JPH06502990A

JPH06502990A - 初期プロモーターを用いた組換えバキュロウイルスベクター

Info

Publication number: JPH06502990A
Application number: JP3516282A
Authority: JP
Inventors: ガリノ，リンダ　エー．; ジャービス，ドナルド　エル．
Original assignee: ザ、テキサス、エー、エンド、エム、ユニバーシティ、システム
Priority date: 1990-09-17
Filing date: 1991-09-17
Publication date: 1994-04-07
Anticipated expiration: 2017-09-03
Also published as: AU650682B2; EP0549700A1; WO1992005265A1; CA2091887A1; JP3320716B2; AU8655091A; US5162222A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】初期ブロモ−吉川いた組換えバキュロウィルスベクタ一本発明は、組換えバキュロウィルスもしくは安定形質転換された生細胞系を生成するのに有用な組換えＤＮＡベクターに関する。

バキュロウィルス発現ベクター（ＢＥＶｓ）は、基礎研究及び、ヒト臨床適用のための蛋白質合成並びに生物医薬品に応用できる、外来遺伝子の発現にとって非常に重要なものである（　Ｗ、Ｄｏｅｒｆ　ｌｅｒ著、Ｃｕｒｒ、　Ｔｏｐ。

Ｍｌｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｉｅｓｕｎｏ、、　１３１：５１８８（１９６ｇ）：　Ｖ、Ａ、Ｌｕｃｋｏｖ及びＭ、Ｄ、Ｓｕｇ＋ｍｅｒｓ著、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、　６：４７５５（１９８９ａ）：Ｌ、に、Ｍｉ　Ｉ　Ｉｅｒ著、Ａｎｎｕａｌ　Ｒｅｖｉｅｗ　ｏｒ　Ｍｉｃｒｏｂｌｏｌ、、　４２：１７７１９９　（１９８ｇ）；　Ｍ、Ｄ、Ｓｕｍｍｅｒｓ著、Ｃｕｒｒ、　Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　）ｌａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｎ、Ｙ、（１９８１１））　。Ｂ　Ｅ　Ｖ　ｓは、プロモータの後に、選択された外来遺伝子を非必須ウィルス遺伝子ポリヘトリン（以下、ｐｏ　ｌ　ｙｈｅｄ　ｒ　ｉ　ｎという場合がある）に代えて挿入したコード配列を有する、組換え虫ベクターである（ＳＩＩＩｉｔｈ及びＳｕＩＩｍｅｒｓに付与された米国特許第４，７４５，０５１号参照）。

バキュロウィルス遺伝子は、４期の異なるウィルス複製サイクルのうち１期以降のサイクル中に、一時的に調整されながら、次々に発現する（　Ｐ、Ｄ、Ｆｒ１ｅｓｅｎ及びり、に、Ｍｉ　ｌ　ｌｅｒ著、Ｃｕｒｒ、　Ｔｏｐ、　Ｍｉｃｒｏｂｔｏｌ、Ｉｔｓｕｎｏｌ、、１３１：３１４９（１９８Ｂ）；　Ｌ、Ａ、Ｃｕａｒｉｎｏ著、ＣＲＣＰｒｅｓｓ、　（１９８９）　［１ｎｐｒｅｓｓ’）。したがって、発現の過程で、異なるバキュロウィルス遺伝子は、ウィルス感染期に応じて、前初期（以下、１ｓｉｅｄｉａｔｅ−ｅａｒｌｙ期という場合がある）（α）、後初期（以下、ｄｅｌａｙｅｄ−ｅａｒｌｙ期という場合がある）（β ）、後期（以下、１ａｔｅ期という場合がある）（γ）、最後期（以下、Ｖｅｒｙ　１８１１３期という場合がある）（δ）に分類し得る。

これらの遺伝子の発現は、カスケード機構を有する思われる転写調整の結果、次々に起こる。こうして、ｉｔｗｅｄｉａｔｅ−ｅａｒｌｙ期遺伝子は、他ウィルスの影響を受けずに、感染俊速やかに発現し、１以上の遺伝子生成物が。

ｄｅｌａｙｅｄ−ｅａｒ＋ｙ期遺伝子の転写を誘発する。ｄｅｌａｙｅｄ−ｅａｒｌｙ期遺伝子生成物のうちいくつかが、交互に１ａｔｅ期遺伝子の転写を誘発し、最終的に、ｖｅｒｙ　１ａｔｅ期遺伝子が、それ以前に発現された１期以上の遺伝子生成物の制御下で発現する。このカスケード調整を行う物質としては、＾ｕｔｏｇｒａｐｈａ　ｃａ１１ｒｏｒｎｉｃａ核ｐｏｌｙｈｉｄｒｏｓｉｓウィルス（ＡｃＭＮＰＶ）の１ｍ５ｅｄｉａｔｅ−ｅａｒｌｙ期遺伝子である。ＩＥＩが比較的よく定義されている。ＩＥＩは、他ウィルスの影響を受けずに発現し、１ａｔｅ期遺伝子同様に（Ｌ、Ａ、Ｇｕａｒｉｎｏ及びＭ、Ｄ、Ｓｕｍｓｅｒｓ著、Ｖｉｒｏｌ、１Ｂ２：４４４４５１　（１９８８））、３９に遺伝子を含むｄｅｌａｙｅｄ−ｅａｒｌｙ期のいくつかの遺伝子の転写を誘発する物質をコードする（Ｌ。

Ａ、Ｃｕａｒｉｎｏ及びＭ、Ｄ、Ｓｕｍｍｅｒｓ著、ＪＪｊｒｏｌ、、５７：５８３５７１（９８６ａ）　；　Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、、６１：２０９１２０９９（１９８７））。しかしながら、１ｍｌ１ｅｄｉａｔｅ−ｅａｒｌｙ期遺伝子は、他ウィルスに依存せずに発現すると考えられている。

ｐｏｌｙｎｅｄｒｉｎ遺伝子は、Ｖｅｒｙｌａｔｅ期遺伝子に分類される。したがって、ｐｏｌｙｈｅｄｒｉｎプロモータからの転写には、それ以前の、未知の、多数の他ウィルス及び細胞遺伝子生成物の発現が必要であると思われる。このため、５ｓ１ｔｈ及び５ｕｔｓｅｒｓによる典型的なりＥＶ系（米国特許第４，７４５，０５１号）のような従来（７）　Ｂ　Ｅ　Ｖ　ｓ　ｊｉ、外来遺伝子を、他のウィルスゲノムの遺伝子発現の結果としてのみ、また、ウィルス感染が十分に進行した後にのみ、発現する。さらに、このベクターは、オフルージョン陽性となった後代を生成できないため、生きた虫における発現には不適である。

他のウィルスゲノムの遺伝子発現の結果としての外来遺伝子の発現を、従来の典型的なりＥＶ系へ応用するには、少なくとも２点の理由から明らかな限界がある。第一に、本質的に完全な組換えウィルスに感染すると、これによって宿主細胞が最終的には殺されてしまい、そのため、宿主細胞の外来蛋白質合成の“工場゛としての役割が失われてしまう。したがって、感染のｖｅｒｙ　１ａｔｅ期において組換えバキュロウィルスに感染した虫細胞内でのみ発現できる、バキュロウィルスの“Ｖｅｒｙｔａｔｅ期”プロモータ（ｐｏｌｙｈｅｄｒｉｎ及びｐｌＯ遺伝子）の制御下−では、外来遺伝子が発現しにくい。これは、これらの宿主細胞感染後４ないし５日で死に、上記ベクターによる発現は一時的なものとなってしまうことを示している。このように、従来のＢＥＶ系は細胞系での一過性遺伝子発現に限定される。

第二の限界は、宿主細胞へのバキュロウィルス感染の進行の結果、該細胞の新規合成蛋白質を処理する能力が低下することである（　Ｄ、Ｓｕｍ＠ｅｒｓ著、Ｍｏｌ　、Ｃｅｌ　Ｉ　、Ｂｉｏｌ　、　。

９：２１４２２３（１９８９））。感染細胞は、感染後−日経過後でさえも、ヒト組織プラスミノーゲンアクチベータの場合に見られるように、もはや外来糖蛋白質を効果的に処理することができなくなる。したがって、ｐｏｌｙｈｅｄｒｉｎプロモータからの遺伝子発現は、宿主細胞の新規合成蛋白質処理能が有意に低下した時点で起こる。

このように、細胞が糖蛋白質生成物を有効に処理できる能力を維持したまま、すなわち、継続的かつ永久的に、外来遺伝子生成物を発現する系の必要性が非常に高くなっている。以下に記載するのはこのような系であり、バキュロウィルス初期プロモータを用いた遺伝子発現のための改良された新規のベクターである。

本発明に記載された、新規改良プラスミドベクターは、形質転換された虫細胞もしくは組換えバキュロウィルスに適用し得る。本ベクターは非感染生細胞だけでなく感染生細胞のＩｍｍｅｄｉａｔｅ−ｅａｒｌｙ期中、及び自然体での虫類内での外来遺伝子を発現する。このように、本プラスミドベクターは、オフルージョン陽性化した後代を生成し得る組換えウィルス内での発現も可能にするため、生きた生白での発現に適している。本新規プラスミドベクターは、環境による不活性化に対しウィルスを安定させるのに必要な、機能的ｐｏ　ｌ　ｙｈｅｄ　ｒ　ｉｎ遺伝子を保持している。

これにより、組換えウィルスを、オフルージョン陽性化後代を生成するために上記プラスミドベクターとともに生成することも可能になる。これらの後代はｉｎ　ｖｉｖ。

の系において非常に感染しやすい。これは、オフルージョン陰性後代のみを生成する他の組換えバキュロウィルスと異なる点である。こうして、新規ベクターは、外来遺伝子をｊｎ　ｖｉｖｏの系で、感染の早い段階で発現させることができる。このような性質は、殺虫剤等の外来遺伝子生成物を虫の体内で発現させる際に、特に重要である。

加えて、これらの特徴から、特にベストコントロールのための環境適用等には、本ベクターの使用が理想的である。

本発明は、有効な殺虫剤を、環境に効果的に散布するのに、直接的に育苗である。本発明の新しい点のひとつは、初期バキュロウィルスの遺伝子発現を、殺虫剤の効果的な散布に適用する点である。虫は、１ａｔｅ期バキュロウィルスプロモータによって、ウィルスに感染し、３ないし５日で死に至る。この間、虫は作物を食べ続ける。

３ないし５日という短期間だけ、ウィルスに感染した虫は、作物を荒らし、農民を憂慮させる。こうして、初期バキュロウィルス遺伝子由来のプロモータによって直接制御される殺虫剤を使用することで、虫を殺し、もしくは少なくとも作物を食べ続けることができない状態にできる。虫は、ウィルス感染後数時間内に、死ぬかもしくはそれ以上作物摂取ができない状態となる。

さらに、バキュロウィルス発現ベクター系の宿主は、感染細胞であるため、所望の外来遺伝子を生成する間は安全であるという利点がある。

一般に、本発明は、所望の外来遺伝子を継続的かつ永久的に発現する転換非感染生細胞クローンもしくは、所望の外来遺伝子を一時的に発現する組換えバキュロウィルスの双方を生成する能力を有するベクターを開示している。後者の生成物は、本特異的なベクターを用いる特異的な方法に依存して、個々に産生される。

したがって、本新規特異ベクターは、（１）所望遺伝子を継続的かつ永久的に発現する形質転換虫細胞（非感染）、あるいは、（２）所望遺伝子を感染のｉｍｍｅｄｉａｔｅ−ｅａｒｌｙ期に、虫細胞内又は虫そのものの体ないで発現する組換えバキュロウィルスを生成するために使用されるものである。

所望遺伝子を形質転換非感染虫細胞に挿入することにより、安定形質転換された細胞クローンが産生され、ここで、所望遺伝子のＤＮＡがコードされ、虫宿主細胞のゲノム内で安定状聾で蓄積して、所望遺伝子の継続的かつ永久的発現をうながす。継続的に発現された生成物は、その後、細胞集合体の一部より、精製する。したがって、安定形質転換生細胞は、所望の遺伝子を継続的に発現する工場となる。“安定形質転換生細胞″及び、“宿主生細胞のゲノム内での安定蓄積”並びに“形質転換虫細胞“という表現は、すべて同じく、外来ＤＮＡの宿主細胞ゲノム内への安定蓄積、及びそれに続く本所望遺伝子の継続的かつ永久的発現を表現するものである。

継続的かつ永久的に所望の遺伝子を発現する、形質転換虫細胞クローン（非感染）を産生ずるプラスミドベクターの最適な実施例として、左から右方向に、以下の化合物が含まれる。

１、　選択可能マーカー遺伝子をコードするＤＮＡ領域（例えば、β−ガラクトシダーゼ遺伝子のＤＮＡコード）。本選択的マーカー遺伝子は、エレメント２の第１のプロモータ領域をコードするＤＮＡ領域及びその上流部に位置する；２、　バキュロウィルスｉｍｍｅｄｉａｔｅ−ｅａｒ１３’期遺伝子（例えばＩＥＮ）由来の第１のプロモータ領域を有するＤＮＡ領域。本プロモータ前方のマーカー遺伝子の発現を行うよう位置する；３、　他のバキュロウィルスｔｍａｅａｔａｔｅ−ｅａｒｔｙ期遺伝子（例えばＩＥＩ）由来の第２のプロモータを有するＤＮＡ領域。所望の遺伝子の発現を行うように適当な間隔で位置する；４、　所望の蛋白質をコードする、ｃＤＮＡあるいはゲノムＤＮＡ配列を挿入し得るクローニング抑制部位を有するＤＮＡ領域。本クローニング抑制部位は、エレメ及びその下流部に位置するマルチクローニングカセット配列を有する；５、　所望の遺伝子をコードするｃＤＮＡあるいはゲノム領域。クローニング抑制部位の第２のプロモータ内に位置し、これにより、第２のプロモータ領域が、所望遺伝子の発現を行う。

このように、本発明は、さらに、上述のバキュロウィルス転写ベクターを含む形質転換虫細胞クローンを包含する。

所望の遺伝子を、感染のｉｍｍｅｄｉａｔｅ−ｆ３ａｒｌｙ期に、虫細胞あるいは虫本体の内部で発現する組換えバキュロウィルス（感染）を産生ずる新規プラスミドベクターの最適な実施例として、左から右方向に、以下の構成を有する。

１、ｐｏｌｙｈｅｄｒｉｎ遺伝子の５′末端側部位をコードする、バキュロウィルスのウィルスＤＮＡ配列（本末端側配列は、バキュロウィルスのｐ０１ｙｈｅｄｒｉｎ遺伝子内での、ｐｌＥＴＶの効果的な相同組換えに必須である）；２、　選択可能なマーカー遺伝子をコードするＤＮＡ領域（例えば、β−ガラクトシダーゼ遺伝子をコードするＤＮＡ）。本選択可能マーカー遺伝子は、エレメント３の第１のプロモータ領域をコードするＤＮＡ領域部位及びその上流部に位置する；３、　バキュロウィルスｉｉｍｅｄ１ａｔｅ−ｅａｒｌｙ期遺伝子（例えばＩＥＮ）由来第１のプロモータ領域を有するＤＮＡ領域。マーカー遺伝子を発現するように上記プロモータ上流部に位置する；４、　他のバキュロウィルスｉｍｍｅｄｉａｔｅ−ｅａｒｌｙ期遺伝子（例エバ、ＩＥＩ）由来第２のプロモータ領域を有するＤＮＡ領域。所望の遺伝子を発現するように適当な間隔で位置する；５、　所望の蛋白質をコードする。ｃＤＮＡあるいはゲノムＤＮＡ配列を挿入し得るクローニング抑制部位を有するＤＮＡ領域。本クローニング制限部位は、エレメント６のｐｏｌｙｈｅｄｒｉｎ遺伝子をコードするＤＮＡ領域の上流部かつエレメントＢの第２プロモータ領域の第１ヌクレオチドの下流部に位置するマルチクローニングカセット配列を有する；６、　所望の遺伝子をコードするｃＤＮＡあるいはゲノム領域。クローニング制限部位の第２のプロモータ内に位置し、これにより、第２のプロモータ領域が、所望遺伝子の発現を行う；７、　ｐｏｌｙｈｅｄｒｉｎプロモータを有するｐｏｌｙｈｅｄｒｉｎ遺伝子をコードするＤＮＡ領域；８、ｐｏｌｙｈｅｄｒｉｎ遺伝子の３′末端側部位をコードする、バキュロウィルスのウィルスＤＮＡ配列（本末端側配列は、バキュロウィルスのｐｏｌｙｈｅｄｒｉｎ遺伝子内での、ｐ　Ｉ　ＥＴＶの効果的な相同組換えに必須である）。

本発明の他の好適な実施例は、所望の末端生成物を上述のプラスミドベクター（安定な形質転換虫細胞クローンもしくは組換えバキュロウィルス）から製造する方法である。

これらプラスミドベクターは、所望の形質転換細胞クローンもしくは組換えウィルスを、迅速かつ容易に認識するためのマーカー遺伝子を含有する。マーカー遺伝子は、当該技術により既知である多数の異なるマーカー遺伝子のうちの一つから選択可能であるが、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコール、アセチルトランスフェラーゼ、もしくはβ−グルクロンニダーゼから選択することがより望ましい。こうして、所望の形質転換細胞クローンもしくは組換えウィルスを、マーカー遺伝子（すなわちβ−ガラクトシダーゼ）の生成により識別することができる。

また、さらに別の好適例は、本プラスミドベクターの、２種のバキュロウィルス初期プロモータによって、宿主虫細胞内で遺伝子発現させる際への適用である。

初期ノくキュロウイルスブロモータであれば、水系に有効であるが、ＩＥＮＳ　ＩＥＯ及びＩＥＩが本発明に好適である。

本発明は、１ｌｌｌｅｄｉａｔｅ−ｅａｒＮ’期ＩＥＮ遺伝子由来初期プロモータ領域を用いて、形質転換虫細胞もしくは組換え　３ウイルスの識別を促進するために使用される、β−ガラクトシダーゼ等のマーカー遺伝子を発現させることが望ましい。ＩＥＮは、マーカー遺伝子を、その配列方向で発現させ、また一方では初期プロモータ領域、最適にはｉｍｍｅｄｉａｔｅ−ｅａｒｌｙ期遺伝子ＩＥＩの配列方向で発現させる。２種のバキュロウィルスプロモータが反対方向に位置するため、２種の初期バキュロウィルスプロモータを異種のものにする必要はない。

より好適な実施例としては、所望の外来遺伝子の挿入を適切な方向で促進させるマルチクローニングカセットの次にＩＥＩプロモータ領域が続くことが望ましい。このマルチクローニングカセットの配列は、ＩＥ１プロモータの下流部に位置される。典型的なカセットの配列単位には、８ないし１１種の酵素によって制限される部位が含まれる（例えば、Ｈｉｎｃｌｌ、　ＥｃｏＲｌ　、　Ｘｈｏｌ、５ＩＩａｌｓＰｓｔｌ、５ａｃｌｌ　、ＮｈｅｌＳＮｃｏ１％Ｎｏｔｌ、　ＢｓｔＢＩ　）　ｏマルチクローニング部位配列単位は数種の企業から入手可能であり　（Ｐｒｏｍｅｇａ、　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｄｓ等）、またはＤＮＡ合成装置を用いてそれぞれの実験室で合成することも可能である。いずれの方法も日常的に用いられており、また、これらマルチクローニングカセット単位の使用についても、当該技術分野において既知のものである。

本発明のさらに他の実施例として、上述のｉｍｍｅｄｉａｔｅ−ｅａｒ！ｙ期遺伝子をｄｅｌａｙｅｄ−ｅａｒｌｙ期のバキュロウィルス遺伝子プロモータ領域と組み合わせて用いる方法がある。

ｉｍＩＩｅｄｉａｔｅ−ｅａｒｌｙ期遺伝子と異なり、ｄｅｌａｙｅｄ−ｅａｒ！ｙ期遺伝子はその他のウィルス遺伝子もしくはｉｓ■ｅｄｉａｔｅ−ｅａｒｌｙ期遺伝子等の遺伝子生成物の存在下でのみ機能する。ｌｓｗｅｄｉａｔｅ−ｅａｒｌｙ期遺伝子は、３９にもしくはバキュロウィルスゲノムの旧ｎｄｌｌｌ　Ｋフラグメント上のｄｅｌａｙｅｄ−ｅａｒｌｙ期遺伝子プロモータの一つのような、数種のｄｅｌａｙｅｄ−ｅａｒｌｙ期遺伝子プロモータ領域すべてと組み合わせることが可能である。より好適には、３９にプロモータ領域と、非相同遺伝子を結合させ、その発現をＩＥＩの存在下で、さらに制御することが望ましい。

加えて、ｉＩｌｍｅｄｉａｔｅ−ｅａｒｌｙ期遺伝子をｄｅｌａｙｅｄ−ｅａｒｌｙ期遺伝子プロモータ領域と組み合わせて使用する際は、直接ｄｅｌａｙｅｄ −ｅａｒｌｙ期遺伝子プロモータ領域とｃｉｓ結合している増強配列の存在により、非相同遺伝子の発現が増強される。これら増強配列（ｈｒｌ　、ｈｒ２　、ｈｒ３　、ｈｒ４及びｈｒ５　）は、ｄｅｌａｙｅｄ−ｅａｒｌｙ期遺伝子の発現が、■１■ｅｄｌａｔｅ−ｅａｒｌｙ期遺伝子もしくはその生成物が制限されている場所で増強することを特徴とする。好適な実施例としては、ｈｒ５増強配列は直接（凹結合で）　ｄｅｌａｙｅｄ−ｅａｒｌｙ期遺伝子プロモータ領域である３９にと結合して、クローン化された非相同ＤＮＡの発現を増強する。

さらに上記組成に加えて、特異プラスミドベクターは、真核細胞もしくは前核細胞のソース由来の所望の蛋白質をコードするｃＤＮＡもしくはゲノムＮＤＡ配列を有するＤＮＡ領域今包含する。この配列は、当該技術で周知であり、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ。

Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ　）から入手可能な多種の異なった遺伝子をコードする。例として、いかにＡＴＣＣより入手可能なりローン化遺伝子またはプローブの簡単なリストを挙げる：表皮成長因子受容体、β−グルクロニダーゼ、Ｙ−ｇｏｓ　ＭＩ　Ｍａｌｏｎｅｙ　ｓａｒｃｏｍａウィルス、組織系ブラスミノゲーンアクチベータ、アルギノサクシネート合成酵素、インスリン（Ａ及びＢ鎖）、プロラクチン、インターロイキン１及び２、コロニー誘発因子、腫瘍壊死因子、β−ヘモグロブリン、インターフェロン、ｌｅｕｔｉｎｉｚｌｎｇホルモン、β−ヘキソースアミニダーゼ、凝固因子ＶＩＩＩＣ，トランスフェリン、エステラーゼＤ１アデノシンデアミナーゼ等。

また、本発明のプラスミドベクターの別の好適な実施例としては、組換えウィルスによってオフルージョン陽性後代を生成し得る、完全なｐｏ＋ｙｈｅｄｒｔｎ遺伝子及びプロモータの使用もまた好適である。これらプラスミドベクターとともに生成される組換えウィルスは、合成ｐｏｌｙｈｅｄｒｉｎが、オフルージョン陽性後代を産生ずるため、好適である。上記組換えウィルスはｉｎ　ｖｉｖｏ系で非常に高い感染能を有し、また、環境の不活性化にも耐性を有する。この能力は他の組換えバキュロウィルスにはみられないものであり、宿主細胞を感染させ、感染初期の段階で、外来遺伝子を虫の体内で発現させる。虫体内において、上記特性は、殺虫剤を含む外来遺伝子生成物の発現には必須である。加えて、これらの特性は、環境的な適用、特にベストコントロールへの適用に理想的な本ベクターを産生ずる。

本ｃＤＮＡ配列はさらに、５′末端側切断翻訳領域及び翻訳開始部位を有する所望の蛋白質をコードするヌクレオチド配列を包含する。本発明によれば、アミノ酸及びヌクレオチド数は、用いられる適当な変換因子と相互変換可能に使用する。

多数の組換えＤＮＡベクター生成物間の（５′から３′方向への）適切な配列位置は、所望の蛋白質をコードする各々の特異ＤＮＡに応じて決定され、その情報によって、所望の蛋白質の、より至適な発現及び生成が行われる。

初期遺伝子プロモータ領域をバキュロウィルス由来のものとする一実施例を挙げる。バキュロウィルスはＡｕｔｏｇｒａｐｈａ　ｃａｌｉｒｏｒｎｉｃａ　ＭＮＰＶ、　Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ　ｎｉ　ＭＮＰＶ。

Ｒａｃｈｊｐｌｕｓｉａ　ｏｕ　ＭＮＰＶ　Ｏｒｇｙｉａｐｓｕｅｄｏｓｕｇａｔａ　ＭＰＶ。

Ｂｏｍｂｙｘ　５ｏｒｔ　ＮＰＶ、　Ｈｅ目ｏｔｈｉｓ　ｚｅａ　ＮＰＶ、　Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｅｘｊｇｕａ　ＮＰｖあるいはＧａ１ｌｅｒｉａ　＊ｅｌｌｏｎｅｌｌａ　ＮＰＶを含む虫細胞のウィルスの中のひとつから選択可能である。

最適な実施例としては、初期遺伝子プロモータ領域をＡｕｔｏｇｒａｐｈａ　ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ　ＭＮＰＶのバキュロウィルスＤＮＡ由来のものとするのが望ましい。上記初期遺伝子プロモータ領域は５ｐｏｄｏｐｏｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄｅの細胞内で発現し得る。バキュロウィルスから単離される初期遺伝子プロモータ領域は、本ウィルスのｉｍｍｅｄｉａｔｅ−ｅａｒｌｙ期遺伝子であり、非相同遺伝子の継続的発現に、他のウィルス遺伝子あるいは遺伝子生成物を必要としない。プロモータ領域由来のｉｍｍｅｄｉａｔｅ−ｅａｒｌｙ期遺伝子は、ＩＥＩもしくはＩＥＮが望ましい。遺伝子プロモータ領域をバキ、０ウイルスＩＥＩのｉｍｍｅｄｉａｔｅ−ｅａｒｌｙ期遺伝子から単離すると好適である。

本発明の方法を上述のように適用すると、安定に形質変換された虫細胞クローンを誘発することができる。したがって、これら形質変換された虫細胞クローンは、上述のバキュロウィルス転移ベクターを包含するようになる。本発明には、形質転換された虫細胞クローンには、ＬｅｐｉｄＯｐｔｅｒａｎ転移虫細胞クローンを使転移石細胞クローンｃｒｅａもしくは、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｌａ　ｎｌを含むＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａｎ虫細胞由来のものならどんなものでもよい。

最適実施例において、安定に形質転換された５ｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ＦｒｕｇｌｐｅｒｄａのＳｆ９細胞系が確立されて、あらゆる初期遺伝子プロモータあるいは、１００パッセージ以上成長した初期遺伝子プロモータを組み合わせ、その制御下で相同ＤＮＡを発現する。本実施例において、用いられるＳｆ９細胞は、ｌｏｇ期まで成長した細胞である。このように安定形質転換された細胞系である非相同ＤＮＡ生成物は、これらの細胞の細胞機能が、ウィルスの初期遺伝子配列によって全く変化しないため、細胞系により翻訳後修飾及び／またはコードされる。

Ｎｅｏ、ｐ３９”Ｎｅｏ、ｐＩＥ１３９Ｎｅｏ、、ｐ５１ＯＮｅｏＳｐＩＥＩＦＢ％ｐｌＥＩＮＦＢ、ｐ３９ＦＢ。

ｐｌＥｌｔＰＡの構成を概略的に示している。

図２は、前初期転移ベクター（ｐ　Ｉ　ＥＴＶ）を示す線図である。ｐｌＥＴＶは、ＡｃＮＰＶ　ＤＮＡのＥｃ。

Ｒ１フラグメントから構成されている。０は構成中に破壊される部位を示す。矢印は図示の遺伝子の転写方向を示す。矢印の先端はポリアデニル化部位を示す。

斜線を付したブロックは多重クローニング配列（図面の下側の配列）を示す。

図３は前初期転移ベクタープラスミドＤＮＡ　（ｐ　Ｉ　ＥＴＶ）を使用して昆虫細胞形質転換クローンまたは組換えバキュロウィルスを産生ずる２種類の異なる方法を示す図である。

発明を実施するための最良の形態ここで、バキュロウィルス初期遺伝子にはバキュロウィルス前初期遺伝子とバキュロウィルス後初期遺伝子とを含むものとする。前初期遺伝子は非感染細胞で発現するウィルス遺伝子からなり、遺伝子ＩＥＩおよびＩＥＮを含む。後初期遺伝子は、ＩＥＩおよびＩＥＮのような前初期遺伝子産物によってｔｒａｎｓで活性化されるウィルス遺伝子である。ＡｃＭＮＰＶ　３９に遺伝子はＡ　ｃ　Ｍ　Ｎ　Ｐ　ＶのＨｉｎｄＩＩ［−にフラグメントの４つの後初期転写物であり、後初期遺伝子の一例として挙げられる。前初期遺伝子産物の制御下での後初期遺伝子からの転写は、ｈｒｌ、ｈｒ２、ｈｒ３、ｈｒ４、ｈｒ５のようなｃｉｓ結合エンハンサ−の存在下で促進される。

ここで、異種遺伝子・異種ＤＮＡには、ウィルス由来の遺伝子・ＤＮＡを含む原核遺伝子・ＤＮＡ、真核遺伝子・ＤＮＡを含むＤＮＡの外因性の原因を含むものとする。

以下に示す例は、本願発明者らが本発明による様々な態様を実施する上で好ましい方法であると考えている実験室技術である。しかしながら、本願に記載の内容に鑑みて、本発明の構成および実施に関する様々な修正および変更が可能であることは当業者らによって容易に理解でき、これらは本発明の趣旨および範囲内にある。

プラスミド寄託バキュロウィルス前初期プロモータＩＥ１を含む好ましいプラスミドであるｐＩＥｌを１９８９年７月６日にＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、　（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）に寄託し、受入れ番号４０６３０を受理している。後初期プロモータ３９におよび転写エンノーンサーエレメントを含む好ましいプラスミドであるｐ　３９　Ｅ”を１９８９年７月６日にＡｍｅｒｉｃａｎ　ＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、　（Ｒｏｃｋｖｉ　ｌ　ｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）に寄託し、受入れ番号４０６２９を受理している。Ａ　ｃ　Ｍ　Ｎ　Ｐ　ＶのＨｉｎｄｍ−にフラグメントの４つの後初期転写物を含む好ましいプラスミドであるｐＨ１ｎｄＩＩＩＫを１９８９年７月６日にＡｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、　（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ。

Ｍａｒｙｌａｎｄ）に寄託し、受入れ番号４０６２８を受理している。

及！開始材料および方法本発明の好ましい実施例によれば、ネオマイシン耐性遺伝子（Ｎ　ｅ　ｏ−Ｒ）を使用するが、これはＰ、Ｊ。

５ｏｕｔｈｅｒｎおよびＰ、Ｂｅｒｇ、　Ｊ、Ｍｏｌ。

Ａｐｐ　１．Ｇｅｎ、　、１　：　３２７−３４１　（１９８２）に記載の方法に基づいて得たものである。し力）しな力（ら、本記載内容から得るところのある当業者は、他の遺伝子も適宜使用可能であることを理解できよう。特に、少なくともＪ、Ｃ，ＬｉおよびＥ、Ｋａｍｉｎｓｋａｓ。

ＰＮＡＳ、　８１　：　５６９４−５６９８　（１９８１）　＋こ記載の方法に基づいて得られるノ＼イグロマイシンＢ耐性遺伝子（Ｈｙｇｒｏ−Ｒ）およびメトトレキセート耐性遺伝子（Ｍｅｔｈｏ−Ｒ）は有効利用できるものと思わＧ、Ｅ、Ｓｍ１ｔｈおよびＭ、Ｄ、Ｓｕｍｍｅ　ｒ　ｓ。

Ｖｉ　ｒｏ　ｌｏｇｙ、８９　：　５１７−５２０　（１９７８）　、Ｇ、Ｅ、Ｓｍｉ　ｔｈおよびＭ、Ｄ、Ｓ　ｕｍｍｅ　ｒｓ、　、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、、３９：１２５−１３７（１９８１）に記載の方法に基づいて、本例でウィルスＤＮＡ生成源として使用したバキュロウィルスであるＡｕｔｏｇｒａｐｈａ　ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウィルス（ＡｃＭＮＰＶ）を単離した。

本発明の好ましい実施例によれば、ＡｃＭＮＰＶやＲ２の特定の菌株を使用することもできる。しかしながら、本記載内容から得るところのある当業者は、他のバキュロウィルスや他のバキュロウィルス菌株を使用してウィルスＤＮＡを得ることも可能であることを理解できよう。

特に、少なくとも密接に関連した自然発生菌株であるｈおよびＭ、Ｄ、Ｓｕｍｍｅｒｓ、　Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、。

３３：３１１−３１９　（１９８０）において単離され特徴付けられたＡ　ｃ　Ｍ　Ｎ　Ｐ　Ｖ　（７）　Ｍ　３、Ｒ９、Ｓｌ、Ｓ３菌株のような溶菌斑精製菌株などは有効利用できるものと思われる。上述の菌株および他の菌株については、Ｇ、Ｅ、Ｓｍ１ｔｈおよびＭ、Ｄ、Ｓｕｍｍｅｒｓ。

Ｊ、Ｖｉ　ｒｏ　１．．８９　：　５１７−５２７　（１９７８）に記載されている。

酵素これらの構成に使用した制限酵素および他の酵素は、Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　（Ｂｅｔｈｅｓｄａ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ）、Ｐｒｏｍｅｇａ　（Ｍｅｄｉｓｏｎ、　Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ。

Ｉｎｃ、　（Ｂｅｖｅｒｌｙ、　Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）のいずれかから入手した。

β−ガラクトシダーゼＤＮＡ本例で使用したβ−ガラクトシダーゼ遺伝子から成るＤＮＡフラグメントは、Ｄｒ、Ｍａｘ　Ｄ、Ｓｕｍｍｅｒｓ、Ｄｅｐｔ、ｏｆ　Ｅｎｔｏｍｏｌｏｇｙ。

Ｔｅｘａｓ　Ａ＆Ｍ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、　Ｃａｌｌｅｇｅ　５ｔａｔｉｏｎ、Ｔｅｘａｓ　７７８４３から入手したプラスミドｐＤＰ５００から単離したものである。（Ｖ、Ａ、ＬｕｃｋｏｗおよびＭ、Ｄ、Ｓｕｍｍｅｒｓ、　Ｖｉｒｏｌ、、１６７：５６−７１　（１９８８ｂ）参照。）β−ガラクトシダーゼ遺伝子から成るＤＮＡフラグメントを含むプラスミドは、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ）　力１本例で使用したヒト組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子から成るＤＮＡフラグメントは、Ｄｒ、ＭａｘＤ、Ｓｕｍｍｅｒｓ、Ｄｅｐｔ、　ｏｆ　Ｅｎｔｏｍ。

１ｏｇｙ、　Ｔｅｘａｓ　Ａ＆Ｍ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、　ＣｏＣｏ１１ｅ　５ｔａｔｉｏｎ、　Ｔｅｘａｓ７７８４３から入手したプラスミドｐＶＬ３２７から単離したものである。（Ｖ、Ａ、ＬｕｃｋｏｗおよびＭ：Ｄ、Ｓｕｍｍｅｒｓ、　Ｖｉｒｏｌ、、１６７：５６−７１　（１９８８ｂ）参照。）ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子遺伝子から成るＤＮＡフラグメントを含むプラスミドは、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、　（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）から入手できる。

昆虫細胞系鱗翅目昆虫細胞系Ｉ　ＰＬＢ−Ｓ　ｆ　Ｚ　Ｉ−ＡＥは、１０年以上前にアキアワヨトウガ５ｐｏｄｏｐｔｅｒａｆ　ｒｕｇｉｐｅｒｄａ　（Ｊ、Ｌ、Ｖａｕｇｈｎ他、ＩｎＶｉｔｒｏ、　１３：２１３−２１７　（１９７７））から樹立された。

５ｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ　Ｓｆ９細胞系は、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、　（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ。

Ｍａｒｙｌａｎｄ）の受入れ番号ＡＴＣＣＣＲＬ１７１１である。Ｍ、Ｄ、ＳｕｍｍｅｒｓおよびＧ、Ｅ。

Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ、　Ｔｅｘａｓ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ　５ｔａｔｉｏｎＢｕｌｌｅｔｉｎ　Ｎｏ、　１５５５．　ＴｅｘａｓＡ＆Ｍ　Ｕｎｉｖｅｒｓ　ｉ　ｔｙ　（１９８７）を参照のこと。本記載内容から得るところのある当業者は、Ｓｆ９細胞系の他のクローン誘導体も有効利用できることを理解できよう。

細胞培地本例で使用したＴＮＭＦＨ培地は、Ｍ、Ｄ、ＳｕｍｍｅｒｓおよびＧ、Ｅ、Ｓｍ１ｔｈ、Ａ　Ｍａｎｕａｌｏｆ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ　Ｖｅｃｔｏｒｓ　ａｎｄ　Ｉｎ５ｅｃｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ、Ｔｅｘａｓ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ　５ｔａｔｉｏｎ　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ　Ｎｏ、　１５５５、Ｔｅｘａｓ　Ａ＆Ｍ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（１９８７）に記載の方法に基づいて調製した。

（Ｗ。

Ｆ、Ｈｉｎｋ、　Ｎａｔｕｒｅ　（Ｌｏｎｄｏｎ）。

２２６：４６６−４６７　（１９７０）も参照のこと。）ＴＮＭＦＨ培地を添加するために使用したウシ胎児血清はＨａｚｅｌｔｏｎ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、　Ｉｎｃ、　（Ｌｅｎｅｘａ、Ｋａｎｓａｓ）から入手できる。

本例で使用したネオマイシン抗生物質Ｇ４１８はＧＩＢＣＯ（Ｇｒａｎｄ　Ｉ　ｓ　１　ａｎｄ、Ｎｅｗ　Ｙ。

ｒｋ）から入手した。ハイグロマイシンＢ抗生物質およびメトトレキセート抗生物質は、Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ　（Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ。

Ｍ　ｉ　ｓ　ｓ　ｏ　ｕ　ｒ　ｉ　）から販売されている。

方法すべてのプラスミドは、Ｕｎｉｔｅｄ　５ｔａｔｅｓＴ、Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｅ、Ｆ、Ｆｒ１ｔｓｃｈおよびＣｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　（１９８２）に記載の標準的な組換えＤＮＡ技術を使用して構成精製した。これらの文献は以下の標準的な方法の実施手順についての記載を含む。すなわ製、ＤＮＡのフェノール抽出、ＤＮＡのエタノール沈殿、寒天ゲル電気泳動、寒天ゲルからのＤＮＡフラグメント精製、制限エンドヌクレアーゼ反応および他のＤＮＡ修飾酵素反応である。

本例に基づいて使用したｐ　Ａ　ｃ　５１．０およびｐ　Ａ　ｃ　３６０−β− ガラクトシダーゼを含む特定プラスミドの同一導入および調製という昆虫細胞培養の標準的な方法は、Ｍ、Ｄ、Ｓ　ｕｍｍｅ　ｒ　ｓおよびＧ、Ｅ、Ｓｍｉ　ｔｈ。

Ａ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ　Ｖｅｃｔｏｒｓ　ａｎｄ　Ｉｎ５ｅｃｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ、　Ｔｅｘａｓ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ　５ｔａｔｉｏｎ　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ　Ｎｏ、　１５５５．　Ｔｅｘａｓ　Ａ＆Ｍ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　（１９８７）に記載されている。この文献はＡｃＭＮＰＶ転移ベクターへの遺伝子クローニング、プラスミドＤＮＡ単離、Ａ　ｃ　Ｍ　Ｎ　Ｐ　Ｖゲノムへの遺伝子転移、ウィルスＤＮＡ精製、組換えタンパク質の放射能装置、昆虫細胞培地の調製などについての標準的な方法も開示している。

ウィルスおよび細胞の培養手順は、Ｌ、Ｅ、ＶｏｌｋｍａｎおよびＭ、Ｄ、Ｓｕｍｍｅｒｓ、　Ｊ、Ｖｉｒ。

ｌ、１９・８２０−８３２　（１９７５）や、Ｌ、Ｅ。

Ｖｏｌｋｍａｎ、Ｍ、Ｄ、ＳｕｍｍｅｒｓおよびＣ，Ｈ。

Ｈｓｉｅｈ、　Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、　１９：８２０−８３２　（１９７６）に記載されている。成長速度はＳ、ｆイとを使用してＭｏ　１　ｋ　ｍ　ａ　ｎ他、同上に記載されているように判定した。

生化学的分析Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｅ、Ｆ、Ｆｒ１ｔｓｃｈおよびＪ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　（１９８２）に記載の標準的な方法によって、Ｓｆ９細胞（継代２６；以下ｒＰ２６Ｊと呼ぶ）またはクローン誘導体（ＩＥＩＦＢＩ、　Ｐ２１；　ＩＥＩＦＢ２．　Ｐ２１；　ＩＥＩＦＢ４．　Ｐ２Ｏ；ＩＥＩＦＢ５．　Ｐ２Ｏ，ＩＥＩＦＢ７．　ＰＩ３）から全細胞性ＤＮＡを抽出した。Ｓｆ９細胞またはクローン誘導体（Ｂ、ＨｉｒｔによってＪ、Ｍｏ１．　Ｂｊｏ　１．、　２６　：　３６５−３６９　（１９６７）に記載されたようなＩＥＩＦＢｌ、　ＰＩ３．　ＩＥＩＦＢ２゜ＰＩ３およびＰ４９．　ＩＥＩＦＢ４．　Ｐ２１；ＩＥＩＦＢ７．ＰＩ３）からＨｉｒｔライゼートを調製した。　Ｅ、Ｍ、５ｏｕｔｈｅｒｎ、　Ｊ、　Ｍｏｌ。

Ｂｉｏｌ、、９８：５０３−５１７　（１９７５）記載の方法によってプラスミド配列の存在下でＤＮＡ標本を分析した。Ａ、Ｐ、ＦｅｉｎｂｅｒｇおよびＢ、Ｖ。

ｇｅｌｓｔｅｉｎ、Ａｎａｌｙｔ、　Ｂｔｏｃｈｅｍ。

、　１３２：６−１３　（１９８３）に記載のランダムプライマー法によって、サザン分析に使用したプローブ＝３２を［α　Ｐ］　ｄＡＴＰ　（Ｎｅｗ　ＥｎｇｌａｎｄＮｕｃｌｅａｒ、　Ｂｏｓｔｏｎ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ；　８００　Ｃｉ／ｍｍｏｌ）で標識した。

Ｊ、Ｇ、Ｗ、Ｆ　ｌ　ｅｍｉ　ｎｇおよびＭ、Ｄ、Ｓｕｍｍｅｒｓ、　Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、、　５７：５５２−５６２（１９８６）に記載されているようにサザンプロットをハイブリッド形成し、高緊張状態で洗浄した。Ｊ、Ｍ。

Ｃｈｉｒｇｗｉｎ他、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ。

１８：５２９４−５２９９　（１９７９）の方法によって全細胞ＲＮＡを抽出し、Ｒ，Ｆ、ＷｅａｖｅｒおよびＣ，Ｗｅｉｓｓｍａｎ、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄＲｅｓ、、７：１１７５−１１９３　（１９７９）に記載の方法に基づいてＳ１ヌクレア一ゼ保護分析を行った。Ｓ１マツピング用プローブには、ポリヌクレオチドキナーゼによって５−末端積置したゲル精製制限フラグメントを使用した。全細胞性タンパク質をデタージエント抽出し、Ｓ、Ｗ、Ｋｅｓｓｌｅｒ、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　１１５：１６１７−１６２４　（１９７５）に記載の放射性免疫沈降法、Ｕ、に、Ｌａｅｍｍｌ　ｉ。

ルミ気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）　、Ｈ，Ｔｏｗｂ　ｉ　ｎ。

Ｔ、５ｔａｅｈｌｉｎおよびＪ、Ｇｏｒｄｏｎ。

Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ。

に記載され、この以前にり、Ｌ、ＪａｒｖｉｓおよびＭ。

た５ＤＳ−ＰＡＧＥとウェスタンブロッティングを両方用いる方法のいずれかによって分析した。Ｍ、Ｓ、Ｂ１ａｋｅ他、Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　３６：１７５−１７９　（１９８４）に記載されたアルカリ性ホスファダーゼによるウェスタンプロットで免疫複合体を検出した。Ｉ、ＺａｍｎおよびＡ、Ｆｏｗｌｅｒ、　ｉｎ：Ｔｈｅ　Ｌａｃｔｏｓｅ　０ｐｅｒｏｎ、　ｐ、２７、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　 ■ａｒｂｏｒ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９７０）記載の修飾方法を使用してβ −ガラクトシダーゼ活性を検定した。β−ガラクトシダーゼ活性単位を１００万セル／　４２０　ｎ　ｍ　／時の吸光度の変化の形で表１および表２に示す。１ ×１０６細胞／時からの抽出物を保温した後の１活性単位は１．０吸光度単位増加量に相当する。

免疫蛍光法間接免疫蛍光法を使用してＳｆ９細胞やこの細胞のクローン変異株の抗原を可視化した。カバーグラス上の細胞を異なる時間で成長させ、ＰＨＥＭ緩衝液（６０ｍＭＰＩＰＥＳ、　２５ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、　１０ｍＭＥＧＴＡ、　２ｍＭ　ＭｇＣ１、Ｉ）Ｈ６，９；ＲＥＦ）で洗浄した。さらに、ホルムアルデヒド（ＰＨＥＭ中２％Ｗ　／　Ｖ　；バラホルムアルデヒドから新たに調製）を加えて室温で２０分かけて固定した。この細胞をＰＨＥＭで洗浄し、ＰＨＥＭ中の０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００によって室温でさらに２０分処理し、ダルベツコ燐酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）で洗浄した。２％ヤギ正常血清含有ＤＰＢＳで希釈した一次抗体（例えばマウス抗β−ガラクトシダーゼ；　Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）を固定可溶化した細胞に加え、加湿器内にて室温でさらに３０分保温した。この細胞をＤＰＢＳで洗浄し、二次抗体（例えばヤギ抗マウスＩｇＧ−ＦＩＴＣ；　ＯｒｇａｎｏｎＴｅｋｎｉｋａ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；　ＷｅｓｔＣｈｅｓｔｅｒ、　Ｐｅｎｎ５ｙｌｖａｎｉａ）を加えて上述した条件下で保温した。最後に、ＤＰＢＳおよび水で細胞を洗浄し、Ｏｌｙｍｐｕｓ　Ｖａｎｏｘ　Ｍｏｄｅｌ　ＡＨＢＴ顕微鏡（オリンパス光学工業；東京、日本）を使用して蛍光検鏡および写真撮影を行った。

本例で使用したすべての構成物を図１に示す。プラスミドｐｌＥＩＮｅｏは、ＩＥＩプロモータ（Ｌ、Ａ、ＧｕａｒｉｎｏおよびＭ、Ｄ、Ｓｕｍｍｅｒｓ、　Ｊ。

Ｖｉｒｏｌ２．　５７：５６３−５７１　（１９８６ａ）；　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、、　６１：２０９１−２０９９（１９８７））のすぐ下流にネオマイシン耐性遺伝子Ｎｅｏ−Ｒ（Ｐ、Ｊ、５ｏｕｔｈｅｒｎおよびＰ、Ｂｅｒｇ、　Ｊ、Ｍｏ１．　Ａｐｐｌ、Ｇｅｎ、、　１：３２７−３４１　（１９８２））を含む。このプラスミドはＮｅｏ−Ｒをコード化する修復ＢｇｌＩＩ−ＢａｍＨ■フラグメントをＩＥＩの翻訳開始部位の上流のＨｉｎＣ部位３９塩基対に挿入することによって構成した。

プラスミドｐ３９Ｅ”Ｎｅｏは、３９Ｋ　（Ｌ、Ａ、ＧｕａｒｉｎｏおよびＭ、Ｄ、Ｓｕｍｍｅｒｓ、　Ｊ。

Ｖｉｒｏｌ、、　５７：５６３−５７１　（１９８６ａ）プロモータと、このプロモータ上流に位置するエンハンサ−エレメントｈｒ５　（Ｌ、Ａ、ＧｕａｒｉｎｏおよびＭ、Ｄ、Ｓｕｍｍｅｒｓ、　Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、、　６０：２１５−２２３　（１９８６ｂ）；　Ｌ、Ａ、Ｇｕａｒｉｎｏ他、　Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、、６０：２４−２２９　（１９８６）　、３９に遺伝子の５−ＡＵＧ下流７塩基対のフレームに挿入したＮｅｏ−Ｒ遺伝子とを含む。このプラスミドは、ＤＮＡポリメラーゼエのクレノＢＩおよびＢａｍＨＩ部位で”Ｎｅｏ−Ｒをコード化するＢａｍＨＩフラグメント）することによりｐ３９　ＣＡＴＱ”　（Ｌ、Ａ、ＧｕａｒｉｎｏおよびＭ、Ｄ、Ｓｕｍｍｅｒｓ、　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、、　５７：５６３−４７１　（１９８６ａ）から誘導した。本発明の好ましい実施例によれば、ＡｃＭＮＰＶ転写エンハンサ−エレメントｈ「５を使用することもできる。しかしながら、本記載内容から得るところのある当業者は、バキュロウィルス前初期遺伝子や遺伝子プロモータと他の転写エンハンサ−エレメントとを組み合わせてもよいことは理解できよう。特に、少なくともり、Ａ、Ｇｕａ　ｒ　ｉ　ｎｏ、Ｍ。

Ａ、ＧｏｎｚａｌｅｚおよびＭ、Ｄ、Ｓ　ｕｍｍｅ　ｒ　ｓ。

Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、、　６０：２２４−２２９　（１９８６）に記載・特徴付けられているＡ　ｃ　Ｍ　Ｎ　Ｐ　Ｖ転写エンハンサ−エレメントｈｒｌ、ｈｒ２、ｈｒ３、ｈｒ４は有効利用できる。

プラスミドｐ３９Ｅ−Ｎｅｏは、プラスミドｐ３９Ｅ”Ｎｅｏと同様に構成した。しかしながら、ｐ３９Ｅ−Ｎｅｏはｈｒ５　（または他の）エンハンサ−を欠いており、Ｈｉｎｄｍ消化およびｐ３９Ｅ”Ｎｅｏの再リガーゼによって構成する。

プラスミドｐｌＥ１３９Ｎｅｏは、Ｎｅｏ−Ｒをコード化するＢｇｌｌＴ−ＢａｍＨＩフラグメントでＢａｍＨＩを置換することによってｐ３９ＣＡＴ／ＩＥ− １（Ｌ。

Ａ、ＧｕａｒｉｎｏおよびＭ、Ｄ、Ｓｕｍｍｅ　ｒ　ｓ。

Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、、　５７：５６３−５７１　（１９８６ａ））から誘導した。

プラスミドｐ５１ＯＮｅｏは、Ｍ、Ｄ、ＳｕｍｍｅｒＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔＳｔａｔｉｏｎ　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ　Ｎｏ、　１５５５゜Ｔｅｘａｓ　Ａ＆Ｍ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　（１９８７）に記載された後期転写ベクターであるｐＡｃ５１００　（Ｄ、Ｐａｎ１ｃａｌｉ、Ａ、Ｇｒｚａｌｅｃｋｉ■フラグメントを挿入することによって構成した。これによってβ−ガラクトシダーゼ遺伝子はＩＥＩ翻訳開始部位下ｆｆ１３６塩基対部位のフレームに位置決めされ、工Ｅ１の最初の１２個のアミノ酸とβ−ガラクトシダーゼフラグメントとを融合する。

プラスミドｐｌＥＩＮＦＢは、β−ガラクトシダーゼをコード化するＢｇｌＩＩフラグメントをＨｉｎｃＩＩのＩＥ１翻訳開始部位上流３つ塩基対に挿入した以外はｐｌＥＩＦＢの構成と同様の方法で構成した。このため、このプラスミドは非融合β−ガラクトシダーゼ遺伝子産物をコード化する。

シラスミドｐ３９Ｅ”　ＦＢは、Ｎｅｏ−Ｒ：７−ド配列のβ−ガラクトシダーゼコード配列を適所に有するようにしたこと以外はｐ３９Ｅ”Ｎｅｏと同様に構成した。

プラスミドｐｌＥ１ｔＰＡは、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）をコード化するＢａｍＨＩフラグメントをβ−ガラクトシダーゼの代わりにＩＥＩ翻訳開始部位下流３６塩基対に挿入した以外はｐｌＥＩＦＢと同様に構成し、ＩＥＩコード配列からみてフレーム外にくるようにしている。このため、このプラスミドは非融合ｔＰＡ遺伝子産物をコード化する。

さらに、本記載内容から得るところのある当業者は、他の異種遺伝子や他のバキュロウィルス初期プロモータを使用して他のプラスミドを調製することも可能であることを理解できよう。

例■ 安定形質転換昆虫細胞クローンの構成本発明による安定形質転換昆虫細胞りａ−ンを構成するだめに、鱗翅目昆虫細胞系がらのクローン誘導体すなわちＳｒ１を使用ｌ−で上述した新規な遺伝子構成を１つ以上含む安定した遺伝子変異型を産生じた。Ｓｆ９細胞を３５ｍｍ培養皿に約Ｉ　Ｘ　１０６の密度で播種し、最低１時間放置して付着させた。培地を除去し、Ｍ、Ｄ、５Ｔｅｘａｓ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ　５ｔａｔｉｏｎ　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ　Ｎｏ。

１５５５、Ｔｅｘａｓ　Ａ＆Ｍ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　（１９８７）に記載の方法を使用して、目的のタンパク質（例えばβ−ガラクトシダーゼ）をコード化する異種ＤＮＡを含む２μｇプラスミドと１μｇ　ｐｌＥＩＮｅｏ　ＤＮＡとの混合物で細胞を同時に導入した。

導入後、細胞を２８℃で２時間保温し、洗浄し、１０％ウシウシ血清（Ｈａｚｅｌｔｏｎ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈＰｒｏｄｕｃｔｓ、　Ｉｎｃ、Ｌｅｎｅｘａｌ　Ｋａｎｓａｓ）および抗生物質（完全ＴＮＭＦＨ）を補充したＴＮＭＦＨ培地ＣＭ、Ｄ、Ｓ　ｕｍｍｅ　ｒ　ｓおよびＧ。

６：４６６−４６７　（１９７０））に添加した。細胞を２８℃でさらに２２時間保温し、各培養皿について低細胞密度で継代培養１＝、６０ｍｍ培養皿で多数の疎播種を行った。６０ｍｍ培養皿の各々には約５Ｘ１０’個の細胞を播種した。これらを２８℃でさらに２４時間保温し、容器の培地を１　ｍ　ｇ　／　ｍ　ｌネオマイシン抗生物質０４１８（ＧＩＢＣＯ＋　Ｇｒａｎｄ　ｌ５ｌａｎｄ。

Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）を含む新鮮な完全ＴＮＭＦＨと交換した。培養物を２８℃で１週間保温して培地を交換した後、この培養物を２８℃でさらに１週間保温した。培地を０４１８を含まない完全ＴＮＭＦＨと交換し、裸眼でもコロニーをはっきりと認めることができるようになるまで培養物を２８℃で保温した。この時、各コロニーを取り出し、分析用に十分な数の細胞が得られるまで各々増幅した。

一度増幅１．てしまうと、問題のクローンは２８℃の完全ＴＮＭＦＨ巾で着生培養物または懸濁培養物として定期的に成長した。

例■ 異種遺伝子の連続的発現に使用するプロモータの評価ＡｃＭＮＰＶ前初期および後初期プロモータの一例としてＩＥｌおよび３９にプロモータを挙げておく。し、かじながら、本記載内容から得るところのある当業者は、他のバキュロウィルス前初期プロモータでも有効利用できることを理解できよう。これらのウィルスプロモータの安定形質転換Ｓｆ９細胞で抗生物質耐性Ｎｅｏ−Ｒ遺伝子の連続的な発現を促進する能力を確認した。

例Ｉで構成した様々なプラスミド（すなわちｐＩＥＮｅｏ、ｐ３９Ｅ−Ｎｅｏ、ｐ３９”Ｎｅｏ、ｐＩＥ１３９ＮｅｏＳｐ５１ＯＮｅｏＳｐ　ＩＥＩＦＢ、ｐ　Ｉ　Ｅ’１ＮＦＢ、ｐ３９”　ＦＢ、ｐ　ＩＥＩ　ｔ　ＰＡＳ　ｆ　９）　で細胞培養物を同時に導入して洗浄し、２８℃で２４時間保温した。これらの細胞培養物を継代培養し、同数の細胞を播種した２４枚のプレート（直径６０ｍｍ）にした。各培養物からの１２プレートでは新鮮なＴＮＭＦＨに細胞を播種し、残りの１２プレートでは１　ｍ　ｇ　／　ｍ　１抗生物質Ｇ４１８を含有する新鮮なＴＮＭＦＨに細胞を播種した。

容器に最初に播種する細胞の数を決めるために、Ｍ、Ｄ。

ＳｕｍｍｅｒｓおよびＧ、Ｅ、Ｓｍ１ｔｈ、Ａ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｍｅｔｈ、ｏｄｓ　ｆｏｒ　Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ　Ｖｅｃｔｏｒｓ　ａｎｄ　Ｉｎ５ｅｃｔＣｅｌｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ。

Ｔｅｘａｓ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ　５ｔａｔｉｏｎ　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ　Ｎｏ。

１５５５、　Ｔｅｘａｓ　Ａ＆Ｍ　Ｕｎｉｖｅｒｓｆ１’　（１９８７）に記載されているような標準的なトリバンブルー排除染色法を使用して開始細胞懸濁物の３倍標本の生菌数を測定した。続いて３倍プレートを制御処理細胞とＧ４１８処理細胞について各々２日間隔と４日間隔で測定した。

導入に使用したプラスミドに関係なく、すべての細胞は抗生物質Ｇ４１８なしでもほぼ同等の成長曲線をたどった。さらに、これらの成長曲線は導入していない正常なＳｆ９細胞に典型的な曲線であった。このようなことから、研究期間全体にわたって重大な毒性を示したプラスミドはないことが分かった。抗生物質Ｇ４１８を添加した場合には、ｐ５１ＯＮｅｏを使用して導入した細胞は生存できなかった。この結果は、Ｎｅｏ−Ｒ遺伝子を極めて後期の多角体プロモータから発現するためには、その前にこの細胞内には欠如している他の多数のウィルス遺伝子を発現させておく必要があるという考え（Ｌ。

（１９８８））と一致する。一方、ｐｌＥＩＮｅｏまたはＰ３９”ＮｅｏにＰＩＥＩを加えたものを使用してＳｆ９細胞を導入すると、多数の６４１８耐性細胞が得られた。この結果から、ＩＥプロモータまたは３９にプロモータのいずれかを使用してＳｆ９細胞中にＮｅｏ−Ｒ遺伝子産物を連続的に発現させることができるということが分かる。これらのプロモータおよび他のバキュロウィルス初期プロモータを使用して、例えばβ−ガラクトシダーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子、ヒトインターロイキン−２、ヒトβ−インターフェロンなどの異種遺伝子産物も同様に発現できるということに注意されたい。また、ネオマイシンに対する耐性をコード化する遺伝子に加えてハイグロマイシンＢやメトトレキセートに対する耐性をコード化するような他の抗生物質耐性遺伝子も有効利用できることに注意されたい。

さらに、上述の結果から、ＩＥＩ遺伝子産物および代表的な転写エンハンサ−エレメントｈｒ５　（Ｌ、Ａ、ＧｕａｒｉｎｏおよびＭ、Ｄ、Ｓ　ｕｍｍｅ　ｒ　ｓ、　Ｊ。

Ｖｉｒｏｌ、、　６０：２１５−２２３　（１９８６ｂ）；　Ｌ、Ａ、Ｇｕａｒｉｎｏ、Ｍ、Ａ、Ｇｏｎｚａｌｅ２およびＭ、Ｄ、Ｓｕｍｍｅｒｓ、　Ｊ、Ｖｉｒｏｌ。

、６０　：　２２４−２２９　（１９８６））が３９にプロモータからの連続的な遺伝子発現におよぼす影響も確認した。ＩＥＩが欠如したｐ３９Ｅ−Ｎｅｏを使用した導入によって得られたＧ４１８耐性細胞の数は最も少なかった。ＩＥＩの存在するｐ３９Ｅ−ＮｅｏまたはＩＥｌが欠如したｐ３９Ｅ”Ｎｅｏを使用して導入を行うと、得られるＧ４１８耐性細胞の数は多くなる。最大数が得られたのは、ｌＥｌおよびｈｒ５の両方が存在している場合であった。この結果は、３９にプロモータからの発現はＩＥＩ遺伝子産物によってｔｒａｎｓで活性化され、ｈｒ５によってｃｉｓで活性化されるという以前に確認されている一時的発現アッセイ（Ｌ、Ａ、ＧｕａｒｉｎＶｉｒｏｌ、、　６０：２１５−２２３　（１９８６ｂ））の結果と一致する。おもしろいことに、ＩＥＩプロモータだけを使用した場合とＩＥＩとｈｒ５との両方を含む３９にプロモータを使用した場合とではほぼ同数の耐性細胞を得ることができた。これらの観察結果に基くと、ＩＥＩプロモータのみであってもＩＥＩとＡ　ｃ　Ｍ　Ｎ　Ｐ　Ｖ転写エンハンサ− エレメントｈｒ５との両方を含む３９にプロモータであっても、異種遺伝子を連続的に発現させ得る安定形質転換Ｓｆ９細胞変異型の産生用プロモータとして等しく有効利用できる。さらに、ｈｒ５の他にＡｃＭＮＰＶ転写エンハンサ−エレメントｈｒｌ、ｈｒ２、ｈｒ３、ｈｒ４も有効利用できることに注意されたい。

る安定形質転換変異型を産出するために、例Ｉのプラスミドを使用して以下のようにＳｆ９細胞を同時に導入した。すなわち、ｐｌＥＩＦＢとｐｌＥＩＮｅｏ、ｐｌＥＩＮＦＢとｐｌＥＩＮｅｏ、またはｐ３９Ｅ”　ＦＢとｐｌＥｌとｐＩＥＩＮｅｏを使用したのである。導入後、Ｇ４１８耐性細胞を選択し、例Ｉ乃至■ において上述したようにコロニーを単離した。十分に単離されたコロニーを取り出して増幅した。個々のクローンからの細胞質抽出物を調製し、β−ガラクトシダーゼ活性検定を行った（表１）。β−ガラクトシダーゼ活性は、ＩＥ１’ＦＢまたはＩＥＩＮＦＢを使用して導入後に単離したクローンの１／２を越え、ｐ３９Ｅ”　ＦＢを使用して導入後に単離したクローンの１／３より大きい値が検出された。

ＩＥＩＦＢ２を使用した場合のクローンの活性が最も大きく、ＡＣ３６０−β− ガラクトシダーゼまたはＶＬ７２０βガラクシトシダーゼに２４時間感染させたＳｆ９細胞に一過的に発現した場合の約５〜１５％であった。

Ａｃ　３６０−β−ガラクトシダーゼやＶＬ７２０β−ガラクトシダーゼは組換えバキュロウィルスであり、β−ガラクトシダーゼ遺伝子は多角体プロモータによって一過的に発現する（Ａｃ３６０−β−ガラクトシダーゼに関するＭ、Ｄ、ＳｕｍｍｅｒｓおよびＧ、Ｅ、Ｓｍｉ　ｔＩ　Ｅｘｐｏｒｉｍｅｎｔ　５ｔａｔｉｏｎ　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ　Ｎｏ、　１５５５．　Ｔｅｘａｓ　Ａ＆ＭＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　（１９８７）や、Ｖ、Ａ、Ｌｕ、　１６７：５６−７１　（１９８８ｂ）などを参照のこと）ｏさらに分析することで、正のＩＥＩＦＢクローンの３／４は培養中に最低２９継代までβ−ガラクトシダーゼを連続して発現する（表２）ということも分かった。表２において示すように、クローンＩＥＩＦＢ２は５５継代以上も連続してβ−ガラクトシダーゼを発現した。Ｉ　Ｅ　１．　Ｆ　Ｂ　５クローンはβ−ガラクトシダーゼ発現能を喪失しており、約２０継代後に組込プラスミドＤＮＡ配列が欠損した。これらの結果から、一般にＩＥＩＦＢ細胞は約５５継代後よりも３〜４Ｉ！代後の方が多くのβ−ガラクトシダーゼを発現するということが分かった。

しかしながら、発現レベルは継代数３０付近で安定し、外来遺伝子の連続的な発現は安定形質転換細胞系において達成できるということも証明できた。

表２　１！代によるβ−ガラクトシダーゼ活性への影響工ＥＩＦＢｉ　ｐ４　０．０００工ＥＩＦＢｉ　ｐ３１　０．０００工Ｅ工ＦＢ２　ｐ４　０＋４７９工ＥＩＦＢ２　ｐ２）　０＋０９２工Ｅ１ＦＢ２　ｐ３１　０．１３４工ＥＩＦＢ２　ｐ５５　０．１２８工Ｅ１ＦＢ４　ｐ４　０．０２１工ＥＩＦＢ４　ｐ３０　０．０４６エＥＩＦＢ５　ｐ４　０．０７９工Ｅ１ＦＢ５　ｐ２９　０．０００工ＥＩＦＢ７　ｐ３　０．０２５工Ｅ１ＦＢ？　ｐ２９　０．００４形質転換したＳｆ９細胞クローン中におけるβ−ガラクトシダーゼ関連ポリペプチドの存在を立証するために、この細胞をパルス標識し、デタージエント抽出し、５ＤＳ−ＰＡＧＥによって免疫沈降を分析した。以下に述べるｐｌＥＩＦＢ形質転換クローン２．４．７の各々は特に見かけ上の分子量約１２０，０００の免疫反応性ポリペプチドを含んでいた。このポリペプチドは偽感染またはＡｃＭＮＰＶ感染Ｓｆ９細胞やＩＥＩＦＢ形質転換クローン１．５（クローン５は初期段階では正であったが継代に伴って反転した（表２）ことに注意）には検出されなかった。Ａｃ３６０−β−ガラクトシダーゼによって発現した同様の組換え産物を使用してこのポリペプチドを同時移動し、この時に多角体の最初の１１個のアミノ酸をβ−ガラクトシダーゼに対応するフレームで融合（Ｍ、Ｄ、Ｓ　ｕｍｍｅ　ｒ　ｓおよびＧ、Ｅ、Ｓｍｉ　ｔｈ。

Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ　５ｔａｔｉｏｎ　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ　Ｎｏ、　１５５５．　Ｔｅｘａｓ　Ａ＆Ｍ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　（１９８７））　した。このように、ここに記載の手順で産生じたポリペプチドは特定の免疫活性、分子量、酵素活性を基準にすると信頼できるＩＥ】−β−ガラクトシダーゼ融合産物となった。

標識期間４時間で異なるＳｆ９細胞形質転換株によって合成したβ−ガラクトシダーゼの相対量を比較したところ、ＩＥＩＦＢ２クローンが最も多量のβ−ガラクトシダーゼを産生ずるということが示された。平均的にみて、ＩＥＩ融合構成（ＩＥＩＦＢ）は非融合ＩＥＩ　（ＩＥＩＮＦＢ）構成よりも多量のβ−ガラクトシダーゼを発現した。また、３９に構成（３９Ｆ　Ｂ）の発現量はＩＥ１構成の場合の発現量よりも少なかった。他の安定形質転換細胞に比べ、一過的ＢＥＶ系でＡｃ　３６０−β−ガラクトシダーゼに感染したＳｆ９細胞において有意に多くのβ−ガラクトシダーゼが標識された。したがって、４時間の標識期間では感染細胞中で合成されるβ−ガラクトシダーゼの割合はもっと多くなる。不思議なことに、４時間の標識期間では継代レベルの高い（Ｐ４１）ＩＥＩＦＢ２細胞の方が継代レベルの低い（Ｐ８）同じ細胞よりも多くの放射性標識β−ガラクトシダーゼを産生じた。

免疫蛍光検鏡を実施してＩＥＩＦＢ２細胞におけるβ−ガラクトシダーゼの細胞内分布を調べた。正常Ｓｆ９細胞は染色されず、Ｓｆ９細胞に感染したＶＬ７２０−β−ガラクトシダーゼは強い細胞質蛍光を呈した。反応はそれほど大きくはないが、ＩＥＩＦＢ２でも同様の蛍光分布が観察された。位相検鏡によってＩＥＩＦＢ２細胞の全体的な形態はＳｆ９細胞の形態と極めて類似しているということが証明された。

ウェスタンブロッティング分析を行い、２４時間、４８時間、７２時間の成長段階で各クローンに蓄積したβ−ガラクトシダーゼの総量を調べた。この結果から、感染から同じ時間経過後における安定形質転換細胞には一過的ＢＥＶ感染細胞にくらべてかなり少量のβ−ガラクトシダーゼしか存在しない（どの場合も感染細胞抽出物の１０分の１しかローディングできなかったことに注意）ということが分かった。いろいろな継代レベルでＩＥＩＦＢ２によって産生されるβ−ガラクトシダーゼの量と、一過性ＢＥＶ３６０−β−ガラクトシダーゼ感染細胞からの抽出物を連続希釈したものとを比較した。ＩＥＩＦＢ２クローンで産生される β−ガラクトシダーゼの量はｐｌＥＩＦＢ　ＤＮＡを使用して導入したＳｆ９細胞で産生される量よりも多かったが、Ａｃ３６０−β−ガラクトシダーゼ−退的ＢＥＶ系に感染したＳｆ９細胞で感染後２０〜２４時間のあいだに産生される量は極めて少なかった。各細胞型について４時間にわたって標識したβ−ガラクトシダーゼの相対量は、β−ガラクトシダーゼバンドを除去し、ゲル切片を可溶化し、放射能を測定することによって判定した。成長開始から４８時間後、ＩＥＩＦＢ２細胞は、一過的ＢＥＶ系の３６０−β−ガラクトシダーゼに４８時間感染させたＳｆ９細胞に総β−ガラクトシダーゼ関連タンパク質の約０．１〜０．５％を含有していた。Ｐ２３からＰ５５の範囲の様々な継代レベルにあるＩＥＩＦＢ２にこれに近い量のβ−ガラクトシダーゼが検出された。最後に、免疫沈降およびウェスタンブロッティングの両方の結果から、一過的ＢＥＶ感染細胞抽出物のβ−ガラクトシダーゼ関連ポリペプチド含有量は、β−ガラクトシダーゼ産物をそのまま使用した場合よりは少ないが、それでもかなり多いということが証明された。このように、一過的ＢＥＶ感染細胞は本発明による安定形質転換細胞よりもかなり多量のβ−ガラクトシダーゼを産生じ、一過的ＢＥＶ系由来の産生物は、感染後比較的速い時期（２４時間）でも比較的多量のおそらく分解産物と思われるものによって汚染さＩＥＩ−β−ガラクトシダーゼ構成で形質転換したＳｆ９細胞におけるβ−ガラクトシダーゼ発現物の遺伝子分析を実施し、外来遺伝子（ここではβ−ガラクトシダーゼ）をコード化する異種ＤＮＡ配列は宿主細胞染色体に安定して組込まれることを証明した。Ｓｆ９細胞または様々なＩＥＩＦＢクローンから全細胞ＤＮＡを抽出し、ＥｃｏＲＩで消化した。ゲル電気泳動、ニトロセルロースフィルタへの送出、例Ｉ乃至■において上述したような放射性標識ｐｌＥＩＦＢプローブによるフィルタの１１イブリツド化によって消化を行った。ＩＥＩＦＢクローン２．４．７から単離したＤＮＡにはプラスミド特異配列が検出されたが、Ｓｆ９細胞やＩＥＩＦＢクローン１．５中には検出されなかった。ｐＩＥＩＦＢＩ異配列のコピー数は、ＩＥＩＦＢクローン４．７に比べてＩＥＩＦＢ２からのＤＮＡの方がかなり多く、プラスミド特異ＤＮＡに含まれる量にほぼ等しかったが、ＩＥＩＦＢ２よりはかなり少なかった。このように、プラスミド特異ＤＮＡの相対量はクローンによって発現するβ−ガラクトシダーゼ活性の相対レベルに対応していた。

上述の結果を見ると、ＰＩ３より前のいくつかの点でｐｌＥＩＦＢ関連配列が欠如することによってＩＥＩＦＢ２（Ｐ４では正であったがＰ２９では負：表２）でもβ−ガラクトシダーゼ活性が失われることが分かる。反対に、ＩＥＩＦＢ２ＤＮＡはＰ５５でも依然として多量のｐｌＥＩＦＢ関連配列を含んでおり、これらの配列はこのクローン内では安定に維持されるということが示された。全細胞ＤＮＡのサザンプロットを見ると、ｐｌＥＩＦＢはＩＥＩＦＢクローン２．４．７に組込まれることが分かる。ＩＥＩＦＢ７におけるプラスミド関連ＤＮＡは初めのうちはオフサイズ制限フラグメントとして発生する。さらに、オフサイズ制限フラグメントはオートラジオグラムの露光時間を長くすればＩＥＩＦＢ２やＩＥＩＦＢ４のＤＮＡ中にも検出できる。しかしながら、後者の２つのクローンにおけるハイブリッド形成パターンからを見ると、これらのクローンは組込んだプラスミドＤＮＡの縦列反復を含むことが分かる。最後に、ＩＥＩＦＢ２からのＤＮＡ中に検出された多重オフサイズ制限フラグメントを見ると、プラスミドはクローンの様々な部位に組込めることが分かる。

Ｓ１ヌクレアーゼ保護アツセイを行い、ＩＥＩＦＢクローンに組込まれたｐ　Ｉ　Ｅ　１．　Ｆ　Ｂ関連配列は転写されるか否かを判定した。継代１８の細胞から全細胞ＲＮＡを抽出し、５″末端標識ｐｌＥＩＮｅｏおよびｐ　Ｉ　Ｅ　１．　ＦＢフラグメントをプローブとして使用してＳ１７ツビンクヲ行った。ｐｌＥＩＮｅｏプローブの１６８塩基対フラグメントはＲＮＡによってＩＥコＦＢクローンの各々から保護された状態となっていたが、非形質転換Ｓｆ９細胞から保護したのはＲＮＡではなかった。このことから、抗生物質耐性Ｎｅｏ−Ｒ遺伝子はＩＥＩＦＢクローンの各々に転写されるということが分かり、これらの遺伝子は抗生物質Ｇ４１８の存在下で生存し得るということを確証できる。さらに、転写は特にＩＥＩプロモータ内で開始されるということも分かる。ｐＩＥＩＦＢプローブの２９３塩基対フラグメントはＲＮＡによってＩＥＩＦＢ２およびＩＥＩＦＢ４から保護されていたが、非形質転換Ｓｆ９細胞やＩＥＩＦＢＩ、ＩＥＩＦＢ５．１ＥＩＦＢ７から保護したのはＲＮＡではなかった。

また、組込まれた配列は転写され、転写は特にＩＥＩプロモータ内で開始されるということも分かる。さらに、異なるＩＥＩＦＢクローンで発現したＲＮＡの相対量はヌクレアーゼ保護の程度によって確認でき、産生されたβ−ガラクトシダーゼ融合タンパク質の量と密接に対応していることが分かった。このことから、様々なＩＥＩＦＢクローンによって産生されたβ−ガラクトシダーゼの相対量における差異は組込まれたプラスミドＤＮＡ配列の全転写レベルの差異によって左右されるということ例１乃至■において詳細に説明した方法を使用して、安定形質転換変異型を構成した。この変異型はヒトプラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）を連続的に発現するものである。例■と同じような方法で、ｐＩＥｌｔＰＡおよびｐＩＥＩＮｅｏでＳｆ９細胞を同時に導入した。

導入後、例！乃至■において上述したように、Ｇ４１８耐性細胞を選択してコロニーを単離した。十分に単離されたコロニーを取り出して増幅した。例■と同様に、形質転換Ｓｆ９細胞クローン中のｔＰＡ関連ポリペプチドの存在を確認するために、細胞をパルス標識し、デタージェント抽出し、５ＤＳ−ＰＡＧＥによって免疫沈降を分析した。いくつかのクローンは、免疫活性および分子量を判定の基準として信頼できるｔＰＡと同一のポリペプチドを発現した。ｐＩＥ１ｔＰＡ形質転換クローンの発現活性は、９４１−　ｔ　ＰＡで２４時間感染させたＳｆ９細胞の発現活性よりもかなり小さかった。９４１−ｔＰＡは、一過的ＢＥＶ系において多角体プロモータがｔＰＡ遺伝子の発現を促進する組換えバキュロウィルスである。（Ｄ、Ｌ、ＪａｒｖｏｓおよびＭ、Ｄ、Ｓｕｍｍｅｒｓ、Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、、　９：２１４−２２３　（１９８９）参照のこと。

）安定形質転換細胞系によるｔＰＡ発現量はＢＥＶ系による発現量よりもかなり少なく、両系のｔＰＡ分泌量は実質的に同一であった。有意なことに、安定形質細胞系において発現したｔＰＡの殆どが分泌され、形質転換細胞は新たに合成したタンパク質を変化させずに維持できるということが示された。一方、外来遺伝子産物を処理する細胞能力に悪影響を及ぼす後期ウィルス作用のため、ＢＥＶ系によって発現したｔＰＡは極めてわずかしか分泌されなかった。

鯉！前初期転移ベクター（ＩＥＴＶ）の詳細な説明図２は前初期転移ベクター（ｐ　Ｉ　ＥＴＶ）を示す図である。ｐ　Ｉ　ＥＴＶはＡｃＮＰＶＤＮＡのＥＣ０ＲＩフラグメントから構成される。０は構成中に破壊される部位を示す。矢印は図示の遺伝子の転写方向を示す。矢印の先端はポリアデニル化部位を示す。斜線を付したブロックは多重クローニング部位の配列（図２の下に示す配列）を示す。

このプラスミドは、Ｅｃｏ　ＲＶ部位において逆配向テ位置スるバキュロウィルスＩＥ１およびＩＥＮ遺伝子からのプロモータを含有する。これは多角体翻訳開始部位（図２）の約１ｏｏｂｐ上流に位置している。Ｅ、ｃｏｌｉ　１ａｃ　Ｚ遺伝子のクローンコピーは活性β−ガラクトシダーゼを酵素的にコード化するものだが、このコピーをＩＥＮプロモータの３′直後に挿入する。ＩＥＮプロモータは前初期類に属するので、このプラスミドは、組換えバキュロウィルスに組込むと感染の前初期相において非感染昆虫細胞でβ−ガラクトシダーゼを発現する。

β−ガラクトシダーゼを発現した昆虫細胞形質転換株すなわちプラスミドＤＮＡ配列を含む組換えウィルスは、色素原基質で保温した時に青色となるため迅速かつ簡単に同定することができる。ＩＥＮ−β−ガラクトシダーゼ遺伝子は３′側でポリアデニル化部位および通常は多角体プロモータの５゛部位に見られる非コード配列と隣接している。ＩＥＮ−β−ガラクトシダーゼ遺伝子の他方の側面は、逆起向で位置しているＩＥＩプロモータである。ＩＥＩ翻訳開始コドンの第１ヌクレオチドの直後に多重クローニング部位（ＭＣＳ）を挿入する。ＭＣＳは、外来遺伝子を挿入するための固有制限エンドヌクレアーゼ部位をいくつか含む。

ｌａｃ　Ｚ遺伝子と同様、外来遺伝子挿入物は非感染昆虫細胞に発現し、組換えウィルスに組込むとウィルス感染の前初期相において発現する。ＭＣ３の３′側の配列は、ＩＥＩポリアデニル化部位を含み、その後ろに多角体プロモータ、まったく変化していない多角体コード配列、通常は多角体遺伝子の３゛部位に見られる３−非コード配列が続いている。

以下に示す３つの理由のため、２つの初期プロモータと隣接する配列が特異的に含まれる。

（１）ポリアデニル化部位は転写物を処理するための信号を出力する。

（２）他の非コード配列は、相同的組換えによってプラスミド配列をウィルスゲノムに挿入できる野生型バキュロウィルスＤＮＡの多角体遺伝子座にプラスミドＤＮＡの目標をおいている。

多角体プロモータおよび多角体コード配列の両方を含むため、組換えウィルスによって吸蔵子孫ウィルスを産生ずることができる。このような特徴から、非吸蔵組換えウィルスに比べて吸蔵ウィルスはｉｎ　ｖｉｖｏで感染しやすく、周囲の非活性状態に対する耐性も大きいので、組換え物を昆虫感染用として理想的なものにすることができる。

図３は、２つの異なる方法で前初期転移ベクタープラスミドＤＮＡ　（ｐ　Ｉ　ＥＴＶ）を使用した形質転換昆虫細胞クローンおよび組換えバキュロウィルスのいずれかの生成を示す図である。

この改良されたプラスミドベクターを使用して昆虫細胞形質転換株や組換えバキュロウィルスを産生ずることができる。このベクターによって、非感染昆虫細胞または感染の前初期感染相のあいだは昆虫細胞や昆虫に外来遺伝子を発現させることができる。この改良されたプラスミドは、組換えウィルス全体で目的の形質転換細胞クローンを迅速かつ簡単に同定するための標識遺伝子を含む。このベクターは、発現させたい外来遺伝子の挿入を容易にするための多重クローニング部位も含む。

これらのベクターを使用して構成された組換えウィルスは、吸蔵子孫ウィルスを産生ずる。この能力は他の方法で計画した組換えバキュロウィルスには見られないも改良されたベクターから産生じた組換えウィルスは多角ｖｉｖｏにおける感染性が高く周囲の非活性状態に対する耐性を有する吸蔵子孫を産生ずることができる。このような性質は、駆虫剤を含む外来遺伝子産物を昆虫に発現させる際には特に重要なものである。

図３において示すように、改良されたプラスミドベクター（ｐ　Ｉ　ＥＴＶ−１）によって、形質転換昆虫細胞クローンまたは組換えバキュロウィルスに所望の遺伝子を発現させることができる。

１、２μｇプラスミドｐ　Ｉ　ＥＴＶ−ＩＤＮＡと１μｇ　ｐＩＥｌ−ＮＥＯＤＮＡとを同時にＳｆ９細胞中に導入。細胞を一晩放置して修復し、低密度で播種。

２、　Ｇ４１８を１μｇ／ｍｌ含有する培地でＮＥＯ遺伝遺伝子含泡細胞択。Ｇ４１８含有培地で２週問おいた後、個々のクローンを取り出して２４のプレートウェルの各ウェルに転移。

３、ウェルにＸ−ｇａｌを添加。青色になったウェルにはＮＥＯ遺伝子およびＩＥＮ−β−ガラクトシダーゼ遺伝子を組込んだ細胞が含まれる。ＮＥＯ陽性かつ β−ガラクトシダーゼ陽性の形質転換株は、Ｉ　ＥＴＶ構成の一部としてβ−ガラクトシダーゼと一緒に導入した目的の遺伝子の構成的遺伝子発現性を有する。

選択した目的の遺伝子を必要量産生し、遺伝子発現およびタンパク質生成の当業者によって周知の標準的な技術を使用して単離。

上述したステップは、例■および■で述べたＮＥＯ選択物で細胞系を産生ずる方法と基本的に同じである。

簡単に言えば、組換えバキュロウィルスは以下のような方法で産生ずる。（詳細な説明については例■を参照のこと。）１、２μｇプラスミドＤＮＡ　（ｐ　Ｉ　ＥＴＶ−１）と１μｇバキュロウィルスＤＮＡとを同時にＳＦ９細胞に導入。３〜５日後に培地を収集して不純物を除去し、溶菌斑アッセイによってウィルスクローンを単離。

２、ウィルス生成。

３、Ｘ−ｇａｌ含有アガロース・オーバーレイによって青色溶菌斑（組換えウィルス）を同定。

４、　組換えウィルス単離。感染後の早い段階で目的の遺伝子を発現する能力について個々の単離物を試験。

この単離物は吸蔵陽性である。

バキュロウィルスベクターおよびバキュロウィルスＤＮＡの構成、特徴付け、単離、精製のための方法および昆虫細胞培養手順は当業者によって周知のものを使用し、ｆｏｒ　Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ　Ｖｅｃｔｏｒｓ　ａｎｄ　Ｉｎ５ｅｃｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ、（Ｓｕｍｍｅｒｓ、　Ｍ、Ｄ、　およびＧ、Ｅ、Ｓｍ１ｔｈ、ＴＡＥＳ　ＢｕｌｌｅｔｉｎＮｏ、　１５５５．　１９８８）に示されている。相同的組換え、溶菌比選択、精製、増殖の手順および導入プロトコルは当業者によって周知のものを使用（同上）する。

細菌形質転換、制限マツピングによるスクリーニング、抽出、細菌形質転換ベクターの構成、細菌プラスミドＤＮＡの精製および他の標準的な分子生化学的手順は、標準的な組換えＤＮＡ技術（Ｍａｎｉａｔｉｓ他、Ｍ。

１ｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　１ａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ、　ＮＹ　（１９８２））を使用して完成させる。

標準的な組換え手順を使用して組換えプラスミドを構成（Ｍａｎｉａｔｉｓ他、　１９８２）Ｌ、さらに組換えバキュロウィルス菌株を生成して増殖（ＳｕｍｍｅｒＳおよびＳｍ１ｔｈ、　１９８７）させる。

一般に、組換えバキュロウィルスは、野生型バキュロウィルスＤＮＡとβ−ガラクトシダーゼ遺伝子含有転移ベクタープラスミドＤＮＡとでＳｆ９細胞を同時に導入することによって得られる。β−ガラクトシダーゼ遺伝子を含む組換えバキュロウィルスは青色溶菌比を産生じ、標準的な溶菌比アッセイ（ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍ１ｔｈ、　１９８７）で簡単に単離できるので、次のステップでは青色ウィルス溶菌比を選択する。ウィルスの青色溶菌比を同定したら組換えバキュロウィルスを単離精製し、当業者によって周知の方法で増殖させる。

ＩＥＮ遺伝子の初期プロモータに隣接するβ−ガラクトシダーゼ遺伝子のクローニングについて簡単に述べる。

このバキュロウィルス転移ベクターは、ＩＥ１遺伝子の初期プロモータを含有することに加えて、多角体遺伝子座で相同的組換えによってウィルス組換え物を産生ずるために必要な、ウィルスと側面を接する配列を含む。９ＭＮ１８７１由来のＳｍａｌ−Ｐｓｔｌフラグメント（Ｓｈａｐｉｒａ他、Ｇｅｎｅ　２５ニア１ −８２（１９８３））をＩＥ１遺伝子の初期プロモータに対する転移ベクター３ ′にクローンする。このｐＭＮ１８７１Ｓｍａｌ−Ｐｓｔｌフラグメントは、β −ガラクトシダーゼ遺伝子をコード化（アミノ酸９から開始して自然終結部位まで進行）する配列を含む。

相同的組換えおよび標準的な溶菌比アッセイ手順を含む選択方法の詳細は当業者間で周知のものだが、これらについてここで簡単に説明しておく。実験にはＩ　ＰＬＢ−Ｓｆ２１　ＡＥ細胞系のＳｆ９クローンを使用する（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒｓ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄｓ：　Ｖａｕｇｈｎ他、　Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　１３：２１３−２１７　（１９７７）から誘導）。個々のＳｆ９細胞培養物を野生型バキュロウィルスＤＮＡとＩＥＴＶ（ＩＥｌ−β−ガラクトシダーゼ）細胞プラスミドＤＮＡとで同時に導入する。

導入後約５日日に成長培地を収集して不純物を除去し、新鮮なＳｆ９細胞単層の溶菌比アッセイに使用する。添加したＩＥＩ配列によってβ−ガラクトシダーゼ活性が損なわれることはないと仮定すると、プラスミドのβ−ガラクトシダーゼ部分は酵素的活性を維持する。色素原基質ｒｘ−ｇａｌｌ　（Ｐｒｏｍｅｇａ− Ｂｉｏｔｅｃｈ）はβ−ガラクトシダーゼと反応させると青色に変色するのだが、溶菌比アッセイの際にこの基質をアガロース・オーバーレイに添加する。組換えウィルス溶菌比は、この青色を基準に同定する。青色溶菌比を単離し、溶菌比を精製し、Ｓｆ９細胞において活動ウィルスストックを２１整し、標準的な方法（Ｓｔｅｐ　Ｇ：　ＳｕｍｍｅｒＳおよびＳｍ１ｔｈ、ＴＡＥＳ　Ｂｕｌｌ、　１５５５　（１９８７）を使用して保存する。

例■ ＩＥＮプロモータ制御下でのβ−ガラクトシダーゼのクローニングおよびＩＥＩプロモータの制御下でのβ−グルコシダーゼのクローニング以下に述べるｐ　Ｉ　ＥＴＶ構成は２種類の異なる遺伝子の発現試験に有益である。例えば、細胞β−グルコシダーゼ（ＧＵＳ）はｐ　Ｉ　ＥＴＶのｐｓｔ１部位にクローンできる。ＧＵＳ遺伝子をＩＥＩプロモータで直接制御する。ＧＵＳはその発現を色素原基質を使用して簡単にモニタリングできるという点でβ−ガラクトシダーゼと類似している。したがって、別の試験遺伝子としてＧＵＳを使用する。ウィルス組換え体や安定細胞系は上述したように産生ずることができる。このため、β−ガラクトシダーゼの発現はＩＥＮプロモータによって制御され、ＧＵＳの発現はＩＥＩプロモータによって制御される。

例ＸＩＥＮプロモータ制御下でのβ−ガラクトシダーゼのクローニングおよびＩＥＩプロモータ制御下での組織プラスミノーゲン活性化因子のクローニング実質的にどんな目的遺伝子でも１）Ｉ　ＥＴＶベクターのＩＥＩプロモータによって制御することができる。遺伝子すなわち目的遺伝子によって研究者らが特異的な関連態様を研究できるような発現に必要な内容に基づいて目的遺伝子を選択する。例えば、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）はｐ　Ｉ　ＥＴＶベクターにクローンすることができる。組換えウィルスの産生や形質転換細胞系の生成のためにβ−ガラクトシダーゼ含有細胞を選択する。選択の際には、上述したような β−ガラクトシダ−ゼ標識系を利用する。タンパク質自体の処理を研究する上でｔＰＡは特に関心が持たれている。本願発明者らは、この実験の結果は安定細胞においてＩＥＩの制御下のｔＰＡを研究して得られた結果と似ているのではないかと考えている。ＩＥＩの制御下の安定細胞系において、ｔＰＡは効率良く処理できる。しかしながら、多角体制御下の非感染細胞ではｔＰＡの発現および処理は最適なものとはならない。

＊＊＊以上、本発明による構成および方法を好ましい実施例について述べてきたが、本発明の概念、趣旨および範囲を逸脱することなく、上述した構成、方法、これらの方法のステップや時間的順序などについて様々な変更や修正が可能であることは当業者によって容易に理解できよう。例えば、化学的および生化学的に関連のある作用物質を上述した作用物質に置き換えても同様の結果を得ることができる。上述した例で概略的に示した方法は、目的遺伝子を連続的に継続して発現する安定形質転換細胞系を産生ずる方法である。これらの例は、形質転換昆虫細胞クローンまたは組換えバキュロウィルスの生成を可能にする新規なベクターについて詳細に説明したものである。本発明は、長期間または一過的に、ヒト、動物、植物のタンパク質産生の可能性を生むものである。これと等価のものや修正して得られるものなどは、添付の請求の範囲に規定される本発明の趣旨、範囲および概念に包含されることは当業者によって理解できよう。

浄書（内容に変更なし）Ｅ■〔−１手　続　補　正　書平成　５年　４月／２日１

Claims

【特許請求の範囲】

１．以下の構成が、適当な読み取り枠部分を残して左から右方向へ配列された、バキュロウイルス転移ベクター：ａ）バキュロウイルス初期遺伝子由来の第１のプロモータ領域を包含するＤＮＡ領域；ｂ）前記第１のプロモータ領域と反対方向に置かれたバキュロウイルス初期遺伝子由来の第２のプロモータ領域を包含するＤＮＡ領域；ｃ）所望の蛋白質をコードするＤＮＡ配列を挿入し得るクローニング制限部位を包含するＤＮＡ領域。
２．前記第１のプロモータ領域をコードするＤＮＡ領域部位の上流部位でかつ枠内に位置する選択可能なマーカー遺伝子をさらにコードするＤＮＡ領域を含み、前記第１のプロモータ領域が前記マーカー遺伝子の発現を指令する、請求の範囲第１項に記載のバキュロウイルス転移ベクター。
３．前記クローニング制限部位が、エレメントｂの前記第２のプロモータ領域の１番目のヌクレオチド部位の下流部位でかつ枠内に位置するマルチクローニングカセット配列を含んでなる、請求の範囲第１項に記載のバキュロウイルス転移ベクター。
４．前記クローニング制限部位でかつ枠内で、前記第２のプロモータ領域部位とともに位置し、所望の蛋白質をコードするＤＮＡ配列をさらに包含し、それによって前記第２のプロモータ領域が、前記所望の蛋白質の発現を指令する、請求の範囲第１項に記載のバキュロウイルス転移ベクター。
５．前記選択可能なマーカー遺伝子が、ベータガラクトシダーゼあるいはベーターグルクロニダーゼもしくはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼをコードするものである、請求の範囲第２項に記載のバキュロウイルス転移ベクター。
６．前記所望の遺伝子が、真核細胞あるいは前核細胞源由来のものである、請求の範囲第４項に記載のバキュロウイルス転移ベクター。
７．前記第１あるいは第２のプロモータ領域が、バキュロウイルス前初期遺伝子に由来するものである、請求の範囲第１項に記載のバキュロウイルス転移ベクター。
８．前記第１あるいは第２のプロモータ領域が、バキュロウイルス前初期遺伝子ＩＥ１あるいはＩＥＮに由来するものである、請求の範囲第１項に記載のバキュロウイルス転移ベクター。
９．前記第１あるいは第２のプロモータ領域が、バキュロウイルス３９ＫプロモータあるいはＨｉｎｄＩＩＩ−Ｋフラグメント後初期遺伝子と組み合わせた前初期遺伝子に由来するものである、請求の範囲第７項に記載のバキュロウイルス転移ベクター。
１０．前記第１あるいは第２のプロモータ領域が、ｈｒ５エンハンサーをさらに含んでなる、請求の範囲第１項に記載のバキュロウイルス転移ベクター。
１１．前記第１あるいは第２のプロモータ領域が、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ　ｃａｌｉｆｏｒｎｉｏａ　ＮＰＶ，Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ　ｎｉ　ＮＰＶ，Ｒａｃｈｉｐｌｕｓｉａ　ｏｕ　ＮＰＶ，Ｏｒｇｙｉａ　ｐｓｕｅｄｏｓｕｇａｔａ　ＮＰＶ，Ｂｏｍｂｙｘ　ｎｏｒｉ　ＮＰＶ，Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ　ｚｅａ　ＮＰＶ，Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｅｘｉｇｕａＮＰＶもしくはＧａｌｌｅｒｉａ　ｍｅｌｌｏｎｅｌｌａ　ＮＰＶから選択される複数のウイルスＤＮＡに由来するものである、請求の範囲第１項に記載のバキュロウイルス転移ベクター。
１２．請求の範囲第１項に記載のバキュロウイルス転移ベクターと、クローニング制限部位に位置する所望の蛋白質をコードするＤＮＡ配列を包含する、形質転換された昆虫細胞クローン。
１３．前記クローンが、安定形質転換された昆虫細胞クローンである、請求の範囲第１２項に記載の形質転換された昆虫細胞クローン。
１４．前記クローンが、鱗翅類（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａｎ）昆虫細胞クローンである、請求の範囲第１２項に記載の形質転換された昆虫細胞クローン。
１５．前記クローンが、Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａｎ虫Ｓｐｏｄｏｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ，Ｂｏｍｂｙｘ　ｍｏｒｉ，Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ　ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ，Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ　ｚｅａ，Ｍａｍｅｓｔｒａ　ｂｒａｓｓｉｃａｓ，Ｅｓｔｉｇｍｅｎｅ　ａｃｒｅもしくはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ　ｎｉに由来するものである、請求の範囲第１４項に記載の形質転換された細胞クローン。
１６．前記クローンが、細胞Ｓｆ９に由来するものである、請求の範囲第１５項に記載の形質転換された細胞クローン。
１７．以下の構成が、適当な読み取り枠部分を残して左から右方向へ配列された、バキュロウイルス転移ベクター：ａ）バキュロウイルス非特異遺伝子部位の５′末端ブランキング配列をコードするバキュロウイルスのウイルスＤＮＡ配列；ｂ）バキュロウイルス初期遺伝子由来の第１のプロモータ領域を包含するＤＮＡ領域；ｃ）前記第１のプロモータ領域と反対方向に置かれたバキュロウイルス初期遺伝子由来の第２のプロモータ領域を包含するＤＮＡ領域；ｄ）所望の蛋白質をコードするＤＮＡ配列を挿入可能なクローニング制限部位を包含するＤＮＡ領域：ｅ）ポリヘドリンプロモータを有するポリヘドリン遺伝子をコードするＤＮＡ領域；およびｆ）バキュロウイルス非特性遺伝子部位の３′ 末端ブランキング配列をコードするバキュロウイルスのウイルスＤＮＡ配列。
１８．前記クローニング制限部位でかつ枠内で前記第２のプロモータ領域部位とともに位置する所望の蛋白質をコードするＤＮＡ配列をさらに包含し、それによって前記第２のプロモータ領域が、前記所望の蛋白質の発現を指令する、請求の範囲第１７項に記載のバキュロウイルス転移ベクター。
１９．請求の範囲第１７項に記載のバキュロウイルス転移ベクターと前記クローニング制限部位に位置して所望の蛋白質をコードするＤＮＡ配列を含んでなる、組換えバキュロウイルス。
２０．安定に核導入された、もしくは適当な読み取り枠部分を残して左から右方向へ以下の構成が配列された、組換えバキュロウイルス転移ベクターによって一時的に感染させた、鱗翅類昆虫細胞を含んでなる、組換えバキュロウイルス発現系：ａ）バキュロウイルス非特異遺伝子部位の５′末端ブランキング配列をコードするバキュロウイルスのウイルスＤＮＡ配列；ｂ）バキュロウイルス初期遺伝子由来の第１のプロモータ領域を包含するＤＮＡ領域；ｃ）前記第１のプロモータ領域と反対方向に置かれたバキュロウイルス初期遺伝子由来の第２のプロモータ領域を包含するＤＮＡ領域；ｄ）所望の蛋白質をコードするｃＤＡＮ配列を挿入可能なクローニング制限部位を包含するＤＮＡ領域；ｅ）前記クローニング制限部位に挿入される所望の蛋白質をコードするＤＮＡ領域；ｆ）ポリヘドリンプロモータを有するポリヘドリン遺伝子をコードするＤＮＡ領域；およびｇ）バキュロウイルス非特異遺伝子部位の３′末端フランキング配列をコードするバキュロウイルスのウイルスＤＮＡ配列。