CN106771187B - 一种猪瘟基因工程亚单位疫苗效力检验方法 - Google Patents

一种猪瘟基因工程亚单位疫苗效力检验方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种猪瘟基因工程亚单位疫苗效力检验方法，猪瘟病毒ELISA抗体为阴性的家兔注射猪瘟基因工程亚单位疫苗(293T‑E2)后，免疫一段时间后再注射脾淋源猪瘟活疫苗，保护率达到100％以上。本发明方法，用家兔进行免疫攻毒和用猪进行免疫攻毒结果是一致的，可替代用猪进行免疫攻毒的检验方法，缩短了检测周期，节约了检测成本，方法可操作性强，结果易于判定，生物安全性高。

Description

一种猪瘟基因工程亚单位疫苗效力检验方法
技术领域
本发明属于疫苗检测技术领域，具体涉及一种猪瘟基因工程亚单位疫苗效力检验方法。
背景技术
猪瘟(slassical swine fever，CFS)以出血和发热为主要特征，呈急性或慢性经过，是一种对猪危害性极大的传染病，被国际兽疫局列为A类动物传染病。目前使用的弱毒疫苗主要是中国猪瘟兔化弱毒疫苗、日本GPE疫苗和法国的Thireval疫苗。20世纪70年代后期，猪瘟的流行形式发生了很大变化。地区散发性流行及非典型猪瘟症状的发生，特别是近年来国内外应用单克隆抗体对C-株检测时发现有不同的反应模式，猪瘟免疫屡屡失败等，表明猪瘟病毒的抗原性可能存在着变异，从而有人对传统弱毒疫苗提出了质疑。随着传代次数的增加和对不同细胞的适应性繁殖，疫苗毒株可能发生异质性或抗原漂移加之数十年来CSFV在大规模免疫接种压力下可能出现抗原变异。
这些情况都表明，现有的传统疫苗已不能适应新形势的需要，研究和开发新型猪瘟疫苗机是大势所趋。分子生物学技术的兴起和发展，为新型猪瘟疫苗的研究和开发奠定了基础。基因缺失弱毒疫苗、亚单位疫苗和活载体疫苗是目前研究的热点。
猪瘟病毒基因工程亚单位疫苗属于灭活疫苗，由于采用靶动物(猪)进行免疫攻毒，存在检测周期长(约51天)，需要进行强毒(猪瘟病毒石门系)攻击检验，急需建立一种替代动物或其他的效力检验方法用于灭活疫苗的效力检验，以解决缩短检测周期，节约检测成本，提高生物安全等问题。
发明内容
本发所要解决的技术问题是针对现有技术存在的不足，而提供一种猪瘟病毒基因工程亚单位疫苗效力检验方法，可替代用猪进行免疫攻毒的效力检验，从而缩短检测周期，并减少成本，从而弥补现有亚单位疫苗效力检验的空白。
为了实现上述技术目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的猪瘟基因工程亚单位疫苗效力检验方法，包括以下步骤：
1)取健康的易感家兔作为检验对象，按照体重、性别随机分为对照组和免疫组，免疫组至少设有2个平行组；
2)对免疫组家兔进行注射，注射待检测的猪瘟基因工程亚单位疫苗，而对照组的家兔不注射任何物质；注射疫苗的家兔和对照组的家兔按照正常饲养方式饲养；
3)步骤2)注射疫苗19日后，免疫组和对照组的家兔每日测温一次；21日后，免疫组和对照组的家兔均注射脾淋源猪瘟活疫苗，注射疫苗后每6小时测温一次，共测72小时；
4)根据步骤3)注射脾淋源猪瘟活疫苗前后家兔体温的变化，判定猪瘟基因工程亚单位疫苗是否达到保护作用，家兔体温变化不超过1℃时判定为达到保护作用。
优选的，步骤1)中，所述的易感家兔，为猪瘟病毒ELISA抗体为阴性的家兔。
优选的，步骤1)中，所述的易感家兔，体重为1.5-3.0kg。
优选的，步骤1)中，所述的对照组不设平行组；所述的免疫组设有平行组，每个平行组设立的家兔只数与对照组相同。
优选的，步骤2)中，所述的猪瘟基因工程亚单位疫苗为293T-E2疫苗。
本发明的方法在对猪瘟病毒基因工程亚单位疫苗进行效力检测时，可用家兔来替代猪进行免疫攻毒的效力检验，由于检验动物家兔易获得，节约检验成本，且检验周期短(约24天)，不涉及用猪瘟强毒攻击，生物安全性高。
具体实施方式
本发明采用健康易感家兔免疫猪瘟基因工程亚单位疫苗，免疫后一定时间攻毒，通过兔体反应热判定疫苗的免疫效果，从而有效的节约检验成本，且缩短了检验周期。
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1：
一种猪瘟基因工程亚单位疫苗效力检验方法，包括以下步骤：
(1)取健康的易感(瘟病毒ELISA抗体均为阴性)家兔(体重为1.5-3.0kg)作为检验对象，按照体重、性别，将20只家兔随机分为4组，每组5只，3组作为免疫组，分别免疫201401、201402、201403批猪瘟病毒基因工程亚单位疫苗(293T-E2)，1组作为对照组；
(2)对免疫组家兔的颈部进行皮下静脉注射，注射猪瘟病毒基因工程亚单位疫苗(293T-E2)(0.2ml/只)，而对照组的家兔不注射任何物质；注射疫苗的家兔和对照组的家兔按照正常饲养方式饲养；
(3)步骤(2)注射疫苗19日后，免疫组和对照组的家兔每日测温一次；21日后，免疫组和对照组的家兔均兔耳静脉注射脾淋源猪瘟活疫苗(1.0ml/只)，注射疫苗后每6小时测温一次，共测72小时；
(4)根据步骤(3)注射脾淋源猪瘟活疫苗前后家兔体温的变化，判定猪瘟病毒基因工程亚单位疫苗(293T-E2)是否达到保护作用，家兔体温变化不超过1℃时判定为达到保护作用。结果如表1所示：
表2：猪瘟病毒基因工程亚单位疫苗(293T-E2)对家兔的保护作用
分组 动物种类 动物数量 保护率 不保护率
201401批免疫组 家兔 5只 100％ 0％
201402批免疫组 家兔 5只 100％ 0％
201403批免疫组 家兔 5只 100％ 0％
对照组 家兔 5只 0％ 100％
由表1、表2可知，家兔注射猪瘟病毒基因工程亚单位疫苗(293T-E2)免疫后21日，再次被病毒攻击后，3批疫苗免疫家兔均无体温反应，保护率达到100％，而对照组5只家兔在攻毒后30小时，体温开始升高1.0℃以上，稽留12小时以上，保护率为0。
实施例2：
实施例1中所述的猪瘟基因工程亚单位疫苗(293T-E2)效力检验方法，以猪进行免疫攻毒的效力检验时：
取健康易感(瘟病毒PCR检测阴性，ELISA抗体为阴性)的35-60日龄猪20头，随机分成4组，每组5头；1-3组为免疫组，各头颈部肌肉注射201401、201402、201403批猪瘟病毒基因工程亚单位疫苗(293T-E2)1.0ml/头；第4组为对照组。免后35日，所有猪注射猪瘟病毒石门系强毒1.0ml/头；攻毒前2日每日测量猪体温两次，攻毒后日测温两次，共测16日，观察攻毒猪的临床表现(眼结膜炎、食欲下降或食欲废绝、便秘和腹泻交替出现、精神沉郁)。根据攻毒前2日及攻毒后测温和临床观察综合判定，体温变化不超过1℃时且无临床表现判定为达到保护作用。结果如表表3、表4、表5所示：
表3：攻毒猪临床观察和剖检统计表
注：“√”表示出现此症状或有体温反应；“-”表示无此症状或无体温反应。
表5：猪瘟基因工程亚单位疫苗(293T-E2)对30-60日龄猪保护作用
分组 动物种类 动物数量 保护率 不保护率
201401批免疫组 30-60日龄猪 5头 100％ 0％
201402批免疫组 30-60日龄猪 5头 100％ 0％
201403批免疫组 30-60日龄猪 5头 100％ 0％
对照组 30-60日龄猪 5头 0％ 100％
上述的结果表明，3批疫苗免疫猪后，用强毒攻击，测温16日体温未见明显变化，临床未见眼结膜炎、精神沉郁等症状，均健活，保护率均为100％，对照组攻毒后5/5发病，5/5死亡。
根据以上试验结果可见，用家兔进行免疫攻毒和用猪进行免疫攻毒结果是一致的。
上述实例只是为说明本发明的技术构思以及技术特点，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明的实质所做的等效变换或修饰，都应该涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种猪瘟基因工程亚单位疫苗效力检验方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤：
1)取健康的易感家兔作为检验对象，按照体重、性别随机分为对照组和免疫组，免疫组至少设有2个平行组；
2)对免疫组家兔进行注射，注射猪瘟基因工程亚单位疫苗，而对照组的家兔不注射任何物质；注射疫苗的家兔和对照组的家兔按照正常饲养方式饲养；
3)步骤2)注射疫苗19日后，免疫组和对照组的家兔每日测温两次；21日后，免疫组和对照组的家兔均注射脾淋源猪瘟活疫苗，注射疫苗后每6小时测温一次，共测72小时；
4)如步骤4)注射脾淋源猪瘟活疫苗前后家兔体温的变化，判定猪瘟基因工程亚单位疫苗是否达到保护作用，家兔体温变化不超过1℃时判定为达到保护作用；
步骤1)中，所述的易感家兔，为猪瘟病毒ELISA抗体为阴性的家兔，体重为1.5-3.0kg；
步骤2)中，所述的猪瘟基因工程亚单位疫苗的注射剂量为0.2ml/只；
步骤4)中，所述的脾淋源猪瘟活疫苗的注射剂量为1.0ml/只；
所述的猪瘟基因工程亚单位疫苗为293T-E2疫苗。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中，所述的对照组不设平行组；所述的免疫组设有平行组，每个平行组设立的家兔只数与对照组相同。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中，所述的猪瘟基因工程亚单位疫苗的注射方式为皮下注射，注射部位为家兔的颈部。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)中，所述的脾淋源猪瘟活疫苗的注射方式为皮下静脉注射，注射部位为家兔的耳部。
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