RU2546249C2 - Композиция для усиления экспрессии трансгена в эукариотических клетках и способ увеличения продукции целевого белка, кодируемого трансгеном - Google Patents

Композиция для усиления экспрессии трансгена в эукариотических клетках и способ увеличения продукции целевого белка, кодируемого трансгеном Download PDF

Info

Publication number
RU2546249C2
RU2546249C2 RU2013136874/10A RU2013136874A RU2546249C2 RU 2546249 C2 RU2546249 C2 RU 2546249C2 RU 2013136874/10 A RU2013136874/10 A RU 2013136874/10A RU 2013136874 A RU2013136874 A RU 2013136874A RU 2546249 C2 RU2546249 C2 RU 2546249C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
cells
composition according
agonist
receptors
receptor
Prior art date
Application number
RU2013136874/10A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2013136874A (ru
Inventor
Равшан Иноятович Атауллаханов
Рустам Равшанович Атауллаханов
Александр Владиславович Багаев
Александр Леонидович Гинцбург
Денис Юрьевич Логунов
Борис Савельевич Народицкий
Алексей Васильевич Пичугин
Елена Сергеевна Седова
Ирина Леонидовна Тутыхина
Амир Ильдарович Тухватулин
Рахим Мусаевич Хаитов
Максим Михайлович Шмаров
Original Assignee
Силезиа Груп Пте. Лтд.
Рустам Равшанович Атауллаханов
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Силезиа Груп Пте. Лтд., Рустам Равшанович Атауллаханов filed Critical Силезиа Груп Пте. Лтд.
Priority to RU2013136874/10A priority Critical patent/RU2546249C2/ru
Priority to EP13890992.4A priority patent/EP3030660A4/en
Priority to PCT/RU2013/000997 priority patent/WO2015020559A1/en
Publication of RU2013136874A publication Critical patent/RU2013136874A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2546249C2 publication Critical patent/RU2546249C2/ru
Priority to US15/018,459 priority patent/US20160201067A1/en

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
    • A61K31/4738—Quinolines; Isoquinolines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A61K31/4745—Quinolines; Isoquinolines ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems condensed with ring systems having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. phenantrolines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7028—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • A61K31/739—Lipopolysaccharides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/164—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/525—Tumour necrosis factor [TNF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/03—Phosphoric monoester hydrolases (3.1.3)
    • C12Y301/03001—Alkaline phosphatase (3.1.3.1)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Изобретение относится к области биохимии, в частности к композициям для интенсивной продукции целевого белка в эукариотических клетках, включающим ДНК-вектор со вставкой гена целевого белка и агонист клеточных рецепторов. Также изобретение относится к способам увеличения продукции целевого белка, кодируемого трансгеном, в эукариотических клетках с использованием вышеуказанных композиций. Изобретение позволяет эффективно увеличивать продукцию целевого белка в эукариотических клетках. 4 н. и 24 з.п. ф-лы, 4 ил., 7 табл., 10 пр.

Description

Область, к которой относится изобретение
Изобретение относится к областям биотехнологии и медицины, в частности к производству ДНК-векторов со вставкой гена целевого белка, производству рекомбинантных белков в культурах эукариотических клеток, наработке модифицированных клеток для клеточной терапии, клеточной и генной терапии у человека и животных.
Описание предшествующего уровня техники
ДНК-векторы используют в различных областях биологии для доставки в клетки и экспрессии чужеродного генетического материала. Их применяют в качестве молекулярно-биологических инструментов как в исследованиях in vitro, например, для изучения функций каких-либо генов, так и in vivo для переноса генетической информации в клетки организма с целью терапии или вакцинации. Отдельной областью использования ДНК-векторов является модификация с их помощью клеток, которые затем используются как продуценты целевого белка или средства для генной терапии.
Во всех описанных выше случаях использования ДНК-векторов их важной характеристикой является уровень экспрессии целевого гена. Поэтому особой задачей при разработке систем на основе ДНК-векторов является увеличение уровня экспрессии доставляемого в клетки трансгена. От этого зависит уровень продукции трансгена при генетической терапии или уровень иммунной реакции при генетической иммунизации. Кроме того, повышение уровня экспрессии трансгена может позволить снизить дозу вектора, вводимого in vitro или in vivo.
Для повышения уровня экспрессии целевого гена используют два основных подхода. Первый подход заключается во включении в состав экспрессионной кассеты ДНК-векторов различных регуляторных элементов: промоторов, сигналов полиаденилирования, интронов, экзонов, 5'- и 3'-нетранслируемых элементов, таких как PARS, IRES, WPRE [Dorokhov Y.L., Skulachev M.V., Ivanov P.A., Zvereva S.D., Tjulkina L.G., Merits A., Gleba Y.Y., Hohn T., Atabekov J.G. Polypurine (A)-rich sequences promote cross-kingdom conservation of internal ribosome entry // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2002, v.99, p.5301-5306. Lee Y.B., Glover C.P., Cosgrave A.S., Bienemann A., Uney J.B. Optimizing regulatable gene expression using adenoviral vectors. // Exp Physiol., 2005 Jan; 90(1):33-37. Li Z.L., Tian P.X., Xue W.J., Wu J. Co-expression of sCD40Llg and CTLA4lg mediated by adenovirus prolonged mouse skin allograft survival. - J Zhejiang Univ Sci B, 2006 Jun; 7(6):436-44. US 20080241883 A1 Recombinant expression vector elements (rEVEs) for enhancing expression of recombinant proteins in host cells. WO 2008000445 Expression vector(s) for enhanced expression of a protein of interest in eukaryotic or procariotic host cells].
Второй подход - воздействие на клетки, в которые введен ДНК-вектор, внешними молекулярными агентами, такими, например, как бутират натрия и трихостатин А [Siavoshian S., J-P Segain, M. Kornprobst, C. Bonnet, C. Cherbut, J-P. Galmiche, H.M. Blottierea. Butyrate and trichostatin A effects on the proliferation/differentiation of human intestinal epithelial cells: induction of cyclin D3 and p21 expression. // Gut, 2000; 46:507-514].
Репликативно дефектные ДНК-векторы, например, рекомбинантные псевдовирусные частицы не способны размножаться [US 6019978 Replication-defective adenovirus human type 5 recombinant as a vaccine carrier], поэтому результативность экспрессии целевого трансгена зависит от способности вирусных частиц трансдуцировать клетки и от эффективности дальнейшей наработки целевого белка.
Повышения эффективности in vivo достигают повышением дозы вводимых вирусов [Tutykhina I.L., Sedova E.S., Gribova I.Y., Ivanova T.I., Vasilev L.A., Rutovskaya M.V., Lysenko A.A., Shmarov M.M., Logunov D.Y., Naroditsky B.S., Tillib S.V., Gintsburg A.L. Passive immunization with a recombinant adenovirus expressing an HA (H5)-specific single-domain antibody protects mice from lethal influenza infection. // Antiviral Res., 2013 Mar; 97(3):318-28] или повышением качества вводимых вирусных частиц [RU 2443779 Способ получения препарата рекомбинантного аденовируса, характеризующегося сниженным коэффициентом соотношения физических и инфекционных вирусных частиц, и генно-терапевтический лекарственный препарат, полученный таким способом].
Известно изобретение [US 20080311095 Methods and compositions for increased transgene expression], в котором предложен метод повышения экспрессии трансгена в Т-клетках человека путем их предварительной активации in vitro с помощью антител к CD3/CD28. Это изобретение было выбрано нами в качестве прототипа. Очевидны следующие существенные недостатки прототипа: (1) данное изобретение пригодно только для активации Т-клеток и не может быть применено для активации других типов клеток, потому что рецептор CD3 синтезируется исключительно Т-клетками; (2) предложенный в прототипе тип активации Т-клеток можно проводить только в условиях in vitro; (3) по предлагаемой в прототипе методике активации с помощью антител к CD3/CD28 все Т-клетки будут активно размножаться (поликлональная активация). Такие поликлонально активированные in vitro Т-клетки нельзя вводить в организм животных или человека, поскольку это приведет к тяжелым аутоиммунным, системным воспалительным, лимфопролиферативным процессам и полному нарушению нормальных функций иммунной системы с очень высоким риском смертельного исхода.
Задачей данного изобретения была разработка композиции для усиления экспрессии трансгена в эукариотических клетках и способа увеличения продукции целевого белка, кодируемого трансгеном, а также обеспечение возможности применения композиции и способа как в культуре клеток in vitro, так и in vivo в живом организме, не вызывая опасных явлений для его здоровья и жизни.
Поставленная задача решается за счет того, что создана композиция для интенсивной продукции целевого белка в эукариотических клетках, включающая ДНК-вектор со вставкой гена целевого белка и агонист клеточных рецепторов из класса рецепторов PRR - pattern recognition receptors, выбранный из следующих агонистов: агонистов рецепторов TLR2, или агонистов рецепторов TLR4, или агонистов рецепторов TLR5, или агонистов рецепторов TLR7, или агонистов рецепторов TLR8, или агонистов рецепторов TLR9, или агонистов NOD1- рецепторов, или агонистов NOD2-рецепторов, взятые в оптимальных соотношениях. При этом в качестве агониста рецептора TLR2 используют липотейхоевую кислоту, либо в качестве агониста рецептора TLR2 используют липопептид. В качестве агониста рецептора TLR4 используют бактериальный липополисахарид, либо в качестве агониста рецептора TLR4 используют кислый пептидогликан с молекулярной массой 1200-40000 КД. В качестве агониста рецепторов TLR5 используют флагеллин. В качестве агониста рецептора TLR7 используют имиквомод, либо в качестве агониста рецептора TLR7 используют препарат CL097, являющийся производным имидазохинолина. В качестве агониста рецептора TLR8 используют имиквомод, либо в качестве агониста рецептора TLR8 используют препарат CL097, являющийся производным имидазохинолина. В качестве агониста рецептора TLR9 используют олигонуклеотид CpG ODN 1826, либо в качестве агониста рецептора TLR9 используют олигонуклеотид CpG ODN 2006. В качестве агониста NOD1-рецепторов используют C12-iE-DAP - Lauroyl-g-D-Glu-D-mDAP и Lauroyl-g-D-Glu-L-mDAP - синтетические фрагменты бактериального пептидогликана. В качестве агониста рецепторов NOD2-используют L18-MDP - производное мурамилдипептида, а именно фрагмента бактериального пептидогликана. В качестве агониста рецепторов PRR может быть использован фармацевтический препарат в эффективной дозе. В качестве агониста рецепторов PRR используют фармацевтический препарат «Иммуномакс» - Р N001919/02. В качестве агониста рецепторов PRR может быть также использован фармацевтический препарат «Пирогенал» - Р N003478/0. В качестве агониста рецепторов PRR может быть также использован фармацевтический препарат «Ликопид» - ЛС-001438. В качестве ДНК-вектора используют нереплицирующиеся рекомбинантные аденовирусные наночастицы на основе аденовируса человека 5 серотипа. ДНК-вектор используют со вставкой целевого гена, кодирующего секреторный белок, либо используют ДНК-вектор со вставкой целевого гена, кодирующего цитоплазматический белок. Либо используют ДНК-вектор со вставкой целевого гена, кодирующего мембранный белок.
В способе увеличения продукции целевого белка, кодируемого трансгеном, в эукариотических клетках при их трансдуцировании ДНК-векторами использована заявленная композиция. При этом усиление продукции целевого белка достигается в условиях культуры эукариотических клеток in vitro. Также усиление продукции целевого белка достигается в условиях организма in vivo. При этом эукариотические клетки получены из организма мыши, или эукариотические клетки получены из организма человека.
Также может быть использована композиция для интенсивной продукции целевого белка в эукариотических клетках, включающая ДНК-вектор со вставкой гена целевого белка и агонист клеточных рецепторов из класса рецепторов цитокинов, в оптимальном соотношении. В этом случае в качестве агониста рецепторов цитокинов используется фактор некроза опухоли. Используется способ увеличения продукции целевого белка в эукариотических клетках при их трансдуцировании ДНК-векторами с использованием вышеуказанной композиции.
Таким образом, технический результат - повышение производства целевого трансгенного белка был достигнут путем использования агонистов PRR-рецепторов (от англ. pattern-recognition receptors), а также рецепторов цитокинов.
Отличительной особенностью изобретения является использование агонистов PRR-рецепторов из классов TLR- и NOD-рецепторов, а также цитокиновых рецепторов (рецептор фактора некроза опухоли, ФНО).
Предлагаемое изобретение дает следующие преимущества: (1) эффект достигается как в условиях in vitro, так и in vivo; (2) эффект достигается в любых типах клеток, которые могут экспрессировать ДНК-вектор и которые несут функционально активные PRR-рецепторы; (3) предложенный нами метод усиления экспрессии трансгена не приводит ни к поликлональной пролиферации, ни к каким-либо другим патологическим эффектам, опасным для животных и человека, и для усиления экспрессии трансгена по предложенному нами методу могут быть использованы фармацевтические препараты агонисты PRR-рецепторов.
Сущность изобретения
Данное изобретение предлагает композицию для усиления экспрессии трансгена в эукариотических клетках и способ увеличения продукции целевого белка, кодируемого трансгеном.
Задача, решаемая данным изобретением, состоит в значительном усилении экспрессии целевого трансгена и продукции целевого белка в эукариотических клетках как в условиях культуры клеток in vitro, так и в условиях организма человека и животных.
Известно, что транскрипция генов и продукция белков в эукариотических клетках могут значительно изменяться под влиянием внешних сигналов, которые можно отнести к нескольким принципиальным типам:
а) контакт эукариотической клетки с возбудителями инфекций или компонентами возбудителей инфекций, которые в научной литературе принято именовать PAMP (pathogen associated molecular patterns);
б) контакт эукариотической клетки с поврежденными клетками или их компонентами, которые в научной литературе принято именовать DAMP (damage-associated molecular patterns);
в) цитокины и сигналы опасности (danger signals), представляющие собой химические регуляторные сигналы для коммуникации клеток между собой;
г) контактные взаимодействия эукариотических клеток друг с другом;
д) контакт клетки с полимерами межклеточного матрикса.
В данном изобретении задача усиления экспрессии трансгена и продукции целевого белка решается путем активации трансдуцированных клеток с помощью РАМР, DAMP, действующих на клетки через PRR-рецепторы, или с помощью цитокинов, действующих на клетки через рецепторы цитокинов, или путем имитации таких воздействий с помощью веществ-агонистов, действующих на эукариотические клетки через PRR-рецепторы или рецепторы цитокинов.
В данном изобретении для усиления экспрессии трансгена и продукции целевого белка в эукариотической клетке, которую трансдуцируют ДНК-вектором со вставкой трансгена, используют вещества, активирующие клеточный метаболизм через PRR-рецепторы или через рецепторы цитокинов. Результатом предложенного в данном изобретении сочетания ДНК-векторов с указанными типами активаторов клеточного метаболизма является усиленная в 2-10 раз продукция целевых белков, относящихся к цитоплазматическим, мембранным или секреторным белкам.
В данном описании изобретения доказывается, что в эукариотической клетке, которую трансдуцируют ДНК-вектором со вставкой трансгена, происходит усиление экспрессии трансгена и продукции целевого белка с помощью активаторов, действующих через PRR-рецепторы или рецепторы цитокинов, что одинаково эффективно реализуется на эукариотических клетках in vitro и in vivo, то есть в условиях организма.
Эффект усиления наблюдается как на клетках животных (мышь), так и человека. Усиление наблюдается в тех типах клеток, которые способны трансдуцироваться и экспрессировать данный ДНК-вектор и несут функционально активные PRR-рецепторы.
Предложенные в данном изобретении усилители экспрессии трансгена могут использоваться и в условиях in vivo, что было продемонстрировано на лабораторных животных, также показано, что в качестве агонистов PRR-рецепторов могут быть использованы фармацевтические препараты.
Перечень фигур
Фиг.1А - Ответ клеток HEK-Blue-TLR4 продукцией репортерного белка SEAP, подтверждающий, что кислый пептидогликан активирует NF-kB через рецепторы TLR-4.
Активность NF-кВ измеряли по экспрессии NF-kB-зависимого репортерного гена SEAP в клетках HEK-Blue, не имеющих рецепторов TLR (null), и в клетках, экспрессирующих один из следующих рецепторов TLR 2, 3, 4, 5, 7, 8, или 9. Клетки инкубировали в течение 18 часов в присутствии КПГ - кислого пептидогликана (5 мкг/мл, ■) или без него (негативный контроль, □). В качестве позитивного контроля для каждого типа клеток использовали стандартный агонист (
Figure 00000001
): ФНО-α (10 нг/мл) для null-клеток, липопептид (1 мкг/мл) для TLR2-клеток, поли I:С (10 мкг/мл) для TLR3-клеток, ЛПС (1 мкг/мл) для TLR4-клеток, флагеллин (1 мкг/мл) для TLR5-клеток, имиквимод (1 мкг/мл) для TLR7-клеток, CL097 (1 мкг/мл) для TLR8-клеток и ODN 2007 (10 мкг/мл) для TLR9-клеток.
Результаты даны в виде кратности повышения продукции NF-kB-зависимого репортерного белка SEAP по отношению к контрольным клеткам (без активатора). Представлены средние значения, полученные в трех независимых экспериментах. Вывод - кислый пептидогликан (КПГ, патент RU №2195308) активирует NF-kB через рецепторы TLR4.
Фиг.1В - Зависимость продукции NF-kB-зависимого репортерного белка SEAP клетками HEK-Blue-TLR4 от концентрации кислого пептидогликана.
КПГ индуцирует экспрессию NF-kB-зависимого репортерного гена (SEAP) в клетках HEK-Blue-TLR4. Клетки инкубировали в присутствии указанных концентраций КПГ в течение 18 часов. Интактные клетки HEK-Blue-TLR4, а также клетки HEK-Blue-TLR-null были использованы в качестве негативного контроля. Результаты даны в виде кратности повышения продукции NF-kB-зависимого репортерного белка SEAP по отношению к контрольным клеткам (без активатора). Представлены средние значения, полученные в трех независимых экспериментах.
Фиг.2 (A, B, C, D, E, F, G, H) - Идентификация клеточного рецептора лекарственного препарата «Иммуномакс» (Р N001919/02).
Клетки коллекции НЕК Blue TLR (InvivoGen), экспрессирующие один из TLR-рецепторов (TLR2, 3, 4, 5, 7, 8, или 9), или не имеющие TLR-рецепторов (null), были использованы для идентификации рецептора лекарственного препарата «Иммуномакс» (Р N001919/02). Представлены результаты исследования:
(A) - на клетках TLR-null;
(B) - на клетках с рецепторами TLR2 и корецепторами CD14;
(C) - на клетках с рецепторами TLR3;
(D) - на клетках с рецепторами TLR4 и корецепторами CD14, и MD2;
(E) - на клетках с рецепторами TLR5;
(F) - на клетках с рецепторами TLR7;
(G) - на клетках с рецепторами TLR8;
(H) - на клетках с рецепторами TLR9.
Клетки указанных линий инкубировали в полной культуральной среде in vitro в течение 18 часов при 37°C и 5% CO2 в присутствии препарата «Иммуномакс» (от 0,02 до 15 мкг/мл) или без него.
В качестве позитивного контроля для каждого типа клеток использовали стандартный агонист: ФНО-α (10 нг/мл) для null-клеток (2 A), липопептид (1 мкг/мл) для TLR2-клеток (2 B), поли I:С (10 мкг/мл) для TLR-клеток (2 C), ЛПС (1 мкг/мл) для TLR4-клеток (2 D), флагеллин (1 мкг/мл) для TLR5-клеток (2 E), имиквимод (1 мкг/мл) для TLR7-клеток (2 F), CL097 (1 мкг/мл) для TLR8-клеток (2 G) и ODN 2007 (10 мкг/мл) для TLR9-клеток (2 H). Активацию TLR-рецепторов (ФНОα-рецепторов в случае контрольных клеток TLR-null) оценивали по активации продукции репортерного белка SEAP, ген которого находится под NF-kB-зависимым промотором во всех использованных типах клеток. Результаты даны в виде кратности повышения продукции NF-kB-зависимого репортерного белка SEAP по отношению к контрольным клеткам (без активатора). Представлены средние значения, полученные в трех независимых экспериментах.
Фиг.3 - Анализ методами конфокальной микроскопии и проточной цитометрии усиления экспрессии трансгена Ad-GFP в перитонеальных макрофагах под влиянием агонистов PRR-рецепторов.
A - перитонеальные макрофаги трансдуцировали Ad-GFP (2×107 БОЕ/мл) в отсутствии (фото слева) или в присутствии агониста TLR4 (КПГ, 10 мкг/мл, фото справа).
B и C - последовательные стадии цитометрического выделения популяции живых макрофагов по светорассеянию и окрашиванию DAPI специфическим красителем ДНК.
D и E - анализ интенсивности GFP-флуоресценции перитонеальных макрофагов, трансдуцированных Ad-GFP (2×107 БОЕ/мл) в отсутствие (D) или в присутствии (E) агониста TLR7/8-рецепторов CL097 (2,5 мкг/мл).
Культуры клеток инкубировали при 37°C и 5% CO2 в течение 4 дней. По окончании инкубации клетки смывали холодным раствором Версена и с помощью проточного цитометра FACS Aria II определяли процент и абсолютное количество клеток, имеющих зеленую флуоресценцию, а также интенсивность флуоресценции клеток. Абсолютное содержание клеток нормировали по калибровочным шарикам с известной концентрацией (CountBright Invitrogen).
Фиг.4 - Повышение экспрессии целевого цитоплазматического белка GFP в перитонеальных макрофагах in vitro с помощью фармацевтических агонистов PRR-рецепторов.
Перитонеальные макрофаги мыши трансдуцировали Ad-GFP (2×105 БОЕ) без дополнительной активации (контроль) или при активации клеток одним из фармацевтических агонистов PRR-рецепторов, в частности лекарственными препаратами «Иммуномакс» (Рег. №Р N001919/02-171011) или «Пирогенал» (Р N003478/0), или «Ликопид» (ЛС-001438). Клетки инкубировали в полной культуральной среде 37°C и 5% CO2 в течение 2 суток. По окончании инкубации клетки смывали холодным раствором Версена и с помощью проточного цитометра FACS Aria II определяли количество макрофагов, имеющих зеленую флуоресценцию (A), и среднюю интенсивность флуоресценции (B). Интегральную флуоресценцию макрофагов (C) вычисляли как произведение числа флуоресцирующих клеток на среднюю интенсивность флуоресценции клеток. Данные нормированы на значения в контроле (Ad-GFP без дополнительной активации клеток).
Раскрытие изобретения
Задача, решаемая данным изобретением, состоит в значительном усилении экспрессии целевого трансгена и продукции целевого белка в эукариотических клетках как в условиях культуры клеток in vitro, так и в условиях организма человека и животных.
В качестве ДНК-векторов в данном изобретении использовали нереплицирующиеся рекомбинантные аденовирусные наночастицы (НРАН), кодирующие цитоплазматические, мембранные или секретируемые белки. ДНК-вектор экспрессировали в культурах следующих эукариотических клеток: первичные клетки селезенки, костного мозга, перитонеальной полости мышей, клетки костного мозга мыши, дифференцированные в культуре in vitro в присутствии гранулоцитарного-макрофагального колониестимулирующего фактора GM-CSF, фракция мононуклеарных клеток из крови человека. Анализ экспрессии трансгена зависел от использованного вектора. При использовании НРАН со вставкой гена зеленого флуоресцентного белка (Ad-GFP) анализ экспрессии проводили методами флуоресцентной и конфокальной микроскопии, а также проточной цитофлуориметрии. При использовании НРАН со вставкой генов гемагглютинина вирусов гриппа H1N1 (Ad-HA1), H3N2 (Ad-НА3) и В (Ad-HA-B) продукцию целевого белка анализировали методом цитофлуориметрии после окрашивания клеток моноклональным антителом, специфично связывающимся с белком НА. Экспрессию НРАН со вставкой гена секреторной эмбриональной щелочной фосфатазы (Ad-SEAP) определяли по секреции целевого белка SEAP, концентрацию которого измеряли колориметрическим методом по ферментативной активности SEAP.
Усиления экспрессии добивались с помощью агонистов PRR-рецепторов. Современные представления о PRR-рецепторах сводятся к наличию в клетках человека и животных нескольких семейств РАМР- и DAMP-распознающих рецепторов, позволяющих клеткам не только детектировать и реагировать на контакт практически с любым микроорганизмом или его компонентами, но также узнавать о повреждении собственных тканей организма и адекватно реагировать на эти повреждения.
К PRR-рецепторам относятся TLR (toll-like receptors), NLR (NOD-like receptors), RLR (RIG-like receptors) и некоторые другие семейства рецепторов [Mikayla R. Thompson, John J. Kaminski, Evelyn A. Kurt-Jones, and Katherine A. Fitzgerald. Pattern Recognition Receptors and the Innate Immune Response to Viral Infection. // Viruses, 2011 June; 3(6): 920-940. Takeuchi O, Akira S. Pattern recognition receptors and inflammation. // Cell, 2010 Mar 19; 140(6):805-20]. Детально описаны внутриклеточные сигнальные пути, начинающиеся с активации PRR-рецепторов и завершающиеся активацией NF-kB, AP-1, IRF и других транскрипционных факторов, которые управляют экспрессией определенных групп генов и последующей продукцией кодируемых этими генами белков.
В представленных ниже примерах 4, 5, 6, 7, 8, 9 и 10 продемонстрировано, что повышение экспрессии целевого трансгена достигается при воздействии на широкий спектр PRR-рецепторов из класса TLR рецепторов, выбранных из списка: TLR2, TLR4, TLR5, TLR7, TLR8 и TLR9, а также из класса NLR, в частности, NOD1- и NOD2-рецепторов.
Усиления экспрессии целевого белка GFP добивались с помощью следующих естественных агонистов PRR-рецепторов или их синтетических аналогов:
лигандов TLR2 - липотейхоиевой кислоты (ЛТК) и липопептида (Lipopeptide, Lot A11, ЕМС microcollections, GMBH);
лигандов TLR4 - липополисахарида (ЛПС) из E. coli серотип 055: В5 (Sigma L-2880) и кислого пептидогликана с молекулярной массой 1200-40000 КД (КПГ, патент РФ №2195308);
лиганда TLR5 - флагеллина (Invivogen);
лигандов TLR7 и TLR8 - имиквимода и CL097 (производное имидазохинолина, Invivogen);
лигандов TLR9 - CpG-олигонуклеотидов ODN 1826 и ODN 2006 (Invivogen).
В примере 4 продемонстрировано, что повышение экспрессии целевого трансгена достигается при воздействии через класс NOD-рецепторов с помощью:
лиганда NOD1-рецептора C12-iE-DAP (Lauroyl-g-D-Glu-D-mDAP и Lauroyl-g-D-Glu-L-mDAP, являющиеся синтетическими фрагментами бактериального пептидогликана, Invivogen) и
лиганда NOD2-рецептора L18-MDP (производное мурапилдипептида, являющегося синтетическим фрагментом бактериального пептидогликана, Invivogen).
Отличительной особенностью данного изобретения является возможность использования эффекта усиления продукции целевого трансгена in vivo и, что особенно ценно, при использовании фармацевтических агонистов PRR-рецепторов.
В приведенном примере 10 продемонстрировано усиление экспрессии целевого белка с помощью фармацевтических агонистов рецепторов:
TLR4, в частности, лекарственного препарата «Иммуномакс» (Рег. №Р N001919/02-171011, Иммафарма, Россия) и лекарственного препарата «Пирогенал» (Р N003478/0, Медгамал, филиал ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН, Россия), а также агониста рецепторов NOD2 лекарственного препарата «Ликопид» (ЛС-001438, ЗАО ПЕПТЕК, Россия).
Наличие положительного эффекта по усилению экспрессии целевого белка не только при использовании агонистов PRR-рецепторов, но и при использовании цитокинов было продемонстрировано на примере ФНО-α (пример 6).
В примерах 6, 7, 8 продемонстрировано повышение экспрессии секреторного белка, для чего использовали ДНК-вектор со вставкой гена SEAP.
В примере 9 продемонстрировано повышение экспрессии целевых мембранных белков, для чего использовали ДНК-векторы со вставкой гена гемагглютинина вирусов гриппа Н1М1, H3N1, или B.
Реализация изобретения была продемонстрирована на клетках мыши (примеры 4, 5, 6, 7, 8 и 10) и человека (пример 9). В примере 8 продемонстрировано усиление экспрессии трансгена и продукции целевого белка в условиях живого организма, в частности у лабораторных мышей, что не ограничивает распространения изобретения у других животных и человека.
Далее приведены примеры, раскрывающие наиболее предпочтительные воплощения данного изобретения с целью лучшего пояснения его сущности.
Примеры реализации изобретения
Пример 1. Создание плазмидных конструкций, кодирующих цитоплазматический, секретируемый или мембранный белок.
В качестве ДНК-вектора используют НРАН на основе аденовируса человека 5-го серотипа.
Для получения НРАН на первом этапе создают плазмидные конструкции, несущие экспрессирующие кассеты, содержащие нуклеотидные последовательности, которые кодируют цитоплазматический белок GFP, секретируемый белок SEAP, мембранные белки HA1, HA3 или HA-B. Таким образом, получают плазмидные конструкции pShuttle-CMV-GFP, pShuttle-CMV-SEAP, pShuttle-CMV-HAI, pShuttle-CMV-HA3, pShuttle-CMV-HA-B.
Для получения плазмидных конструкций pShuttle-CMV-GFP, pShuttle-CMV-SEAP, pShuttle-CMV-HAI, pShuttle-CMV-НА3, pShuttle-CMV-HA-В в качестве вектора используют плазмидную конструкцию pShuttle-CMV с участками генома аденовируса человека 5-го серотипа для получения нереплецирующихся рекомбинантных аденовирусных наночастиц, входящую в набор к системе «AdEasy Adenoviral vector system» («Stratagene» Cat. No 240009). Плазмидную конструкцию pShuttle-CMV гидролизуют по сайту для эндонуклеазы рестрикции EcoRV, а затем осуществляют вставку нуклеотидных последовательностей, которые кодируют белок GFP, SEAP, HA1, HA3 или НА-B, соответственно, получают конструкции pShuttle-CMV-GFP, pShuttle-CMV-SEAP, pShuttle-CMV-HAI, pShuttle-CMV-НА3 или pShuttle-CMV-HA-B. Нуклеотидные последовательности цитоплазматического белка GFP, секретируемого белка SEAP, мембранных белков HA1, HA3 и HA-B для вставки в pShuttle-CMV получают путем гидролиза соответствующих плазмидных конструкций pGREEN (США, Carolina Biological Supply Company), pAL-SEAP, pAL-HA1, pAL-НА3 и pAL-HA-B (химический синтез, Россия, Евроген) по сайтам для эндонуклеазы рестрикции Ase I (pGREEN), EcoRV (pAL-SEAP, pAL-HA1, pAL-НА3 и pAL-HA-B). Наличие генов белков GFP, SEAP, HA1, HA3, НА-B в составе соответствующих плазмидных конструкций pShuttle-CMV-GFP, pShuttle-CMV-SEAP, pShuttle-CMV-HAI, pShuttle-CMV-НА3, pShuttle-CMV-HA-B подтверждают рестрикционным анализом при использовании эндонуклеазы EcoRI, NotI и EcoRV и методом ПЦР.
Таким образом, получают плазмидные конструкции pShuttle-CMV-GFP, pShuttle-CMV-SEAP, pShuttle-CMV-HAI, pShuttle-CMV-НА3, pShuttle-CMV-HA-B, несущие экспрессирующие кассеты, содержащие нуклеотидные последовательности, которые кодируют цитоплазматический белок GFP, секретируемый белок SEAP, мембранные белки HA1, HA3 или НА-B, которые в дальнейшем используют для получения НРАН.
Пример 2. Получение и тестирование нереплицирующихся рекомбинантных аденовирусных наночастиц со вставками генов целевых белков GFP, SEAP, HA1, HA3 или НА-B.
Получение нереплицирующихся рекомбинантных аденовирусных наночастиц Ad-GFP, Ad-SEAP, Ad-HA1, Ad-НА3 и Ad-HA-В, несущих экспрессирующие кассеты, содержащие нуклеотидные последовательности, которые кодируют цитоплазматический белок GFP, секретируемый белок SEAP, мембранные белки НА1, НА3 или НА-В, соответственно, проводят согласно методике «AdEasy Adenoviral vector system» (Stratagene, Cat. No 240009), в основе которой лежит гомологичная рекомбинация участков генома аденовируса в клетках E. coli. Наличие генов GFP, SEAP, HA1, HA3 и НА-B в составе соответствующих НРАН подтверждают методом ПЦР. Далее определяют титры НРАН Ad-GFP, Ad-SEAP, Ad-HA1, Ad-НА3 и Ad-HA-B методом бляшко-образования на культуре клеток НЕК293 (клетки эмбриональной почки человека) [Graham F.L., Prevec L. Manipulation of adenovirus vectors. // Methods in Mol. Biol., 1991, v.7, p.109-127].
Экспрессию полученных ДНК-векторов и продукцию соответствующих целевых белков проверяли в культуре клеток линии А549. Экспрессию цитоплазматического целевого белка GFP определяли с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа (ICM-405, Leitz) и с помощью метода проточной цитофлуориметрии на приборе FACS Aria II (BD Biosceinces).
Экспрессию секреторного целевого белка SEAP определяли по методу Berger (Berger J., Hauber J., Hauber R., Geiger R., Cullen B.R. Secreted placental alkaline phosphatase: a powerful new quantitative indicator of gene expression in eukaryotic cells. // Gene, 1988 Jun 15; 66 (1):1-10) с незначительными модификациями. Аликвоту тестируемой жидкости осветляли центрифугированием 14000 g в течение 2 мин, прогревали при 65°C в течение 5 мин для ингибирования эндогенных фосфатаз, вносили 20 мкл в лунки 96-луночного планшета в 130 мкл реакционного буфера (0,5 М NaHCO3, 0,5 мМ MgCl2, pH 9,8) и инкубировали при 37°C 10 мин. Затем добавляли 50 мкл 60 мкМ пара-нитрофенил фосфата в реакционном буфере и через фиксированные интервалы времени измеряли оптическую плотность на длине волны 405 нм. Активность SEAP выражали в мЕд/мл из расчета, что 1 мЕд/мл соответствует увеличению оптической плотности 0,04 ед. в 1 минуту.
Экспрессию мембранных целевых белков HA1, HA3 и НА-B определяли с помощью окрашивания клеток моноклональными антителами к HA1, HA3 и НА-B, соответственно, с последующим анализом методом проточной цитофлуориметрии на приборе FACS Aria II (BD Biosceinces).
Таким образом были получены ДНК-векторы - НРАН (Ad-GFP, Ad-SEAP, Ad-HA1, Ad-НА3 и Ad-HA-B), несущие экспрессирующие кассеты, содержащие нуклеотидные последовательности, которые кодируют цитоплазматический белок GFP, секретируемый белок SEAP, мембранные белки HA1, HA3 или НА-B, соответственно, а также подтверждена экспрессия соответствующих белков.
Пример 3. Кислый пептидогликан с молекулярной массой 1200-40000 КД (по патенту РФ №2195308) и фармацевтический препарат «Иммуномакс» (Р N001919/02) являются агонистами TLR4.
Для идентификации рецепторов, с которыми взаимодействуют кислый пептидогликан (патент РФ №2195308) и фармацевтический препарат «Иммуномакс» (Р N001919/02), использовали коллекцию клеточных линий HEK-Blue (InvivoGen), стабильно экспрессирующих один из следующих TLR-рецепторов человека: TLR2, TLR4, TLR5, TLR7, TLR8 или TLR9. Все клеточные линии HEK-Blue имеют индуцибельный репортерный ген SEAP, находящийся под контролем NF-kB-зависимого промотора. Сигнал от TLR-рецептора в этих клеточных линиях приводит к секреции репортерного белка SEAP во внеклеточную среду. Исследование, проведенное с клетками HEK-Blue, экспрессирующими различные TLR, показало, что КПГ (патент РФ №2195308) и фармацевтический препарат «Иммуномакс» являются агонистами рецепторов TLR4. Оба эффектора активировали NF-kB-зависимую продукцию репортерного белка SEAP исключительно в клетках, экспрессирующих рецепторы TLR4 (фиг.1А, фиг.2). Активация TLR4-NF-/CB сигнального пути прямо зависела от концентрации агониста (фиг.1В, фиг.2).
Представленные данные доказывают, что КПГ (патент РФ №2195308) и фармацевтический препарат «Иммуномакс» (Р N001919/02) являются агонистами TLR4.
Пример 4. Повышение экспрессии целевого цитоплазматического белка GFP в перитонеальных макрофагах мыши in vitro с помощью агонистов PRR-рецепторов из классов TLR- и NOD-рецепторов.
Перитонеальные макрофаги мыши (BALB/c самки, питомник «Столбовая») вымывали с помощью физиологического раствора, осаждали центрифугированием 1200 об/мин - 10 мин, суспензировали в концентрации 1 млн клеток в 1 мл полной культуральной среды (ПС, состоит из RMPI-1640 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 mM L-глютамина, 50 мкМ β-меркаптоэтанола и 10 мкг/мл гентамицина), инкубировали ночь в чашках Петри диаметром 90 мм при 37°C и 5% CO2. На следующий день не прилипшие клетки смывали теплым фосфатным буферным раствором (PBS, pH 7,4), прилипшие макрофаги заливали раствором Версена, выдерживали 60 мин в холодильнике при 4°С, а затем смывали струей раствора Версена из 5 мл пипетки. Макрофаги осаждали центрифугированием 1200 об/мин - 10 мин, суспензировали в ПС и инкубировали в лунках 96-луночного планшета в концентрации 0,1 млн/мл в объеме 200 мкл на лунку в триплетах с добавлением 2×107 БОЕ/мл Ad-GFP (полученных как в примере 2) в сочетании с агонистами TLR и NOD рецепторов или без них (контроль). Планшеты с клетками инкубировали в течение 4 дней при 37°C и 5% CO2. В таблице 1 представлены использованные в работе агонисты рецепторов TLR и NOD с указанием их конечной концентрации in vitro.
Таблица 1
Использованные агонисты рецепторов PRR
Рецептор Агонист (лиганд) Конечная концентрация
TLR2 Липотейхоевая кислота (Invivogen) 10 м кг/мл
TLR2 Липопептид (ЕМС microcollections, GMBH) 1 мкг/мл
TLR4 Липополисахарид E. coli (Invivogen) 10 мкг/мл
TLR4 КПГ (РФ №2195308) 10 мкг/мл
TLR5 Флагеллин (Invivogen) 1 мкг/мл
TLR7/8 Имиквимод (Invivogen) 10 мкг/мл
TLR7/8 CL097 (Invivogen) 2.5 мкг/мл
TLR9 ODN 1826 (Invivogen) 0,6 мкг/мл
TLR9 ODN 2006 (Invivogen) 10 мкг/мл
NOD1 C12-iE-DAP (Invivogen) 20 мкг/мл
NOD2 L18-MDP (Invivogen) 20 мкг/мл
На фиг.3А приведена фотография макрофагов, полученная при конфокальной микроскопии клеток, трандуцированных Ad-GFP с дополнительной активацией агонистом TLR4 (10 мкг/мл КПГ, правая фотография), в сравнении с контрольными макрофагами, трансдуцированными Ad-GFP без добавления КПГ (левая фотография). Отчетливо видно усиление интенсивности флуоресценции в клетках, дополнительно стимулированных КПГ, что свидетельствует об усилении синтеза целевого белка GFP. Для количественного анализа продукции GFP использовали метод проточной цитометрии, который позволяет определить как абсолютное число клеток, содержащих флуоресцирующий белок GFP, так и содержание флуоресцирующего белка в каждой клетке по интенсивности флуоресценции отдельной клетки. Произведение числа светящихся клеток на интенсивность флуоресценции каждой клетки пропорционально количеству синтезированных молекул GFP.
Как описано выше, перитонеальные макрофаги трансдуцировали Ad-GFP (2×107 БОЕ/мл) в отсутствие или в присутствии одного из указанных агонистов PRR-рецепторов. Культуры клеток инкубировали при 37°C и 5% CO2 в течение 4 дней. По окончании инкубации клетки смывали холодным раствором Версена и с помощью проточного цитометра FACS Aria II определяли процент и абсолютное количество клеток, имеющих зеленую флуоресценцию, а также интенсивность флуоресции клеток. Абсолютное содержание клеток нормировали по калибровочным шарикам с известной концентрацией (CountBright Invitrogen), живые и мертвые клетки разделяли с помощью ДНК-специфического красителя DAPI. На фиг.3B и фиг.3C показаны стадии цитометрического выделения живых клеток и макрофагов. Представлены характерные гистограммы сигнала флуоресценции GFP после трансдукции макрофагов Ad-GFP без дополнительной активации клеток - фиг.3D или с использованием дополнительной активации клеток CL097, агонистом рецепторов TLR7 и TLR8 - фиг.3E.
Количественную оценку усиления экспрессии целевого белка GFP проводили по формуле:
K = M F I × N / M F I c o n t r × r - N c o n t r , ( 1 )
Figure 00000002
где:
K - кратность усиления экспрессии GFP;
MFI - средняя интенсивность флуоресценции трансдуцированных Ad-GFP клеток при их дополнительной активации агонистом;
MFIcontr - средняя интенсивность флуоресценции трансдуцированных Ad-GFP клеток в контроле без дополнительной активации;
N - число флуоресцирующих клеток после трансдукции Ad-GFP с дополнительной активацией агонистом;
Ncontr - число флуоресцирующих клеток в контроле после трансдукции Ad-GFP без дополнительной активации.
Данные, представленные в таблице 2, показывают, что усиление экспрессии GFP в перитонеальных макрофагах, трансдуцированных Ad-GFP, происходило под влиянием агонистов различных PRR-рецепторов, выбранных из классов TLR- и NOD-рецепторов, в частности, агонистов TLR2 (липопептид, липотейхойевая кислота), TLR4 (КПГ, липополисахарид), TLR5 (флагеллин), TLR7/8 (CL097, имиквимод), TLR9 (CpG 2006, ODN 1826), NOD-1 (C12-iE-DAP) nNOD-2(L18-MDP).
Таблица 2
Усиление экспрессии GFP в перитонеальных макрофагах мыши, трансдуцированных Ad-GFP (2×107 БОЕ/мл) и активированных указанным агонистом рецепторов PRR
PRR-рецептор Агонист Кратность усиления экспрессии GFP, по формуле (1) Достоверность отличия
Среднее значение Стандартное отклонение
TLR2 Липопептид, 10 м кг/мл 7.5 1.3 <0.05
TLR2 Липопептид, 1 м кг/мл 16.6 3.2 <0.05
TLR2 ЛТК, 10 м кг/мл 2.10 0.12 <0.05
TLR4 КПГ, 1.5 мкг/мл 10.5 2.2 <0.05
TLR4 ЛПС, 10 мкг/мл 1.96 0.08 <0.05
TLR5 Флагеллин, 1 мкг/мл 2.13 0.18 <0.05
TLR7/8 CL097, 2.5 ug/ml 14.2 1.6 0.05
TLR7/8 Имиквимод, 10 мкг/мл, 2.03 0.25 0.05
TLR9 CpG 2006, 10 мкг/мл 3.1 0.6 0.05
TLR9 ODN 1826, 0,6 мкг/мл 1.43 0.19 0.05
NOD1 C12-iE-DAP, 20 мкг/мл 3.1 1.3 0.05
NOD2 L18-MDP, 2 мкг/мл 3.7 1.2 0.05
Пример 5. Повышение экспрессии целевого цитоплазматического белка GFP in vitro в дендритных клетках мыши костномозгового происхождения с помощью агониста TLR4.
Клетки костного мозга мыши (BALB/c самки, питомник «Столбовая») вымывали из бедренных и большеберцовых костей с помощью физиологического раствора, эритроциты лизировали с помощью гипотонического шока (15 секунд в дистиллированной воде), осмотичность мгновенно восстанавливали, внося необходимое количество 10-кратного раствора Хэнкса, клетки осаждали центрифугированием 1200 об/мин - 10 мин, суспензировали в ПС в концентрации 1 млн/мл и инкубировали в чашках Петри диаметром 90 мм в присутствии 20 нг/мл ростового фактора GM-CSF. Через 3-4 суток культуральную среду заменяли на свежую ПС, дополненную GM-CSF. Через 7 дней смывали неприлипшие клетки, суспензировали их в ПС и инкубировали в лунках 96-луночного планшета в концентрации 0,1 млн/мл в объеме 200 мкл на лунку в триплетах с добавлением 2×107 БОЕ/мл Ad-GFP, полученных как в примере 2, в сочетании с добавлением 5 мкг/мл КПГ (RU №2195308) или без него. Через 2 суток после внесения Ad-GFP клетки смывали холодным раствором Версена и определяли процент флуоресцирующих клеток с помощью проточного цитометра FACS Aria II. Результаты представлены в таблице 3. Экспрессия целевого белка GFP в костномозговых дендритных клетках усиливалась в 5 раз при их активации КПГ (RU №2195308).
Таблица 3
Усиление экспрессии трансгена в костномозговых дендритных клетках в результате их активации агонистом TLR4 (КПГ, патент РФ №2195308)
Трансдукция Процент дендритных клеток, экспрессирующих GFP
Среднее значение Стандартное отклонение Достоверность отличия
Ad-GFP 2×107 БОЕ/мл 3 0,5 -
Ad-GFP 2×107 БОЕ/мл + КПГ (RU №2195308), 5 мкг/мл 15 1 0,05
Коэффициент усиления 5 - -
Пример 6. Повышение экспрессии целевого секреторного белка эмбриональной щелочной фосфатазы в перитонеальных макрофагах мыши in vitro с помощью цитокина ФНО-α.
Перитонеальные макрофаги мыши получали и инкубировали, как описано в примере 4. Клетки инкубировали в триплетах с добавлением Ad-SEAP в концентрации 2×107 БОЕ на лунку вместе с ФНО-α (10 нг/мл) или КПГ (RU №2195308, 10 мкг/мл). В контрольные лунки вносили Ad-SEAP (2×107 БОЕ) без добавления активаторов. Через 4 суток в культуральной жидкости измеряли активность секретируемой щелочной фосфатазы SEAP, как описано в примере 2. В присутствии ФНО-α экспрессия секреторного целевого белка SEAP усиливалась в 1,8 раза (таблица 4).
Таблица 4
Усиление экспрессии трансгена секреторного белка SEAP в перитонеальных макрофагах в результате их активации агонистом TLR4 или цитокином ФНОα
Трансдукция Активность (мЕд/мл) секретируемой щелочной фосфатазы SEAP в культуральной жидкости
Среднее значение Стандартное отклонение Достоверность отличия
Ad-SEAP (2×107 БОЕ на лунку) 0,34 0,06 -
Ad-SEAP 2×107 БОЕ на лунку + ФНО-α (10 нг/мл) 0,62 0,12 <0,05
Ad-SEAP (2×107 БОЕ на лунку) + КПГ(RU №2195308, 10 мкг/мл) 0,82 0,03 <0,05
Коэффициент усиления для ФНО-α 1,8 - -
Коэффициент усиления для КПГ (RU №2195308) 2,4 - -
Пример 7. Повышение экспрессии целевого секретируемого белка SEAP in vitro в дендритных клетках мыши костномозгового происхождения с помощью агониста TLR4.
Дендритные клетки мыши костномозгового происхождения получали, как описано в примере 5. Суспензию дендритных клеток в ПС инкубировали в лунках 96-луночного планшета в концентрации 0,1 млн/мл в объеме 200 мкл на лунку в триплетах с добавлением 2×107 БОЕ Ad-SEAP, полученных, как в примере 2, в сочетании с КПГ (RU №2195308, 5 мкг/мл) или без него. Через 6 суток в культуральной среде измеряли активность секретируемой фосфатазы SEAP, как описано в примере 2. При активации дендритных клеток агонистом TLR4 (КПГ, Патент РФ №2195308) экспрессия SEAP усиливалась в 6 раз (таблица 5).
Таблица 5
Повышение экспрессии трансгена секреторного белка SEAP в дендритных клетках in vitro с помощью агониста TLR4
Трансдукция Активность SEAP в культуральной среде (мЕд/мл)
Среднее значение Стандартное отклонение Достоверность отличия
Ad-SEAP (2×107 БОЕ) 0,48 0,07 -
Ad-SEAP (2×107 БОЕ) + КПГ (патент РФ №2195308, 5 мкг/мл) 3,0 0,3 <0,05
Коэффициент усиления 6 - -
Пример 8. Повышение экспрессии трансгена секреторного белка SEAP в организме лабораторных мышей in vivo с помощью фармацевтического агониста TLR4 («Иммуномакс»).
Ad-SEAP получали, как в примере 2, вводили в дозе 108 БОЕ на мышь в 200 мкл физиологического раствора в перитонеальную полость мышам BALB/c (самки, 14-16 граммов, питомник РАМН «Столбовая») вместе с 10 мкг лекарственного препарата «Иммуномакс» (Иммафарма, Россия) или без него. Через 3 суток индивидуально у каждой мыши забирали кровь из ретроорбитального синуса, получали сыворотку крови, в которой определяли активность SEAP, как описано в примере 2. Введение «Иммуномакса» усиливало экспрессию SEAP в 7 раз (таблица 6). При этом не было отмечено каких-либо нежелательных (токсических) явлений у животных, получавших лекарственный препарат «Иммуномакс» в сочетании с Ad-SEAP. Этот результат доказывает возможность усиления экспрессии трансгена у животных и человека с помощью фармацевтического агониста рецепторов TLR4 лекарственного препарата «Иммуномакс».
Таблица 6
Повышение экспрессии трансгена SEAP в организме лабораторных мышей с помощью однократной инъекции фармацевтического агониста TLR4 («Иммуномакс»)
Трансдукция in vivo Активность SEAP в сыворотке крови мЕд/мл
Среднее значение Стандартное отклонение Достоверность отличия
Ad-SEAP (108 БОЕ на мышь) 4,35 4,69 -
Ad-SEAP (108 БОЕ на мышь) + Иммуномакс 10 мкг на мышь 30,42 12,47 0,02
Коэффициент усиления 7 - -
Пример 9. Повышение экспрессии трансгенов целевых мембранных белков HA1, HA3 и НА-B в культуре клеток человека in vitro с помощью агониста TLR4.
Кровь из локтевой вены здоровых доноров забирали в пробирки с KsEDTA BD Vacutainer и выделяли мононуклеарную фракцию, для этого кровь разводили в 2 раза физиологическим раствором и наслаивали на фиколл с плотностью 1,077 г/л (ПанЭко, Россия), центрифугировали 25 мин при 400 g при температуре 20°C. Фракцию, содержащую мононуклеарные клетки, собирали в 15 мл пробирку, клетки отмывали в растворе PBS (с добавлением 0,5% БСА, 1% глюкозы, 10 мМ HEPES, pH 7,4). Клетки суспензировали в концентрации 3 млн в 1 мл ПС, разливали по 0,5 мл в лунки 24-луночного планшета Nunclon в дуплетах. Затем в культуры вносили один из векторов Ad-HA1, Ad-НА3 или Ad-HA-B (по 5×106 БОЕ) вместе с 5 мкг/мл КПГ (RU №2195308) или без него. Планшет инкубировали 2 суток при 37°C в атмосфере 5% CO2. Через 2 суток клетки из лунок собирали раствором Версена, переносили в 15 мл пробирки и осаждали центрифугированием. Клеточный осадок окрашивали с помощью моноклональных антител против гемагглютинитов HA1, HA3 или НА-B (SinoBiological) в течение 20 мин, отмывали раствором PBS (с добавлением 0,5% BSA, 0,01% азида натрия, 0,35 мМ ЭДТА, 10 мМ HEPES, pH 7,4). Связавшиеся с НА антитела выявляли с помощью меченых FITC Fab-фрагментов антител к мышиным IgG. Клетки отмывали раствором PBS (с добавлением 0,5% BSA, 0,01% азида натрия, 0,35 мМ ЭДТА, 10 мМ HEPES, рН 7,4), моноциты окрашивали с помощью антител CD14 PE-Cy7 (BD Biosceinces). На проточном цитофлуориметре FACS Aria II определяли процент клеток, экспрессирующих НА, в популяции CD14-позитивных клеток. При активации клеток КПГ (RU №2195308) экспрессия мембранных целевых белков HA1, HA3 и НА-B усиливалась в 1,75-4,1 раза (таблица 7).
Таблица 7
Усиление экспрессии HA1, HA3 и НА-B при активации TLR-агонистом мононуклеарных клеток крови человека, трансдуцированных векторами Ad-HA1, Ad-НА3 или Ad-HA-B
Трансдукция Коэффициент увеличения процента моноцитов, экспрессирующих НА*
Среднее значение Стандартное отклонение Достоверность отличия
Ad-HA1 (5×106 БОЕ) + КПГ (RU №2195308), 5 мкг/мл 1,75 0,26 0,05
Ad-HA3 (5×106 БОЕ) + КПГ (RU №2195308), 5 мкг/мл 3,2 0,12 0,05
Ad-HA-B (5×106 БОЕ) + КПГ (RU №2195308), 5 мкг/мл 4,1 1,04 0,05
* Примечание: данные нормированы на процент клеток, экспрессирующих соответствующий НА в контрольных культурах клеток без добавления КПГ.
Пример 10. Повышение экспрессии трансгена целевого цитоплазматического белка GFP в перитонеальных макрофагах мыши in vitro с помощью фармацевтических агонистов PRR из классов TLR- и NOD-рецепторов.
Перитонеальные макрофаги мыши получали и инкубировали, как описано в примере 4. Клетки инкубировали в триплетах, трансдуцировали вектором Ad-GFP в концентрации 5×106 БОЕ/мл. Для активации макрофагов в культуры клеток вносили фармацевтические агонисты рецепторов TLR4, в частности лекарственный препарат «Иммуномакс» (Рег. №Р N001919/02-171011, Иммафарма, Россия) или лекарственный препарат «Пирогенал» (Р N003478/0, Медгамал, филиал ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН, Россия), или фармацевтический агонист NOD-рецепторов - лекарственный препарат «Ликопид» (ЛС-001438, ЗАО ПЕПТЕК, Россия). Контролем служили культуры трансдуцированных макрофагов без добавления активаторов. Через 2 суток оценивали экспрессию целевого белка GFP, как описано в примере 4. На рисунке 4 представлены результаты экспериментов. Они доказывают, что все использованные нами лекарственные препараты - фармацевтические агонисты PRR - вызывают значительное усиление экспрессии целевого трансгена. При стимуляции клеток фармацевтическими агонистами PRR продукция целевого белка усиливалась от 2 до 11 раз. Эффект усиления зависел от дозы агониста. Этот результат означает, что усиление экспрессии трансгена можно осуществлять у человека с помощью лекарственных (фармацевтических) препаратов, активирующих трансдуцированные клетки через рецепторы PRR.
Все перечисленные примеры подтверждают, что поставленная техническая задача, а именно разработка композиции для усиления экспрессии трансгена в эукариотических клетках и способа увеличения продукции целевого белка, кодируемого трансгеном, а также обеспечение возможности применения композиции и способа как в культуре клеток in vitro, так и in vivo в живом организме - реализована в данном изобретении.
Список сокращений
PRR (от англ. pattern recognition receptors) - клеточные рецепторы для распознавания молекулярных образов, ассоциированных с микробами, вирусами, клеточным стрессом и повреждением.
TLR (от англ. Toll-like receptors) - Toll-подобные клеточные рецепторы, относящиеся к PRR
NOD-рецепторы (от англ. nucleotide-binding oligomerization domain-containing receptors) - клеточные рецепторы, относящиеся к PRR.
NLR (от англ. NOD-like receptors) - рецепторы, подобные NOD, относятся к PRR
RLR (от англ. RIG-like receptors) - рецепторы, подобные RIG, относятся к PRR
РАМР (от англ. pathogen associated molecular patterns) - молекулярные образы, ассоциированные с микробами и вирусами
DAMP (от англ. damage-associated molecular patterns) - молекулярные образы, ассоциированные с повреждением
НРАН - нереплицирующиеся рекомбинантные аденовирусные наночастицы
GM-CSF - гранулоцитарный-моноцитарный колониестимулирующий фактор
GFP - зеленый флуоресцентный белок
Ad - НРАН на основе аденовируса 5 типа
Ad-GFP - НРАН со вставкой гена GFP
НА1 - гемагглютинин вируса гриппа H1N1
НА3 - гемагглютинин вируса гриппа H3N2
НА-В - гемагглютинин вируса гриппа B
Ad-HA1 - НРАН со вставкой гена HA1
Ad-НА3-НРАН со вставкой гена HA3
Ad-HA-B - НРАН со вставкой гена НА-B
SEAP - секреторная эмбриональная щелочная фосфатаза
Ad-SEAP - НРАН со вставкой гена SEAP
ЛТК - липотейхоиевая кислота, компонента бактериальной стенки
ЛПС - липополисахарид, компонента бактериальной стенки
КПГ - кислый пептидогликан
CL097 - производное имидазохинолина
ODN - олигонуклеотид
C12-iE-DAP - Lauroyl-g-D-Glu-D-mDAP и Lauroyl-g-D-Glu-L-mDAP, синтетические фрагменты бактериального пептидогликана
L18-MDP - производное мурамилдипептида
ПЦР - полимеразная цепная реакция
ПС - полная среда для культивирования клеток
PBS - фосфатный буферный раствор
БОЕ - бляшко-образующие единицы
ФНО - фактор некроза опухоли
БСА - бычий сывороточный альбумин
FITC - изотиоцианат флуоресцеина
ЭДТА - этилендиамин тетраацетат
FACS - проточный цитофлуориметр
Литература
1. Dorokhov Y.L., Skulachev M.V., Ivanov P.A., Zvereva S.D., Tjulkina L.G., Merits A., Gleba Y.Y., Hohn T., Atabekov J.G. Polypurine (A)-rich sequences promote cross-kingdom conservation of internal ribosome entry // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2002, v.99, p.5301-5306.
2. Lee Y.B., Glover C.P., Cosgrave A.S., Bienemann A., Uney J.B. Optimizing regulatable gene expression using adenoviral vectors. // Exp Physiol., 2005 Jan; 90(1):33-37.
3. Li Z.L., Tian P.X., Xue W.J., Wu J. Co-expression of sCD40Llg and CTLA4lg mediated by adenovirus prolonged mouse skin allograft survival. - J Zhejiang Univ Sci B, 2006 Jun; 7(6):436-44.
4. US 20080241883 A1 Recombinant expression vector elements (rEVEs) for enhancing expression of recombinant proteins in host cells.
5. WO 2008000445 Expression vector(s) for enhanced expression of a protein of interest in eukaryotic or procariotic host cells.
6. Siavoshian S., J-P. Segain, M. Kornprobst, C. Bonnet, C. Cherbut, J-P. Galmiche, H.M. Blottierea. Butyrate and trichostatin A effects on the proliferation/differentiation of human intestinal epithelial cells: induction of cyclin D3 and p21 expression. // Gut, 2000; 46:507-514.
7. RU 2443779 Способ получения препарата рекомбинантного аденовируса, характеризующегося сниженным коэффициентом соотношения физических и инфекционных вирусных частиц, и генно-терапевтический лекарственный препарат, полученный таким способом.
8. US 20080311095 Methods and compositions for increased transgene expression (прототип).
9. Mikayla R. Thompson, John J. Kaminski, Evelyn A. Kurt-Jones, and Katherine A. Fitzgerald. Pattern Recognition Receptors and the Innate Immune Response to Viral Infection. // Viruses, 2011 June; 3(6):920-940.
10. Takeuchi O., Akira S. Pattern recognition receptors and inflammation. // Cell, 2010 Mar 19; 140(6):805-20.
11. Graham F.L., Prevec L. Manipulation of adenovirus vectors. // Methods in Mol. Biol., 1991, v.7, p.109-127.
12. Berger J., Hauber J., Hauber R., Geiger R., Cullen B.R. Secreted placental alkaline phosphatase: a powerful new quantitative indicator of gene expression in eukaryotic cells. // Gene, 1988 Jun 15; 66(1):1-10.
13. US 6019978 Replication-defective adenovirus human type 5 recombinant as a vaccine carrier.

Claims (28)

1. Композиция для интенсивной продукции целевого белка в эукариотических клетках, включающая ДНК-вектор, а именно нереплицирующиеся рекомбинантные аденовирусные наночастицы на основе аденовируса человека 5-го серотипа (НПАН) со вставкой гена целевого белка и агонист клеточных рецепторов из класса рецепторов PRR - pattern recognition receptors, выбранный из следующих агонистов: агонистов рецепторов TLR2, или агонистов рецепторов TLR4, или агонистов рецепторов TLR5, или агонистов рецепторов TLR7, или агонистов рецепторов TLR8, или агонистов рецепторов TLR9, или агонистов NOD1-рецепторов, или агонистов NOD2-рецепторов, взятые в оптимальных соотношениях.
2. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что в качестве агониста рецептора TLR2 используют липотейхоевую кислоту.
3. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что в качестве агониста рецептора TLR2 используют липопептид.
4. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что в качестве агониста рецептора TLR4 используют бактериальный липополисахарид.
5. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что в качестве агониста рецептора TLR4 используют кислый пептидогликан с молекулярной массой 1200-40000 КД.
6. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что в качестве агониста рецепторов TLR5 используют флагеллин.
7. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что в качестве агониста рецептора TLR7 используют имиквомод.
8. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что в качестве агониста рецептора TLR8 используют имиквомод.
9. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что в качестве агониста рецептора TLR7 используют препарат CL097, являющийся производным имидазохинолина.
10. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что в качестве агониста рецептора TLR8 используют препарат CL097, являющийся производным имидазохинолина.
11. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что в качестве агониста рецептора TLR9 используют олигонуклеотид CpGODN 1826.
12. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что в качестве агониста рецептора TLR9 используют олигонуклеотид CpGODN 2006.
13. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что в качестве агониста NOD1-рецепторов используют C12-iE-DAP-Lauroyl-g-D-Glu-D-mDAP и Lauroyl-g-D-Glu-L-mDAP синтетические фрагменты бактериального пептидогликана.
14. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что в качестве агониста рецепторов NOD2-используют L18-MDP-производное мурамилдипептида, а именно фрагмента бактериального пептидогликана.
15. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что в качестве агониста рецепторов PRR используют фармацевтический препарат в эффективной дозе.
16. Композиция по п. 15, отличающаяся тем, что в качестве агониста рецепторов PRR используют фармацевтический агонист TLR-4 рецептора - Ρ N001919/02.
17. Композиция по п. 15, отличающаяся тем, что в качестве агониста рецепторов PRR используют фармацевтический агонист TLR-4 рецептора - ΡN003478/0.
18. Композиция по п. 15, отличающаяся тем, что в качестве агониста рецепторов PRR используют фармацевтический агонист NOD2 рецептора - ЛС-001438.
19. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что используют ДНК-вектор со вставкой целевого гена, кодирующего секреторный белок.
20. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что используют ДНК-вектор со вставкой целевого гена, кодирующего цитоплазматический белок.
21. Композиция по п. 1, отличающаяся тем, что используют ДНК-вектор со вставкой целевого гена, кодирующего мембранный белок.
22. Способ увеличения продукции целевого белка, кодируемого трансгеном, в эукариотических клетках при их трансдуцировании ДНК-векторами, а именно нереплицирующимися рекомбинантными аденовирусными наночастицами на основе аденовируса человека 5-го серотипа (НПАН) с использованием композиции по п. 1.
23. Способ по п. 22, отличающийся тем, что усиление продукции целевого белка достигается в условиях культуры эукариотических клеток in vitro.
24. Способ по п. 22, отличающийся тем, что усиление продукции целевого белка достигается в условиях организма in vivo.
25. Способ по п. 22, отличающийся тем, что эукариотические клетки получены из организма мыши.
26. Способ по п. 22, отличающийся тем, что эукариотические клетки получены из организма человека.
27. Композиция для интенсивной продукции целевого белка в эукариотических клетках, включающая ДНК-вектор, а именно нереплицирующимися рекомбинантными аденовирусными наночастицами на основе аденовируса человека 5-го серотипа (НПАН) со вставкой гена целевого белка и агонист клеточных рецепторов из класса рецепторов цитокинов, а именно фактор некроза опухоли в оптимальном соотношении.
28. Способ увеличения продукции целевого белка в эукариотических клетках при их трансдуцировании ДНК-векторами, а именно нереплицирующимися рекомбинантными аденовирусными наночастицами на основе аденовируса человека 5-го серотипа (НПАН) с использованием композиций по п. 27.
RU2013136874/10A 2013-08-07 2013-08-07 Композиция для усиления экспрессии трансгена в эукариотических клетках и способ увеличения продукции целевого белка, кодируемого трансгеном RU2546249C2 (ru)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2013136874/10A RU2546249C2 (ru) 2013-08-07 2013-08-07 Композиция для усиления экспрессии трансгена в эукариотических клетках и способ увеличения продукции целевого белка, кодируемого трансгеном
EP13890992.4A EP3030660A4 (en) 2013-08-07 2013-11-08 Composition for enhancing transgene expression in eukaryotic cells and method for enhancing production of a target protein encoded by a transgene
PCT/RU2013/000997 WO2015020559A1 (en) 2013-08-07 2013-11-08 Composition for enhancing transgene expression in eukaryotic cells and method for enhancing production of a target protein encoded by a transgene
US15/018,459 US20160201067A1 (en) 2013-08-07 2016-02-08 Composition for Enhancing Transgene Expression in Eukaryotic Cells and Method for Enhancing Production of a Target Protein Encoded by a Transgene

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2013136874/10A RU2546249C2 (ru) 2013-08-07 2013-08-07 Композиция для усиления экспрессии трансгена в эукариотических клетках и способ увеличения продукции целевого белка, кодируемого трансгеном

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2013136874A RU2013136874A (ru) 2015-02-20
RU2546249C2 true RU2546249C2 (ru) 2015-04-10

Family

ID=52461748

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2013136874/10A RU2546249C2 (ru) 2013-08-07 2013-08-07 Композиция для усиления экспрессии трансгена в эукариотических клетках и способ увеличения продукции целевого белка, кодируемого трансгеном

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20160201067A1 (ru)
EP (1) EP3030660A4 (ru)
RU (1) RU2546249C2 (ru)
WO (1) WO2015020559A1 (ru)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109868277A (zh) * 2019-03-13 2019-06-11 浙江海洋大学 曼氏无针乌贼Toll样受体基因及其免疫防御功能
WO2023056202A2 (en) * 2021-09-22 2023-04-06 Hdt Bio Corp. Compositions and methods for enhanced protein production
WO2024108216A1 (en) * 2022-11-18 2024-05-23 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions comprising octadecaneuropeptides (odn) and synthetic derivatives thereof and methods of use for modulation of food intake, obesity, body weight, nausea, and emesis

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6019978A (en) 1995-06-05 2000-02-01 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Replication-defective adenovirus human type 5 recombinant as a vaccine carrier
RU2195308C1 (ru) 2001-11-16 2002-12-27 Атауллаханов Равшан Иноятович Способ получения вещества, обладающего иммуностимулирующей, противовирусной и антибактериальной активностью, вещество, полученое этим способом, и фармацевтическая композиция на его основе
EP1873251A1 (en) * 2006-06-29 2008-01-02 Chemotherapeutisches Forschungsinstitut Georg-Speyer-Haus Expression vector(s) for enhanced expression of a protein of interest in eukaryotic or prokaryotic host cells
JP5432117B2 (ja) 2007-03-30 2014-03-05 アッヴィ・インコーポレイテッド 宿主細胞中の組換えタンパク質の発現を増進するための組換え発現ベクター要素（ｒＥＶＥ）
EP2155873B1 (en) 2007-05-23 2016-11-09 Sangamo BioSciences, Inc. Methods and compositions for increased transgene expression
JP2011521985A (ja) * 2008-06-03 2011-07-28 オカイロス アーゲー Ｈｃｖ感染の予防および治療のためのワクチン
RU2443779C2 (ru) 2009-10-09 2012-02-27 Учреждение Российской академии наук Институт молекулярной генетики РАН (ИМГ РАН) Способ получения препарата рекомбинантного аденовируса, характеризующегося сниженным коэффициентом соотношения физических и инфекционных вирусных частиц, и генно-терапевтический лекарственный препарат, полученный таким способом
US20130129713A1 (en) * 2010-08-04 2013-05-23 Ieo - Istituto Europeo Di Oncologia S.R.L. Method of antigen loading for immunotherapy

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ТУХВАТУЛИН А. И. и др., Изучение способности лигандов рецептора NOD1 активировать транскрипционный фактор NF-KB в условиях in vitro и in vivo, ACTA NATURAE, 2011, Т.3 N 1(8), стр.82-90. ЩЕБЛЯКОВ Д.В. и др., Толл-подобные рецепторы (TLR) и их значение в опухолевой прогрессии, ACTA NATURAE, 2010, N 3, том 2, стр. 28-37. PETRICEVIC B. et al., Cl097, A Tlr7/8 Ligand, Inhibits Tlr-4-Dependent Activation of Irak-M and Bcl-3 Expression, Shock, 2009, Volume 32, Issue 5, pp. 484-490. VOLLMER J. et al., Oligodeoxynucleotides lacking CpG dinucleotides mediate Toll-like receptor 9 dependent T helper type 2 biased immune stimulation, Immunology, 2004, Vol. 113, pp. 212-223 *

Also Published As

Publication number Publication date
US20160201067A1 (en) 2016-07-14
RU2013136874A (ru) 2015-02-20
EP3030660A1 (en) 2016-06-15
EP3030660A4 (en) 2017-04-05
WO2015020559A1 (en) 2015-02-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11738072B2 (en) Tumor vaccine and uses thereof
Jiang et al. Oncolytic adenovirus and tumor-targeting immune modulatory therapy improve autologous cancer vaccination
BR112019023323A2 (pt) composições para facilitar a fusão de membrana e usos das mesmas
BR112020016570A2 (pt) Composições e métodos para liberação de proteína de membrana
CN111163758A (zh) 具有记忆功能的t细胞或b细胞的增强剂、恶性肿瘤复发抑制剂、以及对t细胞或b细胞诱导记忆功能的诱导剂
CN107075480A (zh) γδT细胞及其用途
ES2884727T3 (es) Plaquetas transfectadas por material genético exógeno y micropartículas plaquetarias obtenidas por dichas plaquetas transfectadas, procedimiento de preparación y usos de las mismas
US11345926B2 (en) Transposon system, kit comprising the same, and uses thereof
CN102099472A (zh) 使基因表达靶向于神经胶质瘤的核酸分子和方法
RU2546249C2 (ru) Композиция для усиления экспрессии трансгена в эукариотических клетках и способ увеличения продукции целевого белка, кодируемого трансгеном
US11466289B2 (en) NF-KB signaling pathway-manipulated dendritic cells
EA012520B1 (ru) Способ получения цитотоксических лимфоцитов
JP2017520582A (ja) 関節リウマチ治療のための間葉系間質細胞
CN103182089A (zh) 用表达自杀基因的间充质干细胞进行细胞介导癌症基因治疗
WO2020125576A1 (zh) 一种在细胞中递送基因的方法
CN103820483B (zh) 表达α-gal表位的卵巢癌干细胞疫苗及其制备方法
CN104434973A (zh) 一种强化细胞因子诱导的杀伤细胞功能的方法
EP3999080B1 (en) P21 expressing monocytes for cancer cell therapy
Schröder Effects of circulating exosomes on B cells in head and neck squamous cell carcinoma
EP4183872A1 (en) Immunotherapy method of targeted chemokine and cytokine delivery by mesenchymal stem cell
Steinbach Analysis of the influence of influenza virus infection on tumour progression and CD8+ T cell immunity
US20220387568A1 (en) Asc specks in cancer immunotherapy
RU2631792C2 (ru) Способ получения зрелых антиген-активированных дендритных клеток с трансфекцией РНК опухолевых клеток рака молочной железы
Sukegawa et al. Mesenchymal stem cell origin contributes to the antitumor effect of oncolytic virus carriers
CN117534767A (zh) 靶向cldn6嵌合抗原受体巨噬细胞及其制备方法和应用