CN1237209A - 作为病毒载体的松鼠猴疱疹病毒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及已经通过突变和/或缺失特异性的必需和非必需基因进行了遗传修饰的松鼠猴疱疹病毒有关的方法。在病毒基因的复制中需要所述的必需基因,并且对病毒增殖而言也需要所说的必需基因。所说的非必需基因可以表示用于插入异源遗传物质、即治疗基因的位点。

Description

作为病毒载体的松鼠猴疱疹病毒
本发明涉及病毒操作的方法；所用的手段及其产物，该产物在基因治疗方面具有具体的应用、但也不排除其它的应用。
由于近来在人类遗传学方面的进步，目前许多疾病的基因治疗在理论上已成为可能。通过送递起主要作用的遗传物质，首要的目的为把细胞的表型从患病状态转化成正常状态。从细胞培养系统转变到体内实验模型(以及随后转化到临床)的这种技术需要研究以可控制的方式进行有效的基因送递的新方法。当在鉴别对疾病具有特异性的突变方面人类遗传学正以很快的速度发展的同时，对基因送递系统研究的相对缺乏就变得日益明显。目前，可以选择的有脂质体、DNA聚集体或者以病毒为基础的系统。
脂质体在DNA转移方面的效率仍然很低(1)，在病毒颗粒与带电物质(比如聚赖氨酸)之间形成的DNA聚集体增强了DNA的摄取(2)、但要使制备标准化则是非常困难的。逆转录病毒和腺病毒载体在所述载体中插入的异源DNA的大小方面都有一些限制(3,4)，并且在实现长期异源基因表达方面都是不可靠的。逆转录病毒整合到宿主基因组中，但却很难作为高滴度的原种进行生产，并且通过在逆转录过程中引入的错误内在地存在着高的突变率。尽管腺病毒具有很宽的细胞嗜性，但腺病毒诱导细胞介导的免疫应答，并且从长远来看核酸在受感染的细胞中是不稳定的(5)。
疱疹病毒代表着用于载体研究的很有前途的候选者，这在一部分是由于它们具有维持其在细胞中的基因组呈附加形式的能力，该形式受到阻断而不进行复制。它们包装异源DNA序列的能力可能＞50Kbp(6)，并且多数容易在体外进行操作。单纯疱疹病毒衍生的载体可能具有一些与腺病毒同样的问题，这是因为所述群体的大多数已经具有了研究得非常充分的对所述病毒的免疫应答。但是，能够感染人细胞的其它非人的疱疹病毒不应具有这些缺点。
松鼠猴疱疹病毒(herpesvirus saimiri)(HVS)为松鼠猴(Saimiri sciureus)的嗜淋巴细胞rhadinovirus(γ2疱疹病毒)。所述病毒可以按照常规从健康猴子的外周淋巴细胞中分离出来并且不会造成种中明显的疾病。可以检测到病毒的基因组在T细胞中呈附加的形式，并且基因组的转录似乎限制在呈非裂解(“潜伏”)状态的三种基因当中。已经测定了完整的病毒基因组的序列，并且该基因组与人Epstein-Barr病毒(EBV)之间共有许多相同的特征。遗传组织由DNA的唯一特有的编码区组成，其长度为112,930bp，两侧为数量可变的非编码重复序列。所述病毒基因组有76个开放读框，其中有60个与在其它疱疹病毒中发现的基因之间具有相似性(7)。剩余的基因与功能已知的人基因之间享有序列同源性(在蛋白的水平上)，其中包括补体控制蛋白、细胞表面抗原CD59、细胞周期蛋白D以及G蛋白偶联的受体(8,9)。
在病毒不能(A和B)或是能够(C)在某些其它猴子的种中致癌的基础上，已经将病毒划分为性质不同的称作A、B和C的三种毒株。C毒株具有转化人T细胞至在体外进行有限独立生长的能力(10)。这种转化细胞的能力是由于称作STP(11)的基因造成的，该基因在毒株之间的蛋白序列中具有显著的变异性，从而仅有来自C毒株的STP能够转化细胞(12)。对于病毒正常的裂解周期或是附加型维持而言STP并不重要，并且存在着病毒基因组的这一区域天然缺失的突变株；这些毒株是不致癌的。已经构建了缺乏这一基因的病毒株，它表达选择性的药物抗性标记(14)。人们已经使用这些病毒来说明它们能够感染很多种类型的人细胞、高效地转移异源基因并且在缺少选择性压力的条件下维持长期的表达。尽管该病毒能够感染人细胞，但却没有证据表明该病毒能对人造成任何疾病。因此，对于研制对人细胞不进行复制的安全载体而言，很可能该病毒代表着一个很好的起点。但是，人们对HVS如何复制、尤其是对转录控制和DNA复制而言缺乏基本的了解。
在迄今进行了测序的所有疱疹病毒中，HVS与EBV之间具有最大的同源性。但是，编码区明显要小。在这两种病毒之间，不同的基因块似乎密切相关，并且一般说来疱疹病毒的确是这样。由于存在迄今尚未在任何其它的疱疹病毒中鉴定的某些基因，因此HVS有别于其它的疱疹病毒。通过缺失对在培养过程中的生长来说不是必需的基因或者通过缺失必需基因以及从辅助细胞系的反式(in trans)提供，迄今为止已经使得在人类受试者中的每种病毒载体都不能适用。从进行了充分研究的疱疹病毒中外推可以使我们预测到某些HVS膜蛋白的缺失将会防止细胞-细胞的扩散(spread)。而且，控制必需转录开关[比如腺病毒中的E1A(17)以及单纯疱疹病毒中的IE175(18)]的蛋白的失活将不可避免地使上述病毒不适当地进行复制。因此，本申请的主要目的集中在构建突变病毒上，所述的病毒不能激活早期和晚期的基因表达。靶基因为两种转录控制蛋白，它们是ORF50和57的产物，并且可能对组织培养过程中的生长来说是必需的。
出版的数据(14)表明毒株11/S4衍生的病毒载体仅能在某些细胞系中限制性地生长。因此，应当仅仅在支持病毒复制的细胞系中必需要缺失、阻断或操作转录控制蛋白基因。但是，为了生产出人们可以大胆使用的针对基因送递的病毒，人们可能希望生产出或者不能生产或者生产无功能性转录控制蛋白的病毒。
本申请的另一个主要目的为鉴别出对生长而言是非必需的基因、然后缺失这些基因的至少一个基因的至少一部分，以便促进异源的遗传物质插入上述病毒的基因组中。
目前存在一种针对与松鼠猴疱疹病毒重组而设计的质粒，其中把质粒设计为在预定的位置处将异源的遗传物质插入病毒基因组中，该位置为在DNA的唯一特有的编码区与疱疹病毒DNA的非编码重复序列之间的接点。但是，就可以被克隆到病毒基因组中而言，该质粒相对是不可变通的。例如，几乎不存在合适的限制位点，因而该质粒不适于在商业上使用。因此，在本申请中我们的目的在于鉴别出对生长来说不是必需的基因，以便缺失所说基因中的至少一个基因的至少一部分，从而为插入大量的任意选择的异源遗传物质提供人造的克隆位点。当打算向病毒基因组中插入大量的异源遗传物质时，显而易见将会最为有利地进行所说的非必需基因的缺失以及随后异源遗传物质的插入。
在本申请的另一方面，我们的目的在于提供松鼠猴疱疹病毒，所述的松鼠猴疱疹病毒已被操作以便缺失至少一个转录控制基因的至少一部分并且理想地还缺失至少一个编码非必需生长蛋白的基因的至少一部分。我们支持这一方面，这是因为病毒基因组操作的数量越多，所操作的病毒的安全性就越高。考虑到这一事实，我们也支持松鼠猴疱疹病毒基因组的操作、以便造成STP基因部分或全部的缺失。即使在打算使用毒株A或B的情况下，我们也支持后一操作，这是因为我们考虑到上述操作可能会提高得到的操作的病毒的安全性。
从以上显而易见需要提供一种合适的基因送递系统以便可以进行遗传物质的胞内送递，其中安全地进行着所述的送递并因而至少对靶细胞不产生任何细胞病理学的结果。
因此，本发明的第一个目的为提供一种安全并且可以控制的基因送递系统。
而且，考虑到可能被送递的遗传物质的数量，本发明的另一个目的为提供一种适于接纳大量遗传物质(比如4Kbp以及多达20Kbp并且理想的是＞50Kbp的DNA序列)的基因送递系统。
本发明更进一步的目的在于提供一种基因送递系统，它可以使至少一种给定基因或其部分选择性重组到基因送递系统中、以便至少将所说的被选择的基因或其部分送递到靶细胞中。
本发明最宽的情况涉及提供不能激活早期和晚期基因表达的突变病毒。换句话说，本发明涉及提供一种不能在靶细胞、更优选不能在人细胞中复制的病毒和/或提供适于接纳相当大量的异源遗传物质的突变病毒。
因此，根据本发明的第一方面提供了一种松鼠猴疱疹病毒，该病毒在涉及病毒复制的基因中至少有一处突变，借此，突变阻止了在人类靶细胞中的复制。
在本发明的一个优选的实施方案中，所说的基因为转录控制蛋白基因ORF50和/或ORF57中的任意一种或两种。
更为优选的所说的突变包括所说的一种或两种基因的部分或完全的缺失。
在本发明更进一步的实施方案中，所说的松鼠猴疱疹病毒为STP基因缺乏或者发生突变的毒株，从而该病毒不能转化靶细胞并且因此不能产生致癌表型。
所说的病毒优选进一步进行操作，以便缺失掉编码非必需生长蛋白的至少一个基因的至少一部分。理想的所说的基因为ORF4、ORF14、ORF15、ORF16或ORF51。
在本发明另一个更为优选的实施方案中，给所说的病毒提供插入位点，其中可以把所选择的异源物质插入该位点。优选操作病毒，从而插入发生在缺失位点之内、附近或者远离缺失位点处，其中在缺失位点上缺失了非必需生长蛋白基因的至少一部分；或者插入发生在至少一个非编码重复序列之中或附近，并且更优选发生在DNA唯一特有的编码区和非编码重复序列之间的接点处。仍然更为优选的是，操作所说的病毒，从而仅有所说的非编码重复序列中的一个序列存在于唯一特有的编码区的一个或两个末端处。
在插入发生在所说的缺失位点之中或附近的情况下，所说的缺失涉及一个或多个下列基因的部分或整个的缺失：ORF4、ORF14、ORF15、ORF16或ORF51。
根据本发明的再一个方面提供了一种在编码非必需生长蛋白的至少一个基因中至少有一处突变的松鼠猴疱疹病毒。
在本发明一个优选的实施方案中，所说的基因为一个或多个的ORF4、ORF14、ORF15、ORF16或ORF51。
更为优选的是，所说的突变包括一个或多个所说基因的部分或完全的缺失。
在本发明一个更加优选的实施方案中，所说的松鼠猴疱疹病毒为STP基因缺乏或者发生突变的毒株，以便所说的病毒不能转化靶细胞并从而不能产生致癌表型。
优选地进一步操作所说的病毒，以便缺失与病毒复制有关的至少一个基因的至少一部分。所说的基因理想的为ORF50和/或ORF57。
在本发明一个更为优选的实施方案中，给所说的病毒提供可以使所选择的异源物质插入的插入位点。插入位点优选位于一个或多个所说基因的所说缺失位点之中、附近或者远离所说的缺失位点。
根据本发明的另一方面提供了一种松鼠猴疱疹病毒，该病毒或者在其中具有或者适于在其中插入靠近缺失位点的至少一个事先选择的异源遗传片段，所说的缺失位点表示编码非必需生长蛋白的至少一个基因的部分或完全缺失的位点。
在本发明一个优选的实施方案中，还给所说的病毒提供在与病毒复制有关的基因中的突变，从而防止在将所说的病毒插入靶细胞之后病毒发生复制。
更为优选的是，所说的病毒为STP基因缺乏或者发生突变的毒株，以便所说的病毒不能转化靶细胞并从而不能产生致癌表型。
根据本发明的另一方面提供了一种松鼠猴疱疹病毒，该病毒在单个的编码区和非编码区的接点处或者在其中具有或者适于在其中插入至少一个事先选择的异源遗传片段，而且已经进一步操作了所说的病毒、以便在单个的编码区的一端或两端仅仅存在数量有所减少的非编码重复序列，并且本发明还提供了在与病毒复制有关的基因中的突变、以便防止在将所说的病毒插入靶细胞之后病毒发生复制。
所说的非编码重复序列的数量优选为5个或者更少、并且理想的为1个。
根据本发明的另一方面提供了一种转移载体，该载体能使异源遗传片段插入松鼠猴疱疹病毒DNA中。
所说的插入优选涉及前述插入方法中的任意一种或多种。在本发明这一方面的一个优选实施方案中，所说的载体包括多个特有的限制位点，更优选有三个单一限制位点。此外，所说的载体包括β-半乳糖苷酶基因，该基因优选处于HCMV IE3启动子的控制之下。所说的载体更优选是从pRUNeo(16)得到的，并且理想的是prupoly。
根据本发明的另一方面提供了一种松鼠猴疱疹病毒，该病毒在与病毒复制有关的基因中至少有一处突变、而该突变可以防止病毒在靶细胞中的复制，并且该病毒在编码非必需生长蛋白的基因中至少还有一处突变。
在本发明一个优选的实施方案中，所说的松鼠猴疱疹病毒在STP基因中还发生了突变。
所说的突变优选包括所说基因的部分或者完全的缺失。
与病毒复制有关的所说的基因优选还包括转录控制蛋白基因ORF50和/或ORF57的一种或两种；并且所说的编码非必需生长蛋白的基因为下列基因的一种或多种：ORF4、ORF14、ORF15、ORF16或ORF51。
从以上显而易见本发明优选的病毒包括遗传突变的多种有利的组合，所说的组合可以使病毒不能或者能够具有某种能力，从而使得该病毒安全并且可以控制。通过术语使之不能，我们是指防止病毒在靶细胞中复制；而通过术语使之能够，我们是指接纳相当大量的异源遗传物质插入的能力。更为理想的是，所说的有利的组合还提供了不能转化靶细胞并因而不能产生致癌表型的病毒。
根据本发明的另一方面提供了一种至少包括松鼠猴疱疹病毒基因治疗载体的一部分的靶细胞。
根据本发明的另一方面提供了一种用如前所述的松鼠猴疱疹病毒载体转化的细胞。
根据本发明的另一方面提供了一种向靶细胞送递所选择的异源遗传物质的方法，该方法包括在有利于用所说病毒感染所说细胞的条件下至少将所说的靶细胞暴露到至少包括所说事先选择的异源物质的松鼠猴疱疹病毒中。
现在仅参考下面的物质和方法、通过实施例来描述本发明的实施方案。病毒突变株的分离和特征确定
所操作的病毒为毒株11的修饰形式，它不含ORF1(STP基因)。尽管我们通常选择“野生型”毒株，但是载体将不可避免地必须以已使所述基因除去的病毒为基础。修饰过的毒株可能会使必需基因缺失，并因而可以生成辅助细胞系(以后将进行详述)。它们是通过用合适的HVS基因组克隆与pSV2Neo的共转染来确立的，并且分离出的细胞克隆是G418抗性的。首先针对是否存在合适的基因序列通过PCR筛选这些细胞克隆，并且针对是否存在以反式提供的基因的RNA转录物通过RT-PCR来分析那些测试呈阳性的克隆。扩增合适的克隆并将其用来与病毒DNA和缺失构建体共转染。测试表达β-半乳糖苷酶(比如通过X-半乳糖的代谢测得的)的病毒在辅助细胞和正常的Vero细胞中、以及随后在不同谱系的人细胞类型中复制的能力。出版的数据表明毒株11衍生的载体能够在B细胞(Raji)和人胎成纤维细胞(HFF)起源的某些细胞系中限制性地生长。Raji细胞(EBV转化的)并不足以代表正常的人细胞，因此我们评价了这些病毒在从取自健康志愿者的新鲜的成人外周血中分离的淋巴样细胞以及在可以从商业来源得到的初级人胚胎成纤维细胞和上皮细胞中的生长特性。通过β-半乳糖苷酶的表达(感染和细胞-细胞扩散的证据)、附加DNA的存在以及由RT-PCR检测的“典型的”早期和晚期基因的表达来评价复制。通过在几代细胞中测量能表达报道基因的细胞的百分数并且分析附加型病毒DNA的存在(19)来评价这些细胞中基因组的持久性。具有缺失基因的重组病毒的生产
通过在4℃、30,000g下离心2小时来收获胞外、细胞释放型病毒。将半纯化的病毒小片重新悬浮在10mM Tris/HCl、1mM EDTA(TE)pH8.0中。加入1％w∶v的SDS和100μg/ml的蛋白酶K。在50℃下温育样品16小时，然后用50∶50(w∶v)苯酚/氯仿混合物处理(提取5次)。除去水相，用0.2M的乙酸钠调节到pH5.0，并加入3倍体积的纯乙醇。从试管中收集DNA沉淀物、空气干燥，然后重新溶解在体积适宜的TE缓冲液中。通过在分光光度计中、在254nm下样品的吸光度来测量DNA浓缩物。使用DOTAP试剂将纯化的病毒DNA与相应的质粒构建体共转染到OMK(ATCC CRL1556)细胞中。24小时后除去培养基，并用含有2％热失活的FCS的培养基替换之。然后观察单细胞层，直至普遍的致细胞病变效应的发展明显为止。在这一阶段，收获细胞释放型病毒并用于感染新的分会合的单层OMK细胞。24小时后用处于不含酚红的DMEM/2％热失活的FCS中的1％的琼脂铺层铺在所述细胞上。48小时后，加入X-半乳糖至最终浓度为100μg/ml，以便鉴别出正在表达β半乳糖苷酶的病毒噬菌斑。然后挑选出蓝色的噬菌斑，并使其进一步进行2个循环的噬菌斑纯化，或者直至病毒的群体均一为止。然后使用PCR和Southern印迹来测试这些病毒正确进行同源重组的状况。含有异源基因的重组病毒的生产
将如上所述制得的纯化的病毒DNA与含有合适的异源基因的质粒载体(pJG101-105和/或pAW201,202,203,205,207或209)共转染到OMK细胞中，其中所述的异源基因替换了β-半乳糖苷酶序列、从而重组到非必需或必需基因或基因间隔区中。选择出不再表达β半乳糖苷酶的重组病毒，并以与如前所述的同样的方式纯化噬菌斑。在体外用HVS感染细胞
通过低感染复数的OMK或Vero细胞生产出高滴度的病毒原种。在OMK或Vero细胞中确定细胞释放型病毒的滴度，并在-70℃下储存。通过在不同的感染复数下用β-半乳糖苷酶的表达病毒感染数目确定的细胞来评价以100％的效率感染任何特异性的细胞类型所需的病毒数量。通过在体积最小的培养基中加入病毒来感染贴壁细胞(adherent cell)，并且在37℃、轻微的搅拌下温育细胞2小时。然后除去该培养基并用数量适当的新鲜培养基替换。收获非贴壁细胞、对细胞计数并且把介于106与107之间的细胞重新悬浮在浓度适当的每毫升的病毒中，以实现100％的感染效率。在轻微的搅拌下温育2小时后，以与贴壁细胞所述同样的方式来处理上述细胞。辅助细胞系的生产
在自身或者在异源5’和3’控制序列的控制下，在合适的质粒载体中克隆将要在稳定的细胞系中表达的呈反式的病毒基因。该质粒也可以含有选择性标记，例如赋予了真核细胞对药物G418的抗性的新霉素磷酸转移酶基因。另一方面，可以在单独的质粒上、并且再在异源真核控制序列(例如SV40早期启动子和适宜的聚腺苷酸化信号)的控制下提供该基因。在所有的情况下，如此确立细胞系。将5×105个细胞(或者足以得到40-50％会合)、比如Vero或OMK平铺在直径为10cm的含有10ml DMEM/10％胎牛血清的组织培养皿上，并且在37℃下在空气中含有5％CO2的增湿的气氛中温育12-18小时。在这一阶段之后，使用如前所述的用于转染病毒DNA的DOTAP试剂将2μg的质粒转染到细胞中。所述质粒可以是含有合适的基因和选择性标记基因的单个质粒，或者可以是2μg的每种质粒的混合物。然后在37℃下、在空气中含有5％CO2的增湿的气氛中再温育细胞48小时。在这一阶段中，通过除去培养基、用2×10ml磷酸盐缓冲盐水(PBS，生命技术公司，cat no.20012)洗涤并用溶于PBS的2ml胰蛋白酶(0.25％w∶v)/EDTA(0.2％w∶v)处理，从塑料平皿中分离出目前会合的单细胞层。然后将新鲜的培养基加入细胞悬浮液中，计算出细胞的数目，并将其平铺到96孔板中以便在有限稀释下克隆或者在每个10cm的平皿中以104个细胞进行分配。培养基(DMEM/10％FCS)补充有浓度适当的G418，该浓度足以造成非转染细胞100％的死亡。该浓度同时取决于细胞通道号和细胞类型。对处于通道150的Vero细胞而言，典型的浓度为800μg/ml。然后在前述的生长环境中替换细胞并且在一定的时间间隔内观察细胞的杀灭。取决于细胞死亡/生长速率，大约每隔3-4天更换培养基。在7-14天之后，细胞的单个克隆已经长出，然后挑选出所述克隆，培养到合适的数目并且测定转染的HVS基因的表达。这可以通过使用免疫荧光、Northern印迹或RT-PCR、使用本领域所熟知的方法来实现。评价病毒的安全性
针对立即早期基因、早期基因和晚期基因的选择、通过使用RT-PCR测量病毒基因的表达来评价修饰的病毒复制的能力。此外，温育来自转导细胞的组织培养上清液与指示OMK细胞，以便检测出任何可能的感染病毒的释放。3处插入的重组载体
该策略生产出重组载体，从而使得在HVSLDNA的3’末端处可以插入异源基因。pSJNeo(来自R.Grassman)含有9.4kb的HVSDNA，而所述DNA含有H-L DNA接头。把位于第一个H重复单位之中35bp处的SmaⅠ切割位点改变为SalⅠ位点，从而可以插入neo基因。但是，该载体是一种大的、低拷贝载体，因此它不适于插入大的异源基因。选择表达载体pSA91来制备新的重组载体。该载体以高拷贝数生产，并且含有hCMV IE启动子以便推动基因的表达。为了生产出可以进行重组的有效的表达载体，从pSIneo中切掉HVS DNA序列，并使用接头连接体将该序列插入位于5’端至启动子之间的特有的NarⅠ位点。该载体命名为pJG101。ORF06缺失
ORF06(位于bp12584和15967之间)编码主导DNA结合蛋白，因此该基因的缺失使得病毒复制缺损。为了制备缺失了ORF06的重组盒，从pSS54中切除侧翼DNA区，所述的pSS54含有HVS DNA的从11507至18013的区域(KpnlF片段)。切除掉Kpnl(11507)-Haell(12613)的1106bp的片段5’至ORF06编码区以及SphⅠ(15258)-BglⅢ(16407)的1149bp的片段，并通过合成的寡聚体将它们连接在一起。如下所示，该寡聚体还含有EcoRⅠ和BamHⅠ限制位点，从而可以插入异源基因。必须保持ORF06的3’末端的部分，这是因为它含有ORF07的启动子。把连接的KpnⅠ-BgⅢ片段插入pBluescript KS克隆载体中，以便生成重组盒pJG102。
连接所述片段的寡聚体的序列为：TGAATTCGGATCCGCATGCGCGACTTAAGCCTAGGCHaeⅢ EcoRⅠBamⅢSphⅠORF06的构建以生成辅助细胞系
为了生产出缺失了ORF06编码区的HVS，必须提供反式的ORF06基因产物。这是通过生成稳定的辅助细胞系来实现的。从pSS54中切除掉ORF06基因，作为HaeⅡ(12613)-PstⅠ(15998)片段。使用合成的寡聚体(如下所示)来精确地制备出ORF06编码区的起点并且可以插入到表达载体pSVK3(Pharmacia)中。在将合成的寡聚体连接到ORF06的5’端之后，把EcoRⅠ-PsⅠ片段连接到pSVK3上以生成pJG103。这就推动了从SV40早期启动子的表达，而另一种启动子的使用也使得在辅助细胞系中的重组事件减小到最低限度。
寡聚体的序列为：AATTCATGGCAACGAAGACAGCGCAACCTAGCGCGTACCGTTGCTTCTGTCGCGTTGGATEcoRⅠ ORF06         起点HaeⅡORF51的缺失
ORF51编码HVS的潜在的受体结合膜蛋白，因此该基因的缺失导致病毒不具有感染性。ORF51位于HVS基因组的72626和73432之间。为了生产出针对重组盒的ORF51侧翼序列，从pKK104中切除掉BamHⅠ(71692)-HpaⅠ(72602)的910bp的片段5’至ORF51编码区以及Bstl107I(73395)-PstⅠ(73998)的601bp的片段3’至ORF51，其中pKK104含有HVS EcoRⅠ D的63020至77574的片段，并且通过合成的寡聚体将它们连接在一起。这些寡聚体还含有EcoRⅠ和BamHⅠ限制位点以便能够插入异源基因，此外对ORF52来说需要保持polyA的序列。在连接后，将BamHⅠ-PstⅠ片段连接到克隆载体pSP73(Promega)上，以便生成重组盒pJG104。
合成的寡聚体的序列为：AACGAATTCGGATCCTTAATAATAATGAGCTGTATTGCTTAAGCCTAGGAATTATTATTACTCGACATHpaⅠEcoRⅠBamHⅠORF52polyABstl107I构建ORF51以生成辅助细胞系
从pKK104中作为HpaⅠ(72602)-StuⅠ(73495)的806bp的片段切取ORF51基因，并将该片段克隆到SV40表达载体pSVK3中。将EcoRⅠ接头连接到ORF51的5’和3’末端，以便促进该克隆的反应。得到的ORF51表达载体命名为pJG105。ORF57的缺失
ORF57编码与HSV-1UL54具有同源性的转录激活物，其中的HSV-1UL54为一种必需的立即早期基因。为了生成含有完全缺失了ORF57的病毒，将靠近ORF57编码区的区域扩增，以便可以与病毒DNA发生同源重组。已经设计出的引物如下：
         5’-d GGC GAA TTC GTC TAT AAC TGA CTG GGT TGCTG,5’-d GCC CTG CAG GCA GTT ACT CAC CAT AGC TTG AG,5’-dGCC CTG CAG CAA GTG TCC AAG CTC TAC TTG TGC,5’-d GGG GCATCC CTA TTG ATG TGC CAA GCA ATA GGG T,它们分别扩增了HVS的两个区域、即77850至78260以及79530至80120，已经把合适的限制位点插入引物中以协助克隆。使用上述片段以及事先已用EcoRⅠ和SphⅠ消化的pUC18进行三重连接，以生成pAW101。然后使用PstⅠ和SalⅠ使该质粒线性化，并且在hCMV IE启动子的控制下将该质粒与lacZ基因相连以生成PdeltaORF57，而PdeltaORF57已被保藏在国家工业与海洋细菌有限收藏所(NCIMB)中，该保藏机构位于23St Machan大道，Aberdeen,AB21RY；保藏号为40894。
为了生成辅助细胞系，使用PCR扩增含有ORF57的编码区的片段，将该片段与T载体、pCRⅡ连接以生成pAW103。然后在HCMV IE启动子的控制下，将其克隆到质粒pBKCMV中以生成ORF57，其中pBKCMVORF57已被保藏在如上所述的NCIMB中，保藏号为40895。HVS插入失活的构建体
插入失活是防止基因起作用的一种不太优选的方法，这是因为它依赖于在合适基因的编码序列中指示物β-半乳糖苷酶基因的放入、而不除去开放读框的任何部分。存在着重组事件发生的危险性，它导致β-半乳糖序列的缺失并且没有连接能使所述基因再活化的开放读框。
为了生成插入失活的基因，构建转移载体，其中在I.E.CMV启动子的控制下通过把lac Z基因插入ORF的5’编码区来失活各个独立的基因。然后通过质粒和HVS病毒DNA的共转染，将该失活的基因插入到病毒基因组中，以便得到重组病毒，然后通过噬菌斑纯化所述病毒。质粒的构建ORF4/补体控制蛋白
用BglⅡ和PstⅠ消化pJC81-KpnB，以便生成1152bp的含有ORF4的编码区的片段。将该片段与pUC18相连、以生成pUCORF4。用BglⅡ使该质粒线性化，用T4DNA聚合酶钝化末端，并在IE CMV启动子的控制下与含有lac Z基因的平端片段连接以生成pAW201。ORF14/小的IE基因
用EcoRⅠ和PstⅠ消化pACYC184-EcoF，以便生成3189bp的含有ORF14的编码区的片段。将该片段与pUC18相连、以生成pUCORF14。用KpnⅠ使该质粒线性化，用T4DNA聚合酶钝化末端，并在IE CMV启动子的控制下与含有1ac Z基因的平端片段连接以生成pAW202。ORF 5/CD59同系物
用SstⅠ和PstⅠ消化pACYC184-EcoF，以便生成2415bp的含有ORF15的编码区的片段。将该片段与pUC18相连、以生成pUCORF15。用MunⅠ使该质粒线性化，用T4DNA聚合酶钝化末端，并在IE CMV启动子的控制下与含有lac Z基因的平端片段连接以生成pAW203。ORF50/主要的转录激活剂
用BglⅡ和PstⅠ消化pACYC184-EcoD，以便生成4149bp的含有ORF50的编码区的片段。将该片段与pUC18相连、以生成pAW204。用PstⅠ消化该质粒，并在IE CMV启动子的控制下与含有lacZ基因的DNA片段连接以生成PdeltaORF50，它已保藏在如上所述的NCIMB中、保藏号为40892。使用保藏在如上所述的NCIMB中、保藏号为40893的PUCPST来构建辅助细胞系，其中PUCPST为含有同时包括了所述基因两个外显子的HVS DNA的PstⅠ片段的pUC18。ORF57/IE基因
用BglⅡ使pACYC184-EcoJ线性化，用T4DNA聚合酶钝化末端，并在IECMV启动子的控制下与含有lac Z基因的平端片段连接以生成pAW206。
为了构建辅助细胞系，使用下列引物通过PCR扩增ORF57的编码序列：                                5’-dCGC GGT ACC CACATG TCT ATA ATC GAC TGG GTT,5’-d CGG GGT ACC CTG AGT CATTAG TAG TAG CTC ATG.把该PCR片段连接到TA克隆载体pCRⅡ上并命名为pAW207。
ORF16/编程性细胞死亡抑制基因
由于缺乏方便的限制位点，使用下列引物通过PCR扩增所述的编码区：                    5’-d GCC GAA TCC CAC AGT GCCAAG CTT GCC AGT T,5’-d CGC CTG CAG GGT GTA TAA CTG AGTGTT ACA GC,5’-d GGG CTG CAG GCT GTA CAC TCA GTT ATA CACC,5’d-CCC GCA TGC ACT TGA TCC AGG ACA TGC TTC.其中在5’编码区中掺入了PstⅠ位点以便接下来可以进行克隆。将该PCR产物与pUC18相连、以便得到pAW208。用PstⅠ使该质粒线性化，并且在IE CMV启动子的控制下与lacZ基因连接以生成pAW2-09。用pAW208构建辅助细胞。
                            参考文献
1．Ledley,F.D.(1994)非病毒基因疗法《当前生物技术观点》5,
   626-636.
2．Wagner,E.,Cotton,M.,Foisner,R.,与Birnsteil,M.,(1991)
   运铁蛋白-聚阳离子复合物：聚阳离子对复合物的结构以及DNA
   向细胞送递的影响《美国科学院学报》88:4255-4259.
3．Rich,D.P.,Couture,L.A.,Cardoza,L.M.Guiggio,V.M.,Armen
   tano,D.,Espino,P.C.,Hehir,K.,Welsh,M.J.,Smith,A.E.与
   Gregory,R.J.(1993)用于囊性纤维化的基因治疗的重组腺病毒
   的研究和分析《人类基因治疗》4:461-476.
4．Gordon,E.M.与Anderson,W.F.(1994)使用逆转录病毒载体进   行基因治疗《当前生物技术观点》5:611-616.5．Crystal,R.G.,McElvaney,N.G.,Rosenfeld,M.A.,Chu,C.,Mastrangeli,A.,Hay,J.G.,Brody,S.L.,Jaffe,H.A.,Eissa,N.T.与Danel,C.(1994)将含有人CFTR cDNA的腺病毒向患有囊性纤维化的个体的呼吸道给药《自然遗传学》8:42-51.6．Locker,H.与Frenkel,N.(1979)在连续通过的1型单纯疱疹病毒中所含的缺损基因组的结构和起源(Justin)《病毒学杂志》29:1065-1077.7．Davison,A.J.(1993)疱疹病毒基因《医疗病毒学回顾》3:237-248．Albrecht,J-C.,Nicholas,J.,Biller,D.,Cameron,K.R.,Biesinger,B.,Newman,C.,Wittmann,S.,Craxton,M.A.,Coleman,H.,Fleckenstein,B.与Honess,R.W.(1992)松鼠猴基因组的一级结构《病毒学杂志》66:5047-5048.9．Jung,J.U.,Stager,M.,与Desrosiers,R.C.(1994)病毒编码的细胞周期蛋白《分子细胞生物学》14:7235-7244.10．Biesinger,B.,Muller-Fleckenstein,I.,Simmer,B.,Lang,
G.,Wittmann,S.,Platzer,E.,Desrosiers,R.C.与
Fleckenstein,B(1992)由松鼠猴疱疹病毒转化的人T淋巴细
胞的稳定生长《美国科学院学报》89:3116-3119.11．Murthy,S.C.S.,Trimble,J.J,与Desrosiers,R.C.(1989)松
鼠猴疱疹病毒的缺失突变体限定了转化所必需的开放读框《病
毒学杂志》63:3307-3314.12．Grassmann,R.,Fleckenstein B.与Desrosiers,R.C.(1994)
人T淋巴细胞的病毒的转化《癌症研究进展》63:211-244.13．Desroisers,R.C.,Burghoff,R.L.Bakker,A.与Kamine,
J.(1984)处于复制感受态的松鼠猴疱疹病毒的缺失突变体的
构建《病毒学杂志》49:343-348.14．Simmer,B.,Alt,M.,Buckreus,I.,Berthold,S.,Fleckenstei
n,B.,Platzer,E.与Grassmann,R.(1991)选择性松鼠猴疱疹病
毒在不同的人的造血细胞系和上皮细胞系中的持久性《基因病
毒学杂志》72:1953-1958.15．Chang,Y.,Cesarman,E.,Pessin,M.S.,Lee,F.,Culpepper,J.,
Knowles,D.M.与Moore,P.S.(1994)在与AIDS有关的卡波西肉
瘤中的疱疹病毒一类的DNA序列的鉴定《科学》266:1865-1871.16．Grassmann,R.与Fleckenstein,B.(1989)选择性重组的松鼠
猴疱疹病毒能够在人T-细胞系中持续《病毒学杂志》
63:1818-1821.17．Berkner,K.L.(1988)用于表达异源基因的腺病毒载体的研究《生物技术》6,616-629.18．Glorioso,J.,Goins,W.F.,与Fink,D.J.(1992)基于单纯疱疹
病毒的载体Semin.Virol.3:265-276.19．Gardella,T.,Medveczky,P.,Sairenji,T.与Mulder,C.(1984)
通过凝胶电泳检测哺乳动物细胞中的环形和线性疱疹病毒DNA
分子《病毒学杂志》50:248-254.

Claims (26)

1．一种松鼠猴疱疹病毒，该病毒在编码病毒复制所需蛋白的至少一个基因中至少有一处突变，其中所说的突变防止了病毒在人细胞中的复制。
2．一种根据权利要求1的松鼠猴疱疹病毒，其中所说的突变的基因为ORF50和/或ORF57。
3．一种根据前述任一权利要求的松鼠猴疱疹病毒，其中所说的病毒在转化基因、比如STP基因中还有突变。
4．一种根据前述任一权利要求的松鼠猴疱疹病毒，其中所说的病毒在选自包括ORF4、ORF14、ORF15、ORF16或ORF51的组中的至少一个基因中额外地进行了突变。
5．一种根据前述任一权利要求的松鼠猴疱疹病毒，其中所说的突变为所说基因的完全或者部分的缺失。
6．一种根据前述任一权利要求的松鼠猴疱疹病毒，其中给所说的病毒提供了用于插入异源遗传物质的插入位点。
7．一种根据权利要求6的松鼠猴疱疹病毒，其中所说的位点位于至少一个非编码重复序列之中或附近，并且优选位于特有的编码区和非编码序列之间的接点处。
8．一种根据权利要求6或7的松鼠猴疱疹病毒，当取决于权利要求5时，其中在所说缺失的位点处提供所说的插入位点。
9．一种根据权利要求6的松鼠猴疱疹病毒，其中在选自包括ORF4、ORF14、ORF15、ORF16或ORF51的组中的至少一个基因之中或附近提供插入位点。
10．一种松鼠猴疱疹病毒，该病毒在编码非必需蛋白的至少一个基因中至少有一处突变。
11．一种根据权利要求10的松鼠猴疱疹病毒，其中所说的基因至少为下列基因中的一种：ORF4、ORF14、ORF15、ORF16或ORF51。
12．一种根据权利要求10或11的松鼠猴疱疹病毒，其中所说的突变为所说基因的完全或者部分的缺失。
13．一种根据权利要求10-12的松鼠猴疱疹病毒，其中所说的病毒在转化基因、比如STP基因中还有突变。
14．一种根据权利要求10-13的松鼠猴疱疹病毒，其中进一步操作所说的病毒，从而突变和/或缺失编码ORF50和/或ORF57的基因的至少一部分。
15．一种根据权利要求10-14的松鼠猴疱疹病毒，其中给所说的病毒提供可以将异源DNA插入其中的插入位点。
16．一种松鼠猴疱疹病毒，该病毒或者在其中具有或者适于在其中插入靠近缺失位点的至少一个事先选择的异源DNA片段，所说的位点表示编码非必需蛋白的至少一个基因的部分或完全缺失的位点。
17．一种根据权利要求16的松鼠猴疱疹病毒，其中额外地突变或者缺失所说病毒的编码病毒复制所需蛋白的基因。
18．一种根据权利要求16或17的松鼠猴疱疹病毒，其中所说的病毒在转化基因、比如STP基因中还有突变。
19．一种松鼠猴疱疹病毒，该病毒在单个的编码区和非编码区的接点处或者在其中具有或者适于在其中插入至少一个事先选择的异源DNA片段；而且其中所说的病毒在单个编码区的一端或两端还包括数量有所减少的重复的非编码序列；并且该病毒还包括在编码与病毒复制有关的蛋白的至少一个基因中的至少一处突变。
20．一种根据权利要求19的松鼠猴疱疹病毒，其中所说的非编码重复序列的数量为5个或者更少、并且理想的为1个。
21．一种松鼠猴疱疹病毒，该病毒在编码与病毒复制有关的蛋白的基因中至少有一处突变并且在编码非必需蛋白的基因中也有突变。
22．一种根据权利要求21的松鼠猴疱疹病毒，其中所说的病毒在转化基因、比如STP基因中还有突变。
23．一种根据权利要求21或22的松鼠猴疱疹病毒，其中所说的突变包括所说基因的部分或完全的缺失。
24．一种根据权利要求21-23的松鼠猴疱疹病毒，其中所说的编码与病毒复制有关的蛋白的基因包括ORF50或ORF57。
25．一种根据权利要求21-24的松鼠猴疱疹病毒，其中所说的编码非必需蛋白的基因包括选自包括ORF4、ORF14、ORF15、ORF16、ORF51的组中的基因。
26．一种用于向靶细胞送递所选择的异源DNA的方法，该方法通过在有利于病毒感染的条件下，将所说的细胞暴露到至少包括事先选择的异源DNA的松鼠猴疱疹病毒中。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107653345A (zh) * 2017-11-08 2018-02-02 中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所 猴b病毒实时荧光定量pcr方法及其通用引物、mgb探针与试剂盒

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9826069D0 (en) 1998-11-28 1999-01-20 Univ Leeds HIV vaccine
GB9903694D0 (en) * 1999-02-19 1999-04-14 Univ Leeds Latency-associated regulatory region
US7198924B2 (en) 2000-12-11 2007-04-03 Invitrogen Corporation Methods and compositions for synthesis of nucleic acid molecules using multiple recognition sites
US7754208B2 (en) 2001-01-17 2010-07-13 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
US7829084B2 (en) * 2001-01-17 2010-11-09 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding constructs and methods for use thereof
WO2004009768A2 (en) * 2002-07-18 2004-01-29 Invitrogen Corporation Viral vectors containing recombination sites
EP1687323A4 (en) 2003-08-08 2009-08-12 Life Technologies Corp METHODS AND COMPOSITIONS FOR DIRECT CLONING OF NUCLEIC ACID MOLECULES
DE602004027538D1 (de) 2003-12-01 2010-07-15 Life Technologies Corp Rekombinationsstellen enthaltende nukleinsäuremoleküle und verfahren zur verwendung davon
EP2298815B1 (en) 2005-07-25 2015-03-11 Emergent Product Development Seattle, LLC B-cell reduction using CD37-specific and CD20-specific binding molecules
KR101571027B1 (ko) * 2006-06-12 2015-11-23 이머전트 프로덕트 디벨롭먼트 시애틀, 엘엘씨 효과기 기능을 갖는 단일쇄 다가 결합 단백질
US20090148447A1 (en) * 2007-07-06 2009-06-11 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding Peptides Having a C-terminally Disposed Specific Binding Domain
WO2009126944A1 (en) * 2008-04-11 2009-10-15 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Cd37 immunotherapeutic and combination with bifunctional chemotherapeutic thereof
SG10202002577XA (en) 2015-09-21 2020-04-29 Aptevo Res & Development Llc Cd3 binding polypeptides
WO2018048869A1 (en) * 2016-09-06 2018-03-15 Bioventures, Llc Compositions and methods for generating reversion free attenuated and/or replication incompetent vaccine vectors
RU2771081C2 (ru) * 2020-08-25 2022-04-26 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) Рекомбинантный штамм Herpesvirus saimiri для получения популяций иммортализованных аутологичных Т-лимфоцитов, экспрессирующих парные химерные рецепторы против опухолевых антигенов CD44 и CD133

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5672344A (en) * 1987-12-30 1997-09-30 The Regents Of The University Of Michigan Viral-mediated gene transfer system
JPH04503300A (ja) * 1988-10-06 1992-06-18 デイナ・フアーバー・キヤンサー・インステイテユート Ｈ．ｓａｉｍｉｒｉ―ｈｔｌｖ―ｘ領域ベクター
DE3834157A1 (de) * 1988-10-07 1990-04-19 Behringwerke Ag Selektionierbare vektoren fuer humane t-zellen

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107653345A (zh) * 2017-11-08 2018-02-02 中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所 猴b病毒实时荧光定量pcr方法及其通用引物、mgb探针与试剂盒
CN107653345B (zh) * 2017-11-08 2021-04-27 中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所 猴b病毒实时荧光定量pcr方法及其通用引物、mgb探针与试剂盒

Also Published As

Publication number Publication date
CZ69799A3 (cs) 1999-08-11
ATE342997T1 (de) 2006-11-15
HUP9904329A3 (en) 2002-01-28
WO1998010083A1 (en) 1998-03-12
ES2274541T3 (es) 2007-05-16
DE69736838D1 (de) 2006-11-30
GB9618477D0 (en) 1996-10-16
DE69736838T2 (de) 2007-10-31
US6379967B1 (en) 2002-04-30
IL128635A0 (en) 2000-01-31
JP2000517191A (ja) 2000-12-26
CA2264956A1 (en) 1998-03-12
BR9711998A (pt) 2000-01-18
EP0939828B1 (en) 2006-10-18
EP0939828A1 (en) 1999-09-08
HUP9904329A2 (hu) 2000-04-28
KR20000068461A (ko) 2000-11-25
AU737197B2 (en) 2001-08-09
SG91252A1 (en) 2002-09-17
AU4307197A (en) 1998-03-26
NZ334323A (en) 2000-06-23

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