CN101236204B - O型口蹄疫抗体水平检测试纸及制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于对偶蹄类动物O型口蹄疫抗体水平进行快速检测的胶体金试纸条，这种试纸条的制备，以及其具体检测的方法。试纸条的底板上固定有多孔纤维材料构成的加样吸收垫、位于加样吸收垫尾端并与加样吸收垫相连的免疫金标层、和由硝酸纤维膜构成的检测段，以及位于检测段尾端与检测段相连的用吸水材料构成的吸收段，质控线为抗O型口蹄疫病毒的兔或豚鼠IgG抗体，检测线包由O型口蹄疫病毒构成，检测段的检测线和免疫金标层吸附的胶体金标记的O型口蹄疫病毒是天然病毒，或者是基因重组表达口蹄疫病毒，或者是口蹄疫病毒的分解抗原。

Description

O型口蹄疫抗体水平检测试纸及制备方法

技术领域

本发明涉及一种快速检测用的检测物，具体讲是一种用于偶蹄类动物O型口蹄疫抗体水平进行快速检测的试纸条，这种试纸条的制备，以及用这种纸条对偶蹄类动物O型口蹄疫抗体水平进行具体检测的方法。

背景技术

口蹄疫(Foot-and-Mouth，FMD)是由口蹄疫病毒引起的一种急性、热性、高度接触传染性和可快速远距离传播的动物疫病。侵染对象是猪、牛、羊等主要畜种及其他家养和野生偶蹄动物，易感动物多达70余种。口蹄疫的发病率为100％，爆发可使农场破产，发病地区和国家的畜牧业乃至整个国民经济遭受巨大打击。因此，世界动物卫生组织(OIE)将该病列在15个A类动物疫病之首，我国政府也将口蹄疫排在14个一类动物传染病的第一位。

人类与口蹄疫的斗争已有上百年的历史，但至今该病尚未在全球范围内得到控制和消灭。1997年我国台湾省在享受了多年无口蹄疫的地区地位后，爆发了猪口蹄疫，直接损失不超过10亿美元，但间接损失达到80亿美元，更糟糕的是台湾未能按原计划扑灭疫情，至今未恢复无口蹄疫地区地位，使台湾的畜牧业从此一蹶不振。最近的一次口蹄疫大爆发于2001年英国，直接损失和间接损失接近100亿英镑，使当年的经济增长率下调1.5个百分点。

鉴于口蹄疫可造成的巨大经济损失和社会影响，各国政府都非常重视口蹄疫的防治研究，我国也有专门的机构研究口蹄疫。但口蹄疫病毒的变异性极强，目前有7个血清型，O型、A型、C型、南非1型、南非2型、南非3型、Asia1型，型间不能交叉免疫，等于面对7种不同的传染病。同型内不同的病毒株的抗原性也不同，而新毒株又不断出现，这就使得口蹄疫的防治包括疫苗防治工作产生极大的困难。O型FMDV是提交国际参考实验室阳性临床病理标本中是最常见的FMDV，从本型FMDV的最新流行态势可以看出，其发病多为新侵入，宿主范围比较广泛，对畜牧业危害极大，2000年韩国、日本相继暴发猪、牛、羊O型口蹄疫，估计造成的经济损失达20亿美元，致使两国畜产品无法进入国际市场。2001年英国O型口蹄疫暴发时，共扑杀动物592万头，造成的直接经济损失27亿英镑，间接损失达200亿英磅，相当于英国国内生产总值(GDP)的2.5％。目前O型口蹄疫的流行呈现上升趋势，简单、快速、有效的免疫抗体水平监测方法，是防治口蹄疫爆发和流行的保障，也是制定口蹄疫免疫程序的重要依据。

现采用的抗体检测方法主要有CFT、VNT、凝集试验、免疫扩散和ELISA等，其中最常用于FMDV抗体检测的方法是VNT和ELISA方法。VNT诊断FMD方法准确、可靠，但要动用活毒，需要在专门的实验室进行试验，而且工作量大、实验周期长。液相阻断ELISA具有与VNT相同的灵敏度和特异性，且重复性好，尤其适合于大批量血清样品的检测。是国际认可的一种标准化诊断技术。但该方法同样操作繁复，而且需要相应的检测设备才能判定结果，面对我国基层检测机构及广大的畜禽养殖场缺少检测设备与专业技术人员的现状，发展一种快速、简便、无需专业人员和仪器，可在野外、田间进操作的新型诊断方法已成为一项急需解决的课题。

中国发明专利申请200610043143.6公开了一种口蹄疫病毒定型试纸条及其制备和使用方法。该专利申请是由O、A、Asia I、C四种血清型检测试纸条组成，试纸条由PVC衬板、硝酸纤维素膜、吸收垫、金标垫、样品垫部分组成，所述PVC衬板设在最底部，衬板上部中段设有硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜上部左端贴有吸收垫，硝酸纤维素膜上部右端设有金标垫，金标垫的上部右端设有样品垫。该试纸条可以用于确定口蹄疫病毒的O、A、Asia I、C型四种血清型抗原，以确定被检动物是否感染口蹄疫病毒。该试纸条操作快速简便，判定直观容易，结果敏感特异，费用低廉，运输保存方便，非常适用于基层人员在田间检测使用。但这一专利申请所公开的试纸条却无法检测被检动物经人工免疫或自然免疫产生抗体的水平，以及免疫动物抗体与保护力的关系。

由于FMD流行带来的严重危害性，目前发达国家大多采取扑杀销毁的措施，而发展中国家以疫苗免疫接种为主要手段。FMDV抗原变异频繁，亚型之间的抗原差异性也很大，因此往往造成诊断困难。制备诊断抗原应近可能与FMDV的分子流行病学的研究为基础。

为避免口蹄疫病毒的大面积流行，对人工饲养的偶蹄类动物进行人工免疫是现发展中国家多采用的方法。经人工免疫后，被免疫动物是否产生抗体，能否有效抵抗病毒的感染，需要提供一种有效快捷的手段进行检测。

口蹄疫疫苗免疫动物血清抗体效价与攻毒保护具有相关性，已在国内外许多实验室得到验证，数十年前就证实了免疫动物中和抗体滴度与攻毒保护有很好的相关性，其最高的相关性在免疫后3-4周的牛和猪血清抗体检测中得到验证，后期要达到与前期相同的保护程度，则需要加强免疫，获得更高的抗体滴度。因此确定免疫动物抗体效价与保护力的关系，对于田间动物的免疫效力评价具有实际意义。

发明内容

本发明提供一种可克服现有技术不足，可以以对偶蹄类动物O型口蹄疫抗体水平进行快速检测的试纸条，同时提供这种试纸条的制备方法和使用方法。

本发明的检测试纸条是：在一不透水材料的底板上呈线性排列固定于其上的用多孔纤维材料构成的加样吸收垫、位于加样吸收垫尾端并与加样吸收垫相连的免疫金标层、与免疫金标层的尾端相连由硝酸纤维膜构成的检测段和位于检测段尾端与检测段相连的用吸水材料构成的吸收段，检测段上包被有用抗O型口蹄疫病毒的兔或豚鼠IgG抗体形成的质控线，检测段上处于质控线的上游包被有O型口蹄疫病毒形成的检测线，检测段的检测线和免疫金标层吸附的胶体金标记的O型口蹄疫病毒是天然病毒，或者是基因重组表达口蹄疫病毒，或者是口蹄疫病毒的分解抗原。

本发明的检测试纸条的检测线和免疫金标层的O型口蹄疫病毒最好是天然全病毒。

本发明的检测O型口蹄疫抗体水平检测试纸条的制备方法是：首先制备出15～50纳米的胶体金溶液，然后：

1)制备免疫金标层

先将胶体金溶液的pH值调至8.0～8.4，再在其中按每100ml胶体金溶液加入0.1～0.4mg经纯化处理的O型口蹄疫全病毒，搅拌均匀后，再在溶液中按0.2～1g/100ml加入动物血清蛋白，4℃静置2～4小时，再将上述胶体金溶液离心去除沉淀物，得上清液，将上清液再经离心处理得沉淀物，所得沉淀物按4～10ml/100ml溶于含重量比0.2～0.6％的动物血清蛋白和0.01～0.06％叠氮钠的0.02M pH7.4 Tris-Hcl的缓冲液中得到胶体金标记的病毒溶液，将胶体金溶液浸入玻璃纤维至液体开始渗出为止，或者采用喷膜机将前述的O型口蹄疫全病毒与动物血清蛋白和叠氮钠的缓冲液喷在玻璃纤维上，形成金标抗体层，将金标抗体层进行干燥处理后待用；

2)制备检测段

用喷膜机在硝酸纤维素膜中段喷检测线，再取兔抗或鼠抗O型口蹄疫IgG调浓度为1.5～2.5mg/ml，，用喷膜机在纤维素膜中段，距检测线0.5～1cm处，喷质控线，喷膜量按10～15ul/1cm设置，然后干燥处理，再用0.01m PH7.0含小牛血清的磷酸缓冲液在37℃下封闭30分钟，0.01ml pH7.0的PBS漂洗后再次进行干燥处理，得到检测段待用；

3)试纸组装

将不透水材料的底板材料、金标抗体层、检测段及吸收垫材料和吸收段材料分别按设计长度裁取，依次将金标抗体层、检测段及吸收垫材料和吸收段固定于底板材料上，制成试纸条。组装时应注意使检测段的检测线靠近试纸条的加样吸收垫一侧。

本发明的试纸条制备方法中采用蔗糖密度梯度离心来纯化口蹄疫病毒。

本发明的O型口蹄疫抗体水平检测试纸条的使用方法是是取牛、羊、猪等偶蹄类动物血液或血清，将血液或血清用磷酸缓冲液稀释，再将经稀释的血液或血清滴于加样端样品吸收垫，或者将加样端吸收垫插入被检动物的血液或血清稀释液中，然后观察检测线和质控线的阳性结果，得到被检测动物是否具有抗体的结果。

本发明的检测O型口蹄疫抗体水平检测试纸条使用中，如果是取牛、羊、猪等偶蹄类动物血液或血清用pH7.4 0.02M磷酸缓冲液稀释，将经稀释的血液或血清滴于加样端样品吸收垫，或者将加样端吸收垫插入被检动物的血液或血清稀释液中，如果血清在≥1∶8稀释后，检测层硝酸纤维素膜上形成质控线和检测线双线阳性结果，则表示该检测血清O型口蹄疫抗体水平达到99％保护范围，被检动物能耐受同源强毒攻击，不需要进行免疫；如果被检测血清在≤1∶2稀释后，检测层硝酸纤维素膜上形成质控线单线阴性结果，则表示该检测血清的O型抗体水平属于不保护范围，被检动物不能耐受同源强毒攻击，需要进行基础免疫；如被检测血清在1∶2～1∶4之间稀释后，检测层硝酸纤维素膜上形成质控线和检测线双线阳性结果，则表示该检测血清0型口蹄疫抗体抗体水平属于50％保护范围，被检动物不能完全耐受同源强毒攻击，需要进行加强免疫。

由前述内容可知，本发明的试纸条中，检测段的检测线和免疫金标层吸附的胶体金标记的O型口蹄疫病毒可以是基因重组表达口蹄疫病毒，或者是口蹄疫病毒的分解抗原。采用基因重组表达抗原具有如下优点：重组DNA技术生产的抗原较之从其他生物源分离的抗原有诸多的优越性，如纯度高，特异性强。由于蛋白是在遗传修饰实验室生长细胞中合成的，故每批蛋白制品与前一次制备是相同的，可以保证各批次质量一致。同时因自然抗原很少有完全纯净的，往往会产生针对污染多肽的抗体，而导致产生假阳性结果，而采用基因重组表达病毒能完全避免这些问题。

本发明认为最好使用O型口蹄疫全病毒纯化抗原作为中和抗体水平的检测抗原。资料显示FMDV的免疫原性主要取决于完整的病毒粒子。在FMDV粒子表面的抗原位点有线性位点和构象位点两种。前者主要与表位的一级结构(氨基酸序列)有关，而后者主要与病毒结构有关，对FMDV抗原位点的研究表明，FMDV的结构蛋白均参与抗原位点的构成，其线性位点少，构象位点多。而表达抗原多选用FMDV某一段基因序列，使用的是其线性位点。同时利用原核或真核系统表达，产生的蛋白与天然蛋白构象差异很大，特别是抗原决定簇重要的糖基化位点不能得到很好的修饰，使其免疫原性较差，不能很好的产生中和抗体，这也是现在多数重组抗原不能替代全病毒抗原作为疫苗生产的原因。而作为诊断动物免疫或感染产生中和抗体水平的检测抗原，其必须具备充分的抗原决定簇和完整构象位点才能更好的捕获血清中的抗体，并与其进行特异性反应，以提高其检测的灵敏度。

另一方面，O型口蹄疫天然全病毒纯化生产工艺简单，大规模细胞培养技术成熟稳定，纯化过程简单易行，得到的抗原效价稳定。由于本专利使用了蔗糖密度梯度离心来纯化病毒，使诊断抗原具有较好的特异性和敏感性，同时保存方便。

本发明制备诊断抗原即采用了近可能与国内FMDV的分子流行病学的研究为基础的O型口蹄疫全病毒，克服了FMDV抗原变异频繁，亚型之间的抗原差异性大，易造成诊断困难的不足。其次，本发明的试纸条不仅可以半定量检测出免疫或感染动物的(免疫)抗体水平，同时可确定免疫动物抗体效价与保护力的关系，这是现有技术不能胜任的。

本发明具有如下优点：

1、本发明首次用口蹄疫天然全病毒标记胶体金颗粒，建立了可检测O型口蹄疫抗体水平的试纸条，可对血液或血清中的O型口蹄疫抗体水平进行快速检测。

2、本发明与目前监测抗体水平的病毒中和试验，正向间接血凝试验，及液相阻断ELISA相比，检测样品仅需15分钟即可判定结果。具有检测过程迅速、快捷、方便，无须配备专门仪器设备和技术人员，结果判定直观容易等优点。非常适于兽医基层工作人员进行临床检验、流行病学调查和场地检疫等多种场合，同时还可在口岸通关大批量快速检验时使用。

3、本发明特异性、再现性好，结果稳定。可应用于猪、牛群等O型口蹄疫抗体水平监测，了解整个猪、牛群口蹄疫抗体的状况，为决定是否开展免疫，选择制定O型口蹄疫疫苗适宜的免疫剂量、程序提供依据。

4、本发明使用安全，无放射性同位素与苯二胺等有害物质参与，没有生物安全隐患，不会污染环境。

5、本发明质量稳定，具有可在常温运输保存的优点。

6、本发明制备方法简便、成本低廉，检测费用低。

附图说明

图1为本发明的试纸条整体示意图。图2为试纸条纵向结构的示意图，其中的4端位于图1中的2的位置。图3为试纸条结果判定图。图4为120头免疫牛金标试纸条检测抗体效价与同源强毒攻毒保护/发病分布图；图中：空条表示发病；点状条表示部分保护；实条表示完全保护。图5为60头免疫猪金标试纸条检测抗体效价与同源强毒攻毒保护/发病关系分布图。

具体实施方式

以下提供发明的具体实施例。

(一)试纸条的制备：

1)制备免疫金标层

i胶体金的制备：取100mg氯金酸溶于1000ml三蒸水中，加入20ml浓度为1％的柠檬酸三钠，煮沸15分钟，冷却后得到40纳米的胶体金溶液；

ii胶体金标记细胞培养口蹄疫病毒，取100ml胶体金溶液，用0.2mol/L碳酸钾溶液调PH8.0，加入0.15mgO型口蹄疫全病毒，搅拌20分钟，再加入500mg牛血清蛋白，继续搅拌15分钟，4℃静置2小时，这里所用的O型口蹄疫全病毒可以是经纯化的天然病毒，也可以是基因重组表达O型口蹄疫病毒再经过差速离心或蔗糖密度梯度离心纯化；

iii将上述胶体金溶液经2000转/分钟离心10分钟，去沉淀物，得上清液；iv将上清液经10000转/分钟离心60分钟，得沉淀物；

v将沉淀物按6ml/100ml溶于0.02M PH7.4 Tris-Hcl缓冲液得到胶体金溶液，该缓冲液中含0.25％的牛血清白蛋白和0.02％叠氮钠；

vi将胶体金溶液浸入玻璃纤维或无纺布至液体开始渗出为止，在37℃下2小时干燥而形成免疫金标层。

免疫金标层的制备也可以采用在玻璃纤维上用喷膜机喷膜的方法，其喷膜量应保证胶金溶液的最终浓度符合要求。

2)检测层制备

这一阶段主要是制备形成检测段8的质控线6和检测线7的包被。所述的检测段8是在纤维膜上形成基因表达口蹄疫病毒构成的检测线和抗口蹄疫病毒兔IgG抗体形成的质控线6。其制备方法是取基因表达口蹄疫全病毒，调整浓度为0.1mg/ml，用喷膜机在纤维素膜中段喷检测线7；再取兔抗口蹄疫IgG调浓度为1.5mg/ml，，用喷膜机在纤维素膜中段，距检测线0.5cm处，喷质控线6，按喷膜量10μl/1cm进行喷膜，喷膜温度为37℃。喷膜后干燥2小时，再用0.01mPH7.0含小牛血清的PBS，在37℃下封闭30分钟，用0.01ml PH7.0的PBS漂洗，再在37℃干燥处理。

3)试纸条组装

本阶段是在衬板10上组合口蹄疫病毒金标层和检测段，最终形成试纸条。

将不透水材料的底板材料、金标抗体层、检测段及吸收垫材料和吸收段材料分别按设计长度裁取，依次将金标抗体层、检测段及吸收垫材料和吸收段固定于底板材料上，组装成试纸条。组装中所采用的不透水材料为PVC塑料板，加样吸水层采用玻璃纤维。在塑料垫板10的两端分别粘贴玻璃纤维的加样端吸收垫4和吸水层9；在其中段粘贴包被有检测线7和质控线6的硝酸纤维膜层8，在加样端吸水层4与硝酸纤维素膜层8的交接部位，夹贴含免疫金标层5的玻璃纤维的一端沿其长度的1/5部分应与加样端吸水纸层4相重叠，其另一端沿其长度的1/5应与纤维素膜层8相重叠，以保证免疫金标层与其两端的所设的加样层4、检测段8间有良好的接触。然后按4mm宽、8cm长规格切条，再组装在塑料盒内。盒盖上加样孔2正对测试条的加样端吸水纸层4，观察孔3正对纤维素膜的检测层8。所制成的试纸条结构参见附图1和附图2。

本发明的试纸条制备方法中对天然病毒建议采用蔗糖密度梯度离心来进行纯化处理。

本发明的试纸条采用疫苗效力检验的国际标准方法PD₅₀测定法，采用国际标准攻毒方法攻毒，测定了O型口蹄疫金标试纸条检测抗体效价与保护力的关系。

试验所用疫苗为兰州兽医研究所生物制品厂生产的免疫用口蹄疫O型疫苗，攻毒用口蹄疫O型毒株为疫苗同源强毒株。

1O型口蹄疫抗体检测试纸条操作步骤及判定标准

1.2待检样品的处理将待检血清100μL用0.02mol/LPBS作对倍稀释，分别稀释1∶2、1∶4、1∶8三个稀释度。

1.2样品检测  将O型抗体检测试纸条插入到每个稀释度样品中。注意将试纸条有标志线的一端插入待检样品中，样品液面不可超过标志线。当液体全部浸湿硝酸纤维素膜后，取出试纸条，平放于干净的桌面上，5-15分钟内观察结果。

1.3单支试纸条结果判定

阳性：质控带与检测带都出现清晰可见红色条带。血清中的抗体水平越高，检测带红色带颜色越深。(++：强阳性清晰可见的红色；+：肉眼可见的红色)

阴性：只有质控带出现清晰可见红色条带。

可疑：质控带出现一条颜色清晰可见的红色线，而在检测带出现一条颜色很浅，若隐若显的红色带。

无效：质控带不出现红色条带。

以上参见附图3.

2.4血清效价判定

试纸条抗体效价≥稀释度：试纸条在该抗体稀释度显示阳性结果。

试纸条抗体效价≤稀释度：试纸条在该抗体稀释度显示阴性或可疑结果。

试纸条抗体效价＝无效：试纸条在该抗体稀释度显示无效结果。

2攻毒试验

所用动物为猪和牛。对120头免疫用牛在免疫前用液相阻断ELISA进行了检测，均为口蹄疫O型抗体阴性牛。60头免疫用猪在免疫前用液相阻断ELISA进行了检测，均为口蹄疫O型抗体阴性猪。

2.1血清样品

2.1.1牛血清样品

120份牛血清样品于采自兰州兽医研究所生产的牛口蹄疫O-Asia1型双价灭活疫苗效力检验牛免疫后21日采集血清。用检测试纸条测定了所有免疫牛共120份样品的抗体滴度，分析了该方法测定的抗体滴度与免疫牛保护的关系。疫苗效力检验采用OIE标准方法PD₅₀测定法。免疫计量分别为3ml、1ml、0.33ml。每个剂量5头牛，免疫后21日用同源强毒10000ID₅₀攻毒，舌面注射2点，观察12日，以蹄部出现水泡等感染症状判为发病。

2.2.2猪血清样品

60份猪血清样品2004年采自兰州兽医研究所猪口蹄疫O型灭活疫苗效力检验猪免疫后21日采集血清。疫苗效力检验采用OIE标准方法PD₅₀测定法。免疫后21日用同源强毒10000ID₅₀攻毒，观察12日。以蹄部出现水泡等感染症状判为发病。

3  结果

3.1口蹄疫O型疫苗免疫牛金标试纸条检测抗体效价与保护力关系

120份口蹄疫O型疫苗效力检验牛免疫21日攻毒前血清用金标试纸条测定了抗体效价。统计了免疫牛抗体效价与攻毒牛发病与保护的对应关系，参见图4。图4显示了免疫牛用10000ID50同源强毒攻毒后发病和保护牛在金标试纸条检测抗体效价各个范围内的分布。由图3可见，抗体效价≥1∶8时，用同源强毒10000ID50攻毒，免疫牛全部保护；抗体效价≤1∶2时，用同源强毒10000ID50攻毒，免疫牛全部发病，属于不保护范围；抗体效价在1∶2-1∶4时，用同源强毒10000ID50攻毒，有发病牛，也有保护牛在国际上将这一效价范围称为“灰色区”，统称为50％保护效价范围。

3.2  口蹄疫O型灭活疫苗免疫猪金标试纸条检测的抗体效价与保护力关系

60份口蹄疫O型灭活疫苗效力检验猪免疫21日攻毒前血清用金标试纸条测定了抗体效价。统计了免疫猪抗体效价与攻毒猪发病和保护的对应关系。图5显示了免疫猪用1000ID50同源强毒攻毒后，发病与保护猪在金标试纸条效价各个范围的分布。由图5可见，免疫猪金标试纸条抗体效价≥1∶8时，用同源强毒1000ID50攻毒，全部保护，属于99％以上保护范围；免疫猪试纸条抗体效价≤1∶2时，用同源强毒1000ID50攻毒，全部发病，属于不保护效价范围；免疫猪试纸条抗体效价1∶2-1∶8时，用同源强毒1000ID50攻毒，既有发病猪，也有保护猪，发球灰色区效价范围，称为50％保护效价范围。

由以上试验所得到的结果参见附表

附表  免疫牛猪同源强毒攻击呈现敏感、不完全保护、保护的滴度范围

试验	动物	敏感	不完全保护	保护
					金标试纸条金标试纸条	牛猪	≤0.3(1∶2)≤0.3(1∶2)	0.3(1∶2)-0.6(1∶4)0.3(1∶2)-0.6(1∶4)	≥0.9(1∶8)≥0.9(1∶8)

注：敏感表示免疫动物全部发病；不完全保护表示免疫动物即有发病的也有不发病的；保护表示免疫动物全部保护。

我们用本发明的试纸条测定了120头不同剂量免疫的攻毒/保护试验牛抗体滴度，60头攻毒/保护试验猪抗体滴度，同时确定了免疫动物用同源强毒攻击时呈现敏感、不完全保护、保护的滴度范围。通过上述实验我们确定了O型口蹄疫金标试纸条检测抗体效价与保护力的关系，即血清在≥1∶8稀释后，试纸条显示阳性结果，则表示该检测血清O型口蹄疫抗即抗体水平达到99％保护范围，被检动物能耐受同源强毒攻击，不需要进行免疫；如果被检测血清在≤1∶2稀释后，显示阴性结果，则O型口蹄疫抗体水平属于不保护范围，被检动物不能耐受同源强毒攻击，需要进行基础免疫；血清在1∶2～1∶4稀释后，显示阳性结果，则表示该检测血清O型口蹄疫抗体水平属于50％保护范围，被检动物不能完全耐受同源强毒攻击，需要进行加强免疫。

Claims (4)

1.一种O型口蹄疫抗体水平检测试纸条，包括呈线性排列的固定于不透材料制成的底板上的用多孔纤维材料构成的加样吸收垫、位于加样吸收垫尾端并与加样吸收垫相连的免疫金标层、与免疫金标层的尾端相连由硝酸纤维膜构成的检测段和位于检测段尾端与检测段相连的用吸水材料构成的吸收段，检测段上包被有用抗O型口蹄疫病毒的兔或豚鼠IgG抗体形成的质控线，其特征在于检测段上处于质控线的上游包被有O型口蹄疫病毒形成的检测线，检测段的检测线和免疫金标层吸附的胶体金标记的O型口蹄疫病毒是天然病毒，或者是基因重组表达口蹄疫病毒。

2.根据权利要求1所述的检测O型口蹄疫抗体水平检测试纸条，其特征在于构成检测线和免疫金标层的O型口蹄疫病毒是天然全病毒。

3.根据权利要求1所述的检测O型口蹄疫抗体水平检测试纸条的制备方法，首先制备出15～50纳米的胶体金溶液，其特征是：

1)制备免疫金标层

先将胶体金溶液的pH值调至8.0～8.4，再在其中按每100ml胶体金溶液加入0.1～0.4mg经过蔗糖密度梯度离心纯化的天然O型口蹄疫病毒或经过蔗糖密度梯度离心纯化的基因重组表达O型口蹄疫病毒，搅拌均匀后，再在溶液中按0.2～1g/100ml加入动物血清蛋白，4℃静置2～4小时，再将上述胶体金溶液离心去除沉淀物，得上清液，将上清液再经离心处理得沉淀物，所得沉淀物按4～10ml/100ml溶于含重量比0.2～0.6％的动物血清蛋白和0.01～0.06％叠氮钠的0.02M pH7.4 Tris-Hcl的缓冲液中得到胶体金标记的病毒溶液，将胶体金溶液浸入玻璃纤维至液体开始渗出为止，形成金标抗体层，将金标抗体层进行干燥处理后待用；

2)制备检测段

用喷膜机在硝酸纤维素膜中段喷检测线，再取兔抗或鼠抗O型口蹄疫IgG调浓度为1.5～2.5mg/ml，，用喷膜机在纤维素膜中段，距检测线0.5～1cm处，喷质控线，喷膜量按10～15ul/1cm设置，然后干燥处理，再用0.01M pH7.0含小牛血清的磷酸缓冲液在37℃下封闭30分钟，0.01ml pH7.0的PBS漂洗后再次进行干燥处理，得到检测段待用；

3)试纸组装

将不透水材料的底板材料、金标抗体层、检测段及吸收垫材料和吸收段材料分别按设计长度裁取，依次将金标抗体层、检测段及吸收垫材料和吸收段固定于底板材料上。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征是采用蔗糖密度梯度离心纯化O型口蹄疫天然病毒。

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