RU2771081C2 - Рекомбинантный штамм Herpesvirus saimiri для получения популяций иммортализованных аутологичных Т-лимфоцитов, экспрессирующих парные химерные рецепторы против опухолевых антигенов CD44 и CD133 - Google Patents

Рекомбинантный штамм Herpesvirus saimiri для получения популяций иммортализованных аутологичных Т-лимфоцитов, экспрессирующих парные химерные рецепторы против опухолевых антигенов CD44 и CD133 Download PDF

Info

Publication number
RU2771081C2
RU2771081C2 RU2020128309A RU2020128309A RU2771081C2 RU 2771081 C2 RU2771081 C2 RU 2771081C2 RU 2020128309 A RU2020128309 A RU 2020128309A RU 2020128309 A RU2020128309 A RU 2020128309A RU 2771081 C2 RU2771081 C2 RU 2771081C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
sequence
genome
herpesvirus saimiri
dna
antigen
Prior art date
Application number
RU2020128309A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2020128309A (ru
RU2020128309A3 (ru
Inventor
Степан Петрович Чумаков
Юлия Евгеньевна Кравченко
Дмитрий Сергеевич Кравченко
Елена Ивановна Фролова
Original Assignee
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Федеральное государственное бюджетное учреждение науки институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) filed Critical Федеральное государственное бюджетное учреждение науки институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН)
Priority to RU2020128309A priority Critical patent/RU2771081C2/ru
Publication of RU2020128309A publication Critical patent/RU2020128309A/ru
Publication of RU2020128309A3 publication Critical patent/RU2020128309A3/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2771081C2 publication Critical patent/RU2771081C2/ru

Links

Images

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86Viral vectors
    • C12N15/869Herpesviral vectors
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Группа изобретений относится к биотехнологии. Предложена гетерологичная ДНК, предназначенная для введения в геном вируса “дикого” штамма Herpesvirus saimiri, включает в себя генетические последовательности, кодирующие парные химерные рецепторы против опухолевых антигенов CD44 и CD133, фланкированная участками протяженностью 300-900 пар нуклеотидных оснований, гомологичных тому участку генома Herpesvirus saimiri, в который производится интеграция целевого фрагмента посредством гомологичной рекомбинации. Также предложен рекомбинантный штамм Herpesvirus saimiri, содержащий в своем геноме последовательность указанной ДНК, предназначенный для быстрого получения пролиферирующих популяций аутологичных Т-лимфоцитов, экспрессирующих парные химерные антигенные рецепторы против антигенов CD44 и CD133. Изобретения могут быть использованы в исследовательских и диагностических целях для эффективного получения генетически-модифицированных иммортализованных первичных Т-лимфоцитов для терапии злокачественных новообразований, в частности глиобластом. 2 н. и 3 з.п. ф-лы, 5 ил.

Description

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в исследовательских и диагностических целях для эффективного получения генетически- модифицированных иммортализованных первичных Т-лимфоцитов.
Лабораторно-клиническая практика получения аутологичных или гетерологичных пациент-специфичных лимфоидных линий требует разработки и создания инструментов, обеспечивающих возможность эффективной иммортализации и генетической модификации первичных культур. Эффективным методом иммортализации первичных Т-лимфоцитов является их заражение Гамма-2 герпесвирусом беличьих обезьян Herpesvirus saimiri (HVS), обеспечивающим антигеннезависимую пролиферацию инфицированных культур при сохранении ими функциональной активности и зрелого фенотипа. Использование рекомбинантного HVS также возможно для доставки в клетки протяженных экспрессионных конструкций, благодаря наличию в геноме вируса участков, использование которых в качестве сайтов интеграции целевых генетических последовательностей не оказывает влияния на жизнеспособность вируса. Сочетание этих особенностей делает Herpesvirus Saimiri перспективным инструментом, позволяющим совместить трансдукцию первичных Т- лимфоцитов с их иммортализацией и добиться получения пролиферирующих популяций Т-клеток, экспрессирующих химерные антигенные рецепторы против заданных антигенов.
Распознавание единичного антигена и последующая полная активация цитотоксического действия иммунной клетки целесообразна, если в качестве мишени для нацеливания клеточного иммунотерапевтического препарата использован опухолевый неоантиген, не экспрессирующийся на поверхности нормальных клеток организма. Многие новообразования характеризуются отсутствием уникальных антигенов, однако обладают отличительным паттерном экспрессии нескольких редких рецепторов, каждый из которых по отдельности может встречаться на поверхности нормальных клеток. В этом случае более эффективным оказывается таргетирование клеточных препаратов на сочетание двух антигенов, при условии, что связывание каждого из них в отдельности не должно приводить к полной активации цитотоксического действия во избежание неспецифической активности препарата и побочных эффектов.
Перспективной мишенью для нацеливания клеточных иммунотерапевтических препаратов служит комбинация поверхностных гликопротеинов CD44 и CD133. Экспрессия CD 133 характерна для популяций раковых стволовых клеток опухолей головного мозга; содержание CD133(+) клеток при глиомах отражает степень анаплазии новообразования и служит прогностическим фактором, обратно коррелирующим с продолжительностью жизни больных. CD44 - другой распространенный маркер раковых стволовых клеток, служит рецептором гиалуроновой кислоты, повышенный уровень которой оказывается характерен для микроокружения стволовых клеток и новообразований, в частности, первичных опухолей головного мозга. Использование парных химерных рецепторов против опухолевых антигенов CD44 и CD 133 должно обеспечивать эффективное нацеливание Т-лимфоцитов на наиболее злокачественные клетки глиобластом при минимизации побочных эффектов со стороны организма.
Возможным решением проблемы является техническое решение, предлагаемое в заявке /US5670352A, C12N15/65, опубл.23.09.1997/, описывающее использование штаммов Herpesvirus saimiri с целью трансформации и генетической модификации Т- лимфоцитов, а также с целью обеспечения антигеннезависимой пролиферации инфицированных культур при сохранении ими функциональной активности и зрелого фенотипа. В заявке не оговаривается возможность использования изобретения для получения пролиферирующих популяций аутологичных Т-лимфоцитов, экспрессирующих парные химерные антигенные рецепторы против опухолевых антигенов CD44 и CD 133; более того, предметом заявки является методика, а не рекомбинантный штамм Herpesvirus Saimiri.
Известен генетически модифицированный штамм Herpesvirus Saimiri, обеспечивающий возможность доставки в клетки гетерологичной ДНК /международная заявка WO1998010083A1, C12N15/86, опубл. 12.03.1998 г./. В заявке отсутствует описание возможности использования изобретения с целью одновременной трансдукции и иммортализации первичных Т-лимфоцитов, в частности получения пролиферирующих популяций аутологичных Т-лимфоцитов, экспрессирующих парные химерные антигенные рецепторы против опухолевых антигенов CD44 и CD133.
Техническое решение, приведенное в заявке /US20200032219A1, C12N7/00, опубл. 30.01.2020 г./, описывает генетически модифицированный, в частности в ходе гомологичной рекомбинации, штаммам вируса герпеса, используемый для противоопухолевой терапии. Заявленный терапевтический эффект достигается за счет прямого цитотоксического воздействия вируса на клетки опухоли in vivo; в заявке не оговаривается возможность использования изобретения с целью одновременной трансдукции и иммортализации первичных Т-лимфоцитов.
Другие аналоги, в частности, техническое решение /JPH11513565A, C12N15/86, опубл. 24.11.1999г./ раскрывают возможности использования рекомбинантных генетических векторов на основе вируса герпеса, в частности, Herpesvirus saimiri (HVS), с целью трансдукции и генетической модификации широкого спектра культур клеток человека и животных, в частности, клеток лимфоидных линий. Предметом данной заявки служит методика использования генетических векторов на основе герпесвирусов, не включающая описание рекомбинантных штаммов Herpesvirus Saimiri.
Известна генетическая конструкция, кодирующая структуру Т-клеточного химерного рецептора на основе одноцепочечного VHH-антитела, специфичного к опухолевому рецептору CD47, содержащая в качестве антиген-распознающей части последовательность моноклонального одноцепочечного VHH-антитела, а также последовательности, кодирующие сигнальную последовательность рецептора CD8, последовательность шарнирного домена IgG4 длиной 12 аминокислот, последовательность трансмембранного домена рецептора CD28, и последовательности, кодирующие сигнальные домены рецепторов CD28, CD137 и CD3Z /патент 2707535, заявка 2017146641, опубл. 28.12.2017/, которая позволяет осуществлять экспрессию Т-клеточного химерного рецептора в Т-лимфоцитах путем трансдукции их лентивирусным вектором.
Таким образом, проведенные исследования патентной литературы позволяют заключить, что заявленное техническое решение характеризуется научной новизной, не имеет полных аналогов и обладает конкурентными преимуществами для получения рекомбинантных герпесвирусов, обеспечивающих возможность одновременной трансдукции и иммортализации первичных Т-лимфоцитов.
Технической проблемой, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является создание инструмента, обеспечивающего возможность одновременной иммортализации и генетической модификации первичных Т-лимфоцитов, а именно: получение рекомбинантного штамма Herpesvirus Saimiri, способного вызывать иммортализацию человеческих периферических Т-лимфоцитов и содержащего в своем геноме генетическую последовательность для экспрессии парного химерного антигенного рецептора против опухолевых антигенов CD44 и CD133, предназначенного для быстрого получения пролиферирующих популяций аутологичных Т-лимфоцитов для терапии злокачественных новообразований, в частности, глиобластом.
Заявленная техническая проблема решается за счет создания рекомбинантного штамма Herpesvirus Saimiri, предназначенного для быстрого получения пролиферирующих популяций аутологичных Т-лимфоцитов, экспрессирующих парные химерные антигенные рецепторы против опухолевых антигенов, характеризующегося следующими параметрами:
Гетерологичная ДНК, предназначенная для введения в геном вируса "дикого" штамма Herpesvirus Saimiri, включает в себя генетические последовательности, кодирующие парные химерные рецепторы против опухолевых антигенов CD44 (с последовательностью антиген-распознающей части химерного рецептора на основе моноклонального одноцепочечного VHH-антитела, специфичного к опухолевому антигену CD44 SEQ ID NO.1) и CD133 (с последовательностью антиген-распознающей часть химерного рецептора на основе моноклонального одноцепочечного VHH- антитела, специфичного к опухолевому антигену CD 133 SEQ ID NO.2).
В составе указанной ДНК, последовательность, кодирующая первый активирующий химерный рецептор, включает в себя N-концевую сигнальную последовательность рецептора CD8, а также участки, кодирующие антиген-связывающий домен на основе моноклонального одноцепочечного VHH-антитела, специфичного к опухолевому антигену CD44, спейсерную область, представленную 12 аминокислотной последовательностью шарнирного домена иммуноглобулина G4, трансмембранный домен CD28 и сигнальный домен CD3zeta; последовательность, кодирующая второй костимуляторный химерный рецептор включает в себя N-концевую сигнальную последовательность рецептора CD8, а также участки, кодирующие антиген- связывающий домен на основе моноклонального одноцепочечного VHH-антитела, специфичного к опухолевому антигену CD133, шарнирную область длиной 228 аминокислот, трансмембранный и сигнальный домены рецептора CD28, а также сигнальный домен рецептора CD137.
В составе указанной ДНК, последовательность, предназначенная для введения в геном вируса "дикого" штамма Herpesvirus Saimiri, фланкирована участками протяженностью 300-900 пар нуклеотидных оснований, гомологичных тому участку генома Herpesvirus Saimiri, в который производится интеграция целевого фрагмента посредством гомологичной рекомбинации (SEQ ID NO.3).
В составе указанной ДНК, в качестве последовательности протяженностью 300900 пар нуклеотидных оснований, гомологичной участку генома Herpesvirus Saimiri, используют последовательность вирусного гена vCD59 (SEQ ID NO.4).
В составе указанной ДНК, в состав целевого участка, предназначенного для введения в геном "дикого" штамма вируса Herpesvirus Saimiri, входит последовательность, кодирующая флуоресцентный белок (SEQ ID NO.5).
Предлагается рекомбинантный штамм Herpesvirus Saimiri, предназначенный для быстрого получения пролиферирующих популяций аутологичных Т-лимфоцитов, экспрессирующих парные химерные антигенные рецепторы против опухолевых антигенов CD44 и CD133, содержащий в своем геноме последовательность ДНК, указанную выше.
Получение рекомбинантного штамма Herpesvirus Saimiri, способного вызывать иммортализацию человеческих периферических Т-лимфоцитов и содержащего в своем геноме генетическую последовательность для экспрессии парного химерного антигенного рецептора против опухолевых антигенов CD44 и CD133.
Пермиссивная к литической инфекции HVS культура клеток OMK была инфицирована "диким" штаммом вируса HVS-C488 (VR-1414) ATCC (США).
Использованные генетические конструкции:
экспрессионная плазмида pUC-HVS-SFFV-CAR2@CD44- CAR1@CD133, включающая в себя ген устойчивости к пуромицину (pac), эпитоп FLAG (DYKDDDDK) для осуществления иммуномагнитной сепарации трансдуцированных клеток и генетическую последовательность, кодирующую парные химерные рецепторы против опухолевых антигенов CD44 и CD 133, фланкированные участками (600 п.н.), гомологичными области vCD59 генома HVS (Фиг. 1);
экспрессионная плазмида pMD2-FA30, кодирующая поверхностный гликопротеин F вакцинного штамма вируса кори (Фиг. 2);
экспрессионная плазмида pCG-4AHcA24, кодирующая поверхностный гликопротеин H вакцинного штамма вируса кори (Фиг. 3).
Перечисленными экспрессионными плазмидами (2a, 2b и 2c) с использованием полиэтиленимина 25 кДа (PEI-25, Polysciences, США) были котрансфицированы клетки линии HEK-293T; плазмиды смешивались в соотношении 8 : 7 : 1, соответственно.
Культуры инфицированных клеток OMK и трансфицированных клеток HEK- 293T были подвергнуты совместному культивированию в соотношении 1:7, соответственно; для пассирования клеток была использована ростовая среда Eagle's Minimum Essential Medium, Catalog No. 30-2003. В ходе микроскопического исследования совместно культивируемых линий было зафиксировано формирование многоядерных синцитиев из клеток обеих культур.
Совместно культивируемые клетки, сформировавшие многоядерные синцитии, были использованы для многократного отбора ростовой среды, содержащей рекомбинантные вирионы. Вируссодержащая среда была подвергнута центрифугированию (5000 g; 15 минут) для удаления клеточного дебриса с последующим определением вирусного титра методом Рида-Менча (1.28E+04).
Вируссодержащим супернатантом были заражены культуры ОМК; по прошествии семи дней в конфлюэнтной клеточной культуре было зафиксировано формирование бляшек.
Для клонирования рекомбинантного HVS, на лунки 96-луночного планшета, в которые за 24 часа до этого были рассеяны свежие клетки линии ОМК в субкофлюэнтном количестве, была добавлена культуральная среда, содержащая отсортированные в ходе иммуномагнитной сепарации инфицированные клетки ОМК из расчета 0.1 инфицированная клетка на лунку. Через 10 дней после инфекции в образцах, подвергшихся заражению, были зафиксированы единичные бляшки, образованные индивидуальными рекомбинировавшими вирусными частицами. Вируссодержащая среда с лунок, в которых наблюдалось наиболее выраженное развитие литического процесса, была использована для наработки препаративных количеств рекомбинантного вирусного препарата и его анализа.
Наработанный образец вируса был проанализирован в ходе секвенирования, показавшего успешную интеграцию целевой экспрессионной кассеты в области vCD59 генома.
Анализ эффективности использования рекомбинантного штамма Herpesvirus Saimiri для быстрого получения пролиферирующих популяций аутологичных Т-лимфоцитов, экспрессирующих парные химерные антигенные рецепторы против опухолевых антигенов CD44 и CD133, для терапии глиобластом.
В ходе оценки возможности использования заявленного рекомбинантного вируса для одновременной иммортализации и генетической модификации первичных Т- лимфоцитов полученный препарат был использован для трансдукции периферических мононуклеарных клеток (PBMC), а также линии А549, использованной в качестве контроля. Трансдукция клеток была проведена в течение 8 часов в бессывороточной питательной среде AIM-V, после чего клетки были осаждены центрифугированием и рассажены на свежую порцию питательной среды AIM-V. Для верификации эффективности введения в клетки экспрессионной кассеты инфецированные клетки были подвергнуты окрашиванию антителами к эпитопу FLAG с последующим анализом в ходе проточной цитометрии. Проведенный анализ показал успешное появление фракций флуоресцирующих клеток: для линии А549 их доля сохранялась постоянной в течение 5 недель после инфекции, а для PBMC - постоянно увеличивалась (Фиг.4), свидетельствуя об эффективности вирус-опосредованной иммортализации периферических мононуклеарных клеток и успешности введения в клетки целевой экспрессионной кассеты.
В ходе анализа эффективности вирус-опосредованного нацеливания Т-клеток на опухолевые антигены CD44 и CD 133 было проведено культивирование клеток линии LN-18 (глиобластома, IV стадия; ATCC® CRL-2610™), характеризующейся CD44 (+)/CD133(+) фенотипом, и предварительно отсортированной CD44(-)/CD133(+) фракции LN-18 в присутствии PBMC, полученных на предыдущем этапе; в качестве контроля использовали Т-лимфоциты, трансдуцированные контрольным препаратом HVS, не кодирующим последовательность парных химерных рецепторов. Совместное культивирование клеток было проведено в течение 30 часов в соотношении 1:1; по завершении эксперимента была проведена оценка выживаемости клеток линии LN-18 с помощью набора CellTiter-Glo® (Promega, USA), согласно протоколу, рекомендованному производителем (Фиг.5).
Результаты анализа свидетельствуют о эффективности элиминирования CD44(+)/CD133(+) раковых клеток линии LN-18 клетками PBMC, инфицированным тестируемым препаратом HVS по сравнению с контрольными неинфицированными PBMC (значение точного критерия Фишера составило 0.02809, р < 0,05), что подтверждает эффективность использования тестируемого рекомбинантного вируса для таргетирования клеток лимфоидных линий. Важно отметить значительно более низкую цитотоксичность PBMC в отношении CD44(-)/CD133(+) фракции клеток LN-18, свидетельствующей о том, что связывание каждого из парных антигенных рецепторов в отдельности не приводит к полной активации цитотоксического действия, минимизируя неспецифическую активности препарата и вероятность потенциальных побочных эффектов.
Возможность использования изобретения для решения существующих задач в сочетании с наблюдаемой терапевтической эффективностью подтверждают конкурентное преимущество заявленного технического решения и позволяют рекомендовать его для быстрого получения пролиферирующих популяций аутологичных Т-лимфоцитов для терапии злокачественных новообразований, в частности, глиобластом.
Изобретение иллюстрировано следующими материалами:
Фиг. 1 - Схематическое изображение генетической конструкции pUC-HVS-SFFV- CAR2@CD44-CAR1@CD 133.
Фиг. 2 - Схематическое изображение генетической конструкции pMD2-Fd30.
Фиг. 3 - Схематическое изображение генетической конструкции pCD-4AHcd24.
Фиг. 4 - Динамика изменения численности флуоресцентных популяций клеток после инфекции рекомбинантным HVS.
Фиг. 5 - Результаты анализа эффективности элиминирования CD44/CD133(+) и CD44/CD133(-) раковых клеток линии LN-18 PBMC, инфицированным тестируемым или контрольным препаратами HVS; высота столбцов соответствует относительному уровню люминесценции, отражающему количество живых клеток линии LN-18 в культуре; каждое значение получено в трех повторностях, планки погрешностей соответствуют стандартной ошибке среднего.
SEQ ID NO.1 Нуклеотидная последовательность, кодирующая антиген-распознающую часть химерного рецептора на основе моноклонального одноцепочечного VHH- антитела, специфичного к опухолевому антигену CD44.
SEQ ID NO.2 Нуклеотидная последовательность, кодирующая антиген-распознающую часть химерного рецептора на основе моноклонального одноцепочечного VHH- антитела, специфичного к опухолевому антигену CD133.
SEQ ID NO.3 Нуклеотидная последовательность участка генома Herpesvirus Saimiri, в который производится интеграция целевого фрагмента.
SEQ ID NO.4 Последовательность вирусного гена vCD59.
SEQ ID NO.5 Последовательность, кодирующая флуоресцентный белок.
Последовательности
Последовательность 1: "Нуклеотидная последовательность, кодирующая антиген-распознающую часть химерного рецептора на основе моноклонального одноцепочечного VHH-антитела, специфичного к опухолевому антигену СD44 "
Длина Тип молекулы Организм Содержит фрагмент ы ДНК и РНК Пропущенная последовательность
411 DNA synthetic construct Нет Нет
Характеристики
Ключ характеристики Местоположение характеристики Квалификаторы
source 1..411 mol_type = other DNA organism = synthetic construct
--->
Последовательность
atgcaagttc aactggtaga aagtggtggc ggtctcgtcc aaccgggtgg gtcccttcgc 60
ttgagttgtg aagcgagcgg tttcaatttg gggtattacg gtatctgttg gtttcggcga 120
gctgccggga aagagcggga gggcgtcgcg tgttctgcca cacctgatga ttcaacttac 180
tacgctgatt ccgtcaaggg ccggtttacg atttcaaaag acaaggcaaa gaacatgatc 240
tttttgcaaa tgaatgactt gaaaccagaa gacactgccg tctattattg cgtcacagac 300
cggaaaccca aatacggcaa acagtggttg gagttttccg agtacgacta ctggggacag 360
ggaacccaag tcatagtgtc cagcgagcct aaaacgccga agccacaacc a 411
<---
Последовательность 2: "Нуклеотидная последовательность, кодирующая антиген-распознающую часть химерного рецептора на основе моноклонального одноцепочечного VHH-антитела, специфичного к опухолевому антигену CD133"
Длина Тип молекулы Организм Содержит фрагмент ы ДНК и РНК Пропущенная последовательность
381 DNA synthetic construct Нет Нет
Характеристики
Ключ характеристики Местоположение характеристики Квалификаторы
source 1..381 mol_type = other DNA organism = synthetic construct
--->
Последовательность
atgcaggtgc aggtgcagga gtcgggggga ggctgggtgc agcctggggg gtctctgacg 60
ctctcctgtg cagcccccag atcaatcttc agtgtccttg acataagctg gtaccgccag 120
gctacaggga accagcgcga gttggtcgca gcaattacta tcggtggtgg cacaagctat 180
acagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagacg acgccaagaa gtcggcgtat 240
ctccaaatga gcagcctgaa acctgaggac acggccgtct atgtctgtaa tgcccgatgg 300
cgtgcaggtg ggcagaacta ctggggccag gggacccggg tcaccgtctc ctcagcgcac 360
cacagcgaag accccagctc c 381
<---
Последовательность 3: "Нуклеотидная последовательность участка генома Herpesvirus Saimiri, в который производится интеграция целевого фрагмента"
Длина Тип молекулы Организм Содержит фрагмент ы ДНК и РНК Пропущенная последовательность
1201 DNA synthetic construct Нет Нет
Характеристики
Ключ характеристики Местоположение характеристики Квалификаторы
source 1..1201 mol_type = other DNA organism = synthetic construct
--->
Последовательность
acaggctgct cttcaggagc accagaagaa ggtcgaattg cgttccttct caaaagagga 60
ggcatgtttg caaatgaaat gagaatctgg tgagataaga tgtatttgca tgaagcttct 120
atttatacta cattagaggc atttttcaga agcaaaaatg cctctaatta tatacactgt 180
actatttacc tctattacac attttctatt ttaagtctga aagtgattaa tcaagaaaga 240
agtttgtggt tccctggaga ttagttcaca agctgtctga ggttaaaggt ggttctttag 300
cactgacaca caagttgcta taagaattga agcttgcttt ataaaaagtt acttgtgttt 360
aattactatt aaaataaaga gaatgtatat tttgtttaag ttgatgcttg cttctgtttt 420
ttgcaagtca agctacagct tgcaatgcta caactgttct cactcaacta tgcagtgtac 480
aacatctact agttgtacat ctaatcttga ttcttgtctc attgctaaag ctgggtcaaa 540
agtatattac aggtgctgga agtttgatga ctgtagcttc aaacgcatct caaatcaatt 600
gtctgaaaca cagttaaagt atcattgttg taagaaaaac ttgtgtaatg ttaacaaagt 660
gattgaaaat ggaaaaagaa caatatcaga taaggctctt ttactattag cattgttttt 720
agtaactgct tagaaccttt ctctttaaaa gtgaacaaca tacctatatt gtaacattta 780
tttttgcgta gcttattcgt attgctatta caagttaaaa tattgtgttt ttaactataa 840
tttttaaaaa gataaaatga gatgtagtat attacccata gtcaaaatta aagtgctaga 900
tattattagc atttttatca acaacgcaaa taaaagttaa gatacattat ttttttgata 960
tttggattat tgtgtgcttt ttatcatatg ttaaaagttt tatgtcattt tattcttaca 1020
tatataaagc taaattttaa agcaacttat cagtagcatc ttagcttctg atctgtacag 1080
acttatataa tatgggttta tccttaagaa aaaacaaaga agaaaaaaat aacacagtgc 1140
caaacttgcc agttaattac atgttaagaa atcctgttta taaaaagaaa tatctgccag 1200
<---
Перечень остатков был усечен, поскольку он превышает заданный предел: максимум 1200 остатка(-ов) для печати
Последовательность 4: "Последовательность вирусного гена vCD59"
Длина Тип молекулы Организм Содержит фрагмент ы ДНК и РНК Пропущенная последовательность
351 DNA synthetic construct Нет Нет
Характеристики
Ключ характеристики Местоположение характеристики Квалификаторы
source 1..351 mol_type = other DNA organism = synthetic construct
--->
Последовательность
atgtatattt tgtttaagtt gatgcttgct tctgtttttt gcaagtcaag ctacagcttg 60
caatgctaca actgttctca ctcaactatg cagtgtacaa catctactag ttgtacatct 120
aatcttgatt cttgtctcat tgctaaagct gggtcaaaag tatattacag gtgctggaag 180
tttgatgact gtagcttcaa acgcatctca aatcaattgt ctgaaacaca gttaaagtat 240
cattgttgta agaaaaactt gtgtaatgtt aacaaagtga ttgaaaatgg aaaaagaaca 300
atatcagata aggctctttt actattagca ttgtttttag taactgctta g 351
<---
Последовательность 5: "Последовательность, кодирующая флуоресцентный белок"
Длина Тип молекулы Организм Содержит фрагмент ы ДНК и РНК Пропущенная последовательность
714 DNA synthetic construct Нет Нет
Характеристики
Ключ характеристики Местоположение характеристики Квалификаторы
source 1..714 mol_type = other DNA organism = synthetic construct
--->
Последовательность
atggtgtcta agggcgaaga gctgattaag gagaacatgc acatgaagct gtacatggag 60
ggcaccgtga acaaccacca cttcaagtgc acatccgagg gcgaaggcaa gccctacgag 120
ggcacccaga ccatgagaat caaggtggtc gagggcggcc ctctcccctt cgccttcgac 180
atcctggcta ccagcttcat gtacggcagc agaaccttca tcaaccacac ccagggcatc 240
cccgacttct ttaagcagtc cttccctgag ggcttcacat gggagagagt caccacatac 300
gaagacgggg gcgtgctgac cgctacccag gacaccagcc tccaggacgg ctgcctcatc 360
tacaacgtca agatcagagg ggtgaacttc ccatccaacg gccctgtgat gcagaagaaa 420
acactcggct gggaggccaa caccgagatg ctgtaccccg ctgacggcgg cctggaaggc 480
agaagcgaca tggccctgaa gctcgtgggc gggggccacc tgatctgcaa cttcaagacc 540
acatacagat ccaagaaacc cgctaagaac ctcaagatgc ccggcgtcta ctatgtggac 600
cacagactgg aaagaatcaa ggaggccgac aaagagacct acgtcgagca gcacgaggtg 660
gctgtggcca gatactgcga cctccctagc aaactggggc acaaacttaa ttaa 714
<---

Claims (5)

1. Гетерологичная ДНК, предназначенная для введения в геном вируса "дикого" штамма Herpesvirus saimiri, включающая в себя генетические последовательности, кодирующие парные химерные рецепторы: против опухолевого антигена CD44, который включает в себя N-концевую сигнальную последовательность рецептора CD8, нуклеотидную последовательность антиген-распознающей части на основе моноклонального одноцепочечного VHH-антитела, специфичного к опухолевому антигену CD44, с SEQ ID NO.1, спейсерную область, представленную 12 аминокислотной последовательностью шарнирного домена иммуноглобулина G4, трансмембранный домен CD28 и сигнальный домен CD3zeta; и против опухолевого антигена CD133, который включает в себя N-концевую сигнальную последовательность рецептора CD8, нуклеотидную последовательность антиген-распознающей части на основе моноклонального одноцепочечного VHH-антитела, специфичного к опухолевому антигену CD133, с SEQ ID NO.2, шарнирную область длиной 228 аминокислот, трансмембранный и сигнальный домены рецептора CD28, а также сигнальный домен рецептора CD137.
2. ДНК по п. 1, в которой участок гетерологичной ДНК, предназначенный для введения в геном вируса "дикого" штамма Herpesvirus saimiri, фланкирован участками протяженностью 300-900 пар нуклеотидных оснований, гомологичных участку генома Herpesvirus saimiri с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO.3, в который производится интеграция целевого фрагмента посредством гомологичной рекомбинации.
3. ДНК по п. 2, в которой в качестве последовательности протяженностью 300-900 пар нуклеотидных оснований, гомологичной участку генома Herpesvirus saimiri, используется последовательность вирусного гена vCD59, имеющая последовательность SEQ ID NO.4.
4. ДНК по п. 1, в которой в состав участка гетерологичной ДНК, предназначенного для введения в геном "дикого" штамма вируса Herpesvirus saimiri, входит последовательность SEQ ID NO.5, кодирующая флуоресцентный белок.
5. Рекомбинантный штамм Herpesvirus saimiri, предназначенный для быстрого получения пролиферирующих популяций аутологичных Т-лимфоцитов, экспрессирующих парные химерные антигенные рецепторы против опухолевых антигенов CD44 и CD133, содержащий в своем геноме последовательность ДНК по пп. 1-4.
RU2020128309A 2020-08-25 2020-08-25 Рекомбинантный штамм Herpesvirus saimiri для получения популяций иммортализованных аутологичных Т-лимфоцитов, экспрессирующих парные химерные рецепторы против опухолевых антигенов CD44 и CD133 RU2771081C2 (ru)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2020128309A RU2771081C2 (ru) 2020-08-25 2020-08-25 Рекомбинантный штамм Herpesvirus saimiri для получения популяций иммортализованных аутологичных Т-лимфоцитов, экспрессирующих парные химерные рецепторы против опухолевых антигенов CD44 и CD133

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2020128309A RU2771081C2 (ru) 2020-08-25 2020-08-25 Рекомбинантный штамм Herpesvirus saimiri для получения популяций иммортализованных аутологичных Т-лимфоцитов, экспрессирующих парные химерные рецепторы против опухолевых антигенов CD44 и CD133

Publications (3)

Publication Number Publication Date
RU2020128309A RU2020128309A (ru) 2022-02-25
RU2020128309A3 RU2020128309A3 (ru) 2022-02-25
RU2771081C2 true RU2771081C2 (ru) 2022-04-26

Family

ID=80448233

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2020128309A RU2771081C2 (ru) 2020-08-25 2020-08-25 Рекомбинантный штамм Herpesvirus saimiri для получения популяций иммортализованных аутологичных Т-лимфоцитов, экспрессирующих парные химерные рецепторы против опухолевых антигенов CD44 и CD133

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2771081C2 (ru)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5670352A (en) * 1993-03-18 1997-09-23 Behringwerke Aktiengesellschaft Stable growth transformation of human T-lymphocytes by Herpesvirus saimiri (H. saimiri) subgroup C
US6379967B1 (en) * 1996-09-04 2002-04-30 The University Of Leeds Herpesvirus saimiri as viral vector

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5670352A (en) * 1993-03-18 1997-09-23 Behringwerke Aktiengesellschaft Stable growth transformation of human T-lymphocytes by Herpesvirus saimiri (H. saimiri) subgroup C
US6379967B1 (en) * 1996-09-04 2002-04-30 The University Of Leeds Herpesvirus saimiri as viral vector

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
doi:10.1093/intimm/5.8.985. КРАВЧЕНКО Ю. Е. и др. Проведение рекомбинации Herpesvirus saimiri в синцитиях, образованных трансфицированными и вируспермиссивными клетками. НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ, 2019, Номер: 8-2 (23), с.56-58. *
ENSSER A. et al. The genome of herpesvirus saimiri C488 which is capable of transforming human T cells. Virology, 314, 2003, p.471- 487. *
MITTR&Uuml;CKER H.-W. et al. Herpes virus saimiri-transformed human T lymphocytes: normal functional phenotype and preserved T cell receptor signalling. International Immunology, 1993, 5(8), p.985-990. doi:10.1093/intimm/5.8.985. КРАВЧЕНКО Ю. Е. и др. Проведение рекомбинации Herpesvirus saimiri в синцитиях, образованных трансфицированными и вируспермиссивными клетками. НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ, 2019, Номер: 8-2 (23), с.56-58. ХАМАД А., ЧУМАКОВ С. П. Получение рекомбинантного штамма Herpesvirus saimiri путем совместной культивации трансфицированной и пермиссивной клеточных культур. ВЕСТНИК РГМУ, 6, Опубликована онлайн: 11.12.2019, с.40-47, DOI: 10.24075/vrgmu.2019.079. ENSSER A. et al. The genome of herpesvirus saimiri C488 which is capable of transforming human T cells. Virology, 314, 2003, p.471- 487. *
MITTRÜCKER H.-W. et al. Herpes virus saimiri-transformed human T lymphocytes: normal functional phenotype and preserved T cell receptor signalling. International Immunology, 1993, 5(8), p.985-990. *
ХАМАД А., ЧУМАКОВ С. П. Получение рекомбинантного штамма Herpesvirus saimiri путем совместной культивации трансфицированной и пермиссивной клеточных культур. ВЕСТНИК РГМУ, 6, Опубликована онлайн: 11.12.2019, с.40-47, DOI: 10.24075/vrgmu.2019.079. *

Also Published As

Publication number Publication date
RU2020128309A (ru) 2022-02-25
RU2020128309A3 (ru) 2022-02-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2018223600A1 (zh) Octs-car双靶向嵌合抗原受体、编码基因、重组表达载体及其构建和应用
BR112021003305A2 (pt) métodos para produzir células que expressam receptor de antígeno quimérico
CN104910278B (zh) 一种用于制备cart细胞的具有高效转染能力和生物学活性的慢病毒
US20200384021A1 (en) Hiv immunotherapy with no pre-immunization step
CN112048481B (zh) 一种靶向cd19的嵌合抗原受体nk细胞及其应用
CN109721659B (zh) 一种靶向cd19的新型嵌合抗原受体(car)及其应用
CN105950664B (zh) 一种靶向cd123的复制缺陷性重组慢病毒car-t转基因载体及其构建方法和应用
WO2018218876A1 (zh) 一种基于octs技术的淋系白血病car-t治疗载体及其构建方法和应用
CN113121676B (zh) 一种靶向巨细胞病毒抗原的特异性t细胞受体及其应用
CN118792252A (zh) T淋巴细胞及其应用
CN114230658B (zh) 新型冠状病毒特异性t细胞受体和其用途
WO2009139413A1 (ja) サイトカイン誘導キラー細胞含有細胞集団の製造方法
WO2018218879A1 (zh) 一种基于octs技术的胰腺癌、恶性间皮瘤car-t治疗载体及其构建方法和应用
US11628210B2 (en) Chimeric antigen receptors that bind to SSEA4 and uses thereof
CN111234031A (zh) 靶向肿瘤细胞表面muc1的新型嵌合抗原受体及muc1嵌合抗原受体t细胞的制备方法
CN111197032A (zh) 嵌合抗原受体细胞分泌治疗剂
JP2023540997A (ja) 免疫細胞を感染、活性化、および拡大させる方法および組成物
RU2771081C2 (ru) Рекомбинантный штамм Herpesvirus saimiri для получения популяций иммортализованных аутологичных Т-лимфоцитов, экспрессирующих парные химерные рецепторы против опухолевых антигенов CD44 и CD133
CN109796536B (zh) 一种靶向胶质母细胞瘤多种抗原表位的ctl的制备方法
CN113736810B (zh) 构建体、载体、蛋白、细胞、制备方法、产品及应用
WO2020164166A1 (zh) 一种通用型car-t细胞及其制备方法和用途
WO2018218875A1 (zh) 一种基于octs技术的前列腺癌car-t治疗载体及其构建方法和应用
WO2020164167A1 (zh) 一种用于通用型car-t制备的重组腺相关病毒载体及其构建方法和应用
CN114134182A (zh) 一种新型免疫细胞的制备方法及其应用
CN112175092A (zh) 同时靶向lmp1和gp350的双靶标嵌合抗原受体及其应用