ES2274541T3 - Herpesvirus saimiri como vector viral. - Google Patents

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Abstract

EL OBJETO DE LA PRESENTE INVENCION CONSISTE EN UN MEDIO DE TRATAMIENTO DEL VIRUS DEL HERPES DEL MONO-ARDILLA (SEMIN) MODIFICADO GENETICAMENTE POR MUTACION Y/O SUPRESION DE GENES ESENCIALES Y NO ESENCIALES ESPECIFICOS. LOS GENES ESENCIALES SON NECESARIOS EN LA REPLICACION DE LOS GENES VIRALES Y LA PROLIFERACION VIRAL. LOS GENES NO ESENCIALES PUEDEN REPRESENTAR UNOS SITIOS DE INSERCION DE MATERIAL GENETICO HETEROLOGO, A SABER GENES TERAPEUTICOS.

Description

Herpesvirus saimiri como vector viral.
La invención se refiere a un procedimiento para la manipulación de virus; por lo tanto medios y productos del mismo que tienen aplicación particular, pero no exclusiva, en la terapia génica.
La terapia génica de muchas enfermedades es posible ahora teóricamente, como resultado de los nuevos avances en genética humana. La meta principal es la conversión del fenotipo celular de un estado de enfermedad a uno normal, a través de la inserción de material genético de actuación dominante. La conversión de esta tecnología de sistemas de cultivos celulares a modelos experimentales in vivo (y subsiguientemente a los clínicos) necesita el desarrollo de nuevos procedimientos para la inserción eficiente de genes de una forma controlada. Está resultando evidente que aunque la genética humana se está moviendo a una velocidad rápida en la identificación de mutaciones específicas de enfermedades, existe una ausencia relativa del desarrollo del sistema de inserción de genes. En la actualidad, existe una elección entre sistemas de liposomas, agregados de ADN o basados en virus.
La inserción de liposomas todavía es muy ineficiente en la transferencia de ADN (1), agregados de ADN formados entre partículas de virus y materiales cargados tales como la polilisina potencia la absorción de ADN (2) pero la normalización de las preparaciones es muy difícil. Tanto los vectores de retrovirus como de adenovirus tienen limitaciones en el tamaño del ADN heterólogo incorporado en el vector (3,4) y son poco fiables para conseguir expresiones genéticas heterólogas a largo plazo. Los retrovirus se integran en el genoma hospedador pero son difíciles de producir en forma de reservas elevadas de titulaciones y tienen una elevada proporción de mutación esencialmente a través de errores introducidos durante la trascripción inversa. A pesar de su amplio tropismo celular, los adenovirus inducen una respuesta inmunológica de mediación celular y el ácido nucleico no es estable a largo plazo en las células infectadas (5).
Los herpesvirus representan candidatos prometedores para el desarrollo en forma de vectores, debido en parte a su capacidad para mantener su genoma en células de una forma episomal que se bloquea de la repetición. Su capacidad para empaquetar secuencias de ADN heterólogas es potencialmente >50 Kbp (6) y la mayor parte se manipula con facilidad in vitro. Es probable que los vectores derivados de herpes simplex tengan en parte algunos de los mismos problemas que los adenovirus, en que la mayoría de la población ya tiene una respuesta inmunológica bien desarrollada al virus. Sin embargo, otros herepesvirus no humanos que son capaces de infectar células humanas no deberían sufrir esta desventaja.
El Herpesvirus saimiri (HVS) es un rhadinovirus linfotrópico (_{\gamma}2 herpesvirus) del mono ardilla (Saimiri sciureus). El virus se puede aislar de forma rutinaria de linfocitos periféricos de monos sanos y provoca enfermedad no aparente en la especie. El genoma del virus se puede detectar de forma episomal en células T y la trascripción del genoma aparece limitada a tres genes en el estado no lítico ("latente"). El genoma del virus completo se ha secuenciado y comparte muchas características en común con el virus Epstein-Barr humano (EBV). La organización genética consiste en una región codificadora única sencilla de ADN, 112.930 bp de longitud, flanqueada por un número variable de secuencias repetidas no codificadoras. Existen 76 fases de lectura abiertas, 60 de las cuales tienen similitudes con genes encontrados en otros herpesvirus (7). El resto de genes comparten homología secuencial (al nivel de proteína) con genes humanos de función conocida, incluyendo proteínas de control del complemento, antígeno de superficie celular CD59, receptores acoplados a las proteínas D y G ciclinas (8, 9).
El virus se ha dividido en tres cepas distintas denominadas A, B y C, basadas en su incapacidad (A y B) o capacidad (C) de ser oncogénicas en otras ciertas especies de monos. Las cepas C tienen la capacidad de transformar células T humanas al crecimiento independiente limitado in vitro (10). Esta capacidad para transformar células se debe a un gen denominado STP (11) que ha marcado variabilidad en la secuencia de proteínas entre cepas de tal forma que sólo el STP de las cepas C es capaz de transformar células (12). El STP no es importante para el ciclo lítico normal del virus o mantenimiento episomal y existen mutantes de deleción natural para esta región del genoma del virus (13); estas cepas no son oncogénicas. Se han construido cepas de virus que carecen de este gen, las cuales expresan marcadores genéticos resistentes a fármacos (14). Estos virus se han usado para demostrar que son capaces de infectar un amplio abanico de tipos de células humanas, transfiriendo genes heterólogos con gran eficiencia y manteniendo la expresión a largo plazo en ausencia de presión de selección. No existe prueba alguna de que este virus sea capaz de producir cualquier enfermedad en el hombre, aunque es capaz de infectar células humanas. Así pues, es probable que este virus represente un buen punto de partida para el desarrollo de un vector seguro, no replicante, para células humanas. Sin embargo, existe una ausencia de entendimiento básico sobre cómo se replica el HVS, en particular en lo que se refiere al control de trascripción y replicación del ADN.
De todos los herpesvirus secuenciados hasta el momento, el HVS es el que tiene más homología con el EBV. Sin embargo, la región codificadora es significativamente más pequeña. Parece que los bloques de genes distintos están muy relacionados con estos dos virus, y de hecho con el herpesvirus en general. El HVS se diferencia de otros herpesvirus debido a la presencia de ciertos genes que no se han identificado en ningún otro herpesvirus hasta la fecha. Hasta la fecha se ha inutilizado cada vector de virus en pruebas humanas, o bien a través de la deleción de genes que no son esenciales para el crecimiento en cultivos, o bien la deleción de genes esenciales y su disposición en trans a partir de líneas celulares auxiliares. La extrapolación de los herpesvirus bien estudiados nos permite predecir que la deleción de ciertas proteínas de la membrana del HVS evitará la difusión célula -célula. Además, la inactivación de proteínas que controlan las conmutaciones de trascripción esenciales, tales como E1A en adenovirus (17) y IE 175 en herpes simplex (18), inevitablemente harán incompetente la replicación de tales virus. Así pues, un objetivo principal de esta solicitud está enfocado a la construcción de virus mutantes que sean incapaces de activar la expresión de genes tempranos y tardíos. Los genes diana son dos proteínas de control de trascripción que son los productos de ORF 50 y 57, y probablemente sean esenciales para el crecimiento en el cultivo del tejido.
La información publicada (14 y documento WO9004020) indica que los vectores víricos derivados de la Cepa 11/S4 sólo son capaces de crecimiento limitado en ciertas líneas celulares. Así pues, la necesidad de eliminar, bloquear o manipular los genes de las proteínas de control de trascripción debería ser sólo necesaria en líneas celulares que soporten la replicación vírica. Sin embargo, puede ser conveniente producir un virus que sea incapaz de producir o que produzca proteínas de control de trascripción no funcional, con el fin de producir un virus a efectos de la inserción de genes que se pueda usar de forma confidencial.
Otro objetivo principal de esta solicitud es también identificar genes que no son esenciales para el crecimiento y después eliminar al menos una parte de al menos uno de estos genes con el fin de facilitar la inserción de material genético heterólogo en el genoma vírico.
En la actualidad existe un plásmido diseñado para la recombinación con el herpesvirus saimiri, en el que el plásmido se diseña para insertar material genético heterólogo en el genoma vírico en una localización predeterminada, siendo la localización la unión entre la región codificadora única sencilla del ADN y una secuencia de repetición no codificadora del ADN del herpesvirus. Sin embargo, el plásmido es relativamente inflexible en lo que se refiere a lo que se puede clonar en el genoma vírico. Por ejemplo, existen algunos sitios de restricción adecuados y, por tanto, el plásmido no es adecuado para usar comercialmente. Por tanto, en esta solicitud nos hemos dirigido a identificar genes no esenciales para el crecimiento con el fin de eliminar al menos una parte de al menos uno de dichos genes con el fin de proporcionar sitios de clonación artificiales para la inserción de grandes cantidades de cualquier material genético heterólogo seleccionado. Será evidente que dicha deleción de genes no esenciales y la subsiguiente inserción de material genético heterólogo se asumirá de forma más ventajosa cuando se inserten grandes cantidades de material genético heterólogo en el genoma vírico.
En otro aspecto de nuestra solicitud nos proponemos proporcionar el herpesvirus saimiri que se ha manipulado de tal forma que elimine al menos una parte de al menos un gen de control de trascripción y, de forma ideal, también al menos una parte de al menos un gen que codifica una proteína del crecimiento no esencial. Somos partidarios de este aspecto porque cuanto mayor es el número de manipulaciones del genoma vírico, mayor es la seguridad del virus manipulado. En vista de este hecho, también somos partidarios de la manipulación del genoma del herpesvirus saimiri para producir la deleción, parcialmente o totalmente, del gen del STP. Somos partidarios de esta última manipulación hasta en el caso en el que se vayan a utilizar las Cepas A o B, porque consideramos que una manipulación como tal aumenta la seguridad probable del virus manipulado resultante.
A partir de lo anterior, será evidente que existe una necesidad de proporcionar un sistema de inserción genética adecuado para permitir la inserción intracelular de material genético, en la que la inserción se asume de forma segura y así sin ninguna consecuencia citopatológica al menos en la célula diana.
Por lo tanto, un primer objeto de la invención es proporcionar un sistema de inserción genética que sea seguro y controlable.
Además, en vista de la cantidad de material genético que probablemente se va a insertar, también es un objeto de la invención proporcionar un sistema de inserción genética que se adapte a alojar grandes cantidades de material genético, tal como secuencias de ADN de 4 Kbp y hasta 20 Kbp y, de forma ideal, >50 Kbp.
Otro objeto de la invención es proporcionar un sistema de inserción genética que permita la recombinación selectiva de al menos un gen proporcionado, o parte del mismo, en el mismo de tal forma que al menos dicho gen seleccionado, o parte del mismo, se inserte en una célula diana.
En su aspecto más amplio, la invención se refiere al suministro de virus mutantes que son incapaces de activar expresiones de genes tempranos y tardíos. Es decir, se refiere al suministro de un virus que es incapaz de replicar en una célula diana y más preferiblemente en células humanas y/o el suministro de virus mutantes que se adaptan para alojar cantidades relativamente grandes de material genético heterólogo.
De acuerdo con un primer aspecto de la invención, se proporciona, por tanto, un herpesvirus saimiri que tiene una deleción del gen de control de trascripción ORF 50 ó ORF 57, y en el que el virus además carece de o tiene una mutación en un gen de transformación del STP, de tal forma que el virus es incapaz de transformar una célula diana y además es incapaz de producir un fenotipo oncogénico.
En una realización preferida de la invención se eliminan ambos los genes de control de proteínas de trascripción ORF 50 y/o ORF 57.
Preferiblemente además todavía dicha mutación comprende la deleción parcial o completa de uno o ambos dichos genes.
En todavía otra realización de la invención, dicho herpesvirus saimiri es una cepa que carece de o tiene una mutación en el gen STP, de tal forma que el virus es incapaz de transformar una célula diana y además es incapaz de producir un fenotipo oncogénico.
Preferiblemente dicho virus también se manipula de tal forma que al menos se elimina una parte de al menos un gen que codifica una proteína del crecimiento no esencial. De forma ideal dicho gen es ORF4, ORF 14, ORF15, ORF16 ó ORF51.
En todavía otra realización preferida de la invención dicho virus se proporciona con un sitio de inserción en el que se puede insertar material heterólogo seleccionado. Preferiblemente el virus se manipula de tal forma que la inserción se produce dentro de o bien, junto a o lejos de, un sitio de deleción para la deleción del al menos una parte de un gen de proteínas del crecimiento no esenciales; o bien en o junto a al menos una secuencia de repetición no codificadora y más preferiblemente en la unión entre la región codificadora única sencilla del ADN y una secuencia de repetición no codificadora. Todavía más preferiblemente, dicho virus se manipula de tal forma que sólo una de dichas secuencias de repetición no codificadoras está presente en uno o ambos extremos de la región codificadora única sencilla.
En el caso en el que la inserción se produce dentro de o junto a dicho ADN del sitio de deleción, dicha deleción se refiere o bien a una deleción parcial o bien completa de uno o más de los siguiente genes ORF4, ORF 14, ORF15, ORF16 ó ORF51.
En una realización de la invención se proporciona un herpesvirus saimiri de replicación incompetente que tiene al menos otra mutación más en al menos un gen que codifica una proteína del crecimiento no esencial.
En una realización preferida de la invención dicho gen es uno o más de ORF4, ORF 14, ORF15, ORF16 ó ORF51.
Preferiblemente también todavía dicha mutación comprende la deleción parcial o completa de uno o más de dichos genes.
En todavía otra realización preferida de la invención dicho herpesvirus saimiri es una cepa que carece de o que tiene una mutación en el gen STP, de tal forma que el virus es incapaz de transformar una célula diana y además es incapaz de producir un fenotipo oncogénico.
Preferiblemente dicho virus además se manipula de tal forma que se elimina al menos una parte de al menos un gen implicado en la replicación del virus. De forma ideal dicho gen en ORF 50 y/o ORF 57.
En todavía otra realización preferida de la invención dicho virus se proporciona con un sitio de inserción en el que se puede insertar material heterólogo seleccionado. Preferiblemente el sitio de inserción está dentro de, junto a o lejos de, el sitio de dicha deleción de uno o más de dichos genes.
De acuerdo con todavía otro aspecto de la invención, se proporciona un herpesvirus saimiri que tiene en el mismo o está adaptado para tener insertado en el mismo al menos un fragmento genético heterólogo preseleccionado junto a un sitio de deleción, en el que el sitio de deleción representa un sitio para deleción parcial o completa de al menos un gen que codifica una proteína del crecimiento no esencial.
En una realización preferida de la invención dicho virus también se proporciona con una mutación en un gen implicado en la replicación vírica de tal forma que evita la replicación vírica después de la inserción de dicho virus en una célula diana.
Dicho virus es una cepa que carece de o que tiene una mutación en el gen STP de tal forma que el virus es incapaz de transformar una célula diana y además es incapaz de producir un fenotipo oncogénico.
De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporciona un herpesvirus saimiri que tiene en el mismo o está adaptado para tener insertado en el mismo al menos un fragmento de ADN heterólogo preseleccionado en la unión entre una región codificadora sencilla y una región no codificadora; y además en el que dicho virus comprende un número reducido de secuencias no codificadoras repetitivas en uno o ambos extremos de la región codificadora sencilla; y el virus también carece de o tiene una mutación den un gen de transformación del STP y una deleción de los genes de control de trascripción ORF 50 ó ORF 57.
Preferiblemente dicho número de secuencias de repetición no codificadoras es 5 o menos y de forma ideal uno.
De acuerdo con todavía otro aspecto de la invención, se proporciona un vector de transferencia que permite la inserción de un fragmento genético heteólogo en ADN del virus del herpes saimiri.
Preferiblemente dicha inserción implica uno cualquiera o más de los procedimientos anteriormente descritos de inserción. En una realización preferida de este aspecto de la invención dicho vector incluye una pluralidad de de sitios de restricción únicos y más preferiblemente tres sitios de restricción únicos. Además, dicho vector incluye un gen de beta-galactosidasa que está preferiblemente bajo el control del promotor HCMV IE 3. Más preferiblemente dicho vector se deriva de pRUNeo (16) y de forma ideal es prupoli.
De acuerdo con todavía otro aspecto de la invención, se proporciona un herpesvirus saimiri que tiene al menos una mutación en un gen implicado en la replicación del virus, por el que la mutación es de tal forma que evita la replicación del virus en una célula diana y también al menos una mutación en un gen que codifica una proteína del crecimiento no esencial.
En una realización preferida de la invención dicho herpesvirus sairimi también tiene una mutación en el gen STP.
Preferiblemente dichas mutaciones comprenden la deleción parcial o completa de dichos genes.
Preferiblemente además todavía dicho gen implicado en la replicación del virus comprende uno o ambos genes de proteínas de control de trascripción ORF50 y/o ORF57: y dicho gen que codifica una proteína del crecimiento no esencial es uno o más de los siguientes genes: ORF4, ORF14, ORF15, ORF16 ó ORF51.
A partir de lo anterior, será evidente que el virus preferido de la invención comprende una serie de combinaciones ventajosas de mutaciones genéticas, cuyas combinaciones sirven para inutilizar y posibilitar el virus de tal forma que se haga seguro y controlable. Con el término inutilizar nos referimos a la prevención de la replicación vírica en una célula diana y por el término posibilitar nos referimos a la capacidad de alojar la inserción de una cantidad relativamente grande de material genético heterólogo. De forma todavía más deseable, dicha combinación ventajosa también proporciona un virus incapaz de transformar una célula diana y además incapaz de producir un fenotipo oncogénico.
De acuerdo con todavía otro aspecto de la invención se proporciona una célula diana que incluye al menos una parte del vector de la terapia génica del herpesvirus saimiri.
De acuerdo con todavía otro aspecto de la invención se proporciona una célula transformada con un vector del herpesvirus saimiri como se describe anteriormente.
De acuerdo con todavía otro aspecto de la invención se proporciona un procedimiento de inserción de material genético heterólogo seleccionado a una célula diana que comprende la exposición de al menos dicha célula diana a un herpesvirus saimiri que incluye al menos dicho material heterólogo preseleccionado en condiciones que favorecen la infección de dicha célula con dicho virus.
Ahora se describirá una realización de la invención a modo de ejemplo sólo con referencia a los siguientes materiales y procedimientos.
Aislamiento y caracterización de mutantes víricos
El virus manipulado es una forma modificada de la cepa 11, que no contiene el ORF1 (gen STP). Aunque normalmente habríamos elegido una cepa "de tipo salvaje", inevitablemente los vectores tendrán que estar basados en un virus al que se ha eliminado este gen. La cepa modificada puede tener genes esenciales eliminados y, por lo tanto, se pueden producir las Líneas Celulares Auxiliares (detalladas más tarde). Estas se establecieron a través de la co-trasfección con un clon genómico del HVS más pSV2Neo, y clones celulares aislados que son resistentes al G418. En primer lugar, estos clones celulares se rastrearon por PCR para detectar la presencia de las secuencias genéticas apropiadas y aquellas que resultaron positivas se analizaron por RT-PCR para detectar la presencia de transcritos de ARN del gen proporcionado en trans. Los clones apropiados se expandieron u se usaron para la co-trasfección con ADN del virus y construcción de la deleción. Los virus que expresan \beta-galactosidasa (medida por el metabolismo de X-gal) se analizaron para detectar su capacidad de replicar en células auxiliares y células Vero normales, y subsiguientemente en tipos celulares humanos de linajes diferentes. La información publicada indica que los vectores derivados de la cepa 11 son capaces de crecimiento limitado en algunas líneas celulares de origen de fibroblasto de feto humano (HFF) y de la célula B (Raji). Las células Raji (EBV transformadas) no representan a las células humanas normales, por lo tanto, nosotros evaluamos las características de crecimiento de estos virus en células linfoides aisladas de la sangre fresca periférica de humano adulto tomada de voluntarios sanos, fibroblastos de embriones humanos primarios y células epiteliales que están disponibles en fuentes comerciales. Se evaluó la replicación a través de la expresión de \beta-galactosidasa (prueba de infección y dispersión célula-célula), la presencia de ADN episomal y la expresión de genes tempranos y tardíos "típicos" detectados por RT-PCR. La persistencia genómica en estas células se evaluó midiendo el porcentaje de células capaces de expresar el gen reportero a través de varias generaciones de células junto con el análisis para detectar la presencia de ADN del virus episomal (19).
Producción de virus recombinantes con genes eliminados
El virus liberado de las células, extracelular, se recogió por centrifugación a 30.000g durante 2 horas a 4ºC. El sedimento del virus semipurificado se resuspendió en Tris/HCl 10 mM, 1 mM EDTA (TE) pH 8,0. Se añadió SDS al 1% p/v y se añadió Proteinasa K a 100 \mug/ml. La muestra se incubó a 50ºC durante 16 horas y después se trató con la mezcla de fenol/cloroformo 50:50 (p:v) (5 extracciones). Se eliminó la fase acuosa, ajustada a 0,2M con acetato de sodio pH 5,0 y se añadieron 3 volúmenes de etanol absoluto. El precipitado de ADN se extrajo del tubo, se secó al aire y después se redisolvió en un volumen apropiado de tampón TE. La concentración de ADN se midió por la absorción de la muestra a 254 nm en un espectrofotómetro. El ADN del virus purificado se cotransfirió en células OMK (ATCC CRL 1556) con la construcción del plásmido respectivo usando el reactivo DOTAP. Después de 24 horas el medio de cultivo se eliminó y se sustituyó con un medio que contiene FCS inactivado por calor al 2%. Después se observaron las monocapas celulares hasta que apareció el desarrollo del efecto citopático extensivo. En esta etapa, el virus liberado de las células se recogió y se usó para infectar nuevas monocapas subconfluentes de células OMK. Después de 24 horas éstas se recubrieron con un revestimiento de agar-agar al 1% en DMEM libre de rojo de fenol/FCS inactivado por calor al 2%. Después de 48 horas se añadió X-gal a la concentración final de 100 \mug/ml, con el fin de identificar placas de virus que estaban expresando beta galactosidasa. Las placas azules se recogieron después y se sometieron a otras dos rondas de purificación de placas, o hasta que la población del virus fuera homogénea. Después se analizaron estos virus para detectar los procesos de la recombinación homóloga correcta usando PCT y bandas de Southern.
Producción de virus recombinantes que contienen genes heterólogos
El ADN de virus purificado, preparado como se describe anteriormente, se co-transfectó en células OMK con vectores plásmidos (pJG101-105 y/o pAW 201, 202, 203, 205, 207 ó 209) que contienen el gen heterólogo apropiado que sustituye la secuencia de beta-galactosidasa para la recombinación en genes esenciales o no esenciales, o regiones intergénicas. Se seleccionó el virus recombinante que ya no expresa beta galactosidasa y se purificaron las placas de la misma forma que se describe en el apartado anterior.
Infección de células in vitro con HVS
Las reservas de virus de titulación elevada se produjeron por multiplicidad baja de infección de células OMK o Vero. El virus de liberación celular se ajustó en células OMK o Vero y se almacenó a -70ºC. La cantidad de virus necesitado para infectar cualquier tipo de célula específica al 100% de eficiencia se evaluó por medio de la infección de un número definido de células en diversas multiplicidades de infección con una beta-galactosidasa que expresa el virus. Las células adherentes se infectaron por la adición de virus en un volumen mínimo de medio de cultivo y se incubaron a 37ºC durante 2 horas con agitación suave. Después este medio se eliminó y se sustituyó con una cantidad apropiada de medio fresco. Las células no adherentes se recogieron, contaron y se resuspendieron entre 10^{6} y 10^{7} células por 1 ml de virus en una concentración apropiada para conseguir el 100% de eficiencia de infección. Después de 2 horas de incubación con agitación suave, se trataron las células de la misma forma que describe para las células adherentes.
Producción de líneas celulares auxiliares
Los genes del virus que se iban a expresar en una línea celular estable, en trans, se clonaron en un vector plásmido adecuado, bajo control de sus propias secuencias o de control heterólogas 5' y 3'. Este plásmindo también puede contener un marcador seleccionable, por ejemplo, el gen de neomicina fosfotransferasa, que proporciona la resistencia de las células eucariotas al fármaco G418. De forma alternativa, este gen se puede proporcionar en un plásmido distinto, otra vez bajo el control de secuencias de control eucariota heterólogas, por ejemplo, el promotor temprano del SV40 y señales de poliadenilación apropiadas. En todos los casos, las líneas celulares se establecieron así. Las células 5x10^{5} (o suficientes para proporcionar del 40% al 50% de confluencia) tales como Vero o OMK se sembraron sobre placas de 10 cm de diámetro con cultivo de tejido en 10 ml de DMEM/10% de suero fetal bovino y se incubaron durante 12-18 horas a 37ºC en una atmósfera humedecida que contiene el 5% de CO_{2} en el aire. Después de este periodo, se transfectó un plásmido de 2 \mug en las células usando el reactivo DOTAP que se describe anteriormente para la transfección del ADN del virus. Éste puede ser un solo plásmido que contiene el gen apropiado y el gen marcador seleccionable, o una mezcla de 2 \mug de cada plásmido. Después se incubaron las células a 37ºC en una atmósfera humedecida que contiene el 5% de CO_{2} en el aire durante 48 horas más. En esta etapa, las monocapas ahora confluentes se separaron de la placa de plástico a través de la eliminación del medio, lavando los 2x 10 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS, Life Technologies Inc. cat nº 20012) y tratamiento con una solución de 2 ml de tripsina (0,25% p:v)/EDTA (0,2% p:v) en PBS. Después se añadió el medio fresco a la suspensión celular, se contaron las células y después se sembraron en placas de 96 pocillos para clonación en una dilución limitadora o se dispensaron en 10^{4} células por placa de 10 cm. El medio de cultivo (DMEM/10% FCS) se suplementó con una concentración apropiada de G418 que es suficiente para ocasionar la muerte al 100% de células no transfectadas. La concentración depende tanto del pasaje celular como del tipo de célula. Una concentración típica para las células Vero en el número de pasaje 150 es 800 \mug/ml. Después se sustituyeron las células en el entorno de crecimiento anteriormente descrito y se observaron en intervalos regulares para la muerte celular. El medio de cultivo se sustituyó aproximadamente cada 3-4 días dependiendo de la relación muerte/crecimiento de la célula. Después de 7-14 días los clones individuales de células habían crecido y después se recogieron, y se desarrollaron hasta los números apropiados y se analizaron para detectar la expresión del gen HVS transfectado. Esto se puede conseguir a través del uso de inmunofluorescencia, bandas de Northern o RT-PCT, usando procedimientos bien conocidos en la técnica.
Evaluación de la seguridad del virus
Se evaluó la capacidad del virus modificado para replicarse por la medida de la expresión del gen del virus usando RT-PCR para una selección de genes tempranos inmediatos, tempranos y tardíos. De forma adicional, los sobrenadantes del cultivo del tejido de las células transducidas se incubaron con células OMK indicadoras, para detectar cualquier liberación de virus infecciosa posible.
Inserción del vector de recombinación 3
Esta estrategia produce un vector de recombinación para permitir la inserción de genes heterólogos en el extremo 3' del ADN de HSV L. El pSJNeo (de R. Grassman) contiene 9,4 kb de ADN de HSV, que contiene la unión del ADN del H-L. Un sitio de escisión SmaI ubicado a 35 bp dentro de la primera unidad de repetición H se cambió a un sitio SalI para permitir la inserción del gen nuevo. Sin embargo, este vector es un vector de número de copias bajo, grande, y por lo tanto no es adecuado para la inserción de genes heterólogos grandes. Se escogió un vector de expresión, pSA91, para realizar el nuevo vector de recombinación. Este vector se produce en un número elevado de copias y contiene el promotor del hCMV IE para dirigir la expresión del gen. Para producir un vector de expresión eficiente que permita la recombinación, la secuencia de ADN del HVS se eliminó del pSIneo y se insertó en un sitio NarI único ubicado en el extremo 5' al promotor, usando adaptadores de unión. Este vector se denomina pJG 101.
Deleción de ORF06
El ORF06 (ubicado entre bp 12584 y 15967) codifica la proteína principal de unión al ADN, así pues la deleción de este gen hace que la replicación del virus sea deficiente. Para hacer un casete de recombinación para la deleción de ORF06 se eliminaron las regiones de ADN flanqueantes del pSS54 que contiene la región de ADN de HVS de 11507 a 18013 (el fragmento KpnIF). El fragmento KpnI (11507)-HaeII (12613) de 1.106 bp del extremo 5' a la región que codifica el ORF06 y el fragmento SphI (15258)-BglIII (16407) de 1.149 bp se eliminaron y se ligaron juntos a través de oligómeros sintéticos. Los oligómeros también contienen sitios de restricción EcoRI y BamHI, como se muestra a continuación, para permitir la inserción de genes heterólogos. Es necesario mantener parte del extremos 3' del ORF06, ya que éste contiene el promotor para ORF07. El fragmento KpnI-BglII ligado se insertó en el vector de clonación pBluescript KS para crear el casete de recombinación pJG102.
Secuencia de oligómeros para unir los fragmentos
1
Construcción de ORF06 para generar la línea celular auxiliar
Para producir el HSV delecionado para la región codificadora de ORF06, es necesario proporcionar el producto del gen ORF06 en trans. Esto se consiguió produciendo una línea celular auxiliar estable. El gen ORF06 se eliminó del pSS54 en forma de un fragmento HaeII (12613)-PstI (15998). Los oligómeros sintéticos (como se muestra a continuación) se usaron para crear con precisión el principio de la región codificadora de ORF06 y para permitir la inserción en el vector de expresión psVK3 (Pharmacia). Después de la ligación de los oligómeros sintéticos al extremo 5' del ORF06, el fragmento EcoRI-Ps1 se ligó al pSVK3 para crear el pJG103. Esto acciona la expresión del promotor temprano del SV40, el uso de un promotor alternativo minimiza los procesos de recombinación en la línea celular auxiliar.
Secuencias de oligómero
2
Deleción del ORF51
El ORF51 codifica el receptor potencial que une la proteína de la membrana del HVS, por lo tanto, la deleción de este gen vuelve al gen no infeccioso. El ORF51 se sitúa entre 72626 y 73432 del genoma HVS. Para producir las secuencias que flanquean el ORF51 para el casete de recombinación, el fragmento BamHI (71692)-HpaI (72602) 910 bp del 5' a la región codificadora del ORF51 y el fragmento Bst1107I (73395)-PstI (73998) 601 bp del 3' al ORF51 se eliminaron del pKK104 que contiene el fragmento EcoRI D del HVS desde 63020 hasta 77574, y se ligaron juntos a través de oligómeros sintéticos. Estos oligómeros también contienen sitios de restricción EcoRI y BamHI para permitir la inserción de genes heterólogos y además la secuencia requerida para mantener el polyA para el ORF52. Después de la ligación el fragmento BamHI-PstI se ligó al vector de clonación pSP73 (Promega) para crear el casete de recombinación pJG104.
\newpage
Secuencias de oligómeros sintéticos
3
Construcción de ORF51 para generar la línea celular auxiliar
Se eliminó el gen ORF51 de pKK104 en forma de un fragmento HpaI (72602)-StuI (73495) 806 bp y se clonó en el vector de expresión pSVK3 del SV40. Los enlaces Eco RI se ligaron a los extremos 5' y 3' de ORF51 para facilitar esta reacción de clonación. El vector de expresión de ORF51 resultante se denominó pJG 105.
Deleción del ORF 57
El Orf 57 codifica una activador de transcripción con homología a UL54 del HSV-1, un gen temprano inmediato esencial. Para producir un virus que contiene una deleción completa del ORF 57, se ampliaron las regiones adyacentes a la región codificadora de ORF57 para permitir la recombinación homóloga con ADN vírico. Lo cebadores se han denominado;
100
estos amplían dos regiones del HVS respectivamente; de 77850 a 78260 y de 79530 a 80120, los sitios de restricción adecuados se han incorporado en los cebadores para ayudar en la clonación. Se realizó una ligación tripe usando estos fragmentos y pUC 8, digeridos previamente con EcoRI y SphI, para obtener pAW101. Después este plásmido se linealizó usando PstI y SalI y se ligó con el gen lacZ bajo control del promotor de hCMV IE, para producir PdeltaORF57 que se ha depositado con la National Collection of Industrial and Marine Bacteria Ltd (Colección Nacional de Bacterias Industriales y Marinas) (NCIMB), 23 St Machan Drive, Aberdeen, AB2 1RY; Número de Depósito 40894.
Para producir una línea celular auxiliar, se amplió un fragmento que contenía la región codificadora del ORF57 usando PCR y se ligó con un vector T, pCRII, para obtener pAW103. Después este se clonó en el plásmido pBKCMV para generar ORF57 bajo el control del promotor PBKCMVORF57 del HCMV IE que se ha depositado con el NCIMB, como anteriormente, Número de Depósito 40895.
Construcciones de inactivación insercional de HVS
La inactivación insercional es un procedimiento menos preferido para evitar que un gen funcione, ya que depende de la colocación del gen indicador de \beta-galactosidasa dentro de la secuencia codificadora del gen apropiado, sin eliminar ninguna parte de la fase de lectura abierta. Existe un riesgo de procesos de recombinación que se producen que llevan a la deleción de la secuencia de \beta-gal y ninguna ligación de la fase de lectura abierta que permite la reactivación del gen.
Para producir un gen inactivado de forma insercional, se construyó un vector de transferencia que inactivó cada gen respectivo por inserción del gen lac Z bajo el control de un promotor del CMV I.E. en la región codificadora 5' del ORF. Este gen inactivado se insertó después en el genoma vírico por cotrasfección del plásmido y ADN vírico del HVS para obtener un virus recombinante, que después se purificará por placas.
Construcciones de plásmidos ORF 4/Proteína de control del complemento
Se digirió pJC81-KpnB con BglII y PstI para producir el fragmento 1152 bp que contiene la región codificadora de ORF4. Este fragmento se ligó a pUC18, para obtener pUCORF4. Este plásmido se linealizó usando BglII, polimerasa del ADN que usa el extremo romo de T4, y se ligó con un fragmento de extremo romo que contiene el gen lacZ bajo el control de un promotor del CMV IE, para producir pAW201.
ORF 14/Gen IE pequeño
El pACYC184-EcoF se digirió con EcoRI y PstI para producir el fragmento 3189 bp que contiene la región codificadora de ORF 14. Este fragmento se ligó a pUC18, para obtener pUCORF14. Este plásmido se linealizó usando KpnI, polimerasa del ADN que usa el extremo romo de T4, y se ligó con un fragmento de extremo romo que contiene el gen lacZ bajo control de un promotor de CMV IE, para producir pAW202.
ORF 15/CD59 Homólogo
El pACYC184-EcoF se digirió con SstI y PstI para producir el fragmento 2415 bp que contiene la región codificadora de ORF 15. Este fragmento se ligó a pUC 18, para obtener pUCORF 15. Este plásmido se linealizó usando Munl, polimerasa del ADN que usa el extremo romo de T4, y se ligó con un fragmento de extremo romo que contiene el gen lacZ bajo control de un promotor de CMV IE, para producir pAW203.
ORF 50/Activador trascripcional principal
El pACYC184-EcoD se digirió con BglII y PstI para producir el fragmento 4149 bp que contiene la región codificadora de ORF 50. Este fragmento se ligó a pUC 18, para obtener pAW204. Este plásmido se digirió con PstI y se ligó con un fragmento de ADN que contiene el gen lacZ bajo el control de un promotor de CMV IE, para producir PdeltaORF50, que se ha depositado con el NCIMB, como se indica anteriormente, Número de Depósito 40892. Se construyó una línea celular auxiliar usando PUCPST depositada con el NCIMB, como se indica anteriormente, Número de Depósito 40893, que es pUC18 que contiene un fragmento PstI del ADN del HVS que abarca ambos exones del gen.
ORF 57/Gen IE
El pACYC184-EcoJ se linealizó usando BglII, polimerasa del ADN que usa el extremo romo de T4, y se ligó con un fragmento de extremo romo que contiene el gen lacZ bajo control de un promotor de CMV IE, para producir pAW206.
Con el fin de construir una línea celular auxiliar, la secuencia codificadora de ORF 57 se amplió usando PCR que usa los siguientes cebadores:
101
Este fragmento de PCR se ligó a un vector de clonación pCRII de TA y se denominó pAW207.
ORF 16/Supresor de apoptosis
Debido a una ausencia de sitios de restricción convenientes la región codificadora se amplió usando PCR, incorporando un sitio de PstI en la región codificadora 5', para permitir la clonación subsiguiente, usando los siguientes cebadores;
102
Este producto de PCR se ligó con pUC18 para obtener pAW208. Este plásmido de linealizó usando PstI y se ligó con el gen lacZ bajo el control de un promotor de CMV IE, para producir pAW208.
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Claims (12)

1. Un herpesvirus saimiri que tiene una deleción de un gen de control trascripcional ORF 50 ó ORF 57 y en el que el virus además carece de o tiene una mutación en un gen de transformación del STP, de tal forma que el virus es incapaz de transformar una célula diana y también es incapaz de producir un fenotipo oncogénico.
2. Un herpesvirus saimiri de acuerdo con la Reivindicación 1 que tiene una deleción de ambos genes ORF 50 y ORF 57.
3. Un herpesvirus saimiri de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que dicho virus además carece de al menos un gen seleccionado de un grupo que comprende ORF 4, ORF 14, ORF 15, ORF 16 ó ORF51.
4. Un herpesvirus saimiri de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que dicho virus posee un sitio de inserción para la inserción de material genético heterólogo.
5. Un herpesvirus saimiri de acuerdo con la Reivindicación 4 en el que dicho sitio de inserción se sitúa dentro de, o junto a, al menos una secuencia de repetición codificadora o en la unión entre una región codificadora única y una secuencia no codificadora.
6. Un herpesvirus saimiri de acuerdo con la Reivindicación 4 ó 5 en el que dicho sitio de inserción se proporciona en el sitio de deleción de ORF 50 ó ORF 57.
7. Un herpesvirus saimiri de acuerdo con la Reivindicación 6 en el que se proporciona un sitio de inserción en, o junto a, al menos un gen seleccionado de un grupo que comprende ORF 4, ORF 14, ORF 15, ORF 16 ó ORF51.
8. Un herpesvirus saimiri de acuerdo con la Reivindicación 1 que tiene en el mismo o está adaptado para tener insertado en el mismo al menos un fragmento de ADN heterólogo seleccionado en la unión de una región codificadora sencilla del ADN y una región no codificadora; y además, en el que dicho virus comprende un número reducido de secuencias no codificadoras repetitivas en uno o ambos extremos de la región codificadora sencilla.
9. Un herpesvirus saimiri de acuerdo con la Reivindicación 8 en el que el número de dicha secuencia repetitiva no codificadora varía entre 5 y 1.
10. Un herpesvirus saimiri de acuerdo con la Reivindicación 8 ó 9 que además carece de al menos un gen que codifica una proteína no esencial.
11. Un herpesvirus saimiri de acuerdo con la Reivindicación 10 en el que dicho gen que codifica una proteína no esencial comprende un gen seleccionado del grupo que incluye ORF 4, ORF 14, ORF 15, ORF 16, ORF 51.
12. Uso de un herpesvirus saimiri de acuerdo con la reivindicación 1 para la preparación de un medicamento para el tratamiento de cáncer.
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