CN101736017A - 一种猪瘟病毒e2次单位疫苗及其制备 - Google Patents

Abstract

本发明是使用家蚕(Silkworm)是统平台量产猪瘟病毒(classical swinefever virus)基因亚型2.1(subgroup 2.1)的重组E2蛋白。本发明亦提供一种包含上述重组蛋白的次单位疫苗，可用以提高猪只抵抗猪瘟病毒感染的能力。

Description

一种猪瘟病毒E2次单位疫苗及其制备

技术领域

本发明是关于一种猪瘟疫苗及其制备方法。

背景技术

猪瘟为台湾及世界部分地区养猪业所面临的最严重疾病之一。猪瘟病毒的天然宿主只有驯养猪及野猪，病毒对任何年龄的猪皆具感受性及伤害性。目前除少数特殊目的养猪场未使用疫苗防治及欧美国家采扑杀政策外，几乎所有猪只在成长过程中最少须使用两次以上疫苗才能免于猪瘟的危害。而目前台湾每年生产毛猪数量仍维持在600万头以上，东南亚、中国及南美洲产量更数十倍于此，因此具保护作用的次单位疫苗对于该市场具有非常高的经济价值。

全世界使用最广泛的猪瘟疫苗为兔化减毒疫苗或细胞减毒疫苗，例如台湾使用的兔化疫苗(LPC)已连续通过兔体继代减毒1,000代以上(刘永和1978，台湾畜牧兽医学会会报32：38-39)；而日本使用的细胞培养疫苗(GP)是将病毒于天竺鼠肾细胞减毒(林再春等1969，台湾省畜卫所研报6：1-10；谢竹茂等1981，台湾省畜卫所研报7：13-16)。但减毒疫苗存在的缺点是容易受移行抗体干扰与免疫后的抗体反应无法与野外病毒感染区分。因此1990年代以后欧洲国家如德国及荷兰已相继开发E2次单位疫苗(Kretzdornet al.，2005.美国发明专利第6,919,085号；Bouma et al.，1999.Vet.Microbiol.66：101-114；Ahrens et al.，2000.Vet.Microbiol.77：83-97；van Gennip et al.，2002.Vaccine 20：1544-1556)，其最大优点可做为野外病毒感染的区别诊断(van Rijn et al.，1999.Vaccine 17：433-440)，然欧洲的生产是统为昆虫杆状病毒(AcNPV)及昆虫细胞(Sf21)，其制程长且生产的疫苗成本相当高不适合量产使用。

1986年日本Dr.Yanai则首先使用家蚕杆状病毒(BmNPV)当做载体(Maeda et al.，1985，Nature 3 15：592-594；美国发明专利第5,480,956号)大量生产外源性重组蛋白猫科动物干扰素(Feline interferon)。

猪瘟病毒在台湾已存在长久并持续威胁养猪产业，然1996年后发现外来病毒株(基因亚型2.1型，Subgroup 2.1)已完全取代本土型病毒株(基因亚型3.4型，Subgroup 3.4)现象(Deng et al.，2005，Vet.Microbiol.106：187-193；Lin et al.，2007.Virus Genes 35：737-744)且其抗原性与原来本土型病毒已有差异。此外，荷兰及德国开发的E2次单位疫苗是利用细胞培养法生产，进口贩卖价格达30元台币以上，对于饲主在成本上形成不小的负担。因此，如何根据新入侵型病毒株基因亚型2.1开发有效疫苗，以减少猪只感染并降低养猪业的损失，同时又能兼具低生产成本的优点，将是一个极需解决的问题。

发明内容

本发明的特征在于使用家蚕作为蛋白产制平台，其方法为使用家蚕杆状病毒(BmNPV)，携带一重组猪瘟病毒E2基因于家蚕虫体中增生表现，并于家蚕体液中表现该重组猪瘟病毒E2蛋白。本发明的另一特征即为将其重组E2蛋白开发成猪瘟E2次单位疫苗，便于大量制造，且每剂量疫苗抗原成本大幅降低。

因此，本发明是提供一种制备猪瘟疫苗抗原蛋白的方法，其包括：

(1)选殖一重组猪瘟病毒E2基因于一适当载体中；

(2)以该带有猪瘟病毒E2基因的载体与一家蚕杆状病毒(Baculovirus；BmNPV)的基因体共同转染家蚕细胞(BmN)，使其自然发生基因重组反应而得到带有E2基因的重组家蚕杆状病毒；

(3)筛选力价最高的重组杆状病毒株为种病毒株；

(4)使用该种病毒株感染家蚕；

(5)养殖被感染的家蚕一段适当的时间让病毒进行复制，以产生出重组杆状病毒并表现E2蛋白于体液中；

(6)搜集被种病毒株感染的家蚕体液而得到重组E2蛋白，可作为猪瘟疫苗的抗原。

本发明另外提供一种用于预防或是控制猪瘟病毒感染的猪瘟疫苗，其中该猪瘟疫苗包括如上述方法所制备的重组猪瘟病毒E2蛋白与一可接受的佐剂。

附图简述

前文的所述以及实施方式可通过附图达到更好的说明效果。为了加强本发明的说明，将适当的实施例的附图列举于此。要注意的是，本发明并不受限于列举于此的说明。

图1是E2次单位重组基因的质粒(pBpE2-his)的建构图。

图2是表示重组E2蛋白的浓度，其为以抗组氨酸抗体进行西方墨点法的结果。道1至道8分别表示8只不同蚕体的体液，道9、道10与道11则为标准蛋白质含量的标示，其分别表示50ng，200ng，400ng。Y轴为蛋白的分子量标示，单位为kDa。

图3是表示重组E2蛋白的浓度，其为以抗组氨酸抗体与WH303抗体进行西方墨点法的结果。道1至道5为E2蛋白两倍连续稀释后的结果(道1为1∶1，道2为1∶2，道3为1∶4，道4为：1∶8，道5为1∶16)。″+″号表示E2蛋白纯化后定量为136.832ng/μl的浓度的结果。

图4为表示每剂量60μg的家蚕表现蛋白与不同佐剂混合，进行免疫效力评估的结果。X轴表示的为每隔两周采血的时间点，Y轴表示的为抗体稀释倍率。

图5为表示不同剂量抗原0-120μg与TW-W/O佐剂制成疫苗，进行免疫效力评估的结果。X轴表示的为每隔两周采血的时间点，Y轴表示的为抗体稀释倍率。

实施方式

本发明的主要目的为提供一种制备猪瘟疫苗抗原蛋白的方法，其包括：

(1)选殖一重组猪瘟病毒E2基因于一适当载体中；

(2)以该带有猪瘟病毒E2基因的载体与一家蚕杆状病毒(Baculovirus；BmNPV)的基因体共同转染家蚕细胞(BmN)，使其自然发生基因重组反应而得到带有E2基因的重组家蚕杆状病毒；

(3)筛选力价最高的重组杆状病毒株为种病毒株；

(4)使用该种病毒株感染家蚕；

(5)养殖被感染的家蚕一段适当的时间让病毒进行复制，以产生出重组杆状病毒并表现E2蛋白于体液中；

(6)搜集被种病毒株感染的家蚕体液而得到重组E2蛋白，可作为猪瘟疫苗的抗原。

“家蚕杆状病毒”为家蚕主要病害之一，该病毒特色为具有强力的启动子，可在感染短短数天内制出大量的蛋白产物，其启动子所制造外源蛋白的量，可高达感染细胞的20％以上。因此，家蚕蚕体可作为一个有效率且经济的蛋白生产平台，利用家蚕杆状病毒将表达特定蛋白的转殖基因带入家蚕蚕体，利用家蚕蚕体进行转殖基因的增生及表现。此领域的技术人员可根据所拟表达蛋白的需要，自行生产家蚕杆状病毒并修改其启动子。根据本发明的一实施例，所使用的家蚕杆状病毒是由中央研究院分子生物所赵裕展博士以基因重组方法改造及构筑，其中控制转录的BmNPV的polyhedrin启动子亦由赵博士于中央研究院研发(Wu and Chao，2008，Biotechnology Progress，accepted)。

本文中所称的“猪瘟病毒”(Classic swine fever virus；CSFV)，在分类上是属于Flaviviridae的Pestivirus，为正向单股、有外鞘的RNA病毒。根据本发明的一实施例，可使用基因亚型2.1的猪瘟病毒。  根据M.-C.Denget al.(M.-C.Deng et al.，2005，Veterinary Microbiology 106：187-193)的研究报告，自1993年至2003年间，台湾共分离到24种属于基因亚型2.1的猪瘟病毒，其中更可进一步区分为2.1a与2.1b两种。目前已知的基因亚型2.1a的猪瘟病毒包括有：118/FL/94、CH/96、c/TN/96、TD/96、32/IL/96、PD/98、PD/99、SC/00、CY/01、83/PD/01、03/TN/01、0401/CH/01、IL/01、TD/01、SC/01、81/TD/01与YL/01。目前已知的基因亚型2.1b的猪瘟病毒包括有：0406/CH/01、85/TN/01、82/YL/01、02/TN/01、8/YL/01、266/YL/01与267/YL/01。根据本发明的一实施例，使用的猪瘟病毒为TD/96/TWN株。

本文中所称的“猪瘟病毒E2基因”或称“猪瘟病毒E2次单位基因”，为猪瘟病毒外鞘上一种醣蛋白的核苷酸分子，目前已知是最具抗原性且最具有病毒中和效果。在此所称的“猪瘟病毒E2次单位抗原蛋白”，是指由猪瘟病毒E2次单位基因所转译出的蛋白质，本领域技术人员可自行依据需要，利用一般分子生物学的方法设计重组蛋白。根据本发明的一实施例，本发明的猪瘟病毒E2次单位抗原蛋白共有362个氨基酸，包含E1的20个C端氨基酸序列及E2的342个N端至TM区域的氨基酸，具有如序列编号：1(SEQ ID NO：1)的氨基酸序列。

根据本发明的一实施例，本发明的E2次单位抗原蛋白的核酸序列来自于台湾的TD/96型的猪瘟病毒(TD/96/TWN)。以前述具有如序列编号：1的氨基酸序列的E2蛋白的序列作比对，与基因亚型2.1a的病毒种类有约96.9％的相似度，与基因亚型2.1b的病毒种类有约97.8％的相似度，而与基因亚型2.1a与2.1b的病毒种类有约94.1-95.1％的相似度。因此由本发明方法所制得的疫苗，对于基因亚型2.1a与2.1b的猪瘟病毒应具防御功效。

根据本发明，为制备本发明猪瘟病毒疫苗的抗原蛋白，本发明所属技术领域中具有通常知识者可根据一般分子生物学方法，或目前已知基因比对方法与数据库鉴定其所纯化的病毒与猪瘟病毒基因亚型2.1的抗原蛋白氨基酸序列具一定相似度(例如90％或96％以上)以上的重组基因。根据本发明，本发明选殖出带有自行设计的E2次单位基因的载体，与家蚕杆状病毒进行重组反应后，可得到带有重组E2次单位基因的家蚕杆状病毒，接着将带有重组基因的病毒感染家蚕一段适当时间(例如3-5天)，使病毒进行复制以增生重组杆状病毒并表现E2次单位抗原于家蚕的体液中，因此可由所得的家蚕的体液分取得E2次单位抗原蛋白。  根据本发明，所使用的家蚕并无品种的限定，目前已知的家蚕品种皆可作为本发明的蛋白生产平台。本发明所属技术领域中具有通常知识者可根据蛋白特性、病毒感染能力等因素，自行决定所使用的家蚕品种。依本发明的一实施例，所采用的家蚕品种为由原种OJ03及原种OJ04杂交的二品种(OJ03xOJ04)，由行政院农业委员会苗栗区农业改良场提供。

本发明的另外一个目的为提供一种用于预防或是控制猪瘟病毒感染的猪瘟疫苗组合物，其中该猪瘟疫苗组合物包括如上述的方法所制备的重组猪瘟病毒抗原蛋白与一可接受佐剂。

在此所称的“佐剂”，是指一种能增强特定医疗效果的物质，在免疫学上指能增强宿主对外来物质反应的物质。若从类型来分，一般在医学上可用于人体或动物的佐剂包括有无机性的佐剂，如氢氧化铝或明矾等；有机性的佐剂，如脂质粒、油性佐剂或人工合成的聚核苷酸(polyI:C)等；生物性佐剂，如细胞激素、病毒颗粒等。若从剂型来分，可分为水性、油性、水包油(W/O)、油包水(O/W)或水包油包水(W/O/W)等。一般而言，油性佐剂对动物组织的刺激性较大，容易产生注射部位肿胀，引起慢性炎症反应，但大多数的油性佐剂可以启动非专一性的免疫反应，提高疫苗的保护效果。由于组织吸收油的速度较慢，因此抗原可被保存在油滴中缓慢释放，延长疫苗保护效果。相反地，水性佐剂将抗原一次释放，所以可以迅速刺激非常高免疫力，但免疫力的维持较短。熟知技艺的人士可根据一般免疫学知识，以及评估宿主年龄、性别、抗原强度或施打间隔等因素，自行调配佐剂或采用市售佐剂来加强疫苗的效果。根据本发明的实施例，较佳为油性佐剂。

根据本发明的一实施例，比较各种油性佐剂加强疫苗的效果，同时与多种市售油性佐剂与自行调配佐剂共同调配，其中该市售油性佐剂是为采购自法国SEPPIC厂的进口佐剂，包括ISA 206、ISA 25、ISA 1113等三种，而自行调配佐剂则是采用Marcol 52(EPPIC，Sydney Australia)及接口活性剂Montanox 80(Esso Petroleum Co.Ltd，UK)调配而成，且E2次单位抗原与各种油性佐剂混和的比例为35-65∶65-35，较佳为40∶60或36∶64。

本发明将由下列实施例做进一步的说明，但实际发明范围并不受限于该用于所示的实施例。

实施例1：建构包含E2次单位重组基因的质粒

Subgroup 2.1病毒E1E2TM基因的放大

首先使用逆转录聚合酶superscript II reverse transcriptase(Invitrogen，CA，USA)进行逆转录聚合酶连锁反应，以两个E1-E2基因专一性的引物(如表1)，从TD/96/TWN型猪瘟病毒基因体放大E1-E2基因序列2354-3466bp(SEQ ID NO：2)，其中该核苷酸序列包含部分E1基因的N端60个核苷酸序列及E2基因的C端至TM区域(E1E2TM)1026核苷酸，共1086个核苷酸。接着第二次逆转录聚合酶连锁反应则以第一次反应产物，与反向引物(5’-TTGAG CTCAC CATGT TGAGA GGACA GGT-3’)(SEQ ID NO：5)逆转录成cDNA，最后再以聚合酶连锁反应放大产物量，其条件为以聚合酶(Invitrogen，CA，USA)先进行在94℃变性(denaturation)30秒，55℃结合30秒，再于72℃下延长60秒，并进行30次循环。

表1：逆转录聚合酶连锁反应引物

E1-E2基因正向引物	5’-TTGAG CTCAC CATGT TGAGA GGACA GGT-3’(SEQ ID NO：3)
		E1-E2基因反向引物	5’-ATTCT AGATT AGTGA TGGTG ATGGT GATGAAATTC GGCGA AGTAG TCTG-3’(SEQ ID NO：4)

E1E2TM基因的选殖于pBp质粒中

pBp质粒是由中央研究院分子生物研究所赵裕展博士构筑与提供，含两段BmNPV序列(737-2395 bp及127001-128413 bp)作为与病毒基因体重组的同质区。E1E2TM基因(SEQ ID NO：2)放大后使用SacI与XbaI酵素(Invitrogen，USA)切割，于37℃作用2小时，且纯化的pBp质粒10μg亦用SacI与XbaI酵素切割后，将E1E2TM基因与质粒混合，并用DNA连接酶连结后以大肠杆菌(E.coli)选殖及增殖成为重组质粒pBpE2-his(图1)。如图1所示，重组质粒pBpE2-his已选殖有病毒的基因体序列737-2395 bp及127001-128413 bp做为同质重组区，而127001-128413 bp中含有完整的polyhedrin启动子用于控制mRNA的转录。另于E1E2TM的3’端含有六个组氨酸(Histidine)作为表现蛋白抗体辨识标记。

实施例2：同质重组反应(Homologous recombination)

将选殖完成的质粒pBpE2-his 5μg，与杆状病毒的半纯化基因体50μg使用200μl商品化的Liposome(Invitrogen，USA)混合后，加入1ml的不含血清成份的TC-100培养液，并加入生长于30mm培养盘的单层家蚕细胞(BmN)使其共同转染(Transfection)进入细胞中，并于细胞内自然发生重组反应。约4-7天后可用抗-组氨酸单株抗体(Invitrogen，USA)或抗-E2单株抗体(WH303，Veterinary Laboratory Agency，UK)稀释200倍后染色筛选出具表现能力的病毒斑，病毒再经连续10倍稀释并感染细胞三次，经单株化选殖(subclone)后大量增殖决定力价，并将力价最高的病毒做为种病毒株。

实施例3：以家蚕为蛋白产制平台

选殖完成的重组杆状病毒可感染家蚕并表现E2蛋白，蚕种为由原种(OJ03×OJ04)杂交的二品种，其原种保留于行政院农委会苗栗区农业改良场，并以二品种蚕卵供应饲养使用。一般家蚕饲养至第五龄约第23天时，可于第三背孔处注射10μl的病毒液(10^7.0TCID₅₀/ml)，感染后约3-5天家蚕呈现发病时可收集体液，并检测E2蛋白的浓度。每只家蚕约可抽取0.3-0.5ml的体液，其体液以西方墨点法分析抗原浓度。

取20μl的体液，使用4-1 2％SDS-PAGE gradient gel电泳分析，然后将蛋白转印至硝化纤维膜(nitrocellulose membrane)上，再以5％无脂乳粉填塞(blocking)后，将转印的硝化纤维膜于PBST溶液中含5％无脂乳粉加入20μl的单株抗体作用一小时后，以山羊抗鼠IgG呈色。表现的E2蛋白不但可用抗组氨酸抗体辨识与定量(图2)，也可用两种抗E2抗体(WH303或FC09)辨识(图3)，其中WH303抗体为荷兰开发并已商品化的抗E2单株抗体(Veterinary Laboratory Agency，UK)，而FC09为发明人自行开发的抗E2单株抗体，其特征为可辨认基因亚型2.1病毒的E2蛋白而无法辨认基因亚型1.1病毒的E2蛋白。

如图2所示，道1至道8分别为8只蚕体体液以抗组氨酸抗体辨识的结果，道9、道10与道11则为标准蛋白质含量的标示，其分别代表50ng，200ng，400ng。在图上约40-55kDa位置可看到道1至道8均有大小相同的明显的带状，显示每只家蚕的表现量相当稳定，且根据标准蛋白质含量的推算，每μl的家蚕体液中含有约1.2μg的E2蛋白。

如图3所示，抗E2专一性单株抗体WH303可检测出蛋白在家蚕体液中自动形成双体(95KD)的结构(使用非还原态的胶体)，而抗组氨酸抗体于可检测出表现E2蛋白的单体(使用还原态的胶体)，其中道1至道5为E2蛋白两倍连续稀释后的结果(道1为1∶1，道2为1∶2，道3为1∶4，道4为：1∶8，道5为1∶16)。″+″号表示E2蛋白纯化后定量为136.832ng/μl的浓度的结果。根据图3的结果，发现家蚕E2蛋白浓度稀释至介于4倍与8倍时，与标准E2蛋白浓度相当，推估家蚕E2蛋白浓度约等于6倍的标准E2蛋白浓度(0.136mg/ml)，即0.8mg/ml。此制程产生的抗原浓度与美国发明专利第6,919,085号(Kretzdorn et al.，2005)培养方法相比，高达50倍以上，且可降低每剂量抗原成本至0.1元台币以内。

实施例4：猪瘟疫苗的制备与其功效评估

由实施例3所取得的60μg重组E2蛋白，包含E1的20个3’端氨基酸序列及E2的5’端至TM区域342个氨基酸(SEQ ID NO：1)，与多种不同油性佐剂，包括进口或自我调制者混合制成多种不同组合配方的猪瘟疫苗，并使用猪只做功效的直接评估。其中进口佐剂采用ISA 206，ISA 25，ISA1113三种，皆由法国SEPPIC厂购得；而TW-W/O/W及TW-W/O是自我调配而成含Marcol 52(EPPIC，Sydney，Australia)及界面活性剂(Montanox 80)(Esso Petroleum Co.Ltd)。自我调制的配方TW-W/O/W含抗原∶油性佐剂＝40∶60，TW-W/O含抗原∶油性佐剂＝36∶64，皆经用高压均质机以20000psi乳化调制。因此免疫后只产生抗E2抗体，可用于区别野外病毒感染或使用LPC疫苗免疫者产生抗全病毒抗体，例如抗E0及C蛋白抗体。使用以上的进口或自制佐剂及60μg的抗原，在猪只4-6周龄时由肌肉注射两剂量(两剂量相隔两周)，并从注射第一剂疫苗开始采血进行抗体稀释倍率测验(图4)。

如图4所示，自第二剂注射后两周(p2-2w)即可引起不同程度的免疫反应，且使用自我研发的佐剂(TW-W/O)疫苗与使用ISA 25的佐剂疫苗，产生的中和抗体可维持到免疫后三个月以上，且其稀释倍率可维持在≥100倍以上。

为了进一步确认自我研发的佐剂(TW-W/O)疫苗的抗原所需浓度，使用不同剂量抗原0-120μg与TW-W/O佐剂制成疫苗，以同样免疫方法检测抗体功效(图5)。如图5所示，每剂含30-120μg可引起相似的抗体反应程度且无显著差异，证明每剂量含30μgE2抗原量以上是足够且合理的浓度。

通常本领域技术人员将可在不背离本发明精神的下，根据实施例进行改变和修改。要注意的是，本发明并不受限于说明书中实施例所揭露的范围，而涵盖于其它根据申请范围内揭露的所有变化的形式。

序列表

<110>黄金城

<120>一种猪瘟病毒E2次单位疫苗及其制备

<130>NVR0001TW

<160>5

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>362

<212>PRT

<213>swine fever virus subgroup 2.1

<400>1

Leu Arg Gly Gln Val Val Gln Gly Ile Ile Trp Leu Leu Leu Val Thr

                5                   10                  15

Gly Ala Gln Gly Arg Leu Ser Cys Lys Glu Asp His Arg Tyr Ala Ile

            20                  25                  30

Ser Ser Thr Asn Glu Ile Gly Pro Leu Gly Ala Glu Gly Leu Thr Thr

        35                  40                  45

Thr Trp Lys Glu Tyr Asn His Gly Leu Gln Leu Asp Asp Gly Thr Val

    50                  55                  60

Arg Ala Ile Cys Ile Ala Gly Ser Phe Lys Val Thr Ala Leu Asn Val

65                  70                  75                  80

Val Ser Arg Arg Tyr Leu Ala Ser Leu His Lys Arg Ala Leu Pro Thr

                85                  90                  95

Ser Val Thr Phe Glu Leu Leu Phe Asp Gly Thr Ser Pro Ala Ile Glu

            100                 105                 110

Glu Met Gly Asp Asp Phe Gly Phe Gly Leu Cys Pro Phe Asp Thr Thr

        115                 120                 125

Pro Val Val Lys Gly Lys Tyr Asn Thr Thr Leu Leu Asn Gly Ser Ala

    130                 135                 140

Phe Tyr Leu Val Cys Pro Ile Gly Trp Thr Gly Val Ile Glu Cys Thr

145                 150                 155                 160

Ala Val Ser Pro Thr Thr Leu Arg Thr Glu Val Val Lys Thr Phe Lys

                165                 170                 175

Arg Glu Lys Pro Phe Pro His Arg Val Asp Cys Val Thr Thr Ile Val

            180                 185                 190

Glu Lys Glu Asp Leu Phe Tyr Cys Lys Leu Gly Gly Asn Trp Thr Cys

        195                 200                 205

Val Lys Gly Asn Pro Val Thr Tyr Thr Gly Gly Gln Val Arg Gln Cys

    210                 215                 220

Arg Trp Cys Gly Phe Asp Phe Lys Glu Pro Asp Gly Leu Pro His Tyr

225                 230                 235                 240

Pro Ile Gly Lys Cys Ile Leu Thr Asn Glu Thr Gly Tyr Arg Val Val

                245                 250                 255

Asp Ser Pro Asp Cys Asn Arg Asp Gly Val Val Ile Ser Thr Glu Gly

            260                 265                 270

Glu His Glu Cys Leu Ile Gly Asn Thr Thr Val Lys Val His Ala Leu

        275                 280                 285

Asp Gly Arg Leu Ala Pro Met Pro Cys Arg Pro Lys Glu Ile Val Ser

    290                 295                 300

Ser Ala Gly Pro Val Arg Lys Thr Ser Cys Thr Phe Asn Tyr Thr Lys

305                 310                 315                 320

Thr Leu Arg Asn Lys Tyr Tyr Glu Pro Arg Asp Ser Tyr Phe Gln Gln

                325                 330                 335

Tyr Met Leu Lys Gly Glu Tyr Gln Tyr Trp Phe Asp Leu Asp Val Thr

            340                 345                 350

Asp His His Thr Asp Tyr Phe Ala Glu Phe

        355                 360

<210>2

<211>1086

<212>DNA

<213>swine fever virus subgroup 2.1

<400>1

ttgagaggac aggttgtgca aggcataata tggctgttgc tggtgactgg ggcacaaggg  60

cggttgtcct gtaaggaaga ccacaggtat gcgatatcat caaccaatga gatagggccg  120

ctaggggctg aaggtctcac caccacctgg aaagaataca accatggttt gcagctggat  180

gacgggactg tcagggctat ttgcattgca gggtccttta aagtcacagc actcaatgtg  240

gttagtagga ggtacctggc atcattacac aagagggctt tgcccacttc agtgacattt  300

gaactcctat ttgatgggac cagcccagca attgaggaga tgggagatga ctttggtttt  360

gggctgtgcc cttttgacac gactcctgtg gtcaaaggga agtacaatac cactttatta  420

aacggcagcg cattctatct agtctgccca atagggtgga cgggtgtcat agagtgcacg  480

gcagtaagcc ccacaacctt gagaacagaa gtggtgaaga ccttcaagag agagaagcct  540

ttcccgcaca gagtggattg cgtgaccact atagtagaaa aagaagacct gttctactgc  600

aagttggggg gcaattggac atgtgtgaaa ggcaacccgg tgacctacac gggagggcaa  660

gtaagacaat gcaggtggtg tggttttgac ttcaaggagc ctgatgggct cccacactac  720

cccataggca agtgcatctt aacaaatgag acgggttaca gggtagtgga ttccccagac  780

tgcaacagag atggcgtcgt catcagcact gaaggagaac atgagtgctt gattggcaac  840

actactgtca aggtgcacgc attggatgga agactggccc ctatgccgtg cagacccaaa  900

gaaatcgtct ctagcgcggg acctgtaagg aaaacttcct gcactttcaa ttacacaaag  960

accctaagaa acaagtacta tgagcccagg gacagctatt tccagcaata tatgcttaag  1020

ggcgagtacc aatactggtt tgatctggac gtgactgacc accacacaga ctacttcgcc  1080

gaattt                                                             1086

<210>3

<211>28

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>引物

<400>3

ttgagctcac catgttgaga ggacaggt                           28

<210>4

<211>49

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>引物

<400>4

attctagatt agtgatggtg atggtgatga aattcggcga agtagtctg    49

<210>5

<211>28

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>引物

<400>5

ttgagctcac catgttgaga ggacaggt                           28

Claims (12)

1.一种制备造猪瘟疫苗抗原蛋白的方法，其包括：

a)选殖一重组猪瘟病毒E2基因于一适当载体中；

b)以该带有猪瘟病毒E2基因的载体与一家蚕杆状病毒(Baculovirus；BmNPV)的基因体共同转染家蚕细胞(BmN)，使其自然发生基因重组反应而得到带有猪瘟病毒E2基因的重组家蚕杆状病毒；

c)筛选力价最高的重组杆状病毒株为种病毒株；

d)使用该种病毒株感染家蚕；

e)养殖被感染的家蚕一段适当的时间让病毒进行复制，以产生出重组杆状病毒并表现猪瘟病毒E2蛋白于体液中；

f)搜集被种病毒株感染的家蚕体液而得到重组猪瘟病毒E2蛋白，可作为猪瘟疫苗的抗原。

2.如权利要求1的方法，其中该猪瘟病毒为亚群组2.1(subgroup 2.1)基因型病毒株。

3.如权利要求1的方法，其中该猪瘟病毒为TD/96/TWN株。

4.如权利要求1的方法，其中该重组猪瘟病毒E2蛋白的氨基酸序列为包含包含猪瘟病毒外鞘蛋白中E1的20个C端氨基酸序列，及E2的342个N端至TM区域的氨基酸序列。

5.如权利要求1的方法，其中该重组猪瘟病毒E2蛋白具有如序列编号：1的氨基酸序列。

6.如权利要求1的方法，其中该重组猪瘟病毒E2蛋白为具有与猪瘟病毒基因型2.1的E2蛋白的氨基酸序列90％以上的相似度。

7.如权利要求1的方法，其中该重组猪瘟病毒E2蛋白为具有与猪瘟病毒基因型2.1的E2蛋白的氨基酸序列96％以上的相似度。

8.一种用于预防或是控制猪瘟病毒感染的猪瘟疫苗，其中该猪瘟疫苗包括如权利要求1至7中任一项的方法所制备的重组猪瘟病毒抗原蛋白，与一可接受的佐剂。

9.如权利要求8的猪瘟疫苗，其中该佐剂为一种油性佐剂。

10.如权利要求9的猪瘟疫苗，其中该重组猪瘟病毒E2次单位抗原与油性佐剂混和的比例为35-65∶65-35。

11.如权利要求10的猪瘟疫苗，其中该重组猪瘟病毒E2次单位抗原与油性佐剂混和的比例为40∶60。

12.如权利要求10的猪瘟疫苗，其中该重组猪瘟病毒E2次单位抗原与油性佐剂混和的比例为36∶64。

Images