JP2000517191A

JP2000517191A - ウイルスベクターとしてのヘルペスウイルス・サイミリ

Info

Publication number: JP2000517191A
Application number: JP10512354A
Authority: JP
Inventors: メレディス，デイビッド・マーク; マーカム，アレキサンダー・フレッド
Original assignee: ザ・ユニバーシティ・オブ・リーズ
Priority date: 1996-09-04
Filing date: 1997-09-04
Publication date: 2000-12-26
Also published as: CZ69799A3; ATE342997T1; HUP9904329A3; WO1998010083A1; ES2274541T3; DE69736838D1; GB9618477D0; DE69736838T2; US6379967B1; IL128635A0; CA2264956A1; BR9711998A; EP0939828B1; EP0939828A1; CN1237209A; HUP9904329A2; KR20000068461A; AU737197B2; SG91252A1; AU4307197A

Abstract

(57)【要約】本発明は、特異的な必須遺伝子および非必須遺伝子の突然変異および／または欠失によって遺伝的に修飾されたヘルペスウイルス・サイミリの操作手段に関する。必須遺伝子はウイルス遺伝子の複製に必要であり、またウイルスの増殖に必要である。非必須遺伝子は非相同遺伝物質、即ち治療遺伝子の挿入用サイトの役割を果たす。

Description

【発明の詳細な説明】ウイルスベクターとしてのヘルペスウイルス・サイミリこの発明はウイルスの操作（manipulation）法、該操作法用手段、および、限定的ではないが、特に遺伝子治療における用途を有する該操作法によって得られる生成物に関する。ヒトの遺伝学における最近の進歩の結果により、多くの疾患の遺伝子治療は現在では理論的に可能である。第１の目的は、超優性的に（transdominant）作用する遺伝物質（genetic material）の搬送により、細胞表現型を罹病状態から正常状態に転換することである。この技術を細胞培養系から生体実験モデルを経て、臨床段階まで応用するためには、調整可能な状態で遺伝子を効率的に搬送する新規な方法の開発が必要である。ヒト遺伝学は疾患特異的突然変異の同定の分野においては急速な進歩を遂げているが、遺伝子搬送系の開発は比較的遅れているのが現状である。現在では、リポソーム、ＤＮＡ集合体またはウイルスに基づく系が選択されている。リポソーム搬送はＤＮＡ転移においては非常に効率が悪く（１）、また、ウイルス粒子と荷電物質（例えば、ポリリシン）との間で形成されたＤＮＡ集合体はＤＮＡの取込みを促進するが（２）、その調製の標準化は非常に困難である。レトロウイルスとアデノウイルスのベクターはベクター内に組込まれた非相同ＤＮＡのサイズに制約され（３，４）、また、長期間にわたる非相同遺伝子の発現を達成するには信頼性がないので不適当である。レトロウイルスはホストゲノム内へ取込むことができるが、高力価のストック（stock）として生産することは困難であり、また、逆転写中にもたらされるエラーに起因して本来的に高い突然変異速度を示す。アデノウイルスは広範な細胞親和性（tropism）を示すが、細胞仲介免疫応答を誘発し、核酸は感染細胞中においては長期間にわたって安定に存在しない（５）。ヘルペスウイルスはベクターの開発においては有望な候補の代表的なものであるが、これは該ウイルスがこれらの細胞内のゲノムを複製からブロックされるエピソーム形態に保持する特性を有することにある程度起因する。これらのウイルスが非相同ＤＮＡ配列をパッケージする能力は潜在的には＞５０Ｋｂｐであり（６）、大部分のものは生体外で容易に操作することができる。単純ヘルペスから誘導されるベクターはアデノウイルスの場合と同様の問題があり、集団の大部分はウイルスに対しては十分な免疫応答を示す。しかしながら、ヒト細胞を感染させ得るヒト以外の他のヘルペスウイルスにはこのような問題はない。ヘルペスウイルス・サイミリ（saimiri）（ＨＶＳ）はリスザル［サイミリ・シウレウス（Saimiri sciureus）］のリンパ親和性のラジノウイルス（γ２ヘルペスウイルス）である。このウイルスは健康なサルの末梢リンパ球から常法に従って単離してもよく、また、該ウイルスは該種において明確な疾患はもたらさない。該ウイルスのゲノムはＴ細胞内においてはエピソーム形態で検出されてもよく、また、ゲノムの転写は非溶解性（「潜在性」）状態の３つの遺伝子に限定されると考えられる。完全なウイルスゲノムの配列は決定されており、ヒトのエピステイン−バル（Epstein−Barr）ウイルス（ＥＢＶ）と共通の多くの特徴を有する。遺伝子組成は可変数の非コード反復配列と隣接するＤＮＡの単一のコード領域（長さ：１１２，９３０ｂｐ）から成る。７６個の開放読み枠があり、このうちの６０個は他のヘルペスウイルス中に見出される遺伝子と類似性を有する（７）。残りの遺伝子は既知の機能を有するヒト遺伝子と比べてタンパク質のレベルにおいて配列相同性（補体制御タンパク質、細胞表面抗原ＣＤ５９、サイクリンＤおよびＧタンパク質結合レセプターを含む）を有する（８，９）。該ウイルスは特定の他のモンキー種において腫瘍形成能を有するＡ菌株およびＢ菌株と該腫瘍形成能を有さないＣ菌株に分類されている。Ｃ菌株は生体外においてヒトＴ細胞を独立増殖の乏しいものに形質転換させる（１０）。この細胞形質転換能はＳＴＰと呼ばれている遺伝子に起因するもので（１１）、該遺伝子はこれらの菌株間のタンパク質配列において著しい変異性を示し、Ｃ菌株からのＳＴＰのみが細胞形質転換能を示す（１２）。ＳＴＰはこのウイルスの正常な溶菌サイクル（lytic cycle）またはエピソーム維持にとっては重要ではなく、また、ウイルスゲノムのこの領域に関しては天然の欠失変異体が存在し（１３）、これらの菌株は腫瘍形成能がない。この遺伝子を欠くウイルス菌株は選択可能な薬剤耐性マーカーを発現するように構成されている（１４）。これらのウイルスは、該ウイルスが広範なヒト細胞型の感染能を有すること、非相同遺伝子を高い効率で搬送することおよび選択圧の不存在下で長期間にわたって発現能を維持することを証明するために使用されている。このウイルスはヒト細胞を感染させることはできるが、該ウイルスがヒトにおいていずれかの疾患をもたらすという証拠はない。従って、このウイルスがヒト細胞に対して非複製性で安全なベクター開発のための良好な出発点となり得る可能性がある。しかしながら、ＨＶＳの複製方法、特に転写制御とＤＮＡ複製に関する基本的な知見は知られていない。配列が決定された全てのヘルペスウイルスのうちで、ＨＶＳはＥＢＶに対して最も高い相同性を示す。しかしながら、コード領域は著しく小さい。明確な遺伝子ブロックはこれらの２種のウイルス間だけでなく一般のヘルペスウイルスの間においても密接な関連性があると考えられる。ＨＶＳは現在まで他のいずれのヘルペスウイルスにおいても同定されていない特定の遺伝子が存在する点で他のヘルペスウイルスとは相違する。現在までヒトについて検討された全てのウイルスベクターは培養中での増殖にとっては非必須の遺伝子の欠失もしくは必須遺伝子の欠失によって無能化されており、また、これらは操作過程においてヘルパー細胞系から得られている。現在まで十分に研究されたヘルペスウイルスに関するデータの推定に基づいて、本発明者は、特定のＨＶＳ膜タンパク質の欠失によって細胞−細胞拡散（spread）は阻止されるであろうと予測した。さらに、必須の転写スイッチ、例えば、アデノウイルスにおけるＥ１Ａ（１７）および単純ヘルペスにおけるＩＥ１７５（１８）を調節するタンパク質の不活性化は必然的にこれらのウイルスの複製能を失わせる。従って、本発明の主要な目的は初期遺伝子と後期遺伝子の発現を活性化しない突然変異体ウイルスを調製することである。標的遺伝子は、ＯＲＦ５０およびＯＲＦ５７の生成物であって組織培養における増殖にとって必須であると考えられる２種の転写調節タンパク質である。発表されているデータ（１４）によれば、菌株１１／Ｓ４から誘導されたウイルスベクターは特定の細胞系において不十分な増殖能を示すに過ぎない。従って、転写調節遺伝子の欠失、ブロックまたは操作はウイルスの複製を補助する細胞系において必要となるに過ぎない。しかしながら、確実に利用できる遺伝子搬送用ウイルスを生産するためには、非機能的な転写調節タンパク質の生産能を有するかもしくは有さないウイルスを生産することが望ましい。本発明の別の主要な目的は、増殖にとって非必須の遺伝子を同定し、次いで、該遺伝子の少なくとも１つの少なくとも一部分を欠失させることによってウイルスゲノム内への非相同遺伝物質の挿入を促進することである。ヘルペスウイルスを用いる組換え用に設計されたプラスミドが現存しており、該プラスミドは予め決定された位置、即ち、ＤＮＡの単一の非反復（unique）コード領域とヘルペスウイルスＤＮＡの非コード反復配列との間の位置のウイルスゲノム内へ非相同遺伝物質を挿入させるように設計されている。しかしながら、該プラスミドはウイルスゲノムへのクローン化に関しては比較的不変的である。例えば、適当な制限サイトはほとんどないので、該プラスミドは商業的な規模での使用には不適当である。従って、本発明者はこの発明においては、いずれかの選択された非相同遺伝物質を多量に挿入するための人工クローン化サイトを提供するために該遺伝子の少なくとも１つの少なくとも一部分を欠失させる目的で増殖にとって非必須の遺伝子を同定することを検討した。明らかに、非必須遺伝子の欠失とその後の非相同遺伝物質の挿入は、多量の非相同遺伝物質をウイルスゲノム内へ挿入するときに最も有効におこなわれる。本発明の別の観点によれば、本発明者は少なくとも１つの転写調節遺伝子の少なくとも一部分、および理想的には非必須増殖タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の少なくとも一部分を欠失させるように操作されたヘルペスウイルス・サイミリを提供することを目的とした。ウイルスゲノムの操作数が多いほど操作されたウイルスの安全性は高くなるので、この観点は好ましいものである。この事実に基づき、本発明者はヘルペスウイルス・サイミリのゲノムを操作してＳＴＰ遺伝子の一部または全部を欠失させたが、この態様も好ましいものである。この後者の操作は、操作によって得られるウイルスの安全性を高めると考えられるので、菌株ＡまたはＢを使用する場合であっても好ましいものである。上記の説明から明らかなように、遺伝物質の細胞間搬送を可能にする適当な遺伝子搬送系であって、安全かつ少なくとも標的細胞に細胞病理学的結果をもたらすことなく該搬送を可能にする遺伝子搬送系を提供する必要がある。従って、本発明の第１の目的は、安全で調節可能な遺伝子搬送系を提供することである。さらに、搬送される遺伝物質の量についての観点から、本発明の別の目的は、多量の遺伝物質、例えば、４Ｋｂｐ〜２０Ｋｂｐ、理想的には＞５０ＫｂｐのＤＮＡ配列を供給するのに適合した遺伝子搬送系を提供することである。本発明のさらに別の目的は、少なくとも所定の遺伝子またはその一部を選択的に組換えて少なくとも該選択遺伝子またはその一部を標的細胞へ搬送する遺伝子搬送系を提供することである。本発明の最も広い観点によれば、本発明は初期および後期遺伝子発現を活性化しない突然変異体ウイルスの提供に関する。換言すれば、本発明は、標的細胞、より好ましくはヒト細胞内において複製しないウイルスの提供および／または非相同遺伝物質を比較的多量供給するのに適合した突然変異体ウイルスの提供に関する。本発明の第１の観点によれば、ウイルス複製に関連する遺伝子中に標的ヒト細胞内でのウイルス複製を阻止するような少なくとも１つの突然変異を有するヘルペスウイルス・サイミリが提供される。本発明の好ましい態様においては、該遺伝子は転写調節タンパク質遺伝子ＯＲＦ５０および／またはＯＲＦ５７の一方もしくは両方である。好ましくは、該突然変異は該遺伝子の一方もしくは両方の部分的または完全な欠失をさらに含む。本発明の別の態様においては、該ヘルペスウイルス・サイミリはＳＴＰ遺伝子中に突然変異を有するか、もしくは有さない菌株であって、該ウイルスは標的細胞を形質転換させることができないために腫瘍形成性表現型を生産することはできない。好ましくは、該ウイルスは、非必須増殖タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の少なくとも一部分が欠失されるように操作される。理想的には、該遺伝子はＯＲＦ４、ＯＲＦ１４、ＯＲＦ１５、ＯＲＦ１６またはＯＲＦ５１である。本発明のさらに別の好ましい態様においては、該ウイルスは、選択された非相同物質を挿入させることができる挿入サイトを有する。好ましくは、非必須増殖タンパク質遺伝子の少なくとも一部分を欠失させるための欠失サイトの内部、隣接部または離隔部において挿入が発生するように該ウイルスを操作するか、または、少なくとも１つの非コード反復配列の内部もしくは隣接部、より好ましくはＤＮＡの単一の非反復コード領域と非コード反復配列との接合部において挿入が発生するように該ウイルスを操作する。より好ましくは、単一の非反復コード領域の一端もしくは両端に該非コード反復配列の１つのみが存在するように該ウイルスを操作する。欠失サイトの内部もしくは隣接部において挿入が発生する場合には、該欠失は次の遺伝子の１種もしくは複数種の部分的もしくは完全な欠失に関する：ＯＲＦ４、ＯＲＦ１４、ＯＲＦ１５、ＯＲＦ１６およびＯＲＦ５１。本発明の他の観点によれば、非必須増殖タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子中に少なくとも１つの突然変異を有するヘルペスウイルス・サイミリが提供される。本発明の好ましい態様においては、該遺伝子は次の遺伝子から選択される１もしくは複数の遺伝子である：ＯＲＦ４、ＯＲＦ１４、ＯＲＦ１５、ＯＲＦ１６およびＯＲＦ５１。好ましくは、該突然変異は１もしくは複数の該遺伝子の部分的もしくは完全な欠失をさらに含む。本発明の他の好ましい態様においては、該ヘルペスウイルス・サイミリは、該ウイルスが標的細胞を形質転換させることができないために腫瘍形成性表現型を生産できないような突然変異をＳＴＰ遺伝子中に有するか、または有さない菌株である。好ましくは、該ウイルスをさらに操作することによって、ウイルス複製に関連する少なくとも１つの遺伝子の少なくとも一部分を欠失させる。理想的には、該遺伝子はＯＲＦ５０および／またはＯＲＦ５７である。本発明のさらに別の態様においては、該ウイルスは、選択された非相同物質を挿入させることができる挿入サイトを有する。好ましくは、該挿入サイトは１または複数の該遺伝子の欠失サイトの内部、隣接部または離隔部に存在する。本発明のさらに別の観点によれば、非必須増殖タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子の部分的または全体的な欠失をもたらすサイトとしての役割を果たす欠失サイトに隣接したあらかじめ選択された少なくとも１つの非相同遺伝子フラグメントを有するか、または該フラグメントを挿入させるのに適合したヘルペスウイルス・サイミリが提供される。本発明の好ましい態様においては、該ウイルスはウイルス複製に関連する遺伝子中に、標的細胞内への挿入後のウイルス複製を阻止するような突然変異を有する。より好ましくは、該ウイルスは、標的細胞を形質転換させないために腫瘍形成性表現型を生産できないような突然変異をＳＴＰ遺伝子中に有するか、または有さない菌株である。本発明のさらにまた別の観点によれば、単一のコード領域と非コード領域との接合部に少なくとも１つのあらかじめ選択された非相同遺伝子フラグメントを有するか、または該遺伝子フラグメントを挿入するのに適合したヘルペスウイルス・サイミリであって、該ウイルスが単一のコード領域の一端もしくは両端に減数の非コード反復配列のみが存在するように操作されると共に、ウイルス複製に関与する遺伝子中に、標的細胞内への該ウイルスの挿入後のウイルス複製を阻止するような突然変異を有するヘルペスウイルス・サイミリが提供される。好ましくは、非コード反復配列の該数は５またはそれよりも小さい数であり、理想的には１である。本発明のさらに別の観点によれば、非相同遺伝子フラグメントのヘルペスサイミリウイルスＤＮＡへの挿入を可能にする転移ベクター（transfer vector）が提供される。好ましくは、該挿入には１または複数の前記のいずれかの挿入法が含まれる。本発明の好ましい態様においては、該ベクターは複数の非反復制限サイト、より好ましくは３つの非反復制限サイトを有する。さらに、該ベクターはβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を有しており、該遺伝子はＨＣＭＶＩＥ３の制御下にあるのが好ましい。より好ましくは、該ベクターはｐＲＵＮｅｏ（１６）から誘導されるものであり、理想的にはプルポリ（prupoly）である。本発明のさらにまた別の観点によれば、ウイルス複製に関与する遺伝子中に、標的細胞内でのウイルス複製を阻止するような突然変異を少なくとも１つ有すると共に、非必須増殖タンパク質をコードする遺伝子中に少なくとも１つの突然変異を有するヘルペスウイルス・サイミリが提供される。本発明の好ましい態様においては、該ヘルペスウイルス・サイミリはＳＴＰ遺伝子中にも突然変異を有する。好ましくは、これらの突然変異にはこれらの遺伝子の部分的もしくは完全な欠失が含まれる。好ましくは、ウイルス複製に関与する該遺伝子は転写調節タンパク質遺伝子ＯＲＦ５０および／またはＯＲＦ５７の一方もしくは両方をさらに含んでおり、また、非必須増殖タンパク質をコードする該遺伝子は１または複数の次の遺伝子である：ＯＲＦ４、ＯＲＦ１４、ＯＲＦ１５、ＯＲＦ１６およびＯＲＦ５１。上述の説明から明らかなように、本発明による好ましいウイルスは遺伝子突然変異の多数の有利な組合せを含んでおり、該組合せは該ウイルスを無能にして安全で制御可能な有能なものにするのに役立つ。「無能」とは、標的細胞内での阻止されたウイルス複製能を意味し、「有能」とは、比較的多量の非相同遺伝物質の挿入に対する受容能を意味する。より望ましい場合には、このような突然変異の組合せによって、該ウイルスは標的細胞の形質転換ができなくなるために腫瘍形成性表現型を生産することができなくなる。本発明のさらに別の観点によれば、ヘルペスウイルス・サイミリ遺伝子治療ベクターの少なくとも一部分を含む標的細胞が提供される。本発明のさらにまた別の観点によれば、前記のヘルペスウイルス・サイミリベクターで形質転換された細胞が提供される。また、本発明の他の観点によれば、選択された非相同遺伝物質の標的細胞への搬送法であって、少なくとも該非相同遺伝物質を含むヘルペスウイルス・サイミリに対して該標的細胞を、該ウイルスによる該細胞の感染に好適な条件下において曝らすことを含む該搬送法が提供される。本発明の実施態様を以下の物質と方法に基づく実施例によって説明する。ウイルス突然変異体の分離と特性決定操作されたウイルスは菌株１１の修飾菌株であって、ＯＲＦ１（ＳＴＰ遺伝子）を保有しない。本発明は通常は「野生型」菌株を選択したが、ベクターはこの取り除かれた遺伝子を有したウイルスに基づくものでなければならない。この修飾菌株は欠失された必須遺伝子を有していてもよい。従って、ヘルパー細胞系が生産されてもよく、これについては後で詳述する。これらは適当なＨＶＳゲノムクローンとｐＳＶ２Ｎｅｏを用いる共移入によって確認され、また、Ｇ４１８耐性の細胞クローンが分離された。これらの細胞クローンは適当な遺伝子配列の存在に対するＰＣＲによって選抜した後、ポジティブのものを操作過程で得られた遺伝子のＲＮＡ転写物に対するＲＩ−ＰＣＲによって分析した。適当なクローンを増大させ、ウイルスＤＮＡと欠失調製物を用いる共移入に使用した。β−ガラクトシダーゼを発現するウイルス（Ｘ−galの代謝によって測定した）のヘルパー細胞と正常なVero細胞内での複製能を調べた後、異なる直系型のヒト細胞内での複製を調べた。発表されているデータによれば、菌株１１から誘導されたベクターはヒト胎児繊維芽細胞（ＨＦＦ）起原およびＢ細胞（Raji）の特定の細胞系においては不十分な増殖能を示す。Raji細胞（形質転移ＥＢＶ）は正常なヒト細胞を代表するものではないので、健康な成人ボランティアから採血した新鮮な末梢血液とヒトの一次胎児繊維芽細胞から分離したリンパ様細胞内および市販の上皮細胞内におけるこれらのウイルスの増殖特性を評価した。ウイルス複製はβ −ガラクトシダーゼの発現（感染と細胞−細胞拡散の検証）、エピソームＤＮＡの存在、およびＲＴ−ＰＣＲによって検出される「典型的な」初期遺伝子と後期遺伝子の発現よって評価した。これらの細胞におけるゲノムの存続は、数世代の細胞を経たリポーター遺伝子発現能を示す細胞の割合の測定およびエピソームウイルスＤＮＡの存在に関するアッセイを併用して評価した（１９）。欠失遺伝子を用いる組換えウイルスの生産細胞から細胞外へ遊離したウイルスは遠心分離（３０，０００ｇ；４℃で２時間）によって収集した。半精製ウイルスのペレットを１０ｍＭのTris／ＨＣｌと１ｍＭのＥＤＴＡを含有する緩衝液（ｐＨ８．０）中へ再懸濁させた。ＳＤＳを１％ｗ／ｖ添加した後、プロテイナーゼＫを１００μｇ／ｍｌ添加した。このサンプルを５０℃で１６時間インキュベートした後、フェノールとクロロホルムの５０：５０（ｗ：ｖ）混合物を用いて処理した（５回抽出した）。水性相を除去し、酢酸ナトリウム０．２Ｍ溶液を用いてｐＨを５．０に調整した後、３容量の無水エタノールを添加した。ＤＮＡ沈殿物をチューブから巻き戻し（spool）、風乾後、適量のＴＥ緩衝液に再溶解させた。ＤＮＡの濃度は分光光度計を用いて２５４ｎｍにおけるサンプルの吸光度を測定することによって求めた。精製したウイルスＤＮＡはＤＯＴＡＰ試薬を使用して各々プラスミド構造を有するＯＭＫ（ＡＴＣＣＣＲＬ１５５６）細胞内へ共移入した。２４時間後、培地を除去し、加熱処理で不活性化したＦＣＳを２％含有する培地で置き換えた。次いで、顕著な細胞変性効果が明らかにみられるようになるまで細胞単層の観察を続けた。この段階で、細胞から遊離したウイルスを収集した。該ウイルスはＯＭＫ細胞の新たな亜融合性（subconfluent）単層を感染させるために使用した。２４時間後、これらの細胞層上にフェノールレッド不含ＤＭＥＭ（加熱で不活性化させたＰＣＳを２％含有）中に寒天を１％含有するオーバーレイ（overlay）を載置した。４８時間後、Ｘ−galを添加し（最終濃度：１００μｇ／ｍｌ）、β−ガラクトシダーゼを発現したウイルスのプラークを同定した。青色のプラークを採取し、これをプラーク精製処理に２回付すか、またはウイルス集団が均一になるまで放置した。これらのウイルスはＰＣＲとサザンブロット法を用いる適当な相同組換え処理に関する試験に供した。非相同遺伝子を含有する組換えウイルスの生産前述のようにして調製した精製ウイルスＤＮＡは、非必須遺伝子もしくは必須遺伝子内への組換え用β−ガラクトシダーゼ配列または遺伝子間領域を置き換える適当な非相同遺伝子を含有するプラスミドベクター（ｐＪＧ１０１−１０５および／またはｐＡＷ２０１、２０２、２０３、２０５、２０７または２０９）と共にＯＭＫ細胞内へ共移入させた。β−ガラクトシダーゼを発現しない組換えウイルスを選択し、プラークは前項に記載の方法に従って精製した。生体外細胞のＨＶＳによる感染高力価ウイルスのストックは低感染多重度の０ＭＫ細胞またはVero細胞を用いて生産した。細胞から遊離するウイルスの力価はＯＭＫ細胞内またはVero細胞内で測定し、遊離したウイルスは−７０℃で保存した。いずれかの特異的細胞を１００％の効率で感染させるのに必要なウイルス量は、種々の感染多重度を有する所定数の細胞をβ−ガラクトシダーゼ発現ウイルスを用いて感染させることによって評価した。粘着細胞は、最小容量の培地に含有させたウイルスの添加によって感染させ、穏やかな攪拌下において３７℃で２時間インキュベートした。培地を除去し、適量の新鮮な培地で置き換えた。非粘着細胞を収集し、細胞を計数し、１０⁶〜１０⁷個の細胞をウイルス１ｍｌ中へ１００％の感染効率を達成するのに適当な濃度で再懸濁させた。穏やかな攪拌下でのインキュベーションを２時間おこなった後、細胞を粘着細胞の場合と同様にして処理した。ヘルパー細胞系の生産操作過程において、安定な細胞系内で発現されるべきウイルス遺伝子は適当なプラスミドベクター内において、これらの固有のまたは非相同な５’および３’ 調節配列の制御下でクローン化させた。このプラスミドは選択可能なマーカー、例えば、薬剤Ｇ４１８に対する耐性を真核細胞に付与するネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を含んでいてもよい。あるいは、この遺伝子は、真核生物の非相同調節配列、例えば、ＳＶ４０初期プロモーターおよび適当なポリアデニル化シグナル等の制御下において別のプラスミドに供給されてもよい。すべての場合において、細胞系はこのようにして調製した。５×１０⁵個の細胞（または４０〜５０％の融合性をもたらすのに十分な数の細胞）、例えば、Vero細胞またはＯＭＫ細胞を、直径１０ｃｍの組織培養皿に収容した１０ｍｌのＤＭＥＭ（ウシ胎児血清１０％含有）の界面上へ置き、湿潤空気（ＣＯ₂を５％含有）中において３７℃で１２〜１８時間インキュベートした。次いで、２μｇのプラスミドを、ウイルスＤＮＡの移入に関して先に説明したようにして、ＤＯＴＡＰ試薬を用いて細胞内へ移入させた。この場合、プラスミドは適当な遺伝子と選択可能なマーカー遺伝子を含有する単一のプラスミドであってもよく、あるいは各プラスミドを２μｇ含有する混合物であってもよい。細胞は、湿潤空気（ＣＯ₂を５％含有）中において３７℃でさらに４８時間インキュベートした。この段階において、新たに形成された融合性単層はプラスチック製培養皿から培地を除去することによって該培養皿から分離させた後、リン酸塩緩衝食塩水［ＰＢＳ：ライフ・テクノロジーズ社製（カタログ番号：２００１２）］を用いて洗浄し（２×１０ｍｌ）、次いでトリプシン（０．２５％ｗ：ｖ）とＥＤＴＡ（０．２％ｗ：ｖ）を含有するＰＢＳ溶液２ｍｌを用いて処理した。細胞懸濁液に新鮮な培地を添加し、細胞数を測定し、次いでクローン化用９６個のウェルを有するプレート内へ移した（細胞の稀釈量もしくは分散量：１０⁴個／直径１０ｃｍの皿）。非移入細胞を１００％死滅させるのに十分な濃度のＧ４１８を培地（ＤＭＥＭ／１０％ＦＣＳ）内へ添加した。この濃度は通過細胞数と細胞の種類によって左右される。Vero細胞の場合の一般的な濃度は、通過細胞数が１５０のとき、８００μｇ／ｍｌである。細胞を先に説明したような増殖環境下へ移した後、定期的に細胞の死滅を観察した。培地は死滅／増殖比に応じて約３〜４日毎に交換した。７〜１４日後、増殖した個々の細胞クローンを採取し、適当な数まで増殖させ、次いで移入されたＨＶＳ遺伝子の発現に関する試験に供した。この試験は当該分野において周知の免疫蛍光法、ノザンブロット法またはＲＴ−ＰＣＲ法のいずれかによっておこなうことができる。ウイルスの安全性の評価修飾ウイルスの複製能は、初期直前遺伝子、初期遺伝子および後期遺伝子を選択するためのＲＴ−ＰＣＲ法を用いてウイルス遺伝子発現の測定によって評価した。さらに、形質導入細胞からの組織培養上澄みをインジケーターＯＭＫ細胞と共にインキュベートすることによって感染性ウイルスの遊離の有無を調べた。３挿入組換えベクターここでは、ＨＶＳＬＤＮＡの３’末端への非相同遺伝子の挿入を可能にする組換えベクターを生産する方法を示す。ｐＳＪＮｅｏ（Ｒ．グラスマンから入手）は、Ｈ−ＬＤＮＡ接合部（junction）を有する９．４ｋｂのＨＶＳＤＮＡを有する。最初のＨ反復ユニット内の３５ｂｐに位置するＳｍａＩ切断サイトをＳａｌＩサイトに変えることによってｎｅｏ遺伝子の挿入が可能となる。しかしながら、このベクターは大きな低コピーベクターであるために、大きな非相同遺伝子の挿入には不適当である。発現ベクターとしてｐＳＡ９１を選択して新しい組換えベクターを調製した。このベクターは高コピー数で生産され、該ベクターは遺伝子発現を推進するｈＣＭＶＩＥプロモーターを有する。組換えを可能にする効率的な発現ベクターを生産するために、ｐＳＩｎｅｏからＨＶＳＤＮＡ配列を切除し、該プロモーターに対して５’に位置する非反復ＮａｒＩサイト内へリンカーアダプターを用いて挿入した。このベクターはｐＪＧ１０１で表される。ＯＲＦ０６欠失ｂｐ１２５８４〜１５９６７に位置するＯＲＦ０６は主要なＤＮＡ結合タンパク質をコードするので、この遺伝子の欠失によってウイルス複製は不十分なものとなる。ＯＲＦ０６を欠失させるための組換えカセットを調製するために、フランキングＤＮＡ領域を、１１５０７〜１８０１３のＨＶＳＤＮＡ領域（Ｋｐｎ１Ｆフラグメント）を有するｐＳＳ５４から切除した。ＯＲＦ０６コード領域に対して５’に位置するＫｐｎ１（１１５０７）−Ｈａｅ１Ｉ（１２６１３）１１０６ｂｐフラグメントおよびＳｐｈＩ（１５２５８）−Ｂｇ１ＩＩＩ（１６４０７）１１４９ｂｐフラグメントを切除し、両者を合成オリゴマーを介して連結させた。該オリゴマーは、以下に示すように、非相同遺伝子の挿入を可能にするＥｃｏＲＩ制限サイトとＢａｍＨＩ制限サイトを有する。ＯＲＦ０６の３’末端部分はＯＲＦ０７用プロモーターを有するので保持する必要がある。連結されたＫｐｎＩ−ＢｇＩＩＩフラグメントをpBluescript ＫＳクローニングベクター内へ挿入することによって組換えカセットｐＪＧ１０２に調製した。該フラグメントに結合したオリゴマーの配列は次の通りである。ＴＧＡＡＴＴＣＧＧＡＴＣＣＧＣＡＴＧＣＧＣＧＡＣＴＴＡＡＧＣＣＴＡＧＧＣ HaeIII EcoRI BamIII SphI ヘルパー細胞系を発生させるＯＲＦ０６の調製ＯＲＦ０６コード領域が欠失されたＨＶＳを生産させるためには、ＯＲＦ０６遺伝子生産物を操作過程で供給する必要がある。この要求は安定なヘルパー細胞系を生産することによって達成される。ＯＲＦ０６遺伝子はｐＳＳ５４からＨａｅＩＩ（１２６１３）−ＰｓｔＩ（１５９９８）フラグメントとして切除した。以下に示すオリゴマーを用いることによってＯＲＦ０６のコード領域のスタート部を正確に創製させると共に、発現ベクターｐＳＶＫ３（ファルマシア社製）内への挿入をおこなった。該合成オリゴマーをＯＲＦ０６の５’末端へ連結させた後、ＥｃｏＲ１−Ｐｓ１フラグメントをｐＳＶＫ３へ連結させることによってｐＪＧ１０３を形成させた。これによってＳＶ４０初期プロモーターからの発現が推進され、また、代替プロモーターの使用によってヘルパー細胞系における組換え数は最小になる。合成オリゴマーの配列は次の通りである。ＡＡＴＴＣＡＴＧＧＣＡＡＣＧＡＡＧＡＣＡＧＣＧＣＡＡＣＣＴＡＧＣＧＣＧＴＡＣＣＧＴＴＧＣＴＴＣＴＧＴＣＧＣＧＴＴＧＧＡＴ EcoRI ＯＲＦ06 Start HaeII ＯＲＦ５１欠失ＯＲＦ５１はＨＶＳの潜在的なレセプター結合膜タンパク質をコードするので、この遺伝子の欠失によってウイルスを非感染性にすることができる。ＯＲＦ５１はＨＶＳゲノムの７２６２６と７３４３２の間に位置する。組換えカセット用のＯＲＦ５１フランキング配列を調製するために、ＯＲＦ５１コード領域に対するＢａｍＨＩ（７１６９２）−ＨｐａＩ（７２６０２）９１０ｂｐフラグメント５’およびＯＲＦ５１に対するＢｓｔｌ１０７１（７３３９５）−ＰｓｔＩ（７３９９８）６０１ｂｐフラグメント３’を、ＨＶＳＥｃｏＲＩＤフラグメント６３０２０〜７７５７４を有するｐＫＫ１０４から切除し、両者を合成オリゴマーを介して連結させた。これらのオリゴマーは非相同遺伝子の挿入を可能にするＥｃｏＲＩ制限サイトとＢａｍＨＩ制限サイトのほかに、ＯＲＦ５２のためにｐｏｌｙＡを維持するのに必要な配列も有する。連結後、ＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩフラグメントをクローニングベクターｐＳＰ７３（プロメガ社製）を結合させることによって組換えカセットｐＪＧ１０４を調製した。合成オリゴマーの配列は次の通りである。ＡＡＣＧＡＡＴＴＣＧＧＡＴＣＣＴＴＡＡＴＡＡＴＡＡＴＧＡＧＣＴＧＴＡＴＴＧＣＴＴＡＡＧＣＣＴＡＧＧＡＡＴＴＡＴＴＡＴＴＡＣＴＣＧＡＣＡＴ HpaI EcoRI BamHI ＯＲＦ52polyＡ Bstl107I ヘルパー細胞系を発生させるためのＯＲＦ５１の調製ＯＲＴ５１遺伝子をｐＫＫ１０４からＨｐａＩ（７２６０２）−ＳｔｕＩ（７３４９５）８０６ｂｐフラグメントとして切除し、ＳＶ４０発現ベクターｐＳｖＫ３にクローン化させた。ＥｃｏＲＩリンカーをＯＲＦ５１の５’末端と３’末端に連結させることによってこのクローン化を促進させた。得られたＯＲＦ５１発現ベクターはｐＪＧ１０５で表される。ＯＲＦ５７欠失ＯＲＦ５７は、必須の初期直前遺伝子であるＨＳＶ−１ＵＬ５４に対して相同性を有する転写アクチベーターをコードする。ＯＲＦ５７が完全に欠失されたウイルスを調製するために、ＯＲＦ５７のコード領域に隣接する領域をウイルスＤＮＡを用いる相同組換えが可能になるように増幅させた。プライマーの配列は次の通りである：５’−ｄＧＧＣＧＡＡＴＴＣＧＴＣＴＡＴＡＡＣＴＧＡＣＴＧＧＧＴＴＧＣＴＧ、５’−ｄＧＣＣＣＴＧＣＡＧＧＴＴＡＣＴＣＡＣＣＡＴＡＧＣＴＴＧＡＧ、５’−ｄＧＣＣＣＴＧＣＡＧＣＡＡＧＴＧＴＣＣＡＡＧＣＴＣＴＡＣＴＴＧＴＧＣおよび５’−ｄＧＧＧＧＣＡＴＣＣＣＴＡＴＴＧＡＴＧＴＧＣＣＡＡＧＣＡＡＴＡＧＧＧＴ。これらのプライマーはＨＶＳの２つの領域７７８５０〜７８２６０および７９５３０〜８０１２０を増幅させた。この場合、適当な制限サイトをこれらのプライマー中に取り込んでクローン化を補助した。あらかじめＥｃｏＲＩとＳｐｈＩを用いて消化させたｐＵＣ１８およびこれらのフラグメントを用いて３重連結をおこなってｐＡＷ１０１を誘導した。このプラスミドをＰｓｔＩとＳａｌ１を用いて線状にし、次いで、ｈＣＭＶＩＥプロモーターの制御下においてｌａｃＺ遺伝子と連結させることによってＰδＯＲＦ５７を調製した。ＰδＯＲＦ５７はナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・アンド・マリーン・バクテリア・リミテッド（ＮＣＩＭＢ）［２３Ｓｔマーチャンドライブ、アバディーン、ＡＢ２１ＲＹ］に寄託されている(寄託番号：４０８９４)。ヘルパー細胞系を調製するために、ＯＲＦ５７のコード領域を含むフラグメントをＰＣＲを用いて増幅させた後、Ｔベクター(ｐＣＲＩＩ)に連結させることによってｐＡＷを誘導し、これを、ＨＣＭＶ１ＥプロモーターｐＢＫＣＭＶＯＲＦ５７(ＮＣＩＭＢへの寄託物；寄託番号：４０８９５)の制御下において、プラスミドｐＢＫＣＭＶにクローン化させることによってＯＲＦ５７を得た。ＨＶＳ挿入失活調製物挿入失活は開放読み枠のいずれかの部分を除去することなく遺伝子の機能を阻害する方法としてはあまり好ましいものではない。これは、挿入失活が適当な遺伝子のコード配列内のインジケーターβガラクトシダーゼ遺伝子の位置に依存するからである。この場合には、組換え操作において、β−ｇａｌ配列の欠失をもたらすと共に、遺伝子を再活性させる開放読み枠の連結がおこらない危険性がある。挿入失活遺伝子を調製するために、１．Ｅ．ＣＭＶプロモーターの制御下においてｌａｃＺ遺伝子をＯＲＦの５’コード領域内へ挿入することによって各々の遺伝子を不活性化させる転移ベクターを調製した。この不活性化遺伝子を該プラスミドとＨＶＳウイルスＤＮＡの共移入によってウイルスゲノム内へ挿入することによって組換えウイルスを誘導した。該組換えウイルスはプラーク精製処理に付した。プラスミドの調製ＯＲＦ４／補体制御タンパク質ｐＪＣ８１−ＫｐｎＢをＢｇＩＩＩとＰｓｔＩを用いて消化させることによって、ＯＲＦ４のコード領域を有する１１５２ｂｐフラグメントを調製した。このフラグメントをｐＵＣ１８に連結させることによってｐＵＣＯＲＦ４を誘導した。このプラスミドをＢｇ１ＩＩを用いて線状にした後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて断端を平滑にし、次いで、ＩＥＣＭＶプロモーターの制御下において、ｌａｃＺ遺伝子を有する平滑断端フラグメントを連結させることによってｐＡＷ２０１を調製した。ＯＲＦ１４／小ＩＥ遺伝子ｐＡＣＹＣ１８４−ＥｃｏＦをＥｃｏＲＩとＰｓｔＩを用いて消化させることによって、ＯＲＦ１４のコード領域を有する３１８９ｂｐフラグメントを調製した。このフラグメントにｐＵＣ１８を連結させることによってｐＵＣＯＲＦ１４を得た。このプラスミドをＫｐｎＩを用いて線状にした後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて断端を平滑にし、次いで、ＩＥＣＭＶプロモーターの制御下において、ｌａｃＺ遺伝子を有する平滑断端フラグメントを連結させることによってｐＡＷ２０２を調製した。ＯＲＦ１５／ＣＤ５９同族体ｐＡＣＹＣ１８４−ＥｃｏＦをＳｓｔＩとＰｓｔＩを用いて消化させることによって、ＯＲＦ１５のコード領域を有する２４１５ｂｐフラグメントを調製した。このフラグメントをｐＵＣ１８に連結させることによってｐＵＣＯＲＦ１５を得た。このプラスミドをＭｕｎＩを用いて線状にした後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて断端を平滑にし、次いで、ＩＥＣＭＶプロモーターの制御下において、ｌａｃＺ遺伝子を有する平滑断端フラグメントを連結させることによってｐＡＷ２０３を調製した。ＯＲＦ５０／主要な転写アクチベーターｐＡＣＹＣ１８４−ＥｃｏＤをＢｇ１ＩＩとＰｓｔＩを用いて消化させることによって、ＯＲＦ５０のコード領域を有する４１４９ｂｐフラグメントを調製した。このフラグメントをｐＵＣ１８と連結させることによってｐＡＷ２０４を得た。このプラスミドをＰｓｔＩを用いて消化させた後、ＩＥＣＭＶプロモーターの制御下において、ｌａｃＺ遺伝子を有するＤＮＡフラグメントと連結させることによってＰδＯＲＦ５０を調製した。この調製物はＮＣＩＭＢに寄託されている(寄託番号：４０８９２)。ＮＣＩＭＢに寄託されている(寄託番号：４０８９３）ＰＵＣＰＳＴ(遺伝子の両方のエキソンを包含するＨＶＳＤＮＡのＰｓｔＩフラグメントを含有するｐＵＣ１８である)を用いてヘルパー細胞系を調製した。ＯＲＦ５７／ＩＥ遺伝子ｐＡＣＹＣ１８４−ＥｃｏＩをＢｇ１ＩＩを用いて線状にした後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて断端を平滑にし、次いで、ＩＥＣＭＶプロモーターの制御下において、ｌａｃＺ遺伝子を有する断端平滑フラグメントと連結させることによってｐＡＷ２０６を調製した。ヘルパー細胞系を調製するために、ＯＲＦ５７のコード配列を次のプライマーを用いるＰＣＲによって増幅させた：５’−ｄＣＧＣＧＧＴＡＣＣＣＡＣＡＴＧＴＣＴＡＴＡＡＴＣＧＡＣＴＧＧＧＴＴおよび５’−ｄＣＧＧＧＧＴＡＣＣＣＴＧＡＧＴＣＡＴＴＡＧＴＡＧＴＡＧＣＴＣＡＴＧ。このＰＣＲフラグメントをＴＡクローニングベクターｐＣＲＩＩに連結させてｐＡＷ２０７を調製した。ＯＲＦ１６／アポプトシス(apoptosis)抑制遺伝子適当な制限サイトが存在しないので、ＰＣＲを用いてコードを増幅させて５’ コード領域内へＰｓｔＩサイトを組み込み、次いでクローン化をおこなった。この場合、次のプライマーを使用した：５’−ｄＧＣＣＧＡＡＴＣＣＣＡＣＡＧＴＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＣＣＡＧＴＴ、５’−ｄＣＧＣＣＴＧＣＡＧＧＧＴＧＴＡＴＡＡＣＴＧＡＧＴＧＴＴＡＣＡＧＣ、５’−ｄＧＧＧＣＴＧＣＡＧＧＣＴＧＴＡＣＡＣＴＣＡＧＴＴＡＴＡＣＡＣＣおよび５’−ｄＣＣＣＧＣＡＴＧＣＡＣＴＴＧＡＴＣＣＡＧＧＡＣＡＴＧＣＴＴＣ。このＰＣＲ生産物をｐＵＣ１８と連結させてｐＡＷ２０８を調製した。このプラスミドをＰｓｔＩを用いて線状にし、次いで、ＩＥＣＭＶプロモーターの制御下において、ｌａｃＺ遺伝子と連結させることによってｐＡＷ２−０９を得た。ヘルパー細胞はｐＡＷ２０８を用いて調製した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者マーカム，アレキサンダー・フレッドイギリス、エルエス９・７ティエフ、リーズ、セント・ジェイムズ・ユニバーシティ・ビルディング、クリニカル・サイエンシーズ・ビルディング、ザ・ユニバーシティ・オブ・リーズ、モレキュラー・メディシン、ウエスト・ライディング・メディカル・リサーチ・ユニット

Claims

【特許請求の範囲】１．ウイルスの複製に必要なタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子中に、ヒト細胞内でのウイルスの複製を阻止する少なくとも１つの突然変異を有するヘルペスウイルス・サイミリ。２．突然変異遺伝子がＯＲＦ５０および／またはＯＲＦ５７である請求項１記載のヘルペスウイルス・サイミリ。３．該ウイルスが形質転換遺伝子、例えば、ＳＴＰ遺伝子中の突然変異をさらに有する請求項１または２記載のヘルペスウイルス・サイミリ。４．該ウイルスが、ＯＲＦ４、ＯＲＦ１４、ＯＲＦ１５、ＯＲＦ１６およびＯＲＦ５１から成る群から選択される少なくとも１つの遺伝子中においてさらに突然変異を受けた請求項１から３いずれかに記載のヘルペスウイルス・サイミリ。５．該突然変異が該遺伝子の完全欠失または部分欠失である請求項１から４いずれかに記載のヘルペスウイルス・サイミリ。６．該ウイルスが非相同遺伝物質の挿入のための挿入サイトを有する請求項１から５いずれかに記載のヘルペスウイルス・サイミリ。７．該サイトが少なくとも１つの非コード反復配列の内部もしくは隣接部、好ましくは非反復コード領域と非コード配列の接合部に位置する請求項６記載のヘルペスウイルス・サイミリ。８．該挿入サイトが該欠失のサイトに位置する請求項５から７いずれかに記載のヘルペスウイルス・サイミリ。９．挿入サイトが、ＯＲＦ４、ＯＲＦ１４、ＯＲＦ１５、ＯＲＦ１６およびＯＲＦ５１から成る群から選択される少なくとも１つの遺伝子の内部もしくは隣接部に位置する請求項６記載のヘルペスウイルス・サイミリ。１０．非必須タンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子中に少なくとも１つの突然変異を有するヘルペスウイルス・サイミリ。１１．該遺伝子が次の遺伝子の少なくとも１つである請求項１０記載のヘルペスウイルス・サイミリ：ＯＲＦ４、ＯＲＦ１４、ＯＲＦ１５，ＯＲＦ１６およびＯＲＦ５１。１２．該突然変異が該遺伝子の完全欠失または部分欠失である請求項１０または１１記載のヘルペスウイルス・サイミリ。１３．該ウイルスが形質転換遺伝子、例えば、ＳＴＰ遺伝子中の突然変異をさらに有する請求項１０から１２いずれかに記載のヘルペスウイルス・サイミリ。１４．該ウイルスが、ＯＲＦ５０および／またはＯＲＦ５７をコードする遺伝子の少なくとも一部が突然変異および／または欠失を受けるようにさらに操作された請求項１０から１３いずれかに記載のヘルペスウイルス・サイミリ。１５．該ウイルスが、非相同ＤＮＡを挿入することができる挿入サイトを有する請求項１０から１４いずれかに記載のヘルペスウイルス・サイミリ。１６．非必須遺伝子をコードする少なくとも１つの遺伝子の部分的もしくは完全な欠失のためのサイトの役割を果たす欠失サイトに隣接した少なくとも１つのあらかじめ選択された非相同ＤＮＡフラグメントを有するか、または該ＤＮＡフラグメントを挿入するのに適合したヘルペスウイルス・サイミリ。１７．該ウイルスが、ウイルスの複製に必要な部分をコードする遺伝子に関して突然変異または欠失をさらに受けた請求項１６記載のヘルペスウイルス・サイミリ。１８．該ウイルスが、形質転換遺伝子、例えば、ＳＴＰ遺伝子中に突然変異をさらに有する請求項１６または１７記載のヘルペスウイルス・サイミリ。１９．単一のコード領域と非コード領域との接合部に少なくとも１つのあらかじめ選択された非相同ＤＮＡフラグメントを有するか、または該ＤＮＡフラグメントを挿入するのに適合したヘルペスウイルス・サイミリであって、該ウイルスが単一のコード領域の一端もしくは両端に減数の反復非コード配列を有し、また、該ウイルスがウイルスの複製に関与する部分をコードする少なくとも１つの遺伝子中に少なくとも１つの突然変異を有するヘルペスウイルス・サイミリ。２０．該反復非コード配列の数が５もしくはそれよりも小さいか、または理想的には１である請求項１９記載のヘルペスウイルス・サイミリ。２１．ウイルスの複製に関与する部分をコードする遺伝子中に少なくとも１つの突然変異を有すると共に、非必須タンパク質をコードする遺伝子中に突然変異を有するヘルペスウイルス・サイミリ。２２．該ウイルスが形質転換遺伝子、例えばＳＴＰ遺伝子中に突然変異をさらに有する請求項２１記載のヘルペスウイルス・サイミリ。２３．突然変異に該遺伝子の部分的もしくは完全な欠失が含まれる請求項２１または２２記載のヘルペスウイルス・サイミリ。２４．ウイルスの複製に関与する部分をコードする該遺伝子がＯＲＦ５０またはＯＲＦ５７を含む請求項２１から２３いずれかに記載のヘルペスウイルス・サイミリ。２５．非必須タンパク質をコードする該遺伝子が、ＯＲＦ４、ＯＲＦ１４、ＯＲＦ１５、ＯＲＦ１６およぴＯＲＦ５１から成る群から選択される遺伝子を含む請求項２１から２４いずれかに記載のヘルペスウイルス・サイミリ。２６．ウイルスの感染に好適な条件下において、少なくともあらかじめ選択された非相同ＤＮＡを含むヘルペスウイルス・サイミリに標的細胞をさらすことによって選択された非相同ＤＮＡを該標的細胞へ搬送する方法。