JP6251678B2 - Ｃｄ２７ｌ抗原結合タンパク質 - Google Patents

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Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１１年９月２２日に出願された米国仮特許出願第６１／５３８，０２４号の利益を主張するものであり、その内容は全体として参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は電子的形態での配列表と共に出願されている。配列表は、２０１２年９月１７日に作成された、A-1437-US-NP(US Non-Prov)_ST25.txtという名称の、９４．３ＫＢのサイズのファイルとして提供される。配列表の電子的形態の情報は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
本発明の分野は、ＣＤ２７Ｌと結合することができる抗原結合タンパク質（例えば、抗体）の組成物、および関連方法に関する。
ＣＤ２７Ｌ（ＣＤ７０、ＴＮＦＳＦ７）は、正常組織上でのその発現が、一部の活性化Ｔ細胞およびＢ細胞、樹状細胞、並びにごく一部の胸腺上皮細胞に高度に限定されている、ＩＩ型内在性膜タンパク質である。ＣＤ２７Ｌの生物学的機能としては免疫応答の増強または制御が挙げられるが、これらはその受容体であるＣＤ２７への結合を介してもたらされ、このＣＤ２７は主にリンパ系細胞上に発現している。ＣＤ２７Ｌ／ＣＤ２７相互作用によって、Ｂ細胞の増殖および分化並びにＴ細胞の同時刺激／活性化が制御される。ＣＤ２７欠損マウスにおけるＣＤ２７Ｌ／ＣＤ２７相互作用の撹乱は、免疫暴露がない場合にはいかなる表現型ももたらさない（Grewal, Expert Opin. Ther. Targets. 12, 341-351 (2008)）。
正常組織上でのその非常に限定された発現の他に、ＣＤ２７Ｌは、いくつかのＢ細胞非ホジキンリンパ腫（Ｂ−ＮＨＬ）腫瘍亜型、プレＢ細胞急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）およびＢ細胞型慢性リンパ球性白血病（Ｂ−ＣＬＬ）において、比較的高いレベルで発現される。ＣＤ２７Ｌの異常発現は腎細胞癌（ＲＣＣ）においても観察されるが、正常な腎臓または他の正常組織においては観察されない。従って、ＣＤ２７Ｌは、「腫瘍特異的抗原」の特性と一致する特性を、ほぼ示していると言える（Grewal, Expert Opin. Ther. Targets. 12, 341-351 (2008)）。
毎年米国において、ＲＣＣを発症するおよそ４９，０００人の患者のうち４０，０００人余りが、ｃｃＲＣＣであると診断される（米国がん協会: Cancer Facts and Figures最終版 (2008))。過去４年間にＲＣＣに対するいくつかの新しい治療薬が承認されているが、転移性ＲＣＣを有する患者の５年生存率は１０〜２０％と散々たるままであり(米国国立がん研究所。SEER cancer statistics fact sheet: cancer of the kidney and renal pelvis -- ２００８年にアクセス)、重要な医療ニーズが未だに対処されないままとなっている。年一回推定される、ＣＤ２７Ｌを発現することが予想される新たに診断されたｃｃＲＣＣ患者（米国）の数は、およそ３６，０００人である。推定６４，０００人のｃｃＲＣＣ患者が現在活動性疾患を抱えたまま存在している。
ＣＤ２７Ｌを異常発現することが報告されているＢ細胞悪性腫瘍のうち、びまん性大細胞Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）および濾胞性リンパ腫（ＦＬ）のＢ−ＮＨＬサブセットは、ＦＬの３３％からＤＬＢＣＬの７１％に渡って、最も高い発現発生率を示すことが、有効な抗体を用いる凍結切片に対するＩＨＣにより評価された（Lens et al., Brit. J. Hematol. 106, 491-503 (1999)）。Ｂ−ＣＬＬ腫瘍の５０〜８９％もＣＤ２７Ｌを発現することが、凍結腫瘍切片に対するＩＨＣまたは末梢循環腫瘍細胞に対するフローサイトメトリーによって評価されている（Ranheim et al., Blood 85, 3556-3565 (1965); Trentin et al., Cancer Res. 57, 4940-4947 (1997)）。
活性型Ｂ−ＮＨＬを現在有する米国における１２７，０００人の患者のうち、ＤＬＢＣＬ（中悪性度）亜型を有する患者はおよそ５０％存在する（Morton et al., Blood 107, 265-276 (2002)）。リツキサン（Rituxan）＋シクロホスファミド、アドリアマイシン、ビンクリスチン、プレドニゾン（ＣＨＯＰ）といったＤＬＢＣＬ患者に対する標準療法を受けたとしても、ほぼ半数が再発する。従って、未だ対処されていない医療ニーズがこの疾患にも同様に存在している。
Grewal, Expert Opin. Ther. Targets. 12, 341-351 (2008) 米国がん協会: Cancer Facts and Figures最終版 (2008) Lens et al., Brit. J. Hematol. 106, 491-503 (1999) Ranheim et al., Blood 85, 3556-3565 (1965) Trentin et al., Cancer Res. 57, 4940-4947 (1997) Morton et al., Blood 107, 265-276 (2002)
本発明は、抗ＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質、例えば、抗体およびその機能性フラグメントを提供する。抗ＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質は、異常な細胞増殖に関連する（例えば、がん）、および／または炎症に関連する疾患および障害の治療法において特に有用である。
第一の態様において、ＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質は、ａ）配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、もしくは配列番号７０に記載のアミノ酸配列に少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、または同一である軽鎖可変ドメイン；ｂ）配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、もしくは配列番号２４に記載のアミノ酸配列に少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、または同一である重鎖可変ドメイン；またはｃ）ａ）の軽鎖可変ドメインおよびｂ）の重鎖可変ドメインを含む。
第一の態様の好ましい抗原結合タンパク質には、配列番号６３に記載のアミノ酸配列に少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、または同一である軽鎖可変ドメインおよび配列番号１７に記載のアミノ酸配列に少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、または同一である重鎖可変ドメインを含むもの；配列番号６４に記載のアミノ酸配列に少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、または同一である軽鎖可変ドメインおよび配列番号１８に記載のアミノ酸配列に少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、または同一である重鎖可変ドメインを含むもの；配列番号６５に記載のアミノ酸配列に少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、または同一である軽鎖可変ドメインおよび配列番号１９に記載のアミノ酸配列に少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、または同一である重鎖可変ドメインを含むもの；配列番号６６に記載のアミノ酸配列に少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、または同一である軽鎖可変ドメインおよび配列番号２０に記載のアミノ酸配列に少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、または同一である重鎖可変ドメインを含むもの；配列番号６７に記載のアミノ酸配列に少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、または同一である軽鎖可変ドメインおよび配列番号２１に記載のアミノ酸配列に少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、または同一である重鎖可変ドメインを含むもの；配列番号６８に記載のアミノ酸配列に少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、または同一である軽鎖可変ドメインおよび配列番号２２に記載のアミノ酸配列に少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、または同一である重鎖可変ドメインを含むもの；配列番号６９に記載のアミノ酸配列に少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、または同一である軽鎖可変ドメインおよび配列番号２３に記載のアミノ酸配列に少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、または同一である重鎖可変ドメインを含むもの；並びに配列番号７０に記載のアミノ酸配列に少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、または同一である軽鎖可変ドメインおよび配列番号２４に記載のアミノ酸配列に少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、または同一である重鎖可変ドメインを含むもの、が含まれる。
第二の態様において、ＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質は、ａ）配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、もしくは配列番号７０に記載のアミノ酸配列から１０を超えない、または５を超えないアミノ酸の付加、欠失、もしくは置換を有する軽鎖可変ドメイン；ｂ）配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、もしくは配列番号２４に記載のアミノ酸配列から１０を超えない、または５を超えないアミノ酸の付加、欠失、もしくは置換を有する重鎖可変ドメイン；またはｃ）ａ）の軽鎖可変ドメインおよびｂ）の重鎖可変ドメインを含む。
第二の態様の好ましい抗原結合タンパク質には、配列番号６３に記載のアミノ酸配列から１０を超えない、または５を超えないアミノ酸の付加、欠失、または置換を有する軽鎖可変ドメインおよび配列番号１７に記載のアミノ酸配列から１０を超えない、または５を超えないアミノ酸の付加、欠失、または置換を有する重鎖可変ドメインを含むもの；配列番号６４に記載のアミノ酸配列から１０を超えない、または５を超えないアミノ酸の付加、欠失、または置換を有する軽鎖可変ドメインおよび配列番号１８に記載のアミノ酸配列から１０を超えない、または５を超えないアミノ酸の付加、欠失、または置換を有する重鎖可変ドメインを含むもの；配列番号６５に記載のアミノ酸配列から１０を超えない、または５を超えないアミノ酸の付加、欠失、または置換を有する軽鎖可変ドメインおよび配列番号１９に記載のアミノ酸配列から１０を超えない、または５を超えないアミノ酸の付加、欠失、または置換を有する重鎖可変ドメインを含むもの；配列番号６６に記載のアミノ酸配列から１０を超えない、または５を超えないアミノ酸の付加、欠失、または置換を有する軽鎖可変ドメインおよび配列番号２０に記載のアミノ酸配列から１０を超えない、または５を超えないアミノ酸の付加、欠失、または置換を有する重鎖可変ドメインを含むもの；配列番号６７に記載のアミノ酸配列から１０を超えない、または５を超えないアミノ酸の付加、欠失、または置換を有する軽鎖可変ドメインおよび配列番号２１に記載のアミノ酸配列から１０を超えない、または５を超えないアミノ酸の付加、欠失、または置換を有する重鎖可変ドメインを含むもの；配列番号６８に記載のアミノ酸配列から１０を超えない、または５を超えないアミノ酸の付加、欠失、または置換を有する軽鎖可変ドメインおよび配列番号２２に記載のアミノ酸配列から１０を超えない、または５を超えないアミノ酸の付加、欠失、または置換を有する重鎖可変ドメインを含むもの；配列番号６９に記載のアミノ酸配列から１０を超えない、または５を超えないアミノ酸の付加、欠失、または置換を有する軽鎖可変ドメインおよび配列番号２３に記載のアミノ酸配列から１０を超えない、または５を超えないアミノ酸の付加、欠失、または置換を有する重鎖可変ドメインを含むもの；並びに配列番号７０に記載のアミノ酸配列から１０を超えない、または５を超えないアミノ酸の付加、欠失、または置換を有する軽鎖可変ドメインおよび配列番号２４に記載のアミノ酸配列から１０を超えない、または５を超えないアミノ酸の付加、欠失、または置換を有する重鎖可変ドメインを含むもの、が含まれる。
第三の態様において、ＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質は、ａ）配列番号７１に記載のＬＣＤＲ１配列から３を超えないアミノ酸の付加、欠失、もしくは置換を有するＬＣＤＲ１；配列番号７９に記載のＬＣＤＲ２配列から３を超えないアミノ酸の付加、欠失、もしくは置換を有するＬＣＤＲ２；および配列番号８７に記載のＬＣＤＲ３配列から３を超えないアミノ酸の付加、欠失、もしくは置換を有するＬＣＤＲ３；ｂ）配列番号７２に記載のＬＣＤＲ１配列から３を超えないアミノ酸の付加、欠失、もしくは置換を有するＬＣＤＲ１；配列番号８０に記載のＬＣＤＲ２配列から３を超えないアミノ酸の付加、欠失、もしくは置換を有するＬＣＤＲ２；および配列番号８８に記載のＬＣＤＲ３配列から３を超えないアミノ酸の付加、欠失、もしくは置換を有するＬＣＤＲ３；ｃ）配列番号７３に記載のＬＣＤＲ１配列から３を超えないアミノ酸の付加、欠失、もしくは置換を有するＬＣＤＲ１；配列番号８１に記載のＬＣＤＲ２配列から３を超えないアミノ酸の付加、欠失、もしくは置換を有するＬＣＤＲ２；および配列番号８９に記載のＬＣＤＲ３配列から３を超えないアミノ酸の付加、欠失、もしくは置換を有するＬＣＤＲ３；ｄ）配列番号７４に記載のＬＣＤＲ１配列から３を超えないアミノ酸の付加、欠失、もしくは置換を有するＬＣＤＲ１；配列番号８２に記載のＬＣＤＲ２配列から３を超えないアミノ酸の付加、欠失、もしくは置換を有するＬＣＤＲ２；および配列番号９０に記載のＬＣＤＲ３配列から３を超えないアミノ酸の付加、欠失、もしくは置換を有するＬＣＤＲ３；ｅ）配列番号７５に記載のＬＣＤＲ１配列から３を超えないアミノ酸の付加、欠失、もしくは置換を有するＬＣＤＲ１；配列番号８３に記載のＬＣＤＲ２配列から３を超えないアミノ酸の付加、欠失、もしくは置換を有するＬＣＤＲ２；および配列番号９１に記載のＬＣＤＲ３配列から３を超えないアミノ酸の付加、欠失、もしくは置換を有するＬＣＤＲ３；ｆ）配列番号７６に記載のＬＣＤＲ１配列から３を超えないアミノ酸の付加、欠失、もしくは置換を有するＬＣＤＲ１；配列番号８４に記載のＬＣＤＲ２配列から３を超えないアミノ酸の付加、欠失、もしくは置換を有するＬＣＤＲ２；および配列番号９２に記載のＬＣＤＲ３配列から３を超えないアミノ酸の付加、欠失、もしくは置換を有するＬＣＤＲ３；ｇ）配列番号７７に記載のＬＣＤＲ１配列から３を超えないアミノ酸の付加、欠失、もしくは置換を有するＬＣＤＲ１；配列番号８５に記載のＬＣＤＲ２配列から３を超えないアミノ酸の付加、欠失、もしくは置換を有するＬＣＤＲ２；および配列番号９３に記載のＬＣＤＲ３配列から３を超えないアミノ酸の付加、欠失、もしくは置換を有するＬＣＤＲ３；またはｈ）配列番号７８に記載のＬＣＤＲ１配列から３を超えないアミノ酸の付加、欠失、もしくは置換を有するＬＣＤＲ１；配列番号８６に記載のＬＣＤＲ２配列から３を超えないアミノ酸の付加、欠失、もしくは置換を有するＬＣＤＲ２；および配列番号９４に記載のＬＣＤＲ３配列から３を超えないアミノ酸の付加、欠失、もしくは置換を有するＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変ドメイン；並びにｉ）配列番号２５に記載のＨＣＤＲ１配列から３を超えないアミノ酸の付加、欠失、もしくは置換を有するＨＣＤＲ１；配列番号３３に記載のＨＣＤＲ２配列から３を超えないアミノ酸の付加、欠失、もしくは置換を有するＨＣＤＲ２；および配列番号４１に記載のＨＣＤＲ３配列から３を超えないアミノ酸の付加、欠失、もしくは置換を有するＨＣＤＲ３；ｊ）配列番号２６に記載のＨＣＤＲ１配列から３を超えないアミノ酸の付加、欠失、もしくは置換を有するＨＣＤＲ１；配列番号３４に記載のＨＣＤＲ２配列から３を超えないアミノ酸の付加、欠失、もしくは置換を有するＨＣＤＲ２；および配列番号４２に記載のＨＣＤＲ３配列から３を超えないアミノ酸の付加、欠失、もしくは置換を有するＨＣＤＲ３；ｋ）配列番号２７に記載のＨＣＤＲ１配列から３を超えないアミノ酸の付加、欠失、もしくは置換を有するＨＣＤＲ１；配列番号３５に記載のＨＣＤＲ２配列から３を超えないアミノ酸の付加、欠失、もしくは置換を有するＨＣＤＲ２；および配列番号４３に記載のＨＣＤＲ３配列から３を超えないアミノ酸の付加、欠失、もしくは置換を有するＨＣＤＲ３；ｌ）配列番号２８に記載のＨＣＤＲ１配列から３を超えないアミノ酸の付加、欠失、もしくは置換を有するＨＣＤＲ１；配列番号３６に記載のＨＣＤＲ２配列から３を超えないアミノ酸の付加、欠失、もしくは置換を有するＨＣＤＲ２；および配列番号４４に記載のＨＣＤＲ３配列から３を超えないアミノ酸の付加、欠失、もしくは置換を有するＨＣＤＲ３；ｍ）配列番号２９に記載のＨＣＤＲ１配列から３を超えないアミノ酸の付加、欠失、もしくは置換を有するＨＣＤＲ１；配列番号３７に記載のＨＣＤＲ２配列から３を超えないアミノ酸の付加、欠失、もしくは置換を有するＨＣＤＲ２；および配列番号４５に記載のＨＣＤＲ３配列から３を超えないアミノ酸の付加、欠失、もしくは置換を有するＨＣＤＲ３；ｎ）配列番号３０に記載のＨＣＤＲ１配列から３を超えないアミノ酸の付加、欠失、もしくは置換を有するＨＣＤＲ１；配列番号３８に記載のＨＣＤＲ２配列から３を超えないアミノ酸の付加、欠失、もしくは置換を有するＨＣＤＲ２；および配列番号４６に記載のＨＣＤＲ３配列から３を超えないアミノ酸の付加、欠失、もしくは置換を有するＨＣＤＲ３；ｏ）配列番号３１に記載のＨＣＤＲ１配列から３を超えないアミノ酸の付加、欠失、もしくは置換を有するＨＣＤＲ１；配列番号３９に記載のＨＣＤＲ２配列から３を超えないアミノ酸の付加、欠失、もしくは置換を有するＨＣＤＲ２；および配列番号４７に記載のＨＣＤＲ３配列から３を超えないアミノ酸の付加、欠失、もしくは置換を有するＨＣＤＲ３；またはｐ）配列番号３２に記載のＨＣＤＲ１配列から３を超えないアミノ酸の付加、欠失、もしくは置換を有するＨＣＤＲ１；配列番号４０に記載のＨＣＤＲ２配列から３を超えないアミノ酸の付加、欠失、もしくは置換を有するＨＣＤＲ２；および配列番号４８に記載のＨＣＤＲ３配列から３を超えないアミノ酸の付加、欠失、もしくは置換を有するＨＣＤＲ３を含む重鎖可変ドメイン、を含有する。
第三の態様の好ましいＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質には、ａ）の軽鎖可変ドメインおよびｉ）の重鎖可変ドメインを含むもの；ｂ）の軽鎖可変ドメインおよびｊ）の重鎖可変ドメインを含むもの；ｃ）の軽鎖可変ドメインおよびｋ）の重鎖可変ドメインを含むもの；ｄ）の軽鎖可変ドメインおよびｌ）の重鎖可変ドメインを含むもの；ｅ）の軽鎖可変ドメインおよびｍ）の重鎖可変ドメインを含むもの；ｆ）の軽鎖可変ドメインおよびｎ）の重鎖可変ドメインを含むもの；ｇ）の軽鎖可変ドメインおよびｏ）の重鎖可変ドメインを含むもの；並びにｈ）の軽鎖可変ドメインおよびｐ）の重鎖可変ドメインを含むもの、が含まれる。
本発明の第四の態様において、第一、第二、または第三の態様のＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質は、２×１０−１１Ｍ未満の、またはそれに等しい親和性で、ヒトＣＤ２７Ｌに結合する。
本発明の第五の態様において、第一、第二、第三、または第四の態様のＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質は、ＣＤ２７ＬのＣＤ２７への結合を阻害する。
本発明の第六の態様において、第一、第二、第三、第四、または第五の態様のＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質は、ヒト抗体等の抗体である。好ましい抗体には、配列番号５６に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖および配列番号１０に記載のアミノ酸配列を有する重鎖を含む抗体；配列番号５７に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖および配列番号１１に記載のアミノ酸配列を有する重鎖を含む抗体；配列番号５８に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖および配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有する重鎖を含む抗体；配列番号５９に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖および配列番号１３に記載のアミノ酸配列を有する重鎖を含む抗体；配列番号６０に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖および配列番号１４に記載のアミノ酸配列を有する重鎖を含む抗体；配列番号６１に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖および配列番号１５に記載のアミノ酸配列を有する重鎖を含む抗体；並びに配列番号６２に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖および配列番号１６に記載のアミノ酸配列を有する重鎖を含む抗体、が含まれる。
第七の態様において、第一、第二、第三、第四、第五、または第六の態様のＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質は、薬剤または化学療法剤に結合して複合体化している。好ましい実施形態において、薬剤または化学療法剤は、抗原結合タンパク質（例えば抗体）に、リンカーを用いて結合して複合体化している。好ましいいリンカーには、ＭＣＣ等の切断不可なリンカーが含まれる。好ましい化学療法剤はＤＭ１である。従って、特に好ましい実施形態において、第七の態様は、一つまたは複数のリジン残基に結合したＭＣＣリンカーによってＤＭ１に結合して複合体化した、第一、第二、第三、第四、第五、または第六の態様のＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質を提供する。
ＤＭ１をＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質（例えば抗体）に対する複合体化プロセスにより、抗体あたり様々な範囲のＤＭ１分子を有するＤＭ１結合抗体の集団を含む組成物が生成される。組成物の平均数を測定することが可能である。好ましい実施形態において、ＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質（例えば抗体）あたりのＤＭ１分子の平均数は、１〜１０個、３〜７個、または４〜６個である。好ましい実施形態において、本発明の第一、第二、第三、第四、第五、第六、または第七の態様のＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質の組成物は、ＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質あたり約４．０、約４．１、約４．２、約４．３、約４．４、約４．５、約４．６、約４．７、約４．８、約４．９、約５．０、約５．１、約５．２、約５．３、約５．４、約５．５、約５．６、約５．７、約５．８、約５．９、または約６．０個のＤＭ１分子の平均数を有する。そのような組成物は、治療有効量のＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質を含有していてもよく、凍結乾燥されていてもよい。
第八の態様において、本発明は、ＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質の一つまたは複数のポリペプチド成分（例えば、抗体軽鎖または抗体重鎖）をコードする単離核酸を提供する。好ましい実施形態において、核酸は以下を含むポリペプチドをコードする：
ａ）配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、もしくは配列番号７０に記載のアミノ酸配列に対し少なくとも９５％の同一性を有する軽鎖可変ドメイン；
ｂ）配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、もしくは配列番号２４に記載のアミノ酸配列に対し少なくとも９５％の同一性を有する重鎖可変ドメイン；
ｃ）配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、もしくは配列番号７０に記載のアミノ酸配列から５を超えないアミノ酸の付加、欠失または置換を有する軽鎖可変ドメイン；
ｄ）配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、もしくは配列番号２４に記載のアミノ酸配列から５を超えないのアミノ酸の付加、欠失または置換を有する重鎖可変ドメイン；
ｅ）以下を含む軽鎖可変ドメイン：
ｉ）配列番号７１に記載のＬＣＤＲ１配列から３を超えないアミノ酸の付加、欠失、もしくは置換を有するＬＣＤＲ１；配列番号７９に記載のＬＣＤＲ２配列から３を超えないアミノ酸の付加、欠失、もしくは置換を有するＬＣＤＲ２；および配列番号８７に記載のＬＣＤＲ３配列から３を超えないアミノ酸の付加、欠失、もしくは置換を有するＬＣＤＲ３；
ｉｉ）配列番号７２に記載のＬＣＤＲ１配列から３を超えないアミノ酸の付加、欠失、もしくは置換を有するＬＣＤＲ１；配列番号８０に記載のＬＣＤＲ２配列から３を超えないアミノ酸の付加、欠失、もしくは置換を有するＬＣＤＲ２；および配列番号８８に記載のＬＣＤＲ３配列から３を超えないアミノ酸の付加、欠失、もしくは置換を有するＬＣＤＲ３；
ｉｉｉ）配列番号７３に記載のＬＣＤＲ１配列から３を超えないアミノ酸の付加、欠失、もしくは置換を有するＬＣＤＲ１；配列番号８１に記載のＬＣＤＲ２配列から３を超えないアミノ酸の付加、欠失、もしくは置換を有するＬＣＤＲ２；および配列番号８９に記載のＬＣＤＲ３配列から３を超えないアミノ酸の付加、欠失、もしくは置換を有するＬＣＤＲ３；
ｉｖ）配列番号７４に記載のＬＣＤＲ１配列から３を超えないアミノ酸の付加、欠失、もしくは置換を有するＬＣＤＲ１；配列番号８２に記載のＬＣＤＲ２配列から３を超えないアミノ酸の付加、欠失、もしくは置換を有するＬＣＤＲ２；および配列番号９０に記載のＬＣＤＲ３配列から３を超えないアミノ酸の付加、欠失、もしくは置換を有するＬＣＤＲ３；
ｖ）配列番号７５に記載のＬＣＤＲ１配列から３を超えないアミノ酸の付加、欠失、もしくは置換を有するＬＣＤＲ１；配列番号８３に記載のＬＣＤＲ２配列から３を超えないアミノ酸の付加、欠失、もしくは置換を有するＬＣＤＲ２；および配列番号９１に記載のＬＣＤＲ３配列から３を超えないアミノ酸の付加、欠失、もしくは置換を有するＬＣＤＲ３；
ｖｉ）配列番号７６に記載のＬＣＤＲ１配列から３を超えないアミノ酸の付加、欠失、もしくは置換を有するＬＣＤＲ１；配列番号８４に記載のＬＣＤＲ２配列から３を超えないアミノ酸の付加、欠失、もしくは置換を有するＬＣＤＲ２；および配列番号９２に記載のＬＣＤＲ３配列から３を超えないアミノ酸の付加、欠失、もしくは置換を有するＬＣＤＲ３；
ｖｉｉ）配列番号７７に記載のＬＣＤＲ１配列から３を超えないアミノ酸の付加、欠失、もしくは置換を有するＬＣＤＲ１；配列番号８５に記載のＬＣＤＲ２配列から３を超えないアミノ酸の付加、欠失、もしくは置換を有するＬＣＤＲ２；および配列番号９３に記載のＬＣＤＲ３配列から３を超えないアミノ酸の付加、欠失、もしくは置換を有するＬＣＤＲ３；もしくは
ｖｉｉｉ）配列番号７８に記載のＬＣＤＲ１配列から３を超えないアミノ酸の付加、欠失、もしくは置換を有するＬＣＤＲ１；配列番号８６に記載のＬＣＤＲ２配列から３を超えないアミノ酸の付加、欠失、もしくは置換を有するＬＣＤＲ２；および配列番号９４に記載のＬＣＤＲ３配列から３を超えないアミノ酸の付加、欠失、もしくは置換を有するＬＣＤＲ３；または
ｆ）以下を含む重鎖可変ドメイン：
ｉ）配列番号２５に記載のＨＣＤＲ１配列から３を超えないアミノ酸の付加、欠失、もしくは置換を有するＨＣＤＲ１；配列番号３３に記載のＨＣＤＲ２配列から３を超えないアミノ酸の付加、欠失、もしくは置換を有するＨＣＤＲ２；および配列番号４１に記載のＨＣＤＲ３配列から３を超えないアミノ酸の付加、欠失、もしくは置換を有するＨＣＤＲ３；
ｉｉ）配列番号２６に記載のＨＣＤＲ１配列から３を超えないアミノ酸の付加、欠失、もしくは置換を有するＨＣＤＲ１；配列番号３４に記載のＨＣＤＲ２配列から３を超えないアミノ酸の付加、欠失、もしくは置換を有するＨＣＤＲ２；および配列番号４２に記載のＨＣＤＲ３配列から３を超えないアミノ酸の付加、欠失、もしくは置換を有するＨＣＤＲ３；
ｉｉｉ）配列番号２７に記載のＨＣＤＲ１配列から３を超えないアミノ酸の付加、欠失、もしくは置換を有するＨＣＤＲ１；配列番号３５に記載のＨＣＤＲ２配列から３を超えないアミノ酸の付加、欠失、もしくは置換を有するＨＣＤＲ２；および配列番号４３に記載のＨＣＤＲ３配列から３を超えないアミノ酸の付加、欠失、もしくは置換を有するＨＣＤＲ３；
ｉｖ） 配列番号２８に記載のＨＣＤＲ１配列から３を超えないアミノ酸の付加、欠失、もしくは置換を有するＨＣＤＲ１；配列番号３６に記載のＨＣＤＲ２配列から３を超えないアミノ酸の付加、欠失、もしくは置換を有するＨＣＤＲ２；および配列番号４４に記載のＨＣＤＲ３配列から３を超えないアミノ酸の付加、欠失、もしくは置換を有するＨＣＤＲ３；
ｖ） 配列番号２９に記載のＨＣＤＲ１配列から３を超えないアミノ酸の付加、欠失、もしくは置換を有するＨＣＤＲ１；配列番号３７に記載のＨＣＤＲ２配列から３を超えないアミノ酸の付加、欠失、もしくは置換を有するＨＣＤＲ２；および配列番号４５に記載のＨＣＤＲ３配列から３を超えないアミノ酸の付加、欠失、もしくは置換を有するＨＣＤＲ３；
ｖｉ）配列番号３０に記載のＨＣＤＲ１配列から３を超えないアミノ酸の付加、欠失、もしくは置換を有するＨＣＤＲ１；配列番号３８に記載のＨＣＤＲ２配列から３を超えないアミノ酸の付加、欠失、もしくは置換を有するＨＣＤＲ２；および配列番号４６に記載のＨＣＤＲ３配列から３を超えないアミノ酸の付加、欠失、もしくは置換を有するＨＣＤＲ３；
ｖｉｉ）配列番号３１に記載のＨＣＤＲ１配列から３を超えないアミノ酸の付加、欠失、もしくは置換を有するＨＣＤＲ１；配列番号３９に記載のＨＣＤＲ２配列から３を超えないアミノ酸の付加、欠失、もしくは置換を有するＨＣＤＲ２；および配列番号４７に記載のＨＣＤＲ３配列から３を超えないアミノ酸の付加、欠失、もしくは置換を有するＨＣＤＲ３；もしくは
ｖｉｉｉ）配列番号３２に記載のＨＣＤＲ１配列から３を超えないアミノ酸の付加、欠失、もしくは置換を有するＨＣＤＲ１；配列番号４０に記載のＨＣＤＲ２配列から３を超えないアミノ酸の付加、欠失、もしくは置換を有するＨＣＤＲ２；および配列番号４８に記載のＨＣＤＲ３配列から３を超えないアミノ酸の付加、欠失、もしくは置換を有するＨＣＤＲ３。
第八の態様のある特定の実施形態において、ポリペプチドは、抗体軽鎖をコードし、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、または配列番号５５に記載のヌクレオチド配列に対し少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一である。第八の態様の他の実施形態では、ポリペプチドは、抗体重鎖をコードし、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、または配列番号９に記載のヌクレオチド配列に対し少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％同一である。
第九の態様において、本発明は第八の態様の一つまたは複数の単離核酸を含む発現ベクターを提供する。ある特定の実施形態において、発現ベクターは抗体軽鎖、抗体重鎖、または抗体軽鎖および重鎖の両方をコードする。
第十の態様において、本発明は、プロモーターに機能的に連結した第八の態様の一つまたは複数の単離核酸を含む組換え宿主細胞、例えば、本発明の第九の態様の一つまたは複数の発現ベクターを含む組換え宿主細胞を提供する。好ましい実施形態において、組換え宿主細胞はＣＤ２７Ｌと結合する抗体を分泌する。好ましい宿主細胞は哺乳類宿主細胞（例えばＣＨＯ細胞株）である。
第十一の態様において、本発明は、リンカーおよび薬剤（例えば、化学療法剤）を、第一、第二、第三、第四、第五、または第六の態様のＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質のいずれかに結合することにより、第七の態様のＣＤ２７Ｌ抗体薬剤結合体を作製する方法を提供する。リンカーおよび薬剤を最初に連結してからＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質に結合させて複合体化してもよく、あるいは最初にリンカーをＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質に結合させて複合体化してから薬剤に連結してもよい。好ましい実施形態において、リンカーはＭＣＣであり、薬剤はＤＭ１である。特に好ましい実施形態において、ＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質は、抗体内の一つまたは複数のリジン残基をＭＣＣまたはＭＣＣ−ＤＭ１と化学的に反応させることによって、ＭＣＣによりＤＭ１に結合して複合体化された、配列番号６３に記載の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列および配列番号１７に記載の重鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む抗体（例えば、Ａｂ１）、配列番号６４に記載の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列および配列番号１８に記載の重鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む抗体（例えば、Ａｂ２）、配列番号６５に記載の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列および配列番号１９に記載の重鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む抗体（例えば、Ａｂ３）、配列番号６６に記載の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列および配列番号２０に記載の重鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む抗体（例えば、Ａｂ４）、配列番号６７に記載の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列および配列番号２１に記載の重鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む抗体（例えば、Ａｂ５）、配列番号６８に記載の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列および配列番号２２に記載の重鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む抗体（例えば、Ａｂ６）、配列番号６９に記載の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列および配列番号２３に記載の重鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む抗体（例えば、Ａｂ７）、または配列番号７０に記載の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列および配列番号２４に記載の重鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む抗体（例えば、Ａｂ８）である。
第十二の態様において、本発明は、治療有効量の第一、第二、第三、第四、第五、または第六の態様のＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質を含む治療有効量の組成物を患者に投与することを含む、がん治療法を提供する。好ましい実施形態において、ＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質は、配列番号６３に記載の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列および配列番号１７に記載の重鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む抗体（例えば、Ａｂ１）、配列番号６４に記載の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列および配列番号１８に記載の重鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む抗体（例えば、Ａｂ２）、配列番号６５に記載の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列および配列番号１９に記載の重鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む抗体（例えば、Ａｂ３）、配列番号６６に記載の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列および配列番号２０に記載の重鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む抗体（例えば、Ａｂ４）、配列番号６７に記載の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列および配列番号２１に記載の重鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む抗体（例えば、Ａｂ５）、配列番号６８に記載の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列および配列番号２２に記載の重鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む抗体（例えば、Ａｂ６）、配列番号６９に記載の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列および配列番号２３に記載の重鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む抗体（例えば、Ａｂ７）、または配列番号７０に記載の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列および配列番号２４に記載の重鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む抗体（例えば、Ａｂ８）である。特に好ましい実施形態において、ＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質は、リンカー（ＭＣＣ）によって化学療法剤（例えば、ＤＭ１）に結合して複合体化している。第十二の態様の他の好ましい実施形態において、抗体は増強されたエフェクター機能を含む。
いくつかの実施形態において、ＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質は、腎細胞癌（ＲＣＣ）、明細胞ＲＣＣ、頭頸部がん、グリア芽腫、乳がん、脳腫瘍、鼻咽腔癌（nasopharangeal carcinoma）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、バーキットリンパ腫、未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）、多発性骨髄腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、結節性小切れ込み核細胞リンパ腫（nodular small cleaved-cell lymphoma）、リンパ球性リンパ腫、末梢性Ｔ細胞リンパ腫、レナートリンパ腫、免疫芽球性リンパ腫、Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬＬ）、成人Ｔ細胞白血病（Ｔ−ＡＬＬ）、中心芽細胞性（entroblastic）／中心細胞性（ｃｂ／ｃｃ）濾胞性リンパ腫（follicular lymphoma cancer）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（diffuse large cell lymphoma of B lineage）、血管免疫芽球性リンパ節症（ＡＩＬＤ）様Ｔ細胞リンパ腫、ＨＩＶ関連原発性滲出液リンパ腫（HIV associated body cavity based lymphoma）、胎生期癌、鼻咽腔未分化癌（undifferentiated carcinoma of the rhino-pharynx）、キャッスルマン病、カポジ肉腫、多発性骨髄腫、ワルデンストローム・マクログロブリン血症または他のＢ細胞リンパ腫を有する患者に投与される。
ある特定の実施形態において、ＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質を投与する前に、ＣＤ２７Ｌ発現について患者由来の試料が検査される。試料中のＣＤ２７ＬコードＲＮＡの有無またはＣＤ２７Ｌタンパク質の有無について検査することにより、ＣＤ２７Ｌ発現を決定することができる。試料は血液試料でも生検であってもよい。
第十三の態様において、本発明は、治療有効量の、第一、第二、第三、第四、第五、または第六の態様のうちのいずれかのＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質を、治療を必要とする患者に投与することを含む、自己免疫性疾患または炎症性疾患の治療法を提供する。好ましい実施形態において、ＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質は、配列番号６３に記載の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列および配列番号１７に記載の重鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む抗体（例えば、Ａｂ１）、配列番号６４に記載の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列および配列番号１８に記載の重鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む抗体（例えば、Ａｂ２）、配列番号６５に記載の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列および配列番号１９に記載の重鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む抗体（例えば、Ａｂ３）、配列番号６６に記載の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列および配列番号２０に記載の重鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む抗体（例えば、Ａｂ４）、配列番号６７に記載の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列および配列番号２１に記載の重鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む抗体（例えば、Ａｂ５）、配列番号６８に記載の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列および配列番号２２に記載の重鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む抗体（例えば、Ａｂ６）、配列番号６９に記載の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列および配列番号２３に記載の重鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む抗体（例えば、Ａｂ７）、または配列番号７０に記載の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列および配列番号２４に記載の重鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む抗体（例えば、Ａｂ８）である。好ましい実施形態において、ＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質はＣＤ２７のＣＤ２７Ｌへの結合を阻害する。特に好ましい実施形態において、自己免疫性疾患または炎症性疾患は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、多発性硬化症（ＭＳ）、乾癬、自己免疫性甲状腺炎、関節リウマチ（ＲＡ）、または糸球体腎炎である。他の実施形態では、治療により、患者における移植拒絶反応または移植片対宿主病が阻害または予防される。
ＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質の好ましい実施形態の機能的および物理的な特徴に関する概要。 Ａｂ４（Ａ４）およびＡｂ８（Ａ８）並びにそれらの複合体化同等物の７８６−０細胞への内部移行のレベルおよび速度の、経時的な測定（Ａ）。 ７８６−０細胞を、漸増濃度の抗ストレプトアビジン−ＭＣＣ−ＤＭ１、Ａｂ４−ＭＣＣ−ＤＭ１およびＡｂ８−ＭＣＣ−ＤＭ１の存在下で４日間培養した。細胞増殖に対する効果を、発光読み取り値により細胞数を測定するＣＥＬＬ−ＴＩＴＥＲ−ＧＬＯ試薬を用いて測定した。 ７８６−０異種移植モデルにおけるＡｂ４−ＭＣＣ−ＤＭ１およびＡｂ８−ＭＣＣ−ＤＭ１の用量反応。２４日目の表示用量の静脈内投与を矢印で示す。 Ｃａｋｉ−１異種移植モデルにおけるＡｂ４−ＭＣＣ−ＤＭ１およびＡｂ８−ＭＣＣ−ＤＭ１の用量反応。静脈内投与スケジュールを矢印で示す。 Ｒａｊｉ異種移植モデルにおけるＡｂ４−ＭＣＣ−ＤＭ１の用量反応。静脈内投与スケジュールを矢印で示す。 ７８６−０異種移植モデルにおけるＡｂ４−ＭＣＣ−ＤＭ１の一様でない用量反応。 Ｒａｊｉ腫瘍細胞に対するＡｂ４−ＭＣＣ−ＤＭ１抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）アッセイ。 Ｒａｊｉ腫瘍細胞および７８６−０腫瘍細胞の両方に対するＡｂ４−ＭＣＣ−ＤＭ１抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）アッセイ。 マスクドＩＨＣ（masked IHC）により「陽性」とされた一次凍結腫瘍試料における、ＣＤ２７Ｌ発現の比較。結果は、全体的なＣＤ２７Ｌタンパク質発現は、ｃｃＲＣＣ患者試料において最も高く、次いでＤＬＢＣＬ（びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫）；Ｂ−ＣＬＬおよびＦＬ試料であることを示している。 ＣＤ２７Ｌ ｍＲＮＡおよびタンパク質発現解析の結果。結果は、ＲＣＣ、Ｂ−ＮＨＬおよびＣＬＬ細胞においてＣＤ２７Ｌ発現が高率発生していることを示している。 本明細書の実施例２に記載のＡｂ−ＭＣＣ−ＤＭＡＤＣの構造を示す。
本明細書で使用される節の見出しは構成のみを目的としており、記載される発明の主題を限定するものと解釈されるべきではない。明細書本文内で引用される全ての参考文献は、それらの全体が参照によって明示的に組み込まれる。
組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、組織培養および形質転換、タンパク質精製等には標準的な技法を用いることができる。酵素反応および精製法は、製造業者の仕様書に従って、または当該技術分野において一般に達成されるように、または本明細書に記載の通りに、行うことができる。以下の手順および技法は、概して、当該技術分野において周知の、並びに本明細書全体を通じ引用され論じられている一般的な、およびより特定の種々の参考文献に記載される常法に従って、行うことができる。例えば、Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manuel, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, cold Spring Harbor, N.Y.を参照されたい（あらゆる目的で参照によって本明細書に組み込まれる）。明確な定義がなされない限り、本明細書に記載の分析化学、有機化学、並びに医薬品化学および製薬化学に関連して使用される命名法、並びにそれらの実験手順および実験技術は、当該技術分野において周知の、一般に使用されるものである。標準的な技法を、化学合成、化学分析、医薬製剤（pharmaceutical preparation）、製剤（formulation）、および送達並びに患者の治療に使用することができる。
ＣＤ２７Ｌ
本抗原結合タンパク質はＣＤ２７Ｌに結合するが、このＣＤ２７ＬはＣＤ７０およびＴＮＦＳＦ７としても知られている。ＣＤ２７Ｌは米国特許第５，５７３，９２４号に最初に記述された。例となるヒトＣＤ２７Ｌアミノ酸配列は本明細書では配列番号１として提供され、これはＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００１４２３．１（ＧＩ：４５０７６０５）に対応する。ある特定の実施形態において、本抗原結合タンパク質は、ＣＤ２７Ｌとその受容体ＣＤ２７との相互作用を遮断する。例となるＣＤ２７アミノ酸配列は配列番号２として提供され、これはスイスプロット：Ｐ２６８４２．２（ＧＩ：２６９８４９５４６）に対応する。成熟ＣＤ２７アミノ酸配列は配列番号２のアミノ酸２０〜２６０に対応する。
ＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質
本発明はＣＤ２７Ｌと特異的に結合する抗原結合タンパク質を提供する。抗原結合タンパク質の実施形態は、ＣＤ２７Ｌと特異的に結合するペプチドおよび／またはポリペプチドを含む。そのようなペプチドまたはポリペプチドは、所望により一つまたは複数の翻訳後修飾（port-translational modification）を含んでいてもよい。抗原結合タンパク質の実施形態は、本明細書で様々に定義される、ＣＤ２７Ｌと特異的に結合する抗体およびその断片を含む。これらには、ヒトＣＤ２７Ｌと特異的に結合する抗体が含まれ、例えば、ＣＤ２７Ｌが、ＣＤ２７と結合するのを阻害するおよび／またはＣＤ２７を活性化するのを阻害する抗体が含まれる。
本発明の抗原結合タンパク質はＣＤ２７Ｌに特異的に結合する。「特異的に結合する」とは、本明細書で使用される場合、抗原結合タンパク質が他のタンパク質よりも優先的にＣＤ２７Ｌと結合することを意味する。いくつかの実施形態において、「特異的に結合する」とは、ＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質が、他のタンパク質に対してよりも、ＣＤ２７Ｌに対してより高い親和性を有することを意味する。ＣＤ２７Ｌと特異的に結合するＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質は、１×１０−７Ｍ未満もしくは等しい、２×１０−７Ｍ未満もしくは等しい、３×１０−７Ｍ未満もしくは等しい、４×１０−７Ｍ未満もしくは等しい、５×１０−７Ｍ未満もしくは等しい、６×１０−７Ｍ未満もしくは等しい、７×１０−７Ｍ未満もしくは等しい、８×１０−７Ｍ未満もしくは等しい、９×１０−７Ｍ未満もしくは等しい、１×１０−８Ｍ未満もしくは等しい、２×１０−８Ｍ未満もしくは等しい、３×１０−８Ｍ未満もしくは等しい、４×１０−８Ｍ未満もしくは等しい、５×１０−８Ｍ未満もしくは等しい、６×１０−８Ｍ未満もしくは等しい、７×１０−８Ｍ未満もしくは等しい、８×１０−８Ｍ未満もしくは等しい、９×１０−８Ｍ未満もしくは等しい、１×１０−９Ｍ未満もしくは等しい、２×１０−９Ｍ未満もしくは等しい、３×１０−９Ｍ未満もしくは等しい、４×１０−９Ｍ未満もしくは等しい、５×１０−９Ｍ未満もしくは等しい、６×１０−９Ｍ未満もしくは等しい、７×１０−９Ｍ未満もしくは等しい、８×１０−９Ｍ未満もしくは等しい、９×１０−９Ｍ未満もしくは等しい、１×１０−１０Ｍ未満もしくは等しい、２×１０−１０Ｍ未満もしくは等しい、３×１０−１０Ｍ未満もしくは等しい、４×１０−１０Ｍ未満もしくは等しい、５×１０−１０Ｍ未満もしくは等しい、６×１０−１０Ｍ未満もしくは等しい、７×１０−１０Ｍ未満もしくは等しい、８×１０−１０Ｍ未満もしくは等しい、９×１０−１０Ｍ未満もしくは等しい、１×１０−１１Ｍ未満もしくは等しい、２×１０−１１Ｍ未満もしくは等しい、３×１０−１１Ｍ未満もしくは等しい、４×１０−１１Ｍ未満もしくは等しい、５×１０−１１Ｍ未満もしくは等しい、６×１０−１１Ｍ未満もしくは等しい、７×１０−１１Ｍ未満もしくは等しい、８×１０−１１Ｍ未満もしくは等しい、９×１０−１１Ｍ未満もしくは等しい、１×１０−１２Ｍ未満もしくは等しい、２×１０−１２Ｍ未満もしくは等しい、３×１０−１２Ｍ未満もしくは等しい、４×１０−１２Ｍ未満もしくは等しい、５×１０−１２Ｍ未満もしくは等しい、６×１０−１２Ｍ未満もしくは等しい、７×１０−１２Ｍ未満もしくは等しい、８×１０−１２Ｍ未満もしくは等しい、または９×１０−１２Ｍ未満もしくは等しい、ヒトＣＤ２７Ｌに対する結合親和性を有し得る。抗原結合タンパク質の結合親和性を測定する方法は当該技術分野において周知である。実施例１は例となる方法を提供する。
本明細書のＣＤ２７Ｌ結合抗体の種々の実施形態に参照がなされる場合、そのＣＤ２７Ｌ結合断片も包含されることが理解される。ＣＤ２７Ｌ結合断片は、ＣＤ２７Ｌに特異的に結合する能力を保持する本明細書に記載の抗体断片またはドメインのいずれかを含む。ＣＤ２７Ｌ結合断片は本明細書に記載の骨格のいずれかにあってもよい。
ある治療的実施形態において、ＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質は、ＣＤ２７ＬのＣＤ２７への結合を阻害する、および／またはＣＤ２７ＬのＣＤ２７への結合に関連する一つもしくは複数の生物活性（例えば、ＣＤ２７介在性シグナル伝達）を阻害する。そのような抗原結合タンパク質は「中和〜」と呼ばれている。ある特定の実施形態において、中和ＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質はＣＤ２７Ｌと特異的に結合し、１０％から１００％のあたりで、例えば少なくとも約２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％だけまたはそれ以上、ＣＤ２７ＬのＣＤ２７への結合を阻害する。例えば、ＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質は、ＣＤ２７−ＦｃのＭＰ−１細胞への結合を遮断する抗原結合タンパク質の能力を決定することにより、中和能について試験することができる（Slack et al, Int. Immunol. (1995) 7(7): 1087-1092)）。
抗原結合タンパク質の実施形態は、本明細書で様々に定義される骨格構造を、一つまたは複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）と共に含む。実施形態にはさらに、重鎖または軽鎖いずれかの、一つまたは複数の抗体可変ドメインを有する骨格構造を含む抗原結合タンパク質も含まれる。実施形態には、Ａｂ１軽鎖可変ドメイン（ＬＣｖ）、Ａｂ２ＬＣｖ、Ａｂ３ＬＣｖ、Ａｂ４ＬＣｖ、Ａｂ５ＬＣｖ、Ａｂ６ＬＣｖ、Ａｂ７ＬＣｖ、およびＡｂ８ＬＣｖ（それぞれ、配列番号６３〜７０）からなる群から選択される軽鎖可変ドメイン、並びに／またはＡｂ１重鎖可変ドメイン（ＨＣｖ）、Ａｂ２ＨＣｖ、Ａｂ３ＨＣｖ、Ａｂ４ＨＣｖ、Ａｂ５ＨＣｖ、Ａｂ６ＨＣｖ、Ａｂ７ＨＣｖ、およびＡｂ８ＨＣｖ（それぞれ、配列番号１７〜２４）からなる群から選択される重鎖可変ドメインを含む抗体、並びにその断片、誘導体、変異タンパク質、および変異体も含まれる。
Ａｂ１ＬＣｖを含む例となる軽鎖は、配列番号５６に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖である。
Ａｂ２ＬＣｖを含む例となる軽鎖は、配列番号５７に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖である。
Ａｂ４ＬＣｖを含む例となる軽鎖は、配列番号５８に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖である。
Ａｂ５ＬＣｖを含む例となる軽鎖は、配列番号５９に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖である。
Ａｂ６ＬＣｖを含む例となる軽鎖は、配列番号６０に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖である。
Ａｂ７ＬＣｖを含む例となる軽鎖は、配列番号６１に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖である。
Ａｂ８ＬＣｖを含む例となる軽鎖は、配列番号６２に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖である。
Ａｂ１ＨＣｖを含む例となる重鎖は、配列番号１０に記載のアミノ酸配列を含む重鎖である。
Ａｂ２ＨＣｖを含む例となる重鎖は、配列番号１１に記載のアミノ酸配列を含む重鎖である。
Ａｂ４ＨＣｖを含む例となる重鎖は、配列番号１２に記載のアミノ酸配列を含む重鎖である。
Ａｂ５ＨＣｖを含む例となる重鎖は、配列番号１３に記載のアミノ酸配列を含む重鎖である。
Ａｂ６ＨＣｖを含む例となる重鎖は、配列番号１４に記載のアミノ酸配列を含む重鎖である。
Ａｂ７ＨＣｖを含む例となる重鎖は、配列番号１５に記載のアミノ酸配列を含む重鎖である。
Ａｂ８ＨＣｖを含む例となる重鎖は、配列番号１６に記載のアミノ酸配列を含む重鎖である。
企図される骨格のさらなる例としては、フィブロネクチン、ネオカルチノスタチンＣＢＭ４−２、リポカリン、Ｔ細胞受容体、プロテインＡドメイン（プロテインＺ）、Ｉｍ９、ＴＰＲタンパク質、Ｚｎフィンガードメイン、ｐＶＩＩＩ、トリ膵臓ポリペプチド、ＧＣＮ４、ＷＷドメインＳｒｃ相同ドメイン３、ＰＤＺドメイン、ＴＥＭ−１βラクタマーゼ、チオレドキシン、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、ＰＨＤフィンガードメイン、ＣＬ−２、ＢＰＴＩ、ＡＰＰＩ、ＨＰＳＴＩ、エコチン、ＬＡＣＩ−Ｄ１、ＬＤＴＩ、ＭＴＩ−ＩＩ、サソリ毒、昆虫デフェンシン−Ａペプチド、ＥＥＴＩ−ＩＩ、Ｍｉｎ−２３、ＣＢＤ、ＰＢＰ、シトクロムｂ−５６２、Ｌｄｌ受容体ドメイン、γクリスタリン、ユビキチン、トランスフェリン、および／またはＣ型レクチン様ドメインが挙げられる。非抗体骨格およびそれらの治療薬としての使用は、Gebauer and Skerra, Curr. Opin. Chem. Biol., 13:245-255 (2009)およびBinz et al., Nat. Biotech., 23(10):1257-1268 (2005)で概説されており、これらはその全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
本発明の態様には、以下の可変ドメイン：Ａｂ１ＬＣｖ／Ａｂ１ＨＣｖ（配列番号６３／配列番号１７）、Ａｂ２ＬＣｖ／Ａｂ２ＨＣｖ（配列番号６４／配列番号１８）、Ａｂ３ＬＣｖ／Ａｂ３ＨＣｖ（配列番号６５／配列番号１９）、Ａｂ４ＬＣｖ／Ａｂ４ＨＣｖ（配列番号６６／配列番号２０）、Ａｂ５ＬＣｖ／Ａｂ５ＨＣｖ（配列番号６７／配列番号２１）、Ａｂ６ＬＣｖ／Ａｂ６ＨＣｖ（配列番号６８／配列番号２２）、Ａｂ７ＬＣｖ／Ａｂ７ＨＣｖ（配列番号６９／配列番号２３）、Ａｂ８ＬＣｖ／Ａｂ８ＨＣｖ（配列番号７０／配列番号２４）、およびそれらの組み合わせ、を含む抗体、並びにその断片、誘導体、変異タンパク質および変異体が含まれる。
本発明の抗体の例としては、Ａｂ１（配列番号５６／配列番号１０）、Ａｂ２（配列番号５７／配列番号１１）、Ａｂ４（配列番号５８／配列番号１２）、Ａｂ５（配列番号５９／配列番号１３）、Ａｂ６（配列番号６０／配列番号１４）、Ａｂ７（配列番号６１／配列番号１５）、Ａｂ８（配列番号６２／配列番号１６）が挙げられる。
典型的に、抗体の軽鎖または重鎖の各可変ドメインは３つのＣＤＲを含む。重鎖可変ドメインは、重鎖ＣＤＲ１（ＨＣＤＲ１）、重鎖ＣＤＲ２（ＨＣＤＲ２）、および重鎖ＣＤＲ３（ＨＣＤＲ３）を含む。軽鎖可変ドメインは、軽鎖ＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）、軽鎖ＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）、および軽鎖ＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）を含む。ある特定の実施形態において、抗原結合タンパク質は、本明細書に記載の好ましい可変ドメイン内に含有される一つまたは複数のＣＤＲを含む。
そのようなＣＤＲの例としては、限定はされないが、以下が挙げられる：
Ａｂ１ＬＣｖのＣＤＲ：ＬＣＤＲ１（配列番号７１）、ＬＣＤＲ２（配列番号７９）、およびＬＣＤＲ３（配列番号８７）；
Ａｂ２ＬＣｖのＣＤＲ:ＬＣＤＲ１（配列番号７２）、ＬＣＤＲ２（配列番号８０）、およびＬＣＤＲ３（配列番号８８）；
Ａｂ３ＬＣｖのＣＤＲＬＣＤＲ１（配列番号７３）、ＬＣＤＲ２（配列番号８１）、およびＬＣＤＲ３（配列番号８９）；
Ａｂ４ＬＣｖのＣＤＲ：ＬＣＤＲ１（配列番号７４）、ＬＣＤＲ２（配列番号８２）、およびＬＣＤＲ３（配列番号９０）；
Ａｂ５ＬＣｖのＣＤＲ：ＬＣＤＲ１（配列番号７５）、ＬＣＤＲ２（配列番号８３）、およびＬＣＤＲ３（配列番号９１）；
Ａｂ６ＬＣｖのＣＤＲ：ＬＣＤＲ１（配列番号７６）、ＬＣＤＲ２（配列番号８４）、およびＬＣＤＲ３（配列番号９２）；
Ａｂ７ＬＣｖのＣＤＲ：ＬＣＤＲ１（配列番号７７）、ＬＣＤＲ２（配列番号８５）、およびＬＣＤＲ３（配列番号９３）；
Ａｂ８ＬＣｖのＣＤＲ：ＬＣＤＲ１（配列番号７８）、ＬＣＤＲ２（配列番号８６）、およびＬＣＤＲ３（配列番号９４）；
Ａｂ１ＨＣｖのＣＤＲ：ＨＣＤＲ１（配列番号２５）、ＨＣＤＲ２（配列番号３３）、およびＨＣＤＲ３（配列番号４１）；
Ａｂ２ＨＣｖのＣＤＲ：ＨＣＤＲ１（配列番号２６）、ＨＣＤＲ２（配列番号３４）、およびＨＣＤＲ３（配列番号４２）；
Ａｂ３ＨＣｖのＣＤＲ：ＨＣＤＲ１（配列番号２７）、ＨＣＤＲ２（配列番号３５）、およびＨＣＤＲ３（配列番号４３）；
Ａｂ４ＨＣｖのＣＤＲ：ＨＣＤＲ１（配列番号２８）、ＨＣＤＲ２（配列番号３６）、およびＨＣＤＲ３（配列番号４４）；
Ａｂ５ＨＣｖのＣＤＲ：ＨＣＤＲ１（配列番号２９）、ＨＣＤＲ２（配列番号３７）、およびＨＣＤＲ３（配列番号４５）；
Ａｂ６ＨＣｖのＣＤＲ：ＨＣＤＲ１（配列番号３０）、ＨＣＤＲ２（配列番号３８）、およびＨＣＤＲ３（配列番号４６）；
Ａｂ７ＨＣｖのＣＤＲ：ＨＣＤＲ１（配列番号３１）、ＨＣＤＲ２（配列番号３９）、およびＨＣＤＲ３（配列番号４７）；並びに
Ａｂ８ＨＣｖのＣＤＲ：ＨＣＤＲ１（配列番号３２）、ＨＣＤＲ２（配列番号４０）、およびＨＣＤＲ３（配列番号４８）。
いくつかの実施形態において、抗原結合タンパク質は、Ａ）配列番号７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、および７８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ１；配列番号７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、および８６からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ２；並びに／もしくは配列番号８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、および９４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＬＣＤＲ３を含むポリペプチド（例えば、軽鎖）；並びに／またはＢ）配列番号２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、および３２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ１；配列番号３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、および４０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ２；並びに／もしくは配列番号４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、および４８からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＨＣＤＲ３を含むポリペプチド（例えば、重鎖）を含む。
さらなる実施形態では、抗原結合タンパク質は、Ａ）Ａｂ１ＬＣｖ、Ａｂ２ ＬＣｖ、Ａｂ３ＬＣｖ、Ａｂ４ＬＣｖ、Ａｂ５ ＬＣｖ、Ａｂ６ＬＣｖ、Ａｂ７ＬＣｖ、およびＡｂ８ＬＣｖのうちいずれかのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３を含む軽鎖アミノ酸配列、並びにＢ）Ａｂ１ＨＣｖ、Ａｂ２ＨＣｖ、Ａｂ３ＨＣｖ、Ａｂ４ＨＣｖ、Ａｂ５ＨＣｖ、Ａｂ６ＨＣｖ、Ａｂ７ＨＣｖ、およびＡｂ８ＨＣｖのうちいずれかのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３を含む重鎖アミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態において、ＣＤＲには、本明細書に記載の例となるＣＤＲからの、１を超えない、２を超えない、３を超えない、４を超えない、５を超えない、または６を超えないのアミノ酸の付加、欠失、または置換が含まれる。
本発明の態様には、配列番号６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、および７０からなる群から選択される軽鎖可変ドメインを含む抗体が含まれる。本発明の態様には、配列番号１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、および２４からなる群から選択される重鎖可変ドメインを含む抗体が含まれる。本発明のさらなる態様には、Ａ）配列番号６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、および７０からなる群から選択される軽鎖可変ドメイン、並びにＢ）配列番号１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、および２４からなる群から選択される重鎖可変ドメインを含む抗体が含まれる。
本発明の抗体は当該技術分野において公知のいかなる定常領域も含むことができる。軽鎖定常領域は、例えば、κ型またはλ型軽鎖定常領域（例えば、ヒトκ型またはλ型軽鎖定常領域）であってもよい。重鎖定常領域は、例えば、α型、δ型、ε型、γ型、またはμ型重鎖定常領域（例えば、ヒトα型、δ型、ε型、γ型、またはμ型重鎖定常領域）であってもよい。一実施形態では、軽鎖または重鎖の定常領域は、自然発生定常領域の断片、誘導体、変異体、または変異タンパク質である。
本発明の態様には、１を超えない、２を超えない、３を超えない、４を超えない、５を超えない、６を超えない、７を超えない、８を超えない、９を超えない、または１０を超えないのアミノ酸の付加、欠失、または置換を有する配列番号６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、および７０からなる群から選択される軽鎖可変領域を含む抗体が含まれる。本発明の態様には、１を超えない、２を超えない、３を超えない、４を超えない、５を超えない、６を超えない、７を超えない、８を超えない、９を超えない、または１０を超えないのアミノ酸の付加、欠失、または置換を有する配列番号１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、および２４からなる群から選択される重鎖可変領域を含む抗体が含まれる。本発明のさらなる態様は、Ａ）１を超えない、２を超えない、３を超えない、４を超えない、５を超えない、６を超えない、７を超えない、８を超えない、９を超えない、または１０を超えないのアミノ酸の付加、欠失、または置換を有する配列番号６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、および７０からなる群から選択される軽鎖可変領域、並びにＢ）１を超えない、２を超えない、３を超えない、４を超えない、５を超えない、６を超えない、７を超えない、８を超えない、９を超えない、または１０を超えないのアミノ酸の付加、欠失、または置換を有する配列番号１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、および２４からなる群から選択される重鎖可変領域を含む抗体が含まれる。例えば、ある特定の好ましい実施形態では、抗体は、１）５１位のフェニルアラニンがロイシンに変異している、および／もしくは１０５位のプロリンがグリシンもしくはグルタミンに変異している配列番号６６に記載の軽鎖可変ドメインの変異体；２）１位のグルタミンがグルタミン酸に変異している、および／もしくは１６位のアルギニンがグリシンに変異している配列番号２０に記載の重鎖可変ドメインの変異体；または５１位のフェニルアラニンがロイシンに変異している、および／または１０５位のプロリンがグリシンもしくはグルタミンに変異している配列番号６６に記載の軽鎖可変ドメインの変異体、並びに１位のグルタミンがグルタミン酸に変異している、および／または１６位のアルギニンがグリシンに変異している配列番号２０に記載の重鎖可変ドメインの変異体を含む。
一つの変異体において、抗原結合タンパク質は、配列番号６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、および７０からなる群から選択される軽鎖アミノ酸配列に、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含む。別の変異体において、抗原結合タンパク質は、配列番号１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、および２４からなる群から選択される重鎖アミノ酸配列に、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含む。さらに別の実施態様では、抗原結合タンパク質は、Ａ）配列番号６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、および７０からなる群から選択される軽鎖アミノ酸配列に、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一のアミノ酸配列、並びにＢ）配列番号１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、および２４からなる群から選択される重鎖アミノ酸配列に、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態において、抗原結合タンパク質は軽鎖ＣＤＲ３および／または重鎖ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態において、抗原結合タンパク質は、配列番号８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、および４８に記載の配列から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態において、アミノ酸配列には、配列番号８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、および４８に記載の例となる配列からの、１を超えない、２を超えない、３を超えない、４を超えない、５を超えない、または６を超えないのアミノ酸の付加、欠失、または置換が含まれる。従って、本発明の実施形態には、配列番号８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、および４８に記載の配列から成る群から選択されるアミノ酸配列に、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含む抗原結合タンパク質が含まれる。
ある特定の実施形態において、抗原結合タンパク質は、軽鎖ＣＤＲ２および／または重鎖ＣＤＲ２を含む。いくつかの実施形態において、抗原結合タンパク質は、配列番号７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、および４０に記載の配列から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態において、アミノ酸配列には、配列番号７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、および４０に記載の例となる配列からの、１を超えない、２を超えない、３を超えない、４を超えない、５を超えない、または６を超えないのアミノ酸の付加、欠失、または置換が含まれる。従って、本発明の実施形態には、配列番号７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、および４０に記載の配列から成る群から選択されるアミノ酸配列に、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含む抗原結合タンパク質が含まれる。
ある特定の実施形態において、抗原結合タンパク質は、軽鎖ＣＤＲ１および／または重鎖ＣＤＲ１を含む。いくつかの実施形態において、抗原結合タンパク質は、配列番号７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、および３２に記載の配列から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態において、アミノ酸配列には、配列番号７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、および３２に記載の例となる配列からの、１を超えない、２を超えない、３を超えない、４を超えない、５を超えない、または６を超えないのアミノ酸の付加、欠失、または置換が含まれる。従って、本発明の実施形態には、配列番号７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、および３２に記載の配列から成る群から選択されるアミノ酸配列に、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含む抗原結合タンパク質が含まれる。
本発明の抗原結合タンパク質は、それぞれ、従来の抗体（例えば、ヒトおよびモノクローナル抗体）、二重特異性抗体、ダイアボディ、ミニボディ、ドメイン抗体、合成抗体（「抗体模倣体」と称される場合もある）、キメラ抗体、抗体融合物（「抗体複合体」と称される場合もある）、および各々の断片の骨格を含む。種々のＣＤＲの組み合わせを含む上記のＣＤＲは、下記骨格のいずれにも移植することができる。
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、本明細書において様々に記述される、抗原に特異的に結合する一つまたは複数のポリペプチド鎖を含む単量体または多量体タンパク質の種々の形態を指す。ある特定の実施形態において、抗体は組換えＤＮＡ技術によって作製される。さらなる実施形態において、抗体は自然発生抗体の酵素的または化学的な切断により作製される。別の態様では、抗体はａ）ヒト抗体；ｂ）ヒト化抗体；ｃ）キメラ抗体；ｄ）モノクローナル抗体；ｅ）ポリクローナル抗体；ｆ）組換え抗体；ｇ）抗原結合性フラグメント；ｈ）一本鎖抗体；ｉ）ダイアボディ；ｊ）トリアボディ、ｋ）テトラボディ、ｌ）Ｆａｂフラグメント；ｍ）Ｆ（ａｂ’）２断片、ｎ）ＩｇＡ抗体、ｏ）ＩｇＤ抗体、ｐ）ＩｇＥ抗体、ｑ）ＩｇＧ１抗体、ｒ）ＩｇＧ２抗体、ｓ）ＩｇＧ３抗体、ｔ）ＩｇＧ４抗体、およびｕ）ＩｇＭ抗体からなる群から選択される。
可変領域はフレームワーク領域（フレームワーク領域ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４と称される）内に埋め込まれた少なくとも３つの重鎖ＣＤＲまたは軽鎖ＣＤＲを含む。Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest、公衆衛生局国立衛生研究所、メリーランド州ベテスダ。従来の抗体構造単位は典型的には四量体を含む。各四量体は典型的には２つの同一のポリペプチド鎖対から成り、それぞれの対は１つの「軽」鎖および１つの「重」鎖を有する。各鎖のアミノ末端部には、抗原認識に主に関与する、約１００〜１１０またはそれ以上のアミノ酸から成る可変領域が含まれる。各鎖のカルボキシ末端部分はエフェクター機能に主に関与する定常領域を定める。ヒト軽鎖はκまたはλ軽鎖に分類される。重鎖はμ、δ、γ、α、またはεに分類され、抗体のアイソタイプをそれぞれＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥと定義している。ＩｇＧはいくつかのサブクラスを有し、例えば、限定はされないが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４等である。ＩｇＭはサブクラスを有し、例えば、限定はされないが、ＩｇＭ１およびＩｇＭ２等である。本発明の実施形態には、本明細書に記載の抗原結合タンパク質の可変ドメインまたはＣＤＲを組み込む、そのようなクラスおよびサブクラスの抗体全てが含まれる。
いくつかの自然発生抗体（例えば、ラクダおよびラマに存在する抗体）は、２つの重鎖から成る二量体であり、軽鎖を含まない。本発明は、ＣＤ２７Ｌに結合することができる、２つの重鎖から成る二量体抗体またはその断片を包含する。
重鎖および軽鎖の可変領域は、比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と、それらを連結している３つの超可変領域、すなわち、相補性決定領域またはＣＤＲから成る、同じ全体構造を示すのが典型的である。ＣＤＲは抗原認識および結合に主に関与する。各対の２つの鎖のＣＤＲはフレームワーク領域によって整列せられ、これにより特定のエピトープへの結合が可能となる。Ｎ末端からＣ末端に向かって、軽鎖および重鎖は共に、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４というドメインを含む。各ドメインへのアミノ酸の割り当ては、Ｋａｂａｔの定義に従うものである。
ＣＤＲは抗原結合のための主な表面接触点を構成する。軽鎖のＣＤＲ３、および特に、重鎖のＣＤＲ３は、軽鎖可変領域および重鎖可変領域内の抗原結合における最も重要な決定因子を構成し得る。いくつかの抗体において、重鎖ＣＤＲ３は抗原と抗体の主な接触領域を構成しているように思われる。ＣＤＲ３のみを変化させるインビトロ選択スキームを用いることで、抗体の結合特性を変化させることができ、あるいは、どの残基が抗原の結合に寄与しているかを決定することができる。
自然発生抗体には典型的にシグナル配列が含まれるが、これは、タンパク質分泌のための細胞経路に抗体を仕向け、典型的には成熟抗体内には存在しないものである。本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドは、下記の自然発生シグナル配列または異種シグナル配列をコードしていてもよい。
一実施形態では、抗原結合タンパク質は本明細書に記載の例となるＣＤＲのうちの１〜６個を含む抗体である。本発明の抗体はいかなる型の抗体であってもよく、例えば、ＩｇＭ抗体、ＩｇＧ（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）抗体、ＩｇＤ抗体、ＩｇＡ抗体、またはＩｇＥ抗体である。特定の実施形態において、抗原結合タンパク質はＩｇＧ型抗体（例えばＩｇＧ１抗体）である。
いくつかの実施形態において、例えば、抗原結合タンパク質が完全な重鎖および軽鎖を有する抗体である場合、そのＣＤＲは、全て同一の種（例えば、ヒト）に由来する。あるいは、例えば、抗原結合タンパク質が上記配列に由来の６未満のＣＤＲを含有する実施形態において、追加のＣＤＲは他の種由来であってもよく、あるいは例となる配列に示されたＣＤＲとは異なるヒトＣＤＲであってもよい。例えば、本明細書で特定される適切な配列に由来するＨＣＤＲ３領域およびＬＣＤＲ３領域は、別の種または異なるヒト抗体配列から所望により選択されるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＬＣＤＲ１、およびＬＣＤＲ２、またはそれらの組み合わせと一緒に使用されてもよい。例えば、本発明のＣＤＲを、商業価値のあるキメラ抗体またはヒト化抗体のＣＤＲ領域と置き換えることができる。
特定の実施形態では、ヒト成分である、抗原結合タンパク質の骨格成分が利用されている。しかし、いくつかの実施形態においては、骨格成分は異なる種から得られる混合物であり得る。従って、抗原結合タンパク質が抗体である場合、そのような抗体はキメラ抗体および／またはヒト化抗体であり得る。概して、「キメラ抗体」および「ヒト化抗体」は共に、２つ以上の種に由来する領域を組み合わせた抗体を指す。例えば、「キメラ抗体」は、従来的には、マウス（または、場合によってはラット）由来の可変領域およびヒト由来の定常領域を含む。
「ヒト化抗体」は一般的に、可変ドメインフレームワーク領域（variable domain framework region）がヒト抗体内に存在する配列に置換されている、非ヒト抗体を指す。一般的に、ヒト化抗体においては、一つまたは複数のＣＤＲを除く抗体の全体がヒト由来のポリヌクレオチドにコードされているか、または一つもしくは複数のＣＤＲ内以外はそのような抗体と同一である。いくつか、または全てが非ヒト生物由来の核酸にコードされるＣＤＲをヒト抗体可変領域のβシートフレームワーク内に移植することで抗体を作製することができ、その抗体の特異性は、移植されたＣＤＲにより決定される。そのような抗体の作製は、例えば、ＷＯ９２／１１０１８、Jones 1986, Nature 321:522-525、Verhoeyen et al., 1988, Science 239:1534-1536に記載されている。遺伝子改変された免疫系を有するマウスを用いてヒト化抗体を作製することもできる。Roque et al., 2004, Biotechnol. Prog. 20:639-654。本明細書に記載される例となる実施形態において、特定されるＣＤＲはヒトＣＤＲであり、そのため、この文脈におけるヒト化抗体およびキメラ抗体には共に、いくつかの非ヒトＣＤＲが含まれ；例えば、ＨＣＤＲ３領域およびＬＣＤＲ３領域を、異なる種由来の一つまたは複数のその他のＣＤＲ領域と共に含むヒト化抗体を作製することができる。
一実施形態において、ＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質は多特異的（mutlispecific）抗体であり、特に、「ダイアボディ」と称される場合もある二重特異性（bispecfic）抗体である。これらは、２つ以上の異なる抗原または単一抗原上の異なるエピトープに結合する抗体である。ある特定の実施形態において、二重特異性抗体はＣＤ２７Ｌおよびヒトエフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞）上の抗原と結合する。そのような抗体は、ＣＤ２７Ｌ発現細胞（例えば、腫瘍細胞）に対するエフェクター細胞応答を標的とする際に有用である。好ましい実施形態において、ヒトエフェクター細胞抗原はＣＤ３である。米国特許第７，２３５，６４１号。二重特異性抗体の作製法は当該技術分野において公知である。そのような方法の一つは、細胞内で共発現された際の重鎖のヘテロ二量体形成を促進する「ノブ」および「ノブ穴」が形成されるように、重鎖のＦｃ部分を操作することを含む。米国特許第７，６９５，９６３号。別の方法では、重鎖のＦｃ部分の操作も含まれるが、細胞内で共発現された際の重鎖のヘテロ二量体形成を促進しつつホモ二量体形成を防止するための静電気的なステアリング（electrostatic steering）が使用される。ＷＯ０９／０８９，００４（その全体が参照によって本ん明細書に組み込まれる）。
一実施形態では、ＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質はミニボディである。ミニボディは、ＣＨ３ドメインに結合したｓｃＦｖを含む極小化された抗体様タンパク質である。Hu et al., 1996, Cancer Res. 56:3055-3061。
一実施形態では、ＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質はドメイン抗体である（例えば、米国特許第６，２４８，５１６号参照）。ドメイン抗体（ｄＡｂ）は、ヒト抗体の重鎖（ＶＨ）または軽鎖（ＶＬ）のいずれかの可変領域に対応する、抗体の機能的な結合ドメインである。ｄＡＢはおよそ１３ｋＤａの分子量、または完全抗体の１／１０未満の大きさを有する。ｄＡＢは種々の宿主（例えば、細菌系、酵母系、および哺乳類細胞系）においてよく発現されている。さらに、ｄＡｂは非常に安定であり、厳しい条件（例えば、凍結乾燥または熱変性）に暴露された後でさえ活性を維持する。例えば、米国特許第６，２９１，１５８号；同第６，５８２，９１５号；同第６，５９３，０８１号；同第６，１７２，１９７号；米国特許出願第２００４／０１１０９４１号；欧州特許第０３６８６８４号；米国特許第６，６９６，２４５号、ＷＯ０４／０５８８２１、ＷＯ０４／００３０１９およびＷＯ０３／００２６０９を参照されたい。
一実施形態では、ＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質は抗体断片であり、これは、ＣＤ２７Ｌに対する結合特異性を保持する、本明細書に記載の抗体のいずれかの断片である。種々の実施形態において、抗体結合タンパク質（antibody binding protein）は、限定はされないが、Ｆ（ａｂ）、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、または一本鎖Ｆｖフラグメントを含む。少なくとも、本明細書において意図される抗体は、軽鎖可変領域または重鎖可変領域の全てまたは一部（例えば、一つまたは複数のＣＤＲ）を含むＣＤ２７Ｌと特異的に結合することができるポリペプチドを含む。
ＣＤ２７Ｌ結合抗体断片のさらなる例としては、限定はされないが、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインから成るＦａｂフラグメント、（ｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインから成るＦｄ断片、（ｉｉｉ）単一抗体のＶＬおよびＶＨドメインから成るＦｖフラグメント；（ｉｖ）単一可変部から成るｄＡｂ断片（Ward et al., 1989, Nature 341:544-546）、（ｖ）単離されたＣＤＲ領域、（ｖｉ）２つの連結したＦａｂフラグメントを含む二価の断片であるＦ（ａｂ’）２断片、（ｖｉｉ）ＶＨドメインおよびＶＬドメインが、その２つのドメインが結合して抗原結合部位を形成することを可能にするペプチドリンカーによって連結されている一本鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）（Bird et al., 1988, Science 242:423-426, Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:5879-5883）、（ｖｉｉｉ）二重特異性一本鎖Ｆｖ二量体（ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９９６５）、並びに（ｉｘ） 遺伝子融合により構築される多価または多特異的断片である「ダイアボディ」または「トリアボディ」（Tomlinson et. al., 2000, Methods Enzymol. 326:461-479; WＯ94/13804; Holliger et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:6444-6448）が含まれる。抗体断片は改変されていてもよい。例えば、抗体断片分子はＶＨドメインとＶＬドメインを連結するジスルフィド架橋の組み込みにより、安定化されていてもよい（Reiter et al., 1996, Nature Biotech. 14:1239-1245）。本発明の態様には、これらの断片の非ＣＤＲ成分がヒト配列である実施形態が含まれる。
一実施形態では、ＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質は完全ヒト抗体である。本実施形態では、上記の通り、特定の構造は、ＣＤＲ領域を含むことが示されている完全な重鎖および軽鎖を含む。追加の実施形態では、一つまたは複数の本発明のＣＤＲ、並びに他のヒト抗体由来のその他のＣＤＲ、フレームワーク領域、ＪおよびＤ領域、定常領域等を利用している。例えば、本発明のＣＤＲは、いくつかのヒト抗体、特に商業価値のある抗体のＣＤＲと置換可能である。
重鎖および軽鎖の可変ドメイン（Ｆｖ領域）断片をアミノ酸架橋（短ペプチドリンカー）を介して連結させ、一本鎖ポリペプチドにすることにより、単一鎖抗体を形成させることができる。そのような一本鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖｓ）は、２つの可変ドメインポリペプチド（ＶＬおよびＶＨ）をコードするＤＮＡの間にペプチドリンカーをコードするＤＮＡを融合することにより作製されている。得られるポリペプチドは、２つの可変ドメイン間の可動性リンカーの長さに応じて、自然に折り畳まれて抗原結合性単量体を形成するか、または多量体（例えば、二量体、三量体、または四量体）を形成し得る（Kortt et al., 1997, Prot. Eng. 10:423; Kortt et al., 2001, Biomol. Eng. 18:95-108）。異なるＶＬ含有ポリペプチドおよびＶＨ含有ポリペプチドを組み合わせることにより、異なるエピトープに結合する多量体ｓｃＦｖを形成することができる（Kriangkum et al., 2001, Biomol. Eng. 18:31-40）。一本鎖抗体を作製するために開発された技法には、米国特許第４，９４６，７７８号；Bird, 1988, Science 242:423; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879; Ward et al., 1989, Nature 334:544, de Graaf et al., 2002, Methods Mol Biol. 178:379-87に記載の技法が含まれる。本明細書で提供される抗体に由来する単一鎖抗体（例えば、限定はされないが、Ａｂ１ＬＣｖ／Ａｂ１ＨＣｖ（配列番号６３／配列番号１７）、Ａｂ２ＬＣｖ／Ａｂ２ＨＣｖ（配列番号６４／配列番号１８）、Ａｂ３ＬＣｖ／Ａｂ３ＨＣｖ（配列番号６５／配列番号１９）、Ａｂ４ＬＣｖ／Ａｂ４ＨＣｖ（配列番号６６／配列番号２０）、Ａｂ５ＬＣｖ／Ａｂ５ＨＣｖ（配列番号６７／配列番号２１）、Ａｂ６ＬＣｖ／Ａｂ６ＨＣｖ（配列番号６８／配列番号２２）、Ａｂ７ＬＣｖ／Ａｂ７ＨＣｖ（配列番号６９／配列番号２３）、Ａｂ８ＬＣｖ／Ａｂ８ＨＣｖ（配列番号７０／配列番号２４）、およびそれらの組み合わせの、可変ドメインの組み合わせを含むｓｃＦｖ）も、本明細書に包含される。
一実施形態では、ＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質は抗体融合タンパク質（本明細書では「抗体複合体」とも称される）である。複合体パートナーはタンパク質性であっても非タンパク質性であってもよく；後者は一般的には抗原結合タンパク質上および複合体パートナー上の官能基を用いて作製される。ある特定の実施形態において、抗体は非タンパク質性の化学物質（薬剤）と複合体化されることで、抗体薬剤複合体を形成する。抗体薬剤複合体およびそのような複合体の作製法の例は、以下に記載される。
一実施形態では、ＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質は抗体類似体であり、「合成抗体」と称される場合もある。例えば、様々な研究で、移植されたＣＤＲを有する代替的なタンパク質骨格または人工骨格が利用されている。そのような骨格には、限定はされないが、結合タンパク質の三次元構造を安定化させるために導入される変異、および例えば生体適合性ポリマーから成る完全合成骨格が含まれる。例えば、Korndorfer et al., 2003, Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics, Volume 53, Issue 1:121-129を参照されたい。Roque et al., 2004, Biotechnol. Prog. 20:639-654。さらに、ペプチド抗体模倣剤（「ＰＡＭ」）を使用することができ、さらに、フィブロネクチン（fibronection）成分を骨格として利用している抗体模倣剤に基づいて作用することができる。
「タンパク質」とは、本明細書で使用される場合、少なくとも２つの共有結合したアミノ酸を意味し、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチドおよびペプチドが含まれる。いくつかの実施形態において、２つ以上の共有結合したアミノ酸はペプチド結合によって結合している。例えばタンパク質が下記の発現系および宿主細胞を用いて組換え的に作製されている場合、タンパク質は自然発生アミノ酸およびペプチド結合で構成されていてもよい。あるいは、タンパク質には合成アミノ酸（例えば、ホモフェニルアラニン、シトルリン、オルニチン、およびノルロイシン）、またはペプチド模倣構造体、すなわち、「ペプチドもしくはタンパク質の類似体」（例えばペプトイド）（Simon et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:9367参照（参照により本明細書に組み込まれる））が含まれ得るが、これはプロテアーゼまたは他の生理学的条件および／または保存条件に対し耐性を有し得る。そのような合成アミノ酸は、具体的には抗原結合タンパク質が当該技術分野において周知の常法によりインビトロで合成される際に組み込まれ得る。さらに、ペプチド模倣体、合成的および自然発生残基／構造体のいかなる組み合わせをも使用することができる。「アミノ酸」には、プロリンおよびヒドロキシプロリン等のイミノ酸残基も含まれる。アミノ酸「Ｒ基」または「側鎖」は（Ｌ）−または（Ｓ）−立体配置のいずれかであり得る。特定の実施形態において、アミノ酸は（Ｌ）−または（Ｓ）−立体配置であり得る。
ある態様において、本発明はＣＤ２７Ｌと結合し、いくつかの実施形態では組換えヒトＣＤ２７Ｌまたはその一部と結合する、組換え抗原結合タンパク質を提供する。この文脈において、「組換えタンパク質」は、当該技術分野において公知のあらゆる技術および方法を用いる組換え技術を用いて、すなわち、本明細書に記載の組換え核酸の発現を通じて作製されるタンパク質である。組換えタンパク質を作製するための方法および技術は当該技術分野において周知である。本発明の実施形態には、野生型ＣＤ２７Ｌおよびその変異体と結合する組換え抗原結合タンパク質が含まれる。
「〜本質的に成る」とは、アミノ酸配列が、本明細書に記載の生物活性を保持しつつ、引用される配列番号の配列と比較して約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５％だけ異なっていてもよいことを意味する。
いくつかの実施形態において、本発明の抗原結合タンパク質は単離タンパク質または実質的に純粋なタンパク質である。「単離」タンパク質は、例えば所与の試料中の全タンパク質の少なくとも約５重量％、または少なくとも約５０重量％を構成する、その天然状態において通常付随している物質のうちの少なくとも一部を伴わない。単離タンパク質は状況に応じて全タンパク質含量の５〜９９．９重量％を構成し得ることが理解される。例えば、タンパク質は、誘導性プロモーターまたは高発現プロモーターの使用を通じて有意に高い濃度で作製することができ、それによって、タンパク質を上昇した濃度レベルで作製することができる。定義には、当該技術分野において公知の種々様々な生物および／または宿主細胞内での抗原結合タンパク質の作製が含まれる。
アミノ酸配列において、配列の同一性および／または類似性は当該技術分野において公知の標準的な技術を用いて決定され、例えば、限定はされないが、好ましくは初期設定を用いる、または検査による、局所的配列同一性アルゴリズム（Smith and Waterman, 1981, Adv. Appl. Math. 2:482）、配列同一性整列アルゴリズム（Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443）、類似性検索法（Pearson and Lipman, 1988, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444）、これらのアルゴリズムのコンピュータ処理による実行（Wisconsin Genetics Software Package(Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.）におけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）、Devereux et al., 1984, Nucl. Acid Res. 12:387-395に記載される最良適合配列プログラムが挙げられる。好ましくは、同一性パーセントは、以下のパラメーター：ミスマッチペナルティ（mismatch penalty）は１；ギャップペナルティ（gap penalty）は１；ギャップサイズペナルティ（gap size penalty）は０．３３；連結ペナルティ（joining penalty）は３０、に基づいてＦａｓｔＤＢにより算出される（"Current Methods in Sequence Comparison and Analysis," Macromolecule Sequencing and Synthesis, Selected Methods and Applications, pp 127-149 (1988)、アラン・Ｒ・リース社(Alan R. Liss, Inc.)）。
有用なアルゴリズムの一例はＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、累進的な１対１の整列化を用いて、関連配列の一群から複数の配列アライメントを作成する。ＰＩＬＥＵＰはアライメントを作成するのに使用されるクラスタリングの関連性を示すツリーをプロットすることもできる。ＰＩＬＥＵＰはFeng & Doolittle, 1987, J. Mol. Evol. 35:351-360の累進的な整列法を単純化したものを使用しており；該方法は、Higgins and Sharp, 1989, CABIＯS 5:151-153に記載されるものと類似している。有用なＰＩＬＥＵＰパラメータとしては、デフォルトギャップウェイト（default gap weight）（３．００）、デフォルトギャップレングスウェイト（default gap length weight）（０．１０）、および加重エンドギャップ（weighted end gap）が含まれる。
有用なアルゴリズムの別の例は、以下に記載されているＢＬＡＳＴアルゴリズムである：Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410; Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402;およびKarin et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:5873-5787。特に有用なＢＬＡＳＴプログラムはAltschul et al., 1996, Methods in Enzymology 266:460-480から得られたＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２プログラムである。ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２はいくつかの検索パラメータを使用しており、そのほとんどはデフォルト値に設定される。調整可能なパラメータは以下の値に設定される：オーバーラップスパン（overlap span）＝１、オーバーラップフラクション（overlap fraction）＝０．１２５、ワード閾値（word threshold）（Ｔ）＝ＩＩ。ＨＳＰ ＳおよびＨＳＰ Ｓ２パラメータは動的な値であり、特定の配列の構成および目的の配列を検索する特定のデータベースの構成に応じてプログラムそれ自体により決定されるが；感度を上げるためにその値を調整してもよい。
これに加えて有用なアルゴリズムは、Altschul et al., 1993, Nucl. Acids Res. 25:3389-3402に報告されているギャップドＢＬＡＳＴ（gapped BLAST）である。ギャップドＢＬＡＳＴはＢＬＯＳＵＭ−６２代替スコアを使用し；閾値Ｔパラメーターを９に設定し；ギャップのない伸長を開始するための２ヒット法により、ギャップ長ｋにコスト１０＋ｋを課し；Ｘｕを１６に設定し、Ｘｇを、データベース検索段階用では４０に、アルゴリズムの出力段階用では６７に設定する。ギャップドアラインメントは約２２ビットに相当するスコアで開始される。
一般的に、個々の変異ＣＤＲ間のアミノ酸の相同性、類似性、または同一性は、本明細書に記載される配列に対して少なくとも８０％であり、より典型的には、相同性または同一性が少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、およびほぼ１００％に上昇することが好ましい。同様に、本明細書で特定される結合タンパク質の核酸配列に関する「核酸配列同一性パーセント（％）」を、抗原結合タンパク質のコード配列中のヌクレオチド残基と同一の、候補配列中のヌクレオチド残基の割合として定義する。特定の方法は、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２のＢＬＡＳＴＮモジュールをデフォルトパラメータに設定し、オーバーラップスパンおよびオーバーラップフラクションをそれぞれ１および０．１２５に設定して利用する。
一般的に、個々の変異ＣＤＲをコードするヌクレオチド配列と、本明細書に記載されるヌクレオチド配列の間の核酸配列の相同性、類似性、または同一性は少なくとも８０％であり、より典型的には、相同性または同一性が少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％、およびほぼ１００％に上昇することが好ましい。
従って、「変異ＣＤＲ」は本発明の親ＣＤＲに対し特定の相同性、類似性、または同一性を有するものであり、生物学的機能を、例えば、限定はされないが、親ＣＤＲの特異性および／または活性の少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％共有している。
アミノ酸配列変異を導入する部位または領域は予め決定されているが、変異それ自体は事前に決定されていなくてもよい。例えば、所与の部位での変異の性能を最適化するために、ランダム変異誘発を標的コドンまたは標的領域において実行し、発現された抗原結合タンパク質ＣＤＲ変異体を、所望の活性の最適な組み合わせを求めてスクリーニングしてもよい。公知の配列を有するＤＮＡ内の所定部位に置換変異を起こす技術は周知であり、例えば、Ｍ１３プライマーによる変異誘発およびＰＣＲによる変異誘発がある。変異体のスクリーニングは、抗原結合タンパク質活性（例えばＣＤ２７Ｌ結合性）のアッセイを使用して行われる。
アミノ酸置換は典型的には単一残基の置換であり；挿入は通常は約１〜約２０個の範囲のアミノ酸残基であるが、それよりもかなり大きな挿入にも耐えられ得る。欠失は、約１〜約２０個の範囲のアミノ酸残基であるが、場合によりさらに大きくなってもよい。
最終的な誘導体または変異体に到達するために、置換、欠失、挿入またはそれらのいかなる組み合わせをも使用することができる。一般的にこれらの変化は、分子、特に、抗原結合タンパク質の免疫原性および特異性の変化を最少にするために、少数のアミノ酸に対して為される。しかし、ある状況においてはより大きな変化が許容され得る。保存的置換は表１に示される以下のチャートに従って一般的には行われる。
Figure 0006251678
表１に示されるものよりも保存度が低い置換を選択することによって、機能または免疫学的同一性において相当な変化が生じる。例えば、変化領域におけるポリペプチド骨格の構造（例えばαへリックス構造またはβシート構造）；標的部位における分子の電位もしくは疎水性；または側鎖の嵩に、より有意に影響を与える置換を起こすことができる。一般的にポリペプチドの性質に最も大きな変化を与えると予想される置換は、（ａ）親水性残基（例えば、セリルまたはトレオニル）が疎水性残基（例えば、ロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリルまたはアラニル）に対して（またはそれによって）置換される置換；（ｂ）システインもしくはプロリンが他の任意の残基に対して（またはそれによって）置換される置換；（ｃ）正電荷側鎖を有する残基（例えば、リジル、アルギニル、またはヒスチジル）が負電荷残基（例えば、グルタミルまたはアスパルチル）に対して（またはそれによって）置換される置換；または（ｄ）嵩高い側鎖を有する残基（例えば、フェニルアラニン）が側鎖を有さない残基（例えば、グリシン）に対して（またはそれによって）置換される置換である。
変異体は典型的には同じ性質の生物活性を示し、自然発生類似体と同じ免疫応答を誘発するが、必要に応じて、抗原結合タンパク質の特徴を改変するためにも変異が選択される。あるいは、抗原結合タンパク質の生物活性が変化するように変異体を設計してもよい。例えば、糖鎖付加部位を本明細書で論じられるように変化または除去してもよい。
本発明の範囲内のＣＤ２７Ｌ抗体の他の誘導体には、ＣＤ２７Ｌ抗体ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合した異種ポリペプチドを含む組換え融合タンパク質の発現等による、ＣＤ２７Ｌ抗体またはその断片の、他のタンパク質またはポリペプチドとの共有結合または集合による複合体が含まれる。例えば、複合体化されるペプチドは、異種シグナル（またはリーダー）ポリペプチド（例えば、酵母α因子リーダー）、またはエピトープ標識等のペプチドであり得る。ＣＤ２７Ｌ抗体含有融合タンパク質は、ＣＤ２７Ｌ抗体の精製または特定を容易にするために付加されるペプチド（例えば、ポリＨｉｓ）を含むことができる。ＣＤ２７Ｌ抗体ポリペプチドは、Hopp et al., Bio/Technology 6:1204, 1988、および米国特許第５，０１１，９１２号に記載されているＦＬＡＧペプチドに連結することもできる。ＦＬＡＧペプチドは抗原性が高く、特異的なモノクローナル抗体（ｍＡｂ）が可逆的に結合するエピトープを与えることで、発現された組換えタンパク質の迅速なアッセイおよび容易な精製を可能にする。ＦＬＡＧペプチドが所与のポリペプチドに融合した融合タンパク質を作製するのに有用な試薬は、市販されている（シグマ社、ミズーリ州セントルイス）。
一つまたは複数のＣＤ２７Ｌ抗体ポリペプチドを含有するオリゴマーをＣＤ２７Ｌ拮抗物質として使用してもよい。オリゴマーは共有結合的に連結した、または非共有結合的に連結した二量体、三量体、またはより高位のオリゴマーの形態であってもよい。２つ以上のＣＤ２７Ｌ抗体ポリペプチドを含むオリゴマーの使用が企図されており、その一例はホモ二量体である。他のオリゴマーには、ヘテロ二量体、ホモ三量体、ヘテロ三量体、ホモ四量体、ヘテロ四量体等が含まれる。
ある特定の実施形態は、ＣＤ２７Ｌ抗体ポリペプチドに融合されたペプチド部分間での共有結合性または非共有結合性の相互作用を介して連結した複数のＣＤ２７Ｌ抗体ポリペプチドを含むオリゴマーを対象としている。そのようなペプチドはペプチドリンカー（スペーサー）、またはオリゴマー化を促進する特性を有するペプチドであり得る。ロイシンジッパーおよび抗体由来のある特定のポリペプチドは、以下でより詳細に記載される、それに結合したＣＤ２７Ｌ抗体ポリペプチドのオリゴマー化を促進することができるペプチドに含まれる。
特定の実施形態において、オリゴマーは２〜４個のＣＤ２７Ｌ抗体ポリペプチドを含む。オリゴマーのＣＤ２７Ｌ抗体部分は上記のいずれの形態（例えば、変異体または断片）であってもよい。オリゴマーはＣＤ２７Ｌ結合活性を有するＣＤ２７Ｌ抗体ポリペプチドを含むことが好ましい。
一実施形態では、オリゴマーは免疫グロブリン由来のポリペプチドを用いて作製される。抗体由来ポリペプチド（例えばＦｃドメイン）の様々な部位に融合したある特定の異種ポリペプチドを含む融合タンパク質の作製は、例えば、Ashkenazi et al., 1991, PNAS USA 88:10535; Byrn et al., 1990, Nature 344:677;およびHollenbaugh et al., 1992 "Construction of Immunoglobulin Fusion Proteins", Current Protocols in Immunology, Suppl. 4, pages 10.19.1 - 10.19.11に記載されている。
本発明のある特定の実施形態は、ＣＤ２７Ｌ抗体のＣＤ２７Ｌ結合断片を抗体のＦｃ領域に融合することによって作製される２つの融合タンパク質を含む二量体を対象にしている。二量体は以下により作製することができる：例えば、融合タンパク質をコードする遺伝子融合物を適切な発現ベクターに挿入し、その組み換え発現ベクターで形質転換された宿主細胞内でその遺伝子融合物を発現させ、発現した融合タンパク質を抗体分子の様にアセンブルさせて、Ｆｃ部分間に鎖間ジスルフィド結合が形成されることにより、二量体が得られる。
「Ｆｃポリペプチド」という用語には、本明細書で使用される場合、抗体のＦｃ領域由来のポリペプチドの天然および変異タンパク質形態が含まれる。二量体化を促進するヒンジ領域を含有するそのようなポリペプチドの切断型も含まれる。Ｆｃ部分（およびそれから形成されるオリゴマー）を含む融合タンパク質は、プロテインＡまたはプロテインＧカラム上のアフィニティークロマトグラフィーによる精製を容易にする利点を与える。
ＰＣＴ出願国際公開第９３／１０１５１号（参照により本明細書に組み込まれる）に記載される１つの適切なＦｃポリペプチドは、Ｎ末端ヒンジ領域からヒトＩｇＧ抗体のＦｃ領域の天然Ｃ末端まで伸びる一本鎖ポリペプチドである。別の有用なＦｃポリペプチドは、米国特許第５，４５７，０３５号およびBaum et al., 1994, EMBO J. 13:3992-4001に記載されているＦｃ変異タンパク質である。この変異タンパク質のアミノ酸配列は、アミノ酸１９がＬｅｕからＡｌａに変化していて、アミノ酸２０がＬｅｕからＧｌｕに変化していて、アミノ酸２２がＧｌｙからＡｌａに変化している以外は、ＷＯ９３／１０１５１に記載されている天然Ｆｃ配列のそれと同一である。変異タンパク質はＦｃ受容体に対する親和性が低減している。
他の実施形態では、ＣＤ２７Ｌ抗体の重鎖および／または軽鎖の可変部分が、抗体の重鎖および／または軽鎖の可変部分に対して置換されていてもよい。
あるいは、オリゴマーは、ペプチドリンカー（スペーサーペプチド）を含んでいてもいなくてもよい、複数のＣＤ２７Ｌ抗体ポリペプチドを含む融合タンパク質である。適切なペプチドリンカーとしては、米国特許第４，７５１，１８０号および同第４，９３５，２３３号に記載されているものが挙げられる。
オリゴマーＣＤ２７Ｌ抗体誘導体を作製するための別の方法には、ロイシンジッパーの使用が含まれる。ロイシンジッパードメインは、それらを含有するタンパク質のオリゴマー化を促進するペプチドである。ロイシンジッパーは元々はいくつかのＤＮＡ結合タンパク質において同定されたものであり（Landschulz et al., 1988, Science 240:1759）、それ以後、種々の異なるタンパク質内で発見されている。公知のロイシンジッパーとしては、二量体化または三量体化する自然発生ペプチドおよびそ誘導体が挙げられる。可溶性オリゴマータンパク質を生成するのに適したロイシンジッパードメインの例はＰＣＴ出願国際公開第９４／１０３０８に記載されており、ロイシンジッパーはHoppe et al., 1994, FEBS Letters 344:191（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている肺サーファクタントタンパク質Ｄ（ＳＰＤ）に由来する。融合した異種タンパク質の安定な三量体化を可能にする改変型ロイシンジッパーの使用は、Fanslow et al., 1994, Semin. Immunol. 6:267-78に記載されている。あるアプローチにおいて、ロイシンジッパーペプチドに融合したＣＤ２７Ｌ抗体断片または誘導体を含む組換え融合タンパク質が適切な宿主細胞内で発現され、形成する可溶性オリゴマーＣＤ２７Ｌ抗体断片または誘導体が培養上清から回収される。
抗原結合タンパク質の共有結合的修飾も本発明の範囲内であり、（常にではないが）一般的には、翻訳後に為される。例えば、抗原結合タンパク質のいくつかのタイプの共有結合修飾は、抗原結合タンパク質の特定のアミノ酸残基を、選択された側鎖またはＮ−もしくはＣ末端の残基と反応することが可能な有機誘導体化剤と反応させることにより、分子に導入される。
システイニル残基は、αハロ酢酸塩（および対応するアミン）（例えばクロロ酢酸またはクロロアセトアミド）と反応して、カルボキシメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体を生成するのが最も一般的である。システイニル残基は、ブロモトリフルオロアセトン、α−ブロモ−β−（５−イミドゾイル（imidozoyl））プロピオン酸、クロロアセチルホスフェート、Ｎ−アルキルマレイミド、３−ニトロ−２−ピリジルジスルフィド、メチル２−ピリジルジスルフィド、ｐ‐クロロ第二水銀安息香酸塩、２−クロロ第二水銀−４−ニトロフェノール、またはクロロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾールとの反応によっても誘導体化される。
ヒスチジル残基は、ｐＨ５．５〜７．０でのジエチルピロカルボネートとの反応により誘導体化されが、これは、この作用物質がヒスチジル側鎖に対して比較的特異性があるからである。パラ−ブロモフェナシルブロマイドも有用であり；その反応はｐＨ６．０の０．１Ｍ カコジル酸ナトリウム中で行われることが好ましい。
リジニル（lysinyl）およびアミノ末端残基はコハク酸無水物または他のカルボン酸無水物と反応せられる。これらの作用物質による誘導体化はリジニル（lysinyl）残基の電荷を逆転する効果を有する。α−アミノ含有残基を誘導体化するのに適切な他の試薬としては、イミドエステル、例えばメチルピコリンイミデート；リン酸ピリドキサール；ピリドキサール；クロロホウ化水素；トリニトロベンゼンスルホン酸；Ｏ−メチルイソ尿素；２，４−ペンタンジオン；およびアミノ基転移酵素により触媒されるグリオキシル酸塩との反応が挙げられる。
アルギニル残基は１またはいくつかの従来の試薬、特に、フェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオン、およびニンヒドリンとの反応により修飾される。アルギニン残基の誘導体化はアルカリ性条件で反応が行われることが必要であるが、これは、グアニジン官能基のｐＫａが高いためである。さらに、これらの試薬をリジンの基およびアルギニンε−アミノ基と反応させてもよい。
チロシル残基の特定の修飾を、芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンとの反応によりスペクトル標識（spectral label）をチロシル残基に導入することに特別な関心を持って、為してもよい。最も一般的には、Ｏ−アセチルチロシル種および３−ニトロ誘導体をそれぞれ形成するために、Ｎ−アセチルイミダゾール（N-acetylimidizole）およびテトラニトロメタンが使用される。ラジオイムノアッセイに用いる標識化タンパク質を作製するために、チロシル残基は１２５Ｉまたは１３１Ｉを用いてヨウ素化され、上に記載されるクロラミンＴ法が適切である。
カルボキシル側鎖（アスパルチルまたはグルタミル）は、ＲおよびＲ’が異なるアルキル基であってもよいカルボジイミド（Ｒ’−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−−Ｒ’）（例えば、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−４−エチル）カルボジイミドまたは１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミド）との反応により選択的に修飾される。さらに、アスパルチル残基およびグルタミル残基はアンモニウムイオンとの反応によりアスパラギニル残基およびグルタミニル残基に変換される。
二官能性物質による誘導体化は、種々の方法で使用するために、非水溶性の支持マトリックスまたは表面に抗原結合タンパク質を架橋結合するのに有用である。一般的に使用される架橋剤としては、例えば、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば、４−アジドサリチル酸とのエステル、ホモ二官能性（homobifunctional）イミドエステル、例えば３，３’−ジチオビス（サクシニミジルプロピオネート）等のジサクシニミジルエステル、および二官能性マレイミド、例えばビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタンが挙げられる。メチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミデート等の誘導体化剤は、光の存在下で架橋を形成することができる、光で活性化され得る中間体を生じる。あるいは、臭化シアン活性化炭水化物等の反応性非水溶性マトリクス、並びに米国特許第３，９６９，２８７号；同第３，６９１，０１６号；同第４，１９５，１２８号；同第４，２４７，６４２号；同第４，２２９，５３７号；および同第４，３３０，４４０号に記載されている反応性基質は、タンパク質の固定化に使用される。
グルタミニル残基およびアスパラギニル残基は多くの場合、脱アミド化されて、対応するグルタミル残基およびアスパルチル残基をそれぞれ生じる。あるいは、これらの残基は穏やかな酸性条件下で脱アミド化される。これらの残基のいずれの形態も本発明の範囲内である。
他の修飾としては、プロリンおよびリジンのヒドロキシル化、セリル残基またはトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン側鎖、アルギニン側鎖、およびヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化（T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, 1983, pp. 79-86）、Ｎ末端アミンのアセチル化、並びに任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化が挙げられる。
本発明の範囲に含まれる抗原結合タンパク質の別のタイプの共有結合修飾は、タンパク質のグリコシル化パターンを変化させることを含む。当該技術分野で知られているように、グリコシル化パターンは、タンパク質の配列（例えば、下記の特定のグリコシル化アミノ酸残基の有無）、またはそのタンパク質が産生される宿主細胞もしくは生物の両方に依存し得る。特定の発現系が以下に記載される。
ポリペプチドのグリコシル化は、典型的には、Ｎ結合型またはＯ結合型のいずれかである。Ｎ結合型は、炭水化物部分がアスパラギン残基側鎖に結合することを指す。トリペプチド配列のアスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラギン−Ｘ−トレオニン（Ｘはプロリン以外のいずれかのアミノ酸）は、炭水化物部分がアスパラギン側鎖に酵素的に結合するための認識配列である。従って、これらのトリペプチド配列のいずれかがポリペプチド内に存在することにより、糖鎖付加が起こり得る部位が生じる。Ｏ結合型グリコシル化は、糖類であるＮ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースのうちの１つが、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリンまたはトレオニンに結合することを指すが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリジンも利用され得る。
抗原結合タンパク質への糖鎖付加部位の付加は、アミノ酸配列が一つまたは複数の前述のトリペプチド配列（Ｎ結合型糖鎖付加部位のためのもの）を含有するように、アミノ酸配列を改変させることにより達成されることが好都合である。改変は、開始配列（Ｏ結合型糖鎖付加部位のためのもの）への一つまたは複数のセリン残基またはトレオニン残基の付加、またはそれによる置換によっても為され得る。容易にするために、抗原結合タンパク質アミノ酸配列は、ＤＮＡレベルでの変化を通じて、具体的には、所望のアミノ酸に翻訳されるコドンができるように標的ポリペプチドをコードするＤＮＡを所定の塩基で変異させることにより、改変されることが好ましい。
抗原結合タンパク質上の炭水化物部分の数を増加させる別の手段は、タンパク質へのグリコシドの化学的または酵素的なカップリングによるものである。これらの手順には、Ｎ−およびＯ結合型グリコシル化のためにグリコシル化能を有するタンパク質を宿主細胞内で産生させる必要がないという利点がある。使用されるカップリング様式に応じて、糖は、（ａ）アルギニンおよびヒスチジン、（ｂ）遊離カルボキシル基、（ｃ）遊離スルフヒドリル基（例えばシステインの基）、（ｄ）遊離ヒドロキシル基（例えばセリン、トレオニン、またはヒドロキシプロリンの基）、（ｅ）芳香族残基（例えばフェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファンの基）、または（ｆ）グルタミンのアミド基に結合することができる。これらの方法は、１９８７年９月１１日に公開されたＷＯ８７／０５３３０、およびAplin and Wriston, 1981, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306に記載されている。
開始抗原結合タンパク質上に存在する炭水化物部分の除去は、化学的または酵素的に達成することができる。化学的な糖鎖除去では、タンパク質を化合物トリフルオロメタンスルホン酸またはそれに相当する化合物に曝すことが必要となる。この処理により、連結糖（Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミン）以外の大部分または全ての糖類の切断が生じ、一方でポリペプチドは未変化のまま残る。化学的な糖鎖除去は、Hakimuddin et al., 1987, Arch. Biochem. Biophys. 259:52およびEdge et al., 1981, Anal. Biochem. 118:131に記載されている。ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的切断は、Thotakura et al., 1987, Meth. Enzymol. 138:350に記載されている種々のエンドグリコシダーゼおよびエキソグリコシダーゼを使用することにより達成することができる。潜在的糖鎖付加部位でのグリコシル化は、Duskin et al., 1982, J. Biol. Chem. 257:3105に記載されている化合物ツニカマイシンを使用することにより阻止することができる。ツニカマイシンはタンパク質−Ｎ−グリコシドの連鎖形成を阻止する。
抗原結合タンパク質の別のタイプの共有結合修飾は、米国特許第４，６４０，８３５号；同第４，４９６，６８９号；同第４，３０１，１４４号；同第４，６７０，４１７号；同第４，７９１，１９２号または同第４，１７９，３３７号に記載の方法で、種々の非タンパク質性ポリマー、例えば、限定はされないが、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールまたはポリオキシアルキレン等の種々のポリオールに抗原結合タンパク質を連結することを含む。さらに、当該技術分野で知られているように、抗原結合タンパク質内の様々な位置でアミノ酸置換を行うことにより、ＰＥＧ等のポリマーの付加を促進することができる。
いくつかの実施形態において、本発明の抗原結合タンパク質の共有結合修飾は、一つまたは複数の標識の付加を含む。
「標識基（labelling group）」という用語は、検出可能なあらゆる標識を意味する。適切な標識基の例としては、限定はされないが、以下が挙げられる：放射性同位元素もしくは放射性核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、蛍光基（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニド蛍光体）、酵素基（例えば、西洋わさびペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光基、ビオチニル基、または第二レポーターにより認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体に対する結合部位、金属結合ドメイン、エピトープ標識）。いくつかの実施形態において、標識基は、起こり得る立体障害を減らすために様々な長さのスペーサーアームを介して抗原結合タンパク質にカップリングされる。様々なタンパク質標識方法が当該技術分野において公知であり、本発明を実施する際に使用することができる。
一般的に、標識は、それらが検出されるアッセイに応じて様々なクラスに分類される：ａ）放射性同位元素または重同位元素であり得る、同位体標識；ｂ）磁気標識（例えば、磁性粒子）；ｃ）酸化還元活性部分；ｄ）光学色素；酵素基（例えば、西洋わさびペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）；ｅ）ビオチン化された基；およびｆ）二次レポーターにより認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体に対する結合部位、金属結合ドメイン、エピトープ標識等）。いくつかの実施形態において、標識基は、起こり得る立体障害を減らすために様々な長さのスペーサーアームを介して抗原結合タンパク質にカップリングされる。様々なタンパク質標識方法が当該技術分野において公知であり、本発明を実施する際に使用することができる。
特異的（specific）な標識としては、光学色素、例えば、限定はされないが、発色団、蛍光体およびフルオロフォアが含まれ、後者は多くの場合、特異的（specific）である。フルオロフォアは、「小分子」の蛍光物質（fluore）であっても、タンパク質性の蛍光物質（fluore）であってもよい。
「蛍光ラベル」はその固有の蛍光特性により検出することができるあらゆる分子を意味する。適切な蛍光標識としては、限定はされないが、フルオレセイン、ローダミン、テトラメチルローダミン、エオシン、エリスロシン、クマリン、メチル−クマリン、ピレン、Ｍａｌａｃｉｔｅ ｇｒｅｅｎ、スチルベン、Ｌｕｃｉｆｅｒ Ｙｅｌｌｏｗ、Ｃａｓｃａｄｅ ＢｌｕｅＪ、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、ＩＡＥＤＡＮＳ、ＥＤＡＮＳ、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、ＬＣ Ｒｅｄ６４０、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、ＬＣ Ｒｅｄ７０５、Ｏｒｅｇｏｎ ｇｒｅｅｎ、Ａｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ色素（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ３５０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４３０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５４６、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５６８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５９４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６３３、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６６０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６８０）、Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅ、Ｃａｓｃａｄｅ ＹｅｌｌｏｗおよびＲ−フィコエリトリン（R-phycoerythrin）（ＰＥ）（モレキュラープローブス社、オレゴン州ユージーン）、ＦＩＴＣ、ローダミン、およびＴｅｘａｓ Ｒｅｄ（ピアス社、イリノイ州ロックフォード）、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７（アマシャム・ライフサイエンス社（Amersham Life Science）、ペンシルバニア州ピッツバーグ）が挙げられる。適切な光学色素（例えばフルオロフォア）は、Richard P. HauglandによるMolecular Probes Handbook（参照により本明細書に明確に組み込まれる）に記載されている。
また、適切なタンパク質性蛍光標識としては、限定はされないが、緑色蛍光タンパク質（例えば、ウミシイタケ属（Renilla）、プチロサルクス属（Ptilosarcus）、またはオワンクラゲ属（Aequorea）のＧＦＰ（Chalfie et al., 1994, Science 263:802-805）、ＥＧＦＰ（クロンテック・ラボラトリーズ社、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｕ５５７６２））、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ、クアンタム・バイオテクノロジーズ社（Quantum Biotechnologies, Inc.）1801 de Maisonneuve Blvd. West, 8th Floor、モントリオール、ケベック州、カナダ H3H 1J9;tauber, 1998, Biotechniques 24:462-471; Heim et al., 1996, Curr. Biol. 6:178-182）、増強黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ、クロンテック・ラボラトリーズ社）、ルシフェラーゼ（Ichiki et al., 1993, J. Immunol. 150:5408-5417）、βガラクトシダーゼ（Nolan et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2603-2607）、およびウミシイタケ属（Renilla）（ＷＯ９２／１５６７３、ＷＯ９５／０７４６３、ＷＯ９８／１４６０５、ＷＯ９８／２６２７７、ＷＯ９９／４９０１９、米国特許第５２９２６５８号、同第５４１８１５５号、同第５６８３８８８号、同第５７４１６６８号、同第５７７７０７９号、同第５８０４３８７号、同第５８７４３０４号、同第５８７６９９５号、同第５９２５５５８号）が挙げられる。上記で引用された参考文献は全て、参照によって本明細書に明確に組み込まれる。
ＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質をコードするポリヌクレオチド
本明細書で定義されるＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質（例えば、抗体）をコードする核酸が、本明細書に包含される。好ましい核酸には、本明細書に記載の例となる軽鎖および重鎖をコードする核酸が含まれる。
Ａｂ１ＬＣをコードする核酸の一例は、配列番号４９に記載の配列を含む核酸である。
Ａｂ２ＬＣをコードする核酸の一例は、配列番号５０に記載の配列を含む核酸である。
Ａｂ４ＬＣをコードする核酸の一例は、配列番号５１に記載の配列を含む核酸である。
Ａｂ５ＬＣをコードする核酸の一例は、配列番号５２に記載の配列を含む核酸である。
Ａｂ６ＬＣをコードする核酸の一例は、配列番号５３に記載の配列を含む核酸である。
Ａｂ７ＬＣをコードする核酸の一例は、配列番号５４に記載の配列を含む核酸である。
Ａｂ８ＬＣをコードする核酸の一例は、配列番号５５に記載の配列を含む核酸である。
Ａｂ１ＨＣをコードする核酸の一例は、配列番号３に記載の配列を含む核酸である。
Ａｂ２ＨＣをコードする核酸の一例は、配列番号４に記載の配列を含む核酸である。
Ａｂ４ＨＣをコードする核酸の一例は、配列番号５に記載の配列を含む核酸である。
Ａｂ５ＨＣをコードする核酸の一例は、配列番号６に記載の配列を含む核酸である。
Ａｂ６ＨＣをコードする核酸の一例は、配列番号７に記載の配列を含む核酸である。
Ａｂ７ＨＣをコードする核酸の一例は、配列番号８に記載の配列を含む核酸である。
Ａｂ８ＨＣをコードする核酸の一例は、配列番号９に記載の配列を含む核酸である。
本発明の態様には、本明細書に記載のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド変異体（例えば、縮重による）が含まれる。
本発明の態様には、種々の実施形態、例えば、限定はされないが、以下の好ましい実施形態が含まれる。
以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む一つまたは複数のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド：
Ａ．
１．配列番号６３〜７０に記載の軽鎖可変ドメイン配列に少なくとも９０％同一の軽鎖可変ドメイン配列；
２．配列番号１７〜２４に記載の重鎖可変ドメイン配列に少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメイン配列；
３．（１）の軽鎖可変ドメインおよび（２）の重鎖可変ドメイン；並びに
Ｂ． 以下の配列から得られる各ＣＤＲにおいて、合計で３つを超えないアミノ酸の付加、置換、および／または欠失だけ異なる、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を含む軽鎖可変ドメインおよび／またはＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を含む重鎖可変ドメイン：
１．Ａｂ１の軽鎖ＣＤＲ１（配列番号７１）、ＣＤＲ２（配列番号７９）、ＣＤＲ３（配列番号８７）または重鎖ＣＤＲ１（配列番号２５）、ＣＤＲ２（配列番号３３）、ＣＤＲ３（配列番号４１）；
２．Ａｂ２の軽鎖ＣＤＲ１（配列番号７２）、ＣＤＲ２（配列番号８０）、ＣＤＲ３（配列番号８８）または重鎖ＣＤＲ１（配列番号２６）、ＣＤＲ２（配列番号３４）、ＣＤＲ３（配列番号４２）；
３．Ａｂ３の軽鎖ＣＤＲ１（配列番号７３）、ＣＤＲ２（配列番号８１）、ＣＤＲ３（配列番号８９）または重鎖ＣＤＲ１（配列番号２７）、ＣＤＲ２（配列番号３５）、ＣＤＲ３（配列番号４３）；
４．Ａｂ４の軽鎖ＣＤＲ１（配列番号７４）、ＣＤＲ２（配列番号８２）、ＣＤＲ３（配列番号９０）または重鎖ＣＤＲ１（配列番号２８）、ＣＤＲ２（配列番号３６）、ＣＤＲ３（配列番号４４）；
５．Ａｂ５の軽鎖ＣＤＲ１（配列番号７５）、ＣＤＲ２（配列番号８３）、ＣＤＲ３（配列番号９１）または重鎖ＣＤＲ１（配列番号２９）、ＣＤＲ２（配列番号３７）、ＣＤＲ３（配列番号４５）；
６．Ａｂ６の軽鎖ＣＤＲ１（配列番号７６）、ＣＤＲ２（配列番号８４）、ＣＤＲ３（配列番号９２）または重鎖ＣＤＲ１（配列番号３０）、ＣＤＲ２（配列番号３８）、ＣＤＲ３（配列番号４６）；
７．Ａｂ７の軽鎖ＣＤＲ１（配列番号７７）、ＣＤＲ２（配列番号８５）、ＣＤＲ３（配列番号９３）または重鎖ＣＤＲ１（配列番号３１）、ＣＤＲ２（配列番号３９）、ＣＤＲ３（配列番号４７）；並びに
８．Ａｂ８の軽鎖ＣＤＲ１（配列番号７８）、ＣＤＲ２（配列番号８６）、ＣＤＲ３（配列番号９４）または重鎖ＣＤＲ１（配列番号３２）、ＣＤＲ２（配列番号４０）、ＣＤＲ３（配列番号４８）。
好ましい実施形態において、単離核酸にコードされるポリペプチドは、ＣＤ２７Ｌと結合する抗原結合タンパク質の成分である。
核酸を単離するためのプローブもしくはプライマーとして、またはデータベース検索のための問い合わせ配列として使用される、本明細書に記載のアミノ酸配列に対応するヌクレオチド配列は、アミノ酸配列からの「戻し翻訳（back-translation）」によって、またはコードＤＮＡ配列が特定されているポリペプチドとのアミノ酸相同領域を特定することによって、得ることができる。よく知られているポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）手順を使用することで、ＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質またはＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質ポリペプチド断片の所望の組み合わせをコードするＤＮＡ配列を、単離および増幅することができる。ＤＮＡ断片の組み合わせの所望の末端を定めるオリゴヌクレオチドは、５’プライマーおよび３’プライマーとして使用される。オリゴヌクレオチドが制限酵素の認識部位をさらに含有することにより、発現ベクターへの増幅されたＤＮＡ断片の組み合わせの挿入が促進され得る。ＰＣＲ法は、Saiki et al., Science 239:487 (1988); Recombinant DNA Methodology, Wu et al., eds., Academic Press, Inc., San Diego (1989), pp. 189-196; and PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et. al., eds., Academic Press, Inc. (1990)に記載されている。
本発明の核酸分子には、一本鎖および二本鎖の両方の形態におけるＤＮＡおよびＲＮＡ、並びに対応する相補的配列が含まれる。ＤＮＡには、例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、化学合成ＤＮＡ、ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ、およびその組み合わせが含まれる。本発明の核酸分子には、完全長遺伝子またはｃＤＮＡ分子並びにその断片の組み合わせが含まれる。本発明の核酸はヒト由来であることが優先されるが、本発明には非ヒト由来の核酸も含まれる。
「単離核酸」は、自然発生供給源から単離された核酸の場合、核酸が単離された生物のゲノム内に存在する隣接する遺伝子配列から分離された核酸である。鋳型から酵素的に合成された、または化学的に合成された核酸の場合（例えばＰＣＲ産物、ｃＤＮＡ分子、またはオリゴヌクレオチド）、そのようなプロセスから得られる核酸は単離核酸であることが理解される。単離核酸分子は、分離した断片の形態にある、またはより大きな核酸構築体の成分としての、核酸分子を指す。１つの好ましい実施形態において、核酸には内在性物質が実質的に混入されていない。核酸分子は、標準的な生化学的手法（例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)に概要が記載されているもの）によって、実質的に純粋な形態で、且つその成分ヌクレオチド配列の特定、操作、および回収が可能な量または濃度で、少なくとも１回単離されたＤＮＡまたはＲＮＡに由来していることが好ましい。そのような配列は、真核生物の遺伝子内に典型的に存在する内部非翻訳配列、すなわちイントロンに中断されないオープンリーディングフレームの形態で、提供および／または構築されることが好ましい。非翻訳ＤＮＡ配列はオープンリーディングフレームの５’側または３’側に存在し得るが、そこでは、非翻訳ＤＮＡ配列はコード領域の操作または発現を妨げない。
本発明には、中程度にストリンジェントな条件下で、より好ましくは高ストリンジェントな条件下で、本明細書に記載のＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質をコードする核酸にハイブリダイズする核酸も含まれる。ハイブリダイゼーション条件の選択に影響する基本パラメーターおよび適切な条件を考案する指針は、Sambrook,, Fritsch, and Maniatis (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., chapters 9 and 11; and Current Protocols in Molecular Biology, 1995, Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., sections 2.10 and 6.3-6.4)に記載されており、例えば、ＤＮＡの長さおよび／または塩基組成に基づいて、当業者により容易に決定され得る。中程度にストリンジェントな条件を達成するための一つの方法は、５×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、１．０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）含有する予洗液（prewashing solution）、約５０％ホルムアミド、６×ＳＳＣのハイブリダイゼーション緩衝液、および約５５℃のハイブリダイゼーション温度（または、約５０％ホルムアミドを含有するもの等の、他の同様のハイブリダイゼーション液、および約４２ ℃のハイブリダイゼーション温度）、並びに約６０℃、０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中という洗浄条件を使用することを含む。一般的に、高ストリンジェントな条件は、およそ６８℃、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの洗浄以外は上記のハイブリダイゼーション条件の通りであると定義される。ハイブリダイゼーション液および洗浄緩衝液中、ＳＳＰＥ（１×ＳＳＰＥは０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、および１．２５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）は、ＳＳＣ（１×ＳＳＣは０．１５Ｍ ＮａＣｌおよび１５ｍＭ クエン酸ナトリウムである）に置き換えることができ；洗浄はハイブリダイゼーション完了後に１５分間行われる。当業者に知られ、さらには下記（例えば、Sambrook et al., 1989参照）に記載されている、ハイブリダイゼーション反応および二本鎖の安定性を支配する基本原理を適用することにより、洗浄時の温度および塩濃度を必要に応じて調整して、所望の程度のストリンジェンシーを達成できることが理解されよう。核酸を配列未知の標的核酸にハイブリダイズする場合、そのハイブリッドの長さはハイブリダイズする核酸の長さになることが想定される。配列公知の核酸をハイブリダイズする場合、そのハイブリッドの長さは、それらの核酸の配列を整列させ、最適な配列相補性を有する領域（複数可）を特定することにより決定することができる。長さが５０塩基対未満であると予測されるハイブリッドのハイブリダイゼーション温度は、そのハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）よりも５〜１０℃低くなるはずであり、Ｔｍは下記の式に従って決定される。長さが１８塩基対未満のハイブリッドについて、Ｔｍ（℃）＝２（Ａ＋Ｔの塩基数）＋４（Ｇ＋Ｃの塩基数）。長さが１８塩基対を超えるハイブリッドについては、Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）であり、式中、Ｎはハイブリッド中の塩基の数であり、［Ｎａ＋］はハイブリダイゼーション緩衝液中のナトリウムイオンの濃度である（１×ＳＳＣの［Ｎａ＋］は０．１６５Ｍ）。そのようなハイブリダイズする核酸がそれぞれ、少なくとも１５ヌクレオチド（またはより好ましくは少なくとも１８ヌクレオチド、または少なくとも２０ヌクレオチド、または少なくとも２５ヌクレオチド、または少なくとも３０ヌクレオチド、または少なくとも４０ヌクレオチド、または最も好ましくは少なくとも５０ヌクレオチド）の長さ、またはハイブリダイズする本発明の核酸の少なくとも２５％（より好ましくは少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、最も好ましくは少なくとも８０％）の長さを有し、且つ、ハイブリダイズする本発明の核酸と少なくとも６０％の配列同一性（より好ましくは少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％、最も好ましくは少なくとも９９．５％）を有することが好ましく、ここで、配列同一性は、上でより詳細に記載されたように、重複および同一性が最大となり、配列ギャップが最少となるように整列された場合の、ハイブリダイズしている核酸の配列を比較することにより決定される。
本発明における変異体は、通常、カセット変異導入もしくはＰＣＲ変異導入または当該技術分野において周知の他の技法を用いて抗原結合タンパク質をコードするＤＮＡ内のヌクレオチドを部位特異的に変異させて、変異体をコードするＤＮＡを生成し、その後、本明細書に記載される概略の通りにその組換えＤＮＡを細胞培養液中で発現させることにより、作製される。しかし、約１００〜１５０までの残基を有する変異ＣＤＲを含む抗原結合タンパク質断片は、確立された技法を用いて、インビトロ合成によって作製されてもよい。変異体は典型的に、自然発生類似体と質的に同じ生物活性（例えば、ＣＤ２７Ｌへの結合性）を示すが、以下により詳細に記載される改変された特徴を有する変異体を選択することもできる。
当業者には明らかであるが、遺伝暗号の縮重のために、全て本発明のＣＤＲ（並びに重鎖および軽鎖または抗原結合タンパク質の他の成分）をコードする、極めて多数の核酸が作製され得る。従って、特定のアミノ酸配列を特定した後、当業者は、コードされるタンパク質のアミノ酸配列を変化させないように一つまたは複数のコドンの配列を単に改変することによって、異なる核酸をいくつも作製することができる。
本発明は、上記の少なくとも１つのポリヌクレオチドを含むプラスミド、発現ベクター、転写または発現カセットの形態にある、発現系およびコンストラクトも提供する。さらに、本発明はそのような発現系またはコンストラクトを含む宿主細胞を提供する。
典型的に、いずれの宿主細胞にも使用される発現ベクターは、プラスミド保持のための配列並びに外来性ヌクレオチド配列のクローニングおよび発現のための配列を含有している。そのような配列は、ある特定の実施形態においては集合的に「フランキング配列」と称されているが、典型的には、以下のヌクレオチド配列のうちの一つまたは複数を含む：プロモーター、一つまたは複数のエンハンサー配列、複製開始点、転写終結配列、ドナーおよびアクセプタースプライス部位を含有する完全イントロン配列、ポリペプチド分泌のためのリーダー配列をコードする配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化配列、発現されるポリペプチドをコードする核酸を挿入するためのポリリンカー領域、並びに選択マーカーエレメント。これらの各配列は以下に記載される。
所望により、ベクターは「タグ」コード配列、すなわち、ＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質コード配列の５’または３’末端に位置するオリゴヌクレオチド分子を含有していてもよく；オリゴヌクレオチド配列は市販の抗体が存在する、ポリＨｉｓ（例えばヘキサＨｉｓ）、またはＦＬＡＧ、ＨＡ（赤血球凝集素（hemaglutinin）インフルエンザウイルス）、もしくはｍｙｃ等の別の「タグ」をコードしている。このタグは典型的にはポリペプチドの発現時にポリペプチドに融合され、宿主細胞からＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質をアフィニティ精製または検出するための手段として機能し得る。親和性精製は、例えば、タグに対する抗体をアフィニティーマトリックスとして使用するカラムクロマトグラフィによって、達成することができる。その後所望により、タグは、切断用のあるペプチダーゼを使用する等の様々な手法によって精製したＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質から除去することができる。
フランキング配列は、相同配列であっても（すなわち、宿主細胞と同じ種および／または株に由来）、異種配列であっても（すなわち、宿主細胞の種または株以外の種に由来）、ハイブリッド配列であっても（すなわち、２つ以上の供給源に由来するフランキング配列の組み合わせ）、合成配列であっても、天然配列であってもよい。従って、宿主細胞の機構の中でフランキング配列が機能的であり、且つその機構によって活性化され得るのであれば、フランキング配列の供給源は、いかなる原核生物もしくは真核生物であっても、いかなる脊椎動物もしくは無脊椎動物であっても、またはいかなる植物であってもよい。
本発明のベクターにおいて有用なフランキング配列は、当該技術分野において周知のいくつかの方法のいずれによっても得ることができる。典型的に、本明細書において有用なフランキング配列はマッピングによっておよび／または制限酵素小化によって以前に特定されているものであるため、適切な供給源である組織から適切な制限酵素を用いて単離することができる。場合によっては、フランキング配列の完全なヌクレオチド配列が知られている場合がある。その場合、そのフランキング配列を、本明細書に記載の核酸合成法またはクローニング法を用いて合成することができる。
フランキング配列が全て判っているか一部分のみ判っているかにかかわらず、フランキング配列は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を利用して、並びに／または同種もしくは別種由来のオリゴヌクレオチドおよび／もしくはフランキング配列断片等の適切なプローブを用いてゲノムライブラリーをスクリーニングすることにより、得ることができる。フランキング配列が判っていない場合、フランキング配列を含有するＤＮＡの断片は、例えば、コード配列または１つもしくは複数の別の遺伝子を含有している可能性があるより大きなＤＮＡ断片から単離することができる。単離は、制限酵素小化により適切なＤＮＡ断片を得て、その後、アガロースゲル精製、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）カラムクロマトグラフィ（カリフォルニア州チャッツワース）、または当業者に公知の他の方法を用いて単離することにより達成することができる。この目的を達成するのに適した酵素の選択は、当業者には容易に明らかである。
複製開始点は典型的には市販されている原核生物の発現ベクターの一部であり、開始点は宿主細胞においてベクターを増幅するのに役立つ。最適なベクターが複製開始部位を含有していない場合、公知の配列に基づいて化学合成してベクター内に連結することができる。例えば、プラスミドｐＢＲ３２２（ニュー・イングランド・バイオラボ社（New England Biolabs）、マサチューセッツ州ベバリー）由来の複製開始点は大部分のグラム陰性菌に適しており、種々のウイルス性開始点（例えば、ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、水疱性口内炎ウイルス（vesicular stomatitus virus）（ＶＳＶ）、またはパピローマウイルス（例えばＨＰＶまたはＢＰＶ））は哺乳類細胞でのクローニングベクターに有用である。一般的に、複製開始点要素は哺乳類の発現ベクターには必要ではない（例えば、ＳＶ４０開始点はウイルス性初期プロモータも含有しているという１つの理由からしばしば使用される）。
転写終結配列は典型的にはポリペプチドコード領域の末端の３’側に位置しており、転写を終結させる機能を有する。通常、原核細胞における転写終結配列はＧ−Ｃリッチ断片とそれに続くポリＴ配列である。その配列はライブラリーから容易にクローン化され、さらにはベクターの一部として市販もされているが、本明細書に記載されるような核酸合成法を用いて容易に合成することもできる。
選択マーカー遺伝子は選択培地中で育成される宿主細胞の生存および増殖に必要なタンパク質をコードする。典型的な選択マーカー遺伝子は、（ａ）原核性宿主細胞に抗生物質もしくは他の毒素、例えば、アンピシリン、テトラサイクリン、もしくはカナマイシンに対する耐性を与える；（ｂ）細胞の栄養要求性欠乏を補完する；または（ｃ）複合培地もしくは確定培地（defined media）からは得られない必須の栄養分を補給する、タンパク質をコードする。具体的な選択マーカーは、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、およびテトラサイクリン耐性遺伝子である。ネオマイシン耐性遺伝子も、原核性宿主細胞および真核性宿主細胞の両方における選択に有利に使用することができる。
他の選択遺伝子を使用して、発現される遺伝子を増幅してもよい。増幅は、増殖または細胞生存に必須のタンパク質を産生するのに必要な遺伝子が、後に続く世代の組換え細胞の染色体内で直列に反復されるプロセスである。哺乳類細胞に適した選択マーカーの例としては、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）およびプロモーターを持たないチミジン（thyrnidine）キナーゼ遺伝子が挙げられる。ベクター内に存在する選択遺伝子のために形質転換体のみが生存に唯一適応している選択圧に、哺乳類細胞の形質転換体をかける。選択圧は、培地中の選択剤の濃度が逐次増加される条件下で形質転換細胞を培養することにより与えられ、それによって、選択遺伝子および別の遺伝子（例えばＣＤ２７Ｌポリペプチドに結合する抗原結合タンパク質抗体）をコードするＤＮＡの両方の増幅が起こる。結果として、ＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質等のポリペプチドが、増量されて、増幅されたＤＮＡから合成される。
リボソーム結合部位がｍＲＮＡの翻訳開始に通常必要となり、シャイン・ダルガノ配列（原核生物）またはコザック配列（真核生物）によって特徴付けられる。前記要素は典型的にはプロモーターの３’側および発現されるポリペプチドのコード配列の５’側に位置している。ある特定の実施形態において、一つまたは複数のコード領域が内部リボソーム結合部位（ＩＲＥＳ）に機能的に連結していてもよく、これにより、単一のＲＮＡ転写物からの２つのオープンリーディングフレームの翻訳が可能となる。
真核性宿主細胞発現系においてグリコシル化が所望される場合等の、いくつかの場合において、グリコシル化または収率が向上するように、種々のプレ配列またはプロ配列を操作してもよい。例えば、特定のシグナルペプチドのペプチダーゼ切断部位を改変してもよく、あるいはプロ配列を付加してもよく、それによって、グリコシル化も影響される。最終タンパク質産物は、−１位（成熟タンパク質の第一アミノ酸に対して）に、発現に付随する一つまたは複数の追加のアミノ酸を有する場合があり、完全には除去されていない場合がある。例えば、最終タンパク質産物は、ペプチダーゼ切断部位内に、アミノ末端に結合した、１つまたは２つのアミノ酸残基を有する場合がある。あるいは、いくつかの酵素切断部位を利用することによって、酵素が成熟ポリペプチド内のそのような領域で切断する場合、所望のポリペプチドがわずかに切断された型を得ることができる。
本発明の発現ベクターおよびクローニングベクターは典型的には、宿主生物によって認識され、且つＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質をコードする分子に機能的に連結したプロモーターを含有している。プロモーターは、構造遺伝子（一般的には約１００〜１０００ｂｐ）の開始コドンの上流（すなわち、５’側）に位置する、構造遺伝子の転写を制御する非転写配列である。プロモーターは通常、２つのクラス（誘導性プロモーターおよび構成的プロモーター）のうちの１つに分類される。誘導性プロモーターは、栄養分の有無または温度変化等の培養条件におけるいくつかの変化に応答して、その支配下にあるＤＮＡからの転写をレベルを増加させて開始する。一方、構成的プロモーターは、それが機能的に連結した遺伝子を一律に転写する、すなわち、遺伝子発現に対する制御はほとんどない。種々の有望な宿主細胞によって認識される多数のプロモーターがよく知られている。適切なプロモーターは、プロモーターを供給源であるＤＮＡから制限酵素消化により除去し、所望のプロモーター配列をベクターに挿入することにより本発明のＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質を含む重鎖または軽鎖をコードするＤＮＡに機能的に連結される。
酵母宿主との使用に適したプロモーターも、当該技術分野において周知である。酵母エンハンサーは酵母プロモーターと共に有利に使用される。哺乳類宿主細胞との使用に適したプロモーターは周知であり、限定はされないが、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（例えばアデノウイルス２）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、最も好ましくはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）等のウイルスのゲノムから得られるプロモータが含まれる。他の適切な哺乳類プロモーターには、異種哺乳類プロモーター、例えば、熱ショックプロモーターおよびアクチンプロモーターが含まれる。
重要であり得るさらなるプロモーターには、限定はされないが：ＳＶ４０初期プロモータ（Benoist and Chambon, 1981, Nature 290:304-310）；ＣＭＶプロモーター（Thornsen et al., 1984, Proc. Natl. Acad. U.S.A. 81:659-663）；ラウス肉腫ウイルスの３’末端反復配列内に含有されるプロモーター（Yamamoto et al., 1980, Cell 22:787-797）；ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1444-1445）；メタロチオネイン（metallothionine）遺伝子由来のプロモーターおよび制御配列（Prinster et al., 1982, Nature 296:39-42）；並びに原核生物性プロモーター、例えば、βラクタマーゼプロモーター（Villa-Kamaroff et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75:3727-3731）；またはｔａｃプロモーター（DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:21-25）が含まれる。以下の動物性転写調節領域も重要であり、組織特異性を示し、遺伝子導入動物に利用されている：膵腺房細胞において活性があるエラスターゼＩ遺伝子調節領域（Swift et al., 1984, Cell 38:639-646; Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7:425-515）；膵β細胞において活性があるインスリン遺伝子調節領域（Hanahan, 1985, Nature 315:115-122）；リンパ系細胞において活性がある免疫グロブリン遺伝子調節領域（Grosschedl et al., 1984, Cell 38:647-658; Adames et al., 1985, Nature 318:533-538; Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7:1436-1444）；精巣細胞、乳腺細胞、リンパ系細胞およびマスト細胞において活性があるマウス乳癌ウイルス制御領域（Leder et al., 1986, Cell 45:485-495）；肝臓において活性があるアルブミン遺伝子調節領域（Pinkert et al., 1987, Genes and Devel. 1 :268-276）；肝臓において活性があるαフェトプロテイン遺伝子調節領域（Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648; Hammer et al., 1987, Science 253:53-58）；肝臓において活性があるα１−アンチトリプシン遺伝子調節領域（Kelsey et al., 1987, Genes and Devel. 1:161-171）；骨髄性細胞において活性があるβグロビン遺伝子調節領域（Mogram et al., 1985, Nature 315:338-340; Kollias et al., 1986, Cell 46:89-94）；脳内の乏突起膠細胞細胞において活性があるミエリン塩基性タンパク質遺伝子調節領域（Readhead et al., 1987, Cell 48:703-712）；骨格筋において活性があるミオシン軽鎖−２遺伝子調節領域（Sani, 1985, Nature 314:283-286）；および視床下部において活性がある性腺刺激放出ホルモン遺伝子調節領域（Mason et al., 1986, Science 234:1372-1378）。
エンハンサー配列をベクターに挿入することで、高等真核生物による、本発明のＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質を構成する軽鎖または重鎖をコードするＤＮＡの転写を増加させることができる。エンハンサーは、通常は約１０〜３００ｂｐ長の、プロモーターに作用して転写を増加させる、ＤＮＡのシス作用エレメントである。エンハンサーは配向および位置が比較的独立しており、転写単位の５’側および３’側の両方の位置に見出されている。哺乳類遺伝子から得ることができるいくつかのエンハンサー配列が知られている（例えば、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、αフェトプロテインおよびインスリン）。しかし、典型的には、ウイルス由来のエンハンサーが使用される。当該技術分野において公知のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモータエンハンサー、ポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーは、真核生物性プロモーターを活性化するための例となるエンハンサー要素である。エンハンサーはベクターにおいてコード配列の５’側または３’側のどちらに位置していてもよいが、典型的にはプロモーターの５’側の部位に位置している。適切な天然または異種のシグナル配列（リーダー配列またはシグナルペプチド）をコードする配列を発現ベクターに組み込むことで、抗体の細胞外分泌を促進することができる。シグナルペプチドまたはリーダーの選択は、抗体が産生されることとなる宿主細胞の種類によって決まり、異種シグナル配列は天然シグナル配列と置換することができる。哺乳類宿主細胞において機能的なシグナルペプチドの例としては、以下が挙げられる：米国特許第４，９６５，１９５号に記載されているインターロイキン−７（ＩＬ−７）のシグナル配列；Cosman et al.,1984, Nature 312:768に記載されているインターロイキン−２受容体のシグナル配列；欧州特許第０３６７５６６号に記載されているインターロイキン−４受容体シグナルペプチド；米国特許第４，９６８，６０７号に記載されているＩ型インターロイキン−１受容体シグナルペプチド；欧州特許第０４６０８４６号に記載されているＩＩ型インターロイキン−１受容体シグナルペプチド。
ベクターはベクターが宿主細胞ゲノムに組み込まれた際に発現を促進する一つまたは複数の要素を含有していてもよい。例としては、ＥＡＳＥ要素（Aldrich et al. 2003 Biotechnol Prog. 19:1433-38）およびマトリックス結合領域（ＭＡＲ）が挙げられる。ＭＡＲはクロマチンの構造構築を媒介し、組み込まれたベクター（vactor）を「位置（position）」効果から防護し得る。従って、安定な形質移入体を作製するためにベクターが使用される場合に、ＭＡＲは特に有用である。いくつかの天然および合成ＭＡＲ含有核酸が当該技術分野において公知であり、例えば、米国特許第６，２３９，３２８号；同第７，３２６，５６７号；同第６，１７７，６１２号；同第６，３８８，０６６号；同第６，２４５，９７４号；同第７，２５９，０１０号；同第６，０３７，５２５号；同第７，４２２，８７４号；同第７，１２９，０６２号である。
本発明の発現ベクターは市販ベクター等の開始ベクターから構築することができる。そのようなベクターは所望のフランキング配列の全てを含有していてもしていなくてもよい。一つまたは複数の、本明細書に記載のフランキング配列がベクター内にまだ存在していない場合、それらを個々に入手してベクターに連結してもよい。それぞれのフランキング配列を入手するために使用される方法は当業者に周知である。
ベクターが構築され、ＣＤ２７Ｌ抗原結合配列を含む軽鎖、重鎖、または軽鎖および重鎖をコードする核酸分子がベクターの適切な部位に挿入された後、完成したベクターを、増幅および／またはポリペプチド発現に適した宿主細胞に挿入することができる。ＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質のための発現ベクターによる選択した宿主細胞の形質転換は、周知の方法、例えば、トランスフェクション、感染、リン酸カルシウム共沈、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン介在性トランスフェクション、または他の公知の技法により達成することができる。選択される方法は、部分的には、使用されることになる宿主細胞型によって決定される。これらの方法および他の適切な方法は当業者に周知であり、例えば、上記Sambrook et al., 2001に記載されている。
宿主細胞は、適切な条件下で培養される場合、後に、培地から（宿主細胞が該タンパク質を培地中に分泌する場合）、または該タンパク質を産生する宿主細胞から直接（該タンパク質が分泌されない場合）回収することができる、ＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質を合成する。適切な宿主細胞の選択は、種々の要因、例えば所望の発現レベル、活性に望ましいまたは必要なポリペプチド修飾（例えば、グリコシル化またはリン酸化）、および生物学的に活性な分子への折り畳みのし易さに依存する。宿主細胞は真核生物であっても原核生物であってもよい。
発現用の宿主として利用できる哺乳類細胞株は当該技術分野において周知であり、例えば、限定はされないが、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）から入手できる不死化細胞株が挙げられ、当該技術分野において公知の発現系において使用されるいかなる細胞株も、本発明の組換えポリペプチドを作製するために使用することができる。一般的に、宿主細胞は、所望の抗ＣＤ２７Ｌ抗体ポリペプチドをコードするＤＮＡを含む組み換え発現ベクターで形質転換される。使用することができる宿主細胞としては、原核生物、酵母またはより高等真核細胞が挙げられる。原核生物にはグラム陰性生物またはグラム陽性生物（例えば、大腸菌または桿菌）が含まれる。高等真核細胞には昆虫細胞、哺乳類起源の株化細胞系が含まれる。適切な哺乳類宿主細胞株の例としては、サル腎細胞のＣＯＳ−７株（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）（Gluzman et al., 1981, Cell 23:175）、Ｌ細胞、２９３細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ １６３）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞もしくはその誘導体（例えばＶｅｇｇｉｅ ＣＨＯ）および無血清培地中で増殖する関連細胞株（Rasmussen et al., 1998, Cytotechnology 28: 31）、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ １０）細胞株、およびMcMahan et al., 1991, EMBO J. 10: 2821に記載のアフリカミドリザル腎細胞株ＣＶＩ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）に由来するＣＶＩ／ＥＢＮＡ細胞株、ヒト胚腎臓細胞（例えば２９３、２９３ＥＢＮＡまたはＭＳＲ２９３）、ヒト上皮Ａ４３１細胞、ヒトＣｏｌｏ２０５細胞、他の形質転換霊長類細胞株、正常二倍体細胞、一次組織のインビトロ培養から得られる細胞株、初代移植物（primary explant）、ＨＬ−６０、Ｕ９３７、ＨａＫまたはＪｕｒｋａｔ細胞が挙げられる。所望により、例えば、ＨｅｐＧ２／３Ｂ、ＫＢ、ＮＩＨ ３Ｔ３またはＳ４９等の哺乳類細胞株は、種々のシグナル伝達またはレポーターアッセイにおいて本ポリペプチドを使用することが望ましい場合、該ポリペプチドの発現に使用することができる。あるいは、下等真核生物（例えば酵母）または原核生物（例えば細菌）で本ポリペプチドを産生することが可能である。適切な酵母としては、出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）、分裂酵母（Schizosaccharomyces pombe）、クリベロマイセス菌株（Kluyveromyces strain）、カンジダ属（Candida）、または異種ポリペプチドを発現可能なあらゆる酵母菌株が挙げられる。適切な菌種としては、大腸菌（Escherichia coli）、枯草菌（Bacillus subtilis）、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）、または異種ポリペプチドを発現可能なあらゆる菌種が挙げられる。本ポリペプチドが酵母または細菌内でつくられる場合、機能的ポリペプチドを得るために、それらの中で産生されるポリペプチドを、例えば適切な部位のリン酸化またはグリコシル化により、修飾することが望ましい場合がある。そのような共有結合は公知の化学的手法または酵素法を用いて達成することができる。ポリペプチドは、本発明の単離核酸を一つまたは複数の昆虫発現ベクター内の適切な制御配列に機能的に連結して昆虫発現系を使用することによっても、生成することができる。バキュロウイルス／昆虫細胞発現系のための材料および方法は、例えばインビトロジェン社（米国カリフォルニア州サンディエゴ）（ＭａｘＢａｃ（登録商標）キット）からキットの状態で販売されており、そのような方法は当該技術分野において周知であり、Summers and Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555 (1987)、およびLuckow and Summers, Bio/Technology 6:47 (1988)に記載されている。無細胞翻訳系を使用することで、本明細書で開示される核酸構築体から得られるＲＮＡを用いてポリペプチドを生成することもできる。細菌宿主、真菌宿主、酵母宿主、および哺乳類細胞宿主と使用するのに適したクローニングベクターおよび発現ベクターはPouwels et al. (Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York, 1985)に記載されている。少なくとも１つの発現制御配列に機能的に連結していることが好ましい本発明の単離核酸を含む宿主細胞は、「組換え宿主細胞」である。
ある特定の実施形態において、細胞株は、どの細胞株が高い発現レベルを有し、恒常的にＣＤ２７Ｌ結合特性を有する抗原結合タンパク質を産生するかを決定することにより、選択することができる。別の実施形態では、それ自身の抗体は産生しないが異種抗体を産生および分泌する能力を有するＢ細胞系統に由来する細胞株を選択することができる。
抗体薬剤複合体
本発明の実施形態には抗体薬剤複合体（ＡＤＣ）が含まれる。一般的に、ＡＤＣは、化学療法剤（例えば、細胞傷害性薬物、細胞分裂阻害剤、トキシン、または放射性医薬品）に複合体化した抗体を含む。リンカー分子を使用することで、薬剤を抗体に複合体化させることができる。ＡＤＣ技術に有用な様々なリンカーおよび薬剤が当該技術分野において公知であり、本発明の実施形態に使用することができる（ＵＳ２００９００２８８５６；ＵＳ２００９／０２７４７１３；ＵＳ２００７／００３１４０２；ＷＯ２００５／０８４３９０；ＷＯ２００９／０９９７２８；ＵＳ５２０８０２０；ＵＳ５４１６０６４；ＵＳ５４７５０９２；５５８５４９９；６４３６９３１；６３７２７３８；および６３４０７０１を参照、全て参照により本明細書に組み込まれる）。
抗体薬剤複合体はインビトロ法により作製することができる。薬剤またはプロドラッグを抗体に連結するために、連結基が使用される。適切な連結基は当該技術分野において周知であり、例えば、ジスルフィド基、酸解離性基、光解離性基、ペプチダーゼに不安定な基、およびエステラーゼに不安定な基が挙げられる。好ましい連結基はジスルフィド基である。例えば、複合体は、抗体と薬剤またはプロドラッグとの間のジスルフィド交換反応を用いて構築することができる。薬剤分子は中間担体分子（例えば血清アルブミン）を介して細胞結合剤に連結することもできる。
ある特定の実施形態において、細胞結合剤は、二官能性架橋試薬を細胞結合剤と反応させることで、リンカー分子を細胞結合剤に共有結合させることにより、修飾することができる。本明細書で使用される場合、「二官能性架橋試薬」または「リンカー」は、細胞結合剤を薬剤（例えば本明細書に記載の薬剤）に共有結合的に連結するあらゆる化学的部分である。本発明の特定の実施形態において、連結部分の一部は薬剤から得られる。この点において、薬剤は、細胞結合剤を薬剤に連結するのに用いられるより大きなリンカー分子の一部となる連結部分を含む。例えば、メイタンシノイドＤＭ１を形成するために、メイタンシンのＣ−３ヒドロキシル基にある側鎖が、遊離スルフヒドリル基（ＳＨ）を有するように修飾される。このチオール基導入形態のメイタンシンは、修飾された細胞結合剤と反応することで、複合体を形成することができる。従って、最終的なリンカーは２つの成分から構築され、その１つはは架橋試薬から与えられ、もう一方はＤＭ１の側鎖から与えられる。リンカー試薬が、治療薬（例えば、細胞毒性）の保持、並びにそれぞれ、薬剤および細胞結合剤の特徴の標的化を提供しさえすれば、適切ないかなる二官能性架橋試薬も、本発明に関連して使用することができる。薬剤および細胞結合剤が互いに化学的に結合（例えば、共有結合）されるように、リンカー分子は化学結合（上記）によって薬剤を細胞結合剤に連結することが好ましい。
リンカー
ある特定の実施形態において、ＡＤＣは、一つまたは複数のリンカー成分で構成されるリンカーを含む。薬剤はジスルフィド結合を介して細胞結合剤に連結されることが好ましい。リンカー分子は細胞結合剤と反応することができる反応性化学基を含む。細胞結合剤との反応に好ましい反応性化学基は、Ｎ−サクシニミジルエステルおよびＮ−スルホサクシニミジルエステルである。さらに、リンカー分子は、薬剤と反応することでジスルフィド結合を形成することができる反応性化学基、好ましくはジチオピリジル基を含む。リンカー分子の例としては、例えば、Ｎ−サクシニミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）（例えば、Carlsson et al., Biochem. J., 173, 723-737 (1978)参照）、Ｎ−サクシニミジル４−（２−ピリジルジチオ）ブタノエート（ＳＰＤＢ）（例えば、米国特許第４，５６３，３０４号参照）およびＮ−サクシニミジル４−（２−ピリジルジチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）（例えば、ＣＡＳ登録番号３４１４９８−０８−６参照）が挙げられる。リンカー成分のさらなる例としては、６−マレイミドカプロイル、マレイミドプロパノイル、バリン−シトルリン、アラニン−フェニルアラニン、ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル、並びにリンカー試薬、例えば、限定はされないが、Ｎ−サクシニミジル４−（２−ピリジルチオ）ペンタノエート（「ＳＰＰ」）、Ｎ−サクシニミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１カルボン酸塩（「ＳＭＣＣ」、本明細書では「ＭＣＣ」とも称される）、およびＮ−サクシニミジル（４−ヨード−アセチル）アミノ安息香酸塩（「ＳＩＡＢ」）との複合体化から得られるものが挙げられる。
リンカーは「切断可能な」リンカーであっても「切断不可な」リンカーであってもよい（Ducry and Stump, Bioconjugate Chem. 2010, 21, 5-13；その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）。切断可能なリンカーは、ある環境因子に曝された場合（例えば、標的細胞の中に内部移行された場合）に、薬剤を放出するように設計される。切断可能なリンカーとしては、酸に不安定なリンカー、プロテアーゼ感受性リンカー、感光性リンカー、ジメチルリンカーまたはジスルフィド含有リンカーが挙げられる。切断不可なリンカーは、標的細胞による内部移行および標的細胞内での分解の際に、抗体および薬剤の少なくとも１つのアミノ酸との共有結合を残す傾向がある。切断不可なリンカーは、安定な共有結合の様式で、薬剤（例えば、メイタンシノイド（例えば、ＤＭ１等）、タキサン、またはＣＣ−１０６５類似体）を細胞結合剤に連結することができる、あらゆる化学的部分である。従って、切断不可なリンカーは、薬剤または細胞結合剤が活性を維持する条件下で、酸による切断、光による切断、ペプチダーゼによる切断、エステラーゼによる切断、およびジスルフィド結合切断に対し、実質的に耐性がある。
薬剤と細胞結合剤との間に切断不可なリンカーを形成する適切な架橋試薬は当該技術分野において周知である。切断不可なリンカーの例としては、細胞結合剤と反応するためのＮ−サクシニミジルエステル部分またはＮ−スルホサクシニミジルエステル部分、および薬剤と反応するためのマレイミド系またはハロアセチル系部分を有するリンカーが挙げられる。マレイミド系部分を含む架橋試薬（crosslinking linker reagent）には、Ｎ−サクシニミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボン酸塩（ＳＭＣＣ）、Ｎ−サクシニミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシ−（６−アミドカプロエート）（ＳＭＣＣの「長鎖」類似体（ＬＣ−ＳＭＣＣ））、ｘ−マレイミドウンデカン酸Ｎ−サクシニミジルエステル（ＫＭＵＡ）、γ−マレイミド酪酸Ｎ−サクシニミジルエステル（ＧＭＢＳ）、ε−マレイミドカプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＥＭＣＳ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、Ｎ−（α−マレイミドアセトキシ）−スクシンイミドエステル（ＡＭＡＳ）、サクシニミジル−６−（β−マレイミドプロピオンアミド）ヘキサン酸塩（ＳＭＰＨ）、Ｎ−サクシニミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）−ブチレート（ＳＭＰＢ）、およびＮ−（ｐ−マレイミドフェニル）イソシアン酸塩（ＰＭＰＩ）が含まれる。ハロアセチル系部分を含む架橋試薬には、Ｎ−サクシニミジル−４−（ヨードアセチル）−アミノ安息香酸塩（ＳＩＡＢ）、Ｎ−サクシニミジルヨード酢酸塩（ＳＩＡ）、Ｎ−サクシニミジルブロモ酢酸塩（ＳＢＡ）、およびＮ−サクシニミジル３−（ブロモアセトアミド）プロピオン酸塩（ＳＢＡＰ）が含まれる。好ましい切断不可なリンカーの一例はＭＣＣである。
切断不可なリンカーを形成する硫黄原子を欠く他の架橋試薬リンカーも、本発明の方法で使用することができる。そのようなリンカーはジカルボン酸系部分から得ることができる。適切なジカルボン酸系部分には、限定はされないが、以下の一般式（ＩＸ）のα，ω−ジカルボン酸が含まれ、
ＨＯＯＣ−−Ｘ１−−Ｙｎ−−Ｚｍ−−ＣＯＯＨ （ＩＸ）、
式中、Ｘは２〜２０個の炭素原子を有する直鎖状または分岐鎖状のアルキル基、アルケニル基、またはアルキニル基であり、Ｙは３〜１０個の炭素原子を有するシクロアルキル基またはシクロアルケニル基であり、Ｚは６〜１０個の炭素原子を有する置換もしくは非置換の芳香族基、またはヘテロ原子がＮ、ＯまたはＳから選択される置換もしくは非置換の複素環式基であり、ｌ、ｍ、およびｎはそれぞれ０または１であり、ただしｌ、ｍ、およびｎは全てが同時に０になることはない。
本明細書で開示される切断不可なリンカーの多くは、米国特許出願公開第２００５／０１６９９３３Ａ１号に詳細に記載されている。適切な切断可能なリンカーの例としては、ジスルフィドリンカー、酸に不安定なリンカー、感光性リンカー、ペプチダーゼに不安定なリンカー、およびエステラーゼに不安定なリンカーが挙げられる。ジスルフィドを含有するリンカーはジスルフィド交換によって切断可能なリンカーであり、ジスルフィド交換は生理条件下で起こり得る。酸に不安定なリンカーは酸性ｐＨで切断可能なリンカーである。例えば、ある細胞内区画（例えばエンドソームおよびリソソーム）は酸性ｐＨ（ｐＨ４〜５）を有しており、酸に不安定なリンカーを切断するのに適した条件を与える。光に不安定なリンカーは光が届き易い体表および多くの体腔で有用である。さらに、赤外線は組織を透過することができる。ペプチダーゼに不安定なリンカーを使用することで、細胞内外のあるペプチドを切断することができる（例えば、Trouet et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 626-629 (1982)、およびUmemoto et al., Int. J. Cancer, 43, 677-684 (1989)参照）。
薬剤
ある特定の実施形態において、抗体は化学療法剤に複合体化される。化学療法剤の例としては、アルキル化剤（例えば、チオテパおよびシクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ（商標）））；スルホン酸アルキル（例えば、ブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファン）；アジリジン（例えば、ベンゾドーパ、カルボコン、メツレドーパ（meturedopa）、およびウレドーパ（uredopa））；エチレンイミンおよびメチラメラミン（methylamelamine）（例えば、アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド（trietylenephosphoramide）、トリエチレンチオホスホルアミド（triethylenethiophosphaoramide）およびトリメチロールメラミン（trimethylolomelamine））；アセトゲニン（特に、ブラタシンおよびブラタシノン）；カンプトテシン（例えば、合成類似体トポテカン）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（例えばそのアドゼレシン、カルゼレシンおよびビセレシン合成類似体）；クリプトフィシン（特に、クリプトフィシン１およびクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（例えば、合成類似体、ＫＷ−２１８９およびＣＢＩ−ＴＭＩ）；エリュテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチン；スポンジスタチン；ナイトロジェンマスタード（例えば、クロラムブシル、クロルナファジン（chlomaphazine）、クロルホスファミド（cholophosphamide）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベムビシン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード）；ニトロソ尿素（nitrosurea）（例えば、カルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン）；例えば、エンジイン抗生物質（例えばカリチアマイシン、特にカリチアマイシンγ１およびカリチアマイシンθＩ）等の抗生物質（例えば、Angew Chem. Intl. Ed. Engl. 33:183-186 (1994)参照）；ジネミシン（例えば、ジネミシンＡ）；エスペラミシン；並びにネオカルチノスタチン発色団および関連色素蛋白エンジイン抗生物質発光団（chromomophore）、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アントラマイシン（authramycin）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン（carabicin）、カルミノマイシン（caminomycin）、カルジノフィリン；クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン、例えば、モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシンおよびデオキシドキソルビシン）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン（nitomycin）、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（potfiromycin）、ピューロマイシン、クエラマイシン（quelamycin）、ロドルビシン（rodorubicin）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；代謝拮抗剤（例えば、メトトレキサートおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ））；葉酸類似体（例えば、デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサート）；プリン類似体（例えば、フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン）；ピリミジン類似体（例えば、アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン、５−ＦＵ）；アンドロゲン（例えば、カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン）；抗副腎剤（anti-adrenal）（例えば、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン）；葉酸補充薬（例えば、フォリン酸（frolinic acid）；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド（aldophosphamide glycoside）；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトレキサート；デフォファミン（defofamine）；デメコルチン；ジアジクオン；エルフォミチン（elfomithine）；エリプチニウムアセタート；エポシロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン；メイタンシノイド（例えば、メイタンシンおよびアンサマイトシン）；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ．ＲＴＭ．；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフラン（sizofuran）；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２’’−トリクロロトリエチルアミン；トリコテシン（特に、Ｔ−２毒素、ベルカリン（verracurin）Ａ、ロリジンＡおよびアングイジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（gacytosine）；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド（例えば、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（商標）、ブリストル・マイヤーズスクイブ社、ニュージャージー州プリンストン）およびドセタキセル（doxetaxel）（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）、ローヌ・プーラン・ローラー社、フランス、アントニー））；クロラムブシル；ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；白金類似体（例えば、シスプラチンおよびカルボプラチン）；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロン酸；ＣＰＴ−１１；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（difluoromethylomithine）（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸；カペシタビン；並びに上記いずれかの薬剤的に許容できる塩、酸または誘導体。腫瘍に対するホルモン作用を制御または阻害する働きを持つ抗ホルモン剤もこの定義に含まれ、例えば、抗エストロゲン剤（例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害４（５）−イミダゾール、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン、およびトレミフェン（Fareston））；並びに抗アンドロゲン剤（例えば、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、およびゴセレリン）；ｓｉＲＮＡ並びに上記いずれかの薬剤的に許容できる塩、酸または誘導体である。本発明と共に使用することができる他の化学療法剤は、米国特許出願公開第２００８０１７１０４０号または米国特許出願公開第２００８０３０５０４４号（参照によって全体が組み込まれる）に記載されている。
抗体が２つ以上の異なる化学療法剤と複合体化し得ること、または異なる化学療法剤と複合体化している以外は抗体成分が同一である抗体の混合物を医薬組成物が含み得ることが企図される。そのような実施形態は、標的細胞の複数の生物学的経路を標的とするのに有用であり得る。
好ましい実施形態において、ＡＤＣは一つまたは複数のメイタンシノイド分子と複合体化した抗体を含むが、このメイタンシノイド分子は、チューブリン重合を阻害することにより作用する有糸分裂阻害剤である。メイタンシノイド類は、様々な改変物も含めて、米国特許第３８９６１１１号；同第４１５１０４２号；同第４１３７２３０号；同第４２４８８７０号；同第４２５６７４６号；同第４２６０６０８号；同第４２６５８１４号；同第４２９４７５７号；同第４３０７０１６号；同第４３０８２６８号；同第４３０９４２８号；同第４３１３９４６号；同第４３１５９２９号；同第４３１７８２１号；同第４３２２３４８号；同第４３３１５９８号；同第４３６１６５０号；同第４３６４８６６号；同第４４２４２１９号；同第４４５０２５４号；同第４３６２６６３号；同第４３７１５３３号；およびＷＯ２００９／０９９７２８に記載されている。メイタンシノイド薬剤部分は、天然源から単離してもよく、組換え技術を用いて生成してもよく、あるいは合成によって作製してもよい。メイタンシノイド類の例としては、Ｃ−１９−デクロロ（米国特許第４２５６７４６号）、Ｃ−２０−ヒドロキシ（またはＣ−２０−デメチル）＋／−Ｃ−１９−デクロロ（米国特許第４３０７０１６号および同第４３６１６５０号）、Ｃ−２０−デメトキシ（またはＣ−２０−アシルオキシ（−ＯＣＯＲ）、＋／−デクロロ（米国特許第４２９４７５７号）、Ｃ−９−ＳＨ（米国特許第４，４２４，２１９号）、Ｃ−１４−アルコキシメチル（デメトキシ／ＣＨ２ＯＲ）（米国特許第４，３３１，５９８号）、Ｃ−１４−ヒロドキシメチルまたはアシルオキシメチル（ＣＨ２ＯＨまたはＣＨ２ＯＡｃ）（米国特許第４，４５０，２５４号）、Ｃ−１５−ヒドロキシ／アシルオキシ（米国特許第４，３６４，８６６号）、Ｃ−１５−メトキシ（米国特許第４，３１３，９４６号および同第４，３１５，９２９号）、Ｃ−１８−Ｎ−デメチル（米国特許第４，３６２，６６３号および同第４，３２２，３４８号）、および４，５−デオキシ（米国特許第４，３７１，５３３号）が挙げられる。
所望される連結のタイプに応じて、メイタンシノイド化合物の様々な位置が連結位置として使用され得る。例えば、エステル結合の形成においては、ヒドロキシル基を有するＣ−３位、ヒドロキシメチル（hydrozymethyl）で修飾されたＣ１４位、ヒドロキシル基で修飾されたＣ１５位、およびヒドロキシル基を有するＣ２０位が全て適切である（米国特許第５２０８０２０号、ＲＥ３９１５１、および米国特許第６９１３７４８号；米国特許出願公開第２００６０１６７２４５号および同第２００７００３７９７２号、並びにＷＯ２００９０９９７２８）。
好ましいメイタンシノイド類には、ＤＭ１、ＤＭ３、およびＤＭ４等の当該技術分野において公知のものが含まれる（米国特許出願公開第２００９０３０９２４号および同第２００５０２７６８１２号、参照によって本明細書に組み込まれる）。
メイタンシノイド類を含有するＡＤＣ、そのようなＡＤＣを作製する方法、およびそれらの治療用途は、米国特許第５２０８０２０号および同第５４１６０６４号、米国特許出願公開第２００５０２７６８１２号、並びにＷＯ２００９０９９７２８に記載されている（全て参照により本明細書に組み込まれる）。メイタンシノイドＡＤＣを作製するのに有用なリンカーは当該技術分野において公知である（米国特許第５２０８０２０号および米国特許出願公開第２００５０１６９９３号および同第２００９０２７４７１３号；全て参照により本明細書に組み込まれる）。ＳＭＣＣリンカーを含むメイタンシノイドＡＤＣは、米国特許出願公開第２００５／０２７６８１２号で開示されている通りに作製することができる。
ある特定の実施形態において、ＡＤＣはＳＭＣＣリンカーでＤＭ１と複合体化した抗体を含む。好ましい実施形態には、Ａｂ１−ＳＭＣＣ−ＤＭ１、Ａｂ２−ＳＭＣＣ−ＤＭ１、Ａｂ３−ＳＭＣＣ−ＤＭ１、Ａｂ４−ＳＭＣＣ−ＤＭ１、Ａｂ５−ＳＭＣＣ−ＤＭ１、Ａｂ６−ＳＭＣＣ−ＤＭ１、Ａｂ７−ＳＭＣＣ−ＤＭ１、およびＡｂ８−ＳＭＣＣ−ＤＭ１が含まれる。
薬物負荷
ＡＤＣは抗体あたり１〜２０個の化学療法剤を有することができる。ＡＤＣの組成物は、組成物中の抗体分子あたりの薬剤部分の平均数によって特徴付けることができる。薬剤部分の平均数は質量分析、イムノアッセイ、およびＨＰＬＣ等の常法により決定することができる。いくつかの場合において、均一なＡＤＣ群は逆相ＨＰＬＣまたは電気泳動によって分離および精製することができる。従って、医薬品としてのＡＤＣ組成物は、１、２、３、４、５、６、７またはそれ以上の薬剤部分に連結した、不均一または均一な抗体群を含有し得る。
好ましい実施形態において、ＡＤＣは一つまたは複数のＤＭ１分子と複合体化した抗体を含む。本発明の実施形態には、抗体あたり平均で約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、または約２０個のＤＭ１分子を含む組成物が含まれる。好ましいＡＤＣ組成物は、抗体あたり平均して１〜１０個のＤＭ１分子を有するＡｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、Ａｂ５、Ａｂ６、Ａｂ７、またはＡｂ８を含む組成物、抗体あたり平均して３〜７個のＤＭ１分子を有する抗体を含む組成物、並びに抗体あたり、平均して４〜６個のＤＭ１分子、例えば、平均約４．０、約４．１、約４．２、約４．３、約４．４、約４．５、約４．６、約４．７、約４．８、約４．９、約５．０、約５．１、約５．２、約５．３、約５．４、約５．５、約５．６、約５．７、約５．８、約５．９および約６．０個のＤＭ１分子を有する抗体を含む組成物である。
エフェクター機能により増強された抗体
抗体のＦｃ部分の機能の１つは、抗体がその標的と結合する際に、免疫系に情報伝達をすることである。これは「エフェクター機能」とされている。情報伝達は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）、および／または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）をもたらす。ＡＤＣＣおよびＡＤＣＰは、免疫系細胞表面のＦｃ受容体へのＦｃの結合によって媒介される。ＣＤＣは、補体系タンパク質（例えば、Ｃ１ｑ）とのＦｃの結合によって媒介される。
ＩｇＧサブクラスはエフェクター機能を媒介するその能力において差異がある。例えば、ＩｇＧ１は、ＡＤＣＣおよびＣＤＣを媒介することにおいてＩｇＧ２およびＩｇＧ４よりも大いに優れている。従って、ＣＤ２７Ｌ発現細胞が破壊の標的とされる実施形態においては、抗ＣＤ２７Ｌ ＩｇＧ１抗体が好ましいであろう。
Ｆｃに一つまたは複数の変異を導入することにより、抗体のエフェクター機能を増大または低減することができる。本発明の実施形態には、エフェクター機能を増大させるよう操作されたＦｃを有する抗原結合タンパク質（例えば、抗体）が含まれる（米国特許第７，３１７，０９１号およびStrohl, Curr. Opin. Biotech., 20:685-691, 2009；共に、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）。増大されたエフェクター機能を有するＩｇＧ１ Ｆｃ分子の例には、（カバット番号付けスキームに基づいて）以下の置換を有するものが含まれる：
Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ
Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｓ／Ｉ３３２Ｅ
Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ
Ｓ２９８Ａ／Ｄ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ
Ｐ２４７Ｉ／Ａ３３９Ｄ
Ｐ２４７Ｉ／Ａ３３９Ｑ
Ｄ２８０Ｈ／Ｋ２９０Ｓ
Ｄ２８０Ｈ／Ｋ２９０Ｓ／Ｓ２９８Ｄ
Ｄ２８０Ｈ／Ｋ２９０Ｓ／Ｓ２９８Ｖ
Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ
Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｐ３９６Ｌ
Ｆ２４３Ｌ／Ｒ２９２Ｐ／Ｙ３００Ｌ／Ｖ３０５Ｉ／Ｐ３９６Ｌ
Ｇ２３６Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ
Ｋ３２６Ａ／Ｅ３３３Ａ
Ｋ３２６Ｗ／Ｅ３３３Ｓ
Ｋ２９０Ｅ／Ｓ２９８Ｇ／Ｔ２９９Ａ
Ｋ２９０Ｎ／Ｓ２９８Ｇ／Ｔ２９９Ａ
Ｋ２９０Ｅ／Ｓ２９８Ｇ／Ｔ２９９Ａ／Ｋ３２６Ｅ
Ｋ２９０Ｎ／Ｓ２９８Ｇ／Ｔ２９９Ａ／Ｋ３２６Ｅ
本発明のさらなる実施形態には、エフェクター機能を低減するよう操作されたＦｃを有する抗原結合タンパク質（例えば、抗体）が含まれる。低減されたエフェクター機能を有するＦｃ分子の例には、（カバット番号付けスキームに基づいて）以下の置換を有するものが含まれる：
Ｎ２９７Ａ（ＩｇＧ１）
Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ（ＩｇＧ１）
Ｖ２３４Ａ／Ｇ２３７Ａ（ＩｇＧ２）
Ｌ２３５Ａ／Ｇ２３７Ａ／Ｅ３１８Ａ（ＩｇＧ４）
Ｈ２６８Ｑ／Ｖ３０９Ｌ／Ａ３３０Ｓ／Ａ３３１Ｓ（ＩｇＧ２）
Ｃ２２０Ｓ／Ｃ２２６Ｓ／Ｃ２２９Ｓ／Ｐ２３８Ｓ（ＩｇＧ１）
Ｃ２２６Ｓ／Ｃ２２９Ｓ／Ｅ２３３Ｐ／Ｌ２３４Ｖ／Ｌ２３５Ａ（ＩｇＧ１）
Ｌ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｐ３３１Ｓ（ＩｇＧ１）
Ｓ２６７Ｅ／Ｌ３２８Ｆ（ＩｇＧ１）
ＩｇＧ Ｆｃ含有タンパク質のエフェクター機能を増大させる別の方法は、Ｆｃのフコシル化を低減させることによるものである。Ｆｃに結合した二分岐状複合型オリゴ糖（oligosachharide）からコアであるフコースを除去することにより、抗原結合またはＣＤＣエフェクター機能を変化させることなく、ＡＤＣＣエフェクター機能は大いに増大された。Ｆｃ含有分子（例えば、抗体）のフコシル化を低減させるまたはなくすための、いくつかの方法が知られている。そのいくつかの方法には、ある哺乳類細胞株（例えば、ＦＵＴ８ノックアウト細胞株、変異型ＣＨＯ株Ｌｅｃ１３、ラットハイブリドーマ細胞株ＹＢ２／０、ＦＵＴ８遺伝子に特異的な低分子干渉ＲＮＡを含む細胞株、並びにB−１，４−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素ＩＩＩおよびゴルジα−マンノシダーゼＩＩを共発現する細胞株）においての組み換え発現が含まれる。あるいは、Ｆｃ含有分子は、例えば、植物細胞、酵母、または原核細胞（例えば、大腸菌）等の非哺乳類細胞において発現させることができる。従って、本発明のある特定の実施形態において、組成物は、フコシル化が低減した、またはフコシル化が全く無い、抗体（例えば、Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ３、Ａｂ４、Ａｂ５、Ａｂ６、Ａｂ７、またはＡｂ８）を含む。
医薬組成物
いくつかの実施形態において、本発明は、治療有効量の、１つまたは複数の本発明の抗原結合タンパク質を、薬剤的に有効な希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、保存剤、および／またはアジュバントと共に含む、医薬組成物を提供する。ある特定の実施形態において、抗原結合タンパク質は、抗体（例えば、薬剤と複合体化した抗体または二重特異性抗体）である。本発明の医薬組成物には、限定はされないが、液体組成物、凍結組成物、および凍結乾燥組成物が含まれる。
製剤材料は使用される投与量および濃度においてレシピエントに無毒であることが好ましい。特定の実施形態では、治療有効量のＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質（例えばＣＤ２７Ｌ結合性ＡＤＣ）を含む医薬組成物が提供される。
ある特定の実施形態において、医薬組成物は、例えば、組成物の、ｐＨ、モル浸透圧濃度、粘度、透明度、色、等張性、匂い、無菌性、安定性、溶解もしくは放出の速度、吸着または浸透を改変、維持または保存するための製剤材料を含有していてもよい。そのような実施形態における、適切な製剤材料としては、限定はされないが、アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、プロリン、またはリジン）；抗菌剤；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウムまたは亜硫酸水素ナトリウム）；緩衝剤（例えば、ホウ酸塩、炭酸水素塩、トリス塩酸、クエン酸塩、リン酸塩または他の有機酸）；増量剤（例えば、マンニトールまたはグリシン）；キレート化剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））；錯化剤（例えば、カフェイン、ポリビニルピロリドン、β−シクロデキストリンまたはヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン）；充填剤；単糖類；二糖類；および他の炭水化物（例えば、グルコース、マンノースまたはデキストリン）；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン）；着色剤、香味剤および賦形剤；乳化剤；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；低分子量ポリペプチド；塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）；保存剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸または過酸化水素）；溶媒（例えば、グリセリン、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコール）；糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）；懸濁化剤；界面活性剤もしくは湿潤剤（例えば、プルロニック（pluronic）、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、ポリソルベート（例えばポリソルベート２０、ポリソルベート）、トリトン、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサポール（tyloxapal））；安定性増強剤（例えば、スクロースまたはソルビトール）；張性増強剤（tonicity enhancing agent）（例えば、アルカリ金属ハロゲン化物、好ましくは塩化ナトリウムまたは塩化カリウム、マンニトールソルビトール）；送達ビヒクル；希釈剤；賦形剤および／または補助薬が挙げられる。REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18" Edition, (A. R. Genrmo, ed.), 1990, Mack Publishing Companyを参照されたい。
ある特定の実施形態において、最適な医薬組成は、例えば、企図される投与経路、送達様式および所望の投与量に基づいて、当業者により決定される。例えば、上記REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCESを参照されたい。ある特定の実施形態において、そのような組成は、本発明の抗原結合タンパク質の物理的状態、安定性、インビボでの放出速度およびインビボでのクリアランス速度に影響を与え得る。ある特定の実施形態において、医薬組成物中の主要なビヒクルまたは担体は、水性の性質であっても非水性の性質であってもよい。例えば、適切なビヒクルまたは担体は、非経口投与用の組成物に一般的に含まれる他の物質が添加されている可能性がある、注射用蒸留水、生理的食塩水または人工脳脊髄液であり得る。血清アルブミンと混合した中性緩衝食塩水または食塩水は、ビヒクルのさらなる一例である。特定の実施形態において、医薬組成物は約ｐＨ７．０〜８．５のトリス緩衝液、または約ｐＨ４．０〜５．５の酢酸緩衝溶液を含み、ソルビトールまたはその適切な代替物をさらに含み得る。本発明のある特定の実施形態において、ＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質組成物は、所望の純度を有する選択された組成物を、凍結乾燥したケークまたは水溶液の形態にある所望の製剤化剤（上記REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES）と混合することにより、保存用に調製することができる。さらに、ある特定の実施形態において、ＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質産物は、スクロース等の適切な賦形剤を用いて凍結乾燥物として製剤化することができる。
本発明の医薬組成物は非経口的な送達用に選択することができる。あるいは、本組成物は、吸入用または消化管を介した送達（例えば経口）用に選択することができる。そのような薬剤的に許容できる組成物の調製は当業者の技能の範囲内である。製剤成分は好ましくは投与部位に許容可能な濃度で存在する。ある特定の実施形態では、緩衝液が使用されることで、組成物は、生理的ｐＨに、またはわずかにより低いｐＨに、典型的には約５〜約８のｐＨ範囲内に、維持される。
非経口投与が企図される場合、本発明で使用するための治療用組成物は、薬剤的に許容できるビヒクル中に所望のＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質を含む、発熱物質を含有しない、非経口的に許容できる水溶液の形態で提供され得る。非経口注射用に特に適したビヒクルは、滅菌蒸留水であり、滅菌蒸留水中で、ＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質は適切に保存された無菌等張液として製剤化される。ある特定の実施形態において、調製は、蓄積注射により送達することができる生成物の制御放出または持続放出を与え得る、注射用ミクロスフェア、生体内分解性粒子、高分子化合物（例えば、ポリ乳酸またはポリグリコール酸）、ビーズまたはリポソーム等の作用物質を有する所望の分子の製剤化を含み得る。ある特定の実施形態では、循環血液中での持続期間（sustained duration）を助長する効果を有するヒアルロン酸も使用され得る。ある特定の実施形態では、所望の抗原結合タンパク質を導入するために、埋め込み型の薬物送達デバイスが使用され得る。
本発明の医薬組成物は吸入用に製剤化することができる。これらの実施形態において、ＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質は乾燥した吸入可能な粉末として製剤化されると都合が良い。特定の実施形態において、ＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質吸入液も、エアロゾル送達用の噴霧剤を用いて製剤化され得る。ある特定の実施形態において、溶液は噴霧され得る。肺内投与法およびその製剤方法が国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９４／００１８７５にさらに記載されており、それは参照によって組み込まれ、化学修飾タンパク質の経肺送達について記述している。
製剤が経口投与可能であることも企図される。この様式で投与されるＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質は、錠剤およびカプセル剤等の固体剤形の配合に通常使用される担体を含有して、または含有しないで、製剤化され得る。ある特定の実施形態において、カプセルは、生物学的利用能が最大化され、前全身的（pre-systemic）分解が最少化される胃腸管内の時点で製剤の有効成分を放出するように設計され得る。ＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質の吸収を促進するために、さらなる薬剤が含まれ得る。希釈剤、香味剤、低融点ろう、植物油、滑沢剤、懸濁化剤、錠剤崩壊剤、および結合剤も使用され得る。
さらなる医薬組成物が当業者には明らかであり、例えば、持続送達製剤または制御送達製剤中にＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質を含む製剤が挙げられる。種々の他の持続送達手段または制御送達手段（例えば、リポソーム担体、生体内分解性微小粒子または多孔性ビーズおよび蓄積注射）を製剤化するための技術も、当業者に公知である。例えば、国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９３／００８２９（参照によって組み込まれ、医薬組成物を送達するための多孔性ポリマー微小粒子の制御放出について記載している）を参照されたい。徐放性調製物は、成形された物品の形態（例えば、フィルム、またはマイクロカプセル）の半透過性ポリマーマトリクスを含み得る。徐放性マトリクスとしては、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリ乳酸（米国特許第３，７７３，９１９号および欧州特許出願公開番号第ＥＰ０５８４８１号；そのそれぞれが参照によって組み込まれる）、Ｌ−グルタミン酸およびγエチル−Ｌ−グルタミン酸のコポリマー（Sidman et al., 1983, Biopolymers 2:547-556）、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）（Langer et al., 1981, J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277およびLanger, 1982, Chem. Tech. 12:98-105）、エチレン酢酸ビニル（上記Langer et al., 1981）またはポリ−Ｄ（−）−３−ヒドロキシ酪酸（欧州特許出願公開番号第ＥＰ１３３，９８８号）が挙げられる。徐放性組成物は、当該技術分野において公知のいくつかの方法のうちのいずれかによって調製することができるリポソームも含んでいてもよい。例えば、Eppstein et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82:3688-3692；欧州特許出願公開番号ＥＰ０３６，６７６；同第ＥＰ０８８，０４６号および同第ＥＰ１４３，９４９号を参照されたい（参照により組み込まれる）。
インビボ投与のために使用される医薬組成物は、典型的には無菌調製物として提供される。滅菌は、滅菌濾過膜を通す濾過によって達成することができる。組成物が凍結乾燥される場合、この方法を使用する滅菌は、凍結乾燥および再構成の前または後のいずれかに実施することができる。非経口投与のための組成物は、凍結乾燥された形態でまたは溶液として保存することができる。非経口組成物は、一般に、無菌アクセスポートを有する容器（例えば、皮下注射針によって貫通可能な栓を有する静脈注射用溶液バッグまたはバイアル）内に配置される。
本発明の態様には自己緩衝性（self-buffering）ＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質製剤が含まれ、これは、国際特許出願ＷＯ０６１３８１８１Ａ２（ＰＣＴ／ＵＳ２００６／０２２５９９）（その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）に記載の通りに、医薬組成物として使用することができる。
前述の通り、ある特定の実施形態は、ＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質に加えて、一つまたは複数の賦形剤（例えば、本節および本明細書の他の場所で説明のために記載されているもの）を含むＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質組成物、特に医薬品としてのＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質組成物を提供する。賦形剤は、種々様々な目的（例えば製剤の物理的、化学的、または生物学的特性の調節、例えば粘度の調節、並びに／または有効性を向上させる、および／もしくはそのような製剤を安定化させる本発明のプロセス、並びに例えば、製造、輸送、貯蔵、使用前調製、投与の間、およびその後に生じるストレスによる分解および損傷に対抗するプロセス）のための関連で、本発明で使用することができる。
タンパク質の安定化および製剤材料およびこの関連で有用な方法に関する様々な解説が入手可能であり（例えば、Arakawa et al., "Solvent interactions in pharmaceutical formulations," Pharm Res. 8(3): 285-91 (1991); Kendrick et al., "Physical stabilization of proteins in aqueous solution," RATIONAL DESIGN OF STABLE PROTEIN FORMULATIONS: THEORY AND PRACTICE, Carpenter and Manning, eds. Pharmaceutical Biotechnology. 13: 61-84 (2002)、およびRandolph et al., "Surfactant-protein interactions," Pharm Biotechnol. 13: 159-75 (2002)（そのそれぞれの全体が参照によって本明細書に組み込まれる））、具体的には、本発明における自己緩衝タンパク質製剤のためのそれの賦形剤およびプロセスに関連する部分、特に、動物および／またはヒトへの医学的用途のためのタンパク質医薬品およびプロセスに関する部分である。
本発明のある特定の実施形態において、例えば、製剤のイオン強度および／もしくは等張性を調節するために、並びに／または本発明の組成物のタンパク質もしくは他の成分の溶解性および／もしくは物理的安定性を向上させるために、塩を使用してもよい。
周知の通り、イオンは、タンパク質表面上の荷電残基に結合することにより、並びにタンパク質中の荷電基および極性基を遮蔽してそれらの静電的相互作用、引力相互作用、および反発相互作用の強さを低減することにより、タンパク質の天然状態を安定化することができる。イオンは、具体的には、タンパク質の変性ペプチド結合（−−ＣＯＮＨ）に結合することにより、変性状態のタンパク質も安定化することができる。さらに、タンパク質中の荷電基および極性基とのイオン性相互作用は、分子間電磁気力を低減することにより、タンパク質凝集および不溶性を防止または低減することができる。
イオン種はタンパク質に対するその効果がかなり異なっている。本発明の医薬組成物を製剤化する際に使用することができる、イオンおよびそれらのタンパク質に対する効果を分類するためのいくつかの等級が、開発されている。一例はホーフマイスター系列であり、これは、溶液中のタンパク質の高次構造安定性に対するそれらの効果によって、イオン性溶質および極性非イオン性溶質を分類する。安定化させる溶質は「コスモトロピックな」と称される。不安定化させる溶質は「カオトロピックな」と称される。コスモトロープ（kosmotrope）は通常、溶液からタンパク質を沈殿（「塩析」）させるために、高濃度（例えば、１Ｍ超の硫酸アンモニウム）で使用される。カオトロープ（chaotrope）は通常、タンパク質を変性および／または可溶化する（「塩溶」）ために使用される。「塩溶」および「塩析」に対するイオンの相対的有効性が、ホーフマイスター系列におけるそれらの位置を定める。
遊離アミノ酸を、他の標準的な用途に加えて増量剤、安定剤、および抗酸化剤として、本発明の種々の実施形態におけるＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質製剤に使用することができる。リジン、プロリン、セリン、およびアラニンを製剤中のタンパク質の安定化に使用することができる。グリシンは正確なケーキの構造および特性を保証するための凍結乾燥において有用である。アルギニンは液体製剤および凍結乾燥製剤の両方においてタンパク質凝集を阻害するのに有用であり得る。メチオニンは抗酸化剤として有用である。
ポリオールとしては、糖類（例えば、マンニトール、スクロース、およびソルビトール）および多価アルコール（例えば、グリセロールおよびプロピレングリコール）、並びに、本明細書における考察を目的として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）および関連物質が挙げられる。ポリオールはコスモトロピックである。ポリオールは液体製剤および凍結乾燥製剤の両方において、物理的分解プロセスおよび化学分解プロセスからタンパク質を保護するのに有用な安定化剤である。ポリオールは製剤の張度を調節するのにも有用である。
本発明の選択された実施形態において有用なポリオールとしてはマンニトールが挙げられ、これは凍結乾燥製剤中のケーキの構造的安定性を保証するために一般的に使用される。マンニトールはケーキに対し構造的安定性を保証する。マンニトールは一般的にはリオプロテクタント（例えば、スクロース）と共に使用される。ソルビトールおよびスクロースは、張度を調節するのに、並びに運搬中、または製造工程間の原体の調製中の凍結融解ストレスから保護するための安定剤として、好ましい薬剤である。（遊離アルデヒド基またはケトン基を含有する）糖類（例えばグルコースおよびラクトース）の減少によって、表面のリジン残基およびアルギニン残基は糖化し得る。従って、それらは一般的には本発明での使用に好ましいポリオールには含まれない。さらに、そのような反応種を形成する糖類（例えば、酸性条件下でフルクトースおよびグルコースに加水分解されて結果的に糖化をもたらすスクロース）も、この点で、本発明の好ましいポリオールには含まれない。ＰＥＧはタンパク質を安定化するために、および凍結保護物質として有用であり、この点で、本発明で使用することができる。
ＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質製剤の実施形態は界面活性剤をさらに含む。タンパク質分子は、表面に吸着し易く、且つ変性し易いため、気相液相界面、固相液相界面、および液相液相界面において凝集し易い場合がある。これらの効果は一般的にはタンパク質濃度と反比例（scale inversely）する。これらの有害な相互作用は一般的にはタンパク質濃度と反比例し、典型的には物理的な撹拌（例えば、製品の出荷および運送の間に発生する撹拌）によって悪化する。
界面活性物質が通常、表面吸着を防止、最少化、または低減するために使用される。この関連で、本発明において有用な界面活性剤としては、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、ソルビタンポリエトキシレートの他の脂肪酸エステル、およびポロキサマー１８８が挙げられる。
界面活性物質はタンパク質の高次構造の安定性を制御するのにも一般的に使用される。いかなる所与の界面活性剤も典型的にはいくつかのタンパク質を安定化し他のタンパク質を不安定化させるため、これに関連した界面活性剤の使用はタンパク質特異的である。
ポリソルベートは酸化的分解し易く、多くの場合、供給された際に、タンパク質残基の側鎖、特にメチオニンの酸化を引き起こすのに充分な量の過酸化物を含有している。従って、ポリソルベートは慎重に使用されるべきであり、使用される場合は、その最も低い有効濃度で使用されるべきである。これに関連して、ポリソルベートは、賦形剤がその最も低い有効濃度で使用されるべきであるという通則を裏付けるものである。
ＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質製剤の実施形態は一つまたは複数の抗酸化剤をさらに含む。医薬製剤中のタンパク質の有害な酸化は、周囲の酸素および温度を適切なレベルに維持することにより、並びに光への暴露を避けることにより、ある程度防止することができる。タンパク質の酸化的分解を防止するために抗酸化賦形剤も使用することができる。これに関連して、有用な抗酸化剤としては、還元剤、酸素／フリーラジカル捕捉剤、およびキレート化剤が挙げられる。本発明における治療的タンパク質製剤で使用するための抗酸化剤は、水溶性であって、且つ製品の有効期間の全体を通じてその活性を維持することが好ましい。これに関連して、ＥＤＴＡは本発明における好ましい抗酸化剤である。
抗酸化剤はタンパク質を損傷し得る。例えば、還元剤、具体的にはグルタチオン等により、分子内ジスルフィド結合を破壊することができる。従って、本発明で使用するための抗酸化剤は、特に、それら自体が製剤中のタンパク質を損傷させる可能性を排除する、または充分に減少させるように選択される。
本発明における製剤には、タンパク質補助因子であり、タンパク質配位錯体の形成に必要な金属イオン（例えば、あるインスリン懸濁液の形成に必要な亜鉛）が含まれ得る。金属イオンにより、タンパク質を分解するいくつかのプロセスを阻害することもできる。しかし、金属イオンはタンパク質を分解する物理的プロセスおよび化学的プロセスも触媒する。
マグネシウムイオン（１０〜１２０ｍＭ）を使用することで、アスパラギン酸のイソアスパラギン酸への異性化を阻害することができる。Ｃａ＋２イオン（最大１００ｍＭ）により、ヒトデオキシリボヌクレアーゼの安定性を増加させることができる。しかし、Ｍｇ＋２、Ｍｎ＋２、およびＺｎ＋２により、組換え型ヒトデオキシリボヌクレアーゼ（rhDNase）を不安定化させ得る。同様に、Ｃａ＋２およびＳｒ＋２により第ＶＩＩＩ因子を安定化させることができ、Ｍｇ＋２、Ｍｎ＋２およびＺｎ＋２、Ｃｕ＋２およびＦｅ＋２によりそれを不安定化させることができ、Ａｌ＋３イオンによりその凝集を増加させることができる。
ＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質製剤の実施形態は一つまたは複数の保存剤をさらに含む。保存剤は、同一容器からの２回以上の抽出を含む、複数回投与非経口製剤を開発する際に必要である。それらの主な機能は、製剤の貯蔵期間または使用期間の全体を通して、微生物の増殖を阻害し、製品の無菌性を確実にすることである。一般的に使用される保存剤には、ベンジルアルコール、フェノールおよびｍ‐クレゾールが含まれる。保存剤は小分子非経口剤と共に長い間使用されているが、保存剤を含むタンパク質製剤の開発が課題となり得る。保存剤はほとんどの場合、タンパク質に対して不安定化作用（凝集）を有し、これが、複数回投与タンパク質製剤中でのそれらの使用を制限する主な要因となっている。現在までに、ほとんどのタンパク質薬剤は単回使用用のみに製剤化されている。しかし、複数回投与製剤が可能であれば、タンパク質薬剤には、患者の利便性を可能にする利点が付加され、市場性が増加される。１つの好例は、保存製剤の開発によってより利便性の高い、複数回使用注射用ペンプレゼンテーション（multi-use injection pen presentation）の商業化がもたらされた、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）のタンパク質薬剤である。ｈＧＨの保存製剤を含有する少なくとも４種のそのようなペンデバイス（pen device）が、現在市場で入手可能である。Ｎｏｒｄｉｔｒｏｐｉｎ（液体、ノボノルディスク社）、Ｎｕｔｒｏｐｉｎ ＡＱ（液体、ジェネンテック社）およびＧｅｎｏｔｒｏｐｉｎ（凍結乾燥‐デュアルチャンバーカートリッジ、ファルマシア＆アップジョン社）はフェノールを含有しているが、一方、Ｓｏｍａｔｒｏｐｅ（イーライリリー社）はｍ‐クレゾールと共に製剤化される。
保存的剤形の製剤および開発の間に、いくつかの側面を考慮する必要がある。製剤中の効果的な保存剤濃度が最適化されなければならない。これには、タンパク質安定性を損なうことなく抗微生物有効性を付与する濃度範囲で、剤形中の所与の保存剤を試験する必要がある。
予想され得ることであるが、保存剤を含有する液体製剤の開発は、凍結乾燥製剤よりも、より困難なものである。凍結乾燥製品は、保存剤無しで凍結乾燥させることができ、使用時には保存剤含有希釈液で再構成することができる。これにより、保存剤がタンパク質と接触している時間が短くなり、関連する安定性リスクが有意に最小化される。液体製剤で以て、保存剤の有効性および安定性は、製品の貯蔵期間全体にかけて（約１８ヶ月〜２４ヶ月）、維持されるはずである。注意すべき重要な点は、活性薬剤および全ての賦形剤成分を含有する最終製剤において、保存剤の有効性が示されるべきであることである。
ＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質製剤は一般的には、特に、特定の投与経路および投与方法用に、特定の投与量および投与頻度用に、特定の疾患の特定の治療用に、生物学的利用能および生体内持続性の範囲内で、設計される。従って、本発明における製剤は、あらゆる適切な経路（例えば、限定はされないが、経口的、経耳的（aurally）、経眼的（opthalmically）、経直腸的、および経膣的）による送達、並びに非経口経路（例えば、静脈内注射および動脈内注射、筋肉内注射、および皮下注射）による送達用に設計され得る。
医薬組成物は、製剤化されると、溶液、懸濁液、ゲル、エマルジョン、固体、結晶として、または脱水粉末もしくは凍結乾燥粉末として、無菌バイアル内に保存することができる。そのような製剤は、使用準備済の形態で、または投与前に再構成される形態（例えば、凍結乾燥した形態）で、保存することができる。本発明は、一回用量投与単位（single-dose administration unit）を作製するためのキットも提供する。本発明のキットはそれぞれ、乾燥したタンパク質を含む第一容器および水性製剤を含む第二容器の両方を含有し得る。本発明のある特定の実施形態において、単一チャンバー型および複数チャンバー型の事前充填注射器（例えば、液体注射器およびリオシリンジ（lyosyringe））を含有するキットが提供される。
ＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質を含有する医薬組成物が使用される治療有効量は、例えば、治療状況および目的によって異なる。治療に適した用量レベルが、部分的に、送達される分子、ＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質が使用される指標、投与経路、およびサイズ（体重、体表または臓器サイズ）並びに／または患者の状態（年齢および全体的な健康）に非常に依存的であることは、当業者には明らかである。ある特定の実施形態において、臨床医は投与量を調節し（titer）、投与経路を変更することで、最適な治療効果を得ることができる。典型的な投与量は、上記の要因に応じて、約０．１μｇ／ｋｇ〜最大約３０ｍｇ／ｋｇの範囲またはそれ以上であり得る。特定の実施形態では、投与量は、１．０μｇ／ｋｇ〜最大約２０ｍｇ／ｋｇ、所望により１０μｇ／ｋｇ〜最大約１０ｍｇ／ｋｇまたは１００μｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。
治療有効量のＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質によって、病徴の重症度の低減、病徴が無い期間の頻度もしくは持続期間の増加、または疾患（disease affliction）に起因する機能障害もしくは身体障害の予防がもたらされることが好ましい。ＣＤ２７Ｌ発現腫瘍を処置するために、治療有効量のＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質（例えば抗ＣＤ２７Ｌ ＡＤＣ）は、未処置患者と比較して、細胞増殖または腫瘍増殖を、少なくとも約２０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％阻害することが好ましい。腫瘍増殖を阻害する化合物の能力は、ヒト腫瘍における有効性の予測となる動物モデルにおいて評価してもよい。
医薬組成物は医療機器を用いて投与してもよい。医薬組成物を投与するための医療機器の例は、米国特許第４，４７５，１９６号；同第４，４３９，１９６号；同第４，４４７，２２４号；同第４，４４７，２３３号；同第４，４８６，１９４号；同第４，４８７，６０３号；同第４，５９６，５５６号；同第４，７９０，８２４号；同第４，９４１，８８０号；同第５，０６４，４１３号；同第５，３１２，３３５号；同第５，３１２，３３５号；同第５，３８３，８５１号；および同第５，３９９，１６３号（全て参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
ＣＤ２７Ｌ関連疾患または障害の診断法または治療法
本発明のＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質は、特に、生物試料中のＣＤ２７Ｌを検出するのに有用である。ある特定の実施形態において、患者から得られた生物試料は、ＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質と接触される。ＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質のＣＤ２７Ｌへの結合が次に検出されて、試料中のＣＤ２７Ｌの有無または相対量が決定される。そのような方法は、ＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質（例えば、抗ＣＤ２７Ｌ ＡＤＣ）を用いた治療に適している患者を診断または判定するのに有用であり得る。
ある特定の実施形態において、本発明のＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質は、自己免疫性疾患または炎症性疾患の診断、検出、または治療に使用される。自己免疫性疾患または炎症性疾患の治療において、ＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質は、免疫系のＣＤ２７Ｌ発現細胞を破壊の標的とし、および／または、ＣＤ２７Ｌの受容体ＣＤ２７との相互作用を遮断し得る。
ＣＤ２７とのＣＤ２７Ｌの相互作用は、細胞性自己免疫疾患（例えば、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ））に関与していると考えられている（Nakajima et al. (2000) J. Neuroimmunol. 109:188-96）。この作用はＴＮＦ−ａの産生阻害によって部分的に仲介されると考えられている。さらに、ＣＤ２７Ｌシグナル伝達の遮断によって、ＣＤ８＋Ｔ細胞のＣＤ４０介在性クローン増殖が阻害され、ＣＤ８＋記憶Ｔ細胞の発生が減少する（Taraban et al. (2004) J. Immunol. 173:6542-6）。従って、ＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質を使用することで、自己免疫障害、例えば、ＣＤ２７Ｌを発現するＢ細胞の存在によって特徴付けられる障害（例えば、実験的自己免疫性脳脊髄炎）を有する対象を治療することができる。本開示の抗体を使用することができるさらなる自己免疫障害としては、限定はされないが、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）（例えば、クローン病、潰瘍性大腸炎およびセリアック病）、多発性硬化症（ＭＳ）、乾癬、自己免疫性甲状腺炎、関節リウマチ（ＲＡ）および糸球体腎炎が挙げられる。さらに、本開示のｃｄ２７Ｌ抗原結合タンパク質組成物は、移植拒絶反応の阻害または予防に、または移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の治療に使用することができる。
さらに、ＣＤ２７ＬのＣＤ２７との相互作用が、ＣＤ４＋Ｔ細胞に対するシグナル伝達に関わっていると提唱されている。いくつかのウイルスは、ＣＤ２７経路にシグナルを送ることで、中和抗体反応の破壊をもたらすことが示されている（Matter et al. (2006) J Exp Med 203:2145-55）。従って、本開示のＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質組成物および方法は、ウイルス感染、例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、肝炎（Ａ型、Ｂ型、およびＣ型）、ヘルペスウイルス（例えば、ＶＺＶ、ＨＳＶ−１、ＨＡＶ−６、ＨＳＶ−ＩＩおよびＣＭＶ、エプスタイン・バーウイルス）、アデノウイルス、インフルエンザウイルス、フラビウイルス、エコーウイルス、ライノウイルス、コクサッキーウイルス、コロナウイルス（cornovirus）、呼吸器合胞体ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、ロタウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、パルボウイルス、ワクシニアウイルス、ＨＴＬＶウイルス、デング熱ウイルス、パピローマウイルス、軟属腫ウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、ＪＣウイルスおよびアルボウイルス脳炎ウイルス（arboviral encephalitis virus）およびリンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）からの感染を有する対象を治療するために、または、ＨＩＶ感染／エイズの治療に、使用することができる。さらに、本開示のヒト抗体、抗体組成物および方法を使用することで、ＴＮＦ−ａ産生を阻害することができる。
ある特定の実施形態において、本発明のＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質は、がんまたは腫瘍形成性疾患の診断、検出、または治療に使用される。腫瘍またはがんの細胞がＣＤ２７Ｌを発現し得る、本明細書に記載の治療を受け入れられる腫瘍およびがんとしては、限定はされないが、腎細胞癌（ＲＣＣ）（例えば、明細胞ＲＣＣ、乳頭状ＲＣＣ、嫌色素性ＲＣＣ等）、グリア芽腫、頭頚部がん（例えば、扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）等）、乳がん、脳腫瘍、鼻咽腔癌（nasopharangeal carcinoma）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）（例えば、低悪性度ＮＨＬ、びまん性大細胞ＮＨＬ等）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）（例えば、前駆Ｂ細胞ＡＬＬ等）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬまたはＢ−ＣＬＬ）、バーキットリンパ腫、未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）、多発性骨髄腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、結節性小切れ込み核細胞リンパ腫（nodular small cleaved-cell lymphoma）、リンパ球性リンパ腫、末梢性Ｔ細胞リンパ腫、レナートリンパ腫、免疫芽球性リンパ腫、Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬＬ）、成人Ｔ細胞白血病（Ｔ−ＡＬＬ）、中心芽細胞性（entroblastic）／中心細胞性（ｃｂ／ｃｃ）濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、血管免疫芽球性リンパ節症（ＡＩＬＤ）様Ｔ細胞リンパ腫、ＨＩＶ関連原発性滲出液リンパ腫（HIV associated body cavity based lymphoma）、胎生期癌、鼻咽腔の未分化癌（例えば、シュミンケ腫瘍（Schmincke's tumor））、キャッスルマン病、カポジ肉腫、多発性骨髄腫、ワルデンストローム・マクログロブリン血症および他のＢ細胞リンパ腫が挙げられる。本明細書に記載の治療を受け入れられるさらなる腫瘍型としては以下の腫瘍が挙げられる：腎臓、膵臓、喉頭または咽頭、メラノーマ、卵巣、肺腺癌、結腸 乳房、脳等。
以下の実施例は、実際に行ったものも予測的なものも含めて、本発明の特定の実施形態または特徴を説明することのみを目的に提供されており、その範囲を限定することは意図されていない。
実施例１ ＣＤ２７Ｌに対する完全ヒトモノクローナル抗体
ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を用いて、ヒトＣＤ２７Ｌに対する完全ヒト抗体の作製を行った（米国特許第６，１１４，５９８号；同第６，１６２，９６３号；同第６，８３３，２６８号；同第７，０４９，４２６号；同第７，０６４，２４４号（それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）；Green et al., 1994, Nature Genetics 7:13-21; Mendez et al., 1997, Nature Genetics 15:146-156; Green and Jakobovitis, 1998, J. Ex. Med. 188:483-495）。
ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ４ ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（登録商標）マウスを、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞の表面上に組換え的に発現された可溶性ヒトＣＤ２７ＬまたはヒトＣＤ２７Ｌで免疫／追加免疫した。免疫化マウスからハイブリドーマを作製した。組換えヒトＣＤ２７Ｌを発現する２９３細胞への結合能を対象に、ハイブリドーマ上清をスクリーニングした。２６０種を超える上清が結合能に関して陽性であった。
次に、Ｒａｊｉ細胞および／または７８６−０細胞の表面上の天然ＣＤ２７Ｌへの結合能を対象に、陽性であった上清をスクリーニングした。天然ＣＤ２７Ｌ結合アッセイにより、１６１種の上清が陽性であることが判った。
それらの上清を、カニクイザルＣＤ２７Ｌとの交差反応性について試験した。２５種の上清がカニクイザルＣＤ２７Ｌとの交差反応性において陽性であった。次に、それら２５種を、ＣＤＣ活性およびヒトＣＤ２７ＬへのヒトＣＤ２７の結合を遮断する能力について試験した。１９種の上清が、ＣＤＣ活性およびヒトＣＤ２７ＬへのヒトＣＤ２７の結合阻害において陽性であった。１３種のＩｇＧ１および６種のＩｇＧ４系統のサブクローニングおよび配列決定により、７種の独自のＩｇＧ１抗体（Ａｂ１−Ａｂ７）および１種の独自のＩｇＧ４抗体（Ａｂ８）が明らかとなった。
その８種の抗体の特徴、および市販のマウス抗ヒトＣＤ２７Ｌ抗体のキメラバージョンの特徴の概要を、図１に示す。
親和性
組換え可溶性ヒトＣＤ２７Ｌに対する親和性を、ＢＩＡＣＯＲＥ３０００のＣＭ５チップを用いて決定した。ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体を使用して、試験抗体を捕捉した。ヒスチジン標識ヒト可溶性ＣＤ２７Ｌの結合および解離を測定して、Ｋａ、Ｋｄ、およびＫＤを決定した。条件は以下の通りであった：
温度＝２５℃
流速＝５０μｌ／分
泳動バッファー＝ＨＢＳ−ＥＰ
１０ｍＭグリシン（ｐＨ１．５）を用いて再生
ヒトＣＤ２７Ｌ−ｈｉｓの濃度範囲は２００ｎＭ→０．２１７ｎＭであった
モデル適合（スクラバー２）：１：１ 結合性＋局所的最大結合応答
５分の結合および２５分の解離
ＡＤＣＣ活性
ＡＤＣＣアッセイを無菌９６ウェル丸底組織培養プレート（コーニング社）において行った。抗体を、１００μＬの１０％ＦＣＳ含有完全ＲＰＭＩ中に１０μＬを溶解（１：１０希釈）させることにより、２０μｇ／ｍＬから０．０００２μｇ／ｍＬまで抗体価測定した。カルセインで標識した標的を、１０，０００個の細胞が含有されるように５０μＬ加えた。標的細胞と種々の濃度の抗体を４℃で４０分間インキュベートし、次にエフェクター細胞としてＮＫ細胞を、２００，０００個の細胞が含有されるように、５０μＬ加えた。培養液を３７℃で４時間インキュベートし、その後上清を回収し、蛍光をＷａｌｌａｃ Ｖｉｃｔｏｒ ＩＩ １４２０ Ｍｕｌｔｉｌａｂｌｅ ＨＴＳ ｃｏｕｎｔｅｒ上で４８５〜５３５ｎｍで測定することによりカルセイン放出についてアッセイした。Ｉｇｅｐａｌ６３０界面活性剤（３μＬ／ウェル）を用いて６ウェルのカルセイン標識Ｒａｊｉ標的を溶解することによって１００％溶解値を決定し、標的のみから得られた上清における蛍光を測定することによって自然溶解値を決定した。
特異的溶解率（％）を、（試料蛍光）−（自然溶解蛍光）／（１００％溶解-自然溶解蛍光）として定義した。式を埋め込んだＥｘｃｅｌのスプレッドシートに生データを入力して特異的溶解率（％）を算出し、得られた値を図式プログラム（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ）に移し、データをＳ字形カーブフィッティンググラフに変換した。次に、ＧｒａｐｈＰａｄにて解析（線形回帰算出）を行い、ＥＣ５０値を求めた。
ＡＤＣＰ活性
単球をヒト末梢血から陰性選択し、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地中で４℃低温室に一晩保管した。その後、単球を２００μＬの増殖培地（１０％ＦＢＳおよび４０ｎｇ／ｍｌのヒトＭ−ＣＳＦを含有するＲＰＭＩ１６４０）中２００，０００細胞／ウェルで４８ウェル組織培養プレートに播種し、３７℃、５％ＣＯ２下で６日間インキュベートすることで、単球をマクロファージに分化させた。
６日目に、ＡＤＣＰアッセイを以下の通りに行った：
１． ＰＫＨ６７色素の最終濃度を２×１０ −６ Ｍとして標的細胞をＰＫＨ６７緑色色素で標識
腫瘍細胞を収集し、ＰＢＳと共に細胞を５分間遠心（４００´ｇ）することにより１回洗浄した。
細胞を遠心した後、その上清を慎重に吸引したが、２５ｍＬを超えない上清が残った。
原液濃度４×１０−６Ｍの４μＬのＰＫＨ６７エタノール性色素溶液を、ポリプロピレン管および撹拌したウェル中の、キットから得た１ｍｌのＤｉｌｕｅｎｔ Ｃに添加した。
細胞ペレットを、ポリプロピレン管中で、２０×１０６の密度となるように１ｍＬのＤｉｌｕｅｎｔＣに再懸濁した。
細胞を迅速に染液（dye work solution）に移すと共に、完全な分散液となるように穏やかにピペッティングした。
混合物を、定期的に撹拌しながら室温で４分間インキュベートした。
２ｍＬの全体活性型ＦＢＳ（whole activated FBS）を細胞に添加することで染色を止め、室温での１分間のインキュベートにより過剰な色素を結合させた。
４０ｍＬの１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩを細胞に添加し、細胞を１０分間遠心（４００´ｇ）することにより１回洗浄した。
細胞ペレットを４０ｍＬの培地で再度懸濁し、新しい管に移した。
細胞を再度、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ培地で３回、および完全増殖培地（１０％ＦＢＳおよび４０ｎｇ／ｍｌヒトＭ−ＣＳＦを含有するＲＰＭＩ１６４０）で１回、洗浄した。
細胞を計数し、１×１０６細胞／ｍＬとなるように増殖培地で懸濁し、Ｔ：Ｅ比を１：２にした。
２． 抗体依存性細胞性食作用（ＡＤＣＰ）を目的とする抗体による腫瘍細胞の処理
抗体希釈物をマクロファージ増殖培地中で調製した。
これらの希釈物を最終濃度の４倍高い濃度に濃縮した。
ＰＫＨ６７緑色標識標的細胞を抗体と共にプレインキュベートするために、２８０μｌの４倍濃縮抗体を２８０μｌの緑色標識腫瘍細胞と混合し、４℃で３０分間インキュベートした。
下記の実験計画表に示されるように、緑色標識腫瘍細胞と抗腫瘍抗体の混合物を、４８ウェルプレート中のマクロファージ細胞に、各ウェルに２００μｌずつ添加した。最終体積は０．４ｍｌ／ウェルである。標的細胞のエフェクター細胞（マクロファージ）に対する比は、１：２である。
細胞を３７oＣ、５％ＣＯ２下で１時間インキュベートした。
３． マクロファージマーカーを用いたマクロファージの対比染色
トリプシン−ヴェルセン混合物を用いて、４８ウェルプレート中の標的細胞およびマクロファージを剥がした。
細胞を、ウェルあたり２．２ｍｌの容積を有する９６ウェルブロック（96-well block）に移し、ブロックを４００´ｇで５分間スピンにかけることにより、予め温めておいたＦＡＳＣ洗浄液で１回洗浄し、その後上清を廃棄した。
１００μｌ／ウェルの、ブロッキング液中で１：２００希釈された、マクロファージのマーカーであるＣＤ１１ｂ−ビオチンで、氷上で１０分間、マクロファージを染色した。
細胞を１回洗浄した後、１：１０００希釈されたストレプトアビジンＡｌｅｘａ５６８で、氷上で１０分間、マクロファージを検出した。
細胞をＰＢＳで１回洗浄した後、４％ホルムアルデヒド−ＰＢＳで、室温で２０分間、細胞を固定した。次に、細胞をｄＨ２Ｏで１回洗浄した。
細胞ペレットを２００μｌ／ウェルの水で再懸濁し、１００μｌ／ウェルで９６ウェルプレートに移した。
４． ２０倍対物レンズを使用するＴａｒｇｅｔ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ＢｉｏＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎを備えた、ＡｒｒａｙＳｃａｎ ＶＴＩ ＨＣＳ ｒｅａｄｅｒ（バージョン６、セロミクス社（Cellomics Inc.）サーモフィッシャー・サイエンティフィック社、ペンシルバニア州ピッツバーグ）上での、食作用活性の定量的測定
フィルター設定を表２に示した。各ウェルにおいて少なくとも２００個の細胞を計数した。
Figure 0006251678
Ｐｒｉｓｍ４．０１（グラフパッド社（ＧｒａｐｈＰａｄ）、カリフォルニア州サンディエゴ）を用いて統計解析を行った。プロットは、ｎｇ／ｍｌ単位の抗体濃度の対数に対する腫瘍細胞食作用率（％）を示している。腫瘍細胞食作用の割合は、選択されたフィールドにおける合計マクロファージ数に対するマクロファージと重なっている腫瘍細胞の割合で表され、ＡｒｒａｙＳｃａｎ ｒｅａｄｅｒの出力機構「％ＯｂｊｅｃｔＣｏｕｎｔｓ」から得られる。％値は２連の測定（ｎ＝２）の平均＋／−平均の標準誤差（ＳＥＭ）として表した。ＥＣ５０は、非線形回帰（カーブフィッティング）を用い、続いてシグモイド用量反応式を用いて、決定した。データを最大シグナルおよび最少シグナルに対して正規化し、シグモイド用量反応曲線に当てはめた。
ＣＤＣ活性
腫瘍細胞の調製：Ｒａｊｉ細胞をアッセイ培地で１回洗浄し、アッセイ培地（ＲＰＭＩ１６４０＋１％ＦＢＳ）中に懸濁した。細胞を９６ウェル細胞培養プレート中に、ウサギ補体およびヒト補体の両方について２つの細胞密度で、５０μＬ／ウェルで播種した。ウサギ補体について、細胞密度は５×１０４細胞／ウェルであった。ヒト補体について、細胞密度は２×１０５細胞／ウェルであった。
補体および試験抗体での細胞処理：表３に記載される通りに３倍に濃縮した補体をアッセイ培地中で調製した。次に、それらを５０μＬ／ウェルでプレート中の細胞に加えた。ウサギ補体で処理された細胞においては、ウサギ補体の最終濃度は１０％であり；ヒト補体で処理された細胞においては、ヒト補体の最終濃度は２０％であった。
Figure 0006251678
１０μｇ／ｍＬの試験抗体を５０μＬ／ウェルで細胞に加えた。培養開始時の各ウェルの全量は１５０μＬであった。細胞を連続的に３７℃、５％ＣＯ２で、ウサギ補体で処理した細胞においては１時間、ヒト補体で処理した細胞においては６時間、インキュベートした。
ＡｒｒａｙＳｃａｎプレートリーダーを用いた細胞毒性の測定：インキュベーション後、各ウェルから５０μｌの培地を除去した。２％ＦＢＳ含有ＰＢＳ溶液中１：１０００希釈で調製した、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２およびヨウ化プロピジウム（ＰＩ）の混合物を、１００μＬ／ウェルで細胞に加えた。ヒト補体で処理した細胞を、穏やかに混合した後４０μＬ／ウェルで、新しい９６ウェルプレートに移した。試料を、２０倍対物レンズを使用するＢｉｏＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ「Ｔａｒｇｅｔ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ」を備えたＡｒｒａｙＳｃａｎ ＶＴＩ ＨＣＳリーダー（バージョン６、セロミクス（Cellomics）、サーモフィッシャー・サイエンティフィック社、ペンシルバニア州ピッツバーグ）で解析した。フィルター設定を表４に示した。各ウェルにおいて少なくとも２００個の細胞を計数した。
Figure 0006251678
 統計解析：Ｐｒｉｓｍ４．０１（ＧｒａｐｈＰａｄ社、カリフォルニア州サンディエゴ）を用いて統計解析を行った。
内部移行時間
細胞播種：７８６−０細胞を９６ウェルプレートに１０，０００細胞／ウェルで１００μＬの増殖培地（１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ）と共に播種し、３７℃、５％ＣＯ２で２日間インキュベートして、アッセイの日に細胞の培養密度を１００％に到達させた。播種した細胞を１）内部移行および２）エンドソーム共局在について評価した。
内部移行の経時変化に対する細胞染色：プレートをアッセイ培地（２％ＦＢＳ含有ＰＢＳ）で１回洗浄した。抗体をアッセイ培地中２μｇ／ｍＬ／ウェル（１００μＬ／ウェル）でウェルに加えた。ヒト抗体を４℃で３０分間細胞に結合させ、その後アッセイ培地で１回洗浄した。アッセイ培地中の抗ヒトＩｇＧ Ｆａｂ’ Ａｌｅｘａ４８８（１：１００）およびＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２（１：２０００）を、４℃で２０分間細胞に加えた。次に、細胞をアッセイ培地で１回洗浄した。細胞を、時点ゼロで固定および透過処理するか、または３７℃、５％ＣＯ２で１、３、もしくは５時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を以下の手順で固定および透過処理した。細胞をＢＤ洗浄緩衝液で１回洗浄し、その後、固定／透過処理液を１００μＬ／ウェルでウェルに加えた。試料を、４０倍対物レンズを用いるＢｉｏＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ「Ｓｐｏｔ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ」を備えたＡｒｒａｙＳｃａｎ ＶＴＩ ＨＣＳリーダー（バージョン６、セロミクス（Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ）、サーモフィッシャー・サイエンティフィック社、ペンシルバニア州ピッツバーグ）で分析した。フィルター設定を表５に示した。各ウェルにおいて少なくとも４００個の細胞をカウントした。
Figure 0006251678
初期エンドソーム区画に共局在している内部移行スポットについての細胞の計数染色：内部移行分析の後、７８６−０細胞をＢＤ緩衝液で１回洗浄した。細胞を室温で２０分間、固定／透過処理液に対して、調査した（explore）。２回の洗浄ステップの後、細胞を、０．５μｇ／ｍＬ（１００μｌ／ウェル）のＢＤ緩衝液中ＥＥＡ−１と共に、室温で２０分間インキュベートした。細胞をＢＤ緩衝液で１回洗浄し、１：１０００希釈した抗マウスＡｌｅｘａ５６８を加えた。細胞を室温２０分間インキュベートし、その後ＢＤ 緩衝溶液で２回洗浄した。
画像撮影：内部移行および共局在に関する細胞画像を、Ｏｐｅｎｌａｂ Ｉｍａｇｅ Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェア（インプルビジョン社（Improvision Inc）、マサチューセッツ州レキシントン）またはＡｒｒａｙＳｃａｎ ＶＴＩ ＨＣＳリーダーを備えた、浜松社製（Hamamutsu）デジタルカメラに接続されたライカ社製蛍光顕微鏡で撮影した。
統計解析：Ｐｒｉｓｍ４．０１（ＧｒａｐｈＰａｄ社、カリフォルニア州サンディエゴ）を用いて統計解析を行った。スポット数は、２連測定（ｎ＝２）の平均値±平均値の標準誤差（ＳＥＭ）として表した。解析ツールを用いて、単位時間あたりのスポット数(内部移行速度)を、単相指数関数的関連方程式（one phase exponential association equation）に当てはめた。
実施例２-ＭＣＣ−ＤＭ１複合体化抗体の評価
Ａｂ１、Ａｂ２、Ａｂ４、Ａｂ７、およびＡｂ８をＭＣＣ−ＤＭ１と複合体化した（図１２参照）。目標の積載レベルは抗体あたり４．５〜５個の薬剤であった。簡潔に説明すると、抗体のリジンを、ＮＨＳ−エステルおよびマレイミドを含有する、ヘテロ−二官能性架橋剤サクシニミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボン酸塩（ＳＭＣＣ）のＮＨＳ−エステルに結合させた。次に、リンカー修飾抗体を、過剰なリンカーから精製した後、ＤＭ１上に存在するスルフヒドリルを介して弾頭ＤＭ１（warhead DM1）に結合させた。次に第二精製ステップにより過剰なＤＭ１を除去して、最終的な複合体Ａｂ−ＭＣＣ−ＤＭ１を得た。
より具体的には、哺乳類細胞培養物２９３６−Ｅ細胞において一時的に発現したＣＤ２７Ｌ抗体を、２５ｍＭのトリス、１５０ｍＭの塩化ナトリウム（ｐＨ７．４）中で平衡化したＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅカラム（ＧＥヘルスケア社）上に添加した。次に、ＣＤ２７Ｌ抗体が結合したカラムを３段階の洗浄で洗浄した：第一段階は平衡緩衝液での洗浄、次に２５ｍＭのトリス、５００ｍＭのＬ−アルギニン（ｐＨ７．５）での洗浄、最後に平衡緩衝液での洗浄。ＣＤ２７Ｌ抗体を１００ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）で溶出させた。抗体を含有する画分をプールし、１Ｍのトリス（ｐＨ８．０）で最終ｐＨを５．０に調整した。次に、抗体を、３０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）中で平衡化したＦｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＥＭＤ ＳＯ３−（Ｍ）カラム（ＥＭＤケミカルズ社（EMD Chemicals Inc））で精製した。結合した抗体を、３０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）中０〜０．８Ｍの塩化ナトリウムの８ＣＶ勾配で溶出させた。抗体を含有する分画をプールし、複合体化緩衝液（２ｍＭのＥＤＴＡ、５０ｍＭの塩化ナトリウム、５０ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ６．５）に透析した。
精製したＣＤ２７Ｌ抗体をアミン反応性リンカーのサクシニミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸塩（ＳＭＣＣ）（サーモサイエンティフィック社）で修飾して、チオール反応性マレイミド基を導入した。５５μＭの濃度の抗体を、最終反応混合物中１０％ジメチルアセトアミド（ｖ／ｖ）に調整された複合体化緩衝液中２０モル当量のＳＭＣＣで処理した。室温で９０分間インキュベートした後、反応混合物を、２ｍＭのＥＤＴＡ、１５０ｍＭの塩化ナトリウム、３５ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ５．０）中で平衡化したＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５微細樹脂（ＧＥヘルスケア社）を含有するＨｉＰｒｅｐ ２６／１０ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ Ｃｏｌｕｍｎで脱塩した。抗体を含有する画分をプールし、下記の通りにエルマン試薬（５，５’−ジチオ−ビス−［２−ニトロ安息香酸］）を用いてリンカーでの修飾の程度についてアッセイした。抗体が抗体あたり平均７．５個のマレイミド基で修飾されていることが判った。
エルマン試薬はチオールによって切断され、４１２ｎｍに吸光度を有する（with an absorbance at 412nm）黄色の生成物を生じる。減法的（subtractive）エルマンアッセイを行って、ＳＭＣＣとの反応後のＣＤ２７Ｌ抗体上のマレイミド基の数を決定した。ＳＭＣＣで修飾されたＣＤ２７Ｌ抗体または抗体を含有しない緩衝液の対照試料を、当量濃度のチオール、０．４ｍＭのＤＴＴ（ジチオスレイトール）と共にインキュベートした。抗体試料中に存在するマレイミドはいずれもＤＴＴ中のチオールと反応して、それをエルマン試薬とのさらなる反応に利用できなくする。次に、エルマン試薬を両方の試料に加え、４１２ｎｍでの比色定量を行って、反応したエルマン試薬の濃度を決定した。対照試料と比較した場合の抗体試料中のチオール濃度の減少は抗体試料中に存在するマレイミドの数と比例する。この値を使用して、修飾されたＣＤ２７Ｌ抗体あたりの連結したマレイミド基の数を決定した。
１７μＭ〜２７μＭの濃度のＳＭＣＣ修飾ＣＤ２７Ｌ抗体（抗体あたり７．５個のマレイミド基）を、最終反応混合物中３％ＤＭＡ（ｖ／ｖ）に調節された２ｍＭのＥＤＴＡ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３５ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ５．０）で緩衝化された、マレイミド基あたり１．７モル当量のＤＭ１（イムノゲン社）で処理した。反応混合物を室温で一晩（最大２０時間）インキュベートした。反応混合物を、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、１５０ｍＭの塩化ナトリウム（ｐＨ６．５）で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ゲル濾過カラム（ＧＥヘルスケア社）に添加した。分画を集めて、単量体抗体を含有する分画をプールしアッセイした。抗体あたりに連結したＤＭ１分子のモル比を、２５２ｎｍおよび２８０ｎｍでの吸光度を測定することにより決定したところ、抗体あたり４．５〜５．０個のＤＭ１分子であることが判った。
インビトロでの薬理
抗体薬剤複合体（ＡＤＣ）のＡｂ４−ＭＣＣ−ＤＭ１およびＡｂ８−ＭＣＣ−ＤＭ１は、フローサイトメトリーによる評価において、それの複合体化していない対応物に匹敵する天然ＣＤ２７Ｌ結合性を示した。観察された、Ａｂ４およびＡｂ４−ＭＣＣ−ＤＭ１の結合性のＥＣ５０は同じであったが、Ａｂ８と比較したＡｂ８−ＭＣＣ−ＤＭ１については、中程度に４倍低かった（表６）。Ａｂ４、Ａｂ８およびそれらの複合体対応物の結合親和性のより正確な測定値を、Gyros技術を用いて、Ｒａｊｉ細胞上に発現された天然ヒトＣＤ２７Ｌと結合するそれらの能力を測定することにより、決定した。結果は、両複合体が、非複合体化型のＡｂ４およびＡｂ８において観察された結合性の２倍以内の、ＣＤ２７Ｌに対するｎＭ単位未満（sub-nM）の親和性を示すことを、示した。（表６）。非複合体化型および複合体化型のＡｂ４およびＡｂ８は共に、ＢＩＡＣＯＲＥで決定された、互いに２倍以内の、可溶性ヒトＣＤ２７Ｌ−ｈｉｓに対する結合親和性も示した。
Figure 0006251678
Ａｂ４−ＭＣＣ−ＤＭ１、Ａｂ８−ＭＣＣ−ＤＭ１、Ａｂ４、およびＡｂ８の、ＣＤ２７Ｌを発現するヒトｃｃＲＣＣ株７８６−０における内部移行を評価した。ＣＤ２７Ｌ発現７８６−０細胞を、非複合体化型Ａｂ４およびＡｂ８ヒト抗ＣＤ２７Ｌ抗体、Ａｂ４−ＭＣＣ−ＤＭ１、Ａｂ８−ＭＣＣ−ＤＭ１、対照ＨｕＩｇＧ１、または対照αＳＡ−ＭＣＣ−ＤＭ１に暴露し、４℃で結合させた。被験物質の内部移行を、ＦｌｕｏｒｏＮａｎｏｇｏｌｄヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆａｂ’ Ａｌｅｘａ４８８を用いて評価した。細胞を、被験物質と共にインキュベーションした後の特定の時点において（時間＝０、１、３、および５時間）固定および透過処理し、ＡｒｒａｙＳｃａｎ ＶＴＩ ＨＣＳリーダーを用いてイメージングした。内部移行した被験物質のエンドソームへの局在化を、抗ＥＥＡ−１抗体（エンドソームマーカー）を用いて決定した。抗体（例えばＡｂ４−ＭＣＣ−ＤＭ１）の経時的な内部移行を、４℃、時点ゼロでの細胞膜局在と比較した、３７℃での細胞質内の点状スポット（punctate spot）の形成により、蛍光顕微鏡画像解析で観察した。３７℃で５時間インキュベートした後、Ａｂ４−ＭＣＣ−ＤＭ１はエンドソームマーカーのＥＥＡ−１と共局在していたが、これは、Ａｂ４−ＭＣＣ−ＤＭ１が７８６−０細胞のエンドソーム細胞内区画に内部移行していることを示すものである。内部移行のレベルおよび速度は、Ａｂ４、Ａｂ８およびそれらの複合体型カウンターパートと同様の範囲内にある（図２）。
Ａｂ４−ＭＣＣ−ＤＭ１およびＡｂ８−ＭＣＣ−ＤＭ１は共に、ＣＤ２７Ｌ発現腫瘍細胞の強力かつ特異的なインビトロ増殖阻害を示した。抗増殖（腫瘍増殖阻害）アッセイにおいて、Ａｂ４−ＭＣＣ−ＤＭ１、Ａｂ８−ＭＣＣ−ＤＭ１または非複合体型抗ＣＤ２７Ｌ Ａｂ４もしくはＡｂ８を、ＣＤ２７Ｌ発現７８６−０ルシフェラーゼまたはＣＤ２７Ｌ陰性Ｈ１６５０標的細胞と共に、それぞれ裸のＡｂ４もしくはＡｂ８、または対照ＨｕＩｇＧ１の存在下／非存在下において、４日間、インキュベートした。７８６−０ルシフェラーゼおよびＨ１６５０の両細胞株を、増殖培地と共に９６ウェル細胞培養プレートに播種し、１００μＬのウェルに、７８６−０ルシフェラーゼについては１ウェルあたり５００細胞、Ｈ１６５０については１ウェルあたり１０００細胞含ませた。全てのプレートを３７℃、５％ＣＯ２で４時間インキュベートした。４時間のインキュベーション後、裸のＡｂおよび複合体を種々の用量設定で１００μＬ／ウェルで細胞に加えた。培養開始時の各ウェル中の全量は２００μＬであった。細胞を３７℃、５％ＣＯ２で４日間連続的にインキュベートし、その後、細胞のＡＴＰレベルを測定した。細胞増殖阻害を評価するため、ＡＴＰレベル（細胞数の一つの指標として）を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏアッセイキットを用いる発光により測定した。
Ａｂ４−ＭＣＣ−ＤＭ１およびＡｂ８−ＭＣＣ−ＤＭ１は共に、ＣＤ２７Ｌ発現７８６−０細胞の細胞増殖を、表７に記載の５０％阻害濃度（ＩＣ５０）で阻害した。ＣＤ２７Ｌ陰性Ｈ１６５０細胞においては、Ａｂ４−ＭＣＣ−ＤＭ１およびＡｂ８−ＭＣＣ−ＤＭ１へ暴露した後に細胞増殖阻害は観察されなかった。過剰量の非複合体型親抗ＣＤ２７Ｌ抗体を添加することによって、Ａｂ４−ＭＣＣ−ＤＭ１介在性増殖阻害を遮断することができたが、このことにより、Ａｂ４−ＭＣＣ−ＤＭ１によるＣＤ２７Ｌ結合が活性に必要であることが確認された。非複合体型親抗ＣＤ２７Ｌ抗体はＣＤ２７Ｌ発現７８６−０細胞の増殖を阻害しなかった。対照複合体である抗ストレプトアビジン−ＭＣＣ−ＤＭ１（αＳＡ−ＭＣＣ−ＤＭ１）は、ＣＤ２７Ｌ陽性またはＣＤ２７Ｌ陰性細胞株のいずれにおいても、いかなる細胞増殖阻害も示さなかった。この結果は、Ａｂ４−ＭＣＣ−ＤＭ１およびＡｂ８−ＭＣＣ−ＤＭ１が共に、対照複合体と比較して、７８６−０細胞増殖の強力な阻害剤であることを示している（図３）。Ａｂ４−ＭＣＣ−ＤＭ１は作用強度においてＡｂ８−ＭＣＣ−ＤＭ１を上回るわずかな増加を示す傾向がある（表７）。
Figure 0006251678
Ａｂ４−ＭＣＣ−ＤＭ１は、非複合体型親Ａｂ４抗ＣＤ２７Ｌ抗体（ＥＣ５０＝０．０１μｇ／ｍＬ）で観察されたものと同様の作用強度（ＥＣ５０＝０．００６μｇ／ｍＬ）および規模で、Ｒａｊｉ細胞に対する抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介する。簡潔に説明すると、正常ヒト供血者から得られたＰＢＭＣから単離されたナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を、カルセイン標識ＲａｊｉヒトＢ細胞リンパ腫標的細胞（ＣＤ２７Ｌを発現）と共に、Ａｂ４−ＭＣＣ−ＤＭ１または対照抗体の存在下で、上記の通りにインキュベートした。特異的細胞毒性パーセント（％）を、対照ウェルと比較して、Ａｂ４−ＭＣＣ−ＤＭ１の存在下で溶解されたＣＤ２７Ｌ発現標的細胞からのカルセイン放出を測定することにより、決定した。結果を図８に示すが、この結果は、Ａｂ４−ＭＣＣ−ＤＭ１がＡｂ４抗体と同様のレベル（それぞれ０．００６μｇ／ｍＬおよび０．０１μｇ／ｍＬのＥＣ５０値）のＡＤＣＣを媒介したことを示している。ｈｕＩｇＧ１対照はＣＤ２７Ｌ発現標的の測定可能な溶解を全く媒介しなかった。Ａｂ４−ＭＣＣ−ＤＭ１および非複合体型Ａｂ４抗体は共に、同様のレベルで、ＣＤ２７Ｌ特異的標的のＮＫ細胞介在性ＡＤＣＣを誘導することができる。Ａｂ８−ＭＣＣ−ＤＭ１および非複合体型Ａｂ８抗体においても、同様の結果が観察された。
Ａｂ４−ＭＣＣ−ＤＭ１または非複合体型親抗体Ａｂ４のインビトロでの（vitro）抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）活性を、Ｒａｊｉおよび７８６−０腫瘍細胞の両方に対して測定した。Ａｂ４−ＭＣＣ−ＤＭ１は、非複合体型親抗体Ａｂ４で観察されたものと同様のレベルの補体介在性溶解を媒介した。簡潔に説明すると、正常ヒト供血者から得られたヒト末梢血から単離された単球から、マクロファージを分化させた。マクロファージを、標的細胞としてのＰＨＫ６７緑色標識ＣＤ２７Ｌ発現細胞株、７８６−０およびＲａｊｉと共に、非複合体型抗ＣＤ２７Ｌ抗体Ａｂ４、ＨｕＩｇＧ１、Ａｂ４−ＭＣＣ−ＤＭ１、または対照抗体（αＳＡ−ＭＣＣ−ＤＭ１）の存在下で、上記の通りにインキュベートした。腫瘍細胞食作用パーセント（％）を、選択された視野内の総マクロファージに対する、マクロファージによって貪食された腫瘍細胞の割合から決定した。結果を図９に示すが、この結果は、Ａｂ４−ＭＣＣ−ＤＭ１が、ＣＤ２７Ｌ発現細胞株、７８６−０およびＲａｊｉにおいて、同様のＡＤＣＰ作用強度を媒介したことを示している。非複合体型Ａｂ４のＥＣ５０値は、Ａｂ４−ＭＣＣ−ＤＭ１で観察されたものの１０倍以内であった（表８参照）。
Figure 0006251678
希釈曲線が１：４０の希釈間隔で行われたことを考慮すると、Ａｂ４−ＭＣＣ−ＤＭ１および複合体型Ａｂ４の両方において観察されるＥＣ５０は、同様の作用強度である（希釈因子の範囲内）。従って、複合体型Ａｂ４−ＭＣＣ−ＤＭ１および非複合体型ＷＴＡｂ４抗体は共に、ヒトマクロファージを誘導して、同様のレベルでＣＤ２７Ｌ発現細胞のＡＤＣＰを媒介することができる。Ａｂ８−ＭＣＣ−ＤＭ１および非複合体型Ａｂ８抗体においても同様の結果が確認された。
Ａｂ４−ＭＣＣ−ＤＭ１のインビトロ補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）活性を、ヒト補体およびウサギ補体の両方、並びにＣＤ２７Ｌ発現Ｒａｊｉ腫瘍細胞を使用して評価した。１０μｇ／ｍＬで、Ａｂ４−ＭＣＣ−ＤＭ１は、非複合体型親抗体Ａｂ４において観察されたものと同様のレベルの補体介在性溶解を媒介した（ウサギ補体では７２％溶解、およびヒト補体では１７％溶解）。簡潔に説明すると、活性化ウサギ補体または活性化ヒト補体を、ＣＤ２７Ｌ発現Ｒａｊｉ標的細胞と共に、抗ＣＤ２７Ｌ抗体または対照抗体の存在下で、上記の通りにインキュベートした。ＣＤＣ介在性殺傷を、「細胞毒性％」についての、Ｈｏｅｃｈｓｔに対するＰＩ陽性の％を検出するための、ＡｒｒａｙＳｃａｎリーダー「選択対象％」の出力機構から、測定した。この結果は、腫瘍Ｒａｊｉ細胞が１０％仔ウサギ補体または２０％ヒト補体と共にインキュベートされた場合、Ａｂ４−ＭＣＣ−ＤＭ１がＷＴＡｂ４抗体と同様のレベルのＣＤＣを媒介したことを示している。熱失活したウサギ補体またはヒト補体はＲａｊｉに対してＣＤＣ介在性殺傷を全く示さなかった。従って、Ａｂ４−ＭＣＣ−ＤＭ１および非複合体型Ａｂ４は共に、ＣＤ２７Ｌ発現腫瘍標的細胞に対して同様のレベルのＣＤＣ活性を誘導する。Ａｂ８−ＭＣＣ−ＤＭ１およいｂ非複合体型Ａｂ８抗体においても同様の結果が確認された。
インビボでの薬理
インビボ継代した７８６−０ ｃｃＲＣＣ細胞（７８６−０ Ｓ４）を、増殖因子を減少させたＭＡＴＲＩＧＥＬを用いて雌ＣＢ−１７／ＳＣＩＤマウスに移植し、有効性研究のための腫瘍異種移植片を作製した。７８６−０ Ｓ４細胞は平均しておよそ１８０，０００部位／細胞のＣＤ２７Ｌを発現する。腫瘍サイズが平均しておよそ２５０ｍｍ３に達してから、Ａｂ４−ＭＣＣ−ＤＭ１またはＡｂ８−ＭＣＣ−ＤＭ１による処置を開始した。担腫瘍動物を腫瘍サイズに応じてそれぞれ１０匹の動物から成る群に無作為に分け、静脈内投与を１回行った。この確立された腫瘍モデルにおいて、７〜６４μｇ ＤＭ１／ｋｇ（０．３〜２．５ｍｇ Ａｂ／ｋｇ）の範囲の用量を用いる、Ａｂ４−ＭＣＣ−ＤＭ１およびＡｂ８−ＭＣＣ−ＤＭ１の盲検化用量反応試験を行った。７μｇ ＤＭ１／ｋｇの低用量、２５μｇ ＤＭ１／ｋｇの中用量および６４μｇ ＤＭ１／ｋｇの高用量で、強い腫瘍縮小が観察された。中用量および高用量で、完全な退縮が単回投与後少なくとも２８日間維持された（図４）。試験過程を通じて、いずれの用量群においても体重減少したマウスは観察されなかった。
インビボ有効性の別の実証において、平均して５９，０００部位／細胞のＣＤ２７Ｌ（７８６−０細胞の１／３）を発現するＣａｋｉ−１ ｃｃＲＣＣ細胞を、上記の通りにＣＢ−１７／ＳＣＩＤマウスに移植した。Ｃａｋｉ−１異種移植片が平均サイズ２５０ｍｍ３に到達したら、担癌動物を腫瘍サイズに応じてそれぞれ１０匹の動物から成る群に無作為に分け、３週間に亘って週１回の静脈内投与を行った（週１回の臨床的投与計画をより正確に模倣するため）。この確立された腫瘍モデルにおいて、６０〜２７０μｇ ＤＭ１／ｋｇ（２．４〜１１ｍｇ Ａｂ／ｋｇ）の用量範囲を用いる、Ａｂ４−ＭＣＣ−ＤＭ１およびＡｂ８−ＭＣＣ−ＤＭ１の盲検化用量反応試験を行った。対照複合体またはビヒクルと比較して、腫瘍退縮が１２０μｇ ＤＭ１／ｋｇの中用量および２７０μｇ ＤＭ１／ｋｇの高用量で最初に観察されたが、腫瘍増殖阻害が６０μｇ ＤＭ１／ｋｇの低用量で観察された。時間の経過と共に、用量がより高い方の前記２群における腫瘍縮小は、最後に投与が行われてから７日以内に減少し始めた（図５）。
ｃｃＲＣＣ細胞と同様、Ｒａｊｉ Ｂリンパ腫細胞はＣＤ２７Ｌ（約２００，０００部位／細胞）を発現し、抗ＣＤ２７Ｌ薬剤複合体を内部移行させ、それによりインビトロにおいて有糸分裂停止および細胞死を引き起こす。Ａｂ４−ＭＣＣ−ＤＭ１を皮下Ｒａｊｉ異種移植片モデルにおける有効性について評価した。Ｒａｊｉ異種移植片が平均サイズ２５０ｍｍ３に到達したら、担腫瘍動物を腫瘍サイズに応じてそれぞれ１０匹の動物から成る群に無作為に分け、４日おきに２回（q4 days x 2）、その後週１回をさらに１週間、合計で３回の投与を静脈内投与した（週１回の臨床的投与計画をより正確に模倣するため）。この確立された腫瘍モデルにおいて、６０〜２７０μｇ ＤＭ１／ｋｇ（２．４〜１１ｍｇ Ａｂ／ｋｇ）の範囲の用量を用いるＡｂ４−ＭＣＣ−ＤＭ１の盲検化用量反応試験を行った。対照複合体と比較して、すべての用量レベルで腫瘍増殖阻害が観察され、アクティブな投与期間の間、１２０μｇ ＤＭ１／ｋｇの中用量および２７０μｇ ＤＭ１／Ｋｇの高用量で９０％超の腫瘍増殖阻害が観察され、６０μｇ ＤＭ１／ｋｇの低用量では中間の抗腫瘍反応が観察された（図６）。腫瘍測定期間の終わりに、中用量群および高用量群におけるわずかに半数を超える動物が腫瘍縮小を示し、このことは、用量およびスケジュールのさらなる最適化によって応答を向上させることができるであろうことを示している。
対照複合体αＳＡ−ＭＣＣ−ＤＭ１、またはＡｂ４−ＭＣＣ−ＤＭ１の異なる投与間隔の有効性を、７８６−０異種移植モデルにおいて評価した。ＣＢ−１７／ＳＣＩＤマウスに７８６−０腫瘍細胞を移植した。１３日目に、５０匹の動物を、２００ｍｍ３の平均腫瘍体積を有するそれぞれ１０匹の動物から成るコホートに無作為に分けた。各コホートに、対照複合体αＳＡ−ＭＣＣ−ＤＭ１またはＡｂ４−ＭＣＣ−ＤＭ１のいずれかを腹腔内投与した。腫瘍体積は群平均±平均値の標準誤差（ＳＥＭ）として表される。１３日目から５９日目までの増殖曲線間で観察された差異の統計的有意性を、対数変換した腫瘍体積データの反復測定共分散分析（repeated measures analysis of covariance：ＲＭＡＮＯＶＡ）をダネット修正済み多重比較とともに用いて評価した。ｐ＜０．０５である場合に有意性有りとなる。Ａｂ４−ＭＣＣ−ＤＭ１の３つの用量レベル（抗体に応じて１．０、２．０、もしくは２．９ｍｇ／ｋｇのＡｂ４−ＭＣＣ−ＤＭ１、またはＤＭ１等価物に応じてそれぞれ２５、５０、もしくは７５μｇ／ｋｇ）を投与した。１．０ｍｇ／ｋｇの用量を６週間に亘って週１回または２週間に１回投与し、２．０ｍｇ／ｋｇの用量を６週間に亘って２週間に１回投与し、２．９ｍｇ／ｋｇの用量を６週間に亘って３周間に１回投与した。腫瘍接種の１３日後から動物への腹腔内投与を開始した。５９日目までに、腫瘍体積が大きくなったためにαＳＡ−ＭＣＣ−ＤＭ１治療群は安楽死させた。５９日目、Ａｂ４−ＭＣＣ−ＤＭ１投与群の各用法で処置されたマウスの平均腫瘍体積は、αＳＡ−ＭＣＣ−ＤＭ１対照複合体群のそれを有意に下回った（ｐ＜０．０００１）（図７）。Ａｂ４−ＭＣＣ−ＤＭ１は各投与計画により持続的な腫瘍縮小を媒介した。Ａｂ４−ＭＣＣ−ＤＭ１処置群のいずれにおいても体重減少は観察されなかった。
薬物動態（pharmokinetics）
Ａｂ４およびＡｂ８抗体薬剤複合体を、ＣＤ２７Ｌ発現７８６−０異種移植片を有する雌ＣＢ−１７／ＳＣＩＤマウスへの静脈内投与の後に、有効性研究および続く終末ＰＫ試験において、評価した。累積暴露およびクリアランス値は、Ａｂ４−ＭＣＣ−ＤＭ１とＡｂ８−ＭＣＣ−ＤＭ１分子との間で１．３３倍以内および１．４倍以内であり、両ＡＤＣの半減期はマウスにおいておよそ１２日間であった。
Ａｂ４−ＭＣＣ−ＤＭ１およびＡｂ８−ＭＣＣ−ＤＭ１抗体薬剤複合体の安定性およびＰＫパラメーターを、７８６−０異種移植片を有するＣＢ−１７／ＳＣＩＤマウスに単回静脈内（ＩＶ）投与を行った後インビボで特徴付けした。その２つの抗体薬剤複合体の暴露はかなり類似していたが、Ａｂ４−ＭＣＣ−ＤＭ１はＡｂ８−ＭＣＣ−ＤＭ１分子が示したよりも、親和性−ＭＳにより決定された、試験の９６時間の経時変化の間に亘るより安定な薬剤−抗体複合体化比を示した。Ａｂ４−ＭＣＣ−ＤＭ１は注射後３０分または２４時間の時点においては複合体の完全性の検出可能な損失を示さなかったが、Ａｂ８−ＭＣＣ−ＤＭ１は３０分の時点で変化を示し、注射後２４時間までに全ての複合体種において有意な減少を示した。
実施例３−パラトープマッピング
ＣＤ２７Ｌへの結合性に関して、Ａｂ４への修飾をＥＬＩＳＡによって試験した。ＣＤ２７ＬをＭａｘｉｓｏｒｐプレートに、室温で２時間よりも長く、１００μＬ中１μｇ／ｍＬで振盪しながら結合させた。次にプレートを２５０μＬのＰＢＳ＋０．０５％トウィーン２０中１０％脱脂粉乳で２時間ブロッキングした。３００μＬのＰＢＳ＋０．０５％トウィーン２０（ＰＢＳＴ）での４回の洗浄の後、修飾Ａｂおよび精製された親対照（用量設定は０．０４５〜１００ｎｇ／ｍＬの範囲）をプレートに添加し、１時間インキュベートした。もう一回のＰＢＳＴ洗浄の後、１：７０００に希釈した西洋わさびペルオキシダーゼが複合体化したαｈｕＦｃ検出抗体（ジャクソン社（Jackson））をプレートに添加し、１時間インキュベートした。最後の洗浄を行い、ＴＭＢ基質を１０分間インキュベートし、リン酸で停止させた。ＯＤ読み取りを４５０ｎｍで行い、濃度に対してプロットした。次に、これらの曲線を３パラメーター非線形曲線適合で解析し、ＥＣ５０および最大算出シグナル（Max calculated signal）を精製対照と比較した。ＥＣ５０が２倍以内であり、最大シグナルが５０％より大きい場合に、結合性は親と類似しているものと決定された。ＥＣ５０が２倍超増加し、および／または最大シグナルが５０％未満である場合、結合性は低減した。曲線を作成することができないか、または最大シグナルが５％未満である場合、結合性は消失した。
Figure 0006251678
Ａｂ４に為された２４種の改変体組み合わせのうち１３種が、ＣＤ２７Ｌに対する、ある程度の結合性を保持した。ＣＤ２７Ｌに結合しなかった９種は以下のうち少なくとも１つを有していた：「Ｇ３３Ｓ−Ｉ３４Ｌ」および「Ｓ１０３Ｇ−Ｇ１０４Ｓ」重鎖改変体または「Ｎ３１Ｈ−Ｙ５８Ｎ」軽鎖改変体。９７％類似抗体（２アミノ酸改変）のうち、７５％（８中６）がある程度の結合性を保持し、一方９４％類似抗体（４アミノ酸改変）のうち５６％（１６中７）がある程度の結合性を保持し、そのうち２種が精製親対照と類似の結合性を有している。このことは、Ａｂ４に対する類似性が９４％と低い抗体が、ＣＤ２７Ｌとなお結合可能であることを示している。
配列表
配列番号1
ヒトCD27Lアミノ酸配列
MPEEGSGCSVRRRPYGCVLRAALVPLVAGLVICLVVCIQRFAQAQQQLPLESLGWDVAELQLNHTGPQQDPRLYWQGGPALGRSFLHGPELDKGQLRIHRDGIYMVHIQVTLAICSSTTASRHHPTTLAVGICSPASRSISLLRLSFHQGCTIASQRLTPLARGDTLCTNLTGTLLPSRNTDETFFGVQWVRP

配列番号2
ヒトCD27前駆体アミノ酸配列
MARPHPWWLCVLGTLVGLSATPAPKSCPERHYWAQGKLCCQMCEPGTFLVKDCDQHRKAAQCDPCIPGVSFSPDHHTRPHCESCRHCNSGLLVRNCTITANAECACRNGWQCRDKECTECDPLPNPSLTARSSQALSPHPQPTHLPYVSEMLEARTAGHMQTLADFRQLPARTLSTHWPPQRSLCSSDFIRILVIFSGMFLVFTLAGALFLHQRRKYRSNKGESPVEPAEPCHYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSP

配列番号3
Ab1重鎖コードヌクレオチド配列
CAGATGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCCTCACAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGATGGCTCCATCATCAGTGGTGTTTACTACTGGAGCTGGATCCGCCAGCACCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGATTGGATACATCTATTACAGTGGGAGCACCTCCTACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGACTTACCATGTCAGTAGACACGTCTAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACTGCCGCGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGGAGTGGATACAGCTATGCCCTCTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCCGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACcctGAGGTCAAGTTCAactGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA

配列番号4
Ab2重鎖コードヌクレオチド配列
CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCACAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTGACTCCATCATCAGTGGTGGTTACTACTGGAGCTGGATCCGCCAGCACCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGATTGGGTACATCTTTTACAGTGGGAGCACCGACTACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTTACCATATCAGTAGACACGTCTAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACTGCCGCGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAGGAGTGGATACAGCTATGCCCTCTTTGACCACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCCGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAatgCCAAGACAAagccgCGGGAGGAGCAGTACaaCAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGcACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA

配列番号5
Ab4重鎖コードヌクレオチド配列
caggtgcagctggtggagtctgggggaggcgtggtccagcctgggaggtccctgagactctcctgtgcagcgtctggattcaccttcagtaactatggcatacactgggtccgccaggctccaggcaaggggctggagtgggtggcagttatatggtatgatggaagtaataaatactatgcagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggctgtgtattactgtgcgagagatggaggatatagtggctacgattcggggtttgactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcctcagctagcaccaagggcccatccgtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctatagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga

配列番号6
Ab5重鎖コードヌクレオチド配列
caggtgcagctggtgcagtctggggctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctggatacaccttcaccagttatgatatcaactgggtgcgacaggccactggacaagggcttgagtggatgggatggatgaaccctaacagtggtaacacaggctatgcacagaagttccagggcagagtcaccatgaccaggaacacctccataagcacagcctacatggagctgagcagcctgagatctgaggacacggccgtgtattactgtgcgagagggtacgatttttggagtggttattactactactactacggtatggacgtctggggccaagggaccacggtcaccgtctcctcagctagcaccaagggcccatccgtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagagagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctatagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga

配列番号7
Ab6重鎖コードヌクレオチド配列
caggttcagctggtgcagtctggagctgaggtgaagaagcctggggcctcagtgaaggtctcctgcaaggcttctggttacacctttaccagctatggtatcagctgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatgggatggatcagcgcttacaatggttacacacactatgcacagaagctccagggcagagtcaccatgaccacagacacatccacgagcacagcctacatggagctgaggagcctgagatctgacgacacggccgtgtattactgtgcgagagactacggtggtaacgactactacggtatggacgtctggggccaagggaccacggtcaccgtctcctcagctagcaccaagggcccatccgtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagagagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctatagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga

配列番号8
Ab7重鎖コードヌクレオチド配列
caggtgcagctggtggagtctgggggaggcgtggtccagcctgggaggtccctgagactctcctgtgcagcgtctggattcaccttcagtacctatggcatgcactgggtccgccaggctccaggcaaggggctggagtgggtggcagttatatggtatgatggaagtaataaatactatggagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggctgtgtattactgtgcgagagataacagtcactactactacggtatggacgtctggggccaagggaccacggtcaccgtctcctcagctagcaccaagggcccatccgtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagagagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctatagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa

配列番号9
Ab8重鎖コードヌクレオチド配列
caggtgcagctggtggagtctgggggaggcgtggtccagcctgggaggtccctgagactctcctgtgcagcgtctggattcaccttcagtagctatggcatgcactgggtccgccaggctccaggcaaggggctggagtgggtggcagttatatggtatgatggaagtgataaatactttgcagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggctgtgtattactgtgcgagagatgggatagcaggagctcgctacgtctactttgactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcctcagctagcaccaagggcccatccgtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggaggagatgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctatagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa

配列番号10
Ab1重鎖アミノ酸配列
QMQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSDGSIISGVYYWSWIRQHPGKGLEWIGYIYYSGSTSYNPSLKSRLTMSVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARSGYSYALFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

配列番号11
Ab2重鎖アミノ酸配列
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGDSIISGGYYWSWIRQHPGKGLEWIGYIFYSGSTDYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARSGYSYALFDHWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

配列番号12
Ab4重鎖アミノ酸配列
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSNYGIHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGGYSGYDSGFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

配列番号13
Ab5重鎖アミノ酸配列
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYDINWVRQATGQGLEWMGWMNPNSGNTGYAQKFQGRVTMTRNTSISTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGYDFWSGYYYYYYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

配列番号14
Ab6重鎖アミノ酸配列
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWISAYNGYTHYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARDYGGNDYYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

配列番号15
Ab7重鎖アミノ酸配列
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSTYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKYYGDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDNSHYYYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

配列番号16
Ab8重鎖アミノ酸配列
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSDKYFADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGIAGARYVYFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

配列番号17
Ab1重鎖可変ドメインアミノ酸配列
QMQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSDGSIISGVYYWSWIRQHPGKGLEWIGYIYYSGSTSYNPSLKSRLTMSVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARSGYSYALFDYWGQGTLVTVSS

配列番号18
Ab2重鎖可変ドメインアミノ酸配列
QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGDSIISGGYYWSWIRQHPGKGLEWIGYIFYSGSTDYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARSGYSYALFDHWGQGTLVTVSS

配列番号19
Ab3重鎖可変ドメインアミノ酸配列
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSVISDSGGTTDYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHDYSNRYYFDYWGQGTLVTVSS

配列番号20
Ab4重鎖可変ドメインアミノ酸配列
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSNYGIHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGGYSGYDSGFDYWGQGTLVTVSS

配列番号21
Ab5重鎖可変ドメインアミノ酸配列
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYDINWVRQATGQGLEWMGWMNPNSGNTGYAQKFQGRVTMTRNTSISTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGYDFWSGYYYYYYGMDVWGQGTTVTVSS

配列番号22
Ab6重鎖可変ドメインアミノ酸配列
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWISAYNGYTHYAQKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARDYGGNDYYGMDVWGQGTTVTVSS

配列番号23
Ab7重鎖可変ドメインアミノ酸配列
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSTYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKYYGDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDNSHYYYGMDVWGQGTTVTVSS

配列番号24
Ab8重鎖可変ドメインアミノ酸配列
QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSDKYFADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGIAGARYVYFDYWGQGTLVTVSS

配列番号25
Ab1重鎖CDR1アミノ酸配列
SGVYYWS

配列番号26
Ab2重鎖CDR1アミノ酸配列
SGGYYWS

配列番号27
Ab3重鎖CDR1アミノ酸配列
SYAMS

配列番号28
Ab4重鎖CDR1アミノ酸配列
NYGIH

配列番号29
Ab5重鎖CDR1アミノ酸配列
SYDIN

配列番号30
Ab6重鎖CDR1アミノ酸配列
SYGIS

配列番号31
Ab7重鎖CDR1アミノ酸配列
TYGMH

配列番号32
Ab8重鎖CDR1アミノ酸配列
SYGMH

配列番号33
Ab1重鎖CDR2アミノ酸配列
YIYYSGSTSYNPSLKS

配列番号34
Ab2重鎖CDR2アミノ酸配列
YIFYSGSTDYNPSLKS

配列番号35
Ab3重鎖CDR2アミノ酸配列
VISDSGGTTDYADSVKG

配列番号36
Ab4重鎖CDR2アミノ酸配列
VIWYDGSNKYYADSVKG

配列番号37
Ab5重鎖CDR2アミノ酸配列
WMNPNSGNTGYAQKFQG

配列番号38
Ab6重鎖CDR2アミノ酸配列
WISAYNGYTHYAQKLQG

配列番号39
Ab7重鎖CDR2アミノ酸配列
VIWYDGSNKYYGDSVKG

配列番号40
Ab8重鎖CDR2アミノ酸配列
VIWYDGSDKYFADSVKG

配列番号41
Ab1重鎖CDR3アミノ酸配列
SGYSYALFDY

配列番号42
Ab2重鎖CDR3アミノ酸配列
SGYSYALFDH

配列番号43
Ab3重鎖CDR3アミノ酸配列
HDYSNRYYFDY

配列番号44
Ab4重鎖CDR3アミノ酸配列
DGGYSGYDSGFDY

配列番号45
Ab5重鎖CDR3アミノ酸配列
GYDFWSGYYYYYYGMDV

配列番号46
Ab6重鎖CDR3アミノ酸配列
DYGGNDYYGMDV

配列番号47
Ab7重鎖CDR3アミノ酸配列
DNSHYYYGMDV

配列番号48
Ab8重鎖CDR3アミノ酸配列
DGIAGARYVYFDY

配列番号49
Ab1軽鎖コードヌクレオチド配列
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTTTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCGTTGACAGATATTTCAATTGGTATCAGCAGAAACCTGGGAAAGCCCCTAAGGTCCTGATCTTTGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCGGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGAGCTACAGTACCCCGTGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAGTCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT

配列番号50
Ab2軽鎖コードヌクレオチド配列
GACATCCAGATGACCCAGTCCCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCCGGGCAAGTCAGTTCATTGGCAGATATTTCAATTGGTATCAGCAGCAACCAGGGAAAGCCCCTAAGGTCCTGATCTATGCTGAATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGATTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGAATTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAAGATACTACTGTCAACAGAGTTACAGTACCCCGTGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT

配列番号51
Ab4軽鎖コードヌクレオチド配列
gatattgtgatgactcagtctccactctccctgcccgtcacccctggagagccggcctccatctcctgcaggtctagtcagagcctcctgaatagtaatggatacaactatttggattggtacctgcagaagccagggcagtctccacagttcctgatctatttgggttcttatcgggcctccggggtccctgacaggttcagtggcagtggatcaggcacagattttacactgagaatcagcagagtggaggctgaggatgttggggtttattactgtatacaaactctacaaactccattcactttcggccctgggaccaaagtggatatcaaacgtacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgttag

配列番号52
Ab5軽鎖コードヌクレオチド配列
gaaattgtgttgacgcagtctcctggcaccctgtctttgtctccaggggaaagagccaccctctcctgcagggccagtcagagtgttagcagcagctacttagcctggtaccagcagagacctggccaggctcccaggctcctcatctatggtgcatccagcagggccactggcatcccagacaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcactctcaccatcagcagtctggagcctgaagattttgcagtgtattactgtctgcagtctggtagctctgtcccgctcactttcggcggagggaccaaggtggagatcaaacgtacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgttaa

配列番号53
Ab6軽鎖コードヌクレオチド配列
cagtctgtgctgactcagccaccctcagcgtctgggacccccgggcagagggtcaccatctcttgttctggaagcagctccaacatcggaattaattatgtatactggtaccagcagctcccaggaacggcccccaaactcctcatctataggagtgatcagcggccctcaggggtccctgaccgattctctggctccaagtctggcacctcagcctccctggccctcagtgggctccggtccgaggatgaggctgattattactgtgcagcatgggatgacagcctgagtggtgtggtgttcggcggagggaccaagctgaccgtcctaggccaaccgaaagcggcgccctcggtcactctgttcccgccctcctctgaggagcttcaagccaacaaggccacactggtgtgtctcataagtgacttctacccgggagccgtgacagtggcctggaaggcagatagcagccccgtcaaggcgggagtggagaccaccacaccctccaaacaaagcaacaacaagtacgcggccagcagctatctgagcctgacgcctgagcagtggaagtcccacagaagctacagctgccaggtcacgcatgaagggagcaccgtggagaagacagtggcccctacagaatgttcatag

配列番号54
Ab7軽鎖コードヌクレオチド配列
CAGTCTGTGCTGACGCAGCCGCCCTCAGTGTCTGGGGCCCCAGGGCAGAGGGTCACCATCTCCTGCACTGGGAGCAGCTCCAACATCGGGGCAGGTTATGATGTAAATTGGTATCAGCAGTTCCCAGGAACAGCCCCCAAACTCCTCATCTATGTTAACAACAATCGGCCCTCAGGAGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCACGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCACTGGACTCCAGGCTGAGGATGAGGCTGATTATTACTGCCAGTCCTATGACACCAGCCTGAGTGCTTCGGTATTCGGCGGAGGGACCAGACTGACCGTCCTAGGCCAACCGAAAGCGGCGCCCTCGGTCACTCTGTTCCCGCCCTCCTCTGAGGAGCTTCAAGCCAACAAGGCCACACTGGTGTGTCTCATAAGTGACTTCTACCCGGGAGCCGTGACAGTGGCCTGGAAGGCAGATAGCAGCCCCGTCAAGGCGGGAGTGGAGACCACCACACCCTCCAAACAAAGCAACAACAAGTACGCGGCCAGCAGCTATCTGAGCCTGACGCCTGAGCAGTGGAAGTCCCACAGAAGCTACAGCTGCCAGGTCACGCATGAAGGGAGCACCGTGGAGAAGACAGTGGCCCCTACAGAATGTTCA

配列番号55
Ab8軽鎖コードヌクレオチド配列
gacatccagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgtcgggcgagtcagggcattagcaattatttagcctggtttcagcagaaaccagggaaagcccctaagtccctgatctatgctgcatccagtttgcaaggtggggtcccatcaaagttcagcggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagcctgcagcctgaagattttgcaacttattactgccaacaatattataattacccattcactttcggccctgggaccacagtggatatcaaacgtacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgttag

配列番号56
Ab1軽鎖アミノ酸配列
DIQMTQSPSSLSASLGDRVTITCRASQSVDRYFNWYQQKPGKAPKVLIFAASSLQSGVPSRFGGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPWTFGQGTKVEVKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

配列番号57
Ab2軽鎖アミノ酸配列
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTISCRASQFIGRYFNWYQQQPGKAPKVLIYAESSLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFARYYCQQSYSTPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

配列番号58
Ab4軽鎖アミノ酸配列
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLNSNGYNYLDWYLQKPGQSPQFLIYLGSYRASGVPDRFSGSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCIQTLQTPFTFGPGTKVDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

配列番号59
Ab5軽鎖アミノ酸配列
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQRPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCLQSGSSVPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

配列番号60
Ab6軽鎖アミノ酸配列
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGINYVYWYQQLPGTAPKLLIYRSDQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLALSGLRSEDEADYYCAAWDDSLSGVVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS

配列番号61
Ab7軽鎖アミノ酸配列
QSVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVNWYQQFPGTAPKLLIYVNNNRPSGVPDRFSGSTSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDTSLSASVFGGGTRLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS

配列番号62
Ab8軽鎖アミノ酸配列
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWFQQKPGKAPKSLIYAASSLQGGVPSKFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYNYPFTFGPGTTVDIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

配列番号63
Ab1軽鎖可変ドメインアミノ酸配列
DIQMTQSPSSLSASLGDRVTITCRASQSVDRYFNWYQQKPGKAPKVLIFAASSLQSGVPSRFGGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPWTFGQGTKVEVK

配列番号64
Ab2軽鎖可変ドメインアミノ酸配列
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTISCRASQFIGRYFNWYQQQPGKAPKVLIYAESSLQSGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFARYYCQQSYSTPWTFGQGTKVEIK

配列番号65
Ab3軽鎖可変ドメインアミノ酸配列
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSFSSNYLAWYQQKPGQAPRLFIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYFCQQYGISPCSFGQGTKLEIK

配列番号66
Ab4軽鎖可変ドメインアミノ酸配列
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLNSNGYNYLDWYLQKPGQSPQFLIYLGSYRASGVPDRFSGSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCIQTLQTPFTFGPGTKVDIK

配列番号67
Ab5軽鎖可変ドメインアミノ酸配列
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQRPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCLQSGSSVPLTFGGGTKVEIK

配列番号68
Ab6軽鎖可変ドメインアミノ酸配列
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGINYVYWYQQLPGTAPKLLIYRSDQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLALSGLRSEDEADYYCAAWDDSLSGVVFGGGTKLTVL

配列番号69
Ab7軽鎖可変ドメインアミノ酸配列
QSVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVNWYQQFPGTAPKLLIYVNNNRPSGVPDRFSGSTSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDTSLSASVFGGGTRLTVL

配列番号70
Ab8軽鎖可変ドメインアミノ酸配列
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWFQQKPGKAPKSLIYAASSLQGGVPSKFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYNYPFTFGPGTTVDIK

配列番号71
Ab1軽鎖CDR1アミノ酸配列
RASQSVDRYFN

配列番号72
Ab2軽鎖CDR1アミノ酸配列
RASQFIGRYFN

配列番号73
Ab3軽鎖CDR1アミノ酸配列
RASQSFSSNYLA

配列番号74
Ab4軽鎖CDR1アミノ酸配列
RSSQSLLNSNGYNYLD

配列番号75
Ab5軽鎖CDR1アミノ酸配列
RASQSVSSSYLA

配列番号76
Ab6軽鎖CDR1アミノ酸配列
SGSSSNIGINYVY

配列番号77
Ab7軽鎖CDR1アミノ酸配列
TGSSSNIGAGYDVN

配列番号78
Ab8軽鎖CDR1アミノ酸配列
RASQGISNYLA

配列番号79
Ab1軽鎖CDR2アミノ酸配列
AASSLQS

配列番号80
Ab2軽鎖CDR2アミノ酸配列
AESSLQS

配列番号81
Ab3軽鎖CDR2アミノ酸配列
GASSRAT

配列番号82
Ab4軽鎖CDR2アミノ酸配列
LGSYRAS

配列番号83
Ab5軽鎖CDR2アミノ酸配列
GASSRAT

配列番号84
Ab6軽鎖CDR2アミノ酸配列
RSDQRPS

配列番号85
Ab7軽鎖CDR2アミノ酸配列
VNNNRPS

配列番号86
Ab8軽鎖CDR2アミノ酸配列
AASSLQG

配列番号87
Ab1軽鎖CDR3アミノ酸配列
QQSYSTPWT

配列番号88
Ab2軽鎖CDR3アミノ酸配列
QQSYSTPWT

配列番号89
Ab3軽鎖CDR3アミノ酸配列
QQYGISPCS

配列番号90
Ab4軽鎖CDR3アミノ酸配列
IQTLQTPFT

配列番号91
Ab5軽鎖CDR3アミノ酸配列
LQSGSSVPLT

配列番号92
Ab6軽鎖CDR3アミノ酸配列
AAWDDSLSGVV

配列番号93
Ab7軽鎖CDR3アミノ酸配列
QSYDTSLSASV

配列番号94
Ab8軽鎖CDR3アミノ酸配列
QQYYNYPFT

Claims (133)

  1. 軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含むＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質であって、
    ａ）軽鎖可変ドメインが配列番号７１に記載のＬＣＤＲ１；配列番号７９に記載のＬＣＤＲ２配列；および配列番号８７に記載のＬＣＤＲ３配列を含み；重鎖可変ドメインが配列番号２５に記載のＨＣＤＲ１；配列番号３３に記載のＨＣＤＲ２配列；および配列番号４１に記載のＨＣＤＲ３配列を含む；
    ｂ）軽鎖可変ドメインが配列番号７２に記載のＬＣＤＲ１；配列番号８０に記載のＬＣＤＲ２配列；および配列番号８８に記載のＬＣＤＲ３配列を含み；重鎖可変ドメインが配列番号２６に記載のＨＣＤＲ１；配列番号３４に記載のＨＣＤＲ２配列；および配列番号４２に記載のＨＣＤＲ３配列を含む；
    ｃ）軽鎖可変ドメインが配列番号７３に記載のＬＣＤＲ１；配列番号８１に記載のＬＣＤＲ２配列；および配列番号８９に記載のＬＣＤＲ３配列を含み；重鎖可変ドメインが配列番号２７に記載のＨＣＤＲ１；配列番号３５に記載のＨＣＤＲ２配列；および配列番号４３に記載のＨＣＤＲ３配列を含む；
    ｄ）軽鎖可変ドメインが配列番号７４に記載のＬＣＤＲ１；配列番号８２に記載のＬＣＤＲ２配列；および配列番号９０に記載のＬＣＤＲ３配列を含み；重鎖可変ドメインが配列番号２８に記載のＨＣＤＲ１；配列番号３６に記載のＨＣＤＲ２配列；および配列番号４４に記載のＨＣＤＲ３配列を含む；
    ｅ）軽鎖可変ドメインはｄ）に規定されるがＲ２４Ｋ−Ｓ２６Ｇ変異を有し、重鎖可変ドメインは、ｄ）に規定されるがＮ３１Ｓ−Ｉ３４Ｍ変異を有する；
    ｆ）軽鎖可変ドメインはｄ）に規定されるがＲ２４Ｋ−Ｓ２６Ｇ変異を有し、重鎖可変ドメインはｄ）に規定される；
    ｇ）軽鎖可変ドメインはｄ）に規定されるがＬ５５Ｉ−Ｙ５８Ｆ変異を有し、重鎖可変ドメインはｄ）に規定される；
    ｈ）軽鎖可変ドメインはｄ）に規定されるがＱ９５Ｎ−Ｔ９６Ｓ変異を有し、重鎖可変ドメインはｄ）に規定されるがＮ３１Ｓ−Ｉ３４Ｍ変異を有する；
    ｉ）軽鎖可変ドメインはｄ）に規定されるがＱ９５Ｎ−Ｔ９６Ｓ変異を有し、重鎖可変ドメインはｄ）に規定される；
    ｊ）軽鎖可変ドメインが配列番号７５に記載のＬＣＤＲ１；配列番号８３に記載のＬＣＤＲ２配列；および配列番号９１に記載のＬＣＤＲ３配列を含み；重鎖可変ドメインが配列番号２９に記載のＨＣＤＲ１；配列番号３７に記載のＨＣＤＲ２配列；および配列番号４５に記載のＨＣＤＲ３配列を含む；
    ｋ）軽鎖可変ドメインが配列番号７６に記載のＬＣＤＲ１；配列番号８４に記載のＬＣＤＲ２配列；および配列番号９２に記載のＬＣＤＲ３配列を含み；重鎖可変ドメインが配列番号３０に記載のＨＣＤＲ１；配列番号３８に記載のＨＣＤＲ２配列；および配列番号４６に記載のＨＣＤＲ３配列を含む；
    ｌ）軽鎖可変ドメインが配列番号７７に記載のＬＣＤＲ１；配列番号８５に記載のＬＣＤＲ２配列；および配列番号９３に記載のＬＣＤＲ３配列を含み；重鎖可変ドメインが配列番号３１に記載のＨＣＤＲ１；配列番号３９に記載のＨＣＤＲ２配列；および配列番号４７に記載のＨＣＤＲ３配列を含む；または
    ｍ）軽鎖可変ドメインが配列番号７８に記載のＬＣＤＲ１；配列番号８６に記載のＬＣＤＲ２配列；および配列番号９４に記載のＬＣＤＲ３配列を含み；重鎖可変ドメインが配列番号３２に記載のＨＣＤＲ１；配列番号４０に記載のＨＣＤＲ２配列；および配列番号４８に記載のＨＣＤＲ３配列を含む；
    前記ＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質。
  2. 軽鎖可変ドメインが配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、もしくは配列番号７０に記載のアミノ酸配列に対し少なくとも９５％の同一性を有する、請求項１に記載のＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質。
  3. 重鎖可変ドメインが配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、もしくは配列番号２４に記載のアミノ酸配列に対し少なくとも９５％の同一性を有する、請求項１または２に記載のＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質。
  4. ａ）配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、もしくは配列番号７０に記載のアミノ酸配列から１０を超えないアミノ酸の付加、欠失または置換を有する軽鎖可変ドメイン；
    ｂ）配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、もしくは配列番号２４に記載のアミノ酸配列から１０を超えないアミノ酸の付加、欠失または置換を有する重鎖可変ドメイン；または
    ｃ）ａ）の軽鎖可変ドメインおよびｂ）の重鎖可変ドメイン；
    を含む、請求項１に記載のＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質。
  5. 軽鎖可変ドメインが配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、もしくは配列番号７０に記載のアミノ酸配列から５を超えないアミノ酸の付加、欠失または置換を有する、請求項４に記載のＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質。
  6. 重鎖可変ドメインが配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、もしくは配列番号２４に記載のアミノ酸配列から５を超えないアミノ酸の付加、欠失または置換を有する、請求項４または５に記載のＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質。
  7. 軽鎖可変ドメインが配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９、もしくは配列番号７０に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載のＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質。
  8. 重鎖可変ドメインが配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、もしくは配列番号２４に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載のＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質。
  9. ａ）配列番号６３に記載の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列および配列番号１７に記載の重鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む；
    ｂ）配列番号６４に記載の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列および配列番号１８に記載の重鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む；
    ｃ）配列番号６５に記載の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列および配列番号１９に記載の重鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む；
    ｄ）配列番号６６に記載の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列および配列番号２０に記載の重鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む；
    ｅ）配列番号６７に記載の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列および配列番号２１に記載の重鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む；
    ｆ）配列番号６８に記載の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列および配列番号２２に記載の重鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む；
    ｇ）配列番号６９に記載の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列および配列番号２３に記載の重鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む；または
    ｈ）配列番号７０に記載の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列および配列番号２４に記載の重鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む；
    請求項１〜８のいずれか一項に記載のＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質。
  10. 抗原結合タンパク質がＣＤ２７ＬのＣＤ２７への結合を阻害する、請求項１〜９のいずれか一項に記載のＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質。
  11. 抗原結合タンパク質が抗体である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質。
  12. 抗体がヒト抗体である、請求項１１に記載のＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質。
  13. 軽鎖および重鎖を含み、前記軽鎖が配列番号５６に記載のアミノ酸配列を含み、前記重鎖が配列番号１０に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載のＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質。
  14. 軽鎖および重鎖を含み、前記軽鎖が配列番号５７に記載のアミノ酸配列を含み、前記重鎖が配列番号１１に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載のＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質。
  15. 軽鎖および重鎖を含み、前記軽鎖が配列番号５８に記載のアミノ酸配列を含み、前記重鎖が配列番号１２に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載のＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質。
  16. 軽鎖および重鎖を含み、前記軽鎖が配列番号５９に記載のアミノ酸配列を含み、前記重鎖が配列番号１３に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載のＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質。
  17. 軽鎖および重鎖を含み、前記軽鎖が配列番号６０に記載のアミノ酸配列を含み、前記重鎖が配列番号１４に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載のＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質。
  18. 軽鎖および重鎖を含み、前記軽鎖が配列番号６１に記載のアミノ酸配列を含み、前記重鎖が配列番号１５に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載のＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質。
  19. 軽鎖および重鎖を含み、前記軽鎖が配列番号６２に記載のアミノ酸配列を含み、前記重鎖が配列番号１６に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載のＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質。
  20. 二重特異性抗体であることを特徴とする、請求項１〜１９のいずれか一項に記載のＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質。
  21. 二重特異性抗体が、ＣＤ３であるヒトエフェクター細胞抗原およびＣＤ２７Ｌに結合することを特徴とする、請求項２０に記載のＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質。
  22. 抗体断片であることを特徴とする、請求項１〜２１に記載のＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質。
  23. 抗体断片が、Ｆ（ａｂ）；ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなるＦａｂ断片；Ｆ（ａｂ’）；Ｆ（ａｂ’）２；Ｆｖ；単鎖抗体のＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片；ｄＡｂ断片；単鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）；二重特異性単鎖Ｆｖダイマー；ダイアボディならびにトリアボディから選択される、請求項２２に記載のＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質。
  24. ＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質が化学療法剤に結合している、請求項１〜２３のいずれか一項に記載のＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質。
  25. リンカーが化学療法剤をＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質に結合させる、請求項２４に記載のＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質。
  26. リンカーが切断不可なリンカーである、請求項２５に記載のＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質。
  27. リンカーがＭＣＣを含む、請求項２６に記載のＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質。
  28. 化学療法剤がＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質のポリペプチドに含まれる一つまたは複数のリジンと結合している、請求項２５〜２７のいずれか一項に記載のＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質。
  29. 化学療法剤がＤＭ１である、請求項２４〜２８のいずれか一項に記載のＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質。
  30. ＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質あたりのＤＭ１分子の平均数が１〜１０個である、請求項２９に記載のＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質の組成物。
  31. ＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質あたりのＤＭ１分子の平均数が３〜７個である、請求項３０に記載のＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質の組成物。
  32. ＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質あたりのＤＭ１分子の平均数が４〜６個である、請求項３１に記載のＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質の組成物。
  33. ＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質あたりのＤＭ１分子の平均数が、約４．０、約４．１、約４．２、約４．３、約４．４、約４．５、約４．６、約４．７、約４．８、約４．９、約５．０、約５．１、約５．２、約５．３、約５．４、約５．５、約５．６、約５．７、約５．８、約５．９、または約６．０である、請求項３１に記載のＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質の組成物。
  34. 組成物が治療有効量のＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質を含む医薬組成物である、請求項３０〜３３のいずれか一項に記載のＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質の組成物。
  35. 医薬組成物が凍結乾燥されている、請求項３４に記載のＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質の組成物。
  36. ｉ）配列番号７１に記載の配列を有するＬＣＤＲ１；配列番号７９に記載の配列を有するＬＣＤＲ２；および配列番号８７に記載の配列を有するＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号２５に記載の配列を有するＨＣＤＲ１；配列番号３３に記載の配列を有するＨＣＤＲ２；および配列番号４１に記載の配列を有するＨＣＤＲ３を含む重鎖可変ドメイン；
    ｉｉ）配列番号７２に記載の配列を有するＬＣＤＲ１；配列番号８０に記載の配列を有するＬＣＤＲ２；および配列番号８８に記載の配列を有するＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号２６に記載の配列を有するＨＣＤＲ１；配列番号３４に記載の配列を有するＨＣＤＲ２；および配列番号４２に記載の配列を有するＨＣＤＲ３を含む重鎖可変ドメイン；
    ｉｉｉ）配列番号７３に記載の配列を有するＬＣＤＲ１；配列番号８１に記載の配列を有するＬＣＤＲ２；および配列番号８９に記載の配列を有するＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号２７に記載の配列を有するＨＣＤＲ１；配列番号３５に記載の配列を有するＨＣＤＲ２；および配列番号４３に記載の配列を有するＨＣＤＲ３を含む重鎖可変ドメイン；
    ｉｖ） 配列番号７４に記載の配列を有するＬＣＤＲ１；配列番号８２に記載の配列を有するＬＣＤＲ２；および配列番号９０に記載の配列を有するＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号２８に記載の配列を有するＨＣＤＲ１；配列番号３６に記載の配列を有するＨＣＤＲ２；および配列番号４４に記載の配列を有するＨＣＤＲ３を含む重鎖可変ドメイン；
    ｖ）ｉｖ）に規定されるが、Ｒ２４Ｋ−Ｓ２６Ｇ変異、Ｌ５５Ｉ−Ｙ５８Ｆ変異またはＱ９５Ｎ−Ｔ９６Ｓ変異を有する軽鎖可変ドメイン、およびｉｖ）に規定されるが、Ｎ３１Ｓ−Ｉ３４Ｍ変異を有する重鎖可変ドメイン；
    ｖｉ） 配列番号７５に記載の配列を有するＬＣＤＲ１；配列番号８３に記載の配列を有するＬＣＤＲ２；および配列番号９１に記載の配列を有するＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号２９に記載の配列を有するＨＣＤＲ１；配列番号３７に記載の配列を有するＨＣＤＲ２；および配列番号４５に記載の配列を有するＨＣＤＲ３を含む重鎖可変ドメイン；
    ｖｉｉ）配列番号７６に記載の配列を有するＬＣＤＲ１；配列番号８４に記載の配列を有するＬＣＤＲ２；および配列番号９２に記載の配列を有するＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号３０に記載の配列を有するＨＣＤＲ１；配列番号３８に記載の配列を有するＨＣＤＲ２；および配列番号４６に記載の配列を有するＨＣＤＲ３を含む重鎖可変ドメイン；
    ｖｉｉｉ）配列番号７７に記載の配列を有するＬＣＤＲ１；配列番号８５に記載の配列を有するＬＣＤＲ２；および配列番号９３に記載の配列を有するＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号３１に記載の配列を有するＨＣＤＲ１；配列番号３９に記載の配列を有するＨＣＤＲ２；および配列番号４７に記載の配列を有するＨＣＤＲ３を含む重鎖可変ドメイン；または
    ｉｘ）配列番号７８に記載の配列を有するＬＣＤＲ１；配列番号８６に記載の配列を有するＬＣＤＲ２；および配列番号９４に記載の配列を有するＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変ドメイン、および配列番号３２に記載の配列を有するＨＣＤＲ１；配列番号４０に記載の配列を有するＨＣＤＲ２；および配列番号４８に記載の配列を有するＨＣＤＲ３を含む重鎖可変ドメイン
    を含むＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質の一つまたは複数のポリペプチド成分をコードする単離核酸。
  37. ポリペプチドが抗体軽鎖を含む、請求項３６に記載の単離核酸。
  38. 軽鎖が、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、または配列番号５５に記載のヌクレオチド配列に少なくとも９０％同一のヌクレオチド配列を含む核酸にコードされる、請求項３７に記載の単離核酸。
  39. 軽鎖が、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、または配列番号５５に記載のヌクレオチド配列に少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含む核酸にコードされる、請求項３８に記載の単離核酸。
  40. 軽鎖が、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、または配列番号５５に記載のヌクレオチド配列を含む核酸にコードされる、請求項３９に記載の単離核酸。
  41. ポリペプチドが抗体重鎖を含む、請求項３６に記載の単離核酸。
  42. 重鎖が、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、または配列番号９に記載のヌクレオチド配列に少なくとも９０％同一のヌクレオチド配列を含む核酸にコードされる、請求項４１に記載の単離核酸。
  43. 重鎖が、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、または配列番号９に記載のヌクレオチド配列に少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を含む核酸にコードされる、請求項４２に記載の単離核酸。
  44. 重鎖が、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、または配列番号９に記載のヌクレオチド配列を含む核酸にコードされる、請求項４３に記載の単離核酸。
  45. 請求項３６〜４４のいずれか一項に記載の単離核酸を含む、発現ベクター。
  46. 単離核酸が抗体軽鎖をコードする、請求項４５に記載の発現ベクター。
  47. 単離核酸が抗体重鎖をコードする、請求項４５に記載の発現ベクター。
  48. 抗体重鎖をコードする単離核酸をさらに含む、請求項４６に記載の発現ベクター。
  49. プロモーターに機能的に連結した請求項３６〜４４のいずれか一項に記載の単離核酸を含む、組換え宿主細胞。
  50. 請求項４６または４７に記載の発現ベクターを含む、組換え宿主細胞。
  51. 宿主細胞が請求項４６または４７に記載の発現ベクターを含む、請求項５０に記載の組換え宿主細胞。
  52. 宿主細胞がＣＤ２７Ｌと結合する抗体を分泌する、請求項５１に記載の組換え宿主細胞。
  53. 細胞が哺乳類起源である、請求項４９〜５２のいずれか一項に記載の組換え宿主細胞。
  54. 細胞がチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株である、請求項５３に記載の組換え宿主細胞。
  55. ＣＤ２７Ｌ抗体薬剤複合体の作製方法であって、
    ａ）請求項１〜２３のいずれか一項に記載のＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質を準備するステップ；
    ｂ）ＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質をリンカーに結合させるステップ；および
    ｃ）薬剤を前記リンカーに結合させるステップ、
    を含む、作製方法。
  56. ＣＤ２７Ｌ抗体薬剤複合体の作製方法であって、
    ａ）請求項１〜２３のいずれか一項に記載のＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質を準備するステップ；および
    ｂ）薬剤に共有結合したリンカーを前記ＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質に結合させるステップ、
    を含む、作製方法。
  57. ＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質が抗体である、請求項５５または５６に記載の方法。
  58. 抗体が、配列番号６３に記載の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列および配列番号１７に記載の重鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む、請求項５７に記載の方法。
  59. 抗体がＡｂ１である、請求項５８に記載の方法。
  60. 抗体が、配列番号６４に記載の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列および配列番号１８に記載の重鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む、請求項５７に記載の方法。
  61. 抗体がＡｂ２である、請求項６０に記載の方法。
  62. 抗体が、配列番号６５に記載の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列および配列番号１９に記載の重鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む、請求項５７に記載の方法。
  63. 抗体がＡｂ３である、請求項６２に記載の方法。
  64. 抗体が、配列番号６６に記載の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列および配列番号２０に記載の重鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む、請求項５７に記載の方法。
  65. 抗体がＡｂ４である、請求項６４に記載の方法。
  66. 抗体が、配列番号６７に記載の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列および配列番号２１に記載の重鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む、請求項５７に記載の方法。
  67. 抗体がＡｂ５である、請求項６６に記載の方法。
  68. 抗体が、配列番号６８に記載の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列および配列番号２２に記載の重鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む、請求項５７に記載の方法。
  69. 抗体がＡｂ６である、請求項６８に記載の方法。
  70. 抗体が、配列番号６９に記載の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列および配列番号２３に記載の重鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む、請求項５７に記載の方法。
  71. 抗体がＡｂ７である、請求項７０に記載の方法。
  72. 抗体が、配列番号７０に記載の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列および配列番号２４に記載の重鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む、請求項５７に記載の方法。
  73. 抗体がＡｂ８である、請求項７２に記載の方法。
  74. リンカーがＭＣＣを含む、請求項５５〜７３のいずれか一項に記載の方法。
  75. 薬剤がＤＭ１を含む、請求項５５〜７４のいずれか一項に記載の方法。
  76. 治療有効量の請求項１〜２３のいずれか一項に記載のＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質を含む、がんの治療用医薬組成物。
  77. ＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質が抗体である、請求項７６に記載の医薬組成物。
  78. 抗体が配列番号６３に記載の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列および配列番号１７に記載の重鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む、請求項７７に記載の医薬組成物。
  79. 抗体がＡｂ１である、請求項７８に記載の医薬組成物。
  80. 抗体が配列番号６４に記載の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列および配列番号１８に記載の重鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む、請求項７７に記載の医薬組成物。
  81. 抗体がＡｂ２である、請求項８０に記載の医薬組成物。
  82. 抗体が配列番号６５に記載の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列および配列番号１９に記載の重鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む、請求項７７に記載の医薬組成物。
  83. 抗体がＡｂ３である、請求項８２に記載の医薬組成物。
  84. 抗体が配列番号６６に記載の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列および配列番号２０に記載の重鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む、請求項７７に記載の医薬組成物。
  85. 抗体がＡｂ４である、請求項８４に記載の医薬組成物。
  86. 抗体が配列番号６７に記載の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列および配列番号２１に記載の重鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む、請求項７７に記載の医薬組成物。
  87. 抗体がＡｂ５である、請求項８６に記載の医薬組成物。
  88. 抗体が、配列番号６８に記載の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列および配列番号２２に記載の重鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む、請求項７７に記載の医薬組成物。
  89. 抗体がＡｂ６である、請求項８８に記載の医薬組成物。
  90. 抗体が、配列番号６９に記載の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列および配列番号２３に記載の重鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む、請求項７７に記載の医薬組成物。
  91. 抗体がＡｂ７である、請求項９０に記載の医薬組成物。
  92. 抗体が、配列番号７０に記載の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列および配列番号２４に記載の重鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む、請求項７７に記載の医薬組成物。
  93. 抗体がＡｂ８である、請求項９２に記載の医薬組成物。
  94. 医薬組成物が抗体を含む、請求項７７〜９３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  95. 抗体が、増強されたエフェクター機能を含む、請求項９４に記載の医薬組成物。
  96. 医薬組成物が抗体薬剤複合体の集団を含む、請求項９５に記載の医薬組成物。
  97. 抗体薬剤複合体がＭＣＣリンカーを含む、請求項９６に記載の医薬組成物。
  98. 抗体薬剤複合体がＤＭ１を含む、請求項９６または９７に記載の医薬組成物。
  99. 抗体あたりのＤＭ１分子の平均数が１〜１０個である、請求項９８に記載の医薬組成物。
  100. 抗体あたりのＤＭ１分子の平均数が３〜７個である、請求項９９に記載の医薬組成物。
  101. 抗体あたりのＤＭ１分子の平均数が４〜６個である、請求項１００に記載の医薬組成物。
  102. 抗体あたりのＤＭ１分子の平均数が約４．０、約４．１、約４．２、約４．３、約４．４、約４．５、約４．６、約４．７、約４．８、約４．９、約５．０、約５．１、約５．２、約５．３、約５．４、約５．５、約５．６、約５．７、約５．８、約５．９、または約６．０個である、請求項１００に記載の医薬組成物。
  103. 患者から得られた試料をＣＤ２７Ｌ発現について検査する、請求項７６〜１０２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  104. 試料をＣＤ２７Ｌ ｍＲＮＡ発現について検査する、請求項１０３に記載の医薬組成物。
  105. 試料をＣＤ２７Ｌタンパク質発現について検査する、請求項１０３に記載の医薬組成物。
  106. 試料が血液試料である、請求項１０３〜１０５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  107. 試料が生検試料である、請求項１０３〜１０５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  108. がんが、腎細胞癌（ＲＣＣ）、明細胞ＲＣＣ、頭頸部がん、グリア芽腫、乳がん、脳腫瘍、鼻咽腔癌（nasopharangeal carcinoma）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、バーキットリンパ腫、未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）、多発性骨髄腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、結節性小切れ込み核細胞リンパ腫（nodular small cleaved-cell lymphoma）、リンパ球性リンパ腫、末梢性Ｔ細胞リンパ腫、レナートリンパ腫、免疫芽球性リンパ腫、Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬＬ）、成人Ｔ細胞白血病（Ｔ−ＡＬＬ）、中心芽細胞性（centroblastic）／中心細胞性（ｃｂ／ｃｃ）濾胞性リンパ腫がん、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（diffuse large cell lymphoma of B lineage）、血管免疫芽球性リンパ節症（ＡＩＬＤ）様Ｔ細胞リンパ腫、ＨＩＶ関連原発性滲出液リンパ腫（HIV associated body cavity based lymphoma）、胎生期癌、鼻咽腔未分化癌（undifferentiated carcinoma of the rhino-pharynx）、キャッスルマン病、カポジ肉腫、多発性骨髄腫、ワルデンストローム・マクログロブリン血症または他のＢ細胞リンパ腫である、請求項７６〜１０７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  109. がんがＲＣＣである、請求項１０８に記載の医薬組成物。
  110. がんがＮＨＬである、請求項１０８に記載の医薬組成物。
  111. がんがＣＬＬである、請求項１０８に記載の医薬組成物。
  112. 治療有効量の請求項１〜２３のいずれか一項に記載のＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質を含む、自己免疫性疾患または炎症性疾患の治療用医薬組成物。
  113. ＣＤ２７Ｌ抗原結合タンパク質が抗体である、請求項１１２に記載の医薬組成物。
  114. 抗体が配列番号６３に記載の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列および配列番号１７に記載の重鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む、請求項１１３に記載の医薬組成物。
  115. 抗体がＡｂ１である、請求項１１４に記載の医薬組成物。
  116. 抗体が配列番号６４に記載の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列および配列番号１８に記載の重鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む、請求項１１３に記載の医薬組成物。
  117. 抗体がＡｂ２である、請求項１１６に記載の医薬組成物。
  118. 抗体が配列番号６５に記載の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列および配列番号１９に記載の重鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む、請求項１１３に記載の医薬組成物。
  119. 抗体がＡｂ３である、請求項１１８に記載の医薬組成物。
  120. 抗体が配列番号６６に記載の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列および配列番号２０に記載の重鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む、請求項１１３に記載の医薬組成物。
  121. 抗体がＡｂ４である、請求項１２０に記載の医薬組成物。
  122. 抗体が配列番号６７に記載の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列および配列番号２１に記載の重鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む、請求項１１３に記載の医薬組成物。
  123. 抗体がＡｂ５である、請求項１２２に記載の医薬組成物。
  124. 抗体が配列番号６８に記載の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列および配列番号２２に記載の重鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む、請求項１１３に記載の医薬組成物。
  125. 抗体がＡｂ６である、請求項１２４に記載の医薬組成物。
  126. 抗体が配列番号６９に記載の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列および配列番号２３に記載の重鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む、請求項１１３に記載の医薬組成物。
  127. 抗体がＡｂ７である、請求項１２６に記載の医薬組成物。
  128. 抗体が配列番号７０に記載の軽鎖可変ドメインアミノ酸配列および配列番号２４に記載の重鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む、請求項１１３に記載の医薬組成物。
  129. 抗体がＡｂ８である、請求項１２８に記載の医薬組成物。
  130. 抗原結合タンパク質がＣＤ２７のＣＤ２７Ｌへの結合を阻害する、請求項１１２に記載の医薬組成物。
  131. 自己免疫性疾患または炎症性疾患が、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、多発性硬化症（ＭＳ）、乾癬、自己免疫性甲状腺炎、関節リウマチ（ＲＡ）、または糸球体腎炎である、請求項１１２〜１３０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  132. 治療によって患者における移植拒絶反応が阻害または予防される、請求項１１２〜１３１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  133. 治療によって移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）が阻害または予防される、請求項１１２〜１３２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
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