在人抗体中发现序列的可变结构域构架区的非人抗体。通常，在人源化抗体中，除了一个或多个CDR外，全部抗体通过人来源的多核苷酸编码或者除了一个或多个CDR外，它们与这些抗体相同。将其中一些或者全部通过来源于非人生物体的核酸来编码的CDR移植入人抗体可变区的β-折叠架构内以生成抗体，通过植入的CDR来测定该抗体的特异性。这些抗体的生成描述在例如，WO92/11018，Jones1986，Nature321：522-525，Verhoeyen等人，1988，Science239：1534-1536中。使用具有遗传工程化免疫系统的小鼠也可生成人源化抗体。Roque等人，2004，Biotechnol.Prog.20：639-654。在本文描述的示例性实施方案中，经识别的CDR为人的CDR，因而在此上下文中人源化和嵌合抗体包括一些非人CDR；例如，可生成包含具有不同种类来源的一种或多种其它CDR区的HCDR3和LCDR3区的人源化抗体。
在一个实施方案中，CD27L抗原结合蛋白为多特异性抗体，尤其为双特异性抗体，有时也称为“双体”。这些为结合两个或多个不同抗原或者在单一抗原上不同表位的抗体。在某些实施方案中，双特异性抗体结合在人效应细胞(例如，T细胞)上的CD27L和抗原。这些抗体用于针对表达CD27L的细胞(例如肿瘤细胞)靶向效应细胞应答。在优选的实施方案中，人效应细胞抗原为CD3。美国专利No.7,235,641。制备双特异性抗体的方法为本领域所已知。这些方法之一包括工程化重链的Fc部分以例如生成“隆凸(knob)”和“孔”，当在细胞中共表达时，其促进重链的异源二聚体形成。美国专利7,695,963。另一方法也包括工程化重链的Fc部分，但使用静电牵引以促进异源二聚体形成，当在细胞中共表达时，同时抑制重链的同源二聚体形成。WO09/089,004，其通过引用方式整体并入本文。
在一个实施方案中，CD27L抗原结合蛋白为微抗体。微抗体为最小化抗体样蛋白，其包含连接至CH3结构域的scFv。Hu等人，1996，Cancer Res.56：3055-3061。
在一个实施方案中，CD27L抗原结合蛋白是结构域抗体；参见例如美国专利No.6,248,516。结构域抗体(dAb)为抗体的功能结合结构域，其对应于人抗体的重(VH)或轻(VL)链的可变区。dAB具有约13kDa的分子量、或者为小于完整抗体大小十分之一。dAB良好地表达于包括细菌、酵母和哺乳动物细胞体系的各种宿主中。此外，即使经历严厉条件下，例如冻干或者热变性，dAb高度稳定和保持活性。参见例如，美国专利6,291,158；6,582,915；6,593,081；6,172,197；美国系列No.2004/0110941；欧洲专利0368684；美国专利6,696,245；WO04/058821；WO04/003019和WO03/002609。
在一个实施方案中，CD27L抗原结合蛋白为抗体片段，其为保留对CD27L的结合特异性的任意本文所示抗体的片段。在各个实施方案中，抗体结合蛋白包含但不限于F(ab)、F(ab′)、F(ab′)2、Fv或单链Fv片段。至少，如本文所指的抗体包含可特异性结合CD27L的多肽，其包含所有或者一部分的轻或重链可变区，例如一个或多个CDR。
结合CD27L的抗体片段的进一步例子包括但不限于：(i)由VL、VH、CL和CH1结构域组成的Fab片段；(ii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iii)由单一抗体的VL和VH结构域组成的Fv片段；(iv)dAb片段(Ward等人，1989，Nature341：544-546)，其由单一可变结构域组成；(v)分离的CDR区；(vi)F(ab′)2片段，其为包含两个连接的Fab片段的二价片段；(vii)单链Fv分子(scFv)，其中VH结构域和VL结构域通过肽接头连接，该肽接头使得两个结构域缔合形成抗原结合位点(Bird等人，1988，Science242：423-426；Huston等人，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85：5879-5883)；(viii)双特异性单链Fv二聚体(PCT/US92/09965)以及(ix)通过基因融合构建的“双体”或者“三链抗体”、多价或多特异性片段(Tomlinson等人，2000，Methods Enzymol.326：461-479；WO94/13804；Holliger等人，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90：6444-6448)。可修饰抗体片段。例如，通过并入连接VH和VL结构域的二硫键可稳定分子(Reiter等人，1996，Nature Biotech.14：1239-1245)。本发明的一些方面包括这些片段的非-CDR组件为人序列的实施方案。
在一个实施方案中，CD27L抗原结合蛋白为完整人抗体。在该实施方案中，如上所示，特异性结构包含示出的包含CDR区的完整重和轻链。另外的实施方案利用本发明的一种或多种CDR以及来自其它人抗体的其它CDR、构架区、J和D区、恒定区等。例如，本发明的CDR可使用任意数目人抗体特别是市售相关抗体的CDR替代。
通过氨基酸桥(短肽接头)连接重和轻链可变结构域(Fv区)片段可形成单链抗体，得到单多肽链。通过融合编码肽接头的DNA来制备这些单链Fv(scFv)，该肽接头介于编码两个可变结构域多肽(VL和VH)的DNA之间。取决于介于两个可变结构域之间挠性接头的长度，所得多肽可自身向后折叠以形成抗原结合单体，或者它们可形成多聚体(例如，二聚体、三聚体或四聚体)(Kortt等人，1997，Prot.Eng.10：423；Kortt等人，2001，Biomol.Eng.18：95-108)。通过结合不同的包含VL和VH的多肽，人们可形成结合不同表位的多聚scFv(Kriangkum等人，2001，Biomol.Eng.18：31-40)。开发生成单链抗体的技术包括在美国专利No.4,946,778；Bird，1988，Science242：423；Huston等人，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：5879；Ward等人，1989，Nature334：544；de Graaf等人，2002，Methods Mol Biol.178：379-87中描述的那些。通过本发明涵盖来源于本文所提供的抗体的单链抗体(包括但不限于包含Ab1LCv/Ab1HCv(SEQ ID NO：63/SEQ ID NO：17)、Ab2LCv/Ab2HCv(SEQ ID NO：64/SEQ IDNO：18)、Ab3LCv/Ab3HCv(SEQ ID NO：65/SEQ ID NO：19)、Ab4LCv/Ab4HCv(SEQ ID NO：66/SEQ ID NO：20)、Ab5LCv/Ab5HCv(SEQ ID NO：67/SEQ ID NO：21)、Ab6LCv/Ab6HCv(SEQ IDNO：68/SEQ ID NO：22)、Ab7LCv/Ab7HCv(SEQ ID NO：69/SEQ ID NO：23)、Ab8LCv/Ab8HCv(SEQ ID NO：70/SEQ ID NO：24的可变结构域组合的scFv)、及其组合。
在一个实施方案中，CD27L抗原结合蛋白是抗体融合蛋白(本文有时称为“抗体缀合物”)。缀合物配偶体(conjugate partner)可以为蛋白质或者非蛋白质；通常在抗原结合蛋白上和在缀合物配偶体上使用官能团生成后者。在某些实施方案中，使抗体与非蛋白质化学物质(药物)缀合以形成抗体药物缀合物。以下描述示例性抗体药物缀合物和制备这些缀合物的方法。
在一个实施方案中，CD27L抗原结合蛋白为抗体类似物，有时称为“合成抗体”。例如，各制品利用具有移植的CDR的可选择蛋白支架或者人工支架。这些支架包括但不限于引入稳定结合蛋白的三维结构的突变以及由例如生物相容聚合物组成的全部合成支架。参见例如，Korndorfer等人，2003，Proteins：Structure，Function and Bioinformatics，第53卷，第1：121-129期.Roque等人，2004，Biotechnol.Prog.20：639-654。此外，可使用肽抗体模拟物(“PAM”)以及根据利用纤维蛋白连接素组分作为支架的抗体模拟物的制品。
如本文所使用，所谓“蛋白”是指至少两个共价连接的氨基酸，其包括蛋白、多肽、寡肽和肽。在一些实施方案中，两个或多个共价连接的氨基酸通过肽键连接。蛋白可由天然存在的氨基酸和肽键构成，例如使用如下所示的表达系统和宿主细胞来重组制备蛋白。可选择地，蛋白可包括合成氨基酸(例如，高苯丙氨酸、瓜氨酸、鸟氨酸和正亮氨酸)或者肽模拟物结构，即，“肽或蛋白类似物”，例如类肽(参见Simon等人，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89：9367，通过引用方式并入本文)，其可耐受蛋白酶或其它生理和/或存储条件。当通过本领域众所周知的常见方法体外合成抗原结合蛋白时，可特别地并入这些合成氨基酸。此外，可使用肽模拟物、合成和天然存在的残基/结构的任意组合。“氨基酸”也包括亚氨基酸残基，例如脯氨酸和羟脯氨酸。氨基酸“R基团”或者“侧链”可以为(L)-或者(S)-构象。在具体的实施方案中，氨基酸为(L)-或(S)-构象。
在某些方面中，本发明提供结合CD27L的重组抗原结合蛋白，以及在一些实施方案中，提供重组人CD27L或其部分。在本文中，“重组蛋白”是使用本领域已知的任何技术和方法通过重组技术(即，通过表达本文所述的重组核酸)来制备的蛋白。生成重组蛋白的方法和技术是本领域众所周知的。本发明的实施方案包括结合野生型CD27L及其变体的重组抗原结合蛋白。
“基本上由......组成”是指相对于所引用的SEQ ID NO：序列，氨基酸序列可改变约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15％但如本文所述仍然保留生物活性。
在一些实施方案中，本发明的抗原结合蛋白为分离的蛋白或者基本上纯的蛋白。“分离的”蛋白没有伴随有在它天然状态下通常缔合的至少一些材料，例如在给定样品中构成至少约5％或至少约50％重量份的总蛋白。应理解，取决于环境，分离的蛋白可由5至99.9％重量份的总蛋白含量构成。例如，通过使用可诱导启动子或者高表达启动子在显著较高浓度下可制备蛋白，使得在增高浓度水平下制备蛋白。定义包括在本领域已知的大量生物体和/或宿主细胞中生成抗原结合蛋白。
对于氨基酸序列，通过使用本领域已知的标准技术来测定序列同一性和/或相似性，其包括但不限于：Smith和Waterman，1981，Adv.Appl.Math.2：482的局部序列同一性算法；Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48：443的序列同一性比对算法；Pearson和Lipman，1988，Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.85：2444的相似性方法检索；这些算法的计算机化实施(在Wisconsin Genetics Software Package中GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Genetics Computer Group，575Science Drive，Madison，Wis.)；通过Devereux等人，1984，Nucl.Acid Res.12：387-395描述的最佳拟合测序程序，优选使用默认设置或者通过检验。优选地，根据以下参数通过FastDB来计算同一性％：1的不匹配罚分；1的空位罚分；0.33的空位大小罚分；和30的连接罚分，″Current Methods in Sequence Comparison andAnalysis″，Macromolecule Sequencing and Synthesis，Selected Methods andApplications，127-149页(1988)，Alan R.Liss，Inc。
有用的算法例子为PILEUP。使用渐进、成对比对，PILEUP由一组相关序列生成多序列比对。它也可绘制显示聚类关系的树形图，它用于生成比对。PILEUP使用Feng&Doolittle，1987，J.Mol.Evol.35：351-360的渐进比对方法的简化；该方法类似于Higgins和Sharp，1989，CABIOS5：151-153描述的方法。有用的PILEUP参数包括3.00的默认缺口权重、0.10的默认缺口长度权重、和加权的端缺口。
有用的算法的另一例子为BLAST算法，其描述在：Altschul等人，1990，J.Mol.Biol.215：403-410；Altschul等人，1997，Nucleic Acids Res.25：3389-3402；和Karin等人，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.90：5873-5787。特别有用的BLAST程序为WU-BLAST-2程序，其由Altschul等人，1996，Methods in Enzymology266：460-480获得。WU-BLAST-2使用多个检索的参数，它们大部分设置为默认值。可调整的参数设置为以下值：重叠跨度＝1；重叠分数＝0.125；单词阈值(T)＝II。HSP S和HSP S2参数为动态值，并且取决于针对被检索目标序列的特定数据库的特定序列和组合物，通过程序本身可确定这些参数；然而，可调节值来增加灵敏性。
另外有用的算法为通过Altschul等人，1993，Nucl.AcidsRes.25：3389-3402报道的空位BLAST(gapped BLAST)。空位BLAST使用BLOSUM-62置换得分；设置为9的阈值T参数；触发非空位延伸的两次命中方法(two-hit method)；指示k的空位长度、10+k的成本；设置为16的Xu；以及数据库检索阶段设置为40的Xg和算法输出阶段设置为67。通过对应约22比特的得分来触发空位算法。
通常，在单一可变CDR与本文所示序列之间的氨基酸同源性、相似性或同一性为至少80％，以及更通常为具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％和几乎100％的优选增加的同源性或同一性。以类似的方式，相对于本文所识别结合蛋白的核酸序列的“核酸序列同一性百分比(％)”定义为与抗原结合蛋白的编码序列中核苷酸残基相同的候选序列中核苷酸残基的百分比。具体方法利用设置为默认参数的WU-BLAST-2的BLASTN模块，其分别具有设置为1和0.125的重叠跨度和重叠分数。
通常，在编码单独可变CDR的核苷酸序列和本文所示核苷酸序列之间的核酸序列同源性、相似性或同一性为至少80％，以及更通常为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％和几乎100％的优选增加的同源性或同一性。
因此，“可变CDR”为与本发明的亲本CDR具有规定的同源性、相似性或同一性以及共享包括但不限于至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％亲本CDR的特异性和/或活性的生物功能的CDR。
尽管引入氨基酸序列变异的位点或区域为预先决定的，但是突变本身不需要预先决定。例如，为了优化在给定位点处的突变性能，在筛选用于优化结合所需活性的靶密码子或区和表达的抗原结合蛋白CDR变体处可进行随机诱变。用于在具有已知序列的DNA中预定位点处制备置换突变的技术是众所周知的，例如，M13引物诱变和PCR诱变。使用抗原结合蛋白活性(例如CD27L结合)的分析来进行突变体的筛选。
氨基酸置换通常具有单一残基；插入通常在约一(1)至约二十(20)个氨基酸残基的规则内，但是可耐受相对更大的插入。缺失的范围为约一(1)至约二十(20)个氨基酸残基，但是在一些情况下，缺失可以远远更大。
置换、缺失、插入或其任意组合可用于得到最终衍生物或变体。通常，在少量氨基酸上进行这些改变，从而最小化分子的变化，尤其最小化抗原结合蛋白的免疫原性和特异性。然而，在某些情况下可耐受更大的改变。通常按照如表1所示下表进行保守置换。
表1
Figure BDA0000509038660000381
Figure BDA0000509038660000391
通过选择比在表1中所示那些保守性更低的置换来进行功能或免疫同一性的大量改变。例如，可制备显著影响以下的置换：在变化的区域中多肽主链的结构，例如α-螺旋或β-折叠结构；在靶位点处分子的电荷或疏水性；或者侧链的大小。通常预期在多肽性质中产生最大变化的取代为以下那些，其中：(a)亲水性残基(例如，丝氨酰基或苏氨酰基)置换(或被置换)疏水性残基，例如亮氨酰基、异亮氨酰基、苯丙氨酰基、缬氨酰基或丙氨酰基；(b)半胱氨酸或脯氨酸置换(或被置换)任意其它残基；(c)具有带正电的侧链的残基(例如，赖氨酰基、精氨酰基或组氨酰基)置换(或被置换)带负电的残基，例如谷酰基或天冬氨酰基；或者(d)具有大侧链的残基(例如，苯丙氨酸)置换(或被置换)不具有侧链的残基，例如，甘氨酸。
变体通常表现出相同定性生物活性和引起如天然存在的类似物相同的免疫应答，但也根据需要选择变体以修饰抗原结合蛋白的特性。可选择地，可设计变体，使得改变抗原结合蛋白的生物活性。例如，如本文所讨论可改变或者移除糖基化位点。
在本发明的范围内的CD27L抗体的其它衍生物包括CD27L抗体或其片段与其它蛋白或多肽的共价或聚集缀合物，例如通过表达重组融合蛋白，该重组融合蛋白包含融合至CD27L抗体多肽的N-末端或C-末端的异源性多肽。例如，缀合的肽可以为异源性信号(或前导)多肽，例如，酵母α-因子前导序列或肽，例如表位标签。包含CD27L抗体的融合蛋白可包含加入以促进CD27L抗体(例如，聚组氨酸(poly-His))的纯化或识别的肽。CD27L抗体多肽也可连接如Hopp等人，Bio/Technology6：1204，1988和美国专利5,011,912描述的FLAG肽。FLAG肽具有高抗原性和提供通过特异性单克隆抗体(mAb)可逆结合的表位，从而使能够快速分析和容易纯化表达的重组蛋白。用于制备FLAG肽与给定多肽融合的融合蛋白的试剂为市售试剂(Sigma，St.Louis，MO)。
可采用含有一种或多种CD27L抗体多肽的寡聚体作为CD27L拮抗剂。寡聚体可以为共价连接或者非共价连接的二聚体、三聚体或更高的寡聚物的形式。涵盖使用包含两种或多种CD27L抗体多肽的寡聚体，其中一个例子为同源二聚体。其它寡聚体包括异源二聚体、同源三聚体、异源三聚体、同源四聚体、异源四聚体等。
一个实施方案涉及包含多个CD27L抗体多肽的寡聚体，该多个CD27L抗体多肽通过在融合至CD27L抗体多肽的肽部分之间的共价或非共价相互作用连接。这些肽可以为具有促进寡聚化性质的肽接头(间隔区)或者肽。如以下更加详细所述，亮氨酸拉链和来源于抗体的某些多肽介于连接至其的可促进CD27L抗体多肽寡聚化的肽之间。
在特定的实施方案中，寡聚体包含两至四个CD27L抗体多肽。寡聚体的CD27L抗体部分可以为上述的任意形式，例如，变体或片段。优选地，寡聚体包含具有CD27L结合活性的CD27L抗体多肽。
在一个实施方案中，使用来源于免疫球蛋白的多肽来制备寡聚体。例如，通过Ashkenazi等人，1991，PNAS USA88：10535；Byrn等人，1990，Nature344：677；和Hollenbaugh等人，1992″Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins′″，在CurrentProtocols in Immunology中，增刊4，10.19.1-10.19.11页已经描述包含某些异源性多肽的融合蛋白的制备，这些异源性多肽融合至来源于抗体的多肽的各种部分。
本发明的一个实施方案涉及包含通过融合CD27L抗体的CD27L结合片段与抗体的Fc区产生的两个融合蛋白的二聚体。例如，通过插入编码融合蛋白的基因融合至合适的表达载体内、在使用重组表达载体转化的宿主细胞中表达基因融合以及使得表达的融合蛋白组装非常类似抗体分子(在其上链间二硫键在Fc部分之间形成以生成二聚体)可制备二聚体。
如本文所使用的术语“Fc多肽”包括来源于抗体的Fc区的多肽的天然和突变蛋白形式。也包括包含促进二聚化的铰链区的这些多肽的截短形式。包含Fc部分的融合蛋白(和由其形成的寡聚体)提供通过亲和色谱在蛋白A或蛋白G柱上易于纯化的优势。
在PCT申请WO93/10151(通过据此引用方式并入)中描述的一种合适的Fc多肽为由N-末端铰链区延伸至人IgG抗体的Fc区的天然C-末端的单链多肽。另一有用的Fc多肽为在美国专利5,457,035中和在Baum等人，1994，EMBO J.13：3992-4001中描述的Fc突变蛋白。除了氨基酸19由Leu改变为Ala、氨基酸20由Leu改变为Glu和氨基酸22由Gly改变为Ala，该突变蛋白的氨基酸序列与在WO93/10151中所示的天然Fc序列那些相同。突变蛋白表现出对Fc受体降低的亲和力。
在其它实施方案中，CD27L抗体的重和/或轻链的可变部分可置换抗体重和/或轻链的可变部分。
可选择地，寡聚体为包含具有或没有肽接头(间隔区肽)的多个CD27L抗体多肽的融合蛋白。合适的肽接头为在美国专利4,751,180和4,935,233中描述的那些。
制备寡聚CD27L抗体衍生物的另一方法包括使用亮氨酸拉链。亮氨酸拉链结构域为促进蛋白寡聚化的肽，在所述蛋白中发现了亮氨酸拉链结构域。亮氨酸拉链开始在多种DNA-结合蛋白中识别(Landschulz等人，1988，Science240：1759)，并在多种不同蛋白中发现。已知亮氨酸拉链为二聚或三聚化天然存在的肽及其衍生物。适合生成合适寡聚蛋白的亮氨酸拉链结构域的例子描述在PCT申请WO94/10308中，来源于肺表面活性蛋白D(SPD)的亮氨酸拉链描述在Hoppe等人，1994，FEBS Letters344：191中，其据此通过引用方式并入。经修饰的亮氨酸拉链的用途描述在Fanslow等人，1994，Semin.Immunol.6：267-78中，该经修饰的亮氨酸拉链使得可稳定地三聚化融合至其的异源性蛋白。在一种方案中，包含融合至亮氨酸拉链肽的CD27L抗体片段或衍生物的重组融合蛋白表达在合适的宿主细胞中，并且形成的可溶寡聚CD27L抗体片段或衍生物由培养上清液中回收。
抗原结合蛋白的共价修饰包括在本发明的范围内，并且通常但不总是在翻译之后进行。例如，通过使抗原结合蛋白的具体氨基酸残基与有机衍生试剂反应将抗原结合蛋白的共价修饰多种类型引入分子内，该有机衍生试剂能够与选择的侧链或者N-或C-末端残基反应。
半胱氨酰基残基最通常与α-卤代醋酸酯(和对应胺)(例如氯醋酸或氯乙酰胺)反应以得到羧甲基或羧酰胺基甲基衍生物。通过与溴代三氟丙酮、α-溴代-β-(5-咪唑基)丙酸、氯乙酰磷酸、N-烷基马来酰亚胺、3-硝基-2-吡啶基二硫化物、甲基2-吡啶二硫化物、p-氯汞苯甲酸盐、2-氯汞基-4-硝基酚或氯-7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑反应也衍生得到半胱氨酰基残基。
由于焦碳酸二乙酯对组氨酰基侧链的相对特异性，通过在pH5.5-7.0下与该试剂反应来衍生组氨酰基残基。也可使用对-溴苯甲酰甲基溴；该反应优选在pH6.0下在0.1M二甲胂酸钠中进行。
赖氨酰基和氨基末端残基与琥珀酸或其它羧酸酐反应。使用这些试剂衍生具有逆转赖氨酰基残基电荷的作用。衍生包含α-氨基的残基的其它合适试剂包括亚氨酸酯，例如甲基吡啶亚胺甲酯、磷酸吡哆醛、吡哆醛、氯氢硼化物、三硝基苯磺酸、O-甲基异脲、2，4-戊二酮和转氨酶催化的与乙醛酸盐的反应。
通过与包括苯甲酰甲醛、2，3-丁二酮、1，2-环己二酮和茚三酮的一种或多种常见试剂的反应来修饰精氨酰基残基。由于胍官能团的高pKa，精氨酸残基的衍生需要反应在碱性条件下进行。而且，这些试剂可以与赖氨酸基团以及精氨酸ε-氨基反应。
在通过与芳香重氮化合物或四硝基甲烷反应来引入光谱标记至酪氨酰基残基内的特定目的下，可得到酪氨酰基残基的具体修饰。最通常地，N-乙酰基咪唑和四硝基甲烷用于分别形成O-乙酰基酪氨酰基种类和3-硝基衍生物。使用125I或131I碘化酪氨酰基残基以制备在放射免疫分析中使用的标记的蛋白，上述的氯胺T方法为合适的方法。
通过与碳二亚胺(R′-N＝C＝N--R′)反应来选择性修饰羧基侧基(天冬氨酰基或谷氨酰基)，其中R和R′为任选不同的烷基，例如1-环己基-3-(2-吗啉基-4-乙基)碳二亚胺或者1-乙基-3-(4-氮阳离子-4，4-二甲基戊基)碳二亚胺。而且，通过与铵离子反应，天冬氨酰基和谷酰基残基转化为天冬酰胺酰基和谷氨酰胺酰基残基。
使用二官能剂衍生化用于交联抗原结合蛋白与在各种方法中使用的水不溶性支撑基质或表面。常用的交联剂包括例如1，1-双(重氮乙酰基)-2-苯乙烷、戊二醛、N-羟基琥珀酰亚胺酯(例如，与4-叠氮水杨酸的酯)、包括琥珀酰亚胺酯的同源双官能亚氨酸酯(例如3，3′-二硫代双(琥珀酰亚胺基丙酸酯))和双官能马来酰亚胺(例如双-N-马来酰亚胺-1，8-辛烷)。诸如3-[(p-叠氮基苯基)二硫代]丙酰胺甲酯的衍生化试剂生成在光存在下能够形成交联的光激活中间体。可选择地，将描述在美国专利No.3,969,287；3,691,016；4,195,128；4,247,642；4,229,537；和4,330,440中诸如溴化氰激活的碳水化合物的反应性水不溶性基质和反应性底物用于蛋白固定。
谷氨酰胺酰基和天冬酰胺酰基残基通常分别脱去酰胺基为相应的谷酰基和天冬氨酰基残基。可选择地，在温和酸性条件下这些残基脱去酰基。这些残基的任一形式均落入本发明的范围内。
其它修饰包括脯氨酸和赖氨酸的羟化，丝氨酰基或苏氨酰基残基的羟基的磷酸化，赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的α-氨基的甲基化(T.E.Creighton，Proteins：Structureand Molecular Properties，W.H.Freeman&Co.，San Francisco，1983，79-86页)，N-末端胺的乙酰化和任意C-末端羧基的酰胺化。
包括在本发明的范围内的抗原结合蛋白的共价修饰另一类型包括改变蛋白的糖基化模式。如本领域所已知，糖基化模式可取决于蛋白的序列(例如，存在或缺乏以下讨论的特定糖基化氨基酸残基)或者产生蛋白质的宿主细胞或生物体。以下讨论特定表达系统。
多肽的糖基化通常为N-连接或O-连接。N-连接是指糖部分与天冬酰胺残基的侧链的连接。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸(其中X是除了脯氨酸之外的任何氨基酸)是糖部分与天冬酰胺侧链的酶连接的识别序列。因此，在多肽中这些三肽序列的存在产生潜在糖基化位点。O-连接的糖基化是指糖N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖中一种与羟基氨基酸的连接，该羟基氨基酸最常为丝氨酸或苏氨酸，但也可使用5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸。
通过改变氨基酸序列来方便地完成加入糖基化位点至抗原结合蛋白，使得它含有一种或多种上述三肽序列(用于N-连接的糖基化位点)。通过加入或置换一种或多种丝氨酸或苏氨酸残基至起始序列(用于O-连接的糖基化位点)也可进行变化。为了方便，通过改变DNA水平、特别是通过在预选碱基处突变编码靶多肽的DNA来优选改变抗原结合蛋白氨基酸序列，使得生成翻译至所需氨基酸内的密码子。
增加在抗原结合蛋白上糖部分数量的另一方法是通过糖苷与蛋白的化学或酶偶联。这些程序的优势在于它们不需要在宿主细胞中产生蛋白，该宿主细胞具有N-和O-连接的糖基化的糖基化能力。取决于所使用的偶联模式，糖可以连接(a)精氨酸和组氨酸；(b)游离羧基；(c)游离巯基，例如半胱氨酸的那些；(d)游离羟基，例如丝氨酸、苏氨酸或羟脯氨酸的那些；(e)芳香残基，例如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的那些；或者(f)谷氨酰胺的酰胺基。这些方法描述在1987年9月11日公开的WO87/05330中以及在Aplin和Wriston，1981，CRCCrit.Rev.Biochem.，259-306页中。
可化学或酶法完成在起始抗原结合蛋白上存在的糖部分的去除。化学去糖基化需要暴露蛋白于化合物三氟甲磺酸或者等效化合物。该处理导致除了连接糖(N-乙酰葡萄糖胺或N-乙酰半乳糖胺)的大部分或者所有糖的裂解，同时保留多肽完整。通过Hakimuddin等人，1987，Arch.Biochem.Biophys.259：52和通过Edge等人，1981，Anal.Biochem.118：131描述化学去糖基化。通过如由Thotakura等人，1987，Meth.Enzymol.138：350描述的各种内切糖苷酶和外切糖苷酶可完成在多肽上的糖部分的酶裂解。通过使用如由Duskin等人，1982，J.Biol.Chem.257：3105描述的化合物衣霉素可防止在潜在糖基化位点处糖基化。衣霉素阻断蛋白-N-糖苷连接的形成。
抗原结合蛋白的共价修饰的另一类型包括连接抗原结合蛋白至各种非蛋白聚合物，其包括但不限于以在美国专利No.4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192或4,179,337中示出的方式的各种多元醇，例如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯。此外，如在本领域所已知，可在抗原结合蛋白内各处位置处进行氨基酸置换以便于加入聚合物，例如PEG。
在一些实施方案中，本发明的抗原结合蛋白的共价修饰包括加入一种或多种标记。
术语“标记基团”表示任何可检测标记。合适标记基团的例子包括但不限于以下：放射性同位素或者放射性核素(例如，3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I)；荧光基团(例如，FITC、罗丹明、镧系元素磷光剂)；酶基团(例如，辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶)；化学发光基团；生物素基团或者通过二级报道基因识别的预定的多肽表位(例如，亮氨酸拉链对序列、二级抗体的结合位点、金属结合结构域、表位标签)。在一些实施方案中，标记基团通过各种长度的间隔区臂与抗原结合蛋白偶联，从而降低潜在位阻。标记蛋白的各种方法是本领域已知的，并可在进行本发明中使用。
通常，取决于待测定标记的分析，标记分为多种类型：a)同位素标记物，其可以为放射性或重同位素；b)磁性标记(例如，磁性粒子)；c)氧化还原活性部分；d)光学染料；酶基团(例如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶)；e)生物素酰化基团；以及f)通过二级报道基因识别的预定的多肽表位(例如，亮氨酸拉链对序列、二级抗体的结合位点、金属结合结构域、表位标签等)。在一些实施方案中，标记基团通过各种长度的间隔区臂与抗原结合蛋白偶联，从而降低潜在位阻。标记蛋白的各种方法是本领域已知的，并可在进行本发明中使用。
特异性标记包括光学染料，其包括但不限于生色团、磷光剂和荧光团，在许多实例中后者为特异性光学染料。荧光团可以为“小分子”荧光剂或者蛋白质荧光剂。
所谓“荧光标记”是指通过它内在荧光性质可测定的任何分子。合适的荧光标记包括但不限于荧光素、罗丹明、四甲基罗丹明、伊红、赤藓红、香豆素、甲基香豆素、芘、孔雀石绿、芪、荧光黄、瀑布蓝J(Cascade BlueJ)、德州红(Texas Red)、IAEDANS、EDANS、BODIPYFL、LC Red640、Cy5、Cy5.5、LC Red705、俄勒冈绿(Oregon green)、阿历克斯-氟(Alexa-Fluor)染料(阿历克斯氟350、阿历克斯氟430、阿历克斯氟488、阿历克斯氟546、阿历克斯氟568、阿历克斯氟594、阿历克斯氟633、阿历克斯氟660、阿历克斯氟680)、瀑布蓝、瀑布黄和R-藻红素(R-phycoerythrin)(PE)(Molecular Probes，Eugene，OR)、FITC、罗丹明、和德州红(Pierce，Rockford，IL)、Cy5、Cy5.5、Cy7(Amersham Life Science，Pittsburgh，PA)。包括荧光团在内的合适光学染料描述于Richard P.Haugland的Molecular Probes Handbook中，其据此通过引用的方式明确并入。
合适的蛋白质类荧光标记还包括但不限于绿色荧光蛋白，包括海肾(Renilla)、海笔(Ptilosarcus)或水母(Aequorea)物种的GFP(Chalfie等人，1994，Science263：802-805)、EGFP(Clontech Laboratories，Inc.，基因库(Genbank)登录号U55762)；蓝色荧光蛋白(BFP，Quantum Biotechnologies，Inc.1801de Maisonneuve Blvd.West，8th Floor，Montreal，Quebec，Canada H3H1J9；Stauber，1998，Biotechniques24：462-471；Heim等人，1996，Curr.Biol.6：178-182)；增强型黄色荧光蛋白(EYFP，Clontech Laboratories，Inc.)；荧光素酶(Ichiki等人，1993，J.Immunol.150：5408-5417)；β半乳糖苷酶(Nolan等人，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85：2603-2607)和海肾(Renilla)(WO92/15673、WO95/07463、WO98/14605、WO98/26277、WO99/49019、美国专利No.5292658、5418155、5683888、5741668、5777079、5804387、5874304、5876995、5925558)。以上引用的参考文献全部通过引用方式明确并入本文。
编码CD27L抗原结合蛋白的多核苷酸
编码CD27L抗原结合蛋白的核酸(包括如本文所定义的抗体)涵盖在本发明内。优选的核酸包括编码本文所述的示例性轻和重链的那些。
编码Ab1LC的示例性核酸为包含SEQ ID NO：49表示的序列的核酸。
编码Ab2LC的示例性核酸为包含SEQ ID NO：50表示的序列的核酸。
编码Ab4LC的示例性核酸为包含SEQ ID NO：51表示的序列的核酸。
编码Ab5LC的示例性核酸为包含SEQ ID NO：52表示的序列的核酸。
编码Ab6LC的示例性核酸为包含SEQ ID NO：53表示的序列的核酸。
编码Ab7LC的示例性核酸为包含SEQ ID NO：54表示的序列的核酸。
编码Ab8LC的示例性核酸为包含SEQ ID NO：55表示的序列的核酸。
编码Ab1HC的示例性核酸为包含SEQ ID NO：3表示的序列的核酸。
编码Ab2HC的示例性核酸为包含SEQ ID NO：4表示的序列的核酸。
编码Ab4HC的示例性核酸为包含SEQ ID NO：5表示的序列的核酸。
编码Ab5HC的示例性核酸为包含SEQ ID NO：6表示的序列的核酸。
编码Ab6HC的示例性核酸为包含SEQ ID NO：7表示的序列的核酸。
编码Ab7HC的示例性核酸为包含SEQ ID NO：8表示的序列的核酸。
编码Ab8HC的示例性核酸为包含SEQ ID NO：9表示的序列的核酸。
本发明的一些方面包括编码本文所述的氨基酸序列的多核苷酸变体(例如，由于简并性)。
本发明的一些方面包括各种实施方案，其包括但不限于以下示例性实施方案。
分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码一种或多种多肽，所述多肽包含选自以下组成的组的氨基酸序列：
A.1.与SEQ ID NO：63-70表示的轻链可变结构域序列具有至少90％同一性的轻链可变结构域序列；
2.与SEQ ID NO：17-24表示的重链可变结构域序列具有至少90％同一性的重链可变结构域序列；
3.(1)的轻链可变结构域和(2)的重链可变结构域；以及
B.与以下序列中各CDR有不超过总计三个氨基酸添加、置换和/或缺失差异的包含CDR1、CDR2、CDR3的轻链可变结构域和/或包含CDR1、CDR2、CDR3的重链可变结构域：
1.Ab1的轻链CDR1(SEQ ID NO：71)、CDR2(SEQ ID NO：79)、CDR3(SEQ ID NO：87)或重链CDR1(SEQ ID NO：25)、CDR2(SEQ ID NO：33)、CDR3(SEQ ID NO：41)；
2.Ab2的轻链CDR1(SEQ ID NO：72)、CDR2(SEQ ID NO：80)、CDR3(SEQ ID NO：88)或重链CDR1(SEQ ID NO：26)、CDR2(SEQ ID NO：34)、CDR3(SEQ ID NO：42)；
3.Ab3的轻链CDR1(SEQ ID NO：73)、CDR2(SEQ ID NO：81)、CDR3(SEQ ID NO：89)或重链CDR1(SEQ ID NO：27)、CDR2(SEQ ID NO：35)、CDR3(SEQ ID NO：43)；
4.Ab4的轻链CDR1(SEQ ID NO：74)、CDR2(SEQ ID NO：82)、CDR3(SEQ ID NO：90)或重链CDR1(SEQ ID NO：28)、CDR2(SEQ ID NO：36)、CDR3(SEQ ID NO：44)；
5.Ab5的轻链CDR1(SEQ ID NO：75)、CDR2(SEQ ID NO：83)、CDR3(SEQ ID NO：91)或重链CDR1(SEQ ID NO：29)、CDR2(SEQ ID NO：37)、CDR3(SEQ ID NO：45)；
6.Ab6的轻链CDR1(SEQ ID NO：76)、CDR2(SEQ ID NO：84)、CDR3(SEQ ID NO：92)或重链CDR1(SEQ ID NO：30)、CDR2(SEQ ID NO：38)、CDR3(SEQ ID NO：46)；
7.Ab7的轻链CDR1(SEQ ID NO：77)、CDR2(SEQ ID NO：85)、CDR3(SEQ ID NO：93)或重链CDR1(SEQ ID NO：31)、CDR2(SEQ ID NO：39)、CDR3(SEQ ID NO：47)；和
8.Ab8的轻链CDR1(SEQ ID NO：78)、CDR2(SEQ ID NO：86)、CDR3(SEQ ID NO：94)或重链CDR1(SEQ ID NO：32)、CDR2(SEQ ID NO：40)、CDR3(SEQ ID NO：48)。
在优选的实施方案中，通过分离的核酸编码的多肽为结合CD27L的抗原结合蛋白的组分。
通过由氨基酸序列“回译(back-translation)”或者通过识别与已经识别其编码DNA序列的多肽具有同一性的氨基酸区域可获得对应本文所述的氨基酸序列的核苷酸序列，该核苷酸序列待用作分离核酸的探针或引物或者用作数据库检索的查询序列。可采用众所周知的聚合酶链反应(PCR)程序以分离和扩增编码CD27L抗原结合蛋白的DNA序列或者CD27L抗原结合蛋白多肽片段的所需组合。采用定义DNA片段组合的所需末端的寡核苷酸为5′端和3′端引物。寡核苷酸可另外含有限制性核酸内切酶的识别位点，从而便于插入扩增的DNA片段组合至表达载体内。PCR技术描述在Saiki等人，Science239：487(1988)，Recombinant DNA Methodology；Wu等人编辑，Academic Press，Inc.，San Diego(1989)，189-196页；和PCR Protocols：AGuide to Methods and Applications；Innis等人编辑，Academic Press，Inc.(1990)中。
本发明的核酸分子包括在单链和双链形式以及对应互补序列中DNA和RNA。DNA包括例如cDNA、基因组DNA、化学合成的DNA、通过PCR扩增的DNA及其组合。本发明的核酸分子包括全长基因或cDNA分子及其片段的组合。本发明的核酸优选来源于人来源，但本发明也包括来源于非人种类的那些。
“分离的核酸”为在由天然存在的来源分离核酸的情况下，在由其分离核酸的生物体基因组中存在的相邻遗传序列分离的核酸。在由模板酶合成或化学合成的核酸的情况下，例如PCR产物、cDNA分子或寡核苷酸，应理解，由这些程序产生的核酸为分离的核酸。分离的核酸分子是指以单独片段形式或者作为较大核酸构建物的组件的核酸分子。在一个优选的实施方案中，核酸基本上没有污染内源性材料。核酸分子优选来源于以基本上纯的形式和在使能够通过标准生物化学方法识别、操纵和回收它组分核苷酸序列的量和浓度下分离至少一次的DNA或RNA(例如在Sambrook等人，Molecular Cloning：A LaboratoryManual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY(1989)中所列出那些)。优选以通常在真核基因中存在的未被内部非翻译序列或内含子中断的开放阅读框的形式提供和/或构建这些序列。非翻译DNA的序列可以存在开放阅读框的5′端或3′端，其中它不会影响编码区的操纵或表达。
本发明也包括在适当严格条件和更优选高度严格条件下与编码如本文所述的CD27L抗原结合蛋白的核酸杂交的核酸。通过Sambrook、Fritsch和Maniatis(1989，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，第9和11章；和Current Protocols in Molecular Biology，1995；Ausubel等人编辑，John Wiley&Sons，Inc.，第2.10和6.3-6.4章)示出影响杂交条件的选择的基本参数和用于设计合适条件的指南，并且根据例如DNA的长度和/或碱基组成本领域普通技术人员可容易地测定。获得适当严格条件的方法包括使用含有5x SSC、0.5％SDS、1.0mM EDTA(pH8.0)的预洗溶液；约50％甲酰胺、6x SSC的杂交缓冲液；和约55℃的杂交温度(或者其它类似的杂交溶液，例如具有约42℃的杂交温度的包含约50％甲酰胺的溶液)；以及在0.5x SSC、0.1％SDS中约60℃的洗涤条件。通常，高度严格条件定义为如上的杂交条件，但在约68℃、0.2x SSC、0.1％SDS下洗涤。在杂交和洗涤缓冲液中SSPE(1xSSPE为0.15M NaCl、10mM NaH2PO4和1.25mM EDTA，pH7.4)替代SSC(1xSSC为0.15M NaCl和15mM柠檬酸钠)；在完成杂交之后进行洗涤15分钟。应当理解，如本领域技术人员所已知和以下进一步所述，通过应用支配杂交反应和双链稳定性的基本原理，必要时可调整洗涤温度和洗涤盐浓度，从而得到所需严格程度(参见，例如，Sambrook等人，1989)。当核酸与未知序列的靶核酸杂交时，杂交物长度假定为杂交核酸的长度。当已知序列的核酸杂交时，通过对齐核酸的序列和识别最佳序列互补性的一个或多个区可测定杂交物长度。预期长度小于50个碱基对的杂交物的杂交温度应当比杂交物的解链温度(Tm)低5至10.℃，其中根据以下等式测定Tm。对于长度小于18个碱基对的杂交物，Tm(℃)＝2(A+T碱基的#)+4(#G+C碱基的#)。对于长度18个碱基对以上的杂交物，Tm(℃)＝81.5+16.6(log10[Na+])+0.41(％G+C)-(600/N)，其中N是在杂交物中碱基数目，以及[Na+]是在杂交缓冲液中钠离子的浓度(1xSSC的[Na+]＝0.165M)。优选地，这些杂交核酸各自具有至少15个核苷酸(或者更优选为至少18核苷酸、或至少20核苷酸、或至少25核苷酸、或至少30核苷酸、或至少40核苷酸、或最优选为至少50核苷酸)的长度或者与它杂交的本发明核酸长度的至少25％(更优选为至少50％、或至少60％、或至少70％、和最优选为至少80％)，并与它杂交的本发明的核酸具有至少60％序列同一性(更优选为至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％以及最优选为至少99.5％)，其中当比对时通过比较杂交核酸的序列来测定序列同一性，从而最大化重叠和同一性，同时最小化如上更加详细所述的序列空位。
通常使用盒式突变或PCR诱变或本领域所熟知的其它技术，通过编码抗原结合蛋白的DNA中核苷酸的位点特异性诱变产生编码变体的DNA，并且此后如本文所述在细胞培养中表达重组DNA，来制备本发明的变体。然而，包含具有多达约100-150个残基的变体CDR的抗原结合蛋白片段可使用完善技术通过体外合成来制备。变体通常表现出与天然存在的类似物相同的定性生物活性，例如与CD27L结合，尽管也可选择如下更全面描述的特征改变的变体。
如本领域技术人员所了解，由于遗传密码的简并性(degeneracy)，故可制备非常多的核酸，这些核酸全部编码本发明的CDR(和抗原结合蛋白的重链和轻链或其它组分)。因此，倘若鉴别出一个特定氨基酸序列，那么本领域技术人员可制备任意数量的不同核酸，即通过以不改变所编码蛋白质的氨基酸序列的方式简单修改一个或多个密码子的顺序。
本发明还提供呈质粒形式的表达系统和构建体、表达载体、转录或表达盒，其包含至少一种如上的多核苷酸。此外，本发明提供包含所述表达系统或构建体的宿主细胞。
通常，用于任一宿主细胞的表达载体含有用于质粒维持和用于克隆和表达外源核苷酸序列的序列。这些序列在某些实施例中总称为“侧翼序列(flanking sequence)”，其通常包括以下一种或多种核苷酸序列：启动子、一个或多个增强子序列、复制起点、转录终止序列、含有供体和受体剪接位点的完整内含子序列、编码用于多肽分泌的前导序列的序列、核糖体结合位点、聚腺苷酸化序列(polyadenylation sequence)、用于插入编码待表达多肽的核酸的多接头区(polylinker region)，和可选的标志物元件。以下分别论述这些序列。
任选地，载体可含有编码“标签(tag)”的序列，即位于CD27L抗原结合蛋白编码序列5′或3′端的寡核苷酸分子；寡核苷酸序列编码多聚His(polyHis)(例如6His(hexaHis))、或另一“标签”，例如FLAG、HA(血球凝集素流感病毒)或myc，，存在针对其的市售抗体。该标签通常在多肽表达之后融合至多肽，并且可作为从宿主细胞亲合纯化或检测CD27L抗原结合蛋白的一种手段。亲合纯化可通过例如柱色谱法，使用针对标签的抗体作为亲合基质来完成。任选地，标签随后可通过各种手段(例如使用某些用于裂解的肽酶)从经纯化的CD27L抗原结合蛋白去除。
侧翼序列可以是同源(即来自与宿主细胞相同的物种和/或菌株)、异源(即来自不同于宿主细胞物种或菌株的物种)、杂交(即来自不止一种来源的侧翼序列的组合)、合成或天然的。如此，侧翼序列的来源可以是任何原核或真核生物体、任何有脊椎或无脊椎生物体、或任何植物，但前提是侧翼序列在宿主细胞机制中起作用并且可由宿主细胞机制活化。
用于本发明载体的侧翼序列可通过本领域所熟知若干方法中的任一种获得。通常，本文有用的侧翼序列通过绘图(mapping)和/或通过限制性核酸内切酶消化而预先识别并因此可使用适当限制性核酸内切酶从恰当的组织来源分离。在一些情况下，可能已知侧翼序列的全部核苷酸序列。这时，侧翼序列可使用本文所述用于核酸合成或克隆的方法合成。
不管侧翼序列是全部还是仅一部分已知，其均可使用聚合酶链反应(PCR)和/或通过用合适探针(例如来自同一物种或另一物种的寡核苷酸和/或侧翼序列片段)筛检基因组文库来获得。倘若侧翼序列未知，便可从可能含有例如编码序列或甚至另一种或多种基因的较大片DNA分离含有侧翼序列的DNA片段。分离可如下完成：通过限制性核酸内切酶消化产生恰当DNA片段，之后使用琼脂糖凝胶纯化、
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柱色谱(Chatsworth，CA)或本领域技术人员所知的其它方法分离。所属领域的一般技术人员很容易了解为实现此目的的合适酶的选择。
复制起点通常是那些市售原核表达载体的一部分，并且起点有助于在宿主细胞中扩增载体。若所选载体不含复制起点位点，则可基于已知序列进行化学合成并连接到载体内。例如，来自质粒pBR322(New England Biolabs，Beverly，MA)的复制起点适合于大多数革兰氏阴性细菌，并且各种病毒起源(例如，SV40、多瘤病毒(polyoma)、腺病毒(adenovirus)、水泡性口炎病毒(vesicular stomatitus virus，VSV)或乳头瘤病毒(papillomaviruses)(诸如HPV或BPV))用于在哺乳动物细胞中克隆载体。通常，哺乳动物表达载体不需要复制起点组件(例如，通常仅使用SV40起点，因为其还含有病毒早期启动子)。
转录终止序列通常位于多肽编码区的3′端并用于终止转录。通常，原核细胞中的转录终止序列是富含G-C的片段，之后是多聚T(poly-T)序列。虽然该序列容易从文库中克隆或甚至作为载体的一部分从市场上购买，但它也容易使用核酸合成方法(例如本文所述的那些方法)合成。
可选择标志物基因编码在选择性培养基中所生长的宿主细胞存活和生长所必需的蛋白。典型选择标志物基因编码以下蛋白：(a)对原核宿主细胞赋予抗生素或其它毒素(例如氨苄西林、四环素或卡那霉素)抗性的蛋白；(b)补充细胞的营养缺陷型缺乏(auxotrophic deficiency)的蛋白；或(c)提供不能从复合培养基或限定培养基获得的关键养分的蛋白。具体可选标记是卡那霉素抗性基因、氨苄西林抗性基因和四环素抗性基因。有利的是，新霉素抗性基因也可用于在原核和真核两种宿主细胞中的选择。
其它可选基因可用于扩增待表达的基因。扩增是基因(为产生对生长或细胞存活至关重要的蛋白质所必需的)在连续多代重组细胞的染色体内前后重复的过程。适合用于哺乳动物细胞的可选标记的例子包括二氢叶酸还原酶(DHFR)和无启动子胸苷激酶(promoterless thyrnidine kinase)基因。将哺乳动物细胞转化子置于选择压力之下，其中仅转化子借助于载体中存在的可选基因独特适应而存活。选择压力是通过在培养基中选择试剂的浓度连续升高的条件下培养转化细胞，由此导致可选基因和编码另一基因(例如与CD27L多肽结合的抗原结合蛋白抗体)的DNA两者扩增而施加。作为结果，从扩增的DNA合成诸如CD27L抗原结合蛋白的大量多肽。
核糖体结合位点通常是rnRNA的翻译起始所必需的并且特征是Shine-Dalgarno序列(原核生物)或Kozak序列(真核生物)。该元件通常位于启动子的3′端和待表达多肽的编码序列5′端。在某些实施方案中，一个或多个编码区可操作连接内部核糖体结合位点(IRES)，使得可翻译来自单一RNA转录物的两个开放阅读框。
在一些情况下(例如在真核宿主细胞表达系统中需要糖基化时)，可操纵各种前导序列或前序列(prosequence)来改良糖基化或产率。例如，可改变特定信号肽的肽酶裂解位点或添加还可影响糖基化的前序列。最终蛋白产物可能在-1位置(相对于成熟蛋白的第一个氨基酸)具有一个或多个易于表达的其它氨基酸，这一个或多个其它氨基酸可能不完全去除。例如，最终蛋白产物可能具有在肽酶裂解位点中所见的一个或两个氨基酸残基，其附接于氨基末端。可选择地，使用一些酶裂解位点可产生所需多肽的略截短形式(如果酶在成熟多肽内的这些区域切断)。
本发明的表达和克隆载体通常含有由宿主生物体所识别并且与编码CD27L抗原结合蛋白的分子可操作连接的启动子。启动子是位于结构基因的起始密码子上游(即5′端)(通常在约100至1000bp内)而控制结构基因转录的非转录序列。常规将启动子归为两类：诱导型启动子和组成型启动子。诱导型启动子在其控制下应答培养条件的一些改变(例如存在或不存在养分或温度改变)，起始从DNA的增高水平的转录。另一方面，组成型启动子一致地转录其可操作连接的基因，即几乎不或者不控制基因表达。由多种潜在宿主细胞所识别的大量启动子是熟知的。合适启动子通过利用限制性酶消化从来源DNA去除启动子并将所需启动子序列插入载体内，而与编码构成本发明CD27L抗原结合蛋白的重链或轻链的DNA可操作连接。
本领域还熟知与酵母宿主一起使用的适合启动子。酵母增强子有利地与酵母启动子一起使用。与哺乳动物宿主细胞一起使用的适合启动子是熟知的，其包括但不限于获自病毒基因组的启动子，所述病毒诸如多瘤病毒、鸡痘病毒、腺病毒(例如2型腺病毒)、牛乳头瘤病毒、禽类肉瘤病毒、巨细胞病毒、反转录病毒、B型肝炎病毒和最优选猴病毒40(SV40)。其它适合的哺乳动物启动子包括异源哺乳动物启动子，例如热休克启动子和肌动蛋白启动子。
可能受到关注的其它启动子包括但不限于：SV40早期启动(Benoist和Chambon，1981，Nature290：304-310)；CMV启动子(Thornsen等人，1984，Proc.Natl.Acad.U.S.A.81：659-663)；劳氏(Rous)肉瘤病毒的3′长末端重复序列所含有的启动子(Yamamoto等人，1980，Cell22：787-797)；疱疹胸苷激酶启动子(Wagner等人，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78：1444-1445)；金属硫蛋白基因的启动子和调控序列(Prinster等人，1982，Nature296：39-42)；和原核启动子，诸如β-内酰胺酶启动子(Villa-Kamaroff等人，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.75：3727-3731)；或tac启动子(DeBoer等人，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80：21-25)。还关注以下动物转录控制区，其显示组织特异性并且已被用于转基因动物中：在胰腺腺泡细胞中具有活性的弹性蛋白酶I型基因控制区(Swift等人，1984，Cell38：639-646；Ornitz等人，1986，Cold Spring HarborSymp.Quant.Biol.50：399-409；MacDonald，1987，Hepatology7：425-515)；在胰腺β细胞中具有活性的胰岛素基因控制区(Hanahan，1985，Nature315：115-122)；在淋巴细胞中具有活性的免疫球蛋白基因控制区(Grosschedl等人，1984，Cell38：647-658；Adames等人，1985，Nature318：533-538；Alexander等人，1987，Mol.Cell.Biol.7：1436-1444)；在睾丸、乳房、淋巴和肥大细胞中具有活性的小鼠乳腺瘤病毒控制区(Leder等人，1986，Cell45：485-495)；在肝脏中具有活性的白蛋白基因控制区(Pinkert等人，1987，Genes and Devel.1：268-276)；在肝脏中具有活性的α-胎儿蛋白基因控制区(Krumlauf等人，1985，Mol.Cell.Biol.5：1639-1648；Hammer等人，1987，Science253：53-58)；在肝脏中具有活性的α1-抗胰蛋白酶基因控制区(Kelsey等人，1987，Genes and Devel.1：161-171)；在骨髓细胞中具有活性的β-球蛋白基因控制区(Mogram等人，1985，Nature315：338-340；Kollias等人，1986，Cell46：89-94)；在脑的少突胶质细胞中具有活性的髓鞘碱性蛋白基因控制区(Readhead等人，1987，Cell48：703-712)；在骨胳肌中具有活性的肌球蛋白轻链-2基因控制区(Sani，1985，Nature314：283-286)；和在下丘脑中具有活性的促性腺释放激素基因控制区(Mason等人，1986，Science234：1372-1378)。
可将增强子序列插入载体中以增强较高级真核生物对编码包含本发明CD27L抗原结合蛋白的轻链或重链的DNA转录。增强子是DNA的顺式作用元件，通常长度约10-300bp，其作用于启动子以增强转录。增强子相对地不依赖取向和位置，已在转录单元的5′和3′端位置处发现。已知可从哺乳动物基因获得的若干增强子序列(例如，珠蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、α-胎儿蛋白和胰岛素)。然而，通常使用来自病毒的增强子。本领域已知的SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、多瘤病毒增强子和腺病毒增强子是用于活化真核启动子的示例性增强元件。虽然增强子可在载体中定位于编码序列的5′或3′端，但其通常位于启动子的5′端位点处。可将编码适当天然或异源信号序列(前导序列或信号肽)的序列并入表达载体内，以便促进抗体的细胞外分泌。信号肽或前导序列的选择取决于将要产生抗体的宿主细胞类型，并且异源信号序列可替代天然信号序列。在哺乳动物宿主细胞中起作用的信号肽例子包括以下：美国专利No.4,965,195中所述的白介素-7(IL-7)的信号序列；Cosman等人，1984，Nature312：768中所述的白介素-2受体的信号序列；EP专利No.0367 566中所述的白介素-4受体信号肽；美国专利No.4,968,607中所述的I型白介素-1受体信号肽；EP专利No.0 460 846中所述的II型白介素-1受体信号肽。
载体可含有当该载体被整合至宿主细胞基因组内时促进表达的一个或多个元件。例子包括EASE元件(Aldrich等人，2003Biotechnol Prog.19：1433-38)和基质结合区(MAR)。MAR介导染色质的结构组织以及可使整合的载体免受“位置”效应影响。因此，当载体用于生成稳定转染子时，MAR特别有用。大量天然和合成包含MAR的核酸为本领域已知的，例如，美国专利No.6,239,328；7,326,567；6,177,612；6,388,066；6,245,974；7,259,010；6,037,525；7,422,874；7,129,062。
本发明的表达载体可由诸如市售载体的起始载体构建。这些载体可能含有或可能不含有所有所需的侧翼序列。在本文所述侧翼序列中有一个或多个尚未存在于载体中的情况下，它们可个别获得并连接到载体中。本领域技术人员熟知用于获得各侧翼序列的方法。
在载体已构建并且编码包含CD27L抗原结合序列的轻链、重链或轻链和重链的核酸分子已插入载体中恰当位点之后，可将所完成的载体插入合适宿主细胞内用于扩增和/或多肽表达。将CD27L抗原结合蛋白的表达载体转化至选定宿主细胞内可通过熟知方法完成，所述方法包括转染、感染、磷酸钙共沉淀、电穿孔、显微注射、脂质转染、DEAE-葡聚糖介导的转染或其它已知技术。所选方法部分程度上随所用宿主细胞的类型而变。这些方法和其它合适方法为本领域技术人员所熟知并且例如在Sambrook等人，2001，同上中阐明。
当在适当条件下培养时，宿主细胞合成CD27L抗原结合蛋白，之后所述CD27L抗原结合蛋白可从培养基(若宿主细胞将其分泌至培养基中)或直接从产生其的宿主细胞(若不被分泌出来)中收集。适当宿主细胞的选择取决于各种因素，诸如所要表达水平、活化所需要或所必需的多肽修饰(诸如糖基化或磷酸化)和折叠成生物活性分子的容易性。宿主细胞可以为真核或原核。
可用作表达宿主的哺乳动物细胞系在本领域熟知以及包括但不限于可获自美国模式培养物保藏所(American Type Culture Collection，ATCC)的永生化细胞系，并且在本领域已知的表达系统中使用的任何细胞系可用于制备本发明的重组多肽。通常，使用重组表达载体来转化宿主细胞，该重组表达载体包含编码所需抗-CD27L抗体多肽的DNA。可采用的宿主细胞为原核生物、酵母或较高级的真核细胞。原核生物包括革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如大肠杆菌(E.coli)或者杆菌(bacilli)。较高级的真核细胞包括昆虫细胞和哺乳动物来源的已确立细胞系。合适哺乳动物宿主细胞系的例子包括猴肾细胞的COS-7系(ATCC CRL1651)(Gluzman等人，1981，Cell23：175)；L细胞；293细胞；C127细胞；3T3细胞(ATCC CCL163)；中国仓鼠卵巢(CHO)细胞；或者它们的衍生物，例如在无血清培养基中生长的Veggie CHO和相关的细胞系(Rasmussen等人，1998，Cytotechnology28：31)；HeLa细胞；BHK(ATCC CRL10)细胞系；如通过McMahan等人，1991，EMBO J.10：2821描述来源于非洲绿猴肾细胞系CVI(ATCC CCL70)的CVI/EBNA细胞系；人胚肾细胞，例如293、293EBNA或MSR293；人表皮A431细胞；人Colo205细胞；其它经转化的灵长类细胞系；正常二倍体细胞；来源于初生组织体外培养的细胞菌株；初生外植物(primary explant)；HL-60；U937；HaK或Jurkat细胞。任选地，当在各种信号转导或报道基因分析中需要使用多肽时，哺乳动物细胞系(例如HepG2/3B、KB、NIH3T3或S49)可用于表达多肽。可选择地，在诸如酵母的较低级真核生物中或者在诸如细菌的原核生物中产生多肽是可能的。合适的酵母包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)菌株、念珠菌属(Candida)或者能够表达异源性多肽的任何酵母菌株。合适的细菌菌株包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)或者能够表达异源性多肽的任何细菌菌株。如果多肽由酵母或细菌制备，则可能需要修饰本文产生的多肽，例如通过磷酸化或糖基化适当位点，从而获得功能多肽。使用已知化学或酶方法可完成这些共价连接。通过使本发明的分离的核酸与在一个或多个昆虫表达载体中合适控制序列可操作连接以及采用昆虫表达系统也可产生多肽。用于杆状病毒/昆虫细胞表达系统的材料和方法以试剂盒形式市售，例如，Invitrogen，San Diego，Calif.，U.S.A.(
Figure BDA0000509038660000611
试剂盒)，并且这些方法是本领域熟知的，如在Summers和Smith，Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No.1555(1987)以及Luckow和Summers，Bio/Technology6：47(1988)中所描述。也可采用无细胞翻译系统，从而使用来源于本文所公开的核酸构建物的RNA来产生多肽。通过Pouwels等人(CloningVectors：ALaboratory Manual，Elsevier，New York，1985)描述与细菌、真菌、酵母和哺乳动物细胞宿主一起使用的恰当克隆和表达载体。包含本发明的分离的核酸的宿主细胞为“重组宿主细胞”，所述本发明的分离的核酸优选可操作连接至少一个表达控制序列。
在某些实施方案中，通过测定何种细胞系具有高表达水平并且构成性产生具有CD27L结合性质的抗原结合蛋白可选择细胞系。在另一实施方案中，可选择来自B细胞谱系的细胞系，其不制备自身抗体但具有制备和分泌异源性抗体的能力。
抗体药物缀合物
本发明的实施方案包括抗体药物缀合物(ADC)。通常，ADC包含与化疗剂(例如，细胞毒素剂、细胞生长抑制剂、毒素或放射性试剂)缀合的抗体。接头分子可用于使药物与抗体缀合。在ADC技术中有用的多种接头和药物是本领域已知的，并可用于本发明的实施方案中。(参见US20090028856；US2009/0274713；US2007/0031402；WO2005/084390；WO2009/099728；US5208020；US5416064；US5475092；5585499；6436931；6372738；和6340701，其全部通过引用方式并入本文)。
通过体外方法可制备抗体药物缀合物。为了连接药物或前药与抗体，使用连接基团。合适的连接基团为本领域众所周知的以及包括二硫基、酸不稳定基团、光不稳定基团、肽酶不稳定基团和酯酶不稳定基团。优选的连接基团为二硫基。例如，使用在抗体和药物或前药之间的二硫交换反应可构建缀合物。通过中间载体分子(例如血清白蛋白)也可使药物分子连接细胞结合剂(cell binding agent)。
在某些实施方案中，通过使双官能交联剂(bifunctional crosslinkingreagent)与细胞结合剂反应来修饰细胞结合剂，从而得到接头分子与细胞结合剂的共价连接。如本文所使用，“双官能交联剂”或者“接头”是共价连接细胞结合剂与药物(例如本文所述的药物)的任意化学部分。在本发明的特定实施方案中，通过药物提供一部分连接部分。在该方面中，该药物包含连接部分，该连接部分为用于接合细胞结合剂与药物的较大接头分子的一部分。例如，为了形成美登醇(maytansinoid)DM1，将在美登生碱(maytansine)的C-3羟基处侧链修饰为具有游离巯基(SH)。该美登生碱的硫醇化形式可与经修饰的细胞结合剂反应以形成缀合物。因此，最终接头由两种组分组装，其中之一通过交联剂提供，而另一种通过DM1的侧链提供。
可结合本发明使用任何合适的双官能交联剂，只要接头试剂提供保留药物和细胞结合剂各自的治疗(例如，细胞毒性)和靶向性质。优选地，接头分子通过化学键接合药物与细胞结合剂(如上所述)，只要药物与细胞结合剂彼此可化学偶联(例如，共价键合)。接头
在某些实施方案中，ADC包含由一种或多种接头组分构成的接头。优选地，药物通过二硫键连接细胞结合剂。接头分子包含反应化学基团，该反应化学基团可与细胞结合剂反应。与细胞结合剂反应的优选反应化学基团为N-琥珀酰亚胺酯和N-磺基琥珀酰亚胺酯。此外，接头分子包含反应化学基团，优选为二硫代吡啶基，该反应化学基团可与药物反应以形成二硫键。示例性接头分子包括例如，N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)(参见例如，Carlsson等人，Biochem.J.，173，723-737(1978))；N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯(SPDB)(参见例如，美国专利No.4,563,304)和N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫代)戊酸酯(SPP)(参见例如，CAS登录号341498-08-6)。另外的示例性接头组分包括6-马来酰亚胺己酰基、马来酰亚胺丙酰基、缬氨酸-瓜氨酸、丙氨酸-苯丙氨酸、p-氨基苄氧羰基和与接头试剂缀合产生的那些，该接头试剂包括但不限于：N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯(“SPP”)、N-琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(“SMCC”，本文也称为“MCC”)和N-琥珀酰亚胺基(4-碘代-乙酰基)氨基苯甲酸酯(“SLAB”)。
接头可以为“可裂解”接头或者“非可裂解”接头(Ducry和Stump，BioconjugateChem.2010，21，5-13；通过引用方式整体并入本文)。可裂解接头设计为当受到某些环境因素影响时(例如，当内化至靶细胞内)释放药物。可裂解接头包括酸不稳定接头、蛋白酶敏感性接头、光不稳定接头、二甲基接头或者包含二硫化物的接头。不可裂解的接头倾向于保持与抗体的至少一个氨基酸和通过在靶细胞内内化和降解的药物共价缔合。不可裂解的接头是能够以稳定、共价方式连接药物(例如，美登醇(例如，DM1等)、紫杉烷或CC-1065类似物)与细胞结合剂的任何化学部分。因此，在药物或细胞结合剂仍然具有活性的条件下，不可裂解的接头基本上耐受酸诱导的裂解、光诱导的裂解、肽酶诱导的裂解、酯酶诱导的裂解和二硫键裂解。
在药物和细胞结合剂之间形成不可裂解的接头的合适交联剂为本领域所熟知。不可裂解的接头的例子包括具有用于与细胞结合剂反应的N-琥珀酰亚胺酯或N-磺基琥珀酰亚胺酯部分以及用于与药物反应的基于马来酰亚胺-或卤代乙酰基-部分的接头。包含基于马来酰亚胺-部分的交联接头试剂包括N-琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺甲基)环己烷羧酸酯(SMCC)；N-琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)-环己烷-1-羧基-(6-酰胺己酸酯)，其为SMCC(LC--SMCC)的“长链”类似物；x-马来酰亚胺基十一烷酸N-琥珀酰亚胺酯(KMUA)；γ.-马来酰亚胺基丁酸N-琥珀酰亚胺酯(GMBS)；.ε.-马来酰亚胺基己酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(EMCS)；m-马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MBS)；N-(.α.-马来酰亚胺基乙酸基)-琥珀酰亚胺酯(AMAS)；琥珀酰亚胺基-6-(.β.-马来酰亚胺基丙酰胺基)己酸酯(SMPH)；N-琥珀酰亚胺基4-(p-马来酰亚胺基苯基)-丁酸酯(SMPB)；和N-(p-马来酰亚胺基苯基)异氰酸酯(PMPI)。包含基于卤代乙酰基部分的交联剂包括N-琥珀酰亚胺基-4-(碘代乙酰基)-氨基苯甲酸酯(SIAB)、N-琥珀酰亚胺基碘醋酸酯(SIA)、N-琥珀酰亚胺基溴醋酸酯(SBA)和N-琥珀酰亚胺基3-(溴乙酰胺基)丙酸酯(SBAP)。优选的示例性不可裂解的接头为MCC。
形成不可裂解的接头的缺乏硫原子的其它交联剂接头也可用于本发明方法中。合适的接头可来源于基于二羧酸的部分。合适的基于二羧酸的部分包括但不限于通式(IX)的α、ω-二羧酸：
HOOC--X1--Yn--Zm--COOH (IX)，
其中X是具有2至20个碳原子的直链或支链烷基、烯基或炔基；Y是具有3至10个碳原子的环烷基或环烯基；Z是具有6至10个碳原子的经取代或未经取代芳香基或者经取代或未经取代的杂环基，其中杂原子选自N、O或S，以及其中l、m和n分别为0或1，条件是l、m和n不是同时全部为零。
本文所公开的许多不可裂解的接头详细描述在美国专利申请公开2005/0169933A1中。
合适的可裂解接头的例子包括二硫化物接头、酸不稳定接头、光不稳定接头、肽酶不稳定接头和酯酶不稳定接头。包含二硫化物的接头为通过二硫化物交换可裂解的接头，该二硫化物交换可在生理条件下发生。酸不稳定接头为在酸性pH下可裂解的接头。例如，某些细胞内区室(例如核内体和溶酶体)具有酸性pH(pH4-5)，并提供适于裂解酸不稳定接头的条件。光不稳定接头用于容易接触光的体表处和多处体腔中。而且，红外光可渗透组织。肽酶不稳定接头可用于裂解细胞内或外的某些肽(参见例如，Trouet等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79，626-629(1982)，和Umemoto等人，Int.J.Cancer，43，677-684(1989))。药物
在某些实施方案中，抗体与化疗剂缀合。化疗剂的例子包括烷化剂，例如噻替哌和环磷酰胺(CYTOXAN.TM.)；烷基磺酸酯，例如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶(aziridine)，例如苯并多巴(benaodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替哌(meturedopa)和尿烷亚胺(uredopa)；乙撑亚胺(ethylenimine)和甲基蜜胺(methylamelamine)，其包括六甲蜜胺(altretamine)、曲他胺(triethylenemelamine)、三亚乙基磷酰胺(trietylenephosphoramide)、三亚乙基硫代磷酰胺(triethylenethiophosphaoramide)和三羟甲基蜜胺(trimethylolomelamine)；多聚乙酰(acetogenin)(特别是布拉他辛(bullatacin)和布拉它辛酮(bullatacinone))；喜树碱(包括合成的类似物拓扑替康(topotecan))；苔藓抑素(bryostatin)；callystatin；CC-1065(包括它的阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；隐藻素(cryptophycin)(特别是隐藻素1和隐藻素8)；海兔毒素(dolastatin)；倍癌霉素(duocarmycin)(包括合成类似物，KW-2189和CBI-TMI)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；水鬼蕉碱(pancratistatin)；匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)；海绵素(spongistatin)；氮芥(nitrogen mustard)，例如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlomaphazine)、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌氮芥(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、氮芥(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxidehydrochloride)；左旋苯丙氨酸氮芥(melphalan)、新氮芥(novembichin)、胆甾醇苯乙酸氮芥(phenesterine)、泼尼氮芥(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亚硝基脲(nitrosureas)，例如亚硝基脲氮芥(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)、雷莫司汀(ranimustine)；抗生素，例如烯二炔抗生素(enediyneantibiotic)(例如卡里奇霉素(calicheamicin)，尤其是卡里奇霉素.γ1和卡里奇霉素θI，参见例如Angew Chem.Intl.Ed.Engl.33：183-186(1994)；达内霉素(dynemicin)，包括达内霉素A；埃斯培拉霉素(esperamicin)；以及新制癌菌素生色团(neocarzinostatinchromophore)和相关的色蛋白烯二炔抗生素生色团、阿克拉霉素、放线菌素、安曲霉素(authramycin)、重氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、卡柔比星(carabicin)、洋红霉素(caminomycin)、嗜癌菌素(carzinophilin)、色霉素(chromomycins)、更生霉素(dactinomycin)、道诺红菌素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、阿霉素(doxorubicin)(包括吗啉代-阿霉素、氰基吗啉代-阿霉素、2-吡咯啉基-阿霉素和脱氧阿霉素)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、发波霉素(marcellomycin)、丝裂霉素、霉酚酸、诺加霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、泼非洛霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素、链脲霉素(streptozocin)、杀结核菌素、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢药，例如氨甲蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，例如二甲叶酸(denopterin)、氨甲蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，例如氟达拉滨((fludarabine)、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，例如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷、5-FU；雄激素类，例如二甲睾酮(calusterone)、丙酸甲雄烷醇酮(dromostanolone propionate)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酪(testolactone)；抗肾上腺类，例如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，例如亚叶酸(frolinic acid)；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(biasntrene)；依达曲沙(edatraxate)；defofamine；秋水仙胺(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；elfornithine；依利醋铵(elliptiniumacetate)；埃博霉素(epothilone)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidamine)；美登醇，例如美登生碱和美登木素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamol)；硝呋旦(nitracrine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；2-乙基酰肼；甲基苄肼；PSK.RTM.；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西咗喃(sizofuran)；锗螺胺(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2，2′，2″-三氯三乙胺；单端孢霉烯族毒素类(trichothecenes)(特别是T-2毒素、抚孢菌素(verracurin)A、杆孢菌素A和蛇形菌素(anguidine))；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷(arabinoside)(″Ara-C″)；环磷酰胺；噻替哌；紫杉烷类(taxoids)，例如紫杉醇(TAXOL.TM.，Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，N.J.)和紫杉萜(TAXOTERE.RTM.，Rhone-Poulenc Rorer，Antony，France)；苯丁酸氮芥；吉西他滨(gemcitabine)；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；氨甲蝶呤；铂类似物，例如顺铂和卡铂；长春花碱；铂；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺(ifosfamide)；丝裂霉素C；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺维本(navelbine)；诺消灵(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；道诺霉素；氨基蝶呤；希罗达(xeloda)；伊班膦酸盐(ibandronate)；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS2000；二氟甲基鸟氨酸(difluoromethylomithine，DMFO)；视黄酸；卡培他滨(capecitabine)；以及上述任何物质的药学上可接受的盐、酸或衍生物。此定义还包括能调节或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素剂，例如抗雌激素剂，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)、雷洛昔芬(raloxifene)、芳香酶抑制剂4(5)-咪唑、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、那洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮(onapristone)和托瑞米芬(toremifene)(Fareston)；和杭雄激素制剂，例如氟他胺(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、比卡鲁胺(bicalutamide)、亮丙瑞林(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin)；siRNA以及上述任何物质的药学上可接受的盐、酸或衍生物。本发明可使用的其它化疗剂在美国专利公开No.20080171040或者美国专利公开No.20080305044中公开，并通过引用方式整体并入。
据预计，抗体可以与两种或者多种不同的化疗剂缀合，或者药物组合物可包含抗体的混合物，其中除了与不同化疗剂缀合之外，抗体组分相同。这些实施方案可用于靶向靶细胞内的多个生物途径。
在优选的实施方案中，ADC包含与一个或多个美登醇分子缀合的抗体，所述美登醇分子为通过抑制微管蛋白聚合作用的有丝分裂抑制剂。包括各种修饰的美登醇描述在美国专利No.3896111；4151042；4137230；4248870；4256746；4260608；4265814；4294757；4307016；4308268；4309428；4313946；4315929；4317821；4322348；4331598；4361650；4364866；4424219；4450254；4362663；4371533；和WO2009/099728中。美登醇药物部分可由天然来源分离、使用重组技术生产或者合成制备。示例性美登醇包括C-19-脱氯(美国专利No.4256746)；C-20-羟基(或者C-20-脱甲基)+/-C-19-脱氯(美国专利No.4307016和4361650)；C-20-脱甲氧基(或者C-20-酰氧基(-OCOR)，+/-脱氯(美国专利No.4294757)；C-9-SH(美国专利No.4,424,219)；C-14-烷氧基甲基(脱甲氧基/CH2OR)(美国专利No.4,331,598)；C-14-羟基甲基或者酰氧基甲基(CH2OH或CH2OAc)(美国专利No.4,450,254)；C-15-羟基/酰氧基(美国专利No.4,364,866)；C-15-甲氧基(美国专利No.4,313,946和4,315,929)；C-18-N-脱甲基(美国专利No.4,362,663和4,322,348)；以及4，5-脱氧(美国专利No.4,371,533)。
取决于所需连接类型，在美登醇化合物上各处位置可用作连接位置。例如，对于形成酯键，具有羟基的C-3位置、使用羟甲基修饰的C-14位置、使用羟基修饰的C-15位置和具有羟基的C-20位置均合适(美国专利No.5208020、RE39151和6913748；美国专利申请公开No.20060167245和20070037972以及WO2009099728)。
优选的美登醇包括本领域已知的那些，例如DM1、DM3和DM4(美国专利申请公开No.2009030924和20050276812，其通过引用方式并入本文)。
包含美登醇的ADC、制备这些ADC的方法和它们的治疗用途公开在美国专利No.5208020和5416064、美国专利申请公开No.20050276812和WO2009099728中(其全部通过引用方式并入本文)。用于制备美登醇ADC的接头是本领域已知的(美国专利No.5208020和美国专利申请公开No.2005016993和20090274713；其全部通过引用方式并入本文)。包含SMCC接头的美登醇ADC可如在美国专利公开No.2005/0276812中制备。
在某些实施方案中，ADC包含与具有SMCC接头的DM1缀合的抗体。优选的实施方案包括Ab1-SMCC-DM1、Ab2-SMCC-DM1、Ab3-SMCC-DM1、Ab4-SMCC-DM1、Ab5-SMCC-DM1、Ab6-SMCC-DM1、Ab7-SMCC-DM1和Ab8-SMCC-DM1。
药物负载
ADC可具有每抗体1至20种化疗剂。通过在组合物中每个抗体分子的药物部分平均数可表征ADC的组合物。通过诸如质谱分析、免疫分析和HPLC的常见方法可测定药物部分的平均数。在一些情况下，通过反相HPLC或者电泳的方式可分离和纯化同质ADC群。因此，药物ADC组合物可含有连接1、2、3、4、5、6、7或更多种药物部分的异质或同质抗体群。
在优选的实施方案中，ADC包含与一个或多个DM1分子缀合的抗体。本发明的实施方案包括包含每抗体平均约1、约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、约10、约11、约12、约13、约14、约15、约16、约17、约18、约19或约20个DM1分子的组合物。优选的ADC组合物为：包含Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7或Ab8的那些组合物，其具有每抗体平均1至10个之间的DM1分子；包含具有每抗体平均3至7个之间DM1分子的抗体的那些组合物；以及包含具有每抗体平均4至6个之间DM1分子(包括平均约4.0、约4.1、约4.2、约4.3、约4.4、约4.5、约4.6、约4.7、约4.8、约4.9、约5.0、约5.1、约5.2、约5.3、约5.4、约5.5、约5.6、约5.7、约5.8、约5.9和约6.0个DM1分子)的抗体的那些组合物。
效应子功能增强的抗体
抗体的Fc部分的功能之一是当抗体与它的靶结合时向免疫系统通讯。这被认为是“效应子功能”。通讯导致抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、依赖抗体的细胞吞噬作用(ADCP)和/或补体依赖细胞毒性(CDC)。通过在免疫系统细胞的表面上Fc与Fc受体的结合来介导ADCC和ADCP。通过Fc与补体系统的蛋白(例如，Clq)的结合来介导CDC。
IgG亚类在它们介导效应子功能的能力上不同。例如，在介导ADCC和CDC上，IgG1远远优于IgG2和IgG4。因此，在靶向破坏表达CD27L的细胞的实施方案中，优选抗-CD27L IgG1抗体。
通过引入一个或多个突变至Fc内可增加或降低抗体的效应子功能。本发明的实施方案包括具有经工程化以增加效应子功能的Fc的抗原结合蛋白(例如，抗体)(U.S.7,317,091和Strohl，Curr.Opin.Biotech.，20：685-691，2009；两者均通过引用方式整体并入本文)。具有增加效应子功能的示例性IgG1Fc分子包括(根据Kabat编号方案)具有以下取代的那些分子：
S239D/1332E
S239D/A330S/1332E
S239D/A330L/1332E
S298A/D333A/K334A
P2471/A339D
P2471/A339Q
D280H/K290S
D280H/K290S/S298D
D280H/K290S/S298V
F243L/R292P/Y300L
F243L/R292P/Y300L/P396L
F243L/R292P/Y300L/V3051/P396L
G236A/S239D/1332E
K326A/E333A
K326W/E333S
K290E/S298G/T299A
K290N/S298G/T299A
K290E/S298G/T299A/K326E
K290N/S298G/T299A/K326E
本发明的进一步实施方案包括具有经工程化以增加效应子功能的Fc的抗原结合蛋白(例如，抗体)。具有增加效应子功能的示例性Fc分子包括(根据Kabat编号方案)具有以下取代的那些分子：
N297A(lgG1)
L234A/L235A(lgG1)
V234A/G237A(lgG2)
L235A/G237A/E318A(lgG4)
H268Q/V309L/A330S/A331S(lgG2)
C220S/C226S/C229S/P238S(lgG1)
C226S/C229S/E233P/L234V/L235A(lgG1)
L234F/L235E/P331S(lgG1)
S267E/L328F(lgG1)
增加包含IgG Fc的蛋白的效应子功能另一方法是通过降低Fc的岩藻糖基化。由连接Fc的二天线(biantennary)复合型寡糖中去除核心岩藻糖非常大地降低ADCC效应子功能，但不改变抗原结合或CDC效应子功能。已知降低或消除包含Fc的分子(例如，抗体)的岩藻糖基化的多种方法。这些方法包括在某些哺乳动物细胞系中重组表达，所述某些哺乳动物细胞系包括FUT8敲除细胞系；变体CHO系Lec13；大鼠杂交瘤细胞系YB2/0；包含特异性针对FUT8基因的小干扰RNA的细胞系；以及共表达B-1，4-N-乙酰葡萄糖转移酶III和高尔基体-α-甘露糖苷酶II的细胞系。可选择地，包含Fc的分子可表达在非哺乳动物细胞中，例如植物细胞、酵母或原核细胞(例如，大肠杆菌)。因此，在本发明的某些实施方案中，组合物包含具有降低的岩藻糖基化或者完全没有岩藻糖基化的抗体，例如，Ab1、Ab2、Ab3、Ab4、Ab5、Ab6、Ab7或Ab8。
药物组合物
在一些实施方案中，本发明提供包含治疗有效量的一种或多种本发明的抗原结合蛋白以及药学上有效的稀释剂、载体、增溶剂、乳化剂、防腐剂和/或佐剂的药物组合物。在某些实施方案中，抗原结合蛋白是抗体，其包括与药物缀合的抗体或者双特异性抗体。本发明的药物组合物包括但不限于液体、冷冻和冻干的组合物。
优选地，配制物材料在所用剂量和浓度下对接受者无毒。在具体实施方案中，提供包含治疗有效量的CD27L抗原结合蛋白的药物组合物，例如结合CD27L的ADC。
在某些实施例中，药物组合物可包含用于改变、维持或保存例如组合物pH值、渗透性、粘度、澄清度、颜色、等渗性、气味、无菌度、稳定性、溶解或释放速率、吸附或穿透性的配制物材料。在这些实施例中，合适的配制物材料包括但不限于氨基酸(例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸)；抗菌剂；抗氧化剂(例如抗坏血酸、亚硫酸钠或亚硫酸氢钠)；缓冲液(例如硼酸盐、碳酸氢盐、Tris-HCl、柠檬酸盐、磷酸盐或其它有机酸)；膨胀剂(例如甘露糖醇或甘氨酸)；鳌合剂(例如乙二胺四乙酸(EDTA))；络合剂(例如咖啡碱、聚乙烯吡咯烷酮、β-环糊精或羟丙基-β-环糊精)；填充剂；单糖；双糖；和其它碳水化合物(例如葡萄糖、甘露糖或糊精)；蛋白质(例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白)；着色剂、调味剂和稀释剂；乳化剂；亲水性聚合物(例如聚乙烯吡咯烷酮)；低分子量多肽；成盐平衡离子(例如钠)；防腐剂(例如苯扎氯铵(benzalkonium chloride)、苯甲酸、水杨酸、硫柳汞、苯乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯己定(chlorhexidine)、山梨酸或过氧化氢)；溶剂(例如甘油、丙二醇或聚乙二醇)；糖醇(例如甘露糖醇或山梨糖醇)；悬浮剂；表面活性剂或湿润剂(例如泊洛尼克(pluronic)、PEG、脱水山梨糖醇酯、聚山梨醇酯(例如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯)、曲拉通(triton)、氨丁三醇(tromethamine)、卵磷脂、胆固醇、泰洛沙伯(tyloxapal))；稳定性增强剂(例如蔗糖或山梨糖醇)；张力增强剂(例如碱金属卤化物，优选是氯化钠或氯化钾、甘露糖醇、山梨糖醇)；递送媒介物；稀释剂；赋形剂和/或药物佐剂。参见，REMINGTON′S PHARMACEUTICAL SCIENCES，第18版，(A.R.Genrmo编辑)，1990，MackPublishing Company。
在某些实施方案中，最佳药物组合物将由本领域技术人员依据例如期望施用途径、递送形式和所需剂量来确定。参见，例如REMINGTON′S PHARMACEUTICAL SCIENCES，同上。在某些实施方案中，这些组合物可能影响本发明抗原结合蛋白的物理状态、稳定性、体内释放速率和体内清除速率。在某些实施例中，药物组合物中的主要媒介物或载体实质上可以是水性或非水性的。例如，合适媒介物或载体可以是注射用水、生理盐水溶液或人工脑脊液，并且可能补充有胃肠外施用的组合物中所常用的其它材料。中性缓冲生理盐水或与血清白蛋白混合的生理盐水是另外的示例性媒介物。在具体实施方案中，药物组合物包含约pH7.0-8.5的Tris缓冲液或约pH4.0-5.5的醋酸盐缓冲液，并且可进一步包括山梨糖醇或其合适替代物。在本发明的某些实施方案中，CD27L抗原结合蛋白组合物可通过使具有所需纯度的所选组合物与任选配制试剂(REMINGTON′S PHARMACEUTICAL SCIENCES，同上)混合以冻干块(lyophilized cake)或水溶液形式制备储存。此外，在某些实施方案中，CD27L抗原结合蛋白产品可使用适当赋形剂(例如蔗糖)配制为冻干剂。
本发明的药物组合物可选择进行胃肠外递送。可选择地，组合物可选择进行吸入或经由消化道(例如经口)递送。这些药学上可接受的组合物的制备为本领域技术范围之内。配制物组分优选以施用部位可接受的浓度存在。在某些实施方案中，缓冲液用于将组合物维持在生理pH值或略低的pH值，通常在约5至约8的pH值范围内。
当预期经胃肠外施用时，用于本发明的治疗组合物可提供为包含所需CD27L抗原结合蛋白在药学上可接受媒介物中的无热原质、胃肠外可接受的水溶液形式。尤其适合用于胃肠外注射的媒介物是无菌蒸馏水，在其中将CD27L抗原结合蛋白配制为恰当保存的无菌、等渗溶液。在某些实施方案中，制备可包括将所需分子与可提供产物(其可经由积存注射(depot injection)递送)受控或持续释放的试剂一起配制，所述试剂诸如可注射微球体、生物可降解颗粒、聚合化合物(例如聚乳酸或聚乙醇酸)、珠粒或脂质体。在某些实施方案中，还可使用能够提升循环中持续时间作用的透明质酸。在某些实施方案中，可使用可植入药物递送装置来引入所需抗原结合蛋白。
本发明的药物组合物可经配制用于吸入。在这些实施方案中，CD27L抗原结合蛋白有利地配制为可吸入干粉。在具体实施方案中，CD27L抗原结合蛋白吸入溶液还可以用推进剂配制用于气雾剂递送。在某些实施方案中，溶液可经雾化。因此，肺部施用及其配制方法另外描述于国际专利申请No.PCT/US94/001875中，其通过引用方式并入本文并且描述经化学修饰蛋白的肺部递送。
还预期配制物可经口施用。以此方式施用的CD27L抗原结合蛋白可用或不用固体剂型(例如片剂和胶囊)配制中常用的载体配制。在某些实施方案中，胶囊可设计为在胃肠道中生物利用率最大并且全身循环前(pre-systemic)降解最小之时释放配制物的活性部分。可包括促进CD27L抗原结合蛋白吸收的其它试剂。还可采用稀释剂、调味剂、低熔点蜡、植物油、润滑剂、悬浮剂、片剂崩解剂和粘合剂。
本领域技术人员很清楚另外的药物组合物，其包括持续或受控递送配制物中包含CD27L抗原结合蛋白的配制物。多种其它持续或受控递送手段(例如脂质体载体、生物可降解微粒或多孔珠粒和积存注射剂)的配制技术也为本领域技术人员所知。参见，例如国际专利申请No.PCT/US93/00829，其通过引用方式并入本文并且描述用于递送药物组合物的多孔聚合物微粒的受控释放。持续释放制剂可包括呈成型制品形式(例如薄膜或微胶囊)的半透性聚合物基质。持续释放基质可包括聚酯、水凝胶、聚乳酸(polylactide)(例如美国专利No.3,773,919和欧洲专利申请公开No.EP058481中所公开，其各自通过引用方式并入本文)；L-谷氨酸和γ乙基-L-谷氨酸的共聚物(Sidman等人，1983，Biopolymers2：547-556)；聚(2-羟基乙基-甲基丙烯酸酯)(Langer等人，1981，J.Biomed.Mater.Res.15：167-277和Langer，1982，Chem.Tech.12：98-105)；乙烯乙酸乙烯酯(Langer等人，1981，同上)或聚-D(-)-3-羟基丁酸(欧洲专利申请公开No.EP133,988)。持续释放组合物还可包括脂质体，其可通过本领域已知的若干方法中的任一种制备。参见，例如通过引用方式并入的Eppstein等人，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82：3688-3692；欧洲专利申请公开No.EP036,676；EP088,046和EP143,949。
用于体内施用的药物组合物通常提供为无菌制剂。杀菌可通过无菌过滤膜过滤来完成。当将组合物冻干时，使用此方法的杀菌操作可于冻干和重新配制(reconstitution)之前或之后执行。胃肠外施用的组合物可储存为冻干形式或溶液形式。通常将胃肠外组合物置于具有无菌取样口(access port)的容器中，例如具有皮下注射针可穿透的塞子的静脉溶液袋或小瓶。
本发明的一些方面包括如通过引用方式整体并入本文中的国际专利申请WO06138181A2(PCT/US2006/022599)所述的自缓冲(self-buffering)CD27L抗原结合蛋白配制物，其可用作药物组合物。
如上所讨论，某些实施方案提供CD27L抗原结合蛋白的蛋白组合物，特别是药物CD27L抗原结合蛋白组合物，除了CD27L抗原结合蛋白之外，其包含一种或多种赋形剂，例如在本章节和本文中其它处中示意性描述的那些赋形剂。在这点上，本发明可使用赋形剂用于多种目的，例如调节配制物的物理、化学或生物性质；例如调节粘度和或调整本发明的方法以改善效力和或针对由于例如在制造、装运、储存、使用前制备、施用和此后出现的压力导致的降解和损坏来稳定这些配制物和方法。
可获得在这方面有用的关于蛋白稳定性以及制剂材料和方法的各种公开说明，例如Arakawa等人，″Solvent interactions in pharmaceutical formulations，″PharmRes.8(3)：285-91(1991)；Kendrick等人，″Physical stabilization of proteins inaqueous solution，″在：RATIONAL DESIGN OF STABLE PROTEIN FORMULATIONS：THEORYAND PRACTICE，Carpenter和Manning编辑，Pharmaceutical Biotechnology.13：61-84(2002)；和Randolph等人，″Surfactant-protein interactions，″Pharm Biotechnol.13：159-75(2002)，其各自通过引用方式全部并入本文，特别是关于按照本发明的自缓冲蛋白配制物的赋形剂及其方法的部分，尤其是关于兽用和/或人医药用途的蛋白药物产品和方法。
按照本发明的实施方案可使用盐以例如调节配制物的离子强度和/或等渗性，和/或以改善按照本发明的组合物的蛋白或其它成分的溶解性和/或物理稳定性。
如所熟知，离子通过结合在蛋白的表面上带电残基和通过屏蔽在蛋白中带电和极性基团以及减少它们静电相互作用、相互吸引和排斥作用的强度可稳定蛋白的天然状态。离子通过结合(尤其)蛋白的变性肽键(--CONH)也可稳定蛋白的变性状态。而且，离子与蛋白中带电和极性基团的相互作用也可降低分子间静电相互作用，从而防止和减少蛋白聚集和不溶解。
在它们对蛋白的作用上，离子种类之间差异显著。已经发展出大量离子的分类等级和它们对蛋白的作用，这些可用于配制按照本发明的药物组合物。一个例子为霍夫迈斯特序列(Hofmeister series)，其通过离子和极性非离子溶质对溶液中蛋白的构象稳定性的作用来对它们排序。稳定性溶质被称为“离液序列低(kosmotropic)”。不稳定溶质被称为“离液序列高(chaotropic)”。在高浓度(例如，＞1摩尔硫酸铵)下通常使用离液序列低溶质(Kosmotrope)以由溶液中沉淀蛋白(“盐析”)。使用离液序列高溶质(Chaotrope)来补充(denture)和/或溶解蛋白(“盐溶”)。离子对“盐溶”和“盐析”相对效力定义它们在霍夫迈斯特序列中位置。
游离氨基酸可以在按照本发明的各个实施方案的CD27L抗原结合蛋白配制物中用作膨胀剂、稳定剂和抗氧化剂以及其它标准用途。赖氨酸、脯氨酸、丝氨酸和丙氨酸可用于稳定在配制物中的蛋白。在冻干中使用甘氨酸以确保恰当的块状结构和性质。精氨酸可用于在液体和冻干的配制物中抑制蛋白聚集。甲硫氨酸用作抗氧化剂。
多元醇包括糖，例如，甘露糖醇、蔗糖和山梨糖以及多元醇，该多元醇例如甘油和丙二醇以及用于本文讨论的聚乙二醇(PEG)和相关的物质。多元醇为离液序列低。它们在液体和冻干的配制物中是保护蛋白免受物理和化学降解过程的有用的稳定剂。多元醇也用于调节配制物的张度。
在本发明的选择实施方案中使用的多元醇为甘露糖醇，其通常用于确保在冻干的配制物中块的结构稳定性。它确保块的结构稳定性。通常使用冻干保护剂(lyoprotectant)，例如，蔗糖。山梨糖和蔗糖是调节张度和作为稳定剂的优选试剂，从而防止在运输中冷冻-融化(freeze-thaw)压力或者在制造过程中大批制备。诸如葡萄糖和乳糖的还原糖(其包含游离醛或酮基)可糖化表面赖氨酸和精氨酸残基。因此，它们通常不是按照本发明用途的优选多元醇。此外，形成这些反应种类的糖(例如蔗糖)也不是就这点来说的本发明的优选多元醇，在酸性条件下该糖水解为果糖和葡萄糖，并最终引起糖化。PEG用于稳定蛋白和作为冷冻保护剂，并且在这点上可用于本发明。
CD27L抗原结合蛋白配制物的实施方案还包含表面活性剂。蛋白分子可能容易吸附于表面以及在空气-液体、固体-液体和液体-液体界面处变性和随后聚集。这些作用通常与蛋白浓度成反比。这些有害的相互作用通常与蛋白浓度成反比，并且通常通过物理震荡(例如在装运和处理产品中产生)加剧。
表面活性剂通常用于防止、最小化或者降低表面吸附。在这点上在本发明中有用的表面活性剂包括聚山梨酯20、聚山梨酯80、山梨糖醇聚乙氧基化物(sorbitanpolyethoxylate)的其它脂肪酸酯和泊洛沙姆(poloxamer)188。
表面活性剂也通常用于控制蛋白构象稳定性。因为任何给定表面活性剂通常使一些蛋白稳定和使其它蛋白不稳定，所以在这点上使用表面活性剂为蛋白特异性。
聚山梨酯容易受氧化降解影响，并且通过如所提供含有充足量的过氧化物，从而导致蛋白残基侧链(特别是甲硫氨酸)的氧化。因此，聚山梨酯应当小心地使用，并且当使用时，应当采用它们最低有效浓度。在这点上，聚山梨酯示例一般规则，即应当使用最低有效浓度的赋形剂。
CD27L抗原结合蛋白配制物的实施方案还包含一种或多种抗氧化剂。通过维持适当水平的周围氧气和温度和通过避免暴露于光线，可一定程度防止在药物配制物中蛋白的有害氧化。抗氧化剂赋形剂也可用于防止蛋白的氧化降解。在这点上有用的抗氧化剂为还原剂、氧/游离基清除剂和鳌合剂。在按照本发明的治疗蛋白配制物中使用的抗氧化剂优选为水溶性，并在产品保质期内保持它们的活性。EDTA是在这点上按照本发明的优选的抗氧化剂。
抗氧化剂可破坏蛋白。例如，还原剂(特别是例如谷胱甘肽)可破坏分子内二硫键。因此，选择在本发明中使用的抗氧化剂要尤其消除或者充分地降低它们自身破坏配制物中蛋白的可能性。
按照本发明的配制物可包括金属离子，其为蛋白辅助因子和为形成蛋白配位络合物所必需，例如形成某些胰岛素悬浮液必需的锌。金属离子也可抑制降解蛋白的一些过程。然而，金属离子也催化降解蛋白的物理和化学过程。
镁离子(10-120mM)可用于抑制天冬氨酸异构化为异天冬氨酸。Ca+2离子(至多100mM)可增加人脱氧核糖核酸酶的稳定性。然而，Mg+2、Mn+2和Zn+2可使rhDNase不稳定。类似地，Ca+2和Sr+2可稳定因子VIII；通过Mg+2、Mn+2和Zn+2、Cu+2和Fe+2可使该因子不稳定；并且通过Al+3离子可增加它的聚集。
CD27L抗原结合蛋白配制物的实施方案还包含一种或多种防腐剂。当开发包含来自同一容器中多于一种提取物的多剂量胃肠外配制物时，防腐剂是必要的。它们的主要功能是在药品的保质期或者使用期限内抑制微生物生长和确保产品无菌。常用的防腐剂包括苯甲醇、苯酚和间甲酚。尽管小分子胃肠外防腐剂的使用具有较长历史，但是包含防腐剂的蛋白配制物的开发还是具有挑战性。防腐剂通常对蛋白具有不稳定作用(聚集)，而这是在多剂量蛋白配制物中限制它们使用的主要因素。迄今为止，大部分蛋白药品仅配制为一次性使用。然而，当多剂量配制物为可能时，它们具有使患者方便和增加适销性的额外优势。一个较好的例子是人体生长激素(hGH)的多剂量配制物，其中防腐配制物的开发导致更为方便、多次使用的注射笔表现形式(multi-use injection pen presentation)的商业化。包含hGH的防腐配制物的至少四种这类笔装置目前在市场上销售。Norditropin(液体，NovoNordisk)、Nutropin AQ(液体，Genentech)&Genotropin(冻干--双室型盒(dual chambercartridge)，Pharmacia&Upjohn)包含苯酚，而Somatrope(Eli Lilly)使用间甲酚配制。
在防腐剂型的配制和开发中需要考虑多个方面。必须优化在药品中有效防腐剂浓度。这要求利用赋予抗微生物作用但不损害蛋白稳定性的浓度范围测试剂型中的给定防腐剂。
如可以预期，包含防腐剂的液体配制物的开发比冻干的配制物更具挑战性。冷冻干燥的产物可以在没有防腐剂下冻干以及在使用时经含有稀释剂的防腐剂重新配制。这缩短防腐剂接触蛋白的时间，显著最小化相关稳定性风险。使用液体配制物，应当在整个产品保质期(约18至24个月)内维持防腐剂作用和稳定性。需要重点注意的一点是，应当在包含活性药物和所有赋形剂组分的最终配制物中证实防腐剂作用。
通常设计以下的CD27L抗原结合蛋白配制物：用于具体施用途径和方法；用于具体施用剂量和施用频率；用于具体疾病的具体治疗；使用的生物利用度范围和持久性以及其它方面。因此，可设计按照本发明用于通过任何合适途径递送的配制物，该合适途径包括但不限于经口服、经耳、经眼、经直肠和经阴道，以及通过胃肠外途径(包括静脉内和动脉内注射、肌肉内注射和皮下注射)。
一旦配制出药物组合物，则可将它保存在无菌小瓶中作为溶液、悬浮液、凝胶、乳剂、固体、结晶或者作为脱水或冻干粉末。这些配制物可保存为随时可用形式或者在施用之前重新配制形式(例如，冻干)。本发明也提供提供单剂量施用单位的试剂盒。本发明的试剂盒可分别包含具有干燥蛋白的第一容器和具有水性配制物的第二容器。在本发明的某些实施方案中，提供包含单室型和多室型预填充注射器(例如，液体注射器和冻干注射器(lyosyringe))的试剂盒。
取决于例如治疗情况和目的来采用治疗有效量的包含CD27L抗原结合蛋白的药物组合物。本领域技术人员应理解，部分取决于递送的分子、待使用CD27L抗原结合蛋白的指征、施用途径、和患者的尺寸(体重、体表或器官尺寸)和/或情况(年龄和一般健康状况)来改变治疗的合适剂量水平。在某些实施方案中，临床医生可滴定剂量和改变施用途径以获得最佳治疗效果。取决于以上讨论的因素，典型剂量范围可以为约0.1μg/kg至至多约30mg/kg或更多。在具体实施方案中，剂量范围可以为1.0μg/kg至至多约20mg/kg，任选为10μg/kg至至多约10mg/kg或者100μg/kg至至多约5mg/kg。
治疗有效量的CD27L抗原结合蛋白优选导致疾病症状严重程度降低；没有疾病症状时间段的频率或持续时间增加或者预防由于疾病疼痛导致的损害或残疾。对于治疗表达CD27L的肿瘤，相对于未经治疗的患者，治疗有效量的CD27L抗原结合蛋白(例如抗-CD27LADC)优选抑制至少约20％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％的细胞生长或肿瘤生长。可在预测在人肿瘤中功效的动物模型中评估化合物抑制肿瘤生长的能力。
使用医疗装置可施用药物组合物。用于施用药物组合物的医疗装置的例子描述在美国专利No.4,475,196；4,439,196；4,447,224；4,447，233；4,486,194；4,487,603；4,596,556；4,790,824；4,941,880；5,064,413；5,312,335；5,312,335；5,383,851；和5,399,163中，其全部通过引用方式并入本文。
诊断或治疗CD27L相关疾病或疾患的方法
本发明的CD27L抗原结合蛋白特别用于在生物样品中检测CD27L。在某些实施方案中，使由患者获得的生物样品与CD27L抗原结合蛋白接触。然后检测CD27L抗原结合蛋白与CD27L的结合，从而测定在样品中CD27L的存在或相对量。这些方法可用于诊断或测定适于使用CD27L抗原结合蛋白(例如，抗-CD27LADC)治疗的患者。
在某些实施方案中，本发明的CD27L抗原结合蛋白用于诊断、检测或治疗自身免疫或炎性疾患。在治疗自身免疫或炎性疾患中，CD27L抗原结合蛋白可靶向破坏免疫系统的表达CD27L细胞和/或可阻断CD27L与受体CD27的相互作用。
据认为，CD27L与CD27的相互作用在细胞介导的自身免疫疾病(例如实验性自身免疫脑脊髓炎(EAE))中起着作用(Nakajima等人(2000)J.Neuroimmunol.109：188-96)。据认为，通过抑制TNF-a产生部分介导该作用。而且，对CD27L信号传导的阻断抑制CD8+T-细胞的CD40-介导的克隆扩增以及减少CD8+记忆T-细胞的生成(Taraban等人(2004)J.Immunol.173：6542-6)。如此，CD27L抗原结合蛋白可用于治疗具有自身免疫疾患的受试者，例如特征在于表达CD27L的B-细胞存在的疾患(包括例如实验性自身免疫脑脊髓炎)。可使用本公开的抗体的另外的自身免疫疾患包括但不限于全身性红斑狼疮(SLE)、胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)、炎性肠道疾病(IBD)(包括克罗恩氏病(Crohn′s Disease)、溃疡性结肠炎和乳糜泻(Celiac disease))、多发性硬化(MS)、牛皮癣、自身免疫性甲状腺炎、类风湿性关节炎(RA)和肾小球性肾炎。而且，本公开的cd27L抗原结合蛋白组合物可用于抑制或预防移植排斥或者治疗移植物抗宿主病(GVHD)。
此外，也已经提出，CD27L与CD27的相互作用在CD4+T细胞上信号传导中发挥作用。已经显示，一些病毒信号传导CD27途径，这导致破坏中和抗体应答(Matter等人(2006)JExp Med203：2145-55)。如此，本公开的CD27L抗原结合蛋白组合物和方法可用于治疗具有病毒感染(包括例如来自人免疫缺陷病毒(HIV)、肝炎(A、B&C)、疱疹病毒(例如，VZV、HSV-1、HAV-6、HSV-II和CMV、艾普斯登巴尔病毒(Epstein Barr virus))、腺病毒、流感病毒、虫媒病毒、艾柯病毒(echovirus)、鼻病毒、柯萨奇病毒(coxsackie virus)、冠状病毒(cornovirus)、呼吸道合胞病毒、腮腺炎病毒、轮状病毒、麻疹病毒、风疹病毒、细小病毒、牛痘病毒、HTLV病毒、登革病毒、乳头瘤病毒、软疣病毒(molluscum virus)、脊髓灰质炎病毒、狂犬病毒、JC病毒和虫媒病毒性脑炎病毒以及淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)的感染)或者治疗HIV感染/AIDS的受试者。此外，本公开的人抗体、抗体组合物和方法可用于抑制TNF-a产生。
在某些实施方案中，本发明的CD27L抗原结合蛋白用于诊断、测试或者治疗癌症或者致瘤疾患。适于本文治疗的肿瘤和癌症包括但不限于：肾细胞癌(RCC)，例如透明细胞RCC、乳头状RCC、嫌色细胞RCC等；成胶质细胞瘤；头颈癌(例如，鳞状细胞癌(HNSCC)等)；乳腺癌；脑肿瘤；鼻咽癌；非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)，例如轻度NHL、弥散性大细胞NHL等；急性淋巴细胞性白血病(ALL)，例如前-B-ALL等；慢性淋巴细胞性白血病(CLL或B-CLL)；伯基特氏淋巴瘤；间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)；多发性骨髓瘤；皮肤T-细胞淋巴瘤；结节性小卵裂细胞淋巴瘤；淋巴细胞性淋巴瘤；外周T-细胞淋巴瘤；伦南德氏淋巴瘤；免疫母细胞性淋巴瘤；T-细胞白血病/淋巴瘤(ATLL)；成人T-细胞白血病(T-ALL)；中心母细胞/中心细胞(cb/cc)滤泡性淋巴瘤癌；B系弥漫性大细胞淋巴瘤；血管免疫母细胞性淋巴结病(AILD)样T细胞淋巴瘤；HIV相关体腔型淋巴瘤；胚胎癌；未分化鼻咽癌(例如，施明克氏瘤(Schmincke′stumor))；卡斯尔曼氏病；卡波西氏肉瘤；多发性骨髓瘤；瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症和其它B-细胞淋巴瘤，其中肿瘤或癌症的细胞可表达CD27L。适于本文治疗的另外的肿瘤类型包括以下的肿瘤：肾脏、胰腺、喉或咽、黑素瘤、卵巢、肺腺癌、结肠、乳腺、脑等。
实施例
提供以下实施例(无论实际还是预测)用于说明本发明的具体实施方案或特征的目的，并旨在限制它的范围。
实施例1--针对CD27L的全长人单克隆抗体
使用
Figure BDA0000509038660000841
技术来进行针对人CD27L的全长人抗体的生成(美国专利No.6,114,598；6,162,963；6,833,268；7,049,426；7,064,244，其通过引用方式整体并入本文；Green等人，1994，Nature Genetics7：13-21；Mendez等人，1997，Nature Genetics15：146-156；Green和Jakobovitis，1998，J.Ex.Med.188：483-495)。
使用在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的表面上重组表达的可溶性人CD27L或人CD27L来免疫/强化IgG1、IgG2和IgG4
Figure BDA0000509038660000842
小鼠。由经免疫的小鼠产生杂交瘤。筛选杂交瘤上清液用于与表达重组人CD27L的293细胞结合。超过260种上清液为结合阳性。
然后在Raji和/或786-0细胞的表面上筛选与天然CD27L结合的阳性上清液。天然CD27L结合分析揭示161种阳性上清液。
测试这些上清液与短尾猴(cynomolgus)CD27L的交叉反应性。二十五种上清液与短尾猴CD27L的交叉反应性为阳性。然后测试该二十五种上清液的CDC活性和阻断人CD27与人CD27L结合的能力。十九种上清液的CDC活性和抑制CD27与CD27L结合为阳性。13种IgG1和6种IgG4系的亚克隆和测序揭示7种独特的IgG1抗体(Ab1-Ab7)和1种独特的IgG4抗体(Ab8)。
在图1中提供八种抗体的特征和市售小鼠抗-人CD27L抗体的嵌合版本的那些特征的汇总。
亲和力
在BIACORE3000上使用CM5芯片来测定重组可溶性人CD27L的亲和力。将山羊抗人IgG抗体用于捕获测试抗体。测量组氨酸标记的人可溶性CD27L的结合和离解，从而测定Ka、Kd和KD。条件如下：
温度＝25℃
流速＝50ul/min
电泳缓冲液＝HBS-EP
使用10mM甘氨酸pH1.5再生
Hu CD27L-his的浓度范围为200nM→0.217nM
模型拟合(Scrubber2)：1∶1结合+局部Rmax
5分钟缔合和25分钟离解
ADCC活性
在无菌96孔圆底细胞培养板(Corning)中进行ADCC分析。通过在包含10％FCS的100μL的完整RPMI中运载10μL将抗体从20μg/mL滴定至0.0002μg/mL(1∶10稀释)。加入50μL的钙黄绿素标记的靶以包含10,000个细胞。在4℃下孵育靶细胞和各种浓度的抗体40分钟，然后加入50μL的NK细胞效应子以包含200,000个细胞。在37℃下孵育培养物4小时，然后倒出上清液，并在Wallac Victor II1420Multilable HTS计数器上通过测定在485-535nm下荧光来分析钙黄绿素释放。通过裂解具有Igepal630去污剂(3μL/孔)的钙黄绿素标记的Raji靶的六个孔来测定100％裂解值，以及通过测定在单独靶的上清液中的荧光来测定自发裂解值。
特异性裂解百分比(％)定义为(样品荧光)-(自发裂解荧光)/(100％裂解-自发裂解荧光)。将原始数据输入Excel电子制表软件中，使用嵌入公式计算特异性裂解％，然后将所得值转移至图形程序(GraphPad Prism)，其中数据转变为S形曲线拟合图。在GraphPad中进行随后分析(线性回归计算)以得到EC50值。
ADCP活性
选自人外周血的单核细胞为阴性，以及使用包含10％FBS的培养基RPMI1640将其保存在4℃下冷藏室中过夜。然后使用200μL的生长培养基(包含10％FBS和40ng/ml Hu M-CSF的RPMI1640)以200,000个细胞/孔将单核细胞接种至48-孔细胞培养板，并在37℃下，5％CO2中孵育6天以使单核细胞分化为巨噬细胞。
在第6天，如下进行ADCP分析：
1.在2x10-6M的最终浓度的PKH67染料下使用PKH67绿染料标记靶细胞
●收集肿瘤细胞和通过离心细胞(400′g)5分钟使用PBS洗涤一次。
●在离心细胞之后，将上清液小心吸出，但保留不超过25mL的上清液。
●将在4x10-6M的原始浓度下4μL的PKH67乙醇染料溶液加入在聚丙烯管和混合的小孔中来自试剂盒的1ml的稀释剂C中。
●将细胞沉淀块(Cell pellet)重悬浮至在聚丙烯管中在20x106的密度下1mL的稀释剂C内。
●将细胞快速转移至染料工作溶液，缓慢地吸液以确保完全分散。
●在室温下通过周期性混合将混合物孵育4分钟。
●将2mL的完全活化的FBS加入细胞内以停止染色和在室温下孵育1分钟以使得结合过量的染料。
●将包含10％FBS的40mL的RPMI加入细胞内和通过离心细胞(400′g)10分钟洗涤一次。
●使用40mL的培养基再次悬浮细胞沉淀块，并转移至新管子内。
●使用培养基RPMI+10％FBS和1x完整生长培养基(包含10％FBS和40ng/ml Hu M-CSF的RPMI1640)再次洗涤细胞三次。
●计数细胞和使用在1x106细胞/mL的以1∶2比率的T∶E的生长培养基悬浮。
2.使用抗体依赖细胞吞噬作用(ADCP)的抗体治疗肿瘤细胞
●在巨噬细胞生长培养基中制备抗体稀释物。这些稀释物比最终浓度浓缩高四倍。
●为了预孵育具有抗体的PKH67绿色标记的靶细胞，将280ul的4x浓缩抗体与280ul的绿色标记肿瘤细胞混合，并在4℃下孵育30分钟。
●如在下表实验设计中所示，将绿色标记肿瘤细胞与抗肿瘤抗体的混合物加入在48-孔板中巨噬细胞，各孔加入200μl。最终体积为0.4ml/孔。靶细胞与效应细胞(巨噬细胞)的比率为1∶2。
●在37℃，5％CO2下孵育细胞一小时。
3.对比染色巨噬细胞和巨噬细胞标志物
●使用Trypsin-Versene混合物分离在48-孔板中靶细胞和巨噬细胞。
●将细胞转移至具有2.2-ml体积/孔的96-孔块板(block)内，以及使用预先温热的FASC洗涤溶液通过在400′g下旋转块板5分钟洗涤一次，然后丢弃上清液。
●在冰上在具有100μl/孔的封闭液中在1∶200稀释下使用巨噬细胞的标志物CD11b-生物素染色巨噬细胞10min。
●在洗涤细胞一次之后，在冰上使用在1∶1000稀释下链霉抗生素蛋白Alexa568检测巨噬细胞10分钟。
●在使用PBS洗涤细胞1x之后，在室温下使用4％甲醛-PBS固定细胞20分钟。然后使用dH2O洗涤细胞1x。
●在200μl/孔的水中重悬浮细胞沉淀块和以100μl/孔转移至96-孔板内。
4.在具有采用20x物镜的Target Activation BioApplication的ArrayScan VTIHCS阅读器(版本6，Cellomics Inc.Thermo Fisher Scientific，Pittsburgh，PA)上的吞噬 活性的定量测定。在表2中示出滤光镜设置。在各孔中计数至少200个细胞。
表2
Figure BDA0000509038660000881
使用Prism4.01(GraphPad，San Diego，CA)来进行统计分析。图谱显示肿瘤细胞吞噬％比对以ng/ml计的抗体浓度的log值。肿瘤细胞吞噬％使用在选择的视野中与巨噬细胞重叠的肿瘤细胞比对全部巨噬细胞的百分比表示，并由ArrayScan阅读器“对象计数％”的输出特征得到。值％表示为两次测量值(n＝2)的平均值+/-平均值的标准误差(SEM)。通过使用非线性回归(曲线拟合)，随后通过使用S形曲线剂量-应答等式来测定EC50。将数据归一化至最大和最小信号，并与S形曲线剂量-应答曲线拟合。
CDC活性
制备肿瘤细胞：使用分析培养基洗涤Raji细胞一次和重悬浮在分析培养基(RPMI1640+1％FBS)中。将细胞以50μL/孔接种在96-孔细胞培养板中，对于兔和人补体具有两种细胞密度。对于兔补体，细胞密度为5x104细胞/孔。对于人补体，细胞密度为2x105细胞/孔。
使用补体和测试抗体处理细胞：在表3中示出的分析培养基中制备三次浓缩的补体。然后以50μL/孔将它们加入板中细胞。对于使用兔补体处理的细胞，兔补体的最终浓度为10％；对于使用人补体处理的细胞，人补体的最终浓度为20％。
Figure BDA0000509038660000891
将10μg/mL的测试抗体加入50μL/孔的细胞中。在培养开始时各孔中总体积为150μL。对于使用兔补体处理的细胞，在37℃，5％CO2下连续孵育细胞1小时，而对于使用人补体处理的细胞，孵育6小时。
使用ArrayScan板阅读器测定细胞毒性：在孵育之后，去除各孔中50μl培养基。将Hoechst33342和碘化丙啶(PI)的混合物(cocktail)以100μL/孔加入细胞内，该混合物在含有2％FBS的PBS溶液中以1∶1000稀释下制备。在轻轻搅拌之后，将使用人补体处理的细胞在40μL/孔下转移至新的96-孔板内。在具有采用20x物镜的BioApplication“TargetActivation”的ArrayScan VTI HCS阅读器(版本6，Cellomics，Thermo Fisher Scientific，Pittsburgh，PA)上分析样品。在表4中示出滤光镜设置。在各孔中计数至少200个细胞。
表4
通道 靶 标记 荧光 滤光镜
1 所有细胞的核酸 Hoechst33342 UV/460nm DAPI
2 死细胞的核酸 碘化丙啶 488/＞575nm TRITC
统计分析：使用Prism4.01(GraphPad，San Diego，CA)来进行统计分析。
内化时间
接种细胞：将786-0细胞以10，000细胞/孔接种在具有100μL的生长培养基(包含10％FBS的RPMI)的96-孔板上，以及在37℃，5％C02下孵育2天以得到在分析当天100％细胞汇合。评估接种的细胞：1)内化和2)核内体共定位(endosomal co-localization)。
染色用于内化时间过程的细胞：使用分析培养基(包含2％FBS的PBS)来洗涤板1x。将抗体以2μg/mL/孔(100μL/孔)加入在分析培养基中的孔。在4℃下使人抗体与细胞结合30分钟，然后使用分析培养基洗涤1x。在4℃下将抗人IgG Fab’Alexa488(1∶100)和Hoechst33342(1∶2000)加入在分析培养基中的细胞中20分钟。接下来，使用分析培养基洗涤细胞1x。从时间零点开始固定和透化细胞，或者在37℃，5％CO2下孵育1、3或5小时。在孵育之后，在随后程序中固定和透化细胞。使用BD洗涤缓冲液来洗涤细胞1x，随后以100μL/孔加入固定/透化(Fix/perm)溶液至孔内。在具有采用40x物镜的BioApplication“SpotDetector”的ArrayScan VTI HCS阅读器(版本6，Cellomics，Thermo Fisher Scientific，Pittsburgh，PA)上分析样品。在表5中示出用于内化的滤光镜设置。在各孔中计数至少400个细胞。
表5
通道 靶 标记 滤光镜
1 所有细胞的核酸 Hoechst33342 DAPI(蓝色)
2 内化的斑点 Alexa488 FITC(绿色)
计数用于共定位内化的斑点与早期核内体区室(endosomal compartment)的染色细胞：在内化分析之后，使用BD缓冲液洗涤786-0细胞1x。在RT下将细胞暴露于固定/透化溶液20分钟。在2x洗涤步骤之后，在RT下使用0.5μg/mL(100μl/孔)的在BD缓冲液中的EEA-1孵育细胞20分钟。使用BD缓冲液洗涤细胞1x，并加入以1∶1000稀释的抗小鼠Alexa568。在RT下将细胞孵育20分钟，然后为BD缓冲溶液的两步洗涤步骤。
照相显影：使用连接Hamamutsu数字照相机的Leica荧光显微镜来进行用于内化和共定位的细胞显像，该Hamamutsu数字照相机具有Openlab显像分析软件(ImprovisionInc，Lexington，MA)或者ArrayScan VTI HCS阅读器。
统计分析：使用Prism4.01(GraphPad，San Diego，CA)来进行统计分析。斑点计数表示为两次测量值(n＝2)的平均值±平均值的标准误差(SEM)。使用分析工具，斑点计数/单位时间(内化速率)拟合为一阶指数关联方程(one phase exponential associationequation)。
实施例2-MCC-DM1-缀合的抗体的评估
使Ab1、Ab2、Ab4、Ab7和Ab8与MCC-DM1缀合(参见图12)。目标负载水平为4.5-5药物/抗体。简而言之，使抗体的赖氨酸与异型双功能交联剂琥珀酰亚胺基4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧酸酯(SMCC)的NHS-酯缀合，该SMCC包含NHS-酯和马来酰亚胺。接下来，将接头修饰的抗体由过量的接头中纯化，然后通过在DM1中存在的巯基与弹头(warhead)DM1缀合。然后通过第二纯化步骤去除过量的DM1，从而生成最终缀合物Ab-MCC-DM1。
更特别地，将在哺乳动物细胞培养2936-E细胞中瞬时表达的CD27L抗体负载在MabSelect SuRe柱(GE Healthcare)上，所述柱已经在25mM Tris、150mM氯化钠(pH7.4)中平衡。然后使用3个洗涤步骤来洗涤与CD27L抗体结合的柱子：首先平衡缓冲液洗涤，然后25mM Tris、500mM L-精氨酸(pH7.5)洗涤以及最后使用平衡缓冲液洗涤。使用100mM醋酸钠(pH3.5)来洗脱CD27L抗体。将包含抗体的级分混合，然后使用1M Tris(pH8.0)调节至最终pH为5.0。随后在30mM醋酸钠(pH5.0)中平衡的
Figure BDA0000509038660000921
EMD SO3-(M)柱(EMD ChemicalsInc)上纯化抗体。在30mM醋酸钠(pH5.0)中介于0至0.8M氯化钠之间使用8CV梯度来洗脱结合的抗体。将包含抗体的级分混合，并透析至缀合缓冲液(Conjugation Buffer)(2mMEDTA、50mM氯化钠、50mM磷酸钾(pH6.5))内。
使用胺反应性接头琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)(Thermo Scientific)来修饰纯化的CD27L抗体以引入硫醇反应性马来酰亚胺基团。使用在最终反应混合物中调整至10％二甲基乙酰胺(v/v)的缀合缓冲液中20摩尔当量的SMCC来处理在55μM的浓度下抗体。在室温下孵育90分钟之后，使用HiPrep26/10脱盐柱来脱盐反应混合物，该HiPrep26/10脱盐柱包含在2mM EDTA、150mM氯化钠、35mM柠檬酸钠(pH5.0)中平衡的Sephadex G-25细树脂(GE Healthcare)。将包含抗体的级分混合以及使用如下所述的埃尔曼氏试剂(Ellman’s reagent)(5，5′-二硫代-双-[2-硝基苯甲酸])测定使用接头的修饰程度。发现抗体被修饰，每个抗体平均7.5个马来酰亚胺基团。
通过硫醇来裂解埃尔曼氏试剂，这得到在412nm下吸光度的黄色产物。减法埃尔曼氏分析(subtractive Ellman’s assay)用于测定在与SMCC反应之后在CD27L抗体上马来酰亚胺基团的数目。使用当量浓度的硫醇、0.4mM DTT(二硫苏糖醇)来孵育使用SMCC修饰的CD27L抗体或者没有抗体的缓冲液的对照样品。在抗体样品中存在的任何马来酰亚胺可与在DTT中硫醇反应，这使得它无法进一步与埃尔曼氏试剂反应。然后将埃尔曼氏试剂加入两种样品中，在412nm下进行比色定量以测定反应的埃尔曼氏试剂的浓度。如与对照样品相比，在抗体样品中硫醇降低的浓度与在抗体样品中存在的马来酰亚胺数目成比例。该值用于测定每个经修饰的CD27L抗体的连接的马来酰亚胺基团的数目。
使用1.7摩尔当量的DM1(Immunogen)/马来酰亚胺基团来处理介于17μM-27μM之间的浓度下经SMCC修饰的CD27L抗体(7.5个马来酰亚胺基团/抗体)，使用在最终反应混合物中调整至3％DMA(v/v)的2mM EDTA、150mM NaCl、35mM柠檬酸钠(pH5.0)来缓冲所述DM1。在室温下孵育反应混合物过夜多达20小时。将反应混合物负载在使用20mM磷酸钠、150mM氯化钠(pH6.5)平衡的Superdex200凝胶过滤柱(GE Healthcare)上。收集级分和混合包含单体抗体的级分并分析。通过测量在252nm和280nm下吸光度来测定每个抗体连接的DM1分子的摩尔比率，并发现其为4.5-5.0DM1分子/抗体。
体外药理学
如通过流式细胞计量术所评估，抗体药物缀合物(ADC)Ab4-和Ab8-MCC-DM1证实与它们未经缀合的对应物具有相当的天然CD27L结合。Ab4和Ab4-MCC-DM1的观察到的结合EC50相同，但如与Ab8相比较，Ab8-MCC-DM1要稍小4倍(表6)。通过使用Gyros技术测量Ab4、Ab8和它们缀合物对应物结合在Raji细胞上表达的天然人CD27L的能力来测定它们的结合亲和力的更加精确测量值。结果显示两种缀合物表现出对CD27L的亚-nM(sub-nM)亲和力，其在观察到的未经缀合的Ab4和Ab8的亲和力的两倍内(表6)。未经缀合和经缀合的Ab4和Ab8也表现出对可溶性人CD27L-his的结合亲和力，如通过BIACORE所测定其在彼此亲和力的2倍内。
表6.Ab4和Ab8与它们MCC-DM1缀合物对应物的结合比较
Figure BDA0000509038660000931
在表达CD27L的人ccRCC系786-0中评估Ab4-MCC-DM1、Ab8-MCC-DM1、Ab4和Ab8的内化。将表达CD27L的786-0细胞暴露于未经缀合的Ab4和Ab8人抗-CD27L抗体、Ab4-MCC-DM1、Ab8-MCC-DM1、对照HuIgG1或对照αSA-MCC-DM1中，并使得可在4℃下结合。使用FluoroNanogold山羊抗-hu IgG Fab’Alexa488来评估测试制品的内化。将细胞固定和在孵育测试制品之后的具体时间透化(时间＝0、1、3和5小时)，并使用ArrayScan VTI HCS阅读器显像。使用抗-EEA-1抗体核内体标志物来测定内化的测试制品与核内体的共定位。通过荧光显微显像分析来观察抗体(包括Ab4-MCC-DM1)的时间依赖性内化，与在4℃下时间零点处细胞膜定位相比较，该荧光显微显像分析在37℃下在细胞胞质内形成点状斑点(punctate spot)。在37℃下孵育5小时之后Ab4-MCC-DM1与核内体标志物EEA-1的共定位，这证实Ab4-MCC-DM1内化至786-0细胞的核内体亚细胞区室内。内化的水平和速率在Ab4、Ab8和它们缀合对应物的类似范围内(图2)。
Ab4-MCC-DM1和Ab8-MCC-DM1均证实表达CD27L的肿瘤细胞的强效和特异性体外生长抑制。在抗增殖(肿瘤生长抑制)分析中，使用分别在裸Ab4或Ab8的存在/缺乏下表达CD27L的786-0萤光素酶或者CD27L阴性H1650靶细胞、或者对照HuIgG1来孵育Ab4-MCC-DM1、Ab8-MCC-DM1或未经缀合的抗-CD27LAb4或Ab8达4天。使用具有500个细胞/孔的786-0萤光素酶和1000个细胞/孔的H1650的100μL/孔的生长培养基将两细胞系(786-0萤光素酶和H1650)接种在96-孔组织培养板中。在37℃，5％CO2下孵育所有板4小时。在4小时孵育之后，将裸Ab和缀合物以各种剂量滴定加入100μL/孔的细胞中。在开始培养时在各孔中总体积为200μL。在开始测量细胞ATP水平之前，在37℃，5％CO2下连续孵育细胞4天。为了评估细胞生长抑制，通过使用CellTiter-Glo分析试剂盒的荧光来测量ATP水平(作为细胞数目的量度)。
Ab4-MCC-DM1和Ab8-MCC-DM1均抑制表达CD27L的786-0细胞的细胞生长，其具有如在表7中所示的50％抑制(IC50)的浓度。在暴露于Ab4-MCC-DM1和Ab8-MCC-DM1时，未在CD27L-阴性H1650细胞中观察到细胞生长抑制。加入过量的未经缀合的亲本抗-CD27L抗体能够阻断Ab4-MCC-DM1介导的生长抑制，这证实通过Ab4-MCC-DM1结合CD27L为活性所需求。未经缀合的亲本抗-CD27L抗体不会抑制表达CD27L的786-0细胞的生长。对照缀合物，抗-链霉抗生素蛋白-MCC-DM1(αSA-MCC-DM1)没有表现出在CD27L-阳性或者CD27L-阴性细胞系中对细胞生长的任何抑制。结果证实，与对照缀合物相比，Ab4-MCC-DM1和Ab8-MCC-DM1均为786-0细胞生长的强效抑制剂(图3)。Ab4-MCC-DM1倾向于显示比Ab8-MCC-DM1的效能稍高(表7)。
表7.抗CD27L-MCC-DM1缀合物的细胞效能
786-0-<sub>IC50</sub> Ab4-MCC-DM1 Ab8-MCC-DM1
药物浓度(nM) 0.34 0.54
抗体浓度(nM) 0.07 0.11
Ab4-MCC-DM1介导针对Raji细胞的抗体依赖细胞细胞毒性(ADCC)，其具有与未经缀合的亲本Ab4抗-CD27L抗体的效能(EC50＝0.01μg/mL)相似的效能(EC50＝0.006μg/mL)和量级。简而言之，在Ab4-MCC-DM1或者如上所述的对照抗体存在下使用钙黄绿素标记的Raji人B细胞淋巴瘤靶细胞(表达CD27L)来孵育由正常人血供体获得的由PBMC分离的自然杀伤(NK)细胞。如与对照孔相比较，通过测量在Ab4-MCC-DM1的存在下裂解的表达CD27L的靶细胞中释放的钙黄绿素来测定特异性细胞毒性百分比(％)。结果显示在图8中，其表明Ab4-MCC-DM1介导的ADCC的水平与Ab4抗体所介导的ADCC的水平相似(分别为0.006和0.01μg/mL的EC50值)。huIgG1对照未介导表达CD27L的靶的任何可测量的裂解。Ab4-MCC-DM1和未经缀合的Ab4抗体均能够以相似水平诱导CD27L特异性靶的NK细胞介导的ADCC。观察到Ab8-MCC-DM1和未经缀合的Ab8抗体的相似结果。
针对Raji和786-0肿瘤细胞测量Ab4-MCC-DM1或未经缀合的亲本抗体Ab4的体外抗体依赖细胞吞噬作用(ADCP)活性。Ab4-MCC-DM1介导与观察到的未经缀合的亲本抗体Ab4的相似水平的补体介导的裂解。简而言之，巨噬细胞由单核细胞分化，该单核细胞由正常人血供体获得的人外周血分离。在未经缀合的抗CD27L抗体Ab4、HuIgG1、Ab4-MCC-DM1或如上所述的对照抗体(αSA-MCC-DM1)的存在下，使用PHK67绿色标记的表达CD27L的细胞系、786-0和Raji作为靶细胞来孵育巨噬细胞。肿瘤细胞吞噬百分比(％)由在选择的视野中通过吞噬细胞吞噬的肿瘤细胞比对总巨噬细胞的百分比来测定。结果显示在图9中，并且表明在表达CD27L的细胞系、786-0和Raji中，Ab4-MCC-DM1介导相似的ADCP效能。未经缀合的Ab4的EC50值在Ab4-MCC-DM1观察的EC50值的10-倍内(参见表8)。
表8
786-0 Raji
Abs EC50(pM) EC50(pM)
Ab4 0.008 0.008
Ab4-MCC-DM1 0.087 1.421
假定在1∶40稀释间隔下完成稀释曲线，Ab4-MCC-DM1和未经缀合的Ab4的观察的EC50具有相似效能(在稀释因子的边缘内)。因此，缀合的Ab4-MCC-DM1和未经缀合的WT Ab4抗体均能够诱导人巨噬细胞以类似水平介导表达CD27L的细胞的ADCP。观察到Ab8-MCC-DM1和未经缀合的Ab8抗体的类似结果。
采用人和兔补体以及表达CD27L的Raji肿瘤细胞来评估Ab4-MCC-DM1的体外补体依赖细胞毒性(CDC)活性。在10μg/mL下，Ab4-MCC-DM1介导与未经缀合的亲本抗体Ab4观察到的类似水平的补体介导的裂解(兔补体72％裂解和人17％裂解)。简而言之，在抗CD27L抗体或如上所述的对照抗体的存在下，使用表达CD27L的Raji靶细胞来孵育活化的兔或人补体。由ArrayScan读数“选择的对象％”的输出特征来测定CDC介导的杀伤以检测PI阳性％对比Hoechst的“细胞毒性％”。结果表明，当使用10％幼兔补体或20％人补体孵育肿瘤Raji细胞时，Ab4-MCC-DM1介导与WT Ab4抗体的相似水平的CDC。热失活的兔或人补体没有显示针对Raji的任何CDC介导的杀伤。因此，Ab4-MCC-DM1和未经缀合的Ab4针对表达CD27L的肿瘤靶细胞均诱导相似水平的CDC活性。Ab8-MCC-DM1和未经缀合的Ab8抗体均观察到相似的结果。
体内药理学
使用生长因子还原的MATRIGEL将体内传代的786-0ccRCC细胞(786-0S4)植入雌性CB-17/SCID小鼠内，从而得到用于功效研究的肿瘤异种移植物。786-0S4细胞表达平均约180，000CD27L位点/细胞。当肿瘤大小达到平均约250mm3时，开始使用Ab4-MCC-DM1或Ab8-MCC-DM1治疗。通过肿瘤大小将荷瘤动物分别随机分成十组动物，并立即静脉内给药。在该已建立的肿瘤模型中进行采用剂量范围为7-64ug DM1/kg(0.3-2.5mg Ab/kg)的Ab4-MCC-DM1和Ab8-MCC-DM1的盲法剂量反应研究。在低剂量7ug DM1/kg、中剂量25ug DM1/kg和高剂量64ug DM1/kg下观察到强效肿瘤消退。在中和高剂量下，在一次给药之后维持至少28天的完全消退(图4)。在研究的过程中没有在任何给药组中观察到体重减轻。
在体内功效的另一例证中，将表达平均59,000CD27L位点/细胞的Caki-1ccRCC细胞(比786-0细胞少三倍)植入如上所述的CB-17/SCID小鼠内。当Caki-1异种移植物达到250mm3的平均大小时，通过肿瘤大小将荷瘤动物分别随机分成十组动物，并每周一次静脉内给药持续三周(以更严密地模仿每周临床给药方案)。在该已建立的肿瘤模型中进行采用剂量范围为60-270ug DM1/kg(2.4-11mgAb/kg)的Ab4-MCC-DM1和Ab8-MCC-DM1的盲法剂量反应研究。与对照缀合物或媒介物相比，在中剂量120ug DM1/kg和高剂量270ug DM1/kg下开始观察到肿瘤消退，而在低剂量60ug DM1/kg下观察到肿瘤生长抑制。随着时间推移，在接受最后一次给药7天内在两较高剂量组中肿瘤消退开始减少(图5)。
类似于ccRCC细胞，Raji B-淋巴瘤细胞表达CD27L(约200,000位点/细胞)和内化抗-CD27L药物缀合物，其导致有丝分裂阻滞和体外细胞死亡。在皮下Raji异种移植物模型中评估Ab4-MCC-DM1的功效。当Raji异种移植物达到250mm3的平均大小时，通过肿瘤大小将荷瘤动物分别随机分成十组动物，并静脉内给药q4天x2，然后在另一周内一周一次，总计3次给药(以更严密模仿每周临床给药方案)。在该已建立的肿瘤模型中进行采用剂量范围为60-270ugDM1/kg(2.4-11mg Ab/kg)的Ab4-MCC-DM1的盲法剂量反应研究。与对照缀合物相比，在所有剂量水平下观察到肿瘤生长抑制，在主动给药期内在中剂量120ug DM1/kg和高剂量270ug DM1/Kg下观察到＞90％肿瘤生长抑制，在低剂量60ug DM1/kg下观察到中间抗肿瘤应答(图6)。在肿瘤测定期结束时，在中剂量和高剂量组中稍多些动物表现出肿瘤消退，这表明进一步给药和方案优化可改善应答。
在786-0异种移植物模型中评估对照缀合物αSA-MCC-DM1或Ab4-MCC-DM1的不同给药间隔的功效。使用786-0肿瘤细胞移植CB-17/SCID小鼠。在第13天，将50只动物随机分为各10只动物的具有200mm3的平均肿瘤体积的群组内。向各群组施用对照缀合物αSA-MCC-DM1或Ab4-MCC-DM1的腹膜内剂量。肿瘤体积表示为组平均值±平均值的标准误差(SEM)。使用Dunnett校正的多次比较通过转化的肿瘤体积数据的log值的重复测量协方差分析(repeated measures analysis of covariance)(RMANOVA)评估第13至59天生长曲线之间观察的差异的统计显著性。如果p＜0.05，则具有显著性。施用三次剂量水平的Ab4-MCC-DM1(分别基于抗体的1.0、2.0或2.9mg/kg的Ab4-MCC-DM1或者基于DM1等同物的25、50或75μg/kg)。每周一次或者每2周一次施用1.0mg/kg剂量达6周；每2周一次施用2.0mg/kg剂量达6周和每3周一次施用2.9mg/kg剂量达6周。在肿瘤接种之后第13天开始腹腔内给药动物。至第59天，由于大的肿瘤体积，使αSA-MCC-DM1处理的组安乐死。在第59天，使用施用的Ab4-MCC-DM1各给药方案处理的小鼠的平均肿瘤体积比αSA-MCC-DM1对照缀合物组的平均肿瘤体积小(p＜0.0001)(图7)。Ab4-MCC-DM1的各给药方案介导持久的肿瘤消退。在任意Ab4-MCC-DM1处理组中均未观察到体重减轻。
药物动力学
在效能研究和后续最终PK研究的情况下，在向含有表达CD27L的786-0异种移植物的雌性CB-17/SCID小鼠静脉内施用Ab4和Ab8抗体药物缀合物后评估所述药物缀合物。累积暴露和清除值在Ab4-MCC-DM1和Ab8-MCC-DM1分子之间1.33和1.4-倍内，并且在小鼠中ADC的半衰期均为约12天。
在一次静脉内(IV)给药至荷786-0异种移植物的CB-17/SCID小鼠内之后，体内表征Ab4-MCC-DM1和Ab8-MCC-DM1抗体药物缀合物的稳定性和PK参数。两种抗体药物缀合物的暴露非常相近，但是如通过亲和力-MS所测定，在研究的96小时时间过程内Ab4-MCC-DM1表现出比Ab8-MCC-DM1分子更稳定的药物-与-抗体缀合比率。在注射之后30min或24小时时间点下，Ab4-MCC-DM1未显示缀合物完整性的可检测丧失，而在30分钟时间点处，Ab8-MCC-DM1表现出变化，并且在注射之后24小时处所有缀合物种类均显著降低。
实施例3--互补位图谱(Paratope Mapping)
通过ELISA测定与CD27L结合的Ab4的修饰。在室温下使CD27L与Maxisorp板结合＞2小时，使用在100uL中1ug/mL振荡。然后使用在PBS+0.05％吐温20中250uL10％脱脂奶粉封板2小时。在使用4x300uL PBS+0.05％吐温20(PBST)洗涤修饰的Ab之后，将范围为0.045至100ng/mL的纯化的亲本对照滴度施加至板，并孵育1小时。在另一PBST洗涤之后，将稀释至1∶7000的与αhuFc检测抗体(Jackson)缀合的辣根过氧化物酶施加至板，并孵育1小时。进行最后洗涤，然后将TMB底物孵育10分钟，并使用磷酸停止。取得在450nm下OD读数和相对于浓度绘图。然后使用3个参数的非线性曲线拟合来分析这些曲线，并将EC50和最大计算的信号与纯化的对照比较。如果EC50在2倍内以及最大信号大于50％，则测定的结合类似于亲本。如果EC50增加大于2倍和/或最大信号小于50％，则结合降低。如果不能得到曲线或者最大信号小于5％，则结合消失。
表8：示出轻链和重链修饰组合和以ug/mL计的它们表达水平(通过ForteBio蛋白A定量测定)以及它们对结合的作用。
Figure BDA0000509038660001001
制成Ab4的24种修饰组合中13种保留与CD27L的一定结合水平。没有与CD27L结合的9种具有以下至少一种：“G33S-I34L”和“S103G-G104S”重链修饰或者“N31H-Y58N”轻链修饰。在97％相似抗体(2种氨基酸修饰)中，75％(6/8)保留一定结合水平，而94％类似抗体(4种氨基酸修饰)中56％(7/16)的保留一定结合水平，其中2种具有与纯化亲本对照类似的结合。这显示与Ab4低至94％相似性的抗体仍可结合CD27L。
序列表
SEQ ID NO：1
人CD27L氨基酸序列
MPEEGSGCSVRRRPYGCVLRAALVPLVAGLVICLVVCIQRFAQAQQQLPLESLGWDVAELQLNHTGPQQDPRLYWQGGPALGRSFLHGPELDKGQLRIHRDGIYMVHIQVTLAICSSTTASRHHPTTLAVGICSPASRSISLLRLSFHQGCTIASQRLTPLARGDTLCTNLTGTLLPSRNTDETFFGVQWVRP
SEQ ID NO：2
人CD27前体氨基酸序列
MARPHPWWLCVLGTLVGLSATPAPKSCPERHYWAQGKLCCQMCEPGTFLVKDCDQHRKAAQCDPCIPGVSFSPDHHTRPHCESCRHCNSGLLVRNCTITANAECACRNGWQCRDKECTECDPLPNPSLTARSSQALSPHPQPTHLPYVSEMLEARTAGHMQTLADFRQLPARTLSTHWPPQRSLCSSDFIRILVIFSGMFLVFTLAGALFLHQRRKYRSNKGESPVEPAEPCHYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSP
SEQ ID NO：3
编码Ab1重链的核苷酸序列
CAGATGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCCTCACAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGATGGCTCCATCATCAGTGGTGTTTACTACTGGAGCTGGATCCGCCAGCACCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGATTGGATACATCTATTACAGTGGGAGCACCTCCTACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGACTTACCATGTCAGTAGACACGTCTAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACTGCCGCGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGGAGTGGATACAGCTATGCCCTCTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCCGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
SEQ ID NO：4
编码Ab2重链的核苷酸序列
CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCACAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTGACTCCATCATCAGTGGTGGTTACTACTGGAGCTGGATCCGCCAGCACCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGATTGGGTACATCTTTTACAGTGGGAGCACCGACTACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTTACCATATCAGTAGACACGTCTAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACTGCCGCGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAGGAGTGGATACAGCTATGCCCTCTTTGACCACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCCGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
SEQ ID NO：5
编码Ab4重链的核苷酸序列
CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCGTCTGGATTCACCTTCAGTAACTATGGCATACACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATGGTATGATGGAAGTAATAAATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGATGGAGGATATAGTGGCTACGATTCGGGGTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCCGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
SEQ ID NO：6
编码Ab5重链的核苷酸序列
CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCACCAGTTATGATATCAACTGGGTGCGACAGGCCACTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATGAACCCTAACAGTGGTAACACAGGCTATGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACCATGACCAGGAACACCTCCATAAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGGGTACGATTTTTGGAGTGGTTATTACTACTACTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCCGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
SEQ ID NO：7
编码Ab6重链的核苷酸序列
CAGGTTCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGTTACACCTTTACCAGCTATGGTATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATCAGCGCTTACAATGGTTACACACACTATGCACAGAAGCTCCAGGGCAGAGTCACCATGACCACAGACACATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGGAGCCTGAGATCTGACGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGACTACGGTGGTAACGACTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCCGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
SEQ ID NO：8
编码Ab7重链的核苷酸序列
CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCGTCTGGATTCACCTTCAGTACCTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATGGTATGATGGAAGTAATAAATACTATGGAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGATAACAGTCACTACTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCCGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
SEQ ID NO：9
编码Ab8重链的核苷酸序列
CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCGTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATGGTATGATGGAAGTGATAAATACTTTGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGATGGGATAGCAGGAGCTCGCTACGTCTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCCGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
SEQ ID NO：10
Ab1重链氨基酸序列
QMQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSDGSIISGVYYWSWIRQHPGKGLEWIGYIYYSGSTSYNPSLKSRLTMSVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARSGYSYALFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFFAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKSEQ ID NO：11
Ab2重链氨基酸序列
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGDSIISGGYYWSWIRQHPGKGLEWIGYIFYSGSTDYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARSGYSYALFDHWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO：12
Ab4重链氨基酸序列
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSNYGIHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGGYSGYDSGFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO：13
Ab5重链氨基酸序列
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYDINWVRQATGQGLEWMGWMNPNSGNTGYAQKFQGRVTMTRNTSISTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGYDFWSGYYYYYYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO：14
Ab6重链氨基酸序列
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWISAYNGYTHYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARDYGGNDYYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO：15
Ab7重链氨基酸序列
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSTYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKYYGDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDNSHYYYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO：16
Ab8重链氨基酸序列
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSDKYFADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGIAGARYVYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
SEQ ID NO：17
Ab1重链可变结构域氨基酸序列
QMQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSDGSIISGVYYWSWIRQHPGKGLEWIGYIYYSGSTSYNPSLKSRLTMSVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARSGYSYALFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：18
Ab2重链可变结构域氨基酸序列
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGDSIISGGYYWSWIRQHPGKGLEWIGYIFYSGSTDYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARSGYSYALFDHWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：19
Ab3重链可变结构域氨基酸序列
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSVISDSGGTTDYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHDYSNRYYFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：20
Ab4重链可变结构域氨基酸序列
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSNYGIHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGGYSGYDSGFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：21
Ab5重链可变结构域氨基酸序列
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYDINWVRQATGQGLEWMGWMNPNSGNTGYAQKFQGRVTMTRNTSISTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGYDFWSGYYYYYYGMDVWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO：22
Ab6重链可变结构域氨基酸序列
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWISAYNGYTHYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARDYGGNDYYGMDVWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO：23
Ab7重链可变结构域氨基酸序列
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSTYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKYYGDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDNSHYYYGMDVWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO：24
Ab8重链可变结构域氨基酸序列
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSDKYFADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGIAGARYVYFDYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：25
Ab1重链CDR1氨基酸序列
SGVYYWS
SEQ ID NO：26
Ab2重链CDR1氨基酸序列
SGGYYWS
SEQ ID NO：27
Ab3重链CDR1氨基酸序列
SYAMS
SEQ ID NO：28
Ab4重链CDR1氨基酸序列
NYGIH
SEQ ID NO：29
Ab5重链CDR1氨基酸序列
SYDIN
SEQ ID NO：30
Ab6重链CDR1氨基酸序列
SYGIS
SEQ ID NO：31
Ab7重链CDR1氨基酸序列
TYGMH
SEQ ID NO：32
Ab8重链CDR1氨基酸序列
SYGMH
SEQ ID NO：33
Ab1重链CDR2氨基酸序列
YIYYSGSTSYNPSLKS
SEQ ID NO：34
Ab2重链CDR2氨基酸序列
YIFYSGSTDYNPSLKS
SEQ ID NO：35
Ab3重链CDR2氨基酸序列
VISDSGGTTDYADSVKG
SEQ ID NO：36
Ab4重链CDR2氨基酸序列
VIWYDGSNKYYADSVKG
SEQ ID NO：37
Ab5重链CDR2氨基酸序列
WMNPNSGNTGYAQKFQG
SEQ ID NO：38
Ab6重链CDR2氨基酸序列
WISAYNGYTHYAQKLQG
SEQ ID NO：39
Ab7重链CDR2氨基酸序列
VIWYDGSNKYYGDSVKG
SEQ ID NO：40
Ab8重链CDR2氨基酸序列
VIWYDGSDKYFADSVKG
SEQ ID NO：41
Ab1重链CDR3氨基酸序列
SGYSYALFDY
SEQ ID NO：42
Ab2重链CDR3氨基酸序列
SGYSYALFDH
SEQ ID NO：43
Ab3重链CDR3氨基酸序列
HDYSNRYYFDY
SEQ ID NO：44
Ab4重链CDR3氨基酸序列
DGGYSGYDSGFDY
SEQ ID NO：45
Ab5重链CDR3氨基酸序列
GYDFWSGYYYYYYGMDV
SEQ ID NO：46
Ab6重链CDR3氨基酸序列
DYGGNDYYGMDV
SEQ ID NO：47
Ab7重链CDR3氨基酸序列
DNSHYYYGMDV
SEQ ID NO：48
Ab8重链CDR3氨基酸序列
DGIAGARYVYFDY
SEQ ID NO：49
编码Ab1轻链的核苷酸序列
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTTTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCGTTGACAGATATTTCAATTGGTATCAGCAGAAACCTGGGAAAGCCCCTAAGGTCCTGATCTTTGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCGGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGAGCTACAGTACCCCGTGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAGTCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT
SEQ ID NO：50
编码Ab2轻链的核苷酸序列
GACATCCAGATGACCCAGTCCCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCCGGGCAAGTCAGTTCATTGGCAGATATTTCAATTGGTATCAGCAGCAACCAGGGAAAGCCCCTAAGGTCCTGATCTATGCTGAATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGATTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGAATTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAAGATACTACTGTCAACAGAGTTACAGTACCCCGTGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT
SEQ ID NO：51
编码Ab4轻链的核苷酸序列
GATATTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCCTGGAGAGCCGGCCTCCATCTCCTGCAGGTCTAGTCAGAGCCTCCTGAATAGTAATGGATACAACTATTTGGATTGGTACCTGCAGAAGCCAGGGCAGTCTCCACAGTTCCTGATCTATTTGGGTTCTTATCGGGCCTCCGGGGTCCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACAGATTTTACACTGAGAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATTACTGTATACAAACTCTACAAACTCCATTCACTTTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG
SEQ ID NO：52
编码Ab5轻链的核苷酸序列
GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCTGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAGACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGCAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCTGCAGTCTGGTAGCTCTGTCCCGCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAA
SEQ ID NO：53
编码Ab6轻链的核苷酸序列
CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATCTCTTGTTCTGGAAGCAGCTCCAACATCGGAATTAATTATGTATACTGGTACCAGCAGCTCCCAGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTATAGGAGTGATCAGCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCCTCAGTGGGCTCCGGTCCGAGGATGAGGCTGATTATTACTGTGCAGCATGGGATGACAGCCTGAGTGGTGTGGTGTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGCCAACCGAAAGCGGCGCCCTCGGTCACTCTGTTCCCGCCCTCCTCTGAGGAGCTTCAAGCCAACAAGGCCACACTGGTGTGTCTCATAAGTGACTTCTACCCGGGAGCCGTGACAGTGGCCTGGAAGGCAGATAGCAGCCCCGTCAAGGCGGGAGTGGAGACCACCACACCCTCCAAACAAAGCAACAACAAGTACGCGGCCAGCAGCTATCTGAGCCTGACGCCTGAGCAGTGGAAGTCCCACAGAAGCTACAGCTGCCAGGTCACGCATGAAGGGAGCACCGTGGAGAAGACAGTGGCCCCTACAGAATGTTCATAG
SEQ ID NO：54
编码Ab7轻链的核苷酸序列
CAGTCTGTGCTGACGCAGCCGCCCTCAGTGTCTGGGGCCCCAGGGCAGAGGGTCACCATCTCCTGCACTGGGAGCAGCTCCAACATCGGGGCAGGTTATGATGTAAATTGGTATCAGCAGTTCCCAGGAACAGCCCCCAAACTCCTCATCTATGTTAACAACAATCGGCCCTCAGGAGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCACGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCACTGGACTCCAGGCTGAGGATGAGGCTGATTATTACTGCCAGTCCTATGACACCAGCCTGAGTGCTTCGGTATTCGGCGGAGGGACCAGACTGACCGTCCTAGGCCAACCGAAAGCGGCGCCCTCGGTCACTCTGTTCCCGCCCTCCTCTGAGGAGCTTCAAGCCAACAAGGCCACACTGGTGTGTCTCATAAGTGACTTCTACCCGGGAGCCGTGACAGTGGCCTGGAAGGCAGATAGCAGCCCCGTCAAGGCGGGAGTGGAGACCACCACACCCTCCAAACAAAGCAACAACAAGTACGCGGCCAGCAGCTATCTGAGCCTGACGCCTGAGCAGTGGAAGTCCCACAGAAGCTACAGCTGCCAGGTCACGCATGAAGGGAGCACCGTGGAGAAGACAGTGGCCCCTACAGAATGTTCA
SEQ ID NO：55
编码Ab8轻链的核苷酸序列
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGTCGGGCGAGTCAGGGCATTAGCAATTATTTAGCCTGGTTTCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGTCCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAGGTGGGGTCCCATCAAAGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGCCAACAATATTATAATTACCCATTCACTTTCGGCCCTGGGACCACAGTGGATATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG
SEQ ID NO：56
Ab1轻链氨基酸序列
DIQMTQSPSSLSASLGDRVTITCRASQSVDRYFNWYQQKPGKAPKVLIFAASSLQSGVPSRFGGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPWTFGQGTKVEVKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO：57
Ab2轻链氨基酸序列
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTISCRASQFIGRYFNWYQQQPGKAPKVLIYAESSLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFARYYCQQSYSTPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO：58
Ab4轻链氨基酸序列
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLNSNGYNYLDWYLQKPGQSPQFLIYLGSYRASGVPDRFSGSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCIQTLQTPFTFGPGTKVDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO：59
Ab5轻链氨基酸序列
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQRPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCLQSGSSVPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO：60
Ab6轻链氨基酸序列
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGINYVYWYQQLPGTAPKLLIYRSDQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLALSGLRSEDEADYYCAAWDDSLSGVVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
SEQ ID NO：61
Ab7轻链氨基酸序列
QSVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVNWYQQFPGTAPKLLIYVNNNRPSGVPDRFSGSTSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDTSLSASVFGGGTRLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
SEQ ID NO：62
Ab8轻链氨基酸序列
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWFQQKPGKAPKSLIYAASSLQGGVPSKFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYNYPFTFGPGTTVDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO：63
Ab1轻链可变结构域氨基酸序列
DIQMTQSPSSLSASLGDRVTITCRASQSVDRYFNWYQQKPGKAPKVLIFAASSLQSGVPSRFGGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPWTFGQGTKVEVK
SEQ ID NO：64
Ab2轻链可变结构域氨基酸序列
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTISCRASQFIGRYFNWYQQQPGKAPKVLIYAESSLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFARYYCQQSYSTPWTFGQGTKVEIK
SEQ ID NO：65
Ab3轻链可变结构域氨基酸序列
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSFSSNYLAWYQQKPGQAPRLFIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYFCQQYGISPCSFGQGTKLEIK
SEQ ID NO：66
Ab4轻链可变结构域氨基酸序列
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLNSNGYNYLDWYLQKPGQSPQFLIYLGSYRASGVPDRFSGSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCIQTLQTPFTFGPGTKVDIK
SEQ ID NO：67
Ab5轻链可变结构域氨基酸序列
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQRPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCLQSGSSVPLTFGGGTKVEIK
SEQ ID NO：68
Ab6轻链可变结构域氨基酸序列
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGINYVYWYQQLPGTAPKLLIYRSDQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLALSGLRSEDEADYYCAAWDDSLSGVVFGGGTKLTVL
SEQ ID NO：69
Ab7轻链可变结构域氨基酸序列
QSVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVNWYQQFPGTAPKLLIYVNNNRPSGVPDRFSGSTSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDTSLSASVFGGGTRLTVL
SEQ ID NO：70
Ab8轻链可变结构域氨基酸序列
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWFQQKPGKAPKSLIYAASSLQGGVPSKFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYNYPFTFGPGTTVDIK
SEQ ID NO：71
Ab1轻链CDR1氨基酸序列
RASQSVDRYFN
SEQ ID NO：72
Ab2轻链CDR1氨基酸序列
RASQFIGRYFN
SEQ ID NO：73
Ab3轻链CDR1氨基酸序列
RASQSFSSNYLA
SEQ ID NO：74
Ab4轻链CDR1氨基酸序列
RSSQSLLNSNGYNYLD
SEQ ID NO：75
Ab5轻链CDR1氨基酸序列
RASQSVSSSYLA
SEQ ID NO：76
Ab6轻链CDR1氨基酸序列
SGSSSNIGINYVY
SEQ ID NO：77
Ab7轻链CDR1氨基酸序列
TGSSSNIGAGYDVN
SEQ ID NO：78
Ab8轻链CDR1氨基酸序列
RASQGISNYLA
SEQ ID NO：79
Ab1轻链CDR2氨基酸序列
AASSLQS
SEQ ID NO：80
Ab2轻链CDR2氨基酸序列
AESSLQS
SEQ ID NO：81
Ab3轻链CDR2氨基酸序列
GASSRAT
SEQ ID NO：82
Ab4轻链CDR2氨基酸序列
LGSYRAS
SEQ ID NO：83
Ab5轻链CDR2氨基酸序列
GASSRAT
SEQ ID NO：84
Ab6轻链CDR2氨基酸序列
RSDQRPS
SEQ ID NO：85
Ab7轻链CDR2氨基酸序列
VNNNRPS
SEQ ID NO：86
Ab8轻链CDR2氨基酸序列
AASSLQG
SEQ ID NO：87
Ab1轻链CDR3氨基酸序列
QQSYSTPWT
SEQ ID NO：88
Ab2轻链CDR3氨基酸序列
QQSYSTPWT
SEQ ID NO：89
Ab3轻链CDR3氨基酸序列
QQYGISPCS
SEQ ID NO：90
Ab4轻链CDR3氨基酸序列
IQTLQTPFT
SEQ ID NO：91
Ab5轻链CDR3氨基酸序列
LQSGSSVPLT
SEQ ID NO：92
Ab6轻链CDR3氨基酸序列
AAWDDSLSGVV
SEQ ID NO：93
Ab7轻链CDR3氨基酸序列
QSYDTSLSASV
SEQ ID NO：94
Ab8轻链CDR3氨基酸序列
QQYYNYPFT
Figure IDA0000509038710000011
Figure IDA0000509038710000021
Figure IDA0000509038710000031
Figure IDA0000509038710000041
Figure IDA0000509038710000051
Figure IDA0000509038710000061
Figure IDA0000509038710000071
Figure IDA0000509038710000081
Figure IDA0000509038710000091
Figure IDA0000509038710000101
Figure IDA0000509038710000111
Figure IDA0000509038710000121
Figure IDA0000509038710000131
Figure IDA0000509038710000141
Figure IDA0000509038710000151
Figure IDA0000509038710000161
Figure IDA0000509038710000171
Figure IDA0000509038710000181
Figure IDA0000509038710000191
Figure IDA0000509038710000201
Figure IDA0000509038710000211
Figure IDA0000509038710000221
Figure IDA0000509038710000231
Figure IDA0000509038710000241
Figure IDA0000509038710000251
Figure IDA0000509038710000261
Figure IDA0000509038710000271
Figure IDA0000509038710000281
Figure IDA0000509038710000291
Figure IDA0000509038710000301
Figure IDA0000509038710000311
Figure IDA0000509038710000321
Figure IDA0000509038710000331
Figure IDA0000509038710000341
Figure IDA0000509038710000351
Figure IDA0000509038710000361
Figure IDA0000509038710000371
Figure IDA0000509038710000381
Figure IDA0000509038710000391
Figure IDA0000509038710000401
Figure IDA0000509038710000411
Figure IDA0000509038710000421
Figure IDA0000509038710000431
Figure IDA0000509038710000441
Figure IDA0000509038710000451
Figure IDA0000509038710000461
Figure IDA0000509038710000471
Figure IDA0000509038710000481
Figure IDA0000509038710000491
Figure IDA0000509038710000501
Figure IDA0000509038710000511
Figure IDA0000509038710000521
Figure IDA0000509038710000531
Figure IDA0000509038710000541
Figure IDA0000509038710000551
Figure IDA0000509038710000561
Figure IDA0000509038710000571
Figure IDA0000509038710000581
Figure IDA0000509038710000591
Figure IDA0000509038710000601
Figure IDA0000509038710000611
Figure IDA0000509038710000621
Figure IDA0000509038710000631
Figure IDA0000509038710000641
Figure IDA0000509038710000651
Figure IDA0000509038710000661
Figure IDA0000509038710000671
Figure IDA0000509038710000681
Figure IDA0000509038710000691
Figure IDA0000509038710000701
Figure IDA0000509038710000711
Figure IDA0000509038710000721
Figure IDA0000509038710000731
Figure IDA0000509038710000741
Figure IDA0000509038710000751
Figure IDA0000509038710000761
Figure IDA0000509038710000771
Figure IDA0000509038710000781
Figure IDA0000509038710000791
Figure IDA0000509038710000801
Figure IDA0000509038710000811
Figure IDA0000509038710000821
Figure IDA0000509038710000831

Claims (55)

1.具有轻链可变结构域和重链可变结构域的CD27L抗原结合蛋白，其中
a) 所述轻链可变结构域包含如SEQ ID NO:74表示的LCDR1；如SEQ ID NO:82表示的LCDR2序列；和如SEQ ID NO:90表示的LCDR3序列；以及所述重链可变结构域包含如SEQ IDNO:28表示的HCDR1；如SEQ ID NO:36表示的HCDR2序列；和如SEQ ID NO:44表示的HCDR3序列；
b) 如a)中所定义但存在R24K-S26G突变的轻链可变结构域，和如a)中所定义但存在N31S-I34M突变的重链可变结构域；
c) 如a)中所定义但存在R24K-S26G突变的轻链可变结构域，和如a)中所定义的重链可变结构域；
d) 如a)中所定义但存在L55I-Y58F突变的轻链可变结构域，和如a)中所定义的重链可变结构域；
e) 如a)中所定义但存在Q95N-T96S突变的轻链可变结构域，和如a)中所定义但存在N31S-I34M突变的重链可变结构域；或
f) 如a)中所定义但存在Q95N-T96S突变的轻链可变结构域，和如a)中所定义的重链可变结构域。
2.权利要求1的CD27L抗原结合蛋白，其包含：
a) 与SEQ ID NO:66表示的氨基酸序列具有至少95%同一性的轻链可变结构域；和
b) 与SEQ ID NO:20表示的氨基酸序列具有至少95%同一性的重链可变结构域。
3.权利要求2所述的CD27L抗原结合蛋白，其中所述轻链可变结构域由如SEQ ID NO:66表示的氨基酸序列组成。
4.权利要求2或3所述的CD27L抗原结合蛋白，其中所述重链可变结构域由如SEQ IDNO:20表示的氨基酸序列组成。
5.权利要求1所述的CD27L抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白以小于或等于2 x 10-11 M的亲和力特异性结合人CD27L。
6.权利要求1所述的CD27L抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白抑制CD27L与CD27的结合。
7.权利要求1所述的CD27L抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白为抗体。
8.权利要求7所述的CD27L抗原结合蛋白，其中所述抗体是双特异性抗体。
9.权利要求8所述的CD27L抗原结合蛋白，其中所述双特异性抗体结合CD27L和人效应细胞抗原，所述人效应细胞抗原为CD3。
10.权利要求1所述的CD27L抗原结合蛋白，其中所述CD27L抗原结合蛋白是抗体片段。
11.权利要求10所述的CD27L抗原结合蛋白，其中所述抗体片段选自F(ab)；F(ab')；F(ab')2；Fv；单链Fv分子(scFv)；双特异性单链Fv二聚体；双链抗体和三链抗体。
12.权利要求7所述的CD27L抗原结合蛋白，其中所述抗体为人抗体。
13.权利要求12所述的CD27L抗原结合蛋白，其包含如SEQ ID NO:58表示的氨基酸序列的轻链和如SEQ ID NO:12表示的氨基酸序列的重链。
14.一种抗体缀合物，其含有与化疗剂缀合的权利要求1所述的CD27L抗原结合蛋白。
15.权利要求14所述的抗体缀合物，其中接头使所述化疗剂与所述CD27L抗原结合蛋白缀合。
16.权利要求15所述的抗体缀合物，其中所述接头为不可裂解的接头。
17.权利要求16所述的抗体缀合物，其中所述接头包含N-琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯。
18.权利要求15-17中任一项所述的抗体缀合物，其中所述化疗剂与所述CD27L抗原结合蛋白的多肽中所含的一个或多个赖氨酸缀合。
19.权利要求14所述的抗体缀合物，其中所述化疗剂为DM1。
20.一种药物组合物，其包含权利要求19所述的抗体缀合物，其中每个CD27L抗原结合蛋白的DM1分子的平均数介于1和10之间。
21.权利要求20所述的药物组合物，其中每个CD27L抗原结合蛋白的DM1分子的平均数介于3和7之间。
22.权利要求21所述的药物组合物，其中每个CD27L抗原结合蛋白的DM1分子的平均数介于4和6之间。
23.权利要求21所述的药物组合物，其中每个CD27L抗原结合蛋白的DM1分子的平均数为4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9或6.0。
24.权利要求20-23中任一项所述的药物组合物，其包含治疗有效量的所述抗体缀合物。
25.权利要求24所述的药物组合物，其中所述药物组合物被冻干。
26.分离的核酸，其编码CD27L抗原结合蛋白的轻链可变结构域和重链可变结构域，其中：
a) 轻链可变结构域包含如SEQ ID NO:74表示的序列的LCDR1，如SEQ ID NO:82表示的序列的LCDR2，以及如SEQ ID NO:90表示的序列的LCDR3；和重链可变结构域包含如SEQ IDNO:28表示的序列的HCDR1；如SEQ ID NO:36表示的序列的HCDR2；以及如SEQ ID NO:44表示的序列的HCDR3；或
b) 如a)中所定义但存在R24K-S26G突变和Q95N-T96S突变中任一项的轻链可变结构域，和如a)中所定义但存在N31S-I34M突变的重链可变结构域；或
c) 轻链可变结构域如a)或b)所定义并且与SEQ ID NO:66表示的氨基酸序列具有至少95%同一性；和重链可变结构域如a)或b)所定义并且与SEQ ID NO:20表示的氨基酸序列具有至少95%同一性。
27.权利要求26所述的分离的核酸，其中所述轻链通过与SEQ ID NO:51表示的核苷酸序列具有至少95%同一性的核苷酸序列的核酸来编码。
28.权利要求27所述的分离的核酸，其中所述轻链通过SEQ ID NO:51表示的核苷酸序列的核酸来编码。
29.权利要求26所述的分离的核酸，其中所述重链通过与SEQ ID NO:5表示的核苷酸序列具有至少95%同一性的核苷酸序列的核酸来编码。
30.权利要求29所述的分离的核酸，其中所述重链通过SEQ ID NO:5表示的核苷酸序列的核酸来编码。
31.一种表达载体，其包含权利要求26-30中任一项所述的分离的核酸。
32.一种重组宿主细胞，其包含可操作连接启动子的权利要求26-30中任一项所述分离的核酸。
33.一种重组宿主细胞，其包含权利要求31所述的表达载体。
34.权利要求33所述的重组宿主细胞，其中所述宿主细胞分泌结合CD27L的抗体。
35.权利要求32-34中任一项所述的重组宿主细胞，其中所述细胞具有哺乳动物来源。
36.权利要求35所述的重组宿主细胞，其中所述细胞为中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系。
37.一种制备CD27L抗体药物缀合物的方法，所述方法包括以下步骤：
a) 提供权利要求1-9中任一项所述CD27L抗原结合蛋白；
b) 使所述CD27L抗原结合蛋白与接头缀合；以及
c) 使药物与所述接头缀合。
38.一种制备CD27L抗体药物缀合物的方法，所述方法包括以下步骤：
a) 提供权利要求1-9中任一项所述CD27L抗原结合蛋白；以及
b) 使共价结合药物的接头与所述CD27L抗原结合蛋白缀合。
39.权利要求37或38所述的方法，其中所述CD27L抗原结合蛋白为抗体。
40.权利要求39所述的方法，其中所述抗体包含如SEQ ID NO:66表示的氨基酸序列的轻链可变结构域和如SEQ ID NO:20表示的氨基酸序列的重链可变结构域。
41.权利要求40所述的方法，其中所述抗体包含如SEQ ID NO:58表示的氨基酸序列的轻链和如SEQ ID NO:12表示的氨基酸序列的重链。
42.权利要求37或38的方法，其中所述接头包含N-琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯。
43.权利要求37或38的方法，其中所述药物包含DM1。
44.权利要求1-13中任一项所述的CD27L抗原结合蛋白在制备用于治疗需要其的患者中透明细胞肾细胞癌或B细胞淋巴瘤的药物中的用途。
45.权利要求44所述的用途，其中所述CD27L抗原结合蛋白为抗体。
46.权利要求45所述的用途，其中所述抗体包含如SEQ ID NO:66表示的氨基酸序列的轻链可变结构域和如SEQ ID NO:20表示的氨基酸序列的重链可变结构域。
47.权利要求46所述的用途，其中所述抗体包含如SEQ ID NO:58表示的氨基酸序列的轻链和如SEQ ID NO:12表示的氨基酸序列的重链。
48.权利要求45-47中任一项所述的用途，其中所述抗体包含增强的效应子功能。
49.权利要求45-47中任一项所述的用途，其中所述药物包含抗体药物缀合物群。
50.权利要求49所述的用途，其中所述抗体药物缀合物包含N-琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯接头。
51.权利要求49所述的用途，其中所述抗体药物缀合物包含DM1。
52.权利要求51所述的用途，其中每个抗体的DM1分子的平均数介于1和10之间。
53.权利要求52所述的用途，其中每个抗体的DM1分子的平均数介于3和7之间。
54.权利要求53所述的用途，其中每个抗体的DM1分子的平均数介于4和6之间。
55.权利要求53所述的用途，其中每个抗体的DM1分子的平均数为4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9或6.0。
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