CN103484497A - 利用家兔乳腺反应器平台生产重组人第七凝血因子的方法 - Google Patents

Abstract

发明提供了利用家兔乳腺反应器平台生产重组人第七凝血因子的方法，将重组人第七凝血因子的cDNA导入或整合至家兔的染色体基因中，获得的转基因兔在乳腺反应器内表达重组人第七凝血因子蛋白。转基因兔在乳腺反应器具有较高的重组人第七凝血因子蛋白表达水平、并且蛋白活性好，进而降低生产成本。

Description

利用家兔乳腺反应器平台生产重组人第七凝血因子的方法

技术领域

本发明属于非人哺乳动物制备重组蛋白药物领域，具体涉及利用家兔乳腺反应器平台生产重组人第七凝血因子的方法。 

背景技术

血友病是人类最常见的一种出血性疾病，具有终身性，反复性和致命性，约每5000-10000个男性中就有一个是血友病患者。血友病是由于血液中某些功能性凝血因子的缺失而造成的，其最有效的治疗方法是直接注射凝血因子进行治疗。现在最常见的治疗用凝血因子为第八、九凝血因子，然而，经过频繁的外源性凝血因子八、九的治疗后，病人体内产生了对这些凝血因子的抗性，或产生了中和性的抗体，从而增加对凝血因子治疗的风险，导致病人的关节变形，肌肉萎缩，假瘤和过早死亡。 

第七凝血因子rhF Ⅶ是治疗因第八，第九凝血因子rhFⅧ、rhFⅨ产生抗性的遗传性血友病患者的首选替代药物。它也可广泛用于治疗创伤性出血，如车祸创伤、手术性出血、颅内出血，如脑溢血等常见的血液疾病，其临床研究显示出强大的潜力。目前市场上的第七凝血因子的重组蛋白产品使用仓鼠幼体肾脏细胞（CHO）的培养系统进行蛋白表达， 蛋白表达水平低，导致生产成本极高。有鉴于此，有必要提供一种高效制备重组人第七凝血因子的方法。 

发明内容

　针对上述问题，本发明提供了利用家兔乳腺反应器平台生产重组人第七凝血因子的方法，其具有较高的蛋白表达水平，进而降低生产成本。 

　其技术方案是这样的，利用家兔乳腺反应器平台生产重组人第七凝血因子的方法，其特征在于：将重组人第七凝血因子的cDNA导入或整合至家兔的染色体基因中，获得的转基因兔在乳腺反应器内表达重组人第七凝血因子；其包括以下步骤：⑴将外接信号基因的重组人第七凝血因子的cDNA（rhFⅦ cDNA）插入表达载体中形成第七凝血因子的乳腺表达载体（pBC1- rhFⅦ），所述表达载体包括调控元件；⑵将乳腺表达载体导入或者整合到家兔的染色体基因中，获得转基因兔；⑶获得的转基因兔的当代或者后代母兔在泌乳期的乳汁中产生重组人第七凝血因子。 

　其进一步特征在于： 

     所述表达载体为pBC1质粒载体；

     所述调控元件包括鸡β球蛋白绝缘子，山羊β-酪蛋白启动子，TATA盒，β-酪蛋白外显子1，β-酪蛋白内含子1，β-酪蛋白外显子2，β-酪蛋白外显子7，8，9,β-酪蛋白内含子7，8，β-酪蛋白基因组片段；

      所述重组人第七凝血因子的cDNA 在限制性内切酶Xho I多克隆位点插入pBC1质粒载体，所述限制性内切酶Xho I多克隆位点位于β-酪蛋白外显子2和β-酪蛋白外显子7，8，9之间；

      其更进一步特征在于：

      将乳腺表达载体导入或者整合到家兔的染色体基因之前，利用Sal I与Not I的限性内切酶释放细菌质粒部分，形成乳腺表达构件，所述乳腺表达构件包括所述调控元件和rhFⅦ cDNA；

      步骤⑵中将乳腺表达载体导入或者整合到家兔的染色体基因并获得转基因兔的具体操作为：首先，利用Sal I与Not I的限性内切酶释放细菌质粒部分，形成所述乳腺表达构件；其次，将所述乳腺表达构件通过显微注射直接注入家兔受精卵中；然后，将家兔受精卵放入FBS M199培养液、并在38.5℃、5％CO₂的培养箱中培养；最后，将家兔胚胎移植到受体家兔的输卵管中，经过妊娠，获得转基因兔；

      步骤⑵中将乳腺表达载体导入或者整合到家兔的染色体基因并获得转基因兔的具体操作为：首先，利用Sal I与Not I的限性内切酶释放细菌质粒部分，形成所述乳腺表达构件；其次，将所述乳腺表达构件转染至家兔供体细胞中，然后，将经过乳腺表达构件转染的阳性细胞核通过显微操作移到去除染色体遗传物质的卵母细胞的细胞质中，构成克隆胚胎；最后，将发育的克隆胚胎进行胚胎移植，到同步发情的受体兔中妊娠，获得转基因兔；

所述重组人第七凝血因子cDNA为人全序列第七凝血因子cDNA；

所述外接信号基因为β-酪蛋白信号肽和hFⅦ原有的分泌信号肽；

      所述泌乳期包括人工诱导泌乳期和自然分泌的泌乳期；

所述泌乳期包括泌乳前期、泌乳中期和泌乳后期。

采用本发明的方法后，其有益效果在于：家兔作为转基因药物生产的载体，其优点是可以方便地进行GMP工厂的生产，转基因兔能够在高度清洁（SPF级）的环境中培育，具有培育周期短，效益好，安全性强，成本低等优势，同时，转基因兔乳汁中第七凝血因子蛋白表达量高、活性好，使得使第七凝血因子的价格降低30-50%，可实现该产品的国产化；pBC1质粒载体更加适用于构建乳腺表达载体；调控元件的设置能实现rhFⅦ cDNA在转基因兔体内表达，并优化表达效果；外接的β-酪蛋白信号肽能使rhFⅦ cDNA选择性的在乳汁中表达；乳腺表达载体在显微注射直接注入家兔受精卵之前，利用Sal I与Not I的限性内切酶释放细菌质粒部分，可消除细菌DNA对rhFⅦ cDNA表达的干扰；泌乳期包括人工诱导泌乳期和自然分泌的泌乳期，同时，泌乳期包括泌乳前期、泌乳中期和泌乳后期，转基因家兔的整个泌乳期阶段都具有分泌rhFⅦ的能力，蛋白表达量高，并且通过对泌乳期的人工诱导以及自然选择，能进一步提高转基因兔的rhFⅦ蛋白的表达量；采用显微注射乳腺表达构建进入家兔受精卵的方式获得转基因兔，具有较高的转基因率。 

附图说明

图1为人重组第七凝血因子rhFⅦ cDNA基因的结构图；其中，引物pBC1hFⅦ-f/pBC1hFⅦ-r和pBC1hFⅦ-f2/pBC1hFⅦ-r，S为外接信号基因。 

图2 PCR方法扩增人重组第七凝血因子rhFⅦ cDNA产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果；其中，M: 1 kb DNA ladder，rhFⅦ cDNA为1.4kb。 

图3为人重组第七凝血因子乳腺表达载体pBC1-rhFⅦ的基因结构图；其中，鸡β球蛋白绝缘子（Chicken beta-globin insulator），山羊β-酪蛋白启动子（Goat beta-casein promoter），TATA盒（TATA box），β-酪蛋白外显子1（beta-casein exon 1），β-酪蛋白内含子1（beta-casein intron 1）， β-酪蛋白外显子2（beta-casein exon 2）， 重组人第七凝血因子cDNA（hFⅦss），β-酪蛋白外显子7，8，9 （beta-casein exon 7，8，9），β-酪蛋白内含子7，8（beta-casein intron 7，8），β-酪蛋白基因组片段（beta-casein 3′-genomic fragment），质粒DNA的细菌起始片段（EcolE1），氨苄抗性基因启动子Amp prom，氨苄抗性基因AmpR， SalI、Not I、XhoI为酶切位点。 

图4为人重组第七凝血因子hFⅦ cDNA感染Zero Blunt TOPO 细菌的阳性克隆筛选。 

图5为人重组第七凝血因子乳腺表达载体pBC1-rhFⅦ转化大肠杆菌 DH5α的阳性克隆筛选。 

图6为 pBC1-rhFⅦ表达载体酶切片段的电泳检测结果。 

图7为pBC1-rhFⅦ基因构件转染乳腺上皮细胞MCFⅦ 的RT-PCR检测结果；其中，+RT表示有反转录酶反应后（RT）的PCR反应，-RT表示没有反转录酶反应后（RT）的PCR反应，作为RT的对照组。313 bp的RT-PCR的产物表明扩增的DNA是从mRNA中反转录成cDNA产生的，即pBC1-rhFⅦ的mRNA表达。 

图8为乳腺上皮细胞MCFⅦ中第七凝血因子的Western blot检测结果；其中，Day 3 Non-transfected control为经过3天培养的未转染pBC1-rhFⅦ基因的阴性乳腺上皮细胞MCFⅦ的蛋白检测泳道，Day 3 transfected medium经过3天培养的转染pBC1-rhFⅦ基因的阳性乳腺上皮细胞MCFⅦ的蛋白检测泳道。 

图9为显微操作-转基因兔卵基因注射。 

图10为七个转基因兔的兔耳组织DNA的Southern blot检测结果；其中，cDNA是pBC1-rhFⅦ阳性对照，A449是正常兔阴性对照，H₂O是水阴性对照，1-7是检测的7个转基因阳性兔的DNA。 

图11A为转基因兔的兔奶中重组人第七凝血因子蛋白的Western Blot 检测结果；其中，一抗：小鼠抗人FⅦ，二抗：羊抗鼠。 

图11B为图11 A的对照实验检测结果；其中，单抗：羊抗鼠。 

具体实施方式

实施例1 

     ⑴第七凝血因子乳腺表达载体的制备：

a、第七凝血因子rhFⅦ cDNA扩增：重组第七凝血因子rhFⅦ cDNA结构如图1所示，包括轻链（light chain）和重链（heavy chain），轻链的端部外接有信号肽S，信号肽S包括第七凝血因子hFⅦ原有的分泌信号肽（19个氨基酸多肽）与β-酪蛋白信号肽（19个氨基酸多肽），同时，rhFⅦ cDNA外接bGH ployA（图中未示出），bGH ployA，可增加蛋白质翻译水平，优化表达效果。从人cDNA文库中扩增出hFⅦ的片段，准备两组引物，一组是pBC1hFⅦ-f/pBC1hFⅦ-r，另一组是pBC1hFⅦ-f2/pBC1hFⅦ-r。图1所示箭头为PCR引物的扩增方向，从pBC1hFⅦ-f/pBC1hFⅦ-r扩增的片段，包括hFⅦ原有的分泌信号肽（19个氨基酸多肽）与β-酪蛋白信号肽（19个氨基酸多肽），从pBC1hFⅦ-f2/pBC1hFⅦ-r的扩增片段包含有hFⅦ原有的分泌信号肽（19个氨基酸多肽）。

引物的碱基序列为： 

pBC1hFⅦ-f：aactcgagatggtgatgaaggtcctcatccttgcctgtctggtggctctggccattgcaagagagatggtctcccaggccct

pBC1hFⅦ-f2：aactcgaggccgccaccatggtgatggtctcccaggccct

pBC1hFⅦ-r：aactcgagctagggaaatggggctcgcaggagga

      引物pBC1hFⅦ-f/pBC1hFⅦ-r和pBC1hFⅦ-f2/pBC1hFⅦ-r是根据pBC1和hFⅦ核苷酸序列设计并人工合成的。

　使用引物pBC1hFⅦ-f/pBC1hFⅦ-r经过PCR可以扩增出1.4kb的rhFⅦ cDNA，如图2所示，M为 1 kb DNA  ladder(1 kb DNA阶梯对照，来源：NEB, Cat. N3232S)。 

　将人工合成的hFⅦ cDNA的1.4 kb的片段感染到Zero Blunt TOPO 细菌的感受态细胞中（来源Invitrogen，Cat:K2800 20），将细菌克隆抽提质粒DNA，并电泳测定，测得结果如图4所示，其中的克隆#17, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28为Zero Blunt TOPO vector (3.5kb)的部分 ，为阴性细菌克隆；#1, 14, 15, 16, 18, 具备Zero Blunt TOPO vector + 插入的rhFⅦ 片段 (3.5 kb +1.4kb = 4.9kb) ，为阳性细菌克隆。 

　b、pBC1-rhFⅦ乳腺表达载体的制备、扩增及筛选。 

　pBC1-rhFⅦ表达载体的结构如图3所示，pBC1质粒(来源，Invitrogen商用质粒)连接鸡β球蛋白绝缘子、山羊β-酪蛋白启动子、TATA盒、β-酪蛋白外显子1、β-酪蛋白内含子1、β-酪蛋白外显子2，在质粒载体的限制性内切酶Xho I多克隆位点插入外接信号基因的rhFⅦ cDNA，再连接-酪蛋白外显子7、8、9，β-酪蛋白内含子7、8，在3′端加载β-酪蛋白基因组片段，形成第七凝血因子的乳腺表达载体pBC1- rhFⅦ，基因序列长23020 bp。pBC1质粒DNA还包含细菌（EolE1）起始片段，氨苄抗性基因AmpR启动子以及氨苄抗性基因AmpR。 

　其中，鸡β球蛋白绝缘子，山羊β-酪蛋白启动子，TATA盒，β-酪蛋白外显子1，β-酪蛋白内含子1，β-酪蛋白外显子2，β-酪蛋白外显子7、8、9，β-酪蛋白内含子7、8，β-酪蛋白基因组片段为乳腺表达构件的调控元件，实现rhFⅦ cDNA在家兔体内表达，并优化表达效果。 

将上述步骤a中含rhFⅦ cDNA的克隆#14和pBC1经过Xho I酶切后，进行酶连接，在pBC1质粒载体的限制性内切酶Xho I多克隆位点插入rhFⅦ cDNA,进而形成pBC1-rhFⅦ乳腺表达载体；其中，克隆克隆#14酶切后释放1.4kb片段，即rhFⅦ cDNA。 

使用M13正向引物 (M13 Forward (-20)) 和M13反向引物 (M13 reverse)（来源 Invitrogen商用引物）对克隆#14经Xho I酶酶切后得到的1.4kb片段进行DNA序列分析， 1.4kb片段的DNA序列（SEQ ID No.2）为人全序列第七凝血因子cDNA，其推断出的氨基酸序列（SEQ ID No.3），与天然的hFⅦ蛋白的氨基酸序列100%匹配。 

引物的碱基序列为： 

      M13 Forward (-20): gtaaaacgacggcaag

      M13 reverse: caggaaacagctatgac

上述pBC1-rhFⅦ乳腺表达载体转化基因文库效率DH5α competence 细菌(来源Invitrogen, cat:18263-012)，或者One Shot TOP10 化学性 Competent E. coli (来源Invitrogen, cat: 4040-03), 获得受体菌增殖，以实现pBC1-rhFⅦ的扩增。

获得的细菌克隆采用PCR方法筛选出阳性的克隆。使用在hFⅦ 的3′末端前行引物与载体序列在10070-10045 （313 bp PCR产物）进行PCR扩增。由正向引物为hu7A-5f位于第七因子cDNA的末端 ：5′-atgttctgtgccggctactc-3′(9758-9777) 和反向引物pBC1-sr（pBC1-sr与hu7A-5f配对）位于β-酪蛋白内含子7： 

5′-CATCAGAAGTTAAACAGCACAGTTAG-3′（10070-10045），PCR产物为313 bp。筛选结果如图5所示，从筛选的132个克隆中，细菌克隆#64-79，81-83, 86-96 为阴性，只有克隆#84和85为阳性，其中，M为100 bp DNA ladder（来源：NEB, Cat. N0467S）。克隆#84的基因序列分析（SEQ ID No.1），pBC1-rhFⅦ 线性DNA的总长为23020bp，重组人第七凝血因子基因的ATG起始密码子在8666位点处，TGA终止密码子在10000位点处。

引物pBC1-sr/hu7A-5f是根据pBC1和hFⅦ核苷酸序列设计并人工合成的。 

⑵pBC1-rhFⅦ乳腺表达载体在乳腺上皮细胞内的表达 

    将全长 pBC1-rhFⅦ乳腺表达载体（23020bp）通过电转染的方法感染乳腺上皮细胞MCFⅦ，三天后收集细胞与培养液，检测细胞中表达的mRNA与培养液中rhFⅦ 蛋白质的表达情况。采用RT-PCR的检测方法，使用引物对进行PCR的扩增。使用由正向引物为hu7A-5f和反向引物pBC1-sr（与hu7A-5f配对）进行扩增，PCR产物为313 bp。检测结果如图7所示， pBC1-rhFⅦ cDNA作为阳性的对照，未转染的细胞作为细胞的阴性对照， +RT表示有反转录酶反应后（RT）的PCR反应，-RT表示没有反转录酶反应后（RT）的PCR反应，在感染的细胞中检测到预期的313 bp的RT-PCR产物，从而证实转入的pBC1-rhFⅦ基因在MCFⅦ的细胞中得到了表达。

MCR-7细胞中的重组第七凝血因子的蛋白表达检测是采用常规的Western Blot完成的。第一抗体是兔抗人第七凝血因子的抗体 （来源Renova，1：500稀释），第二抗体是羊抗兔的抗体（来源Abcam,  ab6846,  1:500稀释）。检测结果如图8所示，50 kDa的表达蛋白在转染的MCFⅦ细胞培养液中显示，其余的着色带型是非特异性的蛋白，确定了经过三天培养的转染的细胞分泌了微量的第七凝血因子。 

由此证明，乳腺表达载体在乳腺中能够表达，即外源rhFⅦ cDNA能够在乳腺中表达。 

⑶转基因兔的培育 

a、pBC1-rhFⅦ乳腺表达载体的处理：利用SalI限制性内切酶可以将环状DNA切成线性的DNA （23020 bp）；利用XhoI限性内切酶可释放21.6 kb的乳腺表达载体和 1.4kb的rhFⅦ cDNA片段。利用Sal I和Not I限性内切酶可以释放5.9 kb的细菌质粒部分 与17.1 kb的线性DNA，其中，17.1 kb线性DNA为表达构件、包含调控元件和插入的rhFⅦ cDNA。该表达构件可以用于显微注射到家兔（兰诺生物技术无锡有限公司自繁的兔群）的受精卵，培育第七凝血因子转基因兔的种子，上述酶切片段如图6所示。

b、原核期胚胎显微注射、培育转基因兔： 

运用显微注射的方法将含rhFⅦ基因的表达构件（17.1kb），注射到家兔受精卵的原核中，经过短期体外培养后，成活的胚胎将被移植到受体的输卵管中，经过约31天的妊娠，获得基因注射兔。

性成熟（6月龄以上）的家兔将进行超数排卵处理，连续三天，每天两次按剂量递增的方式（3，3；4，4 和5，5mg）实施颈皮下注射FSH（促滤泡激素），FSH处理完毕后，超排母兔与公兔交配两次，并注射100IU hCG/供体（IU 国际单位，hCG人绒毛促性腺激素）。hCG处理后18-20h，从供体兔的输卵管中冲洗出受精卵。受精卵经15000g的条件离心7-8分钟，充分显示雄性与雌性原核，如图9中A、C所示。整个显微注射的过程见图9，在明显确立了原核膨胀后，如图9中B和D所示，注射过的卵子移入10％ FBS M199培养液中在38.5°C，5％CO₂培养箱中短暂培养，以检查注射胚胎的成活率和分裂的状况。约15-20枚注射胚胎将被移植到经过同期发情处理的受体母兔的输卵管中。结果显示，妊娠率为50％（n=16），在怀孕的母兔中，大约7.5% 的注射卵子会发育成出生幼体，2-8只幼兔在怀孕母兔中诞生，共出生8个阳性的第七凝血因子转基因兔，总转基因效率为24.2%（表1， n=33）。表1为重组人第七凝血因子转基因兔制作效率。 

   表1 

⑷转基因兔的鉴定与分泌蛋白的检测

      a、转基因兔的鉴定：从直径0.5 cm的耳组织中提取DNA，采用常规的PCR以及Southern blot方法，鉴定外源性pBC1-rhFⅦ基因在转基因兔的基因组内的整合情况。使用在位点8554-8580 的前行引物，与反向引物进行PCR扩增（589 bp PCR产物），引物为pBC1-sf位于 beta-casien 外显子2：5′-GATTGACAAGTAATACGCTGTTTCCTC-3′（8554-8580）；hu7A-4r (与 pBC1-sf配对) 位于第七因子cDNA的前端，5′-CAGCAGAGAGTACCCCTCGT-3′(9142-9123)， PCR产物为589 bp。其检测结果如图10所示，cDNA是pBC1-rhFⅦ阳性对照，A449是正常兔阴性对照，H₂O是水阴性对照，1-7是检测的7个转基因阳性兔我们获得33个经过胚胎移植的仔兔，成活7转基因原代兔，4公兔，3母兔，pBC1-rhFⅦ基因的活仔整合率为21.2％。

      b、转基因兔乳汁中rhFⅦ表达检测：采用Western blot印迹法对转基因兔的乳汁进行检测。24微升的兔乳样本，96微升的PBS，与 40微升4X上样缓冲液混合，在95 oC 加热6分钟，10微升的样本加入10% SDS-PAGE电泳胶的泳道。第一抗体是小鼠抗人第七因子抗体（MAH），Sigma, F8146，以 1：1250稀释。第二抗体是羊抗鼠的抗体 （GAM），Abcam, ab6821, 1：500稀释。检测结果如图11A所示，Ladder: 蛋白分子量标记； 泳道1：转基因兔A483-2兔奶，取自自然泌乳期前期；泳道 2：转基因兔B045-2兔奶，取自人工诱导泌乳期后期；泳道 3：转基因兔A480-2兔奶，取自人工诱导泌乳期前期；泳道 4：转基因兔B007-2兔奶，取自自然泌乳期中期；泳道 5：阴性兔奶对照。图11A为经过一抗—小鼠抗人FⅦ，以及二抗—羊抗鼠的Western Blot 印迹反应，图11B为羊抗鼠抗体的单独反应，作为Western Blot的对照。检测结果显示，rhFⅦ 蛋白在转基因兔 A483-2, B045-2, A480-2, B007-2的乳汁中都显示高表达，兔奶中检测出1.0-1.5 mg/mL的rhFⅦ表达量；并且人工诱导泌乳期、自然泌乳期整个泌乳阶段都分泌rhFⅦ。 

c、转基因兔乳中rhFⅦ的提取与蛋白翻译后修饰（PTM）检测： 

采集好的转基因兔奶将采用离心和超微过滤的方法提取净化的rhFⅦ。净化的兔奶经过羟基磷灰石色谱(hydroxyapatic chromatography,HA)处理，其洗脱液经切向流式过滤(tangential flow filtration，TFF)以除去小分子蛋白。TFF洗脱液经过三种阴离子交换色谱 (anion exchange chromatography，Q Sepharose Fast Flow，QSFF)，用高钙，低钙和高钠缓冲液，连续洗脱。在该洗脱过程中，单链非活化的FⅦ，50 kDa单链，变成完全激活的FⅦa，具有30  kDa的重链，与20 kDa的轻链。提取物将继续病毒过滤。其所产生的蛋白纯度为约99％，可以保证其结构分析和药代动力学的研究。所有的产品将在安装有RPUptisphere 10 WC4-25QS柱（Interchim）的AKTA 纯化系统(Amersham-Biosciences)中进行除盐处理，去除可能干扰分析的盐份，得到99.99％纯度的rhFⅦ。

用ELASA生化法检测转基因母兔乳汁分泌并且提纯的rhFⅦ，丹麦诺和诺得公司的诺奇作为阳性对照，诺奇为重组第七凝血因子蛋白产品，检测乳汁中rhFⅦ的γ-羧基化，β-羟基化，以及 N-和O-连接的糖基化，所有检测的结果如表2所示，兔的蛋白生产系统具有复杂的蛋白修饰功能。 

γ 羧基化的检测：使用液相色谱 (liquid chromatography) 耦联电离喷雾质谱 (ionization electrospray mass spectrometry)（LC-ESIMS）研究转基因兔奶中rhFⅦ的γ-羧基化程度。其中，rhFⅦ为经ASP-N和胰蛋白酶消化后的多肽。检测过程为：蛋白样品经脱盐，干燥后，将在8M尿素中变性；这种蛋白质经胰蛋白酶消化，会在精氨酸和赖氨酸残基断裂，或经ASP-N处理后，在天冬氨酸残基断裂；将消化的蛋白加载LC-ESIMS系统中（Uptisphere UP5WOD25QK柱（Interchim）Qq-TOF质谱仪（Applied Biosystems）上进行分析。 

β-羟基化的检测：利用LC-ESIMS的方法检测经过胰蛋白酶消化的转基因兔奶中的rhFⅦ的β-羟基化过程。 

O-糖基化的检测：利用LC-ESIMS法检测经胰蛋白酶消化的的转基因兔奶中的rhFⅦ样本的葡萄糖和岩藻糖的分布情况。 

 N-连接的糖基化的检测：由于血浆来源的rhFⅦ N -连接的糖基化位点，所以rhFⅦ会形成复杂的结构。脱盐和干燥后的样品经变性后，将经过高效毛细管电泳-激光诱导荧光法（High-performance capillary electrophoresis-laser induced flurorescence，HPCE-LIF），分析其N-连接的糖基化变化。表2为乳汁中rhFⅦ的γ-羧基化，β-羟基化，以及 N-和O-连接的糖基化修饰的检测结果。 

表2   

 

⑸重组人凝血因子七的生物学活性的测定：从兔奶中纯化的重组人凝血因子七将用于APTT（activated partial thromboplastin time）测试，测定其生物学活性（即凝血能力）。样本和对照将按照1：20，1：30，1：40比例加入到无凝血因子的血浆中，进行APTT测试。血液凝结的时间将被用于制造凝血活性曲线，确定样本中的重组人凝血因子七的生物学活性。实验结果显示：兔奶中的FⅦ具有较高的生物学活性，其效价为 1：1000以上 。

⑹rhFⅦ动物矫正试验： FⅦ基因缺失小鼠（KO）由美国The Jackson Laboratory提供。对每只KO小鼠静脉注射2.5 IU纯化的rhFⅦa，注射后5分钟、2、4、8、16、24、48小时从腔静脉取血，血浆快速冻干并保存与-80℃。诺其作为阳性对照（4只小鼠/时间点，共4×7×2=56只）。将血浆用于显色反应检测rhFⅦa活性，分析其药物活性。根据APTT结果，确定rhFⅦa相对诺其数值的生物学活性。按照0、50％、100％、200％的比例对KO小鼠静脉注射rhFⅦa（10只/组，10×5=50只）。对应于诺其的人用剂量，鼠用量为12 IU/kg，5分钟后实施鼠尾静脉切断术，收集失血量数据，以分析注射rhFⅦa后对KO小鼠存活率的影响。试验结果显示，兔奶中的rhFⅦ与诺其的有相同的动物矫正效果。 

实施例1的实验结果总体分析：⑴转基因率：实现21.2％的转基因率；⑵乳腺表达率为33%；⑶从转基因兔奶中获得稳定产量的rhFⅦa，产量为1.0-1.5 mg/mL；⑷蛋白糖基化，羟基化，羧基化等表达后修饰稳定；⑸转基因兔兔奶中的rhFⅦa生物活性高。 

其中，还可以通过以下方法将乳腺表达构件导入或者整合到家兔的染色体基因中，具体操作为：首先，利用Sal I与Not I的限性内切酶释放细菌质粒部分，形成所述乳腺表达构件；其次，将所述乳腺表达构件转染至家兔供体细胞中，然后，将经过乳腺表达构件转染的阳性细胞核通过显微操作移到去除染色体遗传物质的卵母细胞的细胞质中，构成克隆胚胎；最后，将发育的克隆胚胎进行胚胎移植，到同步发情的受体兔中妊娠，获得转基因兔。 

Claims (10)

1.利用家兔乳腺反应器平台生产重组人第七凝血因子的方法，其特征在于：将重组人第七凝血因子的cDNA导入或整合至家兔的基因组中，获得的转基因兔在乳腺反应器内表达重组人第七凝血因子。

2.根据权利要求1所述的利用家兔乳腺反应器平台生产重组人第七凝血因子的方法，其特征在于：利用家兔乳腺反应器平台生产重组人第七凝血因子的方法，其包括以下步骤： ⑴将外接信号基因的重组人第七凝血因子的cDNA插入表达载体中形成第七凝血因子的乳腺表达载体，所述表达载体包括调控元件；⑵将乳腺表达载体导入或者整合到家兔的染色体基因中，获得转基因兔；⑶获得的转基因兔的当代或者后代母兔在泌乳期的乳汁中产生重组人第七凝血因子。

3.根据权利要求2所述的利用家兔乳腺反应器平台生产重组人第七凝血因子的方法，其特征在于：所述表达载体为pBC1质粒载体，所述重组人第七凝血因子cDNA为人全序列第七凝血因子cDNA。

4.根据权利要求2所述的利用家兔乳腺反应器平台生产重组人第七凝血因子的方法，其特征在于：所述外接信号基因为β-酪蛋白信号肽和第七凝血因子原有的分泌信号肽。

5.根据权利要求2或3或4所述的利用家兔乳腺反应器平台生产重组人第七凝血因子的方法，其特征在于：所述调控元件包括鸡β球蛋白绝缘子,山羊β-酪蛋白启动子,TATA盒, β-酪蛋白外显子1,β-酪蛋白内含子1, β-酪蛋白外显子2,β-酪蛋白外显子7，8，9，β-酪蛋白内含子7，8，β-酪蛋白基因组片段。

6.根据权利要求5所述的利用家兔乳腺反应器平台生产重组人第七凝血因子的方法，其特征在于：所述重组人第七凝血因子的cDNA在限制性内切酶Xho I多克隆位点插入pBC1载体，所述限制性内切酶Xho I多克隆位点位于β-酪蛋白外显子2和β-酪蛋白外显子7，8，9之间。

7.根据权利要求6所述的利用家兔乳腺反应器平台生产重组人第七凝血因子的方法，其特征在于：在将所述乳腺表达载体导入或者整合到家兔的染色体基因之前，利用Sal I与Not I的限性内切酶释放细菌质粒部分，形成乳腺表达构件，所述乳腺表达构件包括所述调控元件和第七凝血因子cDNA。

8.根据权利要求7所述的利用家兔乳腺反应器平台生产重组人第七凝血因子的方法，其特征在于：步骤⑵中将乳腺表达载体导入或者整合到家兔的染色体基因并获得转基因兔的具体操作为：首先，利用Sal I与Not I的限性内切酶释放细菌质粒部分，形成所述乳腺表达构件；其次，将所述乳腺表达构件通过显微注射直接注入家兔受精卵中；然后，将家兔受精卵放入FBS M199培养液、并在38.5℃、5％CO₂的培养箱中培养；最后，将家兔胚胎移植到受体家兔的输卵管中，经过妊娠，获得转基因兔。

9.根据权利要求7所述的利用家兔乳腺反应器平台生产重组人第七凝血因子的方法，其特征在于：步骤⑵中将乳腺表达载体导入或者整合到家兔的染色体基因并获得转基因兔的具体操作为：首先，利用Sal I与Not I的限性内切酶释放细菌质粒部分，形成所述乳腺表达构件；其次，将所述乳腺表达构件转染至家兔供体细胞中，然后，将经过乳腺表达构件转染的阳性细胞核通过显微操作移到去除染色体遗传物质的卵母细胞的细胞质中，构成克隆胚胎；最后，将发育的克隆胚胎进行胚胎移植，到同步发情的受体兔中妊娠，获得转基因兔。

10.根据权利要求2所述的利用家兔乳腺反应器平台生产重组人第七凝血因子的方法，其特征在于：所述泌乳期包括人工诱导泌乳期和自然分泌的泌乳期；所述人工诱导泌乳期和所述自然泌乳期包括泌乳前期、泌乳中期和泌乳后期。

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