CN108948191B - 一种菌丝霉素单克隆抗体及检测试剂盒 - Google Patents

一种菌丝霉素单克隆抗体及检测试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN108948191B
CN108948191B CN201810632569.8A CN201810632569A CN108948191B CN 108948191 B CN108948191 B CN 108948191B CN 201810632569 A CN201810632569 A CN 201810632569A CN 108948191 B CN108948191 B CN 108948191B
Authority
CN
China
Prior art keywords
mycelial
mycin
monoclonal antibody
detection kit
solution
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201810632569.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108948191A (zh
Inventor
梁伟凡
周玉岩
范惠敏
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guangdong Hinabiotech Co ltd
Original Assignee
Guangdong Hinabiotech Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Guangdong Hinabiotech Co ltd filed Critical Guangdong Hinabiotech Co ltd
Priority to CN201810632569.8A priority Critical patent/CN108948191B/zh
Publication of CN108948191A publication Critical patent/CN108948191A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108948191B publication Critical patent/CN108948191B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/14—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from fungi, algea or lichens
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明公开了一种菌丝霉素单克隆抗体及检测试剂盒，所述抗体通过菌丝霉素单克隆抗体杂交瘤5D11分泌，所述杂交瘤5D11保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日为2018年5月30日，保藏编号为CGMCC No.15790，所述试剂盒包括所述菌丝霉素抗原包被的96孔板，菌丝霉素单克隆抗体，菌丝霉素标准品，辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG，样品稀释液，样品洗涤液，TMB显色液和终止液；所述杂交瘤分泌的菌丝霉素单克隆抗体特异性强，效价高，所述试剂盒可对各种样品进行菌丝霉素的微量检测，并且具有操作简便、灵敏度高、重复性好等优点。

Description

一种菌丝霉素单克隆抗体及检测试剂盒
技术领域
本发明涉及免疫学技术领域，特别涉及一种菌丝霉素单克隆抗体及检测试剂盒。
背景技术
菌丝霉素(Plectasin)是从腐生子囊菌假黑盘菌(Pseudoplectania nigrella)中分离得到的首例真菌防御素，与无脊椎动物的防御素存在50％-55％同源性，与哺乳动物的α-或β-防御素没有序列相似性。成熟的菌丝霉素由40个氨基酸残基组成，由一个α-螺旋和两个反平行的β-折叠组成，包含三个二硫键形成的稳定的空间结构。菌丝霉素对革兰氏阴性细菌的抑菌作用较弱，但对革兰氏阳性细菌具有明显杀伤作用，包括：链球菌属、葡萄球菌属、肠球菌属、棒状杆菌属和杆状菌属，尤其值得注意的是，菌丝霉素对耐药金葡(MRSA)具有非常显著的杀菌作用，而且菌丝霉素对肺炎链球菌的MIC和MBC与万古霉素和青霉素的相当。同时，菌丝霉素对寄生虫Neurospora crassa也有一定的抑菌作用，但对人和兔的红细胞没有溶血性，对人的支气管上皮细胞和肺成纤维细胞没有毒性，也不会诱导白介素IL-8在A549细胞中的转录和翻译。
菌丝霉素作为一种颇具吸引力的新型抗菌药物，目前正吸引了众多研究者进行全方位的研究，包括临床应用(药代动力学、药效动力学、动物模型等)、基因分子改造、基因工程表达、分离纯化、替抗应用等。可靠的菌丝霉素定量检测方法是开展这些工作的基础，目前，菌丝霉素的定量检测方法主要是HPLC法(高效液相色谱法)，但是该方法灵敏度不高、特异性不强、干扰因素太多，适合于高浓度、高纯度菌丝霉素样品的定量检测，比如发酵液中菌丝霉素含量检测。但是药代/药效动力学实验、动物模型实验、环境中残留检测等实验要求的是菌丝霉素的微量检测，显然，HPLC法是无法满足需要的。
可见，现有技术还有待改进和提高。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足之处，本发明的目的在于提供一种菌丝霉素单克隆抗体及检测试剂盒，旨在解决现有技术的检测方法无法满足菌丝霉素样品的微量检测的问题。
为了达到上述目的，本发明采取了以下技术方案：
一种菌丝霉素单克隆抗体，通过菌丝霉素单克隆抗体杂交瘤5D11分泌，所述杂交瘤5D11保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日为2018年5月30日，保藏编号为CGMCC No.15790。
所述菌丝霉素单克隆抗体杂交瘤5D11的制备方法，包括：通过中国发明申请号201710939331.5中所述的菌株发酵、HPLC分离纯化、透析、冻干，获得菌丝霉素抗原；选4只SPF级BALB/c小鼠，菌丝霉素抗原与弗氏完全佐剂混合乳化，免疫1次，菌丝霉素抗原与弗氏不完全佐剂混合乳化，免疫3次；选血清效价最佳的免疫小鼠脾细胞与对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞SP2/0用50％PEG4000融合，再用RPMI1640培养基终止反应，离心弃去上清，然后用正常BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞的HAT培养基重悬融合细胞，间接ELISA法筛选，多次有限稀释，得到稳定分泌菌丝霉素单克隆抗体杂交瘤5D11。
一种菌丝霉素检测试剂盒，由所述的菌丝霉素单克隆抗体杂交瘤分泌的菌丝霉素抗体制备。
所述菌丝霉素检测试剂盒中，所述试剂盒通过间接竞争ELISA法检测菌丝霉素的含量，灵敏度高。
所述菌丝霉素检测试剂盒中，所述试剂盒包括：菌丝霉素抗原包被的96孔板，菌丝霉素单克隆抗体，菌丝霉素标准品，辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG，样品稀释液，样品洗涤液，TMB显色液和终止液。
所述菌丝霉素检测试剂盒中，所述样品稀释液为PBST中添加5％脱脂牛奶。
所述菌丝霉素检测试剂盒中，所述样品洗涤液为PBS中添加0.5％Tween-20。
所述菌丝霉素检测试剂盒中，所述TMB显色液包括TMB显色液A和TMB显色液B；所述显色液A包括TMB200mg、无水乙醇1000mL；所述显色液B包括醋酸钠13.6g、柠檬酸1.6g、30％双氧水0.3mL、去离子水500mL。
所述菌丝霉素检测试剂盒中，所述终止液为2M的H2SO4。
有益效果：
本发明提供了一种菌丝霉素单克隆抗体及检测试剂盒，所述菌丝霉素单克隆抗体特异性强、效价高；所述试剂盒采用免疫学原理，通过抗原-抗体的特异性识别，可对各种样品进行菌丝霉素的微量检测，并且具有操作简便、灵敏度高、重复性好等优点，应用所述菌丝霉素单克隆抗体制备的菌丝霉素检测试剂盒，检出限达到0.125μg/mL，灵敏度远超过HPLC法的50μg/mL。
附图说明
图1为本发明提供的所述5D11单克隆抗体纯化样品的蛋白电泳图。
图2为实施例2中菌丝霉素检测试剂盒应用时建立的标准曲线图。
具体实施方式
本发明提供一种菌丝霉素单克隆抗体及检测试剂盒，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下参照附图并举实施例对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明提供一种菌丝霉素单克隆抗体，通过菌丝霉素单克隆抗体杂交瘤5D11分泌，所述杂交瘤5D11分类命名杂交瘤细胞株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏日为2018年5月30日，保藏编号为CGMCC No.15790。
下述实验中未特别注明的具体实验操作均参考《细胞和分子免疫学实验技术》的所述的方法进行。
下述实施例中所用到的试剂为：
包被液：Na2CO3 1.59g、NaHCO3 2.93g溶于1L去离子水中，pH9.6。
PBS缓冲液(phosphate buffer saline，磷酸缓冲盐溶液)：NaCl 2.0g、KCl 0.2g、KH2PO4 0.2g、Na2HPO4 2.83g、溶于1L去离子水中，pH7.4。
封闭液PBSM：PBS中添加5％脱脂牛奶。
洗涤液PBST：PBS中添加0.5％Tween-20。
稀释液PBSTM：PBST中添加5％脱脂牛奶。
TMB显色液A：200mg TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)加入到1000mL无水乙醇中，充分溶解。
TMB显色液B：醋酸钠13.6g，柠檬酸1.6g，30％双氧水0.3mL，溶于500mL去离子水中。
终止液：2M H2SO4。
实施例1菌丝霉素单克隆抗体的制备
1.菌丝霉素抗原的制备
菌丝霉素抗原由本实验室构建的工程菌(中国发明专利申请号201710939331.5)获得，具体培养方法以及菌丝霉素抗原的发酵上清液参考该专利；将获得的菌丝霉素抗原的发酵上清液通过高效液相色谱仪分离出菌丝霉素，收集菌丝霉素纯化液体，利用1000Da透析袋低温透析24h，期间多次更换透析液，达到脱盐的目的；收集透析袋内液体，冻干，得到菌丝霉素纯品(菌丝霉素抗原)；同时分别收集几个主要的杂蛋白液体，按相同的处理方法获得冻干样品，备用。
2.动物免疫
选择4只4～8周龄的SPF级BALB/c小鼠，将菌丝霉素抗原与弗氏完全佐剂充分混合乳化，采用皮下注射的免疫方式，免疫剂量为50μg/只，免疫1次；然后再将菌丝霉素与弗氏不完全佐剂乳化，采用皮下多点注射免疫，免疫剂量为50μg/只，免疫3次后，取小鼠尾部静脉血，10000rpm离心5min,收集血清，利用间接ELASA法梯度稀释检测小鼠血清的抗体效价。
效价检测过程为：
抗原包被：用包被液稀释菌丝霉素纯品到2ug/mL，按照100μL/孔加入到聚苯乙烯96孔反应板中，4℃放置过夜；
洗涤：次日弃掉孔内的液体，洗涤液PBST清洗3次；
封闭：用5％的脱脂奶粉封闭，加150μL/孔，室温放置0.5h；
洗涤：用洗涤液PBST清洗3次；
加待测样品(一抗)：小鼠血清用样本稀释液分别按1∶1000、1∶2000、1∶4000、1∶8000、1∶16000、1∶32000、1∶64000、1∶128000的梯度进行倍比稀释，空白血清做阴性对照，每孔加入100μL上述血清，温育1h；
洗涤：用洗涤液PBST洗3次；
加酶标抗抗体：加入HRP标记羊抗兔IgG(1∶10000稀释)，100μL/孔，37℃孵育40min；
洗涤：用洗涤液PBST清洗5次，蒸馏水洗2次；
显色：加入TMB底物显色溶液100μL/孔，室温暗处放置30min；
终止反应、比色：加50μL/孔终止液，颜色变黄后用酶标仪测定450nm处的吸光值。
检测结果如表1所示，由表中可以看出，3号小鼠血清的抗体效价最佳，作为细胞融合的脾脏来源。
表1各稀释比例下免疫小鼠的血清效价
稀释度 鼠1 鼠2 鼠3 鼠4 空白血
1∶1000 3.0413 2.8118 3.1046 2.8673 0.0955
1∶2000 3.0392 3.0259 3.0351 2.9513 0.0460
1∶4000 3.0524 2.8148 3.1439 2.8978 0.0287
1∶8000 2.9469 3.0409 3.2742 2.9866 0.0208
1∶16000 2.7600 2.1654 2.9448 3.1960 0.0360
1∶32000 2.6007 1.2810 2.7910 2.4006 0.0147
1∶64000 1.6647 0.4182 2.2442 1.4101 0.0118
1∶128000 1.7874 0.0939 1.8122 0.6555 0.0079
3.细胞融合及筛选
免疫小鼠脾脏细胞制备：细胞融合前3天，对小鼠进行强化免疫，菌丝霉素用PBS溶解，注射小鼠腹腔，免疫剂量为50μg/只。免疫小鼠拉颈处死，取出小鼠脾脏，分离脾脏细胞，RPMI1640培养基重悬，1500rpm离心5min，弃上清，脾脏细胞待用。
细胞融合：取对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞SP2/0与免疫小鼠的脾脏细胞混合，两者细胞数比例为1：5～1：10。取37℃温育的1mL 50％PEG4000，逐滴加入混合的细胞中，90s内滴加完成，加入过程中要轻轻混匀。滴加40mL 37℃温育的RPMI1640培养基终止反应，轻轻混匀，800rpm离心5min，弃去上清。用含饲养层细胞(正常BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞)的HAT培养基重悬融合细胞，分装于96孔板，37℃、5％CO2孵箱培养。
单克隆抗体筛选：96孔板中出现杂交瘤细胞群落后，利用间接ELISA法检测培养上清的效价。选择效价高的细胞株采用有限稀释法进行亚克隆，检测培养上清的效价，选择效价高的细胞株进行第二次亚克隆，直至ELISA法检测96孔板的效价结果全部是阳性为止。对效价较高的7株细胞株进行抗体亚型检测和抗体效价检测。
使用小鼠单克隆抗体亚型鉴定试剂盒鉴定上述7株细胞株的抗体亚型，结果如表2所示，各细胞株的效价检测结果如表3所示。
表2 7株细胞株的抗体亚型
细胞株 1F8 2D3 3E1 5A8 5D11 5F1 1D11
亚型 IgG1 IgG1 IgG1 IgG1 IgG1 IgG1 IgG1
表3 7株细胞株的效价
细胞株 菌丝霉素 杂蛋白1 杂蛋白2 负对照
1F8 2.8719 3.0266 3.0589 0.0352
2D3 2.7950 3.0790 2.8505 0.0029
3E1 2.7606 2.9367 3.2957 0.0203
5A8 3.0343 2.7825 2.8187 0.0233
5D11 2.2692 0.0840 0.1233 0.0090
5F1 2.6243 2.7012 2.7454 0.0481
1D11 2.0922 2.3243 2.2081 0.0607
由表2和表3可知，7株细胞株的抗体亚型均为IgG1；其单克隆抗体均能够识别菌丝霉素；但是，除了5D11细胞株外，其余6株细胞株还会识别发酵液中其他两种主要的杂蛋白，特异性不强，因此，选择5D11细胞株作为菌丝霉素的特异性单克隆抗体来源。
4.单克隆抗体纯化向8周龄的BALB/c小鼠腹腔注射0.5mL弗氏不完全佐剂，一周后向小鼠腹腔注射1mL5D11杂交瘤细胞，数量约为5×106/只。小鼠腹部明显胀大后，用注射器抽取小鼠腹水，4℃4000rpm离心10min，收集上清，即为菌丝霉素的单克隆抗体腹水。
首先用10倍柱床体积的去离子水以1mL/min的流速冲洗Protein A亲和层析柱，再用10倍柱床体积的1％醋酸钠平衡液以1mL/min的流速冲洗Protein A亲和层析柱。腹水上清用0.22μm滤膜过滤，每10mL腹水上清添加40mL 1％醋酸钠平衡液，混匀，以0.5mL/min流速上柱。用1％醋酸钠平衡液以1mL/min的流速冲洗层析柱，直至无蛋白流出。然后用3.5％冰乙酸洗脱蛋白，收集洗脱液，直至无蛋白流出。用饱和碳酸钠调节洗脱液pH至6～7，用10kDa超滤管低温超滤浓缩至10mL左右，浓缩液移至10kDa透析袋，PBS低温透析，期间换液一次；纯化后的单克隆抗体置于-20℃保存或冻干。
请参阅图1，通过Bradford法检测蛋白浓度，5D11单克隆抗体纯化液的蛋白浓度为3mg/mL。通过SDS-PAGE蛋白电泳检测，5D11单克隆抗体的纯度大于90％。通过间接ELISA法测定抗体效价，效价测定的包被抗原是2μg/mL菌丝霉素，菌丝霉素单克隆抗体浓度调整为1μg/mL，效价测定结果如表4所示，5D11单克隆抗体具有较强的抗体亲和力。
表4 5D11单克隆抗体各稀释度下的效价
Figure GDA0003140781160000061
实施例2菌丝霉素检测试剂盒的构建
采用间接竞争ELISA法建立菌丝霉素的检测试剂盒。所述试剂盒包括：经菌丝霉素抗原包被的96孔板、菌丝霉素单克隆抗体(一抗)、菌丝霉素标准品、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG(HRP酶标二抗)、样品稀释液、样品洗涤液、TMB显色液、终止液。
1.标准曲线的建立抗原包被：用包被液将菌丝霉素稀释成2μg/mL，100μL/孔加入96孔板中，4℃放置过夜(约12h)。次日弃掉孔内的液体，PBST洗涤3次，每次300μL/孔。
封闭：加300μL/孔PBSM，37℃封闭2h，PBST洗涤3次，每次300μL/孔。
标准溶液配制：用PBSTM将菌丝霉素分别稀释成以下浓度：0μg/mL、0.125μg/mL、0.25μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、2.5μg/mL，每孔50μL，每个浓度3个重复，同时设置空白对照。
加一抗：PBSTM稀释菌丝霉素单克隆抗体至1μg/mL，50μL/孔，轻轻振荡混匀，盖上盖板膜，37℃避光反应1h，PBST洗涤3次，每次300μL/孔。
加二抗：加入HRP标记羊抗鼠IgG(1∶10000稀释)，100μL/孔，37℃避光温育30min，PBST洗涤3次，每次300μL/孔。
显色：TMB显色液A和TMB显色液B，各50μl混匀后再加入96孔板，避光反应10min，加入100μL终止液。
比色：反应结束后，颜色变黄，用酶标仪测定450nm处各孔的吸光值。
结果判定：
检测吸光值与空白对照吸光值的比值大于2为有效数据。百分吸光率等于标准品或样品的吸光值的平均值除以0μg/mL标准品的吸光值的平均值，再乘以100％，即：
百分吸光率(％)＝B/B0×100％；
其中，B为标准品或样品的平均吸光值；
B0为0μg/ml标准品的平均吸光值。
以菌丝霉素标准品浓度为横坐标，标准品百分吸光率为纵坐标，绘制标准曲线，当相关系数R2大于0.99时标准曲线才有效。将样品的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样品所对应的浓度，乘以其对应的稀释系数即为样品中菌丝霉素的实际浓度。
菌丝霉素的标准曲线如图2所示，通过对数据进行拟合得到回归方程Y＝-30.277X+98.392，相关系数R2＝0.9987，说明在0.125-2.5μg/mL浓度范围内蛋白浓度和吸光值呈线性关系，灵敏度好。
分别利用菌丝霉素工程菌、野生菌株进行摇瓶培养，培养方法参考中国发明专利申请号201710939331.5中所述的方法，离心收集发酵上清液，菌丝霉素工程菌发酵上清液用PBSTM稀释一定倍数，按照上述检测步骤，将标准溶液替换成菌丝霉素发酵上清液，检测菌丝霉素含量，结果显示，野生菌株的发酵上清液未检测出菌丝霉素，菌丝霉素工程菌发酵上清液中菌丝霉素含量为2.12μg/mL(未算稀释倍数)，说明该菌丝霉素检测试剂盒特异性识别菌丝霉素。
用小鼠血清配制0.5μg/mL、1.0μg/mL、1.5μg/mL、2.0μg/mL菌丝霉素样品，按照上述检测步骤，将标准溶液替换成菌丝霉素样品检测菌丝霉素含量，检测结果与理论值一致。
取健康小鼠，按40mg/kg用量静脉注射菌丝霉素，24h后抽取小鼠血清，可根据情况使用PBSTM稀释一定倍数，按照上述检测步骤，将标准溶液替换成小鼠血清样品，即可检测血清中菌丝霉素的含量。96孔板包被抗原、封闭后，分多批次检测小鼠血清菌丝霉素含量，每批次8个重复，检测结果为0.56μg/mL，批次内变异系数为3.4％，批次间变异系数为4.1％。
回收率检测：将0.5μg/L菌丝霉素添加至检测样品中，检测菌丝霉素含量，计算回收率达到99.1％(n＝8)。
稳定性评价：抗原包被、封闭后的96孔板，置于4℃低温冰箱保存，每隔一个月取一块96孔板检测0.5μg/mL菌丝霉素标准品含量，结果显示ELISA平板保存一年内的检测误差小于5％。
以上数据均表明所述菌丝霉素检测试剂盒具有灵敏度高、特异性强、准确率高、稳定性好的特点，适用于各种样品中菌丝霉素的微量检测。
可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。

Claims (8)

1. 一种菌丝霉素单克隆抗体，其特征在于，所述抗体通过菌丝霉素单克隆抗体杂交瘤5D11分泌，所述杂交瘤5D11保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日为2018年5月30日，保藏编号为CGMCC No.15790。
2.一种菌丝霉素检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒由权利要求1中所述的菌丝霉素单克隆抗体制备。
3.根据权利要求2所述的菌丝霉素检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒通过间接竞争ELISA法检测菌丝霉素的含量。
4.根据权利要求2所述的菌丝霉素检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：菌丝霉素抗原包被的96孔板，权利要求1所述的菌丝霉素单克隆抗体，菌丝霉素标准品，辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG，样品稀释液，样品洗涤液，TMB显色液和终止液。
5.根据权利要求4所述的菌丝霉素检测试剂盒，其特征在于，所述样品稀释液为PBST中添加5%脱脂牛奶。
6.根据权利要求4所述的菌丝霉素检测试剂盒，其特征在于，所述样品洗涤液为PBS中添加0.5% Tween-20。
7.根据权利要求4所述的菌丝霉素检测试剂盒，其特征在于，所述TMB显色液包括TMB显色液A和TMB显色液B；所述显色液A包括TMB200mg、无水乙醇1000mL；所述显色液B包括醋酸钠13.6g、柠檬酸1.6g、30%双氧水0.3mL、去离子水500mL。
8.根据权利要求4所述的菌丝霉素检测试剂盒，其特征在于，所述终止液为2M的H2SO4。
CN201810632569.8A 2018-06-20 2018-06-20 一种菌丝霉素单克隆抗体及检测试剂盒 Active CN108948191B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810632569.8A CN108948191B (zh) 2018-06-20 2018-06-20 一种菌丝霉素单克隆抗体及检测试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810632569.8A CN108948191B (zh) 2018-06-20 2018-06-20 一种菌丝霉素单克隆抗体及检测试剂盒

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108948191A CN108948191A (zh) 2018-12-07
CN108948191B true CN108948191B (zh) 2021-10-22

Family

ID=64491175

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810632569.8A Active CN108948191B (zh) 2018-06-20 2018-06-20 一种菌丝霉素单克隆抗体及检测试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108948191B (zh)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102191256A (zh) * 2010-03-01 2011-09-21 中国农业科学院饲料研究所 一种菌丝霉素基因及其原核融合基因工程菌
WO2012037774A1 (zh) * 2010-09-26 2012-03-29 中国农业科学院饲料研究所 多拷贝高效表达重组菌丝霉素的酵母菌
CN104109206A (zh) * 2014-07-03 2014-10-22 北京市动物疫病预防控制中心 鸭坦布苏病毒单克隆抗体、抗原检测试剂盒及应用
CN104711228A (zh) * 2013-12-12 2015-06-17 许丽 抗多环芳烃单克隆抗体与产生该抗体的杂交瘤细胞pyr#6-e4及其应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102191256A (zh) * 2010-03-01 2011-09-21 中国农业科学院饲料研究所 一种菌丝霉素基因及其原核融合基因工程菌
WO2012037774A1 (zh) * 2010-09-26 2012-03-29 中国农业科学院饲料研究所 多拷贝高效表达重组菌丝霉素的酵母菌
CN104711228A (zh) * 2013-12-12 2015-06-17 许丽 抗多环芳烃单克隆抗体与产生该抗体的杂交瘤细胞pyr#6-e4及其应用
CN104109206A (zh) * 2014-07-03 2014-10-22 北京市动物疫病预防控制中心 鸭坦布苏病毒单克隆抗体、抗原检测试剂盒及应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN108948191A (zh) 2018-12-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN113717949B (zh) 一株分泌酮康唑单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用
CN105200013B (zh) 一株抗万古霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用
CN105198990B (zh) 用于Bt Cry1类毒素广谱检测的抗体及其制备方法与应用
CN111487417B (zh) Mcr-1耐药蛋白双抗夹心elisa检测试剂盒及检测方法
CN114058594B (zh) 一种分泌维生素a单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用
CN110713986A (zh) 一株维生素b1单克隆抗体杂交瘤细胞株cbdd及其应用
CN107389920B (zh) 一种检测禽白细胞介素17a含量的方法及其专用试剂盒
CN108948191B (zh) 一种菌丝霉素单克隆抗体及检测试剂盒
CN110724192B (zh) 一株分泌蛇形菌素单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用
CN111334479A (zh) 一株氯羟吡啶单克隆抗体杂交瘤细胞株tyl及其应用
CN109374886B (zh) 牛传染性鼻气管炎病毒抗体检测试剂盒及其应用
CN106929479B (zh) 一株维生素b2单克隆抗体杂交瘤细胞株gz-4及其应用
WO2018103630A1 (zh) 一株分泌抗巴龙霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株c1及其应用
CN106544324B (zh) 人肺炎支原体单克隆抗体及其应用
CN113583119B (zh) 抗金黄色葡萄球菌的纳米抗体Nb56、应用及试剂盒
US10696748B2 (en) Hybridoma cell line of secreting clarithromycin monoclonal antibodies and preparation method thereof
CN111748528B (zh) 一株分泌抗氟虫腈及其代谢物单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用
CN116338193A (zh) 一种基于抗体捕获的非洲马瘟间接elisa抗体检测试剂盒及其应用
CN111454912B (zh) 一株赛拉嗪单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用
CN107056941A (zh) 一种特异性识别山羊IFN‑γ的单克隆抗体制备方法
CN113046325A (zh) 一株维生素k3单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用
CN112029731A (zh) 一株他克莫司单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用
CN110894235A (zh) 一种抗隐球菌夹膜多糖的兔源单克隆抗体及其应用
CN112011516A (zh) 一株西罗莫司单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用
CN106967688A (zh) 一株分泌抗洛美沙星单克隆抗体杂交瘤细胞wxx‑1及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant