CZ69799A3 - Herpesvirus saimiri a způsob jeho použití jako virového vektoru - Google Patents
Herpesvirus saimiri a způsob jeho použití jako virového vektoru Download PDFInfo
- Publication number
- CZ69799A3 CZ69799A3 CZ99697A CZ69799A CZ69799A3 CZ 69799 A3 CZ69799 A3 CZ 69799A3 CZ 99697 A CZ99697 A CZ 99697A CZ 69799 A CZ69799 A CZ 69799A CZ 69799 A3 CZ69799 A3 CZ 69799A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- gene
- virus
- herpesvirus saimiri
- mutation
- herpesvirus
- Prior art date
Links
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims description 77
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 title claims description 15
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 11
- 239000013598 vector Substances 0.000 title description 22
- 241000282695 Saimiri Species 0.000 title description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 122
- 241000701062 Saimiriine gammaherpesvirus 2 Species 0.000 claims abstract description 42
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 33
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims abstract description 30
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims abstract description 30
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 64
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 35
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 29
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 26
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 26
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 26
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 23
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 claims description 14
- 101000812031 Anthoceros angustus Uncharacterized 5.9 kDa protein in rps16-psbA intergenic region Proteins 0.000 claims description 10
- 101000847476 Autographa californica nuclear polyhedrosis virus Uncharacterized 54.7 kDa protein in IAP1-SOD intergenic region Proteins 0.000 claims description 10
- 101000736075 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YcbP Proteins 0.000 claims description 10
- 102100031725 Cortactin-binding protein 2 Human genes 0.000 claims description 10
- 101000748786 Euglena longa Uncharacterized 7.2 kDa protein in rps2-rps9 intergenic region Proteins 0.000 claims description 10
- 101001066788 Haemophilus phage HP1 (strain HP1c1) Probable portal protein Proteins 0.000 claims description 10
- 101000748192 Herpetosiphon aurantiacus Uncharacterized 15.4 kDa protein in HgiDIIM 5'region Proteins 0.000 claims description 10
- 101150056707 stp gene Proteins 0.000 claims description 10
- 101000827329 Acholeplasma phage L2 Uncharacterized 26.1 kDa protein Proteins 0.000 claims description 9
- 101000781183 Autographa californica nuclear polyhedrosis virus Uncharacterized 20.4 kDa protein in IAP1-SOD intergenic region Proteins 0.000 claims description 9
- 101000818057 Haemophilus phage HP1 (strain HP1c1) Uncharacterized 14.9 kDa protein in rep-hol intergenic region Proteins 0.000 claims description 9
- 101001015100 Klebsiella pneumoniae UDP-glucose:undecaprenyl-phosphate glucose-1-phosphate transferase Proteins 0.000 claims description 9
- 101710197985 Probable protein Rev Proteins 0.000 claims description 9
- 101000992423 Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 Putative ORF9c protein Proteins 0.000 claims description 9
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 claims description 9
- 101000854890 Haemophilus phage HP1 (strain HP1c1) Probable terminase, ATPase subunit Proteins 0.000 claims description 8
- 101000768945 Haemophilus phage HP1 (strain HP1c1) Uncharacterized 7.9 kDa protein in int-C1 intergenic region Proteins 0.000 claims description 8
- 101000578717 Klebsiella pneumoniae Mannose-1-phosphate guanylyltransferase Proteins 0.000 claims description 8
- 101000786247 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YqaT Proteins 0.000 claims description 7
- 101000748779 Marchantia polymorpha Uncharacterized 6.4 kDa protein in atpA-psbA intergenic region Proteins 0.000 claims description 7
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 claims description 7
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 claims description 5
- 108091081062 Repeated sequence (DNA) Proteins 0.000 claims description 3
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 claims description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims description 2
- 102000043276 Oncogene Human genes 0.000 claims 4
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 claims 4
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 claims 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 claims 1
- 108700039887 Essential Genes Proteins 0.000 abstract description 6
- 230000010076 replication Effects 0.000 abstract description 6
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 abstract description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 abstract 1
- 230000005727 virus proliferation Effects 0.000 abstract 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 23
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 18
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 14
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 10
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 10
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 10
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 8
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 8
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 7
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 7
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 7
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 7
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 7
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 6
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 6
- 231100000590 oncogenic Toxicity 0.000 description 6
- 230000002246 oncogenic effect Effects 0.000 description 6
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 5
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 4
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 4
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 4
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 4
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 3
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 3
- KSXTUUUQYQYKCR-LQDDAWAPSA-M 2,3-bis[[(z)-octadec-9-enoyl]oxy]propyl-trimethylazanium;chloride Chemical compound [Cl-].CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC(C[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC KSXTUUUQYQYKCR-LQDDAWAPSA-M 0.000 description 2
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 2
- 102100028633 Cdc42-interacting protein 4 Human genes 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000897400 Homo sapiens CD59 glycoprotein Proteins 0.000 description 2
- 101000833492 Homo sapiens Jouberin Proteins 0.000 description 2
- 101000651236 Homo sapiens NCK-interacting protein with SH3 domain Proteins 0.000 description 2
- 102100024407 Jouberin Human genes 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 101150030263 ORF57 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 2
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 2
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 108091006106 transcriptional activators Proteins 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102100022002 CD59 glycoprotein Human genes 0.000 description 1
- 101100148606 Caenorhabditis elegans pst-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101710184994 Complement control protein Proteins 0.000 description 1
- 102000003910 Cyclin D Human genes 0.000 description 1
- 108090000259 Cyclin D Proteins 0.000 description 1
- 102000002431 Cyclin G Human genes 0.000 description 1
- 108090000404 Cyclin G1 Proteins 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 102000052510 DNA-Binding Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101710096438 DNA-binding protein Proteins 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 108010093031 Galactosidases Proteins 0.000 description 1
- 102000002464 Galactosidases Human genes 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 241000700588 Human alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 108010025815 Kanamycin Kinase Proteins 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000024556 Mendelian disease Diseases 0.000 description 1
- 241001045988 Neogene Species 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 101150108906 ORF50 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150046687 ORF51 gene Proteins 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N Phenolsulfonephthalein Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C1(C=2C=CC(O)=CC=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 description 1
- 101100028161 Porcine circovirus 2 ORF4 gene Proteins 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 241000701037 Rhadinovirus Species 0.000 description 1
- 241000282696 Saimiri sciureus Species 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 101150009795 UL54 gene Proteins 0.000 description 1
- ZVQOOHYFBIDMTQ-UHFFFAOYSA-N [methyl(oxido){1-[6-(trifluoromethyl)pyridin-3-yl]ethyl}-lambda(6)-sulfanylidene]cyanamide Chemical compound N#CN=S(C)(=O)C(C)C1=CC=C(C(F)(F)F)N=C1 ZVQOOHYFBIDMTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N beta-D-galactose Chemical group OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000002801 charged material Substances 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 102000051442 human CD59 Human genes 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 101150091879 neo gene Proteins 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 229960003531 phenolsulfonphthalein Drugs 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000007420 reactivation Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000010415 tropism Effects 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/16011—Herpesviridae
- C12N2710/16411—Rhadinovirus, e.g. human herpesvirus 8
- C12N2710/16422—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/16011—Herpesviridae
- C12N2710/16411—Rhadinovirus, e.g. human herpesvirus 8
- C12N2710/16441—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/16443—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Virology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
HERPES VIRUS SAIMIRIA ZPŮSOB JEHO POUŽITÍ JAKO VIROVÉHO VEKTORU <
OBLAST TECHNIKY
Vynález popisuje způsob virové manipulace, jejíž prostředky a produkty jsou použitelné zejména, nikoliv však výhradně, v genové therapii.
DOSAVADNÍ STAV TECHNIKY
Genová therapie většiny chorob je dnes již teoreticky možná, což je důsledek pokroku v lidské genetice. Prvním cílem je konverze fenotypu buněk ze stavu kdy se buňky projevují jako nemocné do stavu, kdy je jejich fenotyp zcela normální, a to pomocí vložení transdominantně působícího genetického materiálu. Konverze této technologie ze systému buněčných kultur do in vivo stádia experimentálních modelů a následně klinické praxe, vyžaduje vyvinutí nových metod účinného doručování genů dobře kontrolovatelným způsobem. Začíná se ukazovat, že zatímco lidská genetika rychle identifikuje nové a nové mutace zodpovědné za projevy dědičných chorob, vývoj nových systémů pro doručování genů do buněk značně zaostává. V současnosti je možné na výběr ze tří způsobů a to doručování pomocí lipozómů, DNA agregátů nebo systémy založené na virových vektorech.
Doručování genů pomocí lipozómů je stále velmi neefektivní způsob přenosu DNA (1), agregáty DNA vzniklé z virových částic a nabitých materiálů, jako je polylysin, značně zvyšují míru internalizace DNA (2), problémem však je standartizace přípravy. Retrovirové a adenovirové vektory jsou limitované velikostí heterologní DNA, kterou je možné vložit do vektoru (3,4) a navíc jsou nespolehlivé co se týče dlouhodobého zajištění exprese heterologního genu. Retro viry integrují do genomu hostitele je však velmi obtížné je přinutit k produkci dostatečně vysokých titrů a vždy obsahují vysoké množství mutací způsobené chybami vzniklými při reverzní transkripci. Navzdory jejich širokému buněčnému tropismu, adenoviry indukují buněčnou imunitní reakci a nukleová kyselina jimi doručená není v dlouhodobě infikovaných buňkách stabilní.
Slibnými kandidáty pro vývoj virových vektorů se zdají být herpesviry, částečně díky jejich schopnosti udržet svůj genom v buňkách v episomální podobě, která neumožňuje replikaci. Množství heterologní DNA, kterou je možné vložit do virové částice je v jejich případě více než 50 Kbp (6) a většinou je velmi snadné s nimi manipulovat in vitro. Virové vektory odvozené od Herpes simplex viru však mají některé podobné problémy jako adenoviry, neboť většina
0 · · · ·
0 0 0 · · · 0··· • · 0 0 0 0 0000 0 000 0 0 0 0 0 000 000 0 00000 0 0
0000 00 00 00 00 00 populace má velmi dobře vyvinutou imunitní odpověď proti tomuto viru. Jiné původně ne lidské herpesviry, které jsou však schopné infikovat lidské buňky, pak mohou tento problém vyřešit.
PODSTATA VYNÁLEZU
Herpesviru saimiri (HSV) je lymfotropní rhadinovirus (γ 2 herpesvirus) infikující opice druhu kotul veverkovitý (Saimiri sciureus). Virus může být snadno izolovaný z periferních lymfocytů zdravých opic kde nezpůsobuje žádnou patrnou chorobu. Virový genom je detekovatelný v episomální formě v T-buňkách a transkripce genomu zůstává limitována na tři geny během nelytické (latentní) fáze. Kompletní virový genom byl zcela sekvenován a v mnoha rysech se podobá lidskému viry Epstain-Baarové (EBV). Genetická organizace se skládá z jedné unikátní kódující oblasti DNA, dlouhé 112 930 bp, obklopené variabilním počtem nekódujících repetitivních sekvencí. Je zde 76 otevřených čtecích rámců, z nichž 60 je podobných genům nalezeným u jiných herpesvirů (7). Zbývající geny jsou sekvenčně homologní (na úrovni proteinu) s lidskými geny známé funkce, včetně proteinů regulujících funkce komplementu, lidského povrchového antigenu CD59 a proteinu spojeného s receptory cyklinu D a G (8,9).
Virus byl rozdělen do tří odlišných kmenů nazvaných A,B a C , podle své schopnosti být (A a B) nebo nebýt (C) onkogenní pro některé jiné druhy opic. Kmen C má dokonce schopnost transformovat lidské T-buňky tak, že jsou schopny omezeného nezávislého růstu in vitro (10). Tato schopnost transformovat buňky je dána genem nazvaným STP (11), který je značně variabilní co se sekvence proteinu týče v rámci kmenů a pouze gen z kmene C je schopen transformovat buňky (12). Gen STP není nezbytný pro normální lytický cyklus viru, nebo jeho episomální údržbu a přirozené deleční genomové mutanty tohoto regionu jsou známé i u divokých kmenů viru (13), tyto kmeny pak nejsou onkogenní. Virové kmeny s delecí tohoto genu byly upraveny tak aby exprimovaly geny, zajišťující rezistenci k volitelným látkám (14). Tyto viry byly použity k důkazu své schopnosti infikovat celou řadu lidských buněčných typů, přenášet heterologní geny s vysokou účinností a zajistit dlouhodobou expresi v nepřítomnosti přirozeného selekčního tlaku. Není známo, že tento virus by byl schopen vyvolat chorobu u lidí, ačkoliv lidské buňky schopen infikovat je. Zdá se tedy, že tento virus je dobrým objektem pro vývoj nereplikujícího se bezpečného vektoru pro lidské buňky. Není však zatím zcela jasné jak se HVS replikuje vzhledem k jeho transkripční kontrole a DNA replikaci.
Všechny dosud sekvenované části herpesviru ukazují, že HVS je velmi sekvenčně podobný EBV. Přesto je kódující region značně menší. Odlišné genové bloky se zdají být u těchto dvou virů velmi podobné, stejně jako u všech herpesvirů. HVS se odlišuje od ostatních herpesvirů přítomností některých genů, které dosud nebyly identifikovány u žádných jiných herpesvirů.
0 0 0 • · • · • · · · · ·
0 0 0 0 0 · 0 0 0 0 • · · β · · · 0 · ·
000 0 0 0 0 0 000 000
00000 0 0 • 00 0 00 00 00 00 00 Každý virový vektor určený k pokusům na lidském materiálu byl až do dnešní doby poškozen buď delecí genů, které nebyly esenciální pro růst v kultuře, nebo delecí esenciálních genů a jejich nahrazením trans formou od pomocné buněčné linie. Odvozením od dobře prostudovaných herpesvirů můžeme předpovídat, že delece některých HVS membránových proteinů bude chránit mezibuněčné rozšiřování. Navíc inaktivací proteinů kontrolujících základních transkripční kontrolní body, jako je E1A u adenovirů (17) a IE175 u herpes simplex viru (18), nevyhnutelně zabrání replikaci těchto virů. Tedy hlavním předmětem této aplikace je zaměřit se na konstrukci mutantního viru, který je neschopen aktivovat časnou a pozdní genovou expresi. Cílovými geny jsou dva transkripční kontrolní proteiny, které jsou produkty IRF50 a 57 a zdají se být nezbytné pro růst v buněčné kultuře.
Publikovaná data (14) ukazují, že Kmen virového vektoru odvozeného od 11/S4 je schopen pouze limitovaného růstu některých buněčných linií. Tedy potřeba deletovat, blokovat nebo manipulovat transkripční kontrolní geny, bude nezbytné pouze v případě buněčných linií, které podporují replikaci viru. Zdá se tedy být žádoucí, za účelem vyprodukování viru pro doručování genů, který by byl zcela bezpečný, vyrobit virus, který je buď neschopný produkovat, nebo produkující nefunkční, transkripční, kontrolní proteiny.
Dalším cílem této aplikace je identifikovat geny, které nejsou nezbytné pro růst, a poté deletovat alespoň část alespoň jednoho z nich, za účelem umožnit inzerci heterologního genetického materiálu do virového genomu.
V současné době existující plasmid určený pro rekombinaci s herpesvirem saimiri je konstruován tak, aby inzertoval heterologní genetický materiál do virového genomu na předem určené místo, které se nalézá v napojení jednoho jedinečného kódujícího regionu DNA a nekódující repetitivní sekvence herpesvirové DNA. Tento plasmid je tedy relativně neflexibilní v otázce způsobu vklonování do virového genomu. Například, je tam několik vhodných restrikčních míst a tedy plasmid není vhodný pro komerční použití. Účelem této aplikace je také identifikovat neesenciální geny, zejména za účelem delece části alespoň jednoho z řečených genů tak, aby vzniklo umělé klonovací místo pro inzerci velkého množství libovolně zvoleného heterologního genetického materiálu. Je jasné, že tato delece neesenciální ch genů a následná inzerce heterologního genetického materiálu, je nezbytná v případě, kdy je třeba vložit do virového genomu velké množství virového heterologního materiálu.
Další aspekt navrhovaného vynálezu je použít herpesvirus saimiri k manipulaci, a to k delecí alespoň části alespoň jednoho genu kontrolujícího transkripci, a pokud možno také alespoň část alespoň jednoho genu kódujícího neesenciální růstové proteiny. Toto je preferovaný aspekt navrhovaného vynálezu, neboť větší počet manipulací s virovým genomem zvyšuje bezpečnost • « · · · · ’ ··············· • ····· · · ···· ·· ·· ·· « 9 99 manipulovaného viru. S ohledem na tento fakt preferujeme také manipulaci s genomem herpesviru saimiri tak, aby byla deletována část, anebo zcela, STP gen. Tuto poslední manipulaci preferujeme i v případě, kdy jsou použity Kmeny A a B, neboť i tak se zvýšeným množstvím manipulací je virus bezpečnější.
Je zřejmé z výše zmíněného, že zde je potřeba vytvořit vhodný systém pro doručování genů, který zaručí intracelulární doručení genetického materiálu, který je přenášen bezpečně, a tedy bez jakýchkoliv cytopatologických následků na cílové buňky.
Prvním účelem navrhovaného vynálezu je tedy popsat bezpečný a kontrolovatelný systém doručování genů. Navíc, vzhledem k množství doručovaného materiálu, je nezbytné vytvořit genový doručovací systém, který bude adaptovaný pro inkorporaci většího množství genetického materiálu, což jsou DNA sekvence od 4 Kbp do 20 Kbp, ideálně pak více než 50 Kbp. Dalším předmětem navrhovaného vynálezu je zajistit genový doručovací systém, který umožní selektivní rekombinaci alespoň jednoho genu nebo jeho části, za stejný gen nebo jeho část, ke kterému byl v cílové buňce doručen.
Nejširším aspektem navrhovaného vynálezu je vytvoření mutantního viru, který je neschopný aktivovat expresi časných i pozdních genů. Jinými slovy, vynález se zabývá přípravou viru, který je neschopný replikace v cílové buňce, a pokud možno v lidské buňce, a/nebo přípravu mutantního viru, který je adaptovaný tak, aby pojal relativně velké množství heterologního genetického materiálu.
Dle prvního aspektu navrhovaného vynálezu je vytvořit herpesvirus saimiri s alespoň jednou mutací v genu zajišťujícím replikaci genu, tato mutace pak zabrání viru, aby se replikoval v cílové lidské buňce.
V preferované variantě vynálezu je řečený gen jeden nebo oba z genů, kódujících transkripční kontrolní proteiny ORF50 a/nebo ORF57.
Preferovaná varianta mutace pak představuje kompletní nebo částečnou deleci jednoho nebo obou genů.
V další variantě navrhovaného vynálezu řečený kmen herpesviru saimiri zcela postrádá nebo má mutaci v STP genu, takže takto upravený virus je neschopný transformovat cílové buňky, a tedy vytvořit onkogenní fenotyp.
Preferovaný virový kmen je dále manipulován tak, že alespoň část alespoň jednoho genu kódujícího neesenciální růstové proteiny je deletovaná. Ideální variantou jsou geny ORF4, ORF14, ORF15, ORF16 a ORF51.
V další preferované variantě navrhovaného vynálezu je řečený virus upraven vložením inzerčního místa, do kterého může být vložen libovolný heterologní materiál. Je vhodné, aby
5»· ·· ·· ···· ·· ·· • · · · · · · · · · · ·········· 1 · ··· « · · · « ··· «· • β···· · · ···· ·· ·· ·· ·· ·· virus byl manipulovaný tak, aby inzerce proběhla buď těsně anebo poblíž delečního místa pro deleci alespoň části neesenciálního genu pro růstový protein, nebo poblíž alespoň jedné nekódující repetitivní sekvence a pokud možno na spoji mezi jedním jedinečným kódujícím regionem DNA a nekódující repetitivní sekvencí. Nejlépe pak, pokud řečený virus je manipulován tak, aby nekódující repetitivní sekvence byla přítomna na jednom nebo obou koncích jednoho jedinečného kódujícího regionu.
V případě, kdy inzerce proběhne uvnitř nebo v blízkosti řečeného delečního místa a řečená delece proběhne, mělo by jít o částečnou nebo kompletní deleci jednoho nebo více následujících genů ORF4, ORF14, ORF15, ORF16 a ORF51.
Dle dalšího aspektu navrhovaného vynálezu je zde popisován herpesvirus saimiri s alespoň jednou mutací v alespoň jednom genu kódujícím neesenciální růstové proteiny.
V další preferované variantě navrhovaného vynálezu se jedná o jeden nebo více genů z ORF4, ORF14, ORF15, ORF16 a ORF51.
Další preferovaná varianta řečené mutace představuje částečnou nebo kompletní deleci jednoho nebo více řečených genů.
Jiná preferovaná varianta navrhovaného vynálezu kmen herpesviru saimiri buď zcela postrádá nebo má mutaci v STP genu, a tedy tento virus je neschopný transformovat cílové buňky a vytvořit onkogenní fenotyp.
Je vhodné, aby řečený virus byl dále manipulován tak, aby alespoň část alespoň jednoho genu nezbytného pro virovou replikaci, byla deletována. Optimální variantou je delece genu ORF50 a/nebo ORF57.
V další preferované variantě preferovaného vynálezu je u viru vytvořeno inzerční místo, do kterého může být inzertován požadovaný heterologní materiál. Je vhodné, aby toto inzerční místo leželo uvnitř, těsně vedle nebo poblíž místa, kde proběhla řečená delece jednoho nebo více genů.
Dle dalšího aspektu navrhovaného vynálezu je herpesvirus saimiri upraven nebo adaptován tak, že je v něm inzertován alespoň jeden vybraný heterologní genetický fragment poblíž delečního místa, které představuje místo částečné nebo naprosté delece alespoň jednoho genu, kódujícího neesenciální růstové proteiny.
V preferované variantě navrhovaného vynálezu je virus upraven mutací v genu nezbytném pro virovou replikaci tak, aby to zamezilo replikaci viru po inzerci tohoto viru do cílové buňky.
Nej vhodnější virový kmen je ten, který postrádá nebo má podstatné mutace v STP genu, tudíž tento virus je zcela neschopen transformovat cílovou buňku a samozřejmě neschopen vytvořit onkogenní fenotyp. Dle dalšího aspektu navrhovaného vynálezu je zde popisován herpesvirus • · · · · · • · • · · · • · · · ·· 4 · · · · • * * · · · « · « · • ··· « · · · · ··· «·· • · · · · · · » ···· ·· ·· ·· ·· «9 saimiri, uvnitř kterého se nachází, nebo který je upravený tak, aby se uvnitř nacházelo inzerční místo pro inzerci alespoň jednoho heterologního genového fragmentu na spoji jediné kódující oblasti a nekódující oblasti, a kdy tento virus byl manipulován tak, aby bylo redukováno na minimum množství nekódujících repetitivních sekvencí přítomných na obou koncích jediného kódujícího regionu a zároveň je upraven mutací v genu nezbytném pro virovou replikaci tak, aby to zamezilo replikaci viru po inzerci řečeného viru do cílové buňky.
Je vhodné, aby počet nekódujících repetitivních sekvencí byl 5 a méně, ideálně 1.
Dalším aspektem navrhovaného vynálezu je popsat transferový vektor, který umožní inzerci heterologního genového fragmentu do DNA viru herpesviru saimiri.
Je preferováno, aby řečená inzerce byla provedena jakoukoliv dříve popsanou inzerční metodou.
V preferované variantě tohoto aspektu obsahuje vektor řadu jedinečných restrikčních míst a ještě lépe tři jedinečná restrikční místa. Navíc řečený vektor obsahuje β galaktosidázový gen, který je pod kontrolou HCMV IE 3 promotoru. Nejlepší je pokud řečený vektor odvozen od pRUNeo (16).
Dle dalšího aspektu navrhovaného vynálezu je upravit herpesvirus saimiri tak, aby měl alespoň jednu mutaci v genu nezbytném pro virovou replikaci, kdy tato mutace je dostatečná pro prevenci virové replikace v cílové buňce a také alespoň jednu mutaci v genu kódujícím neesenciální růstové proteiny.
V preferované variantě vynálezu má herpesvirus saimiri také mutaci v STP genu. Je vhodné aby tyto mutace představovaly buď částečnou nebo kompletní deleci řečených genů.
Je vhodné, aby řečené geny nezbytné pro virovou replikaci byly jeden nebo oba geny pro proteiny kontrolující transkripci ORF50 a/nebo ORF57 a geny kódující neesenciální růstové proteiny byly jeden nebo více z následujících genů: ORF4, ORF14, ORF15, ORF16 a ORF51.
Z výše zmíněného je zřejmé, že virus preferovaný navrhovaným vynálezem obsahuje řadu výhodných kombinací genetických mutací, které slouží pro znemožnění nebo naopak umožnění některých vlastností viru tak, aby byl bezpečný a kontrolovatelný. Termínem znemožnění funkcí je míněná prevence virové replikace v cílové buňce, a termínem umožnění je míněno zvýšení kapacity viru tak, aby byl schopen pojmout inzerci relativně velkých množství heterologního genetického materiálu. Nej důležitějším požadavkem je, aby zmíněné kombinace mutací znemožnily viru transformovat cílovou buňku, a tedy vyprodukovat onkogenní fenotyp.
Dalším aspektem navrhovaného vynálezu je připravit cílové buňky, které budou mít alespoň část vektoru pro genovou terapii herpesviru saimiri.
Ještě dalším aspektem navrhovaného vynálezu je transformovat buňky vektorem herpesviru saimiri, jak bylo popsáno výše.
• · · · · · • · · · · · » to · · · • toto · · · to · · · • to to to to to · · to ··· · to to • · · to to · to to toto·· · · · · · · · · ·♦
Dalším aspektem navrhovaného vynálezu je popsat metodu doručování zvoleného heterologního genetického materiálu do cílových buněk zahrnující vystavení alespoň části buněk herpesviru saimiri, který bude alespoň částečně obsahovat dříve zvolený heterologní genetický materiál za podmínek, které umožní infekci těchto buněk řečeným virem.
Předmět vynálezu bude nyní popsán pomocí příkladů s odkazy na následující materiál a metody.
PŘÍKLADY PROVEDENÍ VYNÁLEZU
PŘÍKLAD 1.
Izolace a charakterizace virových mutantů
Manipulovaný virus je modifikován z kmene 11, který neobsahuje ORF1 (STP) gen. Ačkoliv normálně by byl zvolen “divoký” kmen, je výhodnější když je vektor odvozen od viru, který má tento gen odstraněný. Modifikovaný kmen může mít esenciální kmeny deletované, a tedy je nezbytné vytvořit pomocnou buněčnou linii (detaily dále). To bylo uskutečněno pomocí kotransfekce s vhodným HVS genomovým klonem plus pSV2Neo, a izolovaným buněčným klonem, který je G418 rezistentní. Tyto buněčné klony byly prvně kontrolovány pomocí PCR na přítomnost požadovaných genových sekvencí, a ty, které byly testovány pozitivně, byly analyzovány pomocí RT-PCR na přítomnost RNA transkriptů genů zajištěné trans. Příslušné klony byly namnoženy a použity pro kotransfekci virovou DNA a deleěním konstruktem. Viry exprimující β-galaktosidázu (což je měřitelné mírou metabolizace X-gal) byly testovány pro svoji schopnost replikovat se v pomocných buňkách a v normálních Věro buňkách, a následně v lidských buněčných liniích několika typů. Publikovaná data naznačují, že vektory odvozené od kmene 11 jsou schopné limitovaného růstu v několika buněčných liniích B-buněk (Ráji) a lidských fetálních fibroblastech (HFF). Ráji buňky (transformované pomocí EBV) nejsou reprezentativní normální lidské buňky, proto jsme se rozhodli otestovat růstové charakteristiky těchto virů v lymfoidních buňkách izolovaných z čerstvé periferní krve dospělého člověka, odebrané ze zdravého dobrovolníka, a primárních lidských embryonálních fibroblastech a epiteliálních buňkách, které jsou běžné dostupné z komerčních zdrojů. Replikace byla testována pomocí exprese β-galaktosidázy (důkazy infekce a mezibuněčného šíření) přítomnosti epizomální DNA a expresi typických časných a pozdních genů, detekovatelných pomocí RTPCR. Setrvání v genómu těchto buněk bylo testováno pomocí měření procenta buněk schopných exprimovat reportér gen po několika buněčných generacích a zároveň testování na přítomnost epizomální virové DNA (19).
• 9 ··9 9
9··· 99 · 999 9 • 9» 99 9 9999
99999 9 99 999 999 • 99999 9 9
9999 99 99 99 99 99
Produkce rekombinantních virů s deletovanými geny
Extracelulární viry, sekreto váné buňkami byly izolovány pomocí centriťugace při 30 000 g, po dobu 2 hodin při 4 °C. Částečně purifikovaná peleta viru byla resuspendována v 10 mM Tris/HCl, 1 mM EDTA (TE) pH 8,0. Bylo přidáno SDS do konečné koncentrace 1 % váhy a Proteináza K do koncentrace 100 pg/ml. Vzorky byly inkubovány 16 hodin při 50 °C a poté proběhlo 5 chloroform/fenolových extrakcí v poměru 50:50. Vodná fáze byla odebrána a nukleová kyselina byla precipitována přidáním 0,2 M octanu sodného pH 5,0 a tří objemů 98 % ethanolu. Precipitát DNA byl sebrán ze zkumavek, vysušen na vzduchu a znovu rozpuštěn v odpovídajícím množství TE pufru. Koncentrace DNA byla měřena pomocí absorbance vzorku při 240 nm na spektrofotometru. Purifikovaná virová DNA byla kotransfekována do OMK (ATCC CRL 1556) buněk, za použití plasmidového konstruktu za použití činidla DOTAP.
Po 24 hodinách bylo kultivační médium odstraněno a nahrazeno médiem obsahujícím 2 % tepelně inaktivovaného FCS. Vrstva buněk byla poté pozorována tak dlouho dokud nebyl zřejmý rozvoj extenzivního cytopatického efektu viru. V tomto stádiu byl virus uvolňovaný buňkami sbírán a použit k infekci další generace OMK buněk. Ty byly pokryty po 24 hodinách 1 % agarem s DMEM bez fenolové červeně a 2 % tepelně inaktivovaným FCS. Po 48 hodinách byla přidána X-gal tak aby konečná koncentrace byla 100 μg/ml, což umožnilo identifikovat virové plaky ve kterých se byla exprimována β-galaktosidáza. Modré plaky byly sebrány a poté dvakrát přečištěny plakovou purifikací, dokud nebyla virová populace homogenní. Tyto viry byly poté testovány jestli byla homologní rekombinace korektní za pomoci PCR a Southern blottingu.
Produkce rekombinantních virů obsahujících heterologní geny
Purifikovaná virová DNA, která byla připravena tak jak je popsáno výše, byla kotransfekována do OMK buněk s plasmidovým vektorem (pJG101-105 a/nebo pAW 201, 202, 203, 205, 207 nebo 209), který obsahuje odpovídající heterologní gen nahrazený β-galaktosidázovou sekvencí pro rekombinaci do buď neesenciálních nebo esenciálních genů, nebo do mezigenových oblastí. Rekombinantní viry, které neexprimovaly β-galaktosidázový gen byly selektovány plakovou purifikací stejným způsobem, jaký byl popsán výše.
Infekce buněk s HVS in vitro
Vysoké titry virů byly vyprodukovány pomalým dělením infekcí v OMK nebo Věro buňkách. Vyprodukovaný virus byl titrován z OMK nebo Věro buněk, a byl skladován při -70 °C. Množství viru nezbytné pro infekci konkrétního typu buněk se 100 % účinností bylo stanoveno pomocí infekce definovaného množství buněk při různém množství infekčních částic viru • « · 4 · · • · · · «· · · · · · * ♦ · · · · · · · · • ··· · · · · · ··♦ *·· « ···«· · · ···» ·· ·· 99 99 ·· exprimujících β-galaktosidázu. Adherentní buňky byly infikovány přidáním viru v minimálním množství kultivačního média a inkubovány po dobu 2 hodin v 37 °C za stálého jemného míchání. Po této době bylo médium sebráno a nahrazeno stejným objemem čerstvého média. Neadherentní buňky byly sebrány, spočítány a naředěný tak aby jejich koncentrace byla mezi 106 až 107 buněk na 1 ml roztoku viru v koncentraci která zajistí 100 % účinnost infekce. Po 2 hodinách inkubace za stálého míchání byly buňky ošetřeny stejným způsobem jako bylo popsáno výše.
Produkce pomocné buněčné linie
Virové geny které mají být exprimovány v stabilních buněčných liniích, v trans konformaci, byly klonovány ve vhodném plasmidovém vektoru pod kontrolou jejich vlastní, nebo heterologní 5'nebo 3' kontrolní sekvence. Tento plasmid může také obsahovat volitelný markér, např. gen pro neomycin fosfotransferázu, který zajistí eukaryotickým buňkám rezistenci na látku označovanou G418. Tento gen může být také alternativně přítomen na separátním plasmidu, opět pod kontrolou heterologní eukaryotické kontrolní sekvence, například časného promotoru SV40 a odpovídajícího polyadenylačního signálu. V každém případě je tímto vytvořena buněčná linie. 5 x 106 buněk (nebo odpovídající množství tak aby dalo 40 - 50 % denzitu) jako jsou OMK nebo Věro buňky bylo rozděleno na 10 cm kultivační destičky v 10 ml DMEM s 10 % fetálního telecího séra a inkubováno 12 až 18 hodin při 37 °C v humidifikované atmosféře obsahující 5 % CO2. Po této době byly 2 pg plasmidu transfekovány do těchto buněk za použití DOTAP činidla tak jak bylo popsáno výše pro transfekci virové DNA. Může to být buď jeden plasmid, který obsahuje odpovídající gen a zvolený markér gen, nebo směs 2 pg každého plasmidu. Buňky byly poté inkubovány v 37 °C v humidifikované atmosféře obsahující 5 % CO2 po dobu následujících 48 hodin. V tomto stádiu, další souvislá vrstva buněk byla sebrána z plastikových inkubačních misek promytím 2 x 10 ml fosfát-fyziologického roztoku (PBS, Life Technologies inc., cat no. 20012) a inkubací s 2 ml trypsinu (0,25 % váhových) a EDTA (0,2 % váhových) v PBS. K buněčné suspenzi bylo poté přidáno čerstvé médium, buňky byly spočítány a rozděleny do 96 jamkových destiček pro klonování v limitním ředění, nebo byly rozředěny na 104 buněk na 10 cm kultivační misku. Kultivační médium (DMEM + 10 % FTS) bylo doplněno odpovídající koncentrací G418, která byla dostatečná k tomu aby zcela zlikvidovala všechny netransfekované buňky. Tato koncentrace je závislá jak na počtu buněčných pasáží, tak na jejich typu. Typická koncentrace pro Věro buňky při pasáži číslo 150 je 800 pg/ml. Buňky byly poté přeneseny do výše popsaného kultivačního prostředí a byla sledována míra jejich přežívání v pravidelných intervalech. Kultivační médium bylo měněno každé 3 až 4 dny v závislosti na míře
9 9 9
9 9 9
999 999
9 • 9 9 * 9 9
99 • · · · 9 9 · • 999 • 9
9999 99 přežívání/vymírání buněk. Po 7 až 14 dnech narostly individuální klony buněk, které byly sebrány, naředěny na patřičné množství a testovány na expresi transfekováných HVS genů. To může být provedeno buď za použití imunofluorescence, Northern blottingu nebo method RTPCR, tak jak je v oboru běžné.
Stanovení bezpečnosti buněk
Schopnost modifikovaného viru replikovat se byla stanovena měřením genové exprese viru za použití method RT-PCR, pro výběr okamžitých-časných, časných nebo pozdních genů. Navíc, supematanty z buněčných kultur transdukovaných buněk byly inkubovány s indikátorovými OMK buňkami, tak aby bylo detekováno možné uvolňování infekčních partikulí viru.
Inzerce rekombinantního vektoru
Tato strategie umožňuje produkci rekombinantního vektor, který je schopen inzerce heterologního genu na Ύ konec HVS L DNA. Plasmid pSJNeo (od R. Grassmana) obsahuje 9,4 kb HVS DNA která obsahuje H-L DNA spoj. Restrikční místo pro Smál ležící poblíž 35 bp od první H repetitivní jednotky bylo změněno ne Sáli restrikční místo tak aby to umožnilo inzerci neo genu. Tento vektor je tedy dlouhý pomalý vektor a není vhodný pro inzerci velkých heterologních genů. Expresní vektor pSA91 byl zvolen jako výchozí vektor pro výrobu nového rekombinantního vektoru. Tento vektor je produkován v mnoha kopiích a obsahuje hCMV IE promotor řídící genovou expresi. Pro vytvoření efektivního virového expresního vektoru, umožňujícího rekombinaci, byla sekvence HVS DNA vystřižena z pSIneo a inzertována do jedinečného Narl restrikčního místa umístěného směrem k 5'od promotoru, za použití linker adaptérů. Takto vzniklý vektor byl označen pJGlOl.
Delece ORF06
Gen ORF06 (umístěný mezi bp 12 584 a 15 967) kóduje velký DNA vazebný protein a tedy delece tohoto genu znemožní viru replikaci. Pro výrobu rekombinační kazety pro deleci ORF06, byly vystřiženy obklopující oblasti DNA vystřiženy z pSS54 obsahující oblast HVS DNA od 11507 do 18013 (KnpIF fragment). Fragment Knpl (11507) až Haell (12613) dlouhý 1106bp z 5' ORF06 kódujícího regionu a Sphl (15258) až BglIII (16407) dlouhý 1149 bp byly vystřiženy a ligo vány dohromady pomocí syntetických oligomerů. Tyto oligomery obsahují restrikční místa EcoRI a BamHI, jak je ukázáno níže, tak aby byla do tohoto místa možná inzerce heterologního genu. Je nezbytné zajistit aby 3' konec ORF06 obsahoval promotor ORF07. Ligovaný Knpl •4 4444
4
444 • 4
44 • 4 4 4 4 4
4 4 4 4 ·
444 ♦ 4 4
4 4 4 4
4444 44 44 44
BglI fragment byl inzertován do klonovacího vektoru pBluescript KS tak aby vznikla rekombinační kazeta pJG102.
Sekvence oligomerů spojujících fragmenty:
TGAATTCGGATCCGCATG CGCGACTTAAGCCTAGGC HaelII EcoRI BamlII Sphl
Konstrukce ORF06 pro výrobu pomocné buněčné linie
Pro výrobu HVS postrádajícího oblast kódující ORF06 je nezbytné zajistit produkci genu ORF06 v trans. Toho je dosaženo pomocí stabilní pomocné buněčné linie.Gen ORF06 je vystřižen z pSS54 jako Haell (12613) - Pstl (15998) fragment. Syntetické oligomery (jak jsou zobrazeny výše) byly použity pro přesnou výrobu začátku kódující oblasti ORF06 a pro umožnění inzerce do expresního vektoru pSVK3 (Pharmacia). Následuje ligace syntetických oligomerů na 5' konec ORF06 a EcoRI - Psi fragment je ligo ván do pSVK3 tak aby vznikl pJG103. Tak bude exprese řízena z časného promotoru SV40, použití alternativních promotorů minimalizuje míru rekombinací v pomocné buněčné linii.
Sekvence oligomerů:
AAŤTCATGGCAACGAAGACAGCGCAACCTAGCGC
GTACCGTTGCTTCTGTCGCGTTGGAT
EcoRI ORF06 start Haell
Delece ORF51
Gen ORF51 byl vystřižen z pKK104 jako Hpal (72602) - Stul (73495) fragment o délce 806 bp a vklonován do SV40 expresního vektoru pSVK3. EcoRI linkery byly napojeny na 5' a 3' koncích ORF1 tak aby umožnily tuto klonovací reakci. Výsledný expresní vektor obsahující ORF51 byl označen pJG105.
Delece ORF57
Gen ORF57 kóduje transkripční aktivátor homologní s HSV-1 UL54, což je esenciální velmi časný gen. Aby bylo možné vytvořit virus s kompletní delecí ORF57, bylo třeba amplifikovat oblasti přilehlé kódující oblasti ORF57 tak aby to umožnilo homologní rekombinaci s virovou DNA. Byly připraveny tyto primery:
•4 4444 • 4 4 · 44 4 444 4
444 44 · 4444 t 4 444 9 4 4 4 9 994 444
44444 4 4
4444 44 44 44 44 44
5'-dGGC GAA TTC GTC TAT AAC TGA CTG GGT TGC TG
5'-dGCC CTG CAG GCA GTT ACT CAC CAT AGC TTG AG
5'-dGCC CTG CAG CAA GTG TCC AAG CTC TAC TTG TGC
5'-dGGG GCA TCC CTA TTG ATG TGC CAA GCA ATA GGG T která amplifikují dvě oblasti HSV a to konkrétně 77870 až 78260 a 79530 až 80120, a do nichž byla vložena vhodná restrikční místa tak aby umožnila vklonování. Trojitá ligace proběhla za použití těchto fragmentů a pUC18, dříve naštípané pomocí EcoRI a Sphl, tak aby vznikl pAWIOl. Tento plasmid byl pak linearizován pomocí Pstl a Sáli a ligo ván s lacZ genem pod kontrolou hCMV IE promotoru, tak aby vznikl PdeltaORF57, který byl uložen v National Collection of Industrial and Marině Bacteria Ltd (NCIMB), 23 St. Máchán Drive, Aberdeen, AB2 IRY, pod depozitním číslem 40894.
Inzerční inaktivace HVS konstruktu
Inzerční inaktivace je méně preferovaná metoda prevence genu před funkcí, spočívá v umístění indikátorového β-galaktosidázového genu do kódující sekvence patřičného genu, bez předchozího odstranění jakékoliv části daného otevřeného čtecího rámce. Existuje riziko náhodné rekombinace které vede k deleci β-gal sekvence a nemožnosti ligace otevřeného čtecího rámce umožňující reaktivaci genu.
Pro vytvoření inzerčně inaktivováného genu byl konstruován transferový vektor který inaktivuje každý konkrétní gen inzercí lacZ genu pod kontrolou I.E. CMV promotoru na 5' konci kódující oblasti ORF. Tento inaktivo váný gen byl poté inzertován do virového genomu, kotransfekcí plasmidu a DNA viru HVS tak aby vznikl rekombinantní virus, který je pak plakově purifikován.
Konstrukce plasmidu
ORF4 / kontrolní protein komplementu
Plasmid pJC81-KpnB byl naštěpen BglII a Pstl tak aby vznikl fragment dlouhý 1152 bp obsahující kódující oblast ORF4. Tento fragment byl ligován do pUC18 tak, aby vznikl pUCORF4. Tento plasmid byl linearizován za použití BglII, konce byly dokončeny pomocí T4 DNA polymerázy do formy tupých konců, a byl ligován s fragmentem s tupými konci obsahujícím lacZ gen pod kontrolou IE CMV promotoru, tak aby vznikl pAW201.
·· ···· • φ · · φ φ φ φ • ΦΦΦΦ· ·· ·· ·· ·Φ
0RF14 / malý ΙΕ gen
Plasmid pACYC184-EcoF byl naštěpen pomocí EcoRI a Pstl tak aby vznikl fragment dlouhý 3189 bp, obsahující kódující oblast ORF14. Tento fragment byl ligován do pUC18 tak, aby vznikl pUCORF14. Tento plasmid byl linearizován pomocí KpnI, konce byly dokončeny pomocí T4 DNA polymerázy do formy tupých konců, a byl ligován s fragmentem s tupými konci obsahujícím lacZ gen pod kontrolou IE CMV promotoru, tak aby vznikl pAW202.
ORF15 / CD59 homolog
Plasmid pACYC184-EcoF byl naštěpen pomocí Sstl a Pstl tak aby vznikl fragment dlouhý 2415 bp, obsahující kódující oblast ORF15. Tento fragment byl ligován do pUC18 tak, aby vznikl pUCORF15. Tento plasmid byl linearizován pomocí MunI, konce byly dokončeny pomocí T4 DNA polymerázy do formy tupých konců, a byl ligován s fragmentem s tupými konci obsahujícím lacZ gen pod kontrolou IE CMV promotoru, tak aby vznikl pAW203.
ORF50 / hlavní transkripční aktivátor
Plasmid pACYC184-EcoD byl naštěpen pomocí BglII a Pstl tak aby vznikl fragment dlouhý 4149 bp, obsahující kódující oblast ORF50. Tento fragment byl ligován do pUC18 tak, aby vznikl pAW204. Tento plasmid byl naštěpen pomocí Pstl a ligován s DNA fragmentem obsahujícím lacZ gen pod kontrolou IE CMV promotoru, tak aby vznikl PdeltaORF50. Který byl uložen v NCIMB, stejně jak bylo zmíněno výše, pod číslem 40892. Pomocná buněčná linie byla konstruovaná za použití PUCPST který je uložen v NCIMB, stejně jak bylo zmíněno výše, pod číslem 40893, což je pUC18 obsahující Pstl fragment DNA viru HVS obklopený oběma exony genu.
ORF57 / IE gen
Plasmid pACYC184-EcoJ byl naštěpen pomocí BglII, konce byly dokončeny pomocí T4 DNA polymerázy do formy tupých konců, a byl ligován s fragmentem s tupými konci obsahujícím lacZ gen pod kontrolou IE CMV promotoru, tak aby vznikl pAW203.
Pro konstrukci pomocné buněčné linie byla kódující sekvence ORF57 amplifikována pomocí PCR za použití následujících primerů:
5'-d CCG GGT ACC CAC ATG TCT ATA ATC GAC TGG GTT
-D CGG GGT ACC CTG AGT CAT TAG TAG TAG CTC ATG
Tyto PCR fragmenty byly poté ligovány do TA klonovacího vektoru pCRII a označeny pAW207.
• 9 99 ·9 ·9·9 99 «9
0RF16 / supresor apoptózy
Neboť tato kódující oblast neobsahuje žádné konvenční restrikční místo, byla amplifikována pomocí PCR, což umožnilo vložit na 5' konec kódující oblasti Pstl restrikční místo aby bylo proveditelné následné klonování, pomocí následujících primerů:
5'-d GCC GAA TCC CAC AGT GCC AAG CTT GCC AGT T
5'-d CGC CTG CAG GGT GTA TAA CTG AGT GTT ACA GC
5'-d GGG CTG CAG GCT GTA CAC TCA GTT ATA CAC C
5'-d CCC GCA TGC ACT TGA TCC AGG ACA TGC TTC
Získané produkty PCR byly ligo vány s pUC18 tak aby vznikl pAW208. Plasmid byl linearizován pomocí Pstl a ligován s lacZ genem pod kontrolou IE CMV promotoru, tak aby vznikl pAW2-09. Pomocná buněčná linie byla konstruována pomocí pAW208.
·· «· ► · · 4 • · « * ♦ « · «
XJ·» »*Λ·
REFERENCE
Ledley, F. D. (1994) Non-viral gene therapy Curr. Opinion Biotech 5, 626-636.
Wagner, E., Cotten, M., Foisner, R., and Bimsteil, M., (1991) Transferrin-polycation complexes: the effect of polycations on the structure of the complex and DNA delivery to cells. Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88:4255-4259.
Rich, D.P., Couture, L.A., Cardoza, L.M. Guiggio, V. M., Armentano, D., Espino, P. C., Hehir, K., Welsh, M. J., Smith, A. E. and Gregory, R.
J. (1993) Development and analysis of recombinant adenoviruses for gene therapy of cystic fibrosis. Hum. Gene Ther. 4:461-476.
Gordon, E. M. and Anderson, W. F. (1994) Gene therapy using retroviral vectors. Curr. Opinion Biotech. 5:611-616.
Crystal, R. G., McElvaney, N. G., Rosenfeld, M. A., Chu, C., Mastrangeli, A., Hay, J. G., Brody, S. L., Jaffe, H. A., Eissa, Ν. T. and Danel, C. (1994) Administration of an adenovirus containing the human CFTR cDNA to the respirátory tract of individuals with cystic fibrosis Nátuře Genet. 8:42-51.
Locker, H. and Frenkel, N. (1979) Structure and origin of defective genomes contained in serially passaged herpes simplex virus type 1 (Justin). J. Virol. 29:1065-1077.
Davison, A. J. (1993) Herpesvirus genes. Rev. Med. Virol. 3:237-24 • fe ··*· > ' ' X ·*» » ·
1C
Albrecht, J-C., Nicholas, J., Biller, • fe fefe • · · · fe fefe · « · · fefefe
D.‘,’Cameron,TL Rf, BiešfngSř, B.,
Newman, C., Wittmann, S., Craxton, M. A., Coleman, H., Fleckenstein, B. and Honess, R. W. (1992) Primary structure of the Herpesvirus saimiri genome. J. Virol. 66:5047-5048.
Jung, J. U., Stager, M., and Desrosiers, R. C. (1994) Virus-encoded cyclin Mol. Cell Biol. 14:7235-7244.
Biesinger, B., Muller-Fleckenstein, I., Simmer, B., Lang, G., Wittmann,
S., Platzer, E., Desrosiers, R. C. and Fleckenstein, B (1992) Stable growth transformation of human T lymphocytes by herpesvirus saimiri. Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89:3116-3119.
Murthy, S. C. S., Trimble, J. J, and Desrosiers, R. C. (1989) Deletion mutants of herpesvirus saimiri defíne an open reading frame necessary for transformation. J. Virol 63:3307-3314.
Grassmann, R., Fleckenstein B. and Desrosiers, R. C. (1994) Viral transformation ofhumanT lymphocytes. Adv. Cancer Res. 63:211-244.
Desroisers, R. C., Burghoff, R. L. Bakker, A. and Kamine, J. (1984) Construction of replication-competent herpesvirus saimiri deletion mutants J. Virol 49:343-348.
Simmer, B., Alt, M., Buckreus, I., Berthold, S., Fleckenstein, B., Platzer, E. and Grassmann, R. (1991) Persistence of selectable herpesvirus saimiri in various human haemopoietic and epithelial cell lineš. J. Gen. Virol. 72:1953-1958.
Chang, Y., Cesarman, E., Pessin, M. S., Lee, F., Culpepper, J., Knowles,
D. M. and Moore, P. S. (1994) Identification of heipesvirus-like DNA sequences in AIDS-associated Kaposi's sarcoma. Science 266:18651871.
/7 φφ ·* φ · · · • · · φ φφφ φ φ ··»* »φ • · φ φ φ • φ φ φ«
Φ· ·9 Φ Φ · Φ
Φ · · ·
ΦΦΦ ΦΦΦ
Φ Φ *Φ Φ·
Grassmann, R. and Fleckenstein, Β. (1989) Selectable recombinant herpesvirus saimiri is capable of persisting in a human T-cell line. J. Virol 63:1818-1821.
17. Berkner, K. L. (1988) Development of Adenovirus vectors for the expression of heterologous genes. BioTechniques, 6, 616-629.
18. Glorioso, J., Goins, W. F., and Fink, D. J. (1992) Herpes simplex virusbased vectors Semin. Virol. 3:265-276.
19. Gardella, T., Medveczky, P., Sairenji, T. and Mulder, C. (1984) Detection of circular and linear herpesvirus DNA molecules in mammalian cells by gel electrophoresis. J. Virol. 50:248-254.
Claims (22)
1.
Herpesvirus saimiri vyznačující se tím, že obsahuje alespoň jednu mutaci v alespoň jednom genu kódujícím protein nezbytný pro replikaci viru, kde uvedená mutace zabrání viru replikovat se v lidské buňce.
2.
Herpesvirus saimiri dle nároku 1, vyznačující se tím, že uvedený mutovaný gen je buď ORF50 a/nebo ORF57.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
Herpesvirus saimiri dle všech předchozích nároků, vyznačující se tím, že uvedený virus má také mutaci v genu způsobujícím transformaci, jako je STP gen.
Herpesvirus saimiri dle všech předchozích nároků, vyznačující se tím, že uvedený virus má také mutaci v alespoň jednom genu z následujících ORF4, ORF14, ORF15, ORF16, ORF51.
Herpesvirus saimiri dle všech předchozích nároků, vyznačující se tím, že uvedená mutace je kompletní nebo částečná mutace uvedeného genu.
Herpesvirus saimiri dle všech předchozích nároků, vyznačující se tím, že uvedený virus je připraven s inzerčním místem pro inzerci heterologního genetického materiálu.
Herpesvirus saimiri dle nároku 6, vyznačující se tím, že inzerční místo je umístěno uvnitř a nebo poblíž alespoň jedné nekódující repetitivní sekvence a pokud možno na spoji mezi jedinečnou kódující sekvencí a nekódující sekvencí.
Herpesvirus saimiri dle nároků 6 a 7, a závislý i na nároku 5, vyznačující se tím, že uvedené inzertní místo je umístěno na místě uvedené delece.
Herpesvirus saimiri dle nároku 6, vyznačující se tím, že inzerční místo je umístěno v, nebo leží poblíž alespoň jednoho z následujících genů ORF4, ORF14, ORF15, ORF16, ORF51.
Herpesvirus saimiri, vyznačující se tím, že uvedený gen je jeden z následujících ORF4, ORF14, ORF15, ORF16, ORF51.
Herpesvirus saimiri dle nároku 10, vyznačující se tím, že uvedená mutace je kompletní nebo částečná mutace uvedeného genu.
12. Herpesvirus saimiri dle nároků 10 až 11, vyznačující se tím, že uvedený virus má také mutaci v genu způsobujícím transformaci, jako je STP gen.
99 9 9 9
9 9
13. Herpesvirus saimiri dle nároků 10 až 12, vyznačující se tím, že uvedený virus je dále manipulován tak, že alespoň část genu kódujícího ORF50 a/nebo ORF57 je mutována a/nebo deletována.
14. Herpesvirus saimiri dle nároků 10 až 13, vyznačující se tím, že uvedený virus je připraven s inzerčním místem pro inzerci heterologní DNA.
15. Herpesvirus saimiri, dle nároku 10, vyznačující se tím, že má uvnitř inzertovanou, nebo je připraven pro inzerci alespoň jednoho předem vybraného heterologního DNA fragmentu poblíž místa delece, toto místo pak představuje místo částečné nebo kompletní delece alespoň jednoho genu kódujícího neesenciální gen a uvedený virus je dále mutován nebo deletován v genu kódujícím protein nezbytný pro virovou replikaci.
16. Herpesvirus saimiri dle nároku 15, vyznačující se tím, že uvedený virus má také mutaci v genu způsobujícím transformaci, jako je STP gen.
17. Herpesvirus saimiri, vyznačující se tím, že má uvnitř inzertovanou, nebo je připraven pro inzerci alespoň jednoho předem vybraného heterologního DNA fragmentu na spojení jedinečného kódujícího regionu a nekódující oblasti, dále uvedený virus obsahuje redukovaný počet repetitivních nekódujících sekvencí na jednom nebo obou koncích jedinečné kódující oblasti a virus také obsahuje alespoň jednu mutaci v alespoň jednom genu kódujícím protein nezbytný pro replikaci viru.
18. Herpesvirus saimiri dle nároku 17, vyznačující se tím, že počet uvedených nekódujících repetitivních sekvencí je 5 a méně a ideálně pak 1.
19. Herpesvirus saimiri dle nároku 1, vyznačující se tím, že má alespoň jednu mutaci v genu kódujícím protein nezbytný pro replikaci viru a mutaci v genu kódujícím neesenciální protein,
20. Herpesvirus saimiri dle nároku 19, vyznačující se tím, že uvedený virus má také mutaci v genu způsobujícím transformaci, jako je STP gen.
21. Herpesvirus saimiri dle nároků 19 a 20, vyznačující se tím, že uvedená mutace je kompletní nebo částečná mutace uvedeného genu.
22. Herpesvirus saimiri dle nároků 19 až 21, vyznačující se tím, že uvedený mutovaný gen kódující protein nezbytný pro replikaci viru je buď ORF50 nebo ORF57.
99 99 • 9 9 9 9 9
9 9 9 9 9
9 999·· 9
9 9 9 9
9999 99 99 ·»
23. Herpesvirus saimiri dle nároků 19 až 22, vyznačující se tím, že uvedený gen, kódující neesenciální protein, je jeden z následujících ORF4, ORF14, ORF15, ORF16, ORF51.
24. Způsob doručení zvolené heterologní DNA do cílové buňky, vyznačující se tím, že cílové buňky jsou inkubovány s herpesvirem saimiri dle nároků 6 až 9 a 14 až 18, který obsahuje alespoň část předem zvolené DNA, za podmínek, které umožní virovou infekci.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GBGB9618477.5A GB9618477D0 (en) | 1996-09-04 | 1996-09-04 | Gene therapy |
| PCT/GB1997/002371 WO1998010083A1 (en) | 1996-09-04 | 1997-09-04 | Herpesvirus saimiri as viral vector |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ69799A3 true CZ69799A3 (cs) | 1999-08-11 |
Family
ID=10799414
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ99697A CZ69799A3 (cs) | 1996-09-04 | 1997-09-04 | Herpesvirus saimiri a způsob jeho použití jako virového vektoru |
Country Status (18)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6379967B1 (cs) |
| EP (1) | EP0939828B1 (cs) |
| JP (1) | JP2000517191A (cs) |
| KR (1) | KR20000068461A (cs) |
| CN (1) | CN1237209A (cs) |
| AT (1) | ATE342997T1 (cs) |
| AU (1) | AU737197B2 (cs) |
| BR (1) | BR9711998A (cs) |
| CA (1) | CA2264956A1 (cs) |
| CZ (1) | CZ69799A3 (cs) |
| DE (1) | DE69736838T2 (cs) |
| ES (1) | ES2274541T3 (cs) |
| GB (1) | GB9618477D0 (cs) |
| HU (1) | HUP9904329A3 (cs) |
| IL (1) | IL128635A0 (cs) |
| NZ (1) | NZ334323A (cs) |
| SG (1) | SG91252A1 (cs) |
| WO (1) | WO1998010083A1 (cs) |
Families Citing this family (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB9826069D0 (en) * | 1998-11-28 | 1999-01-20 | Univ Leeds | HIV vaccine |
| GB9903694D0 (en) | 1999-02-19 | 1999-04-14 | Univ Leeds | Latency-associated regulatory region |
| US7198924B2 (en) | 2000-12-11 | 2007-04-03 | Invitrogen Corporation | Methods and compositions for synthesis of nucleic acid molecules using multiple recognition sites |
| US7754208B2 (en) | 2001-01-17 | 2010-07-13 | Trubion Pharmaceuticals, Inc. | Binding domain-immunoglobulin fusion proteins |
| US7829084B2 (en) * | 2001-01-17 | 2010-11-09 | Trubion Pharmaceuticals, Inc. | Binding constructs and methods for use thereof |
| AU2003253992A1 (en) * | 2002-07-18 | 2004-02-09 | Robert P. Bennett | Viral vectors containing recombination sites |
| EP1687323A4 (en) | 2003-08-08 | 2009-08-12 | Life Technologies Corp | METHODS AND COMPOSITIONS FOR DIRECT CLONING OF NUCLEIC ACID MOLECULES |
| EP1697534B1 (en) | 2003-12-01 | 2010-06-02 | Life Technologies Corporation | Nucleic acid molecules containing recombination sites and methods of using the same |
| ES2460517T3 (es) | 2005-07-25 | 2014-05-13 | Emergent Product Development Seattle, Llc | Reducción de células b mediante el uso de moléculas de unión específica a cd37 y de unión específica a cd20 |
| KR101571027B1 (ko) | 2006-06-12 | 2015-11-23 | 이머전트 프로덕트 디벨롭먼트 시애틀, 엘엘씨 | 효과기 기능을 갖는 단일쇄 다가 결합 단백질 |
| AU2008287195A1 (en) * | 2007-07-06 | 2009-02-19 | Emergent Product Development Seattle, Llc | Binding peptides having a C-terminally disposed specific binding domain |
| CN102099377A (zh) * | 2008-04-11 | 2011-06-15 | 新兴产品开发西雅图有限公司 | Cd37免疫治疗剂及其与双功能化学治疗剂的联合 |
| CA2999138C (en) | 2015-09-21 | 2024-05-21 | Aptevo Research And Development Llc | Cd3 binding polypeptides |
| WO2018048869A1 (en) * | 2016-09-06 | 2018-03-15 | Bioventures, Llc | Compositions and methods for generating reversion free attenuated and/or replication incompetent vaccine vectors |
| CN107653345B (zh) * | 2017-11-08 | 2021-04-27 | 中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所 | 猴b病毒实时荧光定量pcr方法及其通用引物、mgb探针与试剂盒 |
| RU2771081C2 (ru) * | 2020-08-25 | 2022-04-26 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) | Рекомбинантный штамм Herpesvirus saimiri для получения популяций иммортализованных аутологичных Т-лимфоцитов, экспрессирующих парные химерные рецепторы против опухолевых антигенов CD44 и CD133 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5672344A (en) * | 1987-12-30 | 1997-09-30 | The Regents Of The University Of Michigan | Viral-mediated gene transfer system |
| EP0437516A4 (en) * | 1988-10-06 | 1991-09-25 | Dana Farber Cancer Institute | H. saimiri-htlv-x region vector |
| DE3834157A1 (de) * | 1988-10-07 | 1990-04-19 | Behringwerke Ag | Selektionierbare vektoren fuer humane t-zellen |
-
1996
- 1996-09-04 GB GBGB9618477.5A patent/GB9618477D0/en active Pending
-
1997
- 1997-09-04 HU HU9904329A patent/HUP9904329A3/hu unknown
- 1997-09-04 SG SG200000410A patent/SG91252A1/en unknown
- 1997-09-04 CN CN97199571A patent/CN1237209A/zh active Pending
- 1997-09-04 BR BR9711998-9A patent/BR9711998A/pt not_active Application Discontinuation
- 1997-09-04 CZ CZ99697A patent/CZ69799A3/cs unknown
- 1997-09-04 KR KR1019997001842A patent/KR20000068461A/ko not_active Application Discontinuation
- 1997-09-04 IL IL12863597A patent/IL128635A0/xx unknown
- 1997-09-04 EP EP97919133A patent/EP0939828B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-09-04 AU AU43071/97A patent/AU737197B2/en not_active Ceased
- 1997-09-04 ES ES97919133T patent/ES2274541T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1997-09-04 NZ NZ334323A patent/NZ334323A/en unknown
- 1997-09-04 JP JP10512354A patent/JP2000517191A/ja active Pending
- 1997-09-04 AT AT97919133T patent/ATE342997T1/de not_active IP Right Cessation
- 1997-09-04 WO PCT/GB1997/002371 patent/WO1998010083A1/en active IP Right Grant
- 1997-09-04 US US09/254,326 patent/US6379967B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1997-09-04 CA CA002264956A patent/CA2264956A1/en not_active Abandoned
- 1997-09-04 DE DE69736838T patent/DE69736838T2/de not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| HUP9904329A3 (en) | 2002-01-28 |
| JP2000517191A (ja) | 2000-12-26 |
| BR9711998A (pt) | 2000-01-18 |
| NZ334323A (en) | 2000-06-23 |
| KR20000068461A (ko) | 2000-11-25 |
| CN1237209A (zh) | 1999-12-01 |
| EP0939828A1 (en) | 1999-09-08 |
| DE69736838T2 (de) | 2007-10-31 |
| CA2264956A1 (en) | 1998-03-12 |
| EP0939828B1 (en) | 2006-10-18 |
| SG91252A1 (en) | 2002-09-17 |
| AU4307197A (en) | 1998-03-26 |
| US6379967B1 (en) | 2002-04-30 |
| WO1998010083A1 (en) | 1998-03-12 |
| HUP9904329A2 (hu) | 2000-04-28 |
| ES2274541T3 (es) | 2007-05-16 |
| IL128635A0 (en) | 2000-01-31 |
| GB9618477D0 (en) | 1996-10-16 |
| ATE342997T1 (de) | 2006-11-15 |
| DE69736838D1 (de) | 2006-11-30 |
| AU737197B2 (en) | 2001-08-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US6395519B1 (en) | Means and methods for nucleic acid delivery vehicle design and nucleic acid transfer | |
| CA2117668C (en) | Recombinant adenovirus and process for producing the same | |
| US6413776B1 (en) | High throughput screening of gene function using adenoviral libraries for functional genomics applications | |
| CZ69799A3 (cs) | Herpesvirus saimiri a způsob jeho použití jako virového vektoru | |
| Mittereder et al. | Evaluation of the efficacy and safety of in vitro, adenovirus-mediated transfer of the human cystic fibrosis transmembrane conductance regulator cDNA | |
| US20050074885A1 (en) | Packaging systems for human recombinant adenovirus to be used in gene therapy | |
| US6319703B1 (en) | Recombinant virus vectors | |
| PT1550722E (pt) | ''adenovírus humano recombinante do serótipo 35'' | |
| CA2378061A1 (en) | Packaging systems for human recombinant adenovirus to be used in gene therapy | |
| AU735339B2 (en) | EHV-1 vectors | |
| Rinaldi et al. | A non-cytotoxic herpes simplex virus vector which expresses Cre recombinase directs efficient site specific recombination | |
| US20020051966A1 (en) | Efficient generation of adenovirus-based libraries by positive selection of adenoviral recombinants through ectopic expression of the adenovirus protease | |
| MXPA99002122A (en) | Herpesvirus saimiri as viral vector | |
| Zhang | Adenoviral vectors: development and application | |
| Kasai et al. | DNA-based methods to prepare helper virus-free herpes amplicon vectors and versatile design of amplicon vector plasmids | |
| NZ503452A (en) | Herpesvirus saimiri having mutation in ORF4, ORF14, ORF15, ORF16 or ORF51 genes resulting in non-replicating, safe vehicle for treatments involving gene therapy | |
| AU766771B2 (en) | Packaging systems for human recombinant adenoviruses to be used in gene therapy | |
| NZ515107A (en) | A recombinant adenovirus vector and cell lines containing E1 and or E2A deletions. | |
| WO2000072887A9 (en) | A novel packaging cell line for the rescue, production and titration of high-capacity adenovirus amplicon vectors | |
| AU2003227281B2 (en) | Packaging systems for human recombinant adenoviruses to be used in gene therapy |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic |