CN115141810A

CN115141810A - 分泌抗鸡滑液囊支原体单克隆抗体的杂交瘤细胞株及应用

Info

Publication number: CN115141810A
Application number: CN202211076000.0A
Authority: CN
Inventors: 王秀梅; 辛九庆
Original assignee: Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2022-09-05
Filing date: 2022-09-05
Publication date: 2022-10-04
Anticipated expiration: 2042-09-05
Also published as: CN115141810B

Abstract

本发明公开了分泌抗鸡滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae,MS)单克隆抗体的杂交瘤细胞株及应用，涉及生物技术领域。本发明的单克隆抗体Mab 2F6由保藏编号为CGMCC No：45241的杂交瘤细胞株2F6分泌产生，能够特异性识别天然抗原并能有效阻断鸡血清中MS抗体与天然抗原的结合。本发明以偶联HRP的单克隆抗体2F6为检测抗体研制了一种MS抗体竞争ELISA检测试剂盒，该试剂盒可以特异性检测鸡血清中的MS抗体，操作简便、用时短、特异性好、灵敏度高、稳定性良好，可用于MS的快速诊断。本发明为MS检测试剂盒开发及流行病学调查、免疫学分析、疫苗的效力检验提供了有力工具。

Description

分泌抗鸡滑液囊支原体单克隆抗体的杂交瘤细胞株及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一株抗鸡滑液囊支原体的单克隆抗体、还涉及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株以及该单克隆抗体在制备鸡滑液囊支原体检测试剂盒及免疫分析中的应用。

背景技术

鸡滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae, MS)是近年来对鸡群危害最严重的致病性禽支原体之一，能感染多个品种的鸡，近年来蛋鸡、白羽肉鸡、黄羽肉鸡、种鸡感染率和发病率均较高，发病率呈父母代向商品代放大，对家禽健康和生产性能产生极大负面影响，被世界动物卫生组织列为重要的呼吸道病原体。MS感染引起鸡急性或慢性传染性滑膜炎或气囊炎、蛋壳尖端异常和减蛋综合征，使鸡群生产性能下降，小鸡和青年鸡因腿病被淘汰约 5~15%，有时超过 75%；生长发育迟缓，鸡增重减少16 ~26%，产蛋量下降 5~20%，孵化率降低5 ~7%，后代死亡率增加 5%以上，甚至激发免疫系统抑制。各年龄鸡群均可感染MS，一旦感染终身携带，可水平传播和经卵垂直传播，使同群和后代成为感染阳性鸡群，导致该病在鸡群长期存在，难以清除，给疫病防控带来巨大困难。MS常诱发、加重其他呼吸道病原感染，导致死亡率和生产损失大幅上升，所以MS被许多国家列为种鸡群需要净化和经济贸易限制的病原体。近年来，MS呈世界性流行，在商品蛋鸡发病严重，国内外蛋鸡群中的流行率高达70%以上，有效防控MS刻不容缓。

MS防控基于对感染鸡群的监测和净化，但目前我国还未形成成熟的MS净化监测体系。现阶段控制MS感染以疫苗免疫和药物治疗为主，并配合科学的饲养管理技术，而这些防控程序的成功取决于对感染鸡群及时准确的诊断。

分离病原被认为是诊断支原体感染的金标准，但MS分离相当困难，不作为感染确诊的标准，该病确诊高度依赖血清抗体的检测。常用的MS抗体检测方法有酶联免疫吸附试验 (ELISA)、血清平板凝集 (SPA)和血凝抑制 (HI) 等。SPA能快速检测感染早期抗体IgM，成本低、灵敏，但该方法与其他支原体物种及近期接种的灭活和/或减毒活疫苗有交叉反应，特异性较低。HI 具有高特异性，但灵敏度低。而ELISA因其灵敏、特异、成本低，易于操作和高通量，广泛用于MS 抗体监测。目前国外已有商品化的MS抗体ELISA检测试剂盒，但价格较高，来源受限，严重制约着我国MS感染的监测和防控。研制快速精准的国产化MS检测试剂盒成为当前亟需解决的关键技术。

近年来陆续报道了基于MS免疫优势蛋白的间接ELISA方法，由于支原体蛋白数量多、优势抗原表达多变，针对单个抗原的抗体滴度低，使得建立的ELISA方法敏感性和特异性不足。而特异性强的单克隆抗体已被证明可用于支原体物种的免疫诊断，成为建立快速准确的病原检测方法必不可少的工具。虽然国外在滑液支原体单克隆抗体制备方面已取得一定的进展，但这些单克隆抗体仅限于MS优势抗原的筛选，它们识别的p45-50kD，p46-52kD，p90kD区域的蛋白并不适合作为MS抗体诊断的靶标。Hwang等鉴定出分子量约为53kD(命名为p53)，22kD(p22)和高免疫原性的41kD(p41)的特异性优势蛋白，其中仅p41在血清诊断方面有一定作用，但与鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum，MG)阳性血清有交叉反应；而p53和p22不能作为MS抗体诊断的抗原。根据上述报道，可以看出p41-53区带的蛋白虽然有免疫原性，但不能作为MS抗体检测的靶标。盖新娜选取其中p45-50kD的蛋白区带制备的MS特异性单克隆抗体与MG抗原无交叉反应，由于p41-53kD区域蛋白已被报道不具备鉴定MS抗体的能力，可以推测针对p45-50kD蛋白区带的单克隆抗体也不具有诊断MS抗体的潜能。

本发明分别以膜蛋白和全菌蛋白为抗原制备MS特异性单克隆抗体，增加了获得针对不同蛋白的MS特异性单克隆抗体的概率。本发明共获得11株可有效区分MG和MS抗原的单克隆抗体，通过三步筛选，仅获得1株具备广谱性竞争MS抗体活性的特异性单克隆抗体，该单克隆抗体可同时与MS不同分离株抗原约100kD，45kD，23kD大小的蛋白带发生特异性反应，表明该单克隆抗体识别的抗原表位具有保守性和高度特异性。基于该广谱性单克隆抗体建立的MS抗体竞争ELISA试剂盒能特异性鉴别MS抗体，并与MG感染抗体无交叉反应，具有良好的特异性和敏感性，可用于MS抗体的诊断。本发明进一步对检测抗体进行辣根过氧化物酶标记，使检测过程只需两步，于50分钟内即可完成，相对于专利CN112538106A和CN114324859A等报道的ELISA方法用时短、操作简单。目前，还未有MS竞争ELISA抗体检测技术的相关报道。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种能够稳定分泌具有广谱抗鸡滑液囊支原体的单克隆抗体（monoclonal antibody，Mab）的杂交瘤细胞株。

本发明的目的之二在于提供由上述杂交瘤细胞株所分泌的抗MS单克隆抗体。

本发明的目的之三在于提供上述杂交瘤细胞株和单克隆抗体在用于MS的诊断和检测中的应用。

为实现上述目的，本发明采用了以下技术手段：

本发明分别以膜蛋白和全菌蛋白作为抗原免疫 BALB/c小鼠，取小鼠脾细胞与SP2/0细胞进行融合，以建立的间接ELISA方法筛选阳性克隆，通过有限稀释法对阳性细胞孔进行三次亚克隆，获得多株能稳定分泌抗MS的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。进一步用临床MS阳性血清样品筛选，获得1株能稳定分泌高亲合力的抗MS的单克隆抗体、且能特异性竞争MS抗体的杂交瘤细胞株，命名为2F6，分类命名为单克隆抗体杂交瘤细胞株，该细胞株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No. 45241，保藏时间为2022年7月20日。

进一步的，本发明还提供了一种由上述杂交瘤细胞株分泌的具有抗MS 的单克隆抗体（Mab 2F6）及该单克隆抗体的标记抗体，经鉴定该抗体重链为IgG1型，轻链为κ链。取Mab 2F6与MS分离株进行Western blot检测，显示该抗体与MS分离株的约100kD、45kD、23kD大小的蛋白发生反应，表明Mab 2F6识别的线性表位具有特异性和保守性。对感染DF-1细胞的MS进行间接免疫荧光检测，显示Mab 2F6能够与感染细胞的MS发生特异性结合，表明Mab2F6具有识别MS抗原的能力。

更进一步的，为了提高对MS的检测效率，本发明还提出了所述的杂交瘤细胞株、所述的单克隆抗体或该单克隆抗体的标记抗体在制备诊断或检测鸡滑液囊支原体试剂中的用途。

更进一步的，本发明利用Mab 2F6的特异性、保守性及广谱性建立了一种以该单克隆抗体作为检测抗体的MS抗体竞争ELISA试剂盒及其检测方法。该试剂盒和方法为我国MS相关疾病的诊断提供了灵敏、特异、且适合批量检测的新型检测手段，填补了国内MS抗体、抗原检测的空白，为MS的防控和净化提供一种准确的检测方法。

其中，优选的，所述的试剂盒是检测MS抗体的酶联免疫检测试剂盒，其中包含Mab2F6或该单克隆抗体的标记抗体。

其中，优选的，所述的试剂盒中还含有包被抗原、酶标板、包被液、样品稀释液、洗涤液、封闭液、TMB显色液以及终止液。

其中，优选的，所述的包被抗原为鸡滑液囊支原体膜蛋白抗原。

所述的试剂盒用于检测MS抗体时，按照以下步骤进行：

(1)将MS抗原用碳酸盐缓冲液稀释后包被酶标板，每孔100μL，4℃过夜；

(2)弃去上清，用PBST溶液清洗酶标板，每孔300μL，洗涤3次后每孔加入封闭液200μL，37℃封闭孵育1.5h；

(3)弃去上清，用PBST溶液清洗酶标板，洗涤3次后，拍干备用。

(4)在预反应板(未包被抗原的96孔酶标板)中加入稀释缓冲液、临床血清样本、阴性对照和阳性对照(MS标准阴性血清和标准阳性血清)和单克隆抗体检测溶液，轻轻混匀所有孔。

(5)从预反应板的每孔中吸取100μL转移至包被板相应的孔中，37℃孵育30min。

(6)弃去各孔液体，每孔加入约300µL的洗涤液，弃去洗涤液，连续洗涤3次。最后一次洗涤液弃去后，在吸水纸上拍干包被板。

(7)每孔加入100µL的TMB显色溶液，显色10min，加入100μL的2M硫酸进行终止显色，并在酶标仪上读取OD450nm值。

实验证明，该方法特异性高、敏感性好、重复性好，可以用于临床血清样品中MS抗体水平的检测，具有良好的开发前景。

相较于现有技术，本发明的有益效果是：

1. 本发明首次以MS特异性单克隆抗体Mab 2F6作为检测抗体建立了竞争ELISA方法，相较传统的ELISA方法具有特异性好、灵敏性高和稳定性良好的特点，可对血清中MS的抗体水平进行快速检测。

2. 本发明使用辣根过氧化物酶（HRP）标记竞争抗体，使检测过程只需两步就可以完成，用时短、操作简单，整个过程只需50分钟即可完成。

3. 由于MS蛋白众多，某些优势抗原与MG同源性高，且优势抗原表达多变，激发宿主体液反应的能力有限。本发明方法以识别保守性抗原表位的MS特异性单克隆抗体作为检测抗体，相对于以往基于单个粘附蛋白或膜蛋白等为包被抗原的间接ELISA方法具有更高的的敏感性和特异性，也能有效避免种属交叉反应。

4. 目前国内市场上还没有商品化的MS抗体诊断试剂盒，与市场上国外商品化试剂盒相比，本发明的试剂盒的检测灵敏度与特异性与同类产品相当，表明本发明的试剂盒可替代国外进口，可满足基层养殖场MS大规模监测的需求。

5. 本发明的MS单克隆抗体具有良好的特异性，能有效区分滑液支原体和鸡毒支原体、衣阿华支原体和鸡支原体，可广泛应用于MS的定性定量诊断，在MS感染的监测和流行病学调查中均具有较大的应用前景。

附图说明

图1为固体培养基上鸡滑液囊支原体分离株（MS-HLJ）株菌落的煎蛋样形态；

图2为6株MS单克隆抗体的免疫印迹图（Western Blot）；

其中，A：单克隆抗体2F6（Mab 2F6）, B：单克隆抗体2C4（Mab 2C4）, C：单克隆抗体4B2（Mab 4B2）, D：单克隆抗体4A5（Mab 4A5），E：单克隆抗体2A1（Mab 2A1）, F：单克隆抗体2F11（Mab 2F11）；

其中，M: 蛋白标准样品，泳道1：鸡滑液囊支原体分离株（MS-HLJ），泳道2：鸡滑液囊支原体分离株（MS-YS），泳道3：鸡滑液囊支原体分离株（MS-GJZ），泳道4：鸡毒支原体分离株（MG-YK）, 泳道5：鸡毒支原体标准株（MG-R），泳道6：鸡毒支原体标准株（MG-S6），泳道7：鸡支原体模式株PG16，泳道8：衣阿华支原体模式株364；

图3为3株单克隆抗体的广谱竞争活性测定图；

其中，A：Mab 2F6, B：Mab 2F11, C：Mab 2C4；

图4为本发明试剂盒的ROC曲线图；

图5为本发明试剂盒检测临床样品的临界值；

图6为本发明试剂盒的特异性测定；

图7为间接免疫荧光检测MS感染的DF-1细胞；

其中，A：阳性对照，B：阴性对照，C：Mab 2F6，D: 未感染的空白对照。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不限定本发明。

实施例1 MS单克隆抗体的制备

1. 1 免疫抗原制备：

鸡滑液囊支原体分离株（MS-HLJ）接种于PPLO液体培养基，37℃培养至培养基颜色由红色变为黄色后，9000r/ min 离心 30min，收集菌体沉淀，生理盐水重悬菌体，用终浓度为0.2%的吡咯灭活，即为全菌蛋白抗原。按照膜蛋白提取试剂盒说明书提取MS膜蛋白，沉淀以PBS重悬后即为膜蛋白抗原。BCA 试剂盒测定蛋白浓度，于 -20℃冻存。

菌株的菌落形态：MS-HLJ株在固体培养基上的生长菌落具有支原体典型“煎蛋样”形态特征（见图 1）。

1.2 单克隆抗体制备

本部分中所有细胞处理过程使用的培养基均为不含血清的RPMI-1640基础培养基，简写为基础培养基；细胞培养时使用添加1%的青/链霉素和15%的胎牛血清的RPMI-1640完全培养基，简写为完全培养基。

1.2.1 小鼠免疫

将步骤 1.1 制备的两种抗原分别作为免疫抗原与弗氏佐剂等体积混合乳化后于颈背部皮下多点注射免疫BALB/c小鼠。分别在免疫后2周和4周用抗原加弗氏不完全佐剂加强免疫两次。每次免疫后1周，采集尾部静脉分离血清测定效价，健康小鼠血清作阴性对照。取效价最高的小鼠脾脏进行细胞融合，融合前三天对小鼠进行加强免疫。

1.2.2细胞融合

1.2.2.1饲养细胞制备

取一只未免疫的BALB/C小鼠，眼球放血，收集血清，即为阴性血清。脱颈处死，无菌取小鼠腹腔细胞，铺于96孔细胞培养板中，置于细胞培养箱中培养，次日用于细胞融合。

1.2.2.2 细胞融合

取加强免疫小鼠，断颈处死，无菌取脾脏、研磨，静置5min，吸取上层脾细胞。将提前复苏培养的骨髓瘤细胞SP2/0与脾细胞按1:10比例混合，以PEG4000作融合剂，按常规方法进行融合，随后逐步加入基础培养基终止融合。将融合后的细胞铺于准备好的饲养细胞之上。

1.3 阳性杂交瘤细胞筛选和亚克隆

当细胞集落生长至视野的1/5~1/3时，用间接ELISA方法测定细胞培养上清的抗体效价以筛选阳性杂交瘤细胞，依抗体的分泌情况筛选出高抗体分泌孔细胞行亚克隆。采用有限稀释法对抗体效价高的阳性细胞孔进行亚克隆筛选。连续两次亚克隆率达到100%后，将克隆化细胞转入培养瓶扩大培养，冻存杂交瘤细胞株和制备腹水，完成杂交瘤细胞的建株过程。

1.4杂交瘤细胞的冻存

将扩大培养的杂交瘤细胞1000r/min离心10min弃上清，用提前预冷的细胞冻存液(含90%胎牛血清和10%DMSO)轻柔吹打混匀细胞，每支冻存管内细胞量在1×10⁶个以上，标好名称、日期，把冻存管放到冻存盒中放到-80℃冰箱，次日转入液氮罐中长期保存。冻存细胞要定期复苏，检查细胞的活性和分泌抗体的稳定性，在液氮中细胞可保存数年或更长时间。

1.5 杂交瘤细胞的复苏

从液氮罐中取出冻存的杂交瘤细胞，快速放入37℃的水浴中摇动，使其解冻。将细胞转移到离心管中并用细胞基础培养基洗涤一次，1000r/min离心10min弃上清，加入细胞完全培养基重悬细胞，移入细胞瓶，置细胞培养箱中培养。当细胞形成集落时，检测抗体活性。

1.7 具有竞争活性单克隆抗体的筛选

具有竞争活性单克隆抗体的筛选分三步进行，第一步采用竞争ELISA方法测定11株单克隆抗体对MS阴性、阳性血清的竞争活性，第二步采用Western blot鉴定有竞争和无竞争活性单克隆抗体株的特异性，第三步选取经前两步筛选获得的具有竞争活性和MS特异性的单克隆抗体进行抗体检测能力的广谱性分析，包括更多份不同养殖场鸡群采集的经IDEXX公司滑液支原体抗体检测试剂盒(IDEXX, 99-06728)测定为MS阳性和MS阴性的血清。

1.7.1 单克隆抗体竞争活性初筛

采用竞争ELISA方法测定，操作步骤如下：将MS阳性、阴性血清样本适量稀释后每孔50μL加入酶标板，再同时往每孔加入50μL的细胞上清，混匀，设置空白对照(CC)和单克隆抗体对照(Mab)孔。置于37℃恒温箱中作用1h，每孔加入200 μL PBST洗涤液洗板3次，拍干，再每孔加入100 µL的酶标二抗，37 ℃孵育1h。弃去每孔液体，200μL PBST洗涤液振荡洗涤3次，拍干。每孔加入100 µL的显色液，37 ℃孵育8~10min。加入50 µL的终止液。最后在酶标仪测定450nm处读取吸收值。按照下述公式计算单克隆抗体对阴性血清和阳性血清的抑制百分比(PI)， PI=100 ×(Mab平均值-样品A450值)/(Mab平均值-CC平均值)。

11株单克隆抗体对MS阳性、阴性血清PI值的差异如表1所示，其中Mab 4B2、Mab2F6和Mab 2C4对阳性血清具有显著的抑制活性，PI值大于40%以上，表明这些单克隆抗体可以抑制MS抗体和抗原的结合，具有竞争活性。

表1. 11株单克隆抗体的竞争活性测定

1.7.2 MS特异性单克隆抗体筛选

选取其中对MS阳性血清有较高竞争活性的2F6、2C4、2F11和4B2以及竞争活性较低的4A5和2A1共6株单克隆抗体分别进行Western blot检测以筛选MS特异性单克隆抗体，结果如图2所示，竞争活性较低的Mab 4A5(图2D)和Mab 2A1(图2E)与具有竞争活性的Mab 2F6(图2A)、Mab 2C4(图2B)和Mab 2F11(图2F)相似，均能与MS不同菌株发生反应，而与MG不同菌株无交叉反应，特异性良好。而表现竞争活性的Mab 4B2(图2C)与MS和MG不同菌株及鸡支原体均发生反应，特异性差。这些结果表明，Mab 2A1和Mab 4A5虽然为MS特异性单克隆抗体且与MG抗原无交叉反应，表现出良好的免疫反应性和特异性，但并不能抑制MS抗体与抗原的结合，无竞争活性。

综合以上结果可以看出，Mab 2A1和Mab 4A5虽经Western blot展示良好的特异性，但它们并无MS抗体竞争活性。为筛选出具有MS抗体检测能力的MS特异性单克隆抗体，测定它们对MS抗体的竞争活性必不可少。

1.7.3 单克隆抗体竞争活性的广谱性检测

为进一步测定具有竞争活性和MS特异性的2F11、2C4和2F6单克隆抗体是否具有广谱诊断MS抗体的能力，分别选取来自不同养殖场的10份MS阳性血清和MS阴性血清进行检测，这些血清经商品化MS抗体检测试剂盒（IDEXX）测定为MS阴性和MS阳性(P指阳性样品，N阴性样品)及3份MG阳性血清(G1-G3)进行竞争ELISA测定。

结果如图3 所示，Mab 2F6(图3 A)检测阴性、阳性血清样品的PI值分界明显，10份阳性血清的PI在44.69~62.81%之间，显著大于阴性样品的PI值(-1.09% ~15.23%)，且和3个MG阳性血清无交叉反应，而Mab 2F11(图3 B)和Mab2C4(图3 C)不能有效区分阴性、阳性样品。这些结果表明，3株单克隆抗体虽经Western blot鉴定为MS特异性单克隆抗体，但并不都具备广谱的竞争活性，仅Mab 2F6检测MS抗体具有良好的特异性、敏感性和广谱性，并且与MG血清无交叉反应性，具有开发应用为MS诊断工具的前景。

将该细胞株2F6保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No. 45241，保藏时间为2022年7月20日。

1.8 单克隆抗体腹水的制备、纯化

1.8.1 腹水的制备及效价的测定：

选取8~10周龄雌雄BLAB/C小鼠，腹腔注射弗氏不完全佐剂0.5 mL/只；1周后，腹腔注射杂交瘤细胞，每只小鼠5×10⁶个细胞；接种后10天左右小鼠腹部明显膨大，用采血针收集腹水于离心管中，4℃，2000r/min离心30min，收集中间层透明的液体，使用Protein GFocurose 4FF亲和层析柱（武汉汇研生物科技有限公司）纯化，-20 ℃冻存。

1.9 Mab 2F6单克隆抗体的辣根过氧化物酶（Horseradish Peroxidase, HRP）标记

委托北京博奥龙免疫生物技术有限公司将Mab 2F6采用HRP标记，命名为HRP-2F6，经Nanodrop分光光度计测定，该酶标抗体的浓度为1.93mg/mL。

实施例2 单克隆抗体的鉴定

2.1单克隆抗体亚类鉴定

采用Southern Biotech公司生产的抗体类型及亚类鉴定试剂盒SBA ClonotypingSystem-HRP对实施例1制备得到的杂交瘤细胞株2F6培养上清进行亚类鉴定，具体步骤按照试剂盒说明书操作。亚类鉴定结果显示Mab 2F6重链为IgG1型，轻链为κ链。

2.2 Mab 2F6的特异性检验

选取常见的鸡支原体病相关病原进行特异性测定，包括MG、衣阿华支原体和鸡支原体，采用Western blot 方法测定Mab 2F6单克隆抗体的特异性。将MS-HLJ新鲜培养物接种于100 mL的支原体液体培养基，37℃培养，培养基变黄后，9000r/min，30 min收集菌体沉淀，用PBS重悬洗涤3次，重悬菌体沉淀，冰浴超声破碎，收集上清，即为支原体全菌体蛋白。将提取的全菌蛋白进行SDS-PAGE电泳后，经过半干转印到PVDF膜上(25V，30min)。PVDF膜用5%鱼明胶，4℃封闭过夜；TBST洗膜3次，用2F6的培养上清作为一抗在室温下作用2小时，TBST洗膜3次，与1:5000倍稀释的羊抗鼠IgG-HRP孵育1小时，TBST洗膜3次，ECL 显色。

Western blot 结果如图2A所示，Mab 2F6单克隆抗体可与MS- HLJ株(泳道1)中约100kD，45kD，28kD大小的蛋白发生特异性反应，而与MG(泳道4-6)、衣阿华支原体(泳道7)和鸡支原体(泳道8)均不发生反应，特异性良好。

实施例3 单克隆抗体的应用

3.1 MS竞争ELISA（cELISA）抗体检测试剂盒的制备

3.1.1 抗体检测板的制备：

采用碳酸盐缓冲液将实施例1制备的膜蛋白抗原以每孔10μg/mL加入到 96 孔酶标板内，4℃包被过夜；PBST洗3次，每次5分钟，拍干。于 5%w/v脱脂乳的 PBS封闭液中，37℃封闭1.5h；PBST洗3次，每次5分钟，拍干，室温干燥，放入干燥剂，装铝箔袋密封，置2-8度保存。

3.1.2 试剂盒组装：将制备好的抗原包被板、酶标单克隆抗体（HRP-2F6）（HRP标记的2F6单克隆抗体，分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞的保藏号为CGMCC No. 45241）、样品稀释液、洗涤液、显色液、终止液，分别无菌包装后，全部装入试剂盒中，并在试剂盒外壳上贴上标签，置2-8度保存。所述的样品稀释液为5%w/v的脱脂乳，所述的洗涤液为PBST，所述的显色液为TMB显色液，所述的终止液为2M H₂SO₄。

3.1.3本发明cELISA试剂盒操作步骤：

(1)平衡：将试剂盒内包被板及所有试剂回温至置15～25℃后使用，液体试剂使用前需轻摇或漩涡振荡混匀。

(2)样品准备：在预反应板(未包被抗原的96孔酶标板)中加入稀释缓冲液、临床血清样品、阴性对照和阳性对照(MS标准阴性血清和标准阳性血清)和单克隆抗体检测溶液。其中第1列作为对照列，A1，A2两孔中各加入100uL的稀释缓冲液作为空白对照孔(CC)；A3，A4两孔中各加入100uL稀释后的HRP标记的单克隆抗体检测溶液(1:5000倍稀释，以下同)，作为单克隆抗体对照(HRP-2F6)；A5，A6两孔中各依次加入60uL样品稀释液、60uL稀释的单克隆抗体检测溶液和1uL的阳性血清作为阳性对照(PC)；A7，A8两孔中各加入60uL样品稀释液、60uL稀释的单克隆抗体检测溶液和1uL的阴性血清，作为阴性血清对照(NC)； 2-12列每孔分别加入60uL的稀释缓冲液、60uL稀释后的单克隆抗体检测溶液和1uL的血清样品(加样前吹打混匀)，轻轻混匀所有孔，避免气泡产生。

(3)加样：从预反应板的每孔中吸取100μL转移至包被板相应的孔中，每块板可检测样品88份，每列样品均需更换吸头，并记录每个样品在包被板的位置。

(4)孵育：置37℃恒温培养箱内孵育45分钟。

(5)洗板：弃去各孔液体，每孔加入约300µL的洗涤液，弃去洗涤液，连续洗涤3次。最后一次洗涤液弃去后，在吸水纸上拍干包被板。

(6)显色：每孔加入100µL的TMB显色溶液。置37℃恒温培养箱内孵育15分钟。

(7)终止：每孔加入100µL的终止液，终止反应。

(8)测定：测定并记录每个样品和对照在450nm波长处的吸光值(OD450nm值)。

3.1.4计算

计算空白对照的平均吸光值(CC

)、阳性对照的平均吸光值(PC

)、阴性对照的平均吸光值(NC

)和单克隆抗体对照的平均吸光值(MabC

)，并计算每一个样品的抑制百分比 (S PI)。S PI=100×(HRP-2F6C

-S A450)/(HRP-2F6C

-CC

)。

试验有效性：当HRP-2F6C

大于等于0.400且小于等于2.000(最好接近1.000)； CC

小于0.200；阴性对照抑制百分比(NC PI)在(-15)~25之间；阳性对照抑制百分比(PC PI) 在 49.7~110之间，检测结果有效。

3.2本发明cELISA试剂盒的临界值

选取采集自某种禽场的鸡阳性血清50份，阴性血清137份，所有血清均经IDEXX公司滑液支原体抗体检测剂盒(IDEXX, 99-06728)检验判定为MS阳性或阴性。利用建立的竞争ELISA方法测定，计算每个样品的SPI值，进行ROC曲线分析。根据95%的CIs下的DSn、DSp性能指标以及95%CI下的AUCs来确定最优临界值。ROC曲线分析结果如图4所示，PI值49.7%为系统分析的最优临界点（见图5），此时DSn为98.5%，DSp为98.8%，AUC曲线下面积为0.9969。所以确定该方法的临界值为49.7%，当PI ≥ 49.7%判为阳性，PI < 49.7%判为阴性。

3.3本发明cELISA试剂盒的特异性检测

选取MG、禽传染性支气管炎病病毒(IBV)、鸡伤寒沙门氏菌(SG)、鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)、禽流感病毒H5、H7、H9型等病原感染的阳性血清进行检测，结果如图6所示，各血清的PI值均显著低于49.7%，全部为阴性，表明此方法具有较高的特异性。

3.4 本发明cELISA试剂盒的的敏感性检测

选择31份背景明确的临床鸡阳性血清(1~30)和1份阴性血清（N1）进行检测，结果如表2所示，31份样品的抑制率(PI)均大于49.7%，表明此方法具有良好的敏感性。

表2. 本发明cELISA试剂盒的敏感性检测

3.5 本发明cELISA试剂盒的重复性检测

选择7份血清样本分别在同一批次酶标板上重复3次，以及3批次酶标板上进行检测，求得平均抑制率X及标准偏差SD，变异系数CV(%) = SD/X×100%。计算出板内变异系数在1.80%~7.47%之间；板间变异系数在1.42%~8.29%之间(表3)，均小于10%，表明该方法具有良好的重复性。

表3. 本发明cELISA试剂盒的批内重复性检测

以上结果表明本发明建立的阻断ELISA方法具有良好的特异性、敏感性及重复性，可用于临床血清样品中的MS抗体水平的检测。

3.6本发明cELISA试剂盒用于临床样品的检测

使用本发明的试剂盒和IDEXX公司MS抗体检测试剂盒(IDEXX, 99-06728)同时检测246份临床血清样品。

表4. 本发明试剂盒与市售产品的符合率

检测结果如表4所示，246份临床血清样品经本发明试剂盒检出阳性73份，商品化试剂盒检出阳性78份，两种试剂盒检出结果一致的有238份血清，不相符血清8份，两个试剂盒的总符合率达到96.7 %。

3.2间接免疫荧光（IFA）检测MS抗原

将新鲜培养的MS培养物经PBS洗涤3次后，用DMEM细胞完全培养基重悬，感染DF-1细胞，37 ℃恒温箱培养2~6 h，未感染细胞作为空白对照。PBS洗涤2次，洗去未黏附的菌体。用4%多聚甲醛等固定液于室温条件下固定细胞30 min，然后透膜数分钟，PBST洗涤3次。加入5%鱼明胶于室温封闭1 h，PBST洗涤3次。每孔加入杂交瘤细胞 2F6上清，室温孵育1 h，以免疫小鼠血清作为阳性对照，免疫前小鼠血清作为阴性对照，PBST洗涤3次。加入1 : 800稀释的FITC标记的山羊抗小鼠IgG，室温避光孵育1 h，PBST洗涤3次后，置于倒置荧光显微镜下观察、分析并采集图像。

IFA检测结果如图7所示，免疫小鼠血清的阳性对照组和杂交瘤细胞培养上清均能与感染DF-1细胞的MS发生特异性反应，在荧光显微镜下可见到绿色荧光信号；而未感染细胞的空白对照组及免疫前小鼠血清的阴性对照处理组未见荧光，说明获得的MAb 2F6能与感染细胞的MS发生反应，可用于MS抗原的检测和MS的免疫学分析。

本发明单克隆抗体在用于抗原含量检测时，可以作为双抗体夹心ELISA 检测试剂盒的包被抗体，也可对它进行生物标记或化学标记，作为双抗体夹心ELISA 检测试剂盒的夹心酶标抗体；同时也可将它与另一物种的多抗配对使用，通过加入夹心抗体的酶标二抗制备MS抗原含量检测试剂盒。

本发明的单克隆抗体用于制备抗体检测试剂盒时，可作为包被抗体或者酶标竞争抗体，也可作为竞争抗体并加入酶标二抗的方法进行检测。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一株分泌抗鸡滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae, MS)单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为2F6，所述杂交瘤细胞株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNo. 45241，保藏时间为2022年7月20日。

2.一种由权利要求1所述的杂交瘤细胞株分泌的具有广谱性抗鸡滑液囊支原体的单克隆抗体。

3.一种由权利要求1所述的杂交瘤细胞株分泌的具有广谱性抗鸡滑液囊支原体的单克隆抗体的标记抗体。

4.权利要求1所述的杂交瘤细胞株在制备诊断或检测鸡滑液囊支原体试剂中的用途。

5.权利要求2所述的单克隆抗体或权利要求3所述的单克隆抗体的标记抗体在制备诊断或检测鸡滑液囊支原体试剂中的用途。

6.一种用于检测鸡滑液囊支原体抗体的竞争ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中含有权利要求2所述的单克隆抗体或权利要求3所述的单克隆抗体的标记抗体。

7.如权利要求6所述的竞争ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还含有包被抗原、酶标板、包被液、样品稀释液、洗涤液、封闭液、TMB显色液和终止液。

8.如权利要求7所述的竞争ELISA检测试剂盒，其特征在于，所述的包被抗原为鸡滑液囊支原体膜蛋白抗原。