TWI394581B - 一種豬瘟病毒ｅ２次單位疫苗及其製備 - Google Patents

一種豬瘟病毒ｅ２次單位疫苗及其製備 Download PDF

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Description

一種豬瘟病毒E2次單位疫苗及其製備
本發明係關於一種豬瘟疫苗及其製備方法。
豬瘟為台灣及世界部分地區養豬業所面臨之最嚴重疾病之一。豬瘟病毒的天然宿主只有馴養豬及野豬，病毒對任何年齡的豬皆具感受性及傷害性。目前除少數特殊目的養豬場未使用疫苗防治及歐美國家採撲殺政策外，幾乎所有豬隻在成長過程中最少須使用兩次以上疫苗才能免於豬瘟之危害。而目前台灣每年生產毛豬數量仍維持在600萬頭以上，東南亞、中國及南美洲產量更數十倍於此，因此具保護作用之次單位疫苗對於該市場具有非常高的經濟價值。
全世界使用最廣泛之豬瘟疫苗為兔化減毒疫苗或細胞減毒疫苗，例如台灣使用之兔化疫苗(LPC)已連續通過兔體繼代減毒1,000代以上(劉永和1978，台灣畜牧獸醫學會會報32:38-39)；而日本使用的細胞培養疫苗(GP)是將病毒於天竺鼠腎細胞減毒(林再春等1969，台灣省畜衛所研報6:1-10；謝竹茂等1981，台灣省畜衛所研報7:13-16)。但減毒疫苗存在的缺點是容易受移行抗體干擾與免疫後之抗體反應無法與野外病毒感染區分。因此1990年代以後歐洲國家如德國及荷蘭已相繼開發E2次單位疫苗(Kretzdorn et al.,2005.美國發明專利第6,919,085號；Bouma et al.,1999.Vet. Microbiol. 66:101-114;Ahrens et al.,2000.Vet. Microbiol. 77:83-97;van Gennip et al.,2002.Vaccine 20:1544-1556)，其最大優點可做為野外病毒感染之區別診斷(van Rijn et al.,1999.Vaccine 17:433-440)，然歐洲的生產系統為昆蟲桿狀病毒(AcNPV)及昆蟲細胞(Sf21)，其製程長且生產之疫苗成本相當高不適合量產使用。1986年日本Dr.Yanai則首先使用家蠶桿狀病毒(BmNPV)當做載體(Maeda et al.,1985,Nature 315:592-594；美國發明專利第5,480,956號)大量生產外源性重組蛋白貓科動物干擾素(Feline interferon)。
豬瘟病毒在台灣已存在長久並持續威脅養豬產業，然1996年後發現外來病毒株(基因亞型2.1型,Subgroup 2.1)已完全取代本土型病毒株(基因亞型3.4型,Subgroup 3.4)現象(Deng et al.,2005,Vet. Microbiol . 106:187-193;Lin et al.,2007.Virus Genes 35:737-744)且其抗原性與原來本土型病毒已有差異。此外，荷蘭及德國開發之E2次單位疫苗係利用細胞培養法生產，進口販售價格達30元台幣以上，對於飼主在成本上形成不小的負擔。因此，如何根據新入侵型病毒株基因亞型2.1開發有效疫苗，以減少豬隻感染並降低養豬業的損失，同時又能兼具低生產成本的優點，將是一個極需解決的問題。
本發明之特徵在於使用家蠶作為蛋白產製平台，其方法為使用家蠶桿狀病毒(BmNPV)，攜帶一重組豬瘟病毒E2基因於家蠶蟲體中增生表現，並於家蠶體液中表現該重組豬瘟病毒E2蛋白。本發明之另一特徵即為將其重組E2蛋白開發成豬瘟E2次單位疫苗，便於大量製造，且每劑量疫苗抗原成本大幅降低。
因此，本發明係提供一種製備豬瘟疫苗抗原蛋白的方法，其包括：
(1)選殖一重組豬瘟病毒E2基因於一適當載體中；
(2)以該帶有豬瘟病毒E2基因的載體與一家蠶桿狀病毒(Baculovirus;BmNPV)之基因體共同轉染家蠶細胞(BmN)，使其自然發生基因重組反應而得到帶有E2基因的重組家蠶桿狀病毒；
(3)篩選力價最高之重組桿狀病毒株為種病毒株；
(4)使用該種病毒株感染家蠶；
(5)養殖被感染的家蠶一段適當的時間讓病毒進行複製，以產生出重組桿狀病毒並表現E2蛋白於體液中；
(6)蒐集被種病毒株感染的家蠶體液而得到重組E2蛋白，可作為豬瘟疫苗之抗原。
本發明另外提供一種用於預防或是控制豬瘟病毒感染之豬瘟疫苗，其中該豬瘟疫苗包括如上述方法所製備之重組豬瘟病毒E2蛋白與一可接受之佐劑。
本發明之主要目的為提供一種製備豬瘟疫苗抗原蛋白的方法，其包括：
(1)選殖一重組豬瘟病毒E2基因於一適當載體中；
(2)以該帶有豬瘟病毒E2基因的載體與一家蠶桿狀病毒(Baculovirus;BmNPV)之基因體共同轉染家蠶細胞(BmN)，使其自然發生基因重組反應而得到帶有E2基因的重組家蠶桿狀病毒；
(3)篩選力價最高之重組桿狀病毒株為種病毒株；
(4)使用該種病毒株感染家蠶；
(5)養殖被感染的家蠶一段適當的時間讓病毒進行複製，以產生出重組桿狀病毒並表現E2蛋白於體液中；
(6)蒐集被種病毒株感染的家蠶體液而得到重組E2蛋白，可作為豬瘟疫苗之抗原。
「家蠶桿狀病毒」為家蠶主要病害之一，該病毒特色為具有強力的啟動子，可在感染短短數天之內製出大量的蛋白產物，其啟動子所製造外源蛋白之量，可高達感染細胞之20%以上。因此，家蠶蠶體可作為一個有效率且經濟的蛋白生產平台，利用家蠶桿狀病毒將表達特定蛋白之轉殖基因帶入家蠶蠶體，利用家蠶蠶體進行轉殖基因之增生及表現。此領域之技術人士可根據所擬表達蛋白之需要，自行生產家蠶桿狀病毒並修改其啟動子。根據本發明之一實施例，所使用之家蠶桿狀病毒是由中央研究院分子生物所趙裕展博士以基因重組方法改造及構築，其中控制轉錄之BmNPV之polyhedrin啟動子亦由趙博士於中央研究院研發(Wu and Chao,2008,Biotechnology Progress ,accepted)。
本文中所稱之「豬瘟病毒」(Classic swine fever virus；CSFV)，在分類上是屬於Flaviviridae之Pestivirus，為正向單股、有外鞘之RNA病毒。根據本發明之一實施例，可使用基因亞型2.1之豬瘟病毒。根據M.-C. Deng et al.(M.-C. Deng et al.,2005,Veterinary Microbiology 106:187-193)的研究報告，自1993年至2003年間，台灣共分離到24種屬於基因亞型2.1之豬瘟病毒，其中更可進一步區分為2.1a與2.1b兩種。目前已知的基因亞型2.1a的豬瘟病毒包括有：118/FL/94、CH/96、c/TN/96、TD/96、32/IL/96、PD/98、PD/99、SC/00、CY/01、83/PD/01、03/TN/01、0401/CH/01、IL/01、TD/01、SC/01、81/TD/01與YL/01。目前已知的基因亞型2.1b的豬瘟病毒包括有：0406/CH/01、85/TN/01、82/YL/01、02/TN/01、8/YL/01、266/YL/01與267/YL/01。根據本發明之一實施例，使用之豬瘟病毒為TD/96/TWN株。
本文中所稱之「豬瘟病毒E2基因」或稱「豬瘟病毒E2次單位基因」，為豬瘟病毒外鞘上一種醣蛋白之核苷酸分子，目前已知是最具抗原性且最具有病毒中和效果。在此所稱之「豬瘟病毒E2次單位抗原蛋白」，係指由豬瘟病毒E2次單位基因所轉譯出的蛋白質，本領域技術人士可自行依據需要，利用一般分子生物學的方法設計重組蛋白。根據本發明之一實施例，本發明之豬瘟病毒E2次單位抗原蛋白共有362個胺基酸，包含E1的20個C端胺基酸序列及E2的342個N端至TM區域的胺基酸，具有如序列編號：1(SEQ ID NO:1)之胺基酸序列。
根據本發明之一實施例，本發明之E2次單位抗原蛋白之核酸序列來自於台灣之TD/96型的豬瘟病毒(TD/96/TWN)。以前述具有如序列編號：1之胺基酸序列之E2蛋白之序列作比對，與基因亞型2.1a的病毒種類有約96.9%的相似度，與基因亞型2.1b的病毒種類有約97.8%的相似度，而與基因亞型2.1a與2.1b的病毒種類有約94.1-95.1%的相似度。因此由本發明方法所製得之疫苗，對於基因亞型2.1a與2.1b的豬瘟病毒應具防禦功效。
根據本發明，為製備本發明豬瘟病毒疫苗之抗原蛋白，本發明所屬技術領域中具有通常知識者可根據一般分子生物學方法，或目前已知基因比對方法與資料庫鑑定其所純化之病毒與豬瘟病毒基因亞型2.1之抗原蛋白胺基酸序列具一定相似度(例如90%或96%以上)以上之重組基因。根據本發明，本發明選殖出帶有自行設計之E2次單位基因之載體，與家蠶桿狀病毒進行重組反應後，可得到帶有重組E2次單位基因之家蠶桿狀病毒，接著將帶有重組基因之病毒感染家蠶一段適當時間(例如3-5天)，使病毒進行複製以增生重組桿狀病毒並表現E2次單位抗原於家蠶的體液中，因此可由所得之家蠶的體液分取得E2次單位抗原蛋白。
根據本發明，所使用之家蠶並無品種之限定，目前已知的家蠶品種皆可作為本發明的蛋白生產平台。本發明所屬技術領域中具有通常知識者可根據蛋白特性、病毒感染能力等因素，自行決定所使用之家蠶品種。依本發明之一實施例，所採用的家蠶品種為由原種OJ03及原種OJ04雜交之二品種(OJ03 x OJ04)，由行政院農業委員會苗栗區農業改良場提供。
本發明之另外一個目的為提供一種用於預防或是控制豬瘟病毒感染之豬瘟疫苗組合物，其中該豬瘟疫苗組合物包括如上述之方法所製備之重組豬瘟病毒抗原蛋白與一可接受佐劑。
在此所稱之「佐劑」，係指一種能增強特定醫療效果的物質，在免疫學上指能增強宿主對外來物質反應的物質。若從類型來分，一般在醫學上可用於人體或動物的佐劑包括有無機性的佐劑，如氫氧化鋁或明礬等；有機性的佐劑，如脂質體、油性佐劑或人工合成之聚核苷酸(polyI:C)等；生物性佐劑，如細胞激素、病毒顆粒等。若從劑型來分，可分為水性、油性、水包油(W/O)、油包水(O/W)或水包油包水(W/O/W)等。一般而言，油性佐劑對動物組織的刺激性較大，容易產生注射部位腫脹，引起慢性炎症反應，但大多數的油性佐劑可以啟動非專一性的免疫反應，提高疫苗的保護效果。由於組織吸收油的速度較慢，因此抗原可被保存在油滴中緩慢釋放，延長疫苗保護效果。相反地，水性佐劑將抗原一次釋放，所以可以迅速刺激非常高免疫力，但免疫力的維持較短。熟知技藝之人士可根據一般免疫學知識，以及評估宿主年齡、性別、抗原強度或施打間隔等因素，自行調配佐劑或採用市售佐劑來加強疫苗的效果。根據本發明之實施例，較佳為油性佐劑。
根據本發明之一實施例，比較各種油性佐劑加強疫苗的效果，同時與多種市售油性佐劑與自行調配佐劑共同調配，其中該市售油性佐劑係為採購自法國SEPPIC廠之進口佐劑，包括ISA 206、ISA 25、ISA 1113等三種，而自行調配佐劑則係採用Marcol 52(EPPIC,Sydney Australia)及介面活性劑Montanox 80(Esso Petroleum Co. Ltd,UK)調配而成，且E2次單位抗原與各種油性佐劑混和的比例為35-65:65-35，較佳為40:60或36:64。
本發明將由下列實施例做進一步的說明，但實際發明範圍並不受限於該用於所示之實施例。
實施例1：建構包含E2次單位重組基因之質體 Subgroup 2.1病毒E1E2TM基因之放大
首先使用逆轉錄聚合酶superscript II reverse transcriptase(Invitrogen,CA,USA)進行逆轉錄聚合酶連鎖反應，以兩個m1-E2基因專一性之引子(如表1)，從TD/96/TWN型豬瘟病毒基因體放大E1-E2基因序列2354-3466bp(SEQ ID NO:2)，其中該核苷酸序列包含部分E1基因之N端60個核苷酸序列及E2基因之C端至TM區域(E1E2TM)1026核苷酸，共1086個核苷酸。接著第二次逆轉錄聚合酶連鎖反應則以第一次反應產物，與反向引子(5’-TTGAG CTCAC CATGT TGAGA GGACA GGT-3’)(SEQ ID NO:5)逆轉錄成cDNA，最後再以聚合酶連鎖反應放大產物量，其條件為以聚合酶(Invitrogen,CA,USA)先進行在94℃變性(denaturation)30秒，55℃結合30秒，再於72℃下延長60秒，並進行30次循環。
E1E2TM基因之選殖於pBp質體中
pBp質體係由中央研究院分子生物研究所趙裕展博士構築與提供，含兩段BmNPV序列(737-2395bp及127001-128413bp)作為與病毒基因體重組之同質區。E1E2TM基因(SEQ ID NO:2)放大後使用Sac I與Xba I酵素(Invitrogen,USA)切割，於37℃作用2小時，且純化之pBp質體10μg亦用Sac I與Xba I酵素切割後，將E1E2TM基因與質體混合，並用DNA連接酶連結後以大腸桿菌(E. coli)選殖及增殖成為重組質體pBpE2-his(圖1)。如圖1所示，重組質體pBpE2-his已選殖有病毒之基因體序列737-2395bp及127001-128413bp做為同質重組區，而127001-128413bp中含有完整之polyhedrin啟動子用於控制mRNA之轉錄。另於E1E2TM的3’端含有六個組安酸(Histidine)作為表現蛋白抗體辨識標記。
實施例2：同質重組反應(Homologous recombination)
將選殖完成之質體pBpE2-his 5μg，與桿狀病毒之半純化基因體50μg使用200μl商品化之Liposome(Invitrogen,USA)混合後，加入1ml之不含血清成份之TC-100培養液，並加入生長於30mm培養盤之單層家蠶細胞(BmN)使其共同轉染(Transfection)進入細胞中，並於細胞內自然發生重組反應。約4-7天後可用抗-組安酸單株抗體(Invitrogen,USA)或抗-E2單株抗體(WH303,Veterinary Laboratory Agency,UK)稀釋200倍後染色篩選出具表現能力之病毒斑，病毒再經連續10倍稀釋並感染細胞三次，經單株化選殖(subclone)後大量增殖決定力價，並將力價最高之病毒做為種病毒株。
實施例3：以家蠶為蛋白產製平台
選殖完成之重組桿狀病毒可感染家蠶並表現E2蛋白，蠶種為由原種(OJ03×OJ04)雜交之二品種，其原種保留於行政院農委會苗栗區農業改良場，並以二品種蠶卵供應飼養使用。一般家蠶飼養至第五齡約第23天時，可於第三背孔處注射10μl之病毒液(107.0 TCID50 /ml)，感染後約3-5天家蠶呈現發病時可收集體液，並檢測E2蛋白之濃度。每隻家蠶約可抽取0.3-0.5ml之體液，其體液以西方墨點法分析抗原濃度。
取20μl之體液，使用4-12% SDS-PAGE gradient gel電泳分析，然後將蛋白轉印至硝化纖維膜(nitrocellulose membrane)上，再以5%無脂乳粉填塞(blocking)後，將轉印之硝化纖維膜於PBST溶液中含5%無脂乳粉加入20μl之單株抗體作用一小時後，以山羊抗鼠IgG呈色。表現之E2蛋白不但可用抗組安酸抗體辨識與定量(圖2)，也可用兩種抗E2抗體(WH303或FC09)辨識(圖3)，其中WH303抗體為荷蘭開發並已商品化之抗E2單株抗體(Veterinary Laboratory Agency,UK)，而FC09為發明人自行開發之抗E2單株抗體，其特徵為可辨認基因亞型2.1病毒之E2蛋白而無法辨認基因亞型1.1病毒之E2蛋白。
如圖2所示，道1至道8分別為8隻蠶體體液以抗組安酸抗體辨識之結果，道9、道10與道11則為標準蛋白質含量的標示，其分別代表50ng，200ng，400ng。在圖上約40-55kDa位置可看到道1至道8均有大小相同之明顯的帶狀，顯示每隻家蠶之表現量相當穩定，且根據標準蛋白質含量的推算，每μl之家蠶體液中含有約1.2μg之E2蛋白。
如圖3所示，抗E2專一性單株抗體WH303可檢測出蛋白在家蠶體液中自動形成雙體(95KD)之結構(使用非還原態之膠體)，而抗組安酸抗體於可檢測出表現E2蛋白之單體(使用還原態之膠體)，其中道1至道5為E2蛋白兩倍連續稀釋後之結果(道1為1:1，道2為1:2，道3為1:4，道4為：1:8，道5為1:16)。"+"號表示E2蛋白純化後定量為136.832ng/μl之濃度之結果。根據圖3之結果，發現家蠶E2蛋白濃度稀釋至介於4倍與8倍時，與標準E2蛋白濃度相當，推估家蠶E2蛋白濃度約等於6倍的標準E2蛋白濃度(0.136mg/ml)，即0.8mg/ml。此製程產生之抗原濃度與美國發明專利第6,919,085號(Kretzdorn et al.,2005)培養方法相比，高達50倍以上，且可降低每劑量抗原成本至0.1元台幣以內。
實施例4：豬瘟疫苗之製備與其功效評估
由實施例3所取得之60μg重組E2蛋白，包含E1的20個3’端胺基酸序列及E2的5’端至TM區域342個胺基酸(SEQ ID NO:1)，與多種不同油性佐劑，包括進口或自我調製者混合製成多種不同組合配方的豬瘟疫苗，並使用豬隻做功效的直接評估。其中進口佐劑採用ISA 206,ISA 25,ISA 1113三種，皆由法國SEPPIC廠購得；而TW-W/O/W及TW-W/O係自我調配而成含Marcol 52(EPPIC,Sydney,Australia)及界面活性劑(Montanox 80)(Esso Petroleum Co. Ltd)。自我調製之配方TW-W/O/W含抗原：油性佐劑=40:60，TW-W/O含抗原：油性佐劑=36:64，皆經用高壓均質機以20000psi乳化調製。因此免疫後只產生抗E2抗體，可用於區別野外病毒感染或使用LPC疫苗免疫者產生抗全病毒抗體，例如抗E0及C蛋白抗體。使用以上之進口或自製佐劑及60μg之抗原,在豬隻4-6週齡時由肌肉注射兩劑量(兩劑量相隔兩週)，並從注射第一劑疫苗開始採血進行抗體稀釋倍率測驗(圖4)。
如圖4所示，自第二劑注射後兩週(p2-2w)即可引起不同程度之免疫反應，且使用自我研發之佐劑(TW-W/O)疫苗與使用ISA 25之佐劑疫苗，產生之中和抗體可維持到免疫後三個月以上，且其稀釋倍率可維持在倍以上。
為了進一步確認自我研發之佐劑(TW-W/O)疫苗的抗原所需濃度，使用不同劑量抗原0-120μg與TW-W/O佐劑製成疫苗，以同樣免疫方法檢測抗體功效(圖5)。如圖5所示，每劑含30-120μg可引起相似的抗體反應程度且無顯著差異，証明每劑量含30μg E2抗原量以上是足夠且合理的濃度。
通常技藝之人士將可在不背離本發明精神之下，根據實施例進行改變和修改。要注意的是，本發明並不受限於說明書中實施例所揭露之範圍，而涵蓋於其他根據申請範圍內揭露之所有變化之形式。
前文之所述以及實施方式可藉由附加之圖式達到更好的說明效果。為了加強本發明之說明，將適當的實施例之圖式列舉於此。要注意的是，本發明並不受限於列舉於此的說明。
圖1是E2次單位重組基因之質體(pBpE2-his)之建構圖。
圖2是表示重組E2蛋白之濃度，其為以抗組安酸抗體進行西方墨點法之結果。道1至道8分別表示8隻不同蠶體之體液，道9、道10與道11則為標準蛋白質含量的標示，其分別表示50ng,200ng,400ng。Y軸為蛋白的分子量標示，單位為kDa。
圖3是表示重組E2蛋白之濃度，其為以抗組安酸抗體與WH303抗體進行西方墨點法之結果。道1至道5為E2蛋白兩倍連續稀釋後之結果(道1為1:1，道2為1:2，道3為1:4，道4為：1:8，道5為1:16)。"+"號表示E2蛋白純化後定量為136.832ng/μl之濃度之結果。
圖4為表示每劑量60μg之家蠶表現蛋白與不同佐劑混合，進行免疫效力評估的結果。X軸表示的為每隔兩週採血的時間點，Y軸表示的為抗體稀釋倍率。
圖5為表示不同劑量抗原0-120μg與TW-W/O佐劑製成疫苗，進行免疫效力評估的結果。X軸表示的為每隔兩週採血的時間點，Y軸表示的為抗體稀釋倍率。

Claims (9)

  1. 一種製備造豬瘟疫苗抗原蛋白的方法，其包括：(1)選殖一重組豬瘟病毒E2基因於一適當載體中；(2)以帶有豬瘟病毒E2基因的載體與一家蠶桿狀病毒(Baculovirus；BmNPV)之基因體共同轉染家蠶細胞(BmN)，使其自然發生基因重組反應而得到帶有豬瘟病毒E2基因的重組家蠶桿狀病毒；(3)篩選力價最高之重組桿狀病毒株為種病毒株；(4)使用該種病毒株感染家蠶；(5)養殖被感染的家蠶一段適當的時間讓病毒進行複製，以產生出重組桿狀病毒並表現豬瘟病毒E2蛋白於體液中；以及(6)蒐集被種病毒株感染的家蠶體液而得到重組豬瘟病毒E2蛋白，可作為豬瘟疫苗之抗原，其中該重組豬瘟病毒E2蛋白具有如序列編號：1之胺基酸序列。
  2. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該豬瘟病毒為亞群組2.1(subgroup 2.1)基因型病毒株。
  3. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該豬瘟病毒為TD/96/TWN株。
  4. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該重組豬瘟病毒E2蛋白之胺基酸序列為包含豬瘟病毒外鞘蛋白中E1的20個C端胺基酸序列，及E2的342個N端至TM區域的胺基酸序列。
  5. 一種用於預防或是控制豬瘟病毒感染之豬瘟疫苗，其中該豬瘟疫苗包括如申請專利範圍第1至4項中任一項之方法所製備之重組豬瘟病毒抗原蛋白，與一可接受之佐劑。
  6. 如申請專利範圍第5項之豬瘟疫苗，其中該佐劑為一種油 性佐劑。
  7. 如申請專利範圍第6項之豬瘟疫苗，其中該重組豬瘟病毒E2次單位抗原與油性佐劑混和的比例為35-65：65-35。
  8. 如申請專利範圍第6項之豬瘟疫苗，其中該重組豬瘟病毒E2次單位抗原與油性佐劑混和的比例為40：60。
  9. 如申請專利範圍第6項之豬瘟疫苗，其中該重組豬瘟病毒E2次單位抗原與油性佐劑混和的比例為36：64。
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