CN102899338B - 具有潜在抗猪瘟病毒作用的irg6基因克隆及其稳定表达细胞系的构建 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种具有潜在抗猪瘟病毒特性的IRG6基因克隆及其稳定表达细胞系的构建，其特征在于：包括以下的步骤：(1)基因片段的获得；(2)载体的构建；(3)稳定表达IRG6蛋白细胞系的筛选；(4)检测报告基因的表达；本发明能够用于研究猪瘟病毒感染机制，并通过揭示该蛋白基因抗猪瘟病毒的机制，开发一种治疗猪瘟的药物。

Description

具有潜在抗猪瘟病毒作用的IRG6基因克隆及其稳定表达细胞系的构建

技术领域

本发明属于动物基因工程领域，具体涉及抗猪瘟病毒的基因克隆及其稳定表达细胞系的构建。

背景技术

猪瘟病毒(CSFV)是一种小囊膜、单股正链RNA病毒，属于黄病毒科、瘟病毒属。CSFV的基因组大约12.5kb，只有1个大的开放性阅读框架(ORF)，所有结构蛋白和非结构蛋白均由该ORF所编码，编码多种蛋白在细胞和病毒的蛋白酶的加工和修饰下形成12种成熟的病毒蛋白，大约4000个氨基酸残基，分子量约438ku(Moormann R.J.M et al.，1990)。猪瘟病毒(CSFV)是引起猪的高度传染性致死性病毒性疫病——猪瘟的病原。猪瘟病毒的感染可导致猪严重的白血球减少症、免疫抑制、广泛的血栓症和内皮损伤。猪瘟病毒引起的猪瘟疾病给世界养猪业带来巨大的挑战和威胁。

尽管目前使用的猪瘟疫苗对猪有很好的保护作用，但猪瘟却始终无法得到彻底的根除，而且猪瘟病毒的感染也呈现了新的特点。目前猪瘟病毒感染除了一般看到的急性临床症状以外，还有一些情况为宿主并不表现明显的症状，呈现持续性感染状态，长期携带病毒而不表现临床症状的猪就成为重要的传染源。病毒引起持续性感染，必须具备两方面的功能：一是不明显表现溶细胞性，以免失去生存场所；二是逃避机体的免疫机制，以免遭到清除。

CSFV的持续性感染的机理目前还不是很明确，但最近的研究标明，CSFV与一些宿主基因的相互作用在其中起到了至关重要的作用。病毒的感染会导致宿主细胞基因转录谱剧烈的变化，这些变化基于病毒与宿主之间的共进化，表现出两种截然相反的策略，一种是病毒破坏细胞的新陈代谢，另一种则是宿主反击病毒的感染(Hardwick&Griffin，1996)，病毒感染后宿主mRNA转录谱的变化究早前已经有很多相关研究(Hsiang et al.，1996；Sorbara et al.，1996；Zhu et al.，1997；TalSinger et al.，1998；Boudinot etal.，1999；Zhang et al.，1999)，通过研究病毒感染后宿主mRNA表达变化，探索在抗病毒反应和病毒诱导病理上存在潜力的基因蛋白。对感染猪瘟病毒后猪的基因转录谱进行了分析，结果发现许多主效的抗病毒基因出现明显的表达升高，如炎症因子和免疫因子(ZixueSHI et al.，2009；LI Jun et al.，2009)。而Li等的研究中观察到，IRG6(Inflammatoryresponse gene 6 protein，IRG6)在整个感染过程中，mRNA表达一直处在非常高的水平(Li Jun et al.，2010)。有关IRG6的研究非常少，仅仅Dorfleutner等人发现其受NF-kB调控(文章未发表)。不过，我们通过NCBI BLAST系统发现，在基因结构上，IRG6与其他物种中的干扰素诱导内质网相关病毒抑制蛋白(Virus inhibitory protein，endoplasmicreticulum-associated，interferon-inducible，viperin)有着非常高的同源性，而在主要的功能区域的同源性更达到90％左右。所以我们推测IRG6在功能上与viperin有着非常相似的特点。

干扰素诱导内质网相关病毒抑制蛋白(Viperin)是一种能被I、II型干扰素和多种抗原所诱导，并对多种DNA和RNA病毒具有抑制作用的蛋白。Viperin基因包含一个氮端跨膜螺旋，一个高度保守的碳端，并在中间区域拥有一个CX3CX2C序列，该序列是腺苷蛋氨酸酶(SAMe)类特有的。SAM酶类内包含了一个[4Fe-4S]区域，是SAM主要的结合位点，而这一结构在所有的Viperin结构中都可以找到。Viperin以SAM酶形式，在宿主对抗病毒的侵袭中起到非常重要的作用(Goyal Shaveta et al.，2010；Kaitlin S.Duschene etal.，2010)。C端的芳香族氨基酸对它的抗病毒功能的发挥是必须的，而缺少N端区域氨基酸的Viperin，则无法正常起到有效的抗病毒效果，尽管这部分并不是绝对需要的(DongJiang et al.，2008)。Viperin通过N端1-42位氨基酸残基所具有的亲水性α螺旋定位到脂滴上。N端区域的α螺旋与丙肝病毒的非结构蛋白5A在脂滴上拥有相同的结合区域，并在结合机理上也非常相似，HCV非结构蛋白5A和HCV的复制复合物正是通过结合到该区域进行复制的。而Viperin便是利用这一特点竞争性地与脂滴结合，从而抑制HCV的复制(Miyanari Y et al.，2007；Ella R.Hinsona et al.，2009)。

很多囊膜病毒的感染都可以诱导Viperin的表达，如艾滋病毒、仙台病毒、埃博拉病毒、流感病毒、人巨细胞病毒、疱疹病毒、水泡性口咽病毒以及与猪瘟病毒同属于黄病毒属的丙肝病毒(Keh-Chuang Chin et al.，2001；Martina Severa et al.，2006；Pierre Boudinot et al.，2000；Karla J.Helbig et al.，2005；Dong Jiang et al.，2008；CHRISTOPHER H.WOELK et al.，2004；Yugen Zhang et al.，2007；Xiuyan Wang et al.，2007；Abdul A.Waheed1 et al.，2007)，这些事实也充分表明Viperin在宿主抵抗病毒感染的重要作用。Chin和其同事发现，稳定表达Viperin的纤维母细胞系能够非常有效得抑制人巨细胞病毒(HCMV)的感染，但通过人类巨细胞病毒(HCMV)直接诱导Viperin的表达，其复制却未受到Viperin的抑制，HCMV可以通过将Viperin从内质网重配到高尔基体上，消除Viperin的影响。(Keh-Chuang Chin et al，2001)内质网在细胞生命活动中起着至关重要的作用，包括粗面内质网和光面内质网。粗面内质网是细胞内一些主要蛋白合成、膜蛋白整合的场所；其次，光面内质网则是脂质合成的重要场所，包括了细胞内磷脂、胆固醇和几乎所有的脂膜的合成，因此，显而易见内质网是病毒和Viperin相互作用的重要场所。随后Wang等证实，Viperin是通过结合内质网上的法尼基二磷酸合成酶(FPPS)扰乱脂筏对流感病毒的出芽释放作用。FPPS作为细胞内一种重要的转运蛋白酶，在很多囊膜病毒的组装和释放中起着非常重要的作用，也具备开发相关抗病毒药物的潜力(Xiuyan Wang etal.，2007；Abdul A.Waheed1 et al.，2007)。不过水泡性口咽病毒虽然能诱导Viperin的表达，但其复制却不受到抑制(Pierre Boudinot et al.，2000)，而水泡性口咽病毒并不通过脂筏途径释放。这一有趣的事实表明，Viperin主要对利用脂筏释放的病毒有着抑制作用。当然，Viperin与病毒的作用不是独立的，它在体内与很多其他的抗病毒反应的基因一起构成一个非常密切而复杂的防御系统。有趣的是，研究发现除了病毒和干扰素外，脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)、双链RNA(poly(I-C))也能够诱导Viperin高量的表达。而最近的对丙肝病毒研究中还发现，Viperin的表达受到干扰素刺激因子3正调控，同时正调节结合区域因子1则通过与干扰素刺激因子3竞争性地结合病毒的方式抑制viperin的诱导表达。在所有的丙肝病毒患者体内，Viperin一直呈现一个比较高的表达水平，在体内它与其他的ISGs(干扰素诱导因子)相互作用抵抗HCV的感染，如干扰素刺激因子20和蛋白酶R。(Dong Jiang et al.，2008；Martina Severa et al.，2006；Karla J.Helbig etal.，2005)。

蛋白质的结构和功能是密不可分的，所以，IRG6与Viperin功能结构上的高同源性提示，其必然在功能上与Viperin上有着相似性。在感染猪瘟病毒过程中，IRG6出现的mRNA高水平的表达(Li Jun et al.，2010)，也说明IRG6与猪瘟病毒感染的密切关系。而揭开这层神秘的关系，则需要在蛋白质水平进一步分析IRG6的功能以及与猪瘟病毒的相互关系。利用IRG6潜在的抗病毒特性，通过基因工程的方法，克隆IRG6并构建稳定表达细胞系作为猪瘟病毒感染猪的机制研究的系统，有利于进一步研究猪瘟持续性感染的机理以及开发抗猪瘟的治疗药物。

发明内容：

本发明提供一种具有潜在抗病毒作用的蛋白基因和稳定表达该基因蛋白的细胞系，进行抗猪瘟病毒的基因克隆及其稳定表达细胞系的构建，用于研究猪瘟病毒感染机制，并通过揭示该蛋白基因抗猪瘟病毒的机制，开发一种治疗猪瘟的药物。

本发明的具体技术方案是：

本发明的抗猪瘟病毒的基因克隆及其稳定表达细胞系的构建包括以下的步骤：

1、基因片段的获得。

2、载体的构建。

3、稳定表达IRG6蛋白细胞系的筛选。

4、检测报告基因的表达。

以上所述的基因片段的获得，首先是采集猪瘟病毒感染猪的静脉血，用淋巴细胞分离液分离血液中的淋巴细胞，淋巴细胞分离步骤如下：

①静脉采集猪外周血10ml(加肝素作为抗凝剂)，用等量的PBS稀释。

②取四个离心管，分别加入5ml的淋巴细胞分离液，将20ml稀释的血液平均分成四份，分别沿管壁小心地注入已经加有分离液的离心管中，务必使其分层。

③2000rpm，20分钟。

④吸取离心管中分离层的第二层白色的淋巴细胞，用相同体积的的PBS稀释，2000rpm离心5分钟。

⑤弃上清，加入5ml的红细胞裂解液，充分混匀，作用5-10分钟，2000rpm，5分钟。

⑥弃上清，加入5mlPBS，吹散细胞，2000rpm，离心5分钟。

⑦弃上清，加入适量的PBS或者细胞培养液，吹散分装到小EP管中。

抽提细胞总RNA并反转录，然后根据NCBI数据库中公布的IRG6序列为模板，利用IRG6-R/F扩增出包含IRG6-ORF的IRG6-KZ大片段。

所述的载体构建是以IRG6-KZ和PCDNA-GFP质粒为模板分别设计两对含有酶切位点的引物，扩增出IRG6-E和GFP-E，并运用双酶切、T4连接酶将GFP和IRG6分别亚克隆到pCDNA3.1载体上。所述的双酶分别为核酸内切酶Hind III和Xho I。

所述的IRG6稳定表达细胞系的筛选是将构建好的真核表达质粒转染PK-15细胞，继续培养24小时后传代转染质粒的细胞，并使用终浓度为1000-1600tg/mL的G418筛选细胞，以终浓度为400-800μg/mL G418为维持筛选浓度，连续筛选约10-14天后，挑单个克隆细胞株进行扩大培养，获得IRG6蛋白与GFP稳定表达的细胞系，通过RT-PCR检测到IRG6-GFP嵌合基因。

本发明所述的编码IRG6的基因，其功能与突变的核苷酸序列相同，突变形式包括缺失、无义、插入、错义。

本发明的具体做法是从感染猪瘟病毒的广西巴马香猪(Sus scrofa domestica)外周血中分离得到淋巴细胞，通过抽提总RNA，使用PCR扩增目的基因，得到了一种潜在抗病毒基因猪炎症反应基因6(Inflammatory response gene 6protein，IRG6)。IRG6基因是由1089个碱基组成，含有完整的ORF，它的起始密码子为ATG，终止密码子为TGA。

IRG6基因编码的蛋白质是一类腺苷蛋氨酸酶，由361个氨基酸组成，和其他动物基因组中的干扰素诱导内质网相关病毒抑制蛋白(Virus inhibitory proteinendoplasmic reticulum-associated interferon-inducible，viperin)基因同源性非常高。该基因含有Viperin非常相似的作用元件，因此具备类似的抑制猪瘟病毒或者其他病毒复制的能力。

以下是本发明人对IRG6的基因进行核苷酸测序并对所得核苷酸序列进行氨基酸序列推导，列表如下：

1、源于广西巴马猪基因组的潜在抗猪瘟病毒基因IRG6

(1)序列特征：

a.长度：1089碱基对

b.类型：DNA/RNA

c.链型：双链

d.几何结构：线性

(2)分子类型：核苷酸

(3)序列描述：

ATGTGGACACTGGTACCTGTCACCTTTGCCCTCAGGCTGCTGAGCACCTTCGTGCAG

CCCCTGGGCTCGCTGGGCAGCAGCCTGGGACCCCTGTTCCTCTGGCTCTGGGCAGCT

TTCTGGCGGGCAGGGGGTGATAGGAGCCGGCAGCAGCTGCAGGGTAAAACAGAAG

CTGGGGAACCCCCGAGGGCACAGGAGGACAGCCATCTGCCCACCACCCCCACTAG

CGTCAATTACCACTTCACCCGCCAGTGCAACTACAAGTGTGGCTTCTGCTTCCACAC

GGCCAAGACATCCTTCGTGCTGCCCCTGGAGGAAGCCAAGAGAGGCTTGTGGCTGC

TGAAGGAAGCGGGTATGGAGAAGATCAACTTTTCAGGCGGAGAGCCGTTTATCCAC

GACCGGGGCGAGTACCTGGGCAAGCTGGTCAGGTTCTGCAAGGAGGAGCTACAGC

TGCCCAGTGTCAGCATCGTGAGCAACGGGAGCCTGATCTGGGAGAGGTGGTTCAAG

AGCTATGGTGAATATCTGGACATTCTTGCCATCTCCTGTGACAGCTTTGATGAGCAG

GTCAATGTCCTTATTGGCCGTGGTCAGGGAAAGAAGAACCATGTGGAAAATCTCCA

AAAACTGAGGACGTGGTGCAGGGATTATAAAGTGGCCTTCAAGATAAATTCAGTCA

TCAATCGCTTCAATGTGGAAGAAGATATGACAGAACACATCAAAGCTCTGAACCCT

GTCCGCTGGAAGGTCTTCCAATGCCTCTTAATTGAGGGTGAGAATGTTGGAGAAGA

TGCTCTGAGAGAAGCAGAGCAGTTTGTTATCAGCGACGAAGAGTTTGAGGAATTCT

TAGACCGCCACAAAGACGTGTCCTGCTTGGTGCCCGAGTCTAACCGGCAGATGAGA

GATTCCTACCTTATTCTGGATGAATATATGCGCTTCCTGAACTGTAGAAACGGGCGG

AAGGATCCATCCAAGTCCATCCTGGATGTCGGGGTAGAAAAAGCCATAAAATTCAG

TGGCTTTGATGAAAAGATGTTTCTAAAGCGAGGAGGAAAATATGTATGGAGCAAG

GCGGACCTGAAGCTGGACTGGTGA

2、IRG6基因推导的氨基酸序列

(1)序列特征：

a.长度：361氨基酸

b.类型：多肽

c.链型：单链

d.几何结构：立体

(2)分子类型：蛋白质

(3)序列描述：

MWTLVPVTFALRLLSTFVQPLGSLGS SLGPLFLWLWAAFWRAGGDRSRQQLQGKTEAGEP

PRAQEDSHLPTTPTSVNYHFTRQCNYKCGFCFHTAKTSFVLPLEEAKRGLWLLKEAGMEKI

NFSGGEPFIHDRGEYLGKLVRFCKEELQLPSVSIVSNGSLIWERWFKSYGEYLDILAISCDSF

DEQVNVLIGRGQGKKNHVENLQKLRTWCRDYKVAFKINSVINRFNVEEDMTEHIKALNPV

RWKVFQCLLIEGENVGEDALREAEQFVISDEEFEEFLDRHKDVSCLVPESNRQMRDSYLIL

DEYMRFLNCRNGRKDPSKSILDVGVEKAIKFSGFDEKMFLKRGGKYVWSKADLKLDW。

本发明的优点是：

1、从广西壮族自治区巴马具本土的香猪(Sus scrofa domestica)外周血中分离得到淋巴细胞，抽提总RNA，PCR扩增，得到了一种潜在抗病毒基因猪炎症反应基因6(Inflammatory response gene 6 protein，IRG6)，进一步分析IRG6的功能及其与猪瘟病毒的相互作用关系。利用IRG6潜在的抗病毒特性，通过基因工程的方法，克隆IRG6基因并构建稳定表达细胞系作为猪瘟病毒致病机制研究的系统，有利于进一步研究猪瘟持续性感染的机理以及开发抗猪瘟病毒的治疗药物。

2、目前关于抗病毒基因猪炎症反应基因6(Inflammatory response gene 6protein，IRG6)还没有相关的任何报道，而利用构建的稳定表达IRG6蛋白的细胞系可以进行抗病毒研究，因此本发明在抗病毒研究中具有重要学术价值和实践意义。

3、利用构建的稳定表达IRG6蛋白的细胞系进行抗病毒研究，可以分析IRG6的功能，为下一步研发带有抗猪瘟病毒基因的克隆猪“抗猪瘟克隆猪”的打下基础。抗猪瘟克隆猪意味着它们由于自身肌体“不易感”，终生无需注射任何疫苗，就能抵抗猪瘟。对作为世界上最大的猪肉生产国和消费国的中国来说，意义十分重大。在养殖生产的实际过程中，就可以减少投入、降低成本。同时，这种克隆猪对人类的健康不会有任何负面影响，而且更有益于食品的安全。

4、通过本发明的基因分析和构建稳定表达，能够进行一些囊膜病毒如艾滋病毒、仙台病毒、埃博拉病毒、流感病毒、人巨细胞病毒、疱疹病毒、水泡性口咽病毒的基因分析和构建表达，揭示这些病毒的致病机制，找出相应的抗病毒制剂，为人类服务。

具体实施方式

下面的优选例对本发明作详细叙述，但并不意味着限制本发明的范围。实施例中常规分子克隆操作参照文献(《分子克隆实验指南》第二版，金冬燕等译，1995年，科学出版社)。

本发明的实施例中所用到的材料包括：

病毒：猪瘟病毒石门株；细胞：PK-15(猪肾传代细胞系)；实验动物：广西巴马香猪。

IRG6基因的序列以Sus scrofa inflammatory response protein 6(IRG6)mRNA序列为模板(NCBI的GenBank数据库，索引号为NM_213817.1)；大肠杆菌(Escherichiacoli)株DH5α为本实验室保存；限制性内切酶、T4连接酶、PCR扩增DNA克隆载体pMD18-TVector购自TAKARA公司。质粒抽提试剂盒及凝胶DNA回收试剂盒购自天根生物公司；DNA Marker、普通Taq酶等购自东盛生物公司公司；脂质体、淋巴细胞分离液、TRIZOL购自Invitrogen公司；氯仿购自广东汕头市光华化学厂；异丙醇购自广州化学试剂二厂；无水乙醇购自广东汕头市西陇化工厂；M-MuLV Reverse Transcriptase购自Promega公司。

大肠杆菌培养基为普通的LB(蛋白胨10g、酵母粉5g、NaCl 5g，水1000ml，pH7.0)和LA液体培养基(LB液体培养基中每升加12g琼脂粉，调PH值到7.2，高压灭菌)。

实施例1基因片段的获得：

(1)淋巴细胞分离

静脉采集感染了猪瘟病毒的广西巴马香猪外周血10ml，用等量的PBS稀释。取4个离心管，分别加入5ml的淋巴细胞分离液，将20ml稀释的血液平均分成四份，分别沿管壁小心地注入已经加有淋巴细胞分离液的离心管中，务必使其分层。2000rpm，20min。小心吸取离心管中分离层的第二层白色的淋巴细胞，用等体积的PBS稀释，2000rpm离心5min。弃上清，加入5ml的红细胞裂解液，充分混匀，室温作用5-10min后，2000rpm，5min。弃上清，加入5mlPBS，吹散细胞，2000rpm，离心5min。弃上清，加入适量的PBS或者细胞培养液，吹散分装到小EP管中，每管300μl。

(2)淋巴细胞的处理：

取300μl的细胞悬液，加入600μl的Trizol，冰浴作用10min。放入-80℃保存，或者直接用于RNA的抽提。

(3)IRG6-KZ大片段的获得，设计如下一对引物：

IRG-6KZ-R：5′TGC TGC CAT GTG GAC ACT GGT AC 3′

IRG-6KZ-F：5′GGT TTC TTC TCC CAG GTA CTC ACT C 3′

抽提淋巴细胞的总RNA，并42℃反转录1小时。以反转录获得的cDNA为模板进行PCR扩增，PCR产物经1.0％琼脂糖电泳，在大约1588bp处有很亮的目的条带(如图1)，回收目的片段，PCR产物插入PMD18-T vector(TAKARA产品)。命名为IRG6-KZ。

(4)IRG6开放阅读框(ORF)基因的获得，设计如下一对引物：

p-IRG6-R：5′CC aag ctt ACC ATG GGG ACA CTG GTA CCT GTC AC-3′

p-IRG6-F：5′-CG ctc gag CCA GTC CAG CTT CAG GTC C-3′

以IRG6-KZ质粒为模板进行PCR扩增，PCR产物经1.0％琼脂糖电泳，在大约1102bp处有很亮的目的条带(如图2)，即IRG6基因，回收目的片段进行测序，得到包括完整ORF的IRG6核苷酸序列，经推导获得IRG6的氨基酸序列。PCR产物

插入PMD18-T vector(TAKARA产品)。命名为IRG6-E。

(5)GFP基因的获得，设计如下一对引物：

GFP-R：5′-CGCTCGAGACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGA-3′

GFP-F：5′GCTCTAGATTACTTGTACAGCTCGTCCAT-3′

以P-GFP质粒(本实验室构建，含有GFP基因)为模板进行PCR扩增，PCR产物经1.2％琼脂糖电泳，在大约732hp处有很亮的目的条带，即GFP基因(如图3)，回收目的片段，PCR产物插入pMD18-T vector(TAKARA产品)。命名为GFP-E。

实施例2载体的构建：

pcDNA3.1+(本实验室保存)用Xho I和Xba I双酶消化，回收酶切产物(5.4kb)。GFP-E plasmid也用Xho I和Xba I双酶消化，回收700bp左右的片段。两段回收产物用T₄DNA ligase连接。转化大肠杆菌DH5α。此载体命名为pC-GFP。pC-GFP plasmid用HindIII I和Xho I双酶消化，回收酶切产物(6kb)。IRG6 E plasmid也用IIind III和Xho I双酶消化，回收1102bp左右的片段。两段回收产物用T₄DNA ligase连接，转化大肠杆菌DH5α。此载体命名为pC-IRG6-GFP(图4)。

实施例3稳定表达IRG6蛋白细胞系的筛选：

载体p-IRG6-GFP通过脂质体转染法导入PK-15细胞，转染后24小时用胰酶消化转染细胞，按照1∶4的比例传代，在细胞贴壁后向细胞上清中添加终浓度为1000-1600μg/mL的G418进行筛选，继续培养约7天左右，期间每三天换一次液，并补适量的G418，待对照孔的细胞(未转染质粒的细胞)全部脱落后，将筛选浓度下调到400-800μg/mL，继续培养大约7天。通过荧光显微镜观察筛选目的细胞株，将表达绿色荧光的细胞团标记，添加少量胰酶消化10秒钟，小心用小滤纸片覆盖上，约10秒后取回小滤纸，用培养液洗涤数次。将洗涤液转移至新的培养板中，添加终浓度为400-800μg/ml的G418扩大培养。经过2代的扩大培养，获得IRG6蛋白与GFP稳定表达的细胞系(如图5)，通过RT-PCR检测到IRG6-GFP嵌合基因。

附图说明

图1是IRG6-KZ大片段DNA的PCR电泳图。M，DNAMarker；1，IRG6-KZ大片段DNA。

图2是IRG6-ORF DNA片段PCR电泳图。M，DNA Marker；1，IRG6-ORF DNA片段。

图3是p-IRG6-GFP Hind III/Xba I双酶切图。M，DNA Marker；1，HindII/XbaI双酶切的IRG6-GFP基因片段。

图4A是倍数物镜下的IRG6-GFP融合蛋白稳定表达的细胞。

图4B为稳定表达GFP的细胞。

图5是IRG6-GFP融合蛋白稳定表达的细胞系进行RT-PCR检测。M，DNA Marker；1，IRG6片段；2，GFP片段；3，IRG6-GFP片段。

IRG6基因推导的氨基酸序列表

 

<110>广西壮族自治区南宁市大学路100号，广西大学530004 

罗廷荣；孙石开；蔡新斌；李晓宁；苏丽娟；尹珊；李晓泉；李延生

<120>一种具有潜在抗猪瘟病毒作用的IRG6基因克隆及其稳定表达细胞系的构建

<160> 1

<170> PatentIn Version 3.3

<210> 2

<211> 368

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

 

     

Met Trp Thr Leu Val Pro Val Thr Phe Ala Leu Arg Leu Leu Ser 

1                     5                       10                        15

Thr Phe Val Gln Pro Leu Gly Ser Leu Gly Ser Ser Leu Gly Pro 

16                   20                      25                        30  

Leu Phe Leu Trp Leu Trp Ala Ala Phe Trp Arg Ala Gly Gly Asp 

31                   35                      40                        45

Arg Ser Arg Gln Gln Leu Gln Gly Lys Thr Glu Ala Gly Glu Pro 

46                   50                      55                        60

Pro Arg Ala Gln Glu Asp Ser His Leu Pro Thr Thr Pro Thr Ser 

61                   65                      70                        75 

Val Asn Tyr His Phe Thr Arg Gln Cys Asn Tyr Lys Cys Gly Phe 

76                   80                      85                        90

Cys Phe His Thr Ala Lys Thr Ser Phe Val Leu Pro Leu Glu Glu

91                   95                      100                      105  

Ala Lys Arg Gly Leu Trp Leu Leu Lys Glu Ala Gly Met Glu Lys 

106                 110                     115                      120

Ile Asn Phe Ser Gly Gly Glu Pro Phe Ile His Asp Arg Gly Glu 

121                 125                     130                     135 

Tyr Leu Gly Lys Leu Val Arg Phe Cys Lys Glu Glu Leu Gln Leu 

136                 140                     145                       150

Pro Ser Val Ser Ile Val Ser Asn Gly Ser Leu Ile Trp Glu Arg 

151                  155                     160                  165

Trp Phe Lys Ser Tyr Gly Glu Tyr Leu Asp Ile Leu Ala Ile Ser 

166                  170                     175                   180

Cys Asp Ser Phe Asp Glu Gln Val Asn Val Leu Ile Gly Arg Gly 

181                  185                     190                     195

Gln Gly Lys Lys Asn His Val Glu Asn Leu Gln Lys Leu Arg Thr

196                  200                     205                      210

Trp Cys Arg Asp Tyr Lys Val Ala Phe Lys Ile Asn Ser Val Ile 

211                  215                     220                   225

Asn Arg Phe Asn Val Glu Glu Asp Met Thr Glu His Ile Lys Ala 

226                  230                     235                     240

Leu Asn Pro Val Arg Trp Lys Val Phe Gln Cys Leu Leu Ile Glu 

241                  245                     250                     255

Gly Glu Asn Val Gly Glu Asp Ala Leu Arg Glu Ala Glu Gln Phe 

251                  260                     265                     270

Val Ile Ser Asp Glu Glu Phe Glu Glu Phe Leu Asp Arg His Lys 

271                  275                     280                     285

Asp Val Ser Cys Leu Val Pro Glu Ser Asn Arg Gln Met Arg Asp 

286                  290                     295                     300

Ser Tyr Leu Ile Leu Asp Glu Tyr Met Arg Phe Leu Asn Cys Arg 

301                  305                     310                     315  

Asn Gly Arg Lys Asp Pro Ser Lys Ser Ile Leu Asp Val Gly Val 

316                  320                     325                    330

Glu Lys Ala Ile Lys Phe Ser Gly Phe Asp Glu Lys Met Phe Leu

331                 335                      340                    345

Lys Arg Gly Gly Lys Tyr Val Trp Ser Lys Ala Asp Leu Lys Leu 

350                 355                      360                    365

Asp Trp ter                                                

366        

 

 

 

 

IRG6基因核苷酸序列表

 

<110>广西壮族自治区南宁市大学路100号，广西大学530004 

罗廷荣；孙石开；蔡新斌；李晓宁；苏丽娟；尹珊；李晓泉；李延生

<120>一种具有潜在抗猪瘟病毒作用的IRG6基因克隆及其稳定表达细胞系的构建

<160> 1

<170> PatentIn Version 3.3

<210> 2

<211> 1089

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

 

A T G T G G A C A C T G G T A C C T G T

C A C C T T T G C C C T C A G G C T G C

T G A G C A C C T T C G T G C A G C C C

C T G G G C T C G C T G G G C A G C A G

C C T G G G A C C C C T G T T C C T C T

G G C T C T G G G C A G C T T T C T G G

C G G G C A G G G G G T G A T A G G A G

C C G G C A G C A G C T G C A G G G T A

A A A C A G A A G C T G G G G A A C C C

C C G A G G G C A C A G G A G G A C A G

C C A T C T G C C C A C C A C C C C C A

C T A G C G T C A A T T A C C A C T T C

A C C C G C C A G T G C A A C T A C A A

G T G T G G C T T C T G C T T C C A C A

C G G C C A A G A C A T C C T T C G T G

C T G C C C C T G G A G G A A G C C A A

G A G A G G C T T G T G G C T G C T G A

A G G A A G C G G G T A T G G A G A A G

A T C A A C T T T T C A G G C G G A G A

G C C G T T T A T C C A C G A C C G G G

G C G A G T A C C T G G G C A A G C T G

G T C A G G T T C T G C A A G G A G G A

G C T A C A G C T G C C C A G T G T C A

G C A T C G T G A G C A A C G G G A G C

C T G A T C T G G G A G A G G T G G T T

C A A G A G C T A T G G T G A A T A T C

T G G A C A T T C T T G C C A T C T C C

T G T G A C A G C T T T G A T G A G C A

G G T C A A T G T C C T T A T T G G C C

G T G G T C A G G G A A A G A A G A A C

C A T G T G G A A A A T C T C C A A A A

A C T G A G G A C G T G G T G C A G G G

A T T A T A A A G T G G C C T T C A A G

A T A A A T T C A G T C A T C A A T C G

C T T C A A T G T G G A A G A A G A T A

T G A C A G A A C A C A T C A A A G C T

C T G A A C C C T G T C C G C T G G A A

G G T C T T C C A A T G C C T C T T A A

T T G A G G G T G A G A A T G T T G G A

G A A G A T G C T C T G A G A G A A G C

A G A G C A G T T T G T T A T C A G C G

A C G A A G A G T T T G A G G A A T T C

T T A G A C C G C C A C A A A G A C G T

G T C C T G C T T G G T G C C C G A G T

C T A A C C G G C A G A T G A G A G A T

T C C T A C C T T A T T C T G G A T G A

A T A T A T G C G C T T C C T G A A C T

G T A G A A A C G G G C G G A A G G A T

C C A T C C A A G T C C A T C C T G G A

T G T C G G G G T A G A A A A A G C C A

T A A A A T T C A G T G G C T T T G A T

G A A A A G A T G T T T C T A A A G C G

A G G A G G A A A A T A T G T A T G G A

G C A A G G C G G A C C T G A A G C T G

G A C T G G T G A

 

 

 

Claims (3)

1.一种抗猪瘟病毒的IRG6基因克隆及其稳定表达细胞系的构建，其特征在于：包括以下的步骤：

（1）基因片段的获得；（2）载体的构建；（3）稳定表达IRG6蛋白细胞系的筛选；（4）检测报告基因的表达；

所述的基因片段的获得，首先是采集猪瘟病毒感染猪的静脉血，用淋巴细胞分离液分离血液中的淋巴细胞，抽提细胞总RNA并反转录，然后根据NCBI数据库中公布的IRG6序列为模板，扩增出包含IRG6开放阅读框ORF的IRG6-KZ大片段；

所述的载体构建是以IRG6-KZ和PCDNA-GFP质粒为模板分别设计两对含有酶切位点的引物，扩增出IRG6-E和GFP-E，并运用双酶切、T4连接酶将GFP和IRG6分别亚克隆到PCDNA3.1载体上；所述的双酶分别为核酸内切酶Hind Ⅲ和XhoⅠ；

所述的IRG6稳定表达细胞系的筛选是将构建好的真核表达质粒转染PK-15细胞，继续培养转染质粒的细胞24小时后进行细胞传代，并使用终浓度为1000-1600 μg/ml的G418筛选，以终浓度为400-800 μg/ml G418为维持筛选浓度，连续筛选14天后，挑单个克隆细胞株进行扩大培养，获得IRG6蛋白与GFP稳定表达的细胞系，通过RT-PCR检测到IRG6-GFP嵌合基因。

2.根据权利要求1所述的抗猪瘟病毒的IRG6基因克隆及其稳定表达细胞系的构建，其特征在于：淋巴细胞分离是静脉采集感染了猪瘟病毒的广西巴马香猪外周血10 ml，用等量的PBS稀释，取4个离心管，分别加入5 ml的淋巴细胞分离液，将20 ml稀释的血液平均分成四份，分别沿管壁小心地注入已经加有淋巴细胞分离液的离心管中，使其分层，2000 rpm，20 min，小心吸取离心管中分离层的第二层白色的淋巴细胞，用等体积的PBS稀释，2000 rpm离心5 min，弃上清，加入5 ml的红细胞裂解液，充分混匀，室温作用5-10 min后，2000 rpm，5 min，弃上清液，加入5 ml PBS，吹散细胞，2000 rpm，离心5 min，弃上清液，加入适量的PBS或者细胞培养液，吹散分装到小EP管中，得细胞悬液；然后取300 μl的细胞悬液，加入600 μl的Trizol,冰浴作用10 min，放入-80℃保存，或者直接用于RNA的抽提。

3.如权利要求1所述的抗猪瘟病毒的IRG6基因克隆及其稳定表达细胞系的构建，其特征在于：猪的抗猪瘟病毒基因猪炎症反应基因6蛋白（Inflammatory response gene 6 protein，IRG6）基因，其核苷酸和蛋白质序列如下：

（1）  核苷酸序列为：

ATGTGGACACTGGTACCTGTCACCTTTGCCCTCAGGCTGCTGAGCACCTTCGTGCAGCCCCTGGGCTCGCTGGGCAGCAGCCTGGGACCCCTGTTCCTCTGGCTCTGGGCAGCTTTCTGGCGGGCAGGGGGTGATAGGAGCCGGCAGCAGCTGCAGGGTAAAACAGAAGCTGGGGAACCCCCGAGGGCACAGGAGGACAGCCATCTGCCCACCACCCCCACTAGCGTCAATTACCACTTCACCCGCCAGTGCAACTACAAGTGTGGCTTCTGCTTCCACACGGCCAAGACATCCTTCGTGCTGCCCCTGGAGGAAGCCAAGAGAGGCTTGTGGCTGCTGAAGGAAGCGGGTATGGAGAAGATCAACTTTTCAGGCGGAGAGCCGTTTATCCACGACCGGGGCGAGTACCTGGGCAAGCTGGTCAGGTTCTGCAAGGAGGAGCTACAGCTGCCCAGTGTCAGCATCGTGAGCAACGGGAGCCTGATCTGGGAGAGGTGGTTCAAGAGCTATGGTGAATATCTGGACATTCTTGCCATCTCCTGTGACAGCTTTGATGAGCAGGTCAATGTCCTTATTGGCCGTGGTCAGGGAAAGAAGAACCATGTGGAAAATCTCCAAAAACTGAGGACGTGGTGCAGGGATTATAAAGTGGCCTTCAAGATAAATTCAGTCATCAATCGCTTCAATGTGGAAGAAGATATGACAGAACACATCAAAGCTCTGAACCCTGTCCGCTGGAAGGTCTTCCAATGCCTCTTAATTGAGGGTGAGAATGTTGGAGAAGATGCTCTGAGAGAAGCAGAGCAGTTTGTTATCAGCGACGAAGAGTTTGAGGAATTCTTAGACCGCCACAAAGACGTGTCCTGCTTGGTGCCCGAGTCTAACCGGCAGATGAGAGATTCCTACCTTATTCTGGATGAATATATGCGCTTCCTGAACTGTAGAAACGGGCGGAAGGATCCATCCAAGTCCATCCTGGATGTCGGGGTAGAAAAAGCCATAAAATTCAGTGGCTTTGATGAAAAGATGTTTCTAAAGCGAGGAGGAAAATATGTATGGAGCAAGGCGGACCTGAAGCTGGACTGGTGA；

（2）  蛋白质序列：

MWTLVPVTFALRLLSTFVQPLGSLGSSLGPLFLWLWAAFWRAGGDRSRQQLQGKTEAGEPPRAQEDSHLPTTPTSVNYHFTRQCNYKCGFCFHTAKTSFVLPLEEAKRGLWLLKEAGMEKINFSGGEPFIHDRGEYLGKLVRFCKEELQLPSVSIVSNGSLIWERWFKSYGEYLDILAISCDSFDEQVNVLIGRGQGKKNHVENLQKLRTWCRDYKVAFKINSVINRFNVEEDMTEHIKALNPVRWKVFQCLLIEGENVGEDALREAEQFVISDEEFEEFLDRHKDVSCLVPESNRQMRDSYLILDEYMRFLNCRNGRKDPSKSILDVGVEKAIKFSGFDEKMFLKRGGKYVWSKADLKLDW。