CN105175540A - 一种抗兔出血症病毒vp60蛋白的单克隆抗体及其识别的b细胞表位和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种抗兔出血症病毒VP60蛋白的单克隆抗体及其识别的B细胞表位和应用，涉及生物技术领域。分泌抗兔出血症病毒VP60蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株5H3，保藏号为CCTCC？NO：C2015150。本发明所述单克隆抗体所识别的B细胞表位，氨基酸序列如SEQ？ID？NO:1所示。本发明还要求保护所述单克隆抗体、B细胞表位在制备用于诊断、预防或治疗兔出血症病毒的药物中的应用。本发明杂交瘤细胞株，能够稳定、高效分泌所述单克隆抗体。本发明单克隆抗体具有阻断RHDV？VLPs与受体HBGAs结合的能力，所述单克隆抗体识别的B细胞表位能够与受体HBGAs结合，为病毒与受体HBGAs的一个结合位点。

Description

一种抗兔出血症病毒VP60蛋白的单克隆抗体及其识别的B细胞表位和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种抗兔出血症病毒VP60蛋白的单克隆抗体及其识别的B细胞表位和应用。

背景技术

兔出血症病毒(RabbitHemorrhagicDiseaseVirus，RHDV)是兔病毒性出血症(RabbitHemorrhagicDisease，RHD)又称兔瘟的病原，是一种严重威胁家兔产业发展的高传播性、高致死性病毒，病程一般为48-72小时，死亡率在90％以上。该病毒于1984年首先在中国报道，随后迅速在全球大部分地区流行，造成数以亿计的家兔和野兔死亡，给全球的兔产业和生态造成巨大损失和破坏。兔出血症病毒(rabbithemorrhagicdiseasevirus，RHDV)是无囊膜的单股正链RNA病毒，其衣壳蛋白VP60由579个氨基酸组成，是病毒衣壳的最基本的单位，衣壳蛋白VP60与病毒的致病性和免疫原性有着密切的关系，是病毒的免疫保护性抗原，在诱导抗病毒感染的免疫反应中起重要作用。VP60蛋白主要分为三个区域，即NTA(第1-65位氨基酸)、S区(第66-229位氨基酸)和P区(第238-579位氨基酸)，另外，在S和P区连接处存在一个短的铰链区(第230-237位氨基酸)。RHDVVP60的P区主要由P1亚区(第238-286位氨基酸、第450-466位氨基酸、第484-579位氨基酸)和P2亚区(第287-449位氨基酸、第467-483位氨基酸)组成。其中，P2亚区是宿主抗体识别及靶向的主要区域，影响病毒的抗原性及病毒粒子与细胞受体的吸附作用，该区域序列具有较高的变异性。

在昆虫细胞中表达衣壳蛋白时，它能够自发地形成形态学上和抗原学上与天然病毒无差异的病毒样颗粒(virus-likeparticles，VLPs)，可以与病毒敏感细胞上的受体结合，模拟病毒感染过程，诱导机体产生中和抗体及有效的细胞免疫应答。因此，RHDVVLPs可用作兔出血症病毒免疫学、结构功能学和致病机制的研究模型。

组织血型抗原(Histo-BloodGroupAntigens，HBGAs)是一种由遗传基因决定的多糖复合物，存在于粘膜分泌物、上皮细胞和红细胞表面，是病原敏感细胞的吸附因子。RHDV及其VLPs能够凝集红细胞，吸附于成年兔上呼吸道及消化道上皮细胞上，以上现象均依赖于HBGAs的存在。HBGAs作为RHDV的一种吸附受体，能够促进感染的发生。RHDV感染宿主后首先与呼吸道和消化道上皮细胞上的HBGAs受体结合，启动病毒复制周期中的入胞环节。研究发现在幼兔的上呼吸道及消化道中由于缺乏HBGAs抗原，在检测这些组织中的病毒时，发现仅有极少量的病毒粒子吸附。在另一项病毒感染实验研究中发现，缺乏正确的HBGAs受体的成年兔能够抵抗低剂量RHDV的致死性感染。HBGAs作为RHDV目前发现并报道的唯一受体，在病毒感染中起到至关重要的作用。

现有技术中，研究人员制备了多种可以应用于检测的抗兔出血症病毒VP60蛋白的单克隆抗体，但是至今还未发现具有阻断RHDVVLPs与受体HBGAs结合能力的单抗，从而限制了用于诊断、预防或者治疗兔出血症的药物开发。

发明内容

本发明的一个目的在于提供分泌抗兔出血症病毒VP60蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，能够稳定分泌抗兔出血症病毒VP60蛋白的单克隆抗体。

本发明的另一个目的在于提供所述杂交瘤细胞株分泌的抗兔出血症病毒VP60蛋白的单克隆抗体，该单克隆抗体具有阻断RHDVVLPs与受体HBGAs结合的能力。

本发明的另一个目的在于提供所述抗兔出血症病毒VP60蛋白的单克隆抗体所识别的B细胞表位。

本发明的再一目的是提供所述抗兔出血症病毒VP60蛋白的单克隆抗体、B细胞表位在制备用于诊断、预防或者治疗兔出血症的药物中的应用。

为解决以上问题，本发明采用的技术方案为：

一种分泌抗兔出血症病毒VP60蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株5H3，保藏号为CCTCCNO：C2015150。

本发明还要求保护所述杂交瘤细胞株分泌的抗兔出血症病毒VP60蛋白的单克隆抗体及其在制备用于诊断、预防或者治疗兔出血症的药物中的应用。

本发明还要求保护所述抗兔出血症病毒VP60蛋白的单克隆抗体所识别的B细胞表位，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。

本发明还要求所述B细胞表位的基因、含有所述基因的重组载体、表达盒和重组菌。

最后本发明还要求保护所述的B细胞表位在制备用于诊断、预防或者治疗兔出血症的药物中的应用。

本发明分泌抗兔出血症病毒VP60蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，能够稳定、高效分泌抗兔出血症病毒VP60蛋白的单克隆抗体。本发明抗兔出血症病毒VP60蛋白的单克隆抗体具有阻断RHDVVLPs与受体HBGAs结合的能力。本发明所述抗兔出血症病毒VP60蛋白的单克隆抗体识别的B细胞表位能够与受体HBGAs结合，为病毒与受体HBGAs的一个结合位点。本发明所述抗兔出血症病毒VP60蛋白的单克隆抗体、B细胞表位可以应用于制备用于诊断、预防或者治疗兔出血症的药物。

附图说明

图1电镜检测重组RHDVVLPs的表达；A.重组杆状病毒rAcV-Bac-VP60接种Sf9细胞的样品；B.野生型杆状病毒rAc-WT接种Sf9细胞的样品。

图2单抗5H3的Westernblot鉴定；1：天然RHDV；2：杆状病毒rAcV-Bac-VP60表达的重组VP60蛋白；3：野生杆状病毒rAc-WT表达的蛋白。

图3间接免疫荧光法检测单抗5H3，其中A是感染rAcV-Bac-VP60的细胞，B是感染野生型杆状病毒rAc-WT的细胞；

图4重组短肽片段C1-C13的SDS-PAGE分析结果；其中1～13依次为短肽片段C1～C13，M：蛋白分子量Marker。

图5是短肽片段C1-C13与单抗5H3反应的免疫印迹结果；其中1～13依次为短肽片段C1～C13，M：蛋白分子量Marker。

图6是VP60蛋白及短肽片段C1、C7和C9与合成多糖HBGAs结合试验结果。

图7是VP60蛋白及短肽片段C1、C7和C9与合成多糖HBGAs结合的单抗5H3阻断试验结果，其中A显示了VP60蛋白及短肽片段的各组样品反应后的OD_405nm值，B显示了单抗5H3对VP60蛋白或短肽片段与合成多糖HBGAs结合的阻断率。

杂交瘤细胞株5H3保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)(地址：中国武汉大学)，其保藏号为CCTCCNO：C2015150，保藏日期为：2015年9月15日，分类命名为杂交瘤细胞株5H3。

具体实施方式

下面结合具体的实验对本发明作进一步的详细说明。

实施例1制备抗兔出血症病毒VP60蛋白的单克隆抗体

1.免疫原的制备

以兔出血症病毒皖阜株RNA为模板采用反转录PCR扩增VP60蛋白基因，通过克隆、转化将VP60蛋白基因插入穿梭载体Bacmid，然后转染Sf9细胞，得到重组杆状病毒rAcV-Bac-VP60(具体制备方法见：王芳,胡波,任雪枫等.兔出血症病毒衣壳蛋白在昆虫细胞中的表达及对家兔的免疫保护效果[J].畜牧兽医学报.2008；39(10):1382-1387.)。将rAcV-Bac-VP60接种Sf9昆虫细胞，出现明显的细胞病变，收获细胞培养物，反复冻融三次后超声裂解，3000rpm离心分离细胞碎片与上清，取上清用超滤管进行十倍浓缩后得到RHDVVLPs。野生型杆状病毒rAc-WT是由空Bacmid质粒转染Sf9细胞后获得的，将rAc-WT接种的Sf9细胞的培养物作为对照，进行同样处理。

采用H-7650型透射电镜分别观察重组杆状病毒rAcV-Bac-VP60和野生型杆状病毒rAc-WT侵染细胞的培养物，结果如图1，可见重组杆状病毒rAcV-Bac-VP60的细胞培养物中存在清晰的VLPs，大小与天然RHDV病毒粒子相似；而野生型杆状病毒rAc-WT的细胞培养物中无VLPs(图1)。利用BCA蛋白分析试剂盒(Pierce，USA)对RHDVVLPs进行蛋白定量。

2.小鼠免疫

将鉴定并定量处理后的RHDVVLPs作为免疫抗原，免疫5只7～8周龄的BALB/c小鼠，免疫途径、抗原剂量和佐剂等免疫程序见表1。

表1RHDVVLPs的小鼠免疫程序

3.细胞融合和杂交瘤细胞株的筛选

融合前一天取成熟健康的普通清洁级(ICR)小鼠，眼球放血处死，浸泡于75％酒精内5min，置超净工作台无菌平皿内。将其固定在解剖板上，无菌条件下剪开腹部皮肤，充分暴露腹部；用无菌注射器吸取适量含10％胎牛血清(购自美国GIBCO公司)的RPMI1640营养液(购自美国GIBCO公司)注入小鼠腹腔，轻轻震动小鼠腹壁，最后将腹腔内的培养液吸出，悬浮细胞，血球计数板计数；用HAT培养基(购自美国GIBCO公司)重悬调节细胞数至5×10⁵个/mL，混匀后加入96孔细胞培养板，100μL/孔，置37℃、5％CO₂、饱和湿度培养箱中培养，作为饲养细胞。

取免疫后小鼠的脾细胞和SP2/0细胞进行细胞融合，融合后细胞悬浮液加入预先铺有饲养细胞的96孔板中，将细胞板放置37℃、5％CO₂、饱和湿度温箱中培养，融合后4d用HAT培养液换液，待融合后的细胞克隆生长到覆盖孔底部1/4～1/3时，利用RHDVVLPs作为包被抗原，对培养上清进行间接ELISA检测，同时设立野生型杆状病毒rAc-WT感染Sf9细胞的裂解物作为对照包被ELISA板，作为排除假阳性的对照试验。经ELISA方法筛选出来的阳性细胞按有限稀释法进行亚克隆，三次亚克隆后，培养板上细胞生长孔的培养上清全部为阳性，最终筛选到了杂交瘤细胞株5H3，获得能够稳定分泌抗兔出血症病毒VP60蛋白的单克隆抗体。该杂交瘤细胞株分泌的抗兔出血症病毒VP60蛋白的单克隆抗体命名为5H3，缩写为单抗5H3。

4.单抗5H3的制备

单抗5H3腹水的制备：取10周龄BALB/c小鼠，腹腔注射灭菌石蜡油0.5mL/只。10～14d后，收集杂交瘤细胞株5H3，1000r/min离心10min，弃上清，用纯的RPMI1640培养液重新悬浮调整浓度，每只小鼠腹腔接种3～5×10⁶个杂交瘤细胞，注射细胞悬液体积为0.5mL。7～10d后，杂交瘤细胞以腹水瘤形式在小鼠腔内大量繁殖，小鼠腹部胀大，触之有波动感，此时即可以收集腹水。取SP2/0细胞腹腔注射BALB/c小鼠制备阴性腹水，具体方法与上述相同。

收集腹水时，抓住小鼠颈部及尾巴，用12号粗针头自腹股沟插入腹腔，让腹水自然流出而收集。将腹水收集至离心管，5000r/min离心10min，收集上清，56℃水浴30min灭活补体和蛋白水解酶，再置室温待其冷却，利用HiTrapProteinGHP纯化柱(购自美国GE公司)进行纯化，最终获得单抗5H3。将单抗5H3从1:100开始倍比稀释，用ELISA检测抗体效价，用SP2/0细胞制备的腹水作为阴性对照，-20℃保存。

利用间接ELISA检测单抗5H3效价的具体方法如下：将rAcV-Bac-VP60感染Sf9细胞，待细胞出现明显病变时收获重组VP60蛋白，用抗原包被液(0.17gNa₂CO₃、0.28gNaHCO₃溶于100mLddH₂O)稀释VP60蛋白至1μg/ml，然后包被ELISA板，37℃孵育2h，PBST(pH7.2)洗涤三次，每次5min，随后加入含5％脱脂乳的PBS溶液，每孔200μl，37℃孵育2h。同样洗涤处理后，分别加入1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:6400、1:12800、1:25600、1:51200稀释的单抗5H3，每个稀释度作三个重复；阴性腹水按照以上方法同样处理作为对照，37℃孵育1h。洗涤，加入1:5000稀释的辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(购自武汉博士德生物工程公司)，100μL/孔，37℃孵育1h，PBST(pH7.2)缓冲液洗涤5次，每次5min；加TMB显色液(购自武汉博士德生物工程公司)，100μl/孔，避光8-15min，显色。每孔加入50μL2MH₂SO₄终止反应，酶标仪测定OD_450nm值，以P/N≥2.1判定为阳性。检测结果发现单抗5H3稀释至1:25600时，P/N≥2.1仍为阳性，检测结果发现抗体稀释至1:51200时，P/N<2.1为阴性，因此单抗5H3效价为1:25600。

5.单克隆抗体特性的鉴定

重组杆状病毒表达的RHDVVLPs和蔗糖密度梯度离心纯化的天然RHDV进行12％聚丙烯酰胺琼脂糖凝胶(SDS-PAGE)电泳后，转印至硝酸纤维素膜上。以野生型杆状病毒rAc-WT感染的细胞培养物作为阴性对照。用含5％脱脂乳的PBS溶液封闭4℃过夜，以单抗5H3作为一抗，HRP(辣根过氧化物酶)标记的羊抗鼠IgG(购自武汉博士德生物工程公司)为二抗，加底物显色液化学发光试剂ECL(购自美国PIERCE公司)显色。Westernblot分析显示，单抗5H3能够与天然RHDV和重组杆状病毒表达的RHDVVLPs发生特异性反应，在约60kDa处有目的条带出现，与预期大小一致(图2)。单抗5H3与野生型杆状病毒rAc-WT感染的细胞样品无特异性条带。

rAcV-Bac-VP60感染培养于96孔的单层Sf9细胞，培养至发生病变时，小心吸弃上清，每孔加入100μL-20℃预冷的乙醇，室温固定15min，PBS洗3次，室温吹干，以1:200倍稀释的单抗5H3为一抗，37℃孵育45min，以1:100稀释的FITC标记的羊抗小鼠IgG为二抗(购自武汉博士德生物工程公司)，37℃孵育30min，PBS洗涤5次，每次10min，倒置荧光显微镜下观察荧光。以感染野生型杆状病毒rAc-WT的细胞作为对照。结果发现，感染rAcV-Bac-VP60的细胞均具有较强的特异性荧光(图3)；而感染野生型杆状病毒rAc-WT的细胞无特异性荧光(图3)，以上结果说明单抗5H3具有良好的特异性和反应原性。

用SouthernBiotech公司的免疫球蛋白标准亚类鉴定试剂盒鉴定单抗5H3的抗体亚类，具体按说明书的操作步骤进行。单抗5H3的亚型鉴定结果：单抗5H3的重链为IgG1型、轻链为Kappa型。

实施例2兔出血症病毒VP60蛋白B细胞表位的鉴定

1.设计兔出血症病毒VP60蛋白截短片段筛选单抗5H3所识别的抗原表位

根据RHDVWF/China/2007VP60的基因序列(Genbank:FJ794180)，设计一系列兔出血症病毒VP60蛋白截短片段P1-P9，具体如表2。利用DNASTAR软件对截短片段设计特异性引物，并在其上、下游引物中分别引入BamHI和XhoI酶切位点，引物由上海英骏生物技术有限公司合成。以兔出血症病毒皖阜株的RNA为模板采用反转录PCR扩增截短片段P1-P9的编码基因，并分别克隆至pET-32a载体中，转化入大肠杆菌，经IPTG诱导表达融合蛋白，进行SDS-PAGE分析，发现所有融合蛋白均获得有效表达，且大小与预期一致。采用Westernblot实验，鉴定能够与单抗5H3发生特异性反应的截短片段。结果如表2所示，经过初步筛选，确定兔出血症病毒VP60蛋白与单抗5H3作用的表位为第320-340位氨基酸。

表2VP60蛋白截短片段及与单抗的反应结果

注：表2中“位置”是指截断片段在VP60蛋白中的位置；“+”表示Westernblot检测结果为阳性，“-”表示Westernblot检测结果为阴性。

进一步设计短肽片段C1-C13(表3)，针对大肠杆菌将各短肽片段的编码基因进行密码子优化，并在其两端分别加上BamHI和XhoⅠ酶切位点，化学合成后克隆至pET-32a载体中，转化入大肠杆菌，经IPTG诱导表达获得重组蛋白。将各重组蛋白进行SDS-PAGE分析，发现所有重组蛋白均获得有效表达，且大小与预期一致，见图4。表3中的短肽片段也可以采用有机合成方法制备。采用Westernblot实验，鉴定能够与单抗5H3发生特异性反应的短肽片段，结果见图5。由Westernblot结果可知单抗5H3与短肽片段C1-C7以及C9、C10具有特异性反应，与C8、C11-C13无反应。因此单抗5H3所识别表位的最小基序为N³²⁶PISQV³³¹(SEQIDNO:1所示)。

表3兔出血症病毒VP60蛋白短肽片段位置、氨基酸序列及与单抗5H3的反应结果

注：表3中“序列位置”是指短肽片段在兔出血症病毒VP60蛋白中的位置；“+”表示Westernblot检测结果为阳性，“-”表示Westernblot检测结果为阴性。

2.VP60蛋白、短肽片段C1、C7和C9与合成多糖HBGAs结合试验

重组杆状病毒rAcV-Bac-VP60接种Sf9昆虫细胞出现明显的细胞病变后，收获细胞培养物，反复冻融三次后超声裂解，3000rpm离心分离细胞碎片与上清，取上清用超滤管进行十倍浓缩得到VP60蛋白。利用BCA蛋白分析试剂盒(购自美国Pierce公司)对VP60蛋白进行定量。

合成多糖HBGAs为生物素标记的H2型合成多糖即H(type-2)-PAA-biotin多糖(购自美国GlycoTech公司)。实验步骤如下：用5μg/mL的H(type-2)-PAA-biotin多糖包被高结合力亲和素板(购自美国Thermo公司)，100μL/孔，22℃作用2h，TBST缓冲液(pH7.2)洗涤5次，每次5min；分别取2μg/mL的VP60蛋白及短肽片段C1、C7和C9，100μL/孔，各样品设置3孔重复，同时设置PBS空白对照组；37℃孵育1.5h，PBST(pH7.2)洗涤5次，每次5min；加入1μg/ml的单克隆抗体5H3，100μL/孔，37℃孵育1h，PBST(pH7.2)洗涤5次，每次5min；加1:5000辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG(购自武汉博士德生物工程公司)，100μL/孔，37℃孵育1h，PBST(pH7.2)缓冲液洗涤5次，每次5min；加TMB显色液(购自武汉博士德生物工程公司)，100μl/孔，避光8-15min，显色。每孔加入50μL2MH₂SO₄终止反应，酶标仪上450nm波长处测定OD_405nm值。

检测结果见图6，从图中可以看出，与PBS组相比，VP60蛋白、短肽片段C1、C7和C9均能够特异性的与合成HBGAs结合。

3.VP60蛋白及短肽片段C1、C7和C9与合成多糖HBGAs结合的单抗5H3阻断试验

实验步骤如下：用5μg/mL的H(type-2)-PAA-biotin多糖包被高结合力亲和素板，100μL/孔，22℃作用2h，TBST(pH7.2)洗涤5次，每次5min；分别取2μg/mL的VP60蛋白及短肽片段C1、C7和C9，设置四组样品，第一组蛋白或短肽片段与1μg/ml的单抗5H3在37℃孵育1.5h；第二组蛋白或短肽片段与阴性腹水37℃孵育1.5h；第三组蛋白或短肽片段与PBS缓冲液37℃孵育1.5h；第四组为PBS缓冲液空白对照组。将上述各组样品分别加入酶标板中，100μL/孔，各样品设置3孔重复，37℃孵育1.5h，PBST缓冲液洗涤5次，每次5min；加入1μg/ml的单克隆抗体5H3，100μL/孔，37℃孵育1h，PBST缓冲液洗涤5次，每次5min；加入1:5000稀释的辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG，100μL/孔，37℃孵育1h，PBST洗涤5次，每次5min；加TMB显色液，100μl/孔，避光8-15min，显色。每孔加入50μL2MH₂SO₄终止反应，酶标仪上405nm波长处测定OD_405nm值。其中PBST缓冲液的pH为7.2。

检测结果见图7，VP60蛋白、短肽片段C1、C7和C9均能够与合成多糖HBGAs结合，与阴性腹水以及PBS孵育C1、C7和C9蛋白组相比，单抗5H3特异性地阻断短肽片段(C1、C7和C9)与合成多糖HBGAs结合(图7A)，阻断率在90％以上(图7B)。与阴性腹水以及PBS孵育VP60蛋白组相比，单抗5H3可部分阻断VP60蛋白与合成多糖HBGAs结合，阻断率高达70％。

SEQUENCELISTING

<110>江苏省农业科学院

<120>一种抗兔出血症病毒VP60蛋白的单克隆抗体及其识别的B细胞表位和应用

<130>20151015

<160>1

<170>PatentInversion3.3

<210>1

<211>6

<212>PRT

<213>兔出血症病毒（RabbitHemorrhagicDiseaseVirus）

<400>1

AsnProIleSerGlnVal

15

Claims (7)

1.一种分泌抗兔出血症病毒VP60蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株5H3，保藏号为CCTCCNO：C2015150。

2.权利要求1所述杂交瘤细胞株分泌的抗兔出血症病毒VP60蛋白的单克隆抗体。

3.权利要求2所述的抗兔出血症病毒VP60蛋白的单克隆抗体在制备用于诊断、预防或者治疗兔出血症的药物中的应用。

4.权利要求2所述抗兔出血症病毒VP60蛋白的单克隆抗体所识别的B细胞表位，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。

5.编码权利要求4所述B细胞表位的基因。

6.含有权利要求5所述基因的重组载体、表达盒和重组菌。

7.权利要求4所述B细胞表位在制备用于诊断、预防或者治疗兔出血症的药物中的应用。