MX2014003482A - Proteinas de union al antigeno cd27l. - Google Patents

Proteinas de union al antigeno cd27l.

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Abstract

La presente invención se refiere a proteínas, tales como anticuerpos, de unión al antígeno CD27L, los polinucleótidos que codifican dichas proteínas de unión al antígeno CD27L, composiciones de conjugados anticuerpo-fármaco, y métodos para diagnosticar y tratar enfermedades asociadas con la expresión de CD27L.

Description

PROTEINAS DE UNIÓN AL ANTÍGENO CD27L CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se refiere a composiciones de proteínas de unión al antígeno que incluyen anticuerpos capaces de unirse a CD27L, así como a métodos relacionados.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN CD27L (CD70, TNFSF7) es una proteína integral de membrana de tipo II, cuya expresión en tejidos normales está altamente restringida a ¦ un subconjunto de células T y D activadas, a las células dendríticas y a un pequeño subconjunto de células' en el epitelio tímico. Las funciones biológicas de CD27L, las cuales incluyen aumento o regulación de la respuesta inmunitarias , son mediadas por la unión a su receptor, CD27, el' cual se expresa predominantemente en células linfoides. Las interacciones CD27L/CD27 regulan la proliferación y diferenciación de las células B, y la coestimulación/activación de las células T. La ruptura de la interacción CD27L/CD27 en ratones deficientes en CD27 no resulta en ningún fenotipo en ausencia de un desafío inmunológico (Grewal, Expert Opin. Ther. Targets. 12, 341-351 (2008) ) .
Además de su expresión muy restringida en tejidos normales, CD27L se expresa en niveles relativamente altos en algunos tumores del subtipo linfoma no Hodgkin de células B (B-NHL) , en la leucemia linfocitica aguda (ALL) pre-B y en la leucemia linfocitica crónica de células B (B-CLL) . También se observa una expresión aberrante de CD27L en carcinoma de células renales (RCC) pero no en ríñones normales u otros tejidos. Por tanto, CD27L, exhibe propiedades que concuerdan de manera aproximada con . las de un "antígeno tumor-específico" (Grewal, Expert Opin. Ther. Targets. 12, 341-351 (2008) ) .
Cada año, de un total aproximado de 49000 pacientes que desarrollarán RCC en los Estados Unidos de América, poco más de 40000 serán diagnosticados con ccRCC (American Cáncer Society: Cáncer Facts and Figures final (2008) ) . Aunque se han aprobado terapias nuevas para RCC en los últimos 4 años, la esperanza de sobrevida de 5 años para pacientes con RCC metastásico se limita a apenas un 10-20% (National Caner Institute. SEER cáncer statístics fact sheet : cáncer of the kidney and renal pelvis -- accessed 2008) manteniéndose una importante necesidad médica no cubierta. En Estados Unidos de América, el número anual proyectado de nuevos pacientes diagnosticados con ccRCC que se espera que expresen CD27L, es aproximadamente 36000. Actualmente hay una estimación de 64000 pacientes con la enfermedad ccRCC activa.
De los tumores malignos de células B reportados que expresan de forma aberrante CD27L, el subconjunto B-NHL de linfoma de células grandes difusas (DLBCL) y el linfoma folicular (FL) muestran la mayor incidencia de expresión, en el rango de 33% para FL a 71% para DLBCL, según evaluaciones de IHC en secciones congeladas utilizando un anticuerpo validado (Lens et al -Brit . J. Hematol. 106, 491-503 (1999). El 50-89 % de los tumores de B-CLL también expresan CD27L según evaluaciones de IHC en secciones de tumores congeladas o por citometria de flujo en células tumorales en circulación (Ranheim et al., Blood 85, 3556-3565 (1965); Trentin et al., Cáncer «es. 57, 4940-4947 (1997)).
De los 127000 pacientes de los Estados Unidos de América, que actualmente presentan B-NHL activo, aproximadamente el 50% .presenta el subtipo DLBCL (grado intermedio) ( orton et al., Blood 107, 2.65-276 (2002)).. A pesar de la terapia dé cuidados estándar para pacientes con DLBCL, Rituxan plus ciclofosfamida, adriamicina, vincristina, prednisona (CHOP), casi 50% recae. Por tanto, en esta enfermedad persiste' otra importante necesidad médica sin cubrir.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN La invención da a conocer proteínas de unión al antígeno anti-CD27L, por ejemplo, anticuerpos y fragmentos funcionales de éstos. Las proteínas de unión al antígeno anti-CD27L son particularmente útiles en los métodos para el tratamiento de enfermedades y trastornos, asociados con la proliferación de células aberrantes, por- ejemplo, cáncer, y/o con la inflamación.
En un primer aspecto, la proteína de unión al antígeno CD27L comprende a) un dominio variable de cadena ligera que posee al menos 90%: de identidad, al menos 95% de identidad, o es idéntico a la secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, o SEQ ID NO: 70; b) un dominio variable de cadena pesada que posee al menos 90% de identidad, al menos 95% de identidad, o es idéntico a la secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID NO:17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO:20, SEQ ID 0:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, o SEQ ID NO:24; o c) el dominio variable de cadena ligera a) y el dominio variable de cadena pesada de b) . · Las proteínas de unión al antígeno preferidas del primer aspecto comprenden aquellas que comprenden un dominio variable de cadena ligera que posee al menos 90%, al menos 95%, o es idéntico a la secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID NO: 63 y un dominio variable de cadena pesada que posee al menos 90%, al menos^ 95%, o es idéntico a la secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID NO: 17; aquellas que comprenden un dominio variable de cadena ligera que posee al menos 90%, al menos 95%, o es- idéntico a la secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID NO: 64 y un dominio variable de cadena pesada que posee al menos 90%, al menos 95%, o es idéntico a la secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID NO: 1.8; aquellas que comprenden un dominio variable de cadena ligera que posee al menos 90%, al menos 95%, o es idéntico a la secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID NO: 65 y un dominio variable de cadena pesada que posee al menos 90%, al menos 95%, o es idéntico a la secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID NO: 19; aquellas que comprenden un dominio variable de cadena -ligera que posee al menos 90%, al menos 95%, o es idéntico a la secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID NO:66 y un dominio variable de cadena pesada que posee al menos 90%, al menos 95%, o es idéntico a la secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID NO: 20; aquellas que comprenden un dominio variable de cadena ligera que posee al menos 90%, al menos 95%, o es idéntico a la secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID NO: 67 y un dominio variable de cadena pesada que posee al menos 90%, al menos 95%, o es idéntico a la secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID NO: 21; aquellas que comprenden un dominio variable de cadena ligera que posee al menos 90%, al menos 95%, o es idéntico a la secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID NO: 68 y un dominio variable de cadena pesada que posee al menos 90%, al menos 95%, o es idéntico a la secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID NO: 22; aquellas que comprenden un dominio variable de cadena ligera que posee al menos 90%, al menos 95%, o es idéntico a la secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID NO: 69 y un dominio variable de cadena pesada que posee al menos 90%, al menos 95.%, o es idéntico a la secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID NO: 23; y aquellas que comprenden un dominio variable de cadena ligera que posee al menos 90%, al menos 95%, o es idéntico a la secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID NO: 70 y un dominio variable de cadena pesada que posee al menos 90%, al menos 95%, o es idéntico a la secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID NO:24.
En un segundo aspecto, la proteina de unión al antigeno CD27L comprende a) un dominio variable de cadena ligera que posee no más de diez o no más de cinco adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO: 69, o SEQ ID NO: 70; b) un dominio variable de cadena pesada que posee no más de diez o no más de cinco adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID N0:21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, o SEQ ID NO: 24; o c) el dominio variable de cadena ligera a) y el dominio variable de cadena pesada de b) .
Las proteínas de unión al antígeno preferidas del segundo aspecto comprende aquellas que comprenden un dominio variable de cadena ligera que posee no más de diez o no más de. cinco adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID NO: 63 y un dominio variable de cadena pesada que posee no más de diez o no más de cinco adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID NO: 17; aquellas que comprenden un dominio variable de cadena ligera que posee no más de diez o no más de cinco adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID NO: 64 y un dominio variable de cadena pesada que posee no más de diez o no más de cinco adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID NO: 18; aquellas que comprenden un dominio variable de cadena ligera que posee no más de diez o no más de cinco adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID NO: 65 y un dominio variable de cadena pesada que posee no más de diez o no más de cinco adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID NO: 19; aquellas que comprenden un dominio variable de cadena ligera que posee no más de diez o no más de cinco adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID NO: 66 y un dominio variable de cadena pesada que posee no más de diez o no más de cinco adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID NO: 20; aquellas que comprenden un dominio variable de cadena ligera que posee no más de diez o no más de cinco adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID NO: 67 y un dominio variable de cadena pesada que posee no más de diez o no más de cinco adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID NO:21; aquellas que comprenden un dominio variable de cadena ligera que posee no más de diez o no más de cinco adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID NO: 68 y un dominio variable de cadena pesada que posee no más de diez o no más de cinco adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID NO: 22; aquellas que comprenden un dominio variable de cadena ligera que posee no más de diez o no más de cinco adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID NO: 69 y un dominio variable de cadena pesada que posee no más de diez Q no más de cinco adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID NO: 23; y aquellas que comprenden un dominio variable de cadena ligera que posee no más de diez o no más de cinco adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID NO: 70 y un dominio variable de cadena pesada que posee no más de diez o no más de cinco adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID NO: 24.
En un tercer aspecto, la proteina de unión al antigeno CD27L contiene un dominio variable de cadena ligera que comprende a) una LCDRl que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de LCDRl descrita en SEQ ID NO: 71; una LCDR2 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de LCDR2 descrita en SEQ ID NO: 79; y una LCDR3 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de LCDR3 descrita en SEQ ID NO:87; b) una LCDRl que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de LCDRl descrita en SEQ ID NO: 72; una LCDR2 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de LCDR2 descrita en SEQ ID NO:80; y una LCDR3 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de LCDR3 descrita en SEQ ID NO: 88; c) una LCDRl que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de LCDRl descrita en SEQ ID NO: 73; una LCDR2 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de LCDR2 descrita en . SEQ ID NO: 81; y una LCDR3 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia .de LCDR3 descrita en SEQ ID NO: 89; d) una LCDRl que posee' no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de LCDRl descrita en SEQ ID NO:74; una LCDR2 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de LCDR2 descrita en SEQ ID NO:82; y una LCDR3 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de LCDR3 descrita en SEQ ID NO: 90; e) una LCDRl que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de LCDRl descrita en SEQ ID NO: 75; una LCDR2 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de LCDR2 descrita en SEQ ID NO: 83; y una LCDR3 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de LCDR3 descrita en SEQ ID NO: 91; f) una LCDRl que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de LCDRl descrita en SEQ ID NO: 76; una LCDR2 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de LCDR2 descrita en SEQ ID NO: 84; y una LCDR3 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de LCDR3 descrita en SEQ ID NO: 92; q) una LCDRl que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de LCDRl descrita en SEQ ID NO: 77; una LCDR2 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de LCDR2 descrita en SEQ ID NO: 85; y una LCDR3 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de LCDR3 descrita en SEQ ID NO: 93; o h) una LCDR1 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de LCDR1 descrita en SEQ ID NO: 78; una LCDR2 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de LCDR2 descrita en SEQ ID NO: 86; y una LCDR3 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de LCDR3 descrita en SEQ ID NO: 94; y un dominio variable de cadena pesada que comprende i) una HCDR1 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de HCDR1 descrita en SEQ ID NO: 25; una HCDR2 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de HCDR2 descrita en SEQ ID NO:33; y una HCDR3 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de HCDR3 descrita en SEQ ID NO: 1; j) una HCDR1 que posee no más de. tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de HCDR1 descrita en SEQ ID NO: 26; una HCDR2 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de HCDR2 descrita en SEQ ID NO: 34; y una HCDR3 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de HCDR3 descrita en SEQ ID NO:42; k) una HCDR1 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de .HCDR1 descrita en SEQ ID NO: 27; una HCDR2 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de HCDR2 descrita en SEQ ID NO: 35; y una HCDR3 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de HCDR3 descrita en SEQ ID NO: 43; 1) una HCDR1 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de HCDR1 descrita en SEQ ID NO:28; una HCDR2 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de HCDR2 descrita en SEQ ID NO: 36; y una HCDR3 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de HCDR3 descrita en SEQ ID NO: 44; m) una HCDR1 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de HCDR1 descrita en SEQ ID NO: 29; una HCDR2 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de HCDR2 descrita en SEQ ID NO:37; y una HCDR3 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de HCDR3 descrita en SEQ ID NO: 5; n) una HCDR1 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de HCDR1 descrita en SEQ ID NO: 30; una HCDR2 que posee . no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de HCDR2 descrita en SEQ ID NO: 38; y una HCDR3 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de HCDR3 descrita en SEQ ID NO: 46; o) una HCDR1 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de HCDR1 descrita en SEQ ID NO: 31; una HCDR2 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de HCDR2 descrita en SEQ ID NO:39; y una HCDR3 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de HCDR3 descrita en SEQ ID NO: 7; o p) una HCDR1 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de HCDR1 descrita en SEQ ID NO: 32; una HCDR2 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de HCDR2 descrita en SEQ ID NO: 40; y una HCDR3 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de HCDR3 descrita en SEQ ID NO: 48.
Las proteínas de unión al antígeno CD27L preferidas del tercer aspecto incluyen aquellas que comprenden el dominio variable de cadena ligera a) y el dominio variable.de cadena pesada de i) ; aquellas que comprenden el dominio variable de cadena ligera b) y el¦ dominio variable de cadena pesada de j); aquellas que comprenden el dominio variable de cadena ligera c) y el dominio variable de cadena pesada de k) ; aquellas que comprenden el dominio variable de cadena ligera d) y el dominio variable de cadena pesada de 1); aquellas que comprenden el dominio variable de cadena ligera e) y el dominio variable de cadena pesada de m) ; aquellas que comprenden el dominio variable de cadena ligera f) y el dominio variable de cadena pesada de n) ; aquellas que comprenden el dominio variable de cadena ligera g). y el dominio variable de cadena pesada de o) ; y aquellas que comprenden el dominio variable de cadena ligera h) y el dominio variable de cadena pesada de p) .
En un cuarto aspecto de la invención, la proteína de unión al antígeno CD27L del aspecto primero, segundo o tercero se une a CD27L humana con una afinidad de menos de o igual a 2 x 1CT11 M.
En un quinto aspecto de la invención, la proteína de unión al antígeno CD27L del aspecto primero, segundo, tercero o cuarto inhibe la unión de CD27L a CD27.
En un sexto aspecto de la invención, la proteína de unión al antígeno CD27L del aspecto primero, segundo, tercero, cuarto o quinto es un anticuerpo, tal como un anticuerpo humano. Los anticuerpos preferidos incluyen aquellos anticuerpos que comprenden una cadena ligera que posee la secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID: 56 y una cadena pesada que posee la secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID NO:10; aquellos que comprenden una cadena ligera que posee la secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID: 57 y una cadena pesada que posee la secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID NO: 11; aquellos que comprenden una cadena ligera que posee la secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID: 58 y una cadena pesada que posee la secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID NO: 12; aquellos que comprenden una cadena ligera que posee la secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID: 59 y una cadena pesada que posee la secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID NO: 13; aquellos que comprenden una cadena ligera que posee la secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID: 60 y una cadena pesada que posee la secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID NO: 14; aquellos que comprenden una cadena ligera que posee la secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID: 61 y una cadena pesada que posee la secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID NO: 15; y aquellos que comprenden una cadena ligera que posee la secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID: 62 y una cadena pesada que posee la secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID NO: 16.
En un séptimo aspecto, la proteína de unión al antígeno CD27L del aspecto primero, segundo, tercero, cuarto, quinto o sexto se conjuga con · un fármaco o un agente quimioterapéutico. En modalidades preferidas, el fármaco el agente quimioterapéutico se conjuga con una proteína de unión al antígeno, por ejemplo un anticuerpo, mediante un conector. Los conectores preferidos incluyen conectores no vulnerables a la escisión, tales como MCC. Un agente quimioterapéutico preferido es DM1. Por tanto, en modalidades particularmente preferidas, el séptimo aspecto da a conocer una proteína de unión al antígeno CD27L del aspecto primero, segundo, tercero, cuarto, quinto o sexto conjugada a DM1 mediante un conector MCC fijado a uno o más de sus residuos lisina.
El proceso de conjugar DM1 a una proteína de unión al antígeno CD27L, por ejemplo un anticuerpo, produce una composición que comprende una población de anticuerpos conjugados a DMlque poseen un rango de moléculas DM1 por anticuerpo. Es posible medir un número promedio para la composición. En modalidades preferidas, el número promedio de moléculas DM1. por proteína de unión al antígeno CD27L, por ejemplo un anticuerpo, se encuentra entre 1 y 10, entre 3 y 7, o entre 4 y 6. En modalidades preferidas, la composición de proteínas de unión al antígeno CD27L del aspecto primero, segundo, tercero, cuarto, quinto, sexto o séptimo de la presente invención posee un número promedio de moléculas DM1 por proteína de unión. al antigeno ' CD27L de alrededor de 4.0, alrededor de 4 alrededor de 4.2, alrededor de 4.3, alrededor de 4 • 4, alrededor de 4.5, alrededor de 4.6, alrededor de 4 • 7, alrededor de 4.8, alrededor de 4.9, alrededor de 5 • 0, . alrededor de 5.1, alrededor de 5.2, alrededor de 5 .3, alrededor de 5.4, alrededor de 5.5, alrededor de 5 ,6, alrededor de 5.7, alrededor de 5.8, alrededor de 5. 9, o alrededor de 6.0. Dicha composición puede contener una cantidad terapéuticamente efectiva de la proteína de unión al antigeno CD27L y puede estar liofilizada .
En un octavo aspecto, la invención da a conocer ácidos nucleicos aislados que codifican para uno o más componentes polipeptídicos de una proteína de unión al antigeno CD27L, por ejemplo, una cadena ligera de un anticuerpo o una cadena pesada de un anticuerpo. En modalidades preferidas el ácido nucleico codifica un pqlipéptido que comprende: a) un dominio variable de cadena ligera que posee al menos 95% de identidad con la secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID NO:63, SEQ ID NO: -6.4, SEQ ID NO:65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, o SEQ ID NO: 70; b) un dominio variable de cadena pesada que posee al menos 95% de identidad con la secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID N0:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, o SEQ ID NO: 24; c) un dominio variable de cadena ligera que posee no más de cinco adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, o SEQ ID NO: 70; d) un dominio variable de cadena pesada que posee no más de cinco adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID N0:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, o SEQ ID NO:24; e) un dominio variable de cadena ligera que comprende: i) una LCDR1 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de LCDR1 descrita en SEQ ID NO: 71; una LCDR2 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de LCDR2 descrita en SEQ ID NO: 79; y una LCDR3 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de LCDR3 descrita en SEQ ID NO: 87; ii) una LCDR1 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de LCDRl descrita en SEQ ID NO: 72; una LCDR2 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de LCDR2 descrita en SEQ ID NO: 80; y una LCDR3 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de LCDR3 descrita en SEQ ID NO: 88; iii) una LCDRl que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de LCDRl descrita en SEQ ID NO: 73; una LCDR2 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de LCDR2 descrita en SEQ ID NO: 81; y una LCDR3 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos · a partir de la secuencia de LCDR3 descrita en SEQ ID NO: 89; iv) una LCDRl que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de LCDRl descrita en SEQ ID NO: 74; una LCDR2 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de LCDR2 descrita en SEQ ID NO:82; y una LCDR3 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de LCDR3 descrita en SEQ ID NO: 90; v) una LCDRl que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de LCDRl descrita en SEQ ID NO: 75; una LCDR2 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de LCDR2 descrita en SEQ ID NO:.83; y una LCDR3 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de LCDR3 descrita en SEQ ID NO: 91; vi) una LCDRl que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de LCDR1 descrita en SEQ ID NO: 76; una LCDR2 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de LCDR2 descrita en SEQ ID NO:84; y una LCDR3 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir . de la secuencia de LCDR3 descrita en SEQ ID NO: 92; vii) una LCDRl que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de LCDRl descrita en SEQ ID NO:77; una LCDR2 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de LCDR2 descrita en SEQ ID NO: 85; y una LCDR3 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de LCDR3 descrita en SEQ ID NO: 93/ o viii) una LCDR1 que. posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de LCDR1 descrita en SEQ ID NO:78; una LCDR2 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de LCDR2 descrita en SEQ ID NO:86; y una LCDR3 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de LCDR3 descrita en SEQ ID NO:94; o f) un dominio variable de cadena pesada que comprende: i) una HCDR1 que posee no. más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de HCDR1 descrita en SEQ ID NO: 25; una HCDR2 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de HCDR2 descrita en SEQ ID NO: 33; y una HCDR3 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de HCDR3 descrita en SEQ ID NO: 41; ii) una HCDRl que posee -no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de HCDRl descrita en SEQ ID NO:26; una HCDR2 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de HCDR2 descrita en SEQ ID NO: 34; y una HCQR3 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de HCDR3 descrita en SEQ ID NO: 42; iii) una HCDRl que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de HCDRl descrita en SEQ ID NO: 27; una HCDR2 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de HCDR2 descrita en SEQ ID NO: 35; y una HCDR3 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de HCDR3 desqrita en SEQ ID NO:43; iv) una HCDRl que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de HCDRl descrita en SEQ ID NO: 28; una HCDR2 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de HCDR2 descrita en SEQ ID NO: 36; y una HCDR3 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de HCDR3 descrita en SEQ ID NO: 44; v) una HCDRl que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de HCDR1 descrita en SEQ ID NO:29; una HCDR2 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de HCDR2 descrita en SEQ ID NO:37; y una HCDR3' que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de HCDR3 descrita en SEQ ID NO: 45; vi) una HCDRl que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de HCDRl descrita en SEQ ID N0:30; una HCDR2 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de HCDR2 descrita en SEQ ID NO: 38; y una HCDR3 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de HCDR3 descrita en SEQ ID NO:46; víi) una HCDRl que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de HCDRl descrita en SEQ ID NO: 31; una HCDR2 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de HCDR2 descrita en SEQ ID NO: 39; y una HCDR3 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de HCDR3 descrita en SEQ ID NO: 7; o viii) una HCDR1 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de HCDR1 descrita . en SEQ ID NO:32; una HCDR2 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de HCDR2 descrita en SEQ ID NO: 40; y una HCDR3 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de HCDR3 descrita en SEQ ID NO: 48.
En ciertas . modalidades del octavo aspecto, el polipéptido codifica para una cadena ligera de un anticuerpo y es al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, o 100% idéntico a la secuencia de nucleótidos descrita en SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54 , o SEQ ID NO: 55. En otras modalidades del octavo aspecto, el polipéptido codifica para una cadena pesada de un anticuerpo y es al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, o 00% idéntico a la secuencia de nucleótidos descrita en SEQ ID NO:3,' SEQ ID NO:4, SEQ ID ,NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO : 7 , SEQ ID NO : 8 ; o SEQ ID NO:9.
En un noveno aspecto, la invención da a conocer un vector de expresión que comprende uno o más ácidos, nucleicos aislados del octavo aspecto. En ciertas modalidades, el vector de expresión codifica para una cadena ligera de un anticuerpo, una cadena pesada de un anticuerpo, o tanto una cadena ligera como una cadena pesada de un anticuerpo.
En un décimo aspecto, la invención da a conocer una célula huésped recombinante que comprende uno o más ácidos nucleicos aislados del octavo aspecto unidos en forma funcional a un iniciador, incluyendo las células huésped recombinantes que comprenden uno . o más vectores de expresión del noveno aspecto de la invención. . En modalidades preferidas, la célula huésped recombinante secreta un anticuerpo que se une a CD27L. Las células huésped preferidas son las células huésped mamiferas, incluyendo las lineas celulares CHO.
En un decimoprimer aspecto, la invención da a conocer métodos para elaborar un conjugado anticuerpo CD27L-fármaco del séptimo aspecto mediante la conjugación de un conector y fármaco, por ejemplo, agente quimioterapéutico, a cualquiera de las proteínas de unión al antígeno CD27L del aspecto primero, segundo, tercero, cuarto, quinto o sexto. El conector y fármaco puede primero conectarse y luego conjugarse con la proteína de unión al antígeno CD27L o puede primero conjugarse el conector con la proteína de unión al antígeno CD27L y luego conectarse al fármaco. En modalidades preferidas, el conector es CC y el fármaco es DM1. En modalidades particularmente preferidas, la proteína de unión al antígeno CD27L es un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera como se describe en SEQ ID NO: 63 y una secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada como se describe en SEQ ID NO: 17 (por ejemplo, Abl), un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera como se describe en SEQ ID NO: 64 y una secuencia de aminoácidos, del dominio variable de cadena pesada como se describe en SEQ ID NO: 18 (por ejemplo, Ab2) , un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera como se describe en SEQ ID NO: 65 y una secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada como se describe en SEQ ID NO: 19 (por ejemplo, Ab3) , un anticuerpo que .comprende una secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera como se describe en SEQ ID NO: 66 y una secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada como se describe en SEQ ID NO:20 (por ejemplo, Ab4), un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera como se describe en SEQ ID NO: 67 y una secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada como se describe en SEQ ID N0:21 (por ejemplo, Ab5) , un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera como se describe en SEQ ID NO: 68 y una secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada como se describe en SEQ ID NO:22 (por ejemplo, Ab6) , un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera como se describe en SEQ ID NO: 69 y una secuencia de ' aminoácidos del dominio variable de cadena pesada como se describe en SEQ ID NO:23 (por ejemplo, Ab7), o un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera como se describe en SEQ ID NO: 70 y una secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada como se describe en SEQ ID NO:24 (por ejemplo., Ab8) conjugado a DM1 mediante MCC haciendo reaccionar químicamente a uno o más residuos lisina en el anticuerpo con MCC o MCC-DMl.
En decimosegundo aspecto, la invención da a conocer métodos para el tratamiento del cáncer que comprenden la administración a un paciente, de cantidad terapéuticamente efectiva de una que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de una proteína de unión al antígeno CD27L del aspecto primero, segundo, tercero, cuarto, quinto o sexto. En modalidades preferidas, la proteína de unión al antígeno CD27L es un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera como se describe en SEQ ID NO: 63 y una secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada como se describe en SEQ ID NO: 17 (por ejemplo, Abl), un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera como se describe en SEQ JD NO: 64 y una secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada como se describe en SEQ ID NO: 18 (por ejemplo, Ab2), un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera como se describe en SEQ ID NO: 65 y una secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada como se describe en SEQ ID NO: 19 (por ejemplo, Ab3) , un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera como se describe en SEQ ID NO: 66 y una secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada como se describe en SEQ ID NO:20 (por ejemplo, Ab4), un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera como se describe en SEQ ID NO: 67 y una secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada como se describe en SEQ ID N0:21 (por ejemplo, Ab5) , un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera como se describe en SEQ ID NO: 68 y una secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada como se describe en SEQ ID N0:22 (por ejemplo, Ab6) , un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera. como se describe en SEQ ID NO: 69 y una secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada como se describe en SEQ ID NO:23 (por ejemplo, Ab7), o un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera como se describe en SEQ ID NO:70 y una secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada como se describe en SEQ ID NO: 24 (por ejemplo, Ab8). En modalidades particularmente preferidas, la proteína de unión al antígeno CD27L se conjuga con un agente quimioterapéutico (por ejemplo, DM1) mediante un conector (MCC) . En otras modalidades preferidas del decimosegundo aspecto, el anticuerpo comprende una función efectora mejorada .
En algunas modalidades, la proteína de unión al antígeno CD27L se administra a un paciente que posee carcinomas de células renales (RCC) , RCC de células claras, cáncer de cabeza y cuello, glioblastoma, cáncer de mamas, tumor cerebral, carcinoma nasofaríngeo, linfoma no Hodgkin (NHL) , leucemia linfocítica aguda (ALL) , leucemia linfocítica crónica (CLL) , linfoma de Burkitt, linfomas anaplásticos de células grandes (ALCL) , mieloma múltiple, linfomas cutáneos de células T, linfomas nodulares de células pequeñas hendidas, linfomas linfocíticos , linfomas de células T periféricas, linfomas de Lennert, linfoma inmunoblástico , linfomas/leucemia de células T (ATLL) , leucemia de células T del adulto (T-ALL) , cáncer de linfoma folicular centroblástico/centrocitico (cb/cc) , linfoma difuso de células grandes de linaje B, linfoma de células T del tipo linfadenopatia angioinmunoblástica (AILD) , linfoma asociado a cavidad corporal relacionado con el VIH, carcinoma embrionario, carcinoma rino-faríngeo no diferenciado, enfermedad de Castleman, sarcoma de Kaposi, mieloma múltiple, macroglobulinemia de Waldenstrom u otro linfoma de células B.
En ciertas modalidades, se ensaya la expresión de CD27L en una muestra obtenida de un paciente previo a la administración de la proteína de unión al antígeno CD27L. La expresión de CD27L puede determinarse mediante el ensayo de la presencia de ARN que codifica CD27L o la presencia de proteína CD27Len la muestra. La muestra puede ser una muestra de sangre o una biopsia.
En un decimotercer aspecto, la invención da a conocer métodos para el tratamiento de un trastorno autoinmunitario o inflamatorio donde -dicho método consiste en la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de una proteína de unión al antígeno CD27L de cualquiera de los aspectos primero, segundo, tercero, cuarto, quinto o sexto a un paciente que lo requiera. En modalidades preferidas, la proteína de unión al antígeno CD27L es un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera como se describe en SEQ ID NO: 63 y una secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada como se describe en SEQ ID NO: 17 (por ejemplo, Abl) , un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera como se describe en SEQ ID NO: 64 y una secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada como se describe en SEQ ID NO: 18 (por ejemplo, Ab2), un anticuerpo que comprende . una secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera como se describe en SEQ ID NO: 65 y una secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada como se describe en SEQ ID NO: 19 (por ejemplo, Ab3), un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera como se describe en SEQ ID NO: 66 y una secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada como se describe en SEQ ID N0:20 (por ejemplo, Ab4), un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera como se describe en SEQ ID NO: 67 y una secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada como se describe en SEQ ID NO: 21 (por ejemplo, Ab5) , un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera como se describe en SEQ ID NO: 68 y una secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada como se describe en SEQ ID NO:22 (por ejemplo, Ab6) , un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera como se describe en SEQ ID NO: 69 y una secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada como se describe en SEQ ID NO:23 (por ejemplo, Ab7), o un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera como se describe en SEQ ID NO: 70 y una secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada como se describe en SEQ ID NO:24 (por ejemplo, Ab8). En modalidades preferidas, la proteina de unión al antigeno CD27L inhibe la unión de CD27 a CD27L. En modalidades particularmente preferidas, el trastorno autoinmunitario o inflamatorio es lupus eritematoso sistémico (SLE) , diabetes miellitus insulina-dependiente (IDDM), enfermedad inflamatoria intestinal (IBD), esclerosis múltiple (MS) , psoriasis, tiroiditis autoinmunitario, .artritis reumatoide (RA) , o glomerulonefritis . En otras modalidades, el tratamiento inhibe o previene el rechazo de trasplantes o la enfermedad injerto contra huésped en el paciente.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS FIG. 1. Resumen de las características funcionales y físicas de las modalidades ej emplificativas le las proteínas de unión al antígeno CD27L.
FIG. 2. Medición del nivel y la tasa de internalización de Ab4 (A4) y Ab8 (A8) y sus contrapartes conjugadas en células 786-0 a lo largo del tiempo (A) .
FIG. 3. Se cultivaron células 786-0 durante 4 días en presencia de concentraciones crecientes. de anti streptavidina-MCC-DMl, Ab4 -MCC-DMl y Ab8-MCC-DMl. Se midió el efecto sobre el crecimiento celular utilizando el reactivo CELL-TITER-GLO, el cual mide el número de células utilizando una lectura luminiscente.
FIG. 4. Relación dosis respuesta para Ab -MCC-DMl y Ab8-MCC-DMl en el modelo de xenoinjerto 786-0. La dosis intravenosa en el día 24 se denota mediante una flecha a las dosis indicadas.
FIG. 5. Relación dosis respuesta para Ab4-MCC-DMl y Ab8-MCC-DMl en el modelo de xenoingerto Caki-1. Se denota el cronograma de dosis intravenosa mediante flechas.
FIG. 6. Relación dosis respuesta para Ab4-MCC-DMl en el modelo de xenoinjerto Raji. Se denota el cronograma de dosis intravenosa mediante flechas.
FIG. 7. Dosis respuesta variable para Ab4-MCC-DMl en el modelo de xenoinjerto 786-0.
FIG. 8. Ensayo de citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) para Ab4-MCC-DMl contra células tumorales Raj i .
FIG. 9. Ensayo de fagocitosis celular dependiente del anticuerpo (ADCP) para Ab4- CC-DMl contra células tumorales Ra i y 786-0.
FIG. 10. Comparación de la expresión de CD27L para muestras primarias de tumor congelado que fueron "positivas" mediante IHC enmascarada. Los resultados indican que la mayor expresión global de la proteina CD27L ocurre en las muestras de pacientes con ccRCC, seguido de DLBCL (linfoma difuso de células B grandes); muestras de B-CLL y FL.
FIG. 11. Resultados del análisis de expresión de ARNm y proteina CD27L. Los resultados indican que existe una alta prevalencia de la expresión de CD27L en las células de RCC, B-NHL y CLL.
FIG. 12 Establece la estructura de Ab-MCC-DMADCs descrita en el Ejemplo 2.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Los encabezados de sección que se utilizan en la presente memoria se proporcionan con el propósito de su organización y no han de entenderse como limitantes del alcance de la materia que se describe. Todas las referencias que se citan en el desarrollo de esta especificación se incorporan por referencia en su totalidad de manera expresa.
Pueden utilizarse técnicas estándar para ARN recombinante, síntesis de oligonucleótidos, cultivo y transformación de tejido, purificación de proteínas, etc. Las reacciones y técnicas de purificación enzimáticas pueden llevarse a cabo de acuerdo a la especificación del fabricante o como se acostumbra en la técnica o como se describe en la presente memoria. Los siguientes procedimientos y técnicas pueden en general llevarse a cabo de acuerdo a los métodos convencionales bien conocidos en la técnica y como se describe en varias referencias generales más específicas que se citan y se discuten en el desarrollo de la especificación; ver, por ejemplo, Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manuel, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, cold Spring Harbor, N.Y., el cual se incorpora por referencia en la presente memoria para todo propósito. A menos que se proporcionen definiciones específicas, la nomenclatura utilizada en relación con, así como los procedimientos y técnicas de laboratorio de, química analítica, química orgánica, y química medicinal y farmacéutica que se describe (n) en la presente memoria es/son bien conocida/os y comúnmente utilizada/os en la técnica. Pueden utilizarse técnicas estándar para la síntesis química, los análisis químicos, la preparación, formulación y administración farmacéutica y el tratamiento de los pacientes.
Las proteínas de unión al antigeno se unen a CD27L, el cual también se conoce como CD70 y TNFSF7. CD27L fue descrito por primera vez en Pat . EUA. No. 5,573,924. En la presente memoria, se da a conocer un ejemplo de secuencia de aminoácidos de CD27L humana como SEQ ID N0:1, la cual corresponde a NCBI Reference Sequence NP_001423.1 (GI : 4507605) . En ciertas modalidades, la proteína de unión al antígeno bloquea la interacción de CD27L con su receptor CD27. Se da a conocer un ejemplo de secuencia de aminoácidos de CD27 como SEQ ID NO:2, la cual corresponde a Swiss-Prot: P26842.2 (GI : 269849546) . Una secuencia de aminoácidos de CD27 madura se corresponde con los aminoácidos 20-260 de SEQ ID NO: 2.
Proteínas de unión al antígeno CD27L La presente invención da á conocer proteínas de unión al antígeno que se unen de manera específica a CD27L. Las modalidades de las proteínas de unión al antígeno comprenden péptidos y/o polipéptidos que se unen de manera específica a CD27L. Dichos péptidos o polipéptidos pueden ocasionalmente incluir una o más modificaciones post traduccionales . Las modalidades de las proteínas de unión al antígeno comprenden anticuerpos y fragmentos de éstos, tal como se define de varias formas en la presente memoria, los cuales se unen de manera específica a CD27L. Éstos incluyen los anticuerpos que se unen de manera especifica a CD27L humana, incluyendo aquellos que inhiben a CD27L a partir de la unión y/o la activación de CD27.
Las proteínas de unión al antígeno de la invención se unen de manera específica a CD27L. "Se une de manera específica a" tal como se utiliza en la presente memoria significa que la proteína de unión al antígeno se une de manera preferencial a CD27L en relación a otras proteínas. En algunas modalidades "se une de manera específica a" significa que la proteína de unión al antígeno CD27L posee una mayor afinidad por CD27L que por otras proteínas. Las proteínas de unión al antígeno CD27L que se unen de manera específica a CD27L pueden poseer una afinidad de unión por CD27L humana menor que o igual a 1 x 10~7 M, menor que o igual a 2 x 1CT7 M, menor que o igual a 3 x 1CT7 M, menor que o igual a 4 x 10~7 M, menor que o igual a 5 x 1CT7 M, menor que o igual a 6 x 10~7 M, menor que o igual a 7 x 10~7 M, menor que o igual a 8 x 10~7 M, menor que o igual a 9 x 1CT7 M, menor que o igual a 1 x 10~8 M, menor que o igual a 2 x 10~8 M, menor que o igual a 3 x 10~8 M, menor que o igual a 4 x 10" 8 M, menor que o igual a 5 x 10~8 M, menor que o igual a 6 x 10~8 M, menor que o igual a 7 x 10"8 M, menor que o igual a 8 x 10~8 M, menor que o igual a 9 x 10"8 , menor que o igual a 1 x 10"9 M, menor que o igual a 2 x 1Q~9 M, menor que o igual a 3 x 10~9 M, menor que o igual a 4 x 10~9 M, menor que o igual a 5 x 10"9 M, menor que o igual a 6 x 10"9 M, menor que o igual a 7 x 10"9 M, menor que o igual a 8 x 10~9 , menor que o igual a 9 x 10~9 M, menor que o igual a 1 x 10"10 M, menor que o igual a 2 x 10"10 , menor que o igual a 3 x 10"10 M, menor que o igual a 4 x 10~10 , menor que o igual a 5 x 10"10 M, menor que o igual a 6 x 10"10 M, menor que o igual a 7 x ío-10 M, menor que o igual a 8 x 10"10 M, menor que o igual a 9 x 10"10 M, menor que o igual a 1 x.10"11 M, menor que o igual a 2 10"11 M, menor que o igual a 3. x 10-11 M, menor que o igual a 4 x 10-11 M, menor que o igual a 5 x 10"11 M, menor que o igual a 6 x 10"11 M, menor que o igual a 7 x IO"11 M, menor que o igual a 8 x 10-11 M, menor que o igual a 9 x 1CT11 M, menor que o igual a l x 10~12 M, menor que o igual a 2 x 10"12 M, menor que o igual a 3 x 10~12 M, menor que o igual a 4 x 10~12 M, menor que o igual a 5 x 10"12 M, menor que o igual a 6 x 10~12 M, menor que o igual a 7 x 1.0~12 M, menor que o igual a 8 x 10"12 M, o menor que o igual a 9 x 10"12 M. Los métodos para medir la afinidad de unión de prdteina. de unión al antigeno son bien conocidos en la técnica. El Ejemplo 1 da a conocer un ejemplo de método.
Ha de entenderse que cuando se hace referencia a las varias modalidades de los anticuerpos de unión a CD27L que se dan a conocer en la presénte memoria, también se abarcan los fragmentos de unión a CD27L de los mismos. Un fragmento de unión a CD27L comprende cualquiera de los dominios o fragmentos de anticuerpo que se describen en la presente memoria que retiene la capacidad de unirse de manera especifica a CD27L. Los fragmentos de unión a CD27L pueden encontrarse en cualquiera de las estructuras marco que se describen en la presente memoria.
En ciertas modalidades terapéuticas, una proteina de unión al antigeno CD27L inhibe la unión de CD27L a CD27 y/o inhibe una o más de las actividades biológicas asociadas con la unión de CD27L a CD27, por ejemplo, la señalización mediada por CD27. Dichas proteínas de unión al antígeno son "neutralizantes". En ciertas modalidades, la proteína de unión al antígeno CD27L neutralizante se une de manera específica a CD27L e inhibe la unión de CD27L a CD27 en cualquier valor entre 10% a 100%, tal como en al menos alrededor de 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 6.6, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% o más. Por ejemplo, puede ensayarse la capacidad neutralizante de las proteínas de unión al antigeno CD27L determinando la capacidad de la proteina de unión al antigeno para bloquear la unión de CD27-Fc a las células P-1 (Slack et al, Int. Immunol. (1995) 7(7): 1087-1092) ) .
Las modalidades de las proteínas de unión al antigeno comprenden una estructura marco, tal como se define en varias formas en la presente memoria, con una o más regiones determinantes de la complementariedad (CDR) . Las modalidades asimismo incluyen las proteínas de unión al antigeno que comprenden una estructura marco con uno o más dominios variables de un anticuerpo, ya sea pesado o ligero. Las modalidades incluyen los anticuerpos que comprenden un dominio variable de cadena ligera seleccionado del conjunto que consiste en los dominios variables de cadena ligera Abl LCv, Ab2 LCv, Ab3 LCv, Ab4 LCv, Ab5 LCv, Ab6 LCv, Ab7 LCv, y Ab8 LCv (SEQ ID NO: 63-70, respectivamente) y/o un dominio variable de cadena pesada seleccionado del conjunto que consiste en los dominios variables de cadena pesada Abl HCv, Ab2 HCv, Ab3 HCv, Ab4 HCv, Ab5 HCv, Ab6 HCv, Ab7 HCv, y AbS HCv (SEQ ID NO; 17-24, respectivamente), y fragmentos, derivados, muteínas, y variantes de éstos.
Un ejemplo de cadena ligera que comprende Abl LCv: es una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID NO:56.
Un ejemplo de cadena ligera que comprende Ab2 LCv es una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID NO: 57.
Un ejemplo de cadena ligera que comprende Ab4 LCv es una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID NO:58.
Un ejemplo de cadena ligera que comprende Ab5 LCv es una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID NO: 59.
Un ejemplo de cadena ligera que comprende Ab6 LCv es una cadena ligera que . comprende la secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID NO: 60.
Un ejemplo de cadena ligera qué comprende Ab7 LCv es una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID NO: 61.
Un ejemplo de cadena ligera que comprende Ab8 LCv es una cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID NO:62.
Un ejemplo de cadena pesada que comprende Abl HCv es una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID NO: 10.
Un ejemplo de cadena pesada que comprende Ab2 HCv es una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID NO: 11.
Un ejemplo de cadena pesada que comprende Ab4 HCv es una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID NO: 12.
Un ejemplo de cadena pesada que comprende Ab5 HCv es una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID NO: 13.
Un ejemplo de cadena' pesada que comprende Ab6 HCv es una cadena pesada que . comprende la secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID NO: 14.
Un ejemplo de cadena pesada que comprende Ab7 HCv es una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID NO: 15.
Un ejemplo de cadena pesada que comprende Ab8 HCv es una cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID NO: 16.
Otros ejemplos de estructuras marco previstas incluyen: fibronectina, neocarzinostatina CBM4-2, lipocalinas, receptor de células T, la proteína de dominio A (proteína Z), Im9, proteínas TPR, dominios de dedos de zinc, pVIII, polipéptido pancreático aviar, GCN4, dominio WW, dominio 3 con homología a Ser, dominios PDZ, beta lactamasa TEM-1, tiorredoxina, nucleasa estafilocócica, dominios PHD-dedos, CL-2, BPTI, APPI, HPSTI, ecotina, LACI-D1, LDTI, MTI-II, toxinas de escorpión, el polipéptido A de la defensina de insecto, EETI- II, Min-23, CBD, PBP, citocromo b-562, dominios receptores de Ldl, gamma-cristalina, ubicuitina, transferrina, y los dominios similares a la lectina del tipo C. Las regiones marco que no se asocian a anticuerpos y su uso terapéutico se analizan en Gebauer y Skerra, Curr . Opin. Chem. Biol., 13:245-255 (2009) y Binz et al., Nat . Biotech., 23 (10) : 1257-1268 (2005), los cuales se incorporan por referencia en la presente memoria en su totalidad.
Los aspectos de la invención incluyen los anticuerpos que comprenden los siguientes dominios variables: Abl LCv/Abl HCv (SEQ ID NO:63/SEQ ID NO: 17), Ab2 LCv/Ab2 HCv (SEQ ID NO:64/SEQ ID NO: 18), Ab3 LCv/Ab3 HCv (SEQ ID NO:65/SEQ ID NO: 19), Ab4 LCv/Ab4 HCv (SEQ ID NO:66/SEQ ID NO: 20), Ab5 LCv/Ab5 HCv (SEQ ID NO:67/SEQ ID NO:21), Ab6 LCv/Ab6 HCv . ( SEQ ID NO:68/SEQ ID NO: 22), Ab7 LCv/Ab7 HCv (SEQ ID N0.69/SEQ ID NO:23), Ab8 LCv/Ab8 HCv' (SEQ ID. NO:70/SEQ ID NO:24), y combinaciones de los mismos, asi como fragmentos, derivados, mureinas y variantes de los mismos.
Los ejemplos de anticuerpos de la invención incluyen Abl (SEQ ID NO: 56/SEQ ID NO:10), Ab2 (SEQ ID NO:57/SEQ ID NO:ll), Ab4 (SEQ ID NO:58/SEQ ID NO:12), Ab5 (SEQ ID NO:59/SEQ ID NO:13), Ab6 (SEQ ID NO:60/SEQ ID NO:14), Ab7 (SEQ ID NO:61/SEQ ID NO:15),' Ab8 (SEQ ID NO: 62/SEQ ID NO:16).
Típicamente, cada dominio variable de cadena ligera o pesada de un anticuerpo, comprende tres CDR. El dominio variable de cadena pesada comprende una CDRl de cadena pesada (HCDR1), una CDR2 de cadena pesada (HCDR2), y una CDR3 de cadena pesada (HCDR3) . El dominio variable de cadena ligera comprende una CDRl de cadena ligera (LCDRl), una CDR2 de cadena ligera (LCDR2) , y una CDR3 de cadena ligera (LCDR3) . En ciertas modalidades, una proteina de unión al antígeno comprende una o más CDR contenidas dentro de los dominios variables preferidos que se describen en la presente memoria.
Entre los ejemplos de dichas CDR se incluyen, de manera no limitante: las CDR de Abl LCv: LCDRl ( SEQ ID NO: 71), LCDR2 (SEQ ID NO: 79), y LCDR3 (SEQ ID NO: 87); las CDR de Ab2 LCv: LCDRl (SEQ ID:NQ:72), LCDR2 (SEQ ID NO:80), y LCDR3 (SEQ ID NO:88); las CDR de Ab3'LCv: LCDRl (SEQ ID NO: 73), LCDR2 (SEQ ID NO: 81), y LCDR3 (SEQ ID NO: 89); las CDR de Ab4 LCv: LCDRl (SEQ ID NO:74), LCDR2 (SEQ ID NO:82), y LCDR3 (SEQ ID NO: 90); las CDR de Ab5 LCv: LCDRl (SEQ ID NO: 75), LCDR2 (SEQ ID NO: 83), y LCDR3 (SEQ ID NO: 91); las CDR de Ab6 LCv: LCDRl (SEQ ID NO : 76 ) , LCDR2 (SEQ ID NO: 84), y LCDR3 (SEQ ID NO: 92); las CDR de Ab7 LCv: LCDRl (SEQ ID NO: 77 ) , LCDR2 (SEQ ID NO: 85), y LCDR3 (SEQ ID NO: 93); las CDR de Ab8 LCv: LCDR1 (SEQ ID NO: 78) , LCDR2 (SEQ ID NO: 86), y LCDR3 (SEQ ID NO: 94); las CDR de Abl HCv: HCDRl (SEQ ' ID. NO: 25) ,/ HCDR2 (SEQ ID NO: 33), y HCDR3 (SEQ ID NO: 41); las CDR de Ab2 HCv: HCDRl (SEQ ID NO : 26 ) , HCDR2 (SEQ ID NO: 34), y HCDR3 (SEQ ID NO: 42); las CDR de Ab3 HC : HCDRl (SEQ ID NO: 27), HCDR2 (SEQ ID NO:35), y HCDR3 (SEQ ID NO: 43) ; las CDR de Ab4 HCv: HCDRl (SEQ ID NO:28), HCDR2 (SEQ ID NO: 36), y HCDR3 (SEQ ID NO: 44); las CDR de Ab5 HCv: HCDRl (SEQ ID NO:29), HCDR2 (SEQ ID NO:37), y HCDR3 (SEQ ID NO:45); las CDR de Ab6 HCv: HCDRl (SEQ ID NO: 30 ) , HCDR2 (SEQ ID NO: 38), y HCDR3 (SEQ ID NO: 46); las CDR de Ab7 HCv: HCDRl (SEQ ID NO: 31) , HCDR2 (SEQ ID NO: 39), y HCDR3 (SEQ ID NO: 47); y las CDR de Ab8 HCv: HCDRl (SEQ ID NO: 32), HCDR2 (SEQ ID NO: 4.0), y HCDR3 (SEQ ID NO: 48).
En algunas modalidades, la proteina de unión al antigeno comprende: A) un polipéptido, por ejemplo, una cadena ligera, que comprende una LCDR1 que posee una secuencia de aminoácidos seleccionada del conjunto que consiste en SEQ ID NOS:71f 72, 73, 74, 75, 7.6, 77, y 78; una LCDR2 que posee una secuencia de aminoácidos seleccionada del conjunto que consiste en SEQ ID NOS: 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, y 86; y/o una LCDR3 que posee una secuencia de aminoácidos seleccionada del conjunto que consiste en SEQ ID NOS:87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, y 94/ y/o B) un polipéptido, por ejemplo, una cadena pesada, que comprende una HCDR1 que posee una secuencia de aminoácidos seleccionada del conjunto que consiste en SEQ ID NOS:25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, y 32; una HCDR2 que posee una secuencia de aminoácidos seleccionada del conjunto que consiste en SEQ ID NOS:33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, y 40; y/o una HCDR3 que posee una secuencia de aminoácidos seleccionada del conjunto que consiste en SEQ ID N0S:41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, y 48.
En modalidades adicionales, la proteina de unión al antigeno comprende A) una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que comprende una LCDR1, LCDR2, y LCDR3 de cualquiera de Abl LCv, Ab2 LCv, Ab3 LCv, Ab4 LCv, Ab5 LCv, Ab6 LCv, Ab7 LCv, y Ab8 LCv, y B) una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que comprende una HCDR1, HCDR2, y HCDR3 de cualquiera de Abl HCv, Ab2 HCv, Ab3 HCv, Ab4 HCv, Ab5 HCv, Ab6 HCv, Ab7 HCv, y Ab8 HCv.
En ciertas modalidades, las CDR incluyen no más de una, no más de dos, no más . de tres, no más de cuatro, no más de cinco, o no más de seis adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de un ejemplo de CDR descrito en la presente memoria.
Los aspectos de la invención incluyen los anticuerpos que comprenden un dominio variable de cadena ligera seleccionado del conjunto que consiste en SEQ ID NOS: 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, y 70. Los aspectos de la invención incluyen los anticuerpos que comprenden un dominio variable de cadena pesada seleccionado del conjunto que consiste en SEQ ID NOS : 17 , 18, 19, 20, 21, 22, 23, y 24. Aspectos adicionales de la invención incluyen los anticuerpos que comprenden A) un dominio variable de cadena ligera seleccionado del conjunto que consiste en SEQ ID NOS: 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, y 70, y B) un dominio variable de cadena pesada seleccionado del conjunto que consiste en SEQ ID NOS:17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, y 24.
Los anticuerpos de la invención pueden comprender cualquier región constante conocida en la técnica. La región constante de cadena ligera puede ser, por ejemplo, una región constante de cadena ligera tipo kappa o lambda, por ejemplo, una región constante de cadena ligera tipo kappa o lambda humana. La región constante de cadena pesada puede ser, por ejemplo, una región constante de cadena pesada tipo alfa, delta, épsilon, gamma, o mu, por ejemplo, una región constante de cadena pesada tipo alfa-, delta-, épsilon-, gamma-, o mu humana. En una modalidad la región constante de cadena ligera o pesada es un fragmento, derivado, variante, o muteina de una región constante natural.
Los aspectos de la invención incluyen los anticuerpos que comprenden una región variable de cadena ligera seleccionada del conjunto que consiste en SEQ ID NOS: 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, y 70 que posee no más de una, no más de dos, no más de tres, no más - de cuatro, no más de cinco, no más de seis, no más de siete, no más de ocho, no más de nueve, o no más de diez adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos. Los aspectos de la invención incluyen los anticuerpos que comprenden una región variable de cadena pesada seleccionada del conjunto que consiste en SEQ ID NOS : 17 , 18, 19, 20, 21, 22, 23, y 24 que posee no más de una, no más de dos, no más de tres, no más de cuatro, no más de cinco, no más de seis, no más de siete, no más de ocho, no más de . nueve, o no más de diez adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos. Aspectos adicionales de la invención incluyen los anticuerpos que comprenden ?) una región variable de cadena ligera, seleccionada del conjunto que consiste en SEQ ID NOS: 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, y 70 que posee no más de una, no más de dos, no más de tres, no más de cuatro, no más de cinco, no más de seis, no más de siete, no más de ocho, no más de • nueve, o no más de diez adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos, y B)una región variable de cadena pesada seleccionada del conjunto que consiste en SEQ ID NOS:17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 que posee no más de una, no más de dos, no más de tres, no más de cuatro, no más de cinco, no más de seis, no más de siete, no más de ocho, no más de nueve, o no más de diez adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos. Por ejemplo, en ciertas modalidades ej emplificativas , un anticuerpo comprende 1) una variante del dominio variable de cadena ligera que se describe en SEQ ID NO: 66, donde la fenilalanina en la posición 51 está mutada a leucina y/o la prolina en la posición 105 está mutada a glicina o a glutamina; 2) una variante del dominio variable de cadena pesada que se describe en SEQ ID NO:20, donde la glutamina en la posición 1 está mutada a ácido glutámico y/o la arginina en la posición 16 está mutada a una glicina; o una variante del dominio variable de cadena ligera que se describe en . SEQ¦ ID ' NO: 66, donde la fenilalanina en la posición 51 está mutada a una leucina y/o la prolina en la posición 105 está mutada a una glicina o una glutamina y una variante del dominio variable de cadena pesada que se describe en SEQ ID NO: 20, donde la glutamina en la posición 1 está mutada a ácido glutámico y/o la arginina en la posición 16 está mutada a una glicina.
En una variación, la proteína de unión al antígeno comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 80%, al menos 81%, al menos 82%, al menos 83%, al menos 84%, al menos 85%, al menos 86%, al menos 87%, al menos 88%, al menos 89%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 931, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, o al menos 99% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena ligera seleccionada del conjunto que consiste en SEQ ID NOS: 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, y 70. En otra variación, la proteína de unión al antígeno comprende una secuencia de aminoácidos que es al menos 80%, al menos 81%, al menos 82%, al menos 83%, al menos 84%, al menos 85%, al menos 86%, al menos 87%, al menos 88%, al menos 89%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, o al menos 99% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena pesada seleccionada del conjunto que consiste en SEQ ID NOS:17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, y 24. En una modalidad adicional, la proteína de unión al .antígeno comprende A) una secuencia de aminoácidos que es al menos 80%, al menos 81%, al menos 82%, al menos 83%, al menos 84%, al menos 85%, al menos 86%, al menos 87%, al menos 88%, al menos 89%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, o al menos 99% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena ligera seleccionada del conjunto que consiste en SEQ ID NOS: 63', 64, 65, 66, 67, 68, 69, y 70, y B) una secuencia de aminoácidos que es al menos 80%, al menos 81%, al menos 82%, al menos 83%, al menos 84%, al menos 85%, al menos 86%, al menos 87%, al menos 88%, al menos 89%, al menos. 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, o al menos 99% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena pesada seleccionada del conjunto que consiste en SEQ ID NOS: 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, y 24.
En ciertas modalidades, la proteina de unión al antigeno comprende una CDR3 de cadena ligera y/o de cadena pesada. En algunas modalidades, la proteina de unión al antigeno comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del conjunto de secuencias que se describe en SEQ ID NOS: 87, 88, 89, 90, 91,92, 93,94, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, y 48. En ciertas modalidades, la secuencia de aminoácidos incluye no más de una, no más de dos, no más de tres, no más de cuatro, no más de cinco, o no más de seis adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de los ejemplos de secuencia que se describen en SEQ ID NOS:87, 88, 89, 90, 91,92, 93,94, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, y 48. Por tanto, las modalidades de la invención incluyen proteínas de unión al antígeno que comprenden una secuencia de aminoácidos que es al menos 80%, al menos 81%, al menos 82%, al menos 83%, al menos 84%, al menos 85%, al menos 86%, al menos 87%, al menos 88%, al menos 89%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos -98%, o al menos 99% idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada del conjunto de secuencias que se describe en SEQ. ID NOS:87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, y 48.
En ciertas modalidades, la proteína de unión al antígeno comprende una CDR2 de cadena ligera y/o de cadena pesada. En algunas modalidades, la' proteína de unión al antígeno comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del conjunto de secuencias que se describe en SEQ ID NOS: 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, y 40. En ciertas modalidades, la secuencia de aminoácidos incluye no más de una, no más de dos, no más de tres, no más de cuatro, no más de cinco, o no más de seis adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de los ejemplos de secuencias que se describen en SEQ ID NOS: 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, y 40. Por tanto, las modalidades de la invención incluyen proteínas de unión al antígeno que comprenden una secuencia de aminoácidos que es al menos 80%, al menos. 81%, al menos 82%, al menos 83%, al menos 84%, al menos 85%, al menos 86%, al menos 87%, al menos 88%, al menos 89%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, o al menos 99% idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada del conjunto de secuencias que se describe en SEQ ID NOS: 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, y 40.
En ciertas modalidades, la proteína de unión al antígeno comprende una CDRl de cadena ligera y/o de cadena pesada. En algunas modalidades, la proteína de unión al antígeno comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del conjunto de secuencias que se describe en SEQ ID NOS: 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, y 32. En ciertas modalidades, la secuencia de aminoácidos incluye no más de una, no más de dos, no más de tres, no más de cuatro, no más de cinco, o no más de seis adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de los ejemplos de secuencias que se describen en SEQ ID NOS: 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, y 32.. Por tanto, las modalidades de la invención incluyen proteínas de unión al antígeno que comprenden una secuencia de aminoácidos que es al menos 80%, al menos 81%, al menos 82%, al menos 83%, al menos 84% al menos 85%, al menos 86%, al menos 87%, al menos 88%, al menos 89%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos.95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, o al menos 99% idéntica a una secuencia de aminoácidos seleccionada del conjunto de secuencias que se describe en SEQ ID NOS: 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, y 32.
Las proteínas de. unión al antígeno de la invención comprenden las estructuras de los anticuerpos tradicionales, incluyendo anticuerpos humanos y monoclonales, anticuerpos biespecíficos, dianticuerpos, minibodies, anticuerpos dominio, anticuerpos sintéticos (a los que a menudo se les refiere en la presente memoria como "miméticos de anticuerpo"), anticuerpos quiméricos, fusiones de anticuerpos (a los que a menudo se les refiere como "conjugados de anticuerpo"), y fragmentos de .cada uno, respectivamente. Pueden incluirse las GDR descritas anteriormente, incluyendo varias combinaciones de CDR, en cualquiera de las siguientes estructuras .
Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "anticuerpo" se refiere a las distintas formas de proteínas monoméricas o multiméricas que comprenden una o más cadenas de polipéptidos que se unen de manera específica a un antígeno, como se describe de distintas maneras en la presente memoria. En ciertas modalidades, los anticuerpos se producen mediante técnicas de ADN recombinante . En modalidades adicionales, los anticuerpos se producen mediante escisión química o enzimática de anticuerpos naturales. En otro aspecto, el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en: a) un anticuerpo humano; b) un anticuerpo humanizado; c) un anticuerpo quimérico; d) un anticuerpo monoclonal; e) un. anticuerpo policlonal; f) un anticuerpo recombinante ; g) un fragmento de unión al antigeno; h) un anticuerpo de cadena única; i) un dianticuerpo; ) un trianticuerpo, k) un tetraanticuerpo, 1) un fragmento Fab; m) un fragmento · F(ab' ).2, n) un anticuerpo IgA, o) un anticuerpo IgD, p) un anticuerpo. IgE, q) un anticuerpo IgGl, r) un anticuerpo IgG2, s) un anticuerpo IgG3, t) un anticuerpo IgG4, y u) un anticuerpo IgM.
Una región variable comprende al menos tres CDR de cadena pesada o ligera insertadas en la región de entramado (regiones de entramado designadas FR1, FR2, FR3, y FR4) . Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins oí Immunological Interest, Public Health Service N.I.H., Bethesda, MD. Las unidades estructurales de los anticuerpos tradicionales por lo general comprenden un tetrámero. Habitualmente cada tetrámero comprende dos pares idénticos de cadenas de polipéptidos, siendo que cada par contiene una cadena ligera y una pesada. La porción amino terminal de cada cadena incluye una región variable de alrededor de 100 a 110 o más aminoácidos primordialmente responsables del reconocimiento de los antigenos. La porción carboxilo terminal de cada cadena define una región constante primordialmente responsable de la función efectora. Las cadenas ligeras humanas se clasifican en cadenas ligeras kappa o lambda. Las cadenas pesadas se clasifican en mu, delta, gamma, alfa, o épsilon, y definen al isotipo de anticuerpo como IgM, IgD, IgG, IgA, e IgE, respectivamente. El IgG tiene varias subclases, incluyendo, de manera no limitante IgGl, IgG2, IgG3, e IgG4. El IgM tiene subclases, incluyendo, de manera no limitante IgMl e IgM2. Las modalidades de la invención incluyen todas estas clases y subclases de anticuerpos que incorporan un dominio variable o CDR de las proteínas de unión al antígeno que se dan a conocer en la presente memoria.
Algunos anticuerpos naturales, como aquellos que se encuentran en camellos y llamas, son dímeros que consisten en dos cadenas pesadas y no incluyen cadenas ligeras. La invención abarca anticuerpos diméricos de dos cadenas pesadas, o fragmentos de éstas, que pueden unirse a CD27L. Las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras normalmente muestran la misma estructura general de las regiones de entramado (FR) relativamente conservadas, unidas por tres regiones hipervariables, también denominadas regiones determinantes de la complementariedad o CDR. Las CDR son primordialmente responsables del reconocimiento y unión a los antigenos. Las CDR de las dos cadenas de cada par se incluyen normalmente dentro de las regiones de entramado, permitiendo la unión a un epitopo especifico. Desde el extremo terminal N a la terminal C, las regiones variables tanto de cadena ligera como de la pesada comprenden los dominios FRl , CDRl, FR2 , CDR2 , FR3, CDR3 y FR4. La asignación de aminoácidos a cada dominio está de acuerdo a las definiciones de Kabat.
Las CDR constituyen los principales puntos de contacto con la superficie para la unión a antigenos. La CDR3 de cadena ligera y, particularmente, la CDR3 de cadena pesada pueden constituir, los determinantes más importantes en la unión a antigenos dentro de las regiones variables de cadena ligera y pesada. En algunos anticuerpos, la CDR3 de cadena pesada parece constituir el área de contacto principal entre el antigeno y el anticuerpo. Pueden utilizarse esquemas de selección in vitro en los que se varia solo la CDR3 para variar las propiedades de .unión de un anticuerpo o determinar qué residuos contribuyen a la unión de un antigeno.
Los anticuerpos naturales por lo general incluyen una secuencia señal, la cual dirige el anticuerpo hacia la ruta celular para la secreción de proteínas y por lo general no está presente en el anticuerpo maduro. Un polinucleótido que codifica para un anticuerpo de la invención puede codificar para una secuencia señal que se produce de manera natural o una secuencia señal heteróloga, como se describe más adelante.
En una modalidad, -la proteina de unión al antigeno es un anticuerpo que comprende de una a seis de las CDR de la modalidad ej emplificativa descritas en la presente memoria. Los anticuerpos de la invención pueden ser de cualquier tipo, incluyendo IgM, IgG (incluyendo IgGl, IgG2, IgG3, IgG4) , IgD, IgA, o IgE. En una modalidad especifica, la proteina de unión al antigeno es un anticuerpo del tipo IgG, por ejemplo, un anticuerpo IgGl.
En algunas modalidades, por ejemplo, cuando la proteina de unión al antigeno es un anticuerpo con cadenas pesadas y ligeras completas, las -CDR son todas de la misma especie, por ejemplo, humana. En forma alternativa, po ejemplo, en modalidades donde la proteina de unión al antigeno contiene menos de seis CDR de la secuencia señalada anteriormente, CDR adicionales pueden pertenecer a otras especies o ser CDR humanas diferentes de las presentes en la secuencia del ejemplo de modalidad. Por ejemplo, las regiones HCDR3 y LCDR3 de las secuencias adecuadas identificadas en la presente memoria pueden usarse con HCDRl, HCDR2, LCDR1, y LCDR2, siendo opcionalmente elegidas de entre especies alternativas o secuencias de diferentes anticuerpos humanos, o combinaciones de lo anterior. Por ejemplo, las CDR de la invención pueden sustituir las regiones CDR de los anticuerpos quiméricos o humanizados de importancia en el mercado .
Algunas modalidades especificas utilizan componentes estructurales de las proteínas de unión al antígeno que son componentes humanos. En algunas modalidades, sin embargo, los componentes estructurales pueden ser una mezcla de diferentes especies. Como tal, si la proteína de unión al antígeno es un anticuerpo, dicho anticuerpo puede ser un anticuerpo quimérico y/o humanizado. En general, tanto los "anticuerpos quiméricos" como los "anticuerpos humanizados" se refieren a anticuerpos que combinan regiones de más de una especie. Por ejemplo, los "anticuerpos quiméricos" tradicionalmente comprenden región (es) variable (s) de un anticuerpo de ratón (o rata, en algunos casos) y. la(s) región (es) constante (s) de uno humano.
Los "anticuerpos humanizados" generalmente se refieren a anticuerpos no humanos cuyas regiones de entramado de dominio variable han sido sustituidas por secuencias que se encuentran en los anticuerpos humanos. Generalmente, en un anticuerpo humanizado, todo el anticuerpo, excepto una o más CDR, se codifica mediante un polinucleótido de origen humano o es idéntico a dicho anticuerpo excepto por una o más CDR. Las CDR, parcial o totalmente codificadas por ácidos nucleicos originados en un organismo no humano, se insertan en la región de entramado de hoja beta de la región variable de un anticuerpo humano para crear un anticuerpo, cuya especificidad queda determinada por la inserción de las CDR. La creación de dichos anticuerpos se describe en, por ejemplo, O 92/11018', Jones 1986, Nature 321:522-525, Verhoeyen et al., 1988, Science 239:1534-1536. Los anticuerpos humanizados pueden también generarse usando ratones con un sistema, inmunitario genéticamente modificado. Roque et al., 2004, Biotechnol. Prog. 20:639-654. En las modalidades que se dan a conocer a modo de ejemplo en la presente memoria, las CDR identificadas son humanas, y por ende tanto los anticuerpos humanizados como los quiméricos en este contexto incluyen algunas CDR no humanas; por ejemplo, pueden generarse anticuerpos humanizados que comprenden las regiones HCDR3 y LCDR3, con una o más de las otras regiones CDR pertenecientes a diferentes especies.
En una modalidad, la proteina de unión al antigeno CD27L es un anticuerpo multiespecifico, y particularmente un anticuerpo biespecifico, a veces llamado "dianticuerpo". Estos son anticuerpos que se unen a dos o más antigenos diferentes o a diferentes epitopos en un único antigeno. En ciertas modalidades, un anticuerpo, biespecifico se une a CD27L y a un antigeno en una célula efectora humana (por ejemplo, células T) . Estos anticuerpos son útiles para disparar una respuesta en la célula efectora contra una célula que expresa CD27L, como ser, una célula de un tumor. En modalidades preferidas, el antigeno de la célula efectora humana es CD3. Pat. EUA. No. 7,235, 641. Los métodos para elaborar anticuerpos biespecífieos se describen en la técnica. Uno de estos métodos implica modificar la porción Fe de las cadenas pesadas de manera de crear "nudos" y "orificios" que faciliten la formación de heterodimeros de las cadenas pesadas coexpresadas en una célula. U.S. 7,695,963. Otro método también implica la modificación de la porción Fe de la cadena pesada pero se utiliza la orientación por interacción electrostática para favorecer la formación de heterodimeros mientras se desfavorece la de los homodimeros de las cadenas pesadas cuando se coexpresan en una célula. Ver WO 09/089,004, el cual se incorpora por referencia en la presente memoria en su totalidad.
En una modalidad, la proteina de unión al antigeno CD27L es un minibody. Los minibodies son proteínas del tipo anticuerpo minimizadas que comprenden un fragmento scFv unido a un dominio CH3. Hu et al., 1996, Cáncer Res. 56:3055-3061.
En una modalidad, la .proteina de unión al antigeno CD27L es un anticuerpo de dominio único; ver, por ejemplo Patente E.U.A. No. 6,248,516. Los anticuerpos de dominio único (dAbs) son dominios de anticuerpos funcionales en la unión que corresponden a las regiones variables tanto de las cadenas pesadas (VH) como ligeras (VL) de los anticuerpos humanos. Los dAbs poseen un peso molecular de aproximadamente 13 kDa, o menos de una décima parte del tamaño de un anticuerpo completo. Los dAbs pueden expresarse correctamente en una variedad de huéspedes incluyendo sistemas celulares bacterianos, de levaduras- y mamíferos. Además, los dAbs son altamente estables y mantienen su actividad incluso habiendo sido expuestos a condiciones extremas, como ser liofilización o desnaturalización por calor. Ver, por ejemplo, Patente EUA 6,291,158; 6,582,915; 6,593,081; 6,172,197; No. de Serie EUA 2004/0110941; Patente Europea 0368684; Patente EUA 6,696,245, WO04/058821, WO04/003019 y WO03/002609.
En una modalidad, la proteína de unión al antígeno CD27L es un fragmento de anticuerpo, es decir, un fragmento de cualquiera de los anticuerpos ' señalados en la presente memoria que mantengan la especificidad de unió a CD27L. En varias modalidades, las proteínas de unión al anticuerpo comprenden, de manera no limitante, un fragmento F(ab), F(ab'), F(ab')2, Fv, o un Fv de cadena única. Como mínimo un anticuerpo, tal como se utiliza en la presente memoria, comprende a un polipéptido que puede unirse específicamente a CD27L, el cual comprende toda o parte de una región variable de una cadena ligera o pesada, como ser una o más CDR.
Otros ejemplos de fragmentos de anticuerpos de unión a CD27L incluyen, de manera no limitante, (i) el fragmento Fab que consiste en dominios VL, VH, CL y'CHl, (ii) el fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CHl, (iii) el fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un único anticuerpo; (iv) el fragmento dAb (Ward et al., 1989, Na ture 341:544-546) que consiste en una única región variable, (v) regiones de CDR aisladas, (vi) fragmentos F(ab' )2 un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos (vii) moléculas de cadena sencilla Fv (scFv) , donde un dominio VH y uno VL se . encuentran unidos por un conector peptidico que permite que los dos dominios se asocien para formar el sitio de unión del antigeno (Bird et al., 1988, Science 242:423-426, Huston et al., 1988, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A. 85:5879-5883), (viii) dimeros Fv de cadena sencilla biespecificos (PCT/US92/09965) y (ix) "diacuerpos" o "triacuerpos", fragmentos multivalentes o multiespecificos construidos por fusión de genes (Tomlinson et. al., 2000, Methods Enzymol. 326:461-479; WO94/13804; Holliger et al., 1993, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A. 90:6444-6448). Los fragmentos de anticuerpo pueden modificarse. Por ejemplo, las moléculas pueden estabilizarse mediante la incorporación de puentes disulfuro que unen los dominios VH y VL (Reiter et al., 1996, Nature Biotech. 14:1239-1245). Algunos aspectos de la invención incluyen modalidades donde los componentes de estos fragmentos que no son CDR son secuencias humanas.
En una modalidad, la' proteina de unión al antigeno CD27L es un anticuerpo completamente humano. En esta modalidad, como fue señalado anteriormente, las estructuras especificas comprenden cadenas pesadas y ligeras completas que se ilustran, las cuales comprenden las regiones CDR. En modalidades adicionales se utiliza una o más de las CDR de la invención, con otras CDR, regiones de entramado, regiones J y D, regiones constantes, etc., provenientes de otros anticuerpos humanos. Por ejemplo, las CDR de la invención pueden sustituir a las CDR de cualquier número de anticuerpos humanos, particularmente' los anticuerpos de importancia comercial .
Los anticuerpos de cadena sencilla pueden formarse mediante la unión de fragmentos de dominio variable (región Fv) de cadena pesada y ligera mediante un puente aminoácido (conector peptidico corto) , resultando en una cadena sencilla de polipéptido. Estos Fv de cadena sencilla (scFv) se prepararon mediante la fusión del ADN que codifica para un conector peptidico . entre los ADN que codifican para los dos polipéptidos de dominio variable (VL y VH) . Los polipéptidos resultantes pueden volver a plegarse sobre si mismos para formar monómeros de unión ¦ al antigeno, o pueden formar multimeros (por ejemplo, dímeros, trímeros o tetrámeros), dependiendo de la longitud del conector flexible entre los dos dominios variables (Kortt et al., 1997, Prot. Eng. 10:423; Kortt et al., 2001, Biomol. Eng. 18:95-108). Mediante la combinación de diferentes polipéptidos que contienen VL y VH, pueden formarse diferentes scFv que se unen a diferentes epítopos. (Kriangkum et al., 20.01, Biomol. Eng. 18:31-40). Las técnicas desarrolladas para la producción de anticuerpos de cadena única incluyen aquellas descritas en Patente E.U.A. No. 4,946,778; Bird, 1988, Science 242:423; Huston et al., 1988, Proc. Nati. Acad. Sci. USA.85:5879; Ward et al., 1989, Nature 334:544, de Graaf et al., 2002, Methods Mol Biol. 178:379-87. Se consideran dentro del alcance de la presente invención los anticuerpos de cadena sencilla derivados de los anticuerpos que se dan a conocer en la presente memoria (incluyendo de manera no limitante los scFv que comprenden las combinaciones de dominio variable Abl LCv/Abl HCv (SEQ ID NO:63/SEQ ID NO : 17 ) , Ab2 LCv/Ab2 HCv (SEQ ID NO: 6 /'SEQ ID NO: 18), Ab3 LCv/Ab3 HCv (SEQ ID N0.65/SEQ ID NO: 19), Ab4 LCv/Ab4 HCv (SEQ ID NO:66/SEQ ID NO:20), Ab5 LCv/Ab5 HCv (SEQ ID NO: 67/SEQ . ID NO: 21), Ab6 LCv/Ab6 HCv (SEQ ID N0.6.8/SEQ ID NO:22), Ab7 LCv/Ab7 H.Cv (SEQ ID NO:69/SEQ ID NO:23), Ab8 LCv/Ab8 HCv (SEQ ID . O: 70/SEQ ID NO:24), y combinaciones de éstas.
En una modalidad, la proteína de unión al antígeno CD27L es una proteína resultante de la fusión de un anticuerpo (a veces referido en la presente memoria como "conjugado de anticuerpo") . El par conjugado puede ser proteico o no proteico; en el segundo caso normalmente se genera mediante la utilización de grupos funcionales en la proteína de unión al antígeno y en el par conjugado. En ciertas modalidades, el anticuerpo se conjuga -a una sustancia no proteica (fármaco) para formar un conjugado fármaco-anticuerpo. Ejemplos de conjugados fármaco-anticuerpo y los métodos para la preparación de dichos conjugados se detallan más adelante.
En una modalidad, la proteína de unión al antígeno CD27L es un análogo de anticuerpo al que a menudo se le refiere como "anticuerpo sintético". Por ejemplo, en una variedad de trabajos se utilizan estructuras de proteína alternativas o estructuras artificiales con CDR insertas. Dichas estructuras incluyen, de manera no limitante, mutaciones introducidas para estabilizar la estructura tridimensional de la proteína de unión, asi . como también estructuras completamente sintéticas que consisten por ejemplo en polímeros biocompatibles . Ver, por ejemplo, Korndorfer et al., 2003, Proteins : Structure, Function , and Bioinformatics, Volumen 53, Número 1:121-129. Roque et al., 2004, Biotechnol. Prog. 20:639-654. Asimismo, pueden utilizarse análogos peptidicos de los anticuerpos ("PAM") , así como también el trabajo basado en análogos de anticuerpos utilizando componentes de fibronectina como estructura..
El término "proteína", tal como se utiliza en la presente memoria, implica al menos dos aminoácidos unidos covalentemente, incluyendo proteínas, polipéptidos , oligopéptidos y péptidos. En algunas modalidades, los dos o más aminoácidos se encuentran unidos covalentemente mediante enlace peptídico.. La proteína puede estar formada por aminoácidos y enlaces peptidicos naturales, por ejemplo cuando se forma la proteína recombinante utilizando sistemas de expresión y células huéspedes, como se explica más adelante. En forma alternativa, la proteína puede incluir aminoácidos sintéticos (por ejemplo, homofenilalanina, citrulina, ornitina, y norleucina) , o estructuras peptidomiméticas , es. decir, "análogos peptidicos o proteicos", como ser peptoides (ver, Simón et al., 1992, Proc. Nati. Acad. Sci . U.S. A. 89:9367, incorporado por referencia en la presente' memoria), que pueden ser resistentes a las proteasas u otras condiciones fisiológicas o de almacenamiento. Estos aminoácidos sintéticos, en particular cuando la¦ proteina de unión al antigeno se sintetiza in vítro, pueden incorporarse mediante métodos convencionales bien conocidos en la técnica. Adicionalmente, puede usarse cualquier combinación de residuos/estructuras peptidomiméticas , sintéticas o naturales. El término "aminoácido" también incluye los residuos iminoácidos como prolina e hidroxiprolina . El "grupo R" o "cadena lateral" del aminoácido puede encontrarse' tanto en la configuración (L) -como (S)-. En una modalidad especifica, los aminoácidos están en la configuración (L) - o (S)-.
En algunos aspectos, la invención da a conocer proteínas recombinantes de unión al antígeno que se unen a CD27L y, en algunas modalidades, a CD27L recombinante humana o una porción de la misma. En este contexto, una "proteína recombinante" es una proteína que se obtiene utilizando técnicas recombinantes utilizando cualquier técnica y métodos conocidos en la técnica, es decir, mediante la expresión de un ácido nucleico recombinante como se describe en la presente memoria. Los métodos y¦ técnicas para . la producción de proteínas recombinantes son bien conocidos en la técnica. Las modalidades de la invención incluyen las proteínas recombinantes de unión al antígeno que se unen a CD27L de tipo nativo y a variantes de la misma.
El término "que consiste esencialmente en" significa que la secuencia de aminoácidos puede variar en alrededor de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, o 15% respecto a la secuencia SEQ ID NO: especificada y aún asi mantener la actividad biológica, como se describe en la presente memoria.
En algunas modalidades, las proteínas de unión al antígeno de la invención son proteínas aisladas o proteínas sustancialmente puras. Una proteína "aislada" se encuentra libre de por lo menos algo del material con el que normalmente se encontraría en su estado natural, por ejemplo constituyendo al menos alrededor de 5%, o al menos alrededor de 50% en peso del total de la proteína en un ejemplo dado. Se entiende que la. proteína aislada puede constituir entre 5 y 99.9% en peso del total del contenido de la proteína dependiendo de las circunstancias. Por ejemplo, la proteína puede obtenerse a una concentración significativamente mayor mediante el uso de un -promotor inducible o promotor de alta expresión, de manera que la proteína se obtiene a mayores niveles de concentración. La definición incluye la producción de una proteína de unión al antígeno en una gran variedad de organismos y/o células huéspedes que se conocen en la técnica.
Para las secuencias ' de aminoácidos, la identidad y/o similitud de la secuencia se determina mediante la utilización de técnicas estándar conocidas en la técnica, incluyendo, de manera no limitante, el algoritmo de identidad local de secuencias de Smith y Waterman 1981, Adv. Appl . Math. 2:482, el algoritmo de alineación de la identidad de secuencia de Needleman y Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443, el método de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman, 1988, Proc. Nat. Acad. Sci. ¦ U.S. A. 85:2444, las ejecuciones computerizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.), el programa de secuencia Best Fit descrito por Devereux et al., 1984, Nucí. Acid Res. 12:387-395, preferentemente utilizando los parámetros por defecto, o mediante inspección. Preferentemente, el porcentaje de identidad se calcula mediante FastDB con los siguientes parámetros: penalización por incompatibilidad de 1; penalización por apertura de hueco de 1; penalización por extensión de hueco de 0.33; penalización por unión de 30, "Current Methods in Sequence Comparison and Analysis ," Macromolecu.le Sequencing and Synthesis, Selected Methods and Applications , pp 127-149 (1988), Alan R. Liss, Inc.
Un ejemplo de algoritmo . útil es PILEUP. PILEUP crea una secuencia múltiple de alineación de un grupo de secuencias relativas utilizando alineación progresiva y por pares.
También puede dibujar un árbol mostrando las relaciones de agregación utilizadas para crear la alineación. PILEUP utiliza una simplificación del método de alineación progresiva de Feng & Doolittle, 1987, J. Mol. Evol. 35:351-360; el método es similar al descrito por Higgins y Sharp, 1989, CABIOS 5:151-153. Los parámetros útiles de PILEUP incluyen un espacio predeterminado en peso de 3.00, una longitud de espacio predeterminado en peso de 0.10, y espacios de extremo pesados.
Otro ejemplo de un algoritmo útil es el algoritmo BLAST, que se describe en: Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol . 215:403-410; Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; y Karin et al., 1993, Proc . Nati. Acad. Sci. U.S. A. 90:5873-5787. Un programa BLAST particularmente útil es el programa WU-BLAST-2 que se tomó de Altschul et al., 1996, Methods in Enzymology 266:460-480. El WU-BLAST-2 utiliza varios parámetros de búsqueda, la mayoría de los cuales están programados en los valores por defecto. Los parámetros ajustables se programan dentro de los siguientes valores: amplitud de superposición=l, fracción de superposición=0.125, umbral de palabra (T)=II. Los parámetros HSP S y HSP S2 son valores dinámicos y los establece el programa mismo dependiendo de la composición de la secuencia particular y la composición de la base de datos en particular en comparación con la secuencia de interés que.se busque; sin embargo, los valores · pueden ajustarse para aumentar la sensibilidad.
Otro algoritmo útil es gapped BLAST de acuerdo a lo informado por Altschul et al., 1993, Nucí. Acids Res. 25:3389-3402. Gapped BLAST utiliza la puntuación de sustitución de BLOSUM-62; el parámetro umbral T se programa en 9; el método de dos coincidencias para activar las extensiones sin huecos, adjudica a las longitudes de hueco de k un costo de 10+k; Xu se. programa en 16, y Xg se programa en 40 para la etapa de búsqueda en la base de datos y en 67 para la etapa de salida de 'los algoritmos. Con una puntuación de alrededor de 22 bits se disparan alineaciones de hueco. Generalmente, la homología, similitud o identidad de los aminoácidos entre las variantes individuales de CDR son de al menos 80% con las secuencias ilustradas en la presente memoria, y con mayor frecuencia de al menos 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, y casi 100%. De manera similar, se define "porcentaje (%) de identidad de secuencia de ácido nucleico" con respecto a la secuencia de ácido nucleico de las proteínas de unión identificadas en la presente memoria como él porcentaje de residuos nucleotídicos en una secuencia analizada que son idénticos a los residuos nucleotídicos en la secuencia de codificación de la proteína de unión al antigeno. Un método específico utiliza el módulo BLASTN del WU-BLAST-2 programado en los valores por defecto, con amplitud de superposición y fracción de superposición programadas en 1 y 0.125, respectivamente.
Generalmente, la homología, similitud o identidad de la secuencia de ácidos nucleicos entre los nucleótidos que codifican para las variantes individuales de CDR y las secuencias de nucleótidos ilustradas en la presente memoria es de al menos 80%, y con mayor frecuencia preferentemente con homología o identidad mayor y de al menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99%, y casi 100%.
De este modo, una "CDR variada" es una con homología, similitud, o identidad, específica con la CDR parental de la invención, y comparte su función biológica, incluyendo, de manera no limitante, al menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99 de la especificidad y/o actividad de la CDR parental.
Mientras que el sitio o región para introducir una variación en la secuencia de aminoácidos se encuentra predeterminado, la mutación per se no necesariamente está predeterminada. Por ejemplo, para optimizar el funcionamiento de una mutación en un sitio dado, la mutagénesis aleatoria puede conducirse en el codón o región objetivo y las variantes expresadas de CDR de la proteína de unión al antígeno pueden analizarse para hallar la combinación óptima de actividad deseada. Las técnicas para realizar las mutaciones de sustitución en sitios predeterminados de ADN de secuencia conocida son bien conocidas, por ejemplo, la mutagénesis del iniciador M13 y la mutagénesis por PCR. Se realiza un estudio de los mutantes usando ensayos de actividades de proteína de unión al antígeno, como por ejemplo las de unión al CD27L.
Las sustituciones de. aminoácidos son normalmente de un único residuo; las inserciones generalmente son del orden de alrededor de uno (1) a alrededor de veinte (20) residuos aminoácidos, aunque se pueden tolerar inserciones considerablemente mayores. Las supresiones son de alrededor de uno (1) a alrededor de veinte (20) residuos aminoácidos, aunque en algunos casos las supresiones pueden ser mucho mayores .
Pueden utilizarse sustituciones, eliminaciones, inserciones o una combinación de las anteriores para llegar a un derivado o variante final. Generalmente, estos cambios se realizan en unos pocos aminoácidos para minimizar la alteración de la molécula, particularmente la inmunogenicidad y especificidad de la proteína de unión al antígeno. Sin embargo, se pueden tolerar cambios mayores en algunas circunstancias. Las sustituciones conservadoras en general se realizan de acuerdo a la siguiente tabla, titulada como TABLA 1.
TABLA 1 Residuo Original Sustituciones ejemplxfxcativas Ala Ser Arg Lys Asn Gln, His Asp Glu Cys Ser Gln Asn Glu Asp Gly ' Pro His Asn, Gln lie Leu, Val Leu • lie, Val Lys Arg, Gln, Ser Thr Thr Ser Trp Tyr Tyr Trp, Phe Val lie, Leu Los cambios sustanciales en inmunológica se realizan mediante la elección de sustituciones que sean menos conservadoras que aquellas que figuran en la TABLA 1. Por ejemplo, pueden realizarse sustituciones que afectan más significativamente: la estructura central del polipéptido en el área de la alteración, por ejemplo la estructura de la alfa-hélice o de la hoja beta; la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio objetivo; o el tamaño de la cadena lateral. Las sustituciones en las que en general se espera se produzcan los mayores cambios en las propiedades de polipéptidos son aquellas en las que (a) un residuo hidrofilico, por ejemplo, seril o treonil, se sustituye con (o por) un residuo hidrofóbico, por ejemplo, leucil, isoleucil, fenilalanil, valil o alanil; (b) una cisteina o prolina se sustituye con (o por) cualquier otro residuo; (c) un residuo con una cadena lateral electropositiva, por ejemplo, lisil, arginil, o histidil, se sustituye con (o por) un residuo electronegativo, por ejemplo, glutamil o aspartil; o (d) un residuo con cadena lateral grande, por ejemplo, fenilalanina, se sustituye con (o por) uno que no tenga cadena lateral, por ejemplo, glicina.
Las variantes normalmente muestran la misma calidad de actividad biológica y provocan la misma respuesta inmunitarias que el análogo natural, sin embargo también se eligen variantes para modificar las características de la proteína de unión al antigeno según sea necesario. En forma alternativa, la variante puede diseñarse de modo que la actividad de la proteína de unión al antígeno se vea alterada. Por ejemplo, los sitios de glicosilación pueden alterarse o eliminarse como se discute en la presente memoria.
Otros derivados de anticuerpos CD27L que se encuentran dentro del alcance de esta invención incluyen los conjugados agregados o covalentes de anticuerpos CD27L, o fragmentos de éstos, con otras proteínas o polipéptidostales como los que se obtienen mediante la expresión de proteínas de fusión recombinantes que comprenden polipéptidos heterólogos fusionados al terminal N o terminal C del polipéptido del anticuerpo CD27L. Por ejemplo, el péptido conjugado puede ser un polipéptido de señal heteróloga (o líder) , por ejemplo, el factor alfa líder de la levadura, o un péptido como ser un marcador de epítopo. Las proteínas de fusión que contienen el anticuerpo ' CD27L pueden contener péptidos agregados para facilitar la purificación o identificación del anticuerpo CD27L (por ejemplo, poli-His) . Un polipéptido del anticuerpo CD27L puede unirse al péptido FLAG como se describe en Hopp et al:, Bio/Technology 6:1204, 1988, y U.S. Patent 5,011,912. El péptido FLAG es altamente antigénico y provee un epítopo de unión reversible mediante un anticuerpo monoclonal especifico (mAb) , permitiendo un ensayo rápido y la fácil purificación de ' la proteina recombinante expresada. Los reactivos utilizados para la preparación de las proteínas de fusión en las que el péptido FLAG se fusiona a un polipéptido dado están disponibles comercialmente (Sigma, St. Louis, MO) .
Los oligómeros que contienen uno o más polipéptidos del anticuerpo CD27L pueden emplearse como antagonistas del CD27L. Los oligómeros pueden encontrarse en la forma de dímeros, trímeros, u oligómeros superiores de unión covalente o no covalente. Los oligómeros que comprenden dos o más polipéptidos del anticuerpo anti-CD27L se contemplaron para su uso, con un homodímero como ejemplo. Otros oligómeros incluyen heterodímeros , homotrímeros , heterotrimeros , homotetrámeros, heterotetrámeros, etc.
Una modalidad se refiere a oligómeros que comprenden múltiples polipéptidos del. anticuerpo CD27L unidos por interacciones covalentes o no covalentes entre los grupos peptídicos fusionados a los polipéptidos del anticuerpo CD27L. Estos péptidos pueden ser conectores peptídicos (espaciadores), o péptidos que poseen la propiedad de favorecer la oligomerizáción . La cremallera de leucina y ciertos otros polipéptidos derivados de anticuerpos se encuentran entre los péptidos que pueden favorecer la oligomerización de los polipéptidos del anticuerpo CD27L a los que se une, como sé detalla más abajo.
En modalidades particulares, los oligómeros comprenden de dos a cuatro polipéptidos del anticuerpo CD27L. Las porciones de anticuerpo CD27L del oligómero pueden encontrarse en cualquiera de las formas descritas anteriormente, por ejemplo, variantes o fragmentos. Preferentemente, los oligómeros comprenden polipéptidos del anticuerpo CD27L que poseen actividad de unión a CD27L.
En una modalidad, se prepara un oligómero . utilizando polipéptidos derivados de inmunoglobulinas . La preparación de proteínas de fusión que comprenden ciertos polipéptidos heterólogos fusionados a varias porciones de polipéptidos derivados de anticuerpos (incluyendo el dominio Fe) , se describe en, por ejemplo, Ashkenazi et ai., 1991, PNAS USA 88:10535; Byrn et al., 1990, Nature 344:677; y Hollenbaugh et ai., 1992 "Construction of Immunoglobulin Fusión Proteins", en Current Protocole in Immunology, Suppl. 4, páginas 10.19.1 - 10.19.11.
Una modalidad de la presente invención se refiere a un dímero que comprende dos proteínas de fusión creadas mediante la fusión de un fragmento de unión a CD27L de un anticuerpo CD27L a la región Fe de un anticuerpo. El dímero puede realizarse mediante, por ejemplo, la inserción de un gen de fusión que codifica la proteína de fusión en un vector de expresión adecuado, expresando la fusión del gen en la célula huésped transformada con el vector de expresión recombinante, y permitiendo que la proteína de fusión expresada se ensamble de manera muy similar a una molécula de anticuerpo, en la cual se forman puentes disulfuro intercatenarios entre los grupos Fe para dar el dímero.
El término "polipéptido Fe" tal como se utiliza en la presente memoria incluye formas nativas y mutadas de polipéptidos derivados de la región Fe de un anticuerpo. También incluye formas truncas de esos polipéptidos que contienen la región bisagra que favorece la dimerización. Las proteínas de fusión que comprenden grupos Fe (y oligómeros formados a partir de éstos) ofrecen la ventaja de una fácil purificación por afinidad cromatográfica en columnas de Proteína A o Proteína G.
Un polipéptido Fe adecuado, descrito en la aplicación PCT WO 93/10151 (incorporada por referencia en la presente memoria) , es un polipéptido de cadena sencilla que se extiende desde la región bisagra terminal N a la terminal C nativa de la región Fe de un anticuerpo humano IgG. Otro polipéptido Fe útil es la mutación del Fe descrito en U.S. Patent 5, 457, 035, y en Baum et al., (1994) EMBO J. 13:3992-4001. La secuencia de aminoácidos de esta mutación es idéntica a la secuencia nativa del Fe presentada en WO 93/10151, excepto que se cambiaron el aminoácido 19 de Leu a Ala, el aminoácido 20 de Leu a Glu, y el aminoácido 22 de Gly a Ala. La mutación muestra afinidad reducida por los receptores Fe.
En otras modalidades, la porción variable de las cadenas pesadas y/o ligeras de un .anticuerpo CD27L pueden sustituirse por la porción variable de una cadena pesada y/o ligera de un anticuerpo.
En forma alternativa, el oligómero es una proteina de fusión que comprende múltiples polipéptidos del anticuerpo CD27L, con o sin conectores peptidicos (espaciadores peptidicos) . Entre los conectores peptidicos adecuados se encuentran los descritos en Patentes E.U.A. 4,751,180 y 4,935,233.
Otro método para la preparación de derivados oligoméricos del anticuerpo CD27L utiliza la cremallera de leucina. Los dominios de cremallera de leucina son péptidos que favorecen la oligomerización de las proteínas en las que se encuentran. Originalmente las cremalleras de leucina se identificaron en varias proteínas de unión de ADN (Landschulz et al., 1988, Science 240:1759), y desde entonces se han encontrado en una variedad de proteínas distintas. Entre las cremalleras de leucina conocidas se encuentran péptidos naturales y derivados de los mismos que se dimerizan o trimerizan. Ejemplos de cremallera de leucina adecuados para la producción de proteínas oligoméricas solubles se describen en la aplicación PCT WO 94/10308, y la cremallera de leucina derivada de la proteína D tensoactivo de pulmón (SPD) descrita en Hoppe et al., 1994, FEBS Letters 344:191, incorporada por referencia en la presente memoria. El uso de una cremallera de leucina modificada que permite la trimerización estable de una proteína heteróloga fusionada a la misma se describe en Fanslow et al., 1994, Semin. Immunol. 6:267-78. En un enfoque,, proteínas recombinantes de fusión que comprenden fragmentos de anticuerpo CD27L o derivados fusionados a un péptidó de cremallera de leucina se expresan en células huésped adecuadas, y los fragmentos oligoméricos solubles del anticuerpo CD27L que se forman se recogen del medio de cultivo sobrenadante.
Las modificaciones covalentes de proteínas de unión al antígeno se incluyen dentro del alcance de la presente invención, y generalmente, pero no siempre, se realizan en la etapa post-traducción . Por ejemplo, se introducen en la molécula varios tipos de modificaciones covalentes de la proteína de unión al antígeno mediante la reacción específica de residuos aminoácidos de la proteína de unión al antígeno con un agente derivante orgánico que puede reaccionar selectivamente con residuos N- o C- · terminales de las cadenas laterales.
Los residuos cisteina se hacen reaccionar con mayor frecuencia con a-haloacetatos (y sus correspondientes aminas), como ser ácido cloroacético o cloroacetoamida, para dar derivados carboximetílicos o carboxiamidometílicos . Los residuos cisteina también se derivan por reacción con bromotrifluoroacetona, ácido a-bromo-ß- ( 5-imidozoil) propiónico, fosfato de cloroacetilo, N-alquilmaleimida, disulfuro de 3-nitro-2-piridilo, \ disulfuro de metil-2-piridilo, p-cloromercuriobenzoato, 2-cloromercurio-4-nitrofenol, o cloro-7-nitrobenzo-2-oxa-l, 3-diazol.
Los residuos de histidina se derivan por reacción con dietilpirocarbonato a pH 5.5-7.0 porque este reactivo es relativamente especifico para la cadena lateral de histidina. También es útil el bromuro de p-bromofenacilo; preferiblemente la reacción .debe realizar en cacodilato de sodio 0.1M a pH 6.0.
Los residuos de lisina y los amino terminales se hacen reaccionar con anhídrido ácido succinico u otro anhídrido de ácido carboxílico. La derivación con estos reactivos tiene el efecto de revertir la carga de los residuos de lisina. Otros reactivos apropiados para la derivación de residuos que contengan grupos al.fa-amino incluyen los imidoésteres como metil picolinimidato; fosfato de piridoxal; piridoxal; cloroborohidruro; ácido trinitrobencensulfónico; 0-metilisourea; 2 , 4-pentanodiona; asi como la reacción de catálisis de transaminasas con glioxilato.
Los residuos de arginina . se modifican por reacción con uno o varios reactivos convencionales, entre ellos fenilglioxal, 2 , 3-butanodiona, 1, 2-ciclohexanodiona, y ninhidrina. La derivación de los residuos de arginina requiere que la reacción se lleve a cabo en condiciones alcalinas debido al elevado valor de pKa del grupo funcional guanidina. Asimismo, estos reactivos pueden reaccionar tanto con los grupos de lisina como con el grupo épsilon-amino de arginina.
La modificación especifica de los residuos tirosina puede realizarse, con particular interés en la introducción de etiquetas espectrales en los residuos tirosina, mediante reacción con diazo compuestos aromáticos o tetranitrometano . Más frecuentemente, se utiliza N-acetilimidizola y tetranitrometano para formar- especies de 0-acetil tirosil y derivados de 3-nitro, respectivamente. Los residuos tirosinase iodinizan con 125I o 131I para producir proteínas marcadas para su utilización en ensayos radioinmunológicos , siendo adecuado el método de cloroamina T descrito anteriormente.
Los grupos carboxilos de cadenas laterales (aspartil o glutamil) son modificados selectivamente por reacción con carbodiimidas donde R y R1 son en forma opcional diferentes grupos alquilo, tal como l-ciclohexil-3- (2-morfolinil-4-etil) carbodiimida o l-etil-3- ( 4-azonia-4 , 4 -dimetilpentil) carbodiimida. Asimismo, los residuos aspartil y glutamil se conviertan en residuos asparaginil y glutaminil por reacción con iones amonio.
La derivación con agentes bifuncionales es útil para el reticulado de proteínas de unión al antígeno en una matriz o una superficie soporte insoluble en agua, para su uso en una variedad de métodos. Algunos' agentes de crosslinking comúnmente utilizados son,- por ejemplo, 1 , 1-bis (diazoacetil ) - 2-feniletano, glutaraldehido, ásteres ' N-hidroxisuccinimida, por ejemplo, ésteres con ácido 4-azido salicilico, imidoésteres homobifuncionales, los cuales incluyen los disuccinimidil ésteres. tales como 3, 3 ' -ditiobis (succinimidil propionato) , y las maleimidas bifuncionales, tales como bis-N-maleimido-1 , 8-octano . Los agentes derivantes como el metil- 3- [ (p-azidofenil ) ditio] propioimidato producen intemedios fotoactivables capaces de formar reticulación en presencia de luz. En forma alternativa, se utilizan para inmovilización de proteínas las matrices reactivas insolubles en agua, tales como carbohidratos cianógenos activados por bromuro y los sustratos reactivos descritos en US Pat. Nos. 3969287; 3691016; 4195128; 4247642; 4229537; y 4330440.
Los residuos glutaminil y asparaginil son frecuentemente deamidados a los correspondientes residuos glutamil y aspartil, respectivamente. En forma alternativa, estos residuos son deamidados bajo condiciones ligeramente ácidas. Ambas formas de estos residuos están comprendidas dentro del alcance de la presente invención.
Otras modificaciones incluyen la hidroxilación de la prolina y lisina, la fosforilación de los grupos hidroxilos de residuos seril o treonil, la metilación de los grupos examino de las cadenas laterales de lisina, arginina e histidina (T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman & Co., San Francisco, 1983, pp. 79-86), la acetilación de la amina terminal N y la amidación de cualquier grupos carboxilo terminal C.
Otro tipo de modificación covalente de la proteina de unión al antigeno incluida dentro del alcance de la presente invención comprende la alteración del patrón de glicosilación de la proteína. Como es sabido en la técnica, los patrones de glicosilación pueden depender tanto de la secuencia de la proteína (por ejemplo, la presencia o ausencia de residuos aminoácidos de glicosilación particulares, como se detalla más adelante) como de la célula huésped en la cual la proteína es producida. A continuación se describen sistemas de expresión particulares.
La glicosilación de polipéptidos es típicamente N-ligada u 0-ligada. N-ligada se refiere a la unión de la porción carbohidratada a la cadena lateral de un residuo de asparagina. Las secuencias tri-pétidicas asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, donde X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para la unión enzimática de la porción carbohidratada a la cadena lateral de asparagina. Por tanto, la presencia de cualquiera de estas secuencias tri-peptídicas en un polipéptido crea un sitio de glicolisación potencial. La glicolización 0-ligada se refiere a la unión de uno de los azúcares de N-acetilgalactosamina, galactosa, o xilosa, a un hidroxi-aminoácido, más comúnmente serina o treonina, aunque 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina también pueden ser usadas.
La adición de sitios de glicosilación a la proteína de unión al antígeno se logra convenientemente alterando la secuencia aminoácida tal que contenga una o más de las secuencias tri-peptídicas descritas anteriormente (para sitios de glicosilación N-ligados) . La alteración también puede ser por alteración de, o sustitución por, uno o más residuos de serina o treonina para comenzar la secuencia (para sitios de glicosilación O-ligados) . Para mayor facilidad, la secuencia aminoácida de la proteína de unión al antígeno es preferentemente alterada a través de cambios al nivel de ADN, particularmente con mutaciones del ADN que codifica para polipéptido objetivo en bases preseleccionadas , tal que se generen codones que se traduzcan en los aminoácidos deseados.
Otra forma de aumentar el número de porciones carbohidratadas en la proteína de unión al antígeno es por acoplamiento químico . o enzimático de glicósidos a la proteína. Estos procedimientos cuentan con la ventaja que no requieren producción de proteínas en una célula huésped que tenga capacidad de glicosilación para glicosilaciones N- y Coligadas. Según sea el modo de acoplamiento utilizado, el azúcar (s) puede unirse a (a) arginina e histidina, (b) grupos carboxilo libres, (c) grupos sulfhidrilo tales como aquellos de la cistina, (d) grupos hidroxilo libres tales como aquellos de serina, treonina, o hidroxi prolina, (e) residuos aromáticos tales como aquellos de fenilalanina, tirosina, o triptófano, o (f) el grupo amida de glutamina. Estos métodos se describen en WO 87/05330 publicado 11 de Set., 1987, y en Aplin y Wriston, 1981, CRC Crit. Rev. Biochem. , pp. 259-306.
La remoción de porciones carbohidratadas presentes en la proteína de unión al . antígeno original puede ser lograda químicamente o enzimáticamente . La deglicosilación requiere la exposición de la proteína al compuesto ácido trifluorometanosulfónico, o un compuesto equivalente. Este tratamiento resulta en a escisión de la mayoría o todos los azúcares excepto el azúcar ligando (N-acetilglucosamina o N-acet.i lgalactosamina) , dejando el polipéptido intacto. La deglicosilación química está ' descrita por Hakimuddin et al., 1987, Arch. Biochem. Biophys . 259:52 y by Edge et al., 1981, Anal. Biochem. 118:131. La escisión enzimática de las porciones carbohidratadas pueden lograrse con el uso de una variedad de endo- y exo-glicosidasas, según describe Thotakura et al., 1987, Meth. Enzymol. 138:35C. La glicosilación en sitios de glicosilación portencial puede ser impedida por el uso del compuesto tunicamicina, tal como lo describen Duskin et al., 1982, J. Biol. Chem. 257:3105. La tunicamicina bloquea la formación de enlaces proteína-N-glicósido.
Otro tipo de modificación covalente de la proteína de unión al antígeno comprende, la unión de la misma a varios polímeros no proteicos-, incluyendo, de manera no limitante, varios polioles tales como as polietilen glicol, polipropylen glicol o polioxialquilenos, del modo expuesto en Pat. E.U.A. Nos. 4640835; 4496689; 4301144; 4670417; 4791192 o 4179337. 9! Además, como es sabido en la técnica, las sustituciones aminoácidas pueden ser en varias posiciones dentro de la proteina de unión al antigeno, de modo de facilitar la adición de los polímeros tales como PEG.
En algunas modalidades, la modificación de las proteínas de unión al antígeno de la invención comprende la unión de uno o más marcadores.
El término "grupo de marcadores" refiere a cualquier nivel detectable. Ejemplos de grupos de marcadores adecuados incluyen, de manera no limitante, los siguientes: radioisótopos o radionucleidos (por ejemplo, 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, "Te, llxIn, 125I, 131I), grupos fluorescentes (por ejemplo, FITC, rodamina, fósforos de lantánidos) , grupos enzimáticos por ejemplo, peroxidasa de rábano (HRP) , ß-galactosidasa, luciferasa, alcalino fosfatasa) , grupos quimioluminiscentes, grupos biotinilo, o polipéptidos epitópicos predeterminados reconocidos por un indicador secundario (por ejemplo, de secuencias de pares de cremallera de leucina, sitios de unión para anticuerpos secundarios, dominios de unión de metales, marcadores epitópicos) . En algunas modalidades, el grupo de marcado es acoplado a la proteína de . unión al antígeno por vía de brazos espaciadores de varios largos para reducir el potencial impedimento esférico. Se conocen varios métodos de marcado de proteínas en la técnica, los cuales pueden ser usados al ejecutar la presente invención.
En general, los marcadores caen en una variedad de clases, dependiendo del ensayo en el cual serán detectados a) marcadores isotópicos, los cuales pueden ser radioactivos o isótopos pesados; . b) marcadores magnéticos (por ejemplo, partículas magnéticas); c) porciones reducción oxidación-activas; d) tinciones ópticas; grupos enzimáticos (por ejemplo peroxidasa de rábano (HRP) , ß-galactosidasa, luciferasa, alcalino fosfatasa) ; e) grupos biotinilzados ; y f) polipéptidos epitópicos predeterminados reconocidos por un indicador secundario (por ejemplo, secuencias de pares de cremallera de leucina, sitios de unión para anticuerpos secundarios, dominios de unión de metales, marcadores epitópicos) . En algunas modalidades, el grupo de marcado es acoplado a la proteína de unión al antígeno por vía de brazos espaciadores de varios largos para reducir el potencial impedimento estérico. Se conocen varios métodos de marcado de proteínas en la técnica y pueden ser usados al ejecutar la presente invención.
Marcadores específicos de tinturas ópticas incluyen de manera no limitante, cromóforos, fósforos y fluoróforos, siendo este último específico en muchas instancias. Fluoróforos pueden ser' "moléculas pequeñas" fluorescentes o proteináceos fluorescentes.
Por "marcador fluorescente" se entiende cualquier molécula que pueda ser detectada a través de su propiedad fluorescente inherente. Marcas fluorescentes adecuadas incluyen de manera no limitante, fluoresceina, rodamina, tetrametilrodamina, eosina, eritrosina, coumarina, metil-coumarínas, pireno, verde Malacita, estilbeno, amarillo Lucifer, Azul J Cascada, Rojo Texas, IAEDANS, EDANS, BODIPY FL, LC Red 640, Cy 5, Cy 5.5, LC Red 705, Verde Oregon, tinturas Alexa-Fluor (Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 430, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 660, Alexa Fluor 680), Azul Cascada, Amarillo Cascada y R-ficoeritrina (PE) (Molecular Probes, Eugene, OR) , FITC, Rodamina, y RojoTexas (Pierce, Rockford, IL) , Cy5, Cy5.5, Cy7 . (Amersham Life Science, Pittsburgh, PA) . Marcas fluorescentes adecuadas, incluyendo fluoróforos, se describen en Suitable optical Molecular Probes Handbook de Richard P. Haugland, expresamente incorporado por referencia en la presente memoria.
. Marcadores fluorescentes proteináceos adecuados también incluyen, de manera no limitante, proteina verde fluorescente, incluyendo especies Renilla, Ptilosarcus, o Aequorea de GF (Chalfie ' et al., 1994, Science. 263 : 802-805) , EGFP (Clontech Laboratories, Inc., Genbank Accession Number U55762) , proteína fluorescente azul (BFP, Quantum Biotechnologies, Inc. 1801 de Maisonneuve Blvd. West, 8th Floor, Montreal, Quebec, Canadá H3H 1J9; Stauber, 1998, Biotechniques 24:462-471; Heim et al., 1996, Curr. Biol. 6:178-182), proteína fluorescente amarillo realzado (EYFP, Clontech Laboratories, Inc.), luciferasa (Ichiki et al., 1993, J. Immunol. 150:5408-5417), ß-galactosidasa (Nolan et al., 1988, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 85:2603-2607) y Renilla (W092/15673, WO95/07463, WO98/14605, W098/26277, O99/49019, Patentes E.U.A. Nos. 5292658, 5418155, 5683888, 5741668, 5777079, 5804387, 5874304, 5876995, 5925558). Todas las referencias antes mencionadas están expresamente incorporadas en la presente memoria por referencia.
Polinucleótidos que codifican para las proteínas de unión al antigeno CD27L El alcance de la invención abarca los ácidos nucleicos que codifican para las proteínas de unión al antígeno CD27L, incluyendo los anticuerpos, tal como se definen en la presente memoria. Los ácidos nucleicos preferidos incluyen aquellos que codifica para los ejemplos de cadena ligera y pesada que se describen en la presente memoria.
Un ejemplo de ácido nucleico que codifica Abl LC es un ácido nucleico que comprende la secuencia que se define en SEO ID NO: 49.
Un ejemplo de ácido nucleico que codifica Ab2 LC es un ácido nucleico que comprende la secuencia que se define en SEQ ID NO: 50.
Un ejemplo de ácido nucleico que codifica Ab4 LC es un ácido nucleico que comprende la secuencia que se define en SEQ ID NO: 51.
Un ejemplo de ácido nucleico que codifica Ab5 LC es un ácido nucleico que comprende la secuencia que se define en SEQ ID NO: 52.
Un ejemplo de ácido nucleico que codifica Ab6 LC es un ácido nucleico que comprende la secuencia que se define en SEQ ID NO: 53.
Un ejemplo de ácido nucleico que codifica Ab7 LC es un ácido nucleico que comprende la secuencia que se define en SEQ ID NO: 54.
Un ejemplo de ácido nucleico que codifica Ab8 LC es un ácido nucleico que comprende la secuencia que se define en SEQ ID NO:55.
Un ejemplo de ácido nucleico que codifica. Abl HC es un ácido nucleico que comprende la secuencia que se define en SEQ ID NO: 3.
Un ejemplo de ácido nucleico que codifica Ab2 HC es un ácido nucleico que comprende la secuencia que se define en SEQ ID NO: 4.
Un ejemplo de ácido nucleico que codifica Ab4 HC es un ácido nucleico que comprende la secuencia que se define en SEQ ID NO: 5.
Un ejemplo dé ácido nucleico que codifica Ab5 HC es un ácido nucleico que comprende la secuencia que se define en SEQ ID NO : 6.
Un ejemplo de ácido nucleico que codifica Ab6 HC es un ácido nucleico que comprende la secuencia que se define en SEQ ID NO: 7.
Un ejemplo de ácido nucleico que codifica Ab7 HC es un ácido nucleico que comprende la secuencia que se define en SEQ ID NO: 8.
Un ejemplo de ácido nucleico que codifica Ab8 HC es un ácido nucleico que comprende la secuencia que se define en SEQ ID NO: 9.
Los aspectos de la invención incluyen las variantes de polinucleótidos (por ejemplo, debido a la degeneración) que codifican las secuencias de aminoácidos que se describen en la presente memoria.
Los aspectos de la invención . incluyen una variedad de modalidades que incluyen, de manera no limitante, las siguientes modalidades ejemplificativas .
Un polinucleótido aislado, donde dicho polinucleótido codifica para uno o más polipéptidos que comprenden una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del conjunto que comprende : A. 1. una secuencia del dominio variable de cadena ligera que es al menos 90% idéntica a una secuencia del dominio variable de cadena ligera descrita en SEQ ID NOs:63- 70; 2. una secuencia del dominio variable de cadena pesada que es al menos 90% idéntica a una secuencia del dominio variable de cadena pesada descrita en SEQ ID NOs : 17-24; 3. un dominio variable de cadena ligera de (1) y un dominio variable de cadena pesada de (2) ; y B. un dominio variable de cadena ligera que comprende una CDR1, CDR2, CDR3 y/o un dominio variable de cadena pesada que comprende una CDR1, CDR2, CDR3 que difieren en no más de un total de tres adiciones, sustituciones, y/o supresiones de aminoácidos en cada CDR a partir de las siguientes secuencias: 1. una CDR1 (SEQ ID NO: 71), CDR2 (SEQ ID NO:79), CDR3 (SEQ ID NO:87) de cadena ligera ' o una CDR1 (SEQ ID NO:25), CDR2 (SEQ ID NO:33), CDR3¦ (SEQ ID NO:41) de cadena pesada de Abl; 2. una CDR1 (SEQ ID NO:72), CDR2 (SEQ ID NO:80), CDR3 (SEQ ID NO:88) de cadena ligera o una CDR1 (SEQ ID NO:26), CDR2 (SEQ ID NO: 34), CDR3 (SEQ ID NO:42) de cadena pesada de Ab2 ; 3. una CDR1 (SEQ. ID NO:73) , CDR2 (SEQ ID NO : 81 ) , CDR3 (SEQ ID NO:89) de cadena ligera o una CDR1 (SEQ ID NO:27), CDR2 (SEQ ID NO: 35), CDR3 (SEQ ID NO:43) de cadena pesada de Ab3; 4. una CDR1 (SEQ ID NO:74), CDR2 (SEQ ID NO:82), CDR3 (SEQ ID NO: 90) de cadena ligera o una CDR1 (SEQ ID NO: 28 ), CDR2 (SEQ ID NO: 36), CDR3 (SEQ ID NO: 44) de cadena pesada de Ab4; 5. una CDRl (SEQ ID NO:75)., CDR2 (SEQ ID NO:83), CDR3 (SEQ ID NO:91) de cadena ligera o una CDRl (SEQ ID NO: 29), CDR2 (SEQ ID NO:37), CDR3 (SEQ ID NO:45) de cadena pesada de Ab5; 6. una CDR1 (SEQ ID NO:76), CDR2 (SEQ ID NO:84), CDR3 (SEQ ID NO: 92) de cadena ligera o una CDR1 (SEQ ID NO:30), CDR2 (SEQ ID NO: 38), CDR3 (SEQ ID NO: 46) de cadena pesada de Ab6; 7. una CDR1 (SEQ ID NO:77), CDR2 (SEQ ID NO:85), CDR3 (SEQ ID NO: 93) de cadena ligera o una CDRl (SEQ ID NO: 31) , CDR2 (SEQ ID NO: 39), CDR3 (SEQ ID NO: 47) de cadena pesada de Ab7; y 8. una CDRl (SEQ ID NO:78), CDR2 (SEQ ID NO: 86) , CDR3 (SEQ ID NO:94) de cadena ligera o una CDRl (SEQ ID NO: 32), CDR2 (SEQ ID NO: 40), CDR3 (SEQ ID NO: 48) de cadena pesada de Ab8.
En modalidades preferidas, el polipéptido codificado por el ácido nucleico aislado .es un componente de una proteína de unión al antígeno que se une a CD27L.
Pueden obtenerse secuencias de nucleótido que corresponden a las secuencias de aminoácidos que se describen en la presente memoria, para su utilización como sondas o iniciadores para el aislamiento de ácidos nucleicos o como secuencias pregunta para las búsquedas en bases de datos, mediante la "retro traducción" a partir de las secuencias de aminoácidos, o mediante la identificación de las regiones de identidad de aminoácidos con polipéptidos para los cuales se ha identificado la secuencia de ADN que los codifica. Puede emplearse la bien conocida técnica de reacción de polimerasa en cadena (PCR) para aislar y amplificar una secuencia de ADN que codifican para una proteína de unión al antígeno CD27L o una combinación deseada de fragmentos polipeptídicos de una proteína de unión al antígeno CD27L. Se utilizan como iniciadores 5' y 3' los oligonucleótidos que definen los terminales deseados de la combinación de fragmentos de ADN. De manera adicional, los oligonucleótidos pueden contener sitios de reconocimiento para. las enconucleasas de restricción, de manera de facilitar la inserción de la combinación amplificada de fragmentos de ADN en un vector de expresión. Las técnicas de PCR se describen en Saiki et al., Science 239: 487 (19-88); Recombinant ARN Methodology, u et al., eds., Academic Press, Inc., San Diego (1989), pp. 189-196; y PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Innis et. al., eds., Academic Press, Inc. (1990).
Las moléculas de ácidos nucleicos de la invención incluyen ADN y ARN en ambas formas de hebra simple y de hebra doble, asi como las correspondientes secuencias complementarias. El término ADN incluye, por ejemplo, ADNc, ADN genómico, AND sintetizado químicamente, ADN amplificado por PCR, y combinaciones de éstos. Las moléculas de ácidos nucleicos de la invención incluyen genes de longitud completa o moléculas de ADNc así como una combinación de fragmentos de éstos. Los ácidos nucleicos de la invención preferentemente son derivados de fuentes humanas, pero la invención también incluye aquellos que son derivados de una especie no humana.
Un "ácido nucleico aislado" es un ácido nucleico que ha sido separado de sus secuencias genéticas presentes en el genoma de la forma de organismo a partir de la cual se aisló el ácido nucleico, en el caso de ácidos nucleicos aislados de fuentes naturales. " En el caso de ácidos nucleicos sintetizados enzimáticamente a partir de un molde o químicamente, tales como los productos de PCR, las moléculas de ADNc, o los oligonucleótidos , por ejemplo, ha de entenderse que los ácidos nucleicos que resultan de dichos procesos son ácidos nucleicos aislados. Una molécula de ácido nucleico aislado se refiere a una molécula de ácido nucleico en la forma de un fragmento separado o como un componente de un constructo de ácido nucleico de mayor tamaño. En una modalidad preferida, los ácidos nucleicos se encuentran sustancialmente libres de cualquier material endógeno contaminante. La molécula de ácido nucleico se ha derivado preferentemente a partir de ADN o ARN aislado al menos una vez en forma sustancialmente pura y en una cantidad y concentración que permite la identificación, manipulación y recuperación de sus secuencias de nucleótido constitutivas mediante métodos bioquímicos estándar (tales como los que se describen en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)). Dichas secuencias preferentemente se proporcionan y/o construyen en la forma de un marco de lectura abierto ininterrumpido por secuencias internas no traducidas, o intrones, que .típicamente se encuentran presentes en los genes eucarióticos . Pueden encontrarse secuencias de ADN no traducidas en 5' o 3' a partir del marco de lectura abierto, donde las mismas no interfieren con la manipulación y la expresión de la región de codificación.
La presente invención también incluye los ácidos nucleicos que se hibridan bajo condiciones moderadamente fuertes, y más preferentemente condiciones altamente fuertes, a ácidos nucleicos que codifican para proteínas de unión al antígeno CD27L tal como se describen en la presente memoria. Los parámetros básicos que afectan la elección de las condiciones de hibridación y las directrices para el diseño de las condiciones adecuadas fueron descritos por Sambrook, Fritsch, y Maniatis (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., capítulos 9 y 11; y Current Protocols in Molecular Biology, 1995, Ausubel et al., eds . , John Wiley & Sons, Inc., secciones 2.10 y 6.3-6.4), y cualquiera que posea capacitación básica en la técnica puede determinarla fácilmente basándose en, por ejemplo, la longitud y/o composición de bases del ADN. Una forma de alcanzar condiciones moderadamente fuertes involucra el uso de una solución de prelavado que contiene 5 x SSC, 0.5% SDS, 1.0 mM EDTA (pH 8.0), buffer de hibridación de alrededor de 50% formamida, 6 x SSC,' y una temperatura de hibridación de alrededor de 55 grados C (u otras soluciones de hibridación similares, tales como las que contienen alrededor de 50% formamida, con una temperatura de hibridación de alrededor de 42 grados C) , y condiciones de lavado de alrededor de 60 grados C, en 0.5 x SSC, 0.1% SDS. En términos generales, se define a las condiciones - altamente fuertes como las condiciones de hibridación que se exponen más arriba, excepto que el lavado se realiza a aproximadamente 68 grados C, 0.2 x SSC, 0.1% SDS. .Puede sustituirse SSC (lxSSC es 0.15M NaCl y 15 mM citrato de sodio) por SSPE (lxSSPE es 0.15M NaCl, 10 mM NaH.sub.2 PO.sub.4, y 1.25 mM EDTA, pH 7.4) en la hibridación y soluciones amortiguadoras de lavado; se realizan lavados durante 15 minutos después de completada la hibridación. Ha de entenderse que la temperatura de lavado y la concentración de sal de lavado pueden ajustarse en la medida necesaria para alcanzar un grado de fuerza deseado mediante la aplicación de los principios básicos que gobiernan las reacciones de hibridación y la estabilidad dúplex, tal como es conocida por los expertos en la técnica y se describe más adelante (ver, por ejemplo, Sambrook et al., 1989). Cuando un ácido nucleico se híbrida a un ácido nucleico objetivo de secuencia desconocida, se asume que la longitud del híbrido será la del ácido nucleico que se híbrida. Cuando se hibridan ácidos nucleicos de secuencia conocida, puede determinarse la longitud del híbrido mediante el alineamiento de las secuencias de los ácidos nucleicos y la identificación de la región o regiones de óptima complementariedad de secuencias. La temperatura de hibridación para los híbridos cuya longitud se anticipa será menor que 50 pares de bases debe ser de 5 a 10 grados C menos que la temperatura de fusión (Tm) del híbrido, donde Tm se determina de acuerdo a las siguientes expresiones. Para los híbridos cuya longitud es menos de 18 pares de bases, Tm (grados C) = 2 (# de bases A + T) + 4 (# de # bases G + C) . Para los híbridos de más de 18 pares de bases de longitud, Tm (grados C) = 81.5 + 16.6(logi0 [Na+] ) + 0.41 (% G + C) - (600/N), donde N es el número de bases en el híbrido, y [Na+] es la concentración' de iones sodio en l solución amortiguadora de hibridación ( [Na+] para lxSSC = 0.165M). Preferentemente, cada uno de dichos ácidos nucleicos posee una longitud que · es al menos 15 nucleótidos (o más preferentemente al menos 18 nucleótidos, o al menos 20 nucleótidos, o al menos 25 nucleótidos, o al menos 30 nucleótidos, o al menos 40 nucleótidos, o más preferentemente al menos 50 nucleótidos), o al menos 25% (más preferentemente al menos 50%, o al menos 60%, o al menos 70%, y más preferentemente al menos 80%) de la longitud del ácido nucleico de la presente invención al cual se híbrida, y posee al menos 60% de identidad de secuencia (más preferentemente al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 81%, al menos 82%, al menos '83%, al menos 84%, al menos 85%, al menos 86%, al menos 87%, al menos 88%, al menos 89%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, o al menos 99%, y más preferentemente al menos 99.5%) con el ácido nucleico de la presente invención al cual se híbrida, donde la identidad de secuencia se determina mediante la comparación de las . secuencias de los ácidos nucleicos que se hibridan cuando están alineadas de forma de maximizar el solapamiento y la identidad a la vez que se minimizan las brechas en la secuencia como se describe más arriba en mayor detalle .
Las variantes conforme a la invención se preparan de la manera habitual mediante mutagénesis de punto específicas de los nucleótidos en el ADN que codifican para la proteína de unión al antígeno, utilizando un cásete o mutaciones PCR u otras técnicas bien conocidas en la técnica, para producir ADN que codifican para la variante, y luego expresando el ARN recombinante en células de cultivo como se describe en la presente memoria. Sin embargo, mediante síntesis in vitro usando técnicas bien conocidas, pueden prepararse fragmentos de las proteínas de unión al antígeno que comprenden CDR variantes que poseen hasta alrededor de 100-150 residuos. Estas variantes típicamente exhiben la misma actividad biológica cualitativa que el análogo natural, por ejemplo, la unión a CD27L, mientras que también pueden seleccionarse variantes que poseen características modificadas tal como se detalla más adelante en mayor detalle.
Como puede apreciar un experto en la técnica, debido a la degeneración del código genético, puede prepararse un número extremadamente alto de ácidos nucleicos, todos los cuales codifican para las CDR (y las cadenas pesadas y ligeras u otros componentes de la proteína de unión al antígeno) de la presente invención. Por tanto, habiendo identificado una secuencia aminoácida en particular, un experto en la técnica podría preparar cualquier número de ácidos nucleicos sencillamente modificando uno o más codones en forma tal que no altera la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada.
La presente invención asimismo da a conocer sistemas y constructos de expresión en la forma de plásmidos, vectores de expresión, casetes de transcripción o expresión que comprenden al menos un polinucleótido conforme a lo establecido más arriba. Por otra parte, la invención da a conocer células huésped que comprenden dichos sistemas o constructos de expresión.
Típicamente, los vectores de expresión utilizados en cualquiera de las células huésped contendrán secuencias para el mantenimiento del plásmido y para la clonación y expresión de secuencias de nucleótidos exógenas. Dichas secuencias, a las que se les refiere en forma colectiva como "secuencias de flanqueo", en ciertas modalidades típicamente incluirán una o más de las siguientes secuencias de nucleótidos: un promotor, una o más secuencias mejoradoras, un origen de replicación, una secuencia de terminación transcripcional , la secuencia completa de un intrón que contiene un sitio de empalme donante y uno aceptor, una secuencia que codifican para una secuencia líder para la secreción de un polipéptido, un sitio de unión al ribosoma, una secuencia de poliadenilación, una región de policonector para la inserción del ácido nucleico que codifica para el polipéptido a expresar, y un elemento marcador seleccionable . Cada una de estas secuencias se describe más adelante.
En forma opcional, el vector puede contener una "etiqueta" que codifican para una secuencia, es decir, una molécula de oligonucleótido ubicada en el extremo 5' o 3' de la secuencia que codifica para la proteína de unión al antígeno CD27L; la secuencia de oligonucleótido codifica para poliHis (tal como hexaHis) , o u otra "etiqueta" tal como FLAG, HA (virus de influenza hemaglutinina) , o myc, para los cuales los anticuerpos se encuentran disponibles a nivel comercial. Esta etiqueta típicamente se fusiona al polipéptido seguido a la expresión . del polipéptido, y puede servir como forma de purificación de la afinidad o la detección de la proteina de unión al antigeno CD27L a partir de la célula huésped. La purificación de la afinidad puede lograrse, por ejemplo-, mediante cromatografía de columna utilizando anticuerpos contra la etiqueta como matriz de afinidad. En forma opcional, luego puede retirarse la etiqueta de la proteína de unión al antígeno CD27L purificada de varias maneras, tales como utilizando ciertas peptidasas para la escisión.
Las secuencias de flanqueo pueden ser homologas (es decir, de la misma especie' y/o cepa de célula huésped) , heterólogas (es decir, a partir de una especie diferente a la especie o cepa de la célula huésped) , híbridas (es decir, una combinación de secuencias de flanqueo de más de una fuente) , sintéticas o nativas. Como tal, la fuente de una secuencia de flanqueo puede ser cualquier organismo procariota o eucariota, cualquier organismo vertebrado o invertebrado, o cualquier planta, siempre que la secuencia de flanqueo sea funcional en, y pueda ser activada por, la maquinaria de la célula huésped.
Pueden obtenerse secuencias de flanqueo útiles en los vectores de la presente invención mediante cualquiera de los métodos bien conocidos en la técnica. Típicamente, las secuencias de flanqueo útiles en la presente memoria deberán previamente haber sido identificadas por mapeo y/o mediante digestión con endonucleasa de restricción y por tanto pueden ser aisladas de la fuente de tejido adecuada utilizando las endonucleasas de restricción apropiadas. En algunos casos, puede conocerse la secuencia de nucleótidos completa de una secuencia de flanqueo. En este caso, la secuencia de flanqueo puede sintetizarse mediante los métodos que se describen en la presente memoria para la síntesis o clonación de ácidos nucleicos.
Ya sea que se conozca la totalidad o sólo una porción de la secuencia de flanqueo, puede obtenerse mediante la reacción de polimerasa en cadena (PCR) y/o mediante el análisis de una biblioteca genómica con una sonda adecuada tal como un fragmento de oligonucleótido y/o secuencia de flanqueo a partir de la misma u otra especie. Cuando no se conoce la secuencia de flanqueo, puede aislarse un fragmento de ADN que contiene una secuencia de flanqueo a partir de una porción mayor de ADN que puede contener/ por ejemplo, una secuencia de codificación o incluso otro u otros genes. Puede lograrse el aislamiento mediante la digestión con endonucleasas de restricción para producir el fragmento de ADN adecuado, seguido de la purificación en gel de agarosa, la cromatografía de columna Qiagen® (Chatsworth, CA) , u otros métodos que han de ser bien conocidos por el experto en la técnica. La selección de enzimas adecuadas para lograr este propósito será relativamente evidente para un profesional en la técnica.
Un origen de replicación típicamente es una parte de aquellos vectores de expresión procariotas que pueden adquirirse comercialmente, y el origen ayuda en la amplificación del vector en la célula huésped. Si el vector que se eligió no contiene un sitio de réplica, puede sintetizarse uno por métodos químicos basándose en una secuencia conocida, el cual puede ligarse al vector. Por ejemplo, el origen de replicación a partir del plásmido pBR322 (New England Biolabs, Beverly, MA) es adecuado para la mayoría de las bacterias gram-negativas , y varios orígenes virales (por ejemplo, SV40, polioma, adenovirus, virus de estomatitis vesicular (VSV) , o virus de papiloma tales como HPV o BPV) resultan útiles para la clonación de vectores en células mamíferas. en general, el componente de origen de replicación no es necesaria en los vectores de expresión mamíferos (por ejemplo, a menudo se utiliza el origen SV40 sólo porque asimismo contiene el promotor temprano del virus) .
Una secuencia de terminación de la transcripción típicamente se ubica en la posición 3' del extremo de una región que codifica para un polipéptido y sirve para terminar la transcripción. Habitualmente, una secuencia de terminación en células 'procariotas es un fragmento rico en G-C seguido de una secuencia de poli-T. Mientras que la secuencia puede clonarse fácilmente a partir de una biblioteca, o incluso adquirirse comercialmente como parte de un vector, también puede fácilmente sintetizarse utilizando métodos para la síntesis de ácidos nucleicos, tales como los que se describen en la presente memoria.
Un gen marcador que puede seleccionarse codifica para una proteína necesaria para la supervivencia y el crecimiento de una célula huésped cultivada en medio de cultivo selectivo. Los genes marcadores seleccionables típicos codifican para proteínas que (a) confieren resistencia a los antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, tetraciclina, o canamicina para las células huésped procariotas; (b) complementan las deficiencias auxotróficas de la célula; o (c) suministran nutrientes críticos que no se encuentran disponibles a partir de un medio complejo o definido. Algunos marcadores seleccionables específicos son el gen de resistencia a la canamicina, el gen de resistencia a la ampicilina y el gen de resistencia a la tetraciclina. De manera ventajosa, puede asimismo utilizarse^ un gen de resistencia a la neomicina para la selección en células huésped tanto procariotas como eucariotas.
Pueden utilizarse otros genes seleccionables para amplificar el gen que ha de expresarse. La amplificación es el proceso en el cual los genes que se requieren para la producción de una proteina critica para el crecimiento o la supervivencia de la célula se reiteran en tándem dentro de los cromosomas de generaciones sucesivas de células recombinantes . Los ejemplos de marcadores seleccionab] es adecuados para las células mamiferas incluyen la dihidrofolato reductasa (DHFR) y los genes de timidina quinasa carentes de .un promotor. Las células mamiferas transformantes se colocan bajo presión de selección donde sólo las transformantes que se adapten, de forma, única a la supervivencia en virtud del gen seleccionable presente en el vector. La presión de selección se impone mediante el cultivo de las células transformadas bajo condiciones en las cuales la concentración del agente de selección en el medio se aumenta en forma sucesiva, logrando la amplificación de tanto el gen seleccionable como el ADN. que codifica para otro gen, tal como un anticuerpo que es una proteina de unión al antigeno que se une al polipéptido CD27L. Como resultado, se sintetizan cantidades aumentadas de un polipéptido, tal como una proteina de unión al antigeno CD27L a partir del ADN amplificado.
Habitualmente se necesita un sitio de unión al ribosoma para la iniciación de la traducción de ARNm, el cual se caracteriza por una secuencia Shine-Dalgarno (procariotas) o una secuencia Kozak (eucariotas ) . El elemento se ubica típicamente a 3' del promotor y 5' de la secuencia que codifica para el polipéptido a expresar.- En ciertas modalidades, pueden unirse de manera funcional una o más regiones de codificación a un sitio interno de unión al ribosoma (IRES), permitiendo la traducción de dos marcos de lectura abiertos a partir de un único ARN transcripto.
En algunos casos, tales ¦ como donde se desea las glicosilación en un sistema de expresión con células huésped eucariotas, pueden manipularse las varias pre- o prosecuencias a fin de mejorar la glicosilación o el rendimiento. Por ejemplo, puede alterarse el sitio de ruptura de la peptidasa de un péptido señal particular, o añadir prosecuencias, lo cual también puede afectar la glicosilación. el producto proteico final puede poseer en la posición -1 (relativa al primer aminoácido de la proteína madura) uno o más aminoácidos adicionales incidentes en la expresión, los cuales pueden · no haber sido eliminados totalmente. Por ejemplo, el producto proteico final puede poseer uno o dos residuos aminoácidos en el sitio de escisión de la peptidasa, fijados al terminal amino. En forma alternativa, la utilización de algunos sitios de escisión enzimática puede derivar en una forma levemente truncada del polipéptido deseado, si la enzima corta en dicha área del polipéptido maduro.
Los vectores de expresión y clonación de la invención típicamente contendrán un promotor que es reconocido por el organismo huésped y se une de manera funcional a la molécula que codifican para la · proteína de unión al antígeno CD27L. Los promotores son secuencias no transcriptas que se ubican a continuación (es decir, 5') del comienzo de codón de un gen estructural (generalmente en el rango de alrededor de 100 a 1000 bp) que controla la transcripción del gen estructural. Los Promotores se agrupan de manera conveniente en una o dos clases: los promotores' inducibles y los promotores constitutivos. Los promotores inducibles inician los niveles au8mentados de transcripción a partir del ADN que está bajo su control en respuesta a algún cambio en las condiciones de cultivo, tal como la presencia o ausencia de un nutriente o un cambio en la temperatura. Los promotores constitutivos, por el otro lado, transcriben de manera uniforme los genes a los cuales están unidos de manera funcional, es decir, con poco o ningún control sobre la expresión del gen. Se conoce un gran número de promotores, reconocidos por una variedad de células huésped potenciales. Un promotor apropiado está unido de manera funcional al ADN que codifica para la cadena pesada o la cadena ligera que constituye una proteína de unión al antigeno CD27L de la invención mediante la eliminación del promotor del ADN fuente por digestión con enzimas de restricción y la inserción de la secuencia del promotor deseado en el vector.
También son bien conocidos en la técnica los promotores adecuados para su utilización con huéspedes de levadura. Se utilizan ventajosamente los mej oradores de levadura con los promotores de levadura. Son bien conocidos los promotores adecuados para su utilización con células huésped mamíferas, los cuales incluyen, de manera no limitante, aquellos que se obtienen a partir de genomas de virus tales como el virus de polioma, el virus de viruela aviar, el adenovirus (tal como el Adenovirus 2), el virus de papiloma bovino, el virus de sarcoma aviar, el citomegalo irus, los retrovirus, el virus de la hepatitis B y más preferentemente el virus simio 40 (SV40). Otros promotores mamíferos adecuados incluyen los promotores mamíferos heterólogos, por ejemplo, los promotores de choque térmico y los promotores de la actina.
Entre otros promotores adicionales de interés se incluyen, de manera no limitante: el promotor temprano de SV40 (Benoist y Chambón, 1981, Nature 290:304-310); el promotor de CMV (Thornsen et al., 1984, Proc. Nati. Acad. U.S. A. 81:659-663); el promotor contenido en la repetición terminal larga en 3' del virus de sarcoma de Rous (Yamamoto et al., 1980, Cell 22:787-797); el promotor de. timidina quinas de herpes (Wagner et al'., 1981, Proc. Nati. Acad. Sel. U.S. A. 78:1444-1445); el promotor y las secuencias reguladoras obtenidas de gen de metalotionina (Prinster et al., 1982, Nature 296:39-42); y los promotores procariotas tales como el promotor de béta-lactamasa (Villa- amaroff et al., 1978, Proc. Nati. Acad. Sci.. U.S. A. 75:3727-3731); o el promotor tac (DeBoer et al., 1983, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A. 80:21-25) . También son de interés las siguientes regiones de control transcripcional animales, las cuales exhiben especificidad de tejido y han sido utilizadas en animales transgénicos : la región de control del gen de la elastasa I que es activo en las células acinares pancreáticas (Swift et al., 1984, Cell 38:639-646; Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant . Biol . 50:399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7:425-515); la región de control del gen de la insulina que es activa en las células beta pancreáticas (Hanahan, 1985, Nature 315:115-122); la región de control del gen de inmunoglobulina que es activo en las células linfoides (Grosschedl et al., 1984, Cell 38:647-658; Adames et al., 1985, Nature 318:533-538; Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7:1436-1444); la región de control del virus, de tumor de mamas de ratón que es activo en las células testiculares , de mama, linfoides y mastoides (Leder et al., 1986, Cell 45:485-495); la región de control del gen de albúmina que es activo en el hígado (Pinkert et al., 1987, Genes y Devel . 1 :268-276); la región de control del gen de alfafetoproteina que es activo en. l hígado (Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648; Hammer et al., 1987, Science 253:53-58); la región de control del gen de alfa 1-antitripsina que es activo en el hígado (Kelsey et al., 1987, Genes y Devel. 1:161-171); la región de control del gen de beta-globina que es activo en las células mieloides (Mogram et al., 1985, Nature 315:338-340; Kollias et al.,. 1986, Cell 46: 89-94 ) ; la región de control del gen de proteína básica de mielina que es activo en las células oligodentrocíticas del cerebro (Readhead e al., 1987, Cell 48:703-712); la región de control del gen de lá cadena ligera 2 de miosina que es activo en el músculo esquelético (Sani, 1985, Nature 314:283-286) ; y la región de control del gen de la hormona liberadora de gonadotrofinas que es activo en el hipotálamo (Masón et al., 1986, Science 234 : 1372-1378) .
Puede insertarse una secuencia mej oradora en el vector a fin de aumentar la transcripción del ADN que codifican para la cadena pesada o la cadena ligera que constituye una proteína de unión al antígeno CD27L de la invención en los eucariotas superiores. Los mej oradores son elementos de acción cis del ADN, hábitualmente de alrededor de 10-300 bp de longitud, que actúan sobre el promotor de manera de aumentar la transcripción. Los mej oradores son relativamente dependientes de la orientación y la posición, y han sido encontrados en las posiciones tanto 5' como 3' respecto a la unidad de transcripción. Se conocen varias secuencias de mejoradores que se encuentran disponibles a partir de genes mamíferos (por ejemplo, globina, elastasa, albúmina, alfafetoproteína e insulina) . Típicamente, sin embargo, se utiliza un mejorador obtenido a partir de un virus. El mejorador de SV40, el mejorador del promotor temprano del citomegalovirus , el mejorador de polinoma, y los mejoradores de adenovirus conocidos en la técnica son ejemplos de elementos mejoradores para la activación de los promotores eucariotas. Mientras que un mejorador puede estar ubicado en el vector en ya sea 5' o 3' respecto a una secuencia de codificación, típicamente se ubica en el sitio 5' a partir del promotor. Puede incorporarse una secuencia que codifican para una secuencia señal nativa o heteróloga adecuada (secuencia líder o péptido señal) en un vector de expresión, a fin de promover la secreción extracelular del anticuerpo. La elección del péptido señal o líder depende del tipo de células huésped en las cuales se ha de producir el anticuerpo, y puede remplazarse la secuencia señal nativa con una señal heteróloga. Algunos ejemplos de péptidos señal en células huésped mamíferas ' incluyen los siguientes: la secuencia señal para interleucina-7 (IL-7) que se describe en Patente EUA No. 4,965,195; la secuencia para el receptor de interleucina 2 que se describe en Cosman et al., 1984, Nature 312:768; el péptido señal del receptor de interleucina 4 descrito en Patente EP No. 0367 566; el péptido señal del receptor tipo I de interleucina 1 descrito en Patente E.ü.A. No. 4,968,607; el péptido señal del receptor tipo II de interleucina 1 descrito en patente EP No. 0 460 846.
El vector puede contener uno o más elementos que facilitan la expresión cuando el vector está integrado en el genoma de la célula huésped. Entre algunos ejemplos se incluye un elemento EASE. (Aldrich et al. 2003 Biotechnol Prog. 19:1433-38) y una región de fijación a la matriz (MAR). Las MAR median la organización estructural de la cromatina y pueden aislar al vector integrado del efecto "posición". Por tanto, las MAR son particularmente útiles cuando se utiliza un vector para crear transíectantes estables. Se conocen en la técnica un conjunto de ácidos nucleicos naturales y sintéticos que contienen MAR, por ejemplo, Pat . E.U.A. Nos. 6,239,328; 7,326,567; 6,177,612; 6,388,066; 6,245,974; 7,259, 010; 6, 037, 525; 7, 422, 874; -7,129, 062.
Pueden construirse los vectores de expresión de la invención utilizando un vector de. partida tal como un vector que se encuentra comercialmente disponible. Dichos vectores pueden o no contener todas las secuencias de flanqueo deseadas. Cuando una o más de las secuencias de flanqueo descritas en la presente memoria no se encuentran ya presentes en el vector, deben obtenerse de manera individual y ligarse al vector. Los métodos que se utilizan para obtener cada una de las secuencias de flanqueo son bien conocidos por un profesional en la técnica.
Una vez que se ha construido el vector y se ha insertado en el sitio adecuado del vector una molécula de ácido nucleico que codifica para una cadena ligera, una cadena pesada, o una cadena ligera y una cadena pesada que comprenden una secuencia de unión al antigeno CD27L, puede insertarse el vector completado en una célula huésped adecuada para su amplificación y/o la expresión del polipéptido. La transformación de un vector de expresión para una proteina de unión al antigeno CD27L en una célula huésped seleccionada puede lograrse mediante métodos bien conocidos, incluyendo la transíección, la infección, la coprecipitación con fosfato de calcio, la electroporación, la microinyección, la lipofección, la transfección mediada por DEAE-dextrano, u otras técnicas conocidas. El método seleccionado será en parte función del tipo de célula huésped a utilizar. Estos métodos y otros métodos adecuados son bien conocidos por un experto en la técnica, y se describen, por ejemplo, en Sambrook et al., 2001, ver más arriba.
Una célula huésped, cuando se cultiva bajo las condiciones apropiadas, sintetiza una proteína de unión al antígeno CD27L que puede luego, recolectarse a partir del medio de cultivo (si la célula huésped la secreta en el medio) o directamente a partir de la célula huésped que la produce (si no es secretada) . La selección de una célula huésped apropiada dependerá de varios factores, tales como los niveles de expresión deseados, las modificaciones de polipéptidos que son deseables o necesarias para la actividad (tales como la glicosilación o fosforilación) y la facilidad de plegado a una molécula bilógicamente activa. Una célula huésped puede ser eucariota o' procariota.
Es bien conocido en la -técnica el uso de líneas celulares mamíferas para la expresión, incluidas, de manera no limitante, las · líneas de células inmortalizadas disponibles a partir de American Type Culture Collection (ATCC) y puede utilizarse cualquiera de las líneas celulares que se utilizan en un sistema de expresión conocido en la técnica para obtener los polipéptidos recombinantes de la invención. En general, las células huésped se transforman con un vector de expresión recombinante que comprende ADN que codifica para un polipéptido deseado de un anticuerpo CD27L.
Entre las células huésped que pueden emplearse se encuentran las procariotas, las levaduras o las eucariotas superiores. Las procariotas incluyen los organismos gram negativos y los gram positivos, por ejemplo E. coli o los bacilos. Las células eucariotas superiores incluyen las células de insecto y las lineas de células establecidas de origen mamífero. Entre los ejemplos de líneas de células huésped mamíferas adecuadas se encuentra la línea COS-7 de células de riñon de mono (ATCC CRL 1651) (Gluzman et al., 1981, Cell 23:175), las células L, las células 293, las células C127, las células 3T3 (ATCC CCL 163), las células de ovario de hámster chino (CHO) , o sus derivados, tales . como Veggie CHO y las líneas de células relacionadas que crecen en medio libre de suero (Rasmussen et al., 1998, Cytotechnology 28: 31), las células HeLa, las líneas celulares BHK (ATCC CRL 10) , y la línea celular CVI/EBNA derivada a partir de la línea de células de riñon de mono verde' africano CVI (ATCC CCL 70) tal como se describe en McMahan et al., 1991, E BO J. 10: 2821, las células de riñon embriónico humanas tales como 293, 293 EBNA o MSR 293, las células epxdermales humanas A431, las células humanas Colo205, otras líneas de células de primate transformadas, las células de diploide normal, las cepas de células derivadas del cultivo in vitro de tejido primario, explantes primarios, células HL-60, U937, HaK o Jurkat. En forma opcional, pueden utilizarse lineas de células mamiferas tales como HepG2/3B, KB, NIH 3T3 o S49, por ejemplo, para la expresión del polipéptido cuando se desea utilizar_ el polipéptido en varios ensayos de transducción de señal o de reportero. En forma alternativa, es posible producir el polipéptido en eucariotas inferiores tales como levaduras o en procariotas tales como las bacterias. Entre las levaduras apropiadas se incluyen Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces strains, Candida, o cualquier cepa de levadura capaz de expresar polipéptidos heterólogos. Entre las cepas de bacteria adecuadas se incluyen Escherichia coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium, o culalquier cepa de bacteria que sea capaz de expresar polipéptidos eteróilogos. Si el polipéptido se produce en levadura o bacteria, puede ser deseable modificar el polipéptido producido allí, por ejemplo mediante fosforilación o glicosilación de los sitios apropiados, a fin de obtener el polipéptido funcional. Pueden lograrse estas uniones covalentes utilizando métodos químicos o enzimáticos conocidos. El polipéptido también puede producirse mediante la unión funcional del ácido nucleico aislado de la invención a una secuencia de control adecuada en uno o más vectores de expresión de insectos, y empleando un sistema de expresión de insectos. Los materiales y métodos para los sistemas de expresión baculovirus/célula de insecto se encuentran disponibles comercialmente en forma de kit a partir de, por ejemplo, Invitrogen, San Diego, Calif., U.S. A. (the MaxBac® kit), y dichos métodos . son bien conocidos en la técnica, tal como se describe en Summers y Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No. 1555 (1987), y Luckow y Summers, Bio/'Technology 6:47 (1988). Asimismo, podrían emplearse sistemas de traducción sin células para producir polipéptidos utilizando fragmentos de ARN derivados de los constructos de ácidos nucleicos que se divulgan en la presente memoria. Los vectores de clonación y expresión adecuados para su uso con huéspedes celulares bacterianos, fúngicos, de levaduras y mamíferos fueron descritos por Pouwels et al. {Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York, 1985) . Una célula huésped que comprende un ácido nucleico aislado de la invención, preferentemente unida de manera funcional a al menos una secuencia de control de expresión, es una "célula huésped recombinante".
En ciertas modalidades, pueden seleccionarse líneas de células mediante la determinación de cuáles líneas de células poseen altos niveles de expresión y producen de manera constitutiva proteínas de unión al antígeno con propiedades de unión a CD27L. En otra modalidad, puede seleccionarse una línea de células de linaje de células B que no produce su propio anticuerpo pero que posee la capacidad.de producir y secretar un anticuerpo heterólogo.
Conjugados anticuerpo-fármaco Las modalidades de la invención incluyen conjugados anticuerpo fármaco (ADC) . Generalmente, los ADC comprenden un anticuerpo conjugado a un agente quimioterapéutico, por ejemplo, un agente citotóxico, un agente citostático o un agente radioactivo. Puede utilizarse una molécula . conectora para conjugar el fármaco al anticuerpo. Se conocen en la técnica una amplia variedad de conectores y fármacos útiles en la tecnología ADC, los cuales pueden utilizarse en las modalidades de la presente '· invención. (Ver US20090028856; US2009/0274713; US2007 /0031 02 ; WO2005/084390; WO2009/099728 ; US5208020; US5416064; US5475092; 5585499; 6436931; 6372738; y 6340701, todos los cuales se incorporan por referencia en la presente memoria) .
Los conjugados anticuerpo-fármaco pueden prepararse mediante métodos in vitro. Para conectar un fármaco o profármaco al anticuerpo, se utiliza un grupo conector. Se conocen en la técnica grupos conectores apropiados, entre los que se incluyen los grupos disulfuro, los grupos ácidos inestables, los grupos fotoinestables, los grupos inestables a la peptidasa y los grupos inestables a la esterasa. Los grupos conectores preferidos son los grupos disulfuro. Por ejemplo, pueden construirse conjugados utilizando una reacción de intercambio de disulfuro entre el anticuerpo y el fármaco o profármaco. Las moléculas de fármaco también pueden conectarse a un agente de unión a la célula a través de una molécula portadora intermediaria, tal como la albúmina de suero.
En ciertas modalidades, el agente de unión a la célula es modificado mediante la reacción de un reactivo bifuncional de reticulación con el agente de unión a la célula, derivando en enlace covalente de. una molécula conectora con el agente de unión a la célula. Tal como se utiliza en la presente memoria, un "reactivo bifuncional de reticulación" o "conector" es cualquier entidad química que enlaza de manera covalente un agente de unión a la célula con un fármaco, tal como los fármacos que se describen en la presente memoria. En una modalidad particular de la invención, el fármaco proporciona una porción de la entidad conectora. En este aspecto, el fármaco comprende una entidad conectora que es parte de una molécula conectora mayor que se utiliza para unir el agente de unión a la célula con el fármaco. Por ejemplo, para formar el maitansinoide DM1, la cadena lateral en el grupo C-3 hidroxilo de la maitansina se modifica de forma de contar con un grupo sulfhidrilo libre (SH) . Esta forma tiolada de la maitansina puede reaccionar con un agente de unión a la célula modificado de manera de formar un conjugado. Por tanto, el conector final se ensambla a partir de dos componentes, uno de los cuales lo proporciona el reactivo de reticulación, mientas que el otro lo proporciona la cadena lateral de DM1.
Puede utilizarse cualquier reactivo hifuncional de reticulación apropiado en relación con la invención en la media en que el reactivo conector considere la retención de la terapéutica, por . ejemplo, la citotoxicidad y las características de diana del fármaco y el aqente de unión a la célula, respectivamente. Preferentemente, la molécula conectara une el fármaco con el agente de unión a la célula mediante enlaces químicos (como se describe más arriba), de manera tal que el fármaco y el agente de unión a la célula se encuentran acoplados químicamente (por ejemplo, enlazados covalentemente) uno al otro.
Conectores En ciertas modalidades, el ADC comprende un conector constituido por uno ¦ o más componentes del conector. Preferentemente, el fármaco está unido a un agente de unión a la célula mediante un puente disulfuro. La molécula conectora comprende un grupo químico reactivo que puede reaccionar con el agente de unión a la célula. Los grupos químicos reactivos preferidos para la reacción con el agente de unión a la célula son N-süccinimidil ésteres y N-sulfosuccinimidil ésteres. De manera adicional, la molécula conectora comprende un grupo químico reactivo, preferentemente u grupo ditiopiridilo, que puede reaccionar con el fármaco para formar un enlace disulfuro. Ejemplos de moléculas conectoras incluyen, por ejemplo, N-succinimidil 3- (2-piridilditio) propionato (SPDP) (ver, por ejemplo, Carlsson et al., Biochem. J. , 173, 723-737 (1978)), N-succinimidil 4- (2-piridilditio) butanoato (SPDB) (ver, por ejemplo, Pat . EUA. No. 4,563,304} y N-succinimidil 4- (2-piridilditio) pentanoato (SPP) (ver, por ejemplo, CAS Registry number 341498-08-6) . Otros ejemplos de componentes de conectores incluyen 6-maleimidocaproilo, maleimidopropanoilo, valina-citrulina, alanina-fenilalanina, p-aminobenziloxicarbonilo, y aquellos que derivan de la conjugación con reactivos conectores, incluyendo, de manera no limitante, N-succinimidil 4- (2-piridiltio) pentanoato ("SPP"), N-succinimidil 4-(N-maleimidometil) ciclohexano-.l carboxilato ("SMCC," también llamado en la presente memoria "MCC") , y N-succinimidil (4-iodo-acetil) aminobenzoato ("SIAB") .
Los conectores pueden ser "escindible" o "no escindible" (Ducry y Stump, Bioconjugate Chem. 2010, 21, 5-13; incorporado por referencia en su totalidad en la presente memoria) . Los conectores escindibles están diseñados para liberar el fármaco cuando está sujeto a ciertos factores ambientales, por ejemplo, cuando es internalizado en la célula objetivo. Los conectores escindibles incluyen los conectores de ácidos inestables, los conectores sensibles a las proteasas, los conectores fotoinestables , los conectores dimetilo o los conectores que contienen disulfuro. Los conectores no escindibles tienden a permanecer asociados de manera covalente con al menos un aminoácido del anticuerpo y el fármaco después de la internalización por y la degradación en la célula objetivo. Un conector no escindible es cualquier entidad química capaz de u8nir un fármaco, tal como un maitansinoide (por ejemplo, DM1,- y similares), un taxano, o un análogo CC-1065, con un agente de unión de manera covalente y estable.' Por tanto, los conectores no escindibles son sustancialmente resistentes a la escisión inducida por ácidos, la escisión inducida por la luz, la escisión inducida por una peptidasa, la escisión inducida por la esterasa, y la escisión del enlace disulfuro, en condiciones bajo las cuales el fármaco o el agente de unión a la célula permanece activo.
Se conocen en la técnica reactivos de reticulación apropiados que forman conectores no escindibles entre un fármaco y el agente de unión a la célula. Los ejemplos de conectores no escindióles incluyen los conectcres que poseen un grupo N-succinimidil éster o N-sulfosuccinimidil éster para la reacción con el agente de unión a la célula, asi como una entidad basada en maleimido o haloacetilo para la reacción con el fármaco. Los reactivos conectores para el reticulación que comprenden una entidad basada en maleimido incluyen N-succinimidil 4- (maleimidometil ) ciclohexanocarboxilato (S CC) , N-succinimidil-4- (N-maleimidometil) -ciclohexano-l-carboxi- ( 6-amidocaproato) , el cual es un análogo de "cadena larga" de SMCC (LC--SMCC) , ácido x-maleimidoundecanoico N-succinimidil éster (KMUA) , ácido . gamma . -maleimidobutírico N-succinimidil éster (GMBS) , ácido . epsilon . -maleimidocaproico N-hidroxisuccinimida éster (EMCS) , m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida éster (MBS) , N- ( . alfa . -maleimidoacetoxi ) -succinimida éster (AMAS), succinimidil-6- ( . beta . -maleimidopropionamido) hexanoato (SMPH) , N-succinimidil 4- (p-maleimidofenil ) -butirato (SMPB) , y N- (p-maleimidofenil ) isocianato (PMPI) . Los agentes de reticulación que comprenden una entidad basada en haloacetilo incluyen N-succinimidil-4- ( iodoacetil ) -aminobenzoato (SIAB) , N-succinimidil iodoacetato (SIA) , N-succinimidil bromoacetato (SBA) , y N-succinimidil 3- (bromoacetamido) propionato (SBAP) . Un ejemplo de conector no escindible preferido es MCC.
También pueden utilizarse en el método de la invención otros conectores reactivos de reticulación que carecen un átomo de azufre que forman conectores no escindibles. Dichos conectores pueden derivarse a partir de entidades basadas en ácidos dicarboxilicos . Las entidades basadas en ácidos dicarboxilicos adecuadas incluyen, de manera no limitante, los ácidos alfa, omega dicarboxilicos de fórmula general (IX): HOOC--Xi--Yn--Zm--COOH (IX), donde X es un grupo alquilo, alquenilo, o . alquinilo lineal ó ramificado que posee de 2 a 20 átomos de carbono, Y es un grupo cicloalquilo o cicloalquenilo que contiene de 3 a 10 átomos de carbono, Z es un grupo aromático sustituido o no sustituido que contiene de 6 a 10 átomos de carbono, o un grupo heterocíclico' sustituido o no sustituido donde el heteroátomo se selecciona de N, O, o S, y donde cada uno de 1, m, y n son 0 o 1, siendo que 1, m, y n no son todos cero al mismo tiempo.
Muchos de los conectores no escindibles que se divulgan en la presente memoria, se describen en detalle en la Publicación de Solicitud de Patente E. U .'A..2005/0169933 Al.
Los ejemplos de ' conectores escindibles incluyen los conectores de disulfuro, los conectores de ácidos inestables, los conectores fotoinestab'les, los conectores inestables a la peptidasa, y los conectores inestables a la esterasa. Los conectores que contienen disulfuro son conectores escindibles mediante el intercambio de disulfuro, el cual puede ocurrir bajo condiciones fisiológicas. Los conectores de ácidos inestables son conectores escindibles a pH ácido. Por ejemplo, ciertos compartimientos . intracelulares , tales como los endosomas y los lisosomas, poseen un pH ácido (pH 4-5) , y proveen las condiciones adecuadas para los conectores de ácidos inestables. Los conectores fotoinestables son útiles en la superficie del cuerpo y en muchas cavidades corporales que son accesibles a la luz. Por otra parte, la luz infrarroja puede penetrar el tejido. Los conectores inestables a la peptidasas pueden utilizarse para la escisión de ciertos péptidos dentro o fuera de las células (ver, por ejemplo, Trouet et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 79, 626-629 (1982), y Umemoto et al., Int. J. Cáncer, 43, 677-684 (1989) ) .
Fármacos En ciertas modalidades, el anticuerpo se conjuga a un agente quimioterapéutico . Los ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen los agentes alquilinantes , tales como tiotepa y ciclofosfamida (CYTOXA . TM. ) ; alquil sulfonatos tales como busulfano, improsulfano y piposulfano; las aziridinas, tales como benzodopa, carboquona, meturedopa, y uredopa; las etileniminas y. metilamelaminas incluyendo altretamina, trietilenemelamina, trietilenefosforamida , trietilenetiofosfaoramida y trimetilolomelamina; las acetogeninas (especialmente bulatacina y bulatacinona) ; una camptozecina (incluido el análogo sintético topotecan) ; briostatina ; calistatina; CC-1065 (incluidos sus análogos sintéticos adozelesina, carzelesina y bizelesina) ; las criptoficinas (en particular criptoficina 1 y criptoficina 8); dolastatina ; duocarmicina (incluidos los análogos sintéticos, KW-2189 y CBI-TMI); eleuterobina; pancratistatina; una sarcodictina; spongistatina; las mostazas de nitrógeno, tales como clorambucil, clomafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, hidrocloruro de óxido de mecloretamina, melfalan, novembichina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida , mostaza de uracilo; las nitrosureas, tales como carmustina, clorozotocina, fotemustina, lomustina, nimustina, ranimustina; los antibióticos, tales como los antibióticos de enedina (por ejemplo caliqueamicina, especialmente caliqueamicina .gammal y caliqueamicina theta I, ver, por ejemplo, Angew Chem. Intl. Ed. Engl . 33:183-186 (1994); dinemicina, incluida la dinemicina A; una esperamicina; asi como el cromóforo neocarzinostatina y los cromóforos antibióticos de cromoproteina enedina asociados), las aclacinomisinas , actinomicina, autramicina, azaserina, las bleomicinas, cactinomicina, carabicina, caminomicina, carzinofilina; las cromomicinas , dactinomicina , daunorubicina, detorubicina, ' 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorubicina (incluidas morfolino-doxorubicina, cianomorfolino-doxorubicina, 2-pirrolino-doxorubicina y deoxidoxorubicina) , epirubicina, esorubicina, idarubicina, marcelomicina, las nitomicinas, ácido micofenólico, nogalamicina, las olivomicinas , peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, streptonigrina, streptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; anti-metabolitos , tales como metotrexato y 5-florouracil (5-FU) ; los análogos del ácido fólico, tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; los análogos de la purina, tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; los análogos de la pirimidina, tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, dideoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina, 5-FU; los andrógenos, tales como calusterona, propionato de dromostanolona, epitiostanol , mepitiostano, testolactona; los anti-adrenales , tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; el renovador de ácido fólico, tal como el ácido frolinico; aceglatona; glicósido de aldofosfamida ; ácido aminolevulinico; amsacrina; bestrabucil ; bisantrene; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elfomitina; acetato de eliptinio; una epotilona; etoglúcido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinan; lonidamina; maitansinoides, tales como maitansina y las ansamitocinas ; mitoguazona; mitoxantrona; mopidamol; nitracrina; pentostatina; fenamet; pirarubicina; ácido podofilinico; 2-etilhidrazida; procarbazina; PSK.RTM.; razoxano; rizoxina; sizofurano; spirogermanio; ácido tenuazónico; triaziquona; 2 , 2 ' , 2 ' ' -triclorotrietilamina; los tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurina A, roridina A y anguidina) ; uretán; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromán; gacitosina; arabinosida ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; los taxoides, por ejemplo paclitaxel (TAXOL . T . , Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.) y doxetaxel (TAXOTERE . RTM . , Rhone-Poulenc Rorer, Antony, Francia); clorambucil; gemcitabina; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; los análogos del platino tales como cisplatin y carboplatina; vinblastina; el platino; etoposida (VP-16) ; ifosfamida; mitomicina C; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina; navelbina; novantrona; teniposida; . daunomicin.a; aminopterina; xeloda; ibandronato; CPT-11; inhibidor de toposisomerasa RFS 2000; difluorometilomitina (DMFO) ; ácido retinoico; capecitabina ; y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables · de cualquiera de ellos. También se incluyen en esta definición los agentes anti-hormonales que actúan en la regulación o inhibición de la acción de las hormonas sobre los tumores, tales como los anti-estrógeneos, incluidos, por ejemplo, tamoxifeno, raloxifeno, los 4 (5) -imidazoles que inhiben la aromatasa, 4-hidroxitamoxifeno, trioxifeno, keoxifeno, LY117018, onapristona, y toremifeno (Fareston) ; y anti-andrógenos, tales como flutamida, nilutamida, bicalutamida , leuprolida, y goserelina; siARN y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables- de cualquiera de ellos. Otros agentes quimioterapéuticos que . pueden utilizarse con la presente invención se divulgan en Publicación EUA No. 20080171040 o Publicación EUA No. 20080305044 y se incorporan por referencia en su totalidad.
Se contempla que un anticuerpo puede conjugarse con dos o más agentes quimioterapéuticos diferentes o una composición farmacéutica puede comprender una mezcla de anticuerpos donde el componente anticuerpo es idéntico excepto en que está conjugado a diferentes agentes quimioterapéuticos. Dichas modalidades pueden ser útiles en el abordaje de múltiples vías biológicas con una célula objetivo.
En modalidades preferidas, el ADC comprende un anticuerpo conjugado a una o más moléculas maitansinoides , las cuales son inhibidores mitóticos que actúan inhibiendo la polimerización de la tubulina. Los maitansinoides, incluidas varias modificaciones, se describen en Pat . EUA. Nos. 3896111; 4151042; 4137230; 4248870; 4256746; 4260608; 4265814; 4294757; 4307016; 4308268; 4309428; 4313946; 4315929; 4317821; 4322348; 4331598; 4361650; 4364866; 4424219; 4450254; 4362663; 4371533; y O 2009/099728. Las entidades maitansinoides que se utilizan como fármacos pueden aislarse a partir de fuentes naturales, producirse mediante tecnología recombinante, o prepararse sintéticamente. Los ejemplos de maitansinoides incluyen C-19-declloro (Pat. EUA. No. 4256746), C-20-hidroxilo (o C-20-dimetilo) +/- C-19-dicloro (Pat. EUA. Nos. 4307016 y 4361650), C-20-dimetoxi (o C-20-aciloxi (-OCOR) , +/- dicloro (Pat. EUA. No. 4294757), C-9-SH (Pat. EUA. No. 4,424,219), C-14-alcoximetilo (dimetoxi/CH20R) (Pat. EUA. No. 4,331,598), C-14-hidroximetilo o aciloximetilo (CH20H o CH20Ac) (Pat. EUA. No. 4,450,254), C-15-hidroxilo/aciloxi (Pat. EUA. No. 4,364,866), C-15-metoxi (Pat. EUA. Nos. 4,313,946 y 4,315,929), C-18-N-dimetilo (Pat. EUA. Nos. 4,362,663 y 4,322,348), y 4,5-dioxi (Pat. EUA. No. 4,371,533) .
Pueden utilizarse varias posiciones en los compuestos maitansinoides como la posición de unión, Dependiendo del tipo de unión deseada. Por ejemplo, para formar una unión tipo éster, la posición C-3 que posee un grupo hidroxilo, la posición C-14 modificada con hidroximetilo, la posición C-15 modificada con un grupo hidroxilo, y la posición C-20 que posee un grupo hidroxilo son todas apropiadas (Pat. EUA. Nos. 5208020, RE39151, y 6913748; Sol. de Pub. de Patente EUA. Nos. 20060167245 y 20070037972, y WO 2009099728).
Los maitansinoides preferidos incluyen aquellos que son conocidos en la técnica como DM1, DM3, y DM4 (Sol. de Pub. de Patente EUA. Nos. 2009030924 y 20050276812, los cuales se incorporan por referencia en la presente memoria) .
Los ADC que contienen maitansinoides, los métodos para elaborar dichos ADC, y su uso terapéutico se divulgan en Patente EUA Nos. 5208020 y 5416064, Sol. de Pub. de Patente EUA. No. 20050276812, y WO 2009099728 (todos ellos incorporados por referencia en la presente memoria) . Los conectores que son útiles ' para preparar dichos ADC de maintansinoides son conocidos en la técnica (Pat. EUA. No. 5208020 y Sol. de Pub. de Patente EUA. Nos. 2005016993 y 20090274713; todos los cuales se incorporan por referencia en la presente memoria) . Los ADC de maitansinoides que comprenden un conector SMCC pueden prepararse tal como se divulga en Pub. de Pat. EUA. No. 2005/0276812.
En ciertas modalidades, el ADC comprende un anticuerpo conjugado a DM1 con un conector SMCC. Las modalidades preferidas incluyen Abl-SMCC-DMl, Ab2-SMCC-DM1, Ab3-SMCC-DM1 , Ab4-SMCC-DM1, Ab5-SMCC-DM1 , Ab6-SMCC-DM1 , Ab7-SMCC-DM1 , y Ab8-SMCC-DM1.
Carga del fármaco Un ADC puede poseer de 1 a 20 agentes quimioterapéuticos por anticuerpo. Las composiciones de ADC pueden caracterizarse según el número promedio de entidades farmacológicas por molécula de anticuerpo en la composición. El número promedio . de entidades farmacológicas puede determinarse por medios convencionales, tales como la espectrometría de masa, el inmunoensayo, y HPLC. En algunos casos, una población de ADC homogénea puede separarse y purificarse mediante HPLC de fase inversa o electroforesis . Por tanto, las composiciones farmacéuticas de ADC pueden contener una población .heterogénea u homogénea de anticuerpos unidos a 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 o más entidades farmacológicas.
En modalidades preferidas, el ADC comprende un anticuerpo conjugado a una o más moléculas de DM1. Las modalidades de la invención incluyen composiciones que comprenden un promedio de alrededor de 1, alrededor de 2, alrededor de 3, alrededor de 4, alrededor de 5, alrededor de 6, alrededor de 7, alrededor de 8, alrededor de 9, alrededor de 10, alrededor de 11, alrededor de 12, alrededor de 13, alrededor de 14, alrededor de 15, alrededor de 16, alrededor de 17, alrededor de' 18, alrededor de 19, o alrededor de 20 moléculas DMl por anticuerpo. Las composiciones de ADC preferidas son aquellas que comprenden un Abl, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, o Ab8 que posee en promedio entre 1 y 10 moléculas DMl por anticuerpo, aquellas que comprenden anticuerpos que poseen en promedio entre 3 y 7 moléculas DMl por anticuerpo, y aquellas que comprenden anticuerpos que poseen en promedio entre 4 y 6 moléculas de DMl, incluyendo un promedio de alrededor de 4.0, alrededor de 4.1, alrededor de 4.2, alrededor de 4.3, alrededor de 4 .4, alrededor • de 4. 5 alrededor de 4. 6, alrededor de 4.7, alrededor de 4. 8 alrededor de 4. 9, alrededor de 5.0, alrededor de 5. 1 alrededor de 5. 2, alrededor de 5.3, alrededor de 5. 4 alrededor de 5. 5, alrededor de 5.6, alrededor de 5.· 7 alrededor de 5. 8, alrededor de 5.9 y alrededor de 6 • moléculas DMl por anticuerpo .
Anticuerpos con función efectora mejorada Una de las funciones de la porción Fe de un anticuerpo es comunicar al sistema inmunitario cuando el anticuerpo se une a su diana. Se considera lo anterior como "función efectora". La comunicación deriva en la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) , la fagocitosis celular dependiente del anticuerpo (ADCP) , y/o la citotoxicidad dependiente de un complemento (CDC) . ADCC y ADCP son mediadas por la unión de Fe a los receptores de Fe en la superficie de las células del sistema inmunitario. CDC es mediada por la unión de Fe con las proteínas del sistema complemento, por ejemplo, Clq.
Las subclases de IgG varían en su capacidad para mediar la función efectora. Por ejemplo IgGl es muy superior a IgG2 y IgG4 en la mediación de ADCC y CDC. Por tanto, en las modalidades donde una célula que expresa CD27L es el objetivo de destrucción, se preferirá un anticuerpo IgGl anti-CD27L.
La función efectora de un anticuerpo pude aumentarse, o disminuirse, mediante la introducción de una o más mutaciones en el Fe. Las modalidades de la invención incluyen proteínas de unión al antígeno, por ejemplo, anticuerpos, que poseen un Fe obtenido mediante ingeniería genética tal que conduce a un aumento en la función efectora (U.S. 7,317,091 y Strohl, Curr. Opin. Biotech., 20:685-691, 2009; ambas de las cuales se incorporan por referencia en la presente memoria en su totalidad). Algunos ejemplos de moléculas Fe de IgGlque poseen una función efectora aumentada incluyen (basándose en el esquema de numeración de Kabat) aquellas que poseen las siguientes sustituciones: S239D/I332E S239D/A330S/I332E S239D/A330L/I332E S298A/D333A/K334A P247I/A339D P247I/A339Q D280H/K290S D280H/K290S/S298D D280H/K290S/S298V F243L/R292P/Y300L F243L/R292P/Y300L/P396L F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L K326W/E333S K290E/S298G/T299A K290N/S298G/T299A K290E/S298G/T299A/K326E K290N/S298G/T299A/K326E Algunas modalidades adicionales de la invención incluyen proteínas de unión al antigeno, por ejemplo, anticuerpos, que poseen un Fe obtenido mediante ingeniería genética tal que conduce a una disminución en. la función efectora. Algunos ejemplos de moléculas Fe que poseen una función efectora disminuida incluyen (basándose en el esquema de numeración de Kabat) aquellas que poseen las siguientes sustituciones: N297A (IgGl) L234A/L235A (IgGl) V234A/G237A (IgG2) L235A/G237A/E318A (IgG4.) H268Q/V309L/A330S/A331S (IgG2) C220S/C226S/C229S/P238S (IgGl) C226S/C229S/E233P/L234V/L235A (IgGl) L234F/L235E/P331S ¦ (IgGl) S267E/L328F (IgGl) Otro método para aumentar la función efectora de las proteínas que contienen Fe de IgG es la disminución de la fucosilación de Fe. La eliminación de la fucosa central de los oligosacáridoss del tipo complejo biantenario unido a Fe aumentó en gran medida la función efectora de ADCC sin alterar la unión al antígeno ni la función efectora de CDC. Se conocen varias formas de disminuir o eliminar la fucosilación de las moléculas que contienen Fe, por ejemplo, los anticuerpos. Entre ellas se incluye la expresión recombinante en ciertas líneas de células mamíferas, incluyendo una línea deficiente en FUT8, la línea de CHO variante Lecl3, la línea de células de hibridoma de rata YB2/0, una línea de células . que comprende un pequeño fragmento de ARN de interferencia específicamente contra el gen FUT8, y una línea de células que coexpresa B-l,4-N- acetilglucosaminiltransferasa III y -manosidasa II de Golgi. E forma alternativa, la molécula que contiene Fe puede expresarse en una célula no mamifera, tal como una célula de planta, levadura o una célula procariota, por ejemplo, E. coli. Por tanto, en ciertas modalidades de la invención, una composición comprende un anticuerpo, por ejemplo, Abl, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, Ab6, Ab7, o Ab8, que posee fucosilación disminuida o que carece de fucosilación.
Composiciones Farmacéuticas En algunas modalidades, la invención da a conocer una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de una o una pluralidad de las proteínas de unión al antígeno de la invención junto con un diluyente, portador, solubilizante, emulsionante, conservante y/o adyuvante farmacéuticamente efectivo. En ciertas modalidades, la proteína de unión al antígeno es un anticuerpo, incluyendo un anticuerpo conjugado al fármaco o un anticuerpo biespecífico . Las composiciones farmacéuticas de la invención incluyen, de manera no limitante, composiciones líquidas,, congeladas y liofilizadas .
Preferentemente, los ingredientes de la formulación son no tóxicos para los receptores en las dosis y concentraciones utilizadas. En modalidades específicas, se dan a conocer composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad terapéuticamente efectiva de una proteina de unión al antigeno CD27L, por ejemplo, una ADG de unión a CD27L.
En ciertas modalidades, la composición farmacéutica puede contener ingredientes de formulación para modificar, mantener o conservar, por ejemplo, el pH, osmolaridad, viscosidad, claridad, color, isotonicidad, olor, esterilidad, estabilidad, velocidad de disolución o liberación, adsorción o penetración de la composición. En dichas modalidades, los ingredientes de formulación adecuados incluyen, de manera no limitante, aminoácidos (como glicina, glutamina, asparragina, arginina, prolina, o lisina) ; antimicrobianos; antioxidantes (como ácido ascórbico, sulfito de sodio o hidrógeno sulfito de sodio) ; soluciones amortiguadoras (como borato, bicarbonato, Tris-HCl, citratos, fosfatos u otros ácidos orgánicos) ; agentes de carga (como manitol o glicina) ; agentes quelantes (como el ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) ) ; agentes complejantes (como cafeína, polivinilpirrolidona, beta-ciclodextrina o hidroxipropil-beta-ciclodextrina); agentes de relleno; monosacáridos ; disacáridos; y otros carbohidratos (como glucosa, mañosa o dextrinas) ; proteínas (como albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulinas ) ; agentes colorantes, aromatizantes y diluyentes; agentes emulsionantes; polímeros hidrofílicos (como polivinilpirrolidona); polipéptidos de bajo peso molecular; contraiones formadores de sales (como sodio) ; conservantes (como cloruro de benzalconio, ácido benzoico, ácido salicílico, timerosal, alcohol feniletilico , metilparabeno, propilparabeno, clorhexidina, ácido sórbico o peróxido de hidrógeno) ; solventes (como glicerina, propilenglicol o polietilenglicol) ; alcoholes de azúcar (como manitol o sorbitol) ; agentes de suspensión; tensoactivos o agentes humectantes (como plurónicos, PEG, ésteres de sorbitán, polisorbatos como polisorbato 20, polisorbato, tritón, trometamina, lecitina, colesterol, tiloxapal) ; agentes potenciadores de la estabilidad (como sacarosa o sorbitol) ; agentes potenciadores de la tonicidad (como haluros de metales alcalinos, preferentemente cloruro de sodio o potasio, .manitol, sorbitol) ; vehículos de administración; diluyentes; excipientes y/o adyuvantes farmacéuticos. Véase, REMINGTO ' S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18" Edition, (A. R. Genrmo, ed. ) , 1990, Mack Publishing Company.
En ciertas modalidades, la composición farmacéutica óptima será determinada por un profesional en la técnica dependiendo de, por ejemplo, la vía de administración prevista, el formato de administración y la dosis deseada. Véase, por ejemplo, REMINGTON ' S PHARMACEU ICAL SCIENCES, citado anteriormente. En ciertas modalidades, dichas composiciones pueden . influir en el estado físico, la estabilidad, la velocidad de liberación in vivo y la velocidad de eliminación in vivo de las proteínas de unión al antígeno de la invención. En ciertas modalidades, el portador o vehículo primario en una composición farmacéutica puede ser de naturaleza acuosa o' no acuosa. Por ejemplo, un vehículo o portador adecuado puede ser agua para inyección, solución salina fisiológica o líquido cefalorraquídeo artificial, complementado posiblemente con otros materiales comunes en composiciones para administración parenteral. La solución salina tamponada neutra o solución salina mezclada con albúmina sérica son vehículos adicionales a modo de ejemplo. En modalidades específicas, las composiciones farmacéuticas comprenden solución amortiguadoraTris de aproximadamente pH 7,0-8,5, o solución amortiguadoraacetato de aproximadamente pH 4,0-5,5,' y pueden incluir además sorbitol o un sustituto adecuado del mismo. En ciertas modalidades de la invención, las composiciones de proteína de unión al antígeno CD27L pueden prepararse para almacenamiento mezclando la composición seleccionada que tiene el grado de pureza deseado con · agentes de formulación opcionales (REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, citado anteriormente) en forma de una torta liofilizada o una solución acuosa.
Asimismo, en ciertas modalidades, el producto de proteína de unión al antígeno CD27L puede formularse como un liofilizado utilizando excipientes apropiados como la sacarosa.
Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden seleccionarse para administración parenteral. En forma alternativa, las composiciones pueden seleccionarse para inhalación o para administración a través del tubo digestivo, tal como por vía oral. La preparación de tales composiciones farmacéuticamente aceptables está dentro de los conocimientos de la técnica. Los componentes de la formulación están presentes preferentemente en concentraciones que son aceptables para el sitio de administración. En ciertas modalidades, se utilizan soluciones amortiguadoras para mantener la composición · en un pH fisiológico o en un pH ligeramente inferior, típicamente dentro de un intervalo de pH de entre aproximadamente 5 y aproximadamente 8.
Cuando se contempla la administración parenteral, las composiciones terapéuticas para uso en esta invención pueden proporcionarse en forma de una solución acuosa libre de pirógenos aceptable por vía parenteral, que contiene la proteína de unión al antígeno CD27L deseada en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Un vehículo particularmente apropiado para inyección parenteral es agua destilada estéril en la que la proteína de' unión al antígeno CD27L se formula como una solución estéril, isotónica, adecuadamente conservada. En ciertas modalidades, la preparación puede implicar la formulación de la molécula deseada con un agente, tal como microesferas inyectables, partículas bioerosionables, compuestos poliméricos (como ácido poliláctico o ácido poliglicólico) , perlas o liposomas, que pueden proporcionar la liberación sostenida o controlada del producto, el cual puede administrarse mediante inyección de depósito. En ciertas modalidades, puede usarse también ácido hialurónico, que tiene el efecto de promover la duración sostenida en la circulación. En ciertas modalidades, pueden utilizarse dispositivos de administración de fármacos implantables para introducir la proteína de unión al antígeno deseada.
Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden formularse para inhalación. En estas modalidades, las proteínas de unión al antígeno CD27L se formulan venta osamente como un polvo inhalable seco. En . modalidades específicas, las soluciones de inhalación de proteína de unión al antígeno CD2.7L pueden formularse también con un propelente para administración en aerosol. En ciertas modalidades, las soluciones pueden nebulizarse. Por tanto, se describen adicionalmente métodos de formulación y administración pulmonar en la Solicitud de Patente Internacional N° PCT/US94/001875, la cual se incorpora aquí por referencia y describe la administración pulmonar de proteínas modificadas químicamente .
También se considera que las formulaciones pueden administrarse por vía oral. Las proteínas de unión al antígeno CD27L que se administran de esta manera pueden formularse con o sin portadores usados habitualmente en la composición de formas de dosificación sólidas tales como comprimidos y cápsulas. En ciertas modalidades, una cápsula puede diseñarse para liberar la parte activa de la formulación en el punto del tracto gastrointestinal cuando la biodisponibilidad se maximiza y la degradación presistémica se minimiza. Pueden incluirse agentes adicionales para facilitar la absorción de la proteína de unión al antígeno CD27L. También pueden emplearse diluyentes, aromatizantes, ceras de bajo punto de fusión, aceites vegetales, lubricantes, agentes de suspensión, agentes de disgregación de comprimidos y aglutinantes.
Las composiciones farmacéuticas adicionales resultarán evidentes para los expertos en la técnica, incluyendo formulaciones que involucran proteínas de unión al antígeno CD27L en formulaciones de administración sostenida o controlada. Los expertos en la técnica también conocen técnicas para formular una variedad de otros medios de administración sostenida o controlada, tales como portadores de liposomas, microparticulas bioerosionables o perlas porosas e inyecciones de depósito. Véase, por ejemplo, la Solicitud de Patente Internacional N° PCT/US93/00829, la cual se incorpora aqui por referencia y describe la liberación controlada de microparticulas poliméricas porosas para la administración de . composiciones farmacéuticas. Las preparaciones de liberación sostenida pueden incluir matrices poliméricas semipermeables en forma de artículos conformados, por ejemplo, películas, o microcápsulas . Las matrices de liberación sostenida pueden incluir poliésteres, hidrogeles, polilactidas (tal como se divulga en la Patente de EE.UU. N° 3.773.919 y en la Publicación de Solicitud de Patente Europea N° EP 058481, cada una de las cuales se incorpora aquí por referencia), copolímeros del ácido L-glutámico y gamma etil-L-glutamato (Sidman et al.,. 1983, Biopolymers 2:547-556), poli (2-hidroxietil-metacrilato) (Langer et al., 1981, J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277 y Langer, 1982, Chem. Tech. 12:98-105), etileno vinil acetato (Langer et al., citado anteriormente) o ácido poli-D (-) -3-hidroxibutírico (Publicación de Solicitud de Patente Europea N° EP 133.988). Las composiciones . de liberación sostenida pueden incluir también liposomas que pueden prepararse mediante cualquiera de los varios métodos conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, Eppstein et al., 1985, Proc. Nati. Acad. Sel. USA 82:3688-3692; Publicaciones de Solicitud de Patente Europea N° EP 036.676; EP 088.046 y EP 143.949, incorporadas aquí por referencia .
Las composiciones farmacéuticas utilizadas para la administración in vivo se proporcionan típicamente como preparaciones estériles. La esterilización puede lograrse mediante filtración a través de membranas de filtración estériles. Cuando la composición se liofiliza, la esterilización usando este método puede llevarse a cabo o bien antes o bien después de la liofilización y reconstitución. Las composiciones para administración parenteral pueden almacenarse en forma liofilizada o en una solución. Las composiciones parenterales generalmente se colocan en un envase que tiene un puerto de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa de solución intravenosa o un vial que tiene un tapón que puede perforarse mediante una aguja de inyección hipodérmica.
Ciertos aspectos de la invención incluyen formulaciones auto-amortiguadas de proteína de unión al antígeno CD27L, las cuales pueden utilizarse como composiciones farmacéuticas, tal como se describe en la solicitud de patente internacional WO 06138181A2 (PCT/US2006/022599) , la cual se incorpora por referencia en su totalidad en la presente memoria.
Como se describió anteriormente, ciertas modalidades proporcionan composiciones proteicas de proteínas de unión al antígeno CD27L, particularmente composiciones farmacéuticas de proteínas de unión al antígeno CD27L, que comprenden, además de la proteína de - unión al antígeno CD27L, uno o más excipientes como los descritos a modo ilustrativo en esta sección y en otras secciones de la presente memoria. En este sentido, los excipientes pueden utilizarse en la invención para una amplia variedad de propósitos, tales como ajustar las propiedades físicas, químicas o biológicas de. las formulaciones, como el ajuste de la viscosidad, y/o procesos de la invención para mejorar la efectividad y/o para estabilizar dichas formulaciones y procesos frente a la degradación y el deterioro debidos a, por ejemplo, el estrés que ocurre durante la fabricación, el transporte, el almacenamiento, la preparación previa a la utilización, la administración y de ahí en adelante.
Existen diversos planteamientos acerca de los ingredientes de formulación y estabilización de proteínas y métodos útiles en este sentido, tales como Arakawa et al., "Solvent interactions in pharmaceutical formulations , " Pharm Res. 8(3): 285-91 (1991); Kendrick et al . , "Physical stabilization of proteins in aqueous solution," en: RATIONAL DESIGN OF STABLE PROTEIN FORMÜLATIONS: THEORY AND PRACTICE, Carpenter and anning, eds . Pharmaceutical Biotechnology. 13: 61-84 (2002), y Randolph et al., "Surfactant-protein interactions, " Pharm Biotechnol. 13: 159-75 (2002), cada una de las cuales se incorpora por referencia en su totalidad en la presente memoria, particularmente en partes relativas a excipientes y procesos de los mismos para formulaciones de proteínas auto-amortiguadas de acuerdo con la presente invención, especialmente en lo relativo a procesos y productos farmacéuticos proteicos para uso médico veterinario y/o humano.
De acuerdo con ciertas modalidades de la invención, pueden utilizarse sales para, por ejemplo, ajustar la fuerza iónica y/o la isotonicidad de una formulación y/o para mejorar la solubilidad y/o la estabilidad física de una proteína u otro ingrediente de una composición de acuerdo con la invención.
Como es bien sabido, los iones pueden estabilizar el estado nativo de las proteínas uniéndose a residuos cargados en la superficie de la proteína y protegiendo grupos cargados y polares en la proteína y reduciendo la fuerza de sus interacciones electrostáticas, interacciones de atracción y de repulsión. Los iones también pueden estabilizar el estado desnaturalizado de una proteína uniéndose, en particular, a los enlaces peptídicos desnaturalizados (-- CONH) de la proteína. · Asimismo, la interacción iónica con grupos cargados y polares en una proteina también puede reducir las interacciones electrostáticas intermoleculares y, de ese modo, impedir o reducir la agregación y la insolubilidad de las proteínas.
Las especies iónicas difieren significativamente en sus efectos sobre las proteínas. Se han desarrollado varias clasificaciones de categorías de iones y sus efectos sobre las proteínas, las cuales pueden utilizarse para la formulación de composiciones farmacéuticas de acuerdo con la invención. Un ejemplo' lo constituye la serie de Hofmeister, la cual clasifica solutos iónicos y polares no iónicos según su efecto en la estabilidad conformacional de las proteínas en solución. Los solutos estabilizadores se conocen como "cosmotrópicos" . Los solutos desestabilizadores se conocen como "caotrópicos" . Los cosmótropos se utilizan comúnmente en concentraciones altas (por ejemplo, sulfato de amonio >1 molar) para precipitar las proteínas de una solución ("insolubilización por salado") . Los caótropos se utilizan comúnmente para desnaturalizar y/o solubilizar proteínas ( "solubilización por salado") . La efectividad relativa de los iones para "solubilizar por salado" e "insolubilizar por salado" determina su posición en la serie de Hofmeister.
De acuerdo con' varias modalidades de la invención, en las formulaciones de proteina de unión al antigeno CD27L pueden utilizarse aminoácidos libres como agentes de carga, estabilizantes y antioxidantes, asi como para otros usos estándares. La lisina, la prolina, la serina y la alanina pueden utilizarse para estabilizar proteínas en una formulación. La glicina es útil en liofilización para asegurar la correcta estructura y propiedades de la torta. La arginina puede ser útil para inhibir la agregación de las proteínas, tanto en formulaciones líquidas como liofilizadas . La metionina es útil como antioxidante.
Los polioles incluyen azúcares, por ejemplo, manitol, sacarosa, y sorbitol y alcoholes polihídricos como, por ejemplo, glicerol y propilenglicol, y, a los efectos del análisis en la presente memoria, polietilenglicol (PEG) y sustancias relacionadas. Los polioles son cosmotrópicos . Son agentes estabilizantes útiles tanto en formulaciones líquidas como liofilizadas para proteger a las proteínas de los procesos de degradación física y química. Los polioles también son útiles para ajustar la tonicidad de las formulaciones.
Entre los polioles útiles en modalidades específicas de la invención se encuentra el manitol, comúnmente utilizado para asegurar la estabilidad estructural de la torta en formulaciones liofilizadas. El mismo garantiza la estabilidad estructural de la torta. Generalmente se utiliza con un lioprotector, por ejemplo, sacarosa. El sorbitol y la sacarosa están entre los agentes preferidos para ajusfar la tonicidad y como estabilizantes para proteger contra el estrés de congelación-descongelación durante el transporte o la preparación de producto a granel en el proceso de fabricación. Los azúcares reductores (los cuales contienen grupos aldehido o cetona libres) , tales como glucosa y lactosa, pueden glicar residuos superficiales de lisina y arginina. Por tanto, generalmente no están entre los polioles preferidos para utilizar de acuerdo con la invención. Asimismo, los azúcares que forman dichas especies reactivas, como la sacarosa, la cual se hidroliza a fructosa y glucosa en condiciones ácidas, y por consiguiente ocasiona la glicación, tampoco están entre los polioles preferidos de la invención en este sentido. El PEG es útil para estabilizar las proteínas y como crioprotector y puede ser utilizado en la invención en este sentido.
Las modalidades de formulaciones de proteína de unión al antígeno CD27L comprenden además tensoactivos. Las moléculas de proteína pueden ser susceptibles a la adsorción en superficies y a la desnaturalización y consecuente agregación en interfaces aire-líquido, sólido-líquido, y líquido-líquido. Estos efectos generalmente aumentan inversamente con la concentración de protelna. Estas interacciones perjudiciales generalmente aumentan inversamente con la concentración de proteína y típicamente se exacerban por agitación física, tal como la que se genera durante el transporte y manipulación de un producto.
Los tensoactivos se utilizan normalmente para impedir, minimizar o reducir la adsorción superficial. En este sentido, los tensoactivos útiles en la invención incluyen polisorbato 20, polisorbato 80, otros ésteres de ácidos grasos y sorbitán poliétoxilado, y poloxamer 188.
Los tensoactivos también se utilizan comúnmente para controlar la estabilidad conformacional de las proteínas. El uso de tensoactivos' en este sentido es específico para cada proteína, ya que cualquier tensoactivo dado típicamente estabilizará algunas proteínas y desestabilizará otras.
Los polisorbatos son susceptibles a la degradación oxidativa y a menudo contienen, tal como son comercializados, cantidades suficientes de peróxidos para causar la oxidación de cadenas laterales de residuos proteicos, especialmente metionina. Por consiguiente, los polisorbatos deben utilizarse con precaución, y cuando se utilizan, deben emplearse en su mínima concentración efectiva. En este sentido, los polisorbatos ejemplifican la regla general que establece que los excipientes deben utilizarse en su mínima concentración efectiva.
Las modalidades de formulaciones de proteina de unión al antigeno CD27L comprenden además uno o más antioxidantes. En cierta medida, la oxidación perjudicial de las proteínas en formulaciones farmacéuticas se puede impedir manteniendo niveles adecuados de temperatura y oxígeno ambiental y evitando la exposición a la luz. Los excipientes antioxidantes pueden utilizarse también para impedir la degradación oxidativa de las proteínas. En este sentido, entre los antioxidantes . útiles se encuentran los agentes reductores, secuestradores de radicales libres/oxígeno, y agentes quelantes. 'Los antioxidantes para uso en formulaciones terapéuticas de proteínas de acuerdo con la invención son preferentemente solubles en agua y mantienen su actividad durante toda la vida útil del producto. En este sentido, el EDTA es un antioxidante preferido de acuerdo con la invención.
Los antioxidantes pueden dañar a las proteínas. Por ejemplo, los agentes reductores como el glutatión en particular, pueden afectar a los puentes disulfuro intramoleculares. Por consiguiente, los antioxidantes para uso en la invención sé seleccionan de modo que, entre otras cosas, eliminen o reduzcan de manera suficiente la posibilidad de que ellos mismos dañen a las proteínas de la formulación.
Las formulaciones de acuerdo . con la invención pueden incluir iones metálicos que son cofactores proteicos y que son necesarios para ' formar complejos de coordinación proteicos, tal como el zinc necesario para formar ciertas suspensiones de insulina. Los iones metálicos también pueden inhibir algunos procesos que degradan a las proteínas. Sin embargo, los iones metálicos también catalizan procesos físicos y químicos que degradan a las proteínas.
Los iones magnesio (10-120 mM) pueden utilizarse para inhibir la isomerización del ácido aspártico a ácido isoaspártico . Los iones Ca+2 (hasta 100 mM) pueden aumentar la estabilidad de la desoxirribonucleasa humana. Sin embargo, los iones Mg+2, Mn+2, y ' Zn+2 pueden desestabilizar la rhDNase. De modo similar, Ca42 y Sr+2 pueden estabilizar el Factor VIII, el cual puede ser desestabilizado por Mg+2, Mn+2 y Zn+2, Cu+2 y Fe+2, y su agregación puede ser incrementada por iones Al+3.
Las modalidades de formulaciones de proteína de unión al antígeno CD27L comprenden además uno o más conservantes. Los conservantes son necesarios para el desarrollo de formulaciones parenterales de dosis múltiples que involucran más de una extracción del mismo envase. Su . función principal es inhibir el crecimiento microbiano y . asegurar la esterilidad del producto durante toda la vida útil o plazo de uso del producto farmacéutico. Entre los conservantes de uso común se incluyen el alcohol bencílico, el fenol, y el m-cresol. Si bien los conservantes tienen una larga historia de uso con parenterales de molécula pequeña, el desarrollo de formulaciones proteicas que incluyan conservantes puede constituir un desafío. Los conservantes presentan casi siempre un efecto desestabilizador (agregación) en las proteínas, y esto se ha vuelto un factor muy importante para limitar su uso en formulaciones proteicas de dosis múltiples. A la fecha, la mayoría de los fármacos proteicos han sido formulados para utilizar una única vez. Sin embargo, cuando las formulaciones de dosis múltiples son posibles, tienen la ventaja adicional de ofrecer practicidad para el paciente y una mayor comerciabilidad. Un buen ejemplo es el de la hormona de crecimiento' humana (hGH) donde el desarrollo de formulaciones conservadas ha conducido a la comercialización de presentaciones de inyección pluma más prácticas y de uso múltiple. Actualmente se dispone en el mercado de al menos cuatro de tales dispositivos pluma que contienen formulaciones conservadas de hGH. Norditropin (líquido, Novo Nordisk) , Nutropin AQ (líquido, . Genentech) & Genotropin (liofilizado--cartucho de doble cámara, Pharmacia & Upjohn) contienen fenol mientras que Somatrope (Eli Lilly) está formulado con m-cres.ol.
Deben considerarse varios aspectos durante la formulación y el desarrollo de., formas de dosificación conservadas. Debe optimizarse la concentración de conservante efectiva en el producto farmacéutico. Esto requiere realizar pruebas con un conservante dado en la forma de dosificación con rangos de concentración que confieran efectividad antimicrobiana sin comprometer la estabilidad de la proteina .
Como puede esperarse, el desarrollo de formulaciones liquidas que contengan conservantes supone un mayor desafio que las formulaciones liofilizadas . Los productos secados por congelación pueden liofilizarse sin el conservante y reconstituirse con un diluyente que contenga conservante en el momento del uso. Esto reduce el tiempo que un conservante está en contacto con la proteina, minimizando significativamente los riesgos de estabilidad asociados. Para formulaciones liquidas, la estabilidad y efectividad del conservante deben mantenerse durante toda la vida útil del producto (alrededor de 18 a 24 meses) . Es importante señalar que la efectividad del conservante debe demostrarse en la formulación final que contiene el fármaco activo y todos los excipientes.
Las formulaciones de proteina de unión al antigeno CD27L por lo general se diseñarán para vías y métodos de administración específicos, para dosis de administración y frecuencias de administración específicas, para tratamientos específicos de enfermedades específicas, con rangos de biodisponibilidad y persistencia, entre otras cosas. Por consiguiente las formulaciones pueden diseñarse de acuerdo con la invención para su administración por cualquier vía adecuada, incluyendo de manera no limitante las vías oral, auricular, oftálmica, rectal, y vaginal, y por vías parenterales , incluyendo inyección intravenosa e intraarterial , inyección intramuscular, e inyección subcutánea.
Una vez que la composición farmacéutica se ha formulado, puede almacenarse en viales estériles como una solución, suspensión, gel, emulsión, sólido, cristal, o como un polvo deshidratado o liofilizado. Dichas formulaciones pueden almacenarse ya sea en' una forma lista para usar o en una forma (por ejemplo, liofilizadas ) que se reconstituye previo a la administración. La invención también da a conocer kits para producir una unidad de administración de dosis única. Los kits de la invención pueden contener cada uno un primer envase con una proteína seca y un segundo envase con una formulación acuosa. En ciertas modalidades de esta invención, se dan a conocer kits que contienen jeringas prellenadas de cámara única y multicámara (por ejemplo, jeringas liquidas y liojeringas) .
La cantidad terapéuticamente efectiva a emplearse de una composición farmacéutica que contiene proteina de unión al antigeno CD27L dependerá, por ejemplo, del contexto y los objetivos terapéuticos. Un profesional en la técnica comprenderá que los niveles de dosis adecuados para el tratamiento variarán dependiendo, en parte, de la molécula administrada, la indicación para la cual se está utilizando la proteina de unión al antigeno CD27L, la via de administración, y el tamaño (peso corporal, superficie corporal o tamaño de los órganos) y/o la condición (la edad y salud general) del paciente. En ciertas modalidades, el clínico puede titular la dosis y modificar la vía de administración para obtener el efecto terapéutico óptimo. Una dosis típica puede variar desde alrededor de 0,1 mg/kg hasta alrededor de 30 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. En modalidades específicas, la dosis puede variar desde 1,0 mg/kg hasta alrededor de 20 mg/kg., opcionalmente desde 10 mg/kg hasta alrededor de 10 mg/kg o desde 100 mg/kg hasta alrededor de 5 mg/kg.
Una cantidad efectiva terapéutica de una proteína de unión al antígeno CD27L preferentemente da como resultado una disminución de la severidad de los síntomas de la enfermedad, un aumento de la frecuencia o duración de los períodos libres de síntomas de la enfermedad o una prevención de impedimentos o discapacidades debidas al sufrimiento de la enfermedad. Para tratar tumores que expresan CD27L, una cantidad terapéuticamente efectiva de proteína de unión al antígeno CD27L, por ejemplo una ADC anti-CD27L, preferentemente inhibe el crecimiento celular o crecimiento tumoral en al menos alrededor de 20%, al menos alrededor de 40%, al menos alrededor de 50%, al menos alrededor de 60%, al menos alrededor de 70%, al menos alrededor de 80%, o al menos alrededor de 90% con relación a los pacientes sin tratar. La capacidad de un compuesto para inhibir el crecimiento tumoral puede evaluarse en un modelo predictivo animal de eficacia en tumores humanos.
Las composiciones farmacéuticas pueden administrarse utilizando un dispositivo médico. Se describen ejemplos de dispositivos médicos para administrar composiciones farmacéuticas en las Patentes, de EE.UU. N° 4.475.196 4.439.196; 4.447.224; 4.447.233; 4.486.194; 4.487.603 4.596.556; 4.790.824; 4.941.880; 5.064.413; 5.312.335 5.312.335; 5.383.851; y 5.399.163, incorporadas todas por referencia en la presente memoria.
Métodos para diagnosticar o tratar una enfermedad o trastorno asociado con CD27L Las proteínas de unión al antígeno CD27L de la invención son particularmente útiles para la detección de CD27L en una muestra biológica. En ciertas modalidades, una muestra biológica obtenida a partir de un paciente se pone en contacto con una proteína de unión al antígeno CD27L. Luego, se determina unión de la proteína de unión al antígeno CD27L con CD27L para determinar la presencia o la cantidad relativa de CD27L en la muestra. Dichos métodos pueden ser útiles para diagnosticar o realizar determinaciones en los pacientes sujetos al tratamiento con una proteína de unión al antígeno CD27L, por ejemplo, un ADC anti-CD27L.
En ciertas modalidades, una proteína de unión al antígeno CD27L de la invención se utiliza para diagnosticar, detectar, o tratar un trastorno autoinmunitario o inflamatorio. En el tratamiento de desórdenes autoinmunitarios o inflamatorios, la proteína de unión al antígeno CD27L puede dirigirse a las células del sistema inmunitario que expresan CD27L para su destrucción y/o pueden bloquear la interacción de CD27L con el receptor CD27.
Se cree que la interacción de CD27L con CD27 juega un papel en las enfermedades autoinmunitarias mediadas por células, tales como la encefalomielitis autoinmunitaria experimental (EAE) (Nakajima et al. (2000) J. Neuroimmunol . 109:188-96). Se cree que este efecto es mediado en parte por una inhibición de la producción de TNF-a. .Asimismo, el bloqueo de la señalización CD27L inhibe la expansión clonal mediada por CD40 de las células CD8+ T y disminuye la generación de células CD8+ memoria T (Taraban et al. (2004) J. Immunol . 173:6542-6). Como tales, las proteínas de unión al antígeno CD27L pueden utilizarse para tratar un sujeto con un trastorno autoimmunitario, por ejemplo, un trastorno caracterizado por la presencia · de células B que expresan CD27L incluyendo, por ejemplo, encefalomielitis autoinmunitario experimental. . Entre otros trastornos autoinmunitarios en los que pueden utilizarse los anticuerpos de la presente divulgación se incluyen, de manera no limitante, el lupus eritematoso sistémico (SLE) , la diabetes miellitus insulina-dependiente (IDDM), la enfermedad inflamatoria intestinal (IBD) (incluyendo la enfermedad de Crohn, la colitis ulcerante y la enfermedad celíaca) , la esclerosis múltiple (MS) , la psoriasis, la tiroiditis autoinmunitario, la artritis ' reumatoide (RA) y la glomerulonefritis . Por otra parte, pueden utilizarse las composiciones de proteínas de unión al antígeno CD27L de esta divulgación para inhibir o prevenir el rechazo de trasplante o en el tratamiento de la enfermedad injerto contra huésped (GVHD) .
Asimismo, también se ha propuesto que la interacción de CD27L con CD27 juega un rol en la señalización en las células CD4+ T. Algunos virus han demostrado señalizar la vía CD27, derivando en la destrucción de las respuestas del anticuerpo neutralizante (Matter et al. (2006) J Exp Med 203:2145-55) .-Como tal, pueden utilizarse las composiciones de proteínas de unión al antígeno CD27L y los métodos de la presente divulgación para tratar un sujeto con una infección viral, por ejemplo, las infecciones que derivan del virus de inmunodeficiencia humana (HIV) , la hepatitis (A, B, y C) , un herpesvirus, (por ejemplo, VZV, HSV-1, HAV-6, HSV-II y C V, el virus Epstein Barr) , adenovirus, el virus de gripe, los flavivirus, echovirus, rhinovirus, virus coxsackie, cornovirus, virus respiratorio sincitial, virus de paperas, rotavirus, virus de sarampión, virus de rubéola, parvovirus, virus de la viruela vacuna, virus HTLV, virus del dengue, virus de papiloma, virus del molusco, virus de polio, virus de la rabia, virus JC y virus de encefalitis arboviral y virus de la coriomeningitis linfocitica (LCMV) o en el tratamiento de la infección de HIV/SIDA. En forma adicional, pueden utilizarse los anticuerpos humanos, composiciones de anticuerpos y métodos de la presente divulgación para inhibir la producción de TNF-a.
En ciertas modalidades, se utiliza una proteina de unión al antigeno CD27L de la invención para diagnosticar, detectar, o tratar un trastorno de cáncer o tumorigénico . Entre los tumores y tipos de cáncer que se tratan en la presente memoria, donde las células del tumor o cáncer pueden expresar CD27L, se incluyen, de manera no limitante: carcinomas de células renales . (RCC) , tales como RCC de células claras, RCC papilar, RCC de cromófobos, y similares, glioblastoma, cáncer de cabeza y cuellos (por ejemplo, carcinoma de células escamosas (HNSCC) , y similares) , cáncer de mama, tumores cerebrales, carcinomas nasofaríngeos, linfoma no Hodgkiri (NHL), tales como NHL de bajo grado, NHL difuso de células grandes, y similares, leucemia linfocítica aguda (ALL) , tal como pre-B-ALL, y similares, leucemia linfocítica crónica (CLL o B-CLL) , linfoma de Burkitt, linfomas anaplásticos de células grandes (ALCL) , mieloma múltiple, linfomas cutáneos de células T, linfomas nodulares de células pequeñas hendidas, linfomas linfocíticos, linfomas de células T periféricas, linfomas de Lennert, linfomas inmunoblásticos, linfornas/leucemia de células T (ATLL) , leucemia de células T del adulto (T-ALL) , cáncer de linfomas foliculares centroblásticos/centrocíticos (cb/cc) , linformas difusos de células grandes del linaje B, linfoma de células T del tipo linfadenopatía angioinmunoblástica (AILD) , linfomas asociados a cavidad ' corporal relacionados con el VIH, carcinomas embrionarios, carcinomas no diferenciados del tipo rinofaríngeo (por ejemplo, el tumor de Schmincke) , enfermedad de Castleman, sarcoma de Kaposi, mieloma múltiple, macroglobulinemia de Waldenstrom y otros linfomas de células B. Otros tipos de tumores que son sujeto del tratamiento que se da a conocer en la presente memoria incluyen los tumores de riñon, páncreas, laringe o faringe, melanoma, ovario, adenocarcinoma de pulmón, colon, mama, cerebro y similares.
EJEMPLOS Los siguientes ejemplos, tanto concretos como potenciales, se dan a conocer con el propósito de ilustrar aplicaciones especificas o características de la presente invención, y no están destinados a limitar su alcance.
Ejemplo 1 - anticuerpos monoclonales completamente humanos contra CD27L La generación de anticuerpos totalmente humanos dirigidos contra CD27L humana se llevó a cabo usando tecnología XenoMouse® (Patente de Estados Unidos Nos. 6.114.598; 6.162.963; 6.833.268; 7.049.426; 7.064.244, la cual se incorporan en la presente memoria por referencia en su totalidad; Green et al., 1994, Nature Genetics 7:13-21; Méndez et al., 1997, Nature Genetics 15:146-156; Green y Jakobovitis, 1998, J. Ex. Med 188 : 483-495) .
Ratones IgGl, IgG2 e IgG4 XENOMOUSE ® fueron inmunizados/reforzados con CD27L humana soluble o CD27L humana expresada de forma recombinante en la superficie de células ovario de hámster chino (CHO) . Los hibridomas fueron producidos a partir de los ratones inmunizados. Se ensayó la unión de los sobrenadantes de hibridomas a células 293 que expresan CD27L recombinante humana. Más de 260 sobrenadantes fueron positivos para la unión.
Los sobrenadantes positivos' fueron luego seleccionados para la unión a CD27L nativa en la superficie de células Raji y/o 786-0. El ensayo de unión a CD27L nativa reveló 161 sobrenadantes positivos.
Se ensayó la reactividad cruzada de estos sobrenadantes con CD27L de macaco .cangrejero. Veinticinco sobrenadantes fueron positivos para la reactividad cruzada con CD27L de macaco cangrejero. Esos 25 fueron luego ensayados para la actividad CDC y la . capacidad de bloquear la unión de CD27 humana a CD27L humana. Diecinueve sobrenadantes fueron positivos para la actividad CDC y para la inhibición de la unión de CD27 a CD27L. La¦ subclonación y la secuenciación de las 13 lineas de IgGl y las 6 de IgG4,' reveló 7 anticuerpos IgGl únicos (Abl-Ab7) y 1 único anticuerpo IgG4 (Ab8) .
Un resumen de las características de los ocho anticuerpos, junto con las de una versión quimérica de un anticuerpo CD27L humana de ratón comercialmente disponible, se muestra en la FIG. 1. ¦ Afinidad La afinidad para la CD27L recombinante humana soluble se determinó usando un chip CM5 en un BIACORE 3000. Para capturar el anticuerpo .del ensayo se utilizó un anticuerpo de cabra anti-IgG humana. Se midió la unión y disociación de CD27L humana soluble marcada con histidina para determinar Ka, Kd, y KD. Las condiciones fueron las siguientes: Temperatura = 25 °C Velocidad de flujo = 50 ul/m'in Solución amortiguadorade corrida = HBS-EP Regeneraciones con Glicina 10 mM pH 1,5 Rango de concentración de CD27L-his humana fue de 200 nm ? 0,217 nM Modelo Fit (Scrubb.er2 ) : 1:1 Enlace + local Rmax 5 Minutos de asociación y 25 minutos de disociación Actividad ADCC El ensayo de ADCC se realizó en una placa estéril de 96 pocilios de fondo redondeado para cultivo de tejidos (Corning) . Los anticuerpos fueron titulados desde 20 µg/ml a 0,0002 µq/ l llevando 10 ? en 100 µ?^ de RPMI completo conteniendo FCS al 10% (dilución 1:10). Se agregaron dianas marcados con calceina, 50 µL conteniendo 10.000 células. Se incubaron las células objetivo y varias concentraciones de anticuerpo durante 40 minutos a 4 °C, luego se añadieron efectores de células K, 50 µ1_. conteniendo 200.000 células. Los cultivos fueron incubados durante 4 horas a 37 °C, luego los sobrenadantes fueron extraídos y ensayados para la liberación de calceina por medición de la fluorescencia a 485-535 nm en un contador Wallac Víctor II 1420 Multilable HTS. Se determinaron los valores de 100% de lisis mediante la lisis de seis pocilios de dianas Raji marcados con calceina con detergente Igepal 630 (3 µ]_, por pocilio) , y se determinaron los valores de lisis espontánea por medición de la fluorescencia en los sobrenadantes de los dianas solos.
El Porcentaje (%) de lisis específica fue definido como (fluorescencia de la muestra) - (fluorescencia de lisis espontánea) / (100% de lisis - fluorescencia de lisis espontánea). Los datos originales fueron ingresados en una hoja de cálculo de Excel con las fórmulas para el cálculo de % de lisis específica y los valores resultantes fueron transferidos al programa gráfico (GraphPad Prism) , donde los datos fueron transformados en un gráfico de ajuste a curva sigmoidea. Se realizaron análisis posteriores (cálculos de regresión lineal) en GraphPad para generar valores de EC50. Actividad ADCP Se seleccionaron monocitos a partir de sangre periférica humana y se almacenaron en cuarto frió a 4 °C durante toda la noche con medio RPMI 1640 conteniendo FBS al 10%. A continuación, los monocitos fueron sembrados en una placa de cultivo tisular de 48 pocilios a 200.000 células por pocilio con 200 µ?^ de medio de crecimiento (RPMI 1640 conteniendo 10% de FBS y 40 ng/ml de Hu CSF-M) y fueron incubados a 37 °C, en C02 al 5% durante 6 dias para permitir que los monocitos se diferencien en macrófagos.
En el día 6, el ensayo de ADCP fue realizado de la siguiente manera: 1. Etiquetado de las células objetivo con colorante verde PKH67 a una concentración final de 2xl0"6 M • Se colectaron células tumorales y se lavaron una vez con PBS por centrifugación (400 'g) durante 5 minutos.
• Después de la centrifugación de las células, se aspiró cuidadosamente el sobrenadante, dejando no más de 25 mi de sobrenadante .
• Se agregaron cuatro µ?, de la solución de colorante PKH67 etanólico a una concentración stock de 4?10~d M a un mi de Diluyente C del kit en un tubo de polipropileno y se mezcló bien.
• Los peletizados celulares se resuspendieron en un mL de Diluyente C a una densidad de 20 x 106 en un tubo de polipropileno.
• Las células fueron transferidas rápidamente a la solución colorante de trabajo pipeteando suavemente para asegurar la dispersión completa.
• La mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 4 minutos mezclando periódicamente.
• Se añadieron dos mL de FBS completamente activado a las células para detener la tinción y se incubaron a temperatura ambiente durante un minuto para permitir la unión del colorante en exceso.
Cuarenta mL de RPMI conteniendo FBS al 10% se añadieron a las células y se lavaron una vez por centrifugación (400 'g) durante 10 minutos.
• Los peletizados celulares fueron suspendidos nuevamente en 40 mL de medio y transferidos a un nuevo tubo.
• Las células se lavaron nuevamente tres veces con medio RPMI + FBS al 10% y una vez con medio de crecimiento completo (RPMI 1640 conteniendo FBS al 10% y 40 ng/ml de Hu M-CSF) .
• Las células fueron contadas y suspendidas en medio de cultivo a IxlO6 células por mi para T:E a una relación 1:2. 2. Tratamiento de células tumorales con anticuerpos para la fagocitosis celular dependiente de anticuerpo (ADCP) • Las diluciones de anticuerpos se prepararon en medio de crecimiento de macrófagos. Estas diluciones fueron cuatro veces más concentradas que las concentraciones finales.
• Para preincubar las células objetivo marcadas con PKH67 verde con los anticuerpos, se mezclaron 280 µ? de anticuerpos concentrados 4x con 280 µ? de células tumorales marcadas de verde y se incubaron a 4 °C durante 30 minutos.
• La mezcla de células tumorales marcadas de verde con anticuerpos antitumorales fue añadida a los macrófagos en una placa de 48 pocilios a 200 µ? en cada pocilio, como se indica en la tabla de Diseño Experimental más abajo. El volumen final es de 0,4 mi por pocilio. La relación de células objetivo a células efectoras (macrófagos) es de 1:2.
• Las células, se incubaron a 37 °C, en CO2 al 5% durante una hora. 3. Contratinción de macrófagos con marcador de macrófagos • Se separaron las células objetivo y los macrófagos en placas de 48 pocilios con una mezcla de Tripsina-Versene .
• Las células fueron transferidas a un bloque de 96 pocilios con un volumen de 2,2 mi por pocilio y se lavaron una vez con solución de lavado FASC pre-calentada centrifugando los bloques a 400 'g durante 5 minutos y luego desechando el sobrenadante.
• Los macrófagos fueron teñidos con su marcador, CDllb-biotina, en una dilución de 1:200 en solución de bloqueo (100 µ? por pocilio) durante 10 min en hielo.
• Después de lavar las células una vez, los macrófagos fueron detectados con estreptavidina Alexa 568 a una dilución 1:1000 durante 10 minutos en hielo.
• Después de un lavado con PBS, las células fueron fijadas con formaldehído-PBS al 4% a temperatura ambiente durante 20 minutos.- Luego, las células .fueron lavadas con dH2Q.
• Los peletizados celulares fueron resuspendidos en agua (200 µ? por pocilio) y ' transferidos a una placa de 96 pocilios (100 µ? por pocilio). 4. Medición cuantitativa de la actividad de fagocitosis en un lector ArrayScan VTI HCS (versión 6, Cellomics Inc.
Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) con Target Activation BioApplication utilizando un objetivo de 20x. El ajuste del filtro se indica en la Tabla 2. Al menos 200 células fueron contadas en cada pocilio.
Tabla 2 El análisis estadístico se realizó utilizando Prism 4.01 (GraphPad, San Diego, CA) . Un ploteo muestra el % de fagocitosis de células tumorales vs. el log de la concentración de anticuerpos en ng/ml. El porcentaje de fagocitosis de células tumorales se representa por el porcentaje de células tumorales que se superponen con los macrófagos vs. los macrófagos totales en los campos seleccionados obtenidos de la función de salida del lector ArrayScan "% ObjectCounts"'. Los valores de % fueron expresados como la media +/- el. error estándar de la media (SEM) para cada medición por duplicado (n = 2) . La EC50 fue determinada mediante el uso de una regresión no lineal (curva de ajuste) seguido por el uso de una ecuación dosis-respuesta sigmoidal. Los datos fueron normalizados a la señal máxima y mínima, y ajustados a una curva dosis-respuesta . sigmoidal . Actividad CDC Preparación de las células tumorales: células Raji fueron lavadas una vez con medio de ensayo y resuspendidas en medio de ensayo (RPMI 1640 + FBS al 1%) . Las células fueron sembradas en una placa de- cultivo tisular de 96 pocilios a 50 µL por pocilio con dos densidades celulares para complemento de conejo (5xl04 células por pocilio) y humano (2xl05 células por pocilio) .
El tratamiento de las células con complemento y anticuerpo de prueba: complementos concentrados 3x fueron preparados en medio de ensayo como se indica en la Tabla 3. Luego fueron añadidos a las células en placas (50 µL por pocilio) . Para las células tratadas con complemento de conejo, la concentración final de complemento fue de 10%; para las células tratadas con complemento humano, la concentración final de complemento fue de 20%.
Los anticuerpos de prueba a 10 µ?/ml fueron añadidos a las células (50 µ?. por pocilio). El volumen total en cada pocilio al inicio del cultivo fue de 150 µ??." Las células fueron incubadas a 37 °C con 5% de C02 durante una hora para las células tratadas con complemento de conejo y 6 horas para las células tratadas con complemento humano.
Medición de la citotoxicidad con el lector de placa ArrayScan: Después de la incubación, se retiraron 50 µ? de medio de cada pocilio. Se añadieron 100 µL a cada pocilio de cóctel de Hoechst 33342 y yoduro de propidio (PI) preparado a una dilución 1:1000 en solución- de PBS con FBS al 2%. Las células tratadas con complemento humano fueron transferidas a una nueva placa de 96 pocilios (40 µL por pocilio) después de mezclar suavemente. Las muestras fueron analizadas en un lector ArrayScan VTI HCS (versión 6, Cellomics, Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) con BioApplication "Target Activation" empleando un objetivo de 20x. El ajuste del filtro se indic en la Tabla 4. Al menos 200 células fueron contadas en cada pocilio.
Tabla 4 Análisis estadístico: El análisis estadístico se realizó utilizando Prism 4.01 (GraphPad, San Diego, CA) .
Tiempo de Internalizacion Siembra de células: Se sembraron células 786-0 en una placa de 96 pocilios a 10.000 células por pocilio con 100 µ?, de medio de cultivo (RPMI conteniendo FBS al 10%) y se incubaron a 37 °C en C02 5% durante 2 días, de modo de llegar al 100% de confluencia celular en el día de ensayo. Las células en placas fueron evaluadas para 1) internalizacion y 2) co-localización endosomal.
Tinción de las células para el seguimiento de la internalizacion: la placa fue lavada una vez con medio de ensayo (PBS conteniendo FBS al 2%). Los anticuerpos fueron añadidos a los pocilios a 2 µg/ml por pocilio en medio de ensayo (100 µL por pocilio)-. Se permitió la unión de los anticuerpos humanos a las células a 4 °C durante 30 minutos y luego se realizó un lavado con medio de ensayo. Se añadieron a las células anticuerpos anti-Fab' de IgG humana Alexa 488 (1:100) y Hoechst 33342 (1:2000) en medio de ensayo y se incubaron a 4 °C durante 20 minutos. Seguidamente, las células se lavaron una vez con medio de ensayo. Las células fueron, o bien fijadas y permeabilizadas empezando con el tiempo cero, o incubadas a 37 °C en C02 5% durante 1, 3, o 5 horas. Luego de la incubación, las células se fijaron y permeabilizaron con el siguiente procedimiento. Las células se lavaron una vez con solución amortiguadorade lavado BD, seguido de la adición de 100 µL de solución de Fix/perm a cada pocilio. Las muestras fueron analizadas en un lector ArrayScan VTI HCS (versión 6, Cellomics, Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) con BioApplication "Spot Detector" empleando un objetivo de 40x. El ajuste de filtros para la internalización se indica en la Tabla 5, Al menos 400 células fueron contadas en cada pocilio.
Tabla 5 Tinción de conteo celular para co-localización manchas internalizadas en el compartimiento endosomal temprano: Tras el análisis de internalización, las células 786-0 fueron lavadas una vez con solución amortiguadora BD. Las células fueron expuestas a solución Fix/perm a temperatura ambiente por 20 minutos. Luego de dos lavados, las células se incubaron con' EEA-1 en solución amortiguadora de BD a 0,5 µg/ml (100 µ?/pocillo) a TA por 20 minutos. Las células se lavaron una vez con solución amortiguadora BD y se añadió anticuerpo anti-ratón Alexa 568 a una dilución 1:1000. Las células se incubaron a TA durante 20 minutos, seguido por dos lavados con solución amortiguadora BD.
Registro de imágenes : se tomaron imágenes celulares para la internalización y la co-localización con un microscopio fluorescente Leica conectado a una cámara digital Hamamutsu con el software Openlab Image Analysis (Improvision Inc, Lexington, MA) o el lector ArrayScan VTI HCS .
Análisis estadístico: El análisis estadístico se realizó usando Prism 4.01 (GraphPad, San Diego, CA) . Los conteos de manchas se expresaron como la media + el error estándar de la media (SEM) para mediciones por duplicado (n = 2). Utilizando la herramienta de análisis, el recuento de manchas por unidad de tiempo (tasa de internalización) se ajustó a una ecuación de asociación exponencial de una fase.
Ejemplo 2 - Evaluación de anticuerpos conjugados a MCC-DM1 Abl, Ab2, Ab4, .Ab7, y Ab8 se conjugaron con MCC-DM1. El nivel de carga especifica fue de 4.5-5 fármacos por anticuerpo. Brevemente, las Usinas del anticuerpo fueron conjugadas alNHS-éster ¦ del conector hetero-bifuncional Succinimidil 4 - [N-maleimidometil] ciclohexano-1-carboxilato (SMCC) , el cual contiene un NHS-éster y una maleimida. A continuación, el anticuerpo modificado con el conector se purificó del exceso del conector y después se conjugó al grupo reactivo DM1 a través de un sulfhidrilo presente en DM1. El exceso de DM1 se separó en una segunda etapa de purificación para generar el conjugado final Ab-MCC-DMl.
Más específicamente, el anticuerpo anti-CD27L, expresado transitoriamente en células 2936-E en cultivo de células de mamífero, se cargó en una columna MabSelect SuRe (GE Healthcare) que se había equilibrado en Tris 25 mM, cloruro de sodio 150 mM, pH 7,4. La columna con el anticuerpo anti-CD27L unido se lavó luego con 3 pasos de lavado: primero un lavado con un solución amortiguadora de equilibrio, seguido de un lavado con Tris 25 mM, L-arginina 500 mM, pH 7,5 y un lavado final con solución amortiguadora de equilibrio. El anticuerpo anti-CD27L se eluyó con acetato de sodio 100 mM, pH 3,5. Las fracciones que contenían el anticuerpo se agruparon y se ajustaron a un pH final de 5,0 con Tris 1 M, pH 8,0. El anticuerpo se purificó posteriormente en una columna Fractogel ® EMD S03- (M) (EMD Chemicals Inc) equilibrada en acetato.de sodio 30 m , pH 5,0. El anticuerpo unido se eluyó con un gradiente de cloruro de sodio 8CV entre 0 a 0,8 M en acetato de sodio 30 mM, pH 5,0. Las fracciones que contenían el anticuerpo se agruparon y se dializaron en Solución amortiguadora de Conjugación (EDTA 2 mM, cloruro de sodio 50 mM, fosfato de potasio 50 mM, pH 6,5) .
El anticuerpo anti-CD27L purificado fue modificado con el conector reactivo a las aminas, succinimidil-4 - (N-maleimidometil ) ciclohexano-1-carboxilato (SMCC) (Thermo Scientific) , para introducir grupos maleimida tiol reactivos. El anticuerpo a una concentración de 55µ? se trató con 20 equivalentes molares de SMCC en solución amortiguadora de conjugación, ajustado al 10% de dimetilacetamida (v/v) en la mezcla final de reacción. Después de la incubación durante 90 minutos a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se desalinizó con una columna de desalinización HiPrep 26/10 que contiene resina fina Sephadex G-25 (GE Healthcare) equilibrada en 2 mM EDTA, cloruro de sodio 150 mM, citrato de sodio 35 mM, pH 5,0. Las fracciones que contienen el anticuerpo se agruparon y se analizó el grado de modificación con el conector utilizando el reactivo de Ellman (5,5 '-ditio-bis- [2-ácido nitrobenzoico] ) como se describe más adelante. Se encontró que el anticuerpo se modifica con un promedio de 7,5 grupos maleimida por anticuerpo.
El reactivo de Ellman se escinde por los tioles, generando un producto de color amarillo con una absorbancia a 412 nra. Se utilizó un ensayo de Ellman sustractivo para determinar el número de grupos maleimida en el anticuerpo anti-CD27L después de la reacción con SMCC. El anticuerpo CD27L modificado con SMCC o una muestra control de solución amortiguadora sin anticuerpo se incubó con una concentración equivalente de tioles, DTT 0,4 mM (ditiotreitol) . Cualquier maleimida presente en la muestra de anticuerpo reaccionaria con los tioles en el DTT, dejándola no disponible para la reacción posterior con el reactivo de Ellman. El reactivo de Ellman se añadió a ambas muestras y se llevó a cabo una cuantificación colorimétrica a 412 nm para determinar la concentración del reactivo de Ellman que reaccionó. La disminución en la concentración de tioles en la muestra de anticuerpo en comparación con la muestra de control es proporcional al número de maleimidas presentes en la muestra de anticuerpo. Este valor se utilizó para determinar el número de grupos maleimida enlazados por anticuerpo anti-CD27L modificado.
El anticuerpo anti-CD27L modificado con SMCC (7,5 grupos maleimida por anticuerpo), a una concentración entre 17µ? - 27µ? se trató con 1,7 equivalentes molares de DM1 (inmunógeno) por grupo maleimida amortiguado con EDTA 2 mM, NaCl 150 mM, citrato de sodio 35 mM, pH 5,0 ajustado al 3 % de DMA (v / v) en la mezcla de reacción final. Las mezclas de reacción se incubaron a temperatura ambiente toda la noche durante 20 horas. La mezcla de reacción se cargó en una columna de filtración en. gel Superdex 200 (GE Healthcare) equilibrada con fosfato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 150 mM, pH 6,5. Se recolectaron las fracciones y se agruparon y analizaron las fracciones monoméricas que contienen anticuerpos. La relación molar de moléculas DM1 enlazadas por anticuerpo se determinó midiendo la absorbancia a 252 nm y 280 nm, y se encontró de 4,5 a 5,0 moléculas de DM1 por anticuerpo.
Farmacología in vítro Los conjugados anticuerpo-fármaco (ADC) Ab4 y Ab8-MCC-DM1 demostraron por citometría de flujo un grado de unión a CD27L nativa comparable al de sus contrapartes no-conjugadas. La EC50 de unión observada para Ab4 y Ab4-MCC-DMl fue la misma, mientras que para Ab8-MCC-DMl fue 4 veces menor en comparación con Ab8 (Tabla 6) . Una medida más precisa de la afinidad de unión se determinó para Ab4, Ab8 y sus contrapartes conjugadas mediante la medición de su capacidad de unión a CD27L humana nativa, expresada en células Raji utilizando tecnología Gyros . Los resultados mostraron que ambos conjugados exhibieron afinidades sub-nM para CD27L en el entorno de un factor de 2 de los valores observados para Ab4 y Ab8 no conjugados (Tabla 6) . Tanto Ab4 y Ab8 no conjugados como conjugados también mostraron afinidades de unión a CD27L-his soluble humana¦ que difieren entre sí en el entorno de un factor de 2,. tal como se determina por BIACORE. Tabla 6. Comparación' de la unión de Ab4 y Ab8 a sus contrapartes conjugadas MCC-DMl La internalización de Ab4-MCC-DMl, Ab8-MCC-DMl, Ab4, y Ab8 se evaluó en la línea humana de ccRCC 786-0 que expresa CD27L. Las células 786-0 que expresan CD27L se expusieron a anticuerpo humano anti-CD27L, Ab4 y AbG no conjugados, Ab4-MCC-DM1, Ab8-MCC-DMl, control HuIgGl, o control aSA-MCC-DMl y se permitió la unión a 4 0 C. La internalización de los artículos de prueba se evaluó usando el Fab 1 de cabra anti-hu IgG Alexa 488 de FluoroNanogold . Las células se fijaron y se permeabilizaron en tiempos específicos después de la incubación con los artículos de prueba (tiempo = 0, 1, 3, y 5 horas) y se fotografiaron utilizando un lector ArrayScan VTI HCS. La co-localización de los artículos de prueba internalizados en los endosomas se determinó utilizando anticuerpo anti-EEA-1 y un marcador endosomal. La internalización dependiente del tiempo de los anticuerpos, incluyendo Ab4-MCC-DMl, se observó a través de análisis de imagen de microscopía de fluorescencia por la formación de manchas puntiformes dentro del citoplasma celular a 37 °C en comparación con la localización de la membrana celular en el tiempo cero a 4 ° C. El . Ab4-MCC-DMl se co-localizó con el marcador endosomal EEA-1 después de una incubación de 5 horas a 37 ° C, lo que demuestra que Ab4-MCC-DMl se internaliza en el compartimiento subcelular endosomal de las células 786-0. El nivel y la tasa de internalización estuvieron dentro de un rango similar para Ab4, Ab8 y sus contrapartes conjugadas (Figura 2) .
Tanto Ab4-MCC-DMl como Ab8 MCC-DMl demostraron de manera potente y especifica la inhibición del crecimiento in vitro de células tumorales que expresan CD27L. En un ensayo de anti-proliferación (inhibición del crecimiento del tumor) , Ab4-MCC-DMl y Ab8-MCC-DMl , así como Ab4 y Ab8 anti-CD27L no conjugados, se incubaron con células objetivo lucíferasa 786-0 que . expresan CD27L o H1650 CD27L-negativas en la presencia/ausencia de Ab4 o Ab8 no conjugados, respectivamente, o con control de HuIgGl durante 4 días. Las dos líneas de células, luciferasa 786-0 y H1650, se sembraron en placas de cultivo de tejido de 96 pocilios con medio de crecimiento a razón de 100 µ? por pocilio con 500 células por pocilio para luciferasa 786-0 y 1000 células por pocilio para H1650. Todas las placas se incubaron a 37 ° C, C02 al 5% durante 4 horas. Después de una incubación de 4 horas, el Ab no conjugado y los conjugados se añadieron a las células a razón de 100 µ? por pocilio a diferentes titulaciones. El volumen total en cada pocilio al inicio del cultivo fue de 200 µ?. Las células se incubaron continuamente a 37 ° C, C02 al« 5% durante 4 días antes de la medición de los niveles de ATP celular. Para evaluar la inhibición del crecimiento celular, los niveles de ATP (como una medida del número de células) se midieron a través de luminiscencia utilizando el kit de ensayo CellTiter-Glo .
Tanto el Ab4-MCC-DMl como el Ab8-MCC-DMl inhibieron el crecimiento celular de las células 786-0 que expresan CD27L con una concentración de inhibición del 50% (IC50) tal como se describe en la Tabla 7. No se observó inhibición del crecimiento celular en las células H1650 CD27L-negativas tras la exposición a Ab4-MCC-DMl y Ab8-MCC-DMl. La adición de un exceso de anticuerpo parental anti-CD27L no conjugado fue capaz de bloquear la inhibición del crecimiento mediado por Ab4-MCC-D l, confirmando la unión a CD27L debido a que el Ab4-MCC-DMl fue requerido para la actividad. El anticuerpo parental anti-CD27L no conjugado no inhibió el crecimiento de células 786-0 que expresan CD27L. El conjugado de control, anti-estreptavidina-MCC-DMl (aSA-MCC-DMl ) , no mostró ninguna inhibición del crecimiento celular, ya sea en la linea de células CD27L-positivas o CD27L-negativas . Los resultados indican que tanto Ab4-MCC-DMl como Ab8-MCC-DMl fueron inhibidores potentes del crecimiento de células 786-0 en comparación con el conjugado de control (Figura 3). Ab4-MCC-DM1 tendió a mostrar un ligero incremento de potencia sobre Ab8-MCC-DMl (Tabla 7).
Tabla 7. Potencia celular de los conjugados antiCD27L-MCC-DMl Ab4- CC-DMl medió' la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) contra las células Raji con potencia (EC50 = 0,006 g / mi) y magnitud similar a la observada para el anticuerpo parental Ab4 anti-CD27L no conjugado (EC50 = 0,01 µg/ml). Brevemente, las células natural killer (NK) , aisladas a partir de PBMC obtenido de un donante de sangre humana normal se incubaron con células objetivo de linfoma de células B humanas Raji marcadas con calceina (las cuales expresan CD27L) en la presencia de Ab4-MCC-DMl o anticuerpos de control como se describe más arriba. La citotoxicidad especifica porcentual se determinó midiendo la liberación de calceina de células objetivo que expresan CD2.7L lisadas en presencia de 7Ab' -MCC-DMl en comparación con los pocilios control. Los resultados se muestran en la Figura 8, e indican que Ab4- CC-D l medió un nivel similar de ADCC que el anticuerpo Ab4 (valores CE .50 de 0,006 y 0,01 yg/ml, respectivamente) . El control HuIgGl no medió ninguna lisis medible de dianas que expresan CD27L. Tanto Ab4-MCC-DMl como el anticuerpo Ab4 no conjugado son capaces de inducir ADCC mediada por células NK de dianas específicos que expresan CD27L en niveles similares. Se observaron resultados similares para Ab8— CC-DMl y el anticuerpo Ab8 no conjugado.
La actividad de fagocitosis celular dependiente del anticuerpo in vitro (ADCP) de Ab4 -MCC-DMl o el anticuerpo parental Ab4 no conjugado se midió contra células Raji y células tumorales .786-0. Ab4-MCC-DMl medió un nivel similar de lisis mediada por complemento a la observada para el anticuerpo parental Ab4 no conjugado. Brevemente, los macrófagos se diferenciaron de los monocitos aislados de la sangre periférica humana .obtenida de humanos normales donantes de sangre. Los macrófagos se incubaron con líneas de células que expresan CD27L, 786-0 y Raji, marcadas con verde PHK67 como células objetivo en presencia de anticuerpo Ab4 anti-CD27L no conjugado, HuIgGl, Ab4- CC-DMl, o anticuerpos de control (aSA-MCC-DMl ) , como se describe más arriba. El porcentaje (%) de fagocitosis de células tumorales se determinó a partir del porcentaje de células tumorales que fueron fagocitadas por los macrófagos frente a los macrófagos totales en los campos seleccionados. Los resultados se muestran en la Figura 9 e indican que Ab4-MCC-DMl medió una potencia de ADCP similar en ambas lineas de células que expresan CD27L, 786-0 y Raji. Los valores de EC50 de Ab4 no conjugado se situaron en el entorno de un factor de 10 respecto a los observados para Ab4-MCC-DMl (ver Tabla 8) .
Tabla 8 Dado que la curva de dilución se realizó en intervalos de dilución de 1:40, la EC50 observada tanto para Ab4-MCC-DMl como para Ab4 no conjugado es de una potencia similar (dentro del margen del factor de dilución) . Asi, tanto el Ab4-MCC-DMl conjugado y los anticuerpos WT Ab4 no conjugados son capaces de inducir a los macrófagos humanos para mediar ADCP de células que expresan CD27L en niveles similares. Se observaron resultados similares para Ab8-MCC-DMl y el anticuerpo Ab8 no conjugado.
La actividad de citotoxicidad dependiente del complemento in vitro (CDC) de Ab4-MCC-DMl se evaluó empleando tanto complemento de conejo y humano así como células tumorales Raji que expresan CD27L. A 10 g/ml, el Ab4-MCC-D l medió un nivel de lisis mediada por complemento similar al observado para el anticuerpo parental Ab4 no conjugado (complemento de conejo 72% de lisis y. de humano 17% de lisis) . Brevemente, los complementos de conejo o humano se incubaron con células objetivo Raji que expresan CD27L en presencia de anticuerpos anti-CD27L . o anticuerpos de control, como se describe más arriba. La destrucción mediada por CDC se midió a partir de la característica de salida del lector ArrayScan "% selected objects" para detectar el % de PI positivo vs Hoechst para "% Citotoxicity". Los resultados indican que Ab4-MCC-DMl medió niveles de CDC similares a los del anticuerpo WT Ab4 al incubar células tumorales Raji con 10% de complemento de conejo bebé o 20% de complemento humano. Los complementos de conejo o humano inactivados por calor no mostraron ninguna destrucción mediada por CDC contra Raji. Así, tanto Ab4-MCC-DMl como Ab4 no conjugado inducen un nivel similar de actividad CDC contra células objetivos tumorales que expresan CD27L. Se observaron resultados similares para Ab8-MCC-DMl y el anticuerpo Ab8 no conjugado.
Farmacología in vivo Las células ccRCC 786-0 pasadas in vivo (786-0 S4) fueron implantadas en hembras de ratones CB-17/SCID utilizando el factor de crecimiento reducido ATRIGEL para generar xenoinjertos tum.orales para estudios de eficacia. Las células 786-0 S4 expresan un promedio de aproximadamente 180.000 sitios CD27L/célula. El tratamiento con Ab4-MCC-DMl o Ab8- CC-DMl se inició cuando el tumor alcanzó un tamaño promedio de aproximadamente 250 mm3. Los animales portadores de tumores animales fueron seleccionados al azar por tamaño de tumor en grupos de. diez animales cada uno y dosificados una vez por vía intravenosa. Se realizó un estudio ciego de respuesta de dosis de Ab4-MCC-DMl y Ab8-MCC-DMl, empleando dosis de 7 a 64 ug DMl/kg (0,3 a 2,5 mg Ab/kg) , en este modelo de tumor establecido. Se observó una regresión tumoral robusta en dosis baja de 7 ug DMl/kg, intermedia de 25 ug DMl/kg y alta de 64 ug. DMl/kg. En las dosis media y alta, las regresiones completas se mantuvieron al menos 28 días después de una dosis única (Figura 4) . No se observó pérdida de peso corporal en ninguno de los grupos de dosificación durante el 6 estudio.
En otra demostración de · la eficacia in vivo, se implantaron células ccRCC Caki-1 que expresan un promedio de 59.000 sitios CD27L por célula (3 veces menos que las células 786-0) en ratones CB-17/SCID como se describe más arriba. Cuando los xenoinjertos Caki-1 alcanzaron un tamaño promedio de 250 ram3, los. animales portadores de tumores fueron seleccionados al azar por tamaño de tumor en grupos de diez animales cada uno y se dosificaron una vez por semana por vía intravenosa durante 3 semanas (para imitar más cercanamente un régimen de dosificación clínica semanal) . Se realizó un estudio ciego de respuesta de dosis, de Ab4-MCC-DMl y Ab8-MCC-DM1, empleando dosis de 60 a 270 ug DMl/kg (2,4 a 11 mg de Ab/kg) , en este modelo tumor establecido. La regresión del tumor se observó ínicialmente en la dosis media de 120 ug DMl/kg y la alta de 270 ug DMl/kg mientras que la inhibición del crecimiento tumoral se observó en la dosis baja de 60 ug DMl/kg en comparación con el conjugado o portador de control. A medida que el tiempo avanzaba, la regresión del tumor en los dos grupos de dosis más altas comenzó a disminuir dentro de los 7 días después de recibir la última dosis (Figura 5) .
Como las células ccRCC, las células Raji de linfoma B expresan CD27L (aproximadamente 200.000 sitios/célula) e internalizan el fármaco conjugado anti-CD27L que da lugar a la detención mitótica y muerte celular in vitro. Ab4-MCC-DMl se evaluó para eficacia en el modelo de xenoinjerto subcutáneo Raji. Cuando los xenoinjertos Raji alcanzaron un tamaño promedio de 250 mm3, los animales portadores de tumores fueron seleccionados al azar por tamaño de tumor en grupos de diez animales cada uno y se dosificaron por vía intravenosa q4 días x 2 y luego una vez por semana cada semana adicional por un total de 3 dosis (para imitar más cercanamente un régimen de dosificación clínica semanal) . Un estudio ciego de respuesta de dosis de Ab4-MCC-DMl utilizando dosis de 60 a 270 ug DMl/kg (2,4 a 11 mg de Ab/kg) se realizó en este modelo de. tumor establecido. La inhibición del crecimiento tumoral se observó en todos los niveles de dosis, con> 90% de inhibición del crecimiento tumoral observado en la dosis medias de 120 ug DMl/kg y las dosis altas de 270 ug DMl/Kg durante el período de dosificación activa con una respuesta antitumoral intermedia observada en la dosis baja de 60ug DMl/kg en comparación con el conjugado de control (Figura 6) . Al final del período de medición tumoral una leve mayoría de los animales, en los grupos de dosis media y alta, mostraron regresión tumoral, lo que sugiere que dosis adicionales y optimización del programa podrían mejorar la respuesta.
La eficacia de los diferentes intervalos de dosificación del conjugado de control aSA- CC-DMl, o Ab4-MCC-DMl se evaluó en el modelo de xenoinjerto 786-0. Los ratones CB-17/SC1D fueron implantados con células tumorales 786-0. En el día 13, 50 animales fueron seleccionados al azar en cohortes de 10 animales cada uno con un volumen promedio del tumor de 200 mm3. A cada cohorte se le administró una dosis intraperitoneal del conjugado de control, ya sea aSA-MCC-DMl o Ab4-MCC-DMl. El volumen del tumor se representa como la media del grupo ± error estándar de la media (SEM) . Se evaluó la significación estadística de las diferencias observadas entre las curvas de crecimiento del día 13 al 59 por análisis de covarianza de medidas repetidas (RMANOVA) de los datos de volumen tumoral transformados logarítmicamente con comparaciones múltiples ajustadas de Dunnett. La significación se alcanzaría si p <0,05. Se administraron tres niveles de dosis de Ab4-MCC-DMl (1,0; 2,0; o 2,9 mg/kg de Ab4-MCC-DMl basados en anticuerpos o 25, 50, o 75 ug/kg basados en equivalentes de DM1, respectivamente) . La dosis de 1,0 mg/kg se administró una vez por semana o una vez cada 2 semanas durante 6 semanas, la dosis de 2,0 mg/kg se administró una vez cada 2 semanas durante 6 semanas y la dosis de 2,9 mg/kg se administró una vez cada 3 semanas durante 6 semanas. Los animales se . dosificaron intraperitonealmente a partir del día 13 después de la inoculación del tumor. Para el día 59, el grupo tratado con aSA-MCC-DMl fue sacrificado .debido a los grandes volúmenes tumorales. El dia 59, el volumen promedio del tumor de los ratones tratados con cada régimen de dosis de Ab4-MCC-DMl administrado fue significativamente menor que para el grupo conjugado de control aSA-MCC-DMl (p <0,0001) (Figura 7). Ab4-MCC-DM1 medió la regresión duradera del tumor con cada régimen de dosificación. No se observó pérdida de peso corporal en ninguno de los grupos de tratamiento Ab4-MCC-DMl .
Farmacocinética Los conjugados anticuerpo-fármaco Ab4 y Ab8 se evaluaron después de la administración intravenosa a ratones hembra CB-17/SCID que contenían xenoinjertos 786-0 que expresan CD27L en el contexto de los estudios de eficacia y un subsiguiente estudio de PK terminal. Las exposiciones acumulativas y valores de aclaramiento estuvieron dentro de 1,33 y 1,4 veces entre las moléculas de Ab4-MCC-DMl y A 8-MCC-DMl , y la vida media de ambos ADC fue de aproximadamente 12 días en ratones .
Los parámetros de estabilidad y de PK de los conjugados anticuerpo-fármaco Ab4-MCC-DMl y Ab8-MCC-DMl se caracterizaron in vivo después de una dosis única intravenosa (IV) en ratones CB-17/SCID que portan xenoinjertos 786-0. Las exposiciones de los dos conjugados anticuerpo-fármaco fueron altamente comparables, pero el Ab4- CC-DMl demostró una relación de conjugación fármaco-anticuerpo más estable durante el transcurso de 96 horas del estudio, tal como fue determinado por afinidad-MS, que la de la molécula Ab8-MCC-DM1. Ab4-MCC-DMl no mostró pérdida detectable de la integridad del conjugado al minuto 30 o la hora 24 después de la inyección, mientras que Ab8-MCC-DMl mostró cambios al minuto 30 y disminuciones significativas en todas las especies de conjugados a las 24 horas después de la inyección.
Ejemplo 3 - Mapeo de. parátopos Se ensayaron modificaciones de Ab4 para la unión a CD27L por ELISA. CD27L fue unida a placas Maxisorp a temperatura ambiente durante más de 2 horas, agitando con lug/mL en 100 uL. A continuación, las placas se bloquearon con 250 uL de leche descremada al 10% en PBS + Tween 20 al 0,05% durante 2 horas. Luego de cuatro lavados con 300 uL de PBS + Tween 20 al 0,05% (PBST) se aplicaron a las placas titulaciones desde 0,045 hasta 100 ng/ml del anticuerpo modificado y del control parental purificado y se incubaron durante una hora. Se aplicó a las placas después de otro lavado con PBST un anticuerpo de detección ahuFc (Jackson) conjugado con peroxidasa de rábano picante diluido 1:7000, y se incubó durante una hora. Se realizó un lavado final y el sustrato TMB se incubó durante 10 minutos y se detuvo con ácido fosfórico. Se tomó una lectura de DO a 450 nm, , la cual fue colocada en gráfica vs . la concentración. Estas curvas se analizaron luego con un ¦ ajuste de curva no lineal de 3 parámetros, y la EC50 y la señal máxima calculada fueron comparadas con el control purificado. Se determinó una unión similar a la parental si la EC50 estaba dentro de 2 veces su valor y la señal máxima era mayor que 50%. La unión se redujo si la EC50 aumentó en más de 2 veces y / o la señal máxima fue menos del 50%. La unión fue abolida si la curva no pudo ser generada o la señal máxima fue menos del 5% .
Tabla 8: se listan combinaciones de modificaciones de cadenas ligeras y pesadas, junto' con sus niveles de expresión en ug/ml (determinado por la cuantificación de proteina A ForteBio) y su efecto sobre la unión Combinaciones Expresión Unión N31H-Y58N + N31S' -I34M 30.3 Reducción N31H-Y58N + G33S' -I34L 46.7 Abolición N31H-Y58N + D54E--G55S 9.91 Abolición N31H-Y58N + S103G- 14.6 Abolición G104S N31H-Y58N + HC 10.4 Reducción precursor R24K-S26G + N31S--I34M 13.8 Similar R24K-S26G + G33S--I34L 16.9 Abolición R24K-S26G + D54E--G55S 1. 87 Reducción R24K-S26G + S103G- 3. 76 Reducción G104S R24K-S26G + HC 3. 43 Similar Precursor L55I-Y58F + N31S--I34M 9. 53 Reducción L55I-Y58F + G33S--I34L 11 .6 Abolición L55I-Y58F + D54E--G55S 1. 26 Reducción L55I-Y58F + S103G- 2. 61 Reducción G104S L55I-Y58F + HC 2. 72 Similar Precursor Q95N-T96S + N31S--Í34M 24 .6 Similar Q95N-T96S + G33S--I34L 32 .7 Abolición Q95N-T96S + D54E--G55S 1. 89 Reducción Q95N-T96S + S103G- 4. 99 Abolición G104S Q95N-T96S + HC 5. 85 Similar Precursor LC Precursor + N31S- 31 .6 Reducción I34M LC Precursor + G33S- 51 .2 Abolición I34L LC Precursor + D54E- 7. 03 Reducción G55S LC Precursor + S103G- 10 .7 Abolición G104S LC Precursor + HC 9. 25 Similar Precursor 13 de las 24 combinaciones de modificaciones realizadas a Ab4 mantuvieron algún grado de unión a CD27L. Las 9 de que no se unen a CD27L tenían al menos una de las siguientes: "G33S-I34L" y "S103G-G104S" modificaciones de cadena pesada o la modificación de cadena ligera "N31H-Y58N". 75% (.6 de 8) de los anticuerpos con 97% de similitud (2 modificaciones de aminoácidos) conservaron un cierto nivel de unión, mientras que el 56% (7 de 16) de los anticuerpos con 94% de similitud (4 modificaciones de aminoácidos) conservaron cierto nivel de unión, 2 de ellos tienen una unión similar a la del control parental purificado. Esto muestra que un anticuerpo con una similitud a Ab4 tan baja como 94% aún puede unirse a CD27L.
Listado de secuencias SEQ ID NO: 1 Secuencia de aminoácidos de CD27L humana MPEEGSGCSVRRRPYGCVLRAALVPLVAGLVICLVVCIQRFAQAQQQLPLESLGWDVAELQ LNHTGPQQDPRLYWQGGPALGRSFLHGPELDKGQLRIHRDGIYMVHIQVTLAICSSTTASR HHPTTLAVGICSPASRSISLLRLSFHQGCTIASQRLTPLARGDTLCTNLTGTLLPSRNTDE TFFGVQWVRP SEQ ID NO : Secuencia de aminoácidos del precursor de CD27 humana MARPHPWWLCVLGTLVGLSATPAPKSCPERHYWAQGKLCCQMCEPGTFLVKDCDQHRKAAQ CDPCIPGVSFSPDHHTRPHCESCRHCNSGLLVRNCTITANAECACRNG QCRDKECTECDP LPNPSLTARSSQALSPHPQPTHLPYVSEMLEARTAGH QTLADFRQLPARTLSTHWPPQRS LCSSDFIRILVIFSGMFLVFTLAGALFLHQRRKYRSNKGESPVEPAEPCHYSCPREEEGST IPIQEDYRKPEPACSP SEQ ID NO:3 Secuencia de nucleótidos que codifica para la cadena pesada de Abl CAGATGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCCTCACAGACCCTGTCCCTCA CCTGCACTGTCTCTGATGGCTCCATCATCAGTGGTGTTTACTACTGGAGCTGGATCCGCCA GCACCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGATTGGATACATCTATTACAGTGGGAGCACCTCCTAC AACCCGTCCCTCAAGAGTCGACTTACCATGTCAGTAGACACGTCTAAGAACCAGTTCTCCC TGAAGCTGAGCTCTGTGACTGCCGCGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGGAGTGGATA CAGCTATGCCCTCTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGC ACCAAGGGCCCATCCGTCTTCCeCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAG CGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTC AGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTAC TCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCA ACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGA CAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACC GAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTC CTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCG TGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACcctGAGGTCAAGTTCAactGGTACGTGGACGGCGT GGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTG GTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGG TCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCC CCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTC AGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCA ATGGGCAGCCGGAGAAGAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTT CTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCA TGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTC CGGGTAAA SEQ ID NO: 4 Secuencia de nucleótidos que codifica para la. cadena pesada de Ab2 CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCACAGACCCTGTCCCTCA CCTGCACTGTCTCTGGTGACTCCATCATCAGTGGTGGTTACTACTGGAGCTGGATCCGCCA GCACCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGATTGGGTACA CTTTTACAGTGGGAGCACCGACTAC AACCCGTGCCTCAAGAGTCGAGTTACCATATCAGTAGACACGTCTAAGAACCAGTTCTCCC TGAAGCTGAGCTCTGTGACTGCCGCGGACACGGCCGTATATTACTGTGCGAGGAGTGGATA CAGCTATGCCCTCTTTGAGCACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGC ACCAAGGGCCCATCCGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAG CGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTC AGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGGTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTAC TCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCA ACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGA CAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTC CTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCG TGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGT GGAGGTGCATAatgCCAAGACAAagccgCGGGAGGAGCAGTACaaCAGCACGTACCGTGTG GTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGG TCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCC CCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTC AGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCA ATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCT CTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCA TGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGcACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTC CGGGTAAA SEQ ID NO: 5 Secuencia de nucleótldos que codifica para la cadena pesada de Ab4 CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCT CCTGTGCAGCGTCTGGATTCACCTTCAGTAACTATGGCATACACTGGGTCCGCCAGGCTCC AGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATGGTATGATGGAAGTAATAAATACTATGCA GACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGC AAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGATGGAGGATA TAGTGGCTACGATTCGGGGTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA GCTAGCACCAAGGGCCCATCCGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGG GCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTG GAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGA CTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACA TCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATC TTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCA GTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCA CATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGA CGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTAC CGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGT GCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGG GCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAAC CAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGG AGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGG CTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTC TTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCC TGTCTCCGGGTAAATGA SEQ ID NC: 6 Secuencia de nucléótidos que codifica para la cadena pesada de Ab5 CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTCT CCTGCAAGGCTTCTGGATACACCTTCACCAGTTATGATATCAACTGGGTGCGACAGGCCAC TGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATGAACCCTAACAGTGGTAACACAGGCTATGCA CAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACCATGACCAGGAACACCTCCATAAGCACAGCCTACATGG AGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGGGTACGATTT TTGGAGTGGTTATTACTACTACTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTC ACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCCGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGA GCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGT GACGGTGTCGTGGAACTGAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTA CAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCA CCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGT TGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTG GGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGA CCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCGACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAA CTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTAC AACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCA AGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTC CAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAG ATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCG CCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCT GGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAG CAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGA AGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA SEQ ID NO:7 Secuencia de nucleótidos que codifica para la cadena pesada de Ab6 CAGGTTCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGGTCT CCTGCAAGGCTTCTGGTTACACCTTTACCAGCTATGGTATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCC TGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATCAGCGCTTACAATGGTTACACACACTATGCA CAGAAGCTCCAGGGGAGAGTCACCATGACCACAGACACATCCACGAGCACAGCCTACATGG AGCTGAGGAGCCTGAGATCTGACGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGACTACGGTGG TAACGACTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCT AGCACCAAGGGCCCATCCGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCA CAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAA CTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTC TACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCT GCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTG TGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTC TTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACAT GCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGG CGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGT GTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCA AGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCA GCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAG GTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGA GCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTC CTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTC TCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGT CTCCGGGTAAATGA SEQ ID NC: 8 Secuencia de nucleótidos que codifica para la cadena pesada de Ab7 CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCT CCTGTGCAGCGTCTGGATTCACCTTCAGTACCTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCC AGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGGAGTTATATGGTATGATGGAAGTAATAAATACTATGGA GACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGC AAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGATAACAGTCA CTACTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGC ACCAAGGGCCCATCCGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACGTCTGGGGGCACAG CGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTC AGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTAC TCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCA ACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGA CAAAACTCACAGATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTC CTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCG TGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGAGGGCGT GGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTG GTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGG TCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCC CCGAGAACCACAGGTGTAGACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTC AGCCTGACCTGCCTGGTGAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCA ATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTT CTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCA TGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTC CGGGTAAA SEQ ID NO: 9 Secuencia de aminoácidos de la CDR3 de la cadena ligera de Ab8 CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTGT CCTGTGCAGCGTCTGGATTCACCTTCAGTAGCTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCC AGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATGGTATGATGGAAGTGATAAATACTTTGCA GACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACGCTGTATCTGC AAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGATGGGATAGC AGGAGCTCGCTACGTCTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA GCTAGCACCAAGGGCCCATCCGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGG GCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTG GAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGA CTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACA TCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATC TTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCA GTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCA CATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGA CGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTAC CGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGT GCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGG GCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAAC CAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTC ATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGG AGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCAGGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGG CTCCTTCTTGCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTC TTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCC TGTCTCCGGGTAAA .
SEQ ID NO:10 Secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de Abl QMQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSCGSIISGVYYWS IRQHPGKGLEWIGYIYYSGSTSY NPSLKSRLTMSVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARSGYSYALFDY GQGTLVTVSSAS TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLY SLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVF LFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQV SLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFS CSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 11 Secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de Ab2 QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGDSIISGGYYWSWIRQHPGKGLEWIGYIFYSGSTDY NPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARSGYSYALFDHWGQGTLVTVSSAS TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLY SLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNH PSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVF LFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPÉVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQD LNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTK QV SLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFS CSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 12 Secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de Ab4 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSNYGIHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKYYA DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGGYSGYDSGFDYWGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVS NSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEP SCDKTHTCPPCPAPELLGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTY RVVSVLTVLHQD LNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA GQPREPQVYTLPPSREEMTKN QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNV FSCSV HEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 13 Secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de Ab5 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYDINWVRQATGQGLEWMGWMNPNSGNTGYA QKFQGRVTMTRNTSISTAY ELSSLRSEDTAVYYCARGYDFWSGYYYYYYGMDV GQGTTV TVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVS NSGALTSGVHTFPAVL QSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELL GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCV VDVSHEDPEVKFN YVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREE MTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR Q QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 14 Secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de Ab6 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYG'ISWVRQAPGQGLEWMGWISAYNGYTHYA QKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARDYGGNDYYGMDVWGQGTTVTVSSA STKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGL YSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSV FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYR VVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTK Q VSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVF SCSV HEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 15 Secuencia de aminoácidos de la cadena pesada de Ab7 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSTYGMH VRQAPGKGLE VAVI YDGSNKYYG DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDNSHYYYGMDV GQGTTVTVSSAS TKGPSVFPLAPSS STSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLY SLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVF LFPPKP DTL ISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQV SLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFS CSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 16 Secuencia de aminoácidos dé la cadena pesada de Ab8 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLE VAVIWYDGSDKYFA DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGIAGARYVYFDYWGQGTLVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTY RVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQ.PREPQVYTLPPSREEMTKN QVSLTCLVKGFYPSDIAVE ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR QQGNV FSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK.
SEQ ID NO: 17 Secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena pesada de Abl QMQLQESGPGLVKPSQTLS'LTCTVSDGSIISGVYYWSWIRQHPGKGLEWIGYIYYSGSTSY NPSLKSRLTMSVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARSGYSYALFDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 18 Secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena pesada de Ab2 QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGDSIISGGYYWSWIRQHPGKGLEWIGYIFYSGSTDY NPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARSGYSYALFDHWGQGTLVTVSS SEQ ID NO: 19 Secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena pesada de Ab3 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSVISDSGGTTDYA DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHDYSNRYYFDY GQGTLVTVSS SEQ ID NO: 20 Secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena pesada de ?? QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSNYGIHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNKYYA DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQ NSLRAEDTAVYYCARDGGYSGYDSGFDYWGQGTLVTVSS SEQ ID NO:21 Secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena pesada de Ab5 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSC ASGYTFTSYDINWVRQATGQGLEWMG MNPNSGNTGYA QKFQGRVTMTRNTSISTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGYDFWSGYYYYYYGMDVWGQGTTV TVSS SEQ ID NO:22 Secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena pesada de Ab6 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYG.IS VRQAPGQGLEWMGWISAYNGYTHYA QKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARDYGGNDYYGMDVWGQGTTVTVSS SEQ ID NO:23 Secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena pesada de Ab7 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSTYG HWVRQAPGKGLE VAVIWYDGSNKYYG DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDNSHYYYGMDVWGQGTTVTVSS SEQ ID NO: 24 Secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena pesada de Ab8 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSDKYFA DSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDGIAGARYVYFDY GQGTLVTVSS SEQ ID NO: 25 Secuencia de aminoácidos de la GDR1 de la cadena pesada de Abl SGVYYWS SEQ ID NO: 26 Secuencia de aminoácidos de la CDR1 de la cadena pesada de Ab2 SGGYY S SEQ ID NO: 27 Secuencia de aminoácidos de la CDR1 de la cadena pesada de Ab3 SYAMS SEQ ID NO: 28 Secuencia de aminoácidos de la CDR1 de la cadena pesada de Ab4 NYGIH SEQ ID NO: 29 Secuencia de aminoácidos de la CDR1 de la cadena pesada de Ab5 SYDIN SEQ ID NO: 30 Secuencia de aminoácidos de la CDR1 de la cadena pesada de Ab6 SYGIS SEQ ID NO: 31 Secuencia de aminoácidos de la CDR1 de la cadena pesada de Ab7 TYGMH SEQ ID NO: 32 Secuencia de aminoácidos de la CDR1 de la cadena pesada de Ab8 SYGMH SEQ ID NO: 33 Secuencia de aminoácidos de la CDR2 de la cadena pesada de Abl YIYYSGSTSYNPSLKS SEQ ID NO: 34 Secuencia de aminoácidos de la CDR2 de la cadena pesada de Ab2 YIFYSGSTDYNPSLKS SEQ ID NO:35 Secuencia de aminoácidos de la CDR2 de la cadena pesada de Ab3 VISDSGGTTDYADSVKG SEQ ID NO: 36 Secuencia de aminoácidos de la CDR2 de la cadena pesada de Ab4 VI YDGSNKYYADSVKG SEQ ID NO: 37 Secuencia de aminoácidos de la CDR2 de la cadena pesada de Ab5 WMNPNSGNTGYAQKFQG SEQ ID NO: 38 Secuencia de aminoácidos de la CDR2 de la cadena pesada de Ab6 WISAYNGYTHYAQKLQG SEQ ID NO:39 Secuencia de aminoácidos de la CDR2 de la cadena pesada de Ab7 ¦ .
VIWYDGSNKYYGDSVKG SEQ ID NO: 0 Secuencia de aminoácidos de la CDR2 de la cadena pesada de Ab8 VI YDGSDKYFADSVKG SEQ ID NO:41 Secuencia de aminoácidos de la CDR3 de la cadena pesada de Abl SGYSYALFDY SEQ ID NO: 42 Secuencia de aminoácidos de la CDR3 de la cadena pesada de Ab2 SGYSYALFDH SEQ ID NO:43 Secuencia de aminoácidos de la CDR3 de la cadena pesada de Ab3 HDYSNRYYFDY SEQ ID NO: 44 Secuencia de aminoácidos . de la CDR3 de la cadena pesada de ??4 DGGYSGYDSGFDY SEQ ID NO: 5 Secuencia de aminoácidos de la CDR3 de la cadena pesada de Ab5 GYDFWSGYYYYYYGMDV SEQ ID NO: 46 Secuencia de aminoácidos . de la C.DR3 de la cadena pesada de Ab6 DYGGNDYYGMDV SEQ ID NO: 7 Secuencia de aminoácidos de la CDR3 de la cadena pesada de Ab7 DNSHYYYGMDV SEQ ID NO: 48 Secuencia de aminoácidos de la CDR3 de la cadena pesada de Ab8 DGIAGARYVYFDY SEQ ID NO: 49 Secuencia de nucleótidos que codifica para la . cadena ligera de Abl GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTTTAGGAGACAGAGTCACCA TCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCGTTGACAGATATTTCAATTGGTATCAGCAGAAACCTGG GAAAGCCCCTAAGGTCCTGATCTTTGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGG TTCGGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAG ATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGAGCTACAGTACCCCGTGGACGTTCGGCCAAGGGAC CAAGGTGGAAGTCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGAT GAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAG AGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGT CACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAA GCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGC CCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT SEQ ID NO: 50 Secuencia de nucleótidos que codifica para la cadena ligera de Ab2 GACATCCAGATGACCCAGTCCCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCA TCAGTTGCCGGGCAAGTCAGTTCATTGGCAGATATTTCAATTGGTATCAGCAGCAACCAGG GAAAGCCCCTAAGGTCCTGATCTATGCTGAATCGAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGA TTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGAATTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAG ATTTTGCAAGATACTACTGTCAACAGAGTTACAGTACCCCGTGGACGTTCGGCCAAGGGAC CAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGAT GAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAG AGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGT CACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAA GCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGC CCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT SEQ ID NO:51 Secuencia de nucleótidos que codifica para la cadena ligera de Ab4 GATATTGTGATGACTCAGTCTCCACTCTCCCTGCCCGTCACCCCTGGAGAGCCGGCCTCCA TCTCCTGCAGGTCTAGTCAGAGCCTCCTGAATAGTAATGGATACAACTATTTGGATTGGTA CCTGCAGAAGCCAGGGCAGTCTCCACAGTTCCTGATCTATTTGGGTTCTTATCGGGCCTCC GGGGTCCCTGACAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGCACAGATTTTACACTGAGAATCAGCA GAGTGGAGGCTGAGGATGTTGGGGTTTATTACTGTATACAAACTCTACAAACTCCATTCAC TTTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATATCAAACGTACGGTGGCTGCACGATCTGTCTTCATC TTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATA ACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAA CTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACC CTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATC AGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG SEQ ID NO: 52 Secuencia de nucleótidos que codifica para la cadena ligera de Abo GAAATTGTGTTGACGCAGTCTCCTGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCC TCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAGCTACTTAGCCTGGTACCAGCAGAGACC TGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATG.GTGCATCCAGCAGGGCCAGTGGCATCCCAGAC AGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGGAGCCTG AAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCTGCAGTCTGGTAGCTCTGTCCCGCTCACTTTCGGCGG AGGGACCAAGGTGGAGATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCA TCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATC CCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGA GAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTG AGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGA GCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAA SEQ ID NO: 53 Secuencia de nucleótidos que codifica para la cadena ligera de Ab6 CAGTCTGTGCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCGCCGGGCAGAGGGTCACCATCT CTTGTTCTGGAAGCAGCTCCAACATCGGAATTAATTATGTATACTGGTACCAGCAGCTCCC AGGAACGGCCCCCAAACTCCTCATCTATAGGAGTGATCAGCGGCCCTCAGGGGTCCCTGAC CGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCCTCAGTGGGCTCCGGTCCG AGGATGAGGCTGATTATTACTGTGCAGCATGGGATGACAGCCTGAGTGGTGTGGTGTTCGG CGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGCCAACCGAAAGCGGCGCCCTCGGTCACTCTGTTC CCGCCCTCCTCTGAGGAGCTTCAAGCCAACAAGGCCACACTGGTGTGTCTCATAAGTGACT TCTACCCGGGAGCCGTGACAGTGGCCTGGAAGGCAGATAGCAGCCCCGTCAAGGCGGGAGT GGAGACCACCACACCCTCCAAACAAAGCAACAACAAGTACGCGGCCAGCAGCTATCTGAGC CTGACGCCTGAGCAGTGGAAGTCCCACAGAAGCTACAGCTGCCAGGTCACGCATGAAGGGA GCACCGTGGAGAAGACAGTGGCCCCTACAGAATGTTCATAG SEQ ID NO:54 Secuencia de nucleótidos que codifica para la cadena ligera de Ab7 CAGTCTGTGCTGACGCAGCCGCCCTCAGTGTCTGGGGCCCCAGGGCAGAGGGTCACCATCT CCTGCACTGGGAGCAGCTCCAACATCGGGGCAGGTTATGATGTAAATTGGTATCAGCAGTT CCCAGGAACAGCCCCCAAACTCCTCATCTATGTTAACAACAATCGGCCCTCAGGAGTCCCT GACCGATTCTCTGGCTCCACGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCACTGGACTCCAGG CTGAGGATGAGGCTGATTATTACTGCCAGTCCTATGACACCAGCCTGAGTGCTTCGGTATT GGGCGGAGGGACCAGACTGACCGTCCTAGGCCAACCGAAAGCGGCGCCCTCGGTCACTCTG TTCCCGCCCTCCTCTGAGGAGCTTCAAGCCAACAAGGCCACACTGGTGTGTCTCATAAGTG ACTTCTACCCGGGAGCCGTGACAGTGGCCTGGAAGGCAGATAGCAGCCCCGTCAAGGCGGG AGTGGAGACCACCACACCCTCCAAACAAAGCAACAACAAGTACGCGGCGAGCAGCTATCTG AGCCTGACGCCTGAGCAGTGGAAGTCCCACAGAAGCTACAGCTGCCAGGTCACGCATGAAG GGAGCACCGTGGAGAAGACAGTGGCCCCTACAGAATGTTCA SEQ ID NO: 55 Secuencia de nucleótidos que codifica para la cadena ligera de Ab8 GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCA TCACTTGTCGGGCGAGTCAGGGCATTAGCAATTATTTAGCCTGGTTTCAGCAGAAACCAGG GAAAGCCCCTAAGTCCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAGGTGGGGTCCCATCAAAG TTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAG ATTTTGCAACTTATTACTGCCAACAATATTATAATTACCCATTCACTTTCGGCCCTGGGAC CACAGTGGATATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGAT GAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAG AGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGT CACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAA GCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGC CCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG SEQ ID NO: 56 Secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de Abl DIQMTQSPSSLSASLGDRVTITCRASQSVDRYFN YQQKPGKAPKVLIFAASSLQSGVPSR FGGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTP TFGQGTKVEVKRTVAAPSVFIFPPSD EQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQ KVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSK ADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRG.EC SEQ ID NO: 57 Secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de Ab2 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTISCRASQFIGRYFNWYQQQPGKAPKVLIYAESSLQSGVPSR FSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFARYYCQQSYSTP TFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSD EQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSK ADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO: 58 Secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de Ab4 DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLNSNGYNYLDWYLQKPGQSPQFLIYLGSYRAS GVPDRFSGSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCIQTLQTPFTFGPGTKVDIKRTVAAPSVFI FPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSST LTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO: 59 Secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de Ab5 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQRPGQAPRLLIYGASSRATGIPD RFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCLQSGSSVPLTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFI FPP SDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTL SKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO: 60 Secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de Ab6 QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGINYVYWYQQLPGTAPKLLIYRSDQRPSGVPD RFSGSKSGTSASLALSGLRSEDEADYYCAAWDDSLSGVVFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLF PPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLS LTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS SEQ ID N0:61 Secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de Ab7 QSVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVNWYQQFPGTAPKLLIYVNNNRPSGVP DRFSGSTSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDTSLSASVFGGGTRLTVLGQPKAAPSVTL FPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYL SLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS SEQ ID NO: 62 Secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de Ab8 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWFQQKPGKAPKSLIYAASSLQGGVPS FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYNYPFTFGPGTTVDIKRTVAAPSVFIFPPSD EQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSK ADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO: 63 Secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena ligera de Abl DIQMTQSPSSLSASLGDRVTITCRASQSVDRYFNWYQQKPGKAPKVLIFAASSLQSGVPSR FGGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPWTFGQGTKVEVK SEQ ID NO: 64 Secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena ligera de Ab2 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTISCRASQFIGRYFNWYQQQPGKAPKVLIYAESSLQSGVPSR FSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFARYYCQQSYSTPWTFGQGTKVEIK SEQ ID NO: 65 Secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena ligera de Ab3 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSFSSNYLAWYQQKPGQAPRLFIYGASSRATGIPD RFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYFCQQYGISPGSFGQGTKLEIK SEQ ID NO: 66 Secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena ligera de Ab4 DIVMTQSPLSLPVTPGEPAS'ISCRSSQSLLNSNGYNYLDWYLQKPGQSPQFLIYLGSYRAS GVPDRFSGSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCIQTLQTPFTFGPGTKVDIK SEQ ID NO: 67 Secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena ligera de Ab5 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQRPGQAPRLLIYGASSRATGIPD RFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCLQSGSSVPLTFGGGTKVEIK SEQ ID NO: 68 Secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena ligera de Ab6 QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGINYVYWYQQLPGTAPKLLIYRSDQRPSGVPD RFSGSKSGTSASLALSGLRSEDEADYYCAAWDDSLSGVVFGGGTKLTVL SEQ ID NO: 69 Secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena ligera de Ab7 QSVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVN YQQFPGTAPKLLIYVNNNRPSGVP DRFSGSTSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDTSLSASVFGGGTRLTVL SEQ ID NO: 70 Secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena ligera de Ab8 ' DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWFQQKPGKAPKSLIYAASSLQGGVPSK FSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYNYPFTFGPGTTVDIK SEQ ID NO: 71 Secuencia de aminoácidos de la CDR1 de la cadena ligera de Abl RASQSVDRYFN SEQ ID NO: 72 Secuencia de aminoácidos de la CDR1 de la cadena ligera de Ab2 RASQFIGRYFN SEQ ID NO: 73 Secuencia de aminoácidos de la CDR1 de la cadena ligera de Ab3 RASQSFSSNYLA SEQ ID NO:74 Secuencia de aminoácidos de la CDR1 de la cadena ligera de Ab4 RSSQSLLNSNGYNYLD SEQ ID NO: 75.
Secuencia de aminoácidos de CDRl de la cadena ligera Ab5 RASQSVSSSYLA SEQ ID NO: 76 Secuencia de aminoácidos de CDR1 de la cadena ligera de Ab6 SGSSSNIGINYVY SEQ ID NO:77 Secuencia de aminoácidos de la CDR1 de la cadena ligera de Ab7 TGSSSNIGAGYDVN SEQ ID NO:78 Secuencia de aminoácidos de la CDR1 de la cadena ligera de Ab8 RASQGISNYLA SEQ ID NO: 79 Secuencia de aminoácidos de la CDR2 de la cadena ligera de Abl AASSLQS SEQ ID NO: 80 Secuencia de aminoácidos de la CDR2 de la cadena ligera de Ab2 AESSLQS SEQ ID NO:81 Secuencia de aminoácidos de la CDR2 de la cadena ligera de Ab3 GASSRAT SEQ ID NO: 82 Secuencia de aminoácidos de la CDR2 de la cadena ligera de Ab4 LGSYRAS SEQ ID NO: 83 Secuencia de aminoácidos de la CDR2 de la cadena ligera de A 5 GASSRAT SEQ ID NO:84 Secuencia de aminoácidos de CDR2 de la cadena ligera Ab6 RSDQRPS SEQ ID NO: 85 Secuencia de aminoácidos de CDR2 de la cadena ligera Ab7 VNNNRPS SEQ ID NO:86 Secuencia de aminoácidos de CDR2 de la cadena ligera Ab8 AASSLQG SEQ ID NO: 87 Secuencia de aminoácidos de la CDR3 de la cadena ligera de Abl QQSYSTP T SEQ ID NO:88 Secuencia de aminoácidos de la CDR3 de la cadena ligera de Ab2 QQSYSTPWT SEQ ID NO: 89 Secuencia de aminoácidos de la CDR3 de la cadena ligera de Ab3 QQYGISPCS ' SEQ ID NO: 90 Secuencia de aminoácidos de la CDR3 de la cadena ligera de Ab4 IQTLQTPFT SEQ ID NO: 91 Secuencia de aminoácidos de la CDR3 de la cadena ligera de Ab5 LQSGSSVPLT SEQ ID NO: 92 Secuencia de aminoácidos de la CDR3 de la cadena ligera de Ab6 AAWDDSLSGVV SEQ ID NO: 93 Secuencia de aminoácidos de. la CDR3 de la cadena ligera de Ab7 QSYDTSLSASV SEQ ID NO: 94 Secuencia de aminoácidos de la CDR3 de la cadena ligera de Ab8 QQYYNYPFT

Claims (148)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito la presente invención, . se considera como novedad, y por lo tanto se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES
1. Una proteína ' de unión al antígeno CD27L caracterizada porque comprende: a) un dominio variable de cadena ligera que posee al menos 90% de identidad con la secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, o SEQ ID NO: 70; b) un dominio variable de cadena pesada que posee al menos 90% de identidad con la secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18,. SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, o SEQ ID NO: 24; o c) el dominio variable de cadena ligera de a) y el dominio variable de cadena pesada de b) .
2. La proteína de unión al antígeno CD27L de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el dominio variable de cadena ligera posee al menos 95% de identidad con la secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69, o SEQ ID NO:70.
3. La proteina de unión al antigeno CD27L de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizada porque el dominio variable de cadena pesada posee al menos 95% de identidad con la secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID N0:17, SEQ ID NO: 18, .SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, o SEQ ID NO:24.
4. Una proteina de unión al antigeno CD27L caracterizada porque comprende: a) un dominio variable de cadena ligera que posee no más de diez adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69, o SEQ ID NO:70; b) un dominio variable de cadena pesada que posee no más de diez adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID O:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, o SEQ ID NO:24; o c) el dominio variable de cadena ligera de a) y el dominio variable de cadena pesada de b) .
5. La proteina de unión al antigeno CD27L de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque el dominio variable de cadena ligera tiene no más de cinco adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69, o SEQ ID NO:70.
6. La proteina de unión al antigeno CD27L de conformidad con la reivindicación 4 o 5, caracterizada porque el dominio variable de cadena pesada tiene no más de cinco adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, o SEQ ID NO:24.
7. La proteina de unión al antigeno CD27L conforme a la reivindicación 1-6, caracterizada porque el dominio variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, o SEQ ID NO: 70.
8. La proteina de unión al antígeno CD27L de conformidad con la reivindicación 1-7, caracterizada porque el dominio variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO: 23, o SEQ ID NO: 24.
9. Una proteína de unión al antigeno CD27L que posee un dominio variable de .cadena ligera caracterizada porque comprende: a) una LCDR1 qúe posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de LCDR1 descrita en SEQ ID NO: 71; una LCDR2 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de LCDR2 descrita en SEQ ID NO: 79; y una LCDR3 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de LCDR3 descrita en SEQ ID NO: 87; b) una LCDR1 que . posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de LCDR1 descrita en SEQ ID NO: 72; una LCDR2 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de LCDR2 descrita en SEQ ID NO: 80; y una LCDR3 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de LCDR3 descrita en SEQ ID NO: 88; c) una LCDR1 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de LCDR1 descrita en SEQ ID NO: 73; una LCDR2 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de LCDR2 descrita en SEQ ID NO: 81; y una LCDR3 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de LCDR3 descrita en SEQ ID NO: 89; d) una LCDR1 que ¦ posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de LCDRl descrita en SEQ ID NO: 74; una LCDR2 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de LCDR2 descrita en SEQ ID NO: 82; y una LCDR3 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de LCDR3 descrita en SEQ ID NO: 90; e) una LCDRl que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de LCDRl descrita en SEQ ID NO: 5; una LCDR2 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de LCDR2 descrita en SEQ ID NO: 83; y una LCDR3 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de LCDR3 descrita en SEQ ID NO: 91; f) una LCDRl que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de LCDRl descrita en SEQ ID NO: 76; una LCDR2 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de LCDR2 descrita en SEQ ID NO: 84; y una LCDR3 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de LCDR3 descrita en SEQ ID NO: 92; g) una LCDR1 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir . de la secuencia de LCDR1 descrita en SEQ ID NO: 77; una LCDR2 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de LCDR2 descrita en SEQ ID NO: 85; y una LCDR3 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de LCDR3 descrita en SEQ ID NO: 93; o h) una LCDR1 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de LCDR1 descrita en SEQ ID NO: 78; una LCDR2 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de LCDR2 descrita en SEQ ID NO: 86; y una LCDR3 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de LCDR3 descrita en SEQ ID NO: 94; and un dominio variable de cadena pesada que comprende: i) una HCDR1 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de HCDR1 descrita en SEQ ID N0:25; una HCDR2 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de HCDR2 descrita en SEQ ID NO: 33; y una HCDR3 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de HCDR3 descrita en SE.Q ID NO: 41; j) una HCDR1 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de HCDRl descrita en SEQ ID NO: 26; una HCDR2 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de HCDR2 descrita en SEQ ID NO: 34; y una HCDR3 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de HCDR3 descrita en SEQ ID NO: 42; k) una HCDRl que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de HCDRl descrita en SEQ ID NO: 27; una HCDR2 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de HCDR2 descrita en SEQ ID NO:35; y una HCDR3 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de HCDR3 descrita en SEQ ID NO:43; 1) una HCDRl que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de HCDRl descrita en SEQ ID NO: 28; una HCDR2 que posee no más de tres adiciones, ¦ supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de HCDR2 descrita en SEQ ID NO: 36; y una HCDR3 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de HCDR3 descrita en SEQ ID NO: 44; m) una HCDR1 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de HCDRl descrita en SEQ ID NO: 29; una HCDR2 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de HCDR2 descrita en SEQ ID NO: 37; y una HCDR3 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de HCDR3 descrita en SEQ ID NO: 45; n) una HCDRl que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de HCDRl descrita en SEQ ID NO: 30; una HCDR2 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir dé la secuencia de HCDR2 descrita en SEQ ID NO: 38; y una HCDR3 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de HCDR3 descrita en SEQ ID NO: 46; o) una HCDRl que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de HCDRl descrita en SEQ ID NO: 31; una HCDR2 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de HCDR2 descrita en SEQ ID NO: 39; y una HCDR3 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de HCDR3 descrita en SEQ ID NO: 47; o p) una HCDRl que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de HCDRl descrita en SEQ ID NO:32; una HCDR2 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de HCDR2 descrita en SEQ ID NO: 40; y una HCDR3 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir . de la secuencia de HCDR3 descrita en SEQ ID NO: 48.
10. La proteina de unión al antigeno CD27L de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque comprende el dominio variable de cadena ligera a) y el dominio variable de cadena pesada de i) .
11. La proteina de unión al antigeno CD27L de conforidad con la reivindicación 10, caracterizada porque el dominio variable de cadena ligera, comprende una LCDR1 como se describe en SEQ ID NO: 71; una secuencia LCDR2 como se describe en SEQ ID NO: 79; y una secuencia LCDR3 como se describe en SEQ ID NO: 87; y el dominio variable de cadena pesada comprende una HCDRl como se describe en SEQ ID NO: 25; una secuencia HCDR2 como se describe en SEQ ID NO:33; y una secuencia HCDR3 como se describe en SEQ ID NO: 41.
12. La proteína de unión al antígeno CD27L de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque comprende el dominio variable de cadena ligera b) y el dominio variable de cadena pesada de j ) .
13. La proteína de unión al antígeno CD27L conforme a la reivindicación 12, donde el dominio variable de cadena ligera comprende una LCDRl como se describe en SEQ ID NO: 72; una secuencia LCDR2 como se describe en SEQ ID NO: 80; y una secuencia LCDR3 como se describe en SEQ ID NO: 88; y el dominio variable de cadena pesada comprende una HCDRl como se describe en SEQ ID NO: 26; una secuencia HCDR2 como se describe en SEQ ID NO: 34; y una secuencia HCDR3 como se describe en SEQ ID NO: 42..
14. La proteína de unión al antígeno CD27L de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque comprende el dominio variable de cadena ligera c) y el dominio variable de cadena pesada de k) .
15. La proteína de unión al antígeno CD27L de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque el dominio variable de cadena ligera comprende una LCDRl como se describe en SEQ ID NO: 73; una secuencia LCDR2 como se describe en SEQ ID NO: 81; y una secuencia LCDR3 como se describe en SEQ ID NO: 89; y el dominio variable de cadena pesada comprende una HCDRl como se describe en SEQ ID NO:27; una secuencia HCDR2 como se describe en SEQ ID NO: 35; y una secuencia HCDR3 como se describe en SEQ ID NO:43.
16. La proteína de unión al antígeno CD27L de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque comprende el dominio variable de cadena ligera d) y el dominio variable de cadena pesada de 1).
17. La proteína de unión al antígeno CD27L de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada porque el dominio variable de cadena ligera comprende una LCDRl como se describe en SEQ ID NO: 74; una secuencia LCDR2 como se describe en SEQ ID NO: 82; y una secuencia LCDR3 como se describe en SEQ ID NO: 90; y el dominio variable de cadena pesada comprende una HCDRl como se describe en SEQ ID NO : 28 ; una secuencia HCDR2 como se describe en SEQ ID NO:36; y una secuencia HCDR3 como se describe en SEQ ID NO: 44.
18. La proteína de unión al antígeno CD27L de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque comprende el dominio variable de cadena ligera e) y el dominio variable de cadena pe.sada de m) .
19. La proteína de unión al antígeno CD27L de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada porque el dominio variable de cadena ligera comprende una LCDRl como se describe en SEQ ID NO: 75; una secuencia LCDR2 como se describe en SEQ ID NO: 83; y una secuencia LCDR3 como se describe en SEQ ID NO: 91; y el dominio variable de cadena pesada comprende una HCDRl como se describe en SEQ ID NO:29; una secuencia HCDR2 como se describe en SEQ ID NO: 37;. y una secuencia HCDR3 como se describe en SEQ ID NO: 5.
20. La proteína de unión al antígeno CD27L de conformidad con la reivindicación 9, . caracterizada porque comprende el dominio variable de cadena ligera f) y el dominio variable de cadena pesada de n) .
21. La proteína de unión al antígeno CD27L de conformidad con la reivindicación 20, caracterizada porque el dominio variable de cadena ligera comprende una LCDR1 como se describe en SEQ ID NO: 76; una secuencia LCDR2 como se describe en SEQ ID NO: 84; y una secuencia LCDR3 como se describe en SEQ ID NO: 92; y el dominio variable de cadena pesada comprende una HCDRl como se describe en SEQ ID NO: 30; una secuencia HCDR2 como se describe en SEQ ID NO:.38; y una secuencia HCDR3 como se describe en SEQ ID NO: 46.
22. La proteína de unión al antígeno CD27L conforme a la reivindicación 9 que comprende el dominio variable de cadena ligera g) y el dominio variable de cadena pesada de o) .
23. La proteína de unión al antígeno CD27L de conformidad con la reivindicación 22, donde el dominio variable de cadena ligera comprende una LCDRl como se describe en SEQ ID NO: 77; una secuencia LCDR2 como se describe en SEQ ID. NO: 85; y una secuencia LCDR3 como se describe en SEQ ID NO: 93; y el dominio variable de cadena pesada comprende una HCDR1 como se. describe en SEQ ID NO:31; una secuencia HCDR2 como se describe en SEQ ID NO: 39; y una secuencia HCDR3 como se describe en SEQ ID NO: 7.
24. La proteina de unión al antígeno CD27L conforme a la reivindicación 9 caracterizada porque comprende el dominio variable de cadena ligera h) y el dominio variable de cadena pesada de p) .
25. La proteina de unión al antigeno CD27L de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada porque el dominio variable de cadena ligera comprende una LCDRl como se describe en SEQ ID NO: 78; una secuencia LCDR2 como se describe en SEQ ID NO: 86; y una secuencia LCDR3 como se describe en SEQ ID NO:94; y el dominio variable de cadena pesada comprende una HCDR1 como se describe en SEQ ID N0:32; una secuencia HCDR2 como se describe en SEQ ID NO: 40; y una secuencia HCDR3 como se describe en SEQ ID NO: 48.
26. La proteina de unión al antigeno CD27L de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-25, caracterizada porque la proteina de unión al antigeno se une de manera especifica a CD27L humana con una afinidad de menos de o igual a 2 x 10"11 M.
27. La proteina de unión al antigeno CD27L de conformidad con cualquiera . de las reivindicaciones 1-26, caracterizada porque, la proteina de unión al antigeno inhibe la unión de CD27L a CD27.
28. La proteina de unión al antigeno CD27L de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-27, donde la proteina de unión al antigeno es un anticuerpo.
29. La proteina de unión al antigeno CD27L de conformidad con la reivindicación 28, donde el anticuerpo es un anticuerpo humano.
30. La proteina de unión al antigeno CD27L de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada porque comprende una cadena ligera y una cadena pesada, donde la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID: 56 y la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID NO: 10.
31. La proteina de unión al antigeno CD27L de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada porque comprende una cadena ligera y una cadena pesada, donde la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID: 57 y la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID NO: 11.
32. La proteina de unión al antigeno CD27L de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada porque comprende una cadena ligera y una cadena pesada, donde la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID: 58 y la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID NO: 12.
33. La proteina de unión al antigeno CD27L de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada porque comprende una cadena ligera y una cadena pesada, donde la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID: 59 y la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID NO: 13.
34. La proteina de unión al antigeno CD27L de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada porque comprende una cadena ligera y una cadena pesada, donde la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID: 60 y la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID NO: 14.
35. La proteina de unión al antigeno CD27L de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada porque comprende una cadena ligera y una cadena pesada, donde la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID: 61 y la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID NO: 15.
36. La proteina de unión al antigeno CD27L de conformidad con la reivindicación 29, carcaterizada porque comprende una cadena ligera y una cadena pesada, donde la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID: 62 y la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID NO: 16.
37. La proteina de unión al antigeno CD27L de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-36, caracterizada porque la proteina de unión al antigeno CD27L está conjugada a un agente quimioterapéutico.
38. La proteina de unión al antigeno . CD27L de conformidad con la reivindicación 37, caracterizada porque un conector conjuga el agente quimioterapéutico con la proteina de unión al antigeno CD27L.
39. La proteina de unión al antigeno CD27L de conformidad con la reivindicación 38, caracterizada porque el conector es un conector que no es una unión escindible.
40. La proteina de unión al antigeno CD27L de conformidad con la reivindicación 39, caracterizada porque el conector comprende MCC.
41. La proteina de unión al antigeno CD27L de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 38-40, caracterizada porque el agente quimioterapéutico está conjugado a una o más lisinas contenidas en un polipéptido de la proteina de unión al antigeno CD27L.
42. La proteína de unión al antigeno CD27L de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 37-41, caracterizada porque el agente quimioterapéutico es DM1.
43. Una composición de proteínas de unión al antígeno CD27L de conformidad con . la reivindicación 42, carcaterizada porque el número promedio de moléculas DM1 por proteína de unión al antígeno CD27E se encuentra entre 1 y 10.
44. La composición de proteínas de unión al antígeno CD27L de conformidad con la reivindicación 43, carcaterizada porque el número promedio de moléculas DM1 por proteína de unión al antígeno CD27L se encuentra entre 3 y 7.
45. La composición de proteínas de unión al antígeno CD27L de conformidad con la reivindicación 44, caracterizada porque el número promedio de moléculas DM1 por proteína de unión al antígeno CD27L se encuentra entre 4 y 6.
46. La composición de proteínas de unión al antígeno CD27L de conformidad con la reivindicación 44, carcaterizada porque el número promedio de moléculas DM1 por proteína de unión al antígeno CD27L es alrededor de 4.0, alrededor de 4.1, alrededor de 4 .2, alrededor de 4.3, alrededor de 4. 4, alrededor de 4.5, alrededor de 4. 6, alrededor de 4. 7, alrededor de 4.8, alrededor de 4. 9, . alrededor de 5. 0, alrededor de 5.1, alrededor de .5. 2, alrededor de 5. 3, alrededor de 5.4, alrededor de 5. 5, alrededor de 5. 6, alrededor de 5.7,. alrededor de 5.8, alrededor de 5.9, o alrededor de 6.0.
47. La composición de proteínas de unión al antígeno CD27L de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 43-46, caracterizada porque la composición es una composición farmacéutica que comprende a cantidad terapéuticamente efectiva de la proteína de unión al antígeno CD27L.
48. La composición de proteínas de unión al antígeno CD27L de conformidad con la reivindicación 47, caracterizada porque la composición farmacéutica se encuentra liofilizada.
49. Un ácido nucleico aislado que codifica un polipéptido, caracterizada porque dicho . polipéptido comprende: a) un dominio variable de cadena ligera que posee al menos 95% de identidad con la secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69, o SEQ ID NO: 70; b) un dominio variable de cadena pesada que posee al menos 95% de identidad con la secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID N0:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, o SEQ ID NO: 24; c) un dominio variable de cadena ligera que posee no más de cinco adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID NO:63, SEQ ID NO : 64 , SEQ ID NO:65, SEQ ID NO : 66 , SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69, o SEQ ID NO: 70; d) un dominio variable de cadena pesada que posee no más de cinco adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de aminoácidos descrita en SEQ ID NO:17, SEQ ID N0:18, SEQ ID N0:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID N0:21, SEQ ID NO : 22., SEQ ID NO:23, o SEQ ID NO:24; e) un dominio variable de cadena ligera que comprende: i) una LCDR1 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de LCDR1 descrita en SEQ ID NO: 71; una LCDR2 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de LCDR2 descrita en SEQ ID NO: 79; y una LCDR3 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de LCDR3 descrita en SEQ ID NO: 87; ii) una LCDR1 que .posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de LCDR1 descrita en SEQ ID NO: 72; una LCDR2 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de LCDR2 descrita en SEQ ID NO:80; y una LCDR3 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de LCDR3 descrita en SEQ ID NO: 88; iii) una LCDR1 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de LCDR1 descrita en SEQ ID NO: 73; una LCDR2 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de LCDR2 descrita en SEQ ID NO: 81; y una .LCDR3 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de LCDR3 descrita en SEQ ID NO:89; iv) una LCDR1 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de LCDR1 descrita en SEQ ID NO: 74; una LCDR2 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de LCDR2 descrita en SEQ ID NO: 82; y una LCDR3 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de LCDR3 descrita en SEQ ID NO: 90; v) una LCDR1 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de LCDRl descrita en SEQ ID NO: 75; una LCDR2 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de LCDR2 descrita en SEQ ID NO: 83; y una LCDR3 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de LCDR3 descrita en SEQ ID NO: 91; vi) una LCDRl que posee no- más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de LCDRl descrita en SEQ ID NO: 76; una LCDR2 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de LCDR2 descrita en SEQ ID NO: 8-4; y una LCDR3 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de LCDR3 descrita en SEQ ID NO: 92; vii) una LCDR1 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de LCDRl descrita en SEQ ID NO: 77; una LCDR2 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de LCDR2 descrita en SEQ ID NO: 85; y una LCDR3 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de LCDR3 descrita en SEQ ID NO:93; o viii) una LCDRl que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de LCDRl descrita en SEQ ID NO:78; una LCDR2 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de LCDR2 descrita en SEQ ID NO: 86; y una LCDR3 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de LCDR3 descrita en SEQ ID NO: 94; o f) un dominio variable de cadena pesada que comprende: i) una HCDR1 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de HCDR1 descrita en SEQ ID NO: 25; una HCDR2 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de HCDR2 descrita en SEQ ID NO: 33; y una HCDR3 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de HCDR3 descrita en SEQ ID NO: 41; ii) una HCDR1 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de HCDR1 descrita en SEQ ID NO: 26; una HCDR2 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de HCDR2 descrita en SEQ ID NO: 34; y una HCDR3 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de HCDR3 descrita en SEQ ID NO: 42; iii) una HCDR1 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de HCDR1 descrita en SEQ ID NO: 27; una HCDR2 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de HCDR2 descrita en SEQ ID NO: 35; y una HCDR3 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de HCDR3 descrita en SEQ ID NO: 43; iv) una HCDR1 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de HCDRl descrita en SEQ ID NO:28; una HCDR2 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de HCDR2 descrita en SEQ ID NO: 36; y una HCDR3 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de HCDR3 descrita en SEQ ID NO: 4; v) una HCDRl que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de HCDRl descrita en SEQ ID NO: 29; una HCDR2 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir dé la secuencia de HCDR2 descrita en SEQ ID NO: 37; y una HCDR3 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de HCDR3 descrita en SEQ ID NO: 5; vi) una HCDRl que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de HCDRl descrita en SEQ ID NO: 30; una HCDR2 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de HCDR2 descrita en SEQ ID NO: 38; y una HCDR3. que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de HCDR3 descrita en SEQ ID NO: 46; vii) una HCDR1 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de HCDR1 descrita en SEQ ID NO: 31; una HCDR2 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de HCDR2 descrita en SEQ ID NO: 39; y una HCDR3 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de HCDR3 descrita en SEQ ID NO:47; o viii) una HCDR1 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de HCDR1 descrita en SEQ ID NO: 32; una HCDR2 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de HCDR2 descrita en SEQ ID NO: 40; y una HCDR3 que posee no más de tres adiciones, supresiones o sustituciones de aminoácidos a partir de la secuencia de HCDR3 descrita en SEQ ID NO: 48.
50. El ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 49, caracterizado porque el polipéptido comprende la cadena ligera de un anticuerpo.
51. El ácido nucleico aislado de. conformidad con la reivindicación 50, caracterizado porque la cadena ligera es codificada por un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos al menos 80% idéntica a la secuencia de nucleótidos descrita en SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, o SEQ ID NO:55.
52. El ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 51, caracterizado porque la cadena ligera es codificada por un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos al menos 90% idéntica a la secuencia de nucleótidos descrita en SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO:52, SEQ ' ID NO:53, SEQ ID NO:54, o SEQ ID NO:55.
53. El ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 52, caracterizado porque la cadena ligera es codificada por un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos al menos 95% idéntica a la secuencia de nucleótidos descrita en SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:54, o SEQ ID NO:55.
54. El ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 53, caracterizado porque la cadena ligera es codificada por un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos descrita en SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:54, o SEQ ID NO: 55.
55. El ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 49, caracterizado porque el polipéptido comprende la cadena pesada de un anticuerpo.
56. El ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado porque la cadena pesada es codificada por un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos al .menos 80% idéntica a la secuencia de nucleótidos descrita en SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID N0:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, o SEQ ID NO:9.
57. El ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 56, caracterizado porque la cadena pesada es codificada por un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos al menos 90% idéntica a la secuencia de nucleótidos descrita en SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID N0:5, SEQ ID NO:6, SEQ 'ID' NO: 7, SEQ ID NO:8, o SEQ ID NO: -9.
58. El ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 57, caracterizado porque la cadena pesada es codificada por un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos al menos 95% idéntica a la secuencia de nucleótidos descrita en SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, o SEQ ID NO : 9.
59. El ácido nucleico aislado conforme a la reivindicación 58, caracterizado porque la cadena pesada es codificada por un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos descrita en SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:54, o SEQ ID NO: 55.
60. Un vector de' expresión caracterizado porque comprende el ácido nucleico asilado conforme a cualquiera de las reivindicaciones 46-56.
61. El vector de expresión de conformidad con la reivindicación 60, caracterizado porque el ácido nucleico aislado codifica la cadena ligera de un anticuerpo.
62. El vector de expresión de conformidad con la reivindicación 60, caracterizado porque el ácido nucleico aislado codifica la cadena pesada de un anticuerpo.
63. El vector de expresión de conformidad con la reivindicación 61, que asimismo comprende un ácido nucleico aislado que codifica la cadena pesada de un anticuerpo.
64. Una célula huésped recombinante caracterizado porque comprende un ácido nucleico aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 49-59 que se encuentra unido de manera funcional a un iniciador.
65. Una célula huésped recombinante caracterizado porque comprende un vector de expresión de conformidad con la reivindicación 61 o 62.
66. La célula huésped recombinante de conformidad con la reivindicación 65, caracterizada porque la célula huésped comprende un vector de expresión de conformidad con las reivindicaciones 61 y 62.
67. La célula huésped recombinante de conformidad con la reivindicación 66, caracterizada porque la célula huésped secreta un anticuerpo que se une a CD27L.
68. La. célula huésped recombinante de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 64-67, caracterizada porque la célula es de origen mamífero.
69. La célula huésped recombinante de conformidad con la reivindicación 68, caracterizada porque la célula es una línea celular de ovario de hámster chino (CHO) .
70. Un método para elaborar un conjugado anticuerpo CD27L-fármaco, caracterizado porque dicho método consiste en los pasos de: a) suministrar una proteína de unión al antígeno CD27L de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-36; b) conjugar, la proteína de unión al antígeno CD27L a un conector ; y c) conjugar un fármaco a dicho conector.
71. Un método para elaborar un conjugado anticuerpo CD27L-fármaco, caracterizado porque dicho método consiste en los pasos de: a) suministrar una proteína de unión al antígeno CD27L de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-36; y b) conjugar un conector unido de manera covalente al fármaco con dicha proteina de unión al antigeno CD27L.
72. El método de conformidad con la reivindicación 70 o 71, caracterizado porque la proteina de unión al antígeno CD27L es un anticuerpo.
73. El método de conformidad con la reivindicación 72, caracterizado porque el anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera como se describe en SEQ ID NO: 63 y una secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada como se describe en SEQ ID NO: 17.
74. El método de conformidad con la reivindicación 73, caracterizado porque el anticuerpo es Abl.
75. El método de conformidad con la reivindicación 72, caracterizado porque el anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera como se describe en SEQ ID NO: 64 y una secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada como se describe en SEQ ID NO: 13.
76. El método de conformidad con la reivindicación 75, caracterizado porque el anticuerpo es Ab2.
77. El método de conformidad con la reivindicación 72, caracterizado porque el anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera como se describe en SEQ ID NO: 65 y una secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada como se describe en SEQ ID NO: 19.
78. El método de conformidad con la reivindicación 77, caracterizado porque el anticuerpo es Ab3.
79. El método de conformidad con la reivindicación 72, caracterizado porque el anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera como se describe en SEQ ID NO: 66' y una secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada como se describe en SEQ ID NO: 20.
80. El método de conformidad con la reivindicación 79, caracterizado porque el anticuerpo es Ab4.
81. El método de conformidad con la reivindieación 72, caracterizado porque, el anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera como se describe en SEQ ID NO: 67 y una secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada como se describe en SEQ ID NO:21.
82. El método de conformidad con la reivindicación 81, caracterizado porque el anticuerpo es Ab5.
83. El método de conformidad con la reivindicación 72, caracterizado porque el anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera como se describe en SEQ ID NO: 68 y una secuencia de aminoácidos del dominio, variable de cadena pesada como se describe en SEQ ID NO: 22.
84. El método de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado porque el anticuerpo es Ab'6.
85. El método de conformidad con la reivindicación 72, caracterizado porque el anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera como se describe en SEQ ID NO:69 y una secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada como se describe en SEQ ID NO:23.
86. El método de conformidad con la reivindicación 85, caracterizado porque el anticuerpo es Ab7.
87. El método de conformidad con la reivindicación 72, caracterizado porque el anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera como se describe en SEQ ID NO: 70 y una secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada como se describe en SEQ ID NO:24.
88. El método de conformidad con la reivindicación 87, caracterizado porque el anticuerpo es Ab8.
89. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 67-85, donde el conector comprende MCC.
90. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 70-88, caracterizado porque el fármaco comprende DM1.
91. Un método para el tratamiento del cáncer, caracterizado porquedicho método consiste en administrar un cantidad terapéuticamente efectiva de una proteína de unión al antígeno CD27L de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-36 a un paciente que lo requiera.
92. El método de conformidad con la reivindicación 91, caracterizado porque la proteína de unión al antígeno CD27L es un anticuerpo.
93. El método de conformidad con la reivindicación 92, caracterizado porque el anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera como se describe en SEQ ID NO:'63 y una secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada como se describe en SEQ ID N0:17.
94. El método de conformidad con la reivindicación 93, caracterizado porque el anticuerpo es Abl.
95. El método de conformidad con la reivindicación 92, caracterizado porque el anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera como se describe en SEQ ID NO: 64 y una secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada como se describe en SEQ ID N0:18.
96. El método de conformidad con la reivindicación 95, caracterizado porque el anticuerpo es Ab2.
97. El método de conformidad con la reivindicación 92, caracterizado porque el anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera como se describe en SEQ ID NO: 65 y una secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada como se describe en SEQ ID NO: 19.
98. El método de conformidad con la reivindicación 97, caracterizado porque el anticuerpo es Ab3.
99. El método de conformidad con la reivindicación 92, caracterizado porque el anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera como se describe en SEQ ID NO: 66· y una secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada como se describe en SEQ ID NO:20.
100. El método de conformidad con la reivindicación 99, caracterizado porque el anticuerpo es Ab4.
101. El método de conformidad con la reivindicación 92, caracterizado porque el anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera como se describe en SEQ ID NO: 67 y una secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada como se describe en SEQ ID N0:?1.
102. El método de conformidad con la reivindicación 101, caracterizado porque el anticuerpo es Ab5.
103. El método de conformidad con la reivindicación 92, caracterizado porque el anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera como se describe en SEQ ID NO: 68 ' y una secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada como se describe en SEQ ID NO:22.
104. El método de conformidad con la reivindicación 103, caracterizado porque el anticuerpo es Ab6.
105. El método de conformidad con la reivindicación 92, caracterizado porque el anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera como se describe en SEQ ID NO: 69 y una secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada como se describe en SEQ ID NO: 23.
106. El método de conformidad con la reivindicación 105, caracterizado porque el anticuerpo es Ab7.
107. El método de conformidad con la reivindicación 92, caracterizado porque el anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera como se describe en SEQ ID NO: 70 y una secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada como se describe en SEQ ID NO:24.
108. El método de conformidad con la reivindicación 107, caracterizado porque el anticuerpo es Ab8.
109. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 92-108, caracterizado porque una composición farmacéutica comprende el anticuerpo.
110. El método de conformidad con la reivindicación 109, caracterizado porque el anticuerpo comprende una función efectora mejorada.
111. El método de conformidad con la reivindicación 109, caracterizado porque la composición farmacéutica comprende una población de conjugados anticuerpo fármaco.
112. El método de conformidad con la reivindicación 111, caracterizado porque el conjugado anticuerpo fármaco comprende un conector MCC.
113. El método de conformidad con la. reivindicación 111 o 112, caracterizado porque el conjugado anticuerpo fármaco comprende DM1.
114. El método de conformidad con la reivindicación 113, caracterizado porque el número promedio de Moléculas DM1 por anticuerpo se encuentra entre 1 y 10.
115. El método de conformidad con la reivindicación 114, caracterizado porque el número promedio de Moléculas DM1 por anticuerpo se encuentra entre' 3 y 7.
116. El método de conformidad con la reivindicación 115, caracterizado porque el número promedio de Moléculas DM1 por anticuerpo se encuentra entre 4 y 6.
117. El método de conformidad con la reivindicación 116, caracterizado porque el número promedio de Moléculas DM1 por anticuerpo es alrededor de 4.0, alrededor de 4.1, alrededor de 4.2, alrededor de 4.3. alrededor de 4.4, alrededor de 4.5, alrededor de 4.6, alrededor de 4 .7, alrededor de 4.8, alrededor de 4.9, alrededor de 5 • 0, alrededor de 5.1, alrededor de 5.2, alrededor de 5 • 3, alrededor de 5.4, alrededor de 5.5, alrededor de 5 .6, alrededor de 5.7, alrededor de ! 5.8, alrededor de 5.9, o alrededor de 6. o.
118. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 91-117, caracterizado porque se ensaya la expresión de CD27L en una muestra obtenida el paciente.
119. El método de conformidad con la reivindicación 118, caracterizado porque se ensaya la expresión de ARNm de CD27L en la muestra.
120. El método de conformidad con la reivindicación 118, caracterizado porque se ensaya la expresión de la proteina CD27L en la muestra.
121. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 118-120, caracterizado porque . la muestra es una muestra de sangre.
122. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 118-129, caracterizado porque la muestra es una biopsia.
123. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 91-122, caracterizado porque el cáncer es carcinomas de células renales (RCC) , RCC de células claras, cáncer de cabeza y cuello, glioblastoma, cáncer de mama, tumor cerebral, carcinoma nasofaríngeo, linfoma no Hodgkin (NHL), leucemia linfocítica aguda (ALL) , leucemia linfocitica crónica (CLL) , linfoma de Burkitt, linfomas anaplásticos de células grandes (ALCL) , míeloma múltiple, linfomas cutáneos de células T, linfomas nodulares de células pequeñas hendidas, linfomas linfocíticos, linfomas de células T periféricas, linfomas de Lennert, linfoma inmunoblástico, linfomas/leucemia de células T (ATLL) , leucemia de células T del adulto (T-ALL) , cáncer de linfoma folicular centroblástico/centrocitico (cb/cc) , . linfoma difuso de células grandes de linaje B, linfoma de células T del tipo linfadenopatia angioinmunoblástica (AILD) , linfoma asociado a cavidad corporal relacionado con el VIH, carcinoma embrionario, carcinoma rino-faríngeo no diferenciado, enfermedad de Castlemán, sarcoma de Kaposi, mieloma múltiple, macroglobulinemia de Waldenstrom u otro linfoma de células B.
124. El método de conformidad con la reivindicación 123, caracterizado porque el cáncer es RCC.
125. El método de conformidad con la reivindicación 123, caracterizado porque el cáncer es NHL.
126. El método de conformidad con la reivindicación 123, caracterizado porque el cáncer es CLL.
127. Un método para el tratamiento de trastornos autoinmunitarios o inflamatorios, caracterizado porque dicho método consiste en administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de una proteina de unión al antigeno CD27L de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-36 a un paciente que lo requiera.
128. El método de conformidad con la reivindicación 127, caracterizado porque la proteina de unión al antigeno CD27L es un anticuerpo.
129. El método de conformidad con la reivindicación 128, caracterizado porque el anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera como se describe en SEQ ID NO: 63 y una secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada como se describe en SEQ ID NO : 17.
130. El método de conformidad con la reivindicación 129, caracterizado porque el anticuerpo es Abl.
131. El método de conformidad con la reivindicación 128, caracterizado porque el anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera como se describe en SEQ ID NO: 64 y una secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada como se describe en SEQ ID NO: 18.
132. El método de conformidad con la reivindicación 131, caracterizado porque el anticuerpo es Ab2.
133. El método de conformidad con la reivindicación 128, caracterizado porque el anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera como se describe en SEQ ID NO: 65 y una secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada como se describe en SEQ ID NO : 19.
134. El método de conformidad con la reivindicación 133, caracterizado porque el anticuerpo es Ab3.
135. El método de conformidad con la reivindicación 128, caracterizado porque el anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera como se describe en SEQ ID NO: 66 y una secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada como se describe en SEQ ID NO: 20.
136. El método de conformidad con la reivindicación 135, caracterizado porque el anticuerpo es Ab4.
137. El método de conformidad con la reivindicación 128, caracterizado porque el anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera como se describe en SEQ ID NO: 67 y una secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada como se describe en SEQ ID N0:21.
138. El método de conformidad con la reivindicación 137, caracterizado porque el anticuerpo es Ab5.
139. El método de conformidad con la reivindicación 128, caracterizado porque el anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera como se describe en SEQ ID NO:'68 y una secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada como se describe en SEQ ID NO: 22.
140. El método de conformidad con la reivindicación 139, caracterizado porque el anticuerpo es Ab6.
141. El método de conformidad con la reivindicación 128, caracterizado porque el anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera como se describe en SEQ ID NO: 69 y una secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada como se describe en SEQ ID NO: 23.
142. El método de conformidad con la reivindicación 141, caracterizado porque el anticuerpo es Ab7.
143. El método de conformidad con la reivindicación 128, caracterizado porque el anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera como se describe en SEQ ID NO: 70 y una secuencia de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada como se describe en SEQ ID NO: 24.
144. El método de conformidad con la reivindicación 143, caracterizado porque el anticuerpo es Ab8.
145. El método de conformidad con la reivindicación 127, caracterizado porque la proteina de unión al antigeno inhibe la unión de CD27 a CD27L.
146. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 127-145, caracterizado porque el trastorno autoinmunitario o inflamatorio es lupus eritematoso sistémico (SLE) , diabetes miellitus insulina-dependiente (IDDM), enfermedad inflamatoria intestinal (IBD), esclerosis múltiple ( S), psoriasis, tiroidit'is autoinmunitario, artritis reumatoide (RA), o glomerulonefri.tis .
147. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 127-145, caracterizado porque el tratamiento inhibe o previene el rechazo de trasplantes en el paciente.
148. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 127-145, caracterizado porque el tratamiento inhibe o previene la enfermedad injerto contra huésped (GVHD) .
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