CN104726495A - 一种基于talen介导的基因打靶敲除山羊blg的载体及重组细胞 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于TALEN介导的基因打靶敲除山羊BLG的载体及重组细胞。本发明根据山羊β-乳球蛋白基因，设计并构建了针对其第一外显子的TALEN真核表达载体以及含有较短同源臂的BLG基因敲除载体，与以TALEN表达载体为模板体外转录的mRNAs共同转染山羊胎儿成纤维细胞，经药物筛选及鉴定后得到β-乳球蛋白基因敲除细胞。本发明利用TALEN技术大大提高了基因打靶效率，同时较短同源臂的利用可以更方便高效的进行中靶细胞的筛选，mRNAs的利用则避免了TALEN表达载体在基因组中的随机整合。

Description

一种基于TALEN介导的基因打靶敲除山羊BLG的载体及重组细胞

技术领域

本发明属于动物基因工程技术领域，涉及一种基于TALEN介导的基因打靶敲除山羊BLG的载体及重组细胞。

背景技术

β-乳球蛋白(β-lactoglobulin,BLG)是反刍动物乳汁中的主要乳清蛋白，约56％-60％，在人和啮齿动物乳汁中基本不存在(Kontopidis G et al.2004)，是引起婴幼儿乳过敏症的主要致敏原之一。目前降低BLG致敏性的生物化学方法有多种，如热处理、酶解、糖基以及发酵等。这些方法虽然对降低BLG过敏症有一定的效果，但却不能从根本上解决BLG的致敏性问题。随着分子生物学技术的发展，RNA干扰技术可有效的降低牛乳中的BLG，其扰效率可达到100％。然而，利用RANi生产转基因动物缺乏遗传稳定性，且干扰载体在动物基因组中的随机整合会产生意想不到的表型。

基因打靶技术是利用同源重组对生物体基因组进行定向修饰以改变其遗传信息的技术，广泛的应用于小鼠胚胎干细胞以生产基因敲除或外源基因定点插入个体。但由于至今家畜中尚未分离到具有生殖系嵌合能力的ES细胞，因此在体细胞中进行基因打靶然后借助体细胞核移植技术是目前生产基因打靶家畜的唯一方法。然而，由于体细胞中同源重组的效率低于10^-6，导致了较低的基因打靶效率。此外，转录沉默的基因的打靶效率较转录活跃的基因低10倍左右，因为前者的同源重组效率更低。

人工核酸内切酶(Engineered endonuclease,EEN)，是通过基因工程的方法，将特定的DNA结合蛋白跟特定的核酸内切酶相互融合构建而成的一种人造蛋白，如锌指核酸酶(Zinc-finger nuclease,ZFN)、类转录激活因子效应物核酸酶(Transcription activator-like effectornuclease,TALEN)。EEN主要包含两个结构域，一个可特异性识别并结合DNA靶序列的结合结构域，；另一个是用来切割DNA靶序列,造成DNA双链断裂(Double-strand break,DSB)的DNA切割结构域。DSB能够激活细胞内固有的非同源末端连接(Non-homologous end joining,NHEJ)或同源重组(Homologous recombination,HR)机制，对这种DNA损伤进行修复。其中NHEJ是一种较为简单的修复方式,但是保真度不高，很容易造成DNA断裂处的序列发生改变,产生未知的DNA小片段插入和/或缺失(indel)，进而造成基因突变。在存在同源序列的情况下,还可以通过同源重组的方式进行修复，以产生大片段的DNA精确删除或者是外源DNA的插入。

ZFN作为第一种人工构建并成功应用的EEN，大大促进了基因组靶向修饰技术。李宁等利用ZFN在牛胎儿成纤维细胞中介导的NHEJ修复途径生产了BLG基因部分缺失的牛，然而其读码框阅读顺序并没有改变，所以并没能完全敲除掉BLG。然而，由于ZFN的构建比较困难且费用较高，以及其脱靶效应的存在，该技术并没有在家畜动物中广泛使用。

TALEN既能够像ZFN一样精确地修饰复杂的基因组，又具有比ZFN更容易设计的优点，且其脱靶率以及细胞毒性更低。应用TALEN介导的基因组修饰已成功应用于多种模式动物，如果蝇、斑马鱼、小鼠、大鼠等。DanielF.Carlson等将TALEN与含有筛选标记的辅助载体共同转染家畜体细胞，以通过药物筛选富集含有基因修饰的突变体。由于这种方法获得的修饰为随机的、不可预测的，使得筛选具有功能缺失的突变体的工作量十分复杂。此外，辅助载体的随机整合对生物个体的安全存在极大的影响。

发明内容

本发明解决的问题在于一种基于TALEN介导的基因打靶敲除山羊BLG的载体及重组细胞，利用TALEN介导进行针对BLG基因阅读框的基因打靶，可在山羊体细胞中高效并精确地修饰BLG基因，以获得基因敲除克隆羊。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种基于TALEN介导的基因打靶敲除山羊BLG的载体，包括TALEN真核表达载体和BLG基因敲除载体；

所述的TALEN真核表达载体所针对的TALEN识别位点位于BLG基因第一外显子，包括上游位点识别表达载体和下游识别位点表达载体；

所述的BLG基因敲除载体是包括有5’同源臂和3’同源臂的打靶载体，其中5’同源臂的末端和3’同源臂的首端落在TALEN识别位点之间，并且两者之间相隔一定长度的BLG阅读框。

所述的TALEN真核表达载体所表达的蛋白识别BLG基因第一外显子上的TALEN识别位点，切割并产生双链断裂，启动DNA双链断裂修复；

所述的BLG基因敲除载体的5’同源臂、3’同源臂分别与BLG基因的同源序列发生同源重组，5’同源臂、3’同源臂同时发生同源重组是，5’同源臂与3’同源臂之间间隔的BLG阅读框被敲除。

所述的TALEN识别位点是位于BLG基因第一外显子靠近信号肽序列的序列；

所述的5’同源臂是与BLG基因第一外显子上游1000～1500bp的序列相同源；所述的3’同源臂是与BLG基因第一外显子下游1000～1500bp的序列相同源；两者之间间隔10～30bp的BLG阅读框。

所述的TALEN识别位点是位于BLG基因第一外显子的+47～+94位序列，其中上游识别位点为+47～+62位，下游识别序列为+78～+94位；

所述的5’同源臂是与BLG基因第一外显子的-1028～+60位的序列相同源；所述的3’同源臂是与BLG基因第一外显子的+80～+1422位的序列相同源。

所述的上游位点识别表达载体是载体pCS2-BLG-L，通过将上游识别位点序列TALEN-BLG-L克隆到载体pCS2-FokI-PEAS得到；所述的下游位点识别表达载体是载体pCS2-BLG-R，通过将下游识别位点序列TALEN-BLG-R克隆到载体pCS2-FokI-PERR得到；

所述的BLG基因敲除载体时将5’同源臂、3’同源臂分别克隆于包含loxP位点的载体ploxPⅡ中，其中5’同源臂位于loxP位点的上游，3’同源臂位于loxP位点的下游。

所述的TALEN-BLG-L序列如SEQ.ID.NO.1所示，所述的TALEN-BLG-R序列如SEQ.ID.NO.2所示；

所述的BLG基因敲除载体为载体pBLG-Neo，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3所示。

所述的基于TALEN介导的基因打靶敲除山羊BLG的载体在构建BLG基因敲除的细胞中的应用。

一种基于所述TALEN介导的基因打靶敲除山羊BLG的载体构建的重组细胞，是以山羊胎儿成纤维细胞为宿主细胞，将TALEN真核表达载体和BLG基因敲除载体共转染到宿主细胞中，筛选得到的5’同源臂、3’同源臂同时发生了重组的细胞。

一种基于所述TALEN介导的基因打靶敲除山羊BLG的载体构建的重组细胞，是以山羊胎儿成纤维细胞为宿主细胞，将线性化的TALEN真核表达载体进行体外转录生产mRNAs，得到T-mRNAs；将T-mRNAs和BLG基因敲除载体共转染到宿主细胞中，筛选得到的5’同源臂、3’同源臂同时发生了重组的细胞。

所述的重组细胞作为核移植构建转基因克隆胚的核供体细胞的应用

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明提供的基于TALEN介导的基因打靶敲除山羊BLG的载体，包括相互密切配合的TALEN真核表达载体和BLG基因敲除载体，能够精确敲除BLG基因的一定长度的阅读框，破坏信号肽序列以及产生阅读框的移码突变。TALEN真核表达载体和BLG基因敲除载体的密切配合是基于TALEN真核表达载体识别BLG基因上的位点，在切割后产生双链断裂，启动DNA双链断裂修复，同时引入BLG基因敲除载体进行重组，利用DNA双链断裂引发的DNA重组修复过程，使间隔一定长度的同源臂特异的插入山羊β乳球蛋白基因，实现对山羊β-乳球蛋白基因的精确敲除；在此基础上可以以获得基因敲除克隆羊。

TALEN真核表达载体和BLG基因敲除载体的密切配合还在于TALEN识别位点与5’同源臂、3’同源臂的相配合；选择BLG基因第一外显子靠近信号肽序列的序列作为TALEN靶位点，而5’同源臂的末端和3’同源臂的首段落在TALEN识别位点之间；并且两者之间相隔一定长度的BLG阅读框，这样当发生同源臂重组时，同源臂替换掉BLG阅读框上同源的序列，而所相隔的BLG阅读框将会被敲除，从而破坏信号肽序列以及产生阅读框的移码突变；进一步的TALEN靶位点、及5’同源臂的末端和3’同源臂可以按照相同的设计方案进行改变，从而可以实现不同位点的敲除，还能够在两个同源臂之间插入目的基因；而为了便于利用PCR方法筛选发生基因打靶的细胞，选择长度<2kb的同源序列作为同源臂。

本发明提供的基于TALEN介导的基因打靶敲除山羊BLG的载体及重组细胞，通过位点的设计有机的结合了TALEN切割识别与基因打靶定点重组，利用TALEN产生的DSB提高体细胞中同源重组的概率，可显著提高基因打靶效率，并产生精确地基因组敲除或修饰。传统基因打靶载体需要较长的同源臂，共约10kb，而本发明采用片段较短的序列作为同源臂(共约2.4kb)，可以更简便有效的利用PCR方法筛选中靶细胞。进一步，在构建重组细胞时，可以采用TALEN表达载体的mRNAs，避免了TALEN表达载体在基因组中的随机整合，避免了可能存在的生物安全风险。

本发明提供的基于TALEN介导的基因打靶敲除山羊BLG的载体及重组细胞，首次利用类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)介导的基因打靶技术成功敲除山羊成纤维细胞中的β-乳球蛋白基因，由此获得基因敲除克隆奶山羊。TALEN介导的转录沉默基因打靶效率约为13％，而传统的基因打靶技术约为0.5％，并且较短同源臂的应用对中靶细胞的筛选鉴定过程提供了极大的便利。而进一步所构建的BLG敲除的克隆羊，其与野生型山羊的羊奶相比，BLG^+/-山羊所分泌乳汁中，BLG的表达量约为野生型的71％。

附图说明

图1为敲除载体构建方式示意图；

图2为PCR鉴定的引物设计示意图；

图3为阳性重组细胞的PCR鉴定结果图；

图4a为克隆羊的JD-5F/5R、JD-3F/3R探针的PCR鉴定结果图；

图4b为克隆羊的JD-3F/3R、neo探针的PCR鉴定结果图；

图5a为荧光定量PCR检测BLG敲除后的山羊分泌乳汁中BLG含量的灰度图；

图5b为荧光定量PCR检测BLG敲除后的山羊分泌乳汁中BLG含量统计结果图，其中1为野生型，2为BLG敲除型。

具体实施方式

为提高敲出山羊β-乳球蛋白基因的基因打靶效率，本发明通过TALEN(类转录激活因子效应物核酸酶)进行介导，识别山羊β乳球蛋白(C.hircusbeta-lactoglobulin)基因第一外显子区上的位点，在切割后产生双链断裂，启动DNA双链断裂修复，同时引入同源臂载体，利用DNA双链断裂引发的DNA重组修复过程，使组装的目的DNA序列特异的插入山羊β乳球蛋白基因，实现对山羊β-乳球蛋白基因的修饰、敲除。下面分别对TALEN真核表达载体的构建、TALEN表达载体为模板进行体外转录mRNAs、含有较短同源臂的BLG基因敲除载体的构建，以及共同转染山羊胎儿成纤维细胞、药物筛选及鉴定做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

以下实施例中TALEN模块与表达载体骨架载体购自北京康为世纪公司，引物合成由上海生工完成，序列测定由南京金斯瑞完成。

Taq酶、T4DNA连接酶购自大连TaKaRa公司，限制性内切酶购自北京NEB公司，体外转录试剂盒，mRNA纯化试剂盒购自，G418、GCV、bFGF、EGF购自Sigma公司；DMEM/F12及胎牛血清购自Gibco公司。酶切、连接、回收、转化、PCR扩增等常规实验操作步骤详见《分子克隆(第三版)》。

1、TALEN真核表达载体的构建

1)TALEN识别位点的筛选

将山羊BLG基因(登录号：Z33881)序列信息从GenBank数据库中获得，然后利用TALEN靶点设计工具进行识别位点的筛选。为了获得更好的敲除效果，选择位于BLG基因第一外显子靠近信号肽序列(+1～+54)的+47～+94位序列作为TALEN靶位点，其中上游识别位点为+47～+62位，下游识别序列为+78～+94位；其DNA序列如下(其中下划线部分分别为TALEN上游和下游识别位点)：

TCCAGGCCATCATCGTCACCCAGACCATGAAAGGCCTGGACATCCAGA

AGGTCCGGTAGTAGCAGTGGGTCTGGTACTTTCCGGACCTGTAGGTCT

2)TALEN真核表达载体的组装

针对所识别的上游位点和下游位点，先根据模块组装法分别组装其对应的蛋白表达序列TALEN-BLG-L(如SEQ.ID.NO.1所示)和TALEN-BLG-R(如SEQ.ID.NO.2所示)；其中组装的模块顺序为：

TALEN-BLG-L：HD HD NI NN NN HD HD NI NG HD NI NG HD NN；

TALEN-BLG-R：HD NG NN NN NI NG NN NG HD HD NI NN NN HDHD；

组装过程参考文献Peng Huang et al.,Heritable gene targeting in zebrafishusing customized TALENs.Nature Biotechnology,29:699-700(2011)；

将组装的TALEN-BLG-L和TALEN-BLG-R分别经Nhe I和Spe I双酶切回收后，然后再分别克隆到骨架载体pCS2-FokI-PEAS和pCS2-FoKI-PERR形成TALEN真核表达载体pCS2-BLG-L与pCS2-BLG-R。

2、BLG基因敲除载体的构建

为了在TALEN介导下通过同源臂重组对BLG基因进行敲除，其中5’同源臂的末端和3’同源臂的首段落在TALEN识别位点之间；并且两者之间相隔一定长度的BLG阅读框，这样当发生同源臂重组时，所相隔的BLG阅读框将会被敲除；进一步为了便于利用PCR方法筛选发生基因打靶的细胞，选择长度<2kb的同源序列作为同源臂。

根据GenBank数据库中山羊BLG基因序列(登录号：Z33881)设计引物用以扩增BLG基因第一外显子上游1089bp(-1028～+60)、下游1343bp(+80～+1422)同源序列，通过和同源臂发生同源重组事件，中靶细胞中BLG基因第一外显子的19bp序列(+61～+79)将被删除，以破坏信号肽序列以及产生阅读框的移码突变。

具体的同源臂的扩增引物序列如下：

B5-F：ATTTGCGGCCGCCCCGTTCCGCTACCCCAATAC

B5-R：CCGCTCGAG GATGATGGCCTG

GATGCCACA

B3-F：GCTCTAGAGCCTGGACATCCAGAAGGTTCGA

B3-R：ACGCGTCGACGAGGGTGGACAGGGCTGGTAGTG

上述下划线为添加的酶切位点，依次为Not Ⅰ、Xho Ⅰ、Sal Ⅰ和Xba Ⅰ；双划线部分为I-Sce Ⅰ识别位点；

以山羊血液基因组为模板，分别以B5-F/R，B3-F/R为引物，进行PCR反应，然后通过琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行检测。分别胶回收PCR反应得到的5’同源臂(B5)和3’同源臂(B3)片段，加A后连接到pMD18-T simple，阳性质粒送交测序。借助NCBI在线软件将测序结果与原序列进行序列比对分析，阳性者分别标记为pMD18-B5和pMD18-B3；

参见图1所示的构建过程，将pMD18-B5用Not I/Xho I酶切后回收B5片段连接至经相同酶切的打靶载体骨架ploxPⅡ。该骨架载体还有PGK启动子启动的新霉素抗性基因(neo)作为正筛选标记，并在neo两侧插入两个同向的loxP位点，同时还含有单纯疱疹病毒胸苷激酶(hsv-tk)自杀基因作为负筛选标记；B5连接至loxP的上游，经酶切鉴定后阳性质粒标记为ploxPⅡ-B5；

pMD18-B3用Sal I/Xba I酶切后连接至经相同酶切的ploxPⅡ-B5，B3连接至loxP的下游，经酶切鉴定后阳性质粒标记为pBLG-Neo，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3所示。

如图1所示，在pBLG-Neo载体中，5’arm及3’arm分别为5’和3’同源臂，红色三角表示loxP位点(其序列为ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT)。发生同源重组后，载体中neo基因部分将定点整合至基因组中与同源臂同源的区域，使中靶细胞获得新霉素抗性，并且不会整合tk自杀基因；而发生随机整合的细胞则同时含有neo基因及tk基因，经过丙氧鸟苷(GCV)的筛选会死亡。中靶细胞经过Cre重组酶的作用，基因组中两个loxP位点之间的neo基因序列删除。

3、TALEN介导的基因打靶效率检测

(1)胎儿成纤维细胞的转染

取液氮中冻存的原代或第一代山羊胎儿成纤维细胞(GFF)，迅速投入到38℃水浴中解冻。吸取解冻的细胞悬液至1.5mL离心管，1000r/min离心5min。弃上清，加入DMEM/F12培养液重悬细胞，接种至3个直径60mm的培养皿中，每皿加入3mL含15％FBS，100U/mL青、链霉素的DMEM/F12培养液，置于37℃、5％CO₂、饱和湿度的二氧化碳培养箱中培养。

当细胞长至80％汇合时，吸弃原培养液，用PBS洗一遍，加入1mL 37℃预热的细胞消化液(0.25％胰酶+0.03％EDTA)，置于培养箱中孵育，待多数细胞收缩变圆，部分细胞脱离培养皿底时加入1mL含10％FBS的DMEM/F12中止消化。轻轻吹打皿底的细胞，使之从皿底脱落。将细胞液移至5mL离心管中1000r/min离心5min。弃上清，一部分加入含10％DMSO、20％FBS的DMEM/F12进行细胞冻存；另一部分重新加入1mL新鲜培养液重悬细胞，接种至3个直径60mm的培养皿中继续培养，用于细胞转染。

将一对TALEN真核表达载体pCS2-BLG-L、pCS2-BLG-R质粒DNA与BLG基因敲除载体pBLG-Neo共同电转上述胎儿成纤维细胞：

200μl电转液加到4mm Gap的电转杯中，利用BTX ECM 2001电穿孔仪500V,1ms,3Pulses，电击后平衡10min，接种到90mm培养皿中，添加10mL DMEM/F12+10％FBS。转染后接种至10cm培养皿中，48h后换液为含有G418(600μg/mL)的培养液进行筛选，以后每3d换液一次，第二次和第三次换液时加入G418(600μg/mL)同时加入GCV(2μmml/L)的负筛选药物进行筛选。

药物筛选7-10天后，平皿中出现细胞克隆，挑取细胞克隆，一部分接种于24孔培养板中，扩大培养；另一部分用于PCR鉴定。

2)BLG基因敲除细胞的鉴定

鉴定引物的设计原则如图2所示，5’端鉴定引物上游位于5′同源臂端外侧基因组，下游定位于打靶载体的新霉素抗性基因；3′端鉴定引物上游定位于新霉素抗性基因，下游则定位于3’同源臂外侧基因组。对药物筛选呈阳性的细胞克隆用以上引物分别进行检测，5’及3’PCR鉴定阳性表明该细胞发生了同源重组，neo基因定点整合至山羊BLG基因中；阴性则说明该细胞并未进行同源重组，只是发生随机整合而获得的新霉素抗性。

引物序列如下：

JD-5F:CTCCTTCAACCCCATCACAG

JD-5R:GCATAGCCGAATAGCCTCTC

JD-3F:CCACCAAGCGAAACATCG

JD-3R:TGACCACACACAGGCACC

鉴定方法：细胞单克隆挑取时取部分细胞至于15μL裂解液(1.5M Tris-ClpH 8.0，5％Triton X-100，5％NP-40，蛋白酶K)中，振荡重悬细胞沉淀。65℃20min裂解细胞，90℃10min以灭活蛋白酶K。取2μL裂解液作为模板，进行首次PCR鉴定(JD-5F/5R)。PCR鉴定阳性的细胞克隆进行扩大培养并提取细胞基因组DNA，并以此为模板进行第二轮PCR鉴定(JD-3F/3R)，鉴定引物及反应程序如前所述。然后将目的条带切胶回收后连接T载体后测序。

PCR鉴定结果如图3所示，图a为JD-5F/5R鉴定结果，其中检测到2.2kb的目标条带为阳性克隆(1、8、14、21泳道)；图b为JD-3F/3R鉴定结果，其中检测到2.4kb的目标条带为阳性克隆(2、3、5、6、8、9泳道)。总体检测结果表明，在126个药物抗性细胞克隆中，中靶细胞克隆为17个，打靶效率约为13.5％。

4、BLG基因敲除克隆胚胎及克隆奶山羊的制备

1)莎能奶山羊胎儿成纤维细胞培养

取40日龄莎能奶山羊胎儿，去除头部、四肢、内脏及尾部后，组织块培养法建立奶山羊胎儿成纤维细胞系。

2)BLG基因敲除细胞的制备

TALEN真核表达载体pCS2-BLG-L、pCS2-BLG-R以Not I线性化后回收，以此为模板，采用AmpliCap^TM SP6High Yield Message Maker Kit进行体外转录生产mRNAs，经纯化回收后，与敲除载体pBLG-Neo共同电转山羊胎儿成纤维细胞。转染及筛选鉴定方法同3。

3)基因敲除克隆胚胎的构建及胚胎移植

对阳性细胞克隆进行染色体分析，染色体数正常比例大于70％的细胞克隆作为核供体细胞进行核移植。从屠宰场采集的卵巢处理干净，用灭菌手术刀片将卵巢表面2～6mm的卵泡切开，体式显微镜下采集卵丘卵母细胞复合物(Cumulus-oocyte complexes，COCs)，成熟培养22～24h，用0.1％透明质酸酶吹打消化去除颗粒细胞，选择排出第一极体的优质卵母细胞去核。在显微镜下吸出第1极体及部分胞质，供体细胞注入到去核卵母细胞的透明带下。注射后的细胞-卵胞质重组体以微电极挤压融合法用两次电脉冲(32V，每次20μs)进行融合。

融合前先将重组体放入融合液(0.3mol/L甘露醇、0.05mol/L氯化钙、0.1mol/L硫酸镁、0.27mol/L组氨酸、0.1％BSA)中预平衡4～6min。融合后的胚胎放入10％FBS的M199中，添加7.5ug/mL的CB，38.5℃、5％CO₂、饱合湿度下培养，2～3h后观察融合情况。融合的重组胚用含5μmol/L的Ionomycin处理4min，然后在含2mmol/L 6的-DMAP培养液内培养3h，洗3次后转移到mSOFaa或G1/G2培养液中进行培养。培养7d后检查囊胚发育率，或将培养20～24h的克隆胚胎移植入同步发情的受体羊输卵管中，每月用B超检查妊娠情况。

5、基因敲除奶山羊的鉴定

1)基因型的鉴定

提取出生小羊血液基因组DNA，进行PCR、测序鉴定，方法同3；SouthernBlot鉴定操作步骤见《分子克隆实验指南(第三版)》，检测示意图如图2所示。检测结果如图4a、图4b所示，结果表明出生的3只小羊均为定点同源重组(如图4a所示的JD-5F/5R、JD-3F/3R的鉴定结果均为阳性)，且出生的3只小羊均为BLG基因敲除的克隆羊(图4b所示，BLG基因第一外显子的19bp序列被精确删除)，与细胞水平鉴定结果一致。

2)BLG敲除效果的验证

基因敲除克隆奶山羊7个月大小时进行诱导泌乳，过程为：肌肉注射雌二醇(0.25mg/kg)和孕酮(0.75mg/kg)，每隔一天一次，共7次；第14天起注射利血平4mg，连续4天；同时每日对山羊乳房进行按摩。所获得的奶样，4℃10000g离心30min脱脂，弃去上层脂肪，吸取中间层清液用乙酸调整PH值到4.6，静置15min，4℃10000g离心30min去除酪蛋白，收集的上层乳清，加入2×蛋白上样缓冲液，煮沸制备样品，取1μL上述制备的样品加入到10％的蛋白胶胶槽中，进行SDS-PAGE电泳，电泳完毕后进行考马斯亮蓝染色；

下层沉淀加入PBS悬浮，轻轻震荡混匀后4℃3000g离心30min，重复三次后获取的沉淀加入Trizol裂解提取RNA，进行Real-Time PCR检测BLG表达量，内参基因选用β-actin，引物序列为：β-actin-F β-actin-R；BLG基因引物序列为：LGB-F、LGB-R。灰度扫描结果表明(如图5a所示)以及荧光定量PCR结果表明(如图5b所示)，与野生型山羊的羊奶相比，BLG^+/-山羊所分泌乳汁中，BLG的表达量约为野生型的71％。

Claims (10)

1.一种基于TALEN介导的基因打靶敲除山羊BLG的载体，其特征在于，包括TALEN真核表达载体和BLG基因敲除载体；

所述的TALEN真核表达载体所针对的TALEN识别位点位于BLG基因第一外显子，包括上游位点识别表达载体和下游识别位点表达载体；

所述的BLG基因敲除载体是包括有5’同源臂和3’同源臂的打靶载体，其中5’同源臂的末端和3’同源臂的首端落在TALEN识别位点之间，并且两者之间相隔一定长度的BLG阅读框。

2.如权利要求1所述的基于TALEN介导的基因打靶敲除山羊BLG的载体，其特征在于，所述的TALEN真核表达载体所表达的蛋白识别BLG基因第一外显子上的TALEN识别位点，切割并产生双链断裂，启动DNA双链断裂修复；

所述的BLG基因敲除载体的5’同源臂、3’同源臂分别与BLG基因的同源序列发生同源重组，5’同源臂、3’同源臂同时发生同源重组是，5’同源臂与3’同源臂之间间隔的BLG阅读框被敲除。

3.如权利要求1或2所述的基于TALEN介导的基因打靶敲除山羊BLG的载体，其特征在于，所述的TALEN识别位点是位于BLG基因第一外显子靠近信号肽序列的序列；

所述的5’同源臂是与BLG基因第一外显子上游1000～1500bp的序列相同源；所述的3’同源臂是与BLG基因第一外显子下游1000～1500bp的序列相同源；两者之间间隔10～30bp的BLG阅读框。

4.如权利要求3所述的基于TALEN介导的基因打靶敲除山羊BLG的载体，其特征在于，所述的TALEN识别位点是位于BLG基因第一外显子的+47～+94位序列，其中上游识别位点为+47～+62位，下游识别序列为+78～+94位；

所述的5’同源臂是与BLG基因第一外显子的-1028～+60位的序列相同源；所述的3’同源臂是与BLG基因第一外显子的+80～+1422位的序列相同源。

5.如权利要求1或4所述的基于TALEN介导的基因打靶敲除山羊BLG的载体，其特征在于，所述的上游位点识别表达载体是载体pCS2-BLG-L，通过将上游识别位点序列TALEN-BLG-L克隆到载体pCS2-FokI-PEAS得到；所述的下游位点识别表达载体是载体pCS2-BLG-R，通过将下游识别位点序列TALEN-BLG-R克隆到载体pCS2-FokI-PERR得到；

所述的BLG基因敲除载体时将5’同源臂、3’同源臂分别克隆于包含loxP位点的载体ploxPⅡ中，其中5’同源臂位于loxP位点的上游，3’同源臂位于loxP位点的下游。

6.如权利要求5所述的基于TALEN介导的基因打靶敲除山羊BLG的载体，其特征在于，所述的TALEN-BLG-L序列如SEQ.ID.NO.1所示，所述的TALEN-BLG-R序列如SEQ.ID.NO.2所示；

所述的BLG基因敲除载体为载体pBLG-Neo，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.3所示。

7.权利要求1～6任何一项所述的基于TALEN介导的基因打靶敲除山羊BLG的载体在构建BLG基因敲除的细胞中的应用。

8.一种权利要求1所述基于TALEN介导的基因打靶敲除山羊BLG的载体构建的重组细胞，其特征在于，以山羊胎儿成纤维细胞为宿主细胞，将TALEN真核表达载体和BLG基因敲除载体共转染到宿主细胞中，筛选得到的5’同源臂、3’同源臂同时发生了重组的细胞。

9.一种权利要求1所述基于TALEN介导的基因打靶敲除山羊BLG的载体构建的重组细胞，其特征在于，以山羊胎儿成纤维细胞为宿主细胞，将线性化的TALEN真核表达载体进行体外转录生产mRNAs，得到T-mRNAs；将T-mRNAs和BLG基因敲除载体共转染到宿主细胞中，筛选得到的5’同源臂、3’同源臂同时发生了重组的细胞。

10.权利要求8或9所述的重组细胞作为核移植构建转基因克隆胚的核供体细胞的应用。